Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Biosenzori2
Biosenzori2
Nanomateriale
aplicaii
n
biosenzori,sursedeenergie,medicin
biologie
Elementedenanotehnologie
ioanstamatin2008
Cuprins
1. Introducere n nanotehnologie
2. Biosenzorii n contextul transdisciplinaritii tiinelor
2.1 De la chemosenzor la biosenzor
2.2 Biosenzorii i nanotehologiile
2.3 Biosenzori, biodiagnostic, nanobiotehnologie, nanomedicin
2.3.1 Biocipurile i tehnologiile actuale ale secolului XXI
2.3.2 Biocipuri, nanobiotehnologia, nanomedicina
2.3.3 Scurt istoric
2.3.4 Referine
3.Stadiul dezvoltrii actuale n domeniul biosenzorilor
3.1 Sisteme, arii de biosenzori, caracteristici de rspuns
3.1.1 Sisteme integrate
3.1.2 abloane
3.1.3 Sensibilitate
3.1.4 Stabilitate
3.1.5 Selectivitate
3.1.6 Parametrii de caracterizare a semnalelor biosenzorilor
3.1.7 Zgomot, rezoluie, drift
3.2 Componentele biologice ale biosenzorilor
3.2.1 Principiile recunoaterii moleculare
3.2.2 Imobilizarea moleculelor gazd
3.2.3 Transducia semnalului
3.2.4 Tipuri de componente biologice
3.2.5 Integrarea componentelor biologice n biosenzori
3.3 Traductori i electrozi
3.3.1 Electrozi
3.3.2 Electrozi n senzori electrochimici
3.4 Fenomene de transport
3.4.1 Cinetica Enzimelor
3.4.2 Fenomene de transport
4. Biosenzori electrochimici
4.1 Senzori chimici vs senzorii biochimici
4.2 Biosenzor electrochimic
4.3.Clasificare
4.4 Receptorul
4.5 Moduri de transducie electrochimic
4.6 Analii, reacii monitorizate.
4.7 Construirea unui biosenzor electrochimic.
4.8 Criterii de performan
1
7
7
11
14
14
15
18
23
25
27
27
27
28
29
29
30
33
34
35
42
42
43
46
51
52
53
54
55
56
59
59
62
62
63
65
67
67
69
73
85
90
93
98
99
104
106
109
110
116
117
118
119
121
122
125
128
133
136
147
162
165
167
169
169
170
172
172
174
176
179
183
186
1. Introducere n nanotehnologie
Discovery consists of seeing what everybody seen and thinking what nobody has thought
Albert von Szent-Gyogyi
The Scientist Speculates,1962
If our small minds, for some convenience, divide thisUniverse into parts - physics, biology,
chemistry, geology, astronomy, and so on remember that nature does not know it!
R. P. Feynman, 1963
When nature finishes to produce its own species, man begins using natural things in harmony
with this very nature to create an infinity of species
Leonardo da Vinci
Nanotiinele: fenomenele i legile fundamentale ale fizicii, chimiei, biologiei aplicate la scal nanometric.
Nanoinginerie: manipularea moleculelor pentru a construi noi tipuri de
materiale; instrumentele i metodele prin care sunt proiectate i realizate
dispozitive la scal nanometric, asamblarea lor n produse de larg consum i
pentru noi cercetri avansate.
Nanotehnologia, tehnologia fabricaiei secolului 21, cuprinde ingineria de nalt
precizie, direcia principal n aplicaiile biomedicale din arii ca terapia genetic, transportul dirijat de medicamente, noi tipuri de medicamente, tehnici de sintez la scal nanometric sau mai concis arta manipulrii atomilor individuali i a moleculelor pentru a
construi structuri cu proprieti dirijate.
Nanotehnologia reprezint abilitatea de a construi obiecte prin asamblarea de atomi
n secvene de timp bine precizate. A construi structuri pornind de la atomi i molecule
este necesar inventarea de dispozitive de asamblare la scal nanometric. Rolul lor este de
a asambla atomii i moleculele n miliarde de configuraii specifice unei structuri nanometrice. Capacitatea ansamblurilor de a se autoreplica este una din cerinele de baz a instrumentelor nanometrice. Fiecare nanoinstrument va trebui s opereze n mod propriu i
s fie programabil.
Materialele sintetizate a cror dimensiuni caracteristice se situeaz ntre 1nm i 100
nm au proprieti dependente de dimensiune. Aceasta prezint un interes tiinific
deosebit. Cu ct dimensiunea unui material se reduce cu att fenomenele cuantice sunt mai
pronunate iar defectele sunt mai puin importante ca n procesele de sinterizare ca
exemplu.
Interesele industriale sunt enorme: depirea limitrilor din litografie pentru
tehnologia semiconductorilor, cererea de control la nivel molecular, simplificarea proceselor, durificarea suprafeelor, aplicaii fotonice, controlul permeabilitii, biocompatibilitate pentru a enumera cteva din ele
Nanotehnologia: este un domeniu multidisciplinar care aduce marile realizri tiinifice din Fizic, Chimie, Biologie, Matematic i tiina materialelor spre aplicarea lor
la a construi cu atomi i molecule materiale la scal nanometric cu inteligen artificial,
structuri biocompatibile, surse de energie neconvenionale, nanoroboi pentru medicin,
cipuri cu densitate mare a componentelor i biomateriale auto-replicabile etc. Metoda de
construcie de jos n sus este astzi cunoscut ca building from bottom-up. Este
domeniul unde structurile biologice (ADN, proteine, oligomeri i bio-oligomeri) sunt
arhitecturate cu materiale sintetizate la scal nanometric utiliznd tehnici combinte din
fizic i chimie (microscopia de fore atomice, nanolitografia, fascicule mole-culare,
nanoelectrochimie, sol-gel) cu cele din genetic; domeniul unde moleculele i polimerii
devin dispozitive electronice (electronica molecular); domeniul unde proprietile
materialelor sunt exploatate la extrem pentru tehnica spaial; domeniul unde se dezvolt
ntrega tehnologie a informaiei.
Ramurile Nanotehnologiei: nanofabricaie, nanomecanic, nanorobotic, nanocompozite i compozite nanostructurate, nanobiotehnologie, nanomedicin, electronic
2
molecular, MEMS, NEMS (sisteme micro/ nanoelectromecanice), microfluidic, medicamente inteligente, textile inteligente, biosenzori, econanotehnologie.
Nanotehnologia a revigorat ntreaga industrie electronic; astzi dimensiunile unui
tranzistor nu depete 180 nm ntr-un procesor
Aceste domenii de cercetare vor profita de combinarea eforturilor teoretice i
experimentale din electronica molecular i materialele inteligente supramoleculare.
Conexiunea dintre ramurile nanotehnologiei o constiuie Sistemele Micro i Nanoelectromecanice, discipline noi create o dat cu dezvoltrile rapide din nano i microlitografie, microelectronic, stereolitografie.
Dispozitive MEMS, NEMS, bioMEMS sunt aplicate la structuri complexe
inteligente care cu o decad n urm practic erau de domeniul science fiction. Domeniul
este focalizat n prezent pe crearea de micro/nanosisteme n efortul de combatere a
terorismului, aplicaii n securitatea domestic (protecia caselor, terenurilor etc), securitatea electronic, siguran n exploatare.
Aspectele multidiscipinare sunt extem de complexe pentru nelegerea ingineriei
acestor sisteme ce acoper arii extem de largi: nanostructuri, nanoelectronic, microfluidic, senzori biochimici de nalt rezoluie, detecia substanelor chimice i a agenilor
biologici nocivi, microsenzori pentru radioactivitate, senzori cu consum redus de putere,
aplicaii medicale, investigri noninvazive, biomimetic, secvenierea rapid a ADN-ului,
transportul la int a medicamentelor, polimeri electronici, nanooptic, tehnici analitice la
nivel nanometric, nanoasamblare, nanointegrare, tehnologia informaiei la scal nanometric, nanosisteme multifuncionale, bionanointerfee.
Tehnologiile implicate n aceast ramur: microstereolitografie, microformri prin
matriare i extrudare la dimensiuni submironice.
Produse i servicii generate de nanotehnologie:
Dispozitive chimice inteligente, compatibilitate pentru microsisteme;
chimice, biocompatibilitate pentru bioMEMS;
Senzori i actuatori inteligeni;
Microsisteme MEMS inteligente pentru microanalize;
Nanosisteme utilizate n transportul la int a medicamentelor;
Electronica comunicaiilor: microantene cu autocontrol, reconfigurabile;
tehnologia Bluetooth; RF-MEMS;
Laborator-pe un cip (lab on chip): compensare, autocalibrare, transmisie de
date; cipuri hibride; interfee auto-adaptabile;
Materiale pentru electronic packaging;
Polimeri, biopolimeri autoasamblabili;
Sisteme CAD/CAM pentru structuri MEMS: modelare electro-termomecanic, microfluidic;
Pentru medicin, farmacie, bioingieria dispozitivelor Lab- on cip, biologie
molecular, inginerie genetic, proteomic, biomimetic: nanoboi transportori de medicamente reparatori de esuturi, nanoboi cu proprieti de
anticorpi, nanoboi sanepizi.
3
Figura 2.1- Schema tipic a unui instrument de control i msurare n senzor. Semnalul
de la senzor trece ntr-un buffer- amplificator operaional-cu impedan mare de
intrare i protecie. Semnalul este digitizat de ctre ADC transformndu-se din
analog n digital.n form digital poate fi procesat, stocat, afiat, disponibil spre
alte locaii prin reeaua de comunicaii
Astfel senzorii ofer portale dintre lumea real sau analoag n care trim i lumea digital a computerelor i a sistemelor moderne de comunicaie prin care ne racordm
7
spre mediul ambiant. Senzorii fac posibil ca s se obin informaii n timp real despre
lucruri pe care le putem vedea, atinge, mirosi i auzi i despre alte lucruri care nu le
putem detecta lucruri care pot fi nocive sau folositoare pentru noi. Semnalul electronic
colectat de la senzor este trecut ntr-un circuit unde este digitizat de un convertor analogdigital (ADC) (figura 2.1). Informaia digital poate fi apoi stocat n memorie, reprodus
vizual pe un monitor sau facut accesibil lumii reale printr-un port digital de
comunicaie.
Din lumea extrem de diversificat a senzorilor ne vom ocupa de biosenzori, clas a
senzorilor chimici, ns pentru o descriere concis a problematicii biosenzorilor att de
vast i variat o definiie se impune de la nceput n contextul general a noiunii de
senzor aa cum figura 2.1 descrie conceptul de detecie i prelucrare a semnalului.
Senzorul n accepiune larg este un dispozitiv ce detecteaz un analit, A, prin intermediul
unui receptor, R, ce este cuplat la un traductor, T. Interacia analit-receptor
produce un schimb de electroni sau emite/absoarbe fotoni pe care traductorul l
transform ntr-un semnal electric sau fotonic, analogic sau digital
Figura 2.2- Principiul general de construcie i funcionare a unui senzor. Interacia A-R
produce un semnal intern preluat de detector , aflat n contact intim cu transfer spre
traductor (figura 2.1)
Un senzor chimic sau biologic funcioneaz pe principiul descris n figura 2.2 prin
emiterea de semnal (tensiune sau curent electric, fotonic) ca rspuns la o reacie chimic
cum ar fi legtura dintre dou molecule. Acest eveniment implic un receptor chimic sau
biologic, R (ligand macrocilic, enzim anticorp etc) care se leag cu o molecul int
specific dintr-o prob de studiat, analitul, A. Transmiterea semnalului este realizat prin
cuplarea cu un traductor, T care interfaeaz procesele din senzor cu unitatea de prelucrare transformare ntr-un semnal msurabil. Detaliu de funcionare i construcie
pentru chemosenzor /biosenzor este prezentat n figura 2.3. Conceptul descris n figura
2.3 arat c biosenzorii sunt o clas, astzi extrem de vast cu particulariti specifice.
Astfel putem s adncim definiia de biosenzor spre particualaritile lui.
Biosenzor-dispozitiv sensibil la un stimul fizic sau chimic (cum ar fi cldura sau
aciditatea, metabolismul) care transmite informaii despre procesele vitale. Biosenzorii se
8
Analiza de semnale n medicin i biologie vizeaz prelucrarea semnalelor nregistrate prin msurtori n scopul extragerii maximului de informaie util n diagnosticare
i monitorizare. Pe baza acestei descrieri generale se observ c senzorii n particular biosenzorii pot fi clasificai dup natura traductorului sau a semnalului procesat, figura 2.4.
Figurile 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 arat c un senzor este un instrument de msurare a mrimilor fiziologice transformndu-le n semnale msurabile.
Acest aspect a parcurs n ultimii ani drumul de la simpli traductori i aparate de
msur la sisteme complexe care integreaz att electronica analogic, ct i digital.
Stadiul actual de dezvoltare este cel din figura 2.1 unde totul este integrat i
digitizat. Operaiile care n mod tradiional se efectuau analogic (filtrare, sumare, scdere,
difereniere, integrare) tind s se fac n msur tot mai mare prin algoritmi de calcul implementai n unitatea de achiziie i procesare de date devenind sisteme moderne de
msurare i transmitere a mrimilor fiziologice.
Efectul acestei tendine de miniaturizare i digitizare a aparaturii simultan cu cretearea performanelor a condus la implementarea de funciuni mai complexe care la
nivelul analogic ar necesita un numr mare de componente liniare discrete (rezistori, condensatori, tranzistori, diode, amplificatoare operaionale).
Biosenzorii au o istorie recent. n a doua jumtate a secolului XX biosenzorii erau
considerai ca o ramur derivat a chemosenzorilor. Dezvoltarea ca tiin transdisciplinar s-a datorat succeselor curente ale biosenzorului de msurare a glucozei pentru diabetici
o metod convenabil, igienic, compact de automonitorizare. Cu acest eveniment biosenzorii au artat un potenial enorm de a detecta o varietate larg de analii n medicin,
industria alimentar, monitorizarea mediului, aprare, securitate. n tabela 2.1 sunt sumarizate interferenele aplicaiilor chemosenzorilor -biosenzorilor n decursul evoluiei
lor. Aa cum este prezentat n tabela 2.1, exist multe domenii cu aplicaii importante
pentru senzorii chimici i biologici, de la monitorizare continu a proceselor chimice din
industrie, sesizarea monoxidului de carbon n case, din mediu ambiant la medicina
curent, terapie intensiv, telemedicin
Tabela 2.1: Aplicaii de uz comun ale chemo i biosenzorilor
Aplicaii
Exemple
Automobile
Sistemul de control al alimentrii cu combustibil,
monitorizarea emissilor de gaze i noxe
Aprare
Aplicaii militare, contramsuri n armele biologice i
chimice
Industria aeronautic Sisteme de monitorizare a calitii aerului n carlinga
avionului,
Agricultur
Detecia pH, ierbicide, pesticide
Industria Chimic
Sisteme de monitorizare a emissilor de gaze toxice,
testare materiale
Securitate civil
Detcia gazelor
Mediu, Protecia
Detecia poluanilor din aer, api sol, BOD, controlul
mediului
detergenilor
Medicin
Diagnostice clinice in vivo sau in vitro, determinarea
concentraiei de gaze anestezice, telemedicin, terapie
intensiv
Control Vamal
Detecia substanelor ilegale, periculoase, droguri,
explozivi, substane radioactive
Alimente, Buturi
Determinarea compoziiei chimice, mirosuri, nivelul
de degradare, odorante, controlul fermentaiei, etc
10
11
Figura 2.6- Manipulatoare al materiei de la scal micro (a) -implantri din ingineria
genetic- la nanoscal (b) unde prin AFM ( microscopia de fore atomice) se pot
poziiona i asambla atomi sau molecule (mecanosinteza) sau lucra cu fluide i
transport de elemente bio( micro/nanofluidic) (c)
Prin consens s-a stabilit c termenul trebuie s fie rezervat pentru utilizarea n context modern ca un senzor ce ncorporeaz elemente biologice cum ar fi, enzime, anticorpi,
acizi nucleici, microorganisme sau celule. IUPAC sugereaz ca acest termen s fie pe
deplin folosit n acest context. O dat cu dezvoltrile din nanotehnologie care au adus o
extrem de larg interdisciplinaritate iar materialele sunt n prezent manipulate la scal
nanometric noiunea de biosenzor capt o definiie mai larg:
Biosenzorul va fi definit ca un dispozitiv analitic compact ncorpornd un element senzorial
biologic sau derivat biologic integrat intim cu un traductor fizico-chimic. Scopul
biosenzorului este de a produce un semnal electronic analogic sau digital care este
proporional cu concentraia unui analit singular sau a unui grup de analii [2].
Actual, biosenzorii sunt utilizai n foarte multe domenii cum ar fi medicin, industria chimic, alimentar, farmaceutic, tehnic militar i de aceea este necesar cunoaterea principiilor de construcie i funcionarea lor. Domeniul n care aceste dispozitive iau gsit o larg utilizare fiind cel medical se impune cunoaterea mecanismelor de reacie
i a afinitii enzimelor i microorganismelor pentru diferite substraturi de interes.
Cercetrile actuale au ca scop miniaturizarea de a crea arii de senzori, structuri integrate, laboratoare de analiz pe un singur cip, creterea sensibilitii i a timpului de
via, scderea timpului de rspuns, lrgirea plajei de utilizare i scderea costurilor de fabricaie a acestor dispozitive.
13
Ce este un Biocip?
Un biocip este un dispozitiv ce conine o structur de elemente senzoriale individuale (biosenzori) interconectate dup funcii i specificiti de recunoatere, integrate pe
14
un cip. Numrul de biosenzori pe un cip poate fi de ordinul 106 uniti. n acest grad de
integrare se pot realiza un imens set de teste distincte extrem de rapid i eficient.
Biocipurile sunt adesea construite pe acelai principii ale microtehnologiei ca i
microcipurile. n contrast cu microcipurile, biocipurile nu sunt n general structuri electronice ( dei ele pot conine diferite structuri electronice cuplate la elementele biosenzoriale). Premiza cheie a biocipurilor este aceea c ele pot realiza reacii chimice/ biochimice la micro i nanoscal. Fiecare biosenzor poate fi gndit ca un microreactor care
realizeaz a reacie chimic specific cu un analit. Biosenzorii din biocip pot fi realizai
pentru a detecta o larg varietate de analii incluznd ADN, anticorpi, proteine, biomolecule.
Biocipurile n contextul micro i nanotehnologiilor
Biocipurile n general sunt arii 2D de senzori plasai ntr-o reea specific cu
coordonate bine precizate. De exemplu (figura 2.7) un senzor la coordonatele x-y de
valoare (4,5) poate senza anticorpul pentru HIV, n timp ce senzorul la coordonatele (7,3)
poate detecta anticorpul pentru virusul Influenza. Pentru a aranja senzorii n coordonate
precise sunt abordate tehnici sofisticate de microdepunere de construire a unui lan sau o
matrice de senzori. Tehnica microdepunerii este costisitoare i de randament sczut.
O alt tehnic recent angajeaz tehnica indexrii dup funcia ce o ndeplinete i
forma microbiosenzorului. Astfel senzorii pot fi plasai oriunde pe cip iar softurile de recunoatere de imagini pot fi utilizate pentru a citi biocipul. Dispunerea i formarea biosenzorilor pe cip este realizat prin microlitografie sau tehnologia ink-printing sau de
contact-printing. Avantajele sunt multiple: 1. senzorii pot fi produi n loturi sau secvene
care pot fi asamblai n paralel sau serial furniznd un randament nalt de fabricaie.
2.Senzorii pot fi asamblai pe arii foarte mici, cu distane reduse ntre ei. 3. Pot fi generate
structuri 3D furniznd semnale mari fa de structurile 2D . 4. Poate fi ncorporat orice
tip de reacie biochimic 5. Senzorii pot fi produi separat i asamblai ulterior dup specificitate i natura aplicaiei. Iat un concept avansat de platform de diagnostic tip
biochip (figura 2.7) pentru a detecta o clas de virusuri.
2.3.2 Biocipuri, nanobiotehnologia, nanomedicina
15
Figura 2.7- Arii de senzori interconectai prin nanofire (NW) ce pot detecta natura
virusului care trece prin structura de microcanale dintr-un fluid biologic colectat.
Fiecare arie de senzori detecteaz forma, dimensiunea tipul de toxin, activitatea
specific, prelund un semnal de prezen (S) i un semnal de detecie specific
12.
13.
14.
15.
16.
de gel ce contine un biocatalizator, enzima glucozoxidaza, urmat de o membran semipermeabil de dializ ce permite glucozei s difuzeze n senzor, dar oprete enzima s
difuzeze. Cu ct intr mai mult glucoz, cu att mai mult oxigen este consumat de enzim. Deci, o cantitate mic de oxigen existent se traduce prin existena unui nivel ridicat
de glucoz. Clark i Lyons [4] introduc termenul de electrod enzimatic, adeseori greit
atribuit de muli autori de recenzii ca fiind introdus de Updike i Hicks [5] care au avut
meritul de a descrie experimental detaliile necesare de a construi un electrod cu enzim
pentru glucoz. Prima descriere a unui biosenzor a fost realizat de Clark i Lyons n anul
1962, unde era prezentat de fapt un electrod de platin cu enzima oxidoreductaza, ntr-o
construcie de sandwich. Anodul de platin polarizat la +0,6V, rspunde la peroxidul
produs de enzim n reacie cu substratul. Acest tip de biosenzor deschide calea pentru
msurarea glucozei din snge.
1974 Traductorii termici. Termometrele n variate forme, termorezistenele i termistorii au fost propui ca biosenzori prin imobilizarea de enzime pe suportul traductor i
msurarea efectului termic datorit efectelor termice induse de reacia enzimatic.
Biosenzorii cu traductori termici propui n 1974 au devenit termeni uzuali astzi
ca sonde termice enzimatice [10] sau termistori enzimatici [11].
1980- 2000-2007
Imunosenzori, efectul SPR.
Ideia construirii de imunosenzori cu fixare direct de anticorpi pe un traductor
piezoelectric sau poteniometric a fost explorat din anii 70. ns pavarea drumului spre
un succes comercial este realizat de Liedberg et al. [17] descriind aplicarea fenomenului
de rezonan a plasmonilor (SPR) pentru a monitoriza afinitatea reaciilor n timp real.
1987, MediSense (Cambridge, MA) introduce primul biosenzor pentru monitorizarea glucozei n regim ambulatoriu. BIAcore ( Pharmacia, Suedia), lansat n 1990
utilizeaz tehnologia SPR
Ferocenii ca mediatori n electrozii enzim, aplicaii n ambulatoriu, microminiaturizarea
n 1984, una din cele mai citate publicaii [18] anun un electrod enzim cu
utilizarea ferocenilor i a derivailor si ca un mediator de imobilizare pentru oxidoreductaz. Acest principiu st la baza electrozilor enzim lansat de MediSense
(Cambridge, USA) n 1987 ca un instrument de msur n form de creion pentru monitorizarea glucozei din snge a pacienilor n regim ambulatoriu. ntreaga sa electronic a
fost proiectat pe modelul de credit card n formatul unui mouse-computer. MediSense
a atins o cretere exponenial n vnzri (US$175 milioane) fiind ulterior adsorbit de
Abbott. Companiile Boehringer, Mannheim i Bayer au n prezent biosenzori cu mediatori deinnd 85% din totalul pieei internaionale. Interesant c cele trei companii dezvolt tehnologii pe baza fotometriei de reflexie convenionale pentru diagnosticul ambulatoriu. Jurnalele academice conin descrieri de largi varieti de dispozitive exploatnd
enzime, acizi nucleici, celule receptor, anticorpi, celule n combinaie cu traductori
electrochimici, optici, piezoelectrici i termici [19]. n cadrul oricrei permutri n tehnicile traductorilor alte mirade de posibiliti apar n concepte de proiectare ale senzorilor
rezolvnd diverse probleme din medicin [20], alimente i buturi [21], procese industriale [22], monitorizarea mediului [23], aprare i securitate (detecia drogurilor, explozivilor). Biosenzorii au nceput s fie folosii cu succes i n alte domenii dect cele
medicale de exemplu msurarea necesarului de oxigen biochimic, ce reprezint un indiciu
al prezenei materiilor organice din apa uzat.
Biosenzorul bazat pe drojdie, realizeaz o citire a rezultatelor n 30 minute fa de
5 zile pentru a obine rezultatele prin metode conventionale. Biosenzorii sunt folosii i
pentru a determina calitatea hranei i prospeimea ei. Cu mare succes sunt folosii n procesele industriale, pentru a determina compoziia chimic a materialelor. Aceste msurtori sunt importante n special n biotehnologie unde n mod curent nu se pot monitoriza
culturile de microorganisme procese de fermentaie ce produc proteine active i alte pro22
duse ca interferon sau insulina. O larg gam de aplicaii sunt cuprinse ntr-o serie de
monografii ce au condus la un important impuls al dezvoltrii biosenzorilor [24, 25, 26,
27 -34].
2.3.4 Referine
1 Theavenot Daniel R., Toth Klara,. Durst Richard A,. Wilson George S, Electrochemical
Biosensors: Recommended Definitions and Classification Pure Appl. Chem., Vol.
71, 12, pp. 2333-2348, (1999)
2.Turner, A.P.F., Karube, I. and Wilson, G.S. Biosensors: Fundamentals and Applications. Oxford University Press, Oxford. 770p. (1987)
3 Clark, L.C. Jnr. Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs 2, 41-48 (1956).
4 Clark L.C. and Lyons C., Ann. N.Y.Acad. Sci., 102, 29-45 (1962)
5 Updike, S.J. and Hicks, J.P. Nature 214, 986-988 (1967).
6 Guilbault, G.G. and Montalvo, J. JACS 91, 2164-2569 (1969).
7 Ho MYK, and Rechnitz GA, "An Introduction to Biosensors," in Immunochemical
Assays and Biosensor Technology for the 1990s, Nakamura RM, Kasahara Y, and
Rechnitz GA (eds), Washington, DC, American Society for Microbiology, pp 275290, (1992).
8 Rechnitz GA, Chem Eng News, 5:2436, (1988)
9 Vurek G. si Bowman R ,Scientific American, August pag 48 (1991).
10 Cooney, C.L., Weaver, J.C., Tannebaum, S.R., Faller, S.R., Shields, D.V. and Jahnke,
M. In: "Enzyme Engineering" (Eds. E.K. Pye and L.B. Wingard Jnr.) 2, 411-417.
Plenum, New York. (1974).
11 Mosbach, K. and Danielsson, B. Biochim. Biophys. Acta. 364, 140-145 (1974).
12 Divies, C. Annals of Microbiology 126A, 175-186 (1975).
13 Lubbers, D.W. and Opitz, N. Z. Naturforsch. C: Biosci. 30c, 532-533 (1975).
14 Voelkl, K.P., Opitz, N. and Lubbers, D.W. Fres. Z. Anal. Chem. 301, 162-163 (1980).
15 Clemens, A.H., Chang, P.H. and Myers, R.W. Proc. Journes Ann. de Diabetologie,
Paris (1976).
16 Shichiri, M., Kawamori, R., Yamaski, R., Hakai, Y. and Abe, H. Lancet, 1129-1131
(1982).
17 Liedberg, B., Nylander, C. and Lundstrm, I. Sensors and Actuators 4, 299-304 (1983).
18 Cass, A.E.G., Francis, D.G., Hill, H.A.O., Aston, W.J., Higgins, I.J., Plotkin, E.V.,
Scott, L.D.L. and Turner, A.P.F. Anal. Chem. 56, 667-671 (1984).
19 Turner, A.P.F. "Advances in Biosensors", I; II; Suppl. I; III. JAI Press, London, UK,
1991; 1992; 1993; (1995).
20 Alcock, S.J. and Turner, A.P.F. IEEE Engineering in Medicine and Biology,
June/July, 319 (1994).
21 Kress-Rogers, E. "Handbook of Biosensors and Electronic Noses: Medicine, Food and
the Environment", CRC Press, Boca Raton, USA, (1996).
23
24
Componente i terminologie
Analit(A): Elementul necunoscut ce trebuie
determinat
Receptor(R): Molecula de biorecunoatere,
elementul biologic/ biochimic care interacioneaz cu analitul printr-o reacie specific.
Traductor: Elementul care detecteaz
semnalul de la interacia analit-receptor
Procesare de semnale: Preluarea de date
credibile, eliminarea zgomotului,
parametrizare.
Lanul de comand
Recunoaterea specific a analitului
Transducia- transformarea efectului
fizico-chimic a interaciei A-R ntr-un
semnal msurabil
Procesarea semnalului i amplificarea
25
26
Succesul senzorilor analitici individuali a continuat dup cum s-a prezentat n seciunea anterioar cu sistemele integrate astzi larg utilizate n laboratoarele clinice medicale. Necesitatea integrrii i diversificrii parametrilor investigai impune crearea de arii
de senzori ntr-o singur unitate de msur. Astfel a aprut necesitatea realizrii de modele de senzori dispuse pe arii i geometrii sofisticate utiliznd tehnologii avansate de
fotolitografie, autoasamblare, ink-jet printing denumite tipare sau abloane (templates) ce
ndeplinesc o serie de funcii predeterminate.
27
Metoda de asamblare de arii de senzori cu funciuni diversificate dar specifice pentru un set ct mai larg de analii se numete ablonare sau simplu astzi prin termenul asimilat de patterning. Tipare sau abloane de senzori ofer meniuri relevante pentru locaii
i situaii specifice. Un exemplu n acest sens l constituie situaiile critice din medicina
ambulatorie. Clinicianul are la dispoziie instrumente portabile de la care poate obine informaii asupra concentraiilor a ase analii cheie din probele de snge: iar n seciile
medicale / spitale instrumentele pot msura pn la 4 parametrii. Aceste instrumente sunt
configurate pentru glucoz, lactat, uree, creatinin. Multiplicarea numrului de analii
pentru investigare necesit instrumente cu senzori cu un mare grad de miniaturizare, integrare pn la arii nanometrice. Aceste solicitri vin acum nu numai din domeniul medical, industria farmaceutic solicit intens senzori de evaluare medicamente produse n
regim de producie de serie cu nalt productivitate i care necesit analiza fiecrui produs
pentru anumite caracteristici bine precizate cum ar fi dozarea relativ la funciunea i rolul
lor n organism. Ariile de nanosanzori sunt preconizate a fi larg utilizate n condiii de
ambulatoriu i medicina de urgen unde trebuiesc identificai para-metrii fiziologici/
biochimici i stabilit medicaia de urgen. n prezent sunt dezvoltate tipuri de arii de
senzori optici utiliznd 12 canale de interferometre de tip Mach-Zhender [4] construite pe
1cm2 de siliciu cu 244 electrozi adresabili individual.
Tehnologia avansat ink-jet a dezvoltat metode de a analiza fracii de nanolitri pe o
suprafa de senzori tridimensional la o vitez de 6m/sec [5]. Este de ateptat ca n viitor
s se produc arii de 1 milion senzori/cm2 utiliznd fotolitografie, imprintarea prin contact
sau tehnici de autoasamblare, adsorpie/desorpie sub fascicul laser ce va permite s
scriem proteine pe suprafaa de analizat cu foarte mare precizie. Tehnici laser, MAPLE
(Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation) sau DW (direct writting) abordate pentru
imobilizarea materialelor biologice pe substraturi sunt nc n stadiul de laborator dar au
mari perspective de utilizare ca metode de imprintare molecular.
3.1.3 Sensibilitate
Fie c sunt senzori individuali, sisteme integrate sau arii de senzori toi sunt
caracterizai prin parametrii unici iar unul din acetia este sensibilitatea i limita de detecie pentru o gam de analii. Detecia de urme a diferiilor analii (indicatori, aditivi, contaminani) cu o suficient sensivitate i siguran sunt criteriile de baz a unui biosenzor
pentru a fi utilizat. Desigur astzi limita de detecie n laborator este mpins pn la un
atom atunci cnd este folosit microscopia de fore atomice. ns n cazul biosenzorilor
aceasta este pe departe dect un deziderat. De exemplu electrozii enzimatici, larg studiai
i continu perfecionai utilizeaz nc paleative cum ar fi concentrarea analitului de
interes ceea ce conduce la dificulti majore de proiectare i miniaturizare [6]. S-au raportat pe acest principiu microbiosenzori pentru vapori de fenol unde fenoloxidaza s-a imobilizat pe gel de glicerol cu o arie de electrozi interdigitizai [7].
Vaporii de fenol sunt direct partiionai n gel i oxidai la chinon. Amplificarea
semnalului pentru a obine o sensibilitate rezonabil s-a mbuntit prin amplificare
redox a cuplului chinon/catechol rezultnd o limit de detecie de 30 ppb fenol. Acest
28
principiu este fezabil a fi extins i la ali compui carbonici pn la limite de pri per trilion.
Limite de detecie ultrajoase pot fi atinse cu senzorii de afinitate cuplat cu detecia
electrochimic [8] pentru a obine dispozitive senzoriale performante.
Structurile ADN au fost studiate ca posibili receptori. Structuri sandwich de dispersii de cristal lichid i compleci ADN-polication au fost studiate cu relativ succes pentru identificarea a diferii analii [9]. Policationul cu rol de a menine integritatea structural a ADN-ului iar complecii formai de ADN-protamine permit detectarea hidrolitic a enzimei tripsin la limita de detecie de 10-14 M. Eliminarea policationului conduce
la creterea distanei dintre cele dou lanuri ADN rezultnd apariia unei benzi intense n
spectrul de dicroism circular ca urmare a modificrii texturii.
3.1.4 Stabilitate
Practic este cel mai mare dezavantaj al complexelor biologice-instabilitatea lor inerent. S-au abordat diferite strategii de a mbunti longevitatea i a prezerva structura
receptorilor biologici. Imobilizarea n matrici prin tehnica sol-gel n optode pentru senzorii de glucoz este una din strategii. n acest caz se utilizeaz doi indicatori de fluorescen: clorura hexahidratat de (2,2'-bipiridil) rutenium(II) i 1-hdroxipirene-3,6,8 acid
trisulfonic. Pe lng proprieti optice bune ale gelului s-a mbuntit i stabilitatea
enzimei GOX [10].Alte exemple cu succese limitate este cazul monooxigenazei utilizat
n detecia hidrocarbonilor; detecia halogenurilor organice cu metaloporfirine; tetraclorura de carbon, haloalchene (percloretilena) i insecticide (DDT) [11]
3.1.5 Selectivitate
mbuntirea selectivitii unui biosenzor poate fi abordat pe dou nivele: interfaare direct traductor-receptor biologic pentru reducerea interferenelor (figurile 2.12.4) i noi receptori cu afinitate mbuntit sau cu noi capaciti de afinitate. De notat c
selectivitatea este un parametru cheie care impune performanele unui senzor. Sunt cteva
strategii de mbuntire a acestui parametru.
Utilizarea mediatorilor pentru mbuntirea performanelor unui biosenzor amperometric a devenit o strategie comun. n [12] se descrie utilizarea pirolochinonei ca mediator ntr-un electrod enzim cu glucozoxidaz pentru msurarea glucozei din buturi.
Alternativ detecia electrocatalitic a produilor de reacie rezultai din reaciile enzimatice poate fi mbuntit prin electrozi modificai chimic ca de exemplu electrozi
rodinizai [13] sau electrozi de carbon modificai cu hexacianoferat [14]. De exemplu
folosirea albastrului de prusia pentru modificarea suprafeei electrodului la detecia amperometric a apei oxigenate la ambele poteniale de oxidare i reducere pentru electrodul
enzimatic n detecia lactatului [15] i a glucozei [14].
O soluie mult mai elegant este de a cuta centrii redox a enzimei via un fir molecular pentru a se realiza transferul de electroni spre electrod. n acest sens s-a publicat
mult despre enzime legate prin fire moleculare dar n general preocuprile s-au axat pe
mediatori imobilizai pe diferite lanuri polimerice. Firele moleculare sunt privite ca
intermediari n transferul de electroni pe distane lungi fiind alctuite din grupuri de dou
29
piridine legate de tiofene cu lungimi diferite (tienoviolagen). Firele de acest tip pot fi folosite n conjucie cu tehnici de autoasamblare pentru a produce un electrod izolat care
transfer electroni pe ci moleculare predeterminate [16]. Aceasta ar conduce la electrozi
enzimatici liberi de interferene electrochimice. Modelarea i proiectarea asistat de
calculator ne permite de a modela reaciile cu transfer de electroni, legarea receptorilor i
interaciile acestora cu o mare acuratee. Aceasta mbuntete nelegerea noastr a interfeei receptor/traductor permindu-ne astfel s dezvoltm noi tipuri de receptori cu selectivitate mare.
Pentru a obine liganzi mbuntii pentru utilizri n optosenzori cum ar fi glicohemoglobina (HbA1c), o nou peptid sintetic, aceasta a fost construit pe baz de
librrie combinatorial chemometric format din 1 milion L-amino acid hexapeptid pornind de la 10 aminoacizi [17]. Librria de hexapeptide a fost selectat si analizat n raport cu HbA1c, HbA1b, HbAF, HbA0, i gsii liganzii secvenai. Liganzii individuali
sau arii de liganzi n conjuncie cu tehnica de recunoatere a formelor sunt domenii ce vor
contribui la cresterea selectivitii i stabilitii.
3.1.6 Parametrii de caracterizare a semnalelor biosenzorilor
30
Figura 3.1 Tipuri de mrimi ce pot fi transformate de ctre traductori n semnale fizice
msurabile
31
Figura3.2 - Schema unui senzor complex. M- mrimea rezultat din interacia (msurandul) A-R, Y1- semnalul electric obinut la traductor, Yi- semnalele rezultate din
lanul de msur. S-sensibilitile pentru fiecare verig din lanul de msur
3. 1
Cazul ideal pentru care rspunsul senzorului este liniar expresia sensibilitii se
simplific, relaiile 3.1 lund forme uor prelucrabile i adaptabile la o larg serie de convertori analog digitali (ADC). n tabelul 3.1 sunt prezentate expresii des utilizate n evaluarea biosenzorilor n condiii de offset nul. Pentru ali parametrii msurabili de un biosenzor cum ar fi frecvena sau absorbana expresiile din tabela 3.1 se modific doar prin
nlocuirea mrimii msurate de traductor.
32
SA =
dY3
S- amplificator (I,V,G,R,etc);
dY2
SF =
dY4
S- filtru;
dY3
S A/ D =
3. 2
dYies
S- convertor analog-digital;
dY4
3. 3
= Ai AT AA AF AA/D
Unele din aceste definiii se vor utiliza pentru cazuri specifice de clase de biosenzori.
3.1.7 Zgomot, rezoluie, drift
sur n care este integrat traductorul. Orice tip de zgomot este caracterizat prin densitatea
spectral i descris printr-o funcie S(f) ce reprezint ptratul tensiunii de zgomot la o
frecven dat.
Pentru un domeniu de msur unde se realizeaz nregistrarea semnalului i pe o
gam de frecvene de interes (f1-f2) unde se manifest zgomotul atunci se estimeaz valoarea medie a ptratului tensiunii de ieire:
f2
V 2 = s( f )df
f1
cu
s( f ) = 4kTR, pentru zgomot termic
s( f ) = 2qI , pentru acumulari/descarcari
spontane de sarcina
3. 4
parametrii reprezentnd caracteristicile fiecrui proces ce produce un anumit tip de zgomot: k-constanta Boltzman, q-sarcina electric, I-curent, R-rezistena electric, V-tensiunea de zgomot, - timp de recombinare
Rezoluia este definit ca fiind cantitatea de msurand care produce un semnal de
zgomot pentru o tensiune de ieire. Definiia rezoluiei se exprim:
R=
tensiune zgomot
S
3. 5
unde S este definit n 3.2. Se observ c senzorii cu sensibiliti mai mari ce produc zgomote egale reprezint o soluie practic important. n practic relaia 3.5 se reconsider
acceptnd zgomote de 3, 6, 9 ori mai mari fa de relaia de evaluare teoretic 3.5.
Aceasta este n funcie de nivelul de precizie al msurtorilor ce trebuie realizate cu
un senzor.
Driftul reprezin deplasri fluctuante, nepredictibile, a semnalului la ieire. Nu are
semnificaie statistic. Prezena sa poate fi redus printr-un design adecvat al componentelor biosenzorului. Driftul se accentueaz pe msura mbtrnirii componentelor
biosenzorului. Analize detaliate asupra rolului acestor parametrii se pot gsi n diferite referine specifice microtehnologiei semiconductorilor. Particular pentru senzori i biosenzori se pot consulta [19, 20,21, 22].
iar celelalte componente constituie arsenalul micro i nanotehnologiilor considerm oportun o succint prezentare a elementelor necesare pentru dezvoltarea conceptelor ulterioare.
Vom accepta ca o definiie general: un senzor ideal este un dispozitiv care va
detecta un analit, inta supus analizei i care este prezent ntr-o prob dat. Majoritatea probelor conin i ali analii care pot interfera cu rspunsul biosenzorului. Acesta
trebuie s posede o selectivitate specific pentru a identifica analitul int. Prin urmare
este necesar s se proiecteze biosenzori cu selectivitate pentru un analit cu capacitatea
de discriminare a interferenelor produse de ceilalali componeni din proba analizat.
Capacitatea de identificare i selectivitate specific reprezint componenta cheie a
recunoaterii moleculare.
Recunoaterea molecular se realizeaz prin componenta din senzor format din o
molecul gazd (de exemplu, host-chemoreceptor) ce se leag selectiv cu analitul
(guest) int (molecula/ complexul molecular oaspete) ce necesit a fi identificat.
Pentru fiecare sistem host-guest (gazd-oaspete) ntotdeauna exist o reacie chimic specific din multitudinea canalelor de reacie posibile. Cnd ansamblul host-guestreacie specific a fost identificat atunci molecula gazd se imobilizeaz sau ncorporeaz n senzor, de regul pe o membran ce interfaeaz traductorul sau un electrod de contact. n final, trebuie gsit un mod de a semnala c evenimentul de legare/ recunoatere a
avut loc (transducia spre traductor). Figura 2.3 schieaz toate aceste aspecte ntr-un concept unitar
3.2.1 Principiile recunoaterii moleculare
Una din cerinele cheie pentru recunoaterea molecular este existena gruprilor
sau de centrii cu reactivitate specific din molecula gazd care pot nchide sau lega
ioni, atomi, molecule, biomolecule. Exemple pentru acest fel de sisteme gazd-oaspete cu
capaciti de recunoatere pot fi vzute n procesele din viaa cotidian. Toate organismele vii folosesc enzime, care sunt proteine ce conin buzunare, centre active, proiectate s recunoasc un analit specific. Acest lucru nseamn c numai un analit specific
este capabil s intre n buzunarul enzimei.
Enzimele pot fi folosite n biosenzori ca elemente receptoare gazd cu capacitate de
recunoatere molecular, dar sunt n general instabile[23,24].
Este astfel necesar s se sintetizeze clase noi de macromolecule/ biomolecule care
sunt capabile s joace rolul de molecule gazd-receptoare. Pentru a proiecta molecule
gazd ce pot fi folosite ntr-un biosenzor sunt luate n considerare urmtoarele criterii:
Molecula gazd trebuie sa fie stabil la condiiile n care va fi folosit
Trebuie sa fie capabil s lege selectiv analitul din prob
Trebuie sa fie capabil s fie imobilizat ntr-un film/membrana care este n
contact cu proba.
Trebuie s semnaleze c un eveniment de legare gazd-oaspete a avut loc
n mod ideal trebuie s elibereze analitul dup detectare astfel nct gazda s
fie liber pentru a fi reutilizabil.
35
Receptori Sintetici
37
Tetraetilestercalix[4]arena
38
Legturile hidrofobe, care pot contribui cu jumtate din fora de legare Ag-Ac, sunt
produse prin asociaia gruprilor nepolare i hidrofobe, de unde moleculele de ap sunt
excluse. Distana optim dintre gruprile reactive variaz cu tipul de legtur.
Forele electrostatice (coulombiene sau ionice) sunt rezultatul atraciei dintre atomi
sau dintre grupe de atomi cu sarcin electric opus, situate pe cele dou grupri reactante: de exemplu, ntre un cation (Na+) i un anion (Cl-) sau ntre COO- i NH3+.
Energia de legare a acestor fore este semnificativ la distane foarte mici (sub 100
) dintre gruprile reactante. Juxtapunerea exact a ionilor favorizeaz aciunea acestor
fore. Energia de legare este de 5 kcal/mol i variaz invers proporional cu ptratul distanei dintre cele dou grupri reactante (1/d2).
Legturile hidrofobe (sau apolare) apar ntre grupri nepolare (neionizate) n soluii
apoase i sunt consecina tendinei de excludere a reelei ordonate de molecule de ap,
dintre molecula de antigen i cea de anticorp. Aceste legturi sunt favorizate de aminoacizii cu grupri apolare, care au tendina de asociere, diminund numrul moleculelor de
ap din vecintatea lor. Prin eliminarea moleculelor de ap dintre gruprile reactante,
distana dintre situsurile active scade foarte mult i crete valoarea forelor stabilizatoare.
Complementaritatea spaial sau forele intermoleculare nu sunt, fiecare n parte,
suficiente pentru a forma legturi stabile. Pentru stabilitatea interaciunii Ag-Ac sunt
necesare ambele condiii. Cu ct energia de legare a reactanilor este mai mare, cu att
complexele Ag-Ac sunt mai stabile.
Interaciunea gruprilor reactante ale antigenului i anticorpului este definit de doi
parametri: afinitatea i aviditatea anticorpilor.
Msurarea afinitii anticorpilor se poate realiza prin dializa la echilibru (figura
3.8). Interaciunea Ag-Ac este reversibil. n interiorul sacului de dializ, haptena este
parial sub form liber i parial legat cu anticorpii, n funcie de afinitatea anticorpilor. Prin membrana sacului de
dializ poate difuza numai haptena liber i concentraia sa extern va egala concentraia haptenei libere din interiorul sacului. Msurarea concentraiei haptenei n sacul de dializ permite calculul cantitii de hapten legat de anticorpi.
Renoirea constant a tamponului duce la disocierea
total i la pierderea haptenei din sacul de dializ, ceea ce denot natura reversibil a legturii Ag-Ac [32].
Afinitatea anticorpilor msoar fora de legare dintre un
determinant antigenic i situsul complementar de legare la un
anticorp specific. Afinitatea este rezultanta forelor de atracie Figura 3.8-aranjament
experimental pentru
i de respingere care mediaz interaciunea celor doi reactani.
msurarea prin
Tria acestor interaciuni se msoar n reacia dintre un
dializ a
interaciunii Ag-Ac
antigen monovalent ( haptene) cu anticorpii specifici. O interaciune cu afinitate nalt presupune structuri complementare
perfecte n timp ce complementaritatea imperfect a gruprilor reactante determin o
afinitate sczut, deoarece forele de atracie sunt active numai pe distane foarte mici i
41
sunt diminuate de forele de respingere. Complexele Ag-Ac formate de anticorpi cu afinitate mic, persist n circulaie i se depun pe membrana bazal a glomerulilor renali.
Complexele formate de anticorpii cu afinitate mare se elimin rapid din circulaie,
fr efecte defavorabile asupra funciei renale.
Interaciunea Ag-Ac este caracterizat permanent prin formarea i anularea diferitelor tipuri de legturi intermoleculare. In vivo, probabil toate reaciile Ag-Ac sunt
reversibile, dar reaciile secundare, in vitro (aglutinarea, precipitarea), n condiiile echilibrului reactanilor, sunt ireversibile.
3.2.2 Imobilizarea moleculelor gazd
O dat ce un compus receptor a fost dzvoltat pentru identificarea unui analit specific este necesar ca acesta s fie imobilizat n dispozitivul senzorial. Cea mai folosit
metod este incorporarea moleculei gazd n membrane flexibile de polimeri fixate pe suprafaa senzorului. Majoritatea membranelor sunt formate fie turnate din soluie de polimeri sau polimeri plastifiai i preformai n filme subiri. Polimerii utilizai sunt n
general solubli n solveni organici uzuali. Este esenial ca receptorul-molecula gazd s
fie solubil ntr-o varietate de solveni organici. Aceasta se obine prin introducerea de
grupri lipofile cum ar fi t-butil n calixarene.
Problemele acestor metode de imobilizare apar cnd membranale intr n contact cu
proba (care este de obicei apoas). S-a constatat c moleculele gazd se filtreaz n timp
din membrane micornd astfel perioada de via a senzorului.
O modalitate de a evita aceast problem este s se lege covalent molecula gazd n
polimerul membranei. Aceast abordare poate fi destul de greoaie din punct de vedere
sintetic pentru c trebuie ncorporate unitile reactive in molecula gazd, care poate
afecta selectivitatea. n cazul n care gruprile reactive au fost introduse n molecul
acestea pot fi folosite s lege covalent gazda n polimeri i la suprafeele substratului (de
exemplu silice) cu cuplare simultan la electrod (platina). Detalii asupra tehnicilor de
imobilizare sunt descrise n [33].
Alte tehnici de imobilizare abordate n prezent sunt: ink-jet printing, polimerizrile
n plasm, transport electroforetic, electro-polimerizrile, fiecare cu avantaje specifice.
3.2.3 Transducia semnalului
electrochimice atunci biosenzorul se va numi Biosenzor electrochimic. Aceasta semnific imobilizarea receptorului pe un traductor electrochimic care msoar un curent ( metoda amperometric) sau o tensiune (poteniometric) ntre doi electrozi.
Dac R este imobilizat pe un component optic atunci vom defini biosenzorii optici.
( cu fibr optic, de fluorescen, de absorbie, de rezonan plas-monic -SPR).
Aceste metode de msurare i transducie a semnalului induce i clasificarea biosenzorilor ce va fi prezentat n detaliu n capitolele urmtoare. n continuare se va prezenta cteva din aspectele generale legate de metodele de ncorporare a elementului de
transducie n gazd (elementul receptor). Pentru detecie,
la majoritatea biosenzorilor electrochimici, este necesar
ca membranele ce conin molecula gazd s fie plasate pe
o suprafa a unui electrod care la legarea oaspetelui conduce la un rspuns electrochimic (figura 2.2, 2.3). Aceast abordare funcioneaz foarte bine cnd analiii int
sunt specii ncrcate cum ar fi cationii metalici.
Din pcate moleculele neutre nu pot fi detectate din
punct de vedere al transduciei electrochimice. Pentru a evita aceast problem s-au folosit cu succes metodele optice de detectare. De exemplu o gazd chiral n calixarene ce conine uniti de naftil, fluorescente. La legarea
cu oaspetele are loc atenuarea fluorescenei ca rezultat al
interaciei dintre grupurile naftilfenil din gazd respectiv Figura 3.9- Calixaren
fluorescent, gruprile
analit. Atenuarea fluorescenei este propor-ional cu conpirenice ataate sunt
centraia de analit. Metodele optice sunt deseori folosite
suficient de libere pentru a
pentru c ele ofer o sensibilitate mai mare dect tehnicile
permite atenuarea
fluorescenei la legarea
electrochimice O calixaren ce prezint fluorescen la leNa+.[29]
garea cu un analit este prezentat in figura 3.9 [34]. n absena analitului oaspete acest compus nu prezint fluorescen pentru c substituentul pirenic nu poate veni n contact cu substituentul nitrofenil
invecinat (iar atenuarea fluorescenei are loc datorit interaciei lor). Totui n prezena
ionilor Na+ este observat fluorescena, pentru c ionul Na+ intr n cavitate i se leag cu
oxigenii din gruprile fenoxi i carbonil din gazd.
Aceast legare induce o conformaie mai rigid ndeprtnd gruprile de nitrofenil
de pirene prevenind atenuarea fluorescenei.
3.2.4 Tipuri de componente biologice
un biosenzor n relaie cu natura receptorului i a semnalului chimic/ biochimic. Se constat c exist dou clase generale de biosenzori care sunt bazai pe rspunsul datorit
bioafinitii dintre R cu A ce modific distribuia de sarcini electrice ce poate fi msurat
cu traductori specifici, fie de consumarea substratului printr-o reacie specific a acestuia.
Tabela 3.2- Clasificare biosenzori dup acticvitatea biologic
2. Biosenzori metabolici
1.Biosenzori de bioafinitate
A + R AR
Colorant
Lectina
Apoenzima
Anticorp
Sistem de trans-port
Semnalul chimic A
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Proteine
Zaharide
Glicoproteine
Substrat Inhibitor
Grup Prostetic
Antigen
Hormon
Substrat Analog.
A + R AR P + R
Raspunsul chimic A
1.
2.
3.
4.
5.
Substrat
Cofactor
Inhibitor
Activator
Activitatea enzimei
3. Biosenzorul cu receptori
Normalitatea proceselor biologice este asigurat de procese moleculare de sensibilitate mare bazate pe specializarea unor proteine structurale, numite receptori capabile de
a recunoate un numr de semnale fiziologice. Este i cazul neurotransmitorilor, a cror
aciune este mediat prin prezena unor receptori n membrana plasmatic, n situsuri sau
inte celulare. n acest caz activarea situsului biologic activ se face prin canalele ionice.
Receptorul pentru acetilcolina este primul receptor cunoscut n feno-menele de
neurotransmisie.(Un excelent studiu a fost prezentat de Costa M, Department of
Physiology and Centre of Neuroscience, School of Medicine, Flinders University,
Adelaide Australia, NATO-ASI,Il Ciocco,Italy Biosensors 2005, Advances In Sensors;
The Lessons From Neurosciences). Acest domeniu este n stadiu de laborator cu
rezultate notabile [35, 36,37, 38, 39, 40, 41,42 ,43, 44, 45, 46]
4. Biosenzorul bazat pe celule sau esuturi
Msurarea speciilor moleculare n acest caz nu se rezum la interacia cu compuii
de analizat, transformrile ce au loc pot fi msurate ca produi rezultai. Este de dorit s
se opereze cu populaii de celule a cror ci metabolice principale s fie cunoscute. Un relevant exemplu este oferit de de biosenzorul L-arginina, care asociaz populaii de celule
bacteriene de Streptococcus faecium n combinaie cu un electrod pentru amoniac.
Arginina este metabolizat de microorganisme, dup schema din figura 3.10 [47 ]
Recunoaterea specific a analitului, transformarea semnalului fizico-chimic produs de interaciunea cu receptorul ntr-un semnal electric, procesarea i amplificarea semnalului au fost desrise pe larg n seciunile anterioare, ele constituind elementele principale din alctuirea oricrui tip de biosenzor. Biosenzorii descrii n literatura de specialitate se subdivid n trei generaii (figura 3.11). La senzorii din prima generaie, biocatalizatorul este prins la suprafaa membranei i apoi acest aranjament este fixat pe suprafaa traductorului (fig 3.11a). Adsorbia sau fixarea covalent a componentului biologic
activ la suprafaa traductorului permite eliminarea membranei semipermeabile, care este a
doua generaie (fig.3.11b). Legarea direct a biocatalizatorului la dispozitivul electronic
care traduce i amplific semnalul, cum ar fi tranzistorul cu efect de cmp, st la baza miniaturizrii biosenzorilor care este a treia generaie (fig.3.11c). n funcie de natura imobilizrii i a interaciei dintre cele trei com-ponente A-R-membran-contact cu electrozii
spre traductor i procesele din biosenzor au evoluat n funcie de generaie.
Dei numrul i varietatea metodelor utilizate n cazul construciei biosenzorilor
este foarte mare, totui cteva principii fundamentale sunt n general valabile pentru toate
tipurile. n primul rnd, specificitatea i selectivitatea este dominat de componenta biologic i este direct legat de natura ei: enzimele, anticorpii, microorganismele. Specificitatea deriv din legarea analitului la componentul biologic folosit ca receptor.
46
rezervoare de medicamente nglobate n polimeri inteligeni.Toate acestea au dimensiunea unui virus. Termenul astzi este din ce mai mult utilizat: Nanomedicin [49].
Pentru a realiza avansurile de integrare ne vom limita la prezentarea schematic a
unui biosenzor de ultim generaie bazat pe ADN, structuri de nanotuburi i polimeri
semiconductori [50]. Figura 3.12 descrie principial secvenele de formare a unui senzor
cu ADN. Biosenzorul electrochimic cu ADN din figura 3.12 este rezultatul cerinelor
diagnosticului medical de a determina rapid i cu acuratee segmentele din secvena unui
ADN. Rezultatele din genetic, biologia molecular preluate pe suportul nanotehnologiilor au condus la una dintre cele mai precise metode de detecie: senzor electrochimic cu ADN (combinarea principiului senzorului ISFET cu fire moleculare din nanotuburi). Principiul de funcionare prezentat n figur const n colectarea de semnal ntre
doi electrozi unul electrod de lucru i altul de referin. Electrozii auxiliari au la rndul
lor un rol bine precizat.
Mecanismul de senzare const n modificarea caracteristicii I-V ( curent tensiune)
n prezena unei molecule int. Nanotuburile de carbon sunt excepionali pentru electrodul de lucru avnd vitez de transfer de electroni mare i o rezoluie spaial excelent.
Numai capetele nanotuburilor sunt active electrochimic, prile laterale fiind inerte,
aceasta ofer un avantaj excepional i anume electrozii de CNT pot fi fixai ntr-un strat
izolator lsnd numai capetele expuse spre mediul electrochimic.inta n senzorul ADN
este o secven necunoscut de ADN (sau oligonucleotide) ataat prin funci-onalizare la
gruprile carboxilice sau aminice de CNT.
48
Figura 3.12- Principiul de construcie a unui biosenzor tip FET realizat prin funcionalizare nanotuburilor
cu ADN
49
50
Traductori de deplasare.
poteniometrici,
optici.
Traductori pentru msurarea concentraiilor (pH-metre)
semiconductori cu proprieti de suprafa, dependente de
concentraia diferitelor substane,
traductori spectrometrici
Traductori de radiaie
ecrane fluorescente,
scintilatori,
semiconductori.
3.3.1 Electrozi
Tipuri de electrozi :
A.
electrozi externi, sau de suprafa, sunt n general electrozi metalici, care
fac contact cu componenta bioactiv din senzor fie n mod direct (electrozi uscai sau solizi), fie prin intermediul unei soluii electrolitice (electrozi lichizi). Electozii solizi sau uscai sunt realizai n general din argint,
platin, aur, sau nichel. Pentru cazul n care avem contact direct cu epiderma va trebui s se ia n considerare c suprafaa pielii nu este n
general uscat sau inert chimic, ci exist poluri electrochimice care au
ca principal component clorura de sodiu. n momentul n care un electrod metalic vine n contact cu soluia electrolitic va aparea un schimb
de ioni ntre metal i electrolit. Ionii metalici, n masura n care sunt solubili n soluia electrolitic vor migra n electrolit, n timp ce ionii negativi
a electrolitului vor migra ctre electrodul metalic, recombinndu-se cu ionii metalici pentru a forma o sare a metalului din care este fomat electrodul. Aceast migrare a ionilor n direcii opuse echivaleaz cu un transfer de sarcina ce duce la apariia unui potenial de electrod. O condiie pe
care trebuie s o ndeplineasc electrozii este aceea c metalele din care
sunt confectionai s nu fie solubile n electroliii prezeni pe suprafaa
pielii, sau dac sunt solubile, reaciile chimice aprute s fie total reversibile la aplicarea unui potenial electric pe electrozi.
n aceast clas de electrozi numii i reversibili intr:
electrozii din metal n contact cu un electolit ce conine proprii
si ioni,
electozii nemetalici n contact cu un electrolit,
electrozii compui dintr-un metal i o sare greu solubil a acestui
metal n electrolitul cu anion comun cu sarea metalului.
B. Electrozi interni, sunt n general realizai din fire foarte subiri, dintr-un metal
rezistent: oel inoxidabil, platin, wolfram. Poriunea activ a electrodului poate fi acoperit cu cu un strat metalic bun conductor (aur, argint) iar cea inac52
Electrodul de aur . Muli ani s-a crezut c nu este posibil transferul direct al electronilor ntre electrod i proteine, datorit denaturrii lor.
Cteva considerente de ordin practic au dus la concluzia c centrul activ din hem
este adsorbit ireversibil atunci cnd rezult denaturarea proteinelor n contact cu electrodul. Modificarea suprafeei electrodului de aur prin adsorbia pe suprafaa lui a 4,4bipiridil, a dus la modificarea configuraiei suprafeei electodului pentru interacia cu
citocromul c[59]. Este important de subliniat c 4,4bipiridil nu este o substan electroactiv, n regiunea de potenial i deci nu joac rol de mediator. Aceast achiziie n
domeniul electrochimiei a fost posibil datorit legrii cvasireversibile a citocromului c
de electrodul modificat, de aur, cu 4,4 bipiridil, din acest demers rezultnd c legturile
de hidrogen din resturile de lizin s-au legat de azotul din piridil care a modificat suprafaa electrodului.Tranzitul prin proteine-electrod complex, orienteaz rapid transferul de
electroni, care se realizeaz dup urmtoarea schem:
difuzia citocromului c pe electrod,
legarea proteinelor pe suprafa,
transferul de electroni,
desorbia proteinelor.
Urmnd acest procedeu au fost posibile mai mult de 60 de modificri de suprafee
pentru electrochimia proteinelor i a electrodului de aur. Prin urmare folosind un reactiv
bifuncional (X-Y), n care grupul X este electrodul legat cu azot (N), fosfor (P) sau sulf
(S) i grupul Y, ce trebuie s fie legat prin legturi slabe de proteine. Rezultatele din
electrochimia proteinelor s-au extins i la aminoacizi i peptide.
53
54
Adugarea enzimelor n soluii coninnd molecule de substrat este condiia esenial n reaciile de cataliz a enzimelor. O discuie de detaliu asupra cineticii enzimelor i
a mecanismelor enzimatice este practic imposibil ntr-un paragraf. Mai mult extragerea
informaiei necesare din tiina enzimelor pentru a
fi aplicate la dezvoltarea de senzori cum ar fi electrodul enzimatic este o sarcin extrem de dificil.
Se va utilza referinele [61,62] pentru a schia cteva din proprietile enzimelor necesare descrierii senzorilor enzimatici.
Considerm o reacie simpl, cu un singur
substrat S, care se combin cu enzima E pentru a
forma complexul intermediar enzim substrat,
ES. Acest complex fiind instabil sufer o nou
reacie n urma creia se obine produsul P.
Schematic aceste reacii se pot scrie:
E+S
k1
k2
ES
E+P
k 1
Cnd reacia are loc n soluii omogene, cu o vitez uniform, aceeai n tot mediul,
este necesar s considerm modificarea n timp a concentraiei componenilor. Dac reacia se produce la suprafa, concentraia reactanilor i produilor prezint modificri locale. Variaia n funcie de distan a concentraiei este semnificativ la scar molecular.Transportul de la regiuni cu concentraii mai mari spre cele cu concentraii mai mici
este un factor important n controlul vitezei reaciilor. Trei mecanisme ale transportului de
mas au loc n soluie: difuzia,convecia, migraia .
Difuzia
Considerm c moleculele din soluia studiat prezint micare brownian suferind
ciocniri cu solventul. n acest caz, probabilitatea ca o molecul s se mite ntr-o direcie
va fi egal cu probabilitatea ca orice alt molecul s se mite n alt direcie. Punnd
condiia egalitii probabilitilor pentru fiecare molecul, probabilitatea net a micrii
globale a moleculelor dintr-un element de volum dat din soluie spre altul alturat, este
dependent de numrul de molecule din fiecare element de volum al soluiei. Rezult c
micarea speciilor chimice se face din regiunile cu concentraie mai mare spre cele cu
concentraie mai mic cu o vitez dependent de diferena de concentraie dintre cele
dou regiuni, ajungnd la echilibru cnd aceast diferent devine egal cu zero. Timpul
necesar ajungerii sistemului la echilibru reprezint timpul de rspuns i reprezint un
criteriu important pentru stabilirea performanei biosenzorului. Determinarea timpului de
rspuns n funcie de membranele permeabile este necesar n operaionalizarea aplicaiilor biosenzorilor. Grosimea membranei trebuie s fie atent aleas, astfel nct difuzia
s conduc la sensibilitatea optim i la cel mai stabil rspuns.
Convecia
Convecia se refer la micarea soluiei n ntregime sub aciunea unor fore mecanice externe. Cnd reacia se produce la suprafaa membranei, convecia este folosit pentru sporirea vitezei transportului de mas, prin nlocuirea soluiei n contact cu membrana
cu alta nou. Meninerea reaciei la o vitez constant este important pentru controlul
difuziei i determinarea sensibilitii. Vscozitatea reprezint mrimea fundamental care
controleaz fluxul i ea reflect rezistena soluiei la micarea de alunecare reciproc a
straturilor. Aceast rezisten este descris formal de legea lui Newton. Pentru o for
dat, fiecare subsecven a stratului de soluie se mic n raport cu secvena anterioar,
asfel nct viteza soluiei, n raport cu subsecvena staionar, crete constant cu creterea
distanei faa de ea. Cnd reacia are loc la suprafaa membranei i speciile sunt generate
sau consumate, ele trebuie s difuzeze prin stratul staionar, numit strat de difuzie.
Migraia
Migraia se refer la micarea speciilor cu sarcina electric ntr-un mediu n care
exist un gradient de potenial. n sistemele electrochimice, ea reprezint mecanismul de
meninere a echilibrului ntre sarcinile create i distruse de electronul de transfer, datorat
curentului dintre cei doi electrozi. n orice caz, contribuia migraiei la viteza global a
56
57
58
4. Biosenzori electrochimici
Un biosenzor electrochimic este un dispozitiv integrat, autonom, capabil s furnizeze informaii analitice cantitative sau semicantitative specifice folosind ca element de
recunoatere molecular un receptor biochimic (element de identificare biologic), care
se afl n contact spaial direct cu un traductor electrochimic. Datorit abilitii lor de a fi
calibrai n mod repetitiv un biosenzor electrochimic se distinge de un sistem bioanalitic
care necesit pai adiionali de procesare, ca de exemplu adiionarea de reactiv.
Biosenzorul disponibil pentru un singur tip de msurtoare, sau incapabil s monitorizeze continu analiza concentraiei sau s nu fie regenerat rapid i reproductibil este definit a fi de unic folosin. Din prezentrile anterioare s-a artat c biosenzorii sunt clasificai n funcie de specificitatea lor biologic cu referire la mecanismul, sau la modul
de interpretare a semnalului fizico-chimic (traductorul). Biosenzorii electrochimici se disting numai prin natura traductorului indiferent de natura componentei biologice conform
cu clasificarea din tabelul 4.1 Elementul de recunoatere biologic are la baz o reacie
chimic catalizat sau o reacie de echilibru cu macromolecule ce au fost izolate n prealabil sau sintetizate n mediul lor biologic original. n cazul reaciilor reversibile starea
de echilibru poate fi n general atins dac nu mai exist un consum net de ctre agentul
biocomplexului imobilizat i incorporat n senzor. Biosenzorii electrochimici pot fi clasificai n funcie de analizele si reaciile pe care le monitorizeaz: monitorizare direct a
concentraiei analiilor sau a reaciilor productoare sau consumatoare a acestora; alternativ, o monitorizare indirect a inhibitorului sau activatorului elementului de recunoatere biologic (receptorul biochimic). O proliferare rapid a biosenzorilor electrochimici
i a diversitii lor a condus la o lips de rigoare n definirea criteriilor de performan. Cu
toate c fiecare biosenzor poate fi evaluat pentru o anumit aplicaie, este util s se stabileasc o serie de protocoale standard pentru stabilirea criteriilor de performan conform normelor i criteriilor IUPAC [64]. Aceste criterii includ caracteristicile de etalonare (sensibilitate, domeniul de liniaritate i operaional al concentraiei, limitele determinrii cantitative i detecia specific), selectivitate, starea de echilibru i timpul de rspuns, reproductibilitate, timp de via, stabilitatea.
4.1 Senzori chimici vs senzorii biochimici
Un senzor chimic este un dispozitiv ce transform informaia chimic ntr-un semnal electronic sau fotonic raportnd concentraia unui compus specific identificat la proba
analizat [65, 66]. Senzorii chimici de obicei conin dou componente de baz: un receptor = un sistem de recunoatere chimic (molecular) i un traductor fizico-chimic.
Senzorii biochimici (biochemosenzorii) sunt senzori chimici, n care metoda / sistemul de identificare utilizeaz un procedeu biochimic.
Senzorii biochimici sau "biochemosenzorii " sunt dispozitive care introduse ntr-un
mediu biologic, ofer la ieire semnale electrice msurabile ce caracterizeaz acest mediu. Acetia pot avea la baz o serie de senzori chimici, cum ar fi electrozii pH, electrozii
ionselectivi (EIS) etc. Modelul schematic este similar cu cele prezentate in figurile 2.1,
59
60
Tabela 4.1 Tipuri de receptori folosii n biosenzori cuplai cu tehnici electrochimice de msurare pentru
recunoaterea specific de specii. Cupluri receptori biologici- tehnica de msur electrochimic sunt
indicate prin litere boldate [67]
Tipul de analit
Receptorul/ sistemul chimic
Tehnica de msurare
/biochimic de recunoatere
Natura traductorului
Potentiometric
1.Ioni
Oxizi metalici multivalenti
Cristale anorganice cu con-ducie Voltametric
ionic,
Ioni permselectivi
Ionofori biologici
Enzime
Sticle schimbatoare de ioni
2. Gaze dizolvate,
Strat dublu lipidic sau membrane Amperometric
Amperometric i poteniometric
vapori i mirosuri
hidrofobe ;
Amperometric, potentiometric sau de
Electrod de metal inert
impedan
Enzime
Piezoelectric, optic
Anticorpi, receptori
3. Substrate
4. Anticorp/
Antigen
Enzime
Celulele
Membrane receptor
Tesuturi de animale sau de plante
Antigene /anticorpi;
Duplex de oligonucleotide,
Aptamer
61
H+., Na+. . . .
Electrod gazos
CO2, NH3
Electrod metalic
Reacii redox
Electrod metalic
O2, Zaharuri, alcooli:
Amperometric
Electrod-carbon
zaharuri, alcooli, fenoli,
Electrozi modificati chimic (CME),
oligonucleotide
Electrozi tip pieptene
Uree, Oligonucleotide
Conductometric,
Electrozi metalici
Impedanmetric
Tranzistor cu efect de cmp cu selectivitate
H+., Na+. . . .
Tranzistori cu efect
ionic (ISFET)
de cmp (FET)
FET cu sensibilitate la Enzime (ENFET)
* Biosenzorii utilizeaz i alte tipuri de traductori non-electrochimici.: a) biosenzori piezoelectrici b)
biosenzori-SAW, traductorul msoar unde acustice de suprafa ntr-un circuit de rezonan (shear and
surface acoustic wave); c) biosenzori calorimetrici (elementul activ este cuplat cu un termistor sau cu un
termocuplu); d) biosenzori optici, utilizeaz fenomene optice cum ar fi fibra optic i fenomenele de
reflexie, refracie, interferen; biosenzori cu fluorescen, chemoluminiscen, absorbia luminii e)
biosenzori SPR ce folosesc interacia analit-receptor imobilizat pe un film metalic depus pe o prism
optic msurnd variaia indicelui de refracie datorit modificrilor induse n sarcina electric a
metalului.
4.3.Clasificare
Biosenzorii electrochimici dup terminologia stabilit n tabela 4.1 i 4.2 pot fi clasificai n funcie de specificitatea lor biologic, dup mecanism sau modul de transmitere a semnalului sau, alternativ, combinaia acestora dou. Ei pot fi: amperometrici, poteniometrici, cu efect de cmp (FET) sau senzori conductometrici (msurarea conduciei
62
Exist patru strategii prin care traductorul asociat poate monitoriza consumul de
analit S prin reacia biocatalitic:
1. Detectarea consumului co-substratului S, ex: diminuarea oxigenului prin
lanul de reacii indus de oxidaze, bacterii sau drojdii. Semnalul msurat
reprezint diminuarea consumului de co-substrat fa de valoarea iniial.
2. Reciclarea produsului de reacie P cum ar fi: peroxihidrogen, H+, CO2, NH3.,
n scheme de reducere prin oxidoreducatz, hidroliz, liaz etc. Semnalul de
la traductor se va amplifica.
3. Detecia centrilor activi din biocatalizator: redox, co-factori, grupuri prostetice ce evolueaz n prezena substratului S prin folosirea unui mediator
imobilizat. Acesta reacioneaz rapid cu biocatalizatorul i este uor de detectat n lanul de transducie. Diferii derivai ferocenici, tetrathia-fulvalene,
tetracianochinodimetan (TTF+ TCNQ- ), sruri organice, chinone, colorani
chinonici, complexe de Ru sau Os n matrici polimere pot fi folosii ca mediatori.[72 ]
4. Transfer direct de electron dintre situsul activ al reaciei redox enzimatice i
traductorul electrochimic.
A-3-a strategie elimin, parial sau total, dependena rspunsului senzorului de
concentraia cosubstratului, S, descrete influena interferenei dintre specii. Aceasta se
realizeaz printr-o vitez de reacie mai mare pentru cuplul mediator- biocatalizator imo63
bilizat pe substrat fa de reaciile cosubstrat- biocatalizator. O alt alternativ este restricionarea analitului s reacioneze localizat pe un film. n acest caz analitul difuzeaz
restrictiv printr-o membran a crei permeabilitate favorizeaz transportul cosubstratului
[73,74]. Utilizarea mediatorilor conduce la diminuarea concentratiei substraturilor mpreun cu lanurile de reacii prin utilizarea unei membrane cores-punztoare, a crei permeabilitate s favorizeze transportul cosubstratului.
Cnd enzimele sunt imobilizate n cadrul acelorai lanuri de reacie, se poate mbunti performana i abilitile biosenzorului. Trei posibiliti sunt frecvent folosite:
1. Unele enzime faciliteaz identificarea biologic prin convertirea secvenial
a produilor seriilor de reacii enzimatice ntr-o form final electroactiv:
acest mod permite o plaj mai larg de analiz a biosenzorului [75]
2. Complexul enzimatic, aplicat n serie, poate regenera co-substratul primei
enzime i amplifica semnalul de ieire al biosenzorului prin regenerarea unui alt cosubstrat al primei enzime.
3. Complexul enzimatic, aplicat n paralel, mbuntete selectivitatea biosenzorului prin scderea concentraiei locale a substratului electrochimic de interferen: aceast secven este o alternativ a utilizrii unei membrane
permselective sau a unei metode secveniale (ex: interpretarea unui semnal
de ieire generat de un biosenzor i de un senzor de referin, fr a exista
element de recunoatere biologic).[76 ]
Element de recunoatere pe baz de biocomplexare sau de bioafinitate
sea alese pentru a fi de ordinul nti la fel i curenii sunt de obicei proporionali cu concentraia analitului.
Poteniometria
cipiul este acelai curentul dintre dren i surs este controlat de mrimea unui potenial
electric (FET).
Conductometrie, impedanometrie
Biosenzorii se pot clasifica fie n funcie de analii sau de reaciile care le monitorizeaz. ntre monitorizarea indirect a inhibitorilor i monitorizarea directa a analiilor
(sau a activitii biologice) exist o imens diferen.
Monitorizarea direct a analiilor sau a activitii biologice cu consum sau producere de analii. Monitorizarea direct a analiilor sau, alternativ, a activitii biologice,
este indiscutabil cea mai mare aplicaie a biosenzorilor. Trebuie s se in seama de faptul
c acelai biosenzor poate monitoriza activitatea enzimei sau a celulei vii, consumul sau
producerea unui compus dat fie continuu sau secvenial
Monitorizarea indirect de inhibitor sau activator a receptorilor biochimici.
Alternativ, biosenzorii au fost dezvoltai pentru monitorizarea indirect a pesticidelor organice sau a unor compui anorganici (metale grele, fluoruri, cianuri) [84, 85]
substane ce inhib proprietile biocatalitice ale enzimelor folosite n construcia biosenzorilor. Oricum aceste dispozitive sunt de obicei ireversibile. De exemplu la imunosenzori activitatea biologic iniial se poate regenera doar prin tratament chimic i prin
urmare nu fac parte din clasa biosenzorilor recondiionabili sau reutilizabili. Potenialul
lor de aplicaie este acela de avertizare i nu de monitorizare exact a unui analit specific.
Se recomand ca acetia s fie considerai de unic folosin. De exemplu, biosenzorul cu
cianur ce folosete ca inhibitor citocromoxidaza care se regenereaz prin splare cu un
tampon de fosfai la pH=6,3 [86].
4.7 Construirea unui biosenzor electrochimic.
Imobilizarea receptorilor biologici
1. Imobilizarea pe membran pe suprafa neexpus la analit: o soluie enzimatic, o suspensie de celule sau de esut se confineaz ntre membrana
permeabil la analit i electrodul de msur (detectorul electrochimic)
2. Reinerea receptorilor biologici ntr-o matrice polimerica, ca de ex: poliacrilonitril, gel agar, poliuretan (PU) sau alcool polivinilic (APV), hidrogeluri redox cu centrii redox ca de exemplu [Os(bpy)2Cl]+/2+ [93]
3. Reinerea receptorilor biologici ntre straturi autoasamblabile (SAM) sau n
membrane din stratul dublu lipidic (BLM).
4. Legarea covalent a receptorilor de suprafaa membranelor prin intermediul
gruprilor bifuncionale: glutaraldehide, carbodiimide, SAMs, avidin-biotin
silanizate.
5. Modificarea structurii ntregului electrod (ex: pasta de carbon modificat cu
enzime sau grafit n rini epoxi [94].)
Receptorii sunt modificai fie singuri fie n amestec cu alte proteine, ca de
exemplu albumina serica bovin (BSA), fie direct pe suprafaa traductorului fie n membrana de polimer. De curnd, membranele preactivate pot fi folosite direct pentru imobilizarea enzimelor sau anticorpilor, fr modificari chimice.
Legarea covalent i reticularea sunt mult mai dificile fa de imobilizarea sau reinerea receptorilor pe membran. n cazul structurilor microsenzoriale unde membrana este direct depus pe traductor atunci legarea covalent este mai sigur i stabil.
Membrane interne i membrane externe
Pe lng straturile de reacie sau membranele cu receptorii imobilizai muli biosenzori, n special cei destinai aplicaiilor clinice sau biologice, ncorporeaz una sau mai
multe membrane auxiliare de separare interne sau externe cu trei funciuni importante:
1. Barier de protecie. Membrana exterioar previne interfe-rena sau intrarea
n straturile de reacie a unor molecule mari (ca de ex: proteine sau celule),
n acelai timp reduce trecerea componentelor din straturile de reacie n
soluia de analizat. Aceste funcii sunt foarte importante, de exemplu, pentru
un senzor de glucoz implantat, eliminarea de glucoz-oxidaz care nu este
de origine uman poate cauza reacii imunologice. O membran se alege
pentru a conferi o permselectivitate specific care s reduc interferenele cu
alte specii n rspunsul biosenzorilor. De exemplu biosenzorii pentru
glucoz in vivo sau ex vivo posed o membran de acetat de celuloz ncrcat negativ pentru a descrete efectele de interferen cu ascorbatul sau ureatul care sunt electrochimic detectate mpreun cu apa oxigenat generat
enzimatic
2. Barier exterioar de difuzie pentru substrat. n cazul enzimelor acestea au
o cinetic ce urmeaz modelul Michaelis-Menten [95]. Vitezele de reacie
enzimatice sunt neliniare cu concentraia. Domeniul de liniaritate dinamic
poate fi larg dac rspunsul biosenzorului este controlat de difuzia substratului prin membran i nu de cinetica enzimei. Acest control se realizeaz
prin implantarea unei membrane exterioare subiri peste o enzim cu acti68
vitate mare: cu ct este mai subire membrana cu att este mai scurt n timp
rspunsul biosenzorului. Mai mult, bariera de difuzie exterioar induce pentru rspunsul biosenzorului o independen fa de enzimele active i mbuntesc stabilitatea.[67,68]
3. Suprafee biocompatibile. Biosenzorii sunt supui la dou seturi de modificri cnd sunt n contact direct cu esuturile organice fluide sau implantate
in vivo, de regul n matrici biologice active, sau n medii de cultur:
Modificri ale probei biologice gazd cauzate de reaciile induse
de biosenzor d.p.d.v a toxicitii, imunogeneticii, carcinogeneticii, trombogeneticii, mutageneticii etc.
Modificarea proprietilor de operare ale biosenzorului de ctre
componentele probei biologice sau de structura ei: pasivizarea
suprafeei de la electrod.
Alegerea unui strat extern de protecie biocompatibil este esenial pentru stabilitatea rspunsului dup implantare pentru traductorii de recunoatere molecular care
cer un contact direct dintre prob i receptorul biologic.Toate aceste tipuri de membrane
i straturi protectoare depind de diametrul senzorului iar funcie de caz se pot utiliza materiale polimerice depuse prin dip- sau spincoating (acetat de celuloz, Nafion, poliuretan, colagen, policarbonat). Microbiosenzorii sunt de obicei realizai prin traparea enzimei printr-un proces de electropolimerizare.
Dac implantarea biosenzorului nu afecteaz funcionarea normal a mediului
gazd i invers dac mediul gazd nu influeneaz operaiile normale ale biosenzorului,
atunci biosenzorul este considerat biocompatibil.
4.8 Criterii de performan
Pentru orice senzor construit pe principiul recunoaterii moleculare [75] este important de al caracteriza prin rspunsul su care este legat de parametrii de operare i de
vitezele reaciilor limitative. Precizia, acurateea, sensibilitatea, reproductibilitatea sunt
criterii de baz n estimarea performanelor biosenzorilor [65,75]. Aceti parametrii sunt
n direct relaie cu mecanismele de reacie, fenomenele de transport i cinetica proceselor din volum respectiv la interfa.
Cele mai multe criterii au fost elaborate pentru biosenzorii enzimatici, ei fiind i cei
mai studiai n literatura de specialitate. n cazul imunosenzorilor elementul cheie este
capacitatea de captur a suprafeei adic numrul de molecule de pe suprafa care sunt
active. O metod de verificare a acestui parametru este msurarea activitii specifice
adic raportul dintre numrul de molecule active la numrul de molecule imobilizate.
Aceast estimare este dependent de modul de imobilizare (orientarea molecular,
numrul de puncte de ataare sau situri active) iar raportul se situeaz ntre limite 0.150.3, foarte rar atingnd unitatea.
Capacitatea de captur devine important cnd suprafaa se micoreaz ca n aplicaii de microfluidic. O alt problem ntlnit la imunosenzori este aceea a regenerrii
suprafeei fr pierderea semnificativ a activitii.
69
c
, unde c0, reprezint o concentraie de referin. Semnalul de rspuns,
0
c
ritmul, log
Rss este corectat n raport cu zgomotul de fond Rbl (background). c0, concentraia de referin este de regul estimat n mol/l dei aceast valoare mare nu este utilizat niciodat atunci cnd domeniile de msur se raporteaz la 1-10 mmol/l iar n prezent s-au
atins sensibiliti de ordinul nmol/l i pmol/l.
Rspunsul n regim tranzitoriu este important pentru analiza probelor n regim dinamic i n tehnicile de eantionare ns este mai puin semnificativ n monitorizarea continu. Rspunsul tranzitoriu este estimat prin panta (dR/dt)max dup adiia de analit n celula de msur. O metod de evaluare este de a introduce senzorul ntr-un sistem FIA
pentru analiza secvenial de probe ntr-un regim hidrodinamic precizat.
Sensibilitatea i domeniul liniar de msur a concentraiei n regim staionar sunt
determinate din reprezentare grafic:
Rss Rbl
c
versus log 0
c
c
sau
Rss Rbl
c
versus log 0
c
c
log 0
c
Aceast metod este mult mai concis dect curbele de calibrare curent utilizate de
plotare a rspunsului corectat la linia de baz funcie de concentraie sau logaritmul ei. n
acelai mod se determin i rspunsul n regim tranzitoriu prin:
dR
dR
n toate cazurile parametrii se estimeaz n domeniul de rspuns liniar al biosenzorului. Orice biosenzor electrochimic are o limit superioar de liniaritate a rspunsului.
Aceast limit este direct legat de proprietile biocatalitice sau de biocomplexare
a receptorului biochimic sau biologic. Mai mult n cazul biosenzorilor cu enzime aceast
limit este semnificativ influenat de membranele i de substraturile de imobilizare unde
barierele de difuzie i cinetice secundare au un rol important.
70
1
1
vs
c
Rss Rbl
Pentru orice biosenzor electrochimic trebuiesc stabilite numrul de standarde utilizate i cum matricea de probe standard poate fi simulat sau duplicat, ele fiind necesare
pentru a specifica procedurile pentru fiecare tip de senzor legat de aplicaia sa. Acestea
sunt de importan special pentru cazul senzorilor de unic folosin ce utilizeaz imunoafinitatea sau reaciile de inhibiie.
Sensibilitatea este panta curbei Rss Rbl vs c sau log c i nu trebuie confundat cu
c0
limita de detecie (LOD) cuantificat n raport cu linia de baz sau cu semnalele de zgomot. Domeniul de concentraii de lucru este determinat de limitele de detecie inferioare
respectiv superioare.
Selectivitatea, sigurana n exploatare
Selectivitatea i sigurana sunt determinate ca pentru orice tip de senzor amperometric sau poteniometric [97, 98]. Ele depind de alegerea receptorului i a traductorului.
Cele mai multe enzime sunt specifice dar sunt i clase de enzime nonselective, cum
ar fi, alcooloxidaze, grupul de zaharuri oxidaze, peroxidaze, lactaze, tirosinaze, ceruloplasmin, alcooldehidrogenaze, glucozdehidrogenaze, NADH-dehidrogenaze etc.
Ele au fost folosite pentru dezvoltarea de biosenzori pentru determinarea fenolilor
din mediu [99, 100] sau n monitorizarea calitii alimentelor. Bacteriile, drojdiile, culturile de celule sunt n mod natural nonspecifice. Pe de alt parte electrozii de oxigen, electrozii pH, ISFET-urile prezint o selectivitate specific pronunat la fel i electrozii
metalici care sunt sensibili la numeroase substane. Selectivitatea proprie poate fi modificat cnd aceti traductori sunt asociai cu receptorii. De exemplu ENFET este pH senzitiv la soluia tampon i la protonare dar selectivitatea sa nu este modificat.
Cnd traductorul interfereaz cu alte substane cunoscute ca ascorbat sau urai la
senzorul de glucoz bazat pe detecia peroxidului de hidrogen aceste efecte secundare pot
fi restricionate prin utilizarea de membrane permselective exterioarea sau interioare.
Alternativ, se concep senzori cu i fr receptori biologici ce funcioneaz prin
compensare - senzori difereniali. Tipuri de senzori difereniali sunt dezvoltai pe principiul ISFET sau ENFET. Exist diferite proceduri de determinare a selectivitii biosenzorului dar dou sunt recomandate de normele IUPAC.
71
72
Principiul de construcie
Clark a studiat electrochimic oxigenul ca un gaz reductor i platina ca un electod
de metal. Platina folosit pentru detectarea oxigenului electrochimic, este recunoscut sub
denumirea de electodul Clark . Electrodul are o membran organic care acoper stratul de electrolit i doi electrozi metalici. Oxigenul difuzeaz prin membrana i este redus
electrochimic la catod. ntre catod i anod se aplic o tensiune fix, pentru care reacia de
reducere a oxigenului are loc.Temperatura influeneaz mult viteza de reacie i
solubilitatea (figura 4.1A). Acesta este un electod polarografic utilizat pentru msurarea
concentraiei oxigenului n lichidele corpului sau n gaze. Mostra sau eantionul de
msurat este n contact cu o membran (polipropilen sau teflon ) prin care oxigenul
diuzeaz ntr-o camer de msur coninnd soluie de clorur de potasiu saturat 50%. n
camer sunt doi electrozi, unul este de referin, Ag/AgCl i altul este de platin, mbrcat
n sticl. Curentul electric la potenialul de polarizare de - 600 mV, este proporional cu
concentraia oxigenului n soluie. Pentru polarizare invers la+600mV se pot realiza
msurtori pentru hidrogen. Reaciile sunt foarte sensibile la temperatur i trebuie
meninut la valori de 0,10C. Electrodul este calibrat utiliznd un amestec din cele dou
gaze oxigen i hidrogen- de concentraie cunoscut. Astfel electrodul de oxigen sau
electrodul Clark s-a dovedit a fi un analizor al gazelor din snge atunci cnd efectum
analize de chimie n laboratorul clinic i n general n aria ngrijirilor medicale, regim
ambulatoriu sau de terapie intensiv. Clark a avut ingenioasa idee de a plasa pe suprafaa
electrodului de platin o enzim care reacioneaz cu oxigenul. Enzimele sunt plasate
ntr-o membran nchis la suprafa, care poate fi recunoscut ca cel mai simplu model de
biosenzor. Curba msurtorilor concentraiei de oxigen a fost proporional cu concentraia glucozei. Acesta a fost primul biosenzor construit, care a ajutat mult la progresul
analizelor de laborator. Pentru scopuri medicale detaliem cteva din etapele funcionrii
acestui tip de electrod. Oxigenul difuzeaz prin membran i este redus electrolitic la
catod. Cu ct este mai mare presiunea parial a oxigenului, cu att difuzeaz mai mult
oxigen la un moment dat. Senzorii de temperatur ataai probei permit compensarea pentru membran a vitezei de difuzie i solubilitate. Instrumentele de msur nregistreaz:
curentul catodului, temperatura probei, temperatura membranei, presiunea ba-rometric,
salinitatea. Cu aceste informaii se poate calcula oxigenul coninut n prob, fie n pri
per milion (ppm), sau n procente ale saturaiei n oxigen. Configuraia geome-tric a
electrodului Clark, are o mare importan. n particular, grosimea stratului electrolitic
dintre catod i membrana trebuie s aib o anumit limit, pentru a asigura liniaritatea i
micorarea driftului de curent.
73
Calibrarea unui sistem polarografic este de strict necesitate. n primul rnd trebuie
asigurat proporionalitatea dintre curent i concentraia de oxigen, cu erori sub 1%
(Pentru probele biologice rolul i parametrii aerului sunt eseniale. Aerul, privit ca un
amestec de gaze ce are un procent constant de oxigen, aproximativ 20,9%, cnd intr n
contact cu apa, cantitatea dizolvat depinde de mai muli factori: timpul optim pentru
dizolvarea oxigenului, omogenitatea soluiei de ap, temperatura apei, presiunea aerului,
srurile coninute n ap, alte substane dizolvate n ap, care sunt consumatoare de oxigen). Oxigenul coninut n ap este determinant pentru procesele biologice i chimice, de
aceea msurarea oxigenului dizolvat n ap este foarte important Pentru a gsi presiunea
parial a oxigenului dizolvat, el trebuie s fie saturat n ap pur la o anumit temperatur.
Consideratii practice
1. Agitarea: consumarea oxigenului de ctre proba de investigat poate cauza
scderea concentraiei de oxigen la stratul de grani dintre membran i
prob. Aceasta necesit agitarea continu.
2. Membranele: se folosesc dou tipuri de membrane; membrane libere, neasamblate i membrane de acoperire sau capsule. Membranele libere sunt mai
ieftine, dar exist dificulti de instalare i rezultatele nu sunt repro-ductibile.
Grosimea membranei determin ct de gros trebuie s fie stratul de electrolit
adiacent catodului, aceasta afectnd timpul de rspuns al probei. Precizia
74
fabricrii membranei d o grosime de electrolit ct mai reproductibil, accelernd asfel timpul de msurare i elimin problemele de asamblare.
3. Electrolitul: electrolitul n orice tip de electod de oxigen Clark trebuie s fie
schimbat periodic, altfel se pierde capacitatea de reducere a oxigenului.
Timpul de meninere a electrolitului depinde de rata cu care oxigenul este redus.
4. Calibrarea: aer saturat cu ap. n condiii de echilibru presiunea oxigenului
n apa saturat cu aer este egal cu presiunea parial a aerului saturat cu ap,
adic la o umiditate relativ de 100%. Electrodul msoar valoarea maxim
a presiunii pariale de oxigen. Deoarece difuzia oxigenului n ap i aer sunt
diferite, se aplic un factor de corecie la calibrarea apei saturate cu aer pentru a obine o valoare corect. Cnd se msoar concentraii sczute (sub 2
ppm) este necesar un al doilea punct de calibrare, punctul pentru standard de
oxigen. La concentraia de 0 oxigen (prin adugare de sulfit de sodiu) curentul prin electrodul Clark este 0, acesta constituie al doilea punct de referin.
Aplicaii ale electrodului Clark sunt la msurarea oxigenului dizolvat: tratamentul
apelor uzate, producerea vinului, bioreacii, monitorizarea apei din mediu
4.9.2 Electrodul enzimatic
Electrodul enzimatic (n unele referine cunoscut ca electrod enzim) este o combinaie dintre o sond electrochimic de orice tip (amperometric, poteniometric sau conductimetric) cu un strat subire (10-200 microni) de enzim imobilizat. n aceste dispozitive funcia enzimei este de a furniza selectivitatea n virtutea afinitii sale biologice
pentru un substrat de molecule (figura 4.2). De exemplu o enzim este capabil de a
cataliza o reacie a unui substrat dat pentru un izomer specific dintr-o mulime de substraturi cu diveri izomeri. Tipic gradul de avansare a unei reacii enzimatice ( direct
legat de concentraia analitului) este monitorizat prin viteza de formare a produsului sau
dispariia unui reactant. Dac produsul sau reactantul este electroactiv atunci rspunsul
poate fi monitorizat direct prin amperometrie adic variaia curentului pentru un potenial
aplicat dat. Metoda final de analiz folosit va depinde n cele din urm de proprietile
specifice ale enzimei.
Principalele consideraii sunt:
1. Conine enzima grupuri redox active ?
2. Sunt electroactivi produii reaciei biochimice ?
3. Este electroactiv unul din substraturi sau cofactorii?
4. Care este viteza i timpul de rspuns?
5. Care este aplicaia final a senzorului
Rspunsul la primele trei criterii va depinde n mare parte de sistemul supus investigaiei. Rspunsul la ultimele chestiuni este dependent de cerinele aplicaiilor specifice.
Dac enzima nu conine grupri redox atunci biosenzorul se rezum la a msura
produii sau consumul substratului prin reacia lor la electrodul de transducie. Curentul
electric este direct legat de concentraia analitului.
75
76
Depinznd de natura mediatorilor potenialul aplicat poate fi redus sub limita interferenelor unor specii cum ar fi ascorbat, ureat i paracetamol. Un vast numr de compui
sunt capabili de a aciona ca mediatori n electrodul enzimatic. Dintre acetia cei mai
populari sunt complecii metalici. Reprezentativi pentru complecii organometalici sunt
ferocenii i derivaii lor deoarece au o larg plaj de poteniale redox, sunt inde-pendente
de pH iar schemele sintetice sunt directe fr complicaii. O serie de ali mediatori prezentai n figura 4.4 au fost intensiv studiai n literatura de specialitate. Compilarea a o
serie de articole de sintez din revistele Biosensors B, Biosensors & Bioelectronics
(Elsevier 1996-2004) arat ponderea tipurilor de mediatoriutiliza n biosenzorii cu enzime ( procentele din figura 4.4 reprezint ponderea apariiei tipului de mediator pentru 135
articole consultate).
Sisteme bi-enzimatice
Lucrri recente s-au focalizat pe comunicarea direct a transferului de electroni
dintre enzime i electrozi. Succesele n domeniu sunt limitate la enzima peroxidaz HRP(horse redish peroxidaza) care catalizeaz reducerea peroxidului de hidrogen pentru un
numr de compui organici. Cnd enzima este imobilizat pe electrod, necesarul de reductor organic este prevenit de electrodul nsi care furnizeaz echivalenii reductori.
Cuplarea peroxidazei cu o enzim oxidaz permite construcia de sisteme bienzimatice prin care peroxidul produs de oxidaz este detectat de sistemul electrod-peroxidaz care opereaz la poteniale mult mai mici n raport cu un electrod simplu de
platin.(figura 4.5) De aici rezult i minimalizarea interferenelor speciilor active.
77
O + ne = R
4. 1
I = nF
dN
dt
4. 2
unde dN/dt reprezint viteza de reacie la electrod ( de oxidarea sau reducere), [mol/sec],
N numrul de moli , F-constanta Faraday (96,845 C/mol)
Viteza reaciei la electrod este direct proporional cu fluxul de molecule spre electrod, J (mol/sm2) i aria acestuia, A:
78
dN
= AJ
dt
4. 3
I = nFAJ
4. 4
Fenomene de difuzie:
Datorit naturii heterogene a proceselor viteza de reacie depinde att de rata de
transfer de electroni la interfa i de transportul de mas de analit la electrod din volumul
soluiei. Pentru un biosenzor amperometric, dealtfel pentru orice proces electrochimic,
este necesar s se cunoasc modul de transport al analitului ca specie electroactiv la suprafaa electrodului. Dou procese sunt importante: difuzia i convecia. Difuzia este fenomenul de transprt al moleculelor dintr-un spaiu cu concentraie mare spre unul cu concentraie mic. Este o consecin a micrii perpetue a moleculelor i a echilibrrii potenialelor chimice. Fenomenul de difuzie are un rol important n procesele care stau la baza
funcionrii senzorului amperometric. Dac considerm relaia (4.4) observm c transportul de substan electroactiv conduce la concentrarea analitului spre electrod.
Iniial concentraia de O era uniform n tot volumul soluiei. Cnd curentul trece
prin soluie concentraia de O la suprafaa electrodului devine mai mic fa de volumul
soluiei datorit conversiei aces-tuia ntr-o form redus R. n acest context apare un flux
suplimentar spre electrod dinspre soluie iar acest fenomen de difuzi este descris de prima
lege a lui Fick:
J ( x, t ) = DO
cO ( x, t )
x
4. 5
cO (0, t )
x
4. 6
79
dc cO ce
=
dx
47
dc cO
=
dx
48
J = D0
cO
49
iar curentul limit prin stratul de difuzie spre electrod devine ( 4.6):
IL =
nFAD0cO
4.10
Astfel curentul electric de limitare datorit stratului de difuzie este direct proporional cu concentraia analitului i invers proporional cu grosimea stratului.
Biosenzorul n condiii de neechilibru. Ecuaia Cottrell
Cazul prezentat anterior referitor la formarea stratului de difuzie a fost evaluat n
condiiile n care soluia cu analii era omogen sau supus unei agitaii continui pentru
omogenizare. Rezultatele au artat un profil de difuzie staionar la suprafaa electrodului
( adic gradientul de concentraie nu se schimb n timp) i de aici a rezultat un curent
staionar. Se va prezenta cazul apropriat de realitate cnd analiii sunt n cantiti foarte
mici ntr-un volum dat de soluie nesupus agitrii. Pn la aplicarea potenialului pe electrod soluia i electrolitul (de regul analitul) pot coexista fr ca o reacie chimic s aib
loc. Cnd un potenial este aplicat pe electrod cu o valoare suficient de mare pentru a se
iniia electroliza componentei electroactive (la t=0) atunci concentraia la suprafaa
electrodului (x=0) se reduce la zero. Din acest moment se stabilete un gradient de concentraie cu o curgere de material dinspre soluie spre electrod. ntruct soluia este staionar (fr micare prin agitare) stratul de difuzie nu va mai fi constant n grosime. El
va crete dinspre electrod spre soluie iar gradientul de concentraie se va modifica continu n timp rezultnd un curent nestaionar pe electrod. Astfel va trebui s se dezvolte un
nou tip de relaii de legtur pentru acest proces de schimbare a fluxului la electrod. A doua lege a lui Fick leag evoluia concentraiei de timp i spaiu. Pentru cazul unidimensional legea a doua a lui Fick se scrie:
cO ( x, t )
2 cO ( x, t )
= DO
t
x 2
4. 11
unde toate variabilele au aceai semnificaie uzual. Ecuaia diferenial 4.11 are soluii
diferite pentru diferite condiii de grani. Utiliznd transformata Laplace pentru ecuaia
4.11 se obine dependena concentraiei de parametrii x i t:
x
c( x, t ) = c erf
Dt
4. 12
unde erf- reprezint funcia eroare. Considernd derivata funciei 4.12 la interfaa cu
electrodul (x=0) se obine:
c
dc
=
Dt
dx x =0
4. 13
iar curentul la electrod se calculeaza din 4.6 cu nlocuirea expresiei din 4.13:
81
i = nFAD
dc(0, t )
D
= nFAc0
dx
t
4. 14
cunoscut ca ecuaia Cottrell pentru orice proces ce implic difuzia ntr-un spaiu unidimensional, semiinfinit. n acord cu aceast ecuaie produsul dintre curent i rdcina
ptrat a timpului este o constant, adic nu se stabilete un curent staionar pe suprafaa
electrodului.
Model matematic pentru electrodul enzimatic, regimul cinetic vs regimul difuzional
Comportarea i performanele unui electrod enzimatic sunt strict dependente de o
serie de factori (imobilizarea pe electrod, tipul de electrod, tipul de substrat de imobilizare, natura soluiei cu analii- fluidul biologic) care n final impun cinetica i
transportul, elementele ce definesc parametrii de funcionare. Cu elementele de baz prezentate anterior precum i cu descrierea cineticii enzimelor se poate elabora un model de
funcionare ce ne permite s stabilim parametrii de lucru a electrodului enzimatic.
Fiind un electrod cu o enzim imobilizat pe suprafaa sa cinetica reaciei este dominant la interfa iar procesele de difuzie sunt dominante dinspre volumul soluiei spre
electrod.
Prin urmare cele dou procese sunt spaial separate (figura 4.7).
Figura 4.7-Model matematic de funcionare a electrodului enzim pe baza a dou procese concurente-cinetic
i difuzional. Modelul const din trei regiuni: convectiv (x>L) unde concentraia analitului este
meninut constant la c=Svol , difuzional (0<x<L) unde au loc procese de difuzie pur, cineticunde la x=0 au loc reaciile controlate de enzim
c ( x ) = S1 exp
De
x; x<0
4. 15
I cinetic = nFAL
k2 [ E ][ S ]
2 ( K M + [ S ])
4. 16
k2 [ E ]
2
4. 17
[S ]
( K M + [ S ])
4. 18
2 =
d2
De
Vmax d 2
K M De
4.19
83
Id =
2 I max De [ S ]
k2 [ E ]d 2
4. 20
Comparnd cele dou cazuri limit se constat c Id este dependent att de grosimea
d i de coeficientul de difuzie n timp ce Icinetic este dependent de L i independent de coeficientul de difuzie. ntruct S1 reprezint maximul de concentraie posibil n stratul cu
enzim atunci rspunsul liniar a senzorului va fi determinat de S1 cnd S1<< KM. Este
posibil s determinm o expresie pentru S1 ca funcie de Svol astfel:
S1 =
Svol
L
1+
De
DS
4. 21
Aceast relaie arat c S1 este dependent de coeficienii de difuzie i poate fi optimizat printr-o atent selecie a parametrilor de difuzie DS, De ( difuzia n stratul de
imobilizare i n stratul limit), grosimea L. n termeni operaionali creterea grosimii
stratului de difuzie sau descreterea difuzivitii pot fi limitate prin caracteristicile de timp
de difuzie prin membrana (stratul) de imobilizare.
Timpul caracteristic de transfer prin membran (=L2/DS) este adesea factorul ce
determin performanele senzorilor n general i a electrodului enzim n particular, parametrii cinetici sunt determinani n stabilirea regimurilor de lucru ale biosenzorului
electrod enzimatic.
84
4.10 Referine
1. Tothill, I.E., Newman, J.D., White, S.F. and Turner, A.P.F. Enzyme and Microbial
Technol,pp296 (1996)
2. Cullen, D.C. n "4th World Congress on Biosensors", 29-31 May, Bangkok, Thailand.
Elsevier Applied Science, Oxford, UK. p. 50. (1996)
3. Fisher, U., Alcock, S.J. and Turner, A.P.F. Biosensors& Bioelectronics, 23, p 10,
(1995)
4. Turner, A.P.F., Newman, J.D. and Rickman, A. "Optics for Environmental and Public
Safety", Munich, Germany, 19-23 June 1995, Europto Series, Berlin, Germany.
5. Newman, J.D., Marazza, G. and Turner, A.P.F. Anal. Chim. Acta vol 262, 13 (1992).
6. Saini, S. and Turner, A.P.F. Trends Anal. Chem., vol14, 304 (1995)
7. Dennison, M.J., Hall, J.M. and Turner, A.P.F. Anal. Chem., vol 67, 3922 (1995).
8. Alcock, S.J., White, S.F., Turner, A.P.F., Setford, S., Tothill, I.E., Dicks, J.M.,
Stephens, S., Hall, J.M. and Warner, P.J. British Patent Application 9416002.5,
(1994)
9. Skuridin, S.G., Yevdokimov, Y.M., Efimov, V.S., Hall, J.M. and Turner, A.P.F. Biosensors& Bioelectronics., 11, 903 (1996).
10. Psoma, S. and Turner, A.P.F. "3rd World Congress on Biosensors", 1-3 June, New
Orleans, USA. Elsevier Applied Science, Oxford, UK, (1994)
11. Dobson, D.J., Turner, A.P.F. and S Saini,. Anal. Chem.(seriile 1990-1996)
12. Loughran, M.G., Hall, J.M. and Turner, A.P.F. Electroanal.7, 1 (1996).
13. Newman, J.D., White, S.F., Tothill, I.E. and Turner, A.P.F. Anal. Chem., 67, 4594
(1995
14. Jaffari, S.A. and Turner, A.P.F. UK Patent GB9402591.3 (1994) .
15. Selkirk, J.Y., Turner, A.P.F. and Saini, S. "4th World Congress on Biosensors", 29-31
May, Bangkok, Thailand. Elsevier Applied Science, Oxford, UK. p. 198. (1996)
16. Albers, W.M., Lekkala, J.O., Jeuken, L., Canters, G.W. and Turner, A.P.F. Bioelectrochem. Bioenerg. (1996).
17. Chen, B. and Turner, A.P.F. in"24th Symposium European Peptide Society",
Edinburgh, Scotland, September, paper No 23 (1996)
18. DAmico A,.DiNatale C. A Sensors Journal, IEEE, vol1, no 3, pp:183 190 (2001)
19. Muller R., Kamins T., Chan M. Device electronic for integrated circuits JohnWiley &
Sons, 3rd edition, (2003).
20. DiNatale C., Salimbeni D., Paolesse R, Macagnano A., DAmico A.. Sensors and
Actuators B 65 220-6. (2000)
21. DAmico A.et al. Sensors and Actuators B 7 685-8. (1992)
22. Walker N.J. Science 296 pp. 557559. (2002)
23. Ciucu Anton, Biochimie analitic Partea I, Ed U B, pp. 144,(2000)
24. Mutihac Lucia, Fundamentals of analytical biochemistry, Ed UB, pg. 194 (2005).
85
25. Dietrich B., Viout P.and Lehn J.M.: Macrocyclic chemistry: aspects of organic and
inorganic supramolecular chemistry, Ed. Weinheim, New York : VCH, (1993).
26. Cram D. J. and Cram J.M: Container molecules and their guests, (Monographs in supramolecular chemistry no. 4, Stoddart J. F. (ed.)), The RoyalSociety of Chemistry,
Cambridge, (1994).
27. Zolotov Y.A., Macrocyclic compounds in analytical chemistry (Chemical analysis:
vol.143, V.Y. Nagy and Y.A. Zolotov (eds.)), Wiley, New York (1997).
28. Mutihac Lucia, Hans-Jrgen Buschmann, Mutihac Radu-Cristian, and Eckhard
Schollmeyer , J. Incl. Phenom. Macrocyclic Chem.51, 1, 1-10, (2005).
29. Diamond D., G. Svehla, E. Seward and M.A. McKervey, Anal. Chim. Acta, 204, 22331. (1988)
30. Diamond D. and K. Nolan: Calixarenes, Anal.Chem., 73, pp. 22A-29A. (2001)
31. Asfari Z., V. Bohmer, J. Harrowfield and J Vicens: Calixarenes 2001,Kluwer
Academic Publishers, Netherlands, (2001).
32. Roitt I. M. Essential Immunology, ninth edition, Blackwell Science (1997)
33. Carr, P. W. and Bowers, L. D. Immobilized Enzymes in Analytical and Clinical Chemistry , Blackwell Science (2000)
34. Kubo Y, Maseda S,Tokita S, Kubo M, Nature vol 382, pp522 (1996)
35. Buck L. and R. Axel, Cell, 65,175187, (1991)
36. Caterina E et al. Nature 389, 27-28 (1997)
37. Corey D.P et al. Nature 432, 723730, (2004)
38. Fleig A and Penner R. The TRPM ion channel subfamily: molecular, biophysical and
functional features. TIPS 25 (12), (2004)
39. Friedrich R.V. Nature 430, 760-768 (2004)
40. Hallem E.A. et al. Cell 117, 965979, (2004)
41. Basbaum Julius D. A.I.Nature 413, 204-207(2001)
42. Lin S-Y.,Corey D P, Current Opinionin Neurobiology 15:350357, (2005)
43. Neher E, Nature Biotechnology 19,24-36 (2001)
44. Suh G.S.B et al.. Nature Neurosci 431, 657-658(2002)
45. Sukharev S. and Anishkin A.. Mechanosensitive channels: what can we learn from
simple model systems? TINS 27(6),( 2004)
46. Voels et al., Nature Chemical Biology 1,26-35 (2005)
47. Shinichi Komaba, et all, Sensors and Actuator B:Chemical, 52, 1-2, 78-83 (1998)
48. Dinischiotu Anca, Costache Marieta, Biochimie generala, vol I, proteine, glucide i lipide, Ed. Ars Docendi,(2004)
Costache Marieta, Anca Dinischiotu Biochimie general, vol II, acizi nucleici: structur i organizare,Ed. Ars Docendi,(2004)
49. Freitas Robert A, Nanomedicine, vol 1-4, (seriile 1998, 2004), (www.foresight.org/
Nanomedicine/NanoMedTOC.html)
50. Hui Peng, et all, Biosensors & Bioelectronics, 20,18211828, (2005)
86
79. Kiefer H., B. Klee, E. John, Y. D. Stierhof, F. Jaehnig. Biosens& Bioelectron. 6, 233
(1991)
80. Sugawara M., . Hirano A, Rehak M., Nakanishi J., Kawai K., Sato H., Umezawa Y.
Biosens &Bioelectron. 12,5,425 (1997).
81. Ciucu Anton, Aplicaiile Analitice ale Biosenzorilor n Controlul Polurii Mediului,
Ed Ars Docendi, Bucureti, pg 175, (2000)
82. Covington A. K. Pure Appl. Chem. 66, 565 (1994);
Buck R. P, E. Lindner. Pure Appl. Chem. 66, 2527 (1994).
83. Cullen D. C, R. S. Sethi, C. R. Lowe. Anal. Chim. Acta 231, 33 (1990).
84. Ciucu A, C. Negulescu, R.P. Baldwin, Biosens& Bioelectron.,18,2-3, 293-300, (2003)
85 Noguer T., Gradinaru A., Ciucu A., J.L. Marty, Anal. Lett., 32, 1723-1738. (1999)
86 Amine A., M. Alafandy, J. M. Kauffmann. Anal. Chem. 67, 2822 (1995).
87.Guilbault G. G. Handbook of Immobilized Enzymes. Marcel Dekker, New York
(1984).
88. Mosbach K (ed.). Methods in Enzymology, vol. 137. Acad Press, N Y (1988).
89. Cass A. E. G (ed.). Biosensors, A Practical Approach. IRL Press, Oxford (1990).
90. Go pel W, T. A. Jones, M. Kleitz, I. Lundstrom, T. Seiyama (eds). Chemical and
biochemical sensors. In Sensors, A Comprehensive Survey (W. Gopel, H. Hesse,
J. N. Zemel, eds), vols 2 & 3. VCH, New York (1991).
91. Blum L. J, P. R. Coulet (eds). Biosensor Principles and Applications. Marcel Dekker,
New York (1991).
92. Kas J., M. Marek, M. Stastny, R. Volf. In Experimental Techniques in Bioelectrochemistry (V. Brabec, D. Valz, G. Milazzo, eds), Chapter 6, pp. 361-447.
Birkaeuser Verlag, Basel (1996)
93. Rajagopalan R, A. Aoki, A. Heller. J. Phys. Chem. 100, 3719 (1996).
94. Gorton L. Electroanalysis 7, 23 (1995).
95. See J. E. and E. T. Bell, Proteins and Enzymes, Marcel Dekker (1988).
96. Laidler K. J., The Chemical Kinetics of Enzyme Action, Claredon Press, London,
(1958)
97. McNaught A. D, A. Wilkinson. Compendium of Chemical Terminology, 2nd edn.
Blackwell Science, Oxford (1997).
98. Umezawa Y., K. Umezawa, H. Sato. Pure Appl. Chem. 67, 507 (1995).
99. Nistor C., J. Emneus, L. Gorton, A. Ciucu, Anal. Chim. Acta, 387, 309-326 (1999)
100. Lindgren A., Stoica L., Ruzgas T., Ciucu A., Lo Gorton, The Analyst, 124, 527532,(1999)
101. Ciucu A., Nica A.G., Gorton L, Rom. J. Biochem., 39 (1-2), 55-62. (2002)
88
5. Biosenzori microbieni
Exist dou clase de biosenzori microbieni ce folosesc acelai principiu: msurarea
activitii metabolismului n prezena analitului.
Prima clas utilizeaz microorganime imobilizate de la care se msoar produii rezultai din metabolism. Aceast clas a devenit comun definit ca biosenzori microbieni.
A doua clas msoar activitatea electric a metabolismului microorganismelor
atunci cnd consum un biocombustibil, de exemplu glucoza. Aceast clas este cunoscut sub denumirea generic de celule bioelectrochimice sau celule de biocombustie.
Fiind dezvoltat ca un domeniu separat al celulelor electrochimice generatoare de
energie electric, pe baza consumului de biocombustibili, s-a neglijat aspectul capacitii
acestora de a fi adevri biosenzori. Vom trata aceste dou clase separat punndu-le n
eviden performanele i capacitile lor din punct de vedere al cerinelor de a fi biosenzori. Biosenzorii microbieni conin microorganisme imobilizate i un lan de transducie
mult mai diversificat (figura 5.1). n general sunt utilizai pentru un singur proces biochimic [1].
Senzorii microbieni prezint urmatoarele avantaje:
Sensibilitate mai mic la inhibare sau impurificarea analitului;
Au o toleran mai mare n ceea ce privete valoarea pH-ului i a temperaturii;
Au un timp de via mai lung dect electrozii enzimatici;
Sunt mai ieftini fa de electrozii enzimatici;
Variabilitate mare pentru c se adapteaz uor la condiii specifice de mediu;
Independen la cofactori;
Rspuns fiziologic la produii toxici;
Preparare uoar deoarece cultivarea microorganismelor este simpl;
Dezavantajele acestor dispozitive sunt urmtoarele:
Au un timp de rspuns mai mare dect electrozii enzimatici;
Reutilizarea lor ntr-o nou msuratoare necesit un timp mai mare;
n principiu schema unui senzor microbian este identic cu cea a unui biosenzor
enzimatic. Schema const n imobilizarea celulelor intacte n contact intim cu un traductor specific care convertete produii sau efectele metabolismului ntr-un semnal biochimic (figura 5.1).
Senzorii microbieni i-au gsit o serie de aplicaii industriale n procesele biochimice i microbiologice n domenii precum producerea medicamentelor, industria alimentar, tratamentul apelor reziduale i producerea de energie.unde reaciile de fermentaie i
transfer de electroni au un rol important. n domeniul laboratoarelor clinice microbiologie, parazitologie-unde intensiv se utilizeaz medii de cultur senzorii microbieni pre89
zint un potenial important pentru implementare. Cele mai multe materiale din mediile
de cultur nu pot fi determinate prin metode spectrofotometrice fiind optic inactive sau
netransparente. O combinaie mediu de cultur-substraturi de imobilizare cu o cupla-re
adecvat spre un traductor ca n figura 5.1 este fezabil cu avantaje asupra reducerii timpilor de investigare i rspuns la un diganostic specific. Monitorizarea continu, rapid,
sensibil i controlul factorilor variabili deja menionai permit evaluarea substraturilor i
produilor de metabolizare, a numrului de celule viabile prezente n culturi, a tipurilor de
microorganisme.
O2
Analit
NH3
H2S
H+
Oxigen
Microorganisme
imobilizate
Electrod
amperometri
Electrod
potentiometric
pH?
Fotoni
Optrode
Cldur
Termistor
PPProcesare semnal
Senzorul se introduce ntr-o soluie tampon saturat cu oxigen. Dup adiia la substrat, activitatea respiratorie a microorganismelor crete, producnd scderea concentraiei
oxigenului n apropierea membranei. Folosind electodul de oxigen, concentraia substratului poate fi msurat prin detectarea scderii concentraiei oxigenului.
Un alt tip de biosenzor microbian detecteaz activitatea metabolic,electrochimic,
cum ar fi: hidrogenul, dioxidul de carbon, amoniacul i acizii organici, care sunt secretai
de microorganisme (figura 5.2b). Se pot utiliza att microorganisme aerobe ct i anaerobe.
curent
Anod plumb
Substrat
A
H2--------- Celula de combustie
CO2--------- electrod gazos
Substrat
Se bazeaz pe fenomenele optice ce le pot avea microorganismele n procesele metabolice: fotoluminiscen, electroluminiscen, chemoluminiscen, activitate optic specific (polarizare dependent de chiralitate, indice de refracie, absorban, etc). De exemplu intensitatea luminescenei fotobