Prefa

Monografia se adreseaz studenilor n medicin, rezidenilor i specialitilor n medicin de laborator. Progresul microbiologiei se explic prin noutile oferite de cercetarea interdisciplinar n biologie, biochimie, fizic, genetic, biologie celular i molecular. La nivelul studiilor universitare medicale se observ tendina de integrare a dou discipline conexe: Microbiologia i Imunologia. Prima prezint principalii ageni infecioi care agreseaz macroorganismul iar a doua disciplin prezint mecanismele de rspuns imunitar, normal i patologic. Se studiaz permanent interrelaia microorganism-macroorganism, cu aspectele clinico-patogenetice i de diagnostic de laborator direct i indirect, clasic i modern.

Autoarea
ABREVIERI
aa - aminoiacid AB - antibiotic AC - anticorp ADCC - citotoxicitate anticorpo-dependent AG - antigen

AMC - anticorp monoclonal BF - bacteriofag C - gen imunoglobulinic ce codific poriunea constant C` - sistem complement CB - corpuscul bazal CD - cluster de difereniere (antigen de difereniere) CIC - complexe imune circulante CIE - complex imun elementar CMH - complex major de histocompatibilitate CPA - celul prezentatoare de antigen CS - component secretor (al IgAs) Cx - fraciune activat a sistemului complement D - gen imunoglobulinic de diversitate Dg - diagnostic ELISA - reacie imunoenzimatic Fab - fragment de legare al antigenului Fc - fragment imunoglobulinic cristalizabil GM - greutate molecular GM - greutate molecular H - lan greu imunoglobulinic HT - hipersensibilitate HTT - hipersensibilitate de tip tardiv HTT - hipersensibilitate de tip tardiv i.d.r. - intradermic i.m. - intramuscular i.v. - intravenos IDR - intradermoreacie IF - imunoflorescena If - limit floculant Ig - imunoglobulin IgAs - imunoglobulin A secretoare IL - interleukin Im - intramuscular IMC - imunitate mediat celular

INF - interferon IOC - indice opsono-citofagic IU - imunitate umoral j - gen de legtur imunoglobulinic J - pies de legtur a IgAs K - celul killer K - kilodaltoni L - lan imunoglobulinic uor LES - lupus eritematos sistemic Lf TC - limfocit T citotoxic Lf TDH - limfocit de hipersensibilitate tardiv Lf TH - limfocit T helpet Lf TS - limfocit T supresor Lf - limfocit LP - lipoprotein LPZ - lipopolizaharid MAF - factor de activare al macrofagului MC - membran citoplasmatic MF - macrofag mf - metabolit focal MIF - factor de inhibare al migrrii macrofagului Mo - monocit MPO - mieloperoxidaza NK - celul uciga natral (natural killer) PC - perete celular PCR - reacia n lan a polimerazei PG - peptidoglican PMN - polimorfonucleare PZ - polizaharid RA - risc absolut RFC - reacie cu fixare de complement RIA - reacie radioimunologic RR - risc relativ SFM - sistem fagocitar mononuclear SHM - untul hexozo-monofosfat SIM - sistem imun al mucoaselor SIS - sistem imun sistemic TCR - receptorul pt. antigen al limfocitului T TNF - factor necrozant tumoral TTSA - antigen tumoral de transplantare UA - unitate antitoxic

- gen de variabilitate (imunoglobulinic)

CUPRINS
Partea I MICROBIOLOGIE GENERAL

CAPITOLUL 1 LUMEA MICROBIAN

Microbiologia - cuprinde totalitatea tiinelor biologice care au ca obiect de studiu microorganismele (mikros n limba greac = mic, bios = via). Microorganismele fac parte din regnul Protista, cel de-al treilea regn, alturi de cel animal i vegetal. Microorganismele (regn Protista) sunt organisme unicelulare, iar atunci cnd sunt pluricelulare, nu formeaz esuturi difereniate. Regnul Protista poate fi subdivizat n: 1. Protiste superioare - constituite din celule de tip eucariot i cuprind: - algele (Algologia) - protozoarele (Protozologia) - mucegaiurile, fungii (Micologia) 2. Protiste inferioare - cuprind organisme unicelulare de tip procariot, n care sunt cuprinse: - algele verzi-albastre (Algologia) - bacteriile (Bacteriologia) Pentru practica medical este necesar cunoaterea agenilor etiologici ai unui proces infecios. Disciplina va lua n considerare i agenii infecioi fr structura celular, virusurile, viroizii i prionii, ageni infecioi care constituie obiectul de studiu al Virusologiei. n strns dependen cu procesul infecios s-a dezvoltat i tiina ce investigheaz mijloacele de aprare ale macroorganismului (nespecifice i specifice) fa de agenii infecioi - noua disciplin fiind denumit Imunologie. Bacteriologia Protozologia Imunologia: Micologia Algologia Virusologia (aprare macroorganism) (agresiune microorganism).

11

Taxonomie bacterian
Pentru scopuri strict medicale este suficient s se opereze cu noiunile de familie, gen, specie. Familia cuprinde unul sau mai multe genuri bacteriene; genul bacterian cuprinde una sau mai multe specii. Exemplu: Familia: Micrococaceae Genul : Staphylococcus Specia : Staphylococcus aureus

12

CAPITOLUL 2 MORFOLOGIA BACTERIAN

Morfologia bacterian studiaz forma, dimensiunile i aezarea celulelor n urma diviziunii. Se disting 3 forme fundamentale bacteriene: forma sferic (coci); forma cu aspect de bastona (bacili); forma spiralat.
Fig. 1 Principalele forme bacteriene

Cocii
Au dimensiuni de un micrometru Uneori exist i excepii de la forma sferic. Ex.: - pneumococul: aspect de flacr de lumnare; - gonococul i meningococul: aspect reniform. Cocii pot avea aezri absolut caracteristice, putnd fi uor recunoscui n frotiu (lucrri practice). Ex.: - Stafilococii - se dispun sub forma de grmezi, care imit ciorchinii de struguri - Streptococii - se dispun n lanuri - pneumococii --| - meningococii --| se dispun n perechi - gonococii --| (in diplo- se mai numesc i diplococi)

13

Fig. 2- Plan general de organizare al celulei bacteriene (51)

Bacilii
Au form de bastona, cu dimensiuni cuprinse ntre 2-11 m lungime i 0,2-1,1 m lime. Exist i excepii de la forma cilindric. Ex.: - bacilul difteric - are forma de haltera, datorit corpusculilor metacromatici - bacilul tetanic - are form de ac cu gmlie datorit sporului - Fusobacterium - are forma de fus i bacilii pot avea aezri absolut caracteristice. Ex.: - bacilul crbunos - se dispune sub forma de lanuri (streptobacili); - bacilul tuberculos - se dispune n grmezi care imit litere majuscule (M,Y,N,W) - bacilul difteric - se dispune n grmezi care imit literele chinezeti

Cocobacilii
Sunt forme de trecere ntre coci i bacili, cu diametrul longitudinal foarte apropiat ca dimensiune cu cel transversal (L:0,4-0,8 m i l: 0,2-0,4 m). Exemple: genurile Brucella, Bordetella, Yersinia.

Forma spiralat
Celula este nvrtit n spire. Exemple: - vibrion - celul cu o singur spir (aspect de virgul - ex.: vibrionul holeric) - spirili - celul cu mai multe spire, cu perete celular rigid - ex.: genul Campylobacter - spirochete - celula cu mai multe spire, cu perete celular flexibil - ex.: genurile Treponema, Leptospira 14

Forme pleiomorfe
n cazul n care bacteriile sunt lipsite de perete celular (Mollicutes) sau formele L bacteriene (obinute n laborator sau sub aciunea chimioterapicelor), morfologia celulei poate fi: filamentoas, cocoidal, n form de par etc.

Celula bacterian - celul procariot Planul general de organizare al celulei bacteriene

Metodele de studiu ale celulei bacteriene includ tehnici de: microscopie optic microscopie electronic dezintegrare ale celulei bacteriene prin: - centrifugri fracionate; - majorare cu ultrasunete; - tehnici crioscopice; - marcare ADN cu izotopi radioactivi. Celula procariot este alctuit din 2 categorii de structuri subcelulare: Obligatorii: nucleoid, citoplasma, membrana citoplasmatic, peretele celular. Facultative: capsula, cili, pili, endospori. Formaiunile facultative nu sunt implicate n supravieuirea celulei.
Fig. 3 Structura general a unei celule bacteriene (64)

15

Tabelul nr.1 - Caracteristicile comparative ale celulei procariote i eucariote: Structura Nucleul Celula eucariot Nucleu cu nucleol Nucleu cu membran proprie Sunt prezeni cromozomii Celula procariot Are un echivalent nuclear (nucleoidul) fr nucleol, fr membrana proprie, fr cromozomi propriuzii. Este o molecul de ADN nchis circular covalent Este necompartimentat, fr organite celulare

Citoplasma

Ribozomii

Este compartimentat, cu organite celulare: mitocondrii, reticul endoplasmatic, aparat Golgi 80 S (cu 2 subuniti 60 S i 70 S (cu 2 subuniti de 30 40 S) S i 50 S) Cu perete celular cu structur proprie: peptidoglicanul Prin sciziparitate

Perete celular Fr Diviziunea celular Prin mitoz

16

Nucleoidul
Formaiune compact cu diametrul de 0,5m) Ocup zona central din celul (fr ribozomi) Conine: 1 molecul ADN, cu L 1000 m, cu GM de 2,8x109 daltoni. - molecula de ADN este nchis circular covalent, cu structur hiperhelicoidal. La microscopie electronic apar anse cu incizuri. - molecula de ARN - n curs de sintez, legat de molecula de ADN prin enzima ARN polimeraz. - proteine bazice (histon-like), ataate de molecula de ADN, dau imagine de tip cromatin la celulele eucariote (formaiuni nucleozomilike: domenii ale moleculei de ADN); pot da reacii imunitare ncruciate. Exemple: Bacil Coli - Bacil Subtillis - enzime - topoizomeraze i giraze - menin structura hiperhelicoidal a moleculei de ADN i mobilitatea acesteia. Nucleoidul este ataat de membrana celular printr-un mezozom. Prin aceast legare se asigur separarea celor 2 molecule de ADN, n urma replicrii. Culturile cu diviziune rapid conin celule care par s aib 2-4 nuclei (e o desincronizare ntre replicarea moleculei de ADN i diviziunea celular). Nucleoidul - confer ereditatea cromozomial.

Plasmidele
Se gsesc uneori n citoplasm. Sunt molecule de ADN nchise circular covalent, de mrimi diferite, dar mult mai mici dect nucleoidul. Rspund de ereditatea extracromozomial.

Citoplasma
- fin granular sau omogen - necompartimentat (nu are plastide celulare) - bazofilie intens (cantitate de ARN crescut n citoplasma) Conine: - ARN - mesager, ribozomal, transport - incluzii - acumuleaz material de rezerva pentru sursa de carbon - formate din polimeri de: acid hidroxi-butiric, glicogen, amidon, volutin (corpusculi, Babe-Ernst la bacilul difteric). - vacuolele - substrat nutritiv - solubil sau gazos, nvelit ntr-un strat de molecul proteic. - ap, acizi nucleici - asigur starea de gel 17

- ribozomi - alctuii din - r-ARN (ARN ribozomal) - 2/3 i proteine - 1/3 - sunt formaiuni sferice cu diametrul 20 m - cu subuniti - S (small) de 30 S i - L (large) de 50 S - reprezint sediul sintezei proteice. - cele 2 subuniti S i L se asambleaz pe o molecul de m-ARN, formnd polisomi. - dup sintetizarea lanului polipeptidic, cele 2 subuniti se separ.

Membrana citoplasmatic
Conine mezozomi. Sunt invaginaii sub forma de saci sau lamele ale MC Metode de studiu ale membranei celulare a). MC se evideniaz prin inerea ei n medii cu osmolaritate crescut (coninutul celulei se elimin n mediu). b). MC se evideniaz prin obinerea de - protoplati sau - sferoplati la bacteriile gram +: prin tratare cu lizozim => protoplati, prin hidroliza total a peretelui celular la bacteriile gram -: prin tratare cu lizozim + EDTA => sferoplati (cu resturi de perete celular) MC are puncte de jonciune cu peretele celular (PC) c). Sedimentarea MC prin centrifugare, dup obinerea MC n medii hipertone. d). Examinarea MC la microscopul electronic. Structura membranei celulare Este o unitate de membran, constituit din glicolipide, glicoproteine Modele: Danielli-Dawson (n sandwich): - 1 strat lipidic ntre 2 straturi proteice - nefolosit, nedemonstrat Singer-Nicholson - modelul n mozaic (acceptat azi). Modelul Singer-Nicholson: MC este un dublu strat fosfolipidic fluid n care sunt implantate molecule proteice, aflate n dinamism continuu.
Fig. 4. Structura membranei celulare bacteriene (80)

18

Funciile membranei celulare Barier osmotic Transport endocelular Metabolic Secretorie Biosintetic De int pentru diferite substane

19

Bariera osmotic - de permeabilitate selectiv (nu permite golirea celulei). - asigur creterea concentraiei endocelulare de nutrieni din mediul ambiant. Transport endocelular - difuzie facilitat - transport activ cu consum de energie prin permeaze. - transport prin fosforilare la substrat (metabolism vectorial prin fosfotransferaze). Funcia metabolic - MC la procariote preia funcia mitocondriei (mitocondria e o celul procariot endocitat i transformat evolutiv). - la bacterii aerobe, n MC e structurat lanul respirator (eliberarea energiei prin transfer de electroni). - stocarea energiei prin procese de sintez a ATP-ului Funcia secretorie - de hidrolaze - macromoleculele din mediu sunt degradate n compui simpli. - la gram pozitivi, ele se excret n mediul extracelular. - la gram negativi, enzimele se sintetizeaz n spaiul periplasmic. Funcia biosintetic - Enzime ale MC care formeaz PC - Enzime ale MC care sintetizeaz fosfolipide - Enzime ale MC care intervin n replicarea ADN - Iniierea septului de separare ntre cele 2 celule fiice - Intervin n sporulare Funcia de int - MC reprezint inta pentru unele: - chimioterapice (ex.: Polimixina) - dezinfectante - substane folosite ca detergeni

Anvelopa celulei bacteriene

Constituit din: - membrana citoplasmatic - peretele celular - capsula - strat S (cristalin de suprafa) aprare fa de BF (bacteriofagi) i enzime. 20

Capsula - suprapus peste peretele celular - evideniat la microscopul optic, prin coloraii speciale (rou de rutenin, Burri) - de natur polizaharidic: - Streptococcus Pneumoniae - Haemophylus - Klebsiella - Clostridium perfringens - de natur polipeptidic - Bacillus anthracis (polimer acid D glutamic) - de acid hialuronic - Streptococ hemolitic Rolurile capsulei: Protejarea celulei fa de deshidratare Polizaharidul capsular e un antigen ce se folosete la identificare serologic Ex.: 80 tipuri pneumococice (dup polizaharid capsular). Identificare bacterian - diplococi ntr-o capsul comun, aspect patognomonic pentru pneumococ. Funcie antifagocitar (factor de patogenitate). Glicocalixul - masa de filamente Pz ntretiate (psl) - cel mai exterior strat (numai la unele bacterii exemplu: Streptococcus mutans). - nu se poate evidenia la bacteriile cultivate pe medii - realizeaz ataarea pe celulele umane, pe obiecte i formeaz microcolonii bacteriene care au un glicocalix comun Ex.: Streptococcus mutans - produce caria prin reacii biochimice: Lactoz Transferaza > Fructoz + Glucoz Glucoz > Glican (insolubil n ap) Polimerizare Lactoz > Glucoz + Fructoz Fructozil Fructoz Transferaza > Levan (insolubil n ap) Levan + Polimerizare Glican ------> ader pe smalul dentar prin glicocalix (se formeaz placa dentar i apoi caria).
Glucozil

21

Peretele celular (PC)

Formaiune celular rigid ce asigur meninerea formei celulei bacteriene, n condiiile unei diferene de presiune osmotic ntre interiorul celulei i mediul exterior (5-20 atm.). Cu structur aparte pentru gram + i gram -. Alctuit din peptidoglican (mureina): Nacetilglucozamina, acidul Nacetil muramic i 5 resturi de aminoacizi. Exemplu:
Nacetilglucozamina -----> acid Nacetil muramic | 1. L-Ala | 2. D-Glu | 3. Di-aa -gram + : lyzina, ornitina, prolina, etc. | -gram - : acidul L-mezo-diaminopimelic 4. D-Ala | 5. D-Ala

Legturile interpeptidice dintre catenele liniare se formeaz prin legtura dintre: diaminoacidul din poziia 3 de pe o caten (I) i D-Ala din poziia 4 de pe alta caten (II). Observaii: - la bacterii gram + pot aprea peptide intermediare (exemplu: la Stafilococ -5 resturi de glicin); - la bacterii gram - legtura ntre L mezodiaminopimelic dintr-o caten cu D-Ala din alt caten se face fr peptide intermediare. Glicanul d rigiditatea moleculei (PC)
Fig. 5 Structura peretelui celular la bacterii gram pozitive (80)

22

Peretele celular la bacterii gram poztive

- mai gros dect la gram negative. - 40 de straturi suprapuse de peptidoglican (50% din greutate este murein) - exist Pz n cantitate mare, legate covalent de acidul Nacetil muramic Polizaharidele sunt: - acizii teichoici - acizii teichuronici - acizii lipoteihoici - Acizii teichoici - (teichos = perete - n limba greac) - polimeri de glicerol fosfat sau ribitol fosfat de care se leag resturi de monozaharuri i D-Ala - sunt principalele antigene de suprafa ale bacteriilor gram pozitive. - Acizii teichuronici - sunt polimeri de acid - manozuronic i glucozuronic - numai la unele specii bacteriene - Acizii lipoteihoici - se leag de membrana citoplasmatic i strbat toat grosimea PC (consolidare)

Peretele celular la bacterii gram negative

- subire i cu o structur complex - proporie sczut de murein (5-10% din greutatea uscat) - proporie sczut de polizaharide, dar crescut n proteine i lipide. Structura peretelui celular - peptidoglicanul (PG) - cu 1-2 straturi moleculare (perete subire) - molecule de lipoprotein (LP) - partea proteic se leag de peptidoglican - partea lipidic ptrunde n membrana extern a PC (rol de ancorare) - membrana extern (ME) a PC - dublu strat fosfolipidic cu proteine - minore - majore - proteinele majore ale ME a PC: - se asociaz n triplete cu trei molecule de LP (lipoproteine) i formeaz canale de difuziune pentru substane nutritive cu greutate molecular mic. Exemple de proteine la E. coli: - OmP A - receptor pentru pilul F 23

- ancoreaz ME de PG (peptidoglican) - proteina Lamb B - receptor pentru bacteriofagul (BF) - trece maltodextranii prin pori - proteina TSx - receptor pentru BF.T6 - trece nucleozidele prin pori - proteine OmP C, OmP D, OmP F, etc. - Proteine minore ale ME a PC - transport specific pentru : - complexe de Fe - vitamina B12, nucleotide - receptori pentru pili sexuali, colicine, BF - implicate n replicarea ADN i diviziunea celular - Spaiul periplasmic - ntre PG i ME. n acest spaiu se concentreaz enzimele hidrolazice. - LPZ - Lipopolizaharidul - specific doar bacteriilor gram negative - similar cu antigenul O (endotoxina) - lipidul A - intr n ME a PC - confer toxicitatea. - polizaharidele - proemin pe suprafaa ME - formeaz uniti repetitive - componenta polizaharidic confer specificitatea antigenic a bacteriilor gram -. - smbure proteic, care confer imunogenicitate Funciile peretelui celular Asigur meninerea formei celulei + rigiditate Bariera osmotic - sita molecular pentru bacterii gram + - sisteme de transport activ la bacterii gram - porine (canale) - proteine carrier - aciunea hidrolazelor Primer (matria) - sinteza proprie - autolizine ale PC - degradarea unor zone limitate de PC, cu refacerea ulterioara a acestor zone. inta de aciune a antibioticelor : exemplu lactaminele Posed antigene de suprafa celular - antigenul O: la gram - carbohidrat C la streptococ, cu rol n identificarea serologic. 24

Cilii (flagelii)
Structuri helicoidale subiri i lungi, flexibile - Confer mobilitate celulei (organe de locomoie) - Formaiuni neobligatorii - Cocii nu au cili - Subuniti proteice de flagelin, polimerizate (cilindru gol) cu GM 35 000 daltoni. Structura: - corpuscul bazal (15 proteine distincte) - 2 discuri perechi - LP - L - n LPZ din ME a PC - P - n peptidoglican PC - SM - S - la suprafaa MC - M - implantat n MC Cele dou perechi de discuri sunt legate printr-un cilindru proteic - crligul - unghi de 90 (manon proteic) - filamentul axial - cilul propriu-zis (flagelina polimerizat)
Fig. 6 Ultrastructura cilului (64)

Rolurile cililor: - mobilitate dirijat, prin transducie senzorial, spre diferite substane. - chemiotaxie - spre substane nutritive. - aerotaxie - spre zone de concentraie mare de O2. - fototaxie - spre surs de lumin. 25

- electronotransfertaxia - spre substane ce funcioneaz ca acceptori de electroni (ex.: nitrat). - identificare bacterian microscopic - coloraia Leifson. - identificare imunologic - posed AG. H ciliar. Mobilitatea bacterian Transducia senzorial = coordonarea micrilor bacteriei printr-un sistem de metilare/demetilare ale unor proteine: - metilarea - asigur micarea bacteriei n sens anti-orar (nainte) - demetilarea - asigur micarea bacteriei n sens orar (napoi) Energia necesar micrilor ciliare este preluat din energia rezultat din lanul respirator al MC (stare de MC energizat) - discul M (din MC) acioneaz ca un motor Procesele de metilare/demetilare - sunt dependente de c GMP - sunt evideniate prin experimentul Adler (evideniaz chemiotaxia) Mobilitatea la Spirochete - aparatul locomotor al Treponemei pallidum e situat ntre peptidoglican i ME a PC- are o form n spiral.
Fig. 7 Spirochete cu aparat locomotor pericelular (64)

Examinarea mobilitii bacteriene n laborator: n preparatul nativ Pe mediul MIU (mobilitate - indol-uree) - mediu opalescent: mobilitate pozitiv Examinarea cililor la microscop optic (coloraia Leifson sau impregnare argentic) 26

 Ciliatura n microscopie electronic (dispoziia cililor pe o celul bacterian).

27

Ciliatura: celula atriche - fr cili celula monotriche - celula cu un cil la un capt al celulei bacteriene. celula amfitriche - celula cu cili la ambele capete ale celulei bacteriene. celula lofotriche - mnunchi de cili la un capt al celulei bacteriene. celula peritriche - cili repartizai uniform pe ntreaga suprafa bacterian.
Fig. 8 Cili peritrichi bacterie flagelat Proteus Sp. (60)

Pilii sau fimbriile

- Sunt formaiuni filamentoase rigide, scurte - Nu sunt organe locomotorii - Pot fi comuni sau sexuali Pilii comuni - aproximativ 100 pe o celul bacterian. - sunt polimeri de pilein - ce reprezint un antigen piliar - scuri L = 2 m - aspect de cilindri goi n interior - rol n aderarea pe suprafee netede ca de ex.: mucoase, hematii (evideniat prin reacia de hemaglutinare (HA) - pili cu HA manozosensibil - aparin bacteriilor nepatogene - pili cu HA manozorezistent - aparin bacteriilor patogene 28

- exemple de bacterii cu pili: E. Coli Pilii sexuali - realizeaz transferul intercelular de material genetic (conjugarea bacterian). - 1-4 pili pe o celul (max. 4) - lungime 20 m, cu extremitate n buton - sunt denumii pili F (codificai de ctre plasmida F de fertilitate) - pot constitui receptori pentru BF (bacteriofagi). (BF folosete pilul sexual pentru introducerea materialului su genetic n celula bacterian infectat)
Fig. 9 Pili i flageli bacterieni imagine electronomicroscopic (E. Coli) (81)

Sporul
Forma de rezisten n mediu neprielnic ce apare n interiorul unor anumite celule bacteriene; exemple: genul Bacillus - bacili sporulai aerobi - cu spor care nu deformeaz celula (diametrul spor < diam. celulei) genul Clostridium - bacili sporulai anaerobi - cu spor care deformeaz celula (diametrul spor mai mare ca diametrul celulei) - Spor localizat terminal: aspect n ac de gmlie ca la bacilul tetanic - Spor localizat subterminal: aspect n rachet de tenis ca la Clostridium botulinum 29

- Spor localizat central (brcu), la Clostridium sporogenes. Structura sporului n microscopia electronic: protoplast sporal = acid nucleic + citoplasm perete sporal cortexul sporal nveliuri sporale multistratificate cu legturi disulfidice Compoziia chimic: - posed cantiti mari de calciu dipicolinat (5-15%) - coninut redus n ap liber (=> termorezistena sporului) - bogia legturilor disulfhidrice din nveliuri confer impermeabilitatea sporului, mpreun cu cele 2 uniti de membran. - activitate metabolic foarte sczut (celul dormant care persist zeci de ani).

Fig. 10 Sporul bacterian (85)

Sporularea - controlat genetic (30 operoni formai din 250 gene) - exist factori sigma specifici sporulrii - are loc n condiii de mediu nefavorabile. Stadiile procesului de sporulare: Separarea acidului nucleic sporal (ADN) Formarea unui buzunar de membran i citoplasm n jurul acidului nucleic sporal Adugarea succesiv a straturilor sporale Germinarea, iniiat de - hidratarea sporului 30

- eliminarea calciului - temperaturi > 20-30 C

31

Importana studierii sporului n: Identificarea bacterian (coloraii speciale) Stabilirea regulilor de sterilizare (pe baza termorezistenei) Studierea proceselor de difereniere celular. Mecanismul coloraiilor Gram i Ziehl - Nielsen Proprietatea de Gram ine de integritatea i structura PC. De exemplu, protoplatii, sferoplatii, formele L se coloreaz gramnegativ deoarece nu au perete celular. - Structura particular a PC la genul Mycobacterium confer acidoalcoolo-rezisten bacilului tuberculos (BK): - PC la BK e foarte bogat n lipide (20-40% din greutatea uscat) - PC conine acid micolic (confer acido-alcoolo-rezisten) - PC este pluristratificat (reele lipopolizaharidice).

32

CAPITOLUL 3 METABOLISMUL BACTERIAN

Particulariti ale metabolismului bacterian:
Unicelular - se desfoar ntr-o singur celul Necompartimentat - prin lipsa organitelor celulare Teleonomic- n evoluie au fost selectate cile metabolice cu eficiena maxim Flexibil - adaptare rapid la condiiile de mediu Intens, accelerat - multiplicare bacterian foarte rapid (timp de generaie 20') Supus restriciei genetice - 3 x 109 molecule proteice, dintre care doar 2000 de molecule sunt enzime.
Tabelul nr. 2 - Diversitatea metabolic a bacteriilor n raport cu factorii de mediu Parametrul 1. Temperatura Bacterii: criofile (psihrofile)--> Dezvoltare optim la:

2. PH-ul

10-15 (ind. alimentar) 25-45 (la om) mezofile --> 60-80 (Archaebacterii) termofile --> bacterii neutrofile pH=7 -ex.: bacterii ce paraziteaz omul - ex.: Thiobacillus, Lactobacillus acidofile pH < 7 - ex.: Vibrion holeric: pH 9,2 alcalofile pH > 7 - se dezvolt la presiunea osmoti osmotolerante halofile halotolerante c a organismului uman - se dezvolt la concentraia n NaCl> 10g% - ex.: Vibrio parahaemolyticus - se dezvolt la concentraia n NaCl pn la 10g% - ex.: Stafilococcus aureus

3. Osmolaritatea

33

4. Necesitile nutritive Clasificarea n funcie de sursa de: a) Carbon bacterii autotrofe: folosesc CO2 mixotrofe: folosesc CO2 i substane organice heterotrofe: folosesc substane organice b) Energie - bacterii fototrofe: utilizeaz radiaia luminoas chimiotrofe: utilizeaz substane chimice: substane anorganice: bacterii *chimiolitrotrofe substane organice: bacterii *chimioorganotrofe c) Azot - bacterii ce fixeaz N2 atmosferic - prin nitrogenaze - bacterii ce folosesc NH4+ - bacterii ce folosesc azot aminic (NH-) - din aminoacizi (marea majoritate). Cile metabolice prin care se utilizeaz azotul la bacterii: - Sistemul glutamat/glutamin - Sistemul glutamin/glutamat - Sistemul aspartat/asparagin Acidul aspartic marcat cu N15 e folosit preferenial n dezvoltarea bacteriilor, comparativ cu acidul glutamic. (experiena prof. dr. Ivanof Antipa) d) Factori de cretere - Substane necesare unor anumite bacterii, pe care acestea nu le pot sintetiza. Exemple: vitamine din complexul B baze purinice i pirimidinice hematina, NAD, NADP - Se adaug n mediu n cantitate de 50 g/ml. Variaia prototrof-auxotrof : Bacterii prototrofe - nu necesit factori de cretere - se dezvolt pe medii minimale - sunt de obicei tulpini slbatice Bacterii auxotrofe - necesit factori de cretere Variaia prototrof - auxotrof: din bacteriile prototrofe se pot obine mutante auxotrofe, care reprezint markeri genetici. Bacterii paratrofe - cu parazitism celular obligatoriu - ex.: genul Ricketsia, Chlamydia 34

Mediul de cultur minimal - Este un mediu sintetic care asigur necesitile nutritive minimale (mediul de baz) - La acest mediu se adaug componeni nutritivi specifici pentru fiecare tip de bacterie ce se izoleaz (ex.: Haemophylus - se adaug snge i factori de cretere X i V). - Mediul de baz Glucoz (surs de Carbon i energie) Sulfat de amoniu (surs de Azot) Fosfai (necesari pentru sinteza ATP) Minerale: Mg, Fe, Na, K, etc. - fierul intr n structura citocromilor i peroxidazelor - potasiul intra n structura ribozomilor Scopurile cultivrii bacteriilor Cultivarea bacteriilor const n izolarea bacteriilor pe medii sintetice, naturale sau semisintetice, cu urmtoarele scopuri: - diagnosticarea bolilor infecioase - controlul puritii apei i alimentelor - testarea sensibilitii bacteriene faa de antibiotice - procese industriale: industria lactatelor, a berii etc. - biomasa: vaccinuri, hormoni, etc. Bacteriile ce paraziteaz organismul uman sunt: - mezofile : (25- 45) - neutrofile : pH = 7 - osmotolerante: tolereaz presiunea osmotic a organismului uman - heterotrofe: substane organice ca surs de carbon - chimioorganotrofe : substane organice ca sursa de energie - utilizeaz azot aminic : aminoacizi ca sursa de azot. Metabolism energetic. Eliberarea i conservarea energiei la bacterii. La microorganisme se produc reacii biochimice: - catabolice: de obinere a energiei n urma degradrii substanelor nutritive - anabolice: cu scopul sintezei structurilor celulare - amfibolice: ci metabolice implicate n catabolism dar care furnizeaz i compui C2 - C6 pentru procesele de biosintez

35

- anaplerotice: duc la fixarea CO2 cu obinerea compuilor C3, C4, necesari anabolismului Metabolism bioenergetic: - reacii catabolice - cu eliberare de energie - prin ci metabolice universale n lumea vie. Exemplu: - glicoliza - ciclul acizilor tricarboxilici (CAT) - oxidarea acizilor grai, etc. - reacii anabolice - cu consum de energie (reacii endergonice) - prin ci metabolice specifice bacteriilor La bacterii, energia rezultat prin degradarea substanelor nutritive se elibereaz prin procese redox: donare de hidrogen ---> acceptare de hidrogen (e- i H+) | (e- i H+) transportorii de e| | legai de M.C liberi - NAD n lanul respirator - NADP bacterian Principalele tipuri de eliberare a energiei la bacterii Se realizeaz prin: - respiraie oxibiotic - respiraie anaerob - fermentaie
donor de H acceptor de H Respiraie oxibiotic: Substana organic ----------------------------------> O2 transport e- prin lanul respirator Respiraie anaeroba: Substana organic -------------------------> Subst. anorganic transport e(nitrat, sulfat, etc.) prin lanul respirator Fermentaie: Substana organic ------------------------------------> Subst. organic glicoliza Embden Meyerhoff

36

(rearanjri moleculare ale substratului)

Clasificarea bacteriilor n funcie de tipurile de eliberare a energiei Strict aerobe Strict anaerobe Aerob - anaerob facultative Anaerob - aerotolerante Aerotolerante
Tabelul nr.3 Clasificarea bacteriilor funcie de eliberarea energiei Grupa Strict aerobe Eliberarea energiei Prez.O2 n mediu Exemple Respiraie oxibiotic Obligatoriu Genurile: Mycobacterium, Bacillus, Pseudomonas Strict anaerobe Fermentaie Fr (este toxic) Genurile: Clostridium Bacteroides Fusobacterium Veillonella Peptococcus Peptostreptoccocus Aerob Respiraie i / sau Prezent Genurile anaerob fermentaie Facultativ Staphylococcus facultative Haemophylus i Enterobacteriile Anaerob Fermentaie Cu sau fr Streptococcus aerotolerante Microaerofile Respiraie sau Foarte sczut CO2 Streptococcus, fermentaie Neisseria, Brucella 5-20% Campylobacter

37

Reacii necesare pentru conservarea energiei Energia se pierde: - sub forma de cldur - pentru transportul activ al substanei nutritive - n timpul micrilor ciliare Pentru viaa celulei, energia trebuie s fie conservat. Aceasta se face prin : - nmagazinarea energiei n legturi macroergice (care elibereaz la hidroliz > -7 kcal/mol). ATP-ul furnizeaz 7,3 kcal/mol. Sinteza ATP: Are loc prin 2 mecanisme a) Fosforilarea prin transport de eb) Fosforilarea la substrat

38

a) Fosforilarea prin transport de electroni

transp. (e-+H+)

Substrat supus oxidrii -----------------------------> O2

prin lan respir.

Particulariti ale lanului respirator bacterian Structurat n membrana citoplasmatic (mitocondria lipsete) Este ramificat (bucle ale lanului) Bacteriile au citocromi hibrizi, care nu apar la alte organisme Transferul de e- i sinteza ATP se pot realiza i pe lan respirator incomplet. Lanul respirator poate funciona i n respiraia anaerob, acceptorul de e- fiind o substan anorganic (aici e corect termenul fosforilare prin transport de e- i nu fosforilare oxidativ)
Fig. 11 Lanul respirator bacterian (80)

Sinteza ATP are loc n 3 poziii din lanul respirator: ntre NAD i flavoprotein ntre citocromul b i citocromul c ntre citocromul a i oxigen Fore proton motrice 39

Transferul separat al e- i H+ prin buclele lanului respirator realizeaz concentrarea diferit a acestora pe cele dou fee ale MC i rezult o diferen de potenial electric i un gradient de pH (gradientul confer starea de membran energizat). b) Fosforilarea la substrat ATP-ul e sintetizat direct prin reacii enzimatice, de exemplu: CAT - ciclul acizilor tricarboxilici De la cetoglutarat --> la succinat Fermentarea glucozei - principalul proces energetic al anaerobiozei - prin glicoliz sau calea Embden-Meyerhoff - produsul final al glicolizei este piruvatul i NAD - pornind de la piruvat, prin fermentaie se ajunge la o gam larg de produi finali, produi care caracterizeaz principalele tipuri de fermentaie
Tabelul nr. 4 - Clasificarea bacteriilor n funcie de tipul de fermentaie Tipul de Produs final obinut Microorganisme fermentaie Alcoolic etanol + CO2 Zimmomonas, Sacharomyces cerevisiae Industria alimentar Lactic Ac. lactic Lactobacillus, Streptococii lactici Propionic Acid propionic Chorynebacterium diphteriae, Clostridium propionicum, Genul Neisseria, Genul Veillonella Acid mixt Acid succinic Toate enterobacteriile, cu Diagnostic Acid formic excepia genurilor Klebsie(identificare Acid acetic lla, Enterobacter., Serratia bacterian) toate: pH < 5 evideniat prin testul rou-metil Acetoinic Acetoina Klebsiella, Serratia, Enterobacter evideniat prin testul Voges-Proskauer Importana

40

 Reacia fosforoclastic - Reacie de fosforilare la substrat ntlnit la anaerobi - n aceast reacie, acceptorii de hidrogen sunt feredoxinele (proteine cu Fe neheminic)

41

Bilanul energetic pentru respiraie i fermentaie Pentru respiraie: Dintr-un mol glucoz prin activitatea coordonat a: - glicolizei | - CAT | => 38 moli ATP - lanului respirator | (bacterii strict aerobe) Pentru fermentaie: Dintr-un mol glucoz prin calea Embden Meyerhoff rezult 2 moli ATP (bacterii strict anaerobe). Deci fermentaia este un proces primitiv i neeficient de eliberare a energiei la bacterii.

Biosinteza materialului celular

Ci metabolice Aminoacizi

Glucoza Proteine nucleoid Amoniu mf Nucleotide poliAcizi nucl. structuri citoplasma (N2 aminic) --------> Monozaharide -------------> Polizaharide ---------------> ribozomi Sruri mineGlicerol merizare Lipide celulare*) MC rale (Fe, Mg,K) Acizi grai cu PC cu cu 100-1000 capsula 25 atomi/molec 60 atomi/molec atomi/molec spori cili, pili *) Sinteza pe matria ADN pentru proteine i acizi nucleici *) Polimerizare pentru polizaharide i lipide mf = metabolii focali - produi intermediari ntre catabolism i anabolism;

Tabelul nr.5 - Metabolii focali Metabolii focali Glucozo-1-fosfat Glucozo-6-fosfat Ribozo-5-fosfat Eritrozo-5-fosfat Piruvat Acid 3-fosfogliceric Dihidroxiacetonfosfat Acetil CoA Originea catabolic Rol n biosintez Degradarea PZ, galactoza Nucleozide cuplate cu monozaharide Glicoliza Pentoza, polizaharide Calea pentozofosfatica Nucleotide Calea pentozofosfatica Aminoacizi aromatici Glicoliza Aminoacizi Glicoliza Glicerol, lipide, fosfolipide

oxidarea acizilor grai, Acizi grai, Steroli degradarea pirimidinei

42

Deci, metaboliii focali provin din: - ci catabolice - ci metabolice anabolice - ci anaplerotice - ci amfibolice (pe unele secvene anabolice pe alte secvene catabolice) Reglarea metabolismului bacterian Reglarea ptrunderii substanelor nutritive n celul - prin funcia selectiv a MC i PC - prin transport activ i facilitat Controlul genetic al biosintezei enzimelor - prin control pozitiv sau - control negativ Controlul alosteric al activitii enzimelor (retro-inhibiie.) (Genetica bacterian)

Creterea i multiplicarea bacteriilor

Cultura microbian este o populaie celular omogen cu celule similare, rezultate dintr-o singur celul, bacteria iniial. Creterea celulelor este continu, pn cnd toi constituenii ajung n cantitate dubl, dup care are loc diviziunea celular. Multiplicarea bacteriilor - prin diviziune celular => 2 celule identice
Fig. 12 Celula bacterian n diviziune (82)

43

Diviziunea celular se produce cu o strangulare a MC iniial, apoi a PC n final, pn la separarea celor 2 celule fiice. Este coordonat prin replicarea moleculei de ADN i prin legtura acidului nucleic cu mezozomul. Ciclul celular cuprinde toate evenimentele metabolice dintre 2 diviziuni Determinarea numrului de celule dintr-o cultur bacterian: Determinarea nr. de celule bacteriene pe unitatea de volum prin: - numrare direct n camera de numrare sau pe lame speciale (ex.: lame ca pentru hematii) - numrarea celulelor viabile prin nsmnarea unei cantiti anume de produs patologic pe un mediu de cultur - dup formula: N = n x 1/Diluie x 1/Vol.nsmnat N = nr. total de celule bacteriene de pe o plac n = nr. de colonii bacteriene (1 colonie bacterian = o clon de celule identice care provin dintr-o singur celul, n urma diviziunilor). exemplu: n = 40 diluia = 10-6 volumul = 0,1 ml => N = 40 x 1/10-6 x 1/10-1 = 40 x 106 x 10 = 4 x 108 bacterii vii / ml cultur Msurarea densitii celulare - Calcularea greutii uscate a bacteriilor, cunoscnd concentraia azotului din celulele dintr-un volum dat. - Stabilirea densitii optice cu ajutorul fotometrelor, prin absorbia luminii la o anumit lungime de und. Msurnd la diferite intervale de timp nr. de celule dintr-un mediu lichid, numr proporional cu log de densitate optica (d. o.) - Se obine o curb de tipul: log d.o. D E F C
Fig. 13 -Curba de dezvoltare a unei culturi bacteriene

AB

Timp

44

Legenda: A - faza de laten (lag) (to lag = a ntrzia) B - faza de accelerare a multiplicrilor bacteriene C - faza de multiplicare exponenial (logaritmic) D - faza de ncetinire a multiplicrii E - faza staionar F - faza de declin Fazele eseniale sunt: A, C, E, F Fazele intermediare sunt: B, D Analiza etapelor din curba de dezvoltare a culturii bacteriene: Faza A - faza de programare metabolic a celulelor, n vederea folosirii substanelor nutritive din mediul de cultur. - S-a demonstrat aceast ipotez prin fenomenul de diauxie a lui Monod. Experiment: Se cultiv E. Coli pe un mediu cu glucoz n cantiti foarte sczute i lactoz n cantiti mari. Curba de dezvoltare are 2 perioade de lag : - lag 1 foarte scurt, corespunde utilizrii glucozei din mediul de cultur - lag 2 lung, corespunde utilizrii lactozei din mediu, dup epuizarea glucozei (prin reprogramarea metabolismului bacterian) Faza de lag - difer n funcie de: specia bacterian i condiiile de cultivare - poate s dispar dac se inoculeaz bacteriile din faza exponenial pe acelai mediu de cultur (principiul chemostatelor ce produc culturi continue, doar cu faz exponenial). Faza de lag dureaz cam 2-6 ore. Faza B - accelerare a multiplicrilor bacteriene. Faza C (exponenial) - Faza n care se produc diviziunile (2N germeni) - Timp de generaie = Intervalul mediu dintre dou diviziuni - variaz n funcie de specia bacterian: timpul de generaie - E. Coli = 20 minute; B. Koch = 1000 minute Caracteristicile celulelor din faza logaritmic: celule tinere cu muli ribozomi celule cu activitate crescut de sintez a proteinelor 45

 aceste celule au cea mai mare sensibilitate la antibiotice i chimioterapice

46

Faza D - de ncetinire a multiplicrii - se produce prin: - epuizarea unuia sau a mai multor metabolii necesari dezvoltrii - scderea concentraiei n O2 n mediul de cultur Faza E - staionar - cu un numr mai mic de diviziuni, dar constant (nr. celule vii = nr. celule care mor) Faza F - de declin - moartea celulelor n progresie geometric - celulele sunt: - mbtrnite, cu PC gros, cu sintez proteic foarte redus - rezistente la factorii fizici, chimici i chimioterapice

Culturi continue
- Sunt culturi meninute ntr-o perioad exponeniala permanent - Vasul de cultur este - adaptat ca pH, aerat i aprovizionat permanent cu mediu de cultur proaspt. - Cantitatea de mediu proaspt adugat este identic cu cea de cultura eliminat. - Se utilizeaz pentru - studii de metabolism, genetic bacterian; - biotehnologie (obinerea de vaccinuri, hormoni, enzime cu ajutorul bacteriilor). Aparatele se numesc chemostate sau biogene.

47

CAPITOLUL 4 GENETICA BACTERIAN

Genetica studiaz fenomenele fundamentale: Ereditatea - transmiterea la descendeni a acelorai caractere (asigur stabilitatea speciei). Variabilitatea - variaiile caracteristicilor bacteriene. ADN Gena Genomul Genotipul Fenotipul = Suportul material al ereditii (inclusiv la bacterii) = Un segment al moleculei de ADN care codific sinteza unui polipeptid distinct. Exist gene structurale i funcionale. = este alctuit din totalitatea genelor unui organism. = Reprezint totalitatea informaiei genetice a unui organism. = Caracterele observabile specifice unui organism, determinate de genotip (n interaciune cu mediul ambiant).

Deci variabilitatea caracterelor bacteriene poate fi divizat n 2 categorii: a) - fenotipice: ex.: bacilul difteric are forma cocoid pe medii cu telurit i forma baciliar n absena teluritului. b) - genotipice: ex.: ctigarea rezistentei la antibiotice. Structura ADN - 4 perechi de baze azotate - A, G purine A adenina G guanina - C, T pirimidine T - timina C - citozina complementare: A T, G C, legate pe un schelet ribozofosfatic. - Are o structur dublu catenar antiparalel. - Fiecare aminoacid e codificat de ctre un triplet din 3 baze azotate denumit codon. - Replicarea ADN se face pe propria matri, prin intermediul ADN polimerazelor I, II, III (mai ales III).

48

Fig. 14 Replicarea ADN-ului bacterian (80)

Transcrierea informaiei genetice - Informaia genetic se concretizeaz n sinteza proteinelor i enzimelor necesare funcionrii microorganismului; - m ARN - preia informaia genetic i o transmite la ribozomi - este ntotdeauna monocatenar - se sintetizeaz folosind ca matri o singur caten de ADN - transcrierea mesajului se face dup primirea unui semnal de iniiere, denumit promoter - transcrierea e controlat de ARN polimeraz ADN dependent. Traducerea mesajului genetic Se face prin intermediul ARN de transfer, cu specificitate de aminoacid. Promoter - N formil metionina - t ARN specific ---> este complexul de iniiere al sintezei proteice la bacterii. Sinteza proteic - ncepe cu legarea m-ARN de ribozomi - apoi se formeaz polizomii, cu obinerea ulterioara a unui lan polipeptidic. Modelul bacterian - timp de generaie foarte scurt (E. Coli 20) - nr. haploid de cromozomi (1 N) - necesitile nutritive sunt markeri genetici (studiul facilitat). 49

Elemente genetice la bacterii

Ereditate bacterian: cromozomial - asigurat de cromozomul bacterian extracromozomial - prin: plasmide, bacteriofagi, etc. Repliconii bacterieni (cromozomul, plasmidele, bacteriofagii) au capacitatea de a se autoreplica (de a se transmite n copii identice la celulele fiice).

Repliconul
Repliconul este o molecul dublu catenar circular covalent cu 2 locusuri de reglare a replicrii: - locus iniiator - locus replicator. Repliconul este ataat prin locusul ORI la un situs mezozomal, pentru a se coordona replicarea repliconului cu diviziunea celular. Locusul ORI reprezint originea replicrii. Cromozomul bacterian - Structur nchis circular covalent, structura hiperhelicoidal GM N x 109 daltoni, conine informaia genetic pentru sinteza a 5000 molecule proteice diferite. - Conine un numr haploid de cromozomi (1 N) - Structur foarte dinamic (prezint formaiuni lobulare i anse, cu dinamism asigurat de ctre 2 enzime) : - topoizomeraza - crete ncrctura negativ a structurii hiperhelicoidale - giraza - scade ncrctura negativ a structurii hiperhelicoidale. - Genele sunt plasate linear n cromozom Plasmidele - Repliconi (elemente genetice extracromozomiale) purttoare ale unor informaii ereditare neeseniale pentru supravieuirea bacteriilor. - Sunt molecule de ADN dublu catenar, nchise circular covalent, care pot exista: - n stare liber n celula bacterian sau - integrate n cromozomul bacterian Acest comportament se numete comportament epizomal. Plasmidele se pot denumi i epizomi.

50

Clasificarea plasmidelor Dup mrime: - plasmide mici (neconjugante) - conin pn la 10 gene - nu se autotransfer (sunt neconjugante) - au 30 - 100 copii ntr-o celul bacterian - au replicare relaxat (independent de replicarea cromozomului bacterian) - plasmide mari (conjugante) - sunt mari (au peste 100 gene) - sunt autotransferabile prin conjugare bacterian (de tip : F, R, Col.) - au operonul TRA (de transfer). Operonul este un complex de gene necesare pentru autotransferul plasmidei - au o replicare stringent (dependent de replicarea cromozomului bacterian) Dup informaia genetic coninut, plasmidele pot fi: - plasmide F - de fertilitate - plasmide R - de rezisten la antibiotice i chimioterapice - plasmide Col - de sinteza a colicinelor, piocinelor etc. - plasmide de rezisten la metale grele (folosite ca dezinfectante). Exemplu: plasmida 01258 - la Staphylococcus aureus - plasmide ce imprim noi proprieti metabolice . Exemplu: fixare de azot la enterobacterii. - plasmide ce codific factori de patogenitate: exemple: - plasmida Ent-la E. Coli (i alte enterobacterii) - plasmide de aderen la smalul dentar, la Streptococcus mutans. - plasmide productoare de hemolizin, la Shigella dysenteriae. Genele plasmidice pot fi: - gene de integrare n cromozom, pentru plasmidele epizomale - gene de transfer ale plasmidei (operon TRA) - gene ce confer proprietile amintite anterior (metabolice, rezistena la antibiotice) - gene de excludere a ptrunderii n celul a unei plasmide nrudite, aflate n aceeai grup de incompatibilitate; exemplu: 15 grupe de incompatibilitate la E. Coli (se creeaz diviziuni taxonomice mai restrnse) 51

Genomul fagic - bacteriofagii: - Sunt virusuri care paraziteaz bacteriile - Sunt structuri de tip cap - coad: Capul: - Capsida proteic ce nvelete acidul nucleic (ADN sau ARN) Coada: - o protein contractil - ce reprezint un canal de injectare al materialului genetic al BF n celula gazd - prezint o plac cu microfilamente cu rol de ataare pe celula bacterian. - Infecia celulei bacteriene poate evolua ca: ciclul litic - genomul fagic se nmulete vegetativ n celula bacterian - virionii rezultai se elibereaz prin liza celulei gazda - astfel de BF sunt fagii viruleni de la E. Coli exemplu: BF T1 - T7. ciclul lizogen - ADN-ul fagic se inser n cromozom ca regiune genetic distinct (sub forma de profag). Celula rezultat este o celul lizogenizat de ctre bacteriofagul respectiv. Celula dobndete noi proprieti toxice sau metabolice n urma acestui proces. - exemplu : BF de la E. Coli - astfel de BF sunt fagii temperai BF temperai pot realiza: - conversia lizogen - transfer de material genetic (transducia). Exemple de toxine bacteriene produse prin conversie lizogen: toxina bacilului difteric - prin BF tox fibrinolizina stafilococic eritrotoxina Dick-streptococic toxinele Clostridiilor, etc.

Elemente genetice transpozabile

Secvene de inserie (IS) - Secvenele genetice care se pot mobiliza pe aceeai molecul de ADN sau ntre moleculele de ADN diferite. - Au 102 - 103 perechi baze - se gsesc n mai multe exemplare n aceeai celul, n numr diferit de la o tulpin bacterian la alta. - Inseria unei IS n interiorul unei gene i ntrerupe continuitatea sau i schimb funcia. 52

Transpozonii (TN) - Sunt secvene mai mari de ADN (2-3 gene), flancate de ctre secvene de inserie: IS - TN - IS (ex.: determinanii de rezisten la antibiotice ai plasmidelor R). - Rearanjeaz molecula de ADN n care apar i produc: duplicare genic, mutaii, blocarea unui promoter Secvene invertibile - Sunt secvene care pot fi inserate n acelai locus genetic, dar n ordine invers, modificnd proprietile genetice ale ntregii zone de nucleotide. Exemplu: Fagul Mu infecteaz E. Coli sau Serratia n funcie de orientarea segmentului invertibil G. Unitile repetative - Flancheaz gene sau segmente funcionale. - Au proprieti asemntoare elementelor transpozabile, intervenind n rearanjarea moleculelor de ADN (produc mutaii, duplicri genice) Variaia genotipic - Modificare brusc, transmisibil ereditar. - Mecanismele variaiei: Mutaia Transferul intercelular de material genetic: - Transformarea - Transducia - localizat - generalizat - abortiv - Conjugarea

Mutaia
Reprezint o modificare spontan n secvena de nucleotide a unei gene. Rata mutaiei (frecvena de apariie) este =10-9. Apare doar atunci cnd sunt depite sistemele reparatorii (mecanismele de aprare anti-mutaie). Mecanisme: Substituia unei perechi de baze, cu formarea altui codon, specific altui aa. Inserii de perechi de baze azotate Deleii de perechi de baze azotate Inversii n succesiunea perechilor de baze azotate 53

 Tranziii - nlocuirea unei purine sau pirimidine cu alt purin sau pirimidin Transversii - nlocuirea unei purine cu o pirimidin sau invers Modificri de forme tautomere ale bazelor azotate Intervenia elementelor transpozabile, ce produc rearanjri genice Alchilarea, dezaminarea bazelor azotate mperecheri greite ntre bazele azotate prin: - radicali activi ai O2 - existena n mediu a unui nucleotid n cantitate mai mare Scindri greite ale moleculei de ADN (ruperea scheletului fosforic al moleculei) Condiii de mediu - factori fizici: radiaii ultraviolete - realizeaz legturi covalente ntre 2 timine. - factori chimici : - acidul nitros dezamineaz bazele azotate - coloranii acridinici se intercaleaz ntre cele 2 catene ADN Tipuri de mutaii 1. Mutaie n acelai sens - Modificarea n gena respectiv da natere la un codon nou, dar care specific acelai aminoacid (exista aminoacizi codificai de ctre mai muli codoni). 2. Mutaie nonsens - Obinerea de lanuri polipeptidice incomplete, dac se formeaz unul dintre cei 3 codoni terminali: UAG, UGA, UAA. 3. Mutaie cu schimbare de program - prin inserii sau deleii, care produc decalaje de citire ale mesajului genetic. 4. Mutaie silenioas - nensoit de modificri fenotipice. 5. Mutaie nainte - Ctigarea unei funcii; exemplu: E. Coli H2S - devine H2S + 6. Mutaii secundare - Mutaie napoi (revers mutatia) Restabilirea fenotipului slbatic iniial ( 10-16) - Mutaii supresoare (cu efect compensator primei mutaii) - intragenice - cu restabilirea funciei genei, prin mutaii n alt codon, al aceleai gene 54

- intergenice - mutaii n gene diferite, pentru restabilirea funciei genei afectate. 7. Mutaii condiionat letale: - Sunt induse n condiii fixate de experimentator. Exemplu: folosirea tulpinilor atenuate pt. prepararea vaccinurilor. Exemple de mutante bacteriene Mutaia poate afecta orice caracter bacterian: mutaie Morfologic: bacterii ciliate ---------> bacterii aciliate variaia colonii S ---------> colonii R Biochimic: lactoz negativ ---------> lactoz pozitiv Patogenitate: absena toxinei ---------> prezena toxinei Rezistena la antibiotice Rezistena la bacteriofagi

Transferul intercelular de material genetic

Transformarea - Este un proces de transfer intercelular de material genetic, transfer n care celula receptor primete tot ADN-ul liber al celulei donator. Celula receptor trebuie s se gseasc n aa numita stare de competen, ce se realizeaz in vitro prin oc termic i calciu. - Acest proces se produce mai uor la bacteriile gram pozitive i n condiii speciale la bacteriile gram negative. - Transformarea a fost descoperit n anul 1928, cnd Griffith a efectuat un experiment asupra virulenei pneumococului. Tulpinile bacteriene folosite n experiment au fost: A. Tulpina SI (cu colonii S pe medii de cultur) - cu capsul, virulent. B. Tulpina RIII (cu colonii R pe medii de cultur) - fr capsul, avirulent. C. Tulpina SI (distrus prin cldura - la 70o C) - avirulent - n experimentul iniial, Griffith a inoculat tulpina la un oarece i animalul a murit. - n experimentul urmtor, Griffith a inoculat tulpina R III la alt oarece i animalul a supravieuit (tulpina RIII era avirulent). - Apoi, Griffith a inoculat la un oarece tulpina C i animalul respectiv a supravieuit.

55

- n experimentul final, a inoculat la alt oarece dou tulpini de pneumococ avirulente (RIII i SI omort prin cldur) i era de ateptat ca animalul respectiv s supravieuiasc; acest lucru nu s-a ntmplat, oarecele respectiv a murit i n hemocultur i s-a izolat tulpina S I de pneumococ. Explicaia este urmtoarea: ADN-ul tulpinii SI a determinat sinteza capsulei ca i factor de patogenitate la tulpina RIII, prin transfer intercelular de material genetic. Acest proces - transformarea - i gsete azi aplicaia pentru introducerea n celula bacterian a unui ADN hibrid, pentru clonarea molecular (folosind tulpini de E. Coli). Transducia - Prin acest fenomen, fragmente din cromozomul bacterian al celulei donator sunt ncorporate n genomul fagic i transferate n genomul celulei receptor. - Clasificare: transducia - generalizat - localizat - abortiv Transducia generalizat - Prile de cromozom de la celula donator au mrimea concatemerilor fagici i sunt transferate n celula receptor. - Materialul genetic preluat de ctre fag se integreaz n cromozomul celulei receptor, celul ce va da natere unei clone celulare cu markeri cromozomiali transdui. - Transducia a fost descoperit de ctre Zinder i Lederberg la Salmonella thyphymurium. - n cazul transduciei generalizate, fagul se poate insera n oricare loc de pe cromozom (de exemplu: bacteriofagul P22 sau P1 la E. Coli). Transducia localizat (situs specific) - Se realizeaz prin bacteriofagi (BF) care au un singur locus de ataare n cromozomul bacterian - de exemplu - BF . n acest caz vor fi transferate doar genele aflate n apropiere, gal sau bio (gena gal codificnd sinteza galactozei - iar gene bio codificnd sinteza biotinei). Transducia abortiv - Este transducia prin care fragmentul de cromozom preluat de la celula donator nu se mai integreaz n cromozomul celulei receptor, ci rmne independent n citoplasm i se circularizeaz. Prin acest procedeu pot fi transduse chiar i plasmide mici n ntregime. 56

Conversia lizogen - Const n apariia unei proprieti noi bacteriene, o dat cu lizogenizarea cu un anumit bacteriofag temperat (n urma transduciei). - exemple de toxine bacteriene produse prin conversie lizogen: toxina bacilului difteric - prin BF Btox fibrinolizina stafilococic eritrotoxina Dick-streptococic toxinele Clostridiilor, etc. Conjugarea A fost descoperit de ctre Lederberg i Tatum n 1946. - n conjugare, transferul intercelular de material genetic are loc ntre dou celule aflate n contact, printr-o punte de legtur (pil sexual) - de la o celul donator masculin fertil (cu factor de sex) la o celul receptor feminin (fr factor de sex). - Primul factor descoperit a fost plasmida F, apoi plasmidele R Col. - Conjugarea este un proces mai ntlnit la bacteriile gram negative (enterobacterii, Pseudomonas etc.) - Conjugarea poate apare extrem de rar la streptococi, la ntlnirea ntmpltoare a dou celule F+ i F- (sau R+ i R-) procesul avnd loc sub influena unor hormoni, denumii feromoni.
Fig. 15 Fenomenul conjugrii bacteriene (115)

Conjugarea la bacilii gram negativi Plasmidele F - Pilii sexuali ai celulei bacteriene de tip masculin sunt codificai de ctre genele operonului TRA (de transfer) din plasmidele mari, conjugante.

57

- Apropierea ntmpltoare a doua celule F+ i F- determin formarea unor puni intercitoplasmatice, reprezentate de ctre pilii sexuali. Se formeaz aa-numitele perechi eficiente. - Concomitent, ncepe replicarea conjugativ a moleculei de ADN dup modelul rolling circle i transferul copiei plasmidice prin canalul de legtur. - ntr-o or, aproximativ 50% din celulele unei populaii F- devin celule F+. Plasmidele R - Conin informaii privind rezistena la unul sau mai multe chimioterapice. - Operonul de transfer al rezistenei - se numete operonul RTF i are o structur similar operonului TRA. - Operonii RTF pot avea i proprieti de tip transpozon (TN), realiznd mobilizarea de pe cromozomul bacterian pe plasmide sau invers. - Prin plasmide R, rezistena la chimioterapice se transmite n mod epidemic. Plasmidele Col - Sunt plasmide mari, conjugante, ce conin informaii privitoare la sinteza bacteriocinelor. - Bacteriocinele sunt produse de ctre unele bacterii, cu cert efect antibacterian. Mecanismele antibacteriene ale bacteriocinelor sunt: - Mecanisme enzimatice - unele bacteriocine sunt nucleaze, enzime care realizeaz degradarea ADN-ului celeilalte celule. - alte bacteriocine sunt ATP-aze, mpiedicnd sinteza ADN la nivelul celeilalte celule bacteriene. - Mecanisme anti membrana citoplasmatic - bacteriocine ce formeaz microcanale membranare n MC, cu eflux de ioni i substane nutritive. - Exemple de bacteriocine: colicine (E. Coli), piocine (Pseudomonas aeruginosa), pesticine (Yersinia pestis). Conjugarea HFR - High frequency of recombination - Cu o frecven de 10-5/generaie bacterian, plasmida F (de fertilitate) - se poate integra n cromozomul bacterian n circa 8-10 situsuri posibile.

58

- Punnd n contact celule HFR (cu plasmida F integrata n cromozom), cu celule F- - se formeaz perechi eficiente n vederea transferului genetic. - De la o celul donator HFR se transfer la celula receptor - material cromozomial i plasmid. Plasmida trece ca ultim element. Celula F - devine i ea celula HFR. - Transferul ntregului cromozom bacterian necesit 120 la temperatura de 37 C. - ntreruperea mecanic a conjugrii bacteriene (prin agitarea suspensiei la anumite intervale de timp), a permis descifrarea hrilor genetice bacteriene; s-a stabilit ordinea de aranjare a genelor n cromozom, folosind tulpini HFR cu diferite situsuri de integrare n cromozom la care procesul de conjugare a fost ntrerupt n mod dirijat. n anul 1984, la E. Coli au fost stabilite 1027 locusuri genetice. Plasmidele F - like (F') - Sunt plasmide F integrabile n cromozomul bacterian, capabile s transfere altei tulpini (prin conjugare HFR) doar o parte din cromozomul celulei donatoare, mpreun cu materialul genetic propriu plasmidic. - Prin plasmidele F -like (F') se poate realiza transferul intercelular de material genetic i ntre specii foarte ndeprtate din punct de vedere filogenetic (ex.: plasmida F'68-45). Caracteristici comune ale proceselor de transfer intercelular de material genetic: - Transferul se face unidirecional: donator -> receptor - Fragmentul de cromozom strin (exogenot) rmne ctva timp alturi de ADN al receptorului (endogenot), realiznd o diploidie parial, un merozigot. - Exogenotul se stabilizeaz n receptor fie n urma recombinrii cu endogenotul, fie ca replicon autonom.

59

Tabelul nr.6 - Principalele proteine care interacioneaz cu ADN ACTIVITATE EXEMPLE Proteine de Semnale n funcionarea - Represor lac; proteina CAP reglare unor pri din molecul - Factorii i ai ARNpolimerazei. - Iniiatorul de replicare ADN-polimeraza - ADN-polimeraza III-replicare ADN - ADN-polimeraza I-reparare leziuni Enzime de: u.v. Polimerizar ARN- polimeraza - ARN-polimeraza - n transcr. e (ARNt, ARNr, ARNm) i sinteza primerului ARN n repl. ARN ADN- ligaza - Leag capete5-fosfat cu 3 hidroxil; Modificare n replicare, sinteza reparatorie, recombinare. ADN- metilaza - Eco RI- metilarea nucleoidelor subliniate n secvenele: 5- G A A T T C -3 3- C T T A A G -5 Endonucleaz de - Eco RI- endonucleaza la locurile restricie indicate cu n: 5- G A A T T C -3 3- C T T A A G -5 Endonucleaz care - ADN-giraza - despiralarea - Nucleaze cresteaz i nchide ADN-ului n replicare Endonucleaza de - Endonucleaza u.v.r. A,B- excizia reparare u.v. dimerilor de timin Ribonucleaza H - ndeprtarea ARN primer aprut n timpul replicrii ADN-ului.

Recombinarea - Poate urma transferului intercelular de material genetic. - Reprezint o interaciune ntre dou secvene diferite de ADN, cu cteva mecanisme moleculare: Recombinarea omoloag - se petrece ntre regiuni care au n cea mai mare parte aceleai secvene de nucleotide, prin asimilarea de catene, sub controlul genei REC (de recombinare). Recombinarea neomoloag - se petrece ntre secvene care nu au omologie de nucleotide, prin rupere i reunire ulterioar de catene. - recombinarea situs specific - prin bacteriofagi. - recombinarea nelegitim - prin secvene de inserie (IS). 60

Relaii ntre repliconi Relaii cromozom-plasmide - Comportamentul epizomal plasmidic - Replicarea - stringent - la plasmidele mari - relaxat - la plasmidele mici Relaii cromozom-material genetic fagic - Comportamentul epizomal al genomului fagic (stare liber sau stare integrat n cromozom) Relaii ntre plasmide - Relaii de indiferen - Relaii de excludere de suprafa, conferite de ctre unele gene ale operonului TRA (de transfer). - Relaii de incompatibilitate: o plasmid conjugant dintr-o celul bacterian se poate opune ptrunderii n celul a altei plasmide omoloage. Din acest tip de relaii rezult subgrupe de incompatibilitate, subgrupe ce pot aduce un criteriu de clasificare suplimentar (exemplu: la E. Coli exist 15 subgrupe de incompatibilitate). Relaii transpozoni-repliconi bacterieni - Transpozonii reprezint elemente genetice mobilizabile pe repliconi, motiv pentru care se terg diferenele dintre ereditatea cromozomial i cea extracromozomial (dat fiind transferul lor n dublu sens). transpozoni Material genetic Material genetic cromozomial extracromozomial

Reglarea genetic a metabolismului bacterian

Modelul operonului n 1961, Jakob i Monod descriu acest model pentru operonul care codific sinteza lactozei (operonul LAC). Cercettorii pornesc de la ipoteza c acest operon este alctuit din 2 categorii de gene: gene structurale, necesare pentru sinteza protein-enzimelor i gene funcionale: operator, promoter, represor. Reglajul genetic este de tip: - inductibil - intervine n sinteza enzimelor implicate n catabolism - represibil - intervine n sinteza enzimelor implicate n anabolism

61

Sistemul inductibil n acest sistem, substratul, substana de catabolizat, interacioneaz cu represorul activ i l inactiveaz (deci substratul lactoza - este un inductor). Represorul inactivat nu mai acioneaz asupra operonului i genele structurale S1, S2, S3 vor produce enzimele de degradare ale substratului lactoza. Sistemul represibil - Substana sintetizat (produsul final al cii anabolice - activeaz represorul. Substana sintetizat este un corepresor). - Represorul activat se leag de operator, cu blocarea consecutiv a genelor structurale i cu sistarea sintezei substanei respective. Controlul genetic prin reele de operoni Reglonul Reprezint o reea de operoni care au un reglator comun, fie stimulator, fie inhibitor. Stimulonul Reprezint un complex de gene poziionate separat pe cromozom, dar care rspund coordonat fa de anumii stimuli din mediul extern. Exemplu: controlul factorilor de patogenitate la Shigella dysenteriae (negativ la 30C, pozitiv la 37C). Controlul genetic la nivelul operonilor prin structura promoterului Structura promoterului i permite acestuia s lege n mod diferit mARN polimeraza, n funcie de secvenele de nucleotide ale promoterului. Apariia mutaiilor n promoter - i modific acestuia capacitatea de legare a m ARN polimerazei. Controlul genetic al operonilor prin structura m-ARN polimerazei m - ARN polimeraza - este un complex de molecular 2 'n - fiecare factor confer o capacitate diferit de legare a m-ARN polimerazei de promoter.

Sisteme de reglare posttranscripional a operonilor

Controlul metabolismului bacterian prin retroinhibiie (feed-back) - (pentru enzime alosterice) Este o reglare prin produs final. Prezena produsului final n cantiti mari, determin inhibiia enzimelor alosterice, prin modificri conformaionale ale centrului activ al enzimelor. 62

Ex.: - Calea metabolic de la treonin la izoleucin necesit 4 enzime. - Izoleucina (n cantitate mare) se leag de enzimele alosterice, modificndu-le conformaia. n final, calea metabolic este blocat de ctre izoleucina n exces. Ci metabolice ramificate n metabolismul teleonomic bacterian se face o reglare secvenial pentru fiecare ramur metabolic n parte. D ---> F A --> B --> C E ---> G (-) G inhib (-) E, dar F nu inhib D (F se sintetizeaz) Reglarea prin spoturi fierbini (hot spots) Hot spots - sunt molecule de 3,5 diguaninfosfat, care intervin n: - reglarea sintezei t ARN (acionnd asupra aminoacil t-ARN sintetazei). - pentru cele 60 de molecule de t ARN diferite exist mecanisme proprii. Procesul de atenuare ntlnit la operonii implicai n sinteza de aminoacizi. A fost studiat operonul triptofanului. Traducerea mesajului genetic ar fi reglat (n acest operon) de ctre structuri conformaionale particulare ale moleculei de m-ARN polimeraza. Sisteme de reparare ale moleculei ADN afectate Sunt sisteme care: Previn sau corecteaz mutaiile. mpiedic persistena n celul a unui ADN strin. Sisteme ce corecteaz sau previn mutaiile: 1. Repararea prin excizie 2. Fotoreactivarea 3. Sistemul SOS 1. Repararea prin excizie Este un mecanism enzimatic, care se realizeaz prin: a. endonucleaze - recunosc situsul erorii i cliveaz molecula de ADN. b. exonucleaze - excizeaz nucleotidele modificate 63

c. ADN polimeraza 1 - resintetizeaz segmentul excizat, utiliznd ca matri catena complementar d. ADN ligaza - reface continuitatea catenei reparate 2. Fotoreactivarea Mecanism prin care se corecteaz mutaiile produse de ctre radiaiile ultraviolete. Procesul este enzimatic. Enzima este Helicaza 2, produsul genei UVR 2, ce stimuleaz aciunea unor endonucleaze, care ndeprteaz secvene modificate de aproximativ 12 nucleotide (ndeprteaz dimerii de timin). Ulterior intervin: ADN polimeraza 1 i ADN ligaza. 3. Sistemul SOS Singurul sistem care intervine chiar n timpul replicrii (dac furca de replicare este blocat). - Sistemele 1., 2., intervin naintea replicrii. Sistemul SOS e constituit din produii a 17 gene, care sunt represate n mod normal prin gena lex A. - Amorsarea sistemului SOS se face prin proteina REC-A (produsul genei rec-A). Proteina REC-A are o funcie proteazic, degradnd produsul genei lex A cu efect inhibitor (proteina. lex A este degradat). - Proteina REC-A iniiaz recombinri genetice cu rol de reparare. mpiedicarea persistenei n celul a unui ADN strin 1. Modificare i restricie - Sunt sisteme enzimatice cu specificitate de gazd. - Sistemul asigur degradarea moleculelor de ADN strine ptrunse n celula gazd: - ADN plasmidic - ADN fagic - ADN al transpozonilor sau IS - ADN cromozomial al altei celule Modificarea - Const n metilarea bazelor azotate ale ADN-ului self, n poziii specifice de pe anumite secvene (secvene palindrom cu simetrie n oglind). Restricia - Este un proces de degradare controlat a unui ADN, prin endonucleazele de restricie. - Aceste enzime recunosc anumite secvene palindrom. 64 *

3'... G A A T T C... 5' 3'... G A A T T C... 5' 5'... C T T A A G... 3' 5'... C T T A A G... 3' * Legenda: - Locul aciunii endonucleazelor de restricie pe secvenele palindrom. * - Bazele metilate, asupra crora nu mai acioneaz endonucleazele de restricie. Dup clivare, rezulta capete adezive, care se pot lega covalent (se pot reinela sau se pot ataa de alte fragmente de ADN - vezi ingineria genetic).

Tehnologia ADN recombinant

Bacteriile, prin multiplicarea lor rapid i economic sunt instrumente cu randament impresionant pentru biosinteza unor produse ale celulelor eucariote (hormoni, interferoni, antigene virale etc.) dac aparatului bacterian de biosintez i se transmite mesajul necesar acestor sinteze. Genetica bacterian a oferit posibilitile tehnice pentru clonarea in vitro a ADN-ului strin n vectori adecvai / molecule de ADN cu caractere de replicon, cum ar fi plasmidele sau fagii temperai - cosmidele. Cu ADN hibrid astfel obinut, o tulpin bacterian (de obicei E. Coli) poate fi transformat. Acesta este principiul ingineriei genetice. Tehnologia de clonare molecular a ADN poate fi rezumat: - Vectorul i molecula de ADN sunt supuse aciunii unei endonucleaze de restricie capabil de a realiza o clivare decalat a catenelor de ADN, care genereaz capete adezive (care se pot lega covalent). Dac se utilizeaz aceeai enzim de restricie (de exemplu HIN D III), pe ambele molecule ADN vor apare aceleai capete adezive. - Fragmentele de ADN strin i vector, amestecate, se circularizeaz i n prezena unei ADN ligaze, se leag covalent. Rezult molecule hibride n care fragmente de ADN strin cu diferite lungimi - sunt inserate covalent n vectori. - Cu amestecul de ADN se transform o tulpina de E. Coli K 12 i utiliznd tehnici de selecie adecvate, se pot izola transformani care exprim determinantul strin clonat. - Un vector plasmidic poate transporta 5-10 kp baze de ADN strin, iar o cosmid poate conine pn la 50 kp baze de ADN strin (kp baze= kiloperechi de baze azotate). Avantajele biotehnologiei sunt imense: - Obinerea pe scar industriala a interferonilor, vaccinurilor, hormonilor, enzimelor 65

- Diagnosticarea unor boli genetice nc din perioada intrauterin. - Obinerea hrilor genetice, identificarea diverselor elemente genetice: plasmide, transpozoni, secvene de inserie. - Diagnostic de laborator n bolile cu germeni greu cultivabili sau n boli virale. De exemplu, tehnica PCR (polimerase chain reaction - reacia n lan a polimerazei - poate identifica chiar i fragmente de acid nucleic bacterian sau viral. Pornind de la civa primeri de polimerizare, o polimeraz poate amplifica de cteva milioane de ori un fragment de acid nucleic, astfel nct acesta s poat fi detectat). - Precizarea determinismului genetic al factorilor de patogenitate bacterieni. - Sinteza anticorpilor monoclonali cu specificitate de epitop. Variaia genetic este premisa adaptrii la mediu dar i un mod continuu de perfecionare a factorilor de patogenitate bacterieni.

66

CAPITOLUL 5 CHIMIOTERAPIE ANTIBACTERIAN

Descoperirea i producerea pe cale industrial a chimioterapicelor antibacteriene i utilizarea lor n practica medical a constituit un mare succes n reducerea mortalitii prin bolile infecioase. Chimioterapicul - Este o substan cu aciune antibacterian, care mpiedic dezvoltarea bacteriilor n organism, n doze mici, printr-o aciune selectiv la nivelul unor ci metabolice bacteriene. Terapia antiinfecioas s-a dezvoltat pe dou ci distincte: Prin obinerea antibioticelor - care sunt substane obinute prin purificarea unor produi de metabolism bacterian. Exemplul Penicilinei notatum (1929 Fleming) este ilustrativ n acest sens. Prin obinerea de chimioterapice propriu-zise, substane de sintez chimic. n prezent aceast clasificare nu i mai are rostul, deoarece i produsele de metabolism bacterian pot fi sintetizate chimic; multe din produsele folosite azi sunt substane de semisintez. Din acest punct de vedere, pare mai corect noiunea de chimioterapic. Scurt istoric 1929 - Fleming - descoper Penicilina, ca produs natural de metabolism al mucegaiului Penicillium notatum. 1940 - Florey i Chain purific Penicilina i o introduc n activitatea medical. Paul Erlich - este ntemeietorul chimioterapiei antibacteriene; - a testat aprox. 600 de substane privind aciunea antibacterian - a descoperit principiul aciunii selective a chimioterapicelor. 1935 - Domagk - a descoperit prima Sulfamida (Prontozilul) cu aciune antibacterian cu spectru larg. Efectul chimioterapicelor Efect bacteriostatic - diminueaz rata de multiplicare bacterian. - este mai puin eficient. Efect bactericid - chimioterapicul lizeaz celula bacterian. - efect de realizat n tratament.

67

Noiunea de chimioterapic ideal: - S aib toxicitate selectiv (s nu fie toxic pentru macroorganism). - S aib un spectru antimicrobian suficient de larg. - S fie bactericid. - S difuzeze n focarul de infecie. - S persiste timp suficient n organism. - S nu determine reacii adverse. - S acioneze n perioada de multiplicare bacterian exponenial. - Bacteria respectiv s nu dezvolte rezisten la chimioterapic.

Noiunea de spectru de aciune

Spectrul antimicrobian al unui antibiotic este suma speciilor care au toate sau aproape toate tulpinile sensibile la antibioticul respectiv. Spectrul natural se refer la specia bacterian. Spectrul actual se refer la tulpini sau grupuri de tulpini bacteriene i este mai restrns dect cel natural. Spectrul real este spectrul de sensibilitate la chimioterapice al unei singure tulpini bacteriene i este determinat prin antibiogram. Chimioterapicul de rezerv Este un chimioterapic cu utilizare n mod deliberat restrns, sub controlul riguros al oportunitii administrrii sale - n intervalul pn la determinarea spectrului real de sensibilitate al tulpinii bacteriene infectante sau/i cnd aceasta este rezistent la chimioterapicele uzuale. Utilizarea chimioterapicelor de rezerv ar trebui restrns la tratarea infeciilor bacteriene care amenin viaa bolnavilor. Familii de chimioterapice: Chimioterapicele se grupeaz n familii, dup criterii variate: - origine i structur chimic - spectru de aciune - mecanism de aciune - efect asupra bacteriilor (bacteriostatic sau bactericid). innd cont de spectrul de aciune, chimioterapicele antibacteriene pot fi clasificate astfel: Familii de chimioterapice cu spectru de aciune larg: Aminoglicozide: - Kanamicina - Gentamicina - Amikacina, Tobramicina .a.m.d. 68

- Tetraciclina, Oxitetraciclina, - Rolitetraciclina, - Doxiciclina, Clortetraciclina .a.m.d. Cloramfenicoli: - Cloramfenicol, Thiamfenicol Sulfamide: - Sulfatiazol, Sulfafurazol, Biseptol, Ftalilsulfatiazol. Nitrofurani: - Furazolidon, Nitrofurantoin Familii de chimioterapice cu spectru de aciune restrns: Macrolidele: - Eritromicina - Spiramicina - Oleandomicina .a.m.d. Polipeptidele ciclice: - Polimixine Tuberculostatice: - Hidrazida acidului izonicotinic (HIN) - Acidul para-aminosalicilic - Etambutol Anti-anaerobi: - Metronidazol - Clindamicina Quinolone: - Norfluoxacin - Acid nalidixic, etc. Familii de chimioterapice cu poziie particular (cu spectrul iniial restrns i apoi lrgit prin noi sinteze) Beta-lactamine: - Penicilinele - Ephitard - Moldamin Chimioterapice: - anti Pseudomonas: Carbenicilina (Pyopen) Ticarcilina Ureidopenicilina - anti Stafilococ: Oxacilina - cu spectru larg: Ampicilina, Amoxicilina Cefalosporinele - reprezentani generaia I: Cefalotin generaia II: Cefoxitin generaia III: Moxalactam Oligozaharidele: - Streptomicina Lincomocinele Peptolidele: - Pristinamicina - Virginamicina Alte chimioterapice (CT):

Tetracicline:

69

CT antifungice : Polienele: CT. antiprotozoarice: derivaii de Imidazol: CT. antihelmintice:

- Amfotericina B - Nistatin - Tinidazol - Metronidazol - Levamisol (Decaris) - Vermox

Clasificarea chimioterapicelor dup mecanismul de aciune: Antibiotice cu aciune pe peretele celular: lactamine Cicloserina Bacitracina Vancomicina HIN (Hidrazida acidului izonicotinic) Chimioterapice cu aciune pe membrana citoplasmatic: Polimixine Gramicidina Tirocidina Polienele Imidazolii Chimioterapice care inhib sinteza proteinelor la nivelul ribozomal Cu aciune pe subunitatea ribozomal: 30 S: Aminoglicozidele Tetraciclinele 50 S: Cloramfenicolul Macrolidele Chimioterapice care inhib direct sinteza acizilor nucleici Sulfamidele PAS Trimetoprim, Biseptol Quinolone Rifamicine Celula are receptori pentru chimioterapic. Chimioterapicul interacioneaz cu celula printr-un ligand (interaciune ligand - receptor).

70

Mecanisme moleculare de aciune ale chimioterapicelor

Chimioterapice cu aciune pe peretele celular Penicilinele Mecanisme de aciune: - Blocheaz sinteza peptidoglicanului, prin blocarea formrii legturilor interpeptidice. - Inactiveaz inhibitorii autolizinelor proprii PC bacterian (PC se distruge masiv). De aici rezulta un efect bactericid. - Nu sunt toxice pt. organismul uman, deoarece celulele eucariote nu au PC (au toxicitate selectiv). - Se pot administra n doze mari att la gravide ct i la nou nscui. Mecanism de rezisten: - Producerea de lactamaze, exemplu: stafilococul. - Ca o particularitate, sunt totdeauna sensibile la penicilina G (fr dezvoltarea rezistenei): Streptococul hemolitic grup A, Treponema pallidum. Cefalosporinele: - Sunt lactamine de semisintez, neatacate de lactamaze. - Au spectru mai larg dect cel penicilinic. - Mecanism de aciune pe peretele celular. Cicloserina: Mecanism de aciune: - Blocheaz sinteza unitii repetative din peptidoglican, prin blocarea enzimelor D-Alanin sintetaza i Alanin racemaza - Foarte toxic, utilizare restrnsa din acest motiv. Vancomicina Mecanism: Blocarea legturilor interpeptidice din peptidoglican. Bacitracina Mecanism de aciune: - mpiedic transportul de precursori pentru PC (interfer cu lipidele carrier). - Decuplarea fosforilrii prin transfer de electroni, cu aciune comun pe PC i MC. - Foarte toxic, se folosete rar. Hidrazida acidului izonicotinic Mecanism de aciune: - Inhibiia sintezei acidului micolic din PC. - Este bacteriostatic (regenerarea bacteriei prin refacerea PC).

71

Fig. 16 Ex. de sctructura chimic chimioterapice

72

Chimioterapice cu aciune pe membrana citoplasmatic Polimixinele: Mecanism: - Acioneaz asupra membranei citoplasmatice, distorsionndu-i structura, ntocmai ca i detergenii cationici; astfel, celula pierde diferite substane. Efect: - bactericid, restrns numai la bacterii gram negative. - Sunt mai active pe cale parenteral. - Utilizri terapeutice au Polimixina B i E. Polienele: Mecanism: - Se leag de sterolii din MC a fungilor (bacteriile nu au steroli n MC - deci sunt inactive pe bacterii). - Produc perturbarea funciei de membran osmotic. Efect: - fungicide Reacii adverse: toxice. Imidazolii: Mecanism: - Blocheaz sinteza lipidelor membranare. Efect: - anti-protozoare i anti-bacterii anaerobe. CT ce acioneaz pe ribozomi - inhibarea sintezei proteice Cu aciune pe subunitatea 30 S. Aminoglicozidele Mecanism de aciune: - Se fixeaz pe proteina S12 a subunitii ribozomale 30 S i: - Blocheaz formarea complexului de iniiere al sintezei proteice. - Blocheaz formarea polizomilor (stabilizeaz monozomii). Efect: bactericid puternic; parenteral sunt foarte eficiente. Reacii adverse: - ototoxicitate (afectarea perechii a VIII-a a nervilor cranieni. - nefrotoxicitate - sensibilizri - n administrri prelungite. Tetraciclinele Mecanism de aciune: - Se fixeaz pe subunitatea 30 S - Inhib sinteza proteic prin blocarea fixrii aminoacil - t-ARN la mARN (se blocheaz elongarea lanului polipeptidic). Efect: - bacteriostatic. Reacii adverse: - Nu se administreaz n timpul sarcinii (produce malformaii).

73

Cu aciune pe subunitatea ribozomal 50 S : Cloramfenicolul Mecanism: - Inhib peptidil-transferaza, blocheaz elongarea lanului polipeptidic. Efect: - Bacteriostatic Reacii adverse: - distrugerea celulelor stem medulare, cu anemie aplastic letal - rezistena apare la bacteriile care produc acetiltransferaz. Macrolidele (Eritromicina) Mecanism: - Se fixeaz pe r-ARN 23 S al subunitii 50 S - Blocheaz translocarea ribozomului pe m-ARN (mpiedicarea elongrii lanului polipeptidic) Lincomicina - posed exact acelai mecanism. Clindamicina Efect: - ultimele 3 chimioterapice sunt bacteriostatice - rezistena la acestea poate s apar dup modificarea intei moleculare, prin metilarea r-ARN.

Inhibarea sintezei acizilor nucleici Sulfamidele Mecanism: - Sunt analogi structurali ai acidului paraaminobenzoic (PABA), metabolit necesar pentru sinteza acidului folic. - nlocuiesc PABA din calea metabolica, prin similitudine structural i blocheaz astfel sinteza acidului folic. Efect: - Bacteriostatic Reacii adverse: - Reacii de sensibilizare la unii pacieni Nu pot aciona asupra bacilului tuberculos. Trimetoprimul Mecanism: - Blocheaz sinteza acidului folic prin inhibarea dihidrofolat reductazei. - Acioneaz sinergic cu sulfamidele, se asociaz (ex.: Biseptolul, ca preparat retard). Efect: - Bacteriostatic Rifampicina Mecanism: - Se fixeaz pe ARN polimeraza ADN dependent i blocheaz transcrierea mesajului genetic. Efect: - Bactericid Acidul nalidixic Mecanism: - Blocheaz giraza ADN i apoi replicarea ADN Efect: - Bactericid 74

Acelai mecanism pentru Novobiocina Acidul para-aminosalicilic (PAS) Mecanism: - Determin sinteza unui acid folic nefuncional. Efect: - Bacteriostatic, slab antituberculos. Ctigarea rezistenei la chimioterapice Se realizeaz prin: - mecanisme genetice - mecanisme biochimice Mecanisme genetice Rezistena cromozomial - Este o eventualitate rar, iar selecia o realizeaz numai chimioterapicul corespunztor variantei rezistente. Rezistena extracromozomial Rezistena plasmidic - Are cea mai mare importan n ctigarea rezistenei, deoarece plasmidele R se pot rspndi epidemic ntr-o populaie bacterian, n urma fenomenului de conjugare. Plasmidele R conjugante pot s asigure i mobilizarea unor plasmide R mici, neconjugative, prin fenomenul de cointegrare a unei plasmide neconjugante ntr-o plasmid conjugant. Transducia i transformarea completeaz posibilitile transferului genetic al plasmidelor mici. Transpoziia - Are un rol aparte n evoluia plasmidelor R (conjugante sau nu); exist evidene c transpozonii de rezisten se pot nscrie pe scheletul unor plasmide, conferindu-le permanent noi determinani de rezisten. n acest mod, se poate transmite rezistena n bloc pentru un set de chimioterapice. nscrierea pe acelai schelet plasmidic a multiple copii ale unui transpozon (TN) de rezisten, asigur adaptarea la concentraii crescute de chimioterapic. - Aa ne explicm de ce ntre 60% i 90% din rezistena la chimioterapice a bacteriilor patogene este mediat plasmidic; bacteriile patogene care i-au pstrat sensibilitatea natural faa de antibioticele de elecie sunt extrem de puine: aa sunt Streptococcus pyo-genes, Treponema pallidium i leptospirele, care au rmas nc sensibile la Penicilina G.

75

Mecanismele biochimice de dobndire a rezistenei la antibiotice:

1. Inactivarea enzimatic a chimioterapicului. 2. Lipsa sau modificarea intei moleculare a chimioterapicului. 3. untarea reaciilor metabolice blocate de ctre chimioterapic. 4. Lipsa permeabilitii pt. chimioterapie a nveliurilor celulare bacteriene. 1. Inactivarea enzimatic a CT Ex.: Rezistena bacterian la lactamine apare prin producerea enzimelor denumite lactamaze. De exemplu, stafilococul aureo hemolitic este secretor de penicilinaze. De aceea, Cefalosporinele (de semisintez) au fost concepute ca s nu fie inactivate de lactamaze. 2. Lipsa sau modificarea intei moleculare a chimioterapicului Ex.: Rezistena bacterian la aminoglicozide apare prin modificarea proteinelor ribozomale care leag antibioticele (modificarea proteinelor receptor). Rezistena la macrolide apare prin metilarea r-ARN sau alterarea proteinei ribozomale L4 - acelai mecanism de alterare al receptorilor. 3. untarea reaciilor metabolice blocate de ctre chimioterapic Spre exemplu, populaiile bacteriene rezistente la Sulfamide, folosesc acid folic preformat din mediu (acid folic produs de ctre macroorganismul infectat), astfel nct bacteria nu mai are nevoie s-i foloseasc propria cale metabolica de sintez a acidului folic. Astfel, rezistena bacterian la sulfamide poate apare relativ uor. 4. Lipsa permeabilitii nveliurilor celulare pentru un anumit chimioterapic Spre exemplu, tetraciclinele acioneaz numai dup obinerea unei anumite concentraii de chimioterapic n celula bacterian. Tulpinele de streptococ sunt impermeabile n mod natural la tetracicline, fapt care explic mecanismul de rezisten. Ca observaie final, putem preciza faptul c marea majoritate a bacteriilor au mai multe mecanisme biochimice de rezisten, care acioneaz n paralel cu mecanismele genetice de dobndire a rezistenei la chimioterapice. 76

Reguli de administrare ale chimioterapicelor antibacteriene Tratamentul antibiotic sau chimioterapic se administreaz ntotdeauna n urma unui diagnostic de laborator de infecie bine precizat, administrnd chimioterapicul antibacterian, antimicotic, antiparazitar corespunztor. Instituirea tratamentului cu chimioterapice are loc ntotdeauna dup ce s-au recoltat toate produsele patologice. n infeciile virale au eficien doar cteva preparate specifice antivirale. CT prezentate anterior nu au nici un efect n infeciile virale. CT se administreaz ntotdeauna dup indicaiile antibiogramei, care precizeaz spectrul actual al fiecrei tulpini n parte. Este de preferat monoterapia intit, folosind indicaiile antibiogramei (se alege CT cu diametrul zonei de inhibiie ct mai mare, bactericid). Asocierile de chimioterapice se prefer n: tratamente de lung durat, asocieri clinice plurietiologie, n cazuri clinice grave (septicemii) Exemplu de asociere (se asociaz CT cu efect sinergic): CT: lactamina + Aminoglicozid + Metronidazol Spectru: (coci gram +) (coci gram (anaerobi bacili gram -) protozoare) n supuraii colectate superficiale sau profunde, tratamentul CT devine eficient dup evacuarea pe cale chirurgical a secreiilor purulente. Profilaxia prin CT: se face numai n cazuri justificate, la anumite persoane din anturajul celui bolnav. Nu se aleg CT cu reacii adverse severe i mai ales nu se administreaz la bolnavii care au i alte afeciuni care le contraindic. Spre exemplu, aminoglicozidele se administreaz cu mare pruden la bolnavi renali, n funcie de o anumit valoare a Cleareance-lui la creatinin. De asemenea, aminoglicozidele nu se administreaz la hipoacuzici. CT se administreaz strict: - n infecii localizate se administreaz numai CT difuzibile n focar. - CT nu se subdozeaz. - se respect cu strictee intervalul dintre administrri, precum i durata minim a tratamentului chimioterapic. - nu se schimba antibioticul prea frecvent. - nu se menine n tratament un CT care in vivo nu d rezultatele scontate. 77

- nu se continu tratamentul cu CT respectiv dac au aprut reaciile adverse.

Principalele reacii adverse ale chimioterapicelor

Aproape toate chimioterapicele pot produce sensibilizri i reacii alergice. Penicilinele pot produce boala serului sau ocul anafilactic la anumii subieci. Ampicilina poate produce reacii eritematoase intense, punnd probleme de diagnostic diferenial cu alte afeciuni cutanate. Aminoglicozidele pot produce nefrotoxicitate i ototoxicitate, prin afectarea perechii a VIII-a a nervilor cranieni. Cloramfenicolul - prin toxicitatea medular - produce sindroame anemice grave. Toate chimioterapicele, prin folosire intempestiv - pot genera dismicrobisme; se distrug bacteriile comensale din microbiocenoze i este favorizat dezvoltarea excesiv a Candidei albicans; la sfritul tratamentului chimioterapic pot apare stomatite, esofagite, vaginite micotice. Chimioterapicele care inhib sinteza acizilor nucleici i sinteza proteic, produc malformaii grave la nivelul produsului de concepie. Antibioticele respective se folosesc cu mult pruden la gravide, luze i nou nscui.

78

CAPITOLUL 6 INFECIE I IMUNITATE

Relaii ecologice ale microorganismelor
Microorganismele sunt o component a biosferei. Microbiocenozele sunt amestecuri de populaii bacteriene, ntre care se stabilesc anumite relaii ecologice: Relaii ecologice ntre microorganisme Relaii de neutralitate Relaii de sinergism Relaii de antagonism Neutralitate : microbiocenozele organismului uman. Sinergism: Spre exemplu fenomenul de satelitism al speciei Haemophilus influenzae, bacterie ce se dezvolt mai bine n jurul coloniilor de Stafilococcus aureus (stafilococul produce factorii de cretere necesari Haemophylus-ului). Antagonism: Unele populaii bacteriene inhib dezvoltarea altora prin: - bacteriocine - competiia pentru substane nutritive - modificri de pH etc. exemplu: ecosistemul bacterie - bacteriofag. Relaii ecologice microorganisme - factori de mediu - Microorganismele contamineaz - aerul, apa i solul. Relaii ecologice microorganisme - macroorganisme n relaia cu omul exist: microorganisme - saprofite - folosesc materia moart sau materii anorganice - parazite - stricte - folosesc ca substrat organismele vii - facultative - folosesc materie vie sau moart.

79

Microorganismele parazite stricte, funcie de capacitatea de a produce infecii sunt: microorganisme patogene de ordinul I: microorganisme cu patogenitate cert - produc ntotdeauna mbolnviri microorganisme - patogene de ordinul II - sunt patogeni oportuniti, produc infecie la organismele tarate imunologic.

Comensalismul - Tip particular de relaii micro - macroorganism, din care nu rezult efecte nocive asupra macroorganismului (flor bacterian normal). - Limitele colonizrii sunt dependente de barierele antimicrobiene ale fiecrui teritoriu n parte. La om exist: Zone practic sterile - ntregul mediu intern (snge, lichid cefalorahidian etc.) - cavitile seroase (pleurale, articulare etc.) - esuturile

Zone contaminate dar necolonizate - bariera acid gastric | - enzimele digestive | scad drastic numrul - bila | bacteriilor (local)

Zone normal colonizate ale organismului - cu bacterii comensale. Organismul uman posed: - 1013 celule proprii - 1014 celule bacteriene

De aici rezult principalele microbiocenoze ale organismului: - ale tegumentului i conjunctivelor - ale cavitilor - nazal, bucal, faringian. - ale ileonului inferior i ale colonului - ale uretrei - ale vaginului

80

Exemple de microbiocenoze 1. Microbiocenoza tegumentului: - Stafilococ epidermidis, aureus - Propionibacterium acnes - Chorynebacterii nepatogene - Streptococi - diferite specii 2. Microbiocenoza nazal - Stafilococ epidermidis - Stafilococ aureus - Chorynebacterii comensale - Neiserii comensale - Haemophilus influenzae 3. Microbiocenoza bucal i a faringelui - Coci gram pozitivi: Streptococi - viridans - grup A - non grup A - pneumoniae Stafilococi coagulazo negativ sau pozitiv - Anaerobi nesporulati gram negativi: Veillonella Fusobacterium Bacteroides - Anaerobi gram pozitivi: Peptococcus, Peptostreptococus Actynomices - Cocobacili: Haemophilus (influenzae i parainfluenzae) - Bacili gram negativi: Enterobacterii (n cantiti reduse) - Fungi: Candida albicans - Virusuri: Herpes simplex 4. Microbiocenoza intestinal (colon) - Anaerobi gram negativi: Bacteroides; Fusobacterium - Anaerobi gram pozitivi: Clostridium Peptococcus Peptostreptococcus Bifido bacterium - Enterobacteriacee gram -: Coli, Klebsiella Enterobacter, Proteus 81

- Fungi: Candida albicans - Virusuri: Adenovirusuri (la copii mai ales) Microbiocenoza colon de tip adult: predomin anaerobii gram negativi. Microbiocenoza colon de tip sugar: predomin anaerobii gram pozitivi. Majoritatea bacteriilor din colon sunt anaerobe. 20% din greutatea fecalelor e reprezentat de bacterii. 5. Microbiocenoza vaginal - Bacili gram pozitivi i negativi anaerobi - Coci anaerobi: Peptococcus, Veillonella - Lactobacillus (abundent la un pH vaginal acid) - Haemophilus vaginalis - Ureaplasma urealiticum - Fungi: Candida albicans Disbioza nseamn o colonizare microbian anormal, face trecerea de la comensalism la parazitism. Cauze perturbatoare ale colonizrii bacteriene: 1. Lipsa sau insuficiena unor bariere antimicrobiene: Exemplu: pacienii cu aclorhidrie gastric au bacili Coli n numr mai mare de 1016 germeni/ml. 2. Modificri cantitative i calitative ale substratului oferit pentru dezvoltare: Exemplu: tenul seboreic stimuleaz colonizarea cu stafilococ. 3. Perturbarea echilibrului bacterian dup un tratament intempestiv cu antibiotice: Exemplu: apariia infeciilor cu Candida albicans dup acest tratament. 4. Suprapunerea unor tulpini bacteriene de spital mai virulente dect cele obinuite. Rolul bacteriilor comensale (funciile microbiotei indigene) Au fost studiate pe animale axenice (germ free), puiul de animal fiind extras prin operaie cezarian i ferit de germeni, pentru a preveni colonizarea bacterian. 82

Funcii nutritive - microbiocenoza intestinal furnizeaz gazdei vitamine: complex B, E, K. - microorganismele pot digera (metabolizeaz lipide sau compui azotai). parial anumite alimente

Funcii de protecie - microorganismele comensale se opun colonizrii zonei cu microorganisme patogene prin: - bacteriocine - competiia pentru substane nutritive. Aprare imunologic - microorganismele comensale au rol n maturarea morfofuncional a sistemului imun limfoid (stimuleaz activitatea centrilor germinativi din ganglionii limfatici). Dezvoltarea intestinului - la animale axenice, musculatura intestinal e foarte slab dezvoltat, iar cecul are un volum de 6 ori mai mare dect cel normal i un coninut enorm de mucus. De aici se deduce implicarea bacteriilor comensale n dezvoltarea intestinului.

Infecia
Infecia reprezint perturbarea homeostaziei, n urma conflictului dintre microorganism i macroorganism. Microorganismul acioneaz prin factorii si de patogenitate. Macroorganismul acioneaz prin rspuns imun. Specificitatea etiologic a infeciei: Un anumit agent etiologic determin un anumit tip de rspuns imun i o anumit boal infecioas. Postulatele lui Koch Cuprind condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc un microorganism, pentru a putea fi considerat patogen: 1. Microorganismul patogen trebuie s fie prezent n toate cazurile de boal. 2. El trebuie izolat i meninut n cultur pur. 3. Cultura inoculat la animalul de laborator produce infecia caracteristic. 4. Trecerea prin infecie duce la instalarea imunitii specifice. 83

n lumina cunotinelor actuale, aceste postulate ar trebui reinterpretate, deoarece ele au anumite limite, de exemplu: n cazul postulatului 1, microorganismul patogen poate fi izolat i de la: - purttori sntoi - cazuri clinice asimptomatice, inaparente. n cazul postulatului 2, exist bacterii ce nu pot fi cultivate pe medii; exemplu bacilul leprei. n cazul postulatului 3, acest postulat nu ine cont de rezistena fa de infecie imprimat de specie (exista boli tipice pentru animal sau specifice numai pentru om). n unele cazuri, restructurrile imunologice nu se produc (exemplu gonoreea). Alteori, nrudirile antigenice dintre bacterii (ex.: Proteus OX19 i Ricketsia prowazecki) dau reacii imunologice ncruciate. Patogenitatea Reprezint capacitatea unui microorganism de a produce infecia. Este o proprietate de specie, care poate fi mbuntit prin ereditatea extracromozomial. Se msoar prin virulen. Virulena - se exprim n DML (doz minim letal) 1 DML - cantitatea cea mai mic de germeni care omoar 100 % din animalele de experien. DL 50 - doza letal pentru 50% din animalele de experien. DL 50 are mai puine erori dect DML. Caracteristicile principale ale infeciei Evoluia stadial a. perioada de incubaie - timpul scurs de la ptrunderea agentului etiologic n organism pn la apariia primelor semne de boal. - este caracteristic fiecrei infecii. b. perioada de debut - apar primele semne caracteristice ale infeciei. c. perioada de stare - tabloul clinic caracteristic pentru o anumita infecie. d. perioada de terminare - convalescena

84

Febra - Simptom comun tuturor infeciilor. Modificrile sanguine - n infecii bacteriene: neutrofilie, crete proteina C reactiv - n infecii virale: limfocitoz sau monocitoz, leucopenie - n infecii parazitare: eozinofilie. Mecanismele de transmitere a. poarta de intrare: - specific pentru fiecare infecie - microorganismul poate rmne cantonat la poarta de intrare, sau poate difuza n snge (bacteriemie). b. calea de eliminare: - poate fi uneori aceeai cu poarta de intrare c. calea de transmitere a infeciei de la individ la individ - calea aerian (picturi Pflge) - calea digestiv - calea veneric - vectori (mute, nari, purici etc.) Clasificarea infeciilor Poarta de intrare reprezint principalul mecanism de clasificare: - infecii - respiratorii - digestive - cutanate etc. Prognostic Infecii acute - rspunsul imun e eficient i - sunt urmate de vindecare dup zile - sptmni. Infecii cronice (persistente) - agentul etiologic rmne cantonat n organism i simptomele pot persista luni - ani. - rspunsul imunologic e perturbat. Condiii de ndeplinit pentru ca un microorganism s fie patogen: - S ptrund n organism i s adere de celule - S se multiplice n esuturi - S produc perturbri n homeostazie - S anihileze factorii de aprare ai organismului gazd. Aceste condiii sunt ndeplinite prin diveri factori de patogenitate bacterian.

85

Patogenitate bacterian
Clasificarea factorilor de patogenitate bacterieni n funcie de mecanismul lor de aciune n - adezine - invazine - agresine Adezinele - factori care favorizeaz ataarea bacteriei pe suprafaa celulei care va fi infectat. - ptrunderea bacteriei n celul se face prin endocitoza bacterian indus. Exemple de adezine: Pilii de la E. Coli - aderare de glicoproteinele de pe suprafaa epiteliului intestinal. - pilii CFA (factor antigenic de colonizare) codificai de ctre plasmida Ent. Pilii de la gonococ - exista 4 tipuri antigenice piliare de gonococ. - pilii S, proteina P2: rol de ataare pe receptorii de acid sialic ai celulelor epiteliale. - pilii au determinism cromozomial. Proteina M piliar a streptococului hemolitic grup A - cu rol de ataare pe receptorii de fibronectin ai mucoasei faringiene. - cu rol antifagocitar. Pilii Bordetellei pertussis - sunt factori de ataare ai Bordetellei pertusis de cilii cilor respiratorii superioare. - Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae - se ataeaz prin piraterie, folosind aceste structuri ale Bordetellei. Diverse proteine din membrana extern funcioneaz ca adezine: Antigene de suprafa ale genului Chlamydia: - ataare de celul prin receptori glicoproteici. - formarea veziculelor de chlatrin, ce protejeaz bacteriile la interiorul lor. Antigene de suprafa ale genului Shigella: - are un antigen de suprafa codificat plasmidic (gena VIR-F) ce codific ataarea i penetrarea n celula epitelial a colonului => vacuole. - hemolizina de contact lizeaz vacuolele, favoriznd rspndirea Shigelelor nspre alte celule. - reglarea genei VIR-F: prin stimulon. 86

Invazine - reprezint produi toxici sau netoxici, secretai de ctre celulele bacteriene, cu rol n difuzarea infeciei. - toxinele sunt - exotoxine - secretate de ctre bacterii gram + i gram- endotoxine - eliberate prin liza corpului bacterian al bacteriilor gram- produi extracelulari netoxici sunt produi enzimatici: colagenaze, hialuronidaze, coagulaze, hemolizine, catalaza etc.
Tabelul nr.7 - Produi extracelulari toxici EXOTOXINE ENDOTOXINE - Excretate de ctre bacterii n mediul n care se - Se elibereaz prin liza corpului multiplic; sunt difuzibile bacterian al bacteriilor gram - ; nedifuzibile - Natura proteic (polipeptide) - Complexe lipopolizaharidice Lipidul A are rol toxic. - Termolabile (se inactiveaz la 60C) - Termostabile - (rezist i la 100C). - Puternic imunogene (induc formarea de - Nu induc formare de anticorpi anticorpi neutralizani). Stimuleaz rspunsul neutralizani. Stimuleaz rspunsul imun imun umoral. celular. - Cu formol se obin anatoxine (toxine cu - Nu se transform n anatoxine (nu se capacitate imunogen pstrat i toxicitate pot prepara vaccinuri) sczut) - Anatoxinele sunt folosite ca vaccinuri ex.: anatoxina difteric, tetanic - Majoritatea exotoxinelor sunt produse prin - Proprietate cromozomial dependent. conversie lizogen sau prin plasmide (determinism extracromozomial). - Fiecare exotoxin are un mecanism de - Mai puin toxice. aciune specific. - Toate endotoxinele au tropism vascular - Sunt foarte toxice i produc oc endotoxic cu: - Aciunea exotoxinelor este ireversibil i extravazarea plasmei apare dup perioade variabile de laten. hipotensiune arterial, edeme leucopenie, pete hemoragice - Fiecare exotoxin poate fi neutralizat numai - Aciunea endotoxinelor apare imediat, att timp ct este circulant. fr perioad de laten - Clasificarea exotoxinelor dup mecanismul - ocul endotoxinic apare n urma de aciune: distruciei masive a bacteriilor gram Exotoxine - cu molecul bimodal negative (probabil tratament - Citotoxine, intempestiv). - Neurotoxine - Endotoxinele produc avort la animale - Enterotoxine de experien gestante. - Inocularea repetat a unor cantiti mici de endotoxin realizeaz o imunizare fa de efectele acesteia (experiene pe animale).

87

88

Principalele mecanisme de aciune ale exotoxinelor Exotoxine cu molecul bimodal Toxina difteric - fragmentul B cu rol de ataare pe celul (endocitoza receptor indus). - fragmentul A - rol toxic - ADP riboziltransferaza - ribozileaz factorul de elongare EF2 i inhib sinteza proteic). Toxina este produs prin conversie lizogen (bacteriofagul tox). Toxina piocianic - cu mecanism asemntor celei difterice. Toxina E. Coli - tulpinile enteroinvazive produc 2 toxine Shiga-like: STL1, STL2 prin conversie lizogen cu 2 bacteriofagi temperai diferii. - fragmentul A blocheaz factorul de elongare EF1 al sintezei proteice. Toxina Shigellei dysenteriae - fragmentul B - ataare pe celula susceptibil A - blocheaz factorul EF1 de elongare al sintezei proteice - toxina Shiga are efect - neurotoxic - enterotoxic - citotoxic (efect citocid) Este una dintre cele mai puternice toxine cunoscute. Toxina Bordetellei pertusis - fragmentul B - ataare pe celul - fragmentul A - ADP ribozilarea proteinei N 1 din sistemul de control al adenilat ciclazei, cu creterea semnificativ a cAMP - adenilat ciclaza calmodulin-dependent are efectele toxice (edem, necroze). Toxina Bacillus anthracis - toxina are 3 componente antigen protector / fragment B factor de edem | fragment A factor letal | - factorul de edem are toxicitate prin adenilat ciclaza calmodulin dependent. - factorul letal nu are mecanism de aciune cunoscut. 89

Toxina holeric - enterotoxin bimodal. - fragmentul B are rol n ataare pe receptorii GM 1 ai mucoasei intestinale. - fragmentul A realizeaz inactivarea proteinei G 1 din sistemul de control al adenilat ciclazei => crete cAMP - celula epitelial e comutat din celula absorbant de ap i electrolii - n celul secretoare de ap i electrolii. - testul ansei ileale ligaturate este pozitiv. - determinismul toxinei holerice este cromozomial. Enterotoxinele Toxina holeric - bimodal (discutat anterior). E. Coli enterotoxigen (tulpini ETEC) - ETEC - TL - termolabile - TS - termostabile - crete cGMP intracelular i transform celula n secretoare de ap i electrolii. - codificat plasmidic prin plasmida Ent. - Plasmida Ent se poate transmite prin conjugare altor populaii bacteriene, care produc mai rar un sindrom diareic: Citrobacter Campylobacter Klebsiella Bacillus cereus Enterobacter Pseudomonas aeruinosa, etc. Stafilococul aureu - secret 7 tipuri antigenice diferite de enterotoxine (A - F) - cu codificare cromozomial i plasmidic. - toxina stimuleaz terminaiile nervoase din intestin i centrul vomei, cu apariia micrilor antiperistaltice i vrsturilor. Neurotoxinele Toxina tetanic - receptorii pentru toxin sunt reprezentai de ctre glicoproteinele neuronale. - inactiveaz sinapsele inhibitorii din SNC i produce convulsii. Toxina botulinic - scade sinteza i eliberarea acetilcolinei la nivelul sistemului nervos, cu apariia paraliziilor. - receptorii pentru toxina botulinic sunt glicoproteine: - GD1B, GT1B de pe suprafaa neuronal 90

Toxina Shiga - are efect toxic citocid pe celulele epiteliale ale vaselor care hrnesc sistemul nervos, cu apariia unui sindrom ischemic. Citotoxinele - Pe celule epiteliale: Toxina stafilococic - determin distrugerea desmozonilor din derm, cu apariia sindromului de piele oprit. Toxina streptococic - eritrotoxina Dick (cu 3 tipuri antigenice), produs prin conversie lizogen. - eritrotoxinele acioneaz prin vasodilataia capilarelor cutanate. - Pe hematii (hemolizinele) Exemple: - Stafilococul aureus - hemolizina - Clostidium perfringens - i toxin - Streptolizina O - O2 labil; Streptolizina S - O2 stabil Produi extracelulari netoxici (enzime) Hialuronidaza - realizeaz hidroliza acidului hialuronic din esutul conjunctiv. - favorizeaz diseminarea infeciei la: streptococ, stafilococ, pneumococ, clostridii Colagenaza - invazia prin degradarea colagenului. - Clostridium perfringens, Clostridium hystoliticum. Fibrinolizina - degradarea coagulului de fibrin din focarul inflamator, realiznd invazia esuturilor. - la Streptococ, Stafilococ. Leucocidine - sunt enzime care mpiedica degradarea intraleucocitar bacterian. - la Streptococ, Stafilococ. Coagulaza - produce coagularea plasmei; realizeaz protejarea bacteriilor fa de factorii antibacterieni (printr-o mantie de fibrin pericelul bacterian). 91

Catalaza - protejeaz fa de efectul bactericid al radicalilor de oxigen din fagocite. Agresine Realizeaz evadarea de sub controlul aprrii antiinfecioase. Majoritatea sunt determinani de suprafa celular. 1. Cu aciune antifagocitar (capsul, proteine de suprafa) 2. Cu aciune anticomplementar (aciune enzimatic) 3. Scindarea Ig As la poarta de intrare (enzime) 4. Variaia antigenic a factorilor de patogenitate. Se clasific n funcie de mecanismul de aciune: Aciune antifagocitar - La bacteriile care au capsul (Klebsiella, Streptococcus pneumoniae, Clostridium perfringens, .a.m.d.). - Proteina A stafilococic - mpiedic opsonizarea. - Coagulaza stafilococic - realizeaz o mantie de fibrin n jurul bacteriilor, cu rol antifagocitar. - Cord-factorul bacilului tuberculos inhib migrarea macrofagelor iar sulfolipidele aceluiai bacil se opun formrii fagolizozomilor. Cu aciune mpotriva sistemului complement (C') - La bacteriile gram negative exist structuri care blocheaz receptorii pentru componenii sistemului C'. - La bacteriile gram + exist o enzim care scindeaz factorul C 5a al sistemului C'. Scindarea imunoglobulinelor A secretorii la poarta de intrare - Aceasta scindare se produce sub aciunea unei enzime, la nivelul regiunii balama a imunoglobulinei. - fenomen caracteristic genurilor bacteriene: Haemophylus, Neisseria, Bacteroides. Variaia antigenic - Acest mecanism are baze genetice i reprezint o metod foarte eficient de evadare de sub controlul rspunsului imunologic al organismului. - De exemplu, genul Salmonella poate sintetiza dou tipuri antigenice diferite de flagelin (H1 i H2) - fenomenul variaiei de faz fiind controlat de ctre doi operoni diferii, sub controlul proteinei HIN. 92

- La genul Neisseria exist fenomenul de duplicaie genic, fapt care determin cteva tipuri antigenice piliare diferite, cu patogenitate diferit. De asemenea, exist 7 proteine distincte care codific fenomenele de aderare ale bacteriilor din genul Neisseria. - La genul Borellia exist variaia antigenic a proteinelor de suprafa cu rol de adezine, din cauza plasmidelor lineare. Prin acest fenomen de variaie antigenic se pot explica cele 6-9 recderi febrile din febra recurent.

Ereditate cromozomial i extracromozomial determinismul factorilor de patogenitate bacterieni

Cu determinism cromozomial putem meniona urmtorii factori de patogenitate: - endotoxina bacteriilor gram negative - endotoxina vibrionului holeric - variaia: colonii S colonii R - prin mutaie, cu schimbarea fenotipului virulent. Cu determinism extracromozomial - numrul exemplelor crete mult mai semnificativ; aici menionm doar cteva: - toxinele streptococice, difterice, ale Clostridiilor - produse prin conversie lizogen. - toxinele ce produc sindrom diareic la E. Coli, Citrobacter, Enterobacter - cu determinism plasmidic (plasmida ENT). Un determinism dublu, cromozomial i extracromozomial l au enterotoxinele sau toxinele exfoliative ale Stafilococului aureu hemolitic. - Acelai factor de patogenitate (spre exemplu o enterotoxin) la unele specii are determinism cromozomial (vibrion holeric) i la altele are determinism plasmidic (Escherichia Coli). Tabloul clinic produs de ctre enterotoxinele respective - este cu toate acestea - acelai. - Pentru a demonstra determinismul genetic al factorilor de patogenitate - s-a efectuat un experiment foarte interesant: bacteriofagul temperat al speciei Clostridium botulinum s-a introdus la Clostridium novy, care a sintetizat n mod paradoxal - toxina botulinic. Experimentul s-a efectuat i n sens invers, Clostridium botulinum sintetiznd toxina Clostridium novy, sub aciunea bacteriofagului Cl. novy. 93

- Prin alte experimente s-a demonstrat faptul c reglajul genetic al factorilor de patogenitate se face prin stimulon (vezi cap. Genetic). Spre exemplu, toi factorii de patogenitate ai Shigellei sunt inhibai la temperatura de 30C, dar stimulai la temperatura de 37C, temperatura corpului uman. Sau - gena VIR - de la vibrionul holeric controleaz n funcie de factorii de mediu - o reea de operoni ce codific sinteza factorilor de patogenitate. - n cazul n care exist bacterii virtual nepatogene, din cauza unui echipament de patogenitate incomplet, acestea se asociaz cu bacterii patogene, determinnd infecii mixte. n cadrul acestei asociaii, arsenalul factorilor de patogenitate este folosit n comun.

94

CAPITOLUL 7 GENUL STAPHYLOCOCUS

Caractere generale
Genul aparine familiei Micrococaceae; sunt coci gram pozitivi aezai n grmezi, catalazo-pozitivi, anaerobi facultativi. Sunt germeni patogeni i condiionat patogeni care produc 80% din infeciile piogene umane (potenial invaziv crescut).

Reprezentani
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus
Tabel nr. 8 - Clasificare i caracteristici difereniale
Prezena coagulazei Fermentarea manitolului oxidativ i fermentativ Fermentarea glucozei Hemoliza Sensibilitate la Novobiocin Producerea de pigmeni (n aerobioz) Patogenitatea Habitat St. aureus + + + + S auriu citrin portocaliu rar - fr pigment Patogen St. epidermidis (oxidativ) -,+ S alb St. saprophyticus ( arareori) + , (-) R galben (arareori) gri

Factori de risc pentru infecii

Condiionat Condiionat patogen patogen Cavitatea nazofaMicrobiocenoza Microbiocenoza ringian (purttori 40% nazal i cutanat tractului urinar ambulator 80% n (produce cistite) mediul spitalicesc) tegumente, intestin perineu Pacieni spitalizai Vrste extreme Idem Idem

97

Factori de patogenitate
Condiioneaz stafilococice. polimorfismul extraordinar al infeciilor

Antigene somatice Puni pentapeptidice de glicin (particularitate a peretelui celular stafilococic); Nucleoproteina P - ntlnit la toi stafilococii, patogeni sau nepatogeni; Acidul ribitol-teihoic - antigen specific de specie pentru Staphylococcus aureus (polizaharidul A); Proteina A (aglutinogenul A): - protein de suprafa ntlnit la St. aureus; - cu rol de adezin i rol antifagocitar; - poate fixa fragmentul FC al imunoglobulinelor G; - este imunogen i declaneaz formarea anticorpilor specifici. Coagulaza legat - formeaz o manta de fibrin n jurul bacteriei, cu rol antifagocitar; Capsula - ntlnit in vivo la anumite tulpini de S. aureus, cu rol antifagocitar; - induce formarea anticorpilor neutralizani; Acidul glicerol-teihoic - este un antigen specific speciei S. epidermidis (polizaharidul B). Antigene extracelulare (invazine) Enzime Coagulaza - liber i legat; coagulaza legat are rol antifagocitar; - cea liber transform fibrinogenul n fibrin n prezena unui activator plasmidic; particip la aglomerarea bacteriilor sub forma unor coaguli mici endovenoi, cu rol n invazivitate; - Testul coagulazei rmne cel mai important test de diagnostic de laborator al S. aureus. Fibrinolizina Stafilococic (Staphylokinaza): - lizeaz fibrina, favorizeaz diseminarea bacteriilor din microembolii supurai. Hialuronidaza - favorizeaz invazivitatea bacterian, prin hidroliza acidului hialuronic din esutul conjunctiv. 98

Dezoxiribonucleaza, Ribonucleaza: - distrug acizii nucleici i contribuie la formarea leziunilor; - Endonucleazele S. aureus sunt termorezistente, iar cele ale S. epidermidis sunt termosensibile. Lipaze, esteraze, fosfolipaze: - favorizeaz colonizarea esutului subcutanat i a glandelor sebacee. Toxine Se pot clasifica n funcie de efect: - citolitice (hemolitice, leucocidale, dermonecrotice, letale); - exfoliative; - enterale (enterotoxine). Toxinele citolitice Hemolizinele - altereaz membrana hematiilor i produc hemoliz complet; hemolizina ( toxina) - efect hemolitic (produce hemoliza pe medii cu snge de oaie sau iepure); - efect dermonecrotic i letal (efect hemolitic redus pe hematii umane); - mai frecvent detectat la Staf. aureus; GM este de 28.000 ; poate fi transformat n anatoxin. hemolizina - produce hemoliz de tip cald-rece pe medii cu snge (ncepe la 37C i devine complet la 4C);

99

- caracteristic tulpinilor de Stafilococ patogene pentru animale. hemolizina - lezeaz hematiile umane; - nu se poate vizualiza pe geloz snge. hemolizina - efect citotoxic pe hematii, neutrofile, macrofage, limfocite. Leucocidina Panton - Valentine - cu efect distructiv asupra PMN i macrofagelor; - cu efect nehemolitic i antifagocitar (distruge lizozomii celulari). Toxina sindromului de oc toxic (TSS) - produs de cteva biotipuri de Staf. aureus, care exist n microbiocenoza cutanat la unele persoane; - efect letal dup o stare de oc, cu fenomene digestive (vrsturi); descris iniial ca enterotoxina F. Toxina exfoliativ - distruge forele de adeziune dintre celulele granulare din derm, producnd epidermoliz - exfoliere cutanat; - este secretat de stafilococi ai tipului fagic II i produce aazisul sindrom al pielii oprite, care include: boala Ritter Sindromul Lyell al copilului, necroza toxic epidermal) impetigo bulos rash scarlatiniform - GM a toxinei este de 24.000 - se evideniaz prin inoculare la oricel nou-nscut, care prezint exfoliere cutanat la locul inoculrii. Enterotoxinele - produse de tulpini de Stafilococ coagulazo-pozitive i coagulazo-negative; - produc toxiinfecii alimentare, cu predominena vrsturilor; - enterotoxinele sunt antigenic distincte (notate de la A la E) i acioneaz asupra terminaiilor nervoase intestinale determinnd micri antiperistaltice. - enterotoxinele sunt termostabile (rezist la fierbere 1 or) i nu pot fi degradate n timpul preparrii alimentelor; de asemenea, enterotoxinele rezist la enzimele proteolitice: tripsina, papaina, chemotripsina etc. - enterotoxinele A i D sunt cel mai frecvent ntlnite n patologia discutat; enterotoxina tip B produce enterocolit postantibiotice; 100

- mecanismul de aciune al enterotoxinei a fost evideniat prin testul Dolmann.

Infecii stafilococice
Infeciile tipic stafilococice sunt piogenice, invazive i toxigene. Infecii piogene Piodermita stafilococic - produs de S. aureus i ocazional de S. epidermidis; - este mai frecvent ntlnit la copiii care triesc n climat cald i umed. Foliculita - afecteaz foliculul pilos superficial. Furunculul - afectarea foliculului pilos i a esutului celular subcutanat (reacie inflamatorie puternic). Carbunculul - asemntor ca tip de leziune cu furunculul, ns prezint focare multiple (folicul pilos, glande sebacee, esutul subcutanat). Panariiul - afectarea zonei periunghiale. Hidrosadenita - infecia piogen a glandelor sudoripare; Impetigo - leziuni cutanate superficiale, de tip vezicular; Leziuni septice (abcese metastatice), secundare bacteriemiei sau septicemiei: - stafilococia pleuro-pulmonar (complicaie dup infecii virale); - pneumonia primar a copilului mic; - sinuzite, otite supurate, mastoidite; - cistite, cistopielite (implicat i S. saprophyticus); - mastite (la femei care alpteaz), endometrite; - meningite, pleurezii, peritonite, pericardite; - endocardita acut - cu S. aureus, la subieci protezai valvular; - endocardita subacut - cu S. epidermidis (poate complica o intervenie chirurgical toracic); - osteomielita - reprezint cea mai frecvent complicaie septic, dup genera-lizarea infeciei pe cale hematogen; afecteaz mai ales copiii sub 12 ani sau persoane care au suferit intervenii chirurgicale ortopedice; - infecia plgii chirurgicale (infecie nosocomial tipic); - stafilococia malign a feei. 101

Boli stafilococice toxigene Toxiinfeciile alimentare - sindroame produse de ctre tulpinile bacteriene secretoare de enterotoxine (grup fagic III); - au incubaie scurt (2-6 ore), debut brusc, predomin vrsturile, dar cu vindecare rapid dup eliminarea toxinei din organism (24-48 ore). Enterocolitele postantibiotice - apar la persoanele spitalizate, tratate cu antibiotice cu spectru larg. Sindroamele de exfoliere cutanat (Sindromul pielii oprite produs de ctre toxina exfoliativ stafilococic): - boala Ritter - sindromul Lyell - impetigo bulos - rash scarlatiniform Primele trei sindroame pot evolua epidemic n seciile de nounscui; Rash-ul scarlatiniform apare la copilul mai mare. Sindromul de oc toxic - sindrom produs de ctre anumite tulpini de S. aureus, productoare de toxin TSS (iniial denumit enterotoxin F).

Aspecte epidemiologice
Rezervorul de infecie: - purttorii nazali - purttorii perineali - alimente i buturi contaminate - mediul spitalicesc (tulpini multiplu rezistente la chimioterapice) Factori predispozani: - persoane imunodeprimate (vrste extreme, cancere, diabet zaharat, intervenii chirurgicale, tratament cu corticosteroizi, infecii virale anterioare). - factori de patogenitate bacterieni cu codificare extracromozomial: adezine, invazine, toxine. Cu transmitere aerogen, prin contact direct (mn), prin transmitere digestiv.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice secreii purulente; exudat nazal i faringian, sputa n infecii respiratorii; urina n infecii urinare; 102

 snge pentru hemocultur etc.; lichid cefalorahidian.

Examenul microscopic direct Cocii Gram + dispui n grmezi care imit ciorchinii de strugure, pe un fond roz-rou reprezentat de detritusuri celulare i fibrin. Izolarea pe medii Stafilococii cresc pe medii cu snge i pe medii hiperclorurate (cu 7,5 g% NaCl). Identificarea se realizeaz examinnd: Proprietile morfotinctoriale: coci gram pozitivi, aezai n grmezi Proprietile de cultur: Medii lichide: - pe ap peptonat i bulion tulbur uniform mediul de cultur; - mediul de mbogire este mediul lichid hiperclorurat Chapmann; - pe bulion+manitol+indicator de pH, pentru depistarea Staphylococcus aureus. Medii solide: - geloza snge: Colonii S (2-3 mm) cu zon de hemoliz complet la S. aureus (i arareori hemoliz la S. epidermidis). n aerobioz, coloniile S. aureus pot fi pigmentate n auriu, citrin, portocaliu, alb; S. epidermidis prezint pigment alb. S. saprophyticus prezint pigment gri sau glbui. Pigmentarea coloniilor poate fi urmrit mai bine pe mediul cu monoacetat de glicerol. - din prelevatele biologice contaminate cu flor de asociaie se face izolarea pe medii selective (hiperclorurate cu manitol). Pe mediul Chapmann, coloniile S. aureus sunt manitol + (vireaz culoarea mediului), n timp ce coloniile stafilococilor saprofii sunt manitol negative (nu l fermenteaz). Proprieti biochimice: Testul catalazei: - este pozitiv la stafilococi (face diagnostic diferenial cu genul Streptococcus); Degradarea manitolului - servete la identificarea speciilor genului Staphylococcus: S. aureus degradeaz manitolul oxidativ i fermentativ; S. epidermidis degradeaz manitolul inconstant, exclusiv oxidativ. 103

Testul fosfatazei - S. aureus este fosfataz +, restul speciilor sunt fosfataze -. Caractere de patogenitate: Investigate prin teste in vitro i in vivo. Teste de patogenitate in vitro Testul coagulazei - este cel mai important test de diagnostic de laborator care precizeaz patogenitatea. Stafilococul patogen este coagulazo pozitiv. - testul coagulazei n tub - evideniaz coagulaza liber; - testul coagulazei pe lam - evideniaz coagulaza legat. Testul fibrinolizinei - evideniaz degradarea fibrinei de pe medii care conin aceast substan; Testul dezoxiribonucleazei - evideniaz endonucleazele S. aureus termorezistente); Enterotoxina - evideniabil prin reacia de dubl precipitare n gel. Teste de patogenitate in vivo Exotoxina exfoliativ - produce exfolierea cutanat a oriceilor nounscui. Activitatea dermonecrotic - inocularea unui filtrat de cultur de stafilococ patogen la un iepure i provoac acestuia o escar uscat (detaabil) dup 24 de ore. Enterotoxinele - termostabile (rezist la fierbere); evideniabile prin testul Dolmann (inocularea intraperitoneal a filtratului de cultur unor pisoi tineri le provoac acestora vrsturi n jet i sialoree). Recapitulnd, o tulpin de stafilococ patogen prezint urmtoarele proprieti: hemoliza, pigmentarea, coagulaza +, fermentarea manitolului +, prezena endonucleazelor termorezistente, activitatea dermonecrotic ( activitate toxigen: enterotoxin, exotoxin exfoliativ, toxina sindromului de oc toxic etc.). Antibiograma Este obligatorie; rezistena la chimioterapice a stafilococilor este n cretere, n special prin producia de lactamaze (codificate plasmidic). Se semnaleaz tot mai frecvent rezistena la Meticilin, Oxacilin, Cloxacilin (n special la tulpinile de stafilococ patogen izolate din mediul spitalicesc). Lizotipia Se realizeaz tipizarea tulpinilor, cu ajutorul bacteriofagilor specifici, grupai n 4 categorii fagice: 104

Grupa I: 29, 52, 52A, 79, 80, 81; Grupa II: 3A, 3B, 3C, 55, 71; Grupa III: 6, 7, 42E, 47, 53, 54, 55, 77; Grupa IV: 42D. Infeciile stafilococice cu potenial epidemic sunt infeciile nozocomiale i toxiinfeciile alimentare. Utilizarea lizotipiei bacteriofagice permite stabilirea sursei infeciei.

Profilaxia
n infeciile stafilococice recidivante, rezultate bune se obin cu terapia cu anatoxin, combinat cu autovaccin, preparat din tulpina bacterian proprie bolnavului. Explicaia const n mbuntirea, stimularea mecanismelor imunitii mediate celular. De asemenea, se respect normele de igien personale i n mediul spitalicesc.

105

CAPITOLUL 8 GENUL STREPTOCOCCUS

Caractere generale
Genul aparine familiei Streptococaceae; sunt coci gram pozitivi aezai n lanuri, catalazo-negativi. Sunt germeni ubiquitari, frecvent ntlnii n microbiocenoze: tegumente, mucoase, cavitate bucal, intestin.

Reprezentani
Sunt comensali, condiionat patogeni sau patogeni. Urmtoarele specii au mare importan n patologia uman: Streptococcus pyogenes (grup A); Streptococcus agalactiae (grup B); Streptococcus pneumoniae; Streptococii viridans (Str. mutans, Str. mitis, Str. sanguis etc.); Streptococi grup D (enterococi: Str. faecalis, Str. faecium etc.); Peptostreptococcus.

Clasificare
Dup tipul hemolizei; Dup tipul antigenic; Dup habitat; Dup proprieti metabolice: Dup tipul hemolizei: - - incomplet, cu nuan verzuie - ex.: Str. pneumoniae, Str. viridans, unii enterococi; - - complet, clar, transparent - ex.: Str. hemolitic uman grup A, B, C, G; - ' - liz incomplet lng colonie, urmat de hemoliz clar ex.: anumite specii ale grupurilor antigenice B, D; - - fr hemoliz pe geloz snge - ex.: specii din grupurile antigenice streptococice D, F, H.

Dup grupul antigenic: Clasificare iniiat de ctre Rebecca Lancefield, pe baza carbohidratului C al peretelui celular; clasificarea nu se aplic Str. viridans i Str. pneumoniae. Grupurile antigenice streptococice sunt notate de la A la U i se pot identifica prin teste speciale. 106

Streptococii din grupul antigenic A au cea mai mare importan n patologia uman, de aceea un criteriu de clasificare l constituie ncadrarea n acest grup (grup antigenic A sau Streptococ non-grup A). Apartenena la grupul A se identific prin testul la bacitracin. Principalele antigene streptococice somatice sunt: Antigene capsulare (acid hialuronic); Pilii (80 de tipuri antigenice de protein M; acid lipoteihoic); Peretele celular (carbohidratul C, peptidoglicanul, proteine T, R); Membrana citoplasmatic (antigene comune cu membrana bazal glomerular i cu fibra muscular cardiac). Dup habitat: streptococi piogeni, viridans (cavitatea bucal), lactici, enterococi (tub digestiv) etc. Dup anumite proprieti metabolice: Cocii sunt catalazo-negativi. Majoritatea speciilor genului sunt aerobe - facultativ anaerobe dar exist i specii microaerofile (Str. pneumoniae) sau strict anaerobe (gen Peptostreptococcus). Grup A, streptococi hemolitici (Streptococcus pyogenes)

Antigene somatice
Carbohidratul C al peretelui celular (clasificare de grup); Proteinele T, R ale peretelui celular; Proteinele M piliare (determin aproximativ 80 de tipuri antigenice diferite de streptococi grup A); cu rol antifagocitar, realizeaz aderena bacterian pe suprafaa celulelor epiteliale.

Antigenele solubile (toxine i enzime, ca factori de patogenitate)

Toxina eritrogen (toxina pirogen streptococic): - este sintetizat prin fenomenul de conversie lizogen; - determin exantemul i enantemul caracteristic n scarlatin; efect pirogen; - produs i de streptococii din grupele antigenice A, C, G; - 3 tipuri antigenice diferite de eritrotoxine. Streptolizina O: - protein O2 labil, responsabil de hemoliza a grupurilor antigenice A, C, G; - inhibat de steroli. Streptolizina S: 107

- protein Oxigen stabil, hemolitic; - este inactivat prin fosfolipide; - sintetizat i de ctre alte grupuri antigenice de streptococi. Streptokinaza: - protein produs de ctre streptococii grupei A,C; - activeaz sistemul fibrinolitic; - utilizat n tratamentul trombilor intravasculari. Factori de difuziune a infeciei: - hialuronidaze - lizeaz acidul hialuronic; - dezoxiribonucleaze - distrug ADN; - ribonucleaze - lizeaz ARN; - proteinaze diverse, cu aciune cardiotoxic, hepatotoxic, nefrotoxic. Marea varietate a factorilor de patogenitate cauzeaz polimorfismul manifestrilor clinice.

Boli streptococice - Streptococcus pyogenes

Faringite, tonsilite - mai frecvente la copii cu vrste cuprinse ntre 5 i 15 ani (zona temperat); Pneumonii; Piodermite - mai frecvente la copii cu vrste ntre 2 i 5 ani (n anotimpul cald); Scarlatina - boal generalizat, produs printr-un streptococ lizogenizat, productor de toxin eritrogen (grup A, dar i C, G); Celulite, limfangite; Erizipel; Flegmoane - posttraumatic sau postintervenie chirurgical; Meningite, abcese cerebrale, abcese n alte organe; Endometrite.

Boli poststreptococice - Streptococcus pyogenes (complicaii

imunopatolo-gice nesupurative, care apar la 2 - 6 sptmni dup o infecie cu Streptococ gr. A) Reumatismul articular acut, miocardita reumatismal, coreea minor; Glomerulonefrita difuz acut; Artrite migratorii; Eritemul nodos.

108

Streptococii de grup A prezint antigene comune cu membranele sinoviale, sarcolema cardiac i esutul conjunctiv. Anticorpii antistreptococici (antistreptolizin O, antistreptokinaz, etc), se fixeaz pe antigenele proprii i determin un rspuns autoimun, dup activarea sistemului complement. Glomerulonefrita se datoreaz depunerii complexelor antigen anticorp n exces n capilarele glomerulare, cu producerea de leziuni prin activarea complementului. Tipurile streptococice nefritogene sunt notate: 4, 12, 49, 55, 57, n timp ce tipurile streptococice reumatogene sunt mai numeroase. Titruri ASLO mari denot hipersensibilizarea.

Diagnostic de laborator Streptococcus pyogenes

Recoltarea prelevatelor biologice n funcie de localizarea infeciei ex.: n faringit - se recolteaz exudat faringian, secreii purulente din plgi, etc. Diagnostic microscopic direct, proprieti morfotinctoriale Coci gram pozitivi aezai n lanuri. Izolare pe medii, proprieti de cultur Pe medii lichide - se dezvolt granular la baza eprubetei; Pe medii solide - pe geloz snge - coloniile sunt S, netede, punctiforme, nconjurate de hemoliz. Proprieti biochimice catalaza negativ; oxidaza negativ. Proprieti antigenice ncadrarea n grupul antigenic A se realizeaz prin: - testul la bacitracin (uzual); - reacia de coaglutinare cu o tulpin de Stafilococ cu protein A; - imunofluorescen; - reacii de aglutinare cu trusa Streptex. serotiparea M, T, SOF prin reacii de precipitare, dup ncadrarea n grupul A. Diagnostic indirect serologic

109

Reacia ASLO evideniaz titrul anticorpilor antistreptolizin O din serul de bolnav. Un titru mai mare dect 250 uniti ASLO denot infecie streptococic sau o complicaie imunologic. Reacia ASLO stabilete diagnosticul, prognosticul i eficiena tratamentului. Scderea titrului ASLO este urmat de vindecare. Reacia ASLO nu poate diagnostica infeciile de tip piodermit.

110

Testul streptozyme - are valori crescute n infecii faringiene i piodermite. Testul anti DN- aze B - are acuratee crescut n diagnosticarea infeciilor. Determinarea titrului anticorpilor antihialuronidaz, antistreptokinaz. Diagnostic indirect biologic Prin teste cutanate (reacia Dick i reacia Schultz-Carlton) se investigheaz capacitatea anticorpilor specifici de a neutraliza efectul toxinei eritrogene. Reacia Dick pozitiv denot susceptibilitatea subiectului la infecia scarlatinoas, pus n eviden prin lipsa anticorpilor specifici protectori. Reacia Schultz-Carlton pozitiv confirm infecia scarlatinoas. (Serul de convalescent de scarlatin, inoculat unui pacient cu eritem cu diagnostic neprecizat, va face s dispar doar eritemul scarlatinos). Antibiograma Streptococii de grup A sunt sensibili la lactamine i de aceea nu necesit efectuarea antibiogramei, care este ns obligatorie pentru streptococii non grup A.

Streptococi hemolitici, grup B (Streptococcus agalactiae)

Habitat Streptococii grupului B se izoleaz frecvent din nazofaringele persoanelor sntoase. La 30% din populaia general streptococul B se ntlnete uzual n flora gastrointestinal. Aproximativ 20% dintre gravide sunt purttoare vaginale de streptococ de grup B, ceea ce explic intervenia bacteriei n patologia materno-infantil.
pneumonia i meningita neo-natal; La femei, streptococul de grup B produce endometrita i mastita postpartum, precum i infecii urogenitale; suprainfecia plgilor chirurgicale se poate complica cu fasceit necrozant i septicemii;

Infeciile tipice

Diagnosticul de laborator (particulariti)

Hemoliz pe medii cu snge; ncadrarea n grup prin: - testul CAMP; - hidroliza hipuratului de sodiu. 111

Antibiograma este obligatorie.

Streptococi de grup D
Pot fi , sau hemolitici (hemoliza este frecvent). Streptococcus faecalis, faecium, durans (enterococi): - aparin microbiocenozei intestinale i sunt germeni condiionat patogeni; - produc infecii urinare recidivante, infecii intraabdominale, genitale, septicemii, endocardit bacterian. Enterococii se dezvolt pe medii cu bil - esculin cu 6,5 g % NaCl, la temperaturi cuprinse ntre 10 - 45C. Non-enterococii (gr. D) nu se dezvolt pe medii cu adaus de 6,5 g % NaCl i prezint hemoliz sau .

Streptococii de grup C, G
Includ specii variate: - Streptococcus equisimilis; - Streptococcus zooepidemicus; - Streptococcus dysgalactiae. Produc streptolizin O i eritrotoxin; Se ntlnesc frecvent n flora nazofaringian a unor subieci aparent sntoi.

Streptococi hemolitici Grupul Viridans

Cele mai comune specii, care aparin florei buco-faringiene normale, sunt: Streptococcus mutans; Streptococcus sanguis; Streptococcus mitis; Streptococcus salivarius.

Infeciile produse:
caria dentar (Streptococcus mutans produce dextran insolubil din fructoz i glucoz; astfel formeaz placa dentar); endocarditele bacteriene subacute: tulpinile de Str. viridans, ajunse n circulaie dup intervenii stomatologice, se pot fixa pe valve cardiace cu leziuni. 112

Nu conin carbohidratul C - nu pot fi inclui n clasificarea Lancefield. Diagnosticul diferenial se face cu ali streptococi hemolitici, cu Str. pneumoniae. Str. viridans sunt rezisteni la optochin i nu sunt lizai pe medii cu bil.

Streptococcus Pneumoniae Infecii produse

pneumonia franc lobar; meningita bacterian a adultului, cu o rat de mortalitate de cca. 40%; este cea mai frecvent cauz de otit medie a copilului, cu complicaii: surditate; sinuzite, ostomastoidite; septicemii, endocardite.

Patogenez
Pneumococii intr n compoziia microbiocenozei nazofaringiene i constituie rezervorul infeciilor pneumococice, care apar preferenial la subieci cu status imunitar alterat. Virulena pneumococului este dat de un polizaharid capsular, care caracterizeaz 82 de tipuri antigenice diferite; are rol cert antifagocitar. Polizaharidul capsular solubilizat neutralizeaz anticorpii circulani (fenomen de paralizie imunologic); neuraminidaza pneumococic confer neurotoxicitatea meningitelor pneumococice; pneumolizina este toxina cu activitate hemolitic in vivo (experimente pe animale).

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice n funcie de localizarea infeciei. Diagnostic microscopic Coci gram pozitivi lanceolai, nconjurai de o capsul comun, aezai in diplo. Izolarea pe medii; proprieti de cultur, studiate n vederea identificrii

113

Pe geloz snge ciocolatie se dezvolt sub forma unor colonii S mucoide, nconjurate de o zon de hemoliz. Necesit incubare n atmosfer de dioxid de carbon (10%); Sensibil la Optochin; Lizat pe medii cu bil (fenomen de biloliz Neufeld pozitiv). Proprieti biochimice Fermenteaz inulina, lactoza, sucroza, trehaloza; Catalaz negativ; Microaerofil. Proprieti antigenice 82 tipuri antigenice funcie de un polizaharid capsular, identificabil prin reacia de umflare a capsulei Neufeld (reacie antigen anticorp); primele 8 tipuri antigenice produc marea majoritate a infeciilor umane cu aceast etiologie. Proprieti de patogenitate oarecele inoculat cu o cultur de pneumococ virulent face o septicemie mortal; apoi se realizeaz o amprent de splin i se vizualizeaz cocii gram pozitivi n diplo, nconjurai de o capsul comun, vizibil ca un halou clar pe fondul roz al celulelor splenice. Antibiograma Este obligatorie.

Profilaxie
Vaccin polivalent (preparat din 23 de polizaharide capsulare purificate).

Coci gram pozitivi anaerobi

Reprezentani Peptococcus sp. - gram pozitivi la limit; Peptostreptococcus sp. - coci mari alungii; Sarcina ventriculis - (coci mari aezai cte opt, la vrfurile unui cub). Aparin microbiocenozei gastrointestinale, bucofaringiene, tractului urogenital i pielii.

Infecii produse
infecii cerebrale, hepatice, mamare; 114

empieme subdurale i extradurale; osteomielite, endometrite; meningite, septicemii. Infeciile apar mai ales dup manopere medico - chirurgicale la subieci imunodeprimai.

115

CAPITOLUL 9 GENUL NEISSERIA

Caractere generale
Genul Neisseria aparine familiei Neisseriaceae. Cuprinde coci gram negativi, dispui n diplo, catalazo-pozitivi, oxidazo-pozitivi.

Reprezentani, infecii produse:

Patogeni: Neisseria meningitidis: - meningita cerebrospinal epidemic; - meningococemia fulminant (Sindromul Friedriechsen); - rinofaringite, artrite. Neisseria gonorheae: - gonoreea; - boli inflamatorii pelviene; - oftalmia gonococic a noului nscut; - artrite, meningite, septicemie. Nepatogeni (comensali ai florei bucofaringiene): Neisseria sicca, Neisseria flavescens; Neisseria perflava, Neisseria mucosa; Neisseria lactamica.

Waterhouse-

Neisseria mengitidis
Epidemiologie Rezervorul natural bacterian este reprezentat de ctre nazofaringe, portajul fiind de 3% - 30%; n timpul epidemiilor, portajul nazofaringian poate atinge 95%, dar mai puin de 1% dintre purttori fac boala sistemic. Grupul A al N. mengitidis este mai frecvent implicat n etiologia bolii copilului sub 5 ani, grupul antigenic B afectnd copiii peste 5 ani. Sezonul rece este factor favorizant. Formele epidemice sunt provocate de ctre tipul antigenic A, n timp ce tipurile B i C produc forme de boal sporadice. Aspecte clinico-patogenetice Efectele toxice meningococice sunt atribuite lipopolizaharidului bacterian, care produce i peteiile hemoragice n fazele bacteriemice ale bolii. Substana induce formare de anticorpi.

116

In vivo, celulele bacteriene sunt protejate de o microcapsul polizaharidic, ce imprim variantele antigenice (serogrupurile A, B, C, X, Y, Z, 29 E, W 135). Polizaharidele capsulare sunt puternic imunogene, cu excepia grupului B, care nu induce anticorpi suficient protectori. Variaia antigenic piliar i secreia proteazelor IgA sunt factori suplimentari de patogenitate. Diagnostic de laborator Este o urgen medical. Se recolteaz: - lichid cefalorahidian n meningit; - snge n meningococemie; - secreie rinofaringian - pentru depistarea purttorilor. Diagnostic microscopic, proprieti morfotinctoriale Frotiu Gram - coci gram negativi reniformi, aezai n diplo intra i extra PMN. Frotiu Giemsa - pentru examenul citologic. Frotiu Ziehl - Nielsen - pentru excluderea meningitei TBC. Izolare pe medii, proprieti de cultur Medii lichide: - tulburate foarte slab; Medii solide: - mediul Mueller Hinton mbogit, mediul Tayer Martin modificat; - colonii S transparente, n pictur de rou. Coloniile se autolizeaz (conin fermeni autocatalitici). Neisseriile sunt germeni stenotermi (nu rezist la variaii mari de temperatur; mediile se prenclzesc la termostat i se incubeaz n atmosfer microaerofil). Proprieti biochimice oxidaza + (test aplicat coloniilor suspecte); fermenteaz glucoza i maltoza, nu ns lactoza i fructoza. Caractere antigenice Lipopolizaharidul microcapsular mparte meningococii n serogrupuri notate: A, B, C, X, Y, Z, 29 E, W 135 (identificate prin reacii AG-AC, ex: reacia de precipitare Vincent Bellot). Structura antigenic imprim virulena. 117

Antibiograma Este necesar. Profilaxie Vaccinurile sunt preparate din polizaharidele capsulare ale grupurilor antigenice A i C; grupul B este slab imunogen.

Neisseria gonorheae
Epidemiologie Reprezint agentul etiologic al gonoreei, cea mai rspndit boal veneric. Habitat - exclusiv omul, mucoasa vaginal i uretral, rect. Calea de transmitere este sexual, cu excepia oftalmiei gonococice a noului nscut. Este o important cauz de sterilitate secundar. Cronicizarea bolii este foarte frecvent, aspect explicat prin: imunitatea strict localizat (PMN), variaia antigenelor piliare i rezistena n continu cretere a tulpinilor de gonococ la diferite chimioterapice (rezistena la lactamine apare la 90% dintre tulpini, prin lactamaze). Rezultate bune se observ la Spectinomycin i Ceftriaxone. Patogenez Bacteria elaboreaz o IgA proteaz, care cliveaz IgA secretoare de la nivelul mucoaselor. Exist 4 tipuri de colonii corespunztoare celor 4 tipuri antigenice, notate T1 - T4, funcie de proteinele piliare. Variantele T1 i T2 sunt cele mai virulente. Proteinele membranei externe sunt adezine. n anumite condiii ambientale, gonococii posed o microcapsul, cu rol antifagocitar. Uneori este posibil multiplicarea bacterian intra PMN. Multiplicarea la poarta de intrare este masiv, dar invazivitatea bacterian este redus (rspunsul imun generalizat este aproape absent; boala nu d imunitate decelabil). Proteinele membranei externe definesc 16 serotipuri gonococice, care nu se identific n mod uzual. Diagnostic de laborator Recoltarea prelevatelor biologice Secreie uretral - de la brbat; Secreie de la nivelul colului vaginal i de la nivelul orificiului uretral; 118

Secreie ocular (de la nou nscut cu oftalmie gonococic). Diagnostic microscopic direct; proprieti morfotinctoriale Se ntind frotiuri din secreiile respective i se coloreaz Gram: Se observ coci reniformi gram negativi, aezai n diplo, n preajma PMN sau intra PMN; - Se evideniaz i celule epiteliale i germeni din flora bucal. IF direct din produsul patologic. Izolarea pe medii, proprieti de cultur: - izolare imediat dup recoltare, pe medii prenclzite; - geloza snge ciocolatie sau mediul Mueller Hinton mbogit cu proteine native i antibiotice (Vancomicin, Colistin, Nistatin, Trimetoprim etc.); - se incubeaz 48 ore la 37C n atmosfer microaerofil (10%-20% CO2); - coloniile sunt S, bombate, uor cenuii i transparente; exist 4 tipuri de colonii, notate T1-T4. Tipurile T1, T2 sunt cele mai patogene. Identificarea se realizeaz pe baza aspectelor microscopice, a proprietilor de cultur, biochimice i antigenice. Caractere biochimice: oxidaza +; fermenteaz glucoza; nu fermenteaz maltoza. Proprieti antigenice Se manifest fenomenul de variaie antigenic a tulpinilor piliate. Tipurile antigenice T1, T2 sunt foarte virulente. Proprieti de patogenitate Singura gazd este omul; gonococul nu este patogen pentru animale. Antibiograma Este necesar pentru a realiza tratamentul corect (tratamentul cuplului). Peste 90% dintre tulpinile de gonococ produc lactamaze.

119

CAPITOLUL 10 GENUL HAEMOPHYLUS

Caractere generale
Bacterii ce se dezvolt numai pe medii cu snge (sunt necesari factorii de cretere X i V, identici cu hemina i NAD, NADP). Cocobacili gram negativi aerobi - anaerobi facultativi, imobili. Formele virulente sunt capsulate (ex.: H. influenzae tip antigenic b). Speciile genului sunt prezente n rinofaringe, mucoasa conjunctival (H. aegiptius) sau genital (H. ducrey).

Reprezentani, infecii produse

Haemophylus influenzae: - pneumonii i bronhopneumonii postgripale, infecii cronice ale tractului respirator inferior, bacteriemii. - (tipul b - meningite, otite, laringo-traheite la copii; - endocardita, artrite supurative, osteomielite). Haemophylus parainfluenzae: - comensal, produce rar endocardite. Haemophylus aprophilus: - endocardite, pneumonii, caria dentar. Haemophylus haemolyticus: - rinofaringite. Haemophylus aegiptyus: - conjunctivita. Haemophylus ducrey: - ancrul moale (cu transmitere sexual).

Haemophylus influenzae Aspecte clinice i patogenetice

A fost considerat ca agent etiologic al gripei pn n anul 1890. Produce afeciuni postgripale. Patogenitatea se explic prin multiplicare excesiv i invazie. Adezinele de suprafa favorizeaz ataarea bacteriei pe suprafaa celulelor. Conine endotoxina. Rolul esenial n patogenitate l deine capsula, tipul antigenic cu virulena maxim fiind tipul b.

120

Incidena meningitelor produse de H. influenzae tip b este maxim la copiii cu vrste cuprinse ntre 3 luni i 6 ani. Portajul tulpinilor necapsulate nevirulente atinge aprox. 30% pn la 50% din populaia infantil. H. influenzae reprezint un important agent etiologic al infeciilor respiratorii i meningeale la copil. Epiglotita acut edematoas produce insuficiena respiratorie. Sechelele meningitelor sunt foarte grave: retardare mintal, hidrocefalie sau chiar orbire.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice Funcie de patogenia infeciei: l.c.r.; snge pentru hemocultur; sput; secreie otic, etc. Examenul direct din lichidele biologice, caractere morfotinctoriale Frotiu Gram: cocobacili gram negativi imobili, capsulai, nesporulai cu tendin la polimorfism i colorabilitate bipolar. Reacia de umflare a capsulei - utilizm ser antiHaemophylus influenzae capsulat. Imunofluorescena - din produsul patologic, cu ser anti Haemophylus influenzae tip antigenic b. Latex-aglutinarea - evideniaz agentul etiologic n l.c.r. (Pastorex, Wellcome). Metoda EIA - pentru detectarea Haemophylus influenzae tip b. Izolarea pe medii, proprieti de cultur Bacteriile se dezvolt pe medii cu snge i factori de cretere. Clasificarea speciilor genului se realizeaz funcie de necesitile n factorii de cretere X (hemina) i V (identic cu NAD i NADP). Necesit incubare n atmosfer umed i 5-10% CO2.
Tabel nr. 9 - Clasificarea speciilor genului Reprezentani Necesiti n factori X V H. influenzae + + H. parainfluenzae + H. aprophylus + H. aegiptyus + + H. ducreyi + Hemoliza +

121

Geloza snge ciocolatie: colonii S transparente, minuscule. Geloza Levinthal: colonii S transparente. Fenomenul de satelitism al coloniilor de Haemophylus n jurul coloniilor de Stafilococ nsmnat simultan (Stafilococul elaboreaz factorul V). Caractere biochimice Sunt germeni aerobi facultativi anaerobi. Testul catalazei +. Testul indol (+ n 70% dintre cazuri), ornitindecarboxilaza etc. S-au stabilit ase biotipuri ale speciei H. influenzae. Proprieti antigenice Principalele antigene sunt reprezentate de: Polizaharidul capsular al Haemophylus influenzae tip b (fosforibozilribitolfosfat-PRP) cu efect antifagocitar; Lipopolizaharidul - lipidul A cu rol toxic; Proteaza Ig A - scindeaz Ig A secretoare; Antigenele bacteriene se pot pune n eviden prin IF, EIA, CIEF, latex aglutinare. Caractere de patogenitate Inocularea bacteriei intraperitoneal la oarece, cobai sau iepure determin moartea animalului prin toxemie acut.

Tratament
Ampicilina n asociere cu Cloramfenicolul sau Cefalosporine de generaia a treia pot fi utilizate ca terapie iniial la pacienii cu afeciuni cauzate de Haemophylus influenzae sau ca terapie alternativ n cazul instalarii rezistenei bacteriene la Amoxicilin.

Profilaxia
Vaccinarea anti Haemophylus influenzae la copii mai mari de 18 luni, cu vaccinuri preparate din PRP+/- peptide imunogene ale toxoidului difteric. Vaccinul nu afecteaz portajul. Chimioprofilaxia cu Rifampicina se recomand pentru neutralizarea strii de purttor sau la contacii unui copil bolnav de meningit bacterian cu aceast etiologie.

Haemophylus parainfluenzae
122

Cu virulen considerabil diminuat comparativ cu H.influenzae, produce pneumonii sau rare endocardite. Nu necesit factorul X ca factor de cretere.

Haemophylus aegyptius
Agent etiologic cert patogen al conjunctivitei purulente acute sau subacute din zonele subtropicale. Proprietile microscopice sau de cultur sunt asemntoare Haemophylus influenzae. Diagnosticul diferenial se realizeaz prin proprietile biochimice: lipsa fermentrii xilozei, testul indol, proprieti hemaglutinante.

Haemophylus ducreyi
Reprezint agentul etiologic al ancrului moale, boal dermatovenerian caracterizat prin ulceraii la nivelul organelor genitale, nsoite de limfadenopatii supurate. Recoltarea prelevatelor biologice Secreia din zona central a ancrului. Secreie purulent ganglionar. Diagnostic microscopic Cocobacili gram negativi, dispui n perechi sau n lanuri. Proprieti biochimice Fermenteaz glucoza, maltoza sau zaharoza. Proprieti de patogenitate Este un germen cu patogenitate cert. Tulpinile prezint endotoxina. Inocularea culturii prin scarificarea pleoapei de maimu determin apariia unui ancru tipic. Diagnostic indirect biologic Intradermoreacia Ito-Reensterna. Se inoculeaz intradermic 0,1ml de cultur omort prin cldur. Reacia este pozitiv prin apariia unei papule i a unui eritem; reacia are valoare retrospectiv.

Tratament, msuri profilactice

Germenul prezint sensibilitate la macrolide sau sulfamide. Nu exist imunitate fa de reinfecie. Profilaxia bolii se suprapune cu msurile generale ale unei boli venerice. 123

CAPITOLUL 11 GENUL BORDETELLA

Caractere generale
Bordetella pertussis a fost izolat pentru prima oar n 1906, de ctre Bordet i Gengou. Genul cuprinde cocobacili gram negativi, strict aerobi, speciile virulente fiind capsulate n cultura tnr.

Reprezentani, infecii produse

Bordetella pertussis: - tuse convulsiv, bronite, pneumonii, sechele pulmonare sau neurologice (encefalopatii). Bordetella parapertussis: - tuse convulsiv. Bordetella bronchiseptica: - infecii respiratorii la animale i la om. Bordetella avium, Bordetella hinzii: - infecii respiratorii la psri.

Bordetella pertussis Aspecte clinice i patogenetice

Factorii de patogenitate variai contureaz manifestrile clinice: Toxina pertusis (TP) este o exotoxin cu structur bimodal; fragmentul A-ADP ribozileaz proteina G1, care n mod normal inhib adenilat-ciclaza. n urma ribozilrii, crete nivelul acestei enzime cu urmtoarele efecte: - hipersensibilitate la histamin i serotonin; - limfocitoz; - alterarea membranei celulelor T; - blocarea fenomenelor exploziei respiratorii intrafagocitare. Toxina adenilat ciclaz-like determin creterea cAMP intracelular, efect antifagocitar. Citotoxina traheal dermonecrotic - provoac tusea spastic drept rspuns la efectul citocid. Hemaglutinina proteic cu structura filamentoas (FHA), (localizat la nivelul fimbriilor) reprezint cea mai important adezin bacterian. Adezine de suprafa capsulare - 14 antigene K, notate: AGG1 AGG14. 124

Alte adezine membranare, care pot fi i antigene protectoare: proteinele OMP15, OMP18, OMP69, 91 etc. Endotoxina - lipopolizaharidul bacterian (microorganism gram negativ). Hemolizine. Boala debuteaz printr-o etap cataral (7-14 zile), urmat de perioada de stare - tusea paroxistic (convulsiv) i reacie limfocitar, care pot dura 3-6 sptmni. Convalescena este nsoit de o perioad de anergie. Mortalitatea bolii este crescut la copilul sub un an, fapt care impune vaccinarea.

Diagnostic de laborator direct

Recoltarea prelevatelor biologice Metoda plcii tuite- nsmnare direct n timpul accesului de tuse. Recoltarea aspiratului traheo-bronic sau a lichidului de spltur nazofaringian n perioada de acalmie; snge pentru serodiagnostic, din sptmna 2-3. Examenul microscopic direct, proprieti morfotinctoriale Coloraia Gram - cocobacili gram negativi, dispui puin caracteristic. Imunofluorescena direct - d rezultate mai bune, prin examinarea exudatului nazofaringian n imunofluorescen. Izolarea pe medii, proprieti de cultur Mediul Bordet Gengou (cu factori de cretere i snge): colonii S translucide, cu irizaii argintii n lumin oblic, cu o discret zon de hemoliz n jur (aspect de perl tiat). Prin pasaje repetate pe medii cu snge, culturile sufer mutaii i apar colonii R, avirulente (colonii S - faza I, fazele II i III sunt intermediare, coloniile R - faza IV). Incubarea se realizeaz 3-5 zile n atmosfer umed. Alte medii de cultur: Regan-Lowe, Stainer-Scholte (mbogite). Proprieti biochimice Strict aerobi. Degradeaz unii aminoacizi. 125

Proprieti de patogenitate Inocularea intranazal la oarece produce bronhopneumonie cu exudate masive. Inocularea intradermic la iepure produce dermonecroze. Inocularea bacteriei la maimu i provoac tusea spastic. Diagnostic de laborator indirect Reacia de aglutinare n tuburi- anticorpii apar tardiv, n sptmna 3-8 a bolii; reacie folosit pentru controlul eficienei vaccinrii. Reacia EIA - utilizeaz anticorpi IgA antiBordetella care cresc dup infecia pe cale natural, nu dup vaccinare pe cale parenteral. Sensibilitatea reaciei este de 90%, spre deosebire de reacia de aglutinare sau RFC, cu o sensibilitate de 30-50%. Hemoleucograma: leucocitoz cu limfocitoz absolut. Indicele opsono-citofagic - crete n primele zile de boal (diagnostic precoce).

Tratamentul
Eritromicina, Rifampicina sau Tetracicline. Eritromicina este considerat antibioticul de elecie pentru c mpiedic multiplicarea bacterian i produce eliminarea B. pertussis din orofaringe. Administrarea preparatului are eficien n faza cataral, atenund contagiozitatea.

Profilaxia
Depistarea adulilor cu boal atipic. Izolarea bolnavilor n faza cataral (Bordetella se elimin prin picturile de saliv expulzate n timpul tusei) i chimioprofilaxia cu Eritromicin. Vaccinarea DTP (realizat la scar naional) reprezint cel mai important mijloc de prevenie. Vaccinul pertussis celular conine germeni n faza I, omori cu formol sau prin cldur. Se administreaz ca trivaccin DTP, astfel: la 2 luni, la 4 luni, la 6 luni, la 1 an i n anul 3 de via. Vaccinul clasic induce reacii adverse neurologice. Vaccinul acelular - vaccin introdus recent n Japonia (1981) conine toxina pertusiss inactivat i hemaglutinina filamentoas i are avantajul de a induce i imunitate celular (DTP induce doar imunitate umoral). Un alt avantaj al acestui ultim vaccin const n raritatea reaciilor adverse.

126

CAPITOLUL 12 GENUL BRUCELLA

Caractere generale
Genul cuprinde cocobacili gram negativi, imobili, nesporulai, cu activitate metabolic redus; speciile genului infecteaz animalele, boala survenind n mod accidental la om (antropozoonoz). Boala a fost denumit febra ondulant.

Reprezentani:
Brucella melitensis; Brucella suis; Brucella abortus bovis; Brucella canis.

Patogenez, aspecte clinice

Poarta de intrare pentru bacterii este reprezentat prin tractul gastrointestinal (consumul alimentelor provenite de la animalele infectate) sau prin leziunile cutanate (risc la zootehniti). Bacteria prezint parazitism celular, localizndu-se preferenial n sistemul reticuloendotelial. Poate produce microabcese cu zone de necroz. Cronicizarea bolii depinde de capacitatea de multiplicare bacterian la nivelul celulelor imunologice (blocarea mecanismelor exploziei respiratorii n cadrul fagocitozei). Nu s-au detectat exotoxine specifice. Endotoxina reprezint un important factor de patogenitate. Tulpinile capsulate prezint antigene K. Antigenele de suprafa: A, M, sau L (similar antigenului de virulen Vi). Proporia antigenelor A\M caracterizeaz speciile studiate. Boala debuteaz dup o perioad de incubaie de 1-2 sptmni. Simptomatologia polimorf (febr, transpiraii, dureri musculare) persist cteva sptmni. Sindromul febril ondulant dureaz cteva luni. Sechelele bolii sunt variate: artrita, meningita, uveita i orhita. Rata de mortalitate este de 5-10%.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice Snge pentru hemocultur. Lichid cefalo-rahidian. 127

Urin. Aspirat de mduv osoas sau puncie hepatic. Puncie ganglionar etc. Diagnostic microscopic din produsul patologic Cocobacili gram negativi imobili, capsulai, n cultur tnr, aezai preponderent intracelular. Izolarea pe medii de cultur Brucella-Bouillon; Brucella-Agar; Castaneda. Identificare Proprieti morfotinctoriale: Cocobacili gram negativi, aspect neconcludent la examenul microscopic. Proprieti de cultur Bacteriile prezint necesiti nutritive complexe (bulion F, geloza cu extract de ficat de viel). Specia Brucella abortus bovis necesit incubare n atmosfer cu 510% CO2. Pe medii lichide tulbur uniform mediul. Pe medii solide formeaz colonii mici, transparente, S, cu cretere lent - (3-4 sptmni). Pentru hemoculturi se utilizeaz procedeul Castaneda (mediu difazic). Se pot cultiva i pe medii celulare (ovocultura). Proprieti biochimice Cultivarea n atmosfer de CO2 - pozitiv la Brucella abortus bovis. Producerea de hidrogen sulfurat - pozitiv la Brucella suis i Brucella abortus. Testul ureazei - rapid la Brucella suis. Testul catalazei - pozitiv. Identificarea speciilor pe baza comportamentului diferit n testele bacteriostatice cu colorani (fuxina, tionina, verde malachit). Proprieti antigenice

128

Identificarea speciilor cu seruri monospecifice A, M, prin reacii de aglutinare pe lam i n tuburi. Proprieti de patogenitate Inocularea unui filtrat de cultur intraperitoneal la cobai conduce la septicemie, cu microabcese n organele parenchimatoase. Diagnostic indirect serologic Reacia Huddleson Reprezint o aglutinare pe lam, care pune un diagnostic rapid de boal. Diagnosticul se continu cu reacia de aglutinare n tuburi (Wright). Reacia Wright Pozitiv la un titru > de 1/100. Dac reacia este negativ, dei semnele clinice de boal sunt evidente, se pune problema existenei n serul de cercetat a anticorpilor blocani. Detectarea acestora se realizeaz prin testul Coombs i Blocking. Detecteaz rapid i sensibil Ig M antiBrucella. RFC cu antigen Wright. Determinarea indicelui opsono-citofagic (IOC crete n cursul infeciei). Diagnosticul indirect biologic Se efectueaz intradermoreacia la brucelin, care atest starea de hipersensibilitate de tip tardiv instalat n urma bolii.

Tratament
Tetraciclina reprezint antibioticul de elecie. Asocierea Tetraciclinei cu Streptomicina scade incidena sechelelor bolii. Tratamentul este puin eficient datorit localizrii intracelulare a bacteriei.

Profilaxia
Pasteurizarea laptelui. Eradicarea bolii la animale (utiliznd un vaccin specific). Msuri de protecie a personalului din sectorul zootehnic.

129

CAPITOLUL 13 GENUL RICKETTSIA

Caractere generale
Familia Rickettsiaceae cuprinde genurile Ricketsia, Coxiella i Ehrlichia. Bacteriile genului Rickettsia sunt cocobacili mici (0,3-0,5mm), cu peretele celular gram negativ-like. Conin n peretele celular peptidoglican i lipopolizaharid. Prezint parazitism celular obligatoriu, elemente precum NAD, ATP, acetyl-CoA fiind furnizate de ctre celula infectat (nu cresc pe medii sintetice). Rezervorul bacterian este animal, bolile fiind transmise la om prin insecte (artropode).

Reprezentani, infecii produse

Genul Rickettsia Grupul tifos Ricketsia prowazecki: - tifos exantematic (vector - pduchele); - tifos de recdere (boala Brill). Ricketsia moserii: - tifos endemic murin (vector - puricele). Grupul febrelor ptate Ricketsia ricketsii: - febr ptat a Munilor Stncoi (vector - cpua). Ricketsia conorii: - febr butonoas (vector - cpua). Ricketsia sibirica: - rickettsioza siberian (vector - cpua). Ricketsia australis: - rickettsioza australian (idem). Ricketsia tsutsugamushi : - febra oriental (larve de acarieni). Genul Coxiella Coxiella burnetti: - febra Q (vector - cpu sau transmis prin contact interuman). Genul Ehrlichia Erhlichia chaffensis: - ehrlichioz (cpua).

130

Patogenez, aspecte clinice

Rickettsiozele sunt zoonoze (rezervorul animal este reprezentat preponderent de roztoare, animale domestice). Tifosul exantematic are rezervor uman. Vectorii sunt diverse artropode (purece, cpu, acarieni, pduche). Rickettsiozele sunt febre exantematice, adic boli febrile nsoite de erupii cutanate i tulburri nervoase (somnolen, apatie, delir). Rickettsiile ptrund n organism prin artropodele vectoare i se multiplic n celulele endoteliale ale vaselor mici, cu diferite consecine nefavorabile: erupie, tromboze vasculare, necroze cutanate i la nivelul diverselor organe: cord, ficat, creier, rinichi. Moartea poate surveni prin CID sau insuficien cardiac. Parazitismul intracelular obligatoriu se explic prin permeabilitatea excesiv a membranei citoplasmatice, care nu poate reine unii metabolii eseniali (ATP, NAD, acetil-CoA). Prin sinteza unei fosfolipaze, bacteria distruge fagozomii i se multiplic abundent n citoplasma celulei gazd (apar incluzii); Rickettsiile inhib opsonizarea i procesul de activare al macrofagelor: adenopatia reflect de fapt ineficiena reaciei inflamatorii. Vasculita se caracterizeaz prin abundente infiltrate celulare cu mononucleare. ocul endotoxic poate s apar prin aciunea endotoxinei. Pentru zona noastr geografic prezint importan ricketsiozele din grupul tifos, febra butonoas i febra Q. Febra Q, produs de Coxiella burnetti se caracterizeaz prin febr i un sindrom pseudogripal. Cazurile grave prezint infiltrate bronhopneumonice. Complicaiile bolii sunt rare: hepatit, endocardit, meningoencefalit. Nu apar erupii cutanate n aceast boal. Erlichioza (E. chaffeensis) prezint un tropism special pentru monocite. Sindromul febril este nsoit de leucopenie, trombocitopenie, eventual hepatit. Erupia i vasculita sunt semne rare. Rezervorul bacterian l constituie cerbul, iar vectorul este cpua. Boala este rspndit n America de Nord, Japonia i Malaezia. Diagnosticul de laborator se realizeaz prin reacia n lan a polimerazei.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice Snge n primele zile de boal; Dou probe de ser sunt recoltate la interval de 15 zile pentru diagnostic serologic dinamic; Triturat de coagul sanguin dup ziua a 7-a de boal, pentru a elimina aciunea anticorpilor; Probe bioptice din piele, pentru diagnosticul febrelor ptate. 131

Transportul sngelui i a probelor bioptice se realizeaz n stare congelat. Diagnosticul direct bacteriologic Examenul microscopic Nu d relaii foarte valoroase. Se realizeaz dup izolarea bacteriei pe sisteme celulare: Prin colorare Giemsa, Giemenez sau Machiavello (dup cultivare n ou embrionat). n coloraia gram se coloreaz dificil. Bacteriile au forme cocobacilare, cu aezare necaracteristic. Identificarea bacteriei direct n celula infectat, prin imunofluorescen. Izolarea Se realizeaz numai pe sisteme vii (celulare). Inocularea n ou embrionat de 5 - 7 zile, n sacul vitelin. Se obin culturi abundente. Se pot prepara antigene folosite pentru reacii serologice. Inocularea la cobai de sex masculin, intraperitoneal. Cobaiul face o reacie febril, care poate evolua spre vindecare sau spre moartea animalului. Tegumentul regiunii scrotale rmne nemodificat n cazul R. prowazecki, spre deosebire de reaciile eritematoase care apar n cazul febrelor ptate. Inocularea n culturi de esuturi Se utilizeaz pe linii celulare Verro sau pe culturi de limfocite. Unele rickettsii se multiplic n citoplasm, altele n nucleu i citoplasm. Evidenierea bacteriilor n celule infectate se realizeaz prin coloraia Giemsa sau prin imunofluorescen. Diagnosticul indirect serologic Reaciile serologice pot fii nespecifice i specifice. Reaciile nespecifice utilizeaz antigene nrudite, precum tulpina Proteus OX19 pentru Rickettsia prowazecki. Reacia Kudicke-Steuer este o reacie de aglutinare pe lam (nespecific), utilizat ca metod de triaj n focarele de tifos exantematic. Reacia Weil-Felix reprezint o reacie la aglutinare n tuburi, cantitativ. Pentru diagnostic titrul semnificativ va fi mai mare dect 1/200. Pentru diagnosticarea altor rickettsii, antigenele nespecifice sunt preparate din tulpini Proteus OX2 i OXk.

132

Reacii specifice - utilizeaz antigene specifice speciei de identificat. Se execut: RFC Ida Bengston pe probe perechi de seruri; Reacii de aglutinare pe lam sau n tuburi; Reacii de hemaglutinare pasiv; Imunofluorescena indirect - detecteaz anticorpi Ig M sau Ig G specifici speciei. Reprezint metoda diagnostic de referin; Imunofluorescena direct evideniaz R. rickettsii n biopsia din leziunile cuta-nate (febra ptat a Munilor Stncoi - America de Nord). Pentru diagnosticul febrelor ptate se utilizeaz i latex aglutinarea; Radioimunotestarea (RIA); Metoda imunoenzimatic (ELISA); PCR (reacia n lan a polimerazei ). Diagnosticul diferenial ntre tifosul exantematic clasic i cel de recdere n tifosul de primoinfecie, reacia Weil-Felix i RFC se pozitiveaz dup prima sptmn de boal, anticorpii specifici fiind preponderent Ig M. n tifosul de recdere (la fotii bolnavi), RFC este pozitiv (Ig G la titruri mari, fixe), n timp ce reacia Weil-Felix rmne negativ. Diagnosticul indirect biologic Intradermoreacia cu o suspensie inactivat de Ricketsia prowazecki pune n eviden starea de hipersensibilitate de tip tardiv (eritem, edem) care apare dup trecerea prin boal. Reacia poate pune i diagnosticul retrospectiv al mbolnvirii.

Tratamentul
Antibioticele de elecie sunt Tetraciclinele i Cloramfenicolul. Tratamentul trebuie administrat precoce, din cauza ratei de mortalitate de 3%-8%; boala este anergizant, riscul recderilor la supravieuitorii tratai incorect fiind cuantificat la 15% la circa 2-3 sptmni de la episodul iniial, din cauza persistenei bacteriei n macrofage. Pentru a diminua riscul recderilor, antibioticul se administreaz nc 4-6 zile de la dispariia sindromului febril.

Profilaxia
Profilaxia recderilor prin tratament corect. Distrugerea vectorilor (deparazitare). 133

Profilaxia la contaci, cu doze sptmnale de Doxiciclin, timp de 6 sptmni de la contactul infectant. Vaccinul este ineficient (preparat din bacterii omorte); stimuleaz puin rspunsul imun T dependent.

Diagnosticul de laborator n febra Q

Coxiella burnetti are proprieti distincte comparativ cu celelalte rickettsii: Posed dimensiuni mai mici i endospor. Nu prezint nrudiri antigenice cu tulpinile de Proteus. Infecia se manifest ca o pneumonie interstiial i se transmite pe cale aerogen sau prin consumul alimentelor infectate. Diagnosticul direct bacteriologic Recoltarea prelevatelor biologice sput, snge, l.c.r., lapte i fragmente de placent animal. Izolarea n sisteme celulare: cobai, ou embrionat sau culturi de celule. Diagnosticul serologic Este specific i utilizeaz: RFC, reacii imunofluorescena indirect. Test de patogenitate Infecia produce avort la cobie gestante. de aglutinare,

Profilaxia
Se adreseaz persoanelor care lucreaz n mediul veterinar. Vaccin antifebr Q (omort) - puin utilizat.

134

CAPITOLUL 14 GENUL CHLAMYDIA

Caractere generale
Genul cuprinde bacterii cu perete celular gram negativ-like, cu parazitism celular obligatoriu (incapabile s sintetizeze ATP). Se pot cultiva prin inoculare n sisteme vii: animale de laborator, ou embrionat, culturi de celule. Ciclul de multiplicare are loc n citoplasma celulei, rezultnd incluzii caracteristice: corpusculi elementari i corpusculi reticulai. Produc infecii la om, animale i psri.

Reprezentani, afeciuni produse

Chlamydia trachomatis: - trahom (tipurile antigenice A, B, Ba, C); - infecii pulmonare tipurile antigenice - infecii oculare (conjunctivita cu incluzii) D, F, G, H, I, J, K; - infecii urogenitale (uretrita negonococic) - limfogranulomatoza venerian (tipurile antigenice L1, L2, L3). Chlamydia psittaci: - psitacoza (pneumonie atipic); - infecii la animale: pneumonie, enterit, avort, encefalit. Chlamydia pneumoniae: - infecii respiratorii (pneumonie atipic).

Patogenez, aspecte clinice

Metabolismul bacterian nu produce ATP, energia fiind furnizat de ctre celula gazd. Parazitismul celular este obligatoriu; ciclul de dezvoltare bacterian dureaz 48 de ore. Corpusculii elementari reprezint forma infecioas extracelular (0,3 m diametru). Ptrund n celul prin endocitoz receptor indus, acumuleaz material celular i se transform ntr-o particul mai mare, cu 1 m n diametru, denumit corpuscul reticulat sau corpuscul iniial (element metabolic activ, bogat n ARN), care sufer procese de diviziune binar; apar incluzii intracitoplasmatice. Corpusculii iniiali formeaz dup aproximativ 20 de ore corpusculi elementari care vor fi eliberai prin liza celulei, astfel nct apar noi cicluri de multiplicare bacterian, dependente de ATP-ul celular. Se atinge un oarecare echilibru ntre gazd i parazit, infeciile subclinice, latente fiind mai frecvent ntlnite dect cele clinic manifeste. Rspunsul imun umoral este slab i nu previne reinfecia. 135

Este o antropozoonoz, boala transmindu-se i de la animal la om. Spre exemplu, Chlamydia psittaci produce pneumonie aviar (la papagal) i uman. Chlamydia trachomatis se transmite prin contact direct interuman. Chlamydia posed antigene de suprafa (proteina MOMP - 62 kD) i hemaglutinine care favorizeaz ataarea pe suprafaa celulelor. Persistena intracelular se explic prin mecanisme de inhibare a formrii fagolizozomilor. Rspunsul imun celular este responsabil pentru distruciile tisulare n procesul inflamator, cu att mai mult cu ct bacteria posed o toxin endotoxin-like. Toxina termolabil este produs de ctre toate speciile Chlamydiei; produce un efect letal la animalul de experien (oarecele), dup inoculare intravenoas.

Infecii produse de ctre Chlamydia trachomatis

Oculare Trachomul - reprezint o infecie cronic ocular (cu aspect folicular), rspndit n Africa i Asia, cu evoluie inevitabil spre orbire. Se estimeaz c 400 de milioane de oameni au aceast boal i circa 20 de milioane dintre acetia sunt orbi. Conjunctivita cu incluzii - apare att la adult (la care coexist afeciunea genital), ct i la nou-nscui (conjunctivit purulent aprut n urma trecerii ftului prin tractul genital matern infectat). Genitale Limfogranulomatoza venerian (LGV) - cu transmitere sexual. Uretritele negonococice (UNG) - cu tablou clinic asemntor gonoreei. Uretritele postgonococice - sunt frecvent ntlnite. Epididimita acut - apare mai ales la vrste sub 35 de ani, nsoind 3% din cazurile de uretrite negonococice. Infecii ale tractului genital feminin: uretrite purulente, cervicite, salpingite - ntlnite frecvent la femei cu parteneri sexuali multipli. Nounscuii provenii din mame infectate prezint conjunctivita cu incluzii sau chiar pneumonie. Rolul Chlamydiei trachomatis n avort i n infertilitate nu este cunoscut suficient. Probabil infecia respectiv poate interfera cu implantarea oului. Sindromul Reiter cuprinde triada: artrit, conjunctivit i leziuni mucocutante, aprute la 1-4 sptmni dup debutul uretritei. 136

Infecii produse de ctre Chlamydia psittaci

Psitacoza, ornitoza-pneumonic interstiial atipic cu febr, tuse, mialgii; uneori cu evoluie subclinic. Sechelele posibile sunt miocardita, encefalita, meningita, hepatita. Riscul major pentru boal l au cresctorii de psri. Tetraciclina i Eritromicina sunt ageni terapeutici valoroi; lactaminele sunt ineficiente.

