TIP DOCUMENT

Cod: PS-18
PROCEDURA SPECIFICA
Editia/Revizie: 1/0
POLICLINICA LIANA
LABORATOR DE Data intrarii in
ANALIZE MEDICALE vigoare:
DETERMINARI MICROBIOLOGICE IN
27.02.2019
SECRETII BIOLOGICE
Pagina: 1/12

DETERMINARI MICROBIOLOGICE IN
SECRETII BIOLOGICE
Cod: PS-18

Elaborat Verificat Aprobat

Nume : Dr. Tapurin Doina Dr. Tapurin Doina Dr. Macavei Iulica
Functia : Manager Tehnic Manager Tehnic Administrator
Semnatura:
 TIP DOCUMENT
Cod: PS-18
PROCEDURA SPECIFICA
Editia/Revizie: 1/0
POLICLINICA LIANA
LABORATOR DE Data intrarii in
ANALIZE MEDICALE vigoare:
DETERMINARI MICROBIOLOGICE IN
27.02.2019
SECRETII BIOLOGICE
Pagina: 2/12

Data: 26.02.2019 26.02.2019 27.02.2019

LISTA DIFUZARE/ RETRAGERE

Difuzare Retragere
Cod Nr.
Editia /
document exemplar Semnatura Nume
Revizia Nume Prenume/ Semnatura/
/ Prenume/
Functia Data
Data Functia
Dr. Tapurin Doina /
PS-18 1/0 1 27.02.201
MT, RA
9
Dr. Macavei Iulica /
PS-18 1/0 2 27.02.201
Adm
9
Dr. Tircol Claudia/
PS-18 1/0 3 27.02.201
RC, RA
9
Burada Lavinia/
PS-18 1/0 4 27.02.201
As. Lab.
9
PS-18 1/0 5 RENAR
 TIP DOCUMENT
Cod: PS-18
PROCEDURA SPECIFICA
Editia/Revizie: 1/0
POLICLINICA LIANA
LABORATOR DE Data intrarii in
ANALIZE MEDICALE vigoare:
DETERMINARI MICROBIOLOGICE IN
27.02.2019
SECRETII BIOLOGICE
Pagina: 3/12

ISTORICUL EDITIILOR/REVIZIILOR

Nume si prenume/Functie
Editia / Data editiei / Descrierea
Revizia reviziei modificarii
Elaborat Verificat Aprobat
Prima editie ca
urmare a MT / Dr. MT / Dr. Adm / Dr.
1/0 27.02.2019
extinderii de Tapurin Doina Tapurin Doina Macavei Iulica
domeniu
 TIP DOCUMENT
Cod: PS-18
PROCEDURA SPECIFICA
Editia/Revizie: 1/0
POLICLINICA LIANA
LABORATOR DE Data intrarii in
ANALIZE MEDICALE vigoare:
DETERMINARI MICROBIOLOGICE IN
27.02.2019
SECRETII BIOLOGICE
Pagina: 4/12

1. SCOP

Documentul are ca scop descrierea procedurii determinari microbiologice in secretii biologice aplicată
în Laboratorului de analize medicale al Policlinicii Liana, in vederea demonstrarii competentei
laboratorului.

- Principalii agenti patogeni intalniti in caz de otita medie sunt Pseudomonas spp, Streptococcus
pneumoniae, S. Pyogenes; mai rar se intalnesc Enterobacteriaceae si Staphylococcus aureus si levuri.
- Otitele externe sunt mai frecvent cauzate de Pseudomonas spp ,Enterobacteriaceae, ocazional de
Staphylococcus aureus
- In cazul conjunctivitelor, agentii etilolgici posibili sunt: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus
pyogenes,Staphylococcus aureus, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., levuri.
- In cazul uretritelor prinipalii agenti cauzanti sunt:, Trichomonas vaginalis, , Mycoplasma hominis,
Ureaplasma urealyticum,Pseudomonas spp, dar se pot intalni ca agenti etiologici posibili si
enterobacterii, stafilococi coagulozo-pozitivi, streptococi grup B si D, levuri ,etc
- Este implicata o mare varietate de agenti patogeni in cazul secretiilor purulente, mai frecvent bacterii –
stafilococi Staphylococcus aureus, streptococi –Streptococcus pyogenes, enterobacterii si fungi.
In laboratorul nostru se lucreaza doar microorganisme aerobe, din orice tip de seretie biologica.

Levurilor se testeaza si se identifica la cerere cu trusa CANDIFAST.

2. DOMENIU DE APLICARE

Procedura se aplica in compartimentul de "Microbiologie" din cadrul Laboratorului de analize

medicale al Policlinicii Liana pentru izolarea agentilor patogeni aerobi din secretiile biologice, implicati
in bolile produse la nivelul ochilor si urechilor – afectiuni conjunctivale si otice si infectii purulente –
cu diferite localizari.

3. DOCUMENTE DE REFERINŢĂ
 TIP DOCUMENT
Cod: PS-18
PROCEDURA SPECIFICA
Editia/Revizie: 1/0
POLICLINICA LIANA
LABORATOR DE Data intrarii in
ANALIZE MEDICALE vigoare:
DETERMINARI MICROBIOLOGICE IN
27.02.2019
SECRETII BIOLOGICE
Pagina: 5/12

3.1. SR EN ISO 15189:2013 – Laboratorare medicale. Cerinţe particulare pentru calitate şi

competenţă. Cap. 5.5.3
3.2. Tratat de Microbiologie Clinica – Dumitru Buiuc, Marian Negut. Ed. Medicala, 2009.
3.3. Diagnosticul de laborator – Mircea Ioan Popa, Editura Medica, 2004
3.4. EA 04/10:2002
3.5. Procedura auxiliara : Asigurarea biosecuritatii in laborator, cod PA-02
3.6. Procedura auxiliara : Sterilizarea materialelor infecte prin autoclavare , cod PA-04
3.7. Procedura auxiliara : Curatenia si dezinfectia in laborator, , cod PA-03
3.8. Procedura tehnica : Conditii de mediu si de lucru, cod PT-02
3.9. Procedura tehnica : Recoltarea, receptia si manipularea probelor biologice, cod PT-06
3.10. Procedura tehnica : Manipularea si depozitarea materialelor de referinta, cod PT-09
3.11. Procedura tehnica : Asigurarea calitatii rezultatelor, cod PT-10
3.12. Procedura tehnica : Raportarea si eliberarea rezultatelor, cod PT-13
3.13. Manual de recoltare, cod PT-06-A2
3.14. Procedura tehnica : Procese post-examinare, cod PT-09
3.15. Procedura tehnica : Control intern in microbiologie, cod PT-14
3.16. Procedura specifica : Identificarea agentilor patogeni, cod PS-16
3.17. Procedura specifica : Antibiograma, cod PS-21

4. DEFINIŢII ŞI ABREVIERI

4.1. Definiţii

COS – geloza Columbia cu 5% sange de oaie

CLED- Cisteina lactoza –deficit de electroliti
MCK – mediul MacConkey
HEKT –mediul Hektoen
TSI – mediu cu glucosa, lactoza , zaharoza si fier
MIU –M= mobilitate
- I =indol
- U =ureaza
LIZINA – mediu cu lizina
CITRAT SIMMONS – mediu cu citrat

Etajele anatomice supuse analizei, avand comunicare cu exteriorul, prezinta flora comensala, care poate
deveni patologica doar in cazuri exceptionale.
- Flora existenta la nivel otic este similara cu cea a pielii ; stafilococi coagulazo-negativi, streptococi
viridans, etc.
- Flora existenta la nivel conjunctival : stafilococi coagulazo-negativi, sterptococi viridans, etc.
- Secretia purulenta : poate afecta orice tesut si organ cu acumulare de puroi in interstitiile cutanate
(pustule, furuncule , hidrosadenite, abcese , gome), in tesuturile musculo-scheletale ( abcese, flegmoane,
osteomielita, etc.), in ganglionii limfatici, in viscere(abcese), in cavitati preformate (sinusuri paranazale,
 TIP DOCUMENT
Cod: PS-18
PROCEDURA SPECIFICA
Editia/Revizie: 1/0
POLICLINICA LIANA
LABORATOR DE Data intrarii in
ANALIZE MEDICALE vigoare:
DETERMINARI MICROBIOLOGICE IN
27.02.2019
SECRETII BIOLOGICE
Pagina: 6/12

urechea medie, seroase, meninge, pleura, pericard, peritoneu, sinoviale articulare), pe suprafete tisulare
denudate (plagi, arsuri). Colectiile purulente se pot deschide spontan prin una sau mai multe fistule.

