Sistemul CRISPR este baza imunității adaptive la bacterii și arhee.

Utilizează nucleazele Cas, care sunt

enzime care se pot lega și crea rupturi dublu-catenar (DSB) în ADN. Când o bacterie este infectată de un
virus, folosește o nuclează Cas pentru a tăia o bucată de ADN viral cunoscută sub numele de
protospacer. Acest fragment este stocat în genomul bacterian cu fragmente de la alți viruși care au
infectat anterior celula - o memorie imunitară. Aceste fragmente virale de distanțiere sunt plasate între
secvențe palindromice repetate, iar acest aranjament de distanțieri și repetări palindromice este ceea ce îi
dă numele CRISPR.
La reinfectarea cu același virus, bacteria îl poate recunoaște și distruge cu Cas9. Activitatea Cas9
se bazează pe un ARN CRISPR (crRNA) și un ARN CRISPR trans-activator (tracrRNA). ARNcr este
complementar cu distanțierul viral care a fost stocat după infecția inițială, în timp ce tracrARN servește
ca schelă; aceste două ARN formează un complex cunoscut sub numele de ARN ghid (gARN). Gândiți-
vă la Cas9 ca la o foarfecă și la gARN ca la mâna care îi direcționează să taie.
Înainte de tăiere, Cas9 acționează ca un instrument de căutare, verificând ADN-ul viral pentru
motivul adiacent protospacer (PAM), o secvență scurtă în aval de site-ul țintă. Când recunoaște PAM,
Cas9 verifică regiunea în amonte - dacă localizează ținta furnizată de ARNg, va crea o rupere dublu
catenară (DSB). DSB-urile invalidează virusul deoarece virușilor le lipsesc propriile mecanisme de
reparare a ADN-ului.
Odată ce Dr. Doudna și Dr. Charpentier au dezvăluit mecanismul molecular care a permis
sistemului natural CRISPR-Cas9 să taie ADN-ul, următoarea întrebare a fost evidentă: dacă lui Cas9 i se
administrează o secvență de ARN ghid diferită, ar putea fi folosită pentru a crea tăieturi la orice dorință.
localizarea în genomul unui organism? Teoria lor a fost corectă, iar rezultatele au fost inovatoare.
Complexul natural gARN a fost conceput într-un ARN himeric unic ghid (sgRNA), oferind o metodă simplă
și rentabilă de manipulare genetică. Cercetătorii trebuiau doar să furnizeze un ARN ghid diferit - care poate fi
generat cu relativă ușurință - și Cas9 ar putea fi folosit pentru a crea tăieturi la o serie de locuri țintă în ADN-ul
oricărui organism (bazându-se pe prezența secvenței corecte PAM).
Editarea genei CRISPR-Cas9 funcționează prin crearea de rupturi dublu catenare în ADN și apoi profitând
de căile de reparare a ADN-ului celular. Deși există mai multe căi de reparare a ADN-ului, cele cheie utilizate
pentru editarea genelor sunt îmbinarea la capăt neomolog (NHEJ) și repararea direcționată către omologie
(HDR). NHEJ este exploatat pentru a face genele nefuncționale, în timp ce HDR este exploatat pentru a introduce
noi gene sau fragmente de material genetic.
 Metode și tehnici CRISPR

Mecanismul de editare a genomului CRISPR

CRISPR este o tehnologie puternică de editare a genomului și are o gamă largă de aplicații. În această
secțiune, vom acoperi diferitele metode care le fac posibile. Pentru mai multe detalii despre toate aceste tehnici,
puteți consulta metodele noastre cuprinzătoare, pe capitole, aici.

Knockout al genei CRISPR

Dacă Cas9 creează un DSB, cel mai probabil va fi reparat de NHEJ. Cu toate acestea, NHEJ este predispus
la erori și, de obicei, are ca rezultat inserții și ștergeri (indels) în regiunea care este reparată. Când indelurile apar
în regiunea de codificare a unei gene și au ca rezultat o mutație de deplasare a cadrelor, gena devine
nefuncțională. Acest lucru este cunoscut sub numele de knockout al genelor (KO).
Knockout-urile genelor sunt utilizate într-o serie de domenii de cercetare, inclusiv genomica funcțională,
analiza căilor, descoperirea și screeningul de medicamente și modelarea bolii. Utilizarea mai multor ARN-uri de
ghidare care vizează diferite regiuni ale genei asigură knockout-ul genei de înaltă eficiență, o metodă care câștigă
popularitate.

