Referat de Doctorat - Producerea de 1.4-Butandiol Prin Fermentare

Universitatea POLITEHNICA din Bucureti
Splaiul Independenei nr. 313, Bucureti RO-060042, ROMNIA

Tel. + 4021 402094064; Fax. +4021 318 10 03
www.upb.ro
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

microorganismelor modificate genetic prin inginerie metabolic
Referat de doctorat
Dobos Alpr
Coordonator tiinific:
Prof. Dr. Ing. Lnyi Szabolcs

microorganismelor modificate genetic prin inginerie metabolic.
Cuprins
1
Introducere .......................................................................................................................... 3
Obiectivele cercetrii .......................................................................................................... 4
Studiu bibliografic .............................................................................................................. 5
3.1
1,4-Butandiol ............................................................................................................... 5
3.2
Biologia sistemic i ingineria metabolic .................................................................. 6
3.3
Pasurile generale n ingineria metabolic a organismelor ........................................... 9
3.4
Programe pentru preconizarea cilor metabolice i pentru construirea modelelor ... 12
3.5
Modele metabolice folosite n ingineria metabolic ................................................. 14
3.6
Metoda OptStrain ...................................................................................................... 15
3.7
Analiza fluxurilor ...................................................................................................... 17
3.8
Programul OptFlux .................................................................................................... 21
Metode i materiale .......................................................................................................... 22

4.1
Ci pentru producerea de 2,3-butandiol .................................................................... 22
Rezultate i discuii........................................................................................................... 30
Bibliografie ....................................................................................................................... 49

Introducere
1,4-Butandiol este un produs chimic important la producerea polimerilor, iar n momentul de

fa producerea lui se bazeaz pe industria petrolier, mpreun cu acetilen, butan,
propilen,butadien etc. Consumul anual de 1,4-butandiol este mai mult de 2,5 milioane de
tone, producerea lui din produse petroliere nu este fezabil i sustenabil [1].
ntre factorii care duc la concluzia c tehnologia pentru producerea de 1,4-butandiol trebuie
s fie schimbat se afl creterea constant a preului produselor petroliere i creterea
emisiilor de gaze cu efect de ser. O alternativ a cilor de producere convenionale ar fi
producerea de 1,4-butandiol din biomas. Balana emisiilor de gaze cu efect de ser devine
mai favorabil cnd 1,4-butandiol este produs din biomas, aceste fiind absorbite via
fotosintez, i costul biomasei este semnificativ inferior fa de produse petroliere [2].
Niciuna dintre microorganisme cunoscute nu produc 1,4-butandiol, astfel microorganismele
trebuie s fie modificate prin ingineria metabolic pentru a atinge scopul propus [1].
Primele ncercri au constat din dou trepte: producerea acidului succinic din biomas (zahr
provenit din biomas) prin fermentare, dup care producerea de 1,4-butandiol din acid
succinic folosind metode convenionale. ncercrile cel mai recente au avut ca scop
fermentarea direct de 1,4-butandiol din zahr [2].
Fermentarea direct de 1,4-butandiol necesit identificarea noilor ci metabolice, producerea
lui este inexistent n natur, astfel nu exist nici o cale metabolic complet. Pentru
identificarea cilor metabolice, modele matematice trebuie s fie folosite. Rezultatul
modelrii este un set de ci care n teorie ar duce la 1,4-butandiol, iar dintre aceste variaii
trebuie s fie selectate cele mai optime, baznd pe numrul pasurilor metabolice, randamentul
procesului, criterii termodinamice, etc. Variaiile selectate apoi trebuie s fie experimentate n
laborator, variaia care funcioneaz i are cel mai mare randament este soluia la problem
[1]. Cercetrile n domeniu exist, variaia cel mai fezabil a fost patentat de o firm
american, GENOMATICA, care este specializat n producerea produselor petroliere prin
procese biologice. Ei vor nfiina o firm cu o capacitate de 18000 tone pe an pentru
producerea de 1,4-butandiol prin fermentare [3].

ns tehnologia cercetat exist, tema rmne deschis, ar putea exista posibiliti de

optimizare i identificare a cilor cu randament mai mare. Tehnologia poate fi adaptat la
diferite condiii geografice ct i la diferite substraturi de intrare.
Obiectivele cercetrii
Obiectivul global al cercetrii este producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

microorganismelor modificate prin ingineria metabolic: identificarea cilor noi, analiza
cilor identificate de ctre firma Genomatica, alegerea celor mai potrivite ci, identificarea
enzimelor care particip n lanul de reacii, modelarea computaional a procesului
biochimic, planificarea vectorului i implementarea procesului n laborator.
Obiectivul referatului este analiza literaturii n domeniu. Exist diferite metode pentru
modelarea cilor metabolice i pentru preconizarea cilor care ar duce la un produs de interes.
Scopul principal a studiului este analiza metodelor existente, identificarea i cunoaterea
funcionrii programelor n domeniu.
O evaluare preliminar a programelor i a metodelor disponibile va fi fcut pentru
verificarea capabilitii lor pentru a identifica ci metabolice pentru producerea de 2,3butandiol. Scopul la faza asta este inventarierea programelor n domeniu, dei nu am ales
identificarea cilor pentru producerea de 1,4-butandiol, care este o sarcin mult mai
complicat, aceste ci nu pot fi gsite la nici una dintre organismele cunoscute n momentul
de fa, nu ca i n cazul 2,3-butandiolului, care este prezent la diverse organisme.
Substratul cel mai obinuit pentru producerea butandiolului este glucoza provenit din
agricultur, cea ce impune problema creterii preurilor de mncare. Concurena ntre
alimentaia populaiei i asigurarea materialelor prime pentru industrie ar putea deveni o
problem. Pentru evitarea acestuia am decis s folosim glucoza produs din deeuri i
glicerol, cea ce este un produs secundar la producerea biodieselului.
Deeurile conin o cantitate mare de celuloz care poate fi transformat n glucoz prin cale
biologic [4]. n deeuri este disponibil o cantitate mai mare de celuloz dect n amidon,
care se afl n cantiti mai mari n plante industriale sau alimentare. Amidonul se afl n
condiie relativ pur, n comparaie cu celuloz, care este mixat cu lignin care se
4

descompune mai greu. Celuloza nu este uor de transformat n glucoz, dar nu este imposibil,
o varietate de enzime sunt necesare pentru realizarea procesului.
Biodieselul se formeaz prin transesterificarea lipidelor cu alcool, formndu-se glicerol ca
produs secundar conform reaciei de mai jos.
Figura 1: Reacia de formare a biodieselului [5]
Glicerolul a devenit un produs secundar ieftin, la fiecare 100 L de biodiesel produs se

formeaz inevitabil 10 L de glicerol. Dezvoltarea intens a industriei de biodiesel rezult un
surplus semnificativ de glicerol micornd preurile. Aceast reducere a preurilor este o
problem pentru industria de glicerol, la fel i pentru industria de biodiesel. Conversia
glicerolului la un produs cu un pre mai mare este o soluie promitoare [6].
Studiu bibliografic
3.1 1,4-Butandiol
1,4-Butandiol este un lichid necolorat, derivat din butan prin punerea grupelor de alcool la
fiecare capt a lanului. Este una dintre cele patru izomere stabile a butandiolului.
Figura 2: Molecula de 1,4 butandiol [7]

1,4-butandiol este folosit ca solvent la lichide de curire industriale, de exemplu

tetrahidrofuran, este folosit i la producerea plasticelor, de exemplu polibutilen tereftalat,
fibre, poliuretane. Majoritatea productorilor, cum sunt BASF, DuPont, Linde i
LyondellBasel, pentru producerea de 1,4-butandiol folosesc o varietate de procese
nesustenabile, bazate pe petrochimie[8].
Procesul cel mai vechi pentru producerea de 1,4-butandiol este procesul Reppe, n care
acetilena reacioneaz cu dou molecule de formaldehid formnd 1,4-butandiol. n 1990
LyondellBasel a dezvoltat un proces fr acetilen. Procesul ncepe cu conversia oxiduli de
propilen n alcool alilic. Prin hidroformilare, alcoolul alilic se transform n 4hidroxibutiraldehid, care este hidrogenat n 1,4-butandiol. Exist i alte procese pentru
producere de 1,4-butandiol bazate pe butadien, acetat de alil i acid succinic, dar aceste
procese au produse secundare care au efect negativ asupra mediului [8].
Dependena producerii de 1,4-butandiol de produse petroliere a forat dezvoltarea metodelor
sustenabile prin fermentare cu ajutorul microorganismelor. Primele ncercri au avut dou
trepte: producerea acidului succinic prin fermentare, apoi transformarea acestuia n dimetil
ester i n final n 1,4-butandiol. Conform metodelor cele mai recente, este posibil i
producerea direct de 1,4-butandiol prin fermentare. Metoda asta va fi relatat n continuare.
Tabel 1: proprietile de 1,4 butandiol [7]
Formula molecular
C4H10O2
Mas molecular
Densitate
90,12 g/mol
1,0171 g/cm3 (20 C)
Punct de topire
20,1 C
Punct de fierbere
235 C
Solubilitate n ap
Solubilitate n etanol
Miscibil
Solubil
3.2 Biologia sistemic i ingineria metabolic

