UNIVERSITATEA BUCUREŞTI

Analize morfologice, fiziologice şi genetice la

unele tulpini de drojdii de interes
biotehnologic şi medical

Teză de doctorat

Conducător ştiinţific: Doctorand:

Prof. dr. Maria – Luiza Flonta Raluca

Ghindea

2008
1. PREZENTAREA GENERALĂ A LUCRĂRII

1.1 Introducere

Denumirea de drojdie (fr. levure = lat. levere) ce denotă proprietăţile deosebite ale acestui
microorganism, datează dintr-o perioadă în care natura acestor microorganisme, precum şi
capacităţile lor fiziologice erau încă necunoscute, prima dovadă a existenţei acestor microorganisme
fiind adusă la mijlocul secolului XVII, de către Antonie van Leenwenhock.
Evoluţia acumulării de cunoştinţe despre drojdii este asociată cu cea a societăţii umane, şi
este sinonimă cu evoluţia industrială, aceste microorganisme fiind implicate în obţinerea unor
alimente precum pâinea, vinul, berea etc.
Identificarea, denumirea şi încadrarea taxonomică a drojdiilor intersectează şi prezintă o
importanţă deosebită pentru mai multe domenii ale ştiinţei, precum: agricultura, medicina,
biotehnologia, industria alimentară, etc. În prezent sunt recunoscute aproximativ 750 de specii de
drojdii, dar dintre acestea doar câteva sunt frecvent izolate. Un principal motiv îl constituie faptul
că, relativ puţine habitate naturale au fost minuţios investigate privind prezenţa drojdiilor,
considerându-se că doar 1% dintre speciile de drojdii existente în natură au fost descrise. Ca urmare,
putem presupune că multe alte specii de drojdii „aşteaptă” să fie descoperite.
Principalele criterii tradiţionale în identificarea drojdiilor sunt cele morfologice (reproducere
sexuată şi vegetativă, aspecte microscopice şi macroscopice), fiziologice (fermentaţia diferitelor
zaharuri, asimilarea surselor de carbon şi azot, necesarul de vitamine, temperaturi de creştere,
producerea de acid lactic etc.) precum şi biochimice (de exemplu: reacţia Diazonium blue B,
capacitatea de a degrada ureea).
Se consideră insă că această taxonomie convenţională este incompletă şi poate conduce la
erori, recurgându-se astfel la taxonomia moleculară ce permite o abordare filogenetică.
Tranziţia dintre identificarea fenotipică a drojdiilor către identificarea moleculară, începe
prin determinarea procentului molar de guanină şi citozină a ADN nuclear. Această analiză a
demonstrat că drojdiile ascomicete se înscriu într-un interval de 28-50% mol GC, în timp de
bazidiomicetele împart un domeniu cuprins între 50-70% mol GC.
Necesitatea stabilirii similitudinilor dintre diverse specii de drojdii a fost ulterior rezolvată,
în parte, prin studiile moleculare ce implică reasocierea ADN nuclear (procesul putând fi măsurat
spectrofotometric, cu ajutorul radioizotopilor sau a altor markeri). O altă metodă folosită pentru
identificarea unor specii de drojdii este reprezentată de secvenţierea domeniilor D1/D2 ADNr 26S,
considerându-se că tulpinile ce prezintă un grad de 0-0,5% omologie a secvenţelor sunt
conspecifice. Alături de secvenţierea diferitelor regiuni ADN, alte tehnologii moleculare des folosite
în taxonomia drojdiilor sunt de exemplu: electrocariotiparea, AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism), RAPD (Randomly Amplified Polimorphic DNA), RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism).
Deşi, taxonomia convenţională nu poate aduce informaţii de ordin filogenetic privind
microorganismele caracterizate, ea rămâne esenţială în recunoaşterea diferitelor specii, nu numai de
drojdii, dar şi la alte micro şi macroorganisme. Identificarea prin tehnici de taxonomie clasică este
de asemenea importantă în studiile de microbiologie industrială. De exemplu diferenţierea între
tulpinile de Saccharomyces cerevisiae şi Saccharomyces boyanus, putându-se realiza pe baza
capacităţii de creştere pe mediu lipsit de vitamine.
De aceea este necesar ca atât taxonomia convenţională cât şi cea moleculară să nu fie
exclusive, ci să se completeze într-un domeniu denumit taxonomie polifazică.
Studiile prezentate în această lucrare, abordează două aspecte ale implicării drojdiilor în
viaţa omului. Primul dintre ele îşi propune izolarea şi identificarea polifazică a unor noi tulpini de
drojdii din ecosisteme naturale precum şi testarea particularităţilor lor fiziologice, în vederea
evidenţierii unui eventual potenţial biotehnologic al acestora.
Cel de-al doilea studiu realizat, urmăreşte elucidarea unor aspecte legate de morfogeneza
drojdiilor, în speţă a speciei Candida parapsilosis, şi implicaţiile acestora în fenomenul de
patogenitate. Obiectivul principal al experimentelor a fost constituit de identificarea unor gene
implicate în tranziţia dimorfică a speciei Candida parapsilosisis, dorindu-de prin aceasta o conturare
a căii de reglare a creşterii filamentoase, necunoscute până în prezent, în cazul acestei specii.