Knock-in CRISPR
În prezența unui DSB indus de Cas9, celulele se pot repara și prin HDR, iar această cale oferă
cercetătorilor o oportunitate de a introduce o nouă bucată de ADN sau o genă întreagă. Această metodă este
cunoscută ca un knock-in de gene.
Pentru a obține o genă knock-in, trebuie să existe un șablon ADN pentru reparare cunoscut sub numele
de șablon donator. Acest șablon donor constă din secvența sau gena de interes flancată de regiuni de omologie
care se potrivesc cu zona de pe fiecare parte a tăieturii. Donatorul este livrat celulelor care sunt proiectate,
împreună cu celelalte componente de editare ale Cas9 și sgRNA.
Knock-in-urile genelor au reprezentat o descoperire cheie în biotehnologie, inclusiv producția de
proteine recombinante, creșterea viabilității liniilor celulare imortalizate și modelarea de precizie a bolii. Poate
cel mai important, CRISPR knock-in poate fi folosit în terapiile celulare și genice pentru a corecta mutațiile
genetice care cauzează boli umane.
În comparație cu knockout-ul genelor, knock-in-urile genelor sunt mai provocatoare. Acest lucru se
datorează faptului că HDR este o cale de reparare mai puțin obișnuită decât NHEJ, care are loc doar în anumite
etape ale ciclului celular. Frecvența scăzută a HDR are ca rezultat, de obicei, eficiențe reduse. Cu toate acestea,
oamenii de știință au creat metode pentru a depăși acest obstacol, inclusiv optimizarea experimentală detaliată,
sincronizarea ciclului celular și tratamente care fie îmbunătățesc HDR, fie dezactivează NHEJ pentru experimente
de tip knock-in.

CRISPRa & CRISPRi

CRISPR-Cas9 poate fi folosit pentru a șterge (KO) sau a insera (KI), dar cu mici modificări, poate fi folosit
și pentru a regla expresia genelor. Acest lucru este cunoscut sub numele de activare CRISPR (CRISPRa) și
interferență CRISPR (CRISPRi). CRISPRa este folosit pentru a crește (reglare în sus) expresia unei gene, în timp ce
CRISPRi poate reduce (regla în jos) expresia unei gene.
Ambele tehnologii funcționează prin fuzionarea unei variante proiectate de Cas9 cunoscută sub numele
de Cas9 mort catalitic (dCas9) cu efectori transcripționali pentru a modula expresia genei țintă. dCas9 nu poate
tăia ADN-ul și, prin urmare, conduce pur și simplu efectorii transcripționali la gena de interes.
Acești modulatori de gene au multe aplicații de cercetare, inclusiv biologia dezvoltării, bolile infecțioase,
progresia bolii, genomica funcțională și screening-ul pentru elemente genetice care mediază rezistența la
medicamente.

Ecranele CRISPR

Flux de lucru al unui ecran CRISPR cu matrice tipice, realizat în format de placă multiwell

Tehnologia CRISPR-Cas9 a permis studii de screening foarte precise, la scară largă, pentru cercetarea
descoperirii de medicamente, permițându-ne să dezlegem mai ușor relațiile dintre genotip și fenotip. Ecranele
CRISPR implică de obicei generarea unei biblioteci mari de sgRNA care vizează diferite gene, efectuând o gamă
largă de modificări la o anumită linie celulară, apoi analizând efectele modificărilor asupra fenotipului celulelor.
Prin efectuarea de knockouts a mai multor gene într-o linie celulară sănătoasă, cercetătorii sunt capabili
să identifice care gene sunt implicate în patogeneza bolii, în timp ce aceeași metodă într-o linie celulară bolnavă
poate identifica care gene sunt ținte ideale pentru medicamente. Ecranele CRISPR oferă rezultate mai
consistente, cu mai puține efecte în afara țintei decât ecranele ARNi care au fost folosite anterior pentru
descoperirea medicamentelor. Abordarea sgRNA knockout multi-ghid utilizată de Synthego face aceste ecrane și
mai fiabile pentru identificarea și validarea țintei.

