Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
PARTEA a-II-a
7. Material şi metodă...............................................................................................
8. Determinări biochimice.........................................................................................
8.1 Determinarea activităţii transaminazelor...........................................................
8.2 Determinarea activităţii lactatdehidrogenazei......................................................
8.3 Determinarea activităţii glutaminazelor.....................................................
8.4 Determinarea activităţii glutamat-dehidrogenazei..................................................
9. Interpretarea datelor de laborator..........................................................................
10. CONCLUZII.....................................................................................................
BIBLIOGRAFIE
Capitolul 1.
1
DATE DE ANATOMIE ŞI HISTOLOGIE.
FUNCŢIILE FICATULUI.
Ficatul este un organ parenchimatos care are in acelasi timp functii metabolice si
de glanda exocrina. Este cea mai mare glanda din organism aflata in loja subfrenica
dreapta, in etajul supramezocolic.
Prezinta doua fete: superioara (facies diaphragmatica) si inferioara (facies visceralis),
despartitein portiunea lor anterioara printr-o margine inferioara (margo acutus).
Posterior , cele doua fete se continua una cu cealalta, fara o limita clara printr-o margine
rotunjita (margo obtusus).
Fata superioara este convexa si este impartita in doi lobi de un ligament peritoneal
antero-posterior denumit ligamentul falciform. Delimitarea celor doi lobi este intregita
pe fata inferioara de santul sagital stang. Fisura segmentara dreapta imparte lobul drept
intr-un segment anterior si unul posterior iar lobul stang intr-un segment median si altul
lateral.
Din punct de vedere histologic ficatul este alcatuit din:
Celule in majoritate de origine epiteliala -numite hepatocite care intra in structura
lobulului hepatic. Ele sunt dispuse sub forma de lame sau placi celulare perforate,
ramificate si anastomozate.
tesut conjunctiv in proportie redusa.
2
intra placile de hepatocite cu dispozitie radiara si anastomozate. Intre placi exista
capilarele sinusoide care sunt si ele anastomozate.
Pe o sectiune transversala, lobulul are forma de poligon, de regula cu 6 laturi. In
colturile sale, la locul de vecinatate cu ceilalti lobuli exista un spatiu interlobular redus
numit spatiu portal Kiernan. In sectiunea transversala, placilor celulare le corespund
cordoane celulare al caror aspect variaza cu varsta individului. La adult grosimea unui
cordon este egala cu diametrul unui hepatocit cu exceptia locurilor de anastomoza.
Pe sectiune longitudinala fiecare cordon este gros de cel putin 2 randuri de
celule, intre celule existand canaliculii biliari.
La periferie exista placa terminala care corespunde hepatocitelor de la periferia
lobulului. Hepatocitele din placa terminala vor forma un perete aproape continuu,
strabatut doar de vasele sangvine si de ductele biliare.
Spatiile interlobulare, portale Kiernan contin 3 elemente care alcatuiesc triada
portala:
1. o vena interlobulara, ramura terminala a venei porte
2. o artera interlobulara, ramura terminala a a. hepatice
3. un canal biliar interlobular
Lobulul portal Sabourin
Lobulul portal repreazinta aria din parenchim a carei bila este tributara aceluiasi
canalicul biliar interlobular. El are forma de triunghi, avand in centru spatiul portal si in
varfuri trei vene centrolobulare de la trei lobuli clasici diferiti.
3
In zona 1 se afla hepatocitele care primesc sangele cu cel mai mare procent de
oxigen, fiind aproape de artera perilobulara. Aceste hepatocite au urmatoarele
caracteristici:
sunt cele mai active metabolic
sunt primele care vor depune glicogen postprandial
sunt primele care se vor activa in hipoglicemie si vor produce glicogenoliza si
gluconeogeneza
sunt primele care vor semnala aparitia semnelor de regenerare in caz de leziuni
hepatice
fiind localizate cel mai aproape de vasul sangvin sunt primele supuse actiunii
toxinelor absorbite din tubul digestiv
In zona 3 hepatocitele sunt supuse si ele actiunii toxinelor insaintr-o proportie
mai mica. Aici ajunge sangele cu continutul cel mai mic de oxigen. De aceea in
ischemie, primele care sufera sunt celulele din zona 3 (celulele din vecinatatea venei
centrolobulare).
In zona 2 celulele au caracteristici intermediare celorlalte doua zone.
Hepatocitele
Reprezinta 80% din totalitatea celulelor de la nivelul ficatului. Ele au forma
poliedrica si diametru de 20-30 m. Durata de viata este de aprox. 150 de zile.
Examinarea la MO arata:
Nucleul este mare, rotund, situat central, eucromatic, avand 1-2 nucleoli.
Hepatocitele pot fi uni- sau binucleate, cele mai multe fiind uninucleate. Frecvent (la
80% din hepatocitele uninucleate) se observa poliploidia, cea mai frecventa fiind
diploidia insa. Prin urmare si volumul nucleului variaza.
25% din hepatocite sunt binucleate. Raportul intre celulele uninucleate si
binucleate se modifica cu varsta (se mareste o data cu inaintarea in varsta) si in timpul
proceselor de reparare dupa agresiuni.
Citoplasma este eozinofila, fin granulara cu granule bazofile care alcatuiesc
corpii Berg (ce se vad in ME) si care sunt aglomerari de RER.
Au un continut mare de incluziuni de glicogen si de lipide, prin urmare, in HE,
au un aspect vacuolar.
4
Cu albastru de toluidina citoplasma se coloreaza albastru iar granulele de
glicogen se coloreaza metacromatic in grena.
Lipidele se gasesc la periferie si se evidentiaza cu osmiu, cand apar negre.
Examinarea la ME
La ME, hepatocitul apare ca o celula polarizata.
Hepatocitul are trei tipuri de suprafete:
suprafata care vine in contact cu capilarul sinusoid, numita suprafata sinusoidala
sau pol vascular
suprafata care vine in raport cu alte hepatocite si delimiteaza pe o anumita distanta
un spatiu intercelular (canaliculul biliar intralobular), numita suprafata biliara sau
pol biliar
suprafata care vine in raport cu celelalte hepatocite dar nu delimiteaza nici un spatiu
intre ele, celulele fiind unite prin jonctiuni. Aceasta suprafata se numeste suprafata
intercelulara.
Reticulul endoplasmic rugos sau granular
Tinde sa se localizeze la polul vascular. El asigura procesele de sinteza a
proteinelor de export hepatice - majoritatea proteinelor din plasma: factori ai coagularii,
lipoproteine, albumine, globuline.
Reticulul granular se caracterizeaza prin prezenta de granule electrono opace de
suprafata, vare sunt de fapt particule de ribonucleoproteine, numite ribozomi. Ribozomii
pot aparea liberi in citoplasma , grupati cate 5, 6 pana la 20. Unii dintre ei participa la
sinteza tuturor proteinelor intramembranare sau de export.
Reticulul granular este format din cisterne , acoperite de o membrana de
grosimea 80Å, mai numeroase in vecinatatea nucleului, aparatului Golgi, zonele
pericanaliculare si sinusoidale. Reticulul endoplasmic granular intervine in sinteza si
secretia materialelor proteice, inclusiv albumina si lipoproteinele cu densitate foarte
joasa. Pe langa functia de sinteza proteica reticulul endoplasmic granular este sediul
unei activitati enzimatice.
Dupa sinteza proteinele trec prin aparatul Golgi iar apoi sunt exocitate direct,
deoarece secretia este continua la nivelul hepatocitului. Prin urmare nu exista granule de
secretie.
5
Este dispersat in toata citoplasma. El contine seturi enzimatice necesare pentru
procesele de catabolism si pentru procesele de sinteza. REN participa in:
metabolismul glicogenului
sinteza colesterolului
procesele de detoxifiere si inactivare.
Procesele de detoxifiere si inactivare se bazeaza pe reactiile de oxidare si de
conjugare. Aici se inactiveaza o mare parte din medicamente: anticonvulsive, h. steroizi,
chimioterapice, antihistaminice. Atunci cand creste cantitatea de medicamente creste si
activitatea enzimatica de la nivelul REN si prin urmare forma organitelor variaza in
functie de necesitatile metabolice ale organismului. Aceste modificari sunt de aspect si
sunt reversibile datorita interventiei lizozomilor.
REN participa la formarea bilei prin:
enzimele care realizeaza conjugarea acizilor biliari: acidul glicocolic si acidul
taurocolic
enzimele care realizeaza conjugarea bilirubinei cu acidul glucuronic.
Mitocondriile
Sunt rotunde sau ovale, in numar de peste 1.000 mitocondrii / celula. Continutul
in mitocondrii difera, la periferia lobulului hepatocitele avand mai multe mitocondrii.
Sunt organitele celulare cu cea mai mare importanta. Acestea au un bogat
echipament enzimatic, la acest nevel fiind localizata activitatea metabolica. Matricea
mitocondriala dispune de cca 16 enzime printre care enzimele ciclului acizilor
tricarboxilici, enzime de oxido reducere, enzime implicate in oxidarea acizilor grasi, etc.
Pe fata externa a membranei interne este localizata glutamic –oxalat transaminaza; tot
pe membrana interna exista si citocromul c si enzimele respiratorii. La nivelul
membranei externe sunt localizate citocromul b5 si monoaminoxidaza; in spatiul
intermembranar exista adenilat kinaza iar glutamic dehidrogenaza se afla localizata la
nivelul matricei.
Aparatul Golgi
Se acumuleaza la nivelul polului biliar al hepatocitului. Acesta pare ca un
organit multiplu. Exista de fapt un singur aparat Golgi care se ramifica si da nastere la
50 de aparate Golgi in fiecare celula. El are mai multe roluri:
definitivarea sintezei si excretia proteinelor plasmatice
6
formarea lipoproteinelor
formarea lizozmilor din hepatocit
Lizozomii
Sunt localizati spre polul biliar. De aceea se mai numesc si corpi peribiliari.
Exista lizozomi primari, secundari si tertiari. Ei contin enzime prin care catabolizeaza
diverse substante exogene si organite celulare perimate pana la molecule mici care vor
fi utilizate pentru noi sinteze. Prin urmare lizozomii participa la mentinerea integritatii
parenchimului hepatic.