Biologia sistemic asigur un cadru pentru construirea modelelor sistemelor biologice. De la
invenia tiinei, analiza computaional a msurrilor efectuate privind funcionarea celulelor
pentru modelarea i descoperirea proceselor s-a dezvoltat semnificativ [9]. Biologia sistemic
6

este tiina care are ca obiectiv nelegerea felului n care macromolecule prind via atunci
cnd fac parte dintr-un sistem. Aceast tiin propune studierea organismelor n ansamblu,
ca un tot unitar, fcnd legtur ntre genom, proteom i metabolom. Concepia a fost
rspndit n 2000 ca o tiin interdisciplinar, combin multe alte ramuri a biologiei ca
biologie molecular, biochimie, bioinformatic i metabolomie. Biologia sistemic analizeaz
cile metabolice, modeleaz procesele biochimice, asigur informaii privind funcionarea
acestora.
Beneficiarul cel mai important a biologiei sistemice este ingineria metabolic, care folosete
informaiile asigurate de acesta. Ingineria metabolic const n optimizarea genetic a
proceselor de regulare a celulelor pentru producerea compusului de interes. Ingineria
metabolic ntr-un fel a precedat biologia sistemic, prin crearea necesitii de analizare
sistematic a cilor metabolice i optimizarea lor [10].
Ingineria metabolic are o dimensiune distinct industrial, fiindc se adreseaz proiectrii
unor microorganisme care pot fi folosite ca bio-catalizatori pentru producerea
combustibililor, chimicalelor i produselor farmaceutice. Fa de biologia sintetic, ingineria
metabolic nu doar asambleaz genele pentru construirea cilor metabolice, ci i creeaz un
proces economic pentru producerea chimicalelor, optimiznd procesul. Elementele de baz al
ingineriei metabolice sunt planificarea, construirea i optimizarea cilor.
Celulele modificate genetic pentru producerea chimicalelor de interes pot fi considerate i ca
bio-reactoare mici, avnd materii de intrare i produse de ieire. Procesul de dezvoltarea a
celulelor modificate pot fi divizate n trei grupe: faza de planificare, faza de cercetare i faza
de evaluare. Procesul este prezentat n urmtoarea diagram [11].
Ar fi ideal c procesul s fie linear, iar dup cum se vede i n diagrama, sunt multe repetiii
n lanul activitilor. Modelul dezvoltat trebuie s fie ajustat dup experimentele in vivo. Este
necesar analiza cantitativ a fluxelor intracelulare i actualizarea variabilelor. Unul dintre
obiectivele cercetrii este construirea i ajustarea modelului metabolic pentru producerea de
1,4 butandiol. n continuare vor fi relatate metodele de modelare i construirea modelelor.

Figura 3: Procesul de dezvoltare, modificare genetic a microorganismelor [11]

n ani receni un set de metode au fost dezvoltate pentru preconizarea cilor metabolice cu
scopul de producere de chimicale prin fermentare microbiologic [12]. Cercetarea reelelor
metabolice impune dou probleme: analiza i sinteza. Analiza implic studierea reaciilor
biochimice i identificarea fiecrei cale metabolic, pentru producerea unui compus
biochimic dintr-un set de compui i reacii biochimice cunoscute. Sinteza implic
identificarea reaciilor i compuilor biochimice inexistente, non-native [13].
Bazat pe cunotinele despre un sistem metabolic, putem manipula sau modifica organismele
pentru a maximiza producerea compusului dorit [14].
Metodele pentru preconizarea cilor pot fi clasificate prin baza abordrii [12]:
1. Metode bazate pe schimbrii de structuri chimice
Metodele din grupul acesta sunt folosite pentru reconstruirea reelelor de relaii ntre compui
biochimici, folosind analiza omologiilor bazate pe structur. Aceast metod genereaz o
varietate de ci non-native, iar preconizarea enzimelor este dificil [12].
2. Metode bazate pe informaii enzimatice
Metodele bazate pe informaii enzimatice se concentreaz la eliminarea genelor i
combinarea cilor existente la diferite microorganisme. Aceast metod este util, dar
preconizrile efectuate sunt limitate la compui biochimici cunoscute [12].
3. Metode bazate pe mecanisme de reacii
Metodele bazate pe mecanisme de reacii sunt capabile pentru identificarea cilor pentru
producerea produsului de interes, dintr-un set de substraturi. Aceste metode au capacitatea de
a identifica ci non-native conform cilor i regulilor cunoscute, dar sunt limitate la reaciile
de biodegradare [12].
3.3 Pasurile generale n ingineria metabolic a organismelor

Programele menionate n capitolele anterioare pot fi combinate, pot fi folosite la acelai scop
diferite programe , [15].

Preconizarea cilor metabolice
BNICE, Desharky, FMM, RetroPath
Prioritizarea cilor metabolice
Desharky, Retro Path
Modelarea cilor metabolice
COBRA toolbox, SurreyFBA, CycSim, Biomet

toolbox, IPATH2, GLAMM
Selectarea cii cel mai potrivite
Proiectarea genelor i integrarea
RBS Calculator, Gene Designer, GeneDesign,
cii
DNAWorks, Clotho, Thinker Cell, GenoCAD,

SynBioSS
Sinteza
Figura 4: Pasurile generale n ingineria metabolic a organismelor i programe utile la fiecare pas [15]
1. Preconizarea cilor metabolice

n primul pas un numr mare de ci posibile sunt identificate, bazate pe reguli chimice i hri
metabolice. La faza asta avem deja o idee general despre posibiliti de producere a
compusului de interes, fr s avem cunotine privind proprietile termodinamice etc.
2. Prioritizarea cilor metabolice
Prioritizarea cilor metabolice are rolul de a reduce numrul cilor identificate la primul pas,
dup criterii termodinamice, distana cii, numrul pasurilor non-native etc. Cile selectate au
o ans mai mare c pot fi introduse ntr-un organism cu succes i vor fi exprimate. Numrul
pasurilor la calea metabolic nu influeneaz rata produceri produsului de interes, iar
10

producia enzimelor n plus consum mai mult energie. Efectul pozitiv a reducerii numrul
pasurilor non-native pentru creterea eficienei nu este evident. Exist o competiie ntre
cile metabolice native i ci metabolice introduse artificial. Cu ct mai multe enzime sunt n
comun cu reeaua metabolic a organismului gazd, cu att competiia va deveni mai mare,
astfel mai multe gene trebuie eliminate pentru asigurarea producerii compusului dorit.
Separarea complet a cilor non-native de la ci native nu este o soluie, trebuie s existe o
conexiune ntre ele.
3. Modelarea cilor metabolice
Modelarea cilor metabolice asigur informaii privind comportamentul cii la organismul de
gazd, folosind analiza fluxului. Aceast analiz asum c sunt condiii steady-state i
fluxurile sunt determinate n funcia coeficienilor stoichiometrice. La modelarea cilor
criteriile de optimizare trebuie s fie definite, criteriul cel mai frecvent ales este producerea
maxim a biomasei, iar acesta poate fi combinat cu producerea compusului de interes.
4. Selectarea cii cel mai potrivite
Calea cu cel mai mare rat de producie va fi selectat, dup simularea comparativ a
modelelor elaborate.
5. Proiectarea genelor i integrarea cii
Prile cii metabolice trebuie s fie analizate, trebuie identificate enzimele, secvenele de
ADN trebuie s fie determinate.
6. Sinteza
Ordinea pasurilor nu este linear, iteraii pot exista ntre ele, aceste sunt necesare pentru
optimizarea procesului, informaiile dobndite la sfritul procesului de proiectare pot fi
folosite la reevaluarea informaiilor la nceput [15].
11

3.4 Programe pentru preconizarea cilor metabolice i pentru construirea

modelelor
Exist o gam larg de programe care sunt accesibile gratuit pe internet, care sunt utile i
pentru non-profesioniti, dar sunt i programe fr o interfa sofisticat. n tabelul de mai jos
sunt prezentate programele cel mai rspndite n domeniu.
Tabel 2: Lista programelor [15]
Descripie
Sistem
Preconizarea cilor
BNICE
Biochemichal Network Integrated Computational Explorer, cadru pentru

identificarea i evaluarea termodinamic a cilor posibile pentru degradarea
sau producerea compusului dorit.
System of Cho et al.
Cadru pentru identificarea i prioritizarea cilor metabolice pentru sinteza

compusului chimic specificat de utilizator
Desharky
Algoritm pentru identificarea cilor. Identific cile metabolice, care sunt cel
mai corespunztoare cu reea metabolic a unui organism gazd i identific
secvenele de aminoacizi a enzimelor corespunztoare de la organisme care
sunt similare
RetroPath
Este un web server pentru gzduirea cadrului pentru proiectarea retro-sintetic

a cilor de metabolism, integreaz preconizarea i clasificarea cilor,
preconizeaz i compatibilitatea cu gene a organismului de gazd
FMM
From Metabolite to Metabolite, este un web server pentru identificarea cilor

metabolice folosind baza de dat KEGG
CarbonSearch
Un algoritm pentru identificarea cilor metabolice prin urmrirea conservrii

atomilor
OptStrain
Este un cadru care ajut la optimizarea reelei metabolice a organismului de

gazd prin adugarea sau tergerea reaciilor
Identificarea prilor
Registry of Standard Registrul al Massachusetts Institute of Technology, coninnd diverse feluri de

Biological Parts
pri biologice, de exemplu secvene de promotori, secvene terminatorii,

plasmide. Registrul conine informaii colectate de la competiii iGEM.
Standard Biological O baz de date (inclusiv pri din Registry of Standard Biological Parts), care
Parts knowledgebase
a fost transformat n formatul Synthetic Biology Open Language pentru a face
12

informaii calculabile
IMG
Integrated Microbial Genomes, mediu pentru analiza comparativ i evolutiv

a genelor microbiale
antiSmash
Identificarea, adnotarea i analiza comparativ a genelor pentru sinteza

metaboliilor secundari
KEGG
Colecia cea mai important a metaboliilor i cilor metabolice, include ci

specifice a organismelor, hri generale cu ci metabolice, corelaii ntre gene
i enzime, informaii ortologice etc.
ASC
Activ Site Classification, folosete structura proteinelor pentru identificarea

reziduurilor lng site-ul activ al enzimelor.
Refactorarea i sinteza prilor
RBS calculator
Proiectarea automat a site-urilor de legtur ribozomal, bazat pe modele

termodinamice
RBS Designer
Algoritm pentru preconizarea eficienelor de traducere de ARNm, este

capabil pentru proiectarea site-urilor de legtur ribozomal pentru un nivel
de expresie a proteinelor
Gene Designer 2.0
Pachet de programe pentru proiectarea genelor, operonelor i vectoarelor,

optimizarea codonilor
Gene Design
Un server cu algoritmi pentru optimizarea codonilor, introducerea grafic a

site-urilor de restricie la secvene de nucleotide
Gene Composer
Program pentru proiectarea genelor
Optimizer
Web server pentru optimizarea codonilor, folosind tabelul cu rolul codoanelor

Programe pentru proiectarea cilor metabolice
Biojade
Program pentru proiectarea i simularea circuitelor genetice
Clotho
Interfa flexibil pentru proiectarea sistemelor sintetice biologice, este

capabil pentru folosirea plugin-elor cu ajutorul crora este posibil
vizualizarea, importarea i editare secvenelor ADN
Tinker Cell
Un program CAD pentru simularea sistemelor biologice
Asmparts
Instrument computaional pentru generarea modelelor prin asamblarea prilor
GenoCAD
Un program CAD pentru proiectarea secvenelor ADN, cu posibilitatea

evalurii gramaticale a genelor
WebGEC
Un simulator fabricat de Microsoft pentru evaluarea i simularea circuitelor

genetice
SynBioSS
Program pentru proiectarea, modelarea i simularea sistemelor genetice.
13

Programul poate fi folosit pentru transformarea secvenelor BioBrick (de la

Registry of Standard Biological Parts) sau altor pri ntr-un model care poate
fi simulat la programul SynBioSS Desktop Simulator
Cell Designer
Program pentru desenarea reelelor biochimice, care pot fi salvate n System

Biology Markup Langueage (SBML) format
BionetCAD
Este un plug-in pentru CAD i simularea reelelor biochimice

Modelarea metabolic i analiza fluxurilor
Cobra Toolbox
Un program standard pentru modelarea metabolic i analiza fluxurilor
Surrey FBA
Instrument pentru modelarea sistemelor la nivel genetic
CycSIM
Web server pentru analizarea modelelor metabolice, include i simulri de

eliminare a enzimelor
BioMet Toolbox
Instrument online pentru analiza modelelor metabolice, include i eliminri de

gene, optimizri de flux
iPath2
Vizualizarea interactiv a datelor cilor metabolice, elementele hrilor

metabolice bazate pe KEGG pot fi colorate dup preferina utilizatorului
GLAMM
Vizualizarea interactiv a cilor metabolice, poate folosi reele metabolice

specifice organismului de gazd i permite detectarea cilor
3.5 Modele metabolice folosite n ingineria metabolic

Exist mai multe tipuri de modele metabolice folosite pentru analiza, simularea sistemelor
metabolice n celule. Modelele mai simple sunt utile la descrierea metabolismului la o scar
mai larg, de exemplu la nivelul celulei, iar modelele mai complexe sunt utile la descrierea
metabolismelor la o scar mai mic, de exemplu numai pentru modelare glicolizei. Modelele
mai complexe necesit mai multe informaii care de multe ori nu sunt disponibile la scar mai
mare.
Modelele topologice includ interaciuni ntre metabolii i enzime, sunt folosite ca puncte de
nceput la analiza datelor i la cutarea cilor metabolice prin metode de teoria grafurilor.
Modelele stoichiometrice bazate pe constrngeri sunt modele statice cu aplicaii largi n
identificarea intei pentru modificarea genomului a organismelor. Aceste modele includ
relaii stoichiometrice ntre enzime i produi n reacii. Direcia reaciilor i constrngerii
fluxului pot fi obinute de exemplu de la valori termodinamice i capaciti enzimatice.
14

Cteva dintre aceste modele sunt adnotate cu reguli de reacii a genelor, cea ce asigur un
link direct cu genomul i permite simulaii a efectelor schimbrii genomului n organism.
Modelele stoichiometrice atom-maped include i transfere atomice la reacii metabolice.
Pentru aplicaii care includ i analiza fluxului cu
13
C este necesar folosirea modelelor
stoichiometrice atom-maped. Modelele cinetice includ i ecuaii de rat a reaciilor

metabolice, ori ecuaii simplificate ori ecuaii complexe. Ecuaii simplificate au rolul de a
prezenta reacii enzimatice cu parametri cunoscute limitate, fr complexitate. Ecuaii
complexe descriu comportamentul reaciei dependente de mecanismul enzimatic [11].
Modele stoichiometrice:
Modele Topologice:
X1: ATP+glucose=> G6P+ADP

X2: G6P=>F6P
X3: G6P+2NADP=>R5P+2NADPH+O2
X4: F6P+ATP=>2G3P+ADP
X5: 2R5P=>S7P+G3P
Modele stoichiometrice atom-maped:

Acid piruvic
1
2
3
Modele cinetice:
Acid oxaloacetic
1
2
3
Figura 5: Modele metabolice folosite n ingineria metabolic [11]
3.6 Metoda OptStrain

Metoda OptStrain este o metod care se bazeaz pe informaii enzimatice. OptStrain este
capabil de modificarea cilor prin adiia sau eliminarea reaciilor ntr-o reea microbian
pentru producerea compusului biochimic dorit [16].
Procedura Optstrain are patru trepte, fiecare dintre ele rezolv o problem diferit [17]:
Treapta 1: Descrcarea i verificarea reaciilor, dintr-o baz de date
15

Metoda are nevoie de un set de reacii enzimatice, care sunt descrcate de la una dintre baze
de date disponibile pe internet, de exemplu KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and
Genomes). Baze de date open source au dezavantajul c nu toate informaiile ncrcate sunt
verificate, astfel credibilitatea lor trebuie s fie analizat. Analiza const din calcularea
atomilor la partea reactanilor, ct i la partea produilor. Reaciile care nu sunt echilibrate
sunt excluse din lista reaciilor [16].
Treapta 2: Estimarea randamentului maxim
Pasul al doilea const din determinarea randamentului maxim de formare a produsului de
interes, de la o gam de substraturi, fr restricii la numrul reaciilor i la originea reaciilor.
Randamentul maxim teoretic este estimat pentru o unitate de substraturi, prin maximizarea
sumei fluxurilor de reacie care produce minus fluxurile de reacie care consum metabolitul
de int, ponderat cu coeficieni stoichiometrici [16].
Treapta 3: Identificarea cilor cu cel mai puine reacii strine pentru organismul gazd
Pasul urmtor folosete randamentul maxim teoretic identificat pentru a determina numrul
minim de reacii non-native care trebuie s fie adugate la reeaua organismului de gazd.
Rezultatele pasului sunt variaiile cilor metabolice clasate n ordinea eficienei, dar innd
cont de numrul reaciilor non-native. n etapa aceasta sunt analizate diferite opiuni de
organisme gazde, organismul cu cel mai mic numr de reacii non-native va fi cel mai potrivit
[16].
Treapta 4: ncorporarea reaciilor non-native la modelul stoichiometric a organismului
gazd
Analiza continu cu extinderea reelei cilor metabolice la organism gazd, cu reacii nonnative. Numai adugarea genelor necesare n sistemul metabolic a organismului nu va rezulta
n producia produsului de interes, fiindc metabolismul organismelor este proiectat pentru
corespunderea presiunilor de selecie: organismul cu cel mai mare randament de reproducere
va supravieui. Genele inutile din punctul de vedere a producerii produsului de interes trebuie
s fie eliminate pentru rezolvarea problemei [16].
16

Scopul metodei OptStrain este asigurarea ideilor despre cum s reformm sistemul metabolic
a organismelor pentru producerea compusului chimic dorit. Metoda este util nu doar n cazul
moleculelor mici, dar i n cazul producerii moleculelor mari i compleci. Validitatea i
relevana rezultatelor primite este influenat de completitudinea i precizia bazei de date a
reaciilor i modelelor de metabolism, astfel acestea trebuie s fie verificate cu grij.
Metoda OptStrain a fost examinat pentru mai multe produse, de exemplu: 1,3-propandiol,
inozitol, piruvat, hidrogen i vanilin. Cel mai promitor dintre ele este molecula 1,3propandiol care e o molecul apropiat de 1,4-butandiol, produsul nostru de interes [16].
3.7 Analiza fluxurilor