1.2. Conţinutul tezei

Teza este împărţită în 4 capitole, după cum urmează:
- Capitolul 1 prezintă aspecte privind biologia şi genetica drojdiilor de interes biotehnologic şi
medical, fiind detaliate informaţii legate de organizarea celulară, fiziologia, organizarea genomului,
reproducerea, precum şi dimorfismul morfogenetic al drojdiilor.
- Capitolul 2 este dedicat prezentării atât tehnicilor de taxonomie clasică cât şi a celor mai moderne
tehnici moleculare utilizate în identificarea drojdiilor (Tehnici electroforetice speciale; aplicaţiile
reacţiei PCR în identificarea microorganismelor; determinarea compoziţiei în baze azotate a ADN;
Studii de omologie pe ADN mitocondrial; studii de omologie a ARNr şi a genelor corespunzătoare).
- Capitolul 3 prezintă cele mai importante aplicaţii biotehnologice şi bioterapeutice ale drojdiilor, cu
accent pe capacităţile xenodegradative ale drojdiilor, Implicaţiile drojdiilor în biotehnologia
preparării vinurilor, Utilizarea drojdiilor drept organisme gazdă pentru producerea de proteine
heterologe şi acţiunea terapeutică a drojdiilor – importanţa produselor probiotice.
Capitolul 4 conţine rezultatele obţinute în urma experimentelor realizate în vederea atingerii celor 2
obiective majore ale tezei de doctorat:
►identificarea polifazică şi evidenţierea potenţialului biotehnologic al unor noi tulpini de drojdii din
izolate naturale;
►studiul genelor implicate în reglajul dimorfismului la drojdii de interes medical.

1.3 Principalele metode utilizate

Tulpini de drojdii:
Au fost luate in studiu şase tulpini de drojdii izolate din produse lactate şi denumite convenţional
astfel : LC, CS, Ri – tulpini izolate in cadrul Laboratorului de Microbiologie, Facultatea de Biologie,
Universitatea din Bucureşti; BC, BF, LF – tulpini izolate în cadrul Laboratorului de Genetica
Microorganismelor şi Biotehnologie, Facultatea de Biologie, Universitatea din Bucureşti
Ca tulpini test, de referinţă, au fost folosite :
►Tulpini din Colecţia de Microorganisme a Laboratorului de Genetica Microorganismelor şi
Biotehnologie, Facultatea de Biologie, Universitatea din Bucureşti :
Saccharomyces cerevisiae X208 ( tulpină de tip sălbatic); Saccharomyces cerevisiae 17/17 a his
(Kil-K0)(K-R-) tulpină standard sensibilă la toxina killer; Saccharomyces cerevisiae 10701C a
thr4(Kil-K1)(K+R+) tulpină standard killer; Saccharomyces cerevisiae SMR4 (Kil-K2)(K+R+)
tulpină standard killer; Saccharomyces cerevisiae D649 (MATa/MATα Μ Α L2/mal2 trp1/TRP1
pet6/PET6 ade2/ADE2 ADE1/ade1 lys2/LYS2 HIS4/his4 LEU2/leu2 THR4/thr4; Candida
parapsilosis;Rhodotorula minuta; Rhodotorula glutinis
►Tulpini din Colecţia de Microorganisme a Laboratorului Kovać, Departamentul de Biochimie,
Facultatea de Ştiinţele Naturii, Universitatea Comenius, Bratislava
Saccharomyces cerevisiae L5366 (MATa/MATα ura3-52/ura3-52)
Candida parapsilosis CBS 604 ( tulpină de tip sălbatic)
►Tulpini din Colecţia de Microorganisme a Institutului de Cecetări Chimico-Farmaceutice din
Bucureşti: Rhodotorula glutinis ICCF;Rhodotorula rubra ICCF

Metode de lucru:
1. Izolarea, purificarea şi conservarea tulpinilor studiate
În scopul izolării tulpinilor de drojdii au fost utilizate un număr de 19 probe din produse
lactate naturale ( brânză proaspătă, lapte, caş, iaurt, smântână, chişleag), provenite din diverse zone
geografice ale ţării. Din totalul de 26 culturi iniţiale, un număr de 12 colonii au fost selectate pentru
purificări ulterioare prin metoda dispersiei şi epuizarea ansei pe mediu YPGA. Tulpinile de drojdii
astfel purificate au fost cultivate pe mediu YPGA şi conservate pe o perioada mai lunga de timp.
Metodele de conservare realizate au fost: conservarea pe termen scurt – subcultura; conservul
vegetativ sub ulei de parafină; crioconservarea
2. Analize de identificare preliminară a tulpinilor izolate, prin teste morfo-fiziologice şi
biochimice

2.1 Caracterizarea morfologică

Studiul caracterelor morfologice a presupus :
2.1.1 evidenţierea unor particularităţi ale coloniilor (suprafaţa, margini, culoare, profil) obţinute în
urma cultivării pe mediu solid YPGA – aspecte macroscopice.
2.1.2 stabilirea caracteristicilor culturii în mediu YPG
2.1.3 observarea celulelor aflate în suspensie – aspecte microscopice.

2.2 Caracterizarea fiziologică

Testarea capacităţii de a utiliza compuşi organici ca unică sursă de carbon pentru creşterea în
aerobioză (teste de asimilaţie) s-a realizat prin cultivarea microorganismelor in mediu YNB (Yeast
Nitrogen Base DIFCO) solid suplimentat cu diferite surse de carbon, precum: D-glucoza, D(+)-
galactoza, sucroza, rafinoza, D(+)-lactoza, etc (auxanograme). Rezultatul testelor a fost apreciat in
comparatie cu un martor pozitiv (YNB + glucoza) si unul negativ (YNB fara sursa de carbon),
observandu-se formarea de colonii in cazul asimilatiei glucidului testat.
Capacitatea de creştere la temperaturi non-permisive. Testul permite identificarea
si decelarea specilor de drojdii pe baza capacitatii lor de crestere la temperaturi non-permisive (de
ex. 37oC,). A fost inregistrata, comparativ, cresterea tulpinilor studiate la o temperatura permisiva
(27oC) si la 37oC si 42 oC.
Capacitatea de degradare a ureei
S-au folosit culturi de drojdii de 48 ore pe mediu YPGA. Din aceste culturi s-a însămânţat pe mediu
uree-agar Christensen, tuburile fiind apoi incubate la temperatura optimă de creştere (28°C) iar
culturile au fost examinate la intervale de 48 ore, 72 ore si 144 ore. Hidroliza ureei a fost indicată
de modificarea culorii indicatorului roşu fenol care a virat prin alcalinizarea mediului de la galben la
roz-purpuriu.
Testarea capacitatii de crestere pe medii cu concentratii inalte de zahar
Tulpinile studiate sunt insamantate in paralel pe mediu YPGA suplimentat cu 50% glucoza si
pe mediu YPGA suplimentat cu 60% glucoza. Aprecierea rezultatelor se face dupa 30 de zile de
incubare la 28°C, comparativ cu un martor pozitiv ( tulpina insamantata pe mediu YPGA cu
compozitie standard).
Testarea capacităţii de a utiliza semianaerob diferite surse de carbon
Testarea capacităţii de fermentaţie s-a realizat prin tehnica Durham, tulpinile fiind cultivate
pe medii cu extract de drojdie YE, incluzând ca sursă de carbon D-glucoza, D-galactoza, maltoza,
sucroza, D(+)-trehaloza, melibioza, lactoza, D(+)-celobioza, rafinoza.

2.3 Caracterizarea biochimică

Testul Diazonium blue B (DBB)
Tulpinile studiate au fost cultivate în mediu YPG timp de 19h la 28°C cu agitare magnetică
(150 rpm). Din culturile astfel obţinute s-a realizat însămânţare prin lutare pe plăci Petri cu mediu
YM. Acestea au fost incubate timp de 12 zile la temperatura optimă de dezvoltare (28°C). Ulterior
temperatura de incubare a fost modificată la 55°C pe o durată de 4 ore. Plăcile Petri au fost apoi
inundate cu agent DBB rece (0°C) urmărindu-se reacţia pozitivă a tulpinilor testate.
Studiul statistic al rezultatelor
Realizarea analizei fenetice
Rezultatele testelor microbiologice clasice au fost utilizate drept variabile in analiza
statistica. Metoda statistica aplicata a fost UPGA ( Unweighted pair group average method ),
frecvent utilizata in taxonomia numerica. UPGA este o metoda din categoria cluster analysis ( Three
clustering), categorie in care distanta ( gradul de deosebire) dintre doua grupuri este determinata prin
intermediul distantei medii dintre toate perechile de obiecte apartinand celor doua grupuri.
Datele caracteristice unei probe de identificat sunt comparate cu cele preexistente intr-o baza
de referinte. Fiecare trasatura caracteristica este asimilata cu o variabila, posibilele ei forme fiind
considerate stari ( de exemplu pentru variabila “capacitatea de a fermenta glucoza, starile posibile
sunt “negativ” respectiv “pozitiv” )

3. Analize de taxonomie moleculară

3.1 Izolarea şi purificarea ADN cromozomal

In vederea izolarii ADN cromosomal din celule de drojdii s-a realizat o adaptare a tehnicii de
izolare a ADN cromosomal [Ausubel,1995], prin experimentarea conditiilor de liza a peretelui
celular si de deproteinizare a lizatului celular. Astfel, protoplastii au fost obtinuti prin tratament cu
β - mercaptoetanol si liticaza 3 mg/ml la diferite concentratii finale, probele fiind supuse unui soc
termic. Indepartarea membranelor celulare s-a realizat prin tratament cu SDS 10% dferit in functie
de tulpinile luate in lucru.. Deproteinizarea s-a realizat prin incubare cu proteinaza K, tratament
KCl 2,5 M si apoi cu amestec cloroform:alcool isoamilic 24:1; Precipitarea ADN cromosomal s-a
realizat prin adaugarea de izopropanol iar proba a fost resuspendata in solutie Tris 10mM EDTA
1mM. Probele au fost stocate la 4°C.
► Verificarea puritatii si integritatii ADN
Inainte de a folosi ADN-ul extras si purificat pentru diverse manipulari moleculare, este
necesar sa se verifice puritatea si integritatea lui. In functie de valorile A260 si A280 se poate stabili
gradul de contaminare proteica, iar gradul de contaminare cu polizaharide se determina in functie de
valoarea raportului A260/A230
►Verificarea electroforetica a ADN
Prin electroforeza in gel de agaroza in placa orizontala in sistem submers s-a verificat gradul
de fragmentare a acestor molecule si gradul de contaminare cu ARN. S-a folosit agaroza SIGMA
dizolvata in tampon TBE 1X, intr-o concentratie de 0,8%.
3.2 Determinarea procentului molar de guanină şi citozină(% mol GC)
Etapele determinarii % mol GC ale unei probe de ADN au fost urmatoarele: - izolarea ADN
conform protocolului descris mai sus, finalizat cu resuspendarea extractului de ADN in SSC (0,1X) ;
- citirea valorilor absorbantei la lungimea de unda de 260nm in timpul denaturarii termice a ADN, la
fiecare 2°C pe un interval de temperatură de 20-100 °C; - valorile absorbantelor si ale temperaturii de
denaturare au fost inregistrate automat intr-un grafic; - punctul de mijloc al curbei a fost considerat a
fi Tm si a fost corelat cu procentul de GC, conform urmatoarelor relatii:
%mol GC = 2.08 xTm – 106.4 [Owen R., 1985]
%mol GC =2,44x (Tm-53.9) [Franck K., 1971]