Infecii produse de ctre Chlamydia pneumoniae

Pneumonie - cu evoluie bifazic: ncepe cu o afeciune de tract respirator superior care se continu cu o bronhopneumonie. Rezervorul bacterian este strict uman. 50% dintre infecii sunt subclinice. Diagnosticul serologic nu este diagnostic de rutin. Tetraciclina este eficient.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice Recoltarea secreiilor (cervicale, uretrale, oculare, din ancrul genital, nazofa- ringiene i din tractul respirator), se realizeaz cu minimum 3 tampoane pentru fiecare tip de secreie. Transportul probelor se realizeaz n medii speciale, n condiii de refrigerare. Recoltarea sngelui - pentru diagnostic serologic. Diagnosticul microscopic direct Se evideniaz incluziile intracitoplasmatice tipice pe frotiuri colorate Giemsa, Giemenez sau Machiavello i n imunofluorescen cu anticorpi monoclonali. Chlamydia trachomatis - prezint incluzii compacte cu matrice de glicogen (Iod+), cu densitate redus de corpi elementari. Chlamydia psittaci - prezint incluzii difuze, fr matrice de glicogen (Iod ) i cu densitate crescut de CE. Microscopia direct este mai eficient n infeciile cu Chlamydia psittaci. Evidenierea antigenelor chlamydiene solubilizate, prin tehnica EIA n faz lichid (Chlamydiazime) sau n faz solid (Test Pack Chlamydia). Evidenierea acizilor nucleici chlamydieni prin: PCR, Sothern Blot. Izolarea Prin inoculare pe culturi de celule Se folosesc liniile celulare HeLa sau McCoy, dup iradierea sau tratarea culturii cu IUDR (metabolism lent). 137

Dup 2-3 zile de la incubaie se detecteaz incluziile specifice prin coloraia Giemsa sau prin imunofluorescen. Prin inoculare n sacul vitelin al oului embrionat de 6-7 zile. Metoda este utilizat pentru prepararea antigenelor pentru reacii serologice. Izolarea pe animale de laborator Inocularea intracerebral la oarece pentru Chlamydia trachomatis. Caracteristici metabolice Elibereaz CO2 pornind de la glucoz, piruvat i glutamat; Conin dehidrogenaze; Sunt incapabile s sintetizeze ATP (parazitism obligatoriu intracelular). Structura antigenic Antigenele de grup - lipopolizaharidice - comune tuturor speciilor Chlamydiene; - indentificabile prin RFC i IF. Antigenele de specie - proteine membranare externe - Chlamydia trachomatis prezint 15 serotipuri: A, B, Ba, C, D K, L1, L2, L3 - identificabile prin imunofluorescen. Diagnosticul serologic Reacia cu fixare de complement - tehnica Ida Bengston. Imunofluorescena - detecteaz anticorpii specifici (IF - detectarea Ig M pentru diagnosticarea pneumoniei la nou-nscut (Chlamydia pneumoniae)). Serotestarea incluziei integrale - anticorpii anti incluzii chlamydiene sunt evideniai prin IF sau ELISA. Diagnostic indirect biologic Intradermoreacia FREI - evideniaz starea de hipersensibilitate de tip tardiv care apare n timpul infeciei, n special n limfogranulomatoza venerian. Reacia poate pune diagnosticul retrospectiv al bolii. Tratament De elecie sunt Tetraciclina, Eritromicina. 138

Chlamydia trachomatis prezint sensibilitate la Sulfadiazin i Cicloserin, spre deosebire de Chlamydia psittaci (criteriu de diagnostic
diferenial).

Profilaxie
Stabilirea precoce a diagnosticului i aplicarea tratamentului. Imunizarea animalelor cu vaccinuri anti Chlamydia. Imunizarea omului nu se practic.

139

CAPITOLUL 15 GENUL MYCOPLASMA

Caractere generale
Genul Mycoplasma aparine familiei Mycoplasmataceae, alturi de Ureaplasma i genul Acholeplasma. Bacteriile genului au dimensiuni reduse (0,2-0,3 m), nu posed perete celular (motiv pentru care nu se pot colora n coloraiile convenionale); membrana citoplasmatic este bogat n colesterol i n molecule lipopolizaharidice fixate. Se dezvolt greu pe medii acelulare (necesit steroli ca factori de cretere, pe care i nglobeaz n membrana citoplasmatic). Se dezvolt i pe sisteme celulare (parazitism celular facul-tativ). Au afinitate pentru membrana celulelor eucariote. Lipsa peretelui celular determin un polimorfism accentuat (forme de par, forme cocoide sau cocobacilare). Genul cuprinde aproximativ 26 de specii care produc infecii la om i la animale. Mycoplasma a fost izolat n 1898, de la bovine cu pleuropneumonie. n 1937 a fost izolat de la om, dintr-un abces pulmonar i a fost denumit pleuropneumonia-like organism (PPLO).

Reprezentani, infecii produse

Mycoplasma pneumoniae: - pneumonie atipic primar; - faringite, otite buloase, bronite; - anemie hemolitic, artrite; - meningoencefalite; - eritemul multiform (sindromul Stevens-Johnson). Mycoplasma hominis: - salpingite, abcese pelviene, febr puerperal, pielonefrit. Mycoplasma salivarium; Mycoplasma orale; Mycoplasma buccale: - infecii respiratorii. Mycoplasma fermentans; Mycoplasma arthridis: - artrite. Ureoplasma urealyticum: - uretrite. Mycoplasma genitalium: - endometrite post partum, post abortum.

140

Aspecte clinico-patogenetice
Mycoplasmele pot coloniza aparatul respirator, cavitatea bucal, tractul genito-urinar. Specia Mycoplasma pneumoniae este patogen, restul speciilor fiind condiionat patogene. Exist specificitate de gazd (specie patogen la om sau la animal). Parazitismul bacterian este celular. Bacteriile nu posed exotoxine sau endotoxine. Efectul citolitic este enzimatic, prin catalaze i peroxidaze; asupra hematiilor acioneaz prin hemolizine (se explic anemia hemolitic n unele infecii cu Mycoplasma pneumoniae). Bacteriile elaboreaz o prelungire celular denumit vrf pufos (aspectul de par), vrf cu care neap celula infectat i i preia substanele nutritive. Genomul mic i lipsa peretelui celular permit contactul strns cu celula gazd, fapt care determin apariia unor autoanticorpi, mai ales n infecia cu Mycoplasma pneumoniae: anticorpi anti celul pulmonar, anti limfocite, anti celul muscular neted, etc. Se produc complexe imune n exces, care sunt rspunztoare de simptomatologie extrapulmonar: leziuni ale sistemului nervos, artrite, eritem multiform. Pneumonia atipic primar este ntlnit n mod special la adulii tineri din colectiviti. Copiii sub 5 ani fac forme clinice inaparente. 20% dintre pneumonii au ca agent etiologic Mycoplasma pneumoniae, care determin totui o pneumonie atipic: stare ge-neral alterat, tuse neproductiv, n contrast cu semnele radiologice cu localizare preponderent hilar i interstiial. Anemia hemolitic, sindromul StevensJohnson, meningoencefalitele i artritele reprezint consecinele fenomenelor autoimune ale infeciei cu Mycoplasma pneumoniae (rspuns imun umoral semnificativ). Bolnavul rmne contagios nc 14 sptmni dup ameliorarea bolii. Infeciile tractului urogenital sunt produse de ctre Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum. Mycoplasma hominis produce endometrit post partum sau post abortum (complicat cu septicemii n 10% din cazuri) i boli inflamatorii pelviene. Ureaplasma urealyticum difer de restul speciilor prezentate prin abilitatea producerii ureazei. Bacteria se gsete n tractul urogenital al adulilor cu via sexual activ, ndeosebi la persoanele cu parteneri sexuali multipli. Ureaplasma produce 50% dintre uretritele negonococice ale sexului masculin.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice exudat faringian; 141

 sput; exudate inflamatorii; secreii uretrale, secreii vaginale; snge pentru examinri serologice.

Examenul microscopic direct, proprieti morfotinctoriale Imunofluorescena poate evidenia Mycoplasma pneumoniae n macrofagele din sput. Coloraiile speciale (Giemsa) evideniaz polimorfismul bacterian (form de par, cocoidal, cocobacilar), datorat absenei peretului celular. Izolarea, proprieti de cultur Pe medii acelulare complexe, cu factori de cretere (colesterin, lecitin, extract de drojdie, extracte proteice existente n ser sau lichid ascitic). Se incubeaz la 37C timp de 3-7 zile (bulion Difco, agar Difco). Coloniile M. pneumoniae sunt mici (10-100 m), implantate n mediu, cu centrul nfundat i periferia clar (aspect tipic de ou ochiuri). Pe medii cu snge produce hemoliz. Coloniile U. urealitycum sunt minuscule, granulare. Cultivarea n mediu lichid determin apariia unor filamente. Pe medii celulare - M. pneumoniae se cultiv n oul embrionat pe membrana corioalantoidian sau n culturi de celule. Proprieti biochimice M. pneumoniae necesit atmosfer aerob : celelalte specii sunt facultativ. Mycoplasmele degradeaz glucoza, reduc srurile de tetrazoliu n mediu. Ureaplasmele hidrolizeaz ureea (ureazo pozitive). Proprieti antigenice Speciile bacteriene se difereniaz prin antigene glicolipidice, (evideniabile prin RFC) i proteice (evideniabile prin testul ELISA). Diagnosticul indirect serologic Metodele de diagnostic sunt nespecifice i specifice. Metode nespecifice

142

Criohemaglutinarea - evideniaz anticorpi (aglutinine la rece), care produc aglutinarea hematiilor proprii bolnavilor (autoaglutinarea) i a hematiilor de grup 0 (izoaglutinarea), la temperatura de 4C. Reacia este pozitiv n 80% din cazurile de pneumonie atipic primar i n 10% din pneumoniile atipice cu alt etiologie. Titrul maxim se observ n sptmna 3 - 4 de boal. RFC cu antigene preparate din Bacillus antitratus. Reacii de aglutinare cu antigene nrudite streptococice. Metode specifice RFC cu antigene lipidice purificate mycoplasmatice. Imunofluorescena indirect. Reacii de hemaglutinare pasiv cu antigene mycoplasmatice adsorbite pe hematii tanate. Diagnosticul serologic se realizeaz pe probe duble de ser, recoltate la interval de 10-14 zile. Creterea titrului de anticorpi n proba 2 este revelatoare pentru diagnostic. ELISA, RIA

Tratament
Sunt utile Tetraciclinele (ex: Doxyciclina) i Macrolidele (ex.: Azithromycin): a-ceste antibiotice sunt preferate deoarece sunt eficiente i mpotriva Chlamydiei, implicat n etiologia uretritelor negonococice sau a unor infecii respiratorii atipice, greu de diagnosticat. Fluoroquinolonele sunt eficiente pentru microorganismele rezistente la Peniciline, Cefalosporine.

Profilaxie i control
Izolarea eptelului infectat cu pleuropneumonie i agalactie. Nu exist vaccin disponibil. Tratamentul antibiotic corect al subiecilor cu pneumonie atipic primar.

143

CAPITOLUL 16 FAMILIA ENTEROBACTERIACEE

Caractere generale
Cuprinde bacterii larg implicate n patologia infecioas, care produc afeciuni digestive, dar i infecii localizate extraintestinal: infecii urinare, respiratorii, meningeale, cutanate etc. Sunt bacili gram negativi, mobili sau imobili, patogeni sau condiionat patogeni, cu sediul n intestinul uman sau animal. Bacteriile prezint un metabolism extrem de activ i cultiv cu uurin pe medii de cultur. Sunt aerob/anaerob facultative.

Reprezentani
Tabel nr. 10 genuri) Familia Enterobacteriacee (clasificare n triburi, GENUL Escherichia Shigella Edwardsiella Klebsiella Enterobacter Serratia Hafnia Proteus Providencia Morganella Salmonella Arizona Citrobacter Yersinia Erwinia Pectobacterium Cedecea Kluyvera Tatumella Ewingella etc.

TRIBUL Escherichiae Edwardsiellae Klebsiellae

Proteae Salmonellae Yersiniae Erwiniae Neclasificate

144

Clasificarea corect din punct de vedere tiinific i se atribuie lui P. R. Edwards, W. H. Ewing (teste biochimice) i F. Kauffman (structur antigenic).

Aspecte clinico-patogenetice
Patologia produs este extrem de divers, aspect rezultat din varietatea factorilor de patogenitate bacterieni: Endotoxina - lipozaharidul este compus din smburele polizaharidic, antigenul O somatic i lipidul A cu rol toxic. Exotoxinele sunt prezente la unele specii bacteriene, produse prin mecanisme genetice extracromozomiale (spre exemplu E. Coli prezint toxine Shiga-like, enteroinvazive dar i toxine enterotoxigene). Adezinele bacteriene (factori de colonizare) realizeaz ataarea bacteriilor pe suprafaa celulelor susceptibile. Acest rol l au pilii sau fimbriile (antigene K, F sau P) i recent numiii pili CFA (factori antigenici de colonizare ai intestinului). Pilii P sunt proteine fimbriare ale unor tulpini de E. Coli generatoare de pielonefrit. Pilii F au rol n fenomenul de conjugare bacterian (pilii sexuali). Antigenul K de virulen (de la cuvntul german Kapsel) sunt asociate cu polizaharidele capsulare cu rol antifagocitar. Pentru serotipare se utilizeaz prezena antigenelor O (somatice), H (flagelare) i K (de virulen). Importana enterobacteriilor poate fi apreciat din mai multe puncte de vedere: participare n patologia uman - produc infecii digestive, urinare, toxiinfecii alimentare, enterite, infecii piogene, endometrite, otite, sinuzite, pneumonii, septicemii (majoritatea infeciilor produse de ctre bacteriile comensale fiind infecii intraspitaliceti). Pe plan igienico-sanitar - prezena E. Coli i a coliformilor n mediu reprezint indicatori ai contaminrii fecale (caracterizarea igienicosanitar a apei i a alimentelor). Pe plan biologic - aduc importante informaii n biologia molecular, n studiul geneticii i metabolismului bacterian. Diferenierea enterobacteriilor fa de ali bacili gram negativi se realizeaz prin: degradarea oxidativ i fermentativ a glucozei; reducerea nitrailor la nitrii; testul citocromoxidazei negativ. Alte teste realizeaz ncadrarea n trib i gen. Pentru precizarea speciei se utili-zeaz att proprieti biochimice, ct i structura antigenic O, H, K. 145

Genurile cu patogenitate cert sunt Salmonella i Shigella, restul genurilor cuprinznd bacterii condiionat patogene i comensale.

146

CAPITOLUL 17 GENUL SALMONELLA

Caractere generale
Cuprinde bacili gram negativi, mobili, care reprezint caracteristicile definitorii ale enterobacteriaceelor din tribul Salmonelleae: lactoza nu este fermentat; fermenteaz glucoza cu producere de gaz; produce H2S din tiosulfat; utilizeaz citratul ca unic surs de atomi de C; decarboxileaz lizina, arginina i ornitina.

Reprezentani, infecii produse

I. Salmoneloze majore: Salmonella tiphy: - febra tifoid Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B: - febre paratifoide. II. Salmoneloze minore: S. tiphimurium, S. choleraesuis, S. anatum, S. panama etc.: - toxiinfecii alimentare, enterite. S. choleraesuis, alte specii grup C: - stri septicopiemice.

Aspecte clinico-patogenetice
Toate serotipurile Salmonellei sunt patogene pentru om. Toate speciile bacteriene conin endotoxina (antigenul O). Invazinele sunt proteine care realizeaz aderena i penetrarea n celulele epiteliale intestinale. Salmonella are un parazitism facultativ intracelular, conferit prin 40 de proteine diferite i prin antigenele Vi, blocnd fenomenele fagocitozei: catalaza, superoxid dismutaza neutralizeaz radicalii activi ai oxigenului; factorii implicai n rezistena la pH acid contribuie la supravieuirea bacteriilor n fagolizozom.

147

Principalele infecii produse de ctre Salmonella se clasific n Salmoneloze minore i majore. Enterocolitele, gastroenteritele, toxiinfeciile alimentare apar dup ingestia a 105 - 108 bacterii. Dup ingestie are loc ataarea bacterian la nivelul celulelor epiteliale ale intestinului subire, apoi penetrarea n celule i migrarea n lamina propria, n regiunea ileocecal. Are loc multiplicarea n foliculii limfoizi anexai intestinului. Local se acumuleaz PMN i rezult o reacie inflamatorie cu eliberare de prostaglandine, care duc la stimularea adenilat ciclazei (cu apariia unui sindrom diareic nesanguinolent). Simpto-mele tipice enterocolitei Salmonelozice (diaree, febr, dureri abdominale, cefalee) apar dup 24 de ore de la inoculare i evolueaz autolimitat 2-5 zile. Complicaiile de temut sunt dezechilibrele hidroelectrolitice, care apar mai uor la pacieni cu vrste extreme. Salmonelozele majore (febra tifoid i febra paratifoid) apar dup ingerarea a 103 bacterii. Dup multiplicarea iniial la nivelul celulelor ansei ileocecale i n macrofagele din formaiunile limfoide intestinale are loc bacteriemia iniial, urmat de invadarea unor organe i formaiuni limfatice. Multiplicarea crescut n ficat i splin este urmat de o a doua bacteriemie masiv i de eliminarea prin bil i prin urin. Dup prima sptmn de boal, Salmonella se elimin prin materiile fecale, excreia prelungindu-se nc mult timp la purttorii cronici. n febra tifoid starea general este alterat: febr, bradicardie, stare de oc, apatie sau delir. Simptomatologia general este determinat n principal de endotoxin, care stimuleaz fenomenele inflamatorii. Complicaiile sunt de temut: perforaii intestinale, tromboflebite, colecistite, angiocolite, coagulare intravascular diseminat, microabcese. Sursa de contaminare o constituie cei cu infecii subclinice i purttorii. Pentru alte salmoneloze, sursa de infecie o reprezint apa i alimentele (lapte, ou, mezeluri). n ultimii ani, n Romnia, a crescut numrul de cazuri de Salmoneloze minore (incidena 5 o/oooo) i a sczut numrul cazurilor de febr tifoid (incidena sub 0,07 o/oooo).

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice n febrele enterice: snge n prima sptmn de boal i materii fecale n sptmna a doua i a treia, urin n sptmna a treia i a patra de boal; snge pentru examinri serologice n sptmna a doua, a treia i a patra. 148

n septicemii salmonelozice: snge. La purttori: materii fecale, bil, snge (examinri serologice). n gastroenteritele Salmonelozice: materii fecale, lichid de vrstur, alimentul. Examenul direct microscopic - al produsului patologic nu d informaii utile diagnosticului. Izolarea germenului: Hemocultura - aprox 10 ml de snge se recolteaz i se nsmneaz n bulion nutritiv sau pe bil de bou steril. Se incubeaz la termostat 7 zile; dup 24-48 ore se fac pasaje pe medii pentru intestinali, geloz snge, medii care se incubeaz n aerobioz i anaerobioz. Coloniile lactozo negative se izoleaz n cultur pur pe geloz nclinat. Coprocultura - se nsmneaz materii fecale din scaunul emis spontan. Pentru depistarea purttorilor, recoltarea se face din scaun de purgaie. Se utilizeaz mediul de conservare Cary Blair. Mediul de mbogire este obligatoriu (cu selenit acid de sodiu). Din acest mediu se fac treceri pe cel puin dou medii selective pentru intestinali, urmate de izolare n cultur pur. Urocultura - urina se centrifugheaz i sedimentul se nsmneaz pe Wilson Blair, pe selenit acid de sodiu i pe mediile selective pentru germeni intestinali. Bilicultura - se centrifugheaz bila B i sedimentul este nsmnat ca i n cazul coproculturii. Identificarea Se realizez prin cercetarea: Proprietilor morfotinctoriale: - bacili gram negativi mobili cu cili peritrichi. Proprietilor de cultur: Pe ADCL: colonii S lactozo-negative semitransparente, cu punct negru central. Pe Mc Conkey, Istrate-Meitert: colonii S lactozo-negative. Tulbur uniform mediile lichide. Caractere biochimice Coloniile lactozo - negative sunt repicate pe mediile multitest: TSI+MIU sau TSI+MILF.

149

Salmonella prezint caractere biochimice comune cu ale enterobacteriaceelor dar i teste caracteristice: Fermenteaz glucoza cu producere de acid i gaz (S. tiphy nu produce gaz). Utilizeaz citratul ca unic surs de atomi de carbon. Nu fermenteaz lactoza sau zaharoza. Nu produc indol, ureaz, acetil - metil - carbinol. Produc hidrogen sulfurat (TSI) i lizindecarboxilaz. Proprieti antigenice Structura antigenic variat O, H, K definete cele 1200 de specii ale genului (schema de identificare Kauffmann-White). Antigenul O conine 65 de antigene diferite, denumite factori de specificitate. Grupurile O sunt notate cu litere mari A, B, C, D, . n fiecare grup, un factor de specificitate este caracteristic, fiind prezent la toate serotipurile. Antigenele H sufer fenomenul variaiei de faz (faz 1 - 2), aspect al variaiei antigenice. Antigenul K de virulen (Vi) confer bacteriilor O inaglutinabilitate, proprietate care dispare prin fierberea suspensiei celulare.
Tabel nr. 11 Salmonella Structura antigenic Grupul de Salmonelle A - S. paratiphy A B - S. paratiphy B C - S. paratiphy C D - S. tiphy Antigenul O, K 1, 2, 12 1, 4, 5, 12 6, 7, Vi 9, 12, Vi Antigen H Faza 1 Faza 2 a b c d 1, 2 1, 5 -

150

Precizarea structurii antigenice O, H, K se realizeaz prin reacii de aglutinare cu seruri anti O polivalent, seruri antiSalmonella de grup AO, BO, CO, DO etc. i antiflagelare (anti faz 1, anti faz 2). Formula astfel obinut se compar cu cele existente n tabelul Kauffmann-White. Diagnosticul indirect serologic Serodiagnosticul Widdal se practic numai n cazul Salmonelozelor majore. Reacia evideniaz prezena anticorpilor fa de Salmonella tiphy, S. paratiphy A i S. paratiphy B, separat pentru antigenele O i H. Testul este dinamic i urmrete creterea titrului de anticorpi pe msura desfurrii bolii (titrul maxim se nregistreaz n sptmna 3-4 a afeciunii). La bolnavii fr antecedente vaccinale, un titru O de 1/250 este considerat semnificativ, cu att mai mult cu ct titrul se dubleaz n 5-7 zile.

151

La subiecii cu antecedente vaccinale recente, titrurile O de 1/250 i H de 1/500 apar frecvent; dublarea titrului dup 7 zile confer titrurilor o valoare diagnostic. Lizotipia Este util n scopuri epidemiologice, preciznd filiaiunea cazurilor n epidemii de toxiinfecii alimentare i infecii intraspitaliceti, deoarece o tulpin de Salmonella i pstreaz aceleai caractere de lizotipie att n timpul bolii, n covalescen ct i la purttor cronic.

Tratamentul
Tratamentul clasic n febra tifoid se realizeaz cu Cloramfenicol sau cu asociere de Ampicilin-Sulfamid. Studii recente recomand Quinolonele, att pentru bolnavi, ct i pentru purttori.

Profilaxia
Igiena personal, respectarea regulilor igienice n industria alimentar. Vaccinuri antiSalmonella tiphy, care se administreaz persoanelor cu risc (ex: vaccinul cu tulpina atenuat Ty21a sau vaccin preparat din imunogenul Vi). Depistarea i tratarea purttorilor cronici de Salmonella.

152

CAPITOLUL 18 GENUL SHIGELLA

Caractere generale
Genul cuprinde bacili gram negativi imobili, lactozo-negativi, cu caracteristici comune enterobacteriaceelor, cu patogenitate cert.

Reprezentani
Sunt clasificai n grupuri antigenice, (funcie de structura antigenului O somatic) i produc dizenteria bacilar. Grup A - Shigella dysenteriae - tip 1- Shigella dysenteriae shigae - tip 2 - Shigella dysenteriae schmitzi - tipurile 3-10 - tipuri Large-Sachs Grup B - Shigella flexneri - tipurile 1-6 Grup C - Shigella boydi - tipurile 1-15 Grup D - Shigella sonnei - variantele S i R

Aspecte clinico-patogenetice
Shigella este patogen prin invazivitate. Etapa primordial a procesului patogenic const n ptrunderea intracelular i multiplicarea n celula epitelial a intestinului gros a Shigellei virulente (capacitatea invaziv are codificare plasmidic - genele "invasion" - inv). Odat internalizate, bacteriile se nconjoar de o membran asemntoare fagozomilor, aspect care confer rezistena la fagocitoz. Procesul de penetraie intraeritrocitar duce la sensibilizarea imunocitelor din lamina propria, cu elaborare de mediatori imunitari i transformare blastic limfocitar. Imunoglobulinele A secretoare au un rol major n aprarea antibacterian. Invazia bacteriilor n celulele nvecinate are loc dup eliberarea acestora din vezicula de chlatrin (prin aciunea hemolizinei de contact) i prin intermediul unor proteine specifice de difuziune, care utilizeaz citoscheletul celulei ca mijloc de propulsie a microorganismelor n zona adiacent. Mucoasa intestinal i vasele mici sufer leziuni citotoxice, prin eliberarea de endotoxin i produi de metabolism bacterian. Astfel se explic apariia n scaun a mucusului, PMN i sngelui (sindrom diareic de tip inflamator). Testul de patogenitate utilizat pentru fenomenul penetrrii intraepiteliale este testul keratoconjunctivitei la cobai (testul Sereny), care precizeaz tulpinile virulente KC+. 153

Shigella dysenteriae shigae produce cele mai grave forme de boal datorit unei exotoxine neurotrope, toxina Shiga, cu efect enterotoxic, neurotoxic i citotoxic. Mecanismul molecular de aciune al acestei exotoxine vizeaz inhibarea sintezei proteice: fragmentul B leag toxina pe receptorii glicoproteici intestinali, iar fragmentul A realizeaz ADP - ribozilarea factorului EF1 de elongare al lanului polipeptidic. In vitro, aceast sintez scade brusc n 30, n timp ce in vivo efectul citopat citocid apare dup aproximativ 24 de ore. n 1950, la noi n ar s-au descris ultimele cazuri de mbolnviri cu Shigella shigae. n prezent dizenteria este produs de Shigella flexneri i Shigella sonnei, care produc forme clinice mai uoare de boal, uneori etichetate ca enterit. Dizenteria evolueaz epidemic n colectiviti cu condiii igienico-sanitare deficitare; transmiterea este fecal-oral, hidric. Exist riscuri de cronicizare a bolii la cazurile incorect tratate.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice Se recolteaz scaune mucosanguinolente de emisie spontan sau materii fecale prelevate cu sonda Nelaton sau tampon rectal (la copii mici sau n situaia depistrii purttorilor). Mediul de transport Cary Blair este foarte indicat. Examenul microscopic direct al produsului patologic Este orientativ - evideniaz bacili gram negativi i hematii. Izolarea Se nsmneaz materiile fecale pe medii selective pentru germeni intestinali: Istrate Meitert, AABTL, ADCL etc. Coloniile lactozo negative se repic. Identificarea Se face pe baza: Proprietilor morfotinctoriale: bacili gram negativi imobili, fr aezare caracteristic; Caracterelor de cultur: coloniile sunt S, minuscule, lactozo negative. Pe mediile lichide tulbur uniform mediul (voal mtsos). 154

Carateristici biochimice Shigella fermenteaz glucoza cu producere de acid, fr gaz (excepie Shigella flexneri tip 6). Shigella dysenteriae (grup A) nu fermenteaz manita, n timp ce Shigellele aparinnd grupurilor antigenice B, C, D o scindeaz. Shigella nu fermenteaz lactoza, cu excepia Shigellei dysenteriae tip 1 i Shigellei sonnei tip 1, care o fermenteaz tardiv. Nu produc H2 S, nu posed ureaz, nu produc acetil metil carbinol. Prezint testele biochimice comune Enterobacteriaceelor. Proprieti antigenice Identificarea tulpinilor patogene se realizeaz prin teste de aglutinare pe lam sau n tuburi : Shigella dysenteriae prezint 10 tipuri distincte antigenic O, Shigella flexneri- 6 tipuri, Shigella boydii- 15 tipuri i Shigella sonnei- 1 tip antigenic, care prezint variaia S-R. Serotipurile se grupeaz n 4 grupuri antigenice, notate A, B, C, D (vezi paragraful Reprezentani). Teste de patogenitate Tulpinile enteroinvazive sunt evideniate prin testul keratoconjunctivitei (testul Sereny). Inocularea culturii sub pleoapa unui cobai i va produce acestuia conjunctivit mucopurulent. Exotoxina Shigella dysenteriae shigae se testeaz pe oarecele alb. Antibiograma Este obligatorie. Tratamentul Impune reechilibrare hidroelectrolitic i administrarea chimioterapicelor antibacteriene, conform antibiogramei: Amoxicilin, Sulfamide, Tetraciclin, etc. Se studiaz anticorpii antitoxin Shiga (seroterapia nu este nc introdus n tratament).

Profilaxia
Respectarea regulilor de igien: controlul sanitar al apei, dezinfecia obiectelor contaminate, tratamentul corect al bolnavilor i depistarea purttorilor (persoane care lucreaz n sectorul alimentar sau sanitar). Istrati i colaboratorii au pus la punct vaccinul Vadizen, preparat dintr-o tulpin atenuat de Shigella flexneri 2a, nedependent T32 (1961), care se administreaz per oral, cu o reducere a morbiditii cu 80% n colectivitile vaccinate. Acest preparat poate preveni dizenteria cronic. 155

CAPITOLUL 19 GENUL ESCHERICHIA. ESCHERICHIA COLI

Caractere generale
Genul cuprinde bacili gram negativi mobili, larg rspndii n natur (n microbiocenoza intestinal uman i animal), n alimente, ap sau pe sol. Sunt germeni aerobi, facultativ anaerobi, lactozo pozitivi. Escherichia Coli prezint nrudiri cu bacteriile genurilor Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, formnd un grup aparte, cu denumirea de "coliformi". Prezena acestor bacterii n apa potabil constituie un indicator al aa-zisei contaminri fecale (indicatori ai polurii apei).

Reprezentani
Escherichia Coli reprezint cea mai important specie a genului, implicat n infecii variate (infecii digestive, urinare, meningeale, piogene, infecii generalizate, infecii nozocomiale).

Aspecte clinico-patogenetice
Dei Escherichia Coli este un germen comensal (ntlnit preponderent n microbiocenoza de tip intestinal), el poate deveni patogen n urma unor fenomene genetice extracromozomiale, realizate prin intervenia unor plasmide sau bacteriofagi. Adezinele bacteriene - au rol n ataarea bacteriilor pe suprafaa celulelor epiteliale intestinale (ex.: pilii CFA- factori antigenici de colonizare, codificai prin plasmida ENT) i pilii P, cu rol n ataarea pe celulele tractului urinar (tot cu codificare plasmidic). Capsula, cu rol antifagocitar - apare la tulpinile Escherichiei Coli K1, care produc 84% din totalul meningitelor nou nscutului (tulpina K 1 prezint similitudini antigenice cu anumite glicoproteine umane - N-CAM, fapt care explic lipsa de reactivitate imunologic fa de Escherichia Coli K1). Tulpinile care prezint antigenul de suprafa B sunt implicate n apariia unui sindrom toxico-septic al nou-nscutului. Endotoxina produce leziunile caracteristice. Exotoxinele sintetizate prin mecanisme genetice extracromozomiale sunt variate: Enterotoxinele termolabile LT1 i LT2 sunt toxine cholerae-like, produc sindrom diareic apos prin stimularea guanilat-ciclazei. 156

Enterotoxina termostabil ST acioneaz prin creterea nivelului cGMP, cu alterarea transporturilor ionice celulare. Exotoxina enterohemoragic (enteroinvaziv sau verrotoxin, tulpini EHEC, VTEC). Tulpinile secretoare - fenotipurile uropatogene produc hemolizine cu efecte citotoxice. Afeciunile gastrointestinale sunt produse prin trei tipuri de tulpini virulente: Tulpinile ETEC provoac un sindrom diareic apos (toxigen), holeriform, prin hipersecreia de ap i electrolii determinat prin enterotoxina ST, LT sau ambele. Serotipurile EHEC produc sindrom diareic, sindrom hemolitic uremic i colite hemoragice. Serotipul O157 H7 produce forme grave de boal printr-o toxin Shiga-like, denumit i verrotoxin pentru c este citotoxic fa de celulele culturii Verro. Tulpinile EPEC de Escherichia Coli produc sindrom diareic apos sau mucos, mai ales la copii cu vrste sub 2 ani. Factorul de patogenitate este reprezentat printr-o adezin cu codificare plasmidic, distrugtoare de microvili. Serotipurile EIEC produc un sindrom diareic de tip dizenteriform , cu efect citotoxic pronunat. Testul keratoconjunctivitei la cobai este pozitiv. Tulpinile enteroagregative de Escherichia Coli (EAgEC) posed fimbrii care distrug celulele marginii n perie a intestinului. Sindromul diareic este de tip apos; se poate croniciza. Infeciile tractului urinar Escherichia Coli reprezint etiologia cea mai frecvent a acestor infecii la sexul feminin (serotipuri O1, O21, O41, O5, O6, O7, etc.). Meningitele neo-natale La nou nscui, tulpinile de Escherichia Coli K 1 produc meningite i septicemii. Infecii intraspitaliceti (infecii de plag chirurgical, urinare, septicemii). Sindroamele clinice prezentate se pot transmite fecal-oral, prin alimente contaminate sau din surs endogen (mai ales infeciile tractului urinar). Infeciile intraspitaliceti apar ca o consecin a nerespectrii igienei actului medico-chirurgical.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice: 157

Materii fecale, urin, secreii purulente, snge, lichid cefalorahidan, secreii biliare, alimente, esuturi recoltate de la cadavru. Examenul microscopic direct Este nerevelator. Izolarea Se realizeaz pe medii selective pentru germeni intestinali: ADCL, Istrate - Meitert, AABTL, GEAM, Brolacin. Pentru izolarea E. Coli din urin se folosete tehnica Uricult sau Urinat. Urocultura cantitativ stabilete diagnosticul de infecie urinar la >105 germeni ml urin. Pe medii selective apar colonii S lactozo pozitive care se replic pe mediul AABTL. Identificarea Se realizeaz pe baza proprietilor: morfotinctoriale: n coloraie gram se vizualizez bacili gram negativi fr aezare caracteristic. Germenul este ciliat. de cultur: - n bulion tulbur uniform mediul (voal mtsos); - Pe ADCL: colonii S lactozo pozitive (roii); - Pe AABBTL, Istrate - Meitert, Brolacin: colonii S lactozo pozitive (galbene); - Pe mediul GEAM (Levine) apar colonii S negre, cu luciu metalic pe geloz snge unele tulpini de E. Coli produc hemoliz. Caractere biochimice Prezint caracterele biochimice comune ale enterobacteriaceelor. Testul rou metil este pozitiv; Testul Voges Proskauer este negativ; Fermenteaz glucoza i lactoza cu producere de acid i gaz; Utilizeaz acetatul ca unic surs de atomi de carbon; Produce indol, nu produce ureaz i H2S. Proprieti antigenice Tulpinile enteropatogene se identific prin reacii de aglutinare pe lam cu ser polivalent i apoi cu seruri de tip (anti O 26, anti O55, antiO111, etc.) i chiar prin imunofluorescen. 158

Tulpinile enteroinvazive se identific tot prin reacii de aglutinare pe lam cu seruri specifice antiA (anti O 26, anti O28, antiO112, etc.) i antiB (anti O136 , anti O142, etc.). Teste de patogenitate Tulpinile enteroinvazive se evideniaz prin testul keratoconjunctivitei la cobai. Tulpinile enterotoxigene se evideniaz prin testul ansei ligaturate la iepuri. Citotoxicitatea tulpinilor EHEC i EPEC se evideniaz n culturi de celule. Tratamentul Se realizeaz conform indicaiilor antibiogramei (sensibilitate la Polimixine, Quinolone, Aminoglicozide, Cefalosporine).

Profilaxia
Respectarea normelor sanitare n colectiviti de copii, spitale, sectorul alimentaiei publice.

159

CAPITOLUL 20 GENUL KLEBSIELLA

Caractere generale
Sunt bacili gram negativi (enterobacterii capsulate, imobile), cu activitate metabolic intens (hidrolizeaz variai hidrai de carbon cu producere de acid i gaz). Germenul este larg rspndit n natur (n intestinul omului i animalelor, n ap, pe sol, n mediul spitalicesc).

Reprezentani, afeciuni produse

Klebsiella pneumoniae: - pneumonii, infecii piogene, urinare, digestive, spitaliceti. Klebsiella ozenae: - ozen, infecii cronice ale aparatului respirator. Klebsiella rinoscleromatis: - rinosclerom. Klebsiella oxytoca: - enterite, infecii nozocomiale. infecii

Aspecte clinico-patogenetice
Klebsiella pneumoniae este un germen condiionat patogen, implicat n patologia uman prin multiplicare i invazivitate. Capsula conine antigene polizaharidice K (de virulen), care imprim rezistena la fagocitoz i precizeaz serotipul (80 de tipuri diferite). Primele dou variante antigenice produc o pneumonie sever, primar sau secundar, la pacienii imunodebilitai. Antigenele de nveli confer un spor de virulen. Endotoxina bacterian produce leziuni caracteristice (Klebsiella este un germen gram-negativ). Unele specii ale genului pot produce o enterotoxin termostabil (similar celei sintetizate de E. Coli), codificat prin plasmida Ent. Klebsiella pneumoniae produce infecii ale tractului respirator (pneumonie, bronite, broniectazii, abcese pulmonare), infecii urinare, infecii piogene cu localizri variate, septicemii (ca infecii nozocomiale), infecii digestive (sindrom diareic enterotoxigen) la adult i copil. Klebsiella ozenae produce ozen, Klebsiella rinoscleromatis rinosclerom iar Klebsiella oxytoca d enterite.

160

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice: Materii fecale urin, secreii purulente, snge, lichid cefalorahidian; Alimente. Izolarea Se realizeaz pe: Geloz simpl, geloz snge; ADCL, Istrate Meitert, AABTL; Bulion. Identificarea Se realizez pe baza proprietilor: Morfotinctoriale: bacili gram negativi ncapsulai, imobili; De cultur: colonii S, mucoide, mari, lactozo pozitive cu fenomen de cameleonaj pe Istrate Meitert i AABTL. Caractere biochimice Posed proprietile comune enterobacteriaceelor. Testul rou metil este negativ. Testul Voges Proskauer este pozitiv. Utilizeaz citratul i malonatul ca unic surs de atomi de carbon. Degradeaz diverse zaharuri (lactaza este pozitiv). Structura antigenic Antigenele O sunt antigene de grup, n timp ce antigenele K definesc tipurile (identificabile prin reacia de umflare a capsulei). Teste de patogenitate Klebsiella pneumoniae inoculat intraperitoneal produce septicemii letale pentru animalele de experien. Lizotipia i tipizarea bacteriocinic este accesibil laboratoarelor de specialitate. Antibiograma Este obligatorie pentru un tratament antibiotic corect.

Profilaxia
Respectarea normelor de igien personal i igien spitaliceasc. 161

CAPITOLUL 21 GENUL PROTEUS

Caractere generale
Cuprinde bacili gram negativi foarte mobili (flagelai), lactozo negativi, ureazo +, FAD+. Bacilii se gsesc n microbiocenoza intestinal, n alimente, n natur.

Reprezentani:
Proteus vulgaris; Proteus mirabilis; Proteus morgagnii; Proteus rettgeri.

Aspecte clinico - patogenetice

Germen condiionat patogen, produce infecii variate la imunodebilitai: enterite, toxiinfecii alimentare, infecii urinare, infecii nozocomiale, septicemii. Proteus este patogen n special prin invazivitate: mobilitatea extraordinar i permite invadarea tractului urinar i a torentului circulator. Produce ureaza, care alcalinizeaz urina i favorizeaz formarea calculilor. Elibereaz endotoxina dup distrucia peretelui celular.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice: materii fecale, urin, lichid cefalorahidian, snge; secreii purulente, etc. Examenul microscopic direct Evideniaz bacili gram negativi polimorfi (forme filamentoase, bacilare, cocobacilare). Flagelii se pot evidenia n coloraii speciale. Izolarea pe medii Se dezvolt pe: medii lichide; geloz simpl; geloz snge; medii pentru germeni intestinali. 162

Identificarea Se realizeaz prin studierea proprietilor morfotinctoriale i mai ales pe baza proprietilor de cultur: - pe geloz simpl sau geloz snge prezint fenomenul de invazie (dezvoltarea culturii sub forma unor valuri concentrice, datorit mobilitii). Fenomenul Dienes este pozitiv - linie de demarcaie aprut ntre 2 tulpini de Proteus invazive. - pe medii lichide tulbur uniform i abundent mediul, degajnd un miros de putrefacie. - pe geloz nclinat prezint fenomenul de crare pe toat suprafaa mediului, chiar dac inoculul se depune la baza mediului, n apa de condensie. - pe ADCL i Istrate Meitert - germenii dezvolt colonii S lactozo negative, cu centru negru (aspect tipic n ochi de pisic). Diagnosticul diferenial se realizeaz cu genurile Morganella i Providencia. Caractere biochimice - Prezint proprietile biochimice comune enterobacteriaceelor. Este glucozo +, lactozo -, H2S+, ureazo +, FAD +. - Mobil (mediul MIU). Structura antigenic Identificarea serotipurilor O i H se realizeaz prin reacii de aglutinare pe lam. Tulpinile OX2, OX19, OXK prezint nrudiri antigenice cu unele specii ale genului Ricketsia. Determinarea patogenitii Inocularea tulpinilor virulente la animalele de experien le provoac acestora un abces la locul inoculrii sau chiar o reacie septicemic letal. Antibiograma, tratament Rezistena germenilor la antibiotice i chimioterapice este remarcabil.

163

CAPITOLUL 22 GENUL PSEUDOMONAS

Caractere generale
Familia Pseudomonadaceae are 4 genuri, speciile importante din punct de vedere medical fiind ncadrate n genul Pseudomonas. Genul cuprinde bacili aerobi i facultativ anaerobi, gram-, mobili, datorit flagelilor polari. Microorganismele respective sunt rspndite n natur (agent de putrefacie al materiei organice). Prefer zonele umede.

Reprezentani, infecii produse

Pseudomonas aeruginosa: - determin un spectru larg de mbolnviri, n special la pacieni cu imunitate sczut: infecii ale tractului urinar, respirator, gastrointestinal, infecii oculare, otite, infecii nozocomiale (suprainfecteaz arsuri i plgi chirurgicale), fibroz chistic, septicemii, endometrite, endocardite, etc. Pseudomonas cepacia (acum Burkholderia cepacia): - produce aceleai infecii ca i Pseudomonas aeruginosa (septicemii, endocardite, infecii urinare, respiratorii, abcese, conjunctivite etc.). Pseudomonas mallei: - produce morva, antropozoonoz (ulceraii, abcese, septicemie). Boala este rar. Pseudomonas pseudomallei: - Meloidoza - antropozoonoz (forma pulmonar sau septicemic). Pseudomonas maltophilia (actualmente Xanthomonas maltophilia): - produce infecii nozocomiale grave (endocardit, pneumonii, meningite, mastoidite, abcese, conjunctivite, infecii urinare etc.). Pseudomonas stulzeri: Pseudomonas thomasii: Pseudomonas pseudoalcaligenes: -infecii nozocomiale variate. Pseudomonas paucimobilis: Pseudomonas putrefaciens: Pseudomonas picketti: -infecii nozocomiale i Pseudomonas fluorescens: toxii fecii alimentare Pseudomonas putida:

164

Pseudomonas aeruginosa. Aspecte clinico-patogenetice.

Bacteria conine un bogat echipament n factori de patogenitate. Adezinele piliare contribuie la ataarea pe celulele epiteliale (pe receptorii glicosfingolipidici GM1 i GM2 i pe receptori proteici). Pilii au capacitatea de a se contracta i de a se extinde, ceea ce faciliteaz adeziunea. Genele codificante ale pililor specific i o peptidaz, (care controleaz exportul de fosfataz alcalin), fosfolipaza C, elastaza, exotoxina A, factori cu rol important n patogenicitate. Adezinele nepiliare sunt considerate exoenzima S, proteinele flagelare i exopolizaharidul capsular (ultimul avnd i rol antifagocitar). Polizaharidul respectiv conine alginat (fenotip mucoid +), implicat n producerea fibrozei chistice i n producerea unui glicocalix bacterian. Colonizarea esuturilor cu Pseudomonas aeruginosa are loc n mod preferenial pe esuturi lezate anterior. Enzimele extracelulare sunt factori de invazivitate; majoritatea tulpinilor produc mai multe tipuri de proteine proteolitice, care pot degrada elastina, colagenul, cazeina, fibrina, etc. Majoritatea tulpinilor Pseudomonas aeruginosa elibereaz lipaze, esteraze, lecitinaze, ceramidaze, care agraveaz leziunile tisulare. Fosfolipaza C hidroli-zeaz fosfatidil colina din membranele celulare, avnd rol n patogeneza infeciilor severe. Exist i o fosfolipaz C hemolitic, rspunztoare de hemoliza observat pe medii cu snge. Fosfolipaza C inoculat intradermic produce eritem i edem. Enzimele extracelulare au un rol major n formarea leziunilor tisulare (de remarcat ectima gangrenosum, lezuni necrotice focale aprute n cursul septicemiilor cu Pseudomonas aeruginosa). Toxinele speciei Pseudomonas aeruginosa sunt variate: Exotoxina A - de natur polipeptidic - inhib sinteza proteinelor in vivo i in vitro, printr-un mecanism asemntor toxinei difterice (blocheaz factorul de elongare EF2, blocnd sinteza proteic prin fragmentul A). Are efect letal mai puternic dect endotoxina. Vaccinul preparat doar prin anatoxina A este slab protector n infeciile piocianice experimentale. Exotoxina S - este termostabil i apare ca un agregat necovalent ntre dou peptide ExoS i Exo T, codificate de cte dou gene separate. Producerea de ExoS a fost corelat cu capacitatea bacteriei de a disemina din zonele de colonizare epitelial, cauznd septicemii letale. ExoS inoculat n culturi de celule HeLa are un efect citotoxic puternic i efect antifagocitar. 165

Pentru unele izolate clinice care lezeaz epiteliul pulmonar in vivo s-a observat prezena ExoT i absena ExoS. Ulterior, pe lng ExoS i ExoT s-a descoperit o protein de 70 kda (ExoU), tot cu rol citotoxic. Se remarc asocierea ExoS i producerea de fosfolipaz C la fenotipurile foarte virulente. Bruno i colab. (1998), apreciaz faptul c ExoS este implicat n creterea morbiditii i mortalitii la subiecii cu fibroz chistic. Endotoxina (LPS) induce la om i animal efecte generale: febr, modificri vasculare, leucopenie, uneori oc endotoxic cu efect letal. LPS imprim relativa impermeabilitate a peretelui celular pentru antibiotice (factor suplimentar al rezistenei). Enterotoxina caracterizeaz unele tulpini de Pseudomonas aeruginosa care produc enterite acute. Enterotoxina are codificare plasmidic i d testul ansei ligaturate pozitiv. Citotoxina acid - este o protein tip leucocidin care acioneaz asupra membranei citoplasmatice a granulocitelor i limfocitelor, dar nu i asupra hematiilor. Sunt eliberate astfel enzime lizozomale cu efect proinflamator. Ali factori de patogenitate: pigmeni, siderofori, molecule semnal sau care imprim serorezistena. Pigmenii (8) contribuie la virulen prin stimularea formrii de anion superoxid i de ap oxigenat, cu efecte nocive asupra celulelor i chiar cu efect de tip bacteriocinic. Exemple: piocianina (pigment verde albastru caracteristic Pseudomonas aeruginosa), fluoresceina (pigment galben-verzui fluorescent), piorubina (pigment rou), piomelanina (pigment brun), clororafina, oxiclororafina. Toi pigmenii prezint activitate bacteriocinic. Pigmentogeneza este favorizat de aerobioz. Piocinele sunt bacteriocinele elaborate de ctre Pseudomonas aeruginosa. Sunt utilizate pentru tipizare n scopuri epidemiologice (piocinotipia). Sideroforii de tipul piochelinei leag fierul prezent n serul uman i contribuie la virulen prin stimularea metabolismului bacterian. Pseudomonas aeruginosa elaboreaz molecule semnal ca N-acyl homoserin lactona (AHL), cu rol n reglarea determinanilor de virulen ai acestor bacterii.

mbolnviri cauzate de Pseudomonas aeruginosa

166

Sunt favorizate de statusul imunodeprimant al pacientului i de manoperele medi-co-chirurgicale invazive. Infeciile cutanate supurative sunt nsoite de secreii purulente cu nuan verzuie; se suprainfecteaz plgile postoperatorii, arsurile, escarele de decubit, leziunile traumatice, ulcerele de gamb etc. Infeciile respiratorii - apar ca o consecin a intubaiilor, bronhoscopiilor; se manifest ca pneumonii, bronhopneumonii, bronite, pleurezii. Infeciile cronice cu Pseudomonas aeruginosa sunt prezente la 90% dintre pacienii cu fibroz chistic. Tulpinile bacteriene patogene izolate prezint mari cantiti de alginat (slime - polizaharid mucoid). Alginatul are un rol antifagocitar; exprimarea receptorilor F c pe neutrofile este inhibat de ctre alginat. Infeciile urinare sunt infecii nozocomiale i sunt recidivante. Infeciile oculare apar pe fondul unor traumatisme anterioare sau postoperator (conjunctivite, keratite, ulcere corneene). Infeciile digestive apar prin aciunea tulpinilor secretante de enterotoxin care produc enterite acute holeriforme. Alte infecii (otite, otomastoidite, sinuzite) apar la copii i la cei cu leziuni trauma-tice preexistente. Meningitele pot apare ca i o complicaie a otitelor. Dup operaii pe cord apar complicaii precum endocardite, pericardite, arterite. Septicemiile sunt generate de infecii profunde sau superficiale i au o gravitate cu totul deosebit (mortalitate 50%, reprezentnd 10% din septicemiile cu bacili gram- ). Rspunsul imun antiinfecios este preponderent umoral, manifestat la titruri nesemnificative i eficacitate sczut.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice Se recolteaz: secreii purulente, leziuni necrotice suprainfectate, secreii de la nivelul arsurilor, materii fecale, urin, lichid cefalorahidian, snge, sput etc. Pentru depistarea infeciilor nozocomiale se recolteaz probe din instalaii sanitare, produse medicamentoase, alimente i ap. Examen microscopic direct, proprieti morfotinctoriale: Evideniaz bacili mobili, colorabili gram negativ. 167

Izolare pe medii i proprieti de cultur: Se dezvolt bine pe medii uzuale, elibernd pigmenii caracteristici: - Pe ap peptonat (sau bulion) - se dezvolt uniform, cu pelicul de suprafa sub care se acumuleaz un pigment albastru-verzui; se degaj un miros aromatic de salcm. - Pe geloz simpl - apar colonii S, fluorescente cu eliminarea n mediu a unui pigment galben-verzui (miros aromatic). - Pe geloz snge - colonii S cenuii, lucioase care produc hemoliz, citocrom-oxidazo+. - Pe mediile AABTL, ADCL, Istrate Meitert apar colonii S mici, lactozo negative (verzi-albstrui), aderente de mediu (miros aromatic). - Pe mediu selectiv GSP - se izoleaz bacilul din alimente, ap; coloniile S sunt albastre-violet, nconjurate de o zon roie-violet. - Pe mediul Loeffler - se observ bine eliminarea de pigment i proteoliza. Pigmentogeneza este pronunat n aerobioz; exist ns i tulpini acromogene, care sunt ncadrate n gen pe baza proprietilor biochimice. Piocianina este un pigment solubil n cloroform, absolut caracteristic genului iar fluoresceina este solubil n ap (pigment necaracteristic, fiind produs i de ctre alte specii bacteriene). Caractere biochimice degradeaz glucoza oxidativ; este aerob, oxidazo+, catalazo-; este lactozo-, indol-, H2S-; testul rou - metil i Voges - Proskauer sunt negative; reduce nitraii la nitrii; ureaza i lizindecarboxilaza lipsesc, arginindehidrolaza e +; posed o intens activitate proteolitic (lichefiaz gelatina) i lipolitic; secret hemolizin termostabil i factori de patogenitate toxici i enzimatici; pigmentogeneza +; elibereaz mai multe tipuri de piocine. Structura antigenic - Conin antigenul O somatic, termostabil, lipopolizaharidic. - Antigenele H flagelare, proteice, termolabile. - Antigenele R - extrase din colonii S de Pseudomonas aeruginosa sunt diferite de antigenele O; sunt slab imunogene i slab aglutinogene; determin reacii ncruciate ntre diferite grupuri serologice O. 168

- Mucusul ( slime layer ) - este de natur polizaharidic, antigenic i foarte toxic pentru animale de experien. Substana mucoid (alginat) extras din colonii mucoase, frecvent ntlnit n infeciile cronice ale aparatului respirator. Lizotipia: Pentru scopuri epidemiologice, se practic tipizarea prin piocine (piocinotipia) sau prin bacteriofagi (lizotipia) - 13BF. Serotipia: realizeaz tipizarea pe baza antigenelor O termostabile, prin reacii de aglutinare (22 grupuri serologice). Proprieti de patogenitate Inocularea cobaiului sau oarecelui pe cale intraperitoneal cu o tulpin virulent produce peritonit acut, septicemie i moarte. Inocularea subcutanat determin edem local, hiperemie i necroz. Inocularea pe cornee produce ulceraii i reacii inflamatorii. Enterotoxina poate fi testat prin testul ansei ligaturate (la iepure) sau prin efectul citotoxic n culturi de celule. Tratament, antibiograma Antibiograma este obligatorie deoarece genul este multiplu rezistent la diferite antibiotice. Se remarc sensibilitatea la Polimixine, la lactamine anti Pseudomonas (Carbenicilina, Sulbenicilina, Ticarcilina, Ureidopenicilina, Mecilinam, Piomecilinam, Piperacilina, Furazlocilina, Nocardicin A). Eficiente sunt i Cefalosporinele (Cefsulodin, Ceftazidime) i aminoglicozidele (Gentamicina, Tobramicina, Amikacina, Sisomicina).

Profilaxia
Vizeaz n special prevenirea infeciilor nozocomiale (dezinfecia saloanelor, a slilor de baie, aplicarea msurilor de asepsie i antisepsie n orice manoper medico-chirurgical). Imunoprofilaxia.

169

CAPITOLUL 23 GENUL VIBRIO

Caractere generale
Aparine familiei Vibrionaceae; cuprinde bacili gram negativi incurbai (aspect de virgul), flagelai - flagelul polar (frecvent) sau flageli laterali; Facultativ anaerobi i oxidazo +. Au ca habitat mediile acvatice bogate n sruri minerale; exist specii patogene pentru om, dar i pentru fauna local (peti, molute etc.).

Reprezentani
Vibrio cholerae (serotip O1: Inaba, Ogawa, Hikojima), biotip El Tor sau non grup O1 - NAG (neaglutinogeni cu serul anti O1). Vibrio metschnikowii. Vibrio parahaemoliticus. Vibrio alginoliticus, fluvialiss, vulnificus etc.

Vibrio Cholerae Aspecte clinico-patogenetice

Cauzeaz holera, o gastroenterocolit acut febril, cu un important sindrom de deshidratare (15 l/24 ore), care pune n pericol viaa bolnavului. Vibrionul este lipsit de capacitate invaziv (nu ptrunde n epiteliul intestinal) dar enterotoxina bimodal produce modificrile fiziopatologice caracteristice, prin transformarea celulei intestinale - din celul absorbant de ap i electrolii, n celul secretoare de ap i electrolii (prin stimularea adenilat ciclazei). Vibrio cholerae autentic (clasic) aparine serotipului O1 i produce formele grave de boal. Biotipul El Tor (O1) produce forme clinice mai uoare, cu letalitate sczut.
Tabelul nr. 12 - Diferenierea biotipurilor Vibrio cholerae i El Tor (dup Ivanov) Testul Aglutinarea hematiilor de gin Producerea de hemolizin solubil Sensibilitatea la Polimixin Sensibilitatea la BF de grup IV Biotipul V. CHOLERAE V. EL TOR + + + + -

170

Holera evolueaz epidemic sau chiar pandemic. Exist un numr semnificativ de purttori, mai ales pentru biotipul El Tor, care constituie principala surs de infecie; la aceasta se adaug persistena vibrionilor n mediul acvatic.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice - materii fecale (au aspect riziform - zeam de orez); - lichid de vrstur; - la purttori se recolteaz scaun de purgaie salin; - probe de ap potabil, alimente, ap de canal etc. Diagnostic microscopic direct, proprieti morfotinctoriale - vibrioni gram negativi cu dispoziie necaracteristic; - vibrionii sunt mobili n preparat nativ. Izolarea pe medii, proprieti de cultur Cresc pe medii simple, dar au nevoie de un pH alcalin; - Pe ap peptonat alcalin (pH 9,21) - prezint o turbiditate slab, cu formarea unui vl de suprafa; - Pe mediul BSA (agar cu sruri biliare) - colonii S transparente, uguiate. Identificarea - se realizeaz pe baza proprietilor morfotinctoriale, de cultur, biochimice, antigenice etc. Proprieti biochimice - Testul indofenoloxidazei este + (se aplic testul cu reactiv asupra unei colonii suspecte; dac testul se pozitiveaz se realizeaz apoi aglutinarea cu ser anti O1); - Testul indol +; - Testul nitratreductazei +; - Testul fermentrii carbohidrailor difereniaz 6 tipuri biochimice. Tipul I Heiberg este caracteristic vibrionilor holerici.

171

Tabelul nr. 13 - Schema Heiberg ZAHARURI zaharoz manoz arabinoz I + + GRUPA DE FERMENTARE (HEIBERG) II III IV V VI + + + + + + + -

172

Testul striului + (String test) - cultura de studiat se emulsioneaz pe lam n soluie de dezoxicolat de sodiu i soluie salin fiziologic. Prin ridicarea ansei de pe lam apare (n maxim 60 secunde) un filament mucos. Caractere antigenice Vibrionii holerici posed antigene O i H; Antigenele H flagelare sunt comune; Antigenele O prezint subfraciuni (A, B, C, ..., M) care determin 6 grupuri serologice; O1, O2, ..., O6. Vibrionii holerigeni aparin serotipului O1 (aglutineaz cu ser O1); Grupul O1 are subtipuri serologice, funcie de combinarea fraciunilor A+B+C : - tipul I: Ogawa (A+B); - tipul II: Inaba (A+C); - tipul III: Hikojima (A+B+C); - tipul IV: fr nume (A). Caractere de patogenitate Sunt date de capacitatea de multiplicare local i toxinogenez, care poate fi investigat prin testul ansei ileale ligaturate la iepure. Bacteria prezint un factor antigenic de colonizare (cu rol n aderena de glicoproteinele intestinale), dar i endotoxin (specific bacteriilor gram negative). Lizotipia - evideniaz 6 lizotipuri. Antibiograma, tratament Vibrionii holerici sunt sensibili la Tetracicline, Cloramfenicol, Nitrofurani, Sulfamide. Reechilibrarea hidroelectrolitic prezint obiectul terapeutic primordial.

Profilaxia
n anul 1913, I. Cantacuzino a realizat i utilizat vaccinul antiholeric, coninnd tulpini bacteriene inactive, cu eficacitate de 30 50%. Actualmente se utilizeaz vaccinul antifragment B al toxinei holerice (mai eficient).

173

CAPITOLUL 24 GENUL CAMPYLOBACTER

Caractere generale
Genul cuprinde bacterii gram negative n form de S sau spiralate, mobile datorit flagelului polar. Este ncadrat n familia Spirillaceae. Majoritatea speciilor genului produc infecii la animale. Infeciile umane apar accidental, dup ingerarea apei sau alimentelor contaminate.

Reprezentani
Campylobacter foetus - subspecia jejuni/coli i subspecia intestinalis; - sunt principalii ageni etiologici ai infeciilor la om; Campylobacter sputorum - subspeciile: bubulus, mucosalis, concisus; Campylobacter fecalis; Campylobacter foetus - subspeciile foetus i venerealis. Not: Ultimii trei reprezentani produc infecii la animale.

Aspecte clinice i patogenetice

Gastroenterita este cel mai frecvent tip de infecie uman, n special la copii. Evolueaz asemntor dizenteriei (mecanism enteroinvaziv). Enterotoxina termolabil a speciei Campylobacter foetus nu este nc pe deplin caracterizat; toate speciile conin endotoxin. Bacteriile genului pot produce meningite, artrite, septicemii, avort spontan i ocazional infecii de tract urinar, la subiecii cu status imunitar sczut (n special Campylobacter foetus). Rezervorul bacterian l reprezint psrile i animalele domestice, dar i omul bolnav, convalescent sau purttor sntos. Factorii favorizani i constituie vrsta (0-2 ani), sezonul cald, profesiunea (zootehniti).

Diagnostic de laborator
Recoltare Materii fecale. Examen microscopic Preparat nativ, pe fond ntunecat sau frotiu colorat Gram, Giemsa.

174

Izolarea Pe medii mbogite (bulion Oxoid), selective (Campy I. C. suplimentat cu snge de berbec 7-10% i amestec de antibiotice etc.). Se incubeaz n atmosfer microaerofil. Temperatura optim de incubare este de 42 - 43C pentru Campylobacter jejuni/coli i 25C pentru Campylobacter foetus. Proprieti biochimice Campylobacter jejuni/coli este catalazo + i oxidazo +; Hidroliza hipuratului este pozitiv (+) la Campylobacter jejuni i negativ (-) la Campylobacter foetus. Diagnostic serologic RFC. ELISA. Reacii de aglutinare.

Tratament
Cu aminoglicozide, hidroelectrolitic. macrolide; se face rehidratarea

Helicobacter pylori Aspecte clinico-patogenetice

Cu denumire anterioar Campylobacter pylori; este un spiril gram negativ, ureazo pozitiv. Este prezent la nivelul mucoasei gastrice la 20% dintre persoanele cu vrsta sub 30 ani i la 40 - 60% dintre subiecii cu vrste peste 60 ani. Prevalena infeciei este mai mare n rile n curs de dezvoltare (80%), la clasele sociale defavorizate i la sexul masculin. Infecia cu Helicobacter pylori este una dintre cele mai frecvente infecii cronice umane. Helicobacter pylori produce gastrite, ulcer gastroduodenal i este de asemenea asociat cu dezvoltarea cancerului gastric. Studii recente au demonstrat c 8 hidroxideoxiguanozina (observat i n carcinogeneza hepatic i renal), prezint nivele crescute la pacienii infectai cu Helicobacter pylori. Enzima constituie un marker pentru ADNul lizat. Factorii de patogenitate bacterieni: citotoxine, hemaglutinine, hemolizine, fosfolipaze, proteaze i ureaza contribuie la realizarea leziunilor tipice gastro-duodenale, leziuni n piedestal, de fapt eroziuni ale mucoasei. 175

Diagnostic de laborator
Examenul microscopic Efectuat n coloraii speciale (Giemsa, impregnare argentic, coloraii cu verde de metil) evideniaz forme bacteriene spiralate. Examenul microscopic al fragmentului biopsic gastro-duodenal poate evidenia prezena leziunilor n piedestal i prezena bacteriilor. Acurateea examenului histologic este crescut, dar metoda este invaziv. Izolare pe medii Dificil de realizat, pe medii mbogite (agar Columbia cu 18 aminoacizi, snge i vitamine n atmosfer microaerofil). Proprieti biochimice Testul ureazei intens +. Proprieti antigenice Posed antigenele O i H. Diagnostic serologic Evidenierea IgM sau IgG anti Helicobacter pylori (testele sunt noninvazive). Alte teste: - Crete nivelul lactoferinei n sucul gastric; - Crete nivelul IL8 i al oxidului nitric la persoane cu gastrit Helicobacter pylori+, spre deosebire de pacienii cu gastrite de alt etiologie.

Tratament
Scheme terapeutice care includ asocieri ntre Amoxicilin, Clarithromycin, Tetraciclin i Metronidazol, scheme care completeaz tratamentul ulcerului gastro-duodenal.

176

CAPITOLUL 25 GENUL CORYNEBACTERIUM

Caractere generale
Speciile genului fac parte din microbiocenozele pielii, cavitii nazo i orofarin-giene, tractului urogenital i intestinal, fiind denumite cu termenul de bacili difteromorfi (comensali i condiionat patogeni). Specia patogen pentru om este Chorynebacterium diphteriae. Bacteriile genului sunt bacili gram pozitivi la limit, cu extremiti bombate (n mciuc) prin prezena corpusculului metacromatic, cu aezare caracteristic sub forma literelor chinezeti sau n palisade.

Reprezentani:
Chorynebacterium diphteriae (gravis, mitis, intermedius); Chorynebacterium hofmanii; Chorynebacterium xerosis; Chorynebacterium cutis; Chorynebacterium ulcerans; Chorynebacterium pseudodiphtericus.

Chorynebacterium diphteriae Aspecte clinice i patogenice

Difteria este o angin cu false membrane, produs de ctre speciile toxigene. Toxina difteric este produs numai n urma conversiei lizogene cu bacteriofagul tox, care conine n genomul su gena necesar pentru sinteza toxinei. Strauss i Pappenheimer jr. au demonstrat faptul c exotoxina difteric are o structur bimodal: - fragmentul B cu GM 38.000 are rol n ataarea i ptrunderea n celul prin intermediul receptorilor specifici; - fragmentul A cu GM 24.000 deine rolul toxic propriu-zis, prin blocarea sintezei proteice n celula infectat (ribozileaz i inactiveaz factorul de elongare EF2 al sintezei proteice).

177

Poarta de intrare bacterian este cea respiratorie. Bacteriile ptrund n celulele epiteliale, se multiplic, elibereaz exotoxine, care produc un efect citocid. Angina febril este nsoit de false membrane aderente, sngernde, care pot produce insuficien respiratorie. De la poarta de intrare, exotoxina difteric difuzeaz n organism, producnd lezarea sever a mai multor organe: cord (miocardita), ficat, rinichi, glande suprarenale, sistem nervos (paralizii, polinevrite), care de asemenea pun n pericol viaa bolnavului. Din aceast cauz, tratamentul difteriei este cel cu ser imun antitoxin difteric (imunoglobulinele antifragment B mpiedic ptrunderea toxinei n celul). Difteria cutanat apare prin colonizarea tegumentului cu bacili difterici toxigeni i/sau nontoxigeni. Aceast form clinic de boal (ulceraii cutanate) apare mai ales n zonele umede i calde ale globului, dup nepturi de insecte. Chorynebacterium diphteriae rmne cantonat n leziuni i nu disemineaz hematogen. Eventual, exotoxina sa poate produce efecte necrotice locale, prin absorbia n esuturi. Bacilii difterici se pot cantona i pe mucoase, spre exemplu mucoasa ocular sau vulvar. Ulceraii cutanate produc i bacilii difteromorfi (Chorynebacterium ulcerans, Chorynebacterium xerosis, Chorynebac-terium cuttis), mai ales la persoane imunodeficiente. Chorynebacterium minutissima este agentul etiologic al eritrasmei, cu apariia unor plci cutanate solzoase. Chorynebacterium vaginalis produce uretrite i vulvovaginite. Chorynebacterium parvum, fr patogenitate, este folosit n componena preparatelor imunostimulante (utilizate n terapia antitumoral i antiviral).

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice Se face n funcie de forma clinic de boal sau stadiul acesteia. exudat nazal i faringian la purttori; exudat nazofaringian, fragmente de fals membran; secreie nazal, vulvar, otic sau secreie de la nivelul leziunii cutanate. Diagnosticul microscopic, proprieti morfotinctoriale Chorynebacterium diphteriae: Bacili (2 - 5 m lungime) gram + la limit, cu extremiti bombate (forma de halter sau de picot) din cauza corpusculului metacromatic Babe - Ernst, aezai sub forma literelor chinezeti. 178

Corpusculul metacromatic reprezint o rezerv nutritiv i se poate evidenia cu ajutorul unor coloraii speciale: ex. Neisser. n aceast coloraie, corpusculii metacromatici apar albastru - nchis, n timp ce corpul bacterian apare n galben - brun, cu aceeai dispoziie caracteristic bacterian. Bacilii pseudodifterici - bacili ascuii sau mciucai, cu aspect tigrat, fr corpusculi, aezai n palisade. Izolarea pe medii, proprieti de cultur Mediul OCST - este mediul de mbogire (lichid); Mediul Tinsdale - este mediul selectiv pentru bacilii difterici, care se dezvolt (de la nceput) sub forma coloniilor R (floare de margaret); - Coloniile bacililor difterici sunt R, negre, cu halou brun; - Coloniile difteromorfilor sunt amestecuri de colonii R i S, negre, fr halou brun. Mediul Loeffler - este electiv i permite dezvoltarea rapid a bacilului difteric (12-18 ore). Pe acest mediu se repic coloniile suspecte, pentru a realiza cultura stock din care se realizeaz ulterior identificarea. Mediul Gndel-Tietz - difereniaz coloniile de Chorynebacterium diphteriae gravis (margarete friabile), mitis (colonii convexe, cremoase), intermedius (colonii plate, semicremoase). Chorynebacterium diphteriae gravis produce cele mai grave forme de boal. Geloza snge - mediul este utilizat pentru tulpini eventual inhibate de telurit i pentru izolarea streptococului hemolitic cu care poate coexista. Identificarea se realizeaz pe baza proprietilor morfotinctoriale, de cultur i biochimice, antigenice i de patogenitate. Caractere biochimice Bacteriile sunt aerobe i microaerofile. Bacilii difterici prezint: - testul H2S +; - testul ureazei -. Bacilii difteromorfi au: - testul H2S -; - testul ureazei +. Chorynebacterium ulcerans: - testul H2S +; - testul ureazei +. Diferenierea speciilor bacteriene n cadrul genului se face prin teste de degradare a zaharurilor. Chorynebacterium diphteriae: 179

- fermentarea glucozei +; - fermentarea zaharozei -; - fermentarea dextrinei +. Bacili difteromorfi: - fermentarea glucozei +; - fermentarea zaharozei +; - fermentarea dextrinei -. Proprieti de patogenitate Investigheaz capacitatea de toxinogenez prin teste de patogenitate in vitro, vivo. Teste in vivo Dermonecroza la iepure (testul Frazer) - bacilul difteric toxigen provoac animalului o escar umed. Inocularea la cobai Neprotejat prin ser specific: animalul moare n 24 - 96 de ore cu leziuni caracteristice: - edem gelatinos la locul inoculrii; - revrsate sanguinolente n seroase; - hipertrofia i hiperemia suprarenalelor. (1 DLM = 1 doz letal minim - reprezint unitatea de msur pentru toxina difteric in vivo). 1 DLM = Cantitatea de toxin care omoar un cobai de 250 g n 4 zile, cu leziunile caracteristice; Cobaiul protejat cu ser antitoxic supravieuiete. Teste in vitro Testul ELEK - Determin elaborarea de exotoxin printr-o reacie de precipitare n gel, care este pozitiv doar la tulpinile toxigene. Reacia de floculare RAMON - Msoar concentraia toxinei difterice, cunoscnd valoarea antitoxic a unui ser antidifteric sau invers. 1 lf = o limit floculant - reprezint unitatea de msur a exotoxinei difterice in vitro; 1 lf precipit (reacia AG - AC +) n prezena 1 UA (o unitate antitoxic de ser); 1 UA - reprezint cantitatea de ser antidifteric care neutralizeaz 100 DLM. Diagnostic indirect Serologic: Hemaglutinarea pasiv - reacia testeaz starea imunitii antidifterice n colectiviti; Reacia de seroneutralizare - se execut cu acelai scop. 180

Biologic: Intradermoreacia Shick - este o reacie de neutralizare toxinantitoxin, care investigheaz starea imunitii antidifterice in vivo. Reacia Shick pozitiv - (eritem cu > 10 mm) la nivelul antebraului inoculat i.d.r. cu 0,2 ml de toxin (coninnd 1/50 DLM) - arat faptul c persoana respectiv nu are anticorpi specifici neutralizani (AC sub titrul minim protector de 0,03 UA/ml ser). Persoanele cu reacia Shick pozitiv trebuie revaccinate antidifteric. Reacia Shick negativ - subiectul nu este susceptibil la infecia difteric (toxina este neutralizat prin AC protectori).

Tratament
Tratamentul difteriei toxigene se face obligatoriu cu ser antitoxic (care conine anticorpi specifici).

Profilaxie
Vaccinarea antidifteric este obligatorie, cu vaccinuri monovalente (ADPA) sau multivalente (DT, DTP). Anatoxina difteric este purificat i adsorbit pe suport mineral (fosfat de aluminiu). Chimioprofilaxia la contaci cu Eritromicin la contaci.

181

CAPITOLUL 26 GENUL LYSTERIA

Caractere generale
Lysteria monocytogenes este larg rspndit n natur, n rezervoare animale: mamifere (ovine, bovine), psri, reptile, peti. Boala este o antropozoonoz. Omul se contamineaz n mod accidental, n special prin consumul alimentelor contaminate: lapte, brnzeturi. Listerioza nou-nscutului apare dup contaminarea transplacentar sau n timpul naterii. Formele clinic manifeste apar preponderent la persoane cu status imun diminuat sau la vrstele extreme (ex.: nou-nscut). Rata de mortalitate la aceste persoane este de 30% pn la 60%, la adult i 54 90% la nou-nscut. Bacteriile sunt bacili mici gram pozitivi, polimorfi, mobili, catalazo pozitivi, microaerofili, cu parazitism facultativ intracelular, n celule fagocitare i endoteliale.

Reprezentani, infecii produse

Lysteria monocytogenes: - patogen pentru om i animale; - listerioza neonatal (meningita); - listerioza adultului (meningoencefalita, endocardita). Lysteria innocua: - nepatogen. Muraya grayi: - nepatogen.

bacteriemia

Aspecte clinoco-patogenetice
Microorganismul este patogen prin multiplicare, invazivitate i producere de factori de patogenitate. Parazitismul este celular facultativ. Intervalina este o protein bacterian membranoas care favorizeaz penetrarea intracelular. Internalizat, bacteria se multiplic n citoplasm, dup distrucia membranei fagolizozomului de ctre listeriolizina O (toxin cu proprieti hemolitice, considerat factorul major al virulenei acestei specii). Fosfolipazele bacteriene realizeaz distrucia membranei citoplasmatice a celulei infectate, favoriznd rspndirea bacteriei nspre celulele indemne. Mecanismul de infectare din aproape n aproape reprezint un sistem de evadare al bacteriei de sub aciunea anticorpilor specifici. 182

Rspunsul imun antiinfecios este preponderent celular viznd mecanismele citotoxicitii. Microscopic se observ leziuni necrotice perivasculare i infiltrate celulare mononucleare i polinucleare. Meningita nou-nscutului apare n primele 3 sptmni de via (contaminare transplacentar sau vaginal) i evolueaz fulminant. Listerioza gravidei determin avort spontan. Listerioza adultului se manifest ca: meningit n 55% dintre cazuri (la canceroi sau transplantai renal), bacteriemie (la aproximativ 25% dintre pacieni) i endocardit la 7% dintre pacieni. Gravitatea sindromului clinic este proporional cu gravitatea imunosupresiei.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice Funcie de localizarea infeciei: snge, lichid cefalorahidian etc.; Alimente contaminate. Examenul microscopic direct, proprieti morfotinctoriale Evideniaz forme cocoide sau cocobacilare gram pozitive (pleiomorfe), mobile datorit flagelilor peritrichi. Izolare pe medii, proprieti de cultur Pe medii cu snge, n atmosfer microaerofil, dup incubare la temperaturi de 20-30C. Coloniile sunt S, minuscule (pictur de rou), nconjurate de o zon de hemoliz. Culturile prezint un miros caracteristic de lapte acidulat. Pe mediul MIU prezint mobilitate exprimat (dezvoltare cu aspect de umbrel ntoars). Pe medii celulare cultivarea se realizeaz pe ou embrionat i n cultur de macrofage infectate. Dificultile de izolare ale bacteriilor din esuturile infectate pun n eviden prezena formelor L (fr perete celular). Diagnostic biochimic Catalaza. Microaerofilia. Nu lichefiaz gelatina. Nu produce indol. Nu reduce nitraii. Prezint aciune fermentativ asupra unor carbohidrai. 183

Proprieti antigenice Lysteria prezint antigene i flagelare (14-15 tipuri). Serotipul I este mai frecvent ntlnit n Europa de Est. Serotipul IV este mai rspndit n Europa de Vest i SUA. Proprieti de patogenitate Animalele de experien (oarecii), inoculate internazal fac meningit i hepatit necrozant cu moartea a 20% dintre animale n 14 zile. Inocularea animalelor pe cale parenteral le omoar n 3-7 zile n proporie de 90% cu apariia leziunilor granulo-matoase i necrotice n diverse organe. Introducerea filtratului de cultur n sacul conjunctival al iepurelui i provoac acestuia o conjunctivit purulent. De asemenea, cobaii sunt receptivi la infectarea pe cale conjunctival. Diagnosticul serologic Ofer informaii relative, prin compararea a dou sau trei probe de ser, la intervale de 15 zile. Se efectueaz: Reacia de aglutinare (titrul > 1/160 este suspect); RFC; Hemaglutinarea indirect; ELISA. Serologia negativ nu exclude un eventual diagnostic pozitiv. Anticorpii anti Lysteria nu sunt protectori.

Tratament
Cu lactamine, Eritromicin i Cloramfenicol.

Profilaxie
Msuri de ordin epidemiologic (pasteurizarea laptelui, brnzeturilor etc.).

184

CAPITOLUL 27 GENUL BACILLUS

Caractere generale
Genul cuprinde 48 de specii, dintre care Bacillus anthracis extrem de patogen (agentul etiologic al antraxului). Bacteriile genului sunt bacili gram pozitivi, cu spor localizat central, imobili, aerobi (cteva specii sunt facultativ anaerobe). Bacillus anthracis este i capsulat, cu aezare caracteristic (dispunere n lanuri).

Reprezentani, infecii produse:

Bacillus anthracis - anthrax (antropozoonoz); 25 000-100 000 cazuri noi anual pe glob; Bacillus cereus - toxiinfecii alimentare, bacteriemii, pneumonii; Bacillus subtilis - toxiinfecii alimentare, meningite, iridociclite, panoftalmii, sinuzite cronice. Sinteza bacteriocinelor: Bacillus licheniformis - productor de bacitracin; Bacillus polymyxa - sintez polimixine; Bacillus brevis - sinteza gramicidinei i tirocidinei, etc.

Aspecte clinico-patogenetice
Bacillus antracis - deine importani factori de virulen: Capsula - este de natur polipeptidic, (polimer de acid Dglutamic), reprezentnd antigenul K (un singur tip antigenic). Are rol antifagocitar i este codificat plasmidic (pXO2). Antigenul somatic - reprezint un polizaharid din peretele celular, alctuit din D-galactoz i N-acetilglucozamin. Produce reacii imunologice ncruciate cu 14 tipuri antigenice de polizaharid capsular pneumococic. Exotoxina este complex, bimodal, determinat plasmidic (pXO1), antigenul protector (capabil s induc producerea de anticorpi specifici) se leag de membrana celulei int, facilitnd aciunea celorlalte componente: factorul de edem i factorul letal. Factorul de edem produce edem local i inhibarea funciilor PMN, n timp ce factorul letal produce moartea celulei afectate. Acumularea toxinei n esuturi produce anoxia. 185

Principalele forme clinice ale antraxului sunt: antraxul cutanat, pulmonar, gastrointestinal sau generalizat (dup bacteriemie). Antraxul cutanat este forma cea mai frecvent ntlnit, aprnd la nivelul unui traumatism cutanat (fa, gt, membre), prin care ptrund sporii. Papula se acoper cu o crust neagr, edematoas (pustula malign, crbunele cutanat). Antraxul pulmonar apare prin inhalarea sporilor bacterieni. Pneumonia se complic cu insuficien respiratorie acut. Antraxul gastrointestinal se manifest ca o toxiinfecie alimentar. Complicaia de temut o reprezint septicemia i meningita secundar. Rata de mortalitate este foarte mare. Anticorpii protectori sunt anticapsulari i antitoxici. Boala este o antropozoonoz, afectnd preponderent persoanele care lucreaz n sectorul zootehnic. Bacillus cereus - produce o toxiinfecie alimentar asemntoare toxiinfeciei alimentare stafilococice (incubaie scurt, vrsturi) sau clostridiene (crampe, sindrom diareic). Enterotoxina bacterian se elibereaz n aliment (de natur cerealier). Fosfolipaza C hidrolizeaz lecitina din alimente, producnd fosforilcolin intestinal activ. Este un germen necapsulat i produce hemolizine active ( hemoliza). Complicaiile bolii de baz sunt septicemiile cu localizri ulterioare pulmonare i meningeale, care apar preponderent la imunodeprimai. Tratamentul eficient vizeaz Clindamicina, Aminoglicozidele, Macrolidele. Bacillus subtilis - produce toxiinfecie alimentar sau septicemie (la consumatori de droguri inoculate pe cale intravenoas). Penicilina reprezint tratamentul de elecie. Alte specii sporulate sunt implicate n contaminarea materialelor sterile i de laborator - n spitale.

Diagnostic de laborator n antrax

Recoltarea prelevatelor biologice exudat vezicular sau lichid de edem n crbunele cutanat; sputa n antraxul pulmonar; materii fecale - n antraxul gastrointestinal; snge n bacteriemii; fragmente de organe pentru diagnosticul retrospectiv. Examenul microscopic direct, proprieti morfotinctoriale 186

Frotiu din produs patologic, colorat Gram: bacili mari, gram pozitivi, imobili, cu capete tiate drept, aezai n lanuri (streptobacili). Coloraiile speciale evideniaz capsula sau sporul central, care nu deformeaz celula bacterian. Pot aprea i spori liberi. Izolarea, proprieti de cultur Pe medii lichide - pentru izolarea Bacillus anthracis din prelevat biologic contaminat cu flora de asociaie: se inoculeaz n bulion, se incubeaz 24 de ore la 37C, se adaug fenol 1-3% timp de 30 (pentru inhibarea florei respective) i se nsmneaz pe geloz simpl sau pe geloz snge. Pe medii lichide se dezvolt sub form de flocoane. Pe medii solide - colonii mari, rugoase (R) cu aspect tipic de coam de leu sau cap de meduz. Prin cultivarea Bacillus anthracis la 42,5 C se obin colonii S avirulente, care se utilizeaz la prepararea vaccinului anticrbunos (tulpinile Pasteur I, II). Pe geloz dreapt se dezvolt sub forma unui brad inversat. Este dificil de realizat un diagnostic diferenial ntre Bacillus cereus i Bacillus anthracis privind caracterele morfotinctoriale i de cultur. n acest scop cercetm sensibilitatea germenilor fa de Penicilin i fa de bacteriofagul specific (gamma): Bacillus anthracis este sensibil att la Penicilin, ct i la bacteriofag. Pe mediul selectiv PLET (polimixin, tiamin, lizozim, EDTA) bacilul crbunos crete, iar Bacillus cereus nu se dezvolt. Identificarea se realizeaz pe baza proprietilor morfotinctoriale, de cultur, biochimice, antigenice. Proprieti biochimice Indol negativ; Reduce nitraii; Zaharolitic, slab proteolitic; Lichefiaz gelatina, hidrolizeaz cazeina; Produce acetil metil carbinol (Bacillus anthracis). Proprieti antigenice Antigen capsular (K); Antigen proteic i polizaharidic de perete celular. Reacia de precipitare inelar Ascoli - evideneaz antigenele crbunoase utiliznd ser anti Bacillus anthracis. Recia este folosit n diagnosticul retrospectiv al animalelor moarte prin crbune. 187

Proprieti de patogenitate oarecele sau cobaiul inoculat cu filtrat de cultur fac o septicemie cu sfrit letal n una-trei zile. Autopsia evideneaz un edem gelatinos la locul inoculrii i congestia organelor interne. Se fac amprente de splin de oarece - care se coloreaz Gram i astfel se evideniaz bacilii mari, capsulai. Infecia experimental la oarece este obligatorie pentru diagnostic. Patogeneza infeciei la animale Anthraxul apare mai frecvent la ierbivorele domestice, care se infecteaz prin consumul furajelor contaminate cu spori bacterieni. Animalele bolnave recontamineaz apa i solul prin fecale, urin, cadavre. Sporii rezist 20-30 de ani pe sol (cmpiile morii). Astfel se retransmite infecia la ierbivore. Diagnosticul serologic Anticorpii specifici se detecteaz prin: imunodifuzia n gel, reacia cu fixare de complement, reacii de hemaglutinare. Diagnosticul indirect biologic Intradermoreacia Blteanu-Toma pune n eviden starea de sensibilizare a organismului fa de antigenele bacilului crbunos. Tratament Bacillus anthracis este foarte sensibil la Peniciline. n caz de alergie la aceste substane se administreaz Tetracicline sau Macrolide, chiar i Sulfamide. n cazuri grave se administreaz serul antitoxic anticrbunos. Bacillus cereus reacioneaz la Clindamicin, Aminoglicozide, Macrolide. Bacillus subtilis este sensibil la diferite lactamine.

Profilaxie
Msuri de ordin epidemiologic pentru prevenirea contaminrii persoanelor din sectorul veterinar. Resturile animalelor moarte de anthrax trebuie arse sau ngropate n containere speciale, pentru prevenirea contaminrii solului. Imunizarea activ mpotriva vaccinului crbunos - vaccinul Pasteur (obinut prin cultivarea Bacillus anthracis la 42 - 43C), conine tulpini netoxigene capsulate (au anihilat efectul plasmidei pOX 1); astfel de tulpini nu induc totui imunitatea protectoare. 188

Sterne (1937) i Isopescu (1949) au elaborat un vaccin din tulpini necapsulate, edematogene (toxigene), utilizat pentru vaccinarea eptelului. Vaccinurile moderne conin tulpini nevirulente (necapsulate, netoxigene) prin anihilarea efectelor ambelor plasmide (pOX1 i pOX2). Alt tip de vaccin este preparat din spori, din tulpini necapsulate sau chiar din componentul protector al toxinei crbunoase (component care poate induce rspuns imun protector). Vaccinoprofilaxia la om nu este obligatorie. Se aplic doar experimental la persoane expuse infeciei (ngrijitori de animale, medici veterinari, muncitori din industria pielriei).

189

CAPITOLUL 28 ANAEROBI SPORULAI GENUL CLOSTRIDIUM

Caractere generale
Genul cuprinde peste 60 de specii, bacili gram + sporulai, anaerobi, mobili (cu excepia Clostridium perfringens care e capsulat). Majoritatea speciilor sunt comensale (n intestinul omului i animalelor). Pot contamina solul prin spori.

Reprezentani, infecii produse

Clostridium perfringens: - gangren gazoas (n asociere cu alte specii Clostridiale); - toxiinfecii alimentare (tip antigenic A i C); - enterita necrozant (tip antigenic C); - septicemii, endometrite post partum, postabortum; - celulite localizate, infecii de plag chirurgical, abcese cerebrale, abdominale. Clostridium tetani: - tetanos. Clostridium botulinum: - botulism. Clostridium difficile: - enterocolit pseudomebranoas (necrozant, letal). Clostridium histolyticum Clostridium septicum Clostridium sporogenes - gangrena gazoas Clostridium novyi - stare septic Clostridium bifermentans Clostridium sordelli, etc.

Patogenez, aspecte clinice

Clostridium perfringens i germenii gangrenei gazoase Cel mai virulent factor de patogenitate l constituie toxina, o lecitinaz cu efect dermonecrotic, hemolitic i letal. Tipul antigenic A produce cele mai mari cantiti de toxin. toxina produce necroze i este letal pentru cobai; nu produce hemoliza. Este produs preponderent de tipurile B i C. 190

 toxina este hemolitic pentru eritrocitele unor specii animale, este letal pentru animalele de laborator; produs preponderent de tipurile B i C. toxina (teta toxina) produce o hemolizin (oxigen labil) pentru eritrocite provenite de la animale de experien i este produs preponderent de tipul C. Tipurile antigenice A, B, D, E produc cantiti mici de teta toxin. (epsilon) toxina produce dermonecroz dup inocularea la cobai este produs preponderent de ctre tipurile B i D. k (kappa) toxina este o colagenaz i o gelatinaz letal i necrotizant, produs de ctre tipurile patogenice A, C, E. (lambda) toxina este o enzim proteolitic cu un spectru larg de activitate: distruge gelatina, hemoglobina (tipurile B, E i unele tulpini ale tipului D). (gamma) toxina este letal pentru animalele de laborator. Dezoxiribonucleaza Hialuronidaza, neuraminidaza reprezint factori de difuziune ai infeciei Fibrinolizina Enterotoxina rspunztoare pentru producerea toxiinfeciilor alimentare este termolabil i produs de ctre tipurile antigenice A i C. Se sintetizeaz n intestinul gros i este eliberat n timpul sporulrii C. perfringens. Toxina are efect emetic i chiar letal, producnd eriteme la animalele de experien. Gangrena gazoas - rezult n urma contaminrii plgilor profunde cu spori ai Clostridium perfringens, Clostridium oedematiens (novyi), Clostridium septicum, Clostridium hystoliticum, Clostridium sporogenes. Local apar edeme dure, crepitante (cu apariia unor mari cantiti de gaze, elaborate n urma fermentrii zaharurilor) i gangren (necroz). Toxinele i enzimele favorizeaz diseminarea infeciei, cu apariia septicemiei cu efect letal. Clostridium hystoliticum provoac liza esuturilor, prin intermediul unei colagenaze, fibrinaze, proteaze, lipaze, exopeptidaze, decarboxilaze. Efectul toxic apare prin , , si toxine. Clostridium septicum produce , , toxine. Clostridium sporogenes poteneaz virulena Clostridium perfringens i Clostridium septicum n culturi (prin proteoliz). Toxinfecia alimentar - este caracterizat prin dureri abdominale i diaree aprute la 8-24 de ore dup consumul alimentului contaminat cu Clostridium perfringens tip A. Efectul letal apare la pacieni vrstnici i subnutrii.

191

Enterita necrozant - produs de Clostridium perfringens tip C, sintetizator de toxin, reprezint o form grav de toxiinfecie alimentar, cu sfrit letal.

Diagnostic de laborator - Clostridium perfringens i germenii gangrenei gazoase.

Recoltarea prelevatelor biologice Se recolteaz: exudate din plgi, fragmente musculare, snge, coninutul flictenelor, materii fecale, catgut etc. Diagnosticul microscopic Bacili mari gram + sporulai, cu spor cu diametrul mai mare dect diametrul celulei, situat central sau subterminal. Clostridium perfringens este capsulat, restul florei anaerobe ai gangrenei gazoase prezint cili peritrichi. Apar numeroi spori liberi. Poate fi prezent flor de asociaie. Izolarea pe medii de cultur Transportul i nsmnarea prelevatelor biologice trebuie realizat n anaerobioz. Anaerobioza se realizeaz prin metode: fizice - nclzirea mediilor pn la fierbere i apoi rcire brusc. - plasarea plcilor n anaerostate. chimice - utilizarea pliculeelor cu amestecuri de substane reductoare (pirogalol, carbonat de potasiu) - tehnica Ott. - ncorporarea n mediul de cultur a acidului tioglicolic, cisteinei, resazurin. - sisteme moderne, generatoare de gaze necesare cultivrii anaerobilor: Anaerocult Merch, Anaerobic Plus System Oxoid etc. - utilizarea germenilor avizi de O2 ce favorizeaz obinerea atmosferei anaerobe. - introducere n medii lichide a fragmentelor de organe, a laptelui sau albuului. - protecia anaerobiozei se realizeaz prin adugarea uleiului de parafin la suprafaa mediului sau prin reducerea suprafeei de contact cu aerul (tuburi nalte Weinberg, dopuri de parafin etc). Mediile utilizate sunt mbogite i realizeaz anaerobioza. Exemple: geloza Veillon n tuburi Weinberg, lapte turnesolat, bulion VF cu acid tioglicolic i albastru de metilen, mediul Nagler, Willis Hobbs, geloza-snge - tehnic Ott, mediul Brewer. 192

Clostridium perfringens reprezint singura specie anaerob care: - produce cheag alveolar n laptele turnesolat; - produce lecitinaz pe mediul Nagler; - crete (n cteva ore) la 45, formnd colonii S sau R; - pe geloz snge produce hemoliz de tip cald-rece; - elaboreaz miros specific - butiric; - pe mediul Veillon n tuburi Weinberg prezint colonii lenticulare biconvexe. Clostridium septicum, hystoliticum, novyi, sporogenes: - pe mediul Veillon n tuburi Weinberg prezint colonii profunde, arborescente (aspect de grenad n explozie). Clostridium septicum: - elaboreaz mari cantiti de gaz; - produce cheag alveolar n laptele turnesolat; - nu produce lecitinaz pe mediul Nagler; - produce hemoliza intens pe geloz snge. Clostridium novyi (sau Clostridium Oedematiens): - produce lecitinaz pe mediul Nagler (colonii R); - produce hemoliz pe geloz snge; - nu produce cheag alveolar n laptele turnesolat. Clostridium hystoliticum: - colonii mici, hemolitice pe geloz snge; - nelecitinazic pe mediul Nagler; - produce proteoliza n mediile cu lapte. Clostridium sporogenes: - colonii R stelate, cu miros putrid; hemoliz pe geloz snge; - prezint activitate lecitinazic redus pe mediul Nagler; - produce proteoliza laptelui. Diagnostic biochimic Clostridium perfringens: - zaharolitic (fermenteaz toate zaharurile, cu excepia manitei); - lecitinazo +. Clostridium septicum: - intens zaharolitic (zaharozo -, lactozo +). Clostridium novyi: - zaharolitic, dar lactozo -; - lecitinazo +, gelatinazo +. Clostridium hystoliticum: - proteolitic (produce cele mai mari cantiti de colagenaz); - absena fermentrii zaharurilor. 193

Clostridium sporogenes: - proteolitic; - lecitinazo pozitiv. Testele biochimice pentru identificarea anaerobilor prin diagnostic rapid: trusa API20, Minitek Anaerobic II, API ZYN. Identificarea prin gaz cromatografie, pe baza acizilor grai specifici. Proprieti antigenice Prezint antigene O i H (C. perfringens nu prezint antigene H, dar prezint antigene K de capsul). Identificarea speciilor gangrenei gazoase se realizeaz prin reacii succesive de aglutinare pe lam, utiliznd seruri monovalente specifice. Clostridium perfringens prezint 5 tipuri antigenice (A - E) care secret 12 toxine distincte din punct de vedere antigenic. Tipul A conine mari cantiti de toxin. Test de patogenitate Cobaiul este animalul cel mai sensibil, care prezint la locul inoculrii cu C. perfringens flegmon gazos cu crepitaii, mioliz i rupturi vasculare; n cazul inoculrii cu C. septicum apare doar edem crepitant; C. novyi produce edem lemnos, iar C. hystoliticum produce edem moale cu histoliza i lichefierea esuturilor afectate. Totdeauna gangrena gazoas este multimicrobian, C. perfringens (welchii) constituind principalul agent etiologic. Fiecare specie bacterian produce toxine specifice care ns nu sunt diagnosticate n mod uzual.

Tratament
Antibiograma se execut n condiii speciale de anaerobioz (tehnica difuzimetric n dublu strat de agar). Penicilinele reprezint antibioticele de elecie pentru infeciile cu C. perfringens. Metronidazolul i Clindamicina sunt eficiente. n tratamentul gangrenei gazoase se administreaz i ser antitoxic polivalent specific, care completeaz tratamentul chirurgical i cu oxigen hiperbar. Tratamentul toxiinfeciilor alimentare vizeaz i msuri de rehidratare.

Profilaxia

194

Se realizeaz prin tratamentul corect al plgilor contaminate cu pmnt; se res-pect msurile igienice pentru prevenirea toxiinfeciilor alimentare. Vaccinurile (anatoxine) sunt n studiu.

Clostridium tetani
Sunt germeni anaerobi, gram +, sporulai (cu spor situat terminal aspect de ac cu gmlie sau b de toboar), mobili. Sunt germeni telurici, patogeni prin exotoxine neurotrope. (n stare vegetativ se gsesc n intestinul omului i animalelor).

Aspecte clinico - patogenetice

Principalii factori de patogenitate ai bacteriei sunt de natur toxic i enzimatic (tetanolizina i tetanospasmina). Tetanolizina produce liza hematiilor unor specii animale. Tetanospasmina inhib eliberarea acetilcolinei la nivelul sinapsei neuromusculare i blocheaz eliberarea unor mediatori postsinaptici, producnd spasme musculare gene-ralizate, convulsii i hiperreflexie (acidul aminobutiric i glicina inhib neuronii motori spinali n mod normal). La cteva zile (maximum 3 sptmni) de la contaminarea plgii cu spori telurici apare trismus i facies de tip rizus sardonicus, apoi paralizie spastic. Moartea apare prin asfixie (mortalitatea este de 50%) i aritmii cardiace. Enzimele (gelatinaze, lipaze, proteaze) favorizeaz extinderea infeciei. Tetanosul local se caracterizeaz prin spasm la locul inoculrii (forma clinic uoar). Tetanosul cefalic este asociat cu disfuncii prin afectarea nervilor cranieni, n special perechea a VII-a. Tetanosul generalizat descris n paragraful precedent, prezint risc mare de mortalitate. n fiecare an, n SUA se raporteaz 50-150 cazuri noi de boal; n rile lumii a treia, riscul este mai mare.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice: secreii i esut din plag, catgut, pansamente. Examenul microscopic direct Bacilii gram + sporulai, cu spor situat terminal (ac cu gmalie, b de toboar), cu aezare necaracteristic. 195

Diagnosticul diferenial se face cu bacilii tetanomorfi. Izolarea Se realizeaz pe medii speciale pentru germeni anaerobi. Bulionul este tulburat slab, cu limpezire datorit sedimentrii sporilor. Degaj un miros de corn ars. Pe mediul Veillon se dezvolt la baza mediului sub forma unor colonii pufoase (bacilii sunt mobili prin cilii peritrichi). Coloana mediului este dislocat de gaze. Pe geloza snge prezint hemoliza. Coloniile sunt granulare, ru delimitate. Diagnostic biochimic Slab proteolitic; Nezaharolitic; Lichefiaz gelatina; H2S . Proprieti antigenice Toate tipurile antigenice produc un singur tip de toxin. Test de patogenitate Se inoculeaz animalul de experien cu filtrat de cultur, subcutan sau intramuscular. Apare o paralizie spastic la nivelul membrului afectat i apoi boala se generali-zeaz. Animalele protejate cu ser antitetanic nu fac boala. Testul de patogenitate are mare valore diagnostic.

Tratament
Se realizeaz toaleta chirurgical a plgii, se utilizeaz apa oxigenat, se face rapel ATPA (anatoxina tetanic purificat i adsorbit) i se administreaz ser antitetanic i.m. (250-500 U.I.) n alt zon dect cea n care s-a efectuat vaccinarea; Se administreaz Penicilin (Eritromicin) aproximativ 10 zile. Cazurile grave necesit i respiraie asistat.

Profilaxia
- se realizeaz prin vaccinare DTP (diftero-tetano-pertusis); - se fac eventuale rapeluri ATPA n cazul unor plgi tetanigene.

Clostridium botulinum
196

Sunt bacili strict anaerobi sporulai, care secret exotoxine neurotrope. Formele vegetative se gsesc n intestin; sporii apar n mediul extern pe sol.

Aspecte clinico-patogenice
Botulismul este o toxiinfecie alimentar foarte grav, care apare n urma consumului alimentelor contaminate n care s-a elaborat exotoxin i este caracterizat prin fenomene gastrointestinale i nervoase (constipaie rebel, diplopie, retenie urinar, disfagie, aritmii i paralizia muchilor respiratori, care poate produce asfixie). Toxina botulinic este bimodal; fragmentul B se ataeaz la nivelul plcilor neuromotorii i fragmentul A mpiedic eliberarea de acetilcolin, determinnd o paralizie flasc. Paralizia este descendent: paralizia globilor oculari, paralizie bulbar, paralizia muchilor respiratori. Mortalitatea este considerabil (doza letal 1g). Botulismul plgilor apare prin contaminarea acestora cu sporii germenului res-pectiv. Botulismul infantil (la copii cu vrste de una pn la 3 luni) este consecina sintezei toxinei botulinice prin germinarea sporilor migrai la nivel intestinal. Manifestrile clinice sunt similare bolii clasice, cu toxina preformat n aliment. Cele 8 toxine sintetizate de Clostridium botulinum sunt distincte din punct de vedere antigenic; sunt notate A, B, Ca; Cb; D; E; F; G. Tulpinile A, B, E i F sunt mai frecvent implicate n infeciile umane, restul fiind patogene pentru animale. Tipul G nu produce mbolnviri. Date epidemiologice arat c n SUA apar 20-30 de cazuri noi de botulism infantil (incidena 0,050/0000). Incidena bolii n Romnia este de 0,06-0,2050/0000.

Diagnostic de laborator
Se bazeaz n principal pe detectarea i tipizarea toxinei (toxinotipie). Recoltarea prelevatelor biologice Lichid de spltur gastric, lichid de vrstur, coninut intestinal, aliment din conserv de carne sau vegetale, ser sanguin, organe de necropsie. Examenul microscopic direct, proprieti morfotinctoriale Nu are importan practic. Bacili sporulai, gram +, necapsulai. Izolarea, proprieti de cultur Pe medii pentru germeni anaerobi, la temperatura optim de 25C. 197

Bulionul conine un depozit granular, format din spori i prezint un miros caracteristic (rnced). Pe mediul Veillon n tuburi Weinberg - coloniile sunt profunde, arborescente, cu centru opac. Coloana mediului este fragmentat din cauza produciei de gaze. Pe geloz snge produce colonii minuscule hemolitice, cu margini filamentoase. Pe mediul Nagler produce opalescen i strat perlat. Diagnostic biochimic: zaharolitic, dar lactozo -, slab proteolitic, H 2S +, Hemolitic. gelatinaza +,

Caractere antigenice Exist 8 tipuri antigenice ale toxinei, care nu dau imunitate ncruciat. Determinarea tipului antigenic corespunztor este esenial pentru salvarea vieii bolnavului, cruia i se administreaz de urgen ser antitoxic, specific de tip antigenic. Determinarea tipului respectiv se realizeaz prin reacia de neutralizare in vivo (toxinotipie). Se inoculeaz la oareci intraperitoneal produsul patologic tratat ca atare, apoi tratat termic (15 la 100C), apoi n amestec cu ser antibotulinic (anti A, anti tip B etc.). oarecii protejai prin antitoxina specific de tip supravieuiesc, ca i cei tratai cu toxina inactivat. Teste de patogenitate Pisica este animalul cel mai sensibil. Inocularea filtratului de cultur i produce paralizia muchilor acomodrii i diaree. La oarece, toxina produce o paralizie flasc a membrelor posterioare i la cobai paralizia muchilor abdominali.

Tratament
Se administreaz de urgen ser antibotulinic monovalent specific de tip; se poate administra i.v. ser trivalent A, B, E, cu precauiile seroterapiei.

Profilaxia
Se refer la: prelucrarea termic adecvat a alimentelor care au fost conservate (conserve de fructe, legume, pete), sterilizarea corect a instrumentarului medical pentru prevenirea botulismului de plag. 198

Clostridium difficile
Bacteria produce colita pseudomembranoas postantibioticoterapie i prezint mare rezisten la antibioticele uzuale cu spectru larg.

199

Aspecte clinico-patogenetice
Tulpinile non-invazive ale Clostridium difficile produc citotoxine A i B care distrug celulele epiteliului intestinal, realiznd denudarea mucoasei intestinale i apariia exudatelor fibrino-mucoase. Colita pseudomembranos este o consecin a tratamentului antibiotic intempestiv, care perturb echilibrul florei microbiocenozei intestinale. Sindromul diareic se nsoete de febr, crampe abdominale, prezena sngelui sau a leucocitelor n scaun. Colita poate evolua i ca infecie nozocomial, n special n seciile de terapie intensiv, la pacieni cu vrste mai mari de 50 de ani. La pacienii imunodeprimai afeciunea poate evolua cu o enterocolit necrozant la nivelul colonului, cu risc mare de mortalitate.

Diagnosticul de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice Se recolteaz probe fecale. Examenul microscopic Relev bacili mobili (cu cili peritrichi), cu spori centrali sau subterminali, gram pozitivi. Izolarea pe medii de cultur Pe mediile specifice germenilor anaerobi. Pe geloz snge nu produce hemoliza; coloniile sunt circulare, albicioase. Proprieti de patogenitate Toxina produce enterocolit la hamster i produce efect citopatogen asupra culturii de celule de amnios uman.

Tratament
Vancomicina reprezint tratamentul antibiotic de elecie pentru tulpinile toxigene, la care se adaug serul antitoxic specific pentru cazurile grave. Germenul este sensibil i la Metronidazol, Penicilin i Cefalosporine.

200

CAPITOLUL 29 ANAEROBI NESPORULAI

Caractere generale
Aceti germeni reprezint microflora fundamental a cavitilor naturale. n cazul scderii capacitii de rspuns imun a organismului (diabetici, caectici, intervenii chirurgicale etc.) bacteriile devin patogene, putnd invada esuturile nvecinate. Astfel, apar abcese cu diverse localizri: abcese cerebrale, enterice, hepatice, dentare dar i peritonite, meningite, infecii de plag chirurgical i septicemii.

Reprezentani
Bacili gram negativi: Bacteroides fragilis, Bacteroides melaninogenicus, Bacteroides corrodens; Fusobacterium nucleatum; Fusobacterium necrophorum. Bacili gram pozitivi: Eubacterium lentum; Propionibacterium acnes, Propionibacterium granulosum; Lactobacillus catenaforme; Actinomyces israelli, Actinomyces naeslundii; Arachnia propionica; Bifidocterium eriksonii. Coci gram pozitivi: Peptostreptococcus anaerobius; Peptococcus magnus, Peptococcus prevotti; Streptococcus intermedius. Coci gram negativi: Veilonella parvula; Acidaminococcus fermentans.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice Secreii purulente din abcese cu diferite localizri, snge, lichid cefalorahidian (n majoritatea cazurilor exist i flora de asociaie aerob).

201

Examenul microscopic direct Dup caz, bacili gram + sau gram -, coci gram + sau coci gram negativi. Bacterioscopia direct este de mic importan. Examinarea n imunofluorescen este valoroas pentru diagnostic. Gaz-cromotografia direct din produsul patologic. Izolarea pe medii de cultur nsmnrile se realizeaz n paralel n atmosfera aerob i anaerob. Dup 24 28 de ore de incubare se compar culturile i se repic coloniile suspecte de pe plcile cultivate n anaerobioz. Mediile utilizate: mbogite cu snge, glucoz, hemin, cistein sau antibiotice. Identificarea germenilor Se face pe baza proprietilor morfotinctoriale, de cultur, biochimice.

Bacili gram negativi

Bacteroides fragilis se ntlnete n toate microbiocenozele

organismului dar populeaz n special cavitatea intestinal. Produce malabsorbie, diaree, steatoree, angiocolit, abces subfrenic, septicemie. Sunt bacili scuri, colorabili bipolar, gram negativi. - Dezvoltarea bacteriei este favorizat prin adaos de 20% bil. - Bacteroides fragilis este rezistent la antibiotice, care pot fi folosite ca ageni selectivi n medii de cultur: mediu cu geloz snge-glucozbil-Kanamicin, Streptomicin, Neomicin. Pe acest mediu nu crete nici un alt germen anaerob sau aerob. - Bacteroides fragilis este intens zaharolitic (glucoz+, fructoz +, maltoz +). - Nu descompune treonina. - Bacteria este slab patogen pentru animale de laborator. Este rezistent la lactamine. Fusobacterium necrophorum Habitatul l reprezint cavitatea bucal i cile respiratorii superioare. - Infeciile produse sunt foarte grave, cu tendin septicemic. - Bacteriile au forme filamentoase, sferice sau de fus; coloraia granular (gram -). - Bila inhib dezvoltarea bacterian. 202

- Fusobacterium nu se dezvolt pe medii cu antibiotice, dar crete pe medii cu snge. - Produce lecitinaz pe mediul Nagler. - Este slab zaharolitic (glucoz +, fructoz +, maltoz). - Descompunerea treoninei este pozitiv. - Patogen pentru animale de laborator (exotoxina cu efect necrozant). - Tratamentul vizeaz evacuarea coninutului leziunii i doze mari de lactamine. Fusobacterium nucleatum, mpreun cu Fusobacterium necrophorum i cteva specii de spirochete produc faringite ulceronecrotice (angina - fusospirilar Plaut-Vincent). Identificare Tehnici ADN, gaz cromatografie.

Bacili gram + nesporulai

Propionibacterium acnes

- Face parte din microflora tegumentului i a mucoaselor. - Produce afeciuni variate cu caracter local, care se pot generaliza (endocardite, pleurezii, abcese cerebrale, dacriocistita). - Sunt bacili mici, gram +, ncurbai, colorabili granular, aezai n grmezi sau n palisade. - Se dezvolt abundent n bulion, produc hemoliza pe geloz snge. Coloniile prezint un pigment roz. - Este zaharolitic, gelatinazo +, H2S-. - Este singura specie anaerob rezistent la Metronidazol. - Tratament - Cloramfenicol, Macrolide. Actinomyces israeli - face parte din microbiocenoza bucofaringian; produce abcese dentare, infecii ale tractului respirator, sinuzite. n esuturi formeaz microabcese (granule de sulf). Lactobacillus, Bifidobacterium - sunt specii comensale.

Coci gram + anaerobi

Aparin tractului intestinal, respirator, genital. Produc infecii dentare, amigdaliene, sinuzite, endometrite postpartum i postabortum, infecii de plag chirurgical, septicemii. Cocii gram + sunt aezai n grmezi, n diplo, n tetrade. Se dezvolt pe bulion i pe geloz snge (colonii S). Germenii sunt sensibili la lactamine, Macrolide, Cloramfeniol. 203

Coci gram
Veillonella i Acidaminococcus sunt comensali ai cavitii bucofaringiene i ai tractului intestinal. Produc infecii dentare i pulmonare dar prezint o patogenitate sczut comparativ cu ali anaerobi nesporulai. Cocii gram negativi au dimensiuni reduse i sunt aezai izolat, n perechi sau n grmezi. Se dezvolt puin abundent n medii de cultur. Sunt sensibili la Cefalosporine, Clindamicin, Cloramfenicol.

204

CAPITOLUL 30 GENUL MYCOBACTERIUM

Caractere generale
Genul Mycobacterium aparine familiei Mycobacteriaceae. Genul cuprinde bacili acido-alcoolorezisteni, aerobi, imobili, cu o structur aparte a peretelui celular (bogat n lipide, acidul micolic are rol esenial n acido-rezisten).

Reprezentani, afeciuni produse

Specii patogene: Mycobacterium tuberculosis uman: - tuberculoza la om (bacil descoperit n 1882 de ctre R. Koch). Mycobacterium tuberculosis bovis: - tuberculoza la bovine i la om. Mycobacterium leprae: - lepra. Mycobacterium ulcerans: - ulceraii cutanate. Mycobacterium atipice: - grupele I-IV Runyon (conin i specii condiionat patogene sau saprofite).
Tabelul nr. 14 - Mycobacterii atipice Grupa Reprezentani Pigmentarea coloniilor Pigmentarea la lumin (galben) Pigmentare i la ntuneric Fr pigmentare Intervenia n patologie Leziuni tip TBC Leziuni cutanate M. Scrofulaceum adenita cervical la copii Localizri tip M. tuberculosis

I Fotocromogeni M. kansasii M. marinum M. simiae M. asiaticum II Scotocromogeni M. scrofulaceum M. szulgi M. xenopi III Necromogeni Complexul avium intracellulare M. haemophilum IV Cu cretere M. fortuitum-chelonei rapid M. smegmatis M. phlei Patogene pt. M. lepraemurium Animale M. paratuberculosis M. microti

Coloniile se dezvolt Majoritatea dup 1-7 zile de la speciilor incubare nepatogene

205

Mycobacteriile sunt germeni cu parazitism facultativ intracelular; rspunsul imun este mediat celular. Imunitatea antiinfecioas este condiionat genetic i de factorii de mediu (alimentaie, stres, condiii igienice precare).

Infecia tuberculoas - aspecte patogenice i clinice Factori de patogenitate bacterieni

M. tuberculosis nu produce exotoxine sau endotoxine. Componentele peretelui celular bacterian dein rolul toxic. Proteine -11 antigene majore identificate prin electroforez la tulpina H37Rv, sunt imunogene i determin apariia limfocitelor T sensibilizate; Cord factor - ester de trehaloz; inhib migrarea PMN in vitro; - este letal pentru animalele de experien; - determin agregarea bacililor sub form de uvie; Ceara D - reprezentat printr-un complex de glicopeptide ale peretelui celular care stimuleaz mecanismele IMC; Sulfolipide - determin virulen; Fosfatide - produc necroz cazeoas.

Aspecte imunopatologice
Primoinfecia este inaparent; poarta de intrare este respiratorie, bacteriile se multiplic n esutul pulmonar; multiplicarea la nivel hilar ganglionar determin - afectul primar tuberculos. Leziunile anatomopatologice produse sunt de dou tipuri: exudative i proliferative. Leziunile exudative - constau ntr-o reacie inflamatorie obinuit, cu predominena PMN; se pot resorbi sau pot evolua productiv. Leziunile proliferative - foliculii tuberculoi - apar ca o reacie inflamatorie de tip granulomatos. Zona central folicular este o necroz cazeoas cu bacili, n jurul creia exist un bogat infiltrat celular: limfocite, monocite, fibroblaste, celule gigante Langhans. esutul necrozat se poate elimina pe cale respiratorie (sput) sau pe cale sanguin (TBC generalizat: osoas, renal, meningeal, digestiv, ganglionar etc.). Macrofagul desfoar o activitate mai eficient n urma activitii sale prin limfokinele produse de ctre limfocitele T activate. Vaccinul BCG administrat imediat dup natere are rolul de a stimula apariia limfocitelor T sensibilizate i a macrofagelor activate.

206

Persistena bacililor n organism determin apariia strii de hipersensibilitate de tip tardiv la antigenele bacilului tuberculos i imunitate fa de reinfecie, denumit premuniie. IDR la PPD pozitiv semnific prezena strii de hipersensibilitate de tip tardiv. Modelul experimental este cobaiul (fenomenul Koch), modelul care explic manifestrile imunopatologice tipice bolii (vezi ,,Proprieti de patogenitate).

Diagnostic de laborator Diagnostic direct

Recoltarea prelevatelor biologice Sputa prin expectoraie spontan; Sucul gastric obinut prin tubaj, la copiii care i nghit sputa; Aspirat bronic (obinut prin bronhoscopie), urin; Lichid cefalorahidian, exudat pleural, peritoneal, articular, secreii purulente, materii fecale etc. Diagnostic microscopic direct Frotiu efectuat din prelevat biologic, colorat Ziehl-Nielsen - Bacilii sunt acido-alcoolorezisteni, fini, aezai n grmezi care imit literele majuscule M, Y, W, N, V etc. - Se examineaz 100 cmpuri microscopice i rezultatele se exprim cantitativ (se obin informaii despre stadiul bolii i gradul de contagiozitate al bolnavului). - Negativ....................................0 - Dubios .............1-3 - Slab pozitiv (+)................4-9 bacili/100 cmpuri - Moderat pozitiv (++)...10-100 - Intens pozitiv (+++)............>100 Coloraia fluorescent cu auramin - rodamin. Izolarea, proprieti de cultur Pe medii lichide (bulion glicerinat, mediul Dubos) - formeaz o pelicul la suprafaa mediului (sunt aerobi i hidrofobi); Pe medii solide (mediul Lwenstein-Jensen), coloniile se dezvolt dup 2-6 sptmni: - M. tuberculosis uman - colonii R conopidiforme (stimulate de prezena glicerinei n mediu - eugonice), nepigmentate; 207

- M. tuberculosis bovis - colonii R disgonice, inhibate de glicerina din mediu, nepigmentate, cu dezvoltare tardiv; - Micobacteriile atipice - colonii R i S, pigmentate sau nu, n funcie de expunerea la lumin i ntuneric. Micobacteriile grupei IV Runyon se dezvolt i pe medii mai simple n 1-7 zile. Diagnostic biochimic Sunt germeni aerobi. Prezint o catalaz termorezistent; Testul niacinei - pozitiv pentru M. tuberculosis; - negativ pentru M. bovis i M. atipice; Reducerea nitrailor, teluritului - pentru identificri de specie. Proprieti antigenice Antigenele bacteriene somatice sunt proteice, polizaharidice i lipidice. Prin tehnici ADN recombinant s-au identificat complexe de substane imunogene, care vor constitui baza viitorului vaccin anti TBC: - Complexul antigenelor 85A + 85B + 85C; - proteinele de 6 kilodaltoni i 36-38 kilodaltoni; - proteinele de oc termic (heat shock protein - hsp 65, 70). Teste de patogenitate Fenomenul Koch - se inoculeaz unui cobai, subcutan n regiunea inghinal, o tulpin virulent; dup 10-14 zile apare local un nodul care exulcereaz i fistulizeaz. Animalul moare dup dou luni cu leziuni anatomo-patologice generalizate. Dac dup apariia primei leziuni se inoculeaz produs patologic n cealalt regiune inghinal, al doilea nodul apare dup 48-72 de ore i infecia nu se generalizeaz. Fenomenul este interpretat prin apariia strii de hipersensibilitate de tip tardiv la antigenele bacilului tuberculos. Aceast reacie inflamatorie poate fi provocat i prin inocularea iniial a unor bacili omori sau cu virulen atenuat (principiul vaccinrii BCG). Rspunsul IMC este negativ fa de infecia primar i pozitiv pentru reinfecie (apare macrofagul activat i limfocitul T sensibilizat la antigenele BK). Antibiograma Se realizeaz n tuburi Lwenstein-Jensen cu tuberculostatice incorporate (fiecare chimioterapic n dou concentraii diferite i mediu martor). Antibiograma se repet n timpul tratamentului.

208

Mycobacteriile atipice sunt rezistente la tuberculostatice. Hidrazida acidului izonicotinic, Etambutol, PAS (acid paraaminosalicilic).

Diagnostic indirect
Diagnosticul biologic - Intradermoreacia la tuberculin (PPD): - Evideniaz starea de hipersensibilitate de tip tardiv fa de antigenele bacilului tuberculos, prezent la infectai inaparent, bolnavi de TBC, vaccinai BCG; - Tuberculina este un filtrat dintr-o cultur n bulion glicerinat, veche de 6 sptmni, autoclavat, filtrat i concentrat 1/10; - Azi se utilizeaz PPD - derivatul proteic purificat; - Intradermoreacia se realizeaz conform tehnicii Mantoux: pe faa anterioar a antebraului stng se inoculeaz i.d.r. 0,1 ml coninnd 2u P.P.D; - Dup 72 de ore se msoar (n mm) diametrul transversal al papulei dermice palpabile (nu i eritemul nconjurtor); - Interpretare: 0-9 mm = reacie negativ (absena strii de HTT, boli anergizante, neinfectai). Este necesar vaccinarea BCG; > 10 mm = reacie pozitiv (stare de HTT cu MF activat prezent, subiect infectat sau vaccinat). - Viraj tuberculinic - apariia unei reacii pozitive la un subiect cu i.d.r. negativ anterior surprinde momentul primoinfeciei naturale.

Profilaxia
Nespecific - depistarea, izolarea i tratarea sursei de infecie i creterea rezistenei nespecifice. Specific - vaccinarea cu vaccinul BCG (Bacil Calmette Guerin), cu bacili Mycobacterium bovis atenuai prin pasaje succesive pe medii, timp de 13 ani. IDR negativ - impune revaccinarea cu BCG. - Vaccinul viitorului, ADN recombinant, preparat din complexul imunogenic (85A + 85B + 85C) este n curs de experimentare; stimuleaz macrofagele i limfocitele T citotoxice.

209

De remarcat creterea incidenei tuberculozei n ultimii ani, prin asocierea cu SIDA (virusul HIV distruge IMC). Orice boal mycobacterian la adult recomand testarea HIV/SIDA.

210

CAPITOLUL 31 GENUL TREPONEMA

Familia Spirochetaceae cuprinde 3 genuri, cu specii variate implicate n patologia uman: Genul Treponema; Genul Leptospira; Genul Borellia. Familia Spirochetaceae cuprinde bacterii spiralate, cu un perete celular elastic, extrem de mobile datorit unui aparat locomotor intracelular, rsucit n jurul corpului bacterian. Bacteriile au o lungime medie de 10-15 m, o grosime de 0,4-0,6 m i aproximativ 10-15 spire; pot executa micri complexe: flexie, rotaie, translaie, rsuciri n jurul propriului ax (se explic astfel potenialul invaziv).

Reprezentani
Treponema pallidum (tulpina Nichols, reprezentativ ca tulpin patogen) - Sifilisul; Treponema pertenue - Pianul; Treponema carateum - Pinta; Treponema vincenti, microdentium, mucosum (n cavitatea bucal); Treponema calligyrum i Treponema genitalis (pe mucoasa genital); Treponema reiter (tulpin de laborator pentru diagnostic, nepatogen); Treponema cuniculi (tulpin patogen pentru iepure).

Treponema Pallidum
Sifilisul este o boal venerian specific uman; evolueaz clinic n trei etape: primar: - caracterizat prin apariia ancrului dur genital, nsoit de adenopatie satelit; apare la 1-12 sptmni de la infectare. secundar: - rozeole cutanate i plci mucoase (septicemia); - apare la 2-3 luni de la contactul infectant i dispare repede (2 sptmni). 50 % dintre pacienii cu sifilis secundar evolueaz nspre etapa teriar. 211

 teriar:

- sifilisul visceral (gome sifilitice cu localizri diverse); - apare dup 5-40 ani de la inoculare. Consecinele sifilisului teriar sunt foarte grave: ruperea cordului, ruperea vaselor, afectarea SNC cu tabes, paralizie general progresiv. Sursa bolii este bolnavul n faza primar sau secundar. Calea de transmitere este: sexual - 95 % i transplacentar i parenteral - 5 %. Treponema acioneaz ca germen patogen prin invazivitate. Nu a fost demonstrat prezena vreunei toxine. Se multiplic celular. Sifilisul congenital are simptomatologie distinct: - erupie maculo-papuloas; - modificri osoase; hepatice; - afeciuni neurologice; - surditate; orbire. Boala apare n urma pasajului transplacentar bacterian.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice Serozitate de la nivelul ancrului dur; Serozitate de la nivelul rozeolelor cutanate i plcilor mucoase (dup scarificare); Snge; Material bioptic din gome. Examenul microscopic direct Preparatul nativ examinat la microscopul cu fond ntunecat: - treponeme refringente cu 10-12 spire animate de micri de flexie, rotaie, translaie, rsucire n ax. Imunofluorescena indirect: - tratarea prelevatelor biologice cu ser specific anti Treponema pallidum marcat fluorescent. Coloraia Burri: - Treponeme albe pe fondul negru al preparatului. Coloraia Giemsa: - Treponeme colorate n brun-violaceu. Coloraia Fontana Tribondeau: - Treponeme colorate n negru pe fondul galben al preparatului. Tehnica Levaditi Manuelian: - reprezint o coloraie Fontana Tribondeau aplicat seciunilor din organele prelevate necroptic (seciuni prin gomele sifilitice). 212

Examenul microscopic se pozitiveaz n perioada primar sau secundar. Izolarea treponemelor Foarte greu de cultivat; Se pot menine viabile 72 ore n mediul Nelson-Mayer; Inocularea la iepure (intratesticular) - animalul prezint o orhit sifilitic cu adenopatie; prin aceast metod se obin tulpini patogene (Nichols, Triffi, Gand) care reprezint o surs de antigene pentru diagnostic; Tulpina Reiter e o tulpin saprofit folosit pentru diagnostic. Diagnostic serologic Se utilizeaz obligatoriu n controlul screening de depistare al sifilisului, pentru decelarea infeciilor latente sau inaparente clinic. Este posibil ncepnd cu sfritul perioadei primare. Se utilizeaz n diagnostic antigene netreponemice (nespecifice) i antigene treponemice (specifice). Treponema pallidum prezint antigene lipoidice, cu structur asemntoare cardiolipinei miocardice. Detectarea anticorpilor sifilitici antilipoidici (reagine luetice) se realizeaz uzual prin reacii nespecifice, care utilizeaz antigene lipoidice din cord de bou (cardiolipina). Reacii serologice nespecifice Reacii de floculare: Citochol, Meinicke, Kahn; RFC Bordet - Wasserman cu antigen Bordet Ruelens; Testul VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) este o reacie de aglutinare pasiv. Ca test de triaj se utilizeaz microreacia VDRL. O reacie pozitiv se completeaz cu tehnica n tuburi. Testul VDRL permite i determinri cantitative ale AC. n cazul testului pozitiv se realizeaz testele de confirmare (specifice): Imunfluorescena indirect: FTA - ABS (The fluorescent treponemal antibody absorbed serum). Antigenele sunt extrase din Treponema Reiter. Este cel mai utilizat test serologic n statele dezvoltate din punct de vedere economic; Reacia de hemaglutinare pasiv (antigen Treponema pallidum); RFC (tehnica Kolmer la rece). Reaciile nespecifice au avantajul c nu pun n pericol sntatea persoanelor din laborator dar prezint dezavantajul reaciilor fals pozitive (n asociere cu boli autoimune, administrare de vaccinuri sau anestezice).

213

Reacii serologice specifice Folosite pentru confirmarea diagnosticului; Testul de imobilizare al Treponemelor (T I T): Treponemele sunt imobilizate n prezena anticorpilor specifici i a sistemului complement. La microscopul cu fond ntunecat se numr microorganismele imobilizate dup 15 ore de inoculare i rezultatele se exprim procentual; Reacia de imunoaderen: Treponemele ader la suprafee netede (hematii, trombocite sau particule inerte) n prezena anticorpilor i a sistemului complement; Testul de hemaglutinare (cu extracte de Treponema Nichols sau pallidum). Este mai puin sensibil dect testul FTA - ABS; Imunofluorescena indirect FTA - ABS; ELISA (cu antigene extrase din tulpina Nichols); Testul de imunodispariie intraperitoneal (TPID); Testul RFC - antigene ale Treponemei Reiter; Contraimunelectroforez - cu acelai tip de antigene. Ultimele 3 reacii menionate au o specificitate mai sczut. n campaniile de depistare serologic a sifilisului se vor executa dou reacii di-ferite: VDRL i RFC cu antigen cardiolipinic sau extras din Treponema Reiter. Pentru confirmarea diagnosticului pozitiv se recomand efectuarea imunfluorescenei indirecte (FTA-ABS), metod de mare sensibilitate i specificitate. Reaciile serologice cantitative verific eficiena tratamentului (titrul anticorpilor specifici scade, n timp ce n reaciile fals pozitive titrul rmne nemodificat). Reacii fals negative pot aprea la unii bolnavi de sifilis, prin exces de anticorpi care determin un fenomen de prozon.

Diagnostic indirect biologic Rspunsul imun anti Treponema este predominent celular (spirochetele se multiplic intracelular). Rspunsul imun umoral elaboreaz AC antilipidici i AC antispecie. Se poate investiga rspunsul imun IMC prin IDR, cu antigene extrase din treponeme (luetina). Reacia pozitiv denot prezena infeciei.

Terapia i controlul afeciunii

Treponemele sunt sensibile la Peniciline i Cefalosporine. Nu s-a semnalat rezistena microbian la aceste preparate. Sifilisul teriar nu poate fi vindecat. Sifilisul congenital poate fi prevenit prin administrarea terapiei specifice precoce (pn n luna a patra de sarcin). 214

Obinerea vaccinului specific este foarte dificil, din cauza dificultilor de cultivare pe medii de cultur ale treponemelor. Profilaxia nespecific se refer la depistarea, tratarea sursei i la educaia sexual.

Treponema pertenue
Produce pianul (framboesia), boal tropical ce se manifest prin leziuni cutanate i mucoase. Boala afecteaz mai ales copiii i evolueaz tot n trei etape, ca i sifilisul. Boala se transmite nesexual. leziunile primare - sunt ulcerative, care apar la 3-4 sptmni de la infectare; leziunile secundare - sunt tot ulcerative, apar la cteva luni sau ani de la infectare; leziunile teriare - sunt tardive i afecteaz osul i pielea. Complicaiile viscerale sunt grave. Nu se semnaleaz infecii congenitale. Se trateaz cu Penicilin.

Treponema carateum
Reprezint agentul etiologic al pintei, care se transmite prin contact direct, nesexual. Boala este endemic n America Central i de Sud. Leziunile primare sunt papule neulceroase. Se descriu complicaii cardiovasculare i nervoase. Diagnosticul de laborator i tratamentul sunt analoge sifilisului.

215

CAPITOLUL 32 GENUL LEPTOSPIRA

Caractere generale
Spirochetele genului sunt larg rspndite n natur, fiind saprofite i patogene (n special pentru animale). Se deosebesc de celelalte spirochete prin fineea lor (12 m lungime i 0,06 m diametru), de aceea pot ptrunde prin tegumentele intacte. Corpul bacterian are 10-12 spire nedeformabile, cu extremitile rsucite. Aparatul locomotor este alctuit dintr-o singur fibril dispus ntre membran i peretele celular foarte elastic.

Reprezentani
I. Grupul Leptospira biflexa - care reprezint tulpinile saprofite, nepatogene; II. Grupul Leptospira interrogans - cuprinde tulpini patogene, de exemplu: Leptospira icterrohemoragiae (boala Weill) - leptospiroza icterohemoragic; Leptospira grypo-tiphosa - febra de nmol; Leptospira pomona - boala porcarilor; Leptospira canicola - tifos canin; Leptospira hebdomadis - febra de apte zile.

Aspecte clinico-patogenetice
Rezervorul de infecie l constituie animalele slbatice sau domestice (obolan, oarece, cine, porci etc.). Leptospirele paraziteaz corticala renal dup bacteriemie i apoi sunt eliminate prin urin n mediul nconjurtor. Leptospirele patogene persist n ap i sol umed. Omul se contamineaz n mod accidental. Leptospirozele (sunt antropozoonoze) i au simptomatologie nespecific: - sindrom febril persistent; - mialgii; - astenie; 216

- fotofobie; - migrene. Leptospiroza icterohemoragic evolueaz cu sindrom febril, icteric, hepatic, renal i hemoragic, care pun n pericol viaa subiectului. Febra Fort Bragg evolueaz i cu erupii cutanate. Uneori boala se manifest ca meningit leptospirotic. Bolile produse prin Serotipurile L. icterrohemoragiae i L. canicola au letalitate crescut.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice snge i lichid cefalorahidian n prima sptmn de boal; urin alcalinizat n prealabil (mediul acid distruge leptospirele) din sptmna a doua pn n luna a doua de boal. Diagnostic microscopic Examenul la microscopul cu fond ntunecat - din prelevat biologic proaspt, plasat ntre lam i lamel. Spirochetele sunt extrem de mobile. Imunofluorescena. Frotiu colorat Giemsa. Coloraia Burri. Impregnarea argentic Fontana Tribondeau. Vizualizarea leptospirelor n organe dup tehnica Levaditi Manuelian. Izolarea nsmnarea se face pe medii cu ser de iepure: Uhlenhut sau Korthof. Mediile se incubeaz la 28-30C i se controleaz prezena leptospirelor sptmnal timp de 60 zile la microscopul cu fond ntunecat; dac examenul microscopic este pozitiv, se fac subculturi pe medii proaspete. Leptospirele patogene nu modific turbiditatea mediului; inocularea se poate face i intraperitoneal sau subcutan la cobai. Proprieti biochimice Leptospirele dispun de un bogat echipament enzimatic: - hialuronidaze; - fosfolipaze; - oxidaze; - catalaze; - hemolizine. 217

Leptospirele patogene au o slab activitate ureazic i au nevoie n mediile de cultur de acizi grai nesaturai (ex: serul de iepure). Vitaminele B1, B12 reprezint factori de cretere. Antigenicitate Antigenul proteic de nveli (P) codific serotipul; are rol de antigen protector i este indispensabil ntr-un vaccin (bacterina). Poate interaciona cu anticorpii specifici dintr-un ser. Peretele celular conine antigenul somatic (S), fixator de complement. Antigenele F4 i TM de natur polizaharidic, cu rol n aglutinare. Endotoxina este izolat din peretele celular al leptospirelor patogene. Proprieti de patogenitate Patogenitatea i invazivitatea leptospirelor se explic prin endotoxin, intervenia enzimelor i mobilitatea bacterian crescut. Infecia experimental se realizeaz la cobai, hamsteri, iepuri nounscui. Animalele se inoculeaz intraperitoneal i subcutan i fac septicemie. Leptospirele pot fi izolate prin nsmnarea pe medii adecvate. Diagnostic indirect serologic Anticorpii se detecteaz dup prima sptmn de boal i ating titrul maxim dup 3-4 sptmni. RFC Ida Bengston. Antigenul se prepar din Leptospira biflexa patoc, care conine antigenul de grup, comun tuturor speciilor patogene. Reacia de aglutinare liz: - Permite diagnosticarea speciei de leptospire care a produs infecia. - Antigenul (lichid) este preparat din tulpini cunoscute de Leptospira. - Serul de bolnav sufer diluii crescnde. Din fiecare diluie de ser se fac aglutinri pe lam cu fiecare tulpin de leptospira. - Lamele se examineaz la microscopul cu fond ntunecat. Aglutinarea se manifest prin aglomerarea leptospirelor n gheme stelate, urmat apoi de liz. - Tipul de leptospir patogen este indicat prin titrul cel mai ridicat al reaciilor. Se determin astfel agentul etiologic specific.

218

Tratamentul
Peniciline, Tetracicline administrate din primele zile de boal; Tratamentul ocului toxiinfecios (dac este cazul).

Profilaxie
Vaccinarea se realizeaz pentru profilaxia bolii la animale. Profilaxia specific nu se aplic la om.

219

CAPITOLUL 33 GENUL BORRELIA

Caractere generale
Cuprinde spirochete cu spire largi i neregulate, saprofite i patogene, colorabile cu colorani de anilin. Clasificarea speciilor se realizeaz dup gazda infectat.

Reprezentani
Borrelia recurentis - specie strict specific omului (febra recurent) transmis prin pduche; Borrelia hispanica, duttoni, burgdorferi (boala Lyme) - transmise la om prin cpu; Borrelia bucalis, vincenti - pe mucoase (cavitatea bucal); Borrelia anserina - la psri; Borrelia brasiliensis - la artropode; Borrelia harveyi - la primate; Borrelia crocidurae - la roztoare; etc.

Patogeneza infeciilor la om
Borreliile sunt patogene prin multiplicare i invazivitate; borreliozele sunt boli generalizate. Borrelia recurentis produce febra recurent, n urma nepturii pduchelui infectat. Sindromul febril prezint 6 - 9 recderi, marcate de perioade de acalmie. Explicaia const n fenomenul de variaie antigenic, ce reprezint metode de eludare a aprrii imune. Explicaia fenomenului const n apariia a unor noi antigene de suprafa, codificate prin plasmide lineare (anticorpii produi devin inutili pentru puseul febril ulterior). Variaia antigenic face dificil clasificarea genului pe grupuri i tipuri antigenice. Rspunsul imun este preponderent umoral. Imunitatea este de scurt durat, strict specific de variant antigenic. Reinfecia este posibil dup 2 - 3 ani. Spirochete condiionat patogene din cavitatea bucal:

220

Borrelia vincenti - reprezint agentul patologic al anginei Plaut Vincent, n combinaie cu Bacteroides melaninogenicus. De asemenea, poate produce gingivita acut ulceronecrozant; Borrelia bucalis i vincenti, n asociere cu Fusobacterium fusiforme produce stomatite, glosite, angine i gingivite.

Diagnostic de laborator n febra recurent

Recoltarea prelevatelor biologice Se recolteaz snge n plin puseu febril. Diagnostic microscopic Spirochetele cu lungimea de 20 - 30 m, cu de 1 m, cu 10 - 30 spire neregulate i deformabile n timpul micrilor, cu capete drepte. Aparatul locomotor este alctuit din 30 de fibrile dispuse ntre membran i peretele celular. Se coloreaz gram (sunt gram negative); se coloreaz i prin impregnare argentic (Fontana - Tribendeau) i cu colorani cu anilin. Izolare pe medii de cultur Pe mediile Noguchi, Kelly sau Dodge (medii mbogite); Inoculare pe ou embrionat de gin, intraalantoidian; Inocularea oarecelui intracerebral; Inocularea pduchilor (Weigl) pentru obinerea culturilor pure, cu virulen nemodificat. Proprieti biochimice Sunt bacterii microaerofile; Fermenteaz glucoza. Proprieti antigenice Variaia antigenic a imunogenelor de suprafa face dificil ncadrarea n serogrupuri i serotipuri. Caractere de patogenitate Borrelia recurentis este patogen pentru maimu; Borrelia duttoni este patogen pentru oarecele alb. Diagnostic serologic RFC cantitativ, efectuat pe probe perechi de seruri. Creterea titrului de cel puin 4 ori semnific o boal n evoluie; 221

Reacii de aglutinare - liz.

Tratament
Tetracicline, - lactamine.

Profilaxia
Nespecific - distrugerea vectorului.

Borrelia burgdorferi
Reprezint agentul etiologic al bolii Lyme, transmis la om prin neptura unei cpue (Ixodes ricinus). Boala evolueaz n trei stadii: I. Dup o incubaie de 3 - 32 de zile apar leziuni cutanate (eritem cronic migrator) la 80% dintre subieci; II. Se caracterizeaz prin leziuni cutanate multiple, artrite i afectarea sistemului nervos central i periferic; III. Se manifest prin meningoencefalite (15%) i tulburri de ritm cardiac (8% dintre pacieni). Tratamentul se realizeaz cu Tetracicline, Cefalosporine, Vancomicin. Distribuia geografic include SUA (coasta Atlanticului), Australia, Asia i Euro-pa. Sezonalitatea bolii: mai - iunie.

222

CAPITOLUL 34 ALTE ETIOLOGII BACTERIENE GENUL LEGIONELLA

Caractere generale
Legioneloza sau boala legionarilor este o pneumonie aprut la o aniversare a Legiunii Americane din Philadelphia (1976). Agentul etiologic este Legionella pneumophila, transmis prin intermediul sistemului de aer condiionat. Genul Legionella cuprinde 39 de specii (bacili fini gram negativi fr aezare caracteristic). Prezint parazitism celular facultativ. Speciile genului sunt larg rspndite n natur, n special n medii umede (izvoare, ap cald, fntni publice etc.).

Reprezentani, infecii produse

Legionella pneumophila: - legioneloza, febra Pontiac. Legionella micdadei: - pneumonie tip infecie nozocomial, asemntoare clinic legionelozei. Legionella bozemanii, gormanii, dumoffii: - descoperite n mediu, neasociate unor infecii umane:

Aspecte clinico-patogenetice
Legionella pneumophila este o bacterie cu parazitism facultativ intracelular i prezint afinitate pentru monocite i macrofage, n interiorul crora supravieuiesc i se multiplic, pn la distrugerea acestora. Exudatul inflamator pulmonar conine preponderent macrofage i neutrofile; bacteriile determin apariia unor focare fibrinopurulente la nivelul alveolelor pulmonare. Formele manifeste clinic sunt ntlnite preponderent la imunodeprimai. Letalitatea depete 20% la cazurile incorect tratate. n cazurile foarte grave pot apare manifestri extrapulmonare: digestive, renale, psihice, hepatice. Febra Pontiac este un sindrom gripal like, fr implicarea plmnului.

223

Efectul patogen bacterian se datoreaz adezinelor de suprafa, ctorva toxine (hemolizine, citotoxine, endotoxine), o toxin peptidic i o catalaz blocheaz fenomenele exploziei respiratorii sau formarea fagolizozomilor; astfel se explic persistena bacterian intracelular i ineficiena fagocitozei, aspect cu att mai grav cu ct i rspunsul imun celular este inhibat.

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice Secreii ale tractului respirator inferior, biopsie pulmonar. Probe de ap contaminat (sedimente din rezervoare de ap, din fntni i din pulverizatorul duurilor). Examenul microscopic, proprieti morfotinctoriale Legionella pneumophila - bacili gram negativi, pleiomorfi, flagelai (polar, subpolar sau lateral), cu incluzii intracelulare (nu formeaz spori). Impregnaiile argentice se utilizeaz pentru preparate histologice Imunofluorescena cu anticorpi monoclonali specifici MAC 2 marcai cu fluorescein - evideniaz bacteriile direct din produsul patologic Izolarea pe medii, proprieti de cultur Nu reprezint un diagnostic de rutin. Mediile de cultur trebuie s conin cistein, fier pirofosfat. Sputa nu se inoculeaz direct, se nsmneaz esuturi infectate. Coloniile au un aspect sticlos, apar dup 3 - 5 zile de incubare n atmosfera umed, aerob, la pH 6,9 i T = 35C. Mediul lichid trebuie s conin ap, macrofage alveolare, alge i bacterii fotosintetice (diagnostic neuzual). Caracteristici biochimice Catalaza +, Oxidaza +, lactamaze +; Gelatinaza +; Hidroliza hipuratului +; Fluorescena coloniilor. Proprieti antigenice

224

Exist 39 de specii de Legionella i 60 de tipuri antigenice distincte. Legionella pneumophila prezint 14 serogrupuri. Serogrupul 1 cauzeaz 80% din mbolnvirile umane. Exist un kit RIA care detecteaz antigenul serogrupului 1 al Legionellei pneumophila n urina pacienilor. Serotiparea se realizeaz prin imunofluorescen, utiliznd antiseruri specifice. Detectarea antigenelor sau acizilor nucleici se realizeaz prin tehnici ADN (laboratoare specializate) sau cu anticorpi monoclonali (MAb2). Diagnosticul indirect serologic Util n investigaii epidemiologice, n formele clinice extrapulmonare i n caz de examen bacteriologic negativ. Dezavantajul diagnosticului serologic const n posibilele reacii ncruciate fa de alte Legionelle. RIF indirect -cea mai sensibil metod (diagnostic pozitiv n 90% dintre cazuri) ELISA Contraimunelectroforeza Se lucreaz pe probe perechi de seruri pentru depistarea seroconversiei; titrul anticorpilor specifici trebuie s fie mai mare de 1/128. Nivelul maxim al anticorpilor se observ n sptmna 3 6 de boal.

Tratament
n unele cazuri diagnosticul serologic poate fi retrospectiv. Terapia standard const n administrarea unor macrolide, quinolone sau sulfamide de ultim generaie. -lactaminele sunt inhibate de ctre lactamazele bacteriene.

Profilaxie, control
Aproximativ 25% din populaia adult prezint anticorpi specifici anti Legionella (majoritatea infeciilor sunt asimptomatice). Controlarea prezenei bacteriei n mediile acvatice (ap potabil, industrial, menajer) sau aer condiionat. Nu s-a putut evidenia transmiterea interuman. Indivizii imunodeprimai (diabet, cancer, dializai, SIDA, etc.) pot beneficia de chimioprofilaxie (macrolidele asociate sau nu cu Rifampicina prezint eficiena maxim).

CALYMMATO BACTERIUM
225

Caractere generale
Descoperit de Donovan n 1903. Cuprinde specia C. granulomatis, patogen pentru om; (reprezint agentul etiologic al donovanozei, boal sexual transmisibil, caracterizat prin apariia unor ulceraii i granuloame inghino genitale). Boala este rspndit n zonele cu climat cald i umed.

226

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice Secreia recoltat cu tamponul de la nivelul ulceraiei. Raclaj din regiunea granulomatoas. Examenul microscopic Bacili gram negativi colorabil bipolar, nesporulai, cu aezare necaracteristic, evideniabili n sacul vitelin al embrionului inoculat sau intramacrofag. Izolare Prelevatele biologice se inoculeaz n sacul vitelin al embrionului de gin. Inoculare pe glbenu de ou coagulat n plac Petri. Proprieti antigenice Posed antigene care determin sinteza anticorpilor specifici, care nu au rol protectiv. Proprieti biochimice Germen aerob, facultativ anaerob. Proprieti de patogenitate Germenul nu este patogen pentru animalele de laborator. Diagnostic indirect serologic RFC. Diagnostic indirect biologic I.D.R. care evideniaz starea de hipersensibilitate de tip tardiv dup boal.

Tratament
Ampicilin i Tetraciclin.

Profilaxia
Respectarea normelor de igien individual.

227

ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE
Caractere generale
Bacili gram pozitivi, morfologic i antigenic nrudii cu speciile Lysteriei, ntlnii n rezervoare animale (suine) sau materie organic divers. Boala este o antropozoonoz (erizipeloid Rosenbach) survenind accidental la lucrtorii din sectorul veterinar (dup apariia unei soluii de continuitate la nivelul tegumentului).

Diagnostic de laborator
Recoltarea prelevatelor biologice Secreii de la nivelul leziunii (eritematoas i chiar buloas). Examenul microscopic Bacili gram+ imobili, necapsulai, aezai tip difteroid (n culturi vechi). Izolare pe medii de cultur Pe medii lichide produce o turbiditate uoar. Pe medii solide se dezvolt sub forma coloniilor S mici, transparente, dup 48 de ore de incubare la 37C, cu hemoliz pe medii cu snge. Mediile de cultur trebuie mbofire cu ser de cal, snge de oaie, triptofan, riboflavin, acid oleic. Diagnostic biochimic Testul indol i reducerea nitrailor sunt negative. Nu hidrolizeaz esculina i hipuratul de sodiu. Produc H2 S pe mediul TSI i fermentarea unor zaharuri. Produc hialuronidaz (factor de patogenitate). Catalaza negativ. Proprieti antigenice Antigenele termolabile - specifice de tip. Exist 2 tipuri antigenice, A i B, tipul A fiind mai virulent. Proprieti de patogenitate oarecele i porumbelul sunt sensibile la infectarea cu E. rhusiopathiae i sunt utilizate n laborator pentru testarea virulenei. Boala la animal se numete rujet.

Tratament
Cu lactamine, Tetracicline sau Streptomicina. 228

GENUL BARTONELLA
Caractere generale
Iniial speciile acestui gen au fost clasificate cu genul Ricketsia, din cauza unor omologii genetice. Speciile genului Bartonella determin sindroame febrile la pacieni imunodeficieni. Sunt bacili scuri gram negativi; Se dezvolt pe medii celulare i acelulare.

Reprezentai, infecii produse

Bartonella baciliformis: - Febra Oroya, Verruga peruana, boala Carrion - Rezervorul este uman, vectorul este flebotomul (America de sud) Bartonella quintana (Rochalimaea quintana): - Sindrom febril, Angiomatoza bacilar, Hepatita, Endocardit, - Rezervorul bacterian este uman, vectorul - insecte (America de Nord, Europa, Asia, Africa) Bartonella henseleae (Rochalimaea henselae): - Boala zgrieturii de pisic, boala transmis prin vectori (?) sau prin traumatism (zgrietura). Rezervor este pisica. Rspndirea bolii ntreg globul.

Aspecte clinice i patogenetice

Febra Oroya este un sindrom febril asociat cu anemie hemolitic (infectarea eritrocitelor), majoritatea cazurilor fiind diagnosticate n America de Sud. 15% dintre per-soanele arealului endemic care au supravieuit infeciei cu Bartonella baciliformis devin purttori asimptomatici, constituind rezervorul infeciei. Infecia se poate croniciza dar este puin evident din punct de vedere clinic. Angiomatoza bacilar se caracterizeaz printr-un sindrom febril nsoit de erupii cutanate papulare violacee, hepatosplenomegalie i adenopatii. Acest sindrom clinic survine preponderent la imunodeficieni. Boala zgrieturii de pisic este o infecie relativ benign, caracterizat prin febr i adenopatii, astenie i anorexie. La imunodeficieni, tabloul clinic este mai grav: exantem, adenopatii generalizate, artralgii i tulburri ale SNC.

Diagnostic de laborator
Examen microscopic 229

Coloraia Gram - bacili gram negativi. - B. baciliformis posed un flagel unipolar. Coloraia Warthin-Starry - coloraie special pentru seciuni histologice. Izolarea Bacteriile necesit Hb sau hemina ca factor de cretere obinut din lizat de hematii, agar cu extracte de cord i 5% snge, n atmosfer microaerofil. (5-10% CO2). Culturile se pozitiveaz la 10 zile de incubare la 28C. Cultivarea se poate realiza i n culturi de celule, care pot fi transpuse apoi pe mediile speciale. Alte teste cu rol diagnostic: Gaz cromatografia: prezena C18 este folosit pentru a realiza diagnosticul diferen-ial ntre Bartonella quintana (18%) i Bartonella henseleae (22%). Imunofluorescena indirect. Metod sensibil, realizeaz diagnostic de specie. Metode imunoenzimatice. Detecteaz anticorpii specifici atunci cnd culturile rmn negative Reacia n lan a polimerazei (PCR) Diagnostic histopatologic Reaciile inflamatorii se caracterizeaz prin infiltraii nodulare de limfocite, histiocite i neutrofile, cu zone de necroz central. Acest tip de reacie denot instalarea strii de hipersensibilitate de tip tardiv.

Tratamentul
Sunt eficiente Doxiciclina, Rifampicina sau Ciprofloxacina. Eritromicina este mai util n cazuri de angiomatoz baciliar. La subiecii imunodeficieni (ex.: SIDA) durata tratamentului antibiotic este de 8 12 sptmni. Rifampicina asociat cu aminoglicozidele are efecte benefice n boala zgrieturii de pisic.

Profilaxia
Cuprinde msuri care vizeaz ntreruperea lanului epidemiologic, controlul donatorilor de snge i distrugerea vectorilor. Rata mortalitii prin febra Oroya poate atinge 40%. Chimioprofilaxia cu antibiotice poate fi eficient. 230

CAPITOLUL 35 INFECII NOZOCOMIALE

Definiie, noiuni generale

Infeciile nozocomiale reprezint infeciile contactate n timpul spitalizrii, altele dect cele pentru care s-a realizat internarea. Pe lng infeciile care apar n unitile cu paturi trebuie menionate i izbucnirile epidemice care pot surveni i n alte instituii sanitare (instituii pentru copii, azile de btrni, etc.). Infeciile intraspitaliceti mai sunt denumite infecii interioare, infecii ncruciate (cross infections) sau hospitalism infecios. Acestea au o rspndire semnificativ, constituind o adevrat problem de sntate public. Se presupune c i n condiiile n care sunt asigurate toate condiiile igienice ale actului medico-chirurgical, incidena acestora poate atinge ntre 3% i 15%, cu o medie de aproximativ 6%. Prezena infeciilor interioare poate fi asemnat cu un aisberg, fiind evidente i tratate doar cele manifeste clinic, n timp ce formele subclinice i latente sau cele care se manifest dup externarea pacientului sunt cele mai numeroase. Din acest motiv, incidena real i numrul deceselor din aceste cauze este foarte greu de cuantificat.

Epidemiologia infeciilor nosocomiale

n general, sejurul n spital produce aproape la fiecare pacient o colonizare cu germeni de spital la nivelul tegumentelor i mucoaselor. Spitalele moderne reprezint o ambian microbian care asigur pe de o parte condiii pentru selecionarea unor microorganisme multirezistente la antibiotice, dar i condiii care favorizeaz implementarea acestora pe organisme deficitare imunologic, pe de alt parte. Dezvoltarea ulterioar colonizrii a infeciei subclinice sau clinice, depinde de numeroi factori legai att de microorganismul patogen, ct i de gazd. Verigile lanului epidemiologic la nivelul comunitii spitaliceti, prezint particulariti care in de arealul geografic i dezvoltarea economico-social, de profilul i calitatea serviciilor de sntate. 231

a) Sursa de infecie Este reprezentat de bolnavul nsi, de flora proprie pacientului modificat n cursul perioadei de spitalizare. Colonizarea cu flora microbian de spital crete riscul declanrii i evoluiei unei infecii cu germeni proprii pacientului. Omul ca surs de infecie poate fi bolnav cu forme clinice de boal sau purttor eliminator de germeni. bolnavul - surs de infecie, poate fi: - cu boal infecioas cu etiologie cunoscut, pentru care este spitalizat n vederea izolrii i tratamentului - bolnavul internat pentru diverse infeciuni care la internare nu prezenta sindrom infecios, dar se afla n perioada de incubaie - bolnavul internat pentru o afeciune oarecare, dar care prezint o infecie acut sau cronic, indiferent de etiologie, gravitate sau form de manifestare - bolnavul cu o boal infecioas spitalizat ntr-o secie necorespunztoare, prin erori de diagnostic la internare - bolnavul care n cursul spitalizrii, pe lng afeciunea de baz contracteaz o infecie supraadugat, indiferent c ea se manifest clinic, sau este numai un portaj de germeni - bolnavul care prezint la internare boli cu etiologie infecioas sau neinfecioas i care n acelai timp este purttor i de ali germeni purttorul eliminator de germeni poate fi: - fost bolnav cu o afeciune infecioas, care dup vindecarea clinic, poate gzdui i elimina pe diverse ci agentul patogen, intermitent sau continuu pe o perioad variabil de timp - purttor aparent sntos (precoce) n perioada de incubaie a unei boli infecioase, care elimin agentul patogen nainte de apariia manifestrilor clinice ale bolii - purttor sntos propriu-zis, care gzduiete i elimin agenii patogeni pe diferite ci, perioade variabile de timp. Formele de manifestare a procesului epidemiologic n infeciile nosocomiale sunt n funcie de precocitatea depistrii i neutralizrii lor, pe de o parte, de caracterele i varietatea germenilor pe de alt parte. Totodat o serie de factori precum: localizarea procesului infecios calea de transmitere i produsul patologic prin care este eliminat agentul patogen cantitatea i modul de eliminare a agentului patogen 232

 numrul de surse din unitatea spitaliceasc activitatea, mobilitatea, modul, frecvena i durata de contact pe care o realizeaz sursele de infecie din spital cu alte persoane comportamentul i nivelul igienico-sanitar al surselor de infecie profilul unitii spitaliceti receptivitatea general a organismului contribuie i ei la determinarea formelor de manifestare a infeciilor nosocomiale n spital. b) Cile de transmitere Transmisia asigur contactul dintre agenii microbieni i gazd. n mediul spitalicesc, transmiterea germenilor se face prin: Contact direct - minile infectate ale personalului medical - de la un pacient la altul Contact indirect - aparatur medical contaminat (de ventilaie asistat, dializ) - lenjerie, instrumentar, catetere vezicale, tuburi de dren, endoscoape, stetoscoape, manete de tensiometre, garoul, soluii perfuzabile, medicamente Aerian - particule de praf, microorganisme aerobe - transmiterea aerian constituie una dintre cele mai dificile probleme de igien a spitalelor d) Organismul receptiv Reprezentat de pacieni i personalul de ngrijire, care dup colonizare, dezvolt infecia, devin la rndul lor surse, deschiznd un nou ciclu al procesului epidemiologic. Factorii care pot altera aprarea organismului fa de agresiunea infeciilor sunt: afeciunea de baz i bolile asociate starea de nutriie, sexul, vrsta afeciunile intercurente tratamentele medicamentoase (imunodepresive,citostatice) actele medicale invazive (endoscopia, bronhoscopia,catetere intravenoase, etc.) tratamentele chirurgicale

233

e). Factori epidemiologici secundari infrastructura spitalului - pereii construciei n care pot fi cantonate levuri (Aspergillus) - sistem de ap necorespunztor expus contaminrii cu germeni gram negativi (Pseudomonas) - un umidificator de aer poate deveni surs de infecie dac apa este contaminat arhitectonica spitalelor care nu respect circuitele funcionale corecte separate curat-murdar, aseptic-septic, steril-nesteril - saloane supradimensionate, suprapopulate (n saloane cu 12 paturi, incidena I.N. este de 1% n timp ce n saloane cu 8-10 paturi incidena crete la peste 10%). (40) - neglijarea msurilor de igien - dotri necorespunztoare - deficiene cantitative i calitative de personal spitalizarea ndelungat influeneaz nefavorabil evoluia postoperatorie a pacienilor (dup 7 zile de la internare 50% dintre bolnavi sunt colonizai cu flor de spital, pentru ca n perioada imediat postoperatorie colonizarea s creasc pn la 75%.

Factori de risc implicai n geneza infeciilor nozocomiale

Unitatea spitaliceasc ntrunete cele trei condiii pentru apariia infeciilor nozocomiale: terenul receptiv prin vrst i boal, agentul microbian (patogen sau condiionat patogen, endogen sau exogen, ntotdeauna multiplu rezistent la chimioterapice antibacteriene), agentul infecios micotic, viral sau parazitar dar i ambiana poluat a mediului respectiv (neglijarea manoperelor de dezinfecie i sterilizare, suprapopularea saloanelor, etc.). Vrstele extreme atrag un deficit imunitar fiziologic, roentgenterapia sau terapia cu citostatice sau imunosupresoare, bolile asociate (diabet zaharat, neoplasme, boli virale anergizante, strile de oc) constituie factori de risc majori pentru apariia infeciilor respective, la care se adaug riscul manoperelor medico-chirurgicale invazive (perfuzii intravenoase, intubaii oro-traheale, interveniile chirurgicale propriu-zise). Ali factori favorizani se refer la arhitectonica spitalului, circuite necorespunztoare, spitalizri ndelungate nejustificate, abundena vizitatorilor sau prezena studenilor. 234

Utilizarea abuziv a antibioticelor selecteaz tulpini rezistente fa de marea majoritate a chimioterapicelor. Prin plasmidele R de rezisten (prin operonii RTF) se poate transfera n bloc chimiorezistena la aproximativ 90% dintre tulpinile existente n spital. Flora microbian local provine de la pacieni, de la purttorii sntoi (fr afeciuni clinic manifeste sau personal medical), din mediul spitalicesc sau extraspitalicesc (aparintori). De cele mai multe ori aceti factori de risc se nsumeaz, ceea ce contribuie la agravarea cazuisticii respective. Totui, n lumina celor prezentate se presupune c o durat a spitalizrii prelungit (peste apte zile), dubleaz practic riscul apariiei unei infecii interioare.

Forme clinice de infecii nozocomiale

Infecia de plag chirurgical superficial sau profund

reprezint cea mai frecvent complicaie a actului chirurgical Infecia tractului urinar este de asemenea foarte frecvent, att n sectorul medical, ct i n cel chirurgical (ex.: infecia asimptomatic, bacteriuria simptomatic, cistite, pielonefrite, etc.). Infeciile aparatului respirator: de tract respirator superior i inferior (ex.: rinofaringite, bronita, traheobronita, pneumonia, bronhopneumonia etc.). Infeciile ochilor, nasului, faringelui i cavitii bucale (ex.: conjunctivite, otite externe, medii i interne, mastoidita, faringita, laringita, epiglotita, sinuzita etc.). Infeciile aparatului digestiv (ex.: gastroenterocolita, enterocolita ulceronecrozant, duodenite, infecii intraabdominale diverse, peritonita). Infeciile aparatului cardiovascular (ex.: endocardite, pericardite, arterite, flebite). Infeciile sistemului nervos central (ex.: infecia intracranian, meningita, ventriculita, abces spinal). Infeciile aparatului osteoarticular (ex.: osteomielita, artrita, bursita). Infeciile aparatului de reproducere (ex.: endometrite, anexite, vulvovaginite, infecia epiziotomiei). Infeciile pielii i a esutului moale (ex.: escare de decubit, escare suprainfectate, mastita, omfalita, pustuloze, intertrigo). Infecia sanguin (ex.: bacteriemii tranzitorii, septicemii). Alte boli infecioase (hepatite cu transmitere parenteral i enteral, sindromul de imunodeficien dobndit, rujeol, rubeol, parotidit epidemic, grip), afeciuni micotice i parazitare. 235

Etiologia infeciilor nozocomiale

Etiologia bacterian este reprezentat prin stafilococi coagulazo pozitivi, coagulazo negativi, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactie, Streptococcus viridans, Streptococus pneumoniae, Enterococcus, Salmonella sp, Shigella, Escherichia Coli (tulpini EPEC, ETEC, EIEC, EHEC, EAAgEC), Proteus sp., Serratia sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Moraxella, Pseudomonas sp., Acinetobacter sp., Xantomonas maltophilia, Chorynebacterium amycolatum, Chorynebacterium jeikeium, Branhamella, Yersinia enterocolitica, Clostridium sp., etc. n funcie de ponderea etiologic trebuie s menionm n particular intervenia semnificativ a Staphylococcus aureus, Escherichia Coli, Enterobacter, Pseudomonas, Streptococcus sp. Etiologia viral este foarte bine reprezentat dar n ara noastr este insuficient diagnosticat. Virusurile hepatitelor ocup un loc aparte n ponderea etiologic a infeciilor interioare , att cele cu transmitere parenteral, ct i cele enterale. Agentul etiologic cel mai frecvent incriminat n etiologia hepatitelor posttransfuzionale este virusul hepatitic C. Virusul imunodeficienei umane ctigate este incriminat mult prea frecvent n etiologia infeciilor nozocomiale; contactul cu sngele infectat reprezint cel mai mare risc; n unele state se practic teste de rutin pentru toi pacienii. O alt etiologie important o constituie Herpeto-viridaele (virusul Epstein Barr, virusul citomegalic, varicelo-zoosterian) care produc infecii generalizate la subiecii imunocompromii. La sugari i copii intervin n geneza infeciilor interioare Rotavirusurile, Reovirusuri, Parvovirus B19, virusurile Coxsackie A i B, Enterovirusurile 60, 69, 70, 71 etc. n sezonul rece, virusurile gripale i paragripale, Rhinovirusurile, Coronavirusurile, se remarc printr-o morbiditate deosebit. Etiologia fungic i parazitar Candidozele localizate i generalizate sunt complicaii inerente ale tratamentului intempestiv cu antibiotice, care genereaz dismicrobisme severe. Ali ageni fungici ntlnii la persoanele imunodeficiene se refer la Aspergillus sp., Torulolepsis glabrata, Trichosporon cutaneum. Pneumocistozele i giardiozele nozocomiale sunt ntlnite frecvent n colectivitile de copii. 236

Apariia infeciilor interioare este strns corelat de gradul de contaminare al mediului din spitale. Prin aciuni cu caracter preventiv, supravegherea prin laboratorul de Microbiologie Virusologie Parazitologie precizeaz sursele de infecie, poluarea mediului, tulpinile implicate n etiologie, circulaia acestora, precum i rezistena lor la chimioterapice.

Diagnosticul infeciilor nozocomiale

Pentru ca o infecie s fie demonstrat ca nosocomial, nu trebuie s existe dovada c era manifest, sau n incubaie, la internarea n spital. Diagnosticul cazului de infecie nosocomial se face pe baza: a) datelor clinice - simptome clinice manifeste b) datelor de laborator - culturi bacteriene - teste de detectare a anticorpilor antigenelor - metode de vizualizare microscopic - alte teste paraclinice (CT, radiografii, etc.) c) datelor epidemiologice - factori favorizani (manopere invazive) - factori predispozani (afeciuni asociate)

Profilaxia infeciilor nosocomiale

Recunoscnd faptul c orice unitate spitaliceasc prezint riscul apariiei infeciilor nosocomiale, este necesar existena unor politici de control a acestora la nivelul fiecrui spital, care s asigure o supraveghere epidemiologic adecvat, precum i controlul aplicrii msurilor preventive i de combatere a infeciilor nosocomiale. Un studiu efectuat n SUA, a artat posibilitatea scderii ratei infeciilor nosocomiale cu 30-50% (n medie 32%) prin aplicarea unui program de prevenire, care cuprinde 5 obiective: urmrirea i informarea continu a clinicienilor privind cele mai frecvente infecii nosocomiale, adoptarea de ctre personalul medical a msurilor specifice de prevenire a infeciilor produse prin dispozitivele medicale invazive (sonde urinare, cateterisme, etc.), formarea continu a personalului n clinici, asigurarea resurselor necesare pentru derularea programului,

237

 prezena unui personal specializat: o asistent specialist de epidemiologie, un medic epidemiolog la 250 paturi, care s asigure activitile de urmrire i formare. Un alt studiu, efectuat n Germania, a relevat o scdere a incidenei infeciilor nosocomiale cu 17% pe an prin aplicarea unui program comparabil cu programul american. Pentru a veni n sprijinul personalului medico-sanitar din unitile clinice din ara noastr, n scopul identificrii, prevenirii i combaterii infeciilor nosocomiale, Ministerul Sntii a elaborat i publicat n 1994 Ordinul 984 Normele privind organizarea supravegherii, prevenirii i controlul infeciilor nosocomiale. Acest ordin, a fost conceput n 5 seciuni: 1. Criteriile de definire a infeciilor nosocomiale, clasificare pe aparate 2. Atribuiile personalului sanitar n prevenirea i controlul infeciilor nosocomiale 3. nfiinarea seciei de prevenire i control a infeciilor nosocomiale (SPCIN)- structur i atribuii 4. Supravegherea epidemiologic a infeciilor nosocomiale 5. Precauiunile universale COORDONATELE IGIENEI SPITALICETI Corectarea i constatarea cauzelor care duc la apariia infeciilor nosocomiale Evidenierea potenialului infecios din seciile cu risc Corelarea acestor poteniale cu situaia epidemiological existent Implicarea n activitatea de depistare, prevenire i combatere a infeciilor nosocomiale, precum i a altor probleme de igien spitaliceasc a ntregului personal Supravegherea continu a circuitelor funcionale Urmrirea asigurrii proteciei personalului medical i auxiliar Instruirea i perfecionarea continu a sistemului informaional din domeniul igienei spitaliceti Standardizarea protocoalelor de curenie, dezinfecie, sterilizare a aparaturii medicale OBIECTIVELE activitii de supraveghere igienico-sanitar, vizeaz cunoaterea statusului igienic din fiecare secie: cunoaterea topografiei i organizarea seciei specialitile medicale din subordine 238

 factorii de conducere sectoarele cu risc existena unui plan de dezinfecie, dezinsecie, deratizare ce materiale de curenie i dezinfecie avem la dispoziie protocoale de utilizare a acestora cunoaterea tehnicilor unitare i specifice condiii de colectare, depozitare a deeurilor dac exist izolator evidena controlului periodic al personalului instruirea periodic a personalului medical i auxiliar privind comportamentul igienic evidena infeciilor nosocomiale i urmrirea lor n dinamic i cunoaterea deficienelor igienico sanitare existente, Stabilirea programului cadru de supraveghere mpreun cu efii de secie Scopul msurilor de supraveghere este acela de a izola infecia, nu pacientul, i de a reduce costul asociat msurilor care nu sunt necesare n scopul izolrii. Profilaxia infeciilor nosocomiale include un ansamblu de msuri orientate spre ntreruperea lanului infecios. Fiecare etap a lanului epidemiologic depinde de realizarea etapei precedente. Dac se reuete ruperea acestui lan, infecia nu se mai rspndete. Din practica igienei spitaliceti, s-a constatat c cele mai eficiente msuri de prevenire i combatere a infeciilor nosocomiale sunt cele ndreptate asupra cilor de transmitere a agenilor etiologici. Astfel, toate unitile medicale au obligaia de a asigura: autorizarea funcionalitii instituiei cu respectarea circuitelor funcionale corecte - curat-murdar - aseptic - septic - steril - nesteril efectuarea dezinfeciei, dezinseciei, deratizrii profilactice curente respectarea riguroas a tehnicilor aseptice nivelul educaional i comportamentul igienic corespunztor ntregului personal asigurarea condiiilor optime de munc n cazul evoluiei unor focare de infecii nosocomiale, se vor lua de urgen urmtoarele msuri: depistarea i tratarea corect a tuturor cazurilor de infecii nosocomiale, cu emiterea diagnosticului complet, n baza datelor clinice, epidemiologice i de laborator 239

 izolarea i tratarea corect a cazurilor confirmate sau suspecte supravegherea corect a contacilor declararea i nregistrarea tuturor cazurilor aprute intensificarea controlului msurilor de prevenire a transmiterii i a dezinfeciilor terminale ancheta epidemiologic a fiecrui caz nregistrat investigaii de laborator competente msuri de ordin organizatoric i administrative Dac n gsirea soluiilor eficiente de prevenire a infeciilor nosocomiale rolul hotrtor l are epidemiologul n aplicarea acestora rolul decisiv l are personalul de ngrijire. Personalul medico-sanitar i auxiliar din spital, n funcie de pregtirea profesional, experien i disciplin poate avea o contribuie pozitiv n prevenirea apariiei infeciilor nosocomiale, dimpotriv, prin deficiene, pot favoriza sporirea numrului acestora, sau izbucniri epidemice. Pentru reuita aplicrii msurilor de prevenire i control a infeciilor nosocomiale, trebuie s existe o strns colaborare ntre serviciul de prevenire i control a infeciilor nosocomiale i celelalte sectoare de activitate din structura unitii spitaliceti. n concluzie, indiferent de agentul etiologic implicat n infeciile nosocomiale, msurile de prevenire i combatere vor urmri: supravegherea clinico-epidemiologic i de laborator a unitilor medicale cu paturi asigurarea posibilitilor de izolare adecvate amenajarea unor circuite funcionale corespunztoare asigurarea dezinfeciei, dezinseciei, deratizrii curente evitarea supraaglomerrii spaiilor de spitalizare respectarea de ctre personalul medical a normelor de igien, ncepnd cu splarea corect a minilor i folosirea adecvat a echipamentului de protecie. Respectarea msurilor profilactice e nsoit de scderea incidenei infeciilor nozocomiale.

240

CAPITOLUL 36 PLACA BACTERIAN. CARIA DENTAR

Modul de populare al cavitii bucale cu microorganisme
Retenia unei bacterii n cavitatea bucal poate fi de dou feluri: adeziv neadeziv (mecanic)
Reteniile adezive apar prin:

- Sinteza de polimeri extracelulari, realizat de ctre unele bacterii. - Ataarea unei bacterii (nesintetizante de polimeri) pe polimerii sintetizai de ctre altele (fenomen de piraterie). - Ataarea prin nveliul fibrilar propriu bacterian (glicocalix). - Ataarea unor bacterii prin intermediul altora. - Simpla depunere a bacteriilor pe suprafeele dentare este temporar; reteniile adezive ns tind spre stabilizare. Depunerea bacteriilor pe suprafeele dentare este favorizat de: - mrimea celulei bacteriene (celulele mari se depun mai uor dect cele mici). - forma celulei - bacilii, formele spirilare - se depun mult mai uor dect formele sferice (cocii). - factorii de patogenitate bacterieni (ex.: cord-factorul micobacteriilor ce favorizeaz depunerea bacteriilor n grmezi uvie - pe diferite suprafee). - suprafaa rugoas a peretelui celular bacterian, a dinilor. Numeroasele depuneri-aderri sunt n marea majoritate a cazurilor reversibile. Interaciunile adezive sunt n general ireversibile i produc colonizarea bacterian. Colonizarea bacterian reprezint o interaciune ntre trei factori: - bacterie - suprafaa de aderare - ecosistemul cavitii bucale. Aderarea bacteriilor pe suprafaa dinilor este o preferin de specie bacterian. Exemple: Streptococcus Salivarius - se fixeaz pe dosul limbii Streptococcus mitis - se fixeaz pe mucoasa obrajilor Streptococcus mutans - se fixeaz pe dini 243

 Streptococcus sanguis - se fixeaz pe dini i ntre acetia Streptococcus salivarius - colonizeaz doar suprafeele netede Streptococcus mutans - colonizeaz doar suprafeele rugoase.

Colonizarea - presupune o dezvoltare numeric abundent a speciilor patogene, n detrimentul celor comensale. Pentru a fi realizat, doza infectat cu specia patogen trebuie s fie mai mare de 108 bacterii/ml saliv. - se poate realiza i la doze infectante mai mici, mai ales la speciile cu patogenitate crescut. Spre exemplu: Streptococcus sanguins - necesit 104 bact/ml saliv Streptococcus mutans - necesit 105 bact/ml saliv (deci colonizarea este un atribut al speciei bacteriene). - trebuie s nving mecanismele rezistenei naturale locale, anume: splarea permanent a suprafeelor dentare i a limbii prin saliv i ndeprtarea permanent a bacteriilor prin deglutiie.

Mecanisme adezive
Aderarea prin producere de polimeri extracelulari
Streptococcus mutans

- Produce din sucroz un polimer de dextran extracelular, cu care ader i se menine pe orice suprafa, att in vivo ct i in vitro. Fitzgerald (1969) a reuit s previn formarea plcii dentare folosind dextranaz, enzim care degradeaz dextranul. n alt experiment, se demonstreaz faptul c streptococul mutans poate fi aglutinat n prezena dextranului, pe cnd alte bacterii nu pot aglutina n prezena acestuia. - Proprietatea adeziv a dextranului favorizeaz aderena altor specii bacteriene (n mod nespecific), prin simplul fenomen fizic al vscozitii. - n lipsa sucrozei, colonizarea cavitii bucale cu Streptococcus mutans nu se produce (sucroza este i substratul nutritiv pentru Streptococcus mutans). Actynomices neslundii - Ader la dini prin acidul hialuronic pe care l secret. - Aderarea sa este nlturat prin hialuronidaz. Alte specii de Actynomices - Secret levani sau polizaharide.

244

Aderarea prin polimeri salivari - n saliv exista glicoproteine diverse care dau caracterul vscos al salivei. - Aceste glicoproteine se pot fixa pe dini n mod permanent i pot reine bacterii din saliv pe suprafaa dinilor. - Cu ct greutatea molecular a glicoproteinei este mai mare, cu att vscozitatea sa crete i aderarea bacterian este facilitat. - Polimerii salivari constituie matricea de la baza plcii dentare pe care se face aglomerarea diverselor celule bacteriene. - Diferitele tipuri de polimeri salivari aglomereaz n mod selectiv anumite specii bacteriene din cavitatea bucal. Experimentul lui Hilmann (1970) demonstreaz c Streptococcus salivarius i Streptococcus sanguis ader n mod egal pe smalul dintelui n lipsa salivei, iar Streptococus salivarius este de 100 de ori mai aderent dect Streptococcus sanguis n prezena salivei. - Diferitele glicopeptide din secreiile bronice au rol n aderarea bacteriilor pe suprafeele dentare. Ataarea prin nveli fibrilar - nveliul fibrilar (glicocalixul) este de natur polizaharidic sau proteic, microfilamentele avnd rol n aderarea bacteriilor pe diferite suprafee (ex.: streptococii patogeni). Aceste filamente sunt mai fine i mai scurte dect pilii bacterieni. - Pilii bacililor constituie factori de aderare. Ataarea prin intermediul altor bacterii A fost postulat de ctre Gibson i Nygaard care constat prezena reaciilor de aglutinare ntre specii bacteriene diferite, cauzele fiind: - nrudirile antigenice - structurile de patogenitate de suprafa

245

n plcile dentare formate de ctre bacteriile cu mare capacitate de aderare, cum ar fi Streptococcus mutans, Actynomices naeslundii i Actynomices viscosis, se fixeaz bacterii care au putere de aderare mai mic, ca de exemplu genul Veillonella, care se fixeaz n placa dentar a Actynomices viscosus.

Retenii mecanice
- Prin adsorbirea bacteriilor pe substratul moale al resturilor alimentare ce stagneaz, n caz de igien bucal deficitar. - Prin ptrunderea accidental a bacteriilor n fisurile dinilor sau n anul gingival, odat cu saliva. n ambele cazuri, bacteriile se nmulesc exagerat, deoarece exist substrat nutritiv iar n zonele respective aciunea mecanic de splare a salivei este foarte redus. Aceste mecanisme sunt caracteristice speciilor bacteriene cu aderen foarte slab: - Lactobacillus - Bacteroides melaninogenicus - Fusobacterium Cu ct o dantur este mai rugoas sau mai fisurat (sau mai protezat), cu att periajul de ntreinere ndeprteaz bacteriile mai greu. Prin formele filamentoase, bacteriile sunt mai uor retenionate. Exemple: Bacillus megaterium Treponeme saprofite Actynomices Micelii de levuri Aceste microorganisme au tendina s formeze ghemuri, n ochiurile crora stagneaz alte bacterii.

Dezvoltarea microorganismelor din cavitatea bucal

Cavitatea bucal ofer un loc ideal pentru dezvoltarea microorganismelor, prin urmtorii factori: - pH-ul bazic i umiditate optime - prezena O2, CO2 - pentru bacteriile care au nevoie de acestea - potenial redox sczut, prin plasarea bacteriilor n anul gingival sau ntre pliurile mucoaselor - aportul nutritiv care este permanent, alimentele rmnnd ntre cutele mucoaselor, n anul gingival, chiar dup splarea dinilor 246

- saliva conine 18 aminoacizi, acid hialuronic, condroitin sulfat, celule epiteliale descuamate, care pot servi ca substrat nutritiv - saliva conine de asemenea 0,03 - 0,13% proteine, iar saliva din anul gingival conine de 30 de ori mai multe proteine. Deci i n condiiile unei igiene bucale mai mult dect riguroase, substratul nutritiv pentru bacterii este furnizat de ctre saliv. Diferitele specii bacteriene i ofer una alteia substanele de care au nevoie: Exemplu: Treponema microdentium se dezvolt n prezena izobutiratului furnizat de ctre difteroizii i fusobacteriile din cavitatea bucal. Speciile aerobe consum n mod permanent oxigenul, favoriznd dezvoltarea speciilor anaerobe n anul gingival sau n plcile dentare. Prezena florei comensale se opune colonizrii cu flora patogen - prin competiia pentru substanele nutritive. Dezvoltarea preferenial a unei specii bacteriene este favorizat uneori prin dieta alimentar a gazdei. Spre exemplu, pentru dezvoltarea Streptococului mutans, este absolut necesar prezena sucrozei (existena n dulciurile rafinate). Lipsa sucrozei din alimentaie scade incidena Streptococului mutans, dar n mod reactiv crete incidena Streptococului sanguis. Cantitatea prea mare de proteine din alimentaie determin nmulirea accentuat a bacteriilor gram negative i a bacililor pleimorfi (care favorizeaz formarea tartrului). Dieta bogat n zaharuri favorizeaz apariia bacteriilor gram pozitive (coci). Dieta compus din alimente moi d un procent mai mare de plci dentare i gingivite. Alimentele moi au o vscozitate mai mare i favorizeaz aderarea bacteriilor. Laptele formeaz o adevrat pelicul adeziv. Regimul alimentar consistent are rol de ndeprtare mecanic a florei bacteriene. Alimentele dure nu sunt retenionate n anurile gingivale. Inflamaiile gingivale, prin exudatul proteic local - favorizeaz elemente nutritive. Experimental, n gingivitele cronice - plcile dentare cresc n volum. Pungile paradontale (prin necrozarea esuturilor locale) favorizeaz dezvoltarea bacteriilor anaerobe i a bacteriilor proteolitice. Acest tip de bacterii stimuleaz apariia necrozelor locale, cu ntreinerea unui cerc vicios. Exemplu: Lactobacillus arabinosus i procur factorul su de cretere (acidul nicotinic) - din dentina dintelui pe care l paraziteaz, bacteria invadnd canaliculele dentinale. 247

Repartizarea i numrul bacteriilor din cavitatea bucal

Speciile bacteriene nu sunt distribuite n mod uniform n cavitatea bucal - ele au preferin pentru dezvoltarea pe anumite arii (suprafee), denumite nie ecologice. Saliva, n momentul secretrii ei, nu conine bacterii dar se ncarc repede pn la 109 bacterii/ml. Concentraia cea mai mare de bacterii n saliv se gsete n timpul masticaiei, prin mobilizarea bacteriilor i n timpul dimineii, deoarece cantitatea de saliv noaptea e mai mic. n saliv exist cel puin 35 de specii bacteriene, menionate n ordinea descresc-toare a frecvenei lor: Streptococi, Veillonella Bacili anaerobi i facultativ anaerobi Stafilococ alb i aureus, Micrococi Spirili, Spirochete - Treponema macrodentium, Treponema oralae Haemophilus (aprophilus, paraprophilus, influenzae, parainfluenzae) Rothia

Placa dentar
Reprezint un conglomerat de bacterii pe un anumit spaiu dentar habitat) i care conine 1011 microorganisme / gram de plac. Coninutul bacterian al plcii dentare:
Streptococii - reprezint 1/4 din bacteriile din placa dentar i mai

puin de 1/4 din bacteriile din anul gingival. Neisserii comensale | Veillonella | reprezint 3...5 % Lactobacillus | Stafilococii epidermidis Spirochete Actinomicete Neisseria, Veillonella, Lactobacillus sunt ntr-o cantitate considerabil la pacienii cu carii dentare i paradontoze. Candida albicans este prezent la 50% dintre persoanele adulte n placa dentar. Protozoarele sunt prezente n cantitatea bucal la cei cu igiena foarte precar. 248

E. Coli este prezent tranzitoriu n cavitatea bucal ntr-o proporie de 1% la aduli i 5% la copii. Streptococii hemolitici apar ocazional la purttori i atunci ocup 12 - 30% din flora bacterian. Bacteroides melaninogenicus apare n infeciile parodontale.