Peroxizomii
Peroxizomii apar rar in hepatocit comparativ cu celelalte organite, cu precadere
la polul biliar, in apropierea incluziunilor de glicogen. Ei contin enzime oxidative,
enzima marker a acestora fiind catalaza. Sunt implicati in mai multe procese:
procesul de gluconeogeneza
metabolismul purinelor - metabolizeaza adenina si guanina la acid purinic
metabolismul alcoolului - oxideaza etanolul la acetaldehida
in -oxidarea acizilor grasi cu lant lung de atomi de carbon.
Incluziunile de glicogen
Sunt mai numeroase in hepatocitele de la periferia lobulului hepatic. Aspectul
lor variaza in functie de ritmul diurn si de starea de nutritie a individului: dupa o masa
bogata in glucide numarul lor creste. Au caracter tranzitoriu: apar dupa mese si dispar
dupa un anumit timp.
Incluziunile lipidice
Numarul lor creste in trimestrul al II-lea de sarcina, in lactatie. In etilism cronic,
hepatocitele se incarca cu picaturi lipidice, mai ales cele din zona centrolobulara. Mai
apoi se incarca toate hepatocitele.
Pigmenti
In hepatocitul in stare normala se gasesc rareori pigmenti endo- sau exogeni:
- lipofuscina = pigment fluorescent brun galben care apare in hepatocit in urma uzurii
si procesului senescentei se acumuleaza in ficat in conditiile unei malnutritii sau ale
bolilor casectizante;
- hemofuscina = pigment cu structura apropiata lipofuscinei care se depune sub forma
de granule galben clare, atat in celulele Kupffer, cat si in hepatocitele ficatului bogat in
hemosiderina. Hemofuscina nu da reactie pozitiva pentru fer.
7
- ceroidul este un pigment granular brun portocaliu, fluorescent colorabil in rosu aprins
cu Sudan. Este prezent in necroza ischemica si ciroza hepatica. E localizat in celulele
mezenkimale.
8
microfilamente de actina care circumscriu canalicului bilar si asigura prin contractie
modificarea diametrului acestuia.
Celulele perisinusoidale sunt:
celula Ito
celula “pit”
Ambele celule sunt asemanatoare cu celulele hematopoietice. Ele au acest rol
(hematopoietic) in viata fetala si in caz de anemii cronice la adult.
Celulele “pit”
Se pot identifica doar la ME. Sunt mai rare. Ele sunt asemanatoare cu celulele
endocrine: in citoplasma au numeroase granule electronodense cu diametrul de 300 nm.
De aceea, initial s-a considerat ca au rol endocrin. Acum sunt considerate o varietate de
limfocite circulante, fiind niste limfocite mari, cu granulatii si activitate de killer.
9
Tesutul conjunctiv
La un ficat normal, tesutul conjunctiv este in cantitate mica. El se gaseste in
capsula organului si in hil de unde trimite prelungiri care insotesc vaselel si ductele
biliare pana in spatiile interlobulare Kiernan.
Tesutul conjunctiv se continua in lobulul hepatic sub forma fibrelor de reticulina
din spatiile Disse. Ele pot forma la nivelul lobulului hepatic stroma conjunctiva care
asigura mentinerea deschisa a capilarelor sinusoide.
Ficatul are o mare putere de regenerare. Are loc atat hiperplazia (cresterea in
numar) cat si hipertrofia (cresterea in volum) a celulelor restante. La sobolan, ficatul
este regenerat in proportie de 75% in decurs de o luna.
Daca agresiunea la nivelul ficatului creste, creste si cantitatea de tesut conjunctiv
si apare fibroza hepatica care debuteaza la nivelul spatiilor portale. Se vor forma in
acest caz noi septuri conjunctive cu o orientare aleatorie fata de componentele
parenchimului hepatic care vor impiedica raportul normal al hepatocitelor cu capilarele
sinusoide si cu canaliculii biliari. De asemenea, aceste septuri conjunctive vor diminua
hiperplazierea hepatocitelor care vor fi comprimate si se vor forma niste pseudonoduli.
Tulburari ale nutritiei hepatocitului pot fi cauze ale cresterii cantitatii de tesut
conjunctiv. Prin modificarea raportului normal intre hepatocit si capilarul sangvin se
produce dezorganizarea parenchimului hepatic.
Vascularizatia ficatului
10
Ultimele ramificatii ale v. porte sunt capilarele sinusoide care se gasesc intre
hepatocite in timp ce ultimele ramificatii ale arterei hepatice sunt capilarele a. hepatice
ce se gasesc in spatiile portale. Ele se vor deschide in capilarele sinusoide, deci
capilarele sinusoide vor contine sange venos amestecat cu sange arterial. Circulatia
sangelui in capilarele sinusoide se face de la periferia lobulului spre centru si apoi ale se
varsa in vena centrolobulara.
Capilarele sinusoide prezinta un endoteliu discontinuu care are raport cu lamina
bazala, ce contine fibre de reticulina care formeaza o retea laxa in jurul endoteliului
capilar. Peretii capilarului sinusoid nu formeaza o adevarata bariera morfologica intre
hepatocit si sange, existand si raporturi directe intre cele doua compartimente, fapt care
face ca schimburile sa fie foarte usoare.
Capilarele sinusoide au un diametru mare, de 30-40 m. Celulele capilarelor
sinusoide sunt:
celulele endoteliale - sunt celule alungite, cu nucleu turtit, care proemina spre
lumen. Celulele au putine organite insa au fenestre care sunt grupate, neacoperite de
diafragme, vezicule de pinocitoza, ceea ce denota o activitate intensa pentru
enzimele de transport.
celulele Kupffer - deriva din monocitele circulante se pot insa divide. Sunt localizate
la jonctiunea dintre doua capilare sinusoide si proemina spre lumen. Nu realizeaza
jonctiuni cu celulele endoteliale. Au forma stelata, au nucleu eucromatic si prezinta
mai multe organite decat celulele endoteliale. Au urmatoarele caracteristici:
Au organite implicate in sinteze (RER, mitocondrii) deoarece aceste celule
sintetizeaza o parte din proteinele de export ale ficatului
Celulele Kupffer intervin si in imunitate prin capacitatea lor de a fagocita.
Ele fagociteaza pigmenti, eritrocite imbatranite sau denaturate care nu au
fost distruse in splina. In caz de splenectomie, aceste celule devin foarte
importante.
Au receptori pentru imunoglobuline si complement
Secreta citokine: IL-1
11
Vascularizatia limfatica
Este foarte bine dezvoltata extralobular. Vasele limfatice se gasesc:
in capsula ficatului (foarte multe)
in septurile conjunctive
nu se vad capilare limfatice la nivelul lobulului hepatic.
Originea limfei este in spatiile Disse. O parte din substantele de la acest nivel,
care nu patrund in capilarele sinusoide trec in spatiul Mall (spatiul dintre hepatocitele
din placa limitanta si tesutul conjunctiv portal) si de aici ajung in spatiul Kiernan unde
vor forma capilarele limfatice.
Circulatia bilei
La acest proces participa hepatocitele si celulele Kupffer. Bila circula de la
centrul lobulului spre periferie. Canalele prin care circula bile pot fi:
intrahepatice:
intralobulare
canaliculele biliare
canaliculele (pasajele) Hering
extralobulare
canalele biliare perilobulare
canalele biliare interlobulare
canalele hepatice lobare (drept si stang)
extrahepatice
canalul hepatic comun
canalul cistic
canalul coledoc (format din unirea canalului hepatic comun cu canalul cistic)
Canaliculii biliari
Reprezinta componenta initiala a sistemului canalicular. Nu au pereti proprii ci
sunt delimitate de membranele a doua hepatocite invecinate. La MO apar ca niste mici
cavitati. Folosind impregnarea argentica Gomori, se vede ca aceste canalicule alcatuiesc
o retea.
12
Pasajele Hering
Fac jonctiunea intre canaliculii biliari si canalele extralobulare. Reprezinta
portiunea de canalicul biliar aflata la nivelul placii limitante. Ele au perete propriu
format dintr-un epiteliu simplu cubic inconjurat de fibre de reticulina.
Caile biliare extralobulare
Au un perete format dintr-un epiteliu asezat pe o MB care este inconjurata de un
strat de tesut conjunctiv bogat in fibre elastice. Epiteliul poate fi simplu cubic sau
simplu cilindric cu microvili.
Caile biliare extrahepatice
Prezinta un perete format din mucoasa, musculara si adventice.
Mucoasa contine un epiteliu simplu cilindric cu celule secretoare de mucus si un
corion in care se gasesc fibre elastice, infiltrat limfoid si glande tubuloacinoase de tip
mucos.
Canalul cistic prezinta in mod particular numeroase pliuri spiralate ale mucoasei
care au un ax muscular. Acestea se numesc valvele spiralate Heister.
Canalul coledoc prezinta si el cateva particularitati:
in epiteliu contine celule care secreta somatostatina.
musculara este initial discontinua. Musculara devine apoi continua si se ingroasa
pentru a forma sfincterele Boyden si Oddi. Musculara se ingroasa deci inainte de
unirea cu canalul Wirsung si formeaza aici sfincterul Boyden. Musculara se ingroasa
din nou la varsarea ampulei Vater in duoden si formeaza aici sfincterul Oddi.
13
Ficatul depoziteaza molecule de tipul glicogenului, lipide complexe, unele proteine”de
rezerva”, fer sub forma de feritina, cupru sub forma de hepatocuprina vitamina B12,
vitaminele liposolubile A,D,E,K;
d) functia antitoxica
Mecanismele antitoxice cuprind in special conjugarea si modificare structurii diferitelor
molecule endo-sau exogene prin oxido-reducere, hidroxilare;
e)functii legate de metabolismul intermediar
f)functia de aparare antiinfectioasa si proimunologica
g) functia de regenerare
h) functia de termoreglare
i) functia de biliogeneza.
14
Capitolul 2.
15
numerosi compusi (artificiali dar si naturali) care au gust dulce fara a fi glucide.
Acestia constituie grupul indulcitorilor artificiali sau edulcoranti. Acestia au o
denumire chimica (IUPAC), una biochimica (comuna, frecvent folosita) precum si
una apartinand nomenclaturii aditivilor alimentari (asa zisele E-uri). Indulcitorii
artificiali sunt denumiti E900-E999.