Editare de bază și editare primară

Unele dintre cele mai recent dezvoltate metode CRISPR sunt editarea de bază și editarea primară. Aceste
tehnologii funcționează pe același principiu, dar la o scară mai precisă, inducând substituții de un singur
nucleotide. Este important că editarea de bază și editarea primară nu induc DSB-uri în ADN-ul țintă.
Editarea de bază folosește fie un Cas9 mort catalitic (dCas9), fie o nickază Cas9 (nCas9). dCas9 este
incapabil să taie ADN-ul, în timp ce nCas9 produce „spărturi” sau rupturi monocatenare (SSB) în ADN. Prin
fuzionarea fie dCas9, fie nCas9 cu o enzimă de modificare a ADN-ului, cercetătorii pot modifica nucleotide
specifice. Una dintre limitările editării de bază este că nu pot fi utilizate pentru a modifica fiecare nucleotidă
posibilă, iar acesta este unul dintre factorii care au condus la dezvoltarea editării prime.
 Editarea primară implică fuzionarea nCas9 cu o transcriptază inversă proiectată și un ARN ghid de
editare primară (pegRNA). PegRNA conține două secțiuni: una care ghidează către regiunea de interes și alta
care conține substituția/ele dorite pentru reparare după ce a fost generată tăietura monocatenară. După ce o
catenă a fost modificată de către editorul principal, catena complementară poate fi, de asemenea, corectată - un
ARNg suplimentar și nCas9 vor crea o tăietură în catena și va fi reparată folosind catena editată anterior ca
șablon. Se prevede că editarea primă va fi capabilă să trateze 89% din mutațiile genetice la oameni.

Editare de bază Editare primară

 Mutații de inserție și deleție
 Rate scăzute de eroare
 Mutații de substituție
 Poate media toate cele patru mutații ale
 Rezultate genetice fiabile, previzibile și eficiente
punctului de tranziție
 Nu necesită HDR bazat pe șablon
 Poate media toate cele opt mutații
 Evitarea rupurilor nedorite de ADN dublu catenar și a
punctuale transversale
rearanjamentelor genomice mari
 Se poate introduce până la 45 bps
 Poate șterge până la 80 bp

4 Aplicații importante ale tehnologiei CRISPR

În doar câțiva ani, CRISPR a avut un impact masiv asupra cercetării științifice, contribuind la
descoperiri în medicină și biotehnologie. Să aruncăm o privire mai atentă la unele dintre aplicațiile cheie
ale acestei tehnologii.

1. Terapii celulare și genice

CRISPR este gata să revoluționeze medicina, cu potențialul de a vindeca o serie de boli genetice,
inclusiv boli neurodegenerative, tulburări de sânge, cancer și tulburări oculare. După cum am menționat
mai devreme, primul studiu al unei terapii cu celule CRISPR a fost efectuat în 2019, tratând pacienți cu
drepanocitoză. Tratamentul a restabilit hemoglobina fetală, eliminând necesitatea unei copii funcționale
a hemoglobinei adulte.
În 2021, un studiu semnificativ CRISPR pentru amiloidoza cu transtiretină, o boală
neurodegenerativă, a arătat rezultate foarte promițătoare. De asemenea, revoluționează tratamentul
cancerului pediatric, descris în acest interviu podcast cu Shondra Miller de la St Jude’s.
CRISPR poate fi, de asemenea, utilizat pentru a genera celule T ale receptorului antigen himeric
(CAR), o formă de imunoterapie utilizată pentru tratarea cancerului. Celulele T sunt extrase de la
pacienți și proiectate pentru a exprima receptorii de antigen himeric înainte de a fi reinjectate în
organism. Receptorii permit celulelor T să țintească și să distrugă mai eficient tipul specific de cancer de
care suferă pacientul.
În timp ce suntem încă în primii ani ai studiilor clinice, această tehnologie ar putea fi folosită
pentru a trata mii de afecțiuni genetice în viitor, inclusiv cancerul de sân și ovarian legat de mutațiile
BRCA, boala Huntington, Tay-Sachs, beta-talasemia, fibroza chistică. și boala Alzheimer cu debut
precoce. Pentru toate cele mai recente evoluții medicale și studii clinice care utilizează această
tehnologie pentru a vindeca o serie de boli umane, puteți arunca o privire pe site-ul CRISPR Medicine
News.