Dup identificarea cilor, pasul urmtor este analiza ratelor de producere a cilor i modului
de control al acestora. Diferena dintre ingineria metabolic i biologia molecular este c
primul se ocup cu ci metabolice integrate n locul reaciilor individuale [10].
Metoda primar pentru analiza reelelor metabolice este analiza fluxurilor metabolice.
Analiza fluxurilor metabolice este o tehnic pentru examinarea ratelor de producie i de
consum a metaboliilor ntr-un sistem biologic. Prin folosirea modelelor metabolice
stoichiometrice i spectroscopiei de mas cu izotope 13C, putem descoperi informaii privind
reeaua reaciilor [18]. La analiza fluxurilor metabolice fluxurile sunt calculate prin folosirea
modelelor stoichiometrice pentru reacii intracelulare i echilibre de mas pentru calcularea
interaciunilor extracelulare. Rezultatul final al analizei este reea fluxurilor metabolice
mpreun cu estimarea ratelor de reacii steady-state (flux).
Analiza controlului metabolic este cadrul matematic pentru descrierea cilor, metaboliilor,
semnalizrii i reelelor genetice. Analiza controlul metabolic determin cum variabilii, de
exemplu fluxuri i concentraia metaboliilor depind de parametrii reelei. n original analiza
controlului metabolic a fost dezvoltat pentru descrierea controlului cilor metabolice, iar
ulterior a fost dezvoltat pentru descrierea reelelor de semnalizare i genetice.
Analiza echilibrului de flux este o metod matematic pentru simularea metabolismului la
scar genomic. n comparaie cu metode tradiionale de modelare analiza echilibrului de flux
necesit mai puine date pentru construirea modelului, i necesit o capacitate computaional
mai mic.
17

Aplicaiile analizei echilibrului de flux sunt urmtoare:

-
Eliminarea reaciilor
Este o tehnic folosit frecvent pentru identificarea reaciilor critice pentru producerea
biomasei, deci pentru viabilitatea organismelor. Prin eliminarea reaciilor pe rnd i
msurarea fluxului prin fluxul biomasei, fiecare reacie poate fi clasificat ca reacie esenial
sau neglijabil.
-
Eliminarea reaciilor n perechi
Eliminarea reaciilor n diferite perechi posibile este folosit cel mai mult de medicin pentru
identificarea medicamentelor cu mai multe inte. Metoda este folosit i n cuantificarea
interaciunilor ntre diferite ci.
-
Eliminarea genelor
Genele sunt conectate la reaciile catalizate de enzime prin expresii Boolean cunoscute ca
expresii gene-protein-reacie corespunztor pentru fiecare reacie. Metoda este capabil de
evaluarea relaiilor logice ntre enzime, de exemplu relaia ntre dou gene este AND cnd
amndoi sunt necesare pentru expresia proteinei, iar relaie este OR cnd enzimele sunt
isoenzime. Astfel este posibil analiza eliminrii genelor singure sau multiple.
-
Inhibarea reaciilor
Efectul inhibrii reaciilor, nu eliminarea total, poate fi simulat cu analiza echilibrului de

flux prin restricionarea fluxului prin reacie. Efectul inhibrii poate fi clasificat fiind mortal
sau fiabil.
-
Optimizarea mediului de cretere a organismelor
Analiza echilibrului de flux este capabil pentru optimizarea mediului de cretere a

organismelor n privina supra-producerii compusului de interes sau n privina maximizrii
altor fluxuri.
18

Matematica n analiza echilibrului de flux

mpotriva metodelor tradiionale, analiza echilibrului de flux nu necesit folosirea ecuaiilor
difereniale ordinare, necesit foarte puine informaii referitor la parametri cinetici i
concentraia metaboliilor n sistem. Asta este obinut prin implicarea urmtoarelor
presupuneri: sistemul este steady-state i optimal. Steady-state nseamn c concentraiile
sunt constante i sistemul optimal nseamn c organismul a fost optimizat pentru inte
biologice, de exemplu creterea optim sau conservarea resurselor. Presupunerea steady-state
reduce sistemul la ecuaii lineare, care sunt rezolvate pentru identificarea distribuiei ntre
fluxuri care satisface condiiile steady-state i constrngerile stoichiometrice. Presupunerea
steady-state se bazeaz pe ecuaia urmtoare:
Dac sistemul este steady-state, acumularea este zero, astfel ecuaie devine:
Reelele metabolice aveau mai multe reacii dect metabolii, rezultnd un sistem de reacii
lineare sub-determinate, coninnd mai multe reacii dect variabile. Abordarea standard
pentru rezolvarea problemei este folosirea programrii lineare. Aceste probleme pot fi
exprimate n forma canonic:
Unde x este vectorul variabililor care trebuie s fie determinat, c i b sunt vectorii
coeficienilor cunoscute, A este matricele cunoscut a coeficienilor, i
este transpunerea
matricei. Expresia care trebuie s fie maximizat sau minimalizat este numit funcia obiectiv,
(
n cazul asta). Inegalitile
sunt constrngeri la care funcia obiectivei trebuie
s fie optimizat.
19

Programarea linear necesit definirea funciei obiectiv, soluia optim este cea care
maximalizeaz sau minimalizeaz funcia obiectiv, dup caz. n cazul analizei echilibrului de
flux, funcia obiectiv pentru programare linear, n majoritatea cazurilor, este producia de
biomas. Producia biomasei este simulat printr-o reacie care reprezint suma reaciilor care
transform precursori de biomas n biomas.
Astfel forma canonic a analizei echilibrului de flux devine:
Unde v reprezint vectorul fluxurilor care trebuie s fie determinat, S este matricea
coeficienilor care sunt cunoscute. Inegalitile
definesc
rata maxim a fluxurilor pentru fiecare reacie corespunznd coloanelor matricei S. Aceste
rate pot fi determinate experimental pentru a constrnge i a mbunti precizia de
preconizare a modelului.
Avantajul cel mai important a analizei echilibrului de flux este c nu necesit cunoaterea
concentraiilor de metabolii i cinetica enzimatic a reaciilor. Coeficienii stoichiometrici
sunt suficiente pentru maximizarea matematic a funciei obiectiv [18].
Construirea modelelor pentru analiza echilibrului de flux
Prile cel mai importante la construirea modelelor pentru analiza echilibrului de flux sunt:
-
Crearea reelei complete a proceselor metabolice
Adugarea constrngerilor n model
Adugarea funciei obiectiv
Cerina principal a reelei este s fie complet, asta nseamn c o evaluare excesiv este
necesar. Pachetele de software pentru construirea modelelor sunt prezentate n capitolul
anterior.
Partea cheie la analiza echilibrului de flux este abilitatea de a aduga constrngeri la rata
fluxurilor de reacii, fornd acestea s rmn ntr-un interval predefinit, asta face modelul s
20

fie real. Sunt dou feluri de constrngeri: constrngeri la sfritul metabolismului, care
limiteaz absorbia i excreia nutrimentelor, i constrngeri interne pentru limitarea
fluxurilor ntre reacii.
Fiecare organism are un mediu de cretere la care absoarbe nutrieni i triete n condiii
bune. n general rata de absorbie este influenat de disponibilitatea nutrienilor, concentraia
lor. Dac rata de absorbie a nutrienilor este msurabil experimental, informaia asta poate
fi adugat ca constrngere n model, prin rate de flux la sfritul sau la nceputul modelului
metabolic. Asta asigur c nutrieni care nu sunt prezeni, sau nu sunt absorbite de organism,
s nu intre n metabolism, pentru ei, rata de flux este zero.
n principiu toate reaciile sunt reversibile, totui n practic reaciile se desfoar numai
ntr-o singur direcie. Asta poate fi datorit concentraiei mai mari a reactanilor n
comparaie cu concentraia produselor, dar de multe ori este datorit entalpiei libere mai mici
a produselor n comparaie cu reactanii, astfel direcia de nainte este mai favorabil [18].
Analiza echilibrului de flux folosete modele stoichiometrice la nivelul genelor. Recent o
mulime de astfel de modele au fost dezvoltate, de exemplu, pentru Escherichia coli. Modelul
acestuia include 2077 reacii, 1039 metabolii. Cu ajutorul modelului, prin folosirea analizei
echilibrului de flux, cercettorii au reuit de exemplu supra-producerea licopenului [10].
Modele similare au fost dezvoltate pentru Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis,
Clostridium acetobutylicum, Corynebacterium glutamicum, Arabidopsis thaliana, chiar i
pentru oameni [10].
3.8 Programul OptFlux

Programul OptFlux este o platform pentru ingineria metabolic pentru identificarea
reaciilor care trebuie s fie adugate n genomul microorganismelor, cum i pentru
identificarea reaciilor care trebuie s fie eliminate pentru producerea compusului de interes,
pstrnd viabilitatea organismului [19]. Programul este open-source, accesibil gratuit pentru
toi, ncorporeaz mai multe algoritme pentru optimizarea cilor metabolice.
Optimizarea cilor are limitaii cnd modelele metabolice sunt incomplete sau cnd compusul
de interes nu poate fi produs. n aceste cazuri trebuie s fie adugate la model reacii
21

adiionale, un plug-in separat a fost dezvoltat n aceast privin, care face posibil adugarea
reaciilor dintr-o baz de date extern [19].
Programul poate lucra cu formatul SBML (Systems Biology Markup Language), dar are i o
bibliotec online proprie cu modelele cilor metabolice care sunt verificate de echipa OptFlux
i pot fi de ncredere. OptFlux determin valorile fluxurilor de reacii care sunt incluse n
model, corespund condiiile mediului (fluxul substraturilor) i condiii genetice [20].
Metode i materiale
4.1 Ci pentru producerea de 2,3-butandiol

Dup vasta analiz a metodelor pentru preconizarea cilor metabolice ncercm s folosim n
practic programele menionate. Scopul este s avem o idee simpl despre producerea de 2,3-butandiol prin fermentare i s avem o idee despre folosirea programelor.
Platforma online FMM a gsit ase ci cu diferene foarte mici pentru producerea de 2,3butandiol din D-glucoz, fiecare cale avnd 9 trepte. Nu toate dintre enzimele identificate
sunt disponibile la un organism, astfel la organismul de gazd trebuie adugate genele
necesare. Calea identificat de platforma FMM atinge calea pentoz-fosfat, sinteza acidului
pantotenic i coenzimei A i metabolismul butanoate. Calea identificat este prezentat n
Figura 3.
Calea identificat de FMM este similar cu calea gsit la baze de date Metacyc, care este
prezentat n Figura 2 [21].
22

Figura 6: Calea gsit la date de baze Metacyc pentru producerea de 2,3-butandiol
23

Figura 7: Rezultatele primite la platforma online FMM [22]
24

Pasul urmtor ar fi implementarea cii prezentate n Figura 3, i simularea modelului, sau

identificarea unui organism la care se gsesc toate enzimele necesare procesului. Dup cum
se vede din Tabelul 2, nici una dintre organismele din natur nu conine toate enzimele
necesare procesului, cel mult ase din nou enzime se gsesc la organisme. Ca un pas urmtor
ar fi alegerea unuia dintre organismele din tabelul de mai jos, i completarea lui cu cile
necesare producerii de 2,3-butandiol.
Tabel 3: Speciile i enzimele din procesul determinat de FMM [22]
Numrul
Enzime
enzimelor
Specii
1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 1.1.1.4 Agrobacterium tumefaciens str. C58
1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 1.1.1.4 Sinorhizobium meliloti 1021
1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 4.1.1.5 Pseudoalteromonas atlantica T6c
1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 1.1.1.4 Sinorhizobium medicae WSM419
1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 4.1.1.5 Serratia proteamaculans 568
1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 4.1.1.5 Enterobacter sp. 638
Proiectul path2models este un mare ajutor, fiind o iniiativ pentru transformarea cilor
metabolice de la baza de date KEGG, n format SBML, iar sunt i transformate modele
metabolice complete al organismelor [23]. Obstacolul cel mai mare este standardizarea
insuficient a modelelor n formatul SBML, muli dintre ele nu pot fi folosite de programele
menionate n capitole anterioare. Chiar i dac modelele sunt cunoscute de programe, sunt
deschise parial, muli dintre valori nu sunt completate, cel mai frecvent lipsesc valorile
ratelor cinetice a reaciilor.
Astfel decizia a fost construirea numai a unei pri a modelului responsabil pentru producerea
de 2,3-butandiol, cu ajutorul programului Matlab Simbiology, folosind datele cinetice din
baza de date BRENDA. Conform literaturii, producerea industrial a 2,3-butandiolului se
face cu ajutorul organismului Enterobacter [24], ceea ce apare i n Tabelul 2. Astfel
organismul ales este Enterobacter sp. 638 unde se gsesc valorile cinetice. Valorile Km sunt
alese pentru varianta slbatic a enzimelor unde a fost disponibil.
25

Tabel 4: Valorile Km pentru enzimele necesare pentru producerea de butandiol conform FMM
Numr EC
Numele enzimelor
quinoprotein glucose dehydrogenase
1.1.5.2
glucose dehydrogenase (acceptor)
Valoarea Km
Kcat
mM
1/s
0,95
3860
1.1.99.10
2,5
??
gluconolactonase
3.1.1.17
9,4
162
gluconate dehydratase
4.2.1.39
760
2-dehydro-3-deoxygluconokinase
2.7.1.45
11
2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase
4.1.2.14
1,9
0,0063
acetolactate synthase
2.2.1.6
4,8
40,3
acetolactate decarboxylase
4.1.1.5
??
??
(R,R)-butanediol dehydrogenase
1.1.1.4
??
Regulile reaciilor au fost determinate conform cineticii enzimatice Michaelis Menten,

folosind valorile din Tabelul 3. Fiecare reacie a fost verificat pe rnd, toi dintre ele sunt
reacii reversibile, modelul elaborat ine cont i de coeficienii stoichiometrici.
Figura 8: Modelul la platforma Simbiology
26

Fluxurile reaciilor sunt prezentate pe Figura 4, este exact aceeai ca i n cazul Figurii 3,
adic urmrete rezultatele platformei FMM. Modelul nu ine cont de alte reacii care sunt
necesare pentru viabilitatea organismului, astfel exerciiul are numai un scop orientativ
asupra funcionrii programelor.
Am realizat o analiz de flux la programul Simbiology, rezultatele sunt prezentate n Figura
5.
Figura 9: Concentraiile metaboliilor
Cantitatea de glucoz este 5 mM la intrare, valoarea lui nu este constant, deci se consum la
reacie. Poate fi observat c concentraia de butandiol va ajunge numai la jumtatea
concentraiei originale a glucozei. Acest fapt este datorit reaciei de formare a 2-acetolactat
din piruvat, la care din dou piruvat se formeaz o 2-acetolactate, conform reaciilor
prezentate n continuare, reacia este reversibil.
27

D-Glucose + Quinone <=> D-Glucono-1,5-lactone + Hydroquinone
D-Glucono-1,5-lactone + H2O <=> D-Gluconic acid
D-Gluconic acid <=> 2-Dehydro-3-deoxy-D-gluconate + H2O
ATP + 2-Dehydro-3-deoxy-D-gluconate <=> ADP + 2-Dehydro-3-deoxy-6-phospho-Dgluconate
28

2-Dehydro-3-deoxy-6-phospho-D-gluconate <=> D-Glyceraldehyde 3-phosphate + Pyruvate
2-Acetolactate + CO2 <=> 2 Pyruvate
(S)-2-Acetolactate <=> (R)-Acetoin + CO2
29

(R,R)-Butane-2,3-diol + NAD+ <=> (R)-Acetoin + NADH + H+

Dac ar fi vorb despre un sistem metabolic complet, care a fost dezvoltat cu reacii
necesare pentru producerea compusului chimic de interes, o analiz Optknock ar fi necesar
pentru identificarea reaciilor de eliminare, pstrnd viabilitatea organismului i maximiznd
rata de producere a compusului chimic de interes. Pentru analiza Optknock avem nevoie de
alte programe, de exemplu Optflux sau Cobra Toolbox.
Rezultate i discuii
Barierele cei mai mari al preconizrii cilor metabolice sunt:

-
Standardizarea insuficient a formatului SBML
Lipsa datelor cinetice
Pentru rezolvarea problemelor menionate, programele folosite la pasurile descrise la

Capitolul 3.2 trebuie s fie combinate cu grij, de exemplu: avem o ans mai mare de
compatibilitate ntre programe Cobra toolbox i Simbiology, fiindc amndou sunt operate
n cadrul programului Matlab. Modelul elaborat n Simbiology nu a fost recunoscut de
programul Optflux, n ciuda faptului c modelul a fost salvat n format SBML level 2 version,
cea ce este compatibil cu programul.
Colectarea datelor cinetice este una dintre cel mai grele sarcini la modelarea proceselor
biochimice. Sunt mai multe baze de date pe internet cu valori cinetice a enzimelor de
exemplu: Brenda. Problema este c valorile cinetice sunt specifice, sunt influenate de
organismul gazd, substrat, condiii de mediu: temperatura i pH. Metoda cea mai uoar este
identificarea organismului de gazd care conine cel mai muli dintre enzime necesare pentru
producerea compusului chimic de interes, dar n acelai timp este disponibil i modelul lui
complet i verificat n colecia modelelor SBML. Modelul asta apoi trebuie s fie completat
cu reacii non-native, care sunt inexistente n organismul gazd. Este recomandat
determinarea valorilor cinetice prin experimente n laborator, cnd acestea nu sunt
disponibile.
30

Exerciiul realizat n Capitolul 3.8 a avut inta de a identifica o cale pentru producerea de 2,3butandiol, cea ce exist ca un metabolit n organismele naturale, iar inta original este
identificarea cilor pentru producerea de 1,4-butandiol cea ce nu exist la nici una dintre
organismele naturale cunoscute n momentul de fa. La Capitolul 3.8 am optat la 2,3butandiol din motive simplificatoare. Modificarea, modelarea organismelor pentru
producerea de 1,4-butandiol este o sarcin mult mai mare. Cei din Genomatica au ales
Escherichia coli ca organism de gazd, din motive practice: este cel mai rspndit i cunoscut
organism folosit n industria biochimic. Modelul detaliat a lui este disponibil. Ei au folosit
o metod bazat pe operatori de reacii n schimb de metodologiile bazate pe reacii
enzimatice cunoscute, astfel au identificat i ci non-native, cea ce este esenial cnd este
vorba de un compus de interes care nu se gsete la nici una dintre organismele cunoscute
[1]. Metodologia folosit de ei este foarte similar cu metodologia descris la Capitolul 3.4.:
Managementul
operatorilor de
reacii
Planificarea operatorilor de reacii bazat pe reguli chimice i clase de enzime

Adugarea operatorilor de reacii la baze de date al programului SimPheny Biopathway
Predictor
Definirea metabolitelor
Calcularea
reelelor
Selectarea compusului de int de la baze de date

Selectarea dimensiunii reelei
Selectarea limitei de mrime a moleculelor
Calcularea reelei: pentru fiecare nivel, operatori de reacii sunt aplicate
Integrarea
automat cu
ajutorul SimPheny
Adugarea metabolitelor secundari la reeaua reaciilor

Calcualrea speciilor dominante i ncrcate la pH neutru
Echilibrarea reaciilor
Calcularea proprietiilor termodinamice
Semnarea reaciilor i metaboliilor cunoscui
Urmrirea cilor
Selectarea manual a metaboliilor de intrare de la reea calculat

Selectarea manual a lungimei maxim a cii
Urmrirea automat a cilor de la metabolii de intrare selectat
Calcularea automat a reaciilor i termodinamica cilor
Prioritizarea i
evaluarea cilor
Calcularea ratei maxime de producere teoretic n modelul metabolic

Selectarea i prioritizarea cilor conform criteriilor de selecie
Evaluarea manual a rezultatelor
Figura 10: Metodologia folosit de Genomatica [1]
31

Folosind metoda prezentat n Figura 10, au obinut mai muli de 10000 de ci alctuite din 4
sau 6 trepte, de la metabolii obinuii cum sunt acetil-CoA, -ketoglutarate, succinil-CoA i
glutamat. Dup prioritizarea cilor innd cont de rata maxim teoretic, lungimea cii,
numrul treptelor non-native, numrul treptelor native i fezabilitatea termodinamic a
procesului au redus numrul cilor la 10 procente. Cile rmase au fost prioritizate folosind
alte criterii: numrul treptelor fr enzime caracterizate (bazat pe Kyoto Encyclopedia a
Genelor i baza de date intern), numrul treptelor non-native, numrul treptelor din
metabolismul central. Fiecare dintre procesele selectate au atins 4-hidroxibutirat [1]:
Figura 11: Calea metabolic adugat la E. Coli de Genomatica, Enzimele numerotate sunt: 1. 2-oxoglutarate
decarboxylase, 2. Succinil-CoA synthetase, 3. Succinate semialdehyde dehydrogenase dependent de CoA, 4. 4hydrixybutirat dehidrogenase, 5. 4-hydroxybutyryl-CoA transferase, 6. 4-hydroxybutyryl-CoA reductase, 7. Alcohol
dehydrogenase [1].
Treptele 2 i 7 exist n natur n sistemul metabolic al Escherichia Coli, celelalte trepte au

fost introdui artificial. Din motive de validare au ales mprirea procesului la dou pri:
partea pentru producerea de 4-hidroxibutirat i partea pentru producerea de 1,4-butandiol.
Partea pentru producerea de 4-hidroxybutirat are dou opiuni, amndou ncep cu compuse
din ciclul acidului citric, una de la succinat, alta de la -cetoglutarate. Versiunea cu cetoglutarate este mai fezabil din punct de vedere termodinamic, conine mai puine trepte,
fr reacii reversibile.
Partea pentru producerea de 1,4-butandiol necesit dou trepte de reducie, catalizate de
dehidrogenaze. Enzimele necesare procesului nu au fost identificate, astfel o list de enzime
candidate au fost identificate pe baza activitii lor cu 4-hidroxibutirat sau cu molecule
32

similare. Dup un numr de experimente, enzimele alese au fost 4-hydroxybutyril-CoAreductaz i 4-hydroxybutyril-CoA-reductaz. Astfel sa produs o cantitate de 138 M 1,4butandiol.
Obiectivul propus esteproducerea de 1,4-butandiol ntr-un singur pas, , folosind acelai
organism. Cercettorii la Genomatica au combinat plasmidele necesare proceselor discutate
mai sus, la prima parte au insertat genele necesare pentru producerea de 4-hidroxybutirat, din
ambele substraturi: succinat i -cetoglutarate. Astfel au reuit s produc 1,3 mM de 1,4butandiol n 40 de ore.
Dup producerea de 1,4-butandiol, dovedind c procesul este viabil, s-a urmrit optimizarea
procesului prin eliminarea genelor pentru a pstra metabolismul pe calea bine definit. Dup
o analiz OptKnock s-au identificat enzimele care trebuie s fie eliminate pentru obinerea
ratei maxime. Producerea de etanol, metanoate, lactat i succinat au fost blocate, astfel
fornd organismul pentru producerea de 1,4-butandiol pentru balansarea potenialului redox.
95% a carbonului a fost transferat spre calea pentru producerea de 1,4-butandiol dup
optimizare. Enzimele la sfritul cii au fost reconsiderate, au fost alese acelai enzime, dar
de la diferite organisme, tot rezultnd n creterea ratei de producere de 1,4-butandiol.
Substratul preferat a fost zaharoza, fiind mai ieftin i rspndit dect glucoza, iar au i
ncercat mai multe feluri de carbohidrai, iar la nici una dintre ele nu s-au obinut o producie
mai mare dect n cazul glucozei.
n final cercettorii la Genomatica au obinut o producie de 1,4-butandiol la o concentraie
de 20 g/L, cea ce momentan nu este economic, o concentraie n jur de 100 g/L este necesar
pentru ca procesul s fie fezabil [1].
Cercetrile n continuarea au rolul de a proiecta un proces ct mai economic, nu doar prin
optimizarea procesului de fermentare, dar ct i prin identificarea noilor ci.
Identificarea noilor ci pentru producerea de 1,4-butandiol este un proces foarte complicat, i
necesit o expertiz de nivel nalt. Astfel am decis evaluarea i evidenierea unor dintre cele
cinci ci identificate de Genomatica (Figura 12). Evaluarea const din urmtoarele:
-
Identificarea enzimelor care particip la proces

33

Construirea modelului n format SBML
Analiza echilibrului de flux a modelului
Identificarea genelor care trebuie s fie eliminate
Construirea plasmidelor i efectuarea experimentelor n laborator
dezvoltarea modelului, folosind rezultatele experimentelor

Alpha - ketoglutarate
2.8.3 6.2.1
Alfa ketoglutaryl CoA
1.1.1
5 hydroxy 2
oxopentanoic acid
4.1.1
4 - hidroxybutanal
1.1.1
1,4 - butanediol
Figura 12: drumul metabolic ales dintre cei 5 ci identificate
de Genomatica
Procesul ncepe cu alfa-ketoglutarate, metabolit de la ciclul acidului citric. Enzimele

prezentate n Figura de mai sus sunt numai propuneri, sunt enzime ale cror funcii cunoscute
sunt similare cu funcia care trebuie s fie ndeplinit n calea metabolic pentru producerea
de 1,4-butandiol. Un set de enzime au fost identificate, ele sunt prezentate n Tabelul 5:
34

Tabel 5: Enzimele identificate pentru procesul prezentat n Figura 12
Numr
Numele
ID de gene
EC
genului
bank
Numele enzimei
Substratul
cunoscut
Numrul
acidelor
amino
KM
mM
Organism
succinylCoA:acetate CoA2.8.3.18
cat1
transferase
succinate
505
0.9
Acetobacter aceti
SuccinylCoA:coenzyme A
2.8.3.18
cat1
P38946.1
transferase
acetate
2.8.3.8
cat2
Clostridium
succinate
538
n/a
kluyveri
Acetate
216
110
Acetobacter aceti
CoA-
transferase
4-hydroxybutyrate
coenzyme
2.8.3.-
cat2
P38942.2
A 4-hydroxi
transferase
Butyrate
glutaconate
2.8.3.12
gctA
CAA57199.1
2.8.3.8
atoA
P76459.1
atoD
P76458.1
n/a
kluyveri
Acidaminococcus
glutarate
320
0.7
fermentans
butanoate
216
n/a
Escherichia coli
butanoate
220
n/a
Escherichia coli
adipyl-CoA
286
n/a
Escherichia coli
succinate
388
0.25
Escherichia coli
succinate
289
0.25
Escherichia coli
258
n/a
Bacillus subtilis
CoA-
transferase
acetate
2.8.3.8
429
CoA-
transferase
acetate
Clostridium
CoA-
transferase
acyl-CoA
3.1.2.18
tesB
NP_414986
thioesterase 2
Succinate-CoA
6.2.1.5
sucCD
NP_415256.1 ligase
Succinate-CoA
6.2.1.5
sucCD
AAC73823.1
ligase
6Carboxyhexanoate-
6.2.1.14
1.1.1.c
bioW
adhE2
NP_390902.2 CoA ligase
AAK09379.1
6-carboxy
hexanoate
alpha-ketoglutaryl
butanoyl-
CoA reductase
CoA
Clostridium
858
alpha-ketoglutaryl
1.1.1.c
mcr
AAS20429.1
CoA reductase
35
acetobutylicum
Chloroflexus
malonyl-CoA
1220
30
aurantiacus

5-hydroxy-2-
2-
oxopentanoic acid oxopentanoic

4.1.1.a
pdc
P06672.1
decarboxylase
acid
5-hydroxy-2-
2-
Zymomonas
568
4.7
oxopentanoic acid oxopentanoic

4.1.1.a
mdlC
P20906.2
decarboxylase
mobilus
Pseudomonas
acid
528
0.056
putida
>C3
387
0.67
Escherichia coli
1,4-butanediol
1.1.1.a
1.1.1.a
yqhD
4hbd
NP_417484.1 dehydrogenase
L21902.1
1,4-butanediol
Succinate
dehydrogenase
semialdehyde
Clostridium
371
0.055
kluyveri
La identificarea enzimelor am folositbaza de date NCBI (National Center of Biotechnological

Information), pentru identificarea informaiilor cinetice sursa a fost baza de date BRENDA.
Dup cum se vede i n Tabelul 5, enzimele sunt specifice, activitatea lor depinde de substrat,
de organism n care sunt prezente, i de condiii de mediu (pH i temperatura). Valorile
prezentate n tabel sunt numai orientative, un set de experimente trebuie s fie efectuate
pentru a determina activitatea specific a enzimelor n calea pentru producerea de 1,4butandiol.
Enzimele identificate i substraturile sunt examinate, dac sunt capabile pentru formarea
complexului enzim-substrat, prin metoda andocare molecular. Metoda andocare molecular
este o metod care precizeaz orientarea preferat de o molecul ctre alta cnd se leag s
formeze un complex stabil. Cunoaterea asocierilor preferate poate fi folosit pentru a prezice
puterea de asociere ntre dou molecule, folosind funciile scoring. Majoritatea funciilor
scoring se bazeaz pe cmpul forelor de mecanic molecular. O energie negativ sczut
indic stabilitatea sistemului. De asemenea, andocarea (docking) este o unealt esenial
pentru procedeele de screening virtual, n cadrul crora o categorie de compui sunt andocai
ntr-o int i sunt calculate cele mai bune interaciuni. Din acest motiv, andocarea este
utilizat frecvent i n prezicerea afinitii de legare a unor molecule mici (medicamente) de
proteine int sau a activitilor biologice ale acestor molecule (medicamente) [25].
Noi am folosit programul AutoDock Vina pentru andocarea substraturilor i enzimelor.
AutoDock este unul dintre cel mai citate softwareruri in literatur de specialitate, programul
36

este open-source, este disponibil gratuit pentru toi. Rezultatele andocrii sunt prezentate n
tabelul urmtor:
Tabel 6: Afinitate de legare a substraturilor cu enzimele [26]
Substraturi
Alfaketoglutarate
Alfaketoglutarate
Alfaketoglutarate
Alfaketoglutarate
Alfaketoglutarate
Substraturi
cunoscute
Numele
enzimelor
Succinate
SuccinylCoA:coenzyme A
transferase
succinylCoA:acetate CoAtransferase
Butanoate
acetate CoAtransferase
adipyl CoA
acyl-CoA
thioesterase 2
Succinate
Succinate-CoA
ligase
Succinate
Organisme gazde
Clostridium
kluyveri(pighearth)
Afinitatea Afinitatea
de legare de legare
sb1
sb test
kcal/mol kcal/mol
-4.7
-4.6
-5
-4.7
-5
-3.7
-5.6
-7.7
-5.2
-5.1
n/a
n/a
-8.1
n/a
Acetobacter aceti
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
(AAC738231)
Clostridium
acetobutylicum
-6.3
-6
AlfaketoglutarylCoA Butanoyl CoA
Succinate-CoA
ligase
3-hydroxybutyrylCoA
dehydrogenase
alcohol
dehydrogenase
(NADP+)
Chloroflexus
aurantiacus
-7.8
-8.2
AlfaketoglutarylCoA Malonyl CoA
alpha-ketoglutaryl
CoA reductase
5 hydroxy 2
oxopentanoicacid
2 oxopentanoic
acid
pyruvate
decarboxylase
-5.3
-5
-3.9
n/a
>C3 (9)
1,4-butanediol
dehydrogenase
Alfaketoglutarate
Succinate
AlfaketoglutarylCoA n/a
4 hydroxybutanal
Escherichia coli
Zymomonas mobilus
Escherichia coli
Afinitatea de legare este capabilitatea de asociere a ligandelor cu un receptor. Afinitatea de

legare depinde de forele de atragere ntre liganzi i receptoare. Valorile de afinitate de legare
mai mici nseamn o legtur ntre receptor i ligand mai mare.
n tabelul de mai sus (Tabel 6) sunt prezentate afinitile de legare ntre enzimele care
particip la calea pentru producerea de 1,4-butandiol propus de genomatica (Figura 12) i
37

substraturile intermediare. Lng asta am fcut i simulri pentru identificarea afinitilor de

legare ntre enzimele menionate i substraturile lor cunoscute, n cazul crora tim c
complexul enzim-substrat se formeaz. Dup cum se vede nu sunt diferene semnificative
ntre valorile cu substraturi cunoscute i cu substraturi din calea identificat de Genomatica.
Putem trage concluzia c teoretic reacia ntre substraturile i enzimele propuse este posibil.
n continuare sunt prezentate rezultatele detaliate al andocrii. Imaginile de 2D prezint
structurile moleculare a liganzilor i modul de legare a lor cu receptoare. n tabelul urmtor
sunt definite simbolurile folosite la prezentarea detaliat al andocrii:
Simbol
Descriere
Reziduuri implicate n legturi de hidrogen
Reziduuri implicate n legturi Van der Waals.
Molecule de ap
Atomi de metal
Reziduuri implicate n legtur covalent
Suprafaa accesibil de solveni a reziduului
Suprafaa accesibil de solveni a atomului
Interaciuni de legtur de hidrogen cu reziduuri care nu sunt aminoacizi
Interaciuni de legtur hidrogen cu aminoacizi din lanul primar
Interaciuni de legtur hidrogen cu aminoacizi din lanul secundar
Interaciuni electromagnetice
Interaciuni Pi
38

Numele enzimei: Succinyl-CoA:coenzyme A transferase

Organism gazd: Clostridium kluyveri(pighearth)
Numele substratului: Alfaketoglutarate. -4.7 kcal/mol
Numele substratului: Succinate. -4.6 kcal/mol
39

Numele enzimei: succinyl-CoA:acetate CoA-transferase

Organism gazd: Acetobacter aceti
Numele substratului: Alfaketoglutarate. -5 kcal/mol
Numele substratului: Succinate. -4.7 kcal/mol
40

Numele enzimei: acetate CoA-transferase

Organism gazd: Escherichia coli
Numele substratului: Alfaketoglutarate. -5 kcal/mol
Numele substratului: Butanoate. -3.7 kcal/mol
41

Numele enzimei: acyl-CoA thioesterase 2

Numele substratului: Alfaketoglutarate. -5.6kcal/mol
Numele substratului: adipyl CoA. -7.7kcal/mol
42

Numele enzimei: Succinate-CoA ligase

Numele substratului: Alfaketoglutarate. -5.2kcal/mol
Numele substratului: Succinate. -5.1kcal/mol
43

Numele enzimei: 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase

Numele substratului: AlfaketoglutarylCoA. -8.1kcal/mol
Numele enzimei: 1,4-butanediol dehydrogenase

Numele substratului: 4 hydroxybutanal. -3.9kcal/mol
44

Numele enzimei: alcohol dehydrogenase (NADP+)

Organism gazd: Clostridium acetobutylicum
Numele substratului: Butanoyl CoA. -6kcal/mol
45

Numele enzimei: alpha-ketoglutaryl CoA reductase

Organism gazd: Chloroflexus aurantiacus
Numele substratului: Malonyl CoA. -8.2kcal/mol
46

Numele enzimei: pyruvate decarboxylase

Organism gazd: Zymomonas mobilus
Numele substratului: 5 hydroxy 2 oxopentanoicacid. -5.3kcal/mol
Numele substratului: 2 oxopentanoic acid. -5kcal/mol
n imaginile de mai sus sunt prezentate interaciunile ntre atomii liganzilor i aminoacizi a
receptoarelor. Liganzii sunt prezentate la nivel atomic, receptoarele sunt prezentate la nivel
47

molecular. Pentru o analiz mai detaliat, identificarea interaciunilor la nivel atomic la

ambele pri ar fi necesar. Majoritatea interaciunilor sunt legturi intermoleculare de
hidrogen, iar sunt i exemple de interaciuni pi i de interaciune electrostatice.
n continuare vom analiza interaciunile ligand-receptor la nivel atomic.
48

Bibliografie
[1] Harry Yim, Robert Haselbeck, Wei Niu, Catherine Pujol-Baxley, Anthony Burgard, Jeff
Boldt,Julia Khandurina, John D Trawick, Robin E Osterhout, Rosary Stephen, Jazell
Estadilla, Sy Teisan, H Brett Schreyer, Stefan Andrae, Tae Hoon Yang, Sang Yup Lee,
Metabolic engineering of Escherichia coli for direct production of 1,4 - butanediol,
Nature Chemical Biology, vol. 7, 2011.
[2] Prospectus, Is Bio-Butandiol here to stay?, Chemsystems Online, New York, 2012.
[3] Genomatica, Inc., Genomatica Sustainable Chemicals, [Interactiv]. Available:
http://www.genomatica.com/products/genobdoprocess/. [Accesat 01 06 2014].
[4] B. C. Stockton, D. J. Mitchell, K. Grohmann, M. E. Himmel, Optimum-D-glucosidase
supplementation of cellulase for efficient conversion of cellulose to glucose,
Biotechnology Letters, vol. 1, pp. 57-62, 1991.
[5] Wikipedia contributors, Biodiesel production, Wikipedia, The Free Encyclopedia., 10
07
2014.
[Interactiv].
Available:
http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Biodiesel_production&oldid=616326940.
[Accesat 14 07 2014].
[6] S. S. Yazdani i R. Gonzalez, Engineering Escherichiacoli for the efficient conversion
of glycerol to ethanol and co-products, Metabolic Engineering, vol. 10, p. 340351,
2008.
[7] Wikipedia contributors, 1,4-Butanediol, Wikipedia, The Free Encyclopedia., 08 07
2014.
[Interactiv].
Available:
http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=1,4-
Butanediol&oldid=616101300. [Accesat 14 07 2014].

[8] R. E. Bibolet, G. E. Fernando i S. M. Shah, Renewable 1,4-Butanediol, Pennsylvania:
Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of Pennsylvania,
2011.
49

[9] Han-Yu Chuang, Matan Hofree, Trey Ideker, A Decade of Systems Biology, Annual
Review of Cell and Developmental Biology, vol. 26, pp. 721-744, 2010.
[10] B. M. Woolston, S. Edgar i G. Stephanopoulos, Metabolic Engineering: Past and
Future, Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering, vol. 4, p. 25988,
2013.
[11] P. Jouhten, Metabolic modelling in the development of cell factories by synthetic
biology, Computational and Structural Biotechnology Journal, vol. 3, 2012.
[12] Ayoun Cho, Hongseok Yun, Jin Hwan Park, Sang Yup Lee, Sunwon Park, Prediction
of novel synthetic pathways for the production of desired chemicals, BMC Systems
Biology, 2010.
[13] Vassily Hatzimanikatis, Chunhui Li, Justin A. Ionita, Christopher S. Henry, Matthew D.
Jankowski and Linda J. Broadbelt, Exploring the diversity of complex metabolic
networks, Bioinformatics, vol. 21, pp. 1603-1609, 2005.
[14] J. Nielsen, Applied Microbiology and Biotechnology, Metabolic Engineering, vol. 55,
pp. 263-283, 2001.
[15] Marnix H. Medema, Renske van Raaphorst, Eriko Takano and Rainer Breitling,
Computational tools for the synthetic design of biochemical pathways, Glasgow, 2012.
[16] Priti Pharkya, Anthony P. Burgard, Costas D. Maranas, OptStrain: A computational
framework for redesign of microbial production systems, Genome Research, vol. 14,
pp. 2367-2376, 2004.
[17] Priti Pharkya, Costas D. Maranas, OptStrain: A hierarchical metabolic pathway
discovery and design framework for microbial production systems.
[18] Edwards, J., Ibarra, R. & Palsson, B, In silico predictions of Escherichia coli metabolic
capabilities are consistent with experimental data, Nature Biotechnology, vol. 19, p.
125130, 2001.
50

[19] Sara Correia, Miguel Rocha, Computational tools for strain optimization by adding
reactions.
[20] Bioinformatics and Systems Biology Interdisciplinary Interactive, OptFlux 3 Beginner'
tutorial, 2012.
[21] Superpathway of (R,R)-butanediol biosynthesis, MetaCyc , [Interactiv]. Available:
http://biocyc.org/META/new-image?type=PATHWAY&object=P125-PWY&detaillevel=2&ENZORG=TAX-1718#. [Accesat 09 06 2014].
[22] From Metabolite to Metabolite, Department of Biological Science and Technology,
Institute of Bioinformatics National Chiao Tung University, Hsinchu, Taiwan,
[Interactiv]. Available: http://fmm.mbc.nctu.edu.tw/index.php. [Accesat 09 06 2014].
[23] Finja Bchel, Nicolas Rodriguez, Neil Swainston, Clemens Wrzodek, Tobias Czauderna,
Roland Keller, Florian Mittag, Michael Schubert, Mihai Glont, Martin Golebiewski,
Martijn van Iersel, Sarah Keating, Matthias Rall, Michael Wybrow, Henning
Hermjakob, etc., Path2Models: large-scale generation of computational models from
biochemical pathway maps, BMC System Biology, 2013.
[24] W. contributors, Butanediol fermentation, Wikipedia, The Free Encyclopedia., 29 10
2013.
[Interactiv].
Available:
http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Butanediol_fermentation&oldid=579296550.
[Accesat 12 06 2014].
[25] Denisa-Constantina Amzoiu, Prof. univ. dr. Florica Popescu, Cercetri farmacologice i
modele virtuale predictive asupra implicrii unor derivai din clasa oxicamilor n tresul
oxidativ la pacieni cu boal artrozic, Universitatea de Medicin i de Farmacie din
Craiova , 2011.
[26] O. Trott, A. J. Olson, AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking
with a new scoring function, efficient optimization and multithreading, Journal of
Computational Chemistry, vol. 31, pp. 455-461, 2010.
51

52

Referat de Doctorat - Producerea de 1.4-Butandiol Prin Fermentare

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Referat de Doctorat - Producerea de 1.4-Butandiol Prin Fermentare

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Universitatea POLITEHNICA din Bucureti

Splaiul Independenei nr. 313, Bucureti RO-060042, ROMNIA

Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

Obiectivele cercetrii .......................................................................................................... 4

Studiu bibliografic .............................................................................................................. 5

Biologia sistemic i ingineria metabolic .................................................................. 6

Pasurile generale n ingineria metabolic a organismelor ........................................... 9

Programe pentru preconizarea cilor metabolice i pentru construirea modelelor ... 12

Modele metabolice folosite n ingineria metabolic ................................................. 14

Metoda OptStrain ...................................................................................................... 15

Analiza fluxurilor ...................................................................................................... 17

Programul OptFlux .................................................................................................... 21

Metode i materiale .......................................................................................................... 22

Ci pentru producerea de 2,3-butandiol .................................................................... 22

Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

1,4-Butandiol este un produs chimic important la producerea polimerilor, iar n momentul de

Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

ns tehnologia cercetat exist, tema rmne deschis, ar putea exista posibiliti de

Obiectivul global al cercetrii este producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

Figura 1: Reacia de formare a biodieselului [5]

Glicerolul a devenit un produs secundar ieftin, la fiecare 100 L de biodiesel produs se

Figura 2: Molecula de 1,4 butandiol [7]

Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

1,4-butandiol este folosit ca solvent la lichide de curire industriale, de exemplu

3.2 Biologia sistemic i ingineria metabolic

Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

Figura 3: Procesul de dezvoltare, modificare genetic a microorganismelor [11]

Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

3.3 Pasurile generale n ingineria metabolic a organismelor

Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

Preconizarea cilor metabolice

BNICE, Desharky, FMM, RetroPath

Prioritizarea cilor metabolice

Desharky, Retro Path

Modelarea cilor metabolice

COBRA toolbox, SurreyFBA, CycSim, Biomet

Selectarea cii cel mai potrivite

Proiectarea genelor i integrarea

RBS Calculator, Gene Designer, GeneDesign,

DNAWorks, Clotho, Thinker Cell, GenoCAD,

1. Preconizarea cilor metabolice

Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

3.4 Programe pentru preconizarea cilor metabolice i pentru construirea

Biochemichal Network Integrated Computational Explorer, cadru pentru

System of Cho et al.

Cadru pentru identificarea i prioritizarea cilor metabolice pentru sinteza

Este un web server pentru gzduirea cadrului pentru proiectarea retro-sintetic

From Metabolite to Metabolite, este un web server pentru identificarea cilor

Un algoritm pentru identificarea cilor metabolice prin urmrirea conservrii

Este un cadru care ajut la optimizarea reelei metabolice a organismului de

Registry of Standard Registrul al Massachusetts Institute of Technology, coninnd diverse feluri de

pri biologice, de exemplu secvene de promotori, secvene terminatorii,

a fost transformat n formatul Synthetic Biology Open Language pentru a face

Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

Integrated Microbial Genomes, mediu pentru analiza comparativ i evolutiv

Identificarea, adnotarea i analiza comparativ a genelor pentru sinteza

Colecia cea mai important a metaboliilor i cilor metabolice, include ci

Activ Site Classification, folosete structura proteinelor pentru identificarea

Proiectarea automat a site-urilor de legtur ribozomal, bazat pe modele

Algoritm pentru preconizarea eficienelor de traducere de ARNm, este