249

Localizarea bacteriilor n cavitatea bucal

Streptococcus salivarius i Veillonella

- cu localizare pe dosul limbii - se instaleaz aici la cteva zile dup natere. - suprafaa respectiv este bogat n bacterii ntocmai ca i placa dentar. Lactobacillus este prezent n caria dentar, fisurile ocluzale i pliurile mucoaselor. Streptococcus mutans este localizat pe suprafee dure (dini) i colonizeaz cavitatea bucal numai dup apariia primilor dini la copii. Streptococcus sanguis colonizeaz cavitatea bucal dup apariia dinilor (dar apare naintea Streptococcus mutans). Streptococcus mitis ader numai pe prile moi, pe suprafaa epitelial a obrajilor. Bacteriile strict anaerobe sunt prezente n anul gingival, deoarece potenialul redox este aici foarte sczut. De exemplu, Bacteroides fragilis, Bacteroides melaninogenicus, Fusobacterium. Aceste specii apar dup erupia dentar. La edentai anaerobii lipsesc.

Ecosistemul cavitii bucale

n cadrul acestui sistem, exist dou tipuri de relaii: a) relaii ntre microorganisme b) relaii ntre microorganisme i macroorganism (cavitate bucal care ofer bacteriilor spaiu i condiiile de dezvoltare). Relaii ntre microorganisme: Relaii tip simbioz - sunt relaii de beneficiu bilateral ntre microorganisme. Spre exemplu, Stafilococul ofer factori de cretere (x i v) pentru genul Haemophylus. Stafilococul poate fi o surs de vitamina A pentru Bacteroides melaninogenicus. Relaii de inhibiie - unilateral - bilateral, reciproc Exemple: Lactobacillus - prin scderea pH-ului, produce un mediu nefavorabil pentru alte specii (Pseudomonas, Proteus, Bacteroides); - Bacteriile ce produc bacteriocine inhib alte specii de bacterii; - Streptococcus viridans elaboreaz peroxid de hidrogen ce duneaz bacteriilor care nu au catalaz; 250

- Lipsa bacteriilor aerobe duneaz speciilor anaerobe, prin lipsa consumului de oxigen, care e toxic pentru anaerobi. Din cauza acestor relaii, populaiile bacteriene sunt ntr-o dinamic permanent (compoziia florei bacteriene e variabil pe un anumit habitat).

Factori care contribuie la limitarea dezvoltrii bacteriene

1. Lizozimul - cu aciune bactericid pe bacteriile gram pozitive 2. Sistemul lacto - peroxidaz - tiocianat - ap oxigenat 3. Acizi grai volatili 4. Protozoare i bacteriofagi care distrug bacteriile 5. Saliva (1-1,5 l/24 ore) spal permanent suprafeele moi i dure i transport bacteriile spre aciditatea stomacului (cu rol bactericid) 6. Descuamarea continu a celulelor epiteliului bucal are rol n ndeprtarea microorganismelor.

Particularitile ecosistemului bucal

- Este stabil, cu un echilibru relativ ntre specii, la acelai individ - n timp i n condiii obinuite; - Controleaz rezidena bacteriilor nou intrate n ecosistem; - Controleaz virulena bacteriilor din ecosistem; Spre exemplu, Streptococcus viridans, integrat n ecosistem este comensal, dar scpat n torentul circulator, dup intervenii sngernde, produce endocardita bacterian subacut. n ecosistemul cavitii bucale predomin n mod evident streptococii. Printr-o anumit structur a florei comensale, acest tip de flor se opune implantrii speciilor de bacterii patogene. De exemplu, administrarea de penicilin distruge cocii gram pozitivi i favorizeaz dezvoltarea necontrolat a bacililor gram negativi.

Descrierea aciunii factorilor de aprare

1. Lizozimul - este prezent n saliv, mucusul nazal, lacrimi, leucocite. - crete cantitativ n gingivite i boala parodontal - acioneaz pe peretele celular, distrugndu-l (la bacteriile gram pozitive se obine un protoplast) - n combinaie cu Sistemul C' produce i liza bacteriilor gram negative - nu se epuizeaz n timpul activitii sale (are rol de catalizator). 251

2. Sistem lactoperoxidaz - tiocianat - ap oxigenat - este component de secreie al glandei parotide i submaxilare; nu se gsete n serul sanguin - apare la nou nscui i acioneaz pn la 10 ani - efectul sistemului este bacteriostatic iar spectrul su include Lactobacillus i Streptococi din grupul antigenic N - la persoanele cu carii dentare, sistemul este n cantitate foarte mic. 3. Factorul Green - este prezent n saliva persoanelor fr carii - are efect antibacterian, mai ales pe Lactobacillus, Streptococcus salivarius i Streptococcus mitis - are rol de catalizator, nu se consum n reacie, ntocmai ca i lizozimul - se asociaz gamaglobulinelor i la electroforez precipit odat cu ele - este de fapt un anticorp natural. 4. lizinele din serul sanguin - acioneaz pe bacterii gram pozitive - au ca i cofactori - ionii de calciu i de carbonat - efectele lor sunt extrem de rapide. 5. Anticorpii salivari locali Imunoglobulina A - este prezent la nivelul mucoaselor i n saliv. Rolurile imunoglobulinei A: - inhib aderena i colonizarea speciilor bacteriene pe suprafaa dinilor - nu are nevoie de aciunea complementului pentru a realiza rolul su antibacterian - s-a conturat ideea unui vaccin anticarie (anti Strepto-coccus mutans). Imunoglobulina G - predomin n fluidul anului gingival. 6. Glicoproteinele salivare - aglomereaz bacteriile i le ndeprteaz prin deglutiie. 7. Fagocitoza - fagocitele sunt prezente n cavitatea bucal n lichidul din anul gingival i pe mucoasa gingival - leucocitele PMN neutrofile predomin, mai ales n inflamaiile gingivale i ale paradontiului - enzimele lizozomale eliberate din PMN au efect bactericid, care se 252

sumeaz lizozimului. 8. Anticorpii serici specifici - ajung n saliv prin glandele salivare i prin fluidele de la nivelul anului gingival - sunt imunoglobuline de tip G i ajung pasiv n cavitatea bucal, peste un anumit titru. 9. Bacteriofagi - cu rol litic asupra unor bacterii.

Contribuia florei microbiene la producerea cariei dentare

Miller (1890) presupune etiologia infecioas a cariei dentare astfel: - bacteriile produc acizi organici ca rezultat al metabolismului (demineralizare); - bacteriile produc dezorganizarea structurii proteinelor dentare. Cele dou procese ar decurge n etape succesive.
Acidifierea pH-ului bucal

1. Streptococii viridans - prin fermentaia zaharurilor scade pH sub 5,5 (nivelul critic de la care ncepe demineralizarea smalului) - Streptococcus viridans produce o cantitate mai mare de acid dect celelalte bacterii acidogene (de ex. Lactobacillus) - Streptococcus viridans ajunge n caviatea pulpar prin canaliculele dentinale (aa se explic i progresia unei carii). 2. Lactobacillus - pe locul doi n producerea de acid n cavitatea bucal; - lipsa igienei bucale ntreine dezvoltarea exagerat a acestora, dei n mod normal cantitatea lor este mai redus; - acetia au fost gsii mereu pe suprafaa cariei, niciodat n cariile profunde, deoarece au un slab caracter invadant, din cauza echipamentului enzimatic srac. 3. Actinomicetele, Levurile, Stafilococii, Micrococii - produc acizi diveri din zaharurile concentrate - acizii contribuie la demineralizarea rapid a dintelui.
Rapiditatea coborrii pH-ului i repetarea acestui proces n aceeai zon - este un element esenial n producerea unei carii dentare

253

- capacitatea de a scdea intens pH-ul i rapiditatea coborrii pH n aceeai zon, sunt elemente eseniale pentru demineralizarea smalului.

254

Tullar a adugat zaharoz sau sucroz pe sedimente salivare extrase din cavitatea bucal i a observat cum scade pH-ul brusc (pH 4,3 i mai puin) n decurs de 1 pn la 6 minute maximum). Stephan a presupus urmtoarele: dac se admite ca pH-ul critic pentru hidroxiapatit este 5,5, atunci speciile acidogene cele mai importante sunt: - Lactobacillus - casei - plantarum - Streptococcus - mutans - sanguis, mitis - salivarium - Stafilococus - Micrococus Hidroxiapatitul din structura smalului dentar ar fi protejat (chiar n condiiile unui pH foarte sczut), prin prezena ionilor de calciu i fosfor din structura salivei normale. Acizii ce se produc prin fermentarea bacterian sunt splai de la locul producerii lor, prin micrile musculare i adui n contact permanent cu ionii de calciu i fosfor care i neutralizeaz. Fr aceste sisteme tampon, incidena cariilor ar fi enorm, de la cele mai fragede vrste. Acizii produi ntr-o anumit zon - n mod repetat - ajung s fie neutralizai prin substanele minerale ale hidroxiapatitului smalului, care devine astfel solubil. De aici se declaneaz demineralizarea.
Demineralizarea dintelui

Permite o cale larg de acces bacteriilor i enzimelor spre interior. Se produce cu att mai repede, cu ct: - vechimea plcii este mai mare - este meninut timp mai ndelungat pH-ul acid - exist un adaos de sucroz n mod repetat, mai ales ntre mese. Fazele anatomopatologice ale cariei dentare 1. demineralizarea 2. decolorarea 3. dezorganizarea structurii smalului 4. adncirea leziunii n smal 5. atacarea dentinei Demineralizarea - apare sub aciunea acizilor bacterieni, imediat sub placa dentar, dac nu funcioneaz sistemele tampon salivare; 255

- pH-ul de 5,5 este critic pentru demineralizare; - la acest pH se distruge structura smalului i proteinele din structura acestuia devin solubile n acizi; - la pH acid se solubilizeaz fosfatul de calciu. Stephan a demonstrat ntr-un expriment pe 192 de subieci - faptul c pH-ul la nivelul leziunilor carioase este de 5,5. Acest pH este favorabil lactobacililor, care abund n cariile de suprafa i n jurul lor. - se produc fisuri dup demineralizare, fisuri n care stagneaz bacteriile. Bacteriile proteolitice degradeaz matricea proteic a dintelui, prin enzimele lor. - sub influena enzimelor bacteriene, esuturile dure ale dintelui devin esuturi moi. Degradarea esuturilor evolueaz mai rapid dect invazia celular microbian propriu-zis. Miller - a identificat aproximativ 20 de specii bacteriene care posed enzime care distrug dentina. Aceasta observaie a servit ca model etiologic pentru cariile observate la persoane care au n permanen un pH alcalin al cavitii bucale. Compuii proteici rezultai din metabolismul bacterian se pot lega de anionul de cal-ciu provenit din structura smalului i pot forma chelai de calciu, att la pH neutru ct i la pH bazic. Din aceasta teorie, se deduce faptul c procesul de demineralizare i cel de proteoliz se produc simultan, i nu separat. Formarea de chelai de calciu cu aminoacizii conduce la o scdere a pH-ului foarte important. Neumann - a subliniat faptul c solubilitatea hidroxiapatitului este maxim sub pH 5 i o scdere a lui cu 0,1 uniti este suficient s-i creasc solubilitatea de 10 ori. Arhens i Ranke - au gsit n saliva omului, mici cantiti de produi de metabolism bacterian fosforilai, toi capabili s formeze compui cu calciul. n favoarea teoriei proteolizei prin chelatizare s-a observat c administrarea in vivo a agenilor chelatizani (EDTA) grbesc procesul de dizolvare al smalului, att la bolnavi ct i la animalele de experien. Concluzii - n etiologia cariei, un rol important l are pH-ul acid, pe care l produc n gur microbii zaharolitici n perioada imediat urmtoare meselor. - Proteoliza cu formarea chelailor de calciu ar surveni mai tardiv, n perioada dintre mese, cnd pH-ul a redevenit neutru sau alcalin. Proteoliza ar fi procesul prin care se extind leziunile carioase. Deci n ambele ipoteze, rolul bacteriilor este esenial, n aa fel nct caria dentar poate fi considerat o boal infecioas. 256

Contribuia microorganismelor la formarea i evoluia plcii dentare

Placa dentar rezult dintr-un mecanism de localizare i stagnare cantitativ a microorganismelor din cavitatea bucal, pe suprafaa smalului. Depunerile din cavitatea bucal sunt de dou tipuri: moi i dure. Depunerile moi sunt depozitri de resturi alimentare la care se adaug: celule epiteliale descuamate, leucocite, microorganisme. Acestea sunt consecina unei igiene bucale defectuoase. Placa dentar este o depunere cu o duritate mare, cu aderen puternic la nivelul coletului. Culoarea sa variaz de la galben la negru i evolueaz n doua direcii: spre calcifiere (spre formarea tartrului) sau nspre iniierea cariei. Formarea ei presupune apariia matricei i suprapunerea bacterian. Formarea matricei plcii dentare - Mucoidul salivar natural este compus dintr-un complex mucopolizaharidic. n stare de soluie servete ca agent lubrifiant i ca agent protector. - Mucoizii salivari ncep s precipite de la pH 5. Dei saliva conine mucinaz, enzim care solubilizeaz precipitatele, totui enzima este inhibat la pH acid. - Bacteriile degradeaz mucoproteinele salivare, desfcnd componenta proteic de cea glucidic. - Componenta proteic precipit pe suprafaa dinilor, formnd matricea. - Matricea se formeaz cam n 24 de ore i grosimea ei este de 1-5 microni. Suprapunerea bacterian - Pe matrice se depun treptat colonii microbiene, deoarece exist o mare adezivitate la nivelul plcii. - Unele bacterii, odat depuse, sintetizeaz polimeri extracelulari, cu care se ataeaz mai bine de matrice. Spre exemplu, Streptococcus mutans, sanguis sau salivarius. - n diferite experimente pe animale, s-a constatat faptul c Streptococcus mutans are potenial cariogen n regim alimentar bogat n sucroz.
Streptococcus mutans

Sucroz ----------------------------------> Dextran + Fructoz

Dextransucraze Streptococcus mutans

257

Sucroz ----------------------------------> Levan + Glucoz

Levansucraze

Dextranul - produce agregarea bacteriilor pe suprafaa dinilor - formeaz matricea stabil a plcii dentare. Fructoza - folosit ca surs de carbon i energie pentru streptococi poate fi metabolizat n compui acizi care produc caria dentar. n placa dentar predomin Streptococcus mutans i Streptococcus sanguis. Nu exist Streptococcus mitis, deoarece acesta nu sintetizeaz polimeri. Ali polimeri produi de ctre Streptococcus mutans: glicani, mutani, fructani, dextrani, levani. Aceti polimeri prezint o mare instabilitate. Glicanii sunt mai importani dect levanii n fenomenul de aderare, avnd rol esenial n cariogenez. Streptococcus sanguis - produce glican insolubil, n aceeai cantitate ca i Streptococcus mutans, dar i glican solubil, care servete ca surs nutritiv pentru bacteriile din placa dentar. Produce de asemenea fructan insolubil, n cantitate de 4 ori mai mare dect Streptococcus mutans. Streptococcus salivarius - se gsete n cantiti mai mari n saliv i pe dosul limbii. Sintetizeaz abundent fructan solubil, ca surs acidogen n producerea cariei. Streptococcus mitis - nu produce polimeri. ntr-un experiment s-a nlocuit sucroza din alimentaia unor pacieni, cu glucoz; s-a pstrat un lot martor care a consumat numai sucroz. S-a constatat faptul c grupul care a consumat glucoz nu a fcut plci dentare sau carii. Deci sucroza este o surs de polimeri solubili i insolubili, absolut necesar pentru formarea matricei plcii dentare. i alte specii produc polimeri extracelulari: Actinomyces naeslundii - produce polimeri de acid hialuronic i levan. Actinomyces viscosis - poate forma caria dentar i singur, fr aportul altor specii bacteriene. Cu ajutorul acestei specii s-a indus experimental boala la hamsteri. S-a demonstrat pe obolan faptul c Actinomyces naeslundii i A.viscosis pot induce boala paradontal n absena sucrozei. S-a demonstrat de asemenea, faptul c fosfolipidele din peretele celular al actinomycetelor i N-acetil-glucozamina, pot aciona ca polimeri extracelulari cu rol adeziv. Aceti polimeri interacioneaz cu glicoproteinele salivare i cresc frecvena de apariie a plcii dentare i de aceea, speciile de Actinomyces au 258

fost denumite microorganisme formatoare primare de plac dentar. Depunerile microbiene din matrice au un caracter inegal. Invazia bacterian ncepe la 2-4 zile i e complet la 9 zile. Colonizarea iniial a matricei se face cu bacterii aerobe, mai ales coci gram pozitivi. Bacteriile gram negative, mai ales bacilii, se gsesc la suprafaa plcii dentare. Spirochetele i vibrionii lipsesc n aceast faz iniial. n stadiul final apar bacteriile anaerobe. Formele bacilare se ataeaz perpendicular pe suprafaa dintelui, corpul bacilar constituind textura plcii dentare. Microcoloniile de coci apar sub forma unor grupuri compacte ntre fibrele texturii.

Dinamica plcii dentare

Ritz - a studiat speciile bacteriene care se depun n placa dentar, din prima zi pn ntr-a noua. n toate zilele, streptococii predomin (30-40 %), ajungnd la proporia de 70% n ziua a treia. Neisseria i Nocardia sunt abundente n primele zile i descresc treptat numeric. Fusobacterium, Veillonella i Actinomyces cresc de la 3% n ziua nti pn la 23% n ziua a noua. Pe msur ce placa se nvechete, cocii gram pozitivi sunt nlocuii de ctre bacili gram negativi. n placa de pn n ziua a noua predomin cocii, n proporie de 64%. n placa de 24 de zile, bacilii gram negativi ajung la 70% ca proporie. Compoziia plcii dentare este unic n acel loc i n acelai timp, la un anumit individ. ndeprtarea unei plci dentare poate fi urmat de formarea unei noi plci, cu o alt compoziie calitativ i cantitativ. Aderena bacterian este o condiie primordial pentru formarea plcilor, chiar i n lipsa speciilor bacteriene cariogene. Numrul bacteriilor viabile din caria dentar este variabil, dup diferii autori: - Klinger : 5 x 107 bacterii/mg de plac - Stralfors : 4 x 108 bacterii/mg de plac Placa bacterian conine aproximativ 30 de specii bacteriene. Apa reprezint 80% din greutatea plcii dentare. Componenta solid a plcii dentare reprezint 20% i este compus din: materii organice i anorganice, bacterii, oligoelemente, leucocite degradate, resturi alimentare, celule epiteliale descuamate.

Evoluia plcii dentare

259

1. Placa dentar poate rmne ca atare un timp nedefinit. Ea poate rmne neobservat, de aceea pentru punerea ei n eviden se pot folosi diferii colorani (eozina, fuxina sau permanganatul de potasiu). 2. Placa evolueaz prin calcifiere, spre formarea tartrului dentar. 3. Placa dentar evolueaz spre boala parodontal. 4. Placa evolueaz spre caria dentar, prin activarea bacteriilor acidogene: perioada precarie este de 96 de sptmni iar perioada de apariie a cariei propriu-zise este de 117 sptmni. 5. Acumulrile de plci dentare duc la gingivite (nocivitate pentru esuturi). Din punct de vedere morfopatologic apar: - torsiuni ale vaselor - edeme - peteii hemoragice. Aceste manifestri morfopatologice au fost obinute prin inocularea coninutului microbian al plcilor dentare la animalele de experien. Efectele hemoragice apar prin aciunea toxinelor bacteriene i a enzimelor lor. Un alt experiment pe animale arat c: cu ct se injecteaz unui animal o suspensie mai concentrat, din mai multe plci dentare (chiar numai de 2 zile vechime), cu att reaciile inflamatorii sunt mai grave. Adams i Cowly - au pus plac dentar triturat pe patru feluri de culturi de celule; acetia au observat o inhibiie n dezvoltarea celor 4 tipuri de celule. S-a concluzionat c placa dentar irit epiteliul de la baza anului gingival. Mc. Donald - a inoculat subcutanat la animale - suspensii de plci dentare i a obinut abcese. S-au obinut astfel distrucii la nivel vascular; de aici s-a evideniat rolul toxinelor n geneza inflamaiei i a distruciei tisulare, ce are loc n boala parodontal.

260

Efectul chemiotactic al plcilor dentare

Plcile dentare au funcie chemotactic pentru leucocitele neutrofile, att in vitro ct i in vivo. Cu ct suspensia de plci dentare este mai concentrat, cu att funcia lor chemotactic este mai intens. Factorul C5a al sistemului complement, precum i endotoxinele bacteriilor gram negative - sunt principalii factori chemotactici. Leucocitele PMN atrase, elibereaz enzime lizozonale cu rol necrotizant asupra esuturilor. Aciunea distructiv asupra colagenului datorit plcii dentare: Loesche i Paunio au evideniat prezena n plcile dentare a bacteriilor: Bacteroides melaninogenicus, Clostridium hystoliticum i Bacillus cereus, bacili care au activitate colagenazic intens prin enzime.

Dezinfecia Cavitii Bucale

Problema dezinfectanilor cavitii bucale se pune: - dup extracii dentare - dup operaii efectuate la nivelul cavitii bucale - n boala parodontal - naintea efecturii manoperelor sngernde stomatologice - pentru prevenirea plcilor dentare - pentru tratarea afeciunilor bucale stomatologice i nestomatologice (amigdalite, faringite, stomatite). Periajul dinilor Un periaj dentar dup fiecare mas este un lucru esenial, dar cu toate mijloacele utilizate, cavitatea bucal nu va fi niciodat sterilizat, deoarece: - aportul bacterian este asigurat permanent, mpreun cu alimentele - rapiditatea nmulirii bacteriene prin sciziparitate este n jur de 20' (timp de gene-raie foarte scurt) - afectiunile gingivale i cariile - constituie focare ce asigur nmulirea permanent a bacteriilor.

Condiii pentru un dezinfectant bucal ideal:

- s nu fie toxic - s nu fie caustic pentru mucoase - s fie eficient ntr-o cantitate ct mai mic - s fie bactericid - s nu coloreze sau s decoloreze dinii - s nu aib reacii adverse pe cale general. 261

Aceste substane sunt puine; fluorurile ar ndeplini acest tip de condiii. Mecanismele de aciune ale fluorurilor: (Cimasoni - 1972) - producerea unui smal dentar mai rezistent la contactul cu soluiile acide; - se pare c inhib producerea de acid a microorganismelor, prin inhibarea enzimelor glicolitice; - scad sinteza de polizaharide streptococice. Fluorul: - se gsete n smalul dentar sub forma de fluoropatit i pe suprafaa dintelui, sub forma de fluorur de calciu - n saliv se gsete n concentraie extrem de mic (10-13 grame); de aceea, nu poate inhiba formarea de acizi n saliv. - Din compararea curbei de cretere i cea a producerii de acid n cavitatea bucal, reiese faptul c fluorul i face efectul numai cnd numrul celulelor a atins un maxim de dezvoltare; - Ionii de ortofosfat i calciu, inhib aciunea fluorului; - Ionii de magneziu, mangan i zinc mresc aciunea fluorului; - n saliva obinuit se gsete o cantitate de calciu i ortofosfat, suficient de mare, pentru ca ea s se opun aciunii fluorului; de aici se deduce necesitatea administrrii fluorului, dar nu oricum; - Pastele de dini cu concentraii mari n fluor (>0,2 %), au efecte negative atunci cnd esuturile sunt inflamate. Aceste paste produc n gingivite disfuncii vasculare foarte importante. Anders i colaboratorii (1974) - arat c: - Proprietile antibacteriene ale fluorurii de staniu sunt mai bune dect cele ale fluorurii de sodiu; aminele fluorurate inhib placa dentar la concentraii mai mici dect fluorurile anorganice. Aceste amine scad incidena cariilor, cu 25% fa de un lot martor. Gluconatul de clorhexidin - este o biguanin alcalin, cu efect bactericid. Aplicat local, de dou ori pe zi, n concentraie de 0,2% - este foarte eficient, dar: efectul bactericid este temporar i asupra inflamaiilor gingivale nu are nici un efect. Aceast substan se administreaz numai sub control medical. Apa oxigenat, permanganatul de potasiu i compuii clorurai - sunt substane oxidante folosite n prevenirea afeciunilor gingivale i sunt foarte toxice, n special pentru anaerobi. - Permanganatul de potasiu are avantajul c pune n eviden i plcile dentare, colorndu-le n roz. 262

CAPITOLUL 37 BOALA PARODONTAL

Boala parodontal reprezint un ansamblu de entiti clinice care afecteaz structurile de susinere ale dinilor (gingia, ligamentele parodontale)

Istoricul problemei

1728 Pierre Fouchard

1991 - Sokranski

- denumete parodontita marginal gingival

cronic drept scorbut

- lanseaz ideea etiologiei bacteriene specifice a plcii dentare; - consider c aproximativ 300-400 specii bacteriene se gsesc constant n placa subgingival uman, dintre care 10-20 specii particip la procesele distructive din boala parodontal.

Etiologia bolii parodontale

Porphyromonas gingivalis (fost Bacteroides gin-givalis) - este principalul agent etiologic al bolii parodontale a adultului Actinobacillus actinomycetemcomitans - principalul agent etiologic al parodontitelor juvenile Treponema denticola Capnocytophaga (ochracea, sputigena, gingivalis) Fusobacterium (nucleatum, nucleophorus) Peptostreptococcus micros Eubacterium (timidum, brachy, nadatum), etc.

Epidemiologia bolii parodontale

Boala are caracter endemic, este o problem de sntate public. 15% dintre subiecii cu vrste sub 30 de ani prezint forme uoare

ale bolii parodontale (gingivite). 50% dintre subiecii cu vrste peste 50 de ani prezint forme avansate ale bolii. Tinerii prezint gingivite sau tartru. Dup 40 de ani apar pungile parodontale superficiale. Dup 50 de ani apar pungile parodontale profunde (la aproximativ 22% dintre subieci). 263

 Boala parodontal nu apare n primii 5-7 ani de via. Creterea numrului de cazuri este direct proporional cu:

- vrsta; - starea igienei cavitii bucale; - nu exist nici o corelaie cu sexul subiectului.

Factorii favorizani ai bolii parodontale

Deficiena n vit. A modificri ale epiteliului, esutului conjunctiv; Deficiena n vit. C edem, hemoragii, ulceraii; Deficiena n proteine (alimentaie); Alimente moi aderente; Factori hormonali: pubertatea, menstruaia, graviditatea, corticosteroizii; Traume ale cavitii bucale: - periaj dentar foarte intens - consum excesiv de tutun, alcool - iritaii chimice: Pb, Hg - reacii alergice; Factori genetici: - asocierea bolii parodontale cu boli genetice de tipul: - acatalazemia - hipofosfatasia - neutropenia idiopatic Boli asociate: - diabetul zaharat; Igiena bucal defectuoas; naintarea n vrst.

Aspecte clinice ale bolii parodontale

Calcificarea plcii dentare duce la apariia tartrului; Inflamaia gingiei (gingivita); Degenerarea structurilor de susinere ale dinilor; Migrarea apical a epiteliului gingival, cu formarea pungilor

parodontale (superficiale i apoi profunde), n care se acumuleaz bacterii; Rezorbia osului alveolar, cu distrugerea fibrelor de colagen, cu rol de inserie a dinilor (pierderea dinilor).

264

Forme clinice ale bolii

Gingivite acute cronice ulceronecrozante (ANUG) uoar de tip ADULT moderat (PA) avansat refractar
(rapid progresiv)

simple

Parodontita

de tip JUVENIL Evoluia etiologic bacterian de la:

Bacterii aerobe gram+ (coci)
AGRAVARE

prepubertar generalizat (PJG) localizat (PJL)

bacterii anaerobe gram negative (bacili)

GINGIVITA SIMPL
Reprezint inflamaia esutului gingival, fr implicarea ligamentelor parodontale sau ale osului alveolar, prezena plcii dentare subgingivale, tumefierea mucoasei gingivale, tendina marcat la sngerare a acestei mucoase. Dup Miller (1990) n gingivite apar de 10-20 ori mai multe microorganisme dect la nivelul gingiei sntoase, spre exemplu: Streptococcus mitis i sanguis; Actynomices viscosus; Bacteroides intermedius; Fusobacterium nucleatum.

Gingivite experimentale
Experimentul su Gingivita apare dup o igien defectuoas timp de 7-8 zile; la ndeprtarea plcii subgingivale, semnele de boal diminu sau dispar. 1977 Sokransky consider c genul Actynomices reprezint un microorganism semnal al gingivitelor. Actynomices viscosus i naesludi produc boala parodontal la animale, prin: alterarea funciilor fibroblaste i eliberarea enzimelor proteolitice. Gingivita experimental are 3 faze bacteriologice (dup Newmann 265

i Nisengarden): faza I: - n ziua 1-3 - flora: coci gram+ faza II: - n ziua 3-5 - flora: bacili i forme filamentoase faza III: - n ziua 5-9 - flora: spirochete i vibrioni (n plus).

GINGIVITA ACUT NECROZANT

Este o infecie acut gingival care se complic cu ulceraia i necroza gingiei interdentare.

Etiologia bacterian
Spirochete (Treponema vincenti, Treponema denticola) Asociaia fusospirilar (Fusobacterium) Bacteroides (melaningogenicus, intermedius)

- Genul Bacteroides determin un rspuns imun umoral generalizat (IgM, IgG). Alte gingivite care predispun la boala parodontal: - gingivostomatite herpetice; - gingivite asociate bolilor metabolice (diabet zaharat); - gingivite descuamative, toxice.

PARODONTITE
Boli care afecteaz structurile de susinere ale dinilor cu rezultat final pierderea acestora.

Etiologia bacterian
Bacteroides gingivalis (dar i forshytus, intermedius acum redenumit Porphyromonas gingivalis), agent etiologic al parodontitelor adultului; Actinobacillus actinomycetemcomitans (Capnocito-phaga), agent etiologic al parodontitelor juvenile.

PAROTIDITA CRONIC A ADULTULUI Clinic

inflamaia

gingiei; pierderea esutului conjunctiv ataat dintelui; apariia pungilor parodontale (spaiul rezultat ntre dinte i gingie);

266

Etiologie bacterian:
Pungile parodontale conin urmtoarele bacterii: Bacteroides gingivalis (Porphyromonas gingivalis) Bacteroides melaninogenicus; Fusobacterium nucleatum; Actinomyces viscous, naeslundi; Capnocitophaga; Spirochete.

PARODONTITA AGRESIV Clinic:

boala debuteaz la vrste mai tinere (30 de ani), cu semne de inflamaie acut, sngerri masive i sever pierdere osoas.

Tratament:
detartraj

radicular antibiotice (Metronidazol sau Clindamicin cu Tetra-ciclin, Eritromicin sau Augumentin).

chiuretaj

PARODONTITA JUVENIL LOCALIZAT Clinic

apare la adolesceni; form rar, rapid progresiv; semnele de inflamaie general sau local sunt rare; flora bacterian - Actinobacillus actinomycetemcomi-tans (2 tipuri

antigenice A i B) - Capnocitophaga cu fond genetic pe linie feminin (cu posibil transmitere epidemic intrafamilial).

Tratament
Tetraciclin

(eficien 6-8 luni); Chirurgical pentru eliberarea pungilor parodontale.

PARODONTITA JUVENIL GENERALIZAT

- cu pierderi osoase generalizate; - cu mecanism imunologic (defect chemotactic al PMN - urilor); - flora bacterian:

267

 Bacteroides; Actinobacillus; Capnocitophaga; Eikenella corrodens.

PARODONTITA PREPUBERTAR Clinic:

apare n timpul erupiei dentare primare; cu component genetic; asociat cu infecii cutanate, respiratorii, otice.

PARODONTITE REFRACTARE Clinic

nu reacioneaz la nici un tratament; formele active (cu pierderi dentare) au ca etiologie bacteriile

anaerobe; formele inactive (fr pierderi dentare) au ca etiologie bacteriile aerobe.

FACTORII DE PATOGENITATE AI BACTERIILOR IMPLICATE N BOALA PARODONTAL Porphyromonas Gingivalis

Factorii de patogenitate sunt enzimatici: hialuronidaze; heparinaze; nucleaze; colagenaze; IgA proteaze; enzime tripsin-like; lipopolizaharide. Enzimele menionate (i n special enzimele tripsin-like) au efect distructiv asupra: esuturilor parodontale (Yoshimura i colab., 1984), fibroblastelor i a celulelor epiteliale cu mpiedicarea regenerrii esuturilor respective. Lipopolizaharidele P. gingivalis i producia crescut de IL1, produc fenomene inflamatorii i distructive.

Diagnostic de laborator:
Enzimele tripsin-like (Yoshimura) se pot investiga printr-un test 268

diagnostic, denumit BANA: o enzim tripsin-like poate hidroliza peptidul N-Benzoyl-DL-Argini 2 naphtilamida. Acest test reprezint un indicator de activitate al bolii parodontale. Teste ELISA detecteaz anticorpi IgG anti Porphyromonasgingivalis la circa 2/3 din pacienii cu periodontit. Experimentele pe animale (cu periodontite experimentale cu Porphyromonas gingivalis demonstreaz acelai rspuns imun (umoral) generalizat.

Actinobacillus actinomycetemcomitans
Produce distrucii osoase prin urmtorii factori de patogenitate: Leucotoxina Factorul stabil termic Factori care inhib activitatea: neutrofilelor, fibroblas-telor, celuleor epiteliale, sinteza acizilor nucleici i a pro-teinelor. Leucotoxina Reprezint principalul factor de patogenitate al Actinobacillus actynomycetemcomitans; Produce distrucia monocitelor i a neutrofilelor, prin modificri membranare; Prin distrucia PMN, se elibereaz produi lizozomali n mediul extern, cu agravarea fenomenelor distructive; Leucotoxina induce AC specifici antileucotoxin A, detectabili n serul pacienilor. Factorul stabil termic Inhib producerea de anticorpi; Inhib producerea de limfokine; Stimuleaz limfocitul TS cu efecte imunosupresoare; Substana care inhib factorii chemiotactici pentru PMN. Factori care stimuleaz colonizarea bacterian cu Actinobacillus actinomycetemcomitans Actinobacillus actynomycetemcomitans are capacitate invaziv, coloniznd esuturile moi n fazele timpurii ale bolii. O supraproducie de anticorpi genereaz complexe imune n exces, cu activarea secundar a sistemului C, cu rol litic.

Fusobacterium nucleatum (sau vincenti, polimorphum)

Prezint o mare capacitate adeziv, fixndu-se pe celule epiteliale,

fibroblaste gingivale, leucocite, esuturi necrozate; 269

 Tulpinile respective apar n special la pacienii cu o igien

deficitar a cavitii bucale; Complicaiile de tip necrotic sunt frecvente.

Capnocytophaga sputigena
Se ntlnete n parotidite avansate, cu distrucii tisulare; Conine enzime: - care degradeaz: IgA, IgG, inhib fibroblastele,

PMN; - de tip: fosfataz acid, colagenaz; - enzime tripsin-like.

Wolinella recta Eikenella corrodens

Conin factori de patogenitate enzimatici; La pacienii cu parodontite, aceste specii reprezint un procent de 80%

din totalul florei bacteriene, spre deosebire de 20%, procent ntlnit la persoane sntoase n flora buco-dentar (Lipka, 1990).

Treponema denticola (oralis)

Ating nivele nalte n boala parodontal de tip adult; Prezena acestei bacterii n placa dentar constituie un semn

prognostic nefavorabil; Unii autori consider c tratamentul antibiotic (Tetraciclina + Metronidazol) realizeaz o scdere drastic a numrului i a patogenitii acestor bacterii; Factori de patogenitate ai spirochetelor: - capacitatea invaziv prin mobilitate exagerat; - enzimele proteolitice distrug componentele esutului conjunctiv; - Treponema oralae leag fibronectina pe suprafaa ei exterioar, mpiedicnd fagocitoza; - Treponema denticola posed un echipament enzimatic compus din: aminopeptidaze endopeptidaze colagenaze enzime tripsin-like (BANA) - inhib fagocitoza prin inhibarea formrii fagolizozomilor.

270

Observaii: - Testul BANA se pozitiveaz pentru urmtoarele specii bacteriene: Porpyromonas gingivalis Treponema denticola Capnocytophaga

Eubacterium (timidum, brachy, nadatum)

Sunt bacili gram pozitivi anaerobi; Declaneaz un rspuns imun foarte slab, foarte greu sau

imposibil de detectat; Diagnosticul de laborator se poate face exclusiv prin teste ADN; Factori de patogenitate enzimatici.

Peptostreptococcus micros
Coci gram pozitivi anaerobi; Intervin n leziunile parodontale profunde active, la pacieni de

toate vrstele; Declaneaz rspuns imun umoral n esutul gingival i n serul bolnavilor cu parodontopatii generalizate;

Factori de patogenitate:
hialuronidaze enzime proteolitice inhibarea activitii fibroblastelor i a celulelor epiteliale degradeaz imunoglobulina A secretoare degradeaz C3 a sistemului complement.

Bacteria respectiv este foarte greu de ndeprtat din esuturile parodontale (exist o oarecare sensibilitate a acestei specii bacteriene la Penicilin i Clindamicin); (Ramus i colab. 1992). Lacroix (1989), Ramus (1992) consider boala parodontal ca o infecie mixt, cu predominena bacililor gram negativi anaerobi i a bacililor gram pozitivi anaerobi.

IMUNITATEA N BOALA PARODONTAL

1991 Raney Bacteriile bolii parodontale reprezint un stimul

antigenic puternic (antigenele lor, n urma proceselor distructive ptrund n esutul conjunctiv subiacent i determin un rspuns imun local i general).

271

Imunitatea local
Experimental s-a demonstrat faptul c esuturile gingivale

inflamate conin imunoglobuline: IgA, IgG-IgG 1 i IgG2, IgM, urme de IgE (predomin cantitativ IgG-IgG1); Prin imunofluorescen (IF) se detecteaz n gingia inflamat complexe antigen-anticorp; Distruciile tisulare locale se explic i prin mecanis-me de tip imunopatologic: - prin enzimele lizozomale eliberate n exces din PMN din focarul inflamator; - prin aciunea distructiv a sistemului complement asupra esuturilor; - C5a (rol chemotactic pentru celulele imunologice n focarul inflamator); - sngerri gingivale i exfolierea dinilor se observ la subiecii cu agranulocitoz i neutropenii; Actinobacillus actinomycetemcomitans produce leucotoxine care altereaz funciile neutrofilelor sau le distrug; IL1 produce demineralizarea osului (pierderi dentare); - acioneaz sinergic cu rezorbia osoas produs de ctre TNF i limfotoxine; - are efect proinflamator, agravnd boala; - se ntlnete n pungile parodontale a 100% dintre pacienii cu parodontopatii. IL2 crete n boala parodontal (produs de ctre limfocitul T activat); OAF factorul de activare al osteoclastelor, produce distrucii osoase; Limfotoxina secretat de ctre limfocitul T citotoxic - cu rol n procese citocide; Mecanismele IMC au rol major n procesele de distrucie tisular, spre exemplu la: Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans. Limfocitele T4/8 < 1 la pacieni cu parodontopatii avansate exist imunosupresie; 9% dintre pacienii cu AIDS prezint diverse forme de parodontopatii progresive. C3, C4 n fluidul gingival, n comparaie cu aceiai factori din ser. Aceast scdere () arat o activare a sistemului complement pe ambele 272

ci (clasic i alternativ). - C3 este clivat n fluidul gingival n leziunile parodontale severe (activarea C); - Factorul B este clivat (n fraciunea Bb, fraciunea activ), att n parodontitele adultului, ct i n cele juvenile; activarea sistemului complement agraveaz leziunile inflamatorii din boala parodontal. Nivele antigenice microbiene nalte determin rspunsul imun generalizat, predominent umoral; Rspunsul umoral apare la 2-4 luni dup tratament i descrete gradat, astfel nct la 8-12 luni ajunge la nivele anterioare tratamentului; Rspunsul n AC serici (IgM, IgG detectabili imunoenzimatic) apare fa de genurile: Porphyromona, Actinobacillus, Capnocytophaga, Eikenella; Rspunsul imun IgG are rol protector n boala parodontal.

Tratamentul n boala parodontal

Detartraj Chiuretaj radicular Tratament antibiotic pentru aerobi i anaerobi Tratament chirurgical pentru suprimarea pungilor parodontale Tratament imunologic local cu anticorpi monoclonali anti

Porphyromonas gingivalis.

Profilaxia
Antibioterapie profilactic:

- nainte de intervenia chirurgical; - n timpul interveniei chirurgicale. Pasta de dini antitartru antiparodontoz, Salviagen, Aronal dimineaa, Elmex seara; Tratament imunologic: - Imudon preparat din bacterii ale microbiocenozei cavitii bucale, cu rolul de a stimula imunitatea local; Folosirea substanelor cu rol dezinfectant pentru cavitatea bucal; Vaccinul anti Porphyromonas gingivalis (n studiu); Supravegherea pacienilor cu semne minime ale bolii parodontale, folosind testele: - BANA detectarea enzimelor tripsin like; -ELISA IgM, IgG anti Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans; - senzorii pentru gingivite 273

CAPITOLUL 38 UTILIZAREA PROFILACTIC I CURATIV A ANTIBIOTICELOR N STOMATOLOGIE

Prevenirea infeciilor endodontice
Infeciile pulpare i periapicale au ca ageni etiologici o flor bogat, endogen i exogen, aerob, facultativ anaerob i strict anaerob. Tabel nr. 15 - Ageni etiologici bacterieni ai infeciilor endodontice.
Clasificare bacterian dup tipul respiraiei Bacterii anaerobe Clasificare microscopic Bacili gram negativi Coci gram negativi Bacili gram pozitivi Exemple Bacteroides melaninogenicus, oralis, fragilis Veillonella Enbacterium Lactobacillus anaer. Propionbacterium Peptococcus, Peptostreptococcus. Neisseria sp. Lactobacillus an. fac. Streptococi viridans Streptococi , , hemolitici Enterococcus Staphylococcus sp. Chorynebacterium sp. Treponema sp. Leptospira sp. Campylobacter Wollinella

Coci gram pozitivi Bacterii anaerob facultative Coci gram negativi Bacili gram pozitivi Coci gram pozitivi

Bacterii aerobe Bacterii mobile

Coci gram pozitivi Bacili gram pozitivi Spirochete Spirili

274

Tehnicile sofisticate ale diagnosticului bacteriologic arat un procentaj semnificativ crescut al anaerobilor n etiologia infeciilor endontotice, care sunt favorizate de trei mari categorii de factori de risc: bacteriologic (elemente de patogenitate), condiii de gazd (starea organismului teren imunodeprimat sau boli asociate), natura manoperelor medico-chirurgicale stomatologice. Factori de risc microbiologic Abundena florei bacteriene din cavitatea bucal reprezint un risc endogen permanent, mai ales dac individul prezint o igien defectuoas a cavitii orale. Majoritatea speciilor bacteriene locale prezint enzime tripsin-like, capabile s declaneze leziuni proteolitice, care agraveaz procesul infecios prin substratul nutritiv oferit bacteriilor. Condiii de gazd (teren receptiv) Subiecii cu diverse tipuri de imuno-deficiene primare sau secundare (SIDA, transplant, tratament cu corticosteroizi, hepatopatie portal, insuficien renal cronic, diabet zaharat, etc.) prezint un risc de infecie evident mai mare dect subiecii cu rspuns imunitar eficient (vrste cuprinse ntre 20 i 40 de ani, fr boli asociate). Indivizii cu leziuni valvulare preexistente reprezint o categorie aparte de subieci supui riscului unei endocardite bacteriene subacute, produs de ctre streptococii viridans (ajuni n torentul circulator dup diferite manopere stomatologice sngernde). Apariia unei simptomatologii de tipul puseu febril, astenie marcat, dureri la nivelul extremitilor degetelor (false panariii Osler), erupii cutanate, artralgii i hematurie, atrage atenia asupra declanrii unei endocardite streptococice. n studiul lui Bender I. s-a demonstrat faptul c 92% din endocarditele luate n studiu aveau n antecedente manopere de tip endodontic.
Tabel. nr 16 Factori de risc cardiovasculari implicai n geneza unei endocardite streptococice

275

Factori care necesit protocolul antibiotic special Proteze valvulare sau arteriale Antecedente de RAA cu suflu cardiac restant Antecedente de endocardit infecioas Maladii care tratament parenteral necesit

Factori de risc care impun protocolul standard Insuficien aortic Bicuspidie aortic Insuficien mitral Tetralogie Fallot Comunicri interventriculare Sindrom Marfan Canal arterial Fistule arteriovenoase Miocardita reumatic Aortita sifilitic Pace-maker endocardic Cardiomiopatie obstructiv

276

Riscul infecios al manoperei stomatologice executate Utilizarea pieselor stomatologice rotative contamineaz zona endodontic att cu bacterii endogene ale cavitii, ct i cu microorganisme ale mediului nconjurtor (suprafee, aeromicroflor). Pot s apar infecii cu potenial epidemic, de tip infecie nozocomial, cu ageni etiologici precum Streptococi hemolitici, mutans, mitis, salivarius, Stafilococi (epidermidis, aureus), Bacteroides melaninogenicus, Propionibacterium, Acinetobacter, Actinomyces i aa mai departe. Un alt factor de risc l reprezint manoperele endodontice i lezarea gingival.

Antibioticoterapia curativ de utilizare local

Utilizarea antibioticelor local (intracanalicular) vizeaz paste antibiotice: STREPTOMIXINE FORTE este o combinaie de Neomicin i Polimixin B iar LEDERMIX conine Dimetilclortetraciclina sau Demeclocilina n combinaie cu un corticosteriod topic, cu efect antiinflamator. Administrarea local a acestor antibiotice este fundamentat prin studii clinice de specialitate, care afirm c 37% dintre pacieni prezint bacteriemie la cinci minute dup o extracie, din cauza capilarelor traumatizate care permit accesul agenilor infecioi. Utilizarea local imediat a unor antiseptice (Clorhexidina) ar fi cel puin la fel de eficient ca i antibioticoterapia.

Antibioticoterapia de utilizare pe cale general

Acest tip de tratament se indic n situaiile urmtoare: infecii periapicale care nu pot fi drenate eficient, infecii endodontice cronice acutizate, bacteriemie dup manopere sngernde, pacieni cu boli generale preexistente. Penicilina G este antibioticul de referin i de prim elecie n tratamentul infeciilor periapicale acute sau a celulitelor. inta sa de aciune este Streptococul. Eritromicina este recomandat n cazurile de alergie la Penicilin, chiar dac acest antibiotic nu este eficient n cazul bacteriilor strict anaerobe. Muli autori recomand Amoxicilina n combinaie cu Acidul Clavulanic n locul Penicilinei G, din cauza spectrului mai larg i a aciunii prelungite. Metronidazolul i Clindamicina cu efect antiflor anaerob completeaz tratamentul cu lactamine. Preparatul mixt RODOGYL (Spiramicina i Metronidazol) prezint rezultate bune, n special n tratamentul infeciilor endodontice. 277

Utilizarea antibioticelor n scop profilactic

Se recomand n special pacienilor cu risc i celor care au suferit traumatisme la nivelul cavitii bucale; de asemenea, exist indicaia profilaxiei naintea tuturor manoperelor sngernde la nivelul endodontic. Sunt utilizate antibiotice pe cale parenteral pentru a obine ct mai rapid concentraiile bactericide la nivelul osului alveolar. Tratamentul trebuie meninut dou sptmni, pn la cicatrizarea complet. De cele mai multe ori, monoterapia intit nu este suficient i se recomand scheme terapeutice cu asocieri de antibiotice. Tabel nr. 17 Protocol antibiotic profilactic general
Subiect fr alergie la lactamine Subiect alergic la lactamine Tratament iniial Tratament iniial (Penicilin G + Gentamicin +(Eritromicin + Gentamicin + Metronidazol) intravenos Metronidazol) intravenos Tratament de ntreinere Tratament de ntreinere Augumentin 2 sptmni, per os. Metronidazol + Eritromicin per os 2 sptmni

Profilaxia endocarditei bacteriene American Heart Association (AHA) recomand pacienilor cu risc cardiac protocolul antibiotic pentru manopere stomatologice sngernde. Tab. nr. 18 Protocol antibiotic pentru risc cardiac
Protocol standard Amoxicilina 3g per os naintea interveniei cu o or 1,5g la 6 ore dup doza iniial Pacieni alergici la lactamine Eritromicina 1g per os 2 ore nainte interveniei, apoi - 0,5g la 6 ore dup doza iniial sau Clindamicina 300 mg per os cu o or naintea interveniei apoi - 150 mg la 6 ore dup doza iniial Protocol special Pacieni cu risc particular

278

Protocol standard Ampicilina, Gentamicina 2g de Ampicilin sau Gentamicin i.m. sau i. v. cu 30 de minute naintea interveniei; apoi 1,5g de Amoxicilin per os la 6 ore dup doza iniial. Protocolul parenteral se poate repeta dup 8 ore. Pacieni cu risc particular cu teren alergic Vancomicina 1g n perfuzie lent cu o or naintea interveniei

n concluzie, succesul tratamentului endodontic depinde att de acurateea manoperei, ct i de posibilitatea ndeprtrii microorganismelor prin antibioticoprofilaxie i terapie.

Prevenirea cariilor dentare cu antibiotice

Antibioticele au fost testate n prevenirea plcii dentare. Modul de administrare a fost diferit: - pe cale sistemic - prin pensulri ale arcadelor - prin paste de dini - prin cltiri periodice ale cavitii bucale cu soluii antibiotice Rezultatele experimentului Parsons sunt: Penicilina scade incidena cariei dentare cu 50%; Penicilina i Bacitracina - mai eficient este combinaia lor; Vancomicina i Spiramicina - au efecte foarte bune. Reacii adverse ale antibioticelor: - Penicilina produce sensibilizri - Dezechilibre ntre speciile microbiene, cu apariia candidozelor - Reacii adverse digestive: diaree, vom - Selecia unor tulpini rezistente la chimioterapice

279

INTRODUCERE
IMUNOLOGIA - este tiina care se ocup cu studiul mecanismelor aprrii antiinfecioase, mecanisme prin care organismul reuete s discrimineze structurile proprii, fa de cele strine, non-self. (P. Kourilsky - Discriminarea ntre self i non-self este inima imunologiei). Mecanismele supravegherii imunologice sunt asigurate de ctre sistemul imun, care cuprinde organe, celule i mediatori chimici variai. APRAREA ANTIINFECIOAS cuprinde dou categorii de mecanisme biologice: REZISTENA NATURAL - cu mecanisme nespecifice, nnscute, de aprare imunologic, determinate genetic i cu specificitate de specie, asigurate prin: bariere fizice de organ, bariere cutanate i mucoase factori celulari; factori umorali. IMUNITATEA DOBNDIT - cu mecanisme specifice, dobndite, de aprare mpotriva unui anumit agent infecios (cu determinism genetic), prin intermediul: imunitii mediate celular (IMC); imunitii umorale (IU). Astfel se realizeaz i se pstreaz memoria imunologic fa de respectivul agent infecios.

281

CAPITOLUL 39 REZISTENA NATURAL

Mecanismele de aprare respective sunt prezente la toi indivizii unei anumite specii i reprezint prima linie de aprare la contactul cu orice agent infecios (lipsa specificitii).

FACTORII REZISTENEI NATURALE

BARIERE ANATOMICE Tegumentele integritatea lor structural constituie o barier mecanic (excepii: genurile Leptospira, Treponema care pot ptrunde prin tegument intact); filmul lipidic superficial al pielii are un pH acid, care confer un efect bactericid. Mucoasa respiratorie: barier mecanic; mucusul nglobeaz microorganismele care sunt expulzate prin tuse; mucusul conine lizozim cu efect antibacterian. Mucoasa conjunctival: lacrimile ndeprteaz bacteriile, att prin intermediul lizozimului, ct i prin splare mecanic. Mucoasa digestiv: microorganismele sunt permanent ndeprtate prin intermediul peristaltismului intestinal; aciditatea gastric i secreiile pancreatico - biliare au un efect bactericid. Mucoasa urogenital: jetul urinar ndeprteaz permanent microorganismele; flora comensal local i pH-ul vaginal acid realizeaz un efect bactericid; spermina din lichidul seminal determin efectul bactericid.

FACTORI UMORALI Lizozimul: efect bactericid asupra bacteriilor gram pozitive. Sistemul complement: 282

 rol virocid pentru virusurile mari, nvelite; rol imunomodulator; rol opsonizant; efect bactericid asupra bacteriilor gram negative. Sistemul properdinic: activarea fagocitozei; activarea complementului; rol bactericid. FACTORI TISULARI I CELULARI Polipeptide bazice (de tipul protaminei i histonei); acizi grai din esuturi - cu efect bactericid; Interferonii - cu aciune antiviral; Enzime ale fagocitelor - cu efect bactericid.

MICROBIOCENOZE Populaiile bacteriene comensale, specifice unor anumite teritorii ale organismului, mpiedic suprapunerea bacteriilor patogene prin: competiia pentru substane nutritive; bacteriocine. FEBRA reprezint un mecanism nespecific al aprrii imunologice, prezent n majoritatea infeciilor; stimuleaz mecanismele cooperrii ntre diverse celule imunologice; limiteaz multiplicarea agenilor infecioi, prin alterarea temperaturii optime de dezvoltare a acestora. FAGOCITOZA I INFLAMAIA reprezint mecanismul major al ndeprtrii microorganismelor, mecanism n care factorii celulari au un rol esenial. Din sistemul fagocitar mononuclear fac parte: celula su angajat (celula de origine a elementelor celulare hematopoetice) monoblastul promonocitul monocitul (din snge periferic, monocitul circulant) macrofagul (din esuturi, spre exemplu macrofagele difereniate): din ficat; 283

din plmn (macrofagul alveolar); din seroase (macrofagul pleural sau peritoneal); din sistemul nervos (microglia); din esutul osos (osteoclaste); din esutul conjunctiv (histiocit); din mduva osoas; din splin i ganglioni limfatici. macrofagele din diferite exudate; celulele Langerhans multinucleate; celule de corp strin, toate acestea fiind prezente n orice esut inflamat. Durata tranzitului celular n fiecare compartiment (la om) este de: 2 - 3 zile n mduva osoas; 3 - 4 zile n snge; 1 - 5 sptmni n esuturi. Acest flux dublu de celule snge esuturi reprezint aproximativ 13,5 milioane de celule/kg/zi. Numrul total al macrofagelor este de ordinul miliardelor (aproximativ 2,5 miliarde / kg corp). Macrofagele tisulare prezint o mare heterogenitate structural i funcional n funcie de esutul n care apar i n funcie de starea macroorganismului (sntate sau boal). receptorii celulari de suprafa ai macrofagelor Aceti receptori sunt foarte diveri (aproximativ 30 tipuri), implicai n fagocitoz sau rspuns imun. receptorii pentru fragmentul cristalizabil (Fc) al imunoglobulinelor a) sensibili la proteinaze - leag selectiv subclasele de IgG 1 i IgG3 monomere (aa - numiii anticorpi citofili, cu afinitate celular). b) rezisteni la proteinaze - mediaz legarea eficient a complexelor antigen - anticorp sau a agregatelor de imunoglobuline, favoriznd fagocitarea lor (la om leag n special IgG2 i IgG4). Receptorii pentru FC ai imunoglobulinelor A sunt implicai n aprarea imunologic la nivelul sistemului imun al mucoaselor. receptori pentru complement a) receptori pentru componentul C3 al sistemului complement (n special pentru C3b) b) receptori pentru componentul C5 al sistemului complement (C5a) 284

Prezena fraciunii C3b reprezint un element necesar pentru promovarea fenomenelor fagocitozei. diveri receptori pentru interleukine (IL2) n special pentru interleukinele implicate n activarea macrofagului i n proliferarea acestuia. receptorii pentru fibronectin Favorizeaz adeziunea macrofagelor de resturi celulare sau fibrin, contribuind la ndeprtarea lor din organism. receptori pentru glicoproteine i lipoproteine normale i alterate 2 macroglobulin proteinaze. receptori pentru molecule HLA cu rol n determinismul proceselor de cooperare celular.

SISTEMUL FAGOCITOZA

FAGOCITAR

MONONUCLEAR

FAGOCITOZA / PINOCITOZA Macrofagele au capacitatea de a internaliza (de a ENDOCITA) foarte activ substane lichide (pinocitoza de la grecescul pinein = a bea) sau substane solide (fagocitoza de la fagein = a mnca) Fagocitoza poate fi de natur: imun - mediat prin receptorii Fc i ai sistemului complement macrofagele reprezint a doua linie celular de celule fagocitante (dup PMN) i nu distrug complet microorganismele. legarea particulelor este posibil i la temperaturi sczute (la 4C), dar ingestia acestora este condiionat de temperaturi mai mari de 20C. Prin acest mecanism s-ar putea explica frecvena mai mare a infeciilor respiratorii n sezonul rece. neimun - mediat prin alt tip de receptori se realizeaz curirea unui teritoriu de resturi celulare, spre exemplu n repararea plgilor, fiind totui discutabil intervenia macrofagelor n embriogenez. FUNCIA SECRETORIE Macrofagul secret aproximativ 100 produi de secreie, cu diverse structuri i efecte biologice, de exemplu: produi enzimatici: - enzime lizozomale, colagenaze, elastaze, lipoproteinlipaze, fosfataze, fosfolipaze, etc. 285

 produi cu rol antiinfecios: interleukina 1 (IL1), lizozim interferoni, compui ai sistemului complement citokine - factorul necrozant tumoral, factorul de stimulare al coloniilor de granulocito - macrofage, factori limfostimulatori. Interleukina 1 este o glicoprotein cu greutate molecular de aproximativ 15.000 , secretat de ctre macrofag, cu roluri importante: acioneaz asupra limfocitelor THelper; stimuleaz producia de interleukin 2 (IL2); stimuleaz proliferarea limfocitelor B (i indirect a anticorpilor); amplific efectele reaciilor inflamatorii i imunitare.
Tabelul nr. 19 - Principalii produi de secreie ai macrofagelor (dup Zarnea)

286

ENZIME: Lizozim Arginaz Lipoprotein lipaz Angiotensina Convertaz PROTEAZE NEUTRE: Activatorul plasminogenului Colagenazele de tip I, II, III, IV, V Proteinazele citolitice Elastazele HIDROLAZE ACIDE: Proteinaze Peptidaze Glicozidaze RNA-aze DNA-aze Lipaze Fosfataze Sulfataze METABOLII AI OXIGENULUI: H2O2 Anionul superoxid Radicalul hidroxil Singlet oxigen COMPONENI AI COMPLEMENTULUI: C1, C2, C3, C4, C5 Factorii B, F, D Properdin

LIPIDE BIOACTIVE: Prostaglandina E2 Tromboxan B2 Leucotriena C PROTEINE PLASMATICE: Fibronectin Factorul I (inactivatorul C3b) Factorul H (inactivator-accelerator al C3b) Proteine de coagulare Factorii V, VII, IX, X Tromboblastin celular Transcobalamina II Apolipoproteina E METABOLII AI NUCLEOTIDELOR: cAMP Timidin Uracil Acid uric FACTORI DE REGLARE FUNCIONAL: Interferoni Interleukina 1 Factori chemotactici pentru neutrofile FACTORI STIMULATORI AI PROLIFERRII PENTRU: Fibroblati Endotelii Celule B Celule T Factorul stimulator al coloniilor Precursori ai eritrocitelor

287

FUNCIA DE COOPERARE CU SISTEMUL IMUN macrofagul este principala celul prezentatoare de antigen (CPA), celul care realizeaz o degradare menajat a antigenului, pentru developarea epitopilor semnificativi din punct de vedere imunologic. Macrofagul particip la cooperrile celulare n vederea realizrii rspunsului imun (cu limfocitul B, T - diverse subclase, etc.) FAGOCITOZA Fenomenul a fost descris n 1884 de ctre Metschnikov. Fagocitoza reprezint proprietatea unor celule de a ngloba i digera particule strine; cuprinde procese de endocitoz (pinocitoz, fagocitoz). Fagocitoza se realizeaz prin intermediul fagocitelor profesioniste: Polimorfonucleare neutrofile (microfage) Macrofagele sistemului fagocitar mononuclear (macrofage)
Tabelul nr. 20. Principalele caracteristici de difereniere ntre microfage i macrofage. Microfage (PMN) Macrofage celule cu via scurt (ore, zile) celule cu via mai ndelungat sunt primele celule care celule mai puin mobile fagociteaz (primele care ajung a doua linie celular care la locul infeciei) fagociteaz diger total bacteriile fagocitate diger parial bacteriile fagocitate prin enzimele lizozomale numrul de lizozomi crete n mieloperoxidaz prezent n macrofagul activat lizozomi nu au mieloperoxidaz neutrofilele sunt foarte active intervin n special asupra bacteriilor eozinofilele fagociteaz care au un parazitism celular complexe antigen - anticorp i reprezint principala celul au rol antiparazitar prezentatoare de antigen (CPA), au pe suprafa receptori pentru realiznd degradarea menajat a C3 i pentru FC al IgG antigenului celul citotoxic au pe suprafa receptori pentru C3 i pentru FC al IgG

288

Fig. nr. 17. Migrarea PMN n focarul inflamator (dup Galin, 1980)

celul endotelial PMN N

ETAPELE FAGOCITOZEI Chemotaxia - reprezint migrarea dirijat a fagocitelor nspre stimuli care reprezint un gradient de concentraie. Opsonizarea - etapa de pregtire a fagocitozei (opsonein = a pregti pentru mncare), cu recunoaterea particulei strine i ataarea sa pe suprafaa fagocitului. nglobarea - penetrarea substanei strine n fagocit Omorrea i digerarea microorganismelor , prin mecanisme oxidative i neoxidative. Chemotaxia Factorii chemotactici pot fi de origine bacterian sau pot fi componente ale organismului gazd. Factorul C5a este cel mai important factor chemotactic al organismului gazd. Ali factori chemotactici ai gazdei: componente ale sistemului complement histamina, kalikreina, derivai arahidonici limfokine sau factori eliberai de ctre neutrofile. Aceti factori determin mobilizarea fagocitelor n focarul inflamator. Opsonizarea Este condiionat n principal de prezena pe macrofage a receptorilor celulari cu afinitate mare pentru IgG i C3 al sistemului complement. Fenomenul poate fi specific sau nespecific. 289

Opsonizarea specific Majoritatea bacteriilor trebuie acoperite cu anticorpi i/sau complement, pentru a putea fi fagocitate. Receptorul pentru fragmentul FC al imunoglobulinelor de pe suprafaa fagocitelor acioneaz ca i liganzi, atand bacteriile pe suprafaa fagocitelor (imunoglobulinele formeaz o punte de legtur ntre fagocit i bacterie). Opsoninele specifice, active n absena complementului sunt imunoglobulinele IgG1 i IgG3. Opsoninele specifice, active n prezena complementului sunt imunoglobulinele IgG2, IgG4,IgM, care duc la eliberarea fragmentului C3b, care se ataeaz pe suprafaa bacteriei. Opsonizarea nespecific Se realizeaz n prezena fibronectinei, care mrete aderena celulelor de substraturi, de suprafeele rugoase sau de suprafaa diferitelor componente ale peretelui celular bacterian. nglobarea Fagocitul emite prelungiri ale membranei celulare (pseudopode), acoper bacteria pentru a forma o vezicul fagocitar. Formarea fagozomului (vezicula fagocitar) este consecina unui proces progresiv de nglobare, care implic apoziia continu de liganzi i receptori, pn cnd particula va fi complet nchis. Griffin (1976) a denumit acest proces mecanism de fermoar .
Fig. nr. 18. Formarea fagozomului (dup Zarnea)

290

Omorrea i distrugerea microorganismelor fagocitate Fagozomii fuzioneaz cu lizozomii i formeaz fagolizozomi Majoritatea microorganismelor fagocitate sunt distruse n fagolizozomi n cteva minute sau aproximativ dou ore. Mecanismele distrugerii microorganismelor sunt mecanisme: oxidative neoxidative. Mecanismele oxidative - prin aa-zisa explozie respiratorie genereaz O2-, H2O2, HO- i acid hipocloros i hipohalogeni sub aciunea mieloperoxidazei. inta mecanismelor oxidative o reprezint lipidele nesaturate membranare, enzimele sau acizii nucleici. Aceste evenimente biochimice au loc n fagolizozomi (n special oxidarea glucozei prin untul hexozo - monofosfat). Fig. nr. 19. Mecanismele oxidative care contribuie la efectul bactericid al PMN (dup Ivanof i colaboratorii) -

Mecanismele neoxidative - polipeptidele bazice, lizozimul, lactoferina, pH - ul acid (n special la nivelul fagolizozomului) exercit un rol bactericid. Unele bacterii, dei sunt nglobate n macrofage - nu pot fi distruse (ex.: Mycobacterium tuberculosis); astfel, acestea sunt ferite de aciunea celulelor sistemului imunitar sau a chimioterapicelor. Pentru a crete eficiena de fagocitare a macrofagului, prin intermediul interleukinelor elaborate de ctre limfocitul T, se obine aa numitul macrofag activat (cu o cantitate crescut de enzime lizozomale). 291

Macrofagele particip la eliminarea celulelor infectate cu virusuri (fie direct, fie indirect - prin intermediul interferonului produs, care stimuleaz mecanismele citotoxicitii).

INFLAMAIA
Reprezint o succesiune de reacii vasculare, umorale sau celulare fa de ageni infecioi sau fizico - chimici. Reaciile inflamatorii sunt locale i se caracterizeaz prin: - eritem (rubor) - edem (tumor) - creterea temperaturii locale (calor) - durere (dolor) - tulburri funcionale (functio lesa) Factorii vasculari Leziunea determin - vasodilataie - creterea permeabilitii capilare - modificri ale celulelor epiteliale vasculare, care favorizeaz diapedeza. Factorii celulari Spre locul infeciei, se deplaseaz prin diapedez, n urma stimulilor chemotactici: polimorfonucleare (sunt primele celule care ajung n focarul inflamator), monocite, limfocite. Fagocitele nglobeaz i diger microorganismele din focarul inflamator. Celulele imunologice vor coopera, n vederea realizrii rspunsului imun. Factorii umorali fibrinogen (care se transform n fibrin, cu rol de localizare a focarului) lizine - lizozim (cu rol bactericid) sistem complement (mediator al inflamaiei), activat pe cale clasic sau alternativ ali mediatori: histamina, serotonina, catecolamine, kinine, factor Hagemann, leucokinine, limfokine, sistem prostaglandinetromboxan, substana lent reactiv anafilactic (SRS - A)

292

Activitatea mediatorilor inflamaiei se face ca urmare a modificrilor din focarul inflamator. Totui, cel mai important mediator l reprezint sistemul complement, care promoveaz: vasodilataia capilar creterea permeabilitii vasculare eliberarea enzimelor lizozomale (n fagocitoz) lezarea membranelor celulare. Unii mediatori ptrund n circulaia general i determin sindromul de faz acut al inflamaiei concretizat prin: creterea proteinei C reactive (foarte semnificativ - n infeciile bacteriene i n mod discret n infeciile virale) creterea vitezei de sedimentare a hematiilor creterea numrului de polimorfonucleare neutrofile creterea fibrinogenului i a cantitii haptoglobinelor creterea titrului sistemului complement

293

CAPITOLUL 40 SISTEM IMUN. ORGANE LIMFOIDE

Rspunsul imun reprezint rspunsul organismului agresat prin intermediul agenilor infecioi (bacterii, parazii, virusuri, etc.). Rspunsul imun este realizat prin intermediul unui sistem specializat n acest sens, denumit sistem imun. Componentele acestui sistem (organe, celule i molecule) se gsesc n tot organismul i constituie aproximativ 1% din greutatea corpului.
Tabelul nr. 21 - Componentele sistemului imun (dup Olinescu) : Timus PRIMARE Mduva osoas Echivalentele bursei lui Fabricius Ganglioni limfatici ORGANE Splina LIMFOIDE Apendicele SECUNDARE Plcile Peyer Foliculi limfatici din mucoase i submucoase Neutrofile GRANULOCITE Eozinofile Bazofile Macrofage MONOCITE Celule dendritice CELULELE De tip T (cu subpopulaii) De tip B Celule NK (natural killer) LIMFOCITE Celule K (killer) Celule LAK (celule ucigae activate prin limfokine) IMUNOGLOBULI IgG, IgA, IgM, IgE, IgD NE Molecula HLA MOLECUL Diveri receptori imunitari (ex.: E ALTELE TCR) Sistem complement Citokine (monokine, limfokine)

294

ORGANELE LIMFOIDE
Organele limfoide prezint o structur fin reticular, structur n ochiurile creia se dispun celule cu rol imun. Organele limfoide sunt delimitate la exterior de o capsul conjunctiv, din care pornesc spre interior travee, ce realizeaz compartimente interioare. Clasificarea organelor limfoide Se realizeaz dup dou criterii : 1. Modul de apariie n embriogenez: Organele limfoide primare apar iniial n evoluia filogenetic i n embriogenez. Se denumesc i organe limfoide centrale, pe baza importanei n producerea i diferenierea celor dou tipuri de limfocite (timusul - pentru limfocitele T i echivalentele bursei lui Fabricius - pentru limfocitele B). 2. Aspecte funcionale: Organele limfoide primare educ precursorii celulari pentru realizarea funciilor lor (ctigarea imunocompetenei). Organele limfoide secundare sau periferice, (enumerate anterior) reprezint sediul n care celulele maturate i desfoar activitatea. Organele limfoide secundare sunt foarte bine vascularizate, ceea ce favorizeaz : ntlnirea limfocitelor cu diverse antigene recircularea celulelor sistemului imunitar i rentoarcerea acestor celule n teritoriile specifice (zone timus dependente, populate de ctre limfocitele T i zonele timus independente populate de ctre limfocitele B).

CELULE LIMFOIDE
Tabelul nr. 22. Distribuia limfocitelor T i B n diferite organe limfoide i n sngele periferic (Olinescu) Celule prezente % Organul limfoid T B Timus 100 0 Mduva osoas 0 100 Canal toracic 80-90 4-10 Ganglioni limfatici 60-80 20-35 Splin 30-50 50-60 Plci Peyer 30-35 60-70 Snge periferic 60-80 5-25

295

Cantonarea celulelor n teritorii specifice se numete fenomen de stabilire a domiciliului (englez - homing) i se realizeaz prin intermediul unor receptori specifici de natur polipeptidic, respectiv antigenul CDW44 de pe suprafaa limfocitelor i a celulelor neuronale, cu o greutate molecular de 85 - 95 k. Acest receptor pentru ecotaxie conine trei duble legturi disulfidice intralan, cu diverse locuri de fixare a oligozaharidelor. Acest receptor recunoate (n prezena calciului) polizaharidele bogate n G-6-P sau M-6-P de la nivelul ariilor limfoide. Sistemul de homing asigur posibilitatea de maturare n continuare a limfocitelor (sub aciunea stimulilor antigenici) i transformarea lor n celule efectoare sau cu memorie imunologic. Teoria seleciei clonale Burnet n ontogenez se difereniaz limfocite capete de clon, aa numite clone interzise, care nu declaneaz rspuns imun fa de antigenele self, proprii organismului (astfel se previn fenomene autoimune). n perioada extrauterin, antigenele funcioneaz ca i presori selectivi, acionnd asupra celulelor capete de clon capabile s discrimineze structurile non-self (strine organismului). Limfocitele sunt principalii ageni de discriminare self-non self, att n perioada intrauterin, ct i n perioada extrauterin. Diferenierea limfocitelor i ctigarea imunocompetenei este un proces care se desfoar n numeroase etape, cu modificri gradate ale antigenelor de suprafa celular (consecutive unor procese de reasortare genetic). Din punct de vedere funcional, limfocitele T (i cele B) se pot afla n urmtoarele stadii de maturare : Precursori celulari - care nu exprim pe suprafaa lor nici un fel de receptori (n afar de cei pentru homing); sunt celule tinere, fr funcii, n curs de maturare. Celule naive - i-au dobndit imunocompetena (pot recunoate antigene specifice), dar nc nu au avut ocazia s i exercite funciile. Celulele efectoare - celule imunocompetente care au venit n contact cu anumite antigene i care devin celule cu memorie imunologic (pot recunoate un antigen pe care l-au mai ntlnit). Dezvoltarea ontogenetic a limfocitelor

296

Celula surs apare n viaa fetal n sacul vitelin, apoi n ficat i n timus, unde se difereniaz. Cu puin timp nainte de natere i apoi pentru tot restul vieii, mduva hematogen preia funcia de furnizare a celulei surs limfoide. Din celula surs limfoid se difereniaz : limfocitele T - migreaz n timus n sptmna a opta a vieii intrauterine - se difereniaz sub influena timozinei, timopoetinei i a factorului umoral timic, n subpopulaiile caracteristice (etapa timic); - diferenierea lor continu i dup migrarea acestora n organele limfoide secundare, n zonele timodependente (etapa posttimic).
Fig. nr. 20. Maturarea limfocitelor T (dup Haeney, 1984)

limfocitele B - se difereniaz din celula surs, n sptmna a 8-a a vieii intrauterine - se ajunge la celula pre-B, caracterizat prin prezena n citoplasm a IgM. Diferenierea continu cu apariia unui limfocit B imatur imunologic (cu receptori de suprafa - IgM monomerice). Dup sptmna a 13-a de via se difereniaz limfocitul B imunocompetent, cu receptori membranari - IgM i IgD monomerice.

297

Fig. nr. 21. Dezvoltarea limfocitului B (dup Ivanof i colab., 1982)

- Angajarea imunologic a limfocitului B imunocompetent se realizeaz dup natere, sub influena stimulilor antigenici, care determin apariia plasmocitului secretor de imunoglobuline. (Etapa dependent de antigen). limfocitele nule - nu au markerii caracteristici limfocitelor B sau T. - n proporie de 10 % din totalul celulelor limfoide. - populaie foarte heterogen de celule, cu diferite roluri imunologice : Celulele NK - ucigae naturale (natural killer) Celulele K - ucigae (killer) - produc citotoxicitate dependent de anticorpi Celulele LAK - ucigae activate prin limfokine; produc citotoxicitate stimulat prin iL2 i INF. Celulele B sau T - precursori, care nu au nc markerii imunologici caracteristici. Extraordinara heterogenitate a limfocitelor poate fi exprimat i pe baza unor criterii : Morfologice - limfocit mic / limfocit mare - limfocit neted / limfocit cu viloziti Durat de via - limfocite cu durat de via scurt sau lung (memoria imunologic) Proprieti fizice - densitate, mobilitate, ncrcare electric Funcionale - n funcie de rolul bine stabilit n declanarea rspunsului imun 298

Limfocitele T - reprezint efectorii imunitii mediate celular (IMC). Cuprind subpopulaii celulare, care ndeplinesc anumite funcii imunologice: Limfocitele TH helper, ajuttoare (65% din totalul celulelor T) marker de difereniere : CD4 ajut proliferarea i diferenierea celulelor imunitare stimuleaz maturarea limfocitului B, apariia plasmocitelor i producia de imunoglobuline stimuleaz limfocitele citotoxice s distrug celulele int ajut exercitarea funciilor supresoare de ctre limfocitul T supresor stimuleaz activitatea celulelor ucigae naturale, poteneaz activitatea macrofagelor stimuleaz producerea mediatorilor specifici de tipul interleukinelor. Enumernd aceste roluri, se deduce faptul c lfTH deine rolul central n evoluia rspunsului imun i deine rolul dirijorului orchestrei de celule imunologice. Limfocitele TA (Amplifying T cell) realizeaz amplificarea proliferrii i diferenierii celulelor T killer. Ca i limfocitele TH i limfocitele TA sunt supuse restriciei complexului major de histocompatibilitate (CMH) Limfocitele TS supresoare au rol esenial n modularea rspunsului imun, limitnd, pondernd - att rspunsul imun mediat celular, ct i cel mediat umoral. Markerul de difereniere este CD8 (CD - cluster of differentiation = antigen de difereniere) Activitatea lor este supus restriciei complexului major de histocompatibilitate Limfocitele T contrasupresoare (TCS) contracareaz activitatea lfTS, acionnd sinergic cu lftH Limfocitele TC citotoxice, efectoare posed structura de difereniere CD8 (lfT8+) celulele acioneaz direct i specific (sub restricia CMH) asupra celulelor allogene cu complex CMH diferit de cel propriu, uciderea realizndu-se n absena anticorpilor i sistemului complement Efectul citocid se realizeaz (dup activarea specific) asupra: celulelor infectate cu virusuri 299

celulelor tumorale celulelor grefelor incompatibile. Limfocitele TDH - particip n reaciile de hipersensibilitate de tip tardiv i au capacitatea de a recruta macrofagele i de a delimita situsul de infecie (acioneaz sub restricia CMH). Dup rol, subpopulaiile limfocitelor T le putem clasifica drept reglatoare : lfTH, lfTA, lfTS, lfTDH sau efectoare : lfTC. n ansamblu, limfocitele T mature au caracteristicile : Sunt principalii ageni de discriminare self - non self produc mediatori solubili (aa numitele limfokine ) prezint subpopulaii celulare cu rol reglator sau efector produc efecte importante n aprarea organismului : activitate citotoxic mediat celular aciune antiviral, antitumoral, antifungic, antiparazitar, antigref incompatibil particip la procese de cooperare celular foarte complexe, eseniale pentru evoluia unui rspuns imun eficient i pot autoregla propriile funcii, rspunznd la propriile citokine interacioneaz n special cu antigene de natur proteic i le leag prin intermediul unor receptori specializai, receptorii celulei T (T cell receptor = TCR) nu prezint imunoglobuline de suprafa (ancorate) aa cum prezint limfocitele B, dar prezint pe suprafa structuri de difereniere CD 4 (lfTH) sau CD8 (lfTS, lfTC). Limfocitele T posed receptori pentru hematii de oaie, cu posibilitatea aglutinrii acestora n absena anticorpilor i/sau a sistemului complement (rozete neimune). Limfocitele T se transform blastic i n prezena unor mitogeni nespecifici, spre exemplu fitohemaglutinina i concavalina A. exist limfocite T cu memorie imunologic. Limfocitele B Reprezint mpreun cu descendenii lor difereniai (limfoblastele i plasmocitele) - efectorii imunitii umorale, fiind singurele celule capabile s sintetizeze imunoglobulinele cu rol de anticorpi. Deriv (la mamifere) din celule educate, instruite de la nivelul mduvei osoase. Nu posed subpopulaii celulare i recunosc antigene libere sau legate. Se transform blastic n prezena antigenelor.

300

 Posed pe suprafaa lor un numr impresionant de receptori, n special de natur imunoglobulinic (imunoglobulinele M i D - monomer, cu rol de receptori pentru antigen). Receptori de suprafa ai limfocitelor B Imunoglobulinele M i D monomerice: Au o structur diferit comparativ cu cele secretate, deoarece prezint o secven hidrofob transmembranar suplimentar, care le ancoreaz n membrana celular. Celulele care evolueaz spre plasmocit prin intervenia stimulului antigenic i pierd receptorii membranari i i dezvolt mecanismele moleculare necesare sintezei proteic 1301 Bnoglobulinele); Un plasmocit sintetizeaz o singur clas de imunoglobuline; restul populaiilor de limfocite B din organele limfoide vor sintetiza alte clase de anticorpi; Experimental s-a demonstrat distribuia difuz a acestor receptori imunoglobulinici pe suprafaa limfocitelor B i redistribuirea lor pentru a forma grupri polare de tipul bonetelor (fenomen de capping) n cazul n care se produce stimularea antigenic. Redistribuirea imunoglobulinelor de suprafa este urmat de internalizarea lor, mpreun cu antigenul, prin endocitoz. Acesta reprezint semnalul necesar pentru transformarea blastic a limfocitelor B. Markeri fenotipici neimunoglobulinici Pe lng imunoglobulinele de suprafa, celulele B prezint o serie de antigene i receptori care pot fi identificai cu ajutorul AMC. Semnificaia acestor markeri nu este nc complet cunoscut. Marea majoritate a markerilor respectivi sunt implicai n interaciunile limfocitelor B cu celelalte celule. Astfel de structuri sunt : antigene 1301 B (codificate de ctre CMH), care servesc ca un dicionar de recunoatere a structurilor strine receptorii pentru fragmentul FC al imunoglobulinelor G receptorii pentru interleukine receptorii pentru fragmentul C3 al sistemului complement Limfocitele B formeaz rozete imune cu eritrocitele heterologe, n prezena anticorpilor (de natur IgM) i a sistemului complement (aa zise rozete EAC = eritrocite - anticorpi - complement).

301

 receptori pentru mitogeni: limfocitele B sunt insensibile la aciunea fitohemaglutininei i a concavalinei A (care sunt foarte active asupra limfocitelor T) dar sunt activate de mitogeni lipopolizaharidici. Limfocitele B sunt celule mai mici i dense i ader puternic de suprafee de sticl sau nylon, comparativ cu limfocitele T. Plasmocitele - reprezint ultimul stadiu de difereniere al limfocitelor B. ntre limfocitul B activat (limfoblast B) i plasmocit exist stadiul de plasmoblast. sunt rar prezente n circulaie; apar n medulara ganglionilor limfatici, pulpa roie splenic, lamina proprie a esutului limfoid respirator (BALT), gastrointestinal (GALT) i mduv. nu posed receptorii limfocitelor B pe suprafa, n schimb imunoglobulinele secretate acoper ntreaga suprafa celular. Plasmocitele pot secreta aproximativ 2000 - 10.000 molecule de imunoglobuline pe secund. Anticorpii produi au aceeai specificitate ca i moleculele imunoglobulinelor membranare ale clonei de celule B din care provin plasmocitele. Limfocitele B cu memorie - provin din celulele B mature, care dup stimularea antigenic nu sufer diferenierea spre plasmocit, ci revin la stadiul de limfocit mic, cu via lung (luni sau ani). Aceste limfocite cu memorie imunologic nu posed receptori pentru FC, C3 sau IgD monomer. Pot s fie mai uor stimulate dect celulele naive i mpreun cu limfocitele T cu memorie - determin rspuns imun secundar. Celulele NK (Natural Killer) Celulele ucigae naturale distrug fr restricia CMH celule tumorale, celule infectate viral sau bacterian sau celule proprii, modificate antigenic. Aceste celule au rol important n aprarea organismului, avnd rol reglator asupra celulelor hematopoetice i n special asupra limfocitelor B (regleaz anticorpogeneza). Celulele NK au o durat redus de via, nu sunt aderente i nu sunt fagocitare. Aparin unei subpopulaii limfocitare distincte, numit LGL (large granular lymphocites - limfocite granulare mari), a cror caracteristic morfologic principal este existena granulelor azurofile intracitoplasmatice.

302

Celulele NK posed receptori pentru F C dar nu au receptori pentru complement i nici imunoglobuline de suprafa. Prezena pe suprafaa lor a markerilor de difereniere CD2, CD4 i producia de interleukin 2 face plauzibil ipoteza derivrii celulelor NK din linia limfocitar T. Celulele NK recunosc i leag spontan celulele int, pe care le distrug foarte rapid (cteva ore). Existena i funciile celulelor NK sunt influenate de ctre urmtorii factori : vrsta subiectului (la vrstnici, activitatea i producia acestor celule scade, fapt care explic o inciden mai mare a tumorilor n preajma vrstei a treia) factori genetici (exist indivizi cu un numr crescut de celule NK, n timp ce alii prezint puine celule NK i o marcat predispoziie spre tumori). radiaiile, hormonii corticosteroizi, histamina, teofilina, stressul - scad producia celulelor NK. interleukina 2, interferonii, BCG, activeaz funciile lor citotoxice nespecifice. Celulele K (Killer) Acest tip de celule realizeaz citotoxicitatea dependent de anticorpi (ADCC = antibody dependent cellular cytotoxicity). n acest tip de citotoxicitate, celula efectoare distruge nespecific orice int care a fost recunoscut specific de ctre moleculele de anticorpi. Pentru o singur celul int (Ex.: hematii, limfocite deviate neoplazic, fibroblaste, etc.) sunt necesare aproximativ 100 molecule de IgG, excesul de anticorpi inhibnd activitatea litic. Interferonii nu activeaz ADCC. Citostaticele inhib acest tip de citotoxicitate.

Celulele LAK sunt celule ucigae activate prin intermediul limfokinelor (IL2 sau INF). efectul antitumoral al celulelor LAK este evident n sinergism cu efectul celulelor NK

303

CAPITOLUL 41 ANTIGENE I IMUNOGENE

Antigenul (imunogenul) - este reprezentat de ctre orice substan strin care poate induce declanarea unor reacii imunologice i care poate interaciona specific cu efectorii imunitari. Imunogenicitatea - capacitatea unei substane de a induce un rspuns imun; de aceea, termenul mai corect pentru antigen este sinonim cu imunogen. Specificitatea antigenic - se refer la un anumit tip de rspuns imun indus (caracteristic unui anumit antigen, unui anumit epitop) 1 epitop reprezint situsul de pe un antigen care interacioneaz cu o molecul de anticorp i care imprim specificitatea imunologic prin structura sa (proteic sau polizaharidic). 1 epitop este alctuit din civa aminoacizi sau cteva polizaharide i reprezint imunogenul la scar molecular. Proprietile fundamentale ale antigenului (imunogenului) sunt: Imunogenicitatea Specificitatea

FACTORI CARE CONDIIONEAZ IMUNOGENICITATEA:

Condiii filogenetice anumit substan este cu att mai imunogen, cu ct aceasta este mai ndeprtat din punct de vedere filogenetic. Astfel, antigenele bacteriene, virale, parazitare etc., ndeplinesc aceast condiie. Constituenii proprii organismului pot deveni strini (nonself) dac sufer modificri induse viral, bacterian, tumoral, toxic, etc. Uneori, nu sunt recunoscute ca self aa - numitele antigene sechestrate anatomic, (din cristalin, testicul, etc.) - n momentul n care acestea trec n mod accidental n circulaie (n urma traumatismelor). Din cauza poziiei anatomice particulare, aceste antigene cantonate n cristalin, gonade, creier nu sunt recunoscute ca self de ctre sistemul limfoid n perioada embriofetal.

304

Caracterul de non-self nu este dat de prezena unor molecule unice, originale pentru un organism, ci adesea este dat de ctre modificri minime, care se traduc prin prezena unui aminoacid sau monozaharid diferit. Reaciile care apar n grefele de esuturi i organe (exogene) au atras atenia asupra existenei pe suprafaa celulelor respective a unor antigene care induc rspuns imun din partea receptorului, urmate de respingerea grefei respective. Aceste antigene difer de la individ la individ, exprimarea lor pe suprafaa celulelor fiind codificat de ctre genele complexului major de histocompatibilitate uman, aflat pe cromozomul 6. CMH posed 3 regiuni genetice: CMH clasa I, a II - a i a III - a ce codific antigenele HLA corespunztoare (human leucocytar antigens)si componente ale complementului (vezi cap. Baza genetic a rspunsului imun). Antigenele HLA clasa I - Sunt prezente pe suprafaa tuturor celulelor nucleate din organism i reprezint adevrate carnete de identitate biochimic i genetic pentru fiecare individ n parte. Pentru ca un anume antigen s fie recunoscut de ctre un limfocit T citotoxic (CD 8) este necesar restricia HLA, restricia CMH. Aceste molecule fac diferenierea self-non-self i devin inta sistemului imunitar n trei situaii: pentru respingerea de esuturi i organe incompatibile (non-self) cnd suprafaa celulelor proprii e modificat prin antigene virale tumorale etc. cnd moleculele HLA sufer procese de uzur sau mutaii, ele devin autointe care vor fi eliminate. Antigenele HLA clasa a II-a au o distribuie celular mai limitat, n special pe suprafaa celulelor imunocompetente (limfocit T, limfocit B, macrofag) i au un rol esenial n declanarea reaciilor imunitare, prin interaciuni i cooperri celulare, funcionnd ca un dicionar de recunoatere a structurilor strine organismului. Receptorii TCR de pe suprafaa limfocitelor T (receptori pentru antigen) posed specificitate dubl: att pentru antigene, ct i pentru o molecul HLA de pe suprafaa celulelor cu care interacioneaz.

305

n concluzie, antigenele HLA clasa I intervin n prezentarea antigenelor endogene ctre limfocitele T citotoxice, n timp ce antigenele HLA clasa a II-a se asociaz cu antigene exogene prelucrate, pe care le prezint limfocitul T helper (CD4). Recunoaterea asociat a antigenului i a produilor CMH, funcioneaz ca un sistem de siguran cu dou chei, care pe de o parte limiteaz potenialul distructiv al limfocitelor i pe de alt parte asigur eficiena rspunsului imun. Astfel, se demonstreaz faptul c sistemul imunitar a evoluat n aa fel nct ambele tipuri de molecule HLA servesc ca i indicatoare rutiere pentru celulele T, ghidndu-le spre antigen.
Fig. nr. 22 - Receptorul pentru antigen al limfocitului T (dup Klein)

Domeniu variabil

Domeniu constant Membrana citoplasmatic

Condiii fizico-chimice. Greutatea molecular. Pentru ca o substan s fie imunogen, GM minim trebuie s fie de aproximativ 10000 . Cu ct o substan posed o GM mai mare, cu att imunogenicitatea acesteia crete, prin creterea numrului de epitopi. Epitopii sunt situsuri antigenice specifice, capabile s interacioneze cu molecule de anticorpi. Numrul de epitopi al unui antigen constituie valena unui antigen. Imunogenicitatea antigenului este direct proporional cu valena sa.