Compusi toxici cu gust dulce ca de exemplu acetatul de plumb Pb(C2H3O2)2 . Acesta
a fost folosit o perioada indelungata in istorie ca indulcitor artificial. Romanii
fierbeau mustul in vase de plumb pentru a obtine un sirop in a carui compozitie e
posibil sa se fi gasit si acetat de plumb. In prezent este interzis datorita efectelor
neurotoxice si posibil carcinogene.
Edulcorantii artificiali ca si cei naturali prezinta avantajul major de a fi libere de calorii
sau au foarte putine putand fi folosite de catre persoanele cu diabet, obezitate,
predispozitie genetica spre cariogeneza etc.
Unele dintre ele sunt substante potential toxice (dozajul trebuie foarte atent controlat)
sau insuficient studiate sub prisma efectelor carcinogene sau teratogene. Efecte adverse
apar la consum exagerat.
Principalii edulcoranti artificiali sunt: acesulfam K(E 950), aspartam (E951),
ciclamatii (E952) si zaharina (E954).
16
Exista insa si edulcoranti naturali extrasi din diverse plante. Statutul acestora
difera de la tara la tara ( indulcitori/aditivi sau suplimente alimentare). Principalii
indulcitori naturali sunt:
• Osladina - este extrasa din rizomii plantei Polypodium vulgare
• Steviozinul - este extras din frunzele plantei Stevia Rebaudiana
• Taumatina (E 957) - este extrasa din fructul plantei Thaumatocus Danielli ("fructul
miraculous de Sudan"),
• Curculina - este o proteina extrasa din fructele de Curculigo latifolia si are putere de
indulcire aprox. 550,
• Glicirizina - se extrage din radacina plantei Glycyrrhiza glabra (lemn dulce) si are
putere de indulcire aprox. 50
• Brazeina - substanta de natura proteica, extrasa dintr-o planta care creste in vestul
Africii si are putere de indulcire aprox. 2000 si numeroase altele.
Figura 2.1.2 Steviolul - sta la baza celor doi glicozizi din Stevia: steviozidul si
rebaudiozid
Oricare ar fi ei, edulcorantii nu copie fidel gustul zaharozei de aceea in unele cazuri se
folosesc impreuna cu aceasta.
Glucoza este glucidul cu cea mai mare importanta in alimentatia omului. In
afara rolulului energetic mai este folosita pentru sinteza mai multor compusi deosebit
de importanti ca de exemlu:
- acizii uronici folositi in sinteza proteoglicanilor si eliminare a unor compusi toxici
endogeni sau exogeni
- fructoza utilizata in sinteza nucleotidelor si ulterior a acizilor nucleici,
- NADPH necesar sintezelor reductive;
- acetil Co A si gliceroluul utilizati pentru sinteza lipidelor;
- amioacizi neesentiali, purine, pirimidine si porfirine.
17
Utilizarea glucozei drept substrat energetic presupune parcurgerea glicolizei
(degradare anaeroba incompleta pana la lactate sau piruvat) si a ciclului Krebs
(degradare completa a acestor produsi intermediari pana la CO2, apa si ATP ).
Postprandial, moment caracterizat de abundenta substratelor energogene,
glucoza va fi transformata in piruvat si apoi oxidata terminal in ciclul Krebs, pentru
asigurarea resurselor energetice ale organismului. Cu precadere in ficat glicoliza se
poate desfasura exclusiv in vederea obtinerii elementelor de constructie a
trigliceridelor care vor fi depozitate in tesutul adipos.
Transformarea glucozei in triacilgliceroli, fosfolipide si glicerol are loc atunci cand este
depasita capacitatea de depozitare a acesteia in ficat sub forma de glicogen.
In perioada interprandiala sau in timpul unui efort intens fizic sau intelectual
glucoza continua sa reprezinte principalul substrat energetic doar pentru tesuturile
glucodependente; in acest caz glucoza este asigurata prin glicogenoliza si
gluconeogeneza hepatica.
Orice cale de metabolizare ar urma glucoza necesita in mod obligator un proces
de fosforilare, conditie necesara ramanerii in celula.
Acest proces este o reactie ireversibila, catalizata de hexochinaze care se desfasoara in
prezenta ATP-ului ca donor de grupare fosfat.(reactie 1)
Glucokinaza este izoenzima majora in ficat si actioneaza exclusiv asupra
glucozei. Ea este activa doar in conditiile unui aport masiv de glucoza, care depasind
nevoile de moment ale organismului, va fi depusa dupa conversia la glucozo-6-fosfat
ca glicogen, mentinandu-se astfel glicemia la valori normale.
Glucozo-6-fosfatul este metabolizat in ficat pe urmatoarele cai:
- 55% este hidrolizat la glucoza,
- 25% este catabolizat pe cale Embden-Meyerhoff (glicoliza)
- 18% contribuie la sinteza glicogenului,
- 2 % este metabolizat pe calea pentozo- fosfatilor.
18
Oxidarea glucozei la piruvat presupune parcurgerea glicolizei (calea Embden-
Meyerhoff).
In conditii aerobe piruvatul rezultat este convertit la acetil CoA antrenata ulterior
inciclul Krebs si oxidat pana la CO2.
19
Figura 2.1.4 Ciclul Krebs (al acizilor tricarboxilici) constituie calea comuna de
degradare a pricipalelor substrate energetice (gucide, lipide, protide)
20
In conditii de anaerobioza piruvatul este redus la lactat.
Glicogenul reprezinta forma de depozitare a excesului de glucoza la care se
apeleaza in momentul in care nevoile o cer. Glicogenul se depoziteaza in ficat 6% din
greutatea corporala si in muschi 1% din greutatea corporala. Doar rezervele hepatice
pot fi folosite in scopul eliberarii glucozei si mentinerii glicemiei la valori normale,
pe cand cel muscular este folosit doar pentru obtinerea de energie in muschi.
Rezervele hepatice scad dramatic dupa o perioada de 12-20 de ore de post. Rezervele
se refac in faza anabolica.
Intrarea glucozo-6-fosfatului in glicoliza este exclusa in faza catabolica, datorita
glucagonului care produce scaderea concentratiei fructozo2, 6 bifosfatului activator al 6
fosfo- fructo- 1 kinazei si inactivarea piruvat kinazei prin transformarea acesteia in
forma fosforilata inactiva.
21
Figura 2.1.5 Calea pentoz fosfatilor- Schema
22
Figura 2.1.6 Gluconeogeneza hepatica- schema
23
foloseste substrat aminoacizi glucoprimatorri, lactat, glicerol si- dupa date mai recente –
chiar si acetona. Procesul consta in principiu in parcurgerea in sens invers a etapelor
glicolizei cu mentiunea ca trei dintre acestea sunt catalizate de enzime unidirectionale
proprii. Prin urmare ficatul contribuie la homeostazia glicemica prin intermediul acestor
doua procese de glicogenoliza si gluconeogeneza.
Dintre toti nutrientii introdusi zilnic prin alimentatie, proteinele (in special cele
bogate in aminoacizi esentiali) sunt cele mai importante îndeosebi în perioada de
creştere. Ficatul joacă un rol important in metabolismul proteic, fiind sediul principal de
degradare a aminoacizilor precum si locul de biosinteza a proteinelor. Rolul crucial
jucat de ficat in metabolismul proteic este dovedit şi de faptul că în stările patologice
caracterizate de alterarea severa a funcţiei hepatice (ciroza ) celelalte metabolisme
(lipidic si glucidic ) nu sunt atât de puternic perturbate. Cantitatea de aminoacizi liberi
existentă la un moment dat in organism constituie fondul de aminoacizi.
24
1. Dezaminarea
2. Incorporarea NH3 in uree in vederea eliminarii acestuia din organism prin procesul
de ureogeneza
3. Descompunerea scheletului de carbon al aminoacizilor la intermediari metabolici
comuni.
Dezaminarea oxidativa se face printr-o reactie de transaminare urmata de una de
dehidrogenare, in care intervine enzima glutamat dehidrogenaza NADH dependenta.
Amoniacul rezultat este transformat in uree, produs hidrosolubil care este preluat de
sange si eliminat prin urina.
Ureea se formeaza in urma unei succesiuni de reactii (mitocondriale si citosolice)
cunoscute sub numele de Ciclul Krebs- Henseleit sau ciclul ureogenetic.
Aminoacizii sunt folositi la sinteza a numerosi compusi cu functii variate ca de
exemplu:
- sinteza hemului
- nucleotide si sinteza ADN
- compusi de conjugare
- amine endogene (histamina,serotonina, GABA, etc) cu rol de neuromediatori
- hormoni peptidici
- enzime.
Biosinteza hemului are loc cu precadere in celulele sistemului eritroformator din
maduva, ficat, splina. Procesul cuprinde urmatoarele etape:
- sinteza acidului delta aminolevulinic din succinilCoA- etapa mitocondriala
- sinteza porfobilinogenului - in citosol
- formarea protoporfirinei IX,
-coordinarea ionului la molecula de protoporfirina IX, cu formarea hemului.
25
preferata de energie a unor organe ca miocard si mushi scheletici. In anumite conditii
patologice (diabet zaharat, inanitie) creierul poate folosi ca sursa de energie corpii
cetonici proveniti din acizii grasi.
26
unui pranz bogat in lipide, acizi grasi superiori , in diabet, inanitie si dupa administrarea
unor medicamente.
Cetogeneza
27
Biosinteza acizilor grasi
28
Figura 2.3.1 Complexul multienzimatic al sintetazei acizilor grasi
29
panteteinei la gruparea cys- SH vecina. Gruparea Pant-SH este incarcata cu o noua
grupare malonil si sunt reluate reactia de condensare si celelalte reactii formandu-se un
alt acid gras intermediar. Ciclul de elongare se repeta pana la formarea acidului
palmitic.
8) eliberarea prin hidroliza, sub actiunea tioesterazei, a acidului palmitic care printr-o
inhibitie feed-back inchide procesul.
Biosinteza colesterolului
Ficatul este atat furnizorul major de colesterol pentru tesuturile extrahepatice cat si locul
de tranzit al colesterolului in vederea excretiei.
In sinteza colesterolului se porneste de la acetil CoA ce poate fi obtinuta din glucoza,
acizi grasi si din catenele anumitor aminoacizi. Biosinteza colesterolului are mai multe
etape:
1) formarea de hidroxil-metil-glutaril-CoA (HMG-CoA) din acetil coA
2) transpunerea HMG-CoA in izopren biologic activ
3) condensarea a 6 unitati izoprenice cu formarea unee molecule cu 30 at de C numita
scualen.