2. Diagnosticare
În timpul pandemiei de COVID 19, CRISPR a fost folosit atât ca instrument terapeutic potențial,
cât și ca instrument de diagnosticare pentru coronavirus. Kitul de testare SHERLOCK™ CRISPR
SARS-CoV-2 a primit autorizație de utilizare de urgență de la autoritățile federale pentru a fi utilizat în
setările de laborator. Puteți afla mai multe despre SHERLOCK și testul de diagnostic STOPCovid
dezvoltat mai recent aici și în acest podcast.
Mammoth Biosciences a dezvoltat, de asemenea, o metodă de diagnosticare a Covid-19 bazată pe
CRISPR, cunoscută sub numele DETECTR. La fel ca SHERLOCK și STOPCovid, DETECTR utilizează funcția de căutare
a Cas9 pentru a detecta materialul genetic din virus, utilizând nucleaze Cas naturale, cum ar fi Cas12 și Cas13.
Pentru mai multe informații despre DETECTR, puteți asculta acest interviu cu Trevor Martin, CEO al Mammoth
Bioscience.
 Diagnosticele similare care utilizează funcția de căutare a Cas9 au fost, de asemenea, concepute pentru
a identifica alte boli, atât infecțioase, cât și genetice. La începutul anului 2021, dr. Kiana Aran de la Cardea Bio a
publicat un studiu care a combinat trei tehnologii diferite, câștigătoare a Premiului Nobel - grafen, tranzistori și
CRISPR - într-un mic cip care poate detecta polimorfismele de un singur nucleotide (SNP) patogene. Deoarece
50% dintre mutațiile care cauzează boli la oameni sunt SNP, aceasta este o descoperire semnificativă în
diagnosticul medical.

3. Agricultura
Tehnologia de editare genetică are un potențial imens în agricultură, iar experții sugerează că alimentele
modificate cu CRISPR vor fi disponibile în 5-10 ani. Acest lucru se datorează în primul rând pentru că poate fi
folosit pentru a crea culturi care sunt rezistente la boli și la secetă. De exemplu, oamenii de știință de la
Universitatea din Berkeley și Innovative Genomics Institute au colaborat cu Mars, Inc. pentru a crea plante de
cacao rezistente la boli.
Poate fi folosit și pentru a prelungi perioada de valabilitate a altor alimente perisabile, reducând risipa
alimentară și permițând accesul la alimente sănătoase la un cost relativ scăzut. Pentru mai multe informații
despre aceste aplicații, puteți citi prezentarea noastră de ansamblu asupra utilizării CRISPR în agricultură.

4. Bioenergie
Fiind una dintre alternativele de top la combustibilii fosili, bioenergia se află în centrul atenției de ceva
vreme. Cu toate acestea, există mai multe obstacole în calea producerii biocombustibililor la scară. Utilizând
CRISPR, oamenii de știință au reușit recent să facă unele progrese semnificative în acest domeniu.
De exemplu, KO a multiplilor factori de transcripție care controlează producția de lipide în alge a condus
la o creștere uriașă a producției de lipide pentru generarea de biodiesel. În mod similar, editarea genelor poate
îmbunătăți toleranța drojdiei la condiții dure în timpul producției de biocombustibili. De asemenea, a crescut
eficiența editării la speciile bacteriene care sunt folosite pentru a produce etanol. Pentru mai multe detalii,
puteți consulta acest blog despre cum CRISPR ajută industria biocombustibililor.

Continuare...

https://www.synthego.com/learn/crispr