306

Fig. nr. 23 - Structura unui antigen (imunogen)

2 3

1-epitop cu specificitate x 2-epitop cu specificitate y 3-epitop cu specificitate z

3 2 2 Conformaia spaial a antigenului Sela (1969) demonstreaz faptul c, din punct de vedere fizicochimic exist dou categorii de epitopi: epitopi secveniali (lineari) - a cror imunogenicitate poate fi modificat prin schimbarea secvenei monomerilor. epitopi conformaionali - structuri stereo-spaiale particulare, cu modificarea imunogenicitii prin modificarea configuraiei spaiale (de obicei a proteinelor globulare.
Fig. nr. 24 - Structura unui imunogen conformaional

1
2 3

1 4

307

n majoritatea situaiilor, anticorpii produi de proteinele naturale recunosc mult mai bine epitopii conformaionali, dect pe cei secveniali. n aceste situaii, legturile antigen - anticorp sunt de tip lact cheie, pe baza potrivirilor de conformaie steric. Epitopii conformaionali au o imunogenicitate crescut i o gam larg de specificitate. Accesibilitatea epitopilor Zonele imunogene (epitopii) trebuie s fie dispuse la suprafaa celulelor, pentru a fi accesibile efectorilor sistemului imunitar. Antigenele corpusculare sunt fragmentate n macrofag i epitopii vor fi ulterior dispui pe suprafaa acestuia (din aceast cauz, macrofagul reprezint principala celul prezentatoare de antigen (CPA) care poate expune i zone imunologice aa - zise ascunse). Natura chimic a antigenului Imunogenele sunt substane organice macromoleculare: Proteinele - n special cele cu greutate molecular mare sunt foarte bune imunogene, mult mai eficiente dect celelalte. Polizaharidele - sunt mai puin imunogene dect proteinele. Lipidele, acizii nucleici - sunt slabe imunogene, dar imunogenicitatea acestora crete n substane complexe (lipoproteine, nucleoproteine, etc.) Complexitatea structural a moleculei de antigen Cu ct heterogenitatea moleculei de antigen crete, cu att imunogenicitatea este mai exprimat. Astfel, antigenele nucleoproteice, glicoproteice, lipoproteice sunt mai bune imunogene dect antigenele simple. Izomerismul optic Influeneaz imunogenicitatea, moleculele cu reziduuri de aminoacizi levogiri (L) fiind mai imunogene dect cele cu aminoacizi dextrogiri (D). (Explicaia este c moleculele L pot fi mai uor degradate enzimatic n fagolizozomii celulelor fagocitare). Rigiditatea moleculei de antigen

308

O molecul stabil, rigid este mai bun imunogen dect o molecul flexibil. Spre exemplu, gelatina dei are o greutate molecular mare este lipsit de rigiditate. Dac acestei substane i se mrete coninutul n Tyr sau n Trp, molecula devine stabil i antigenic. Persistena moleculei de antigen n organism Persistena epitopilor n organism influeneaz imunogenicitatea substanei respective. Polimorfonuclearele neutrofile distrug epitopii n totalitate i funciile imune nu pot fi stimulate. Dac antigenul persist nedegradat n fagocit, scade imunogenicitatea substanei respective, pn la anularea ei. Se demonstreaz astfel nc o dat - importana degradrii menajate a antigenului, cu expunerea epitopilor specifici. Cantitatea de antigen Dozele mici de antigene induc formarea unor cantiti mici de anticorpi, cu mare afinitate i specificitate pentru antigenele respective. Dozele foarte mici de antigen stimuleaz n mod preferenial limfocitele T, inducnd imunitatea mediat celular i chiar memorie imunologic. Administrarea unei doze foarte mari de antigen poate fi urmat de fenomenul de paralizie imunologic, ce se caracterizeaz prin lipsa rspunsului imun. Modalitatea de administrare a antigenului: Administrarea antigenelor n doze fracionate, la diferite intervale - asigur un rspuns imun mult mai bun dect doza de antigen unic. n funcie de natura antigenelor i cantitatea acestora, asocierea antigenelor poate produce un efect sinergic n cursul imunizrii Administrarea antigenelor mpreun cu anumii adjuvani asigur o imunogenicitate superioar. Antigenele solubile, macromoleculare sunt mai imunogene cnd sunt inoculate intradermic, dect pe cale intravenoas. Administrarea parenteral a antigenului ofer avantajele contactului rapid cu celulele imunocompetente (protejeaz antigenul de degradarea enzimatic posibil prin enzime digestive).

309

Toate aceste constatri experimentale stau la baza regulilor de administrare ale vaccinurilor. Rolul factorilor genetici A fost demonstrat experimental pe linii genetic pure de oareci (linii inbread). Astfel de experimente au dovedit faptul c markerii HLA pun amprenta unicitii individuale a rspunsului imun. Spre exemplu, David C. i Mac Devitt demonstreaz faptul c anumii oareci, incapabili de rspuns imun la un antigen dat, pot produce, prin ncruciarea cu un oarece hibrid (care rspunde la acel antigen) - un rspuns imun normal la antigenul incriminat. Genele care controleaz reactivitatea imun au fost denumite gene Ir (immune response, adic genele rspunsului imun individualizat). David C., analiznd semnificaia regiunii genetice I (a complexului H2 de la oarece), afirm faptul c genele Ir au 6 categorii funcionale: gene Ir care confer susceptibilitatea individului la boli infecioase gene Ir care intervin n procese de cooperare celular gene Ir care confer susceptibilitate crescut la boli autoimune i alergice gene implicate n sinteza unor mediatori imunologici gene ce intervin n diferenierea celulelor imunocompetente gene care codific respingerea de gref incompatibil Factorii genetici influeneaz att mecanismele rezistenei naturale, ct i mecanismele imunitii dobndite. Vrsta organismului Rspunsul imunologic al vrstelor extreme este mai slab (n mod fiziologic) dect la maturitate. La copii putem lua n discuie imaturitatea sistemului limfoid, n timp ce la vrstnici putem constata declinul funciilor acestui sistem. Alterarea rspunsului imunitar la subiectul vrstnic: Diminuarea mecanismelor rezistenei naturale Involuia timusului i alterarea funciilor diverselor subclase ale limfocitelor T Alterarea rspunsului imun umoral, calitativ i cantitativ Cooperri celulare defectuoase: limfocit T - limfocit B Diminuarea reactivitii limfocitelor Consecinele patologice ale supravegherii imunitare la subiectul vrstnic se produc prin fragilitate la aciunea agenilor etiologici infecioi i prin frecvena crescut a maladiilor autoimune i a bolii canceroase. 310

Nicolleti C. i colaboratorii au studiat modalitile de alterare a rspunsului imun umoral la vrstnici, pornind de la experimente pe animale. Studiul demonstreaz faptul c anticorpii antifosforilcolinici (antipneumococ) - produi de ctre oareci vrstnici (BALB C: 18 - 22 luni) sunt diferii din punct de vedere structural i funcional, comparativ cu anticorpii produi de ctre oarecii tineri (3-4 luni). Anticorpii produi de ctre oarecii vrstnici au un coninut idiotipic mai srac i o capacitate de legare a antigenului mai sczut.

MODALITI DE CLASIFICARE ALE ANTIGENELOR (dup OLINESCU)

1. 2. 3. 4. Dup natura antigenelor: Naturale (existente n natur) Sintetice (obinute artificial) Dup sursa lor: Exoantigene (antigene exterioare organismului) Endoantigene (antigene proprii organismului, modificate prin tumori, infecii virale, mbtrnire, etc.) Dup gradul de nrudire genetic: Autohton (autolog) antigene proprii unui individ Singen (izolog) - antigenele provin de la indivizi ai aceleai specii, dar identici din punct de vedere genetic (ex.: gemenii monozigoi sau linii de animale inbread). Alogen (omolog) - provin de la subiecii aceleai specii, diferii din punct de vedere genetic (ex.: sistemul ABO i sistemul Rh) Xenogen (heterolog) - antigenele provin de la specii diferite. Dup necesitatea prezenei limfocitelor T, antigenele pot fi: Timodependente - pentru a declana reacii imune au nevoie de prezena limfocitelor T (marea majoritate a antigenelor naturale).

311

Timoindependente - nu necesit prezena limfocitelor T, realiznd stimularea direct a limfocitelor B. De exemplu: flagelina, endotoxinele, polivinilpirolidona, etc., cu epitopi care se succed n mod repetativ. 5. n funcie de necesitatea de prelucrare a antigenului, la nivelul celulei prezentatoare de antigen - CPA. Tipul I - nu necesit prelucrarea. Ex.: fibrinogenul, proteinele Listeriei monocitogenes. Tipul II - necesit doar desfurarea moleculei de antigen, cu evidenierea epitopilor si. Ex.: lizozim, mioglobin, ribonucleaz. Tipul III - necesit degradarea moleculei (ovalbumin, citocromul C) 6. Natura antigenelor agenilor infecioi. Antigene bacteriene (somatice i difuzibile): Somatice - ale peretelui celular: polizaharidul C, endotoxinele bacililor gram- capsulare: polizaharidele pnemnococice - ribozomale: antigen P al bacteriilor patogene - flagelare: antigenul H al Salmonellei - piliare: proteina M piliar streptococic - Antigene parazitare, micotice, virale (somatice) Difuzibile - toxine: ex.: toxina difteric - enzime extracelulare: ex.: hialuronidaza stafilococic. 7. Dup natura antigenelor organismului: Antigene HLA clasa I - exprimate pe suprafaa tuturor celulelor nucleate ale organismului, confer noiunea de self Antigenele HLA clasa II - exprimate pe suprafaa celulelor care intervin n cooperri imunologice Antigene eritrocitare: - antigenele sistemului ABO, Rh, MN (stabilesc regulile transfuzionale) 8. Dup modalitatea de utilizare a antigenelor: n scop diagnostic: folosind antigene cunoscute, se pot detecta prin reacii serologice - anticorpii specifici din serul de bolnav. n scop profilactic: pentru prepararea vaccinurilor: corpusculare (ex.: bacterii cu virulen atenuat sau bacterii omorte) difuzibile (ex.: anatoxine, preparate din exotoxine) 312

9. Dup capacitatea de declanare a rspunsului imun: Antigene incomplete - haptene Haptena este o substan cu greutate molecular mic, incapabil s produc singur un rspuns imun, dar care poate deveni imunogen (poate induce sinteza anticorpilor) - prin cuplare cu o molecul carrier (purttor) Haptena - este de obicei de natur polizaharidic i confer n mare parte specificitatea antigenului respectiv (are o GM sub 10.000 i aproximativ 1 - 10 epitopi) induce preponderent rspuns imun umoral Carrier- purttorul haptenei este de natur proteic prin cuplare cu haptena determin apariia unui antigen complet, imunogen rspunsul imun indus este puternic, n special de tip mediat celular Haptenele autocuplante sunt substane cu greutate molecular mic (ex.: sruri de diazoniu), care se pot cupla spontan cu proteinele organismului, determinnd apariia unor afeciuni dermatologice imunoalergice. Prin aceste haptene autocuplante sar putea explica i mecanismul alergiei la Peniciline. Antigenul complet - substan capabil s produc singur rspuns imun (ex.: polipeptidele, substane complexe chimic)

FACTORI CARE INFLUENEAZ SPECIFICITATEA ANTIGENIC

Specificitatea antigenic este asigurat prin anumite pri ale moleculei de antigen, denumite epitopi. Un epitop este alctuit din civa aminoacizi sau cteva polizaharide, dintre care unul este imunodominant i asigur specificitatea antigenic. Specificitatea este influenat nu numai de compoziia chimic a moleculei respective, ci i de conformaia ei steric (epitopi conformaionali). Orice modificare n structura chimic sau conformaional a unui antigen duce la schimbri de specificitate. S-au obinut informaii privind specificitatea antigenic, prin studii experimentale asupra lipopolizaharidului Salmonellei (antigenul O).

313

Fig. nr. 25 Lipopolizaharidul genului Salmonella.

Lipidul A Smburele polizaharidului UR UR UR

uniti repetitive compuse din 3-6 monozaharide

Specificitatea antigenic a Salmonellelor se datoreaz: ordinii n care sunt dispuse aceste monozaharide tipului de legtur chimic ( sau glicozidic) ramificrii oligozaharidului. Astfel, se explic specificitatea antigenic diferit a celor 1500 de specii ale genului Salmonella. Specificitatea epitopilor proteici depinde de: secvena aminoacizilor n cazul proteinelor fibrilare conformaia stereospaial a proteinelor globulare. Valena antigenului este dat de numrul de epitopi al antigenului i este direct proporional cu acest numr. Structura unitii repetitive ale diverselor grupuri antigenice ale genului Salmonella este: Salmonella paratiphi A - formula epitopilor este 1,2,12. Epitopul imunodominant 2, cu structura polizaharidic de tipul:
manoza paratoza rhamnoza galactoza

Salmonella paratiphi B - formula epitopilor 1,4,5,12 Epitopul imunodominant 5, cu structura:

manoza abequoza rhamnoza galactoza

COMPLEXUL IMUN ELEMENTAR (CIE)

CIE este complexul AG - AC format la nivel molecular, ntre epitop (aparinnd antigenului) i paratop (aparinnd anticorpului).

314

Fig. nr. 26 Complexul imun elementar (dup Klein, 1991)

Imunoglobulina

Epitopi

Imunoglobulina

Legturile epitop - paratop sunt realizate prin fore fizice, (sunt reversibile), structurile implicate fiind complementare steric (modelul minilor care se strng) Conceptul de imunon Un antigen ideal trebuie s declaneze rspunsul imun primar i va avea urmtoarele proprieti: greutatea molecular s fie ideal (> 10.000 ) molecula s aib o structur linear, s fie flexibil, hidrofil i capabil s interacioneze liber cu receptori de suprafa rspunsul imun s necesite cooperri celulare minime numrul minim de epitopi coninut s fie aproximativ 10. (Concept elaborat de ctre Dintzis i colaboratorii - 1976)

315

CAPITOLUL 42 IMUNOGLOBULINE
STRUCTUR I FUNCII
Imunoglobulinele sunt glicoproteine (82 - 96% polipeptide i 4 18% carbohidrat) a cror sintez este indus prin prezena n organism a unor substane strine (antigene). Dein rolul esenial n reaciile de imunitate umoral. Imunoglobulinele sunt secretate de ctre plasmocit, sub influena stimulului antigenic specific; ele migreaz electroforetic - n marea lor majoritate - n zona gamaglobulinelor i mai puin n cea a globulinelor. Imunoglobulinele se gsesc n: plasm lichide extravasculare saliv, lacrimi, lapte, etc. (anticorpi circulani) esuturi (sistemul imun al mucoaselor) fixai citofil pe membrana limfocitelor, macrofagelor, polimorfonuclearelor, mastocitelor, prin intermediul fragmentului lor cristalizabil FC. Observaie: Anticorpii nu pot strbate bariera hematoencefalic sau filtrul renal (n condiii normale, fiziologice - deci nu apar n lichidul cefalorahidian sau urin). Imunoglobulinele reprezint aproximativ 20% din proteinele plasmatice totale. Funciile imunologice ale Ig sunt variate: neutralizarea toxinelor bacteriene neutralizarea efectului citopat indus de virusuri formarea complexelor antigen - anticorp, cu activarea sistemului complement n vederea aciunii bactericide realizarea reaciilor citotrope aprarea antibacterian i antiviral la nivelul porii de intrare a agenilor etiologici, prin IgA secretorii promovarea fagocitozei (opsonizarea specific) realizarea citotoxicitii dependente de anticorpi realizarea unor efecte nocive n unele situaii, precum reaciile de hipersensibilitate i agresionarea structurilor self n bolile autoimune rolul diagnostic, folosind diverse reacii antigen - anticorp

316

 rolul terapeutic: ex. - folosind anticorpi monoclonali. Studiul structurii imunoglobulinelor a fost iniiat de ctre R. Porter i G. Edelman, care au scindat molecula imunoglobulinic n lanuri i fragmente care au fost studiate ulterior, din punct de vedere biochimic i funcional. R. Porter (1959) - prin prelucrarea enzimatic a Ig cu papain, obine trei fragmente, din care dou puteau fixa antigenul; (din aceast cauz le-a denumit Fab = fragment antigen binding = fragment capabil s lege antigenul) i unul care cristaliza, pe care l-a denumit F C fragment cristalizabil. Fragmentul Fab leag antigenul monovalent, cu care nu formeaz complexe vizibile (GM Fab: 45 k). Fragmentul FC (GM: 55 k) fixeaz complementul i se poate lega citofil la receptorii FC de pe membrana diverselor celule imunologice.
Fig. nr. 27, 28 - Structura unui monomer imunoglobulinic

Regiunea balama

Fragment pentru legarea antigenului

Fragment cristalizabil

317

Prin scindarea cu pepsin, se obine un fragment bivalent, cu cele dou fragmente Fab unite ntre ele, care particip la reacii de aglutinare i precipitare. G. Edelman - reducnd cu 2 mercaptoetanol legturile disulfidice ale moleculei, a izolat 4 lanuri polipeptidice: dou lanuri mai grele, cu greutate molecular de 50 k (lanuri H = heavy) i dou lanuri uoare, cu greutate molecular de 20 - 25 k (lanuri L = light). Lanurile Ig sunt unite ntre ele prin legturi disulfidice - S - S -. Aceste legturi sunt eseniale pentru asigurarea structurii tridimensionale a moleculei i formarea unor domenii, cu diferite funcii imunologice. Lanurile L sunt dou tipuri, distincte din punct de vedere antigenic: k (kappa) i (lambda) ntr-o molecul de imunoglobulin, lanurile uoare sunt ambele fie , fie k frecvena lanurilor Lk este mai mare (se ntlnesc la aproximativ 60% din totalul populaiei) sunt comune pentru toate clasele de imunoglobuline i reprezint aproximativ 1/2 dintr-un lan greu H (216 aminoacizi) Lanurile H conin epitopi variai care confer caracterul de clas al imunoglobulinelor: lanurile H - aparin IgM lanurile H - aparin IgG lanurile H - aparin IgA lanurile H - aprin IgE lanurile H - aprain IgD conin aproximativ 446 de resturi de aminoacizi, dintre care 108-125 corespund regiunii variabile i 321-325 corespund regiunii constante. diferitele clase de catene H se asociaz cu funcii efectoare diferite: IgG - prezint cele mai multe particulariti funcionale ale AC determin imunitatea pasiv la ft sunt principale imunoglobuline de rspuns imun secundar IgM - asigur rspunsul imun primar e important n liza bacteriilor 318

monomerul constituie un receptor pentru antigen de pe suprafaa limfocitelor B IgA - asigur rezistena imunitar la nivelul mucoaselor are o activitate important antiviral, la nivelul porii de intrare IgD - constituie un receptor pe suprafaa limfocitelor B, n fazele timpurii ale diferenierii lor IgE - are un rol de reagin, cu rol de mediator n reaciile alergice. Studierea secvenelor lanurilor L sau H au artat faptul c n fiecare lan polipeptidic exist zone variabile (notate V) situate spre captul amino terminal i zone constante (notate cu C), situate spre poriunea carboxi terminal a imunoglobulinei. Zonele variabile ocup 1/2 din lungimea lanului L i respectiv 1/4 din regiunea lanului H. Zonele VL + VH formeaz domeniul variabil al imunoglobulinei, ce reprezint situsul de combinare al imunoglobulinei (denumit paratop) cu epitopii. Complexul imun epitop - paratop este complexul imun elementar, complexul imun la nivel molecular. O molecul monomer de Ig posed 2 paratopi. Suprafaa paratopului este de 100 2. La nivelul paratopilor (situai la extremitatea distal a fragmentului Fab) exist zone imunologice hipervariabile, ntre: aminoacizii 24 - 34, 50 - 55, 87 - 89 pentru VL aminoacizii 30 - 36, 50 - 56, 86 - 91, 95 - 100 pentru VH Aceste regiuni hipervariabile realizeaz antigenicitatea (imunogenicitatea) anticorpilor, fiecare paratop putnd s constituie la rndul su un epitop pentru un alt anticorp ( reeaua idiotip - antiidiotip Jerne, cu rol probabil n ponderarea rspunsului imun). Paratopii imunoglobulinelor conin i regiuni cu variabilitate mai puin exprimat, aa - numitele regiuni cadru, care realizeaz arhitectura spaial a situsului de combinare cu epitopii. Regiunile cadru reprezint aproximativ 85 % din lungimea domeniilor variabile. Poriunile constante ale lanurilor L i H ale imunoglobulinelor reprezint 1/2 din lanul L i 3/4 din lanul greu H. Legturile disulfidice contribuie la realizarea domeniilor constante CL, CH1, CH2, CH3. Domeniile variabile le putem denumi similar, VL, VH. n concluzie, lanul L posed 1 domeniu variabil (VL) i un domeniu constant (CL), pe cnd lanul H (greu) - conine un domeniu variabil ( VH) i 3 comenii constante (CH1, CH2, CH3). -

319

Domeniile CH2 i CH3 aparin fragmentului cristalizabil al imunoglobulinei (FC), n timp ce domeniile VL, VH, CL, CH1 - aparin fragmentului Fab. Un domeniu conine aproximativ 100-110 aminoacizi; analiza cristalografic cu raze X a artat faptul c domeniile imunoglobulinice sunt formaiuni globulare compacte, rotunjite sub form de bucl, lanurile polipeptidice fiind pliate la interior. Regiunile pliate compact sunt mai protejate fa de proteoliz, comparativ cu zonele extinse, care sunt foarte uor accesibile. Fiecare domeniu imunoglobulinic este stabilizat printr-o legtur - S - S -, situat central. Lanurile imunoglobulinice sunt orientate n direcii opuse i stabilizate prin legturi de hidrogen intercatenare, astfel nct iau o form tridimensional, denumit structur .
Fig. nr. 29 - Reprezentarea schematic a domeniilor din structura imunoglobulinei (Klein)

Domeniu imunoglobulinic variabil

Domeniu imunoglobulinic constant

ntre domeniile adiacente se stabilesc dou tipuri de interaciuni: interaciuni de tip cis - pe vertical, ntre dou domenii nvecinate Interaciuni de tip trans - pe orizontal, ntre domenii situate pe lanuri diferite Diametrul unui domeniu este de aproximativ 3,5 nm. n realizarea funciei de anticorp, o mare importan o are regiunea balama, care confer flexibilitatea Fab pe F C, prin realizarea unor unghiuri cu deschidere variabil cuprinse ntre 0 i 180. De aici rezult forma monomerului imunoglobulinic - respectiv Y sau T. - Regiunea balama are 15 aminoacizi. Are o structur primar unic, poriunea ei central constnd din dou legturi disulfidice, legate la un helix de prolin, care confer rigiditatea lanului polipeptidic, restrngndu-i rotaia. - Regiunea balama asigur transducia semnalelor de la Fab la F C i este situat la jumtatea lanurilor grele H. 320

- Regiunea balama conine un situs care interacioneaz cu fragmentul C1q al sistemului complement i poate interaciona cu receptorul pentru FC de pe membrana limfocitelor B, PMN - lor sau macrofagelor. - Regiunea balama conine glicin, prolin, cistein n cantiti mari i realizeaz o asociere ntre Fab i fragmentul FC.

321

Tabelul nr. 23. - Diverse funcii ale unor domenii ale moleculei de imunoglobulin - IgG (dup Olinescu) Fragmentul sau Funcia domeniul VH+VL = Paratop sau Leag antigenul (epitopii) situs combinativ Legturi asigurate ntre sistemul combinativ i fragmentul cristalizabil CH1+CL Leag fraciunea C4,6 a sistemului complement Conine legturi disulfidice ntre lanurile H (grele) Unete fragmentul Fab i FC Realizeaz transducia semnalelor de Fab Regiunea balama la FC, dup legarea epitopilor Permite poziionarea n spaiu a Fab i asigur mobilitatea moleculei de imunoglobulin Leag fragmentul C1q al complementului Leag C1q CH2 Controleaz rata de catabolizare a imunoglobulinei Leag molecula la receptorul FC de pe CH3 monocite i macrofage Domeniu suplimentar la IgE (fixare pe CH4 mastocite i bazofile); apare i la IgM

322

Fragmentul imunoglobulinic cristalizabil FC conine domeniile CH2 i CH3 ( CH4 la IgE i IgM) i posed urmtoarele funcii: Interacioneaz cu proteinele sistemului complement (exist dou situsuri de legare cu C1q, cte unul pentru fiecare monomer) i care funcioneaz independent. Interaciunea cu factorul reumatoid se realizeaz la nivelul domeniului CH2, molecula IgG de la reumatici fiind diferit conformaional, comparativ cu cea a indivizilor sntoi. Transportul transplacentar al imunoglobulinelor este posibil datorit legturii moleculei prin FC, la membrana celulelor placentei. Fragmentul FC conine determinani antigenici de clas: (IgG), (IgM), (IgE), (IgA), (IgD) i de subclas: 1,2,3,4 (IgG1, G2, G3, G4); 1,2(IgM1, M2); 1, 2 (IgA1, A2).
Fig. nr. 30. - Structura celor 4 subclase de IgG (Klein, 1991)

Confer proprietatea de citofilie; FC asigur interaciunea moleculei de imunoglobulin cu receptorii FC de pe membrana macrofagelor, limfocitelor, celulelor killer, celulelor NK etc., mai ales prin domeniul CH3. La IgE, interaciunea cu mastocitele i bazofilele are loc prin domeniul suplimentar CH4. Reglarea catabolismului moleculei de imunoglobulin, domeniul CH 2 controlnd timpul de njumtire pentru diferitele clase i subclase de Ig.

323

 Fragmentul FC conine receptori pentru proteina A (SpA) stafilococic, att la nivelul CH2, ct i la nivelul CH3. Interaciunea proteinei A stafilococice cu IgG liber i - a gsit o aplicare practic: obinerea de anticorpi hibrizi legai prin SpA, folosirea SpA n plasmaferez ca mijloc de epurare a moleculelor de IgG care au legat antigene tumorale, etc. Fragmentul cristalizabil FC conine componenta carbohidratic a imunoglobulinei, sub forma a dou catene laterale, cu structur simpl sau complex. Componenta carbohidratic mpiedic interaciunile prea puternice protein - protein (ntre domenii, ntre diverse molecule de Ig sau ntre Ig i celule). Coninutul n glucide (glucoz, galactozamin, manoz, fucoz, acid sialic) variaz ntre 3% (IgG) i 13% din masa molecular a diferitelor imunoglobuline. Pe lng reglarea interaciunilor imunoglobulinice, glucidele structurale ar putea avea i alte funcii: Realizarea i/sau meninerea unei conformaii eseniale pentru sinteza imunoglobulinelor Creterea solubilitii imunoglobulinelor Rol de spaiator ntre domenii i lanuri Rol n reglarea catabolismului prin protecie fa de degradarea proteolitic. Experimental s-a demonstrat c regiunile F C ale Ig - lor pot fi clivate proteolitic, cu producerea unor fragmente biologic active, cu rol de reglare a rspunsului imun. Exemple de peptide imunoreglatoare, obinute prin scindarea FC: Rigina - este tetrapeptid: Gly - Gln - Pro - Arg, derivat din domeniul CH3 al IgG1. Are rolul de stimulator al fagocitozei. Tuftsina - este tetrapeptid: Thr - Lys - Pro - Arg, prezent n poziiile 289- 292 n domeniul CH2, la toate subclasele IgG umane. Are rolul de stimulator al fagocitozei. Peptidul biologic activ - deriv din scindarea CH3 la IgG1 umane; are capacitatea de augmentare a secreiei de anticorpi.

HETEROGENITATEA IMUNOGLOBULINELOR
n definirea heterogenitii imunoglobulinelor se utilizeaz criterii: greutatea molecular constanta de sedimentare coninutul de carbohidrai 324

rata de catabolizare (timp de njumtire) ncrctura electric sensibilitatea la substane reductoare caracterizarea antigenic: epitopii de clas i subclas (lanuri H) natura antigenic a lanurilor L - , K (tipul imunoglobulinei) epitopi de allotip (lanuri L i H) epitopi de idiotip (fragment Fab) Astfel, heterogenitatea Ig - lor poate fi: Heterogenitatea de izotip - de clas, de subclas, de tip Heterogenitate de allotip Heterogenitate de idiotip Izotipul imunoglobulinelor Heterogenitatea de clas, subclas i tip caracterizeaz toi indivizii unei anumite specii. Clasa imunoglobulinelor este dat de ctre epitopi caracteristici, situai pe lanul H: IgG - epitop caracteristic: IgA - epitop caracteristic: IgM - epitop caracteristic: IgE - epitop caracteristic: IgD - epitrop caracteristic: Subclasa imunoglobulinelor este asigurat prin epitopi situai tot pe lanurile H: IgG - conin 4 epitopi de subclas: 1: IgG1 (66% din totalul moculelor IgG) 2: IgG2 (23% din total IgG) 3: IgG3 (7%) 4: IgG4 (4%) IgA - are 2 epitopi de subclas: 1: IgA1 2: IgA2 IgM - epitopii 1 i respectiv 2 definesc subclasele IgM1 i IgM2. Tipuri de Ig

325

epitopii lanurilor L caracterizeaz dou tipuri L K i L. ntro molecul de Ig cele 2 lanuri sunt identice (fie , fie K). Astfel fiecare izotip are dou forme, sau K.

Allotipul imunoglobulinelor Caracterizeaz anumite grupuri de indivizi ale aceleai specii i e asigurat prin epitopi caracteristici situai la nivelul regiunilor constante ale lanurilor L i H. Spre exemplu, sistemul Gm - situat pe lanurile H ale IgG are 25 de factori allotipici (Gm1,..., Gm25; Gm= gamma marker) sistemul Am - situat pe lanurile H2 ale IgA2 are 2 factori allotipici, notai Am1, Am2. factorii Km (Inv) - pe lanurile LK. (Kapa marker are 3 factori allotipici: Km1, Km2, Km3). Detectarea particularitilor allotipice ale imunoglobulinelor are aplicaii n: Studiul sintezei in vivo i a evoluiei Ig aprecierea reuitei grefelor de esut hematopoetic stabilirea sau excluderea paternitii antropologie genetica populaiilor. Idiotipul imunoglobulinelor Fiecare imunoglobulin are specificitate pentru un epitop, conferind imunoglobulinelor heterogenitate de specificitate, dat de natura situsului de combinare (paratopului). Idiotipurile (idios = individual) au fost descoperite de ctre Oudin (1974), care a demonstrat faptul c anticorpii anti Salmonella tiphi produi pe iepure, injectai unui alt iepure cu acelasi allotip ca i donatorul, induc formarea de anticorpi care reacioneaz specific cu anticorpii produi de ctre primul animal. Se demonstreaz astfel c datorit unicitii lor structurale, anticorpii la rndul lor pot deveni antigene. Specificitatea idiotipic este legat de prezena regiunilor hipervariabile ale lanurilor L i H, datorit prezenei unor epitopi individuali, denumite idiotopi (epitopi). Colecia de idiotopi din structura unei molecule de Ig formeaz idiotipul ei. Fiecare Ig are un idiotip unic sau particular (idiotip privat); au fost descrise i idiotipuri comune, (idiotip public), prezente pe imunoglobuline diferite, care reacioneaz ncruciat. Exprimarea unui anumit idiotip ar fi legat de genele care aparin familiei supergenice a imunoglobulinelor. 326

Anticorpii specifici pentru idiotopi ar aciona ca elemente reglatoare n activitatea sistemului imunitar (reeaua idiotip - antiidiotip Jerne) care intervine probabil n ponderarea rspunsului imun. Funcii biologice efectoare ale imunoglobulinelor Imunoglobulina M Apare sub dou forme: monomer (legat de membrane) i polimer (liber n ser - pentameric). IgM monomer Constituie un receptor pentru antigen pe suprafaa limfocitelor B. Formele monomer se gsesc n ser n concentraii extrem de reduse, n afeciuni imunologice precum: lupusul eritematos sistemic, ataxia - teleangiectazia sau macroglobulinemia Waldenstrm. IgM pentameric Cu o greutate molecular de aproximativ 950.000 i formula (L2H2)5, lan caracteristic . Fiecare pentamer conine un lan peptidic J (lan de legtur - joining chain), care are rol n polimerizarea subunitilor imunoglobulinice. Greutatea molecular a lanului J este de aproximativ 20.000 . Datorit piesei de legtur, cele 5 uniti monomerice sunt aezate radiar (n stea) cu 5 brae (vezi fig. nr.31). IgM pentamerice reprezint 5% pn la 10% din totalul imunoglobulinelor din organism. IgM constituie anticorpii de rspuns imun primar, care apar dup primul contact cu antigenul. Exist pe Fab - urile imunoglobulinei aproximativ 10 situsuri de legare cu antigenul (valena - 10), dar efective ar fi doar 5 situsuri, pentru c restul ar putea fi mascate. Din cauza dimensiunilor mari, imunoglobulinele M nu pot traversa bariera placentar (prezena lor la un nou nscut pune diagnosticul infeciilor contactate n perioada intrauterin: infecia rubeoloas, citomegalic, toxoplasmoza, etc.)

327

Imunoglobulinele M pentamere sunt principalele imunoglobuline aglutinante, pot realiza i reacii de precipitare i prezint o mare capacitate de activare a sistemului complement, capacitate de aproximativ 100 de ori mai mare dect cea a imunoglobulinelor G. Activarea sistemului complement prin intermediul IgG se poate realiza numai cu condiia existenei a dou molecule foarte apropiate, care s lege prin fragmentele FC componenta C1q, condiie obligatorie pentru declanarea reaciilor enzimatice activatoare. Este suficient o molecul IgM pentameric pentru activare, deoarece se realizeaz condiia obligatorie de legare a C1q ntre dou fragmente FC. Situsul pentru C1q este situat la nivelul domeniilor C 3 - C4 i devine accesibil n urma schimbrilor de conformaie ale moleculei dup fixarea antigenului. Lanul J (Joing) nu are nici un rol n fixarea componentelor sistemului complement. n dezvoltarea ontogenetic apare prima dat - clasa imunoglobulinelor M; de asemenea IgM apar precoce i n rspunsul imun. Aceast clas de Ig confer i activitatea bactericid a serului. Imunoglobulinele M secretorii dimerice apar ca o consecin a unui deficit n IgA secretorii. Sinteza imunoglobulinelor M este cel mai puin influenat de aciunea unor factori imunodepresori. IgM reprezint forma sub care se gsesc anticorpii naturali ai grupelor sanguine. Concentraia IgM n ser este cuprins ntre 0,5 - 1,9 mg/ml, iar concentraia lor extravascular este de aproximativ 20%. Sinteza IgM se face ntr-un ritm de 6 - 8 mg / kg corp / zi iar timpul lor de njumtire este cuprins ntre 5 i 7 zile.

328

Fig. nr. 31. Structura IgM pentamer (Klein, 1991)

Imunoglobulina G Reprezint 75-80% din totalul imunoglobulinelor din serul uman normal. Greutatea lor molecular este de circa 150 k. Sunt imunoglobuline monomerice, apar dup stimulul antigenic secundar. Moleculele IgG care apar n cursul stimulului secundar sau prin comutare dup stimulul primar, inhib sinteza anticorpilor IgM printr-un proces feed-back, intrnd n competiie cu antigenele. Concentraia n ser a IgG este cuprins ntre 8 i 12 mg/ml, cu o durat de njumtire de aproximativ 23 zile. Sinteza IgG se realizeaz ntr-un ritm de 30 mg/ml, cu o durat de njumtire de aproximativ 23 de zile. Sinteza IgG se realizeaz ntr-un ritm de 30 mg/kg corp/zi. Lanul caracteristic este , cu 4 subclase 1, 2, 3, 4 corespunztoare IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Sinteza moleculelor IgG aparinnd diverselor subclase este condiionat de natura stimulului antigenic. Spre exemplu, antigenele Rh activeaz sinteza anticorpilor IgG1 i IgG3, polenul activeaz sinteza anticorpilor IgG4 iar dextranul induce sinteza IgG2. Astfel, dozarea cantitativ a IgG totale ar putea fi uneori irelevant, deoarece n unele afeciuni exist doar modificri la nivelul subclaselor IgG, fr influenarea IgG totale. Spre exemplu, n infecii severe ale aparatului respirator cresc mult IgG 2 i IgG4 n dauna celorlalte subclase IgG. 329

Subclasele IgG difer ntre ele privind natura legturilor disulfidice ntre lanurile grele, prin determinani de subclas i prin proprieti biologice.
Tabelul nr. 24 - Proprieti ale subclaselor IgG. (Olinescu) Proprietatea Procent din totalul moleculelor IgG Lan greu, epitopi specifici Timp de njumtire specific Fixarea complementului Transfer transplacentar IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 66% 23% 7% 14% 1 2 3 4 23 zile 23 zile 8 zile 23 zile + + + + + + +

330

Imunoglobulinele G trec transplacentar i asigur aprarea imun a nou-nscutului Moleculele IgG activeaz complementul pe cale clasic, excepia fiind subclasa IgG4. Moleculele IgG au un rol esenial n neutralizarea toxinelor, virusurilor, bacteriilor; intervin n reacii de citotoxicitate anticorpo dependent (ADCC). Moleculele IgG promoveaz fagocitoza, fiind opsonine specifice. Moleculele IgG se pot fixa la piele, cu excepia IgG2.
Tabelul nr. 25 - Proprietile biologice ale diverselor clase de imunoglobuline umane (dup Olinescu A).

331

Proprietatea Lanul greu este de tip Concentraia n ser (mg/ml) Greutatea molecular (k ) Concentraia extravascular (%) Coeficient de sedimentare S Greutatea lanului H (k ) Nr. domeniilor lanului H Hidrai de carbon (%) Numrul subclaselor Nr. situsurilor combinative Prezena lanurilor de unire J Rezistena la 56 C Rezistena la 2-mercaptoetanol Determinante izotipice (subclase) Sinteza (mg/kg/zi) Catabolism (%/zi)

Clasa de imunoglobine IgG 8-12 150160 60 7 53 3 2-5 4 2 + ++ IgA IgD 0,031,4-4,0 0,5-1,9 0,4 170 n ser, 400 900 185 n secreii 60 7;9;11 56 3 8-10 2 2;4;6 + + 20 19 65 4 10-12 2 sau 10 + + 6-8 14 5,1 25 7 69 3 12-15 2 ++ 0,4 ? 2,8 IgM IgE 0,0001 190 50 8 72 4 11-12 2 ? 2,5 2,3

1;2;3;4 1;2

30 8-27 3 12 21 (la Perioada de njumtire (zile) 7 IgG3=7)

332

Proprietatea Capacitatea de fixare a complementului (cale clasic)

Clasa de imunoglobine IgG IgA + (IgG4 nu) IgM ++ IgD IgE -

333

 Imunoglobulina A Clasa IgA este alctuit din IgA serice i IgA secretorii, cu particulariti distincte. Clasa IgA are o tendin evident de a produce polimeri cu constante de sedimentare 10S, 13S, 15S, 18S, care corespund unor imunoglobuline di-, tri-, tetra- sau pentamere. Subclasele IgA au fost stabilite pe baza unor diferene multiple i au fost notate IgA1 i IgA2. Subclasa IgA1 - se gsete n proporie de 80% n ser i are lanul mai scurt cu aproximativ 40 de resturi de aminoacizi. Epitopul caracteristic de subclas este 1. Nu prezint markeri genetici allotipici pe F C. Viteza ei de sintez este de aproximativ 24 mg/kg corp/zi, iar timpul su de njumtire n ser este de aproximativ 6 zile. Subclasa IgA2 - reprezint 20% din IgA serice, cu epitop caracteristic de subclas 2. Pe catena H prezint doi markeri A 2m(1) corespunznd tipului caucazian i A 2m(2) corespunznd raselor mongoloid negroide. Viteza de sintez a IgA2 este 21,3 mg/kg corp/zi iar timpul de njumtire n ser este de aproximativ 4, 5 zile. Dup Schiff (1986), diferenele ntre subclasele IgA1 i IgA2 in i de structura regiunii balama (coninut n aminoacizi, rezisten la proteoliz). Imunoglobulinele A serice sunt prezente n special sub form monomer (greutate molecular aproximativ 162 kilo ); la om, formele polimere sunt ntlnite mai frecvent n mieloamele cu IgA, cu grad de polimerizare individualizat. Funciile imunoglobulinelor A serice sunt foarte puin cunoscute: Au activitate de anticorp extrem de slab Ig serice au un efect opsonizant foarte slab, dei fagocitele prezint receptori pe suprafaa lor pentru fragmentul cristalizabil IgA serice nu pot fixa complementul i nici nu l pot activa singure La om, rolul IgA serice ar putea fi asociat cu ndeprtarea unor cantiti mici de antigene provenite din alimente sau ar putea lega antigene din snge pe care le-ar putea transporta la nivelul mucoaselor (la nivelul sistemului imun al mucoaselor) IgA serice pot participa, deci, la reacii de neutralizare i precipitare.

334

Imunoglobulinele A secretoare (IgAs) sunt prezente n secreiile de la nivelul mucoaselor. Apar sub form dimeric (60 - 80%), restul sub form polimeric. IgA secretorie este principala imunoglobulin existent n secreiile salivare, nazale, gastrointestinale i mamare, fiind secretat de ctre plasmocitele laminei propria. IgA secretorii prezint o greutate molecular de aproximativ 400 k, formate din doi monomeri unii printr-o pies de legtur J (Joing). Dimerul conine o protein suplimentar, denumit component secretor sau piesa CS care este sintetizat de ctre celulele endoteliale. Piesa S ajut la traversarea celulelor epiteliale de ctre dimer i confer rezisten fa de aciunea proteazelor de la nivelul mucoaselor. Aceast tanscitoz epitelial este favorizat de ctre un receptor imunoglobulinic polimeric care are n componena sa i piesa secretorie. Componentul secretor este o globulin nenrudit cu imunoglobulinele i foarte bogat n glucide. Este format din 737 aminoacizi, cu secven cunoscut. Dup modelul Heremans (1974), componentul secretor s-ar nfura n jurul fragmentelor cristalizabile ale monomerilor IgAs, extinzndu - se de la o regiune balama la alta, fapt care mrete stabilitatea moleculei i, de asemenea rezistena la proteoliz prin intermediul enzimelor existente n secreiile mucoaselor. n diferite secreii ale organismului uman. IgAs se gsete n concentraii diferite. Astfel, cantitile de IgAs sunt: n saliv: 28mg%; n colostru: 151mg%; n secreii oculare: 7 mg%; n secreii bronice: 10 - 70 mg%; n intestinul subire: 75mg%; n vezicula biliar: 50 mg%; n prostat: 25 mg%; n secreiile vaginale: 6 mg%.

335

Fig. nr. 32 - Structura IgA secretoare (Klein, 1991)

Componentul secretor
Pies de legtur

Monomer IgA

Funciile efectoare ale IgAs se caracterizeaz prin: aprare local antiviral (la poarta de intrare), suprimnd ataarea virusurilor pe receptorii specifici activitate bactericid crescut la poarta de intrare rol de reglare a componenei florei microbiene de la nivelul mucoaselor. Indivizii cu deficit n IgA sunt susceptibili la boli autoimune, la infecii ale cilor respiratorii. Deficitul genetic n IgAs se poate compensa prin IgM secretorii. Protecia fa de infecii respiratorii i digestive ale nou nscutului, prin prezena IgA secretorii n laptele matern. Sinteza proprie a IgAs ncepe aproximativ la 30 zile dup natere. Sugarii alimentai natural sunt mai protejai fa de infecii dect cei alimentai artificial. Mrirea aviditii fa de antigene i capacitatea IgAs de a interconecta mai multe particule strine.

336

 minimalizarea efectului toxinei holerice, probabil prin mpiedicarea atarii subunitii B pe celulele epiteliului intestinal. Capacitatea IgAs de a participa direct la distrugerea microorganismelor cu proprieti invazive - este foarte controversat. IgAs pot participa i n reaciile de citotoxicitate mediate celular dependente de anticorpi. Anticorpii IgAs nu pot aglutina, precipita antigene corpusculare, dar pot activa complementul pe cale alternativ (nu pe cale clasic). Rolul opsonizant al IgAs este foarte slab (aproape absent). Concentraia IgA serice este de 1,4 - 4 mg/ml cu timp de 1/2 de 7 zile. Imunoglobulina E IgE are o structur monomer, cu epitop caracteristic de clas . Lanurile prezint 5 domenii i au o concentraie mare n hidrai de carbon (11%). Greutatea molecular a IgE este de aproximativ 190 k. IgE sunt prezente n snge n concentraii reduse (aproximativ 250 ng/ml de ser) sau 0,004% din totalul Ig. Celulele care sintetizeaz IgE au fost evideniate preferenial n mucoasele respiratorii gastrointestinale i n ganglionii regionali. Timpul de njumtire al IgE circulante este de aproximativ 4 zile, iar a celor fixate pe celule (mastocite, bazofile) este de 7 - 14 zile. Anticorpii IgE nu activeaz sistemul complement, se leag prin intermediul FC (domeniul CH4) pe membrana mastocitelor, bazofilelor, inducnd degranularea acestora i eliminarea aminelor vasoactive (histamina, serotonina, leucotriene, substana SRS - A, factorul chemiotactic pentru eozinofile). De aceea, aceti anticorpi sunt denumii anticorpi reaginici, hemocitotropi, fiind implicai n procese de hipersensibilitate de tip I anafilactic i n aprarea antiparazitar. Rspunsul n IgE este precoce, imediat dup rspunsul IgM i nainte de rspunsul IgG, nivelul seric IgE fiind influenat genetic iar limfocitele T supresoare au un rol important n reglarea sintezei lor. Concentraia IgE n ser crete n alergii i parazitoze pn la 25.000 - 30.000 ng/ml. IgE contribuie la ndeprtarea unor helmini din intestin, prin intermediul unor factori chemiotactici pentru eozinofile i prin expulzarea paraziilor din organele care conin muchi netezi care se contract prelungit. 337

 Efectul IgE n reaciile de Hipersensibilitate de tip I este predominant nefavorabil. Imunoglobulina D Descoperit n anul 1965 de ctre D. S. Rowe i F.L.Fahey n serul unui bolnav cu mielom. Concentraia seric a IgD este foarte sczut - 40 mg/ml, reprezentnd 0,2%- 1% din imunoglobulinele totale. Greutatea molecular a IgD este de aproximativ 180 k i constanta de sedimentare 7S. Epitopul caracteristic de clas este . Lanul are 3 domenii constante i o regiune balama foarte lung, cu o mare susceptibilitate la proteoliza enzimatic. Molecula IgD este monomeric, bivalent, cu un timp de njumtire foarte scurt (aproximativ 3 zile). Funciile biologice ale IgD sunt urmtoarele: Receptor pentru antigen pe suprafaa limfocitelor B mature (B + B) - IgD fixate. IgD serice nu fixeaz i nu activeaz complementul, nu traverseaz placenta, nu produc reacii citotrope (nu se fixeaz pe monocite, limfocite, mastocite). IgD fixate ar putea constitui receptori necesari n diferenierea celular i n instalarea memoriei celulare Concentraia IgD serice crete progresiv de la natere pn la vrsta de 15 ani, dup care nivelul su rmne constant toat viaa. IgD are o slab activitate de anticorp fa de antigene tiroidiene, nucleare, insulin, proteine din lapte (efect nefavorabil - posibil fenomene autoimune) IgD are aciuni limitate n timp, prin marea susceptibilitate la degradarea termic i enzimatic.

SISTEMUL IMUN AL MUCOASELOR (SIM)

Sistemul imun al mucoaselor este reprezentat prin esutul limfoid asociat mucoaselor tractului respirator, digestiv, urogenital. SIM se ntreptrunde cu sistemul imunitar sistemic dar ntre cele 2 sisteme exist diferene:

338

 Celulele SIM sunt distribuite n structurile limfoide ale laminei propria a mucoaselor. Celulele SIM acioneaz preferenial asupra anumitor antigene care pot adera la epitelii. Celulele limfocitare B produc n mod preferenial IgA secretorii, rezistente la degradarea proteolitic, spre deosebire de sistemul imun sistemic, care determin formarea predominant de IgM i IgG. Iniierea rspunsului imun este determinat de ptrunderea antigenelor ingerate sau inhalate, pe calea celulelor epiteliale specializate ale mucoaselor. n intestinul subire, epiteliul asociat foliculilor limfoizi conine celule M (membranare) subiri, care transport antigenul spre interior, printr-un sistem tubular. Celulele similare, care capteaz antigenele au fost evideniate i n epiteliul bronhic, al criptelor amigdaliene i n apendice. Sistemul imun asociat cu intestinul este denumit GALT (gut associated lymphoid system) iar cel asociat cilor respiratorii - BALT (Bronchus associated lymphoid tract). Prezentarea antigenelor determin migrarea limfocitelor T i B sensibilizate n ganglioni limfatici i de aici, pe calea canalului toracic - n circulaia sanguin. Dup ce au circulat prin limf i n sngele periferic, limfocitele se rentorc la nivelul mucoaselor, datorit unor receptori imunologici de stabilire a domiciliului (fenomenul de homing). Rentoarcerea celulelor nu se face numai la situsul iniial de plecare, ci prin diseminare n toate insulele limfoide ale submucoaselor. Aceast diseminare de limfocite T i B sensibilizate amplific rspunsul imunitar prin antrenarea ntregului sistem de aprare al mucoaselor. Astfel, sistemul imunologic comun al mucoaselor Common mucosal immunological system ar explica interrelaiile GALT i BALT (vezi fig. 33). Producia IgA secretoare este n legtur cu sistemul imun al mucoaselor, n timp ce producia IgA serice aparine sistemului imun sistemic. Aceast diferen este meninut i de lipsa de corelaie dintre activitile SIM i SIS. Pe lng IgAs, diferitele secreii ale mucoaselor conin i imunoglobuline aparinnd altor clase; n mucoasa duodeno-jejunal exist plasmocite productoare preponderent de IgM, n timp ce n mucoasa gastric i nazal 3% - 5% dintre plasmocite secret IgG. Plasmocitele productoare de IgA sunt ntlnite la nivelul tractului aeroalimentar superior i n glanda lacrimal. Aprarea imunitar la nivelul mucoaselor este rezultatul unor mecanisme imunologice complexe (care includ Ig i celule NK) mecanisme care se adaug funciei de barier natural pentru antigene variate. 339

CONTROLUL GENETIC AL SINTEZEI IMUNOGLOBULINELOR

Heterogenitatea extraordinar a imunoglobulinelor (aproximativ 10 anticorpi diferii - dup Urbain, 1987) se poate explica exclusiv prin mecanisme genetice, n timpul dezvoltrii ontogenetice a limfocitului B (Tonegawa, Premiul Nobel 1976). Mecanismele genetice care asigur variabilitatea anticorpilor ar putea fi explicate prin : existena unor gene de variabilitate (V) care n timpul dezvoltrii ontogenetice a limfocitului B sufer diverse mutaii ( teoria mutaiei somatice). existena unui numr mare de gene separate care codific zonele variabile VL i VH (teoria liniei germinative)
90

340

Fig. nr. 33 - Reprezentarea interrelaiilor GALT i BALT (dup Zarnea)

existena unui numr mare de gene de legtur J (Joing) care favorizeaz recombinrile genetice ntre genele care asigur variabilitatea (ipoteza recombinrilor somatice). Sinteza imunoglobulinelor urmeaz etapele obligatorii : c) sinteza lanurilor polipeptidice H d) sinteza lanurilor uoare L e) asamblarea lanurilor L i H f) adugarea componentelor glucidice ale imunoglobulinei g) eliminarea moleculelor imunoglobulinice din plasmocit, dup realizarea polimerizrii h) comutarea sintezei Ig La om, genele care codific sinteza lanurilor : LK - sunt localizate pe cromozomul 2 L - sunt localizate pe cromozomul 22 H - sunt situate pe cromozomul 14 341

Organizarea genelor codificante ale catenei H Aparatul genetic este alctuit din exoni (zone codificante) i introni (zone necodificante, care favorizeaz procesele recombinrilor genetice). Prin splicing (rupere i nndire) - se elimin anumii exoni i se obbin structuri foarte variate ale lanurilor imunoglobulinice. Exonii codificani ai zonelor variabile H sunt : V - de variabilitate (VH1 VH200) D - de diversitate (DH1 - DH20) J - de legtur (JH1 - JH4) Exonii C codific zonele constante, cu specificitate de clas i subclas. Succesiunea exonilor C este urmtoarea, dinspre captul 5 spre 3:
C, C, C, C, C 5 3

Fig. nr. 34 - Reprezentarea schematic a rearanjrilor genetice produse n limfocitele B n cursul sintezei de IgM (Rougeon, 1985)

342

Trecerea de la o clas de imunoglobuline la alt clas de imunoglobuline, prin procese de reasortare genetic, se numete comutarea de izotip. Comutarea de izotip are loc numai n limfocitele B, mature din punct de vedere imunologic. Recombinarea exonilor unui lan H ncepe cu: 1 exon D(x) cu 1 Exon J(y), cu formarea structurii D(x)J(y). Exemplu : D15 cu J4 D15J4 D1 cu J1 D1J1 1 exon V(z) cu complexul D(x)J(y) Exemplu : V(11)D15J4, V(180)D20J3 etc. Complexul VzDxJy codific zonele variabile H. n final, VzDxJy sufer o recombinare cu un exon C : VzDxJy + C IgM (de rspuns imun primar) VzDxJy + C IgG (de rspuns imun secundar)
Fig. nr. 35 - Comutarea izotipic (Klein, 1991)

343

Fiecare gen CH are o secven Switch (de comutare) nspre captul 5, secven ce favorizeaz comutarea izotipic. Fiecare segment V sau D prezint nspre gena J aa - zise secvene semnal de recunoatere. Aceste structuri, mpreun cu intronii (secvene spaiator), favorizeaz procesele recombinrii genetice prin formarea unui sistem trunchi i bucl (stem and loop), de fapt o structur tridimensional care aduce aproape ntocmai exonii care vor suferi recombinri genetice, Dx - Jy, cu deleia enzimatic a segmentului ADN dintre cele 2 regiuni implicate. Procesul de legare combinatorial amplific diversitatea anticorpilor, datorit variabilitii diferitelor puncte legare. Variaiile joncionale sunt legate de o anumit imprecizie a situsurilor de recombinare, care modific secvena ADN la nivelul jonciunilor VH - DH, DH JH (VL -JL) limitate ca amploare n cazul catenelor L, reprezint o surs crescut de diversitate n cazul catenelor H, datorit posibilitii de citire a informaiei genetice D (de diversitate) n trei cadre de citire diferite, apar modificri semnificative n secvena de aminoacizi. Gradul de variabilitate (aproximativ) al lanurilor H este asigurat prin asortarea aleatorie a: 200 gene V x 20 gene D x 4 gene J = 16.000 catene H Numrul de variaii produse prin flexibilitate joncional este de cte 2,5 pentru fiecare pereche VH - DH i DH JH. Diversitatea conferit de genele DH i JH este apreciat cu factorul 5. n concluzie, 16.000 catene H x 2,5 x 2,5 x 5 = 500.000 catene H La aceast cifr, se poate realiza diversitatea suplimentar (printrun factor N), diversitate produs probabil prin mutaii somatice sau prin recombinri ntre segmente genetice ale laturilor L i H, care ofer un repertoriu potenial de imunoglobuline - de miliarde de anticorpi diferii. Organizarea genelor codificante ale lanurilor L Sinteza lanurilor LK este codificat astfel pentru zonele variabile, aproximativ 300-600 exoni Vk 5 exoni J, de legtur (4 activi) Sinteza lanurilor L este codificat prin cteva gene V i 5 exoni J, dintre care activi sunt doar 3. Zonele constante ale lanurilor uoare sunt codificate prin 6 pn la 9 exoni C, cu specificitate de lan sau K. Lanurile L au o diversitate genetic sczut.

344

Recombinrile genice se realizeaz ncepnd cu exonii V(x) J(y), recombinri ce sunt amplificate prin prezena intronilor i a secvenelor semnal de recunoatere. Numrul mare de gene Vk ofer o variabilitate nalt a lanurilor uoare LK (600VK x 4J = 2400), aspect necesar pentru realizarea variabilitii situsurilor combinative ale imunoglobulinelor. n final, complexului V(x) J(y) i se ataeaz un segment constant C (z). Ansamblul V(x) J(y)C(z) este transcris ntr-un ARN premesager, apoi secvenele ARN care corespund intronilor i secvenelor genetice mute sunt excizate, obinndu-se un mARN funcional care este codificat la nivel ribozomal n lan L. Posibilitile de variabilitate ale lanurilor L sunt sporite i prin mutaii somatice punctiforme, cu referire special la genele V i J inclusiv prin realizarea unei variabiliti la locul de recombinare. Prin asociere combinatorial, o anumit caten H dat (indiferent de clasa sau subclasa creia i aparine) este teoretic capabil s se asocieze cu oricare dintre catenele LK sau L, produse de ctre celul. Aceast reunire este necesar, pentru a realiza configuraia i specificitatea paratopilor. Dei repertoriul potenial (teoretic) de anticorpi diferii atinge cteva miliarde, repertoriul disponibil (practic) este de ordinul a cteva milioane de paratopi diferii, prezeni la un moment dat n sistemul imunitar al organismului respectiv. Numrul paratopilor disponibili, efectivi, reali, este cu mult mai mare dect numrul antigenelor cu care organismul respectiv interacioneaz pe parcursul vieii. Genele care asigur diversitatea genetic a imunoglobulinelor fac parte dintr-o familie supergenic V,D,J (familia supergenic a Ig) care asigur i controlul genetic al variabilitii receptorilor pentru antigen de la nivelul limfocitelor T (TCR) i a CD-urilor de difereniere dup mecanisme similare celor prezentate anterior : recombinri ale unor gene V, D, J, C; flexibilitatea joncional; unirea imprecis a segmentelor de gene; asocierea combinatorial, mutaii somatice, etc. Toate aceste evenimente genetice apar n cursul ontogeniei limfocitelor B i T.

ANTICORPII MONOCLONALI
Anticorpii monoclonali (AMC) sunt anticorpi cu specificitate restrns, care interacioneaz cu un singur epitop. Producerea AMC a fost impulsionat datorit numeroaselor i avantajoaselor aplicaii ale acestora: 345

APICAIILE AMC Studiul receptorilor de suprafa celular , prin marcarea AMC cu substane fluorescente sau radioactive. Astfel, prin AMC se pot evidenia i antigene de difereniere limfocitar, care fac corelaia ntre fenotipul limfocitului i funcia sa. Prin AMC se poate urmri ontogeneza limfocitelor B i T, prin studierea grupelor de difereniere CD (cluster of differentiation). Spre exemplu, structura CD4 evideniaz un limfocit T helper, iar structura CD8 caracterizeaz limfocitele T citotoxice i limfocitele T supresoare. Utilizarea AMC n scop diagnostic: n boli infecioase cu etiologie bacterian, viral, micotic, parazitar n boli genetice (trisomia 21) n sarcin (utiliznd AMC antigonadotrofin corionic) n testarea compatibilitii HLA a grefelor n identificarea diverselor tipuri de celule maligne n organism determinarea diferenelor antigenice ntre virusuri studiul structurii i variabilitii genetice a anticorpilor Utilizarea AMC n scop terapeutic: Utilizarea AMC cu scopul neutralizrii infeciozitii virale (inhibarea atarii virusului pe suprafaa celulelor susceptibile) Utilizarea AMC ca factori imunosupresori n transplantele de organe, n bolile autoimune i alergice (ex.: AMC anti-CD3, CD4, LFA-1) Utilizarea AMC n terapia specific antitumoral Utilizarea AMC pentru purificarea interferonilor n scop terapeutic Conjugarea medicamente - AMC, pentru vehicularea unor citostatice Cuplarea AMC cu imunotoxine, cu scopul potenrii reaciilor de citotoxicitate. Metoda este util pentru distrugerea celulelor int care poart pe suprafaa lor un numr redus de antigene (cu imunogenicitate redus) Imunolipozomii - realizarea unor conjugate lipozomi AMC, cu scopul ghidrii lipozomilor spre anumite celule int Tehnologia obinerii anticorpilor monoclonali 346

AMC se obin prin tehnologia hibridomului i sunt de fapt o variant in vitro a proteinelor mielomatoase, deoarece se selecteaz o singur clon de limfocite care sintetizeaz anticorpi cu specificitatea dorit (pentru un singur epitop). Utilizarea limfocitelor B normale este o metod care nu ofer rezultate mulumitoare, deoarece plasmocitele nu supravieuiesc n culturi de celule. Pentru a compensa acest neajuns, se realizeaz fuzionarea celulelor B cu celule tumorale, care sunt imortale (au o capacitate de supravieuire nelimitat n culturi de celule). Celulele tumorale folosite sunt celule de mielom multiplu (plasmocitom), care prolifereaz necontrolat, producnd cantiti mari din aceeai imunoglobulin monoclonal. Dup fuzionarea limfocitului B (care precizeaz tipul imunoglobulinei monoclonale) cu celula mielomatoas, se adaug n mediul de cultur hipoxantin, aminopterin i timin (mediul HAT). n mediul HAT vor supravieui i se vor multiplica nedefinit numai celulele de hibridom, care produc hipoxantin guanin - ribozil transferaza. Celulele nefuzionate mor. Celulele de hibridom (fuzionate) sunt distribuite n plci cu godeuri, respectiv o celul hibrid / godeu. Se selecteaz astfel clona dorit care se multiplic n vitro, dup care se va inocula intraperitoneal la un oarece consangvin, care va produce ulterior cantiti mari de imunoglobuline monoclonale (20 mg de protein la 1 ml de lichid ascitic, zilnic recoltndu-se aproximativ 2 - 10 ml de lichid). Dei randamentul metodei de obinere a AMC este bun, inocularea repetat a AMC de origine murin la om - va stimula puternic rspunsul imun al gazdei fa de proteina exogen; exist chiar riscul inactivrii anticorpului inoculat. Pentru ndeprtarea acestor neajunsuri, s-au obinut anticorpi himerici, alctuii n zona variabil VL i VH ntocmai ca AMC murini, dar cuplai cu CL, CH1, CH2, CH3 umane. i aceti anticorpi himerici sunt imunogeni, singura speran n diminuarea imunogeneticitii lor fiind obinerea AMC prin tehnologia ADN - ului recombinant, cu specificitate izotipic uman.

347

Fig. nr. 36 - Schema producerii anticorpilor monoclonali (Zarnea, 1990)

348

CAPITOLUL 43 SISTEMUL COMPLEMENT

Sistemul complement (C) reprezint un sistem biologic de amplificare a rspunsului imun, constituit din 9 fraciuni (C 1 - C9) i 11 proteine globulare distincte (C1 - alctuit din subfraciunile C1q, C1r, C1s). Funciile biologice ale sistemului complement sunt variate: Bacterioliza (liza bacteriilor, mai ales a bacteriilor gram negative) Liza virusurilor mari nvelite sau liza celulelor infectate cu virus Promovarea fagocitozei (componentul C3 constituie o opsonin specific) Activarea degranulrii mastocitelor i bazofilelor Reacii de citotoxicitate (liza celulelor strine sau liza celulelor proprii, realizat n boli autoimune, hemoliz imun) Rol n inflamaie (anafilotoxin, chemotactism, creterea permeabilitii vasculare i contracia muchilor netezi, etc.) Factorii sistemului complement se gsesc n ser n stare inactiv, dar pot fi activai enzimatic, pe calea clasic i pe calea alternativ (properdinic). Activarea componentelor sistemului complement se realizeaz prin clivare proteolitic, n urma acestui fenomen rezultnd dou fragmente diferite a sau b: Un fragment activ n clivarea componentului urmtor n secven Un fragment ce se fixeaz pe membrana celular. Activarea componentelor se realizeaz n sistemul de cascad enzimatic. Etapa esenial a activrii este obinerea fraciunii C 3, placa turnant ntre activarea C pe cale clasic i cea pe cale alternativ. Activarea pe cale clasic ncepe de la C 1, e iniiat de prezena complexului AG-AC i are o evoluie rapid i eficient. Proteinele specifice cii sunt C1, C2 i C4. Activarea pe cale alternativ ncepe de la C 3 i este mai lent. Calea properdinic este declanat prin intermediul endotoxinelor bacteriene, proteazelor lizozomale sau agregatelor imunoglobulinice (IgA, IgE). Calea de activare altern prezint proteine specifice: factorii D, B, I, H i Properdina (P).

349

ACTIVAREA SISTEMULUI COMPLEMENT PE CALE CLASIC

Calea clasic este activat prin sisteme antigen anticorp situate pe suprafaa unor membrane celulare. Componentul C1 este unitatea de recunoatere a sistemului complement i este alctuit din trei subuniti C 1q, C1r, C1s meninute asociate n prezena ionilor de calciu. C1q are o greutate molecular de 400 k i este alctuit din 6 subuniti, reunite n Y, aspectul conferit fiind acela de buchet de lalele. Fiecare extremitate are aspectul globular i reprezint situsuri de legare pe domeniul CH2 al IgG i probabil CH3 al IgM. Interaciunea cu antigenele determin o modificare conformaional a imunoglobulinelor, care descoper situsul de legare de pe F C pentru C1q. n cazul IgM, legarea i activarea C1 poate fi efectuat de ctre o singur molecul, n timp ce n cazul IgG sunt necesare dou molecule de imunoglobulin G, situate foarte aproape una alta, pe suprafaa celulei. Diferitele subclase de IgG au o capacitate de legare a C inegal: IgG 3>IgG1>IgG2. IgG4, IgA, IgD, IgE nu prezint receptori pentru sistemul complement. Activarea unei fraciuni se noteaz C x . C 1q se fixeaz pe situsul S1 al membranei celulare. C1q activeaz C1r i C1s. C1q,1r,1s se leag prin legturi necovalente n prezena calciului, realiznd factorul C 1 . C 1 scindeaz C2 i C4 n fragmentele C2a, C2b i C4a, C4b. Fragmentul C4b se ataeaz de membrana celular n poziia S 2, apoi se leag C2a n acelai situs, n prezena ionilor de magneziu. Enzima C2aC4b reprezint C3 convertaza clasic, ce cliveaz fragmentul C3 n dou fragmente: C3a i C3b. Fragmentul C3b se ataeaz pe membrana celular n situsul S2, alturi de C4b2a. Fragmentul C3a trece n faz lichid, ndeplinind diverse roluri imunologice. Complexul C4b2a3b are rolul C5 convertaz, care scindeaz factorul C5 n fragmentul C5a, care trece n faz lichid i C5b care ataeaz n situsul S3. Reaciile enzimatice se ncheie la C 5, dup care urmeaz simple reacii de adsorbie. C5b leag C6 i C7, rezultnd C5b67, la care se ataeaz apoi C8 (tot n situsul S3), rezultnd complexul C5b678. Complexul rezultat prezint ase poziii de legtur pentru C 9, rezultnd un complex decamolecular activat C5b6789. Din punct de vedere funcional, moleculele complementului C5b,C6,C7,C8,C9 reprezint complexul de atac al membranei, care va realiza funciile citolitice, prin crearea unor microcanale membranare prin care se pierde coninutul celular. 350

Fig. 37 - Reprezentarea fazelor de activare ale sistemului complement (Zarnea)

351

Tabelul nr. 26 - Principalele proprieti ale proteinelor sistemului complement (Zarnea, 1990) Greutatea Concentraia Mobilitatea Componentul electroforetic molecular ( ) seric ( g/l) C1 900.000 200-300 C1q C1r C1s C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 B D P C1INH 410.000 85.000 85.000 110.000 205.000 210.000 C5a 11.000 C5b 195.000 128.000 121.000 155.000 79.000 93.000 25.000 220.000 109.000 150-180 50 100 30 80 400-450 80 75 53 80 200 200 1,5 10-25 180

352

CALEA ALTERNATIV (PROPERDINIC)

Factorii de activare ai acestei ci sunt reprezentai prin factori variai (endotoxine, Ig polimerizate, properdina). Principalul factor de iniiere al cii se numete Fi (factorul de iniiere), cu GM de 170 , care este o pseudoglobulin format din dou lanuri peptidice. Factorul de iniiere activeaz factorul B (1 glicoproteina cu greutate molecular 93 ) i l cliveaz n fragmentul B b (ce se unete cu C3b, rezultnd C3bBb) i fragmentul Ba ce trece n faz lichid (reacii catalizate prin proteina H i Mg2+). Complexul C3bBb reprezint convertaza solubil C3, care va activa componentul C5, cu formarea ulterioar a complexului de atac al membranei celulare (C5b6789). Factorul B este supus clivrii n cele 2 fragmente B b i Ba sub aciunea factorului D ( globulin cu GM 24 ). Fragmentele Ba trec n faz lichid, n timp ce fragmentele B b se vor ataa la alte molecule C 3b, complexele C3bBb fiind stabilizate sub influena properdinei P (cu GM 223 , protein tetrameric). Se formeaz convertaza properdin dependent, cu formarea complexului de atac al membranei.

353

Fig. 38 - Calea alternativ de activare a sistemului complement (Haeney, 1984)

Mecanisme de control ale activitii sistemului C

Pentru a preveni eventuale boli autoimune, cu agresionarea structurilor proprii exist sisteme complexe de reglare ale activitii sistemului C. Cele mai cunoscute sunt urmtoarele: Factorul C1 inhibitor (C1INH) Recunoate factorii C1r i C1s i le inhib activitatea. Factorul C1INH este o glicoprotein cu o GM de 105 k , care nu influeneaz concentraia de C1 nativ, inactiv.

354

 Factorul I Inactiveaz factorii C2, C4 i activitatea cii alternative. Factorul I (cofactor H) cliveaz i distruge C3b (inhibiia preferenial a cii alternative se realizeaz prin intervenia competitiv a factorului H, care va forma complexul inactiv C3bH, complex ce nlocuiete fragmentul Bb din convertaza C3bBb). Degradarea enzimatic a factorului Bb diminueaz activitatea cii alternative. Factorul C4BP (n corelaie cu factorul I) sunt responsabile pentru reglarea activitii C4b. Vitronectina (proteina S) previne legarea complexului C5b67 pe suprafaa membranelor biologice (inhib activitatea complexului de atac al membranei). Factorii XI i XII ai coagulrii controleaz activitatea C1 fa de C2 i C4 n calea clasic.

FUNCII BIOLOGICE ALE COMPONENTELOR SISTEMULUI C

Cele mai importante proprieti biologice ale sistemului complement se refer la intervenia n procesele inflamatorii i aprarea antiinfecioas. Realiznd sinteza acestor proprieti s-a confirmat experimental faptul c: C1 are rol n neutralizarea viral. C1q, C1r, C1s iniiaz liza virusurilor i precipitarea complexelor imune. C2 crete permeabilitatea vascular i stimuleaz contracia muchilor netezi. C3a i C5a - au rol de anafilotoxine i au rol chemiotactic (factorul C 5a este cel mai important factor chemiotactic al gazdei) - produc contracia muchilor netezi - cresc permeabilitatea vascular, prin aciunea lor combinat asupra mastocitelor, bazofilelor i determin aflux leucocitar n esuturile infectate - rol n eliminarea unor complexe imune 355

- C5a activeaz enzimele lizozomale i stimuleaz fagocitoza prin PMN. C3b - realizeaz imunoaderena (reprezint o opsonin specific i promoveaz fagocitoza). - asigur deplasarea complexelor imune n zonele n care rspunsul imun este mai intens - favorizeaz mecanismele citotoxicitii dependente de anticorpi (ADCC). C4b - realizeaz imunoaderenden - rol important n neutralizarea viral C5b - iniiaz liza celular. C6,7,8,9 - complex de atac al membranei (realizeaz liza celular).

Reglarea sintezei componentelor sistemului complement

Reglarea genetic a componentelor sistemului complement este asigurat prin genele CMH clasa a III a. Genele codificante ale C 2, C4 i ale factorului B sunt localizate la nivelul braului scurt al cromozomului 6 uman. Reglarea biochimic Sinteza proteinelor sistemului complement este reglat i prin citokine (spre exemplu, INF stimuleaz sinteza C2, IL1 i IL6 stimuleaz sinteza C3) sau histamine (receptorul pentru histamin H 1R stimuleaz sinteza componentelor C, spre deosebire de H 2R care poate uneori inhiba sinteza). Mecanismele de reglare i control cantitativ i calitativ (funcional) ale componentelor sistemului C sunt extrem de complexe, la nivel genetic, celular i molecular.

356

CAPITOLUL 44 BAZELE GENETICE ALE RSPUNSULUI IMUN

Baza genetic a rspunsului imun este asigurat de ctre un complex de gene strns asociate, cu rol esenial n compatibilitatea esuturilor, recunoaterea antigenelor strine, reglarea rspunsului imun, individualitatea i specificitatea rspunsului imun denumit complex major de histocompatibilitate (CMH). La om, informaia genetic pentru CMH este localizat pe braul scurt al cromozomului 6, cu locusurile genetice (A,B,C) ale CMH clasa I, cu locusurile (D/DR, DQ, DP, DN) ale CMH clasa a II a. Locusurile genetice C2,C4S,C4F, Bf codific sinteza unor componente ale sistemului complement. Ansamblul genelor CMH codific sistemul HLA (Human Leucocyte Antigens), descoperit de ctre Dausset, prin studii fcute asupra aglutinabilitii leucocitelor.

ORGANIZAREA GENETIC A CMH Organizarea genetic a CMH clasa I

Locusurile genetice A,B,C codific antigenele HLA clasa I, care sunt prezente pe suprafaa tuturor celulelor nucleate din organism i asigur individualitatea genetic i biochimic a fiecrui individ n parte. Gena B ocup o poziie central pe harta regiunii, fiind situat la o distan aproximativ egal de gena A i gena D/DR (aproximativ 0,85 cM). Polimorfismul sistemului HLA se explic prin existena mai multor alele pentru fiecare locus genetic n parte. Pentru exemplificare, exist cel puin 24 de alele distincte pentru locusul A i cel puin 50 de alele distincte pentru locusul B.

Organizarea genetic a CMH clasa a II-a

Regiunea genetic HLA-D conine 5 subregiuni distincte: DR, DQ, DP, DN, DO, iar regiunea HLA-I conine genele Ir, de rspuns imun individualizat.

357

Genele CMH clasa a II-a ce codific lanuri sunt desemnate prin litera A, n timp ce genele CMH clasa a II-a ce codific lanurile ale moleculelor HLA - sunt desemnate prin litera B. Spre exemplu, subregiunea genetic HLA-DR cuprinde locusurile genetice HLA-DR A1, HLA-DR A2, HLA-DR B1, HLA-DR B2, etc., cifra asociat indicnd o anumit specificitate a antigenului. Moleculele DR-B1 codific specificitile DR de la DR1 la DRW18, moleculele DR-B3 codific specificitatea DRW52, iar DR-B4 codific DRW53. Subregiunea HLA-DQ conine dou seturi de gene HLA-DQ A1 i HLA-DQ B1, respectiv HLA-DQ A2 i HLA-DQ B2, ultimele dou fiind pseudogene. Lanurile DQ- i DQ- sunt extrem de polimorfe. Moleculele DQ- codific specificitile DQW1 - DQW9. Deoarece fiecare n parte are 2 subregiuni DQ, cte una pe fiecare din cei doi cromozomi (matern i patern), nseamn c exist dou gene diferite DQA1 i dou gene DQ-B1, care se altur tip cis-trans. mperecherea de tip cis se refer la asocierea lanurilor sau codificate de ctre genele aceluiai cromozom, pe cnd recombinarea trans se refer la mperecherea genelor de pe cromozomi opui. Moleculele codificate prin recombinarea trans a genelor se numesc molecule hibrid i sunt cauze importante de asociere a sistemului HLA cu diferite boli. Subregiunea HLA-DP conine, de asemenea, dou seturi de gene (HLA-DP A1, HLA-DP B1 i HLA-DP A2 cu HLA-DP B2), ultimele dou fiind de fapt pseudogene. Moleculele DP codific specificitatea pentru antigenele DPW1-DPW6. Exist la heterozigoi 4 gene distincte DP, care se pot recombina cis i trans n anumite condiii. Subregiunile DN i DO Subregiunea DN conine o singur gen HLA-DN A, iar subregiunea DO conine gena DO-B, gene care n mod normal nu se exprim in vivo dar pot fi puse n eviden prin reacii in vitro. n prezent nu se cunoate funcia acestor gene. Regiunea genetic I - codific rezistena individual la infecie
Fig. nr. 39 - Organizarea genetic a CMH uman [1]

358

Hrile genetice clasice plaseaz genele Ir (de rspuns imun individualizat) n cadrul CMH clasa a II-a.

Organizarea genetic a CMH clasa a III-a

Structura sa este polimorf. Exist 4 alele care determin patru forme alternative ale factorului properdinic (BF), care pot fi evideniate prin separare electroforetic: o form cu migrare rapid (fast form BF sau BF-F); o form cu migrare lent (slow form BF sau BF-S); o form rar cu migrare rapid (BF-F1); o form rar cu migrare lent (BF-S1). Exist 2 alele pentru codificarea factorului C2 (S.C) (C2C i C2A) - prezente n mod constant i o alel C2QO prezent foarte rar. Exist 7 alele codificante pentru locusul C4A i 3 alele codificante pentru locusul C4B (10 alele codificante pentru factorul C4 al sist. C). Antigenele HLA codificate de ctre CMH clasa I i II au structuri imunoglobulin - like (sunt glicoproteine membranare integrate) i au un rol extrem de important n procesele de recunoatere imunologic Bazele genetice ale heterogenitii imunoglobulinelor Sistemul imunitar uman posed o capacitate virtual nelimitat de a produce anticorpi diferii. Diversitatea genetic a superfamiliei genice a imunoglobulinelor este asigurat prin recombinri variate ale segmentelor genice V (de variabilitate), D (de diversitate), J (de legtur), C (constante), procese genetice care asigur att variabilitatea imunoglobulinelor dar i a moleculelor imunoglobulin-like, cu rol n interaciunile celulare (molecule HLA clasa I, clasa a II-a, receptorul celulei T, receptorii CD2, CD4, CD8). 359

Alturi de procesele de recombinare ale segmentelor V, D, J, C, pentru asigurarea diversitii lanurilor L sau H exist i alte surse de diversitate genetic a imunoglobulinelor: Mutaiile somatice Acest tip de mutaii apar att n regiunile V, corespunztoare situsului de legare al antigenului, ct i n zonele adiacente, denumite regiuni cadru. AC de tip mutant apar n fazele tardive ale rspunsului imun. Flexibilitatea de legare Alt i Honjo au semnalat posibilitatea adugrii unor nucleotide inexistente n ADN-ul din celula embrionar la jonciunea DH-JH. Ele formeaz o regiune nou, N, introdus n structura ADN de ctre o polimeraz ADN, prezent n celulele B imature. Ea poate aduga la ntmplare nucleotide la extremitile 3 ale unei catene ADN, nainte de a lega situsurile de jonciune. Asocierea combinatorial Este procesul prin care o caten H dat, indiferent de clasa sau subclasa creia i aparine, este teoretic capabil s se asocieze cu oricare dintre catenele LK sau L produse de ctre celul. Posibilitatea comutrii clasei de imunoglobuline Analiza genetic a locusului CH a demonstrat faptul c genele respective sunt precedate de ctre secvene de comutare (switch), cu rol de situs activ n schimbarea clasei lanurilor H. Aceste recombinri sunt nsoite de deleia regiunii C i a altor regiuni din genom intercalate. Se presupune c intervin n acest mecanism, dou proteine cu rol n comutare, care recunosc i leag dou regiuni switch, ce preced gene diferite. Astfel se poate realiza comutarea chiar la gene ndeprtate, cum ar fi C C. Demonstrnd potenialul uria de amplificare a informaiei genetice prin reasortarea genelor, familia supergenic a imunoglobulinelor codific i majoritatea receptorilor sistemului imunitar.

ANTIGENELE HLA Structura antigenelor HLA clasa I

360

Antigenele de histocompatibilitate sunt glicoproteine membranare integrate. Sunt alctuite dintr-o caten grea (similar imunoglobulinelor), cu 3 domenii extracelulare (de cte 90 aminoacizi fiecare), un domeniu transmembranar i un domeniu transcitoplasmatic. Catena are un domeniu situat aminoterminal (2) n care exist situsurile recunoscute de ctre celulele sistemului imunitar. Restul moleculei aparine unor regiuni ct. Catena este asociat necovalent cu o caten uoar, 2 microglobulina. Aceasta are dou molecule asociate, Qa i Tla, care fac parte, de asemenea, din familia supergenic a imunoglobulinelor. Funciile moleculelor Qa i Tla sunt mai puin cunoscute i se pare c acioneaz n domeniul recunoaterii antigenului. Nu se cunoate de ce exist acest sistem doar pentru moleculele CMH clasa a I i pentru moleculele CMH clasa a II-a - nu. (v. Fig. nr. 40).

361

Fig. nr. 40 - Structura moleculelor HLA I i HLA II [1]

Moleculele HLA clasa a II-a sunt dimeri, respectiv catena este catena grea (GM: 35 k) i are domeniile A, E; catena este catena uoar (GM: 28 k) (structur Ig - like) i are domeniile A, E. Fiecare dintre aceste domenii posed cte 90 aminoacizi. Pe domeniile 1, 1, 2 se structureaz situsurile n care vor ptrunde antigenele pentru care exist specificitate. Polimorfismul extraordinar al antigenelor HLA - este asigurat prin reasortri genetice ale genelor de variabilitate (V), diversitate (D), de legtur joining (J), constante ( C) (v. Fig. nr. 24).

Structura antigenelor HLA clasa a II-a

Rolurile imunologice ale antigenelor HLA clasa I

Aceste molecule sunt prezente pe suprafaa tuturor celulelor nucleate din organism. Reprezint adevrate carnete de identitate biochimic i genetic pentru fiecare individ n parte. Pentru ca un anume antigen s fie recunoscut de ctre un limfocit T citotoxic CD8 - este necesar restricia HLA.

362

Aceste molecule fac diferenierea self - non-self i devin inta sistemului imunitar n 3 situaii: pentru respingerea de transplante de esuturi i organe incompatibile (non-self); cnd suprafaa celulelor e modificat prin antigene virale, tumorale sau substane chimice. cnd moleculele HLA sufer modificri prin mutaie, devin autointe care vor fi eliminate.

Rolurile imunologice ale antigenelor HLA clasa a II-a

Aceste molecule au o distribuie celular mai limitat, n special pe suprafaa celulelor imunocompetente (limfocit B, limfocit T, macrofag, etc.). Uneori, celulele care n mod normal nu exprim pe suprafaa lor molecule HLA clasa a II-a (spre exemplu - celulele endoteliale sau tiroidiene), le pot exprima n condiii necunoscute. Exprimarea anormal a acestor antigene a constituit un element important pentru explicarea asocierilor sistemului HLA cu diferite boli (v. Tabelul nr. 10). Moleculele HLA clasa a II-a au un rol esenial n declanarea reaciilor imunitare, prin interaciuni i cooperri celulare, funcionnd ca un dicionar de recunoatere ale structurilor strine organismului. Interaciunile eficiente ntre limfocitele TH (CD4) i macrofagele care prezint antigenele, ca i cooperarea celular dintre limfocitul T i B, au loc numai dac celulele respective posed antigene Ia, care funcioneaz ca i elemente de restricie CMH. Dup Buss este probabil c genele care codific antigenele Ia sunt gene Ir, dar nu toate genele Ir codific antigene Ia. Antigenele Ia (immunity associated) au un rol important n generarea unei decizii a organismului (dac declaneaz sau nu un rspuns imun). Limfocitele T posed receptori cu specificitate dubl (TCR=T cell receptor), att pentru antigene, ct i pentru o molecul CMH de pe suprafaa celulelor cu care interacioneaz. Pentru a activa limfocitele T, macrofagul prezint pe suprafaa sa att antigenul, ct i o molecul HLA clasa a II-a (o molecul Ia). Celula T activat trimite semnale stimulatoare (helper) unei celule B. Limfocitele T supuse restriciei CMH sunt denumite limfocite T-CMH. Exist ns i limfocite TH-Ig, care funcioneaz i fr restricie CMH.

363

Tabelul nr. 27 - Specificitile HLA cunoscute n prezent

n concluzie antigenele HLA clasa I intervin n prezentarea antigenelor endogene ctre limfocitele T citotoxice, n timp ce antigenele HLA clasa a II-a se asociaz cu antigene exogene prelucrate, pe care le prezint limfocitului TCD4. Recunoaterea asociat a antigenului i a produilor CMH, funcioneaz ca un sistem de siguran cu dou chei, care, pe de o parte limiteaz potenialul distructiv al limfocitelor i pe de alt parte asigur eficiena rspunsului imun. Astfel, se demonstreaz faptul c sistemul imunitar a evoluat n aa fel nct ambele tipuri de molecule HLA, codificate de ctre genele CMH, servesc ca i indicatoare rutiere pentru celulele T, ghidndu-le spre antigen.

364

RELAIA: ANTIGENE HLA - PREDISPOZIIE LA BOAL Ipoteze ale acestei asocieri

Au fost propuse 5 ipoteze pentru a explica asocierile sistemului HLA cu diferite boli. Acestea sunt urmtoarele: Moleculele HLA reprezint receptori pentru agenii etiologici Anumite molecule HLA pot constitui receptori pentru virusuri, toxine, alte substane strine. Spre exemplu, antigenul HLA B27 este un receptor posibil pentru un virus insuficient definit, care ar cauza spondilita anchilozant. Ca suport a acestei ipoteze este observaia conform creia i alte molecule de pe suprafaa celulelor imunologice pot constitui receptori pentru virusuri (de exemplu, structura CD4 a limfocitului T constituie un receptor pentru virusul imunodeficienei umane.) Moleculele HLA sunt selective pentru anumite peptide. Este posibil ca o anumit secven de aminoacizi din structura moleculei HLA - s poat lega (n mod anormal), un fragment antigenic peptidic, rezultnd un complex imun nerecunoscut ca self, complex care va fi atacat de ctre un limfocit CD8 (citotoxic). Prin aciunea limfocitului, se declaneaz boala. Receptorul pentru antigen al celulei T (TCR) confer predispoziia la boal Recunoaterea antigenului de ctre celula T este sub restricia moleculei HLA, codificat de CMH. Spre exemplu, presupunnd c indivizii cu HLA B27 prezent (cu risc pentru spondilita anchilozant) pot s formeze un complex imun ntre molecula B27 i virusul cauzal, complex recunoscut n mod corespunztor de ctre un TCR, atunci toi indivizii cu acelai tip de TCR - vor face boala manifest. Agenii etiologici care mimeaz structura antigenelor HLA

365

Din cauza similaritii structurale a antigenului cu molecula HLA, rspunsul imun va fi deturnat mpotriva antigenului HLA respectiv, acesta fiind rspunsul autoimun. Aceast teorie a ctigat cea mai mare credibilitate din cauza unei observaii experimentale: antigenul HLA B27 este asociat cu sindromul Reiter n aceeai msur ca i cu spondilita anchilozant. Sindromul Reiter la indivizi cu antigenul HLA B27 pozitiv, se declaneaz adeseori dup mbolnviri de dizenterie provocate de Shigella flexneri. S-a constatat faptul c tulpinile bacteriene amintite posed o plasmid, care codific o protein cu 5 aminoacizi din lanul proteic, identici cu 5 aminoacizi din structura antigenului HLA B27. Deoarece anumii indivizi au aceast similaritate de structur HLA cu agentul etiologic, ei sunt predispui la boal, n lumina teoriei expuse. Exprimarea moleculelor HLA clasa a II-a pe suprafaa celulelor este aberant Aceast ipotez se refer doar la bolile asociate cu sistemul HLA clasa a II-a. Moleculele de pe suprafeele celulare sufer un proces de uzur continu. Degradarea moleculelor HLA clasa a II-a de pe suprafaa celulelor poate fi similar unui proces de prelucrare a antigenului. Un fragment peptidic al unei astfel de molecule prelucrate poate s fie asociat n situsul de legare al unei molecule HLA clasa a II-a, pentru a forma un complex imun i pentru a declana un rspuns imunologic mpotriva acestei molecule specifice.

Modele de calcul statistic privind asocierile sistemului HLA cu anumite stri patologice
Cercettori americani au cuantificat asocierea anumitor stri patologice cu un anumit antigen HLA predispozant, prin calcularea riscului relativ (RR) pentru o anumit afeciune :

RR =

p c p c

p+ = numrul pacienilor care au un anumit antigen HLA particular; p- = pacienii care nu au acel antigen HLA; c+ = numrul indivizilor din lotul de control care posed antigenul HLA c- = indivizii din lotul de control care nu au acel antigen HLA particular. Se observ faptul c riscul relativ este cu att mai mare, cu ct antigenul HLA predispozant pentru o anumit boal este mai ntlnit la pacieni. 366

Riscul absolut (RA) reprezint ansa ca un individ care posed antigenul HLA predispozant s i contacteze afeciunea respectiv. RA se calculeaz dup formula:

P = prevalena bolii n populaia general; p+, c+ = au semnificaia de mai sus. Deoarece exist diferene semnificative n frecvena unui antigen HLA ntre diferitele grupuri rasiale, este necesar s comparm grupul populaional studiat cu indivizi din lotul de control din aceeai ras.

p+ RA = + P c

Strile patologice cunoscute pentru care prezena unor anumite haplotipuri HLA constituie un risc relativ
Din cele prezentate, se deduce faptul c toate variaiile individuale ale rspunsului imun sunt corelate cu antigenele codificate de ctre complexul major de histocompatibilitate. Pornind de la identitatea genetic a frailor gemeni monozigoi i diversitatea genetic a celorlali frai (dizigoi i frai obinuii), se pot aduce noi informaii privind controlul genetic al rspunsului imun i al evoluiei unei infecii. Sunt puine date din literatur privind rezultatele experimentelor efectuate pe gemeni; studiile respective au constituit un model de cercetare. n ncheiere, se vor prezenta strile patologice cunoscute (v. Tabelul nr. 10). pentru care prezena unor anumite haplotipuri HLA constituie un risc relativ:

367

Tabelul nr. 28 - Strile patologice asociate sistemului HLA (Abba Terr)

BOALA Boala Hodgkin Hemocromatoza idiopatic Boala Behcet Hiperplazia suprarenal congenital Spondilita anchilozant Rectocolita ulcerohemoragic Sindromul Reiter Uveita anterioar acut Tiroidita subacut Psoriazis vulgar Dermatita herpetiform Enteropatia glutenic Sindromul Sicca Boala Addison idiopatic Boala Graves Diabetul insulino-dependent

HLA A1 A3 B14 B5 B47 B27 B27 B27 B27 B35 CW6 DR3 DR3 DR3 DR3 DR3 DQW7 DR2 DR3 DR4 DR3 DR3 DR2 DR2 DR2 DR1 DR4 DRW8 DR4 DR4 DR5 DR5

RISC RELATIV: 1,4 8,2 4,7 6,3 15,4 87,4 14 37 10,4 13,7 13,3 15,4 10,8 9,7 6,3 3,7 9 3,3 6,4 2 2,5 5,8 4,1 2,4 15,9 9,6 4,2 3,6 14,4 4 3,2 5,4

Miastenia gravis Lupus eritematos sistemic Scleroza multipl Nevrita optic Sindromul Goodpasture Artrita reumatoid

Pemfigus Nefropatia cu IgA Tiroidita Hashimoto Anemia pernicioas 368

CAPITOLUL 45 ROLUL LIMFOCITELOR N RSPUNSUL IMUN

Participarea limfocitelor n rspunsul imun este iniiat prin interaciunea cu un antigen specific. Celulele imunologice prezint receptori, structuri specifice care recepioneaz semnale din mediul ambiant, semnale pe care ulterior le traduc n limbaj biochimic spre constituenii celulari. Receptorii sunt proteine sau glicoproteine membranare integrate n membrana celular i conin zone distincte pentru: recunoatere transducia semnalului iniierea rspunsului imun. Prezena receptorilor de pe suprafaa celulelor imunologice poate fi identificat cu ajutorul: serurilor antireceptor prin tratare cu anticorpi marcai fluorescent izotopilor radioactivi.