4) ciclizarea scualenului si formarea primului compus stersidic, lanosterol.
5) transformarea lanosterolului in colesterol.
30
Figura 2.3.2 Reglarea sintezei colesterolului de catre HMG-CoA reductaza.
Calea principala de excretie a colesterolului este bila care cuprinde colesterol si acizi
biliari.
O cale alternativa de excretie este descuamarea pielii si a epiteliului intestinal.
Bila cuprinde relativ mult colesterol, in majoritate neesterificat.
Acizii biliari sunt formati in hepatocite, secretati in canaliculele biliare si dupa tranzit
prin vezica biliara sunt deversati in duoden.
Acizii sintetizati in ficat se numesc acizii biliari primari. Tot in ficat acizii biliari
sunt conjugati cu glicol sau taurina.
31
In insuficienta hepatica sinteza colesterolului este redusa, predominand sinteza
fractiunii esterificate; deficitul de proteine afecteaza transportul colesterolului in sange.
Lipidele din ficat sunt controlate de factori lipotropi(colina, metionina si
betaina) care ajuta la eliberarea excesului de grasimi din ficat. Colina este factorul
lipotrop major facilitand transportul acizilor grasi spre tesuturile periferice. Deficitul de
colina poate produce tulburari coronariene, renale, miocardice si aortice. La animalele
carentiate in colina s-au observat alterari ale hepatocitelor:
- mitocondrii tumefiate si uneori vacuolizate
- reticolul endoplasmic hipoplazic si aglutinat in grupuri.
Sursa principala a lipoproteinelor din ser e ficatul. Acesta primeste acizii grasi
din sange si isi sintetizeaza acizii grasi proprii din glucide si aminoacizi. Acizii grasi
sunt fie complet oxidati la apa si dioxid de carbon, fie oxidati la corpi cetonici sau
eliberati in sange la polul sinusoidal al hepatocitului pentru a fi transportati la celelalte
tesuturi ale organismului. Forma de transport sanguin a grasimilor o constituie
lipoproteinele. Pentru sinteza acestora ficatul esterifica acizii grasi cu glicerofosfat
transformandu-i in trigliceride pe care le uneste cu proteine, fosfolipide, colesterol si
chiar cu glucide.
Rolurile lipoproteinelor plasmatice:
- transporta colesterolul exogen si cel sintetizat in ficat spre tesuturi extrahepatice si
invers: vehiculeaza alti compusi lipidici
- participa la pastrarea compozitie lipidice a membranelor
- regleaza procese metabolice celulare.
Electroforeza lipoproteinelor a dus la identificarea a patru fractiuni:
- chilomicronii care nu migreaza. Contin 98-99% lipide.
- pre ß- proteine VLDL – sunt lipoproteine sintetizate in ficat cu continut ridicat de
grasimi 89-94% in marea majoritate trigliceride 55-56%, fosfolipide, esteri ai
colesterolului si colesterol liber.
- ß-lipoproteinele = LDL – 75-80 % lipide, predominant colesterol, fosfolipide si
trigliceride. Se formeaza in plasma din VLDL prin inlaturarea trigliceridelor VLDL sub
actiunea lipoprotein lipazei si imbogatire in colesterol.
32
- Alfa lipoproteine = HDL – 50-55% lipide, predominand fosfolipidele. Componenta
proteica majora este apoA. Sunt sintetizate si secretate de hepatocite, sunt catabolizate
in final la nivelul ficatului.
In conditii patologice in ser apare o lipoproteina anormala a carei componenta lipidica
este formata din lecitina si colesterol liber iar componenta proteica din 40 % albumina si
60 % apoproteina X.
33
Capitolul 3.
1. Peroxidarea lipidica
Efectele celulare ale peroxidarii lipidelor membranare sunt:
A. alterarea aranjarii fosfolipidelor;
a) diminuarea fluiditatii;
b) cresterea incarcarii electrice negative de suprafata;
34
c) crearea conductivitatii pentru protoni;
d) pierderea stabilitatii electrice si cresterea permeabilitatii nespecifice
Peroxidarea lipidica este reprezinta o succesiune de reactii dupa cum urmeaza:
- Initiere
- Propagare:
- Intrerupere
35
3. Alterari cromozomiale si mutatii genetice produse de radiatiile ionizante sunt
foarte bine cunoscute. Mecanismul prin care acestea se produc este tocmai formarea de
radicali liberi de oxigen care produc alterari ale structurii si deci si functiei ADN.
4. Actiunea SRO asupra tesutului conjunctiv pare a fi una de tip anabolic prin
degradarea acidului hialuronic si actibarea prolinhidroxilazei. Aceasta ar explica fibroza
care apare in leziunile induse de oxigen.
Diferitele tipuri de SRO sunt produse atat in timpul proceselor fiziologice dar in
cantitate mult mai mare conditii patologice cum ar fi:
a. dezordini in distributia tisulara a oxigenului (hipoxie, hiperoxie)
b. inflamatia
c. iradieri
d. carcinogeneza si imbatranire
e. ateroscleroza
f. detoxifierea xenobioticelor
g. peroxidarea lipidica, o sursa de radicali liberi.
Peroxidarea lipidelor expuse la oxigen este responsabila nu numai de rancezirea
alimentelor, ci si de prejudiciul tesuturilor in vivo, cauzand anumite boli, ca de exemplu
cancerul, bolile inflamatorii, ateroscleroza s.a.
Sistemele organismului care neutralizeaza acesti radicali pot fi de doua feluri:
antioxidanti enzimatici sau neenzimatici. Antioxidantii neenzimatici cuprind numeroase
substante printre care si vitamina E, ceruloplasmina, b carotenul, vitamina A, histidina,
glucoza, seleniul, albumina, hemopexina, transferina, taurina, chelatori de ioni metalici,
bilirubina, s.a.
Antioxidantii enzimatici includ: catalaza, familia superoxiddismutazei (SOD), ciclul
redox glutationic.
Rolul GSH in organism
Actiunea GSH se poate realiza enzimatic sau neenzimatic astfel:
-actiunea neenzimatica este o actiune directa cu SRO si nespecifica, care se poate
observa la toti donorii de grupari –SH
- actiunea enzimatica: GSH este binecunoscut ca substrat pentru GSH-ST, GSH-Px si
GSH-r.
36
Reglator/modulator al statusului redox sulfhidril celular
Starea redox a celulelor este expresia raportului dintre concentratia de echivalenti
oxidanti si concentratia de echivalenti redusi. Datorita faptului ca majoritatea
constituentilor apartin echivalentilor redusi, variatiile chiar foarte mici ale concentratiei
GSH pot modula puternic starea redox. Prin proprietatile sale antioxidante GSH
actioneaza ca un tampon redox celular. Intre valoarea gruparilor –SH plasmatice libere
si GSH hepatic s-au constatat corelatii.
Apararea impotriva atacului oxidativ
In mod independent sau in cooperare cu enzimele auxiliare a caror activitate depinde in
ultima instanta de concentratia de GSH si a factorilor care ii afecteaza concentratia.
Contributia la mentinerea mediului reducator intracelular necesar conservarii structurii
si functiei enzimelor si proteinelor redox sensibile sub forma activa.
In calitate de cosubstrat al GSH- Px si GSH-red , contribuie la convertirea apei
oxigenate sau a peroxizilor lipidici la apa si hidroacizi grasi si respectiv la conjugarea
unei mari varietati de xenobiotice electrofile.
Reglarea unor sisteme enzimatice implicate in stresul oxidativ a caii SHMP care
produce NADPH , un importanta agent reducator si cofactor al glutation reductazei.
Participarea in transport, sinteza de proteine, de acizi nucleici, sinteza si actiunea unor
leucotriene, formarea de microtubi, in transductia de semnale, exprimarea unor gene.
Dintre multiplele roluri atribuite GSH, dominanta ramane actiunea antioxidanta
(detoxifiant si protector), prin ecranarea unei game variate de specii reactive radicalice
sau neradicalice. In plus aceasta triada de compusi naturali (vitamina C, E si GSH) prin
interactiune intr-o serie de ractii ciclice de oxidoreducere, asigura regenerarea formelor
reduse ale compusilor cu veleitati antioxidante. GSH reactioneaza rapid in special cu
radicalul hidroxil, donand un atom de hidrogen. S-a sugerat de altfel existenta unui
factor GSH- dependent care ar inhiba LPO la nivel membranar. In realizarea acestei
inhibitii ar fi implicata si o vitamina conform reactiilor:
Ca si cei mai multi componenti ai apararii antioxidante si GSH are nivele care
fluctueaza in functii de diferite conditii fiziologice sau patologice. Nu este insa stabilita
37
o relatie cauzala intre nivelele scazute de GSH si cele ridicate ale peroxizilor, desi unele
studii sustin acest lucru.
Rol in cresterea si dezvoltarea celulara
Diferentierea terminala e asociata frecvent cu modificarea echilibrului redox al
organismului. Pe masura ce isi pierd capacitatea mitotica , celulele devin mai oxidate in
fazele finale de diferentiere. Tesuturile cu capacitate de regenerare crescuta cum e si
cazul ficatului la mamifere nu prezinta scaderi ale GSH in cursul diferentierii.
Dimpotriva, capacitatea acestora de a sintetiza GSH se diminueaza progresiv in urma
depletiei, fapt care ar putea fi un factor de dezvoltare. Concentratia GSH creste in cursul
dezvoltarii tesuturilor meiotice. De exemplu s-a constatat o triplarea a cantitatii de GSH
in testicolele de sobolan intre 8 si 29 zile de viata.
Alte functii: stocarea si transportul cisteinei, reglarea metabolismului
leucotrienelor si PG , reglarea sintezei dezoxiribonucleotidelor, functia imuna ,
reducerea radicalilor tocoferol, direct sau indirect, prin reducerea semidihidro-
ascorbatului.
38
Capitolul 4.
Functia e detoxifiere este poate cea mai importanta functie hepatica privita din
perspectiva terapeuticii. Consta in captarea compusilor toxici (endogeni – produsi
fianali ai metabolismului ca de exemplu amoniac, uree, acid uric sau exogeni –
medicamente, droguri, otravuri), reducerea toxicitatii si marirea capacitatii de eliminare
a acestora (adeseori aceasta consta in hidrosolubilizarea compusilor mai sus amintiti).