4.2. Abrevieri

MT- Manager Tehnic

RC – Responsabil Calitate
SMC - Sistemul de management al calităţii
SIL – Sistemul informatic al laboratorului (programul de laborator şi reţeaua de calculatoare)

5. RESPONSABILITĂŢI

5.1. Administrator
 raspunde de asigurarea dotarii corespunzatoare a laboratorului cu materiale si reactivi.

5.2. Manager Tehnic

 asigura instruirea personalului executant privind prezenta procedura
 desemneaza personalul care efectueaza aceste tipuri de analize;
 decide oprirea analizelor in cazul identificarii neconformitatilor, inclusiv in cazul unor conditii
de mediu necorespunzatoare si reluarea analizelor dupa stingerea neconformitatilor.
 efectueaza interpretarea rezultatelor
 verifica si valideaza rezultatele
 decide modul de asigurare a calitatii rezultatelor, frecventa, desemneaza executantii si verifica
rezultatele;
 instruieste personalul executant privind normele SSM si SU.
 verifica efectuarea corecta a inregistrarilor efectuate in registrele de lucru.

5.3. Responsabil calitate

 asigura instruirea personalului pe linie de calitate;

5.4. Responsabilul de analiza

 insamanteaza probele
 analizeaza din punct de vedere microbiologic probele
 noteaza in registrele de lucru aspectele morfolologice culturale si microscopice ale probelor
 efectueaza identificarea si antibiograma bacteriilor
 stabileste diagnosticul de laborator al probelor
 deschide fise de neconformitati, aplica corectii si implementeaza actiuni corective eficiente
atunci cand rezultatele controlului intern sunt necorespunzatoare.
 efectueza controlul extern de calitate, transmite rezultatele laboratorului, interpreteaza
rezultatele primite de la organizatorul de scheme PT.
 verifica si valideaza rezultatele analizelor
 TIP DOCUMENT
Cod: PS-18
PROCEDURA SPECIFICA
Editia/Revizie: 1/0
POLICLINICA LIANA
LABORATOR DE Data intrarii in
ANALIZE MEDICALE vigoare:
DETERMINARI MICROBIOLOGICE IN
27.02.2019
SECRETII BIOLOGICE
Pagina: 7/12

5.5. Executantul de analiza

 isi insuseste prezenta procedura si o respecta intocmai;
 defineste interferentele/incompatibilitatile intre teste numai daca intervin modificari
 pastreaza reactivii conform instructiunilor producatorului si ii foloseste numai pana la data de
valabilitate indicata de producator;
 redacteaza electronic Buletinul de analize medicale;
 depoziteaza infectele corespunzator in vederea predarii pentru incinerare;
 informeaza MT asupra problemelor ivite pentru analiza .
 asigura curatenia aparatelor din laborator
 se ocupa de dezinfectia meselor de lucru, a hotei si a microscopului din dotare
 monitorizeaza conditiile de mediu
 efectueaza sterilizarea prin autoclavare a deseurilor in fiecare zi.

6. DESCRIERE PROCEDURĂ

6.1. Echipamente si resurse

 Hota cu flux laminar

 Termostat
 Autoclav
 Lampa UV
 Microscop optic
 Trusa de coloratie Gram
 STREPTOCOCCAL GROUPING KIT
 STAPHYTECT PLUS
 CANDIFAST
 MYCOFAST REVOLUTION
 Staphylococcus aureus ATCC 25923
 Candida albicans ATCC 10231
 E coli ATCC 25922
 Reactivi de catalaza
 Discuri optochin
 Mediu de cultura – placi Petri cu mediu geloza Columbia cu 5% sange oaie , CLED
Sabuoraud -gata de utilizare
 Teste biochimice : TSI,MIU,LIZINA, CITRAT SIMMONS ; benzi indol
 Lame de microscop
 Pipete sterile
 Anse sterile de unica folosinta
 TIP DOCUMENT
Cod: PS-18
PROCEDURA SPECIFICA
Editia/Revizie: 1/0
POLICLINICA LIANA
LABORATOR DE Data intrarii in
ANALIZE MEDICALE vigoare:
DETERMINARI MICROBIOLOGICE IN
27.02.2019
SECRETII BIOLOGICE
Pagina: 8/12

 Solutie dezinfectanta

6.2. Reguli de procedura

6.2.1. Proba

Recoltarea probelor se face conform - intructiunilor de recoltare si receptia probelor supuse analizelor
microbiologice prezentate in procedura tehnica : Recoltarea, receptia si manipularea probelor biologice,
cod PT-06 si in Manualul recoltarii, cod PT-06-A2.

Secretii otice
- urechea externă –se preleveaza exudatul din canalul auditiv extern cu un tampon steril
- urechea medie –prelevatul de electie este exudatul aspirat prin timpanocenteza in caz de perforare
spontana a timpanului se examineaza exudatul prelevat pe un tampon fin steril ghidat printr-un
speculum auricular catre fistula auricular
Recoltarea probelor din urechea medie sunt facute in principiu de medicul ORL.

Secretii conjunctivale -
Pentru a asigura calitatea probelor acestea se preleveaza inainte de :
- toaleta fetei
- terapia antimicrobiana
- aplicarea solutiei de fluoresceina,
- machiaj.
Se examineaza dupa caz :
- exudatul acumulat in sacul conjunctival si pe suprafata ambelor conjunctive
- exudatul seros sau sero-purulent aspirat cu micropipeta din sacul conjunctival,
- raclatul , realizat separat de pe conjunctiva tarsala superioara si inferioara.
Toate aceste tehnici sunt in principiu apanajul oftalmologului.
Se recoltează câte un tampon pentru fiecare ochi
Se realizează câte un frotiu pèntru fiecare ochi.

Secretii purulente
Prelevarea probelor din supuratii este frecvent unica si irepetabila.
Tampoanele sunt contraindicate ori de cate ori este posibila recoltarea prin punctie-aspiratie,
chiuretaj sau biopsie.
Cand este necesara , irigarea leziunilor se face cu solutii saline non-inibitorii , cum este solutia
Ringer lactozata.
Leziunile cronice sunt sarace in bacterii , de aceea se impun prelevate probe cu volum mai mare
decat din leziunile acute.

Probele supuse încercărilor microbiologice se înregistreaza, se codifica si se eticheteaza.

 TIP DOCUMENT
Cod: PS-18
PROCEDURA SPECIFICA
Editia/Revizie: 1/0
POLICLINICA LIANA
LABORATOR DE Data intrarii in
ANALIZE MEDICALE vigoare:
DETERMINARI MICROBIOLOGICE IN
27.02.2019
SECRETII BIOLOGICE
Pagina: 9/12

Transportul
Transportul se realizeaza in recipiente cu mediu de transport: asistenta aduce probele recoltate in
laborator, domeniul de microbiologie, in cutii cu capac. Identificarea probei prin cod se păstrează pe toată
durata existenţei probei în laborator.
Pentru secretii purulente timpul de transport este esential -1-2 ore maxim pe mediu de transport.

6.2.2. Metoda de lucru

6.2.2.1. Pregatirea

Prima zi :
Se porneste lampa UV si se mentine pornita 30 minute.
Se scot din frigider plăcile Petri cu geloza Columbia cu 5 % sange , CLED , Sabouraud şi se pun pe
masa de lucru pentru aclimatizare. Pe placile Petri ce contin gelozele mai sus mentionate se noteaza codul
probei pentru a putea fi apoi identificată si data in care s.-a facut insamantarea. Pe o placă se însămânţează
câte două probe.
Insamantarea si incubarea probei (lor):
- tamponul se scoate din tub si se descarca prin rotire pe toate partile, pe gelozele mai sus amintite
- inoculul primar se descarca intr-un colt al placii dupa care cu ansa de unica folosinta se disperseaza-
metoda poligonului deschis. După ce s-au însămânţat pe geloze, plăcile se pun în termostat la 37 oC, pentru
incubare la 18-24 ore..
Dupa insamantarea probelor, recoltoarele ce contin prelevatul de incercat, se aseaza in pungile
autoclavabile din interiorul galetilor de infecte.
Hota se dezinfecteaza in interior cu solutie dezinfectanta , se activeaza lampa UV care se mentine
timp de o ora.

A doua zi - după perioada de incubare plăcile se scot din termostat şi se examinează macroscopic.
Se analizeaza macroscopic coloniile prezente pe suprafata placilor si se noteaza in registrul de
lucru.

6.2.2.2. Descriere aspect colonii

Pe geloza Columbia cu sange

- colonii beta hemolitice –Streptococcus pyogenes
- colonii ’ hemolitice – Streptococcus agalactiae – grup B
- colonii  hemolitice – Streptococcus viridans, Streptococcus –grup D
- colonii gri lucioase hemolitice, nehemolitice, plate sau bombate – specii de enterobacterii (E. coli,
Klebsiella sp.) colonii gri lucioase invazive – specii de Proteus
colonii gri, cu luciu metalic, hemolitice, cu miros aromat – specii Pseumomonas spp

Pe geloza CLED
- colonii lactozo pozitive – specii de E.coli, Klebsiella
 TIP DOCUMENT
Cod: PS-18
PROCEDURA SPECIFICA
Editia/Revizie: 1/0
POLICLINICA LIANA
LABORATOR DE Data intrarii in
ANALIZE MEDICALE vigoare:
DETERMINARI MICROBIOLOGICE IN
27.02.2019
SECRETII BIOLOGICE
Pagina: 10/12

- colonii lactozo negative – specii Proteus. Pseudomonas spp

- colonii mici galben portocalii – specii de Streptococcus –grup D
- colonii galbene mici –Staphylococcus aureus
- colonii mici albe – verzui specii de stafilococi altii decat S. aureus
- colonii mici verzui translucide Streptococcus agalactiae

Pe mediul Sabouraud
Colonii albe , mate -levuri

6.2.2.3. Identificare specii bacteriene izolate din secretii biologice

6.2.2.3.1. Examinare placi si repicare

Pe geloza Columbia cu sange – coloniile isolate, caracteristice uneia din speciile bacteriene redate
in pct. 6.2.2.2. se repica in sectoare .
Speciile de Streptococ beta si alfa hemolitic - pe Columbia cu sange se repica in sector colonii beta
hemolitice. Placile se incubeaza la 37oC – 24 ore. Dupa incubare se scot placile din incubator si din
fiecare sector repicat se fac identificari de grup cu trusa STREPTOCOCCAL GROUPING KIT, in 10
minute conform procedurii "Identificarea germenilor patogeni", cod PS-16
Speciile de streptococi viridans- pe COS se repica in sector colonii alfa hemolitice ; peste fiecare
sector repicat se pune un disc de optochin. Placile se incubeaza la 37 oC – 24 ore. Dupa perioada de
incubare, se scot placile din incubator si se observa daca s-au produs zone de inhibitie in jurul discului
de optochin, care trebuie sa aiba un diametru> 12 mm ( pentru identificarea pneumococului).
Mediul Sabuoraud se mai poate lasa pe masa de lucru inca 3-4 zile .
Speciile de enterobacterii si Pseudomonas spp se identifica cu ajutorul testelor biochimice conform
procedurii "Identificarea germenilor patogeni", cod PS-16.
Staphylococcus aureus se identifica cu trusa STAPHYTECT PLUS, conform procedurii
"Identificarea germenilor patogeni", cod PS-16
Levurile se identifica la cerere cu trusa CANDIFAST, conform procedurii "Identificarea
germenilor patogeni", cod PS-16