3.3 Analiza electrocariotipurilor

► Electrocariotipare prin tehnica FIGE
Electroforeza in camp electric inversat s-a realizat cu ajutorul unui dizpozitiv conceput in
laborator, utilizand agaroza 0,9% (Agarose for Pulsed Field Electrophoresis Running Gel) preparata
in tampon TBE 0,5 X cu un voltaj de 2V/cm. Parametrii electroforezei au fost stabiliti in raport cu
dimensiunea preconizata a cromozomilor ce urmau a fi separati si au fost programati cu ajutorul
unui computer astfel:
-Timpul initial de migrare inainte ( Fwi = 10 sec)
-Timpul final de migrare inainte ( Fwf = 500 sec)
- Pauza pentru directia inainte (Pfw = 1/10 Fwi)
- Timpul de migrare invers ( Rv = 1/3 Fwi)
- Pauza pentru directia invers (Prv = 1/10 Rv)
- Timpul total de migrare = 48 ore

3.4 Izolarea plasmidei 2µ m

In vederea izolarii ADN plasmidial 2 µ m, s-a realizat cultivarea in mediu YPG lichid, cu agitare
magnetica si incubarea timp de 18 ore la 28°C. Din suspensia celulara 1.5 ml au fost centrifugati 6
minute la 7000 rpm. Sedimentul celular obtinut a fost resuspendat prin barbotari succesive in 1 ml
solutie TE-1 si 20 µ l β -mercaptoetanol; 30 min 37°C. Dupa indepartarea  m ercaptoetanolului
prin centrifugare 6 minute la 6500 rpm, sedimentul a fost reluat in solutie CFEM si lyticaza intr-o
concentratie finala de 3mg/ml, urmata de incubare 60 min la 37 °C. Protoplastii astfel obtinuti au
fost sedimentati prin centrifugare 6 minute la 6500 rpm, iar sedimentul rezultat a fost resuspendat in
solutie TEG (15 min. la –20°C) Liza celulara s-a realizat prin adaugarea de solutie II cu pH
12,5, agitarea tubului prin inversare si incubare pe gheata timp de 15 minute. Renaturarea ADN
2 m s-a realizat prin adaugarea a 300 µ l solutie III cu pH 4,8, amestecarea prin inversarea usoara
a tubului si incubare timp de 15 minute pe gheata.
După o centrifugare 12 minute la 12000 rpm deproteinizarea se realizeaza chimic, prin
adaugarea unui amestec cloroform: alcool isoamilic ( 24:1 v/v ) si agitare 10 minute la temperatura
camerei; 8min.7000 rpm. Precipitarea ADN 2µ m s-a realizat prin adaugarea a 0,6 - 1 volum alcool
etilic 100% rece, agitare usoara prin inversarea tubului si incubare 15 minute pe gheata;15 min.
15000 rpm. Sedimentul a fost resuspendat in solutie TE cu pH 8,0 si incubat la 4 °C.
3.5 Analize de restricţie pe ADN mitocondrial
Digestia enzimatica a ADN mitocondrial extras s-a realizat utilizand endonucleazele de
restrictie EcoRV, HindIII, Bgl II, PvuII, AluI, HaeIII, Sau 3A, EcoRI, Hinf I, Pst I.
Volumul final al amestecului de reacţie a fost de 20 µ l, şi a cuprins 2U enzimatice.Timpul de
incubare a fost de 3h la 37°C.
3.6 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Reacţia de amplificare a ADN genomic izolat din tulpinile studiate, s-a realizat cu ajutorul
primerului OPA18 (BIOSEARCH) 50nM, cu secvenţa 5’-AGGTGACCGT- 3’.
3.7 ITS –PCR şi analize de restricţie a ampliconilor obţinuţi (ARDRA)
ADN genomic izolat în etapa precedentă a fost utilizat ulterior şi în reacţia de amplificare
selectivă prin reacţie PCR.
Pentru amplificarea regiunii 5.8S – ITS a ADNr au fost folosiţi primerii ITS1 şi ITS4, ce
permit obţinerea unor ampliconi ce cuprind ambele regiunui ITS .
ITS1 – 5’ - TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’
ITS4 – 5’ - TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’

3.8 Amplificarea şi secvenţierea domeniului D1/D2 ADNr 26S.

Reactia de polimerizare s-a realizat utilizand:
• primerii specifici NL1, NL4 (10µ M) pentru amplificarea domeniilor D1/D2 din ADNr
26S
NL1 (Invitrogen) - 5’GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG 3’
NL 4 (Invitrogen) – 5’ GGT CCG TGT TTC AAG ACG G 3’
În vederea realizării reacţiei de secvenţiere, într-o primă etapă s-a realizat purificarea
ampliconilor cu ajutorul unui kit specializat denumit QIAquick PCR Purification Kit, kit ce permite
purificarea moleculelor de ADN dublucatenare şi monocatenare din reacţii PCR sau alte reacţii
enzimatice. Produsul PCR obtinut conform datelor descrise anterior a fost supus analizei de
secventiere, utilizand aceeasi pereche de primeri oligonucleotidici NL1 si NL4.
4. Evidenţierea potenţialului biotehnologic al tulpinilor studiate

4.1 Testarea activităţii antimicrobiene

Evidenţierea caracterului killer
S-a urmărit testarea caracterului killer al tulpinilor izolate faţă de o tulpină standard sensibilă
la toxina killer: Saccharomyces cerevisiae 17/17 precum şi faţă de tulpinile Candida albicans
ATCC1073 şi Candida parapsilosis CBS604. Drept martor pozitiv a fost folosită tulpina standard
killer Saccharomyces cerevisiae SMR4.
4.2 Determinarea capacităţii de creştere pe substrat lipidic
Testarea activitatii lipolitice
 Evidenţierea activităţii lipolitice a tulpinilor studiate s-a realizat pe medii specifice
suplimentate cu 0,05% Tween 80. Pornind de la compozitia standard a mediului s-au realizat si alte
variante de mediu prin modificarea concentratiei de Tween 80 ( 0.1%, 0.8% sau 1% Tween 80) sau
a clorurii de calciu (0.04%)

5. Studiul genelor implicate în reglajul dimorfismului la drojdii de interes medical

Studiul a fost realizat în colaborare cu Laboratorul Kovać, Departamentul de Biochimie,
Facultatea de Ştiinţele Naturii, Universitatea Comenius, Bratislava, în cadrul unei burse FEMS cu
titlul “Molecular genetic dissection of morphogenesis of the pathogenic yeast Candida
parapsilosis”
Tehnica folosită a fost tehnica PHD, realizându-se supraexprimarea genelor tulpinii Candida
parapsilosis CBS604, în celule diploide de Saccharomyces cerevisiae L5366. Etapele realizării
acestui obiectiv au fost:
- Transformarea chimică a celulelor de drojdie
- Izolarea ADN total din celulele de drojdie transformate
- Electrotransformarea celulelor de drojdie
- Izolarea vectorului YEplac 195 din celule bacteriene de Escherichia coli
- Identificarea genei implicate în morfogeneză, prin analize de secveţiere
- Analize de restricţie a vectorului YEplac 195
- Retransformarea celulelor de Saccharomyces cerevisiae L5366

1.4 Rezultate şi discuţii

Etapa preliminară de izolare a microorganismelor din produse lactate, a condus la izolarea
unui număr de 26 de tulpini de drojdii, ce au fost apoi crioconservate. Studiile ulterioare au implicat
6 dintre aceste tulpini, urmărindu-se caracterizarea lor morfologică, fiziologică şi genetică, în
vederea unei încadrări taxonomice cât mai precise.
Rezultatele studiilor de taxonomie convenţională au condus la încadrarea taxonomică
preliminară a tulpinilor LF în specia Trichosporon beigelii, tulpinile BC şi LC în specia Candida
parapsilosis, CS în specia Kluyveromyces marxianus, iar tulpinile Ri şi BF în specia Saccharomyces
cerevisiae. Analiza statistică a datelor obţinute, a confirmat această încadrare taxonomică, indicând
însă în cazul tulpinilor BC şi LC un grad mic de divergenţă faţă de specia Candida parapsilosis.

T r e e D ia g r a m fo r 1 1 C a s e s T r e e D ia g ra m fo r 1 0 C a s e s
U n w e ig h t e d p a ir - g r o u p a v e r a g e U n w e ig h te d p a ir -g r o u p a v e ra g e
S q u a re d E u c lid e a n d is ta n c e s S q u a r e d E u c lid e a n d is ta n c e s
8 6

7
5
6
4
5
Linkage Distance

Linkage Distance

4 3

3
2
2
1
1

0 0
S .C .1 0 7 S .C .1 0 5 S .C .1 0 4 S .C .1 0 2 S .C .1 0 3 S .C .1 0 1 K _M A R X35 K _M A R X 39 K_M AR X36 R -C S K _M A R X 38
R -B F S .C .1 0 8 S .C .1 1 0 S .C .1 0 6 S .C .1 0 9 K_M AR X41 K _M A R X 40 K _M A R X 42 K_M AR X37 K _M A R X34

Fig.1 Rezultatul analizei fenetice aplicate izolatelor naturale BF şi CS

 Analizele moleculare realizate, au condus la următoarele concluzii :
Protocolul optimizat pentru izolarea şi purificarea moleculelor de ADN cromozomal
poate fi utilizat cu succes, conducând la obţinerea unor extracte ADN optime din punct de vedere al
concentraţiei şi purităţii.

Fig.2Electroforeza în gel de agaroză a

probelor de ADN cromozomal
(Godeuri 1: CS; 2 : LF; 3: BC; 4:Ri; Fig.3 Spectrul de absorbţie al ADN cromozomal izolat
5:LC; 6: BF ) din tulpina BC

Valorile %molGC obţinute pentru tulpinile BC, LC, CS, LF, Ri au fost comparate cu cele
descrise în literatura de specialitate pentru speciile Candida parapsilosis, Kluyveromyces
marxianus, Trichosporon beigelii, respectiv Saccharomyces cerevisiae, observându-se că valorile
obţinute pentru tulpinile studiate se înscriu în limitele descrise pentru speciile de referinţă.

Tab. 17 Valorile % mol GC pentru tulpinile

BC, LC, LF, BF
Tulpina Tm Mol Mol %GC
%GC (formula lui
(formula Frank)
lui
Owen)
70,4 40,03 40.26
BC
70.7 40.65 40.99
LC
71,0 41,28 41.72
CS
81,4 62,91 67.1
LF
71.1 41.48 41.96 Fig.4 Curba de shift hipercromic pentru tulpina LC
BF
 Analiza electrocariotipurilor obţinute prin tehnica FIGE, a arătat numeroase similitudini
între tulpinile BC, LC şi C. parapsilosis sugerând în continuare apartenenţa tulpinilor din izolate
naturale la specia respectivă.

Au fost abordate ulterior analize moleculare ce au implicat moleculele de ADN

extracromozomal.
Acest studiu a indicat, pentru toate tulpinile studiate, absenţa plasmidelor 2µ m/2µ m-like
în celulele de drojdie. Acest rezultat este în concordanţă cu datele existente în literatură, referitoare
la profilul plasmidial al speciilor C. parapsilosis, K. marxianus şi T. beigelii, întărind ipoteza
apartenenţei tulpinilor BC, LC, CS, respectiv LF la aceste specii. S-a considerat faptul că absenţa
plasmidei 2 µ m în cazul tulpinilor BF şi Ri nu exclude încadrarea taxonomică a acestora în specia
S. cerevisiae, fiind cunoscut faptul că prezenţa acestei plasmide este tulpină specifică, regăsindu-se
numai în anumite tulpini de S. cerevisiae.

Fig.5 Electroforeza în gel de agaroză a ADN plasmidial

izolat din (A)1- Saccharomyces cerevisiae D649, 2-BF, 3-Ri ; (B)1-Saccharomyces cerevisiae D649,
2- LC; 3-CS; 4-LF; (C)1- Saccharomyces cerevisiae D649; 2- BC; 3-Ri

În ceea ce priveşte reacţiile de digestie enzimatică a ADN mitocondrial, analiza

profilurilor de restricţie obţinute în urma reacţiilor de digestie enzimatică cu endonucleazele EcoRV
si BglII au arătat că tulpinile LC si BC sunt similare între ele, dar diferite de tulpina de referinţă
Candida parapsilosis CBS 604
Dimensiunile estimate ale fragmentelor de restricţie obţinute pentru cele două tulpini LC si
BC au fost comparate de asemenea şi cu cele corespunzătoare fragmentelor de restricţie ale ADN
mitocondrial de la C. orthopsilosis şi C. metapsilosis, fragmente înscrise într-o bază de date pusă la
punct în laboratorul gazdă.
 S-a observat astfel că tulpinile LC şi BC prezintă de asemenea diferenţe semnificative în
ceea ce priveşte profilurile de restricţie a ADN mitocondrial şi faţă de tulpinile şi C. orthopsilosis, C.
metapsilosis .
Pentru confirmarea rezultatelor obţinute, analizele de restricţie au continuat prin digestia
enzimatică a extractelor de ADN mitocondrial cu endonucleazele Hinf I şi Alu I. Profilurile de
restricţie obţinute în cazul tulpinii C. parapsilosis CBS604 sunt identice celor descrise în literatura
de specialitate ceea ce dovedeşte acurateţea rezultatelor obţinute în urma acestei analize moleculare.
În urma acestor reacţii, a fost confirmat faptul că tulpinile BC si LC sunt similare intre ele,
dar diferite faţă de tulpinile de referinţă C. parapsilosis, C. orthopsilosis (C. parapsilosis Grupul
II) şi C. metapsilosis (C. parapsilosis Grupul III).
Aceste rezultate au fost completate prin abordarea unei noi tehnici de taxonomie moleculară
bazată pe amplificarea unor secvenţe randomice din ADN genomic.
În cazul tulpinilor studiate, într-o etapă premergătoare amplificării, s-a realizat izolarea ADN
genomic din tulpinile luate în studiu, acesta arătând un grad ridicat de integritate şi puritate a
probelor (lipsa contaminării cu ARN).

1 2 3 4 5 6 7

Fig.6 Electroforeza în gel de agaroză a probelor de ADN genomic

(Godeuri 1: c. parapsilosis; 2: BC; 3: LC; 4: CS; 5: LF; 6: Ri; 7: BF)

Ulterior, acesta a fost utilizat în reacţii de amplificare cu ajutorul unui primer randomic –
OPA 18 ce prezintă specificitate pentru genul Candida, fiind cunoscut faptul că, în reacţia RAPD
alegerea unui primer nepotrivit cu ADN-ul sursă, poate duce la lipsa produşilor de reacţie sau la
apariţia unor benzi slabe, greu de interpretat.
Similitudinile dintre profilurile RAPD obţinut pentru tulpinile BC şi LC indică apartenenţa
lor la aceeaşi specie, diferită însă de C. parapsilosis.
Pentru identificarea tulpinilor luate în lucru, utilizând aceleaşi probe de ADN genomic, a fost
realizată amplificarea regiunii ITS1-5.8 S-ITS2, alegând drept primeri perechea - ITS1/ITS4.
Dimensiunea ampliconilor obţinuţi în urma acestei reacţii, corespunde datelor descrise în
literatură, pentru speciile de referinţă Candida parapsilosis, Kluyveromyces marxianus, respectiv
Trichosporon beigelii.
 Tab. 2 Dimensiunea ampliconilor ITS1-ITS2 şi a fragmentelor de restricţie obţinute
în cazul tulpinilor C.parapsilosis CBS 604, BC şi LC

Tulpina Dimensiun Numărul situsurilor de restricţie şi

ea dimensiunea (bp) fragmentelor de
ampliconul restricţie obţinute cu endonucleaza
ui (bp) CfoI Hinf I Hae III Hpa II

C.parapsilo 520/550 1 300;240 1 290;26 1 ~100;4 560

sis CBS604 0 00
BC 520-550 2 210; 2 240; 1 ~100;4 1 2x26
170; 80 150; 00 0
150
LC 520-550 2 210; 2 240; 1 ~100;4 1 2x26
170; 80 150; 00 0
150

Tab. 3 Dimensiunea ampliconilor ITS1-5,8S-ITS2 şi a fragmentelor de restricţie obţinute

în cazul tulpinii CS
Tulpina Dimensiun Numărul situsurilor de restricţie şi
ea dimensiunea (bp) fragmentelor de
ampliconul restricţie obţinute cu endonucleaza
ui (bp) CfoI Hinf I Dde I

CS 740 3 285;190;165; 3 240; 1 140; ~ 600

90 185;
120; 80

În vederea identificării precise a tulpinilor BC şi LC ce s-au dovedit a fi similare, dar diferite

de tulpina de referinţă considerată a fi C. parapsilosis, s-a recurs la secvenţierea parţială a ADNr
26S. Este unanim recunoscut faptul că, secvenţa regiunii D1/D2 ADN 26S r, are un rol important în
taxonomia drojdiilor, secvenţele corespunzătoare multor specii de drojdii fiind deja determinate şi
înscrise în bazele de date.
În urma reacţiei PCR au fost obţinuţi, pentru fiecare din tulpinile luate în lucru, ampliconi
D1/D2 ADNr26S cu dimensiunea de aproximativ 600 bp, rezultatul confirmând datele de literatură
Analiza acestei secvenţe s-a dovedit a fi, şi în acest caz, o metodă rapidă şi acurată de
identificarea a drojdiilor, tulpinile BC şi LC fiind inacadrate taxonomic drept Issatchenkia orientalis.
Deşi în studiul nostru, această tehnică s-a dovedit a furniza cele mai precise rezultate,
considerăm că încadrarea polifazică a microorganismelor poate fi cea mai bună abordare ce conduce
la o identificare adecvată a acestora.
 În urma analizelor morfo-fiziologice, şi de nivel molecular, considerăm oportună încadrarea
taxonomică cu mare probabilitate a tulpinilor CS, LF, BF şi Ri, în speciile K. marxianus, T.
beigelii respectiv, S. cerevisiae. De asemenea semnalăm identificarea de înaltă acurateţe a două
dintre tulpinile din izolate naturale, BC şi LC în specia I. orientalis.

În vederea evidenţierii fenotipului killer cunoscut ca fiind caracteristic numai unui număr
redus de specii, într-o primă etapă s-a realizat testarea potenţialului killer al tulpinilor studiate
folosind drept tulpină standard sensibilă la toxina killer, tulpina S. cerevisiae 17/17.
Rezultatele au fost interpretate comparativ cu cele obţinute în cazul tulpinii martor S.
cerevisiae SRM 4- tulpină standard producătoare de toxină killer (martor pozitiv).

Fig. 7 Evidenţierea caracterului killer al tulpinilor studiate faţă de tulpina standard

sensibilă S. cerevisiae 17/17:
(A) tulpina Ri; (B)tulpina LC; (C) tulpina CS
(D) tulpina BF; (E) tulpina BC; (F) tulpina LF; (G) tulpina S. cerevisiae SMR4

Cu ajutorul unui stereomicroscop 2X, au putut fi puse în evidenţă zonele de inhibiţie

(colorate în albastru deschis) formate în jurul tulpinilor studiate. S-a observat faptul că, toate
tulpinile luate în lucru au manifestat fenotip killer faţă de tulpina sensibilă S. cerevisiae 17/17, o
zonă de inhibiţie mai redusă remarcându-se doar în cazul tulpinii BF.
Rezultatele obţinute ulterior, au arătat de asemenea că, tulpina Candida albicans
ATCC10231 este sensibilă la toxina killer produsă de tulpinile LF şi CS, în timp ce tulpinile BC, CS,
LC, LF şi S. cerevisiae SMR4 manifestă fenotip killer faţă de tulpina Candida parapsilosis CBS 604
 Experimentele următoare, au urmărit testarea activităţii lipolitice a tulpinilor nou izolate
precum şi optimizarea unor condiţii de mediu pentru cultivarea microorganismelor, în scopul
creşterii producţiei de lipaze. Activitatea lipolitică, pe toate substraturile testate, a fost apreciată
prin observarea zonelor de opacitate formate în jurul tulpinilor studiate. Prezenţa acestor zone de
precipitare se datorează formării sărurilor de calciu, insolubile, ale acizilor graşi eliberaţi prin
hidroliza Tween 80 ( ester al acidului oleic).
Rezultatele au fost interpretate comparativ cu cele obţinute pentru tulpinile C. tropicalis, C.
guilliermondii, C. parapsilosis CBS604 şi C. albicans ATCC10231- tulpini considerate potenţial
producătoare de lipaze
În scopul unei mai bune caracterizări a activităţii lipolitice, în cazul tulpinilor din izolate
naturale (BC, LC, CS, BF, Ri, LF) a fost utilizat şi un mediu conţinând 1% Tween 20.

Tab.4 Activitatea lipolitică a tulpinilor studiate pe diverse medii de creştere

Mediul standard de creştere suplimentat cu
Tulpina 0.5% 0.5% 0.1% 0.8% 1%
Tween8 Tween80 Tween8 Tween8 Tween80
0 0.04% 0 0
CaCl2
Candida ++ + + + ++
tropicalis
Candida + + ++ ++ -
guilliermon
dii
Candida + + ++ ++ -
parapsilosis
CBS604
Candida +++ +++ +++ +++ +++
albicans
ATCC10231
BC + - - - -
LC - - - - -
CS - - - - -
BF - - - - -
Ri - - - - -
LF + + + + ++

Tab.5 Activitatea lipolitică a tulpinilor studiate pe mediu suplimentat cu 1% Tween20

Mediul Tulpini
standard de BC LC CS BF Ri LF
creştere
suplimentat
cu
1% Tween - - - - - +++
20
 Fig.8 Zone de precipitare în jurul tulpinii C. albicans ATCC10231 pe mediu
cu 0.5% Tween80 – (A) după 4 zile (B) după 8 zile de incubare

În ceea ce priveşte optimizarea condiţiilor de creştere în prezenţa substratului lipidic,

studiul realizat a urmărit să evidenţieze: 1.capacitatea de creştere a tulpinilor studiate, pe mediu
YNB suplimentat cu diferite substraturi: Tween80, Tween20, Triton X-100, precum şi - 2.influenţa
variaţiei substratului asupra creşterii celulare
Profilurile curbelor de creştere obţinute pentru tulpina C. albicans ATCC10231, sunt similare
celor descrise în literatura de specialitate, confirmând astfel acurateţea metodei alese.

Fig.9 Influenta variatiei substratului asupra cresterii celulare

in cazul tulpinii Candida albicans ATCC10231

Dintre toate tulpinile aparţinând genului Candida tulpina C. parapsilosis CBS 604 a
înregistrat cea mai importantă creştere utilizând drept substrat Tween20. În ceea ce priveşte tulpinile
nou izolate, cel mai spectaculos caz a fost cel al tulpinii LF, ce a prezentat încă din primele 24h,
capacitate de creştere preferenţială pe mediu YNB suplimentat cu Tween 20. Aceste date confirmă
rezultatele anterioare ce au evidenţiat capacitatea degradativă a acestei tulpini în prezenţa
substratului lipidic Tween20.
 Variind concentraţia substratului testat, exceptând C. parapsilosis CBS604, tulpina LF
prezintă rata cea mai mare de creştere în prezenţa substratului lipidic fie el Tween20 sau Tween80,
fapt ce indică această tulpină ca având capacităţi degradative deosebite.
S-a stabilit astfel că unele dintre tulpinile testate prezintă unele particularităţi fiziologice ce
le indică drept potenţiale candidate pentru utilizarea lor ca tulpini cu aplicabilitate probiotică,
urmând a fi realizate şi alte studii care să întărească această ipoteză
Într-un studiu final, fost urmărit un alt aspect al implicării drojdiilor în viaţa omului, cel al
patogenităţii. Scopul experimentelor realizate, l-a constituit identificarea unor gene implicate în
morfogeneză la specia C. parapsilosis, cunoscută ca fiind a doua specie patogenă pentru om, după
C. albicans.
Parcurgând tehnica “PHD screen”, într-o primă etapă a fost realizată transformarea chimică a
celulelor de drojdii cu vectorul YEplac195 în care se afla construită biblioteca de gene a tulpinii C.
parapsilosis CBS 604.
În total, în urma transformării celulelor de S. cerevisiae L5366 cu vectorul YEplac195 şi
testarea acestora pentru formarea de pseudohife, pe mediu SLAD – sărac în sursă de azot, au fost
analizate microscopic un număr de 4 000 de clone. Acestea reprezintă aproximativ 5% din
biblioteca de gene de la C. parapsilosis CBS604 construită în vectorul Yeplac 195. Dintre acestea,
100 de clone au format pseudohife pe mediu sărac în sursă de azot. Prin retestare pe mediu SLAD,
numai un număr de 22 de clone au prezentat fenotip stabil
Într-o etapă ulterioară s-a realizat izolarea de ADN total, din toţi cei 22 de transformanţi.
Acesta a fost utilizat apoi, în experimentele de electroporare a celulelor competente de
Escherichia coli. Transformanţii bacterieni astfel obţinuţi, au fost însămânţaţi pe mediu LB cu
ampicilină, realizându-se astfel selecţia clonelor ce au primit gena de rezistenţă la ampicilină de la
nivelul vectorului YEplac195.
S-a realizat apoi izolarea ADN plasmidial din celulele bacteriene electrotransformate, iar
integritatea moleculelor de ADN plasmidial obţinut a fost verificată electroforetic, folosind ca
marker de greutate moleculară vectorul Yeplac 195
Din analiza gelului de electroforeză s-a putut observa prezenţa, în cazul unora dintre
transformanţi, a unor molecule de ADN plasmidial de dimensiuni comparabile cu cele ale vectorului
YEplac195 lipsit de insert. Astfel de molecule au fost omise din experimentele ulterioare de
retransformare a celulelor de S. cerevisiae L5366. In urma retransformării celulelor de S.
cerevisiae L5366 cu molecule de ADN plasmidial, s-a observat faptul ca doar unul dintre
transformanţi (notat T46) a prezentat stabilitate fenotipica (formare de pseudohife) pe mediu selectiv
SLAD.
Ulterior ADN plasmidial izolat din transformantul T46, a fost investigat prin analize de
restricţie ce au condus la estimarea dimensiunii insertului la 3 kb, precum şi prin analize de
secvenţiere.
În urma comparării secvenţei obţinute în bazele de date, cu ajutorul programului BLAST, a
fost observat un grad înalt de omologie (81.62%) cu gena WAP1 de la C. albicans. Această genă
denumită CpWAP1, codifică pentru o proteină de suprafaţă celulară localizată la nivelul
pseudohifelor.
1.5 Concluzii
► În urma analizelor morfo-fiziologice, şi de nivel molecular, considerăm oportună
încadrarea taxonomică cu mare probabilitate a tulpinilor studiate, după cum urmează: CS -
Kluyveromyces marxianus, LF – Trichosporon beigelii respectiv; BF şi Ri - S. cerevisiae. De
asemenea semnalăm identificarea de înaltă acurateţe a două dintre tulpinile din izolate naturale, BC
şi LC în specia Issatchenkia orientalis.
► Tulpinile studiate, dintre care s-au remarcat LF şi CS, prezintă unele particularităţi
fiziologice ce le indică drept potenţiale candidate pentru utilizarea lor ca tulpini cu aplicabilitate
probiotică, urmând a fi realizate şi alte studii care să întărească această ipoteză
► In ceea ce priveste morfogeneza speciei Candida parapsilosis, studiul realizat reprezintă
o premieră, gena CpWAP1, fiind prima genă izolată şi caracterizată ca fiind implicată în tranziţia de
la forma unicelulară la cea filamentoasă, în cazul speciei C.parapsilosis.