Procesele de detoxifiere au loc atat in metabolismul normal cat si in cel
patologic si nu sunt selective, mare parte a toxicelor este metabolizata de enzime
nespecifice.
Termnenul de xenobiotic de origine greaca are sensul etimologic de „strain
vietii” (xenos= strain si bios= viata) deci un compus care nu este sintetizat, nu se
gaseste si nu joaca niciun rol in organismul viu (uman). Cuprinde asadar o gama larga
de substante chimice printre care si medicamente, droguri, otravuri, aditivi alimentari,
pesticide, etc.
Xenobioticele pot intra in organism accidental (mancare contaminata, poluarea
mediului/aerului, razboi etc) sau in mod deliberat – in scop terapeutic (medicamentele)
sau din contra cu scopul de suprimare a vietii (suicid, omucid, eutanasiere, executie)
Xenobioticele cuprind o gama larga de substante cum ar fi:
- Medicamente : acetaminofen, aspirina , tranchilizante, etc.
- Cosmetice: Fixative, vopsele de par, deodorante, sprayuri etc.
- Pesticide: DDT, hexaclorciclohexan(Gamexan), parathion, etc.
- Metaboliti bacterieni: de exemplu amine formate in tractul intestinal
(putresceina, cadeverina)
- Diferite substante active aflate in alimente (alcaloizi, uleiuri volatile, etc)
- Aditivi alimentari : coloranti, indulcitori, conservanti, etc.
La indepartarea xenobioticelor participa, am putea spune, intreg organismul
(rinichii, pielea, plamanii, sistemul imun, sangele) dar rolul major in acest proces il
joaca ficatul datorita in special bogatului sau echipament enzimatic.
39
Ficatul participa la acest proces prin captarea, biotransformarea, excretia si
secretia xenobioticelor. Acestea ajung in ficat fie din circulatia generala in cazul caii de
adminisrare parenterala sau din circulatia portala in cazul medicamentelor administrate
pe cale orala.
(Schema)
Captarea se face prin intermediul unor sisteme de transport situate bazolateral in
membrana hepatocitelor:
- familia de polipeptide transportoare de anioni organici Na- indepenenta
(OATP/OATP)
- familia de transportori de cationi organici (OCT/OCT)
Biotransformarea medicamentelor consta in modificarea proprietatilor fizico-
chimice si biologice ale acestora in urma unei succesiuni de reactii intracelulare.
Biotransformarea poate avea ca rezultat obtinerea, diminuarea sau anularea activitatii
biologice a medicamentelor, iar in ceea ce priveste toxicele pentru unele gradul de
toxicitate poate creste in urma metabolizarii hepatice.
Procesele de biotransformare sunt procese enzimatice care decurg in una sau doua faze
si vizeaza cu precadere substantele liposolubile catre traverseaza cu usurinta membrana
celulara. Principala modificare consta in hidrosolubilizarea acestora si trecerea acestora
din nou in sange sau in bila. Din sange produsii astfel transformati se elimina fie pe cale
urinara – majoritatea , fie prin aerul expirat(cele volatile). Dar unii metaboliti se pot lega
de o macromolecula celulara cum ar fi cea de ADN putand cauza mutatii cu potential
carcinogen.
In sange moleculele de medicament se pot lega de proteine ( in marea majoritate
de albumina). Exista asadar sub doua forme: libera activa si legata de proteine inactiva.
Procesul este reversibil iar capacitatea de legare este cu atat mai crescuta cu cat numarul
de molecule de medicament legate de o singura molecula de albumina este mai mare.
Albumina are cea mai mare afinitate pentru moleculele anionice si hidrofobe.
In cazul administrarii concomitente a doua medicamente cu afinitate crescuta pentru
albumina acestea intra in competitie pentru situsurile de legare disponibile. Aceste
medicamente se grupeaza in doua clase:
- clasa I de medicamente Daca doza de medicament e mai mica decat capacitatea de
legare a albuminei atunci raportul doza/capacitate este redus.
- clasa II de medicamente Raportul doza/capacitate este ridicat ceea ce face ca o
proportie relativ mare a medicamentului sa circule sub forma libera, activa in plasma.
40
- importanta clinica a deplasarii medicamentului rezulta din faptul ca administrarea unui
medicament din cea de-a doua categorie la un pacient caruia i s-a administrat anterior un
medicament din prima clasa va determina deplasarea celui dintai de pe albumina si
cresterea rapida a concentratiei formei libere in plasma.
41
Figura 4.1 Ciclul cyt P 450 hidroxilazei in microzomi
Proteinele cyt. P450 au un sigur grup prostetic Fe- protoporfirina IX legat de oxigen si
de substrat. Ferul heminic poate avea doua forme diferite de spin – hexacoordinata si
pentacoordonata. Odata cu legarea de substrat are loc trecerea in forma pentacoordinata
de spin inalt.
Dat fiind faptul ca exista peste 150 de izoforme ale cyt p 450 s-a impus nevoia stabilirii
clare a unei nomenclaturi care s-a bazat pe omologia de structura. Izoformele se noteaza
folosind simbolul CYP urmat de numere arabe care desemneaza familia si apoi de o
majuscula desemnand subfamilia si inca un numar arab desemnand membrii aceleeasi
subfamilii. Pentru genele care codeaza aceste proteine se aplica acelasi model cu
diferenta ca se folosesc litere italice.
Unii citocromi pot avea forme polimorfe adica izoforme genetice unele deintre ele
avand o slaba activitate catalitica.
Reactiile fazei I care nu implica sistemul cyt P450
Reactiile chimice oxidative din faza I catalizate de oxidaze sunt: desulfurarile,
hidroxilarea aromatica, dehalogenarile, dezaminarea oxidativa, dealchilarile de tip N,O
si S, oxidarile tip N si S.
1. Oxidari:
- oxidarea alifatica, prin care lanturile alifatice sunt oxidate cu formarea unui alcool
R-CH3-------- >R-CH2OH
42
- hidroxilarea aromatica
- N- desalchilarea
- N- oxidarea
- epoxidarea
- dezaminarea oxidativa
- oxidarea alcoolilor
43
- alte forme de oxidare cuprind printre altele oxidarea S in sulfoxizi, inlocuirea S cu O si
formarea legaturii – S – S –
=S----- >=SO ----- > SO2; =C=S ----- > =C=O
2 R-SH ----- > R-S-S-R
2.Reduceri
R-NO2 ----- > R-NO ----- > R-NH-OH ----- > R-NH2
Nitroderivat Nitrozoderivat Hidroxilamina Amina
3.Hidroliza
Reactiile fazei II-a
Reactiile fazei a doua sunt reactii de conjugare cu acidul glucuronic, glutation, glicocol,
sulfoacetat si grupari metil. Aceste procese sunt influentate de:
-sex (consumul de contraceptive la femei)
- varsta frecventa mai mare a hepatitelor induse medicamentos la persoanele in varsta de
peste 50 de ani
- starea de de/nutritie
- calea de administrare (medicamentele administrate pe cale oralasunt inactivate partial
la primul pasaj)
- fluxul sanguin hepatic
- polimorfismul genetic al enzimelor implicate in metabolizarea medicamentelor
Glucurono- conjugarea reprezinta calea majora de detoxifiere a numerosi metaboliti
endo- si exogeni ca de exemplu bilirubina, hormoni tiroidieni, steroizi, acizi aromatici
s.a. Secventa reactiilor ce au loc este urmatoarea:
1. Glucozo-1-P + UTP ---------- > UDP-Glucoza + PP
2. UDP-Glucoza + 2 NAD ------- > UDP- Acid glucuronic + 2 NADH2
44
3. UDP Acid glucuronic + RX ----- >UDP + R-X-Acid glucuronic
Sulfo- conjugarea
Conjugarea cu glutamina
45
Capitolul 5.
Odata ingerat alcoolul etilic, fiind o molecula hidrosolubila, este rapid absorbit
prin difuziune simpla la nivelul stomacului si portiunii superioare a intestinului subtire.
Absorbtia este direct proportionala cu concentratia bauturii alcoolice, la concentratii
mari absorbtia fiind completa si rapida. Dupa absorbtie etanolul ajunge in ficat unde cea
mai mare parte este metabolizata de la prima trecere (cca. 73%). Acest proces are loc in
cazul ingestiei unor cantitati moderate de alcool (social drinking) dar este sever
diminuat la alcoolici.
46
- Stadiul III paralitic este caracterizata de o anestezie cerebrala (care nu permite
insa efectuarea unei interventii chirurgicale) tradusa prin instalarea unei stari
precomatoase, abolirea reflexelor conditionate, limbaj neinteligibil, relaxarea
sfincterelor cu emisiuni involuntare urinare. Corespunde unei alcoolemii de 2-3
g %o.
- Stadiul IV – coma alcoolica cu grade diferite de profunzime de la stadiul de
coma vigila pana la stadiul de coma depasita. Corespunde unei alcoolemii de 4-
5g %o. Rezorbtia foarte rapida a alcoolului se produce frecvent la pacienti cu
afectiuni hepatocelulare severe (ciroza pana la insuficienta) alcoolul neputandu-
se metaboliza hepatic, la gastrectomizati, atunci cand ingestia se produce pe
nemancate, la copii, epileptici si alte categorii tarate.
Intoxicatia acuta in general nu produce o afectare hepatica decat exceptional
(tentative de suicid, ingerarea concomitenta a unor medicamente, accidente/
traumatisme cu pierdere de parenchim, etc.)
Intoxicatia etanolica cronica (alcoolismul) este insa cea care produce leziuni
hepatice in ordinea aparitiei steatoza, hepatita si ciroza alcoolica. Steatoza este
intotdeauna reversibila dupa incetarea consumului. Hepatita poate fi si ea
reversibila sau in tot cazul este incetinita evolutia spre ciroza daca se intrerupe
consumul. Se estimeaza ca este necesar un consum de cca 500 ml tarie (wisky,
wodka, tuica) zilnic timp de 10 ani pentru a aparea ciroza hepatica. In orice caz
alcoolul singur nu poate explica patogenia cirozei cunoscut fiinf faptul ca doar
aproximativ 10-15 % dintre alcoolici fac ciroza.
Dar tratamentul alcoolismului ridica o alta problema data fiind metabolizarea
hepatica a acestor droguri (carbamati, benzodiazepine, disulfiram – acesta duce la
acumularea acetaldehidei).
Mai trebuie precizat ca bauturile alcoolice in special cele obtinute prin distilare in
gospodariile taranesti contin pe langa etanol si alti compusi. Din procesul de
fermentare pot rezulta ca produsi secundari: alcool izobutilic, alcool izoamilic,alcool
amilic, etanal, glicerina, acid lactic, acid acetic. Toti acestia se afla in cantitati mici
dar sunt deasemenea toxici.
De asemenea bauturile alcoolice pot contine diferite alte substante potential
toxice in cazul unui consum excesiv la persoanele cu a rata foarte ridicata de
metabolizare a alcoolului, sau pe un teren tarat:
47
- Renumitul absinth, „ zana verde” este preparat di frunze de pelin (Arthemisia
absinthum), anason si alte plante aromate. Continne numerozi alcaloizi dintre
care absintina care ii da gustul amar si tujon incriminat pentru efectele
psihedelice. Cantitatea permisa a acestuia este reglementata in Uniunea
Europeana iar in preparatele naturale cantitatea de tujon este in aceste limite.
- Amygdalina este un alcaloid care prin descompunere enzimatica elibereaza
HCN inhibitor al lantului respirator celular. Se poate gasi in migdale
amare( lichioruri de migdale) si in cantitati mai mici in samburi de caise, visine
(visinate).
- Capsaicina alcaloidul care da gustul iute al ardeilor se poate regasi in diferite
sortimente de bere cu chili uscati, afumati, maruntiti. Ca si absintina este un
stimulent al secretiei gastrice.
- Aluminiul din care sunt facute recipientele in care se imbuteliaza berea (cutii,
butoaie) este solubilizat intr-o mica parte de catre continutul care este usor acid.
Ajuns apoi in organism se poate depozita in creier fiind implicat in patogenia
dementei.
48
Acetaldehida este mai departe oxidata in acetat sub actiunea acetaldehid
dehidrogenazei localizata in citosol, mitocondrii, microsomi. ALDH prezinta la randul
ei cel putin 4 izoenzime distincte. Izoformele ALDH 1 si 2 se gasesc preponderent in
ficat iar izoenzimele 3 si 4 se gasesc in stomac, plamani inima.
Cea mai mare parte a acetatului trece in sange si intra ulterior in ciclul Krebs.
Oxidarea unei molecule de etanol pe aceasta cale conduce la formarea a doua
molecule de NADH care se acumuleaza in ficat modifican raportul NADH/NAD.
Acetaldehida poate fi oxidata si pe alte cai astfel in reactiile catalizate dexantin oxidaze
sau aldehid oxidaze care duc la formarea de apa oxigenata. Sub efectul
dezoxiriboaldolazei acetaldehida este condensata cu un intermediar al glicolizei, glico-
3 fosfatul , rezultand 2-dezoxiribozofosfatul. Aceasta reactie leaga metabolismul
alcoolului de glicoliza si de metabolismul acizilor nucleici.
Factorul limitativ al activitatii ADH este cantitatea disponibila de NAD. NADH
este reoxidat in NAD la nivelul lantului respirator, reactie complicata de faptul ca
mitocondriala este impermeabila pentru NADH. Trecerea se face cu ajutorul navetei
malat- aspartat care joaca un rol central. Cand capacitatea sa functionala e depasita de
cantitatea de alcool NAD nu mai poate oxida etanolul si raportul NADH/ NAD este
crescut in ficat. Lipsa NAD contureaza cresterea altor cupluri de oxido-reducere
hepatica: lactat/ piruvat, alfaglicerofosfat/ dihidroxiacetona. Sistemele transportoare pot
constitui factorul limitant al vitezei de reoxidare a NADH.
Oxidarea microzomala
49
corp este de crescuta de 2-3 ori la populatia cu activitatea MEOS ridicata indusa- de
exemplu – prin consumul prelungit si abundent de alcool. Pe aceasta cale alcoolul este
metabolizat la acetaldehida transformata la randul ei in acetil coenzima A care, in cea
mai mare parte, intra in ciclul Krebs iar o alta parte e convertita la acizi grasi si
colesterol.
Calea MEOS este responsabila de aparitia tolerantei la alcooldatorita inductibilitatii
sale.
Alcooliza
50
Efectele nocive ale alcoolului asupra organismului uman se manifesta fie ca urmare
unui exces de NADH din calea ADH ce perturba toate celelalte metabolisme (lipidic,
glucidic, proteic), fie prin formare de radicali liberi, fie prin actiunea sa directa, fie prin
actiunea metabolitilor sai intermediari toxici ( in special acetaldehida). Toate aceste
efecte se manifesta indeosebi in cazul intoxicatiei cronice (etilism cronic) atunci cand
mecanismele enzimatice sunt depasite si rezervele organismului epuizate.
51
Asupra metabolismului proteic alcoolul mai exercita urmatoarele efecte:
- inhibarea sintezei albuminei ca urmare a dezorganizarii ribozomilor in
ergatoplasma;
- diminuarea ureogenezei si perturbarea eliminarii amoniacului;
- cresterea proteolizei , responsabila in parte de cresterea in ser a aminoacizilor
nemetabolizati in ficat cum ar fi: cei cu lanturi ramificate si acidul alfa- amino-
N -butiric rezultat din degradarea metioninei, serinei si treoninei.
Asupra metabolismului apei si comportamentului dipsic consumul de etanol (atat
acut cat si cronic) are numeroase efecte, dat fiind determinismul dublu • biologic legat
de homeostazia hidrica cat si • neuropsihologic al acestuia (consumam bauturi cu gust
placut, sau in anumite ocazii consumam ceea ce consuma si ceilalti )
Consumul acut de bauturi alcoolice este urmat de o crestere a diurezei si o
inhibitie a absorbtiei intestinale de apa – acesta din urma avand o importanta limitata.
Cresterea diurezei si consecinta clinica a acestei –poliuria este urmata de scaderea
volemiei si compensator polidipsie. Cresterea diurezei se face prin actiunea alcoolului la
nivel hipotalamic sau suprahipotalamic manifestata prin scaderea hormonului
antidiuretic.
Osmolalitatea indusa de alcool determina eliberarea opioidelor endogene
diminuand secretia hormonilor antidiuretici. Cresterea osmolalitatii precum si cresterea
secretiei de angiotensina II determina aparitia senzatiei de sete. La nivel cardiac
rasunetul acestor fenomene consta in cresterea frecventei cardiace ca raspuns la
scaderea presiunii arteriale secundare cresterii diurezei, vasodilatatiei si scaderii
contractibilitatii miocardice induse de alcool.
Consumul cronic de etanol duce la permanentizarea senzatiei de sete, la o
adevarata potomanie. Apare asadar polidipsia intretinuta prin poliurie hipo-osmotica. In
plus se produce o expansiune izotonica a ansamblului de sectoare hidrice cu diminuarea
excretiei urinare a electrolitilor. Aceasta inflatie hidrica determina cresterea presiunii
arteriale.
Sevrajul ,insa, produce efecte contrare si anume o antidiureza si o retentie
hidrosodata care determina hipervolemie si hiperhidratare izoosmotica. Secretia de
hormon antidiuretic creste foarte mult ca urmare a unui fenomen de rebound. In mod
paradoxal pacientul continua sa aibe senzatie de” gura uscata” ceea ce contribuie la
agravarea hiperhidratarii.
52
Efectele metabolitilor toxici ai etanolului
Acetatul :
- blocheaza eliberarea de acizi grasi liberi din tesuturi
- contribuie la sinteza trigliceridelor prin conversia sa la acetil CoA
- initiaza transformarea ATP la AMP , acesta din urma degradandu-se mai departe
in purine si acid uric.
Consecintele interactiunii alcool- biomembrane neuronale sunt:
1. expansiunea membranei. Cresterea de volum a membranei este de ~10 ori mai mare
decat volumul moleculelor de alcool incorporate in membrana.
53
2. fluidizarea membranei este o modificare comuna tuturor anestezicelor. Acest
fenomen este acompaniat de o serie de schimbari conformationale.
3. dezorganizareaa lipidelor
4. modificari conformationale ale proteinelor
Din alcool rezulta si diferiti radicali liberi care contribuie la accentuarea statusului
general hipoxic al alcoolicului.
Radicalii liberi derivati din etanol sunt urmatorii:
- CH3-CH´- OH (alfa hidroxil etil)
- ´CH2- CH2- OH ( ß-hidroxil etil)
- CH2- CH2- O´ (etoxil)
Aceste trei specii primare de radicali liberi ai alcoolui etilic participa mai departe la o
serie de reactii rezultand alte specii reactive.
54
cronic de alcool se constata o crestere semnificativa a formelor asialo-, disialo- si
monosialo-transferina.
c) modificari hematologice: se apreciaza ca cresterea VEM > 90µ³ are valoare
predictiva
d) raportul de Ritis este reprezentat de raportul AST/ALT serice fiind mai mare de 2 in
formele de ciroza si hepatita alcoolica severa pe cand in alte etiologii este subunitar.
e) testul respirator cu aminopirina marcata se bazeaza pe faptul ca alcoolul avand un
efect inductor asupra MEOS accelereaza metabolizarea si a altor droguri. Aminopirina
este administrata intravenos iar apoi se dozeaza cantitatea de marcat eliminat prin
respiratie. Metoda nu are utilizare practica.
f) glutamat dehidrogenaza creste de 2-5 ori ca urmare a consumului de alcool dar scade
la jumatate dupa 48 de ore de abstinenta.
Modificari ale valorii serice a IgA,valorii urinare a acidului D glucaric, a fosfatazei
alcaline precum si a unor metaboliti a fost observata la pacientii cu afectare hepatica de
etiologie alcoolica dar fara a se putea stabili o corelatie clara.
Capitolul 6.
55
Virusurile cu marcat hepatotopism care sunt cauza majoritatii hepatitelor virale au fost
notate cu litere latine de la A,......la G. Pe langa acestea mai pot fi implicate in situatii
mai rare sau in care imunitatea organismului este compromisa si urmatoarele virusuri:
- virusul Epstein-Barr
- virusul varicelei
- virusul herpes simplex
- citomegalovirus (CMV)
- adenovirusuri
- enterovorusuri
Toate aceste virusuri provoca inflamatia acuta a ficatului – hepatita acuta – mai bogata
sau mai saraca in simptome. Inflamatii cronice – hepatite cronice – provoaca insa doar
virusurile B,C ,D si G.
Hepatitele cronice s-ar putea clasifica astfel:
1. hepatite cronice virale :cu virusurile B,C,D si G
2. hepatite cronice toxice: - etanolice
- iatrogene (datorate administrarii indelungate a unor
chimioterapice cum ar fi izoniazida, clorpromazina, unele contraceptive orale)
- profesionale datorate expunerii profesionale la diferite noxe
3. hepatite cronice reactive: -criptogenetice
-din boli digestive
- infectioase.
4. hepatite cronice autoimune.
Cronicitatea hepatitelor presupune existenta a unei perioade mai mari de 6 luni in care
sa existe modificari biochimice si histologice fara ameliorare.
In etiologia hepatitelor cronice virale ponderea cea mai mare o constituie totusi
virusurile B si C.
Caile de transmitere a acestor virusuri se suprapun in mare parte.
Astfel hepatita B se transmite:
- pe cale sexuala (relatii homosexuale sau heterosexuale neprotejate),
- pe cale sanguina (transfuzii de sange, transplant de organe, interventii
chirurgicale/stomatologice cu instrumentar incorect sterilizat, tatuaje/piercing
efectuate in conditii improprii, etc),
- perinatal de la mama la fat in timpul travaliului si dupa prin sangele matern
infectat, colostru, lapte matern.
56
Figura 6.1 Structura HVB
57
Figura 6.2 Structura VHC
Fiziopatologia biochimica
Sindromul de hiperreactivitate mezenchimala
58
hepatocarcinom la valori peste 400 ng/ ml precum si in alte forme de cancer( tumori
gastrointestinale, tumori testiculare, ovariene).
Principalele a 2 globuline sunt:
- haptoglobina
- ceruloplasmina
ß globulinele cresc in sindroamele colestatice.
Gama globulinele cresc in hepatitele cronice si ciroze prin stimularea sintezei de catre
infiltratul limfoplasmocitar.
Imunoglobulinele sunt tot gama globuline dar sintetizate de catre limfocitele B activate-
plasmocite. Valori crescute ale Ig G apar in hepatitele cronice virale precum si in cele
autoimune. Ig A insa creste in cirozele alcoolice.
Testele functional- biochimice hepatice sunt:
- transaminazele, glutation transferaza, lactat dehidrogenaza, feritina si alte cateva
enzime mai putin importante pentru sindromul de citoliza hepatica..
- albumina, prealbumina, colinesteraza, LCAT, electroforeza proteinelor serice, timpul
de protrombina si timpul partial de tromboplastina pentru sindromul hepatopriv.
- fosfataza alcalina, GGT, 5 nucleotidaza, leucinaminopeptidaza pentru sindromul bilio-
obstructiv (de colestaza).
Sindromul hepatocitolitic
59
Prin analiza ALAT-GPT mai utilizate sunt doua metode : 1)metoda Reitman- Frankel
reprezinta masurarea activitatii ALAT pentru conversia produsului de reactie(piruvat) la
piruvat-dinitrofenilhidrazona.
2) Metoda WROBLEWSKI reprezinta metoda in care se cupleaza reactia catalizata de
ALAT cu reactia catalizata de lactat dehidrogenaza, determinand produsu de reactie a
acesteia din urma.
Pentru analiza ASAT sunt folosite urmatoarele metode:
1) reactia dintre oxal acetat si 2,4- dinitrofenilhidrazina care formeaza o hidrazona rosie.
2) Metoda enzimatica (masurarea ultravioleta) Karmen
3) Alte tehnici fotometrice, toate avand un principiu similar reactiei unei sari de aril
diazoniu cu gruparea metilen activa a oxal acetatului.
Raportul ASAT/ALAT sau TGO/TGP reprezinta coeficientul de Ritis care are valoarea
normala de 1,3.
In conditiile in care 89% din ALAT se afla in citosol , activitatea enzimei creste in ser
mai rapid si mai mult sub actiunea acuta a noxelor (coeficientul de Ritis< 1), dar in
leziunile mai severe sau de lunga durata predomina eliberarea ASAT. ALAT
semnalizeaza prompt si fidel exisenta unei hepatite acute virale sau toxice. Coborarea si
mentinerea valorilor normale indica vindecarea spontana sau eficienta tratamentului in
hepatita acuta virala. O noua crestere a aminotransferazelor in ser anunta recaderea,
curba taraganata sugereaza cronicizarea. Cresteri de pana la 5 ori releva „activitatea”
hepatitelor cronice sau a cirozelor hepatice.
Deasemenea sufera modificari si alte enzime:
Ornitin-carbamiltransferaza (OCT< 70 mU/L) este o enzima mitocondriala organ
specifica, foarte sensibila care depisteaza leziunile hepatocelulare minime. Valori
crescute apar in HCP, dar si in cazul coafectarii ficatului in afectiuni extrahepatice.
Lactat dehidrogenaza (LDH <240 U/L) este un indice mai putin sensibil al necrozei
hepatocelulare, chiar daca se analizeaza izoenzima LDH 5 .
Glutamat-dehidrogenaza are localizare mitocondriala. In cazul zonarii metabolice a
ficatului, enzima este mai abundenta in hepatocitele din jurul venei centrolobulare, spre
deosebire de ALAT, localizata mai ales periportal. De aceea glutamat dehidrogenaza
este eliberata cu precadere in caz de hipoxie, leziuni toxice, obstructie biliara, iar ALAT
in cursul inflamatiilor.
Sideremia (90-150 µg/ml la barbat si 80-130 la femei) creste ca si enzimele „indicatoare
directe” in cazul permeabilizarii citomembranelor.
60
Concentratia in ser a vit b12 creste de 2-10 ori fata de normal in hepatitele epidemice.
Sindromul hepatopriv
In conditii patologice metabolismul protidic este cel mai grav afectat. Sinteza
proteica hepatica poate fi cuantificata prin determinarea concentratiilor plasmatice ale
unor compusi produsi fie in exclusivitate de ficat fie preponderent de catre ficat cum ar
fi: albumina, prealbumina , alfa 1 glicoproteina, alfa 2 haptoglobina, transferina,
cerulolasmina, transcobalamina, fractiunea c3 a complementului, numeroase enzime de
secretie.
Albuminemia ( valori normale intre 3,5 – 5 g/dL) reprezinta bilantul dintre
sinteza exclusiv hepatica , distributia sa in organism si catabolism si/sau eeventuale
pierderi renale. In hepatita acuta valorile albuminemiei scad tardiv si inconstant datorita
timpului de injumatatirea oarecum indelungat al acesteia (cca 20 zile); disfunctia
hepatica este relevata de scaderi ale prealbuminei , haptoglobinei, complementului. In
hepatita cronica si ciroza hipoalbuminemia este aproape nelipsita, valorile acesteia
constituind un indiciu al severitatii bolii.
Albumina se poate doza prin mai multe metode cea mai folosita fiind prin intermediul
unei determinari directe de globulina, bazata pe continutul de triptofan. Metoda
utilizeaza un singur reactiv acid glioxilic, care intr-un mediu acid si in prezenta ionilor
de calciu condenseaza cu triptofanul din globuline dand o coloratie rosie. A doua
metoda ca raspandire este electroforeza proteinelor serice. Alte metode folosite mai
sunt: metode imunologice (imunodifuzia radiala si electroimunodifuzia), turbidimetria,
nefelometria, metode de fixare a colorantilor (portocaliu de metil, acidul 2,4 hidroxiazo-
benzen benzoic, verde de bromocresol, purrpura de bromocresol).
Albumina poate fi definita de urmatoarele 4 proprietati fizico-chimice:
- nu contine in molecula grupari carbohidrate;
- Gm=66.000 Da
- este sensibila in sulfat de amoniu 2.03 moli/l la 23 ºC la pH> 6
- migrarea in camp electroforetic este de 6 unitati de mobilitate Tiselius in buffer de
sorbitol
Albumina indeplineste urmatoarele functii:
61
- Rol important in nutritie: contine toti aminoacizii esentiali si este foarte usor
metabolizata. Hipoalbuminemia (albumina serica < 3 g/dl ) reprezinta unul din markerii
denutritiei alaturi de:
• transferina < 200mg%
• proteina legata de tiroxina <22 mg %
• proteina legata de retinol <4,5 mg%
• limfocite < 1500/ mm³.
- Rol in mentinerea presiunii osmotice . Edemele apar la valori ale albuminei serice mai
mici de 2g/ dl.
- Rol de legare si transport a unor compusi hidrofobi endogeni sau exogeni printre care
si a numeroase medicamente. Forma legata a medicamentelor este inactiva de aceea in
hipoalbuminemii pot aparea fenomene toxice chiar in cazul administrarii unor doze
considerate terapeutice.
Hipoalbuminemia apare fie datorita unei sinteze deficitare (malnutritie, leziune hepatica
severa) fie unor pierderi exagerate ( sindrom nefrotic, arsuri, unele enteropatii).
Prealbumina este un tetramer care leaga iodotironinele A; contine o molecule de
legare a retinolului (RBP retinol binding protein).Valorile serice ale acesteia scad in
bolile hepatice (V.N = 0,2- 0,3 g/l)
Colinesteraza serica (V.N 180-250mm/ml/ora) este o enzima ,, de secretie” fiind
eliberata de catre ficat in circulatie si in conditii normale. Reprezinta un parametru
foarte sensibil si fidel al rezervei functionale hepatice, al extinderii si severitatii
leziunilor. Valori scazute indica un prognostic nefavorabil.
Factorii de coagulare sunt investigati prin tromboelastograma, testul de liza al
euglobinei, timpul partial de tromboplastina si dozarea separata a factorilor de oagulare
II, V, VII, X, XIII. In general se constata o diminuare a sintezei acestor factori.
Tulburari ale metabolismului glucidic
Perturbarile acestui metabolism devin evidente doar in cazul scaderii numarului de
hepatocite sub 20 % din normal, ceea ce se intampla tardiv in cursul evolutiei bolilor
hepatice.
62
Ficatul are un rol cheie in captarea, sinteza, oxidarea si esterificarea acizilor
grasi, sinteza acizilor biliari, precum si formarea lipoproteinelor. In afectiunile hepatice
au loc:
- Cresterea AGL in circulatie , mai ales in hepatita alcoolica.
- Cresterea acizilor biliari in ser care reprezinta un indicator prognostic mai
sensibil decat albumina. Raportul seric intre acizii trihidroxilati (acid colic) si
cei dihidroxilati (acid chenodezoxicolic si dezoxicolic) creste in colestaza si
scade in insuficienta hepatocelulara.
- Colesterolemia creste in afectiunile de colestaza si scade in insuficienta hepatica
si comele hepatice.
- Fosfolipidele (in principal lecitina) cresc in hepatopatiile cronice mai mult decat
colesterolul.
- Lipoproteinele se comporta diferit in afectiunile hepatice cronice. Astfel
fractiunile a si preb scad iar fractiunea b creste.
Sindromul bilioexcretor
63
Capitolul 7.
Material şi metodă
Model experimental
64
Figura 7.1 - Ficat normal de soarece HE
65
Figura 7.2 - Ficat la 24 de ore de la administrarea CCl4
66
Figura 7.4 - Ficat la 120 de ore de la administrarea toxicului
Capitolul 8.
67
Determinări biochimice
68
Tabel 8.1
Enzime TGO TGP
Probe P S B P S B
Solutie standard TGO 0,5 0,5 0,5 - - -
(ml)
Solutie standard - - - 0,5 0,5 0,5
TGP(ml)
Se incubeaza 5 minute la 37 º
C
Omogenat dilutie 1/10 0,1 - - 0,1 - -
Sol standard piruvat - 0,1 - - 0,1 -
Se incubeaza 60 minute la 37 º C Se incubeaza 30 minute la 37 º C
Solutie 2,4 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
dinitrofenilhidrazina(ml)
Omogenat dilutie1/10ml - - 0,1 - - 0,1
Solutie NaOH 0,4 N(ml) 5 5 5 5 5 5
Principiu
LDH catalizează reacţia reversibilă
Determinarea activităţii LDH se face prin incubarea soluţiei care conţine enzima piruvat
şi NaOH la pH 7,4 sau lactate şi NAD la pH 8.9. Scăderea absorbţiei optice la 340nm în
primul caz şi creşterea în al doilea caz sunt folosite la evaluarea activităţii enzimei.
Reactivi
1. soluţie piruvat de sodiu 8 mg/l
2. soluţie NaOH 7mg/ml în NaHCO3 1%
3. soluţie tampon Tris-maleat 0,2 N ; pH 7,4 sau tampon fosfat N/15, pH 7,4
Mod de lucru
Se introduc în cuva de cuarţ cu f =0,5cm a spectrofotometrului:
1. tampon Tris-maleat pH 7,4 1,8 ml
2. NaOH 0,03ml
3. omogenat 0,1 ml
69
Se agită şi se citeşte E0 la 340nm.Se adaugă apoi 0,1 soluţie piruvat , se porneşte
cronometrul , se agită şi se citeşte din minut în minut timp de 5 minute, extincţiile E1 ,
E2.......E5.
70
Reactivi:
- acid sulfuric 1N
- carbonat de potasiu saturat
- fenolat de sodiu
- carbonat de sodiu 0,05 N
- hipoclorit de sodiu 0.05 N-0.07 N
- nitroprusiat de sodiu 0.5% din care se prepară în ziua determinarii o soluţie
1/100 cu apă distilată
- soluţie standard stoc: 20mg N-NH3
- soluţie standard de lucru: se obţine prin diluarea soluţiei standard stoc 1/100 cu
apă bidistilată în momentul utilizării.
Tehnică:
Celulele de microdifuziune se aşează orizontal pe un stativ asfel încât lichidele
din cele doua compartimente să nu se amestece.In compartimentul din fundul celulei
probă P se introduce 1ml soluţie saturată de carbonat de potasiu.In celălalt
compartiment se introduce 1ml sâange (imediat după prelevare pe heparină ) . Se
fixează dopul cu bagheta la gâtul celulei după ce s-a depus pe extremitatea baghetei o
cantitate de 0,01-0,02 ml acid sulfuric 1 N, cu ajutorul unei micropipete.Se prepară în
paralel două probe standard cu câte 1 ml soluţie standard de lucru şi un martor B.
Celulele probă P, standard S ,martor B,se fixează în poziţie orizontală în lăcaşul special
al agitatorului astfel încât lichidele din cele două compartimente să nu se
amestece.După montarea celulelor se pune în funcţie agitatorul cu mişcare rotatorie ,
ceea ce permite declanşarea simultană a difuziunii în toate celulele. Se agită 15 minute
la temperatura camerei 20-24 turaţii pe minut.După oprirea agitării se extrage dopul cu
bagheta centrală fără ca aceasta să atingă pereţii celulei. Bagheta este introdusă într-un
mic flacon de penicilină care conţine 1ml apă distilată. Peste baghetele probă standard şi
martor pe care a fost captat amoniacul şi care au fost introduse în flacoanele cu
penicilină conţtinând câte 1 ml apă bidistilată se adaugă reactivi conform tabelului 8.
Se închid flacoanele şi se agită manual.
După 30 minute culoarea albastră atinge maximum de intensitate stabilă.
Se diluează de 2-4 ori cu apă bidistilată pentru o bună citire la fotometru.
71
Tabel 8.3 Determinarea amoniacului
Reactivi (ml) P S B
Fenolat de sodiu 1 1 1
Nitroprusiat de sodiu 1 1 1
Carbonat de sodiu 0,05 1 1 1
M
Se agita lent si se extrag baghetele.
Hipoclorit de sodiu 1 1 1
Principii :
GDH catalizează reacţia:
Reactivi:
1. Soluţie EDTA 0,26 M
2. Soluţie acetat de amoniu 3M
3. Soluţie a cetoglutarat 0,4 M
4. Soluţie tampon fosfat N/ 15, pH 8
Echilibrul reactiei este in favoarea formarii de acid glutamic si a oxidarii NADPH
determinat spectrofotometric la 340 nm.
Mod de lucru:
Se pipetează într-o cuva de cuarţ cu grosimea de 0,5 cm :
1. Tampon fosfat pH 8 1,64 ml
72
2. NADPH 0,03 ml
3. EDTA 0.02 ml
4. Acetat de amoniu 0.07 ml
5. Omogenat 0,1 ml
Capitolul 9.
73
Asadar la 2 ore dupa administrarea de CCl4 s-a constatat o scadere a activitatii
enzimatice obtinandu-se valori de 17,9 micromoli N-NH3/ gram tesut si pe ora.
Urmeaza o panta descendenta obtinandu-se valori de 17,6 micromoli N-NH3/ gram
tesut si pe ora la 6 ore, 15,5 micromoli N-NH3/ gram tesut si pe ora la 12 ore, 12
micromoli N-NH3/ gram tesut si pe ora la 24 ore. La 48 de ore se produce o usoara
crestere la 13,3 micromoli N-NH3/ gram tesut si pe ora care se continua la 72 ore
atingand valoarea de 16,4 micromoli N-NH3/ gram tesut si pe ora si la 19,2 micromoli
N-NH3/ gram tesut si pe ora la 96 ore.
La 120 de ore valoarea se stabilizeaza la 18 micromoli N-NH3/ gram tesut si pe
ora.
S-a calculat dupa formulele:
unde
În care
= valoarea medie
s = derivatia standard
CV =coeficient de variatie
74
Tabel 9.1 Dinamica activităţii glutaminazelor hepatice în hepatita toxică experimentală
75
- la 96 de ore se inregistreaza valoarea de 3,37 micromoli/ gram tesut pe minut
- la 120 de ore se inregistreaza valoarea de 3,6 micromoli/ gram tesut pe minut
care se incadreaza in limitele normalului
76
- la lotul cu hepatita toxică experimentală aceasta scade brusc la 2 ore la 89,2
micromoli/gram /ora, urmată de o uşoara crestere la 6 ore – 94,1 micromoli/
gram ţesut /oră. Din acest moment începe o scădere progresivă la 73,2
micromoli/gram ţesut /oră la 12 ore şi atingând minimul la 24 ore 61,3
micromoli/gram/oră.
- Din acest moment valorile urmează o tendinţă ascendentă astfel: 70,2
micromoli/gram ţesut /oră la48 ore şi 110 micromoli/gram ţesut /oră la 72 ore.
- La 96 ore se produce o uşoară scădere la 105,5 micromoli/gram ţesut /oră ca
ulterior să se stabilizeze la 118 micromoli/gram ţesut /oră.
77
CV 22,79
78
Tabel 9.5 Dinamica activităţii TGO si TGP hepatice în hepatita toxică experimentală
prin CCl4
79
Dinamica activitatii TGP
Concluzii
80
S-a observat debutul precoce al leziunii biochimice începând de la două ore după
administrarea toxicului atingând un maxim între 24 şi 48 de ore ( în sensul depresiei
activitaţii enzimatice sau creşterii proteolizei).
Procesele de amoniogeneză şi ureogeneză nu sunt afectate de toxic .
Modificările morfologice se conturează la 12 ore după administrarea toxicului.
In cadrul etapei de distrucţie apar leziuni de necroză în zona centrolobulară şi de
distrofie vacuolară în zona mediolobulară.
Caracteristic etapei de reactivare mezenchimo-parenchimatoase ( 24-72 de ore )
este apariţia unui infiltrat de celule mezenchimale şi inceputul unei diviziuni celulare.
In etapa de reechilibrare citohistologică ( 72-120 de ore ) procesul regenerativ se
intensifică însă nu se ajunge în toate cazurile la o restabilire a morfologiei.
Intensitatea leziunilor de necroză corespunde cu cea a fenomenelor de proteoliză
iar procesul de regenerare cu restabilirea a activitaţii biochimice.
Intre leziunea biochimică şi cea morfologică se constată un decalaj în sensul că
leziunea biochimică apare prima şi se normalizează tot prima .
BIBLIOGRAFIE
81
6. Naum, E. , Boisteanu,P. – Drama biologica a alcoolismului, Editura
Dosoftei 2000
7. Moraru, I. – Anatomie patologica, Editura Medicala, Bucuresti 1980.
8. Pascu, O. si Grigorescu, M.- Tratat de gastroenterologie, vol II, Editura
Tehnica , Bucuresti 1997
9. Davidson, V.L. , Sittman, D.B. – Biochemistry, Editia a treaia, Harwall
Publishing, Philadelphia 1994
10. Rodes,J. , Benhamou, J-P. ,Blei, A. – The Textbook of hepatology
Editura Wiley 2007
82