6.2.2.3.2. Examinare microscopica

Fiecare secretie recoltata trebuie sa fie insotita de 2 frotiuri - care se coloreaza Gram si Giemsa -se
examineaza la microscop cu obiectiv de X 40 sau X100. Daca pe frotiuri se constata prezenta celulelor
inflamatorii, culturile respective se lucreaza – se fac identificari si antibiograme din coloniile cu aspect
sugestiv, dezvoltate pe suprafata gelozelor.
Se noteaza forma si culoarea celulelor bacteriene prezente pe frotiu , numarul PMN-urilor, prezenta sau
absenta levurilor si a Trichomonas vaginalis.

6.2.3. Prelucrare rezultate - criterii calitative

 TIP DOCUMENT
Cod: PS-18
PROCEDURA SPECIFICA
Editia/Revizie: 1/0
POLICLINICA LIANA
LABORATOR DE Data intrarii in
ANALIZE MEDICALE vigoare:
DETERMINARI MICROBIOLOGICE IN
27.02.2019
SECRETII BIOLOGICE
Pagina: 11/12

6.2.3.1. Criterii calitative :

Dupa ce s-a efectuat identificarea speciei (iilor) bacteriene, rezultatele se noteaza in registrul de lucru
alaturi de testele efectuate pentru identificare. Buletinele de analiza se semneaza de catre responsabilul
care a efectuat identificarea.

6.2.3.2. Raportare rezultate

6.2.3.2.1. Când nu a crescut nici o colonie caracteristica speciilor bacteriene patogene – se specifica in
registru ca necrescut in dreptul fiecarui tip de geloze utilizate.
In functie de organismul recomandat pentru izolare se specifica pe rapoartele de analiza - ex : pentru
analiza prelevat pentru o anumita specie bacteriana
Nu s-au izolat specii de Streptococ beta hemolitic
Nu s-au izolat Enterobacterii.
Nu s-a izolat Streptococcus agalactiae
Nu s-a izolat Staphylococcus aureus .
Nu s-a izolat Streptococcus pneumoniae.
Nu s-au izolat levuri.
Nu s-au identificat specii de Pseudomonas spp.

6.2.3.2.2. Se noteaza rezultatul frotiului - prezenta in special a celulelor inflamatorii si a celulelor

bacteriene si se specifica specia (iile) bacteriana (ene) izolata si identificata:
Streptococ beta hemolitic –prezent
Enterobacterii prezente ( se specifica genul)
Streptococcus agalactiae - prezent
Staphylococcus aureus - prezent
Streptococcus pneumoniaei - prezent.
Pseudomonas spp –prezent.
Levuri –prezente ( la cerere se identifica cu trusa CANDIFAST).

6.2.4. Incertitudinea de masurare

Pentru aprecierea incertitudinii de masurare se tine cont de bugetul de surse de eroare posibile precizat in
procedura tehnica "Incertitudinea de masurare", cod PT-08, repetabilitate si reproductibilitate.

Repetabilitate :
O data pe luna se lucreaza in dublu o proba din fiecare tip de secretie biologica conform modului de
lucru descris anterior. Rezultatele obtinute se specifica in registrul de lucru.

Reproductibilitate:
O data pe luna se lucreaza o proba din fiecare tip secretie biologica si de un alt biolog sau medic, dupa
caz, iar rezultatele se inscriu in registrul de lucru.
 TIP DOCUMENT
Cod: PS-18
PROCEDURA SPECIFICA
Editia/Revizie: 1/0
POLICLINICA LIANA
LABORATOR DE Data intrarii in
ANALIZE MEDICALE vigoare:
DETERMINARI MICROBIOLOGICE IN
27.02.2019
SECRETII BIOLOGICE
Pagina: 12/12

7. ÎNREGISTRARI ŞI ANEXE

7.1 Înregistrări

7.1.1 Lista de lucru

7.1.2 Registru receptie probe
7.1.3 Registru de analize- microbiologie
7.1.4 Registrul de reactivi dati in consum
7.1.5 Buletinul de analiza
7.1.6 Registru de evidenta control intern