ROLUL LIMFOCITELOR B N RSPUNSUL IMUN

Receptorii pot fi distribuii uniform pe ntreaga suprafa a celulei (difuz) sau pot fi distribuii discontinuu, la un pol al celulei (ex.: fenomenul de beretare). Exist o mare mobilitate a Ig - receptor, fapt care explic beretarea la nivelul suprafeei limfocitului B, dup contactul cu antigenul. Evenimentele descrise mai sus se refer la o aglomerare a complexelor AG receptor imunoglobulinic al limfocitului B, (iniial pete fluorescente) pn la formarea unui conglomerat AG receptori imunoglobulinici, dispui la un pol al celulei (bereta). Complexele AG-AC formate vor fi endocitate, transducia semnalelor declannd modificri biochimice complexe, care se concretizeaz n: mrirea permeabilitii membranei celulare activarea ATP azei creterea nivelului celular de cAMP i cGMP. 369

 sintez crescut de acizi nucleici i fosfolipide.

370

Fig. 41 - Reprezentarea schematic a fenomenului de beretare (Gotze i Brger, 1986)

n urma acestor evenimente biochimice se produce transformarea blastic a limfocitului B angajat i limfoblastul rezultat se difereniaz apoi n plasmocit, care prezint o sintez accelerat de glicoproteine (imunoglobuline). Plasmocitul este principala celul productoare de imunoglobuline (2000 molecule/secund), respectndu-se succesiunea urmtoarelor evenimente: Sinteza lanurilor polipeptidice (separat pentru lanurile H - sinteza unui lan H durnd 60 secunde i separat lanurile L cu o durat de sintez de 30 de secunde) 371

 Asamblarea moleculei de imunoglobulin ine cont de clas i subclas, n modaliti variate: H + H H2 ; H2 + L H2L ; H2L + L H2L2 H + H H2 ; L + L L2 ; H2 + L2 H2L2 H + L HL ; H + L HL ; HL + HL H2L2 Apoi moleculele de imunoglobulin H2L2 ajung n max. 20 minute prin cisternele ergastoplasmice n aparatul Golgi, de unde sunt transportate prin vezicule de membran i secretate. Ataarea componentei glucidice se realizeaz n timpul transportului intracelular Etapa final se refer la secreia imunoglobulinelor, expuse iniial pe suprafaa plasmocitului i apoi clivate enzimatic i eliminate n circulaie. Imunoglobulinele polimerice sunt secretate de ctre celul n forma final (spre ex.: IgM- pentamer), chiar dac n plasmocit Ig se gsesc numai sub form de monomeri. Imunoglobulina A secretoare este secretat de plasmocit sub forma unui dimer cu o pies J, care la trecerea prin celula epitelial a mucoasei primete componentul secretor sintetizat de ctre celula respectiv. La un moment dat, un plasmocit (sau oricare celul din seria lfB limfoblast proplasmocit) produce un set de imunoglobuline care aparin aceleai clase, subclase, tip, allotip, idiotip, cu aceeai specificitate i aviditate pentru antigen. Prin mecanisme genetice se poate realiza comutarea de izotip a Ig - lor. Angajarea limfocitului B este nsoit i de un rspuns proliferativ puternic, nu numai de o diversificare n morfologia i funciile celulei (nainte de imunizare predomin limfocitele B mici, dup imunizare predomin limfoblastele i plasmocitele). n cursul diviziunilor blastice ale limfocitului B activat, unele limfoblaste (prin diviziune asimetric) revin la aspectul de limfocit B mic, cu memorie imunologic i cu o durat prelungit de via. Pentru antigenele timodependente, rspunsul imun generat de limfocitul B are nevoie i de cooperarea limfocitelor TH. Pentru antigenele timoindependente (flagelina polimerizat, polizaharide bacteriene) angajarea limfocitului B se face fr intervenia limfocitului T.

372

PARTICIPAREA LIMFOCITULUI T N RSPUNSUL IMUN

Limfocitele T sufer fenomenul de transformare blastic (prin fenomene biochimice precum cele discutate anterior la limfocitul B), fr etap de beretare, deoarece limfocitele T nu posed receptori imunoglobulinici pentru antigen. Angajarea limfocitelor T n rspunsul imun se realizeaz sub aciunea unui antigen specific, (avnd ca rezultat o expansiune clonal) sau sub aciunea unor mitogeni nespecifici (precum fitohemaglutinina i concavalina A), ce determin o activare policlonal. Dup Reinhery i colaboratorii (1986), activarea i proliferarea limfocitelor T este determinat n principal de ctre interleukina 2 (IL 2). Celulele T n repaus posed puini receptori pentru IL 2, dar dup activare numrul acestor receptori crete semnificativ. Creterea progresiv a numrului de receptori pentru IL 2 este urmat de o faz de sintez i secreie accentuat de IL 2, care se leag pe receptorii celulelor care au produs-o. Legarea unei cantiti suficiente de IL2 amorseaz diviziunea celular i creterea sintezei acizilor nucleici. n absena stimulilor caracteristici pentru limfocitul T, reapar n numr mare receptorii pentru antigen (TCR) i reducerea numeric a receptorilor pentru IL2. Exprimarea tranzitorie a receptorilor pentru IL2 funcioneaz ca un sistem de siguran, care elimin riscul proliferrilor necontrolate prin IL2. Aa se explic de ce proliferarea celulelor T poate fi stimulat prin IL2 provenit din surse exogene. IL2 induce sinteza altor citokine i stimuleaz i activitatea limfocitelor T citotoxice.
Tabelul nr. 29 Principalii mitogeni limfocitari utilizai n Imunologie (dup Zarnea) Denumirea Sursa Greutatea molecular Fitohemaglutinina (PHA) Phaseolus vulgaris 140.000 Concavalina (ConA) Canavalia ensiformis 51.000 Lectina de soia Glycine max 120.000 Lectina din germeni de gru Triticum vulgare 36.000 Lectina din ricin (RCA) Ricinus comunis 120.000

373

Dup cum rezult din tabelul precedent, mitogenii nespecifici sunt polizaharide extrase din plante, care produc expansiunea clonal doar a limfocitelor T. Rolul limfocitelor T n imunitatea celular este major n: Aprarea fa de infecii bacteriene, n special mpotriva acelor ageni etiologici care prezint parazitism celular: Mycobacterium, Brucella, Ricketsia, Treponema, Aprarea antiviral (limfocitele T citotoxice distrug celulele infectate cu virusuri) Aprarea antiparazitar (ex.: Toxoplasma, Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania) Aprarea antimicotic (ex.: Candida, Cryptococcus, Histoplasma, Supravegherea imun fa de celule strine, mutante, mbtrnite sau modificate tumoral Respingerea transplantelor i grefelor incompatibile Hipersensibilitatea de tip tardiv (HTT) aspect imunopatologic (reacie de hipersensibilitate de tip IV, produs mai probabil prin intervenia limfocitelor T specializate TDH (T delayed hipersensitivity) i a macrofagului activat. HTT reprezint un aspect al IMC. Memoria imunologic prin angajarea sa n rspunsul imun, limfocitul T transformat blastic revine la aspectul de limfocit T mic, devenind principala celul recirculant cu memorie imunologic (iniiaz rspunsul imun secundar) Reglarea imunologic limfocitul T helper reprezint dirijorul orchestrei celulelor imunologice implicate n rspunsul imun. Pe de alt parte, limfocitele T secret o diversitate de citokine cu rol n amorsarea reaciilor imune (activarea macrofagelor, limfocitelor, etc.) i n procesele inflamatorii.

374

CAPITOLUL 46 TIPURI DE IMUNITATE

CLASIFICARE DUP CELULA EFECTOARE
Imunitate umoral (IU) efectorii: limfocitul B i plasmocitul Imunitatea mediat celular (IMC)- limfocitul T cu subpopulaiile sale i macrofagul activat

CLASIFICARE DUP MODALITATEA DE CTIGARE A IMUNITII

Imunitate activ - amorsarea mecanismelor imunologice, cu apariia limfocitelor cu memorie imunologic - sunt implicate ambele forme de imunitate (IU+IMC) - este de lung durat - singurul dezavantaj faptul c imunitatea activ are nevoie de un interval de laten pentru a se instala. - Natural se obine dup trecerea printr-o infecie sau la un contact cu un antigen - Artificial se obine n urma vaccinrilor Imunitate pasiv - se realizeaz numai pentru imunitatea umoral - este util n terapia bolilor infecioase, deoarece rspunsul imun este foarte prompt, cu dezavantajul c protecia imunologic este de scurt durat - Natural: - se refer la trecerea IgG transplacentar de la mam la ft sau trecerea IgA secretorii (prin laptele matern) - Artificial: - se refer la administrarea serurilor imune (seroterapie) - transferul IMC este imposibil de realizat practic; n mod teoretic, IMC s-ar putea transfera printr-o limfokin (factor de transfer) i limfocite T obinute de la un subiect imun, care n final ar determina imunitate activ.

375

CLASIFICAREA DUP EFECTUL BIOLOGIC AL IMUNITII

Efect biologic favorabil - supraveghere imunologic i corect aprare antiinfecioas i antitumoral Efect biologic nefavorabil - manifestri imunologice aprute prin alterri calitative sau cantitative ale rspunsului imun (constituie obiectul de studiu al Imunopatologiei)

376

CAPITOLUL 47 DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC

REACII ANTIGEN - ANTICORP
Asocierea unui anticorp cu antigenul su specific depinde de interaciunea necovalent dintre epitop i paratop; definirea reaciilor AG AC se bazeaz pe consecinele formrii complexului imun elementar.

Bazele moleculare ale interaciunii AG - AC:

Reaciile AG - AC se bazeaz pe complementaritatea structural dintre epitop (aparinnd AG) i paratop (aparinnd AC). Complexul imun elementar este complexul AG - AC la nivel molecular, descris precum modelul ,,cheie - broasc sau modelul ,,minilor care se strng. Complementaritatea stereospaial epitop - paratop genereaz noi fore fizice de atracie, precum forele electrostatice, legturi de hidrogen, fore van der Waals. Din cauza legturilor fizice dintre reactani, reaciile AG - AC sunt ntotdeauna reversibile; AC nu altereaz AG. Reversibilitatea (disocierea complexelor AG - AC) poate fi considerat o reacie unimolecular n care viteza de reacie este dependent de concentraia complexului imun. Dup studii n care reactanii au fost marcai radioactiv, timpul de njumtire al reaciilor antigen - anticorp a fost estimat ca durat minim de trei ore, pn la T1/2 maxim de 8 zile. Interaciunile AG - AC depind de concentraiile reactanilor, complexele imune formndu-se cu probabilitate maxim la concentraii echimoleculare ale AG i AC. n reaciile imunologice, specificitatea, afinitatea i aviditatea anticorpilor au un rol extrem de important. Specificitatea - reprezint capacitatea unui anticorp de a deosebi antigenul fa de care a fost produs, fa de alte antigene cu structur asemntoare. Serurile imune incomplet purificate pot determina reacii imunologice ncruciate. Afinitatea msoar fora de legare dintre un epitop i un paratop, respectiv suma forelor de atracie i de repulsie dintre cele dou componente ale sistemului imun elementar. 377

Constanta de afinitate (Ka) sau de ,,echilibru se poate calcula dup formula: Ka = Kas / Kdis = [AG - AC] / [AG] x [AC] , unde: Ka = constanta ratei de asociere Kdis = constanta ratei de disociere [AG] = concentraia epitopilor [AG - AC] = concentraia complexului imun [AC] = concentraia situsurilor de legare liber a AC [,,X] = concentraia molar Constanta K va fi mare pentru complexele imune cu afinitate crescut. Aviditatea caracterizeaz energia medie a interaciunii de legare a unui antigen cu epitopi multipli i diferii, cu anticorpii specifici indui de ctre acetia. Spre deosebire de afinitate, care furnizeaz date despre natura fizico-chimic a interaciunilor AG-AC, aviditatea este semnificativ pentru antigenele naturale, care sunt multivalente n realitate. Avantajul multivalenei este faptul c aceasta crete energia de legare de 103 ori n cazul IgG (bivalente) i de 107 ori n cazul IgM (multivalente). Afinitatea i aviditatea crescut a anticorpilor specifici determin reacii imunologice favorabile organismului: protecie antibacterian, antiviral, antimicotic, antiparazitar, antitumoral, neutralizarea efectului citopat viral etc. Complexele imune cu afinitate sczut persist n circulaie sau se depun n unele esuturi (spre exemplu, glomerulul renal) i determin variate consecine imunopatologice. La temperatura corpului, crete viteza de asociere a AG cu AC specifici, de aceea majoritatea reaciilor imunologice cu scop diagnostic (aglutinare, precipitare, etc.) se incubeaz la 37 oC. Pentru evidenierea crioaglutininelor, incubarea reaciei se face la temperaturi sczute (4 oC). Tipul de reacie imunologic observat depinde de starea fizic a antigenelor, precum i de condiiile experimentale (ex.: temperatura optim sau pH-ul optim al reaciei, cuprins ntre 6,5 i 8,5). Spre exemplu, antigenele particulate genereaz reacii de aglutinare, antigenele solubile produc reacii de precipitare. Sensibilitatea reaciilor AG - AC cu rol diagnostic poate fi cuantificat prin numrul efectiv de particule necesare pentru a produce o reacie vizibil; spre exemplu, 107 celule bacteriene produc o reacie de aglutinare evident, spre deosebire de 6 x 10 12 molecule de antigen solubil care produc o reacie de precipitare detectabil. 378

 Teoria ipotezei unitare a anticorpilor postuleaz faptul c fiecare molecul de anticorp poate desfura mai multe tipuri de reacii imunologice, corespunztor specificitii respective (,,anticorpi multipoteni). Reaciile AG - AC cu scop diagnostic sunt foarte variate; toate reaciile serologice i propun evidenierea anticorpilor specifici i titrarea lor. Creterea progresiv a titrului anticorpilor semnific infecii n evoluie. Principalele reacii imunologice cu rol diagnostic pot fi clasificate: Reacii de agregare Reacii de aglutinare- pe lam - n tuburi - pe suport (ex.: latex aglutinare, hemaglutinare pasiv) Reacii de precipitare - precipitarea inelar - reacia de floculare - precipitare n gel - difuzie simpl - Metoda Oudin - Imunodifuzia radial Mancini - difuzie dubl - Metoda Outcherlony - Imunelectroforeza - Contraimunelectroforeza Reacii AG - AC cu participarea complementului Bacterioliza, Virionoliza virusurilor nvelite (Imunocitoliza) Imunhemoliza Imunocitoaderena (ex: rozete EAC) i opsonizarea Imunoaderena, imunocitotoxicitatea Reacia cu fixarea sistemului complement (RFC, cu variantele tehnice: Ida Bengston, Kolmer, Bradstrecet Taylor etc.) Reacii cu anticorpi monoclonali (AMC) specifici Reacii AG - AC cu complexe imune vizualizate prin artificii tehnice Imunofluorescena (IF) - metoda direct i indirect Radioimunotestarea (RIA) - metoda direct i indirect Teste imunoenzimatice (ELISA) - metoda direct i indirect Reacii de seroneutralizare (RSN) - pentru diagnosticul infeciilor virale 379

Principiul reaciilor, tehnica de lucru i interpretarea acestora sunt descrise la lucrrile practice. Alegerea uneia sau alteia dintre reacii, pentru diagnosticul unei boli infecioase - se bazeaz pe mai multe criterii: natura agentului etiologic, sensibilitatea reaciei, clasa imunoglobulinelor de identificat (ex.: titruri nalte de IgM semnific infecie acut) i nu n ultimul rnd, la noi n ar, n funcie de posibilitile materiale ale laboratorului respectiv.

TESTE CARE EVIDENIAZ IMUNITATEA MEDIAT CELULAR

Imunitatea mediat celular are ca efector specific limfocitul T, iar ca celul asociat, macrofagul. Prin testele de imunitate celular se poate aprecia funcionarea normal a IMC; diminuarea rspunsului imun celular se poate observa n afeciuni congenitale, infecii virale, bacteriene, fungice, parazitare, cancere, hepatite cronice, etc. Testele IMC pun n eviden i existena unui rspuns imun celular specific fa de un anumit antigen (ex.: i.d.r. la tuberculin, brucelin etc.) Testele IMC pot fi efectuate in vivo i in vitro. Clasificarea reaciilor este urmtoarea: Teste in vivo Intradermoreacia, care evideniaz starea de hipersensibilitate de tip tardiv (prototip - i.d.r. la tuberculin). Reacia investigheaz IMC global i prezena macrofagului activat prin limfokinele limfocitului TH. Teste in vitro Testele sunt foarte complexe, nefiind introduse n activitatea de rutin. Mai frecvent utilizate sunt: Numrarea limfocitelor T Evaluarea raportului dintre limfocitele TCD4 i TCD8. (Raportul lfTCD 4 / lfTCD8 >1 semnific valori normale, valoarea subunitar fiind expresia imunosupresiei). Capacitatea de proliferare (ca rspuns imun) la un stimul mitogen. Se evideniaz prin: Transformarea blastic a limfocitelor Cultura limfocitar mixt (MLC). Capacitatea productiv de citokine se investigheaz prin: 380

 Evidenierea MIF i LIF (factori de inhibare ai migrrii macrofagelor i respectiv ai leucocitelor polimorfonucleare) Evidenierea factorilor mitogeni limfocitari (FML) i ai limfotoxinelor Evidenierea interferonului sau a factorilor chemiotactici. Manifestarea citotoxicitii (lfTCD8) fa de celula int: Teste de limfocitotoxicitate - evideniaz mecanismele distrugerii celulei int, care are izotopi radioactivi ncorporai. Eliberarea n supernatant a izotopului se detecteaz cu ajutorul unor contoare speciale. Testele au aplicabilitate n determinarea i tipizarea antigenelor HLA, n imunitatea antitumoral i antiviral. Flow-citometria Reprezint o metod modern de diagnostic, care realizeaz identificarea i sortarea celulelor aflate ntr-un flux lichid, pe baza unui parametru fizic sau chimic care le caracterizeaz. Flow-citometrele utilizeaz diverse tipuri de lasere, numrtoare electronice de celule i programe computerizate de sortare celular (500 - 7000 celule/secund, cu puritatea sortrii de 97%). Pentru detectarea antigenelor de suprafa celular se utilizeaz anticorpi monoclonali specifici, fluorocromi (IF), fluorocitokine. Fluorokinele sunt interleukine cuplate cu o substan fluorescent, pentru detectarea unor subpopulaii celulare cu rspuns imun diferit la variai mesageri chimici imunologici (IL 1, IL2, IL6, LiF etc). Se deschid noi perspective de cercetare i diagnostic n imunologie, prin avantajele oferite de flow-citometrie, metod care poate preciza: Coninutul celular n acizi nucleici Numrul reticulocitelor Proporia: limfocite, monocite, granulocite n sngele periferic (inclusiv transpunere grafic) Raportul dintre limfocitele TCD4 i TCD8 Histocompatibilitatea, n vederea realizrii unui transplant (prin determinarea unor antigene HLA) Rezistena celulelor tumorale la terapia citostatic Nivelul proliferrilor celulare (prin detectarea markerului CD69 prin testul Fastimmune) Nivelul citotoxicitii anumitor celule Eficiena fagocitozei (Phago-test) Producia radicalilor liberi n fagocitoz Starea metabolismului oricrei celule (influx de Ca2+, K+, pH intern) Noiuni de citogenetic 381

 Prezena unor autoanticorpi fixai pe suprafaa sau n interiorul unor celule (anticorpi antimuchi neted, AC antinucleari) Existena unor molecule de suprafa celular pentru care nc nu exist anticorpi monoclonali specifici, prin utilizarea fluorokinelor Diverse antigene de suprafa celular (CD 4, CD8, CD19, CD20, CD69 etc., antigene HLA, receptori diveri), realizndu-se ,,imunofenotipizarea celular, cu ajutorul anticorpilor monoclonali specifici marcai fluorescent. Imunofenotipizarea celular este cea mai utilizat metod flow-citometric. Firma Becton - Dickinson a lansat o gam larg de kit-uri de diagnostic: Kitul Simul Set IMK Plus, Kitul LeuKaemia Immunophenotyping - depisteaz hemopatii maligne ,,border-line. Kitul Tri-Test permite determinarea numrului absolut de celule CD 4, CD8, CD19; kitul Fastimmune evideniaz proliferarea celular (CD69). Aparatele cele mai moderne produse de ctre firma respectiv sunt: FACS Vantage i FACS Calibur care pot realiza o gam larg de operaiuni. Cele mai recente flow-citometre sunt uor manevrabile (,,user friendly), precum FACScan sau EPICS, dar n aceste situaii aplicaiile diagnostice sunt foarte specifice.
Fig. nr. 42 - Imagini flow-citometrice ale unor subpopulaii celulare din sngele periferic, cu AC monoclonali ai trusei Simul Set (Virgil Punescu i colab)

382

383

CAPITOLUL 48 MEDIATORI BIOCHIMICI AI RSPUNSULUI IMUN

Citokinele reprezint semnalele absolut necesare (transmise de ctre celulele imunologice), pentru a regla interaciunile cooperante cu rol n declanarea unui rspuns imun eficient. Interleukinele sau citokinele au fost denumite iniial limfokine (substane secretate de ctre limfocite) sau monokine (substane secretate de ctre monocite, macrofage). Interleukinele (IL) sunt substane de natur proteic ce transmit celulelor imuno-competente semnalele necesare pentru activarea, proliferarea i diferenierea lor. Interleukinele sunt considerate a fi imunohormoni care amplific mecanismele aprrii imunologice. Identificarea interleukineleor este foarte dificil, din cauza prezenei lor n organism n doze extrem de sczute (10-10 - 10-12 M). Semnalul reprezentat de ctre interleukin este prelucrat numai de ctre celule care exprim receptori specifici pentru legarea lor; aceste celule imunologice trebuie s fie activate n prealabil. Pentru purificarea i izolarea interleukinelor s-au utilizat tehnici ADN recombinant. Caracterele generale ale interleukinelor sunt urmtoarele: greutate molecular foarte mic (sub 80 k ) moleculele IL sunt glicozilate acioneaz autocrin sau paracrin interacioneaz cu receptori celulari specifici majoritatea IL regleaz proliferarea i diferenierea limfocitelor B nu sunt numeroase (13 specii moleculare diferite, dintre care bine cunoscute sunt 8) intervin n cooperrile celulare din rspunsul imun i n procese de tip inflamator concentraiile lor sunt minuscule (10-12 M)

Principala clasificare a activitilor atribuite interleukinelor IL cu rol reglator a activitii celulare imunologice; ex.: IL2, IL3 interferonii i factorul inhibitor al migrrii macrofagelor (MIF) factorul inhibitor al migrrii leucocitelor (LIF) 384

 factorul chemiotactic (CF) factorul activator al macrofagelor (MAF) Reglarea activitii altor esuturi: factorul stimulator al coloniilor de granulocite-macrofage (CSF-GM) factorul activator al osteoclastelor (OAF) Distrugerea celulelor int: limfotoxinele (perforin i granzim, elaborate de ctre limfocitele T citoxice)

PRINCIPALELE CITOKINE Interleukina 1 (IL1)

produs de ctre monocite i macrofage (monokin) prima sa denumire a fost factorul de activare al limfocitelor (LAF) n 1972 urmtoarea denumire (1974) a fost factorul de activare al limfocitelor B (BAF); a fost evideniat datorit capacitii sale de a stimula producia de anticorpi n absena limfocitelor T substana conine 270 aminoacizi, greutatea ei molecular este de 31000 prezint dou forme moleculare ( i ) producia sa poate fi stimulat prin aciunea limfocitelor T helper activate sau a mitogenilor nespecifici. Dup Dinarello (1984), IL 1 se elibereaz n cantiti mari din macrofage activate (ca urmare a infeciei) i o parte a IL1 ar exista ca parte integrant a membranei macrofagului (probabil aceast etap reprezint etapa eliberrii iniiale din celul) rolurile sale imunologice sunt extrem de diverse IL1 determin proliferarea i diferenierea limfocitelor B, stimulnd anticorpogeneza fie direct, fie prin intermediul limfocitelor T helper induce apariia receptorilor pentru IL2 i crete sinteza de IL2 i de factori stimulatori ai coloniilor (poteneaz hematopoeza) prin creterea sintezei de IL2 acioneaz indirect asupra funciilor limfocitelor T citotoxice i a celulelor ucigae naturale (NK) IL1 este principalul pirogen endogen (sindrom febril declanat). Hipertermia are efect antiinfecios. 385

 IL1 determin multiplicarea fibroblastelor i a celulelor endoteliale IL1 induce migrarea polimorfonuclearelor neutrofile din mduv, mobilizarea lor chemotactic, eliberarea lizozimului. IL1 regleaz rspunsul antiinflamator sistemic prin producerea proteinelor de faz acut IL1 stimuleaz producia de colagenaze i protoglandine (PGF2 crescut explic proteoliza i casexia din infeciile cronice) IL1 provoac somnul de und lent IL1 are rol protector mpotriva radiaiilor IL1 deprim activitatea plasminogenului IL1 scade presiunea venoas i pH-ul sanguin IL1 deprim sinteza lipoproteinelor i a acizilor grai liberi, deprim sinteza albuminei Nivelul IL1 crete n: Septicemii Glomerulonefrite Ciroz hepatic Sclerodermie sistemic Diabet insulino-dependent etc. Nivelul IL1 scade n: Cancere Malnutriie Progresiv cu vrsta Psoriazis i lupus eritematos sistemic

Interleukina 2 (IL2)
A fost denumit i : TCGF (T cell growth factor) - factorul de cretere al celulelor T TSF (Thymocyte stimulating factor) - factorul stimulator al timocitelor IL2 este produs de ctre limfocitele T activate i a putut fi obinut experimental din supernatantele unor culturi de limfocite stimulate cu mitogeni (fitohemaglutinin).

386

IL2 este de natur glicoproteic, cu GM aprox. 17000 , alctuit din 133 de aminoacizi. Precursorul IL2 are 153 de aminoacizi din care, n urma proteolizei unei secvene de 20 aminoacizi, rezult molecula matur. Timpul de njumtire a IL2 plasmatice este de aprox. 2-3. Activitatea de sintez a IL2 ncepe la 4 ore de la stimularea antigenic i atinge un maxim dup 3-5 zile. Producia IL2 este stimulat de IL1, INF, PHA. Exist similitudini structurale ntre IL2 i INF. Ambele molecule sunt formate din sase helixuri i nu conin catene; helixurile 2, 3, 4, 6 ale IL2 sunt organizate ntr-un buchet, aceast dispoziie fiind extrem de important pentru legarea receptorului. Capacitatea limfocitelor de a rspunde la IL2 este condiionat de prezena receptorilor pentru IL2, care se gsesc pe suprafaa celulelor B i T, monocitelor i pe suprafaa precursorilor mieloizi. Limfocitele n repaus posed un numr sczut de receptori pentru IL2 dar n urma stimulrii antigenice, dup aprox. 48 de ore, 50% dintre celulele respective vor poseda aceti receptori (aprox. 10000 receptori/celul). Cantitatea receptorilor pentru IL2 va regla intensitatea rspunsului imun, controlnd de fapt viteza de diviziune a limfocitelor. Roluri imunologice Interleukina 2 stimuleaz proliferarea i diferenierea limfocitelor T, a unor celule B normale sau leucemice i a celulelor NK. IL2 stimuleaz diferenierea limfocitelor T helper 1 (Th1) de tip inflamator i T helper 2 (Th2) de tip ajuttor stimulator, poteneaz aciunea limfocitelor T citotoxice i producia de anticorpi. La nivel intracelular, IL2 activeaz sinteza receptorilor pentru transferin i n cazul monocitelor stimuleaz producia de INF i TNF. Pornind de la acest aspect s-a ncercat terapia antitumoral cu IL2, dar rezultatele obinute au fost umbrite de efecte adverse precum insuficiena respiratorie, tulburri psihice sau gastrointestinale. Deficitul de IL2 se poate ntlni in AIDS, boala Hoodgkin, lupus eritematos sistemic; administrarea de IL2 exogen (cu riscurile sus-menionate) ar putea ameliora aceste afeciuni.

Interleukina 3
IL3 prezint o activitate multifuncional, cu rol stimulativ asupra liniilor celulare hematopoetice majore (hemopoetin panspecific-PSH). A mai fost denumit i : multicolony stimulating factor Histamine-producing cell stimulating factor 387

 PSH-hemopoetin panspecific IL3 este o glicoprotein cu greutate molecular de aprox. 30 k , cu 134 de aminoacizi, fiind produs de ctre limfocitele T activate. Reziduurile Pro i Leu din secvena moleculei au un rol critic n modularea funciilor biologice ale acestei limfocite. Aciunea IL3 asupra celulelor int este condiionat de legarea pe receptorul specific (aprox. 1000 de receptori/celul). Receptorul pentru IL3 are un domeniu extracelular cu 417 resturi de aminoacizi legai printrun domeniu transmembranar. Legarea IL3 de receptorul specific determin un efect local (n situsul n care s-a produs activarea) dup stimuli imunologici puternici (infestri parazitare sau rejet de gref). Cele mai multe experimente arat c IL3 nu acioneaz asupra limfocitelor T i nici n producerea normal (echilibrat) de celule hematopoetice. IL3 intervine direct asupra creterii precursorilor multipli hematopoetici ai granulocitelor, bazofilelor, enzinofilelor, macrofagelor sau mastocitelor. Excepie fac celulele din seria eritroid i megacariocitar asupra crora IL3 acioneaz n prezena eritropoetinei i trombopoetinei. Stimularea hematopoezei de ctre IL3 este amplificat sub aciunea IL1, IL6, GM-CSF, etc. IL3 poate potena rspunsul inflamator indus de ctre endotoxinele bacililor gram negativi. Dereglarea activitii IL3 n ceea ce privete hematopoeza este unul dintre principalele mecanisme generatoare de leucemii, cu proliferarea celular anarhic. Unii cercettori indic utilizarea IL3 sintetic n terapie, pentru proliferare celular specific dup grefele de mduv.

Interleukina 4
A fost denumit i: Factorul inductor al IgG1-Lindquist (1984) Factorul stimulator nr.1 al celulelor B (Norma, 1984) IL4 poate fi sintetizat de ctre limfocite T, celule de tip hibridom sau limfom. IL4 are o greutate molecular de 20 k ; este sensibil la degradarea proteolitic i este inactivat la pH 10. Activarea IL4 este complex: IL4 stimuleaz sinteza ADN (prin activarea limfoblatilor T normali)

388

 IL4 stimuleaz biosinteza anticorpilor din subclasa IgG 1 i supreseaz rspunsul n IgG3 i IgG2b. Acioneaz sinergic n asociere cu PHA (fitohemaglutinina), cu proprieti similare IL1. IL4 reprezint un factor de cretere pentru mastocite. IL4 regleaz producerea de citokine de ctre celulele T, B, NK, macrofage i fibroblaste. Prin acest rol imunomodulator acioneaz ca agent antitumoral i antiinflamator. IL4 inhib sinteza TNF; la rndul ei, IL4 este inhibat de ctre INF. Receptorii pentru IL4 (aprox. 100-1000 receptori pe o celul T sau B n repaus sau n activitate), au o structur de tip monomer imunoglobulinic, cu GM de 130 k.

Interleukina 5
A fost denumit iniial factorul nlocuitor al celulelor T. Denumirea de IL5 a fost propus de Kinashi, Azuma n 1986. IL5 este o glicoprotein cu GM cuprins ntre 32 i 60 k . Receptorul pentru IL5 (GM aprox 48 k) este exprimat n exclusivitate pe limfocitele B activate i pe eozinofile. IL5 acioneaz n principal ca factor de difereniere al eozinofilelor (efect antiparazitar). IL5 acioneaz sinergic cu IL1 pentru inducerea sintezei de IgM i cu IL4 pentru sinteza IgG1. IL5 poteneaz exprimarea receptorilor pentru IL2 la nivelul limfocitelor T, stimulnd cooperrile celulare necesare rspunsului imun. IL5 stimuleaz funcia citotoxic anticorpodependent.

Interleukina 6
Cu denumiri anterioare: Factorul 2 stimulator al celulelor B (BSF-2) Interferon 2 sau factorul stimulator al hepatocitelor Este o glicoprotein cu greutate molecular de 21 k , cu 184 de aa. Este produs de ctre monocite, macrofage, limfocite B i T activate, mastocite, fibroblaste, astrocite, celule endotoliale, epiteliale i neoplazice. 389

Acioneaz asupra unui numr mare de esuturi i celule, i anume n: inducerea diferenierii i activrii limfocitelor B inducerea proteinelor de faz acut n inflamaii proliferarea i diferenierea lf T, cu exprimarea receptorilor pentru IL2 activarea maturrii megacariocitelor promovarea fagocitozei proliferarea celulelor mielomatoase, a keratinocitelor Receptorul pentru IL6 se ntlnete pe suprafaa limfocitelor T n repaus, a limfocitelor B fr receptor imunoglobulinic IgG membranar, pe suprafaa celulelor mielomatoase. Receptorul pentru IL6 este de tip imunoglobulinic cu GM de 80 k. Nivelul seric al IL6 crete n boli autoimune, ciroz hepatic, glomerulonefrite, psoriazis sau neoplazii. Sinteza IL6 poate fi inhibat de IL4, IL10 i TGF .

Interleukina 7
Denumit iniial limfopoetina 1, din cauza aciunii ca factor de cretere a limfocitelor B i T. IL7 este o glicoprotein cu GM de 14.9 k cu 154 de aminoacizi. IL7 intervine n proliferarea limfocitelor B imature, pn cnd limfocitul B exprim pe suprafaa sa IgM monomer i intervine n proliferarea limfocitelor T imature (CD4-, CD8-, CD3+), pn cnd celula T devine imunocompetent i faciliteaz exprimarea receptorilor pentru IL2. IL7 activeaz sinteza IL1, IL8 i TNF.

Interleukina 8
Este secretat de ctre limfocitele T sau monocitele activate, de ctre fibroblaste sau celulele endoteliale. Este proteina activatoare a neutrofilelor. IL8 stimuleaz chemotactismul pentru PMN i poteneaz funciile fagocitare ale acestora. IL8 crete permeabilitatea vascular i protejeaz celulele endoteliale mpotriva efectului distructiv al PMN (IL8 poteneaz fenomenele inflamatorii, n general)

Interleukina 9
390

Glicoproteina cu GM 30-40 k ( cu 144 de aminoacizi) este sintetizat de ctre limfocitele T i monocite. IL9 este un factor ce stimuleaz creterea i proliferarea limfocitelor T, a mastocitelor, a megacariocitelor i a precursorilor eritrocitari.

Interleukina 10
Glicoproteina cu GM de 30-40 k, este sintetizat de ctre limfocitele Th2 (nu ns i de limfocitele Th1), sub influena stimulilor antigenici i mitogenici. IL10 stimuleaz timocitele IL10 induce exprimarea antigenelor CMH clasa a II-a pe suprafaa membranar a limfocitelor B. IL10 inhib producia de IL1, IL6, IL8 i TNF.

Interleukina 11
Molecula are o GM de 22 k i aproximativ 199 resturi de aminoacizi. Este sintetizat de ctre celulele stromale i are activiti variate, asemntoare cu cele ale IL6. IL11 determin sinteza proteinelor de faz acut n inflamaii IL11 stimuleaz producerea de imunoglobuline la nivelul plasmocitoamelor (aciune sinergic cu IL3) IL11 acioneaz asupra precursorilor hematopoetici

Interleukina 12
Cu denumiri anterioare : Factor de cretere al celulelor stem Factor de cretere al mastocitelor Factor de stimulare al celulelor NK IL12 este un dimer cu GM de 20 k i 248 de aminoacizi. Este produs de ctre fibroblaste, celule stromale, celule ale carcinoamelor hepatocelulare. IL12 induce sinteza INF de ctre celulele NK. IL12 reprezint un factor de cretere al mastocitelor, precursorilor hematopoetici i al celulelor ucigae naturale. 391

 Sinteza IL12 este stimulat de ctre INF i blocat de IL4 i IL10.

Interleukina 13
Citokina este produs la om prin limfocitele Th i limfocitele CD8+. Molecula conine 132 de aminoacizi. IL 13 acioneaz asupra limfocitelor B, macrofagelor, celulelor NK i asupra unor celule canceroase. Pentru limfocitele B rspunsul este proproliferativ, n timp ce limfocitele T nu sunt afectate. IL13 stimuleaz preferenial sinteza de IgE, cu intervenie n procesele alergice IL13 posed aciuni antiinflamatorii, inhibnd sinteza unor citokine proinflamatorii precum IL1, IL6, IL8, TNF. IL13 scade fagocitoza i citotoxicitatea dependent de anticorpi IL13 ar avea efect anti-HIV, inhibnd replicarea HIV n monocite, prin inhibarea reverstranscriptazei virale i scderea concentraiei antigenului p24 viral. IL13 prezint similitudini structurale cu IL4 i aciuni parial asemntoare.

Interleukina 14
Identificat n 1991, are o greutate molecular mare (468 de aminoacizi). Este produs de ctre limfocitele T i stimuleaz celulele B .

Interleukina 15
Descoperit n 1994, este produs de ctre placent i celule musculare striate. Greutatea molecular 15 k (cu aproximativ 162 de aminoacizi). Rolul su imunologic este nc necunoscut, dar ar putea suplini funcia IL2.

INTERFERONII
Sunt substane de natur glicoproteic, produse sub influena unor stimuli inductori variai, cu efect antiviral, antitumoral i imunomodulator. S-au descoperit urmtoarele categorii antigenice de interferoni umani, clasificate dup principala celul productoare : INF - LEUCOCITAR - 14 subtipuri diferite din punct de vedere biochimic - codificat de ctre 14 gene diferite (cromozomul 9) 392

- rezistent la pH acid (i la temperatura de 56C) INF - FIBROBLASTIC (produs de ctre fibroblaste) - dou subtipuri diferite din punct de vedere biochimic - codificat de ctre 2 gene diferite (cromozomul 9) - rezistent la pH acid (i la temperatura de 56C) INF - LIMFOCITAR, sau IMUN, produs de limfocitele T sensibilizate - un singur tip biochimic, codificat de o singur gen (cromozomul 12) - cu cel mai important efect n viroze i neoplazii - rezistent la pH acid (i la temperatura de 56C) INF - produs de ctre celule mononucleare umane stimulate cu fitohemaglutinin, asemntor cu INF (n studiu). Principalele proprieti ale interferonilor Au aciune antiviral, antitumoral, imunoreglatoare. Au specificitate de specie un tip de INF produs de ctre celulele unei specii, acioneaz numai asupra speciei respective. De aceea, tipul de interferon luat n studiu trebuie menionat, utiliznd un acronim pentru specia productoare : Hu-INF (human interferon interferon uman), Mu-INF (murin interferon - interferon al oarecelui), etc. Au greuti moleculare cuprinse ntre 17 k (INF) i 20 k (INF,INF) Nu au specificitate de virus (un interferon indus de ctre un anumit virus are aciune asupra oricrui alt virus, n cadrul speciei respective) Sunt glicoproteine cu inductori foarte variai ai sintezei, cum ar fi: ARN dublu catenar natural sau sintetic (poliriboinozinat poliribocitidilat ) reprezint cel mai bun inductor de interferon. n mod normal, n timpul replicrii virusurilor cu genom ARN apare ARN dublu catenar. Este activ n doze mici (g/ml). Extracte microbiene ale microorganismelor cu parazitism intracelular: Ricketsia, Bordetella, Brucella, Listeria, sau endotoxinele bacteriilor gram negative reprezint inductori slabi de INF, la doze de ordinul mg. Aciunea interferonilor este rapid i puternic .

393

 Sistemul INF este cel mai precoce sistem de aprare antiviral al gazdei: apare la cteva ore dup stimularea antigenic, efectul este maxim la 24-48 ore de la infectare i persist de la dou la ase sptmni. Aciunea este puternic, aproximativ 1-10 molecule de INF protejeaz antiviral o celul infectat, dup urmtoarea schem: INF fibroblastic acioneaz iniial la poarta de intrare a virusului, realiznd alterri ale receptorilor celulari. Dac totui, virusul depete poarta de intrare, se secret INF leucocitar. INF sensibilizeaz limfocitele T. Aceste celule activate produc INF imun, care poteneaz toate mecanismele de aprare ale gazdei, n special mecanismele citotoxice, prin celulele killer, celule natural-killer, limfocite Tc, macrofage. Aprarea imunologic antitumoral se explic prin potenarea efectelor citotoxice. Efectul principal antiviral al INF se manifest n etapele de decapsidare viral, replicare sau transcriere a genomului. Interferonii nu pot aciona asupra adsorbiei virale sau a viropexiei; efectul protector este maxim asupra celulelor adiacente i diminuat proporional fa de celulele ndeprtate. Mecanismele moleculare antivirale ale aciunii interferonilor au fost studiate n vitro. Toi interferonii induc sinteza enzimelor: oligonucleotid polimeraz, activ n prezena ARN dublu catenar i a ATP i proteinkinaza, cu rol inhibitor n sinteza proteinelor virionale. Alte activiti ale INF n imunitate : creterea numrului de macrofage i intensificarea fagocitozei, prin exprimarea receptorilor pentru Fc a IgG. intensificarea activitii microbicide i tumoricide prin existenta factorului MAF (factorul de stimulare al macrofagelor). creterea numrului de molecule CMH de clasa a II-a pe macrofag i pe celulele imunocompetente. INF amplific activitatea celulelor NK, concomitent cu inhibarea exprimrii genelor oncogene onc n aprarea antitumoral. INF amplific mecanismele inflamatorii. INF stimuleaz maturarea limfocitelor spre plasmocite. INF inhib sinteza prostaglandinelor produse de IL 1 i proliferarea keratinocitelor. Concluzionnd, interferonii posed efect antiviral, antitumoral, proliferativ asupra limfocitelor B i macrofagelor. 394

FACTORII NECROZANI TUMORALI

Sunt citokine cu aciune antitumoral, cu dou subpopulaii moleculare diferite : TNF (casectina) 1985 este secretat de ctre monocite, macrofage, limfocite, celule NK, celule endoteliale. Casexia este rezultatul aciunii TNF, care inhib lipoproteinlipaza prezent n adipocite prezint trei subuniti helix, cu greuti moleculare de 17 k , cu 157 de resturi de aminoacizi gena codificant este situat pe cromozomul 6, n cadrul CMH TNF (limfotoxina) este sintetizat doar de ctre limfocite, stimulate de INF sau lipopolizaharidele bacteriene are o structur asemntoare TNF, trimer cu greutate molecular de 25 k, cu 171 resturi de aminoacizi gena codificant este situat pe cromozomul 6. Receptorii pentru TNF sunt de dou tipuri, cu distribuie celular variat: TNF-R (75 k) i TNF-R(55 k), care pot fixa fiecare att TNF, ct i TNF. Se pare c exist i receptori solubili pentru TNF (STNF-R), identificai n urina i serul tuturor indivizilor, n concentraii specifice persoanei respective. Receptorii solubili pentru TNF rezult prin clivarea proteolitic a TNF-R sau i pstreaz n continuare capacitatea de legare a TNF. Receptorii solubili pentru TNF ar putea avea rolul de a bloca aciunea TNF la concentraii prea mari. Prezena unor concentraii mari de TNF solubil n preajma celulelor tumorale, ar putea explica rezistena formaiunii la TNF-ul administrat exogen. TNF-ul solubil ar putea explica i efecte paraneoplazice precum anorexia i casexia. Factorii inductori ai sintezei TNF sunt: - componente bacteriene - lectine (fitohemaglutinina, concavalina A, etc.) - citokine (IL1, IL2, INF, GM-CSF, ) - zimozanul, etc. Factorii inhibitori ai sintezei TNF sunt multipli : - glucocorticoizi - prostaglandinele - IL4, IL6, IL10 - alfaglobulinele 395

histamina, serotonina

Aciunile TNF Aciune citotoxic tumoral, prin distrugerea vaselor tumorale i declanarea coagulrii locale (tumorile mari sunt mai sensibile la aciunea TNF). Activitatea antitumoral a TNF nu are specificitate de specie. Un alt posibil mecanism de aciune ar putea fi activarea enzimelor lizozomale ale celulelor cu potenial citotoxic i chiar fragmentarea ADN-ului celulei int, prin activarea endonucleazelor endogene. Rol antiviral tip INF. Moduleaz producia de citokine (IL1, IL2, IL6, IL8) i de factori chemotactici i stimuleaz producia proteinelor de faz acut. Activeaz funciile citotoxice (moduleaz eliberarea radicalilor activi ai oxigenului). Stimuleaz exprimarea antigenelor HLA clasa I . Crete aderarea mononuclearelor pe suprafaa endoteliului vascular. Inhib angiogeneza. Produce casexie, hipotensiune arterial, modificri de ritm cardiac. TNF produce fenomene de necroz vascular n ocul septic. IL1, INF i TNF reprezint ageni ai ocului endotoxic (rspuns imun n exces, din cauza concentraiei mari de LPZ bacteriene). Utilizarea TNF n terapie este nsoit de efecte adverse (mielosupresie, febr, casexie). Administrarea TNF n asociere cu INF i IL2 sau asocierea TNF cu anticorpi monoclonali dau efecte pozitive minime.

ALI MEDIATORI Factorul de transformare al creterii (TGF)

Citokin existent n trombocite, rinichi i mduva osoas, produsa sub aciunea celulelor transformate tumoral sau viral Exist dou peptide TGF diferite, TGF i TGF, cu greutate molecular de 25 k, cu structur dimeric (TGF1, 2 i TGF1, 2). TGF este implicat n embriogenez, aprare antiinfecioas i antitumoral. TGF acioneaz ca stimulator al proliferrii fibroblastelor i a celulelor endoteliale (stimuleaz procesele de refacere ale esutului conjunctiv) 396

 Acioneaz i ca imunosupresor scade capacitatea de sintez a IgM i IgG, capacitatea citotoxic a celulelor NK i n mod paradoxal, crete sinteza de IgAs la nivelul mucoaselor. Aplicaiile terapeutice ale TGF1 se refer la administrarea substanei respective nainte de interveniile chirurgicale, cu rol n cicatrizarea plgilor.

Factorul de stimularea al coloniilor de granulocitemacrofage (GM-CSF)

Exist o glicoprotein de 22 k, cu 127 de aminoacizi, care stimuleaz proliferarea i diferenierea precursorilor hematopoetici i poteneaz funcia macrofagelor i a granulocitelor. Citokina are funcie tumoricid i favorizeaz exprimarea antigenelor HL-A clasa I pe suprafaa celulelor.

Factorul de stimulare al coloniilor granulocitare (G-CSF)

Foarte asemntor structural cu IL6, cu dou forme moleculare G-CSF i G-CSF. Este produs de ctre monocite, macrofage, celule endoteliale i fibroblaste stimulate imunologic. Principala aciune se refer la diferenierea granulocitelor PMN i acioneaz asupra celulelor multipotente.

Factorul de stimulare al coloniilor de macrofage (M-CSF)

Este sintetizat de ctre monocite, fibroblaste, celule endoteliale. Glicoproteina are o greutate molecular de 45-90 k i induce formarea de colonii de precursori ai macrofagelor i mbuntete mecanismele oxidative la nivelul macrofagelor adulte.

Factorul de activare al trombocitelor (PAF)

PAF este produs de ctre granulocite, cu funcii stimulatorii pentru trombocite; stimuleaz agregarea trombocitelor la locul inflamaiei, induce bronhoconstricia i activeaz sinteza IL1.

CAPITOLUL 49 MODULAREA RSPUNSULUI IMUN PRIN COOPERRI CELULARE

Reaciile imune declanate de ctre un anumit antigen implic proliferarea clonelor de limfocite cu funciile lor specifice, pentru realizarea rspunsului imun mediat celular sau mediat umoral. 397

Activarea celulelor imunologice se realizeaz prin mai multe categorii de stimuli : mesageri primari reprezentai de ctre antigenele care se fixeaz pe receptorii celulari specifici mesageri secundari sunt produi biochimici rezultai prin activarea unor complexe enzimatice mesageri teriari sunt factori implicai n sinteza de citokine Pentru declanarea rspunsului complex limfocitar este obligatorie etapa de recunoatere a antigenului strin, dup captarea, prelucrarea i prezentarea lui fracionat (epitopi) altor celule imunologice. Recunoaterea i prelucrarea antigenului este realizat prin intermediul celulelor prezentatoare de antigen, care pot s dein sau nu funcii fagocitare. Principalele celule cu funcii fagocitare sunt monocitele sanguine i macrofagele tisulare, eventual astrocitele cerebrale. Celule prezentatoare de antigen nefagocitare sunt celulele Langerhans din piele, celulele dendritice i limfocitele B (din esuturile limfoide).

CELULE PREZENTATOARE DE ANTIGEN Macrofagele

Aceste celule realizeaz fagocitoza (pentru antigenele corpusculare) i pinocitoza (pentru antigenele solubile). Substanele endocitate sunt degradate pn la nivel peptidic, apoi asociate cu antigenele CMH clasa a II-a i ulterior prezentate limfocitelor. Epitopii obinui sunt peptide cu 10-15 resturi de aminoacizi. Legarea peptidelor la moleculele CMH n vederea complexului de prezentare se realizeaz la nivelul situsului molecular de legare (10-25), care se individualizeaz la nivelul domeniilor globulare 1, 2 pentru moleculele HLA clasa I i la nivelul domeniilor 1 i 1 ale moleculelor HLA clasa a II-a. Recunoaterea imunologic asociat de numete restricie CMH. Antigenele endogene (spre exemplu o celul proprie organismului infectat viral) se asociaz la celulele HLA clasa I, stimulnd limfocite TCD8 (citotoxice). Moleculele HLA clasa I au un situs de legare pentru antigen care este n permanen ocupat de ctre peptidele proprii, la concuren cu ocuparea acestor situsuri de ctre peptidele exogene. Antigenele exogene sunt endocitate i degradate i interacioneaz cu antigenele HLA clasa a II-a, complexul fiind prezentat limfocitelor TCD 4 (helper). Dup recunoaterea antigenului de ctre celula T, limfocitul primete semnale imunologice activatoare. 398

Limfocitele B
Aceste celule prezint receptori specifici pentru antigen, de natur imunoglobulinic (IgMm i IgD) i pot prezenta epitopi semnificativi din punct de vedere imunologic limfocitelor T (se pot constitui n celule CPA, prezentatoare de antigen). Nu exist date suficiente dac limfocitele B prelucreaz antigenele precum macrofagele. Prezentarea antigenului se face tot sub restricie CMH.

Celulele dendritice
Aceste celule prezint antigenele, att sub restricia CMH, ct i n absena acesteia (celulele dendritice foliculare nu utilizeaz restricia CMH, n timp ce celulele dendritice din medulara timusului utilizeaz aceast restricie). Informaiile despre antigen ar fi furnizate de ctre celulele dendritice foliculare, care ar putea reine complexele antigen-anticorp i lear prezenta limfocitelor B cu memorie. Celulele dendritice limfonodulare coopereaz att cu limfocitele, ct i cu macrofagele.

TEORIA RECUNOATERII ASOCIATE

Cooperrile celulare necesare elaborrii rspunsului imun sunt supuse urmtoarelor principii : Limfocitele TCD8+ recunosc epitopii, n asociere cu produii genelor CMH clasa I-a, prezeni pe suprafaa tuturor celulelor nucleate din organism. Limfocitele TCD4+ interacioneaz cu antigenele strine, n prezena moleculelor HLA clasa a II-a, aflate pe suprafaa celulelor imunocompetente (limfocite B, limfocite T, macrofage.). Limfocitele T posed receptorii TCR cu specificitate dubl, att pentru antigen, ct i pentru molecula CMH corespunztoare interaciunii respective, respectndu-se regulile sus-menionate. Mecanismele cooperrilor celulare sunt prezentate simplu (n scop didactic) i anume modele de cooperare a dou celule imunologice i respectiv a trei celule imunologice. Bineneles c in vivo, mecanismele cooperrilor celulare sunt foarte complexe.

399

MODELUL INTERACIUNII A DOU CELULE IMUNOLOGICE Interaciunea celul prezentatoare de antigen limfocit T
Celula prezentatoare de antigen developeaz epitopii semnificativi din punct de vedere imunologic i i expune pe suprafaa sa, pentru a putea fi prezentai limfocitului T H. (Macrofagele sunt principalele celule prezentatoare de antigen, dup degradarea menajat a acestuia). Macrofagul secret interleukina 1 i stimuleaz proliferarea i activarea limfocitelor T CD4 (aceste limfocite activate secret IL2 dar i factorul de activare al macrofagului MAF, care augmenteaz procesele fagocitare). Interaciunile celulare se bazeaz pe restricia CMH.

Cooperarea celular limfocit TCD4-limfocit B

Cooperarea celular limfocit TH limfocit B se realizeaz sub restricia antigenelor HLA clasa a II-a. Limfocitul T helper activat transmite semnale stimulatoare i proliferative limfocitelor B prin citokine, n special prin IL2. Se produce diferenierea limfocitelor B nspre plasmocit i secreia de imunoglobuline. Unele antigene (flagelina polimerizat, polizaharidele bacteriene) stimuleaz limfocitele B, fr intervenia limfocitelor T (acestea sunt antigenele timoindependente). Aceste antigene prezint molecule cu greutate molecular mare, cu uniti repetitive, greu degradabile in vitro i foarte persistente n organism. Antigenele timoindependente stimuleaz sinteza de IgM, nu ns i sinteza de IgG. Mecanismul respectiv este greu de explicat: efectul antigenelor timoindependente ar putea fi mitogenic i s-ar putea exercita asupra anumitor populaii de limfocite B. Antigenele timoindependente reprezint marea majoritate a antigenelor, rspunsul imun umoral fiind condiionat n acest caz de cooperarea dintre limfocitele B i T.
Fig. nr. 42 - Cooperarea imunologic dintre celula CPA i limfocitul Th (Klein)

400

Fig. nr. 44 - Interaciunea limfocit Th - limfocit B (Zarnea, 1990)

401

Cooperarea celular limfocit T citotoxic celul int

Celulele Tcitotoxice (CD8+) se leag de celulele int prin intermediul antigenului i a moleculelor HLA clasa I de pe suprafaa celular. Efectul citotoxic al limfocitului TCD8+ se realizeaz prin intermediul limfotoxinelor: perforina i granzima, care realizeaz microcanalicule membranare n celula de distrus. Celulele distruse pot fi celule self mbtrnite (cu antigene HLA expuse unui proces de uzur), celule infectate viral sau celule modificate tumoral. Alte modele de cooperare celular dual ar putea fi : cooperarea limfocit TH limfocit TC, limfocit TS i limfocit B, limfocit TH limfocit TS. Raportul dintre numrul limfocitelor TH i numrul limfocitelor TS trebuie s fie supraunitar pentru un rspuns imun normal. Valoarea subunitar a raportului limfocite TH / limfocite TS indic imunosupresia (spre exemplu, n AIDS).

Fig. nr. 45 - Citotoxicitatea prin intermediul limfocitului Tc (Klein, 1991)

402

MODELUL INTERACIUNII A TREI CELULE IMUNOLOGICE Interaciunea MF limfocite TH limfocite TB

Modelul se bazeaz pe interaciunea dintre celula prezentatoare de antigen (cel mai adesea macrofag) cu celule B i T. Procesul este complex: macrofagul fragmenteaz antigenul, expune epitopii semnificativi imunologic i secret IL1, cu rol stimulator i proliferativ asupra limfocitului T helper. Limfocitul T H activat secret IL2, cu rol n proliferarea i diferenierea limfocitului B spre plasmocit secretor de imunoglobuline.

Interaciunea MF limfocit Tcitotoxic celul int

Este un alt model posibil de cooperare celular, care are la baz teoria dublei recunoateri prin intermediul receptorului pentru antigen al celulei T. Intervenia macrofagului faciliteaz prezentarea antigenului. Macrofagul ar putea realiza chiar fagocitoza resturilor celulare ale celulei int. Modelele prezentate demonstreaz restricia CMH la nivelul cooperrilor celulare. Unii cercettori, afirm faptul c exist o categorie de celule TH nesupus restriciei CMH, numite T H-Ig. Aceste limfocite TH pot stimula numai celule B mature care exprim anumite izotipuri de imunoglobuline. De asemenea, celulele ucigae naturale i exercit efectul citotoxic n absena restriciei CMH. n concluzie, parametrii implicai n procesul cooperrilor imunologice declanate de prezena antigenului sunt : diverse celule (variate celule prezentatoare de antigen, limfocite B i T, celule int, etc.) antigenele HLA clasa I i clasa a II-a de pe suprafaa celular (restricia CMH) diverse citokine Aceste procese foarte complexe sunt necesare pentru elaborarea rspunsului imun adecvat i specific.

403

CAPITOLUL 50 MODULAREA RSPUNSULUI IMUN PRIN ANTIGEN

Rspunsul imun este influenat cantitativ i calitativ prin proprietile antigenului i prin proprietile de prezentare ale acestuia celulelor sistemului limfoid. Potenialul reglator al antigenului depinde mai ales de doz, de imunogenicitatea epitopilor i de accesibilitatea acestora. Nerespectarea unor minime condiii n privina acestor parametri va conduce la toleran imunitar.

MECANISMELE TOLERANEI IMUNOLOGICE Tolerana imunitar funcie de proprietile fizico-chimice ale antigenului

Scderea greutii moleculare a unui antigen (sub 10.000 ) fr modificarea specificitii acestuia, determin scderea rspunsului imun. Scderea numrului de epitopi de pe suprafaa antigenului va determina creterea tolerogenitii. Antigenele neprelucrate la nivelul celulelor prezentatoare de antigen i cele neaccesibile celulelor sistemului imunitar vor induce rapid tolerana imun. Fraciunea solubil sau nemetabolizat a unui antigen induce tolerana imun mai repede dect o fraciune particulat. Agregatele moleculare (spre exemplu agregatele imunoglobulinice) sunt bune imunogene. Dispersia acestor agregate ar putea induce starea de toleran imunologic.

Tolerana imunitar funcie de modul de administrare al antigenului

404

 Asocierea unui antigen cu un adjuvant particulat i poteneaz acestuia imunogenicitatea. Principiul se aplic n fabricarea vaccinurilor. Adjuvantele clasice se prepar din substane uleioase (spre exemplu adjuvantul Freud se prepar cu lanolin, parafin i celule moarte de Mycobacterium tuberculosis) sau substane minerale (fosfat de aluminiu, hidroxid de aluminiu, alginat de calciu). Adjuvantele moderne sunt lipozomi cationici sau lipidul A monofosforilat sau chiar imunomodulatoare antitumorale, cum este UBENIMEX-ul (folosit n compoziia vaccinurilor antiHIV moderne). Administrarea unei doze unice de antigen este mai tolerogen dect administrarea unor antigene asociate. Dac sunt asociate minimum dou antigene diferite, capacitatea de rspuns imun crete. Principiul este folosit n vaccinri, spre exemplu bivaccinul DT (diftero-tetano) sau trivaccinul DTP (diftero-tetano-pertusis). Administrarea antigenului pe cale oral sau inocularea intravenoas (fr adjuvani) poate genera toleran imunitar. La administrarea intramuscular, subcutanat sau intradermic, rspunsul imun apare mai tardiv, dar dureaz mai mult. Administrarea intradermic a antigenului stimuleaz preferenial imunitatea mediat celular. Administrarea antigenului n zone diferite (sau pe ci diferite) ale corpului este mai eficient dect administrarea unic. n cazul inoculrilor succesive ale anumitor antigene se poate instala competiia antigenic, n care primul antigen blocheaz rspunsul imun pentru antigenul inoculat ulterior. Acest gen de reglare are importan practic n aplicarea anumitor scheme de vaccinare. Inocularea pentru prima oar a antigenului determin rspunsul imun primar. (Spre exemplu prima doz de vaccin induce acest tip de rspuns, n timp ce imunizrile rapel induc rspunsul imun secundar.)

RSPUNSUL IMUN N FUNCIE DE DOZA DE ANTIGEN

405

Fig. nr. 46 - Influena dozei de antigen asupra rspunsului imun (Ivanof i colab., 1982)

Exist o relaie strns ntre doza de antigen i rspunsul imun. Astfel, exist o toleran imunitar real ; nu se instaleaz rspunsul imun la doze de ordinul picogramelor (10-12g), urmat de posibilitatea instalrii unei tolerane imunitare de doz joas, la cantiti de antigen de ordinul nanogramelor (10-9g). Pe msura creterii cantitii de antigen la doze de ordinul microgramelor (10-6g), rspunsul imun crete progresiv, pn la o doz optim de antigen de ordinul miligramelor (10 -3g) pn la ordinul gramelor. La doze mai mari de antigen dect doza optim apare tolerana imunitar de doz nalt, prin suprancrcare antigenic i epuizarea capacitii de rspuns imun. Fracionarea unei doze antigenice i inocularea repetat n timp vor declana un rspuns imun mai amplu dect administrarea ntregii cantiti n doz unic. Repetarea stimulului antigenic duce la o amplificare a rspunsului imun, dac repetarea se face la anumite intervale de timp intervale optime. Stabilindu-se pentru fiecare imunogen intervalele optime dintre inoculri, Zdrodowski a fundamentat legea intervalelor, utilizat n programele de imunizare (imunizare de baz, imunizare rapel).

Tolerana imunitar n funcie de maturitatea imunologic a gazdei

406

Animalele de experien nou-nscute posed o stare de toleran imunitar fiziologic, deoarece limfocitul B imatur induce fenomenul de beretare mult mai greu. Tolerana imunitar a limfocitului B se poate induce mai lent dect tolerana imunitar pentru limfocitul T. La nounscut exist i imaturitate a limfocitului TH. n concluzie, cu ct nivelul de imunocompeten i maturitate imunologic este mai sczut, cu att tolerana imunitar este mai uor indus. Bineneles c persoanele cu deficit imunitar au risc crescut n instalarea toleranei imunologice, comparativ cu persoanele normale. Rolul influenelor genetice nu este foarte bine stabilit, dar se ia n considerare influena genelor de rspuns imun individualizat (Ir), gene care aparin complexului major de histocompatibilitate clasa a II-a. Inducia toleranei imunitare s-ar putea realiza indirect, prin stimularea aciunii limfocitelor T supresoare.

Tolerana imunitar indus prin limfocitele Ts

n procesele imunosupresoare intervin trei tipuri de celule TS: Celule TS inductoare Celule TS reglatoare sau transductoare Celule TS efectoare Supresia imun se realizeaz prin feed-back. Celula TS efectoare inhib funcia limfocitelor TH i a limfocitelor TS inductoare proprii circuitului respectiv. Alt activitate a limfocitelor TS se realizeaz n cadrul reelei idiotipice a sistemului imunitar. Teoria se bazeaz pe ideea c structurile idiotipice de pe suprafaa celulelor T reglatoare ar putea funciona ca elemente de ghidare ntr-un circuit supresor. Idiotipul receptorului T va fi recunoscut de ctre alt celul, care posed un antiidiotip, procesul desfurndu-se n lan. Celulele TS au rolul esenial n meninerea toleranei la self i n controlul negativ al amplitudinii rspunsului imun. Tolerana imunitar natural, activitatea sczut a limfocitelor T S favorizeaz boli autoimune i boli alergice. Activitatea excesiv a lf TS determin boli cu deficit imun.

Tolerana imunitar indus artificial

Cu scopul tratrii unor boli autoimune sau cu scopul meninerii unei grefe sau a unui transplant, se apeleaz la factori imunosupresori, cum ar fi drogurile citotoxice (Ciclofosfamida, Ametopterina, Azatioprina), serul antilimfocitar sau iradierea limfoid total. 407

CAPITOLUL 51 DINAMICA RSPUNSULUI IMUN UMORAL

ndeprtarea antigenului (imunogenului) din organism se realizeaz prin celule imunologice (imunitate mediat celular) i prin imunoglobuline cu funcie de anticorpi (imunitate mediat umoral). Nu se poate face o delimitare strict ntre IMC i IU, deoarece nu exist sintez de anticorpi fr cooperare celular ntre celulele imunologice i de asemenea, celulele imunologice i pot desfura efectul citotoxic n prezena anticorpilor (citotoxicitate anticorpo-dependent). Numeroase observaii experimentale arat c exist unele variaii n cinetica rspunsului imun, n special n cazul imunitii umorale: rspuns imun primar i secundar. Particularitile de rspuns imun apar n patru faze distincte: faza de laten a rspunsului imun faza de cretere exponenial a concentraiei Ig-lor faza de platou faza de declin
Fig. nr. 47 - Dinamica rspunsului imun umoral (Ivanof i colab., 1982)

RSPUNSUL IMUN PRIMAR

Faza de laten

408

Aceast etap are o durat variabil n funcie de mai muli parametri: cale de inoculare, doza i natura antigenului, sensibilitatea tehnicilor de detectare. Pentru antigene proteice solubile, faza poate dura 5-7 zile, iar pentru bacterii aproximativ 14 zile. n acest rstimp, antigenul este fagocitat, prelucrat i prezentat prin celulele prezentatoare de antigen limfocitelor TH i B. n acest rstimp se activeaz toate procesele de cooperare celular, cu transformarea limfocitelor B n plasmocite secretoare de anticorpi. Faza de cretere exponenial a concentraiei Ig Faza de sintez activ sau de cretere logaritmic dureaz 4-6 zile, n medie. n rspunsul imun primar, titrul IgM este maxim. IgM polimer este foarte avid i foarte eficient. Producia de IgG ar ncepe dup doutrei zile, dar la valori mai mici dect titrul IgM. Creterea evident a IgG, dup 5-6 zile ar putea fi legat i de declinul uor al sintezei IgM, care dup cteva sptmni dispar prin circulaie. Faza de platou Rspunsul imun primar, instalat dup un stimul antigenic unic are o durat variabil (12-16 zile) i corespunde unei concentraii constante i crescute de imunoglobuline. Faza de declin Se caracterizeaz printr-o scdere a titrului de Ig, iniial lent i apoi rapid i constant. Apare n zilele 21-28, iar durata fazei depinde de titrul maxim atins i de viteza de catabolism. Procentul anticorpilor catabolizai zilnic este de 18% pentru IgM , 7% pentru IgG i 25% pentru IgA. Cel mai lent scade titrul IgG, titru care se menine timpul cel mai ndelungat. Rspunsul imun primar fa de antigenele T independente are ca particularitate predominana sintezei de IgM n toate fazele.

RSPUNSUL IMUN SECUNDAR

Acest tip de rspuns este indus dup al doilea contact al organismului cu acelai antigen i prezint anumite particulariti: poate fi iniiat cu o doz mai mic de antigen perioada de laten este foarte scurt Anticorpii apar mai rapid, ating concentraii mari n ser, aparin clasei IgG (cu afinitate mare i aviditate sczut pentru imunogenul declanator) Sinteza IgG se menine timp ndelungat n rspunsul imun secundar (faza de platou poate dura luni de zile). 409

Rspunsul imun secundar poate fi repetat de mai multe ori. Cu fiecare repetare a stimulului, rspunsul imun apare mai rapid i cu o intensitate mai mare. Fenomenul are aplicaie n imunizri. Aceste fenomene sunt posibile prin creterea brusc a celulelor imunologice cu memorie (o celul precursoare poate produce aproximativ 1000 celule cu memorie). Diferenierea limfocitelor B nspre plasmocit este mult mai rapid, deoarece procesele de cooperare celular evolueaz mai eficient. n cazul antigenelor timoindependente, readministrarea unui antigen de acest tip nu produce un rspuns de tip secundar, ci unul asemntor cu rspunsul imun primar, cu hiperproducie de IgM. Aceste antigene nu induc apariia celulelor cu memorie imunologic. n rspunsul imun umoral secundar timodependent exist i sintez de IgM, dar la titruri considerabil sczute, comparativ cu IgG. Dublarea titrului IgG are loc la fiecare 8 ore n faza exponenial, cu atingerea titrului maxim n aproximativ 14 zile (aproximativ de 100 ori mai mare dect titrul maxim IgG din rspunsul imun primar). Anticorpii produi n rspunsul imun secundar timodependent au o afinitate mai mare dect cei produi n rspunsul imun primar (maturare a afinitii). Nivelul afinitii depinde i de doza de antigen administrat. Dozele mici de imunogen favorizeaz creterea afinitii, iar cele mari o inhib. n cazul dozelor prea mari, celulele cu afinitate mare sunt saturate, excesul de antigen devenind accesibil i celor cu afinitate mic, astfel c anticorpii secretai vor avea afinitate diferit. n general, n cursul rspunsului imun secundar toate reaciile imune specifice au cea mai ampl exprimare: producerea rapid de anticorpi cu efecte protectoare, fie reacii de hipersensibilitate imediat (mai rar). Studiind mecanismele rspunsului imun primar i secundar, s-a fundamentat legea intervalelor, absolut necesar n stabilirea unor scheme de imunizare.

410

CAPITOLUL 52 IMUNOPROFILAXIA I SEROTERAPIA

n anul 1798, Jenner introduce vaccinarea antivariolic, chiar nainte de a cunoate agentul etiologic al variolei. Jenner a observat faptul c mulgtorii fac aceast boal foarte rar. Pornind de la aceast constatare, inoculeaz produs patologic la om, din leziunile prezente pe ugerele vacilor. Metoda a fost denumit vaccinare (n limba latin, vacca=vac). Ulterior (1880), Pasteur a stabilit principiul atenurii virulenei agenilor patogeni, care a marcat producerea primului vaccin fundamentat imunologic (preparat dintr-o tulpin de Baccilus anthracis atenuat prin cldur). Vaccinul este un preparat realizat din ageni etiologici infecioi (bacterii, virusuri, fungi, parazii), care administrat la om induce imunitatea specific, fr reacii adverse.

VACCINURI CLASICE I MODERNE

Primele vaccinuri folosite utilizau microorganisme vii, neatenuate, nlocuite apoi cu germeni atenuai sau omori prin diverse proceduri fizico-chimice. n afar de vaccinurile cu antigene corpusculare (exemplu: celule bacteriene) sunt folosite i vaccinuri subunitare, fracionate (exemplu: vaccinuri preparate din ribozomi bacterieni vaccinul din ribozomi ai Mycobacterium tuberculosis, obinut de soii Youmans). Acestea sunt primele vaccinuri, denumite vaccinuri clasice sau convenionale. Totui, pe lng valoarea lor profilactic indiscutabil, uneori pot genera accidente postvaccinale, precum redutabile reacii alergice sau chiar infecie, n cazul atenurii inadecvate a tulpinii respective. Pentru evitarea acestor reacii adverse a fost necesar obinerea vaccinurilor convenionale ameliorate, ce utilizeaz antigene nalt purificate, cunoscute din punct de vedere al virulenei i al epitopilor semnificativi din punct de vedere imunologic. Progresele biologiei moleculare a fcut posibil obinerea vaccinurilor preparate prin tehnologia ADN recombinant, aa zise vaccinuri de generaia a treia. Spre exemplu: Engerix B, Recombivax HB utilizate mpotriva hepatitei cu virus B. 411

Vaccinurile preparate din polipeptide sintetice reprezint o mare realizare a biochimiei. Se sintetizeaz doar peptidele cu semnificaie imunologic (epitopi). Acest fragmente pot deveni imunogene prin cuplarea lor cu molecule carrier = purttor. Adjuvanii reprezint substane care cresc imunogenicitatea vaccinurilor purificate, nalt selective. Dei aceste substane sunt foarte variate, pot stimula limfocitele T helper, procesele de cooperare celular i producia de citokine. Adjuvani convenionali sunt reprezentai de gelurile de oxid (hidroxid sau fosfat de aluminiu). Astfel, anatoxina difteric (ADPA) este purificat i absorbit pe fosfat de aluminiu. Adjuvanii moderni sunt de natur proteic sau lipidic. Spre exemplu, vaccinul viitorului va fi reprezentat de un carrier (probabil proteic), pe care se vor fixa epitopii (sintetici) cu semnificaia imunologic pentru mai multe boli infecioase. Se realizeaz astfel o poliimunizare. Pentru prepararea vaccinurilor antivirale se folosesc adjuvani de tip protein micelar, formele sterice ale acestor proteine fiind similare celor din nveliul extern viral. Aceste vaccinuri antivirale sunt foarte imunogene. Virosomii (imunosomii) sunt structuri purttor artificiale echivalente lipozomilor i reprezint vezicule fosfolipidice n care sunt inclui spiculi glicoproteici virali. i virosomii reconstituie nveliul extern viral dorit. Iscomii sunt complexe imunostimulatoare, realizate prin legarea spiculilor glicoproteici virali de substana Quil-A (o saponin care induce spontan formarea de micele). Imunogenicitatea iscomilor este mai mare dect cea a virosomilor. Lipozomii sunt vezicule fosfolipidice utilizate ca i purttor, n special pentru vaccinurile antivirale i antiparazitare.
Fig. 48 - Lipozomi multilaminari (Klein, 1991)

412

Proteosomii utilizeaz proteine de membran extern din peretele celular meningococic. Proteosomii sunt structuri hidrofobe, care formeaz spontan vezicule membranare, avnd o aciune asemntoare lipozomilor. Proteosomii, recent descoperii, nu au reacii adverse i reprezint carrier-ul ideal pentru o gam larg de vaccinuri, mai ales multivalente. Vaccinurile moderne antiPlasmodium prezint ca adjuvani proteosomi i o eficacitate crescut. Vaccinurile antiHIV moderne, n curs de experimentare pe animale (aproximativ 20 de tipuri diferite) sunt multivalente, cu epitopi preparai din glicoproteinele de nveli (n special din glicoproteina 120 zona variabil V3), cu adjuvani de tipul liposomilor, iscomilor, proteosomilor, imunomodulatori antitumorali (Ubenimex). Administrarea intranazal a acestor vaccinuri, crete rspunsul n imunoglobuline A secretoare la nivelul mucoaselor; administrarea acestor vaccinuri pe cale parenteral stimuleaz rspunsul imun general (umoral i mediat celular). Dei aceste vaccinuri moderne par a fi foarte eficiente, costul lor extrem de ridicat face momentan imposibil profilaxia n mas antiHIV. Vaccinurile de generaia a cincea vaccinurile antiidiotip servesc ca nlocuitori ai antigenelor i au fost propuse ca o alternativ la vaccinurile convenionale, ADN recombinante sau chiar celor cu polipeptide sintetice. Vaccinarea are la baz teoria lui Jerne 1974, (privind reeaua idiotip-antiidiotip, cu rol n reglarea rspunsului imun) i teoria hibridomului, pentru producerea anticorpilor monoclonali. Vaccinurile antiidiotip se bazeaz pe fenomenul de mimare molecular, prin care anticorpul care poart imaginea intern a antigenului strin n structura sa, se comport similar antigenului nsui, inducnd sinteza aceluiai tip de anticorpi protectori. Se realizeaz astfel un proces de vaccinare fr antigen (!), antigenele fiind nlocuite de anticorpi antiidiotip exogeni. Tehnica respectiv obine o prim categorie de anticorpi (Ac1), dup imunizarea cu antigenul incriminat. Anticorpii Ac1 sunt folosii pentru imunizarea altor indivizi, obinndu-se anticorpi Ac2 antiidiotip specifici, cu imaginea intern (complementar) a antigenului pentru care se realizeaz imunizarea. Vaccinurile antiidiotip sunt indicate pentru antigene ale agenilor infecioi greu de obinut prin tehnologia ADN recombinant sau sinteze biochimice. Sunt n curs de experimentare vaccinuri antiherpetice, antipoliomielit. Specificitatea nalt riguroas a acestor vaccinuri nu declaneaz reacii adverse i produce un rspuns imun mediat celular destul de puternic. 413

Vaccinurile antiadezive mpiedic ataarea bacteriilor pe suprafaa mucoaselor i stimuleaz fagocitoza nainte de colonizarea organismului. La om au fost experimentate vaccinuri preparate din fimbriile Neisseria gonorheae sau ale E. Coli. S-a observat faptul c administrarea acestor vaccinuri determin titruri ridicate de anticorpi serici, fr ns a mpiedica o colonizare a mucoaselor de ctre bacterii. Va fi necesar ameliorarea tehnicii de preparare a acestor vaccinuri, pentru a obine titruri crescute de anticorpi antifimbrii bacteriene, la nivelul mucoaselor. Programul Naional de Vaccinoprevenie se bazeaz pe datele calendarului de vaccinri: Se stabilesc grupele populaionale i colectivitile de risc supuse vaccinrii. Se respect schemele de imunizare stabilite prin consens internaional, pentru fiecare vaccin n parte. Se asigur condiiile impuse de respectarea lanului de frig n scopul transportului i depozitrii vaccinurilor. Se constituie echipe de specialiti: epidemologi, infecioniti, pediatri, care s coordoneze programele de imunizare de la nivelul dispensarelor. Structura programului de vaccinare n anumite ri ine i de posibilitile economice i de incidena bolilor transmisibile din zona respectiv. Programul Naional de Vaccinoprevenie din Romnia prevede vaccinarea antituberculoas, antidifteric, antitetanic, antituse convulsiv, antipoliomielit, antirujeol, antihepatit viral B.

VACCINURI ANTIBACTERIENE I ANTIVIRALE

Vaccinurile antibacteriene obligatorii folosite la noi n ar sunt: Vaccinul BCG (Bacil Calmette Guerin), preparat dintr-o tulpin de bacil tuberculos bovin, atenuat prin pasaje succesive pe cartof glicerinat i biliat, timp de 13 ani. Tulpina respectiv induce IMC, respectiv hipersensibilitate de tip tardiv la antigenele bacilului tuberculos. Vaccinul DTP (Diftero-Tetano-Pertusis) conine anatoxin difteric, anatoxin tetanic i celule bacteriene omorte ale Bordetelei pertussis. Vaccinurile antibacteriene neobligatorii (folosite n situaii de risc epidemiologic) sunt: Vaccinul antiholeric preparat din celule bacteriene omorte, utilizat n epidemia de holer. 414

 Vaccinurile anti Pseudomonas preparat tot din celule bacteriene omorte, este administrat profilactic marilor ari sau n infecii urinare recidivante de aceast etiologie. Vaccinul antitifoidic preparat din celule bacteriene omorte, se administreaz n zone unde febra tifoid este epidemic. Vaccinul antistafilococic administrat n infecii stafilococice cronice Vaccinurile antivirale obligatorii folosite la noi n ar sunt vaccinuri convenionale, atenuate sau inactive: Vaccinul antipolio de tip Sabine preparat din mutante fr neurotropism ale celor trei tipuri antigenice de virus polio (atenuat). Vaccinul antipolio de tip Salck este un vaccin obligatoriu n rile dezvoltate, preparat din virioni omori. Vaccinul antirujeol preparat din tulpina supraatenuat EdmonstonSchwartz. Vaccinul Engerix B vaccin obligatoriu antihepatit viral B (preparat prin tehnologia ADN recombinant) administrat nou-nscuilor sau grupelor de risc (ex.: personal medico-sanitar). Vaccinurile antivirale neobligatorii sunt: Vaccinul antigripal mixtur antigenic a tipurilor antigenice A,B, i C cu virulen diminuat sau vaccinuri preparate din mixturi de hemaglutinin i neuraminidaz. Se administreaz anumitor grupuri de risc. Vaccinul antirubeolos tulpina Cendhill, vaccin neobligatoriu la noi, dar obligatoriu n Occident, administrat sexului feminin la vrsta fertilitii, cu scopul prevenirii malformaiilor congenitale produse de virus. Vaccin antirabic preparat din virioni omori (vaccin Fermi). Vaccinul antirabic preparat din tulpina atenuat Floury, administrat dup muctur de animal. Vaccinul antiamaril (antifebr galben) este administrat este administrat doar persoanelor care circul n zone endemice. ntr-un program de vaccinare trebuie cunoscute avantajele i dezavantajele vaccinurilor antivirale atenuate sau virioni omori.

Vaccinuri antivirale cu virulen diminuat

Avantaje: 415

 Puine doze impun un rspuns imun eficace, simulnd trecerea pacientului prin boala respectiv Determin rspuns imun mixt IU+IMC Sunt ieftine (accesibile rilor slab dezvoltate economic) Se administreaz pe cile naturale de ptrundere ale virusului (vaccinul antipolio de tip Sabine se administreaz per os) Exist posibilitatea eliminrii din circulaie a virusurilor slbatice Dezavantaje: Revers mutaia cu apariia fenotipului slbatic iniial Efectul vaccinului poate fi perturbat prin fenomenul de interferen

Vaccinurile antivirale cu virioni omori

Avantaje: Au o stabilitate genetic foarte mare Pot fi administrate i la persoane imuno-deficiente Controlul inoculrii este uor de efectuat Dezavantaje: Necesit cantiti mari de Ag n doze multiple.Ex.: vaccin antipolio Salck

Contraindicaiile vaccinrilor
Temporare: Strile febrile ca urmare a unor infecii benigne nu contraindic vaccinarea, ci doar o amn Administrarea imunoglobulinelor contraindic vaccinarea pe o perioad de 4-6 sptmni Tratamentele cu medicamente imunosupresoare contraindic vaccinarea 1 pn la 3 luni Sarcina contraindic vaccinarea cu ageni atenuai, vii. Riscul teratogen este foarte mare n primele trei luni de sarcin Tuberculoza pulmonar activ este o contraindicaie

Definitive: n afeciuni neurologice grave nu se administreaz vaccinuri cu neurotropism (ex.: virusul polio, virusul parotiditei) Afeciuni organice grave, decompensate (insuficiena cardiac, infarctul miocardic, nefropatiile cronice) contraindic vaccinarea Complicaiile alergice (alergii majore la proteinele aviare) reprezint o interdicie pentru vaccinare 416

417

Principalele reacii adverse ale vaccinurilor

Episoade febrile precoce: ADPA, ATPA, DT, vaccin antigripal, antihepatitic B Convulsii (la copil mic): DTP, vaccin antirujeolic Leziuni supurate, adenopatii: vaccinul BCG, vaccin antirubeolic, anti hepatit B Paralizie: 1 caz la 3,2 milioane de doze vaccin antipolio Sabine oc vaccinal: 1 caz la 100 000 de administrri; asemntor ocului anafilactic apare la vaccinuri preparate din endotoxine

Evaluarea eficienei vaccinopreveniei

Se folosesc indicatori epidemiologici, urmnd frecvena unei anumite boli infecioase n lotul persoanelor vaccinate, comparativ cu lotul persoanelor nevaccinate Se folosesc tehnici imunologice care evideniaz prezena seroconversiei n anticorpi specifici (ex. Trusa Difterotest reacie de hemaglutinare pasiv pentru demonstrarea eficienei vaccinrii antidifterice). Trebuie stabilit, de asemenea, dac nivelul anticorpilor obinut este protectiv. Procedeele de imunizare sunt benefice pentru indivizi i reprezint o bun metod de pstrare a sntii populaiei, prin metodele preveniei. Eradicarea variolei va fi urmat curnd de eradicarea rujeolei i poliomielitei, conform programelor OMS.

SEROTERAPIA
Serurile imune induc imunitatea pasiv i conin anticorpi specifici mpotriva unui anumit agent infecios. Aceste seruri se folosesc n terapia i profilaxia anumitor boli infecioase. n anul 1890, Behring i Kitasato au demonstrat faptul c serul animalelor imunizate cu toxina difteric neutralizeaz toxina. Din anul 1891, serul animalelor imunizate a fost folosit n terapia difteriei. n anul 1889, V. Babe a utilizat serul antirabic i vaccinul n prevenirea rabiei; de aceea l putem considera ntemeietorul seroterapiei i seroprofilaxiei. Serurile obinute prin hiperimunizarea animalelor de experien se numesc seruri heterologe. Dei anticorpii se obin n cantiti mari, dezavantajul principal l constituie boala serului sau ocul anafilactic. 418

Serul uman de la convalesceni nu se mai utilizeaz datorit pericolului transmiterii hepatitelor virale i a virusului imunodeficienei ctigate. Prin amestecul serurilor obinute de la aprox. 1000 de subieci se obin concentrate de imunoglobuline numite gamaglobuline. Administrarea acestora nu transmite bolile infecioase sus-menionate, dar pot produce fenomene de hipersensibilizare prin administrri repetate. Administrarea corect a agregatelor de imunoglobulin antiRh pot preveni accidentele prin izoimunizare Rh. Gamaglobulinele hiperimune se obin din serul unor subieci imunizai specific prin vaccinare (ex. Gamaglobulin hiperimun antidifteric, antirabic, antirujeoloas, antiherpetic, antimalaric, etc.) O alt clasificare a serurilor se poate face dup natura anticorpilor: Seruri antitoxice conin anticorpi antiexotoxin bacterian (ser antidiferic, antitetanic, antibotulinic) Seruri cu anticorpi anticelul bacterian - (ser anti Pseudomonas) Seruri mixte anticorpi anti celul bacterian i antiexotoxin (ser anti Clostridium perfringens, ser anticrbunos)

Seruri antibacteriene

Seruri antivirale
exemplu: serul antirabic n cazul utilizrii serurilor imune, se instaleaz imediat dup administrare o imunitate pasiv, care persist un timp scurt. La noi se folosesc serurile: antidifteric, antitetanic, antibotulinic, antigangrenos polivalent i antirabic. Serurile trebuie pstrate la temperaturi sczute (4 C) i la ntuneric. nainte de administrare, fiolele se verific privind termenul de valabilitate i lipsa impuritilor.

419

CAPITOLUL 53 MECANISMELE CITOTOXICITII

Mecanismele citotoxice sunt mecanismele de distrugere ale celulei int, realizate prin: limfocitele T citotoxice - CD8, sub restricia CMH. citotoxicitate mediat celular anticorpo-dependent (ADCC), produs prin celulele K (Killer) n prezena anticorpilor specifici. citotoxicitate prin aciunea anticorpilor specifici i a sistemului complement (prin complexe imune). citotoxicitate mediat prin celulele NK (natural Killer), fr restricie CMH. citotoxicitate mediat prin enzime lizozomale, eliberate de la nivelul PMN i macrofagelor.

MECANISME MOLECULARE
n urma contactului dintre celula citotoxic i celula int, sunt eliberate substane denumite citotoxine, molecule care realizeaz microcanalicule membranare n membrana intei i fragmentarea nucleului acesteia. Leziunile membranare sunt tubulare, cu dimensiuni de 5-20 nm. Substanele citotoxice sunt serinesteraze i se numesc perforine i granzime. Pentru formarea unui por membranar, sunt necesare 3-4 molecule de perforine. Polimerizarea monomerilor perforinei se realizeaz n prezena Ca2+; apoi perforinele sufer modificri conformaionale care duc la polimerizarea lor n dublul fluid fosfolipidic membranar, cu formarea unor canalicule, prin distorsionarea structurii membranei. Sistemul C realizeaz distrucia celulei int prin formare de pori membranari, dup formarea complexului de atac membranar (proteine polimerizate). Perforinele (citolizinele) sunt foarte asemntoare componentei C9 a C. Celula uciga (citotoxic) este protejat de efectul distrugtor al perforinelor, prin intermediul protectinelor, care inactiveaz perforinele active, fcnd imposibil ptrunderea acestora n straturile fosfolipidice. Perforinele deschid calea granzimelor, care i exercit efectul distructiv n celulele int, prin porii formai.

420

Liza celulei int genereaz apoptoza (apo = separare, ptosis = cdere), cu contracia celulei int, dilatarea reticulului endoplasmatic i modificri nucleare (agregate cromatiniene). Din fragmentarea celular rezult corpi apoptotici care vor suferi un fenomen distructiv secundar, cu moartea celulei. Ulterior, corpii apoptotici sunt fagocitai de ctre MF. Alte ipoteze afirm rolul redus al citotoxinelor i rolul considerabil al unui fenomen de autoliz intern. Moartea celular programat (fiziologic) este controlat genetic i poate include noiunea de moarte apoptotic (din care lipsesc unele etape - ex.: fragmentarea nucleului). Expunerea la substane care lizeaz acizii nucleici, privarea de factori de cretere, infecia cu anumite virusuri, induc moartea celular. Un posibil mecanism este reprezentat de ctre activarea proteazelor celulare prin protein - kinaze, sub aciunea Ca2+. Activarea endonucleazelor fragmenteaz cromatina, favoriznd apoptoza. n 1993 a fost demonstrat proteoliza intracelular prin convertaza IL1 - i proteazele nrudite. IL1 activeaz prin proteoliz unele enzime precursor, care determin modificrile morfofuncionale ale morii celulare programate. Al doilea mecanism de aciune al IL1 - presupune activarea proteolitic a unor factori de reglare care induc transcripia unor gene cu rol n apoptoz. Mecanisme apoptotice aberante pot fi activate la pacieni HIV +, cu inducerea morii limfocitelor TH, mai sensibile la semnale apoptotice. Clonele self autoreactive se ndeprteaz, probabil, din organism prin semnale apoptotice. Corpii apoptotici nefagocitai ar putea produce alterri ale esuturilor n care apar i autoanticorpi (anti - ADN), oferind nc o ipotez a originii bolilor autoimune. O alt explicaie a morii celulare programate o constituie ceramidele derivate din sfingomielina membranar: iniiaz direct moartea celular, prin stimularea unor mecanisme proapoptotice, fie inhib mecanismele anti apoptotice existente. Ceramidele inhib transcripia mARN n circa 4-6 ore. Acumularea ceramidelor poate produce inversarea polaritii membranei, cu exprimarea pe faa extern a acesteia - a fosfatidil serinei. Este favorizat recunoaterea i procesul de fagocitare al celulelor apoptotice de ctre MF. Rolul granzimelor n apoptoz este insuficient elucidat. Granzimele ptrund n celul prin porii realizai de ctre perforine i acioneaz n prezena acestor substane. Pentru fragmentarea ADN, concentraiile de granzime necesare sunt foarte reduse, aproximativ 10 -7 M. Pe lng funciile citotoxice, granzimelor li s-au atribuit roluri n extravazarea, migrarea i diferenierea limfocitelor T; granzimele inhib dezvoltarea tumorilor, prin blocarea aderenei la substrat. 421

Exist mai multe tipuri de granzime, notate A, B, C, D, E, F, G, H, Triptaza - 2, Met - aza 1. Acestea produc leziuni la nivelul membranei nucleare i la nivelul nucleului, clivnd diverse situsuri: Arg/ Lys, Asp/ Glu, Phe/ Leu, Met/ Leu etc. Greutatea molecular a granzimelor este cuprins ntre 27 - 33 k. Granzima B este unica serin - proteaz al crei situs de clivare este situat n apropierea unui reziduu acid; activarea IL 1 este dependent de aceast granzim, foarte abundent n granulaiile citotoxice. Efectul distructiv al granzimei B asupra cromatinei se realizeaz prin intermediul ADN - azei I i prin kinaza p34 cdc2. Activarea aberant a kinazei poate induce fenomenul apoptotic. Proteina antiapoptotic cea mai studiat este proteina Bcl-2, de 26 k, prezent n membrana mitocondrial extern, reticulul endoplasmic neted i n membrana nuclear. Prin localizarea pe endomembranele celulare, Bcl-2 inhib peroxidarea membranelor i eliberarea radicalilor activi ai oxigenului. Proteina Bcl-2 inhib funcia proteinei p53, protein care poate declana apoptoza (n anumite situaii), nainte de faza S a ciclului celular. Alte substane antiapoptotice sunt vitronectina i fibronectina. Unele virusuri cu ADN posed mecanisme de anihilare ale granzimelor prin serpine (cu aciune anti serin - proteaz). Alte virusuri (probabil cu ARN) pot sintetiza proteine Bcl-2 - like sau blocheaz influxul Ca2+ intracelular. Modularea efectului substanelor antiapoptotice ar putea avea aplicaii n transplantul de organe.

CLASIFICARE FUNCIE DE CELULA EFECTOARE Mecanismele citotoxicitii mediate prin celulele Tc

Dup recunoaterea imunologic a celulei int, are loc aderarea limfocitelor Tc (CD8), n prezena Mg2+. Faza de programare pentru liz, denumit i srutul morii necesit aproximativ 10 minute, prezena Ca2+ i o temperatur optim de 37o C. Apar primele leziuni la nivelul membranei celulei int. Faza de liz se caracterizeaz prin pierdere de metabolii i macromolecule, consecutiv leziunilor membranare. Celulele Tc se desprind apoi de celula lizat i pot relua aceast lovitur letal de trei sau ase ori. Celulele T c (CD8+) au rol esenial n aprarea antiviral i n respingerea grefelor incompatibile.

Citotoxicitatea mediat prin macrofage

422

Este mai lent dect cea produs prin limfocite T c (dup aproximativ 24 de ore). Celulele atacate preferenial sunt celulele tumorale i celulele bacteriene cu parazitism intracelular (Mycobacterium, Brucella, Ricketsia etc.) Citotoxicitatea are specificitate mai restrns, putnd fi distruse i hematii sau celulele unor esuturi.

Citoliza mediat de granulocite

Granulocitele PMN fagociteaz i distrug n special microorganisme piogene. Eozinofilele particip la anumite reacii de hipersensibilitate de tip imediat i realizeaz un efect antiparazitar. Granulocitele posed receptori pentru Fc -ul imunoglobulinelor i pentru C3 a sistemului C i pot realiza citotoxicitate Ac dependent.

Celulele NK
Reprezint aprox. 5 % din totalul celulelor mononucleare. Sunt mai frecvente n splin i mai puin prezente n ganglionii limfatici. Sunt neaderente, nefagocitare, nu sunt supuse restriciei CMH i nu au memorie imunologic. Aciunea celulelor NK este potenat prin interferoni. Gradul de activitate citotoxic a acestor celule este evideniat in vitro prin capacitatea celulelor NK de a liza celulele marcate cu izotopi radioactivi. Dup recunoaterea i formarea de contacte cu celula int, are loc programarea pentru liz i apoi liza propriu-zis. Celulele NK purificate secret factori solubili citotoxici, care produc o liz mai lent (aprox. 18 ore). Activitatea celulelor NK scade proporional cu vrsta subiectului, fapt care ar putea explica frecvena crescut a tumorilor la vrstnici. Activitatea citotoxic este potenat prin interferoni. Aceste substane mresc numrul celulelor NK legate de celulele int i cresc capacitatea litic a celor deja legate. Sunt active toate speciile de interferoni (, i ). De asemenea, citoliza prin celule NK este potenat prin IL2. Probabil, efectul stimulator al IL2 se manifest prin creterea sintezei de INF. Principala activitate a celulelor NK se refer la controlul apariiei metastazelor tumorilor (rol antitumoral). Celulele NK au i activitate antiviral, dar i antifungic i antiparazitar. Au rol n respingerea grefelor i n reglarea hematopoezei normale. Proprietile lor imunoreglatoare se refer la reglarea anticorpogenezei, reglarea activitii celulelor Ts i a imunitii mediate celular.

Citotoxicitatea prin celule killer

423

Celulele K produc citotoxicitate dependent de anticorpi, cu specificitate imunologic. Acioneaz doar asupra celulelor int acoperite cu anticorpi specifici i produc citotoxicitate n absena C; sunt neaderente, nefagocitare, nu produc rozetarea hematiilor. Liza se realizeaz prin legarea IgG de celula int, fragmentul F c al IgG fiind fixat pe celula K. Cantitatea de anticorpi specifici implicai n acest proces este mai mic dect cea necesar fixrii sistemului complement. n cazul celulelor K, imunoglobulinele servesc ca i o punte de legtur cu celula int. Mecanismele moleculare ale citotoxicitii sunt foarte asemntoare limfocitelor Tc. S-a observat faptul c celulele NK i K au foarte multe caracteristici comune; ar putea fi un singur tip de celule efectoare, care ar putea aciona citotoxic direct (NK) i indirect prin IgG (celule K).

Citotoxicitatea natural indus de limfokine

Realizat de ctre celulele LAK- Lymphokine Activated Killers Cells, produc i liza celulelor int rezistente la activitatea celulelor NK. Studii ulterioare au artat ns c celulele LAK nu reprezint un grup aparte de celule efectoare, ci reprezint celule NK cu activitate imunologic potenat prin IL2. Fenomenul de citotoxicitate face parte din funcia de supraveghere imunologic, liznd celule non-self (tumorale, celule infectate cu diveri ageni etiologici, celule self alterate sau mbtrnite).
Fig. nr. 49 - Mecanisme citotoxice (dup Zarnea, 1991)

424

IMUNITATEA ANTITUMORAL
Rspunsul imun specific are un rol major n controlul difuzibilitii i proliferrii tumorilor, n special prin mecanismele citotoxicitii (celule NK, celule K, macrofage, limfocite T citotoxice), aciunea sistemului complement i prin unele interleukine (factorul necrozant tumoral - TNF, IL2, interferoni). Similitudinea mecanismelor de aprare imunologic antiviral i antitumoral ntresc ideea c majoritatea tumorilor prezint o etiologie viral. Virusurile oncogene se pot integra ca i provirus n genomul celulei infectate, constituind primul semnal al oncogenezei. Descoperirea genelor oncogene a fost demonstrat prin transformarea neoplazic in vitro a unor celule normale. S-a constatat apoi faptul c i celulele indemne conin secvene genice omoloage oncogenelor, denumite protooncogene, care codific sinteza unor proteine implicate n reglarea multiplicrii celulelor normale. Duplicaia genic (gen protooncogen i gen oncogen viral) ar putea amorsa o capacitate proliferativ celular anormal, care s iniieze dezvoltarea tumorii. Conform teoriei supravegherii imune, se presupune c prin mecanismele imunologice normale se pot ndeprta aproximativ 103 celule transformate neoplazic, cu antigene tumorale de suprafa variate: TTSA - antigene tumorale specifice de transplantare, TSA - antigene tumorale specifice, TATA antigene asociate antigenelor TTSA, antigene oncofetale). Antigenele TTSA induc proliferarea limfocitelor T citotoxice n mod preferenial. n aproximativ 38% dintre tumorile spontane la om, infiltrarea lor cu limfocite Tc variaz ntre 18% i 87% (Olinescu). Experimental limfocitele Tc ar fi mai eficiente n regresia tumorilor induse viral, care sunt puternic imunogene i ar putea avea un rol redus n tumorile spontane, care sunt slab imunogene. Rspunsul imun antitumoral n anticorpi specifici este foarte slab (infiltraia tumorilor cu limfocite B nu depete 1% conform experimentului discutat anterior). Anticorpii specifici determin liza celular mediat prin complement, citotoxicitate ADCC i promoveaz fenomenele fagocitare ca opsonine specifice.

425

Macrofagele activate prezint activitate tumoricid ntr-un raport optim 1:1 - celul tumoral : macrofag. n afara efectului citotoxic direct, macrofagele se constituie n celule prezentatoare de antigen i n celule secretoare de citokine antitumorale. Rolul major n aprarea antitumoral l dein celulele NK, care realizeaz citotoxicitate independent de CMH. Celulele LAK prezint un potenial antitumoral exacerbat, prin intervenia stimulatoare a IL2 i INF. Celulele NK scad progresiv cu vrsta subiectului, fapt care explic frecvena crescut de apariie a diverselor tumori la vrstnici. TNF are aciune antitumoral similar INF. Activitatea TNF nu are specificitate de specie i presupune activarea endonucleazelor cu fragmentarea ADN-ului celulei int i activarea enzimelor lizozomale ale celulelor efectoare.

Imunoterapia antitumoral
Imunotoxinele sunt molecule imunoglobulinice IgG (anticorpi monoclonali) cuplai cu diferii ageni citotoxici, foarte selectivi: izotopi radioactivi, chimioterapice antitumorale, toxine (vezi tabelul nr. 26). AMC cu specificitate dubl (AMC bifuncionali) se obin prin metode fizico-chimice i de inginerie genetic, prin asocierea unor jumti de molecule imunoglobulinice cu specificitate distinct.
Tabelul nr. 30 - Imunotoxine (dup Misfeldt)

426

IMUNOTOXINA

TUMORA Limfoame celule B AMC Limfoame celule T AMC anti CD5 - Ricin A Limfoame AMC anti CD22 - Ricin A celule AMC cuplai cu AMC anti CD19 - Ricin A Limfoame toxine celule Limfoame celule B AMC cuplai cu AMC - Chlorambucil Melanom citostatice antimelanom 211 Bismut - anti Th1 Celule AMC cuplai cu transformate izotopi radioactivi tumoral AMC anti CD3 i anti Sarcom TAA Melanom AMC cu AMC anti CD3 i anti specificitate dubl hormon stimulator melanoci-tar

EXEMPLE Anti-Ig idiotip Anti-receptor pt. IL2

cu cu cu T cu B cu

Descoperirea AMC bifuncionali constituie baza viitorului tratament antitumoral, mult mai eficient dect experimentele anterioare: terapia cu TNF este marcat de efecte adverse precum endocardita necrozant sau reacii de hipersensibilitate; terapia cu INF este limitat prin toxicitatea medular a acestuia iar terapia cu celule LAK proprii pacientului este eficient numai mpotriva tumorilor cu antigene specifice puternic imunogene. Imunoprofilaxia antitumoral este n curs de experimentare i vizeaz tehnici ADN recombinant pentru sinteza antigenelor tumorale specifice i nu n ultimul rnd - vaccinuri antivirale orientate mpotriva virusurilor cu potenial oncogen.

427

CAPITOLUL 54 IMUNITATE ANTIBACTERIAN, ANTIVIRAL, ANTIMICOTIC, ANTIPARAZITAR

IMUNITATEA ANTIBACTERIAN
Aprarea imun se realizeaz att prin mijloace nespecifice, ct i specifice. Rezistena natural, (prin barierele cutaneo-mucoase i prin factorii cunoscui) - se opune ptrunderii agenilor patogeni. Cea mai mare parte a bacteriilor patogene este eliminat de la poarta de intrare prin mecanisme nespecifice: lizozim, proteina C reactiv, fagocitoza, inflamaia. Rspunsul imun umoral specific este declanat de ctre bacterii cu dezvoltare extracelular i de ctre exotoxinele bacteriene. Bacteriile care au aderat la nivelul mucoaselor (bronhice i digestive) sunt nlturate prin IgAs. Opsonizarea este un proces obligatoriu pentru iniierea rspunsului imun antibacterian prin sistemul mononuclear macrofagic. IgG i IgM sunt opsonine specifice, neutraliznd i unii factori antifagocitari ai unor bacterii (polizaharide capsulare, proteina M, antigenele O etc.). Anticorpii IgM produc aglutinarea unor bacterii (mpiedicnd penetrarea) sau produc liza acestora prin activarea sistemului complement. Neutralizarea toxinelor bacteriene se realizeaz prin anticorpi neutralizani, protectori (anticorpi antidifterici, antitetanos, antieritrotoxin streptococic etc.). Rspunsul imun celular este orientat n special mpotriva bacteriilor cu multiplicare intracelular (Mycobacterium, Brucella, Lysteria etc.). Aceste bacterii sunt fagocitate de ctre PMN i macrofage, dar sunt foarte greu de distrus, din cauza factorilor lor de patogenitate. Macrofagul poate fi activat n vederea creterii puterii fagocitare, prin intermediul MAF (Factor de activare al macrofagelor). Macrofagele infectate sunt distruse prin limfocitele T citotoxice, cu funcia citocid potenat prin IL2.

428

IMUNITATEA N VIROZE Imunitatea n viroze acute

Rspunsul imun limiteaz replicarea viral i diseminarea virusurilor. Anticorpii neutralizeaz diverse structuri virale sau efectul citopat tisular, n timp ce IMC acioneaz asupra celulei int infectat cu virus. n infeciile virale generalizate, intensitatea rspunsului imun este mare, deoarece antigenele respective ajung mai repede la nivelul organelor limfoide; se sintetizeaz cantiti mari de anticorpi de tip IgM i IgG, care neutralizeaz infectivitatea viral. n infeciile virale localizate la nivelul mucoaselor este indus sinteza local de anticorpi de tip IgAs. Ac neutralizani fac parte din clasele IgM, IgG, IgA. Dozele mici de antigene virale induc sintez de IgM (de durat scurt), iar dozele mari de antigen viral induc sinteze crescute de IgM i IgG. Virusurile nvelite pot fi distruse prin aciunea sistemului complement. Rspunsul antiviral mediat celular se realizeaz prin intermediul limfocitelor T citotoxice, cu activitate potenat prin limfocitele T helper. Limfocitele Tc sunt mai eficiente n controlul diseminrii virusurilor, iar celulele NK i celulele Killer protejeaz organismul fa de reinfecie. Interferonii au aciune antiviral nespecific; ating titrul cel mai nalt n organismul infectat la circa 12 - 48 ore dup stimularea antigenic. Se previne astfel rembolnvirea cu un alt virus timp de dou pn la ase sptmni. De aici utilitatea interferonului n profilaxie i terapie.

Imunitatea n viroze persistente

Infeciile virale persistente au evoluie ncetinit, att n incubaie, ct i n cursul bolii clinic manifeste. Aceast incubaie prelungit se poate explica prin existena strii de provirus (genom viral integrat n genomul celulei gazd). Persistena infeciei se datoreaz ineficienei mecanismelor imunologice de aprare specific ale gazdei. Encefalitele spongioase, cu ageni etiologici precum viroizii sau prionii, nu induc rspuns imun. Greutatea lor moleculara sub 10.000 le confer o imunogenicitate extrem de sczut iar reaciile imunologice nu prezint intensitatea necesar eliminrii virusului.

429

n infeciile persistente este posibil nlocuirea virusurilor virulente cu particule virale defective, ca fenomen al autointerferenei. n infeciile latente, virusurile se pot cantona n structuri protejate fa de reacia imun (ex. v. herpetice la nivel neuronal, v. Epstein Barr la nivelul limfocitelor B). Alterrile rspunsului imun pot fi considerabile prin distrucia limfocitelor TCD4, realizat de ctre virusul imunodeficienei umane (prbuirea imunitii mediate celular). Alteori, reacia IMC este insuficient prin prezena anticorpilor blocani, care mpiedic limfocitele T citotoxice s acioneze asupra celulelor infectate cu virus. Multiplicarea virusului HIV n monocite explic de asemenea o IMC ineficient. Un tip particular de infecii cronice l constituie cele produse de Oncornavirinae, cu o evoluie particular a infeciei - oncogeneza viral, cu origine n fenomenul de supresie imunitar.

IMUNITATEA N MICOZE
Aprarea antifungic se realizeaz prin mecanisme nespecifice i specifice. Mecanismele IMC reprezint rolul esenial, prin granulocite neutrofile, macrofage i celule NK. Polimorfonuclearele neutrofile realizeaz aprarea imunitar fa de specii precum Candida i Aspergillus. Celulele NK ofer o protecie foarte eficient mpotriva genului Candida, dar i asupra altor genuri de fungi (ex.: Criptococcus). Macrofagele acioneaz antifungic prin mecanisme citotoxice, efectul lor fiind potenat prin MAF, IL3 i INF. n micozele localizate superficial (ex.: dermatomicoze), rspunsul imun este foarte slab i infecia are mare risc de cronicizare. n micozele profunde, mecanismele imune sunt de tip hipersensibilitate tardiv, cu leziuni de tip granulomatos nodular. Deficitele imune celulare favorizeaz diseminarea fungilor n organism, cu apariia micozelor sistemice. Spre exemplu, Candida albicans poate activa limfocitele T supresoare CD8+, care agraveaz imunosupresia. Micozele apar n mod preferenial la subieci cu deficit imunologic timodependent.

IMUNITATEA N PARAZITOZE

430

Organismul gazd dezvolt un rspuns imun antiparazitar mixt mediat celular i mediat umoral. n infecii cu parazii localizai intracelular imunitatea celular confer rezisten fa de infecie. Eficiena reaciilor imunologice este extrem de divers din cauza antigenelor parazitare foarte variate, funcie de stadiul de dezvoltare al parazitului i funcie de localizrile acestuia. Paraziii se protejeaz mai bine fa de mecanismele imunologice ale gazdei, prin agresine: nchistarea parazitului n diverse structuri sau localizarea n sistemul nervos, blocheaz accesul efectorilor sistemului imunitar. Variabilitatea antigenic parazitar este foarte mare, fapt care suprasolicit mecanismele imunitare. Paraziii elimin factori imunosupresori: substane limfocitotoxice sau substane cu rol n clivarea imunoglobulinelor; Toxoplasma gondii se poate multiplica n macrofag. Anticorpii antiparazitari sunt mai puin protectori, chiar dac se produc la titruri nalte; majoritatea anticorpilor sunt utili n serodiagnostic. Mecanismele IMC reduc diseminarea parazitar prin limfocitele T activate specific i prin macrofagele activate. Limfadenopatiile apar constant n infeciile parazitare, ca reacie la persistena stimulrii Ag. Granulocitele eozinofile au efecte majore n infeciile helmintice. IL5 stimuleaz eozinofilopoeza. Limfocitele T activate stimuleaz producia de IgE, cu rol antiparazitar. IgE activeaz mastocitele care vor produce factor chemiotactic pentru eozinofile, histamin, serotonin, heparin i alte substane vasoactive. Limfocitele T helper activeaz rspunsul imun al altor clone de limfocite B, pentru producerea anticorpilor specifici mpotriva unor antigene parazitare. Aceti anticorpi intervin n cadrul reaciei de citotoxicitate celular anticorpo-dependent, ADCC. Anticorpii antiparazitari specifici pot bloca situsurile de ataare ale paraziilor pe celulele gazdei sau pot avea rol de opsonine specifice, pentru stimularea fagocitozei. Eficiena acestor anticorpi este foarte sczut n infeciile cu protozoare patogene care colonizeaz intestinul. Rspunsul imun umoral este ns foarte puternic atunci cnd agentul parazitar se cantoneaz la nivelul esuturilor (parazit extracelular). Titrul crescut de anticorpi nu are specificitate foarte nalt, ci mai degrab imunoglobulinele sunt policlonale. Helminii pot declana fenomene de hipersensibilitate imediat i tardiv. Aceast particularitate imunologic poate fi folosit i n scop diagnostic. Astfel, se utilizeaz teste cutanate pentru diagnosticul echinococozei, ascaridiozei, trichinelozei, strongiloidozei etc. 431

Progresele biologiei moleculare au diversificat spectrul vaccinurilor antiparazitare, totui mai restrns dect cel al vaccinurilor antibacteriene sau antivirale.

432

CAPITOLUL 55 IMUNOPATOLOGIE
REACII DE HIPERSENSIBILITATE
Reacii imune exacerbate, denumite i alergii (allos - gr., nseamn altfel) definesc stri de hipersensibilitate imunologic. Dup clasificarea cercettorilor P. G. Gell i Coombs, exist patru tipuri de reacii, primele trei de tip imediat (mediate de anticorpi) i ultima de tip ntrziat, tardiv- mediat prin limfocit T i macrofag. Hipersensibilitatea imediat de tip I, anafilactic. Hipersensibilitatea imediat de tip II, citotoxic. Hipersensibilitatea de tip III, mediat prin complexe imune. Hipersensibilitatea de tip IV, tardiv, de tip tuberculinic.

Hipersensibilitatea imediat de tip I

Este o stare de activitate exagerat fa de un antigen (alergen), care poate s apar la orice membru al unei specii (anafilaxie) sau numai la anumii indivizi predispui, hiperreactivi (atopie). Acest tip de reacie este provocat de ctre anticorpii din clasa IgE, denumii i reagine. Acestea se fixeaz imediat pe mastocite i bazofile, dup stimulul antigenic. La repetarea acestui stimul se va declana degranularea mastocitelor i bazofilelor, cu eliminarea aminelor vasoactive: histamina, bradikinina, factori chemotactici, leucotriene, cu fenomene clinice locale (urticarie, eczeme, astm bronic, rinit) sau generale (oc anafilactic). Acest tip de oc se caracterizeaz prin prbuirea tensiunii arteriale (prin vasodilataie), spasm bronic sau glotic i moarte. Subiecii atopici prezint un nivel seric al IgE mai mare dect normalul i receptori specifici pentru IgE la nivelul mastocitelor i bazofilelor n cantiti de 5-10 ori mai mari. Dei acest tip de hipersensibilitate prezint mari dezavantaje, ar prezenta totui un efect favorabil n infeciile parazitare (IgE prezint un cert rol antiparazitar). Activarea strii de hipersensibilitate reaginic se realizeaz prin antigene bivalente sau multivalente care se fixeaz la nivelul IgE. Se formeaz grmezi de IgE, legate de receptori, la un pol al celulei, aceasta fiind prima etap a activrii mastocitelor.

433

Alte mecanisme de activare presupun intervenia anticorpilor antiidiotipici anti-epitopi Fab a IgE sau a lectinelor (fitohemaglutinina, concavalina A), care se fixeaz de componentele glucidice ale F c ale IgE. (Se explic alergia la unele fructe). Alergenele sunt foarte variate, marea majoritate neinfecioase (ex.: polen, praf de cas, dejecii de acarieni, proteine din lapte, ou, antibiotice, anestezice, scuame cutanate, veninul viespilor, fragi, cpuni, conservani alimentari, substane cosmetice). Detectarea acestui tip de hipersensibilitate se realizeaz prin: *0 reacia Prausnitz - Knster (la om) *1 testul de anafilaxie pasiv cutanat (la animale) *2 testul radioalergosorbent La subiecii predispui se realizeaz desensibilizri repetate (cu scop terapeutic, utiliznd doze mici de alergen).

434

Fig. nr. 50 - Sindromul alergic (dup Vaida)

Alergen Activare celular - monocite - limfocit TH - mastocite - bazofile Mediatori vasoactivi Histamina- Vasodilataie, edem - Contracia muchilor netezi (bronhospasm) - Hipersecreie de mucus - Sintez de prostaglandine Adenozina - Vasodilataia coronarelor - Contracia muchilor netezi Proteaze - Inflamaie - Activarea kininelor - Sinteza de angiotensine PAF - Agregare trombocitar (eliberare de tromboxan i serotonin) - Recrutare eozinofile i PMN - Edem - Hipersecreie de mucus Protaglandine - Bronhospasm - Migrare PMN Leucotriene - Spasm, edem - Scderea funciei cardiace - Activitate chemiotactic etc. fixare IgE Factori chemotactici

Infiltraie celular (Neutrofile, Eozinofile, Bazofile)

Mediatori ai inflamaiei

Hipersensibilitatea de tip II, citotoxic

Acest tip de reacie se produce fa de antigene prezente pe suprafaa unor celule proprii organismului, prin: *3 liza celular declanat prin sistemul complement activat *4 opsonizare i fagocitoz *5 citotoxicitate anticorpodependent Activarea sistemului complement are loc n urma combinrii anticorpilor IgG sau IgM cu antigenele de pe suprafaa celulei int. Complexul de atac membranar C5b6789 va determina citoliza. 435

Datorit formrii complexelor antigen - anticorp, celulele int opsonizate pot fi fagocitate. n situaia compuilor cu molecul prea mare, care nu pot fi nglobai, se produce fenomenul fagocitozei frustrate, cu expulzarea coninutului granulaiilor lizozomale n mediul extern, cu apariia leziunilor tisulare. Activarea funciei celulelor ADCC determin liza celulelor int. Moleculele de IgG realizeaz o punte ntre celula int i celulele efectoare, prin legarea de antigen prin fragmentul Fab i prin legarea F C de celula killer. Sindroamele clinice caracteristice sunt: *6hemoliza posttransfuzional (dup transfuzie cu snge incompatibil) *7anemia hemolitic autoimun (autoanticorpi antihematii) *8sindromul Goodpasture (autoanticorpi antimembran bazal a rinichiului sau anticelul pulmonar) *9boala hemolitic a nou nscutului (prin incompatibilitate de Rh) *10 trombocitopenii autoimune (autoanticorpi antitrombocitari) *11 sterilitate prin anticorpi antispermatozoizi *12 reacii alergice medicamentoase (medicamentele administrate mai ales parenteral pot forma conjugate de tipul hapten - purttor, care pot deveni imunogene i pot produce autoanticorpi).

Hipersensibilitatea de tip III, prin complexe imune (sau Reacia de tip Arthus)
Organismul uman poate fi uneori expus la un exces de antigene (infecii persistente, contact repetat cu alergeni externi n cantiti mari). Excesul de complexe imune produs n organism atrage depunerea acestor complexe n anumite regiuni ale acestuia, cu apariia unor reacii lezionale.

436

Fixarea complexelor imune circulante la nivelul peretelui capilar sau n anumite esuturi, activeaz trombocitele i bazofilele, care vor elibera amine vasoactive, care vor provoca accentuarea permeabilitii vasculare direct proporional cu fixarea de noi complexe imune. Factorii chemiotactici vor atrage n focar PMN, care prin enzime lizozomale produc leziuni. Sistemul complement este activat concomitent cu accentuarea leziunilor respective pn la apariia necrozei. Aceste distrucii devin evidente la 3-6 ore de la contactul cu antigenul, de unde i denumirea de hipersensibilitate de tip intermediar. Anticorpii efectori ai acestui tip de reacie sunt anticorpii IgG sau IgM necitofilici. Acetia sunt circulani, precipit antigenul. Eliminarea lor din circulaie devine foarte dificil la titruri imunoglobulinice mari. Depunerea complexului antigen anticorp este apoi inevitabil, cu apariia leziunilor al cror mecanism a fost precizat. Locurile de elecie pentru depozitarea complexelor imune sunt rinichii, articulaiile i jonciunile derm-epiderm. Boala serului apare ca i o complicaie a seroterapiei, cu apariia unor nefrite sau artrite. Fenomenul Arthus este un exemplu de patologie local, mediat prin complexe imune. Fenomenul a fost demonstrat experimental n anul 1903, prin injectri repetate la iepure a unor antigene solubile. S-a observat faptul c leziunile au aprut la locul de administrare al antigenului, cu leziuni arteriolare, microtrombi n vasele mici, cu consecine ischemice. De fapt, afeciunea este o vasculit acut, n prezena unui titru crescut de anticorpi precipitani IgG. Clinic, un astfel de fenomen se observ la diabeticii sensibilizai la insulin. n lupusul eritematos sistemic, producerea de autoanticorpi se poate declana fa de autoantigene native sau alterate (nucleoproteine, histone, ADN), cu apariia leziunilor cutanate (purpure buloase sau ulcerative), sinoviale sau viscerale (hepatita sau nefrita prin complexe imune). n poliartrita reumatoid, antigenul este o molecul imunoglobulinic, iar anticorpul este factorul reumatoid (IgM sau IgG anti Ig proprie). Procesul inflamator are loc la nivelul articulaiilor, ducnd la deformare i anchilozare. Lista bolilor produse prin complexe imun este foarte lung, dar amintim: fibroza chistic, nefropatia malaric, tiroidita Hashimoto, scleroza multipl, miastenia gravis, sarcoidoza, boala plmnului de fermier (antigenul este reprezentat de ctre Micropolyspora faeni), bagasoza (inhalarea prafului de trestie de zahr), reumatismul articular acut i glomerulonefrita poststreptococic etc.

437

Hipersensibilitatea de tip ntrziat, de tip IV, de tip tuberculinic

n acest tip de hipersensibilitate fenomenele apar tardiv, dup 24-72 ore sau chiar 10-20 zile de la contactul cu antigenul, fenomenele fiind locale. Limfocite TDH (DH = delayed hipersensitivity), sensibilizate de ctre un antigen, la un nou contact cu acesta, vor elabora limfokine, care vor atrage n focarul inflamator diverse celule mononucleare, mai ales macrofage. De subliniat faptul c aceast form de hipersensibilitate este mediat celular. Fenomenul poate fi indus de ctre bacterii cu parazitism celular: Mycobacterium, Brucella, Listeria, Salmonella, Treponema, de ctre fungi patogeni sau de ctre parazii: Leishmania, Toxoplasma, Schistosoma, Plasmodium etc., dar i de antigenele celulare non-self ale grefelor, tumorilor sau ale virusurilor. Exist mai multe tipuri de hipersensibilitate de tip tardiv: *13 Hipersensibilitatea de tip tuberculinic Const ntr-o reacie inflamatorie la locul de inoculare al tuberculinei, care apare cu intensitate maxim la 24 - 48 de ore, la un subiect care are imunitate fa de bacilul tuberculos n urma infeciei sau dup vaccinarea BCG. Local apare un nodul indurat, provocat prin infiltraiile cu celule mononucleare. Dup aprox. 72 de ore, reacia diminu, dar uneori poate persista ca i reacie de tip granulomatos. Prin intradermoreacia la tuberculin sau PPD, prin tehnica Mantoux, se depisteaz persoanele bolnave de tuberculoz. Acest tip de reacii apar i n bruceloz, morv (Maleomyces malei), schistosomiaz, histoplasmoz etc. *14 Hipersensibilitatea de tip granulomatos Apare n urma persistenei agentului infecios n interiorul macrofagelor, din cauza imposibilitii acestora de a-l distruge. n granulom, macrofagele sunt situate central, nconjurate de limfocite i fibroblaste. Macrofagele pot fuziona cu fibroblastele, genernd celule gigant, multinucleate. Exist o hipersecreie de limfokine, cu rol de mesageri intracelulari, principala celul secretoare fiind Lf T DH (delayed hipersensitivity). Exemple din patologie: boala Crohn, granulomul lepros sau tuberculos.
Tabelul nr. 31 - Limfokine implicate n reacia de HT tip IV.

438

Limfokina Mecanisme de aciune MIF Factorul de inhibare al migrrii macrofagelor (imobilizeaz macrofagele la locul reaciei respective) MAF Factorul de activare al macrofagului - i poteneaz acestuia capacitatea fagocitar i distructiv, prin creterea secreiei de enzime lizozomale MF Factor mitogenic Activeaz macrofagul, formarea celulelor gigante INF

439

IL2

Stimuleaz proliferarea limfocitelor T

*15

Hipersensibilitatea de contact Acest tip de reacie este provocat de ctre haptene care se combin cu proteine ale organismului i care sensibilizeaz limfocitele T, prin intermediul celulelor Langerhans din epiderm. Reacia const ntr-un infiltrat cu celule mononucleare care apare la 24 - 72 ore de la aplicarea epidermic a haptenelor. Expresia clinic a acestei reacii const n dermatita de contact, provocat de metale (nichel, cobalt), cauciuc, materiale plastice, cosmetice, medicamente. *16 Hipersensibilitatea cutanat bazofilic (reaciile Jones - Mote) Apare la 24 de ore de la contactul cu antigenul, infiltratul predominnd n bazofile, reglarea realiznd-o limfocitele T supresoare. Aplicaiile practice ale reaciilor de hipersensibilitate de tip IV: *17 Evaluarea gradului de rezisten al organismului fa de anumite infecii: tuberculoz, bruceloz, lues etc. *18 Evaluarea rspunsului imun celular antitumoral. *19 Precizarea compatibilitii donatorului cu cea a receptorului de transplant. *20 Testarea sensibilitii pielii fa de anumite alergene (praf de cas, polen, compui organici etc.).

IMUNODEFICIENE
Deficitele imune pot fi clasificate n: afeciuni de tip primar (congenitale, cu determinism genetic) i imunodeficiene secundare (ctigate). n aceste situaii se remarc o susceptibilitate crescut fa de infecii, cu ageni etiologici variai. Imunodeficienele primare pot afecta global imunitatea (IU + IMC) sau o pot afecta parial IU sau IMC). Aceste deficite imunitare au fost grupate n 4 categorii: deficitele imunitii umorale (ale limfocitelor B) deficitele imunitii celulare (ale limfocitelor T) deficitele sistemului complement deficitele sistemului fagocitar Exist i deficite imune mixte (ale limfocitelor T i B), la nivelul celulelor precursoare. Astfel de afeciuni nu sunt compatibile cu viaa (disgenezia reticular, agamaglobulinemia de tip elveian) Imunodeficienele primare ale limfocitelor B Hipogamaglobulinemia de tip Bruton 440

 boal genetic prezent la sexul masculin cu nivele sczute de IgG i IgA, cu imunitate celular normal; clinic - infecii piogene cu etiologii variate se poate trata cu gamaglobuline Deficienele imunologice selective Defecte genetice nelegate de sex Deficiene selective n IgM, IgG sau IgA Deficiena n IgG i IgA, cu IgM normal (este disgamaglobulinemia de tip I) Deficiena n IgM i IgA, cu IgG normal (tipul II de disgamaglobulinemie) Deficiena n IgG i IgM, cu IgA normal. Deficitele imune n IgG i/sau IgM se asociaz cu infecii grave. Imunodeficienele n IgA ar putea genera i boli autoimune, cum ar fi artritele reumatoide, colitele ulcerative, anemia hemolitic autoimun, astm bronic, alergii grave. La unii indivizi, deficitul selectiv n IgAs se poate corecta prin dimerizarea IgM, cu ataarea piesei J i a componentului secretor (rezult IgMs).

Imunodeficienele primare ale limfocitelor T

Principalele sindroame clinice sunt: Deficite predominante ale IMC Sindromul Di George Sindromul Wiscott - Aldrich Ataxia - teleangiectazia. Candidozele cronice cutaneo - mucoase. Deficite imunitare combinate. Deficitul n expresia moleculelor HLA de clasa a II-a Deficitele n proteinele de adeziune leucocitar Deficitul de activare al limfocitelor T Disgenezia reticular (alimfocitoza i agranulocitoza) Deficitul n precursorii limfocitelor T

Deficiene ale sistemului complement

Deficienele primare ale sistemului C' pot determina susceptibilitate crescut la infecii i boli autoimune prin complexe imune circulante. 441

Deficitele genetice n C1q, C2, C4, C3, C5, C8, C3b inactivator se nsoesc de infecii recurente, n special piogenice. Deficitele genetice n C1r, C1s, C5, C7, C8 se pot asocia i cu lupusul eritematos sistemic sau fenomenul Raynaud. Deficitul n C1INH (inactivatorul lui C1, factor de reglare al activitii sistemului complement) cauzeaz edemul angioneurotic ereditar. Aceti pacieni prezint o activare exagerat a cii clasice a sistemului complement, cu eliberarea fragmentelor vasoactive, care favorizeaz vasodilataia i edemul. n localizarea laringeal, moartea apare prin asfixie. Deficitul n C1INH se asociaz cu deficitele n C2 i C4. Deficienele n C2 sunt cele mai frecvente, dar aprox. 50% dintre acestea sunt asimptomatice, restul fiind colagenoze. Deficienele n C 3 i C5 se asociaz cu infecii bacteriene severe. Deficitele secundare ale sistemului C' n majoritatea bolilor infecioase, nivelul sistemului complement scade, probabil prin consum, prin fixare pe complexe imune sau prin rolul de mediator al rspunsului inflamator. Complexele imune induc scderea componentelor C1q, C2, C3, C4. Scderea factorului C3 sub 10% fa de normal reprezint o cauz favorizant a instalrii infeciilor cu piogeni (ex.: meningite i pneumonii pneumococice). Factorul nefritic, descris n 1969 de ctre Spizer, poteneaz clivarea fraciunii C 3, n prezena factorilor B i D ai cii alternative. Acest factor nefritic cauzeaz o glomerulonefrit acut postinfecioas sau se poate izola de la pacieni cu lupus eritematos sistemic. Hipocomplementia a mai fost observat i n endocardite bacteriene subacute, n mononucleoz infecioas, malarie sau n hepatita B; cauzele neinfecioase sunt: malnutriia, ciroza, ocul endotoxinic. Deficiene ale funciei fagocitare Deficienele fagocitozei intereseaz chemiotaxia, ingestia i activitatea microbicid. Deficienele chemiotaxiei se datoresc unor anormaliti celulare, fiind nsoite de tulburri ale producerii de factori chemiotactici. Sindroamele clinice se pot clasifica astfel: Anormaliti celulare primare Sindromul Chediak Higashi Deficiene ale glicoproteinelor membranare i ale asamblrii microtubulilor. Anormaliti celulare secundare Scderea chemiotaxiei cu creterea IgE Anormaliti asociate cu diabetul zaharat 442

Anormaliti asociate cu alte afeciuni Deficiene umorale Anormaliti n producerea factorilor chemiotactici Absena antagonitilor inhibitorilor chemiotactici Deficienele funcionale ale PMN (boala neutrofilelor lenee) se caracterizeaz prin mobilitate celular sczut nspre stimulii chemiotactici. Defectele funciei fagocitare se traduc prin scderea capacitii de distrugere a microorganismelor fagocitate. Absena NADH oxidazei din PMN, duce la incapacitatea acestora de a distruge bacteriile fagocitate. Funcionarea defectuoas a mecanismelor exploziei respiratorii, diminueaz efectele bactericide, cu apariia unor inflamaii cronice de tip granulomatos, care se pot complica prin abcese. Neutropenia i deficienele funcionale fagocitare se exprim clinic printr-o susceptibilitate crescut la infecii bacteriene, cu localizri respiratorii i cutanate. Imunodeficienele secundare apar ca i o consecin a altor afeciuni, putnd afecta separat sau mixt, imunitatea umoral i cea mediat celular. Malnutriia energo-proteic produce alterri ale imunitii mediate celular, cu modificri ale populaiilor limfocitare. Carena n proteine afecteaz sinteza optim de anticorpi (structuri glicoproteice). Infeciile bacteriene, virale sau parazitare diminueaz capacitatea de rspuns imun, mai probabil prin suprasolicitare. Spre exemplu, o infecie viral diminueaz rspunsul imun mediat celular, terenul fiind lsat descoperit pentru o infecie bacterian ulterioar. Este aa-zisul sinergism virus - bacterie (spre exemplu, o infecie gripal poate fi urmat de o infecie pulmonar cu Haemophylus influenzae). SIDA reprezint un caz particular de imunodeficien viral dobndit. Distrugerea limfocitelor TCD4 (lf TH) produce o imunosupresie a IMC, cu apariia infeciilor oportuniste cu bacterii (ex.: Mycobacterium, Salmonella), virusuri (v. Citomegalic, v. Epstein - Barr, v. herpes simplex), parazii (Toxoplasma, Cryptosporidium etc.) i fungi (Candida). Imunodeficienele secundare pot fi provocate i prin terapia imunosupresiv (corticosteroizi, radiaii), ageni citotoxici i afeciuni cu pierderi de proteine (sindrom nefrotic, ciroze, enteropatii).

AUTOIMUNITATEA

443

Definete rspunsul imun neadecvat fa de stimulii antigenici self, prin suprimarea mecanismelor normale de toleran fa de structurile proprii. Rspunsul imun fa de propriile structuri poate fi umoral (prin autoanticorpi) sau celular (prin procesele hipersensibilitii de tip tardiv, prin mecanisme citotoxice). Conflictul imunologic se manifest clinic prin apariia unor boli autoimune. Pentru definirea acestui tip de boal, trebuiesc identificate autoantigenele i mecanismele patogenice de producere, aspecte care trebuie s se confirme i experimental. Spre exemplu, patologia encefalitei alergice a fost demonstrat prin imunizarea animalelor cu proteina mielinic de baz (MBP); s-a indus o demielinizare inflamatorie similar cu cea din scleroza multipl. Autoantigenele pot deveni imunogene prin: modificarea antigenelor celulare de suprafa mimare molecular (reacii ncruciate cu antigene strine) eliberarea n circulaie a antigenelor self sechestrate (ex.: din cristalin, testicul, tiroid etc.) anomalii de imunoreglare la nivelul sistemului limfoid (ex.: clone de limfocite T interzise i reactive, ineficiena limfocitelor T supresoare, existena unor clone anormale de limfocite B, hiperreactive). Infeciile virale provoac formarea de autoanticorpi destul de frecvent. Antigenele virale i structurile self se pot asocia, dnd natere unor noi antigene, spre exemplu se pot forma complexe cu antigenele de histocompatibilitate sau cu actomiozina membranar. Infeciile bacteriene altereaz mai puin structurile celulare, n schimb lipopolizaharidele bacteriene stimuleaz puternic producia celulelor B competente. Excesul de anticorpi determin apariia unui exces de complexe imune circulante, cu depunerea acestora n esuturi i cu activarea sistemului complement. Autoimunitatea indus de medicamente recunoate prezena unor haptene (medicamentul, substana strin) care se leg de structurile self, cu apariia unor autoantigene. Exist predispoziie genetic demonstrat pentru boli autoimune. Prin complexul major de histocompatibilitate clasa a II-a se selecioneaz epitopii. Activatorii sau represorii transcripionali ai moleculelor CMH clasa a II-a se afl sub controlul unei familii de gene care se afl sub influena unor stimuli intracelulari (ex.: virali) sau extracelulari (oc termic). Aceti stimuli pot produce mutaii n secvenele de control ale genelor CMH i apariia unor molecule cu potenial autoimunogen. Genele pentru complement i pentru receptorii acestuia pot fi alterate n unele boli autoimune, fapt care explic leziunile specifice. 444

 B.A.I organ - specifice: antigenele respective sunt cantonate ntr-un singur organ, care prezint manifestri inflamatorii cronice specifice. B.A.I. non organ specifice, sistemice: implic autoantigene situate pe esuturi variate. Modificrile imunopatologice sunt generalizate. B.A.I. non - organ specifice, cu leziuni restrnse - leziunile afecteaz puine organe.

Clasificarea bolilor autoimune (B.A.I)

Exemplificri
B.A.I. organ - specifice Tiroida Hashimoto - distrucia autoimun a acinilor tiroidieni; apar anticorpi anti tireoglobulin i anticoloid tiroidian. Tireotoxicoza - Apare o imunoglobulin din clasa G, cunoscut ca stimulator tiroidian cu aciune prelungit. Anemii hemolitice autoimune - Sunt produse prin autoanticorpi orientai mpotriva unor antigene eritrocitare de suprafa. Autoanticorpii la cald (interacioneaz cu antigenele la 37oC) i aparin clasei IgG, sunt aglutinine. Autoanticorpii la rece aparin clasei IgM i sunt hemolizine. Gastritele atrofice autoimune - leziunile sunt provocate prin autoanticorpi anticelul parietal gastric i prin anticorpi antifactor intrinsec. Ambele tipuri de anticorpi mpiedic absorbia intestinal de vitamin B12. Vitiligo - produs prin autoanticorpi anti melanocite Pemfigus - leziunile apar prin autoanticorpi anti antidesmozomi. Azoospermia - anticorpi anti spermatozoizi. Insuficiena ovarian - autoanticorpi anti corpus luteum. B.A.I. non organ specifice, sistemice

445

Lupusul eritematos sistemic - cu manifestri cutanate, articulare, seroase, renale, hematopoetice produse prin autoanticorpi antinucleari (anti ADN, anti ARN - proteine), concomitent cu creterea secreiei de IL2 cu efect proliferativ asupra celulelor B. Este foarte important i rolul complementului ca factor lezional, prin aciunea asupra complexelor antigen - anticorp depuse la nivel tisular. Probabil etiologia bolii este multifactorial (factori infecioi virali sau bacterieni: Streptococcus pyogenes, factori de mediu i factori genetici CMH). Investigaiile imunologice evideniaz: celula lupic (celula LE - PMN cu nucleu alterat) rozeta lupic (rozet de PMN n jurul celulei LE) cu scopul realizrii fagocitozei anticorpi antinucleari Artritele reumatoide - cu etiologie multifactorial (factori genetici HLA - DR4, DR32 etc., factori endocrini sau infecioi). Boala apare cu frecvena maxim la 40 - 50 ani, femeile fiind mai des afectate dect brbaii. Factorul reumatoid este o IgM anti IgG uman. Se formeaz complexe imune n exces. Se activeaz sistemul complement, cu apariia fenomenelor inflamatorii i apoi necrotice. Reacia inflamatorie este potenat i prin eliberarea aminelor vasoactive, activarea mediatorilor plasmatici, infiltrarea local cu PMN, limfocite T CD4 i CD8. esutul sinovial se hipertrofiaz, se hipervascularizeaz, se asociaz cu cheaguri de fibrin (aspect morfopatologic tip panus vascular). Procesul inflamator se cronicizeaz. IL1 are rol important n producerea leziunilor prin provocarea eliberrii de prostaglandine (PGE 2) i proliferarea celulelor endoteliale i a osteoclastelor (resorbie osoas). Complicaiile sunt destul de frecvente: noduli reumatici, vasculite, afeciuni pulmonare (sindrom Caplan), afeciuni oculare (iridociclita, scleromalacia perforans), afeciuni neurologice i cardiovasculare, amiloidoza, rupturi de tendoane. Diagnosticul de laborator evideniaz prezena factorului reumatoid (FR) - testul latex i reacia Waaler - Rose, creterea proteinei C reactive i hipergamaglobulinemie. Anticorpii antinucleari apar n 15 - 50% din cazuri (AC anti histone). Sclerodermia - apare prin anticorpi anti topoizomeraz I, anticolagen I i IV i prin anticorpi antinucleari. Polimiozita - produs prin autoanticorpi antiaminoacil tARN sintetaza. B.A.I. non organ - specifice, cu leziuni restrnse 446

Ciroza biliar primitiv - se caracterizeaz prin colestaz intrahepatic, prurit, icter, hepato-splenomegalie. Boala apare prin aciunea autoanticorpilor antimuchi neted, antinucleari i antimitocondriali. Ultimii anticorpi menionai acioneaz i asupra rinichilor i asupra celulelor parietale ale stomacului. Hepatita cronic agresiv - se caracterizeaz printr-o necroz a hepatocitelor prin autoanticorpi antihepatocite, autoanticorpi antimitocondriali i antinucleari. Mecanismul citotoxicitii se manifest prin celule ADCC. -

Terapia bolilor autoimune

Este o terapie imunosupresoare neselectiv (substane imunosupresoare, corticosteroizi) sau selectiv (cu anticorpi monoclonali anti CD4, anti CD5, anti CD25, anti receptor T, antimolecule de adeziune, anti molecule CMH clasa II, anticitokine etc). Agenii imunosupresori mai frecvent folosii sunt Azatioprina, Ciclofosfamida, Ciclosporina A, Metothrexat-ul. Ciclofosfamida acioneaz preferenial asupra limfocitelor B, iar Azatioprina i Ciclosporina A inhib funcia limfocitelor T. Metotrexatul inhib funcia ambelor tipuri de limfocite. Vaccinul T are un efect preventiv. Clonele patogene sunt tratate chimic pentru ca TCR s devin imunogen pentru a determina un rspuns imun puternic al limfocitelor TCD8 (citotoxice), care vor distruge limfocitele T patogene. Acest tip de vaccin este nc experimental, orientat mpotriva encefalitelor autoimune. La om este extrem de dificil de izolat clona patogen de limfocite T. Asociat imunoterapiei supresoare, substanele antiinflamatoare sunt bine venite. Se pot utiliza n tratament i antagoniti ai receptorilor pentru IL1 i inhibitori ai factorilor chemiotactici, precum inhibitori de IL 8 i MCP-1. Reducerea activitii citokinelor respective determin scderea infiltratului inflamator, mai ales la nivelul articulaiilor. Patogeneza bolilor autoimune este extrem de complex i insuficient cunoscut, motiv pentru care i terapia nu este n totalitate eficient.

447

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1. Abba Terr - Basic Human Immunology, First Edition, Daniel P., Stites, Appleton & Lange, California, 5 - 17, 1991. 2. Adal K.A., Cokerell C. J., Petri W.A.: Cat scratch disease and other infections due to Rochalimaea, N. Eng. J. Med., 330:1509-1515, 1994. 3. Ajjan N. - La vaccination, 2-nd edition, Ed. Fondation Merieux, Lyon, vol.I, 121 - 141, 1985; 4. Akira S. J., Okazaki K., Sakano H. - Two pairs of recombination Signals are sufficient to cause immunoglobulin V(D) J joing, Nature, 214, 33 - 36, 1989; 5. Allison J. P., Lanier L. L. - The T cell receptor gamma gene: rearrangement and cell lineage, Immunology Today, 1987, 8, 293 296. 6. Alton G., Jones L. M.: Techniques of the brucellosis laboratory, INRA, Paris, 1988. 7. Andrie L., Olinescu A. - Compendiu de Imunologie Fundamental, Edit. tiina, Chiinu, 1992. 8. Arnold A. et al. - Immunoglobuline gene rearrangements as unique clonal markers in human lymphoid neoplasmus, N. Engl. J. Med., 309, 15 - 19, 1983; 9. Arnon R., Shapira M., Jacob C. - Synthetic vaccines, J. Immunol. Methods, 61, 261 - 273, 1983. 10. Axellson P., Lindhe J.: On the Prevention of Caries and Periodontal Disease, J. Clin Periodont., 18, p.182-189, 1991. 11. Azoici Doina, Ivan A. - Vaccinologie, Edit. Polirom, Iai, 1995. 12. Blbie V., Posgi N. - Bacteriologie medical, vol. I i II, Edit. Medical, Bucureti, 1985. 13. Br Constantin - Imunologie Fundamental, Editura Medical, Bucureti, 1996. 14. Bableit B. P. et al. - Binding of immunogenic peptides to Ia histocompatibility molecules, Nature, 317, 355 - 359, 1985; 15. Baehr W., Zhang X. Y: , Joseph T. et al: Mapping antigenic domains expressed by Chlamydia trachomatis major outer membrane protein genes. Proc. Natl. Acad. USA 85:4000, 1988. 448

16. Bahkdi S., Tramm - Jensen J: Alpha - toxin of Staphyloccocus aureus. Microbiol. Rev. 55 - 733, 1991. 17. Balkwill F. - Cytokines - Soluble factors in immune responses, Curr. Opinion Immunol., 1988, 1, 241 - 249. 18. Balows A., DeHaan R. M., Dowell V.R.: Anaerobic bacteria, C. Thomas Springfiedd, I. L. 1976. 19. Baron: Medical Microbiology, p.840, 1991. 20. Brzu O. i col.: Curs de biochimie medical, vol. I i II. Litografia IMF Cluj-Napoca, 1977. 21. Basch R., Stetson SA - Quantitative studies on histocompatibility antigens of the mouse, Transplantation, 1, 80 - 469, 1983; 22. Bast R. C., Zalutski M. - Monoclonal serotherapy, Cancer Medicine, 3rd Edit., Philadelphia, 1993. 23. Becker Y.: The agent of trachoma. Monogr. Virol. 7,1984. 24. Becker, Darai: Diagnosis of Human Viruses by Polimerase Chain Reaction Technology; New series - Frontiers of Virology, vol. I, p.440, 1990. 25. Bellanti J. A., Rocklin R. E. - Immunology III, Philadelphia W. B. Saunders Company, 1985. 26. Benga Gh.: Curs de biologie celular, Litografia IMF Cluj-Napoca, 1980. 27. Bennet J. V.: Nosocomial Infections due to Pseudomonas, J. Inf. Dis., 130, 54-57, 1974. 28. Berceanu t., Punescu E. - Biologia i Patologia Sistemului Imun, Bucureti, 1981. 29. Berg C.M., Berg D.E.: Bacterial Transposons, Ed. Schlessinger, Am. Soc. For Microbiology, Washington D.C., p.107-146, 1981. 30. Berzofski J. A., Berkover J. - Antigen - Antibody reactions, in Fundamental Immunology, Raven Press N. Y., p. 595 - 644. 31. Bhakdi S., Jensen J. - Membrane damages by complement, Biochim. Biophis. Acta., 737, 343, 1983; 32. Bier O. G., Silwa V., Albert E. - Fundamental of Immunology, Berlin, New York, Springer Verlag, 1981. 33. Bisno A. L. Medical progress: Group A streptococcal infections and acute rheumatic fever. N. Engl. J. Med. 783 - 793, 1991. 34. Bisthai W. R., Murphy J. R.: Bacteriophage gene products that cause human disease, In Calendar R (ed): The bacteriophages. Plenum, New York, 1988. 35. Blbie V., Poszgi N.: Bacteriologie Medical, volumele 1 i 2, Editura Medical, Bucureti, 1985.

449

36. Black P. H., Kunz L.J., Schwartz M. N.: Salmonelosis a review of some unusual aspects; N. Engl. J. Med. 262 : 811, 864 - 921, 1980. 37. Black P. H., Kunz L.J., Schwartz M. N.: Salmonelosis a review of some unusual aspects; N. Engl. J. Med. 262 : 811, 864 - 921, 1980. 38. Blake J. D., Neaver R.E., Hollins D. G.: Disease of humans caused by vibrions. Ann. Rev. Microbiol., 34:341, 1980. 39. Blaser M. J. , Parsonnet J.: Parasitism by the "How" bacterium Helicobacter pylori leads to altered gastric homeostasis and neoplasia, J. Clin, Invest., 94:4-8, 1994. 40. Blatner F. R., Tucker P. W. - The molecular biology of immunoglobulin D., Nature, 307, 417 - 421, 1984; 41. Bodmer W. F. - HLA - A supergene, Harvey Lectures, 72, 91 - 138, 1976; 42. Body S.P. et al: Klebsiella bacteriemia: a 10 year review in a cancer institution; Cancer 64:2368, 1989. 43. Bona A. C. - V genes encoding autoantibodies, molecular and phenotipic caracteristics, Ann. Rev. Immunol., 6, 258 - 327, 1988; 44. Boss E. S., van der Doelen A. A., van Rooy N. - 3,3', 5,5' Tetramethylbenzidine as an ames test negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme - immunoassay, J. Immunoassay, 2, 187 - 204, 1981; 45. Boyd J. E., James K. - Human monoclonal antibodies, Trends Biotechnology, 2, 70 - 77, 1984. 46. Braude: Microbiology: Basic Science and Medical Applications, vol. I, p.415, 1982. 47. Braude: Microbiology: Basic Science and Medical Applications, vol. I, p.415, 1982. 48. Brooks G. F., Donegan E. A.: Gonococcal Infection. Edward Arnold, London, 1985. 49. Brown J. H. et al. - A hypothetical model of the foreign antigenbinding site of class I histocompatibility molecules, Nature, 332, 845 - 860, 1988; 50. Buiuc D., Negu M.: Tratat de Microbiologie Clinic, Editura Medical, Bucureti, 1999. 51. Buiuc D.: Microbiologia Practic, un ghid n studiul i practica medicinii, ediia a 7-a, IMF Iai, 1982. 52. Buiuc D.: Microbiologie Medical, Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti, 1998. 53. Buiuc Dumitru - Microbiologie clinic, Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti, 1997.

450

54. Bush M.S., Challacombe S.J.: A Method of Identification of Streptococcus Mutans in Gingival Margin Plaque by Immunofluorescence; Caries Res., 24, p.23-29, 1990. 55. Buss S., Setle A., Grey H. M. - The interaction between proteinderived immunogenic peptides and Ia, Immunol. Rev., 98, 116 - 121, 1987; 56. Butterworth C. M., Mc Lelland B., Allansmith M. - Influence of sex on immunoglobulin levels, Nature, 214, 12 - 24, 1977; 57. Buttler J. C., Breiman R. F., Campbell J. J.: Pneumococal polysaccharide vaccine efficacy: evoluation of current recommendations. JAMA, 270, 1826 - 1831, 1993. 58. Carrol M. C. et al. - A molecular map of the human major histocompatibility complex class III region linking complement genes, C1, C2 and factor B, Nature, 28, 391 - 395, 1981; 59. Cebra J. J., Komisar J. L., Schweitzer P. A. - CH isotype Switching during normal B - lymphocyte development, Ann. Rev. Immunol., 1, 493 - 497, 1984; 60. Cernescu C. - Virusologie Medical, Ed. Med. Bucureti, 172 - 186, 1995; 61. Chiu M.J. et al: Spirochetal infections of the Skin, in Atlas of Infections Disease, Philadelphia, 1994. 62. Ciangio G.S.: Antimicrobials and Antibiotics, Oral Microbiology and Immunology, Newan and Nisengarden, p.485-496, 1988. 63. Ciufecu E. S. - Compendiu de Virusologie Medical, Ed. Fundaiei Romnia de mine, 83 - 92, 1995; 64. Clowes R.C.: Molecular Structure of Bacterial Plasmides, Bact. Rev., 36, p.361-405, 1972. 65. Cohen R. D., Conn D., Illstrup D. M. - Clinical features, prognosis and responses to treatment in polyartritis, Mayo Clin. Proc.; 55, 146 155, 1980. 66. Collier R.J.: Genetic Approaches to Structure and Activity in ADP Ribosylating Exotoxins, Am. Soc. for Microbiology, Washington D.C., 1979. 67. Conde - Glez C. J., Morse S., Rice P: Pathobiology and Immunobiology of Neisseriaceae. Instituto Nacional de Saled Publico, Guernavaco, 1994. 68. Cook P. J., Honeybourne D: Chlamydia pneumoniae; J. Antimicrobial Chemoterapy, 34(6), 859, 1994. 69. Cook P. J., Honeybourne D: Chlamydia pneumoniae; J. Antimicrobial Chemoterapy, 34(6), 859, 1994.

451

70. Corykendall A. J.: Classification and identification of the viridans streptococci. Clin. Microbiol Rev, 2, 315 - 328, 1989. 71. Cruse M., Julins E., Lewis R. E. - The genetic basis of aberrant autoimmunoregulation, Concepts in immunopathology, vol. 5, 1 - 20, 1987; 72. Cucuianu M., Rus H. G., Niculescu D., Vonica A. - Biochimie. Aplicaii clinice, Ed. Dacia, Cluj-Napoca, 85 - 142, 1991; 73. Cumming B.R., Loe H.: Consistency of Plaque Distribution in Individuals Without Special Home Care Instruction, J. Periodontal. Res., 8, p.57, 1973. 74. Cumming B.R., Loe H.: Optimal Dosage and Method of Delivering Clorhexidine Solutions for the Inhibition of Dental Plaque, J. Periodontal Res., 8, p.57, 1973. 75. Dalton I., Nottebart J.: Interpretative Medical Microbiology, p.100, 1986. 76. David C., Schreffler S. - Lymfocyte antigens controlled by the Ir region of the mouse H2 complex, Transplantation, 17, 19 - 462, 1974; 77. Davis B.D., Dulbecco R. i col.: Microbiology, Third Edition, Harper Intern. Edit., 1980. 78. Davis B.D., Dulbecco R., Eisen N.H.: Microbiology, Fourth Edition, 1990. 79. De Voe I. W.: The meningococcus and mechanism of pathogenicity. Microbiol. Rev. 46 - 162, 1982. 80. Deac Liana Monica: Infeciile nosocomiale, Editura Dacia, ClujNapoca, 1977. 81. Delespesse G., Gausset P. - Alteration de l'immunite humorale au cours du vieillissement, Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 128, 99 - 104, 1977; 82. Denny F. W., Wannamaker L. W., Brink W. R. et al: Prevention of rheumatic fever: treatment of the preceding streptococcal infection. JAMA, 143, 151 153, 1980. 83. Densen P., Mandell G. L.- Phagocyte strategy of microbial tactics. Rev. Infect. Dis. 2, 817 - 838, 1980. 84. Dillon H.: Post - streptococcal glomerulonephritis following pyoderma. Rev. Infection Dis, 1, 935 - 943, 1979. 85. Doern G. V., Jones R. N.: Antimicrobial susceptibility testing of Haemophylus influenzae; Antimicrob. Agents Chemoter 32:1747, 1988. 86. Dolken G., Weitzmann U., Boldt C. - Recent advances in immunisation, J. immunol. Meth., 67, 225 - 233, 1984; 452

87. Dragomirescu M. i colab. - Contribuii privind structurile HLA n infecia prelungit cu virusul hepatitic B, Viaa Medical, 29, 3 - 4, 1983; 88. Dragomirescu M. i colab.: Patogenia infeciilor, Editura Facla, Timioara, 1980. 89. Dragomirescu M., Novac E. - Patogenia infeciilor, Ed. Facla, Timioara, 1 - 25, 1982; 90. Dreyer W. J., Benett J. C. - The molecular basis of antibody formations, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 54, 864 - 895, 1965; 91. Duane C.Y., Raymond C.V.: Ferredoxins and Flavodoxins of Bacteria, Ann. Rev. Microb., 26, p.139-162, 1972. 92. Duca E., Duca M., Furtunescu G.: Microbiologie Medical, Ed.II, Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti, 1979. 93. Dunlop N. E., Ballinger S. - The importance of G1m and 2 allotypes for the IgG2 antibody levels and avidity against pneumococal polysaccharide type 1 within mono and dizygotic twin pairs, Scandinavian Journal of Immunology, 40, 6 - 251, Aug., 1994; 94. Dytoc M. Sone R et all: Multiple determinants of verrotoxin producing Escherichia Coli O 157/H7 attachement - effacement. Infect. Immun. 61:3382, 1993. 95. Dzink J.L., Gibbons J., Childs W.C.: The Predominant Cultivable Microbiota of Crevicular Epitelial Cells, Oral Microbiolgy Immunology, 4, p.1-5, 1989. 96. Early P. et al. - Two mARNs can be produced from single immunoglobulin gene, by alternative ARN processing pathways, Cell, 20, 313 - 320, 1979; 97. Easman C. S., Adlam C.: Staphylococci and Staphylococal infections. Vol 1 i 2, Academic Press, London, 1983. 98. Ellen P.R., Grove D.A.: Bacteroides Gingivalis. Vesicles Bind to and Aggregate Actynomices Viscosus, Inf. and Immunity, p.1618-1620, may 1989. 99. Ellen P.R., Hoover C.I., Felton J.R.: Association of Proteases of Bacteroides Gingivalis with its Adhesion to Actynomices Viscosus, Journal of Dent. Rest., 70(2), p.82-86, febr. 1991. 100. Ellen P.R.: Genns Actynomices and other Filamentous Bacteria, Oral Microbiology and Immunology, Newman and Nisengarden, p. 173-182, 1988. 101. Enquist L.W., Weisberg R.A.: Bacteriophage Lambda Site - Specific Recombination, Ed. D. Schlessinger, p.50-55, 1981. 102. Evans D.J., Evans D.G.: Colonization factor antigens of humman pathogens. Current Topics Microbiol. Immunol. 151_129, 1990. 453

103. Farley M. H., Harvey R. C., Stull T.: A population based assessment of invasive disease due to group A streptococcus in adults. N. Engl. J. Med., 328, 1807 - 811, 1993. 104. Figueroua F. and Nagy Z. Genetics of the Major Histocompatibility Complex, The final act, Ann. Rev. Immunol., 1, 119 - 142, 1995; 105. Finegold S. M., George W. L. (eds): Anaerobic Infections in Human Dissease, Academic Press, San Diego, 1977. 106. Finger H., Wirsing von Koenig C.H.: Serological diagnosis of whooping cough, Dev. Biol Stand 61:331, 1985. 107. Fischer Lindhal K., Hansman B. Flaherty L. - Polymorphism of a Qa associated antigen defined by cytotoxic T cell, Ann. J. Immunology, 12, 66 - 159, 1982; 108. Foster W. - A history of Medical Bacteriology and Immunology, W. Heinemann Medical Books, 320 - 323, 1980; 109. Fraser D. W., Tsai T. R., Orenstein W.: Legionnaire's disease: description of an epidemic of pneumonia; N. Engl. J. Med. 297; 1189, 1977. 110. Freeman, Burrows Microbyology, Newman and Nisengarden, p.583597, 1990. 111. French D. L., Lascow R. , Scharff M. D. - The role of somatic hypermutations in the generation of antibody diversity, Science, 244,11 - 52, 1989; 112. Frobisher M.,Hindil R.D., Crabtree K.T., Goodhearts C.R., Fundamentals of Microbiology, Ed.9, Saunders Comp., Philadelphia, 1974. 113. Fuerst R.: Frobisher and Fuerst's Microbiology in Health and Disease, 15th edition, W. B. Saunders Company, 1983. 114. Gay F. P. - Immunology, a medical science developed through animal experimentation, J. Am. Med. Assoc.,56, 19 - 26, 1978; 115. Gell P. H., Coombs R. RA - Clinical Aspects of Immunology, Blackwell Scientific Publications, 1962, Oxford. 116. Gerald T. N. - HLA class II variants: Structural Studies and Disease Associations, Autoimmunity, Experimental and clinical Aspects, vol. 475, New York Academy of Science, 849 - 862, 1987; 117. Gerdhart P, Manual of Metods for General Bacteriology, ASM. Washington, 1992. 118. Getzoff E. D. et al - Mechanism of antibody binding to a protein, Science, 235, 1091, 1987. 119. Gianella R. A.: Importance of the intestinal inflammatory reaction in Salmonella-mediated intestinal secretion; Infect. Immune 23: 140, 1979. 454

120. Gillies: Gillies and Dodd's Bacteriology Ilustrated, Springer Verlag 1984. 121. Glenys Thomson - Investigation of the mode of inheritance of the HLA associated diseases by the method of antigen genotype frequencies among diseases individuals Tissue Antigens, 21, 81 104, 1983; 122. Golub S. Edward - Immunology: A synthesis, Sinauer associates Inc. Publisher, Sunderland, Massachusetts, vol. Immunity and vol. Immunological Diseases, 1987. 123. Goodman Y.E. et al: ELISA for detection of pertussis IgA in nasopharingeal secretions as an indicator of recent infection. J. Clin. Microbiol., 13:286, 1981. 124. Graziano Frank, Lemanske Robert - Clinical Immunology, Edit. Williams & Wilkins, 1989. 125. Grundbacher F. J. - Heritability Estimate and genetic and environmental correlation of the human immunoglobulins G., M, A, Am, J., Hum.Genet.,26, 1 - 12, 1987; 126. Gunther E. - Aspects of Genetic Control of Immune Responsiveness, Behring Inst. Mitt., 65, 62 - 70, 1980; 127. Haddock B.A., Jones C.W.: Bacterial Respiration, Bact. Rev., 41, p.47-49, 1987. 128. Haideh Payami, Muhammad A. Kalam - Analysis of Genetics Interrelationship among HLA - associated Diseases, Am. J. Hum. Genet.., 41, 331 - 349, 1987; 129. Hale T. L.: Genetic bases of virulence in Shigella species, Micro Rev. 55: 206, 1991. 130. Hamiloff J. Mc Elhanez R. N., Finch L. R., Baseman J. D.: Mycoplasma, Molecular Biology and Pathogenesis. American Society for Microbiology, Washington, 1992. 131. Harold F.M.: Conservation and Transformations of Energy by Bacterial Membranes, Bact. Rev., 36, p.172-230, 1972. 132. Harrison L. H., de Silva G. A., Pittman M. et al: Epidemiology and Clinical Spectrum of Brazilian purpuric fever; J. Clin. Micobiology 27,599,1989. 133. Haskins K. et. al. - The major histocompatibility complex restricted antigen receptor on T cells, J. Exp. Med., 157, 1149 - 1160, 1983; 134. Hayes W: The Genetic of Bacteria and their Viruses, Ed.2, Blackwell Scientific Publications, Oxford and Edinburgh, 1968. 135. Hechemy K. E., Paretsky D.: Rickettsiology : Current Issues and Perspectives, vol. 590, N. Y. Acad. Sci., New York, 1990.

455

136. High N., Mounier J.: Ipa B. of Shigella flexneri causes entry into epithelial cells and escape from the phagocytic vacuole, EMBO J., 11, 1992. 137. Hohnes K. K., Mardh P. A., Sparling P. F.: Sexually Transmitted Diseases, 2nd Ed. Mc Graw Hill, New York, 1990. 138. Honjo T. , Alt F. W. - Immunoglobulin genes, Academy Press, 27, 11 - 17, 1989; 139. Horan J. C., Culver D. H. et al: Nosocomial infections in surgical patients in the United States, Infect Control Hosp. Epidemiol. 14-73, 1993. 140. Hunkapillar T., Hood L. - Diversity of Ig gene Superfamily, Adv. Immunol., 1, 44 - 46, 1989; 141. Ivanof A. , M. Ciupe, C. Sac, D. Vancea :Microbiologie, Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti, 1982. 142. Ivanof A., D. Vancea, C. Sac: Lucrri practice de Microbiologie pentru uzul studenilor, Litografia IMF Cluj- Napoca, 1983. 143. Ivanof A., Mihalache M.: Microbiologie General, Curs pentru uzul studenilor, Editura Universitii "Lucian Blaga" Sibiu, 1996. 144. Ivanof A., Sasca C., Vancea D.: Curs de Microbiologie, Partea a IIIa, Litografia IMF Cluj Napoca 1980. 145. Ivanof A.: Curs de Microbiologie, vol.I i vol.II, Litografia IMF Cluj Napoca, 1977. 146. Ivanovici G., Fuiorea O. - Diagnosticul de laborator n practica medical, Ed. Militar, Bucureti, 71, 209 - 211, 1990; 147. Javetz E. i colab.: Revue of Medical Microbiology. Ed.13. Lange Med. Publ. Los Altos, California, 1988. 148. Jawetz Melnick - Medical Microbiology, 19-th Ed. Appleton and Lange, 434 - 438, 1991; 149. Johnson J.R., Stamm W.E.: Urinary tract infections in women: diagnosis and treatment. Ann. Intern. Med. 111:906, 1989. 150. Johnson R.C. (ed): The biology of Parasitic Spirochetes, Academic Press, San Diego 1976. 151. Joklick W.K., Willet H.P.: Zinnser Microbiology, Ed.16. Appleton Century Crofts, New York, 1976. 152. Joklik W. A. - Zinsser Microbiology, Appleton and Lange, 289 - 388, 1990; 153. Joller-Jemelka H. I. - Contribution du dosage des immunoglobulines et des sous-classes d IgG au controle chimique, Med. et Hyg., 53, 993 - 1000, 1995; 154. Katsushiro F., Kazuaki S. - Statistical detection of HLA and disease association; Tissue Antigens, 26, 81 - 86, 1985; 456

155. Kauffman A.E., Weyant R.S.: Leptospiraceae, in Murray P.R.: Manual of Clinical Microbiology, 6th Ed., American Society for Microbiology, Washington D.C., 1995. 156. Kay N. E., Douglas S. D. - Antigenic phenotype and morphology of human blood lymphocytes, Ann. H. Genet., 10, 7 - 21, 1988; 157. Kenny G. E., Kaiser G. G., Cooney M. K. et al: Diagnostics of Mycoplasma pneumoniae and pneumonia: Sensitivities and specificities of serology with lipid antigen and isolation of the organism on soy peptone medium for identification of infections. J. Clin. Microbiol, 28, 2087, 1990. 158. Keusch G. T. et al: Shigellosis in Evans A. S. (ed) : Bacterial Infections of Humans, Epidemiology and Control, Plenum, New York, 1991. 159. Kingsbury David, Wagner Gerald: Microbiology 2nd edition, The National Medical Series for Independent Study, Harwal Publishing, USA, 1990. 160. Klebanoff S. J. - The neutrophil: Function and Clinical Disorders, Amsterdam, New York, Publishing Co, 1978. 161. Klein J., Figueroa F. - Genetics of the Major Histocompatibility Complex, Rev. Immunol., 1 42 - 119, 1984; 162. Kramer J. M., Gilbert R. J.: Bacillus cereus and other Bacillus species, Foodborne Bacterial Pathogens, New York, 1989. 163. Kushner I., Gewurtz H., Benson M. A. - C-reactive protein and the acute phase response, J. Lab. Clin., 97, 739 - 8 4, 1981; 164. Lambert, O'Grady: Antibiotic and Chemoterapy, Appleton & Lange, California, 1992. 165. Lambert, O'Grady: Antibiotic and Chemoterapy, Appleton & Lange, California, 1992. 166. Larsen S.A., Steiner B.M., Rudolph A.H.: Value and limitations of non-treponemal and treponemal tests in the laboratory diagnosis of syphilis: Clin. Obst. Gynecol. 18:191, 1975. 167. Le Franc M. P., Le Franc G. - Cours d' Immunologie, Inst. Cantacuzino, Bucharest, Dec. 1992. 168. Leder P. - The genetics of antibody diversity, Sci. Am., 39, 102 109, 1982; 169. Lenette H.E., Shadomy H.J.: Manual of Clinical Microbiology, Fourth Edition, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1995. 170. Leppla S. H.: The anthrax toxin complex, Sourcebook of Bacterial Proteins , Academic Press, New York, 1990.

457

171. Luderitz O., Staub A.M., Westphal O.: Immunochemistry of "O" and "R" Antigens of Salmonella and Related Enterobacteriaceae, Bact. Rev., 30, p.192-256, 1966. 172. Luderitz O., Staub A.M., Westphal O.: Immunochemistry of "O" and "R" Antigens of Salmonella and Related Enterobacteriaceae, Bact. Rev., 30, p.192-256, 1966. 173. Lyon B. R., Skurraz R.: Antimicrobial resistance in Staphylococcus aureus: genetic basis. Microbiol Reviews 51 - 88, 1987. 174. Mller - Eberhard H. J. - The complement system in the Plasma Proteins, 1975. 175. Mac Devitt H.O. - CMH system and its relation to disease, Hosp. Pract., 14, 20 - 57, July, 1985; 176. Mandelstam J., Mc Quillen K.: Biochemistry of Bacterial Growth. Blackwell Scientific Publ., Oxford., 1968. 177. Marak P., Kapler J. - T cell can distinguish between allogenic major histocompatibility complex products on different cell types, Nature, 332, 840 - 845, 1988; 178. Margineanu C.: Microbiologie Stomatologic, Editura Didactica i Pedagogic Bucureti 1981. 179. Matinca Doina - Microbiologie pentru studenii facultilor de Farmacie, Edit. Mediamira, Cluj Napoca, 1995. 180. Max E. et al. - Variation in the crossover of Kappa immunoglobulin gene V. J. recombination, Cell, 21,793 - 802, 1980; 181. Mc Cacken G.: Emergence of resistant Streptococcus pneumoniae: a problem in pedriatics. Pedriatic Infect. Dis. J, 14, 424 - 428, 1995. 182. Mc. Dade J. E., Shepard C. C., Redus M. A.: Evidence of Rickettsia prowazekii infections in the United States, Am. J. Trop. Med. Hyg. 29: 277, 1980. 183. Mc. Michael A. J. et al. - HLA restriction of cell mediated lysis of influenza virus infected human cell, Nature, 270, 524 - 529, 1977; 184. Meschner M. F. - Surface contact requirements for activation of cytotoxic T limphocytes, J. Immunology, 149, 2402, 1992. 185. Mesrobeanu I., Berceanu t. - Imunologie, Imunochimie, Imunopatologie, Edit. Academiei, Bucureti, 1975. 186. Mesrobeanu I., Berceanu t.: Fiziologie bacterian, Editura Academiei, Bucureti 1960. 187. Miariu Mircea - Probleme de imunologie n stomatologie, Edit. Tribuna, Sibiu, 1998. 188. Middleton E., Reed C. - Allergy; principles and practice. St. Louis, vol. I, II, 1983.

458

189. Mihalache M.: Imunologie, Curs pentru uzul studenilor, Editura Conexiuni, Sibiu, 1999. 190. Mihalache M.: Imunologie, Curs pentru uzul studenilor, Editura Conexiuni, Sibiu, 1999. 191. Miller H.C.: Microbial Ecology of the Oral Cavity, Oral Microbiology Infections Disease, Schuster, Third Edition, p.441-446, 1990. 192. Miller H.C.: The Oral Microbial Flora, Oral Microbiology Infections Disease, Schuster, Third Edition, p.465-478, 1990. 193. Mircea Ioan Popa: Microbiologie general i special - note de curs, Concept Publishing House, Bucureti 1999. 194. Mishu B., Koehler J.: Outbreak of Salmonella enterididis infections in the United States, 1985-1991, J. Infect. Dis.: 169-547, 1994. 195. Mobley H.L.T., Chippendale G.R.: Hemaglutinin, urease and hemolysin production of Proteus mirabilis, J. Infect. Dis. 161:525, 1990. 196. Moellering R. C.: Emergence of Enterococcus, as a significant pathogen. Clin. Infections Dis. 14, 1173 - 1178, 1992. 197. Moller G. - HLA and disease Susceptibility, Immunol. Rev. Entire issue, 1, 70 - 74, 1988; 198. Moller G. - Molecular genetics of class I and classII MHC antigens, Immunol. Rev., 1, 84 - 91, 1985; 199. Moraru I. - Imunologie, Ed. Medicala, Bucureti, 171 - 225, 1984; 200. Moraru I., Punescu E. (sub red.): Dicionar enciclopedic de Imunologie, Edit. tiinific i Enciclopedic, Bucureti, 1981. 201. Morse S. A., Broome C. V., Cannon J, (et al): Perspectives on pathogenic Neisseriae. Clin. Microbiol. Rev. 2:S1, 1989. 202. Moss J., Waughn M.: Activation of adenylate cyclaze by choleragen; Amr. Rev. Bivehem. 48:581, 1979. 203. Moulder J. W. (ed.): Intracellular Parasitism, CRC Press, Boca Raton, FL, 1989. 204. Munoz J.J., Bergman R.K.: Bordetella pertussis, vol.4. Marcel Dekker, New York, 1977. 205. Murphy T. F., Apicella M. A.: Nontypable Haemophylus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis 9 : 1, 1987. 206. Murray J.J.: The Prevention of Dental Disease, Second Edition, Oxford University Press, 1989. 207. Murray P., Drew W., Thompson J.: Medical Microbiology, C. V. Mosby Company, 1989.

459

208. Musker D. M.: Biology of Treponema pallidum, Sexually Transmitted Disease, 2nd Edit., Mc Saw Hill Book Company, New York, 1990. 209. Neil Risch - Assessing the role of HLA - linked and unlinked determinants of disease, Am. J. Human Genet., 40, 1 - 14, 1998; 210. Nelson D. S. - Immunity to infection, allograft immunity and tumour immunity: Parallels and contrasts. Transplant Revue, 19, 226 - 254, 1984. 211. Newmann M.G., Nisengarden R.: Oral Microbiology and Immunology, Newman and Nisengarden, p.411-437, 1988. 212. Nicolletti C. - Antibody protection in ageing: influence of idiotypic repertoire and antibody binding activity to a bacterial antigen, Experimental and Molecular Pathology, 62 99 - 108, Apr., 1995; 213. Nossal G. J. - The basic components of the immune system, The N. Engl. J. Med., 316, 1320 1325, 1990. 214. Notkins A. L. et al.- How the immune response to a virus cause disease, Sci. Amer., 228, 23 3, 1986. 215. Ojcius D. M., Ding J., Young E. - Cell - mediated killing; efector mechanism; efector mechanism and mediators, Cancer Cells, 1990, 2, 138 - 145. 216. Olinescu A. - Elemente de Imunologie Comparat, Edit. Ceres, Bucureti, 1988. 217. Olinescu A. - Imunologie, Ed. Didactic i pedagogic, Bucureti, 1995; 218. Punescu V., Tatu A. Clin, Stnescu I. Diana, Medrea P. Dan Imunologie, Concepte fundamentale i Aplicative, Edit. Helicon, Timioara, 1996. 219. Page R.C.: Gingivits, J. Clin. Periodontol, 13, p.345, 1986. 220. Pappenheimer J.A.M.: Interaction of Protein Toxins with Mammalian Cell Membranes, Ed. D. Schlessinger, ASM. Washington D.C., p. 187-192, 1979. 221. Parrish H. J. - A history of immunisation, Ed. Livingstone, 3 - 45, 1985; 222. Penner J. L.: The genus Camphylobacter: a decade of progress. Clin. Microbiol. Rev 1:157, 1988. 223. Penner J. L.: The genus Camphylobacter: a decade of progress. Clin. Microbiol. Rev 1:157, 1988. 224. Pestka S., Baron S. - Definition and classification of interferons, Met. Enym, 78, 3 14, 1992.

460

225. Peter Mihail, Domokos Ludovic, Piros Sanda, Lrinczi Lilla, Toma Felicia: ndreptar de lucrri practice de microbiologie, Litografia UMF Trgu-Mure, 1998. 226. Ponvert C., Paupe J., Griscelli C. - Immunologie fondamentale et immunopathologie, 1991. 227. Powrie F., Coffman R. L. - Cytokine regulation of T cell function: potential for therapeutic intervention., Immunology Today, 1993, 14(6), 200 - 204. 228. Rappuoli R., Perugini M., Falsen E.: Molecular epidemiology of the 1984 - 1986 outbreak of diphteriae in Sweden. N. Engl. J. Med. 312 321, 1988. 229. Rappuoli R., Perugini M., Falsen E.: Molecular epidemiology of the 1984 - 1986 outbreak of diphteriae in Sweden. N. Engl. J. Med. 312 321, 1988. 230. Razin S. Barile M. F.: The Mycoplasmas, Vol. 4, Mycoplasma Pathogenicity. Academic Press, Orlando, 1985. 231. Razin S., Jacobs E.: Mycoplasma adhesion. J. Gen. Microbiol. 138 407, 1992. 232. Reichman L. B., Hershfield E. S.: Tuberculosis - A Comprehensive International Approach. Marcel Dekker, New York 1993. 233. Reinherz E. L., Schlossmann S. F. - Differentiation and function of human T lymphocites cell, 19, 821 - 827, 1980. 234. Rigsby M. O., Curis A. H.: Pulmonary disease from nontuberculous Mycobacteria in patients with human immunoficiency virus. Chest 106, 913, 1994. 235. Rogolski M.: Nonenteric Toxins of Staphylococcus Aureus, Microbiology Rew., 43, p.320-360, 1979. 236. Roitt I., Brostoff M., Mak D. - Immunology Second Edition, Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. 237. Rom W. N., Garay S.: Tuberculosis, Little, Brown and Co, New York 1995. 238. Rose N. L., Friedman H., Fahey J. L. - Manual of clinical laboratory immunology, American Soc. for Microbiol., Washingon DC, 78 116, 1986; 239. Roth J.: Virulence Mecanisms of Bacterial Pahtogens, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1988. 240. Rottem S., Kahane I.: Mycoplasma Cell Membranes. Plenum Press, New York 1993. 241. Sakagawa E.: Study of the role of mucoid strain in chronic airways infections, Japanese, Kansenshogakn, Zasshi, 72(4), 379 - 394, 1998.

461

242. Salyers A. A., Whitt D. D.: Bacterial pathogenesis: a molecular approach. American Society for Microbiology, Washington D. C., 1994. 243. Sasazuki T., Nistimura Y. et al. - Molecular and functional analysis of HLA class II molecules, Human T Cell Clones, Human Press Inc., 101, 333 - 352, 1985; 244. Sasc C., Ivanof A. - Lucrri practice de Microbiologie, virusologie i sindroame infecioase, Litografia U.M.F. Cluj-Napoca, retiprit i adugit, vol. 1, 226 - 331, 1991; 245. Schachter: Chlamydiae: exotic and ubiquitos; West J. Med. 132 238, 1980. 246. Schahter J., Crossman M.: Chlamydial infections; Ann. Rev. Med. 32 - 45, 1981. 247. Schlievert P. M.: Role of superantigens in human disease. J. Infections Dis 167 - 997, 1993. 248. Sell G. H., Wright P. F.: Haemophylus influenzae, Epidemiology, Immunology and Prevention of Disease, Elsevier Biomedical, 4036, 1990. 249. Shaenning o., Lutwick L.: Pseudomonas aeruginosa infections, Infect. Med., 13, 2, 110 - 113, 1996. 250. Shinnick T.: Tuberculosis, Curr. Top Microbiol Immunol, Springer Verlag Hardalbery, 1995. 251. Silver J., Gayert S. M. - Epitopes are the functional Units of HLA Class II Molecules and form the molecular basis for disease Susceptibility, HLA class II Antigens Rev., Springer Verlag Berlin, 28, 132 - 141, 1990; 252. Singer S.J., Nicholson A.L.: The Fluid Mosaic of Cell Membranes, Science, p.175;720, 1972. 253. Siskind G. W. - Immunologic tolerance in Fundamental Virology Paul W. E., Raven Press, New York, 537 558, 1998. 254. Smith H.: Biochemical Challenge of Microbiolopathogenity, Bact. Rew., 32, p.164-184, 1968. 255. Smith H.: Microbial Surface in Relation to Patogenity, Microbiol. Rew., 41, p.475-500, 1977. 256. Spangler B.D.: Structure and function of cholera toxin and the related E. Coli heat-labile enterotoxin. Microbiol. Rev 56:622, 1992. 257. Spies T. et al. - Structural organisation of the DR subregion of the human major histocompatibility complex, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 5165 - 5169, 1985; 258. Stanila L.: Microbiologia bolii parodontale, Litografia IMF ClujNapoca, 1993. 462

259. Sternas L., Luka J., Kallin B., et al. - Elisa technique, J immunol. Meth., 63, 171 - 185, 1983; 260. Stewens D. J., Tanner M. H., Winship J et al: Severe group A Streptococcal infections associated with a toxic shock-like syndrome and scarlet fever toxin A. N. Engl. J. Med, 321, 1 - 8; 1989. 261. Sutter V. L., Citron D. M.: Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual, 4th Ed. Star Publishing, Belmont, C. A., 1985. 262. Talmage W. D. - A century of progress, Beyond molecular immunology, Journal of Immunol., 32, 55 - 141, 1988; 263. Tao X., Schiering N, Zeng H - Y: DtxR, iron and the regulation of diphteria toxin expression. Mol. Microbiol. 14, 191, 1994. 264. Terasaki P. I., Giertson D. - Immunobiology of MHC, Convoc. Immunol., New York, 270 - 276, 1980; 265. Tesh V. L., O'Brien A. D.: Adherence and colonization mechanism of enteropatogenic and entherohemorragic E. Coli. Microb. Pathogenesis, 12:245, 1992. 266. Thomas L. - Protein diagnostic, Behring Institute, 3, 332 - 354, 1982; 267. Tiwali J. L., Terasaki P. I. - HLA and disease associations, Springer Verlag, 15 - 98, 1985; 268. Toltzis P., Blunier J.L.: Antibiotic resistant gram negative bacteria in the critical care setting. Pedriatic Clin. North Amer. 42:687, 1955. 269. Tonegawa S. - Somatic generation of antibody diversity, Nature, 302, 575 - 597, 1983; 270. Tonegawa S.- The molecules of immune system, Sci. Amer., 253, 104 113 1976. 271. Tribby I., Frs R., Moulder J. W.: Effect of Chloramphenicol, Rifamicin and Nalidixic Acid on Chlamidia psittaci growing in L cells: J. Infection Disease 127 - 155, 1973. 272. Trowsdale J., Campbell R. D. - Physical map of the human HLA region, Immunol. Today, 9, 34 - 36, 1988; 273. Vaida T., Cristea V. - Elemente de imunologie, Editura Vasile Goldi Arad, 1996. 274. Victor E., Linda A. Corey, Walter E. Nance - The inheritance of immunoglobulin levels, Twin Research, Clinical Studies, Allan R. Liss Inc., 5, 171 - 176, 1978; 275. Virella Gabriel: Microbiology and Infectiouse Disease, National Medical Series for Independent Study, Williams & Wilkins, USA, 1996. 276. Voiculescu M. - Boli infecioase, Clinica i Epidemiologie, Ediia a 3-a, Ed. Medical, Bucureti, 57 - 125, 1981;

463

277. Voiculescu M. - Boli infecioase, vol. I, vol. II, Ed. Med. Bucureti, 344-425, 1990; 278. Wessels M. R., Kasper D. J.: The changing spectrum of group B streptococcal disease: N. Engl. J. Med, 328, 1843 - 1844, 1993. 279. Williams A., Barclay A. - Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific Publication, 1985. 280. Wise K. S.: Adaptive surface variation of Mycoplasmas. Trends Microbiol 1:59, 1993. 281. Woods D. E., Iglewski B. H.: Toxins of Pseudomonas aeruginosa: new perspectives, Rev. Inf. Dis. 5:715, 1983. 282. Young E.J., Corbel M.J.: Brucellosis: Clinical and Laboratory aspects, CRC Press, Boca Raton, 1989. 283. Zarnea G. - Tratat de Microbiol. general vol. I (1983), vol. II (1984), vol. III (1986), vol. IV (1991), Edit. Academiei, Bucureti. 284. Zarnea G.: Microbiologie general, Ed. Didactic i Pedagogic, Bucureti, 1970. 285. Zola H. - Differentiation and maturation of human B lymphocytes; Pathology 17, 365-381, 1985. 286. Zola H. - The surface antigens of human B lymphocytes, Immunology Today, 8, 308 - 313, 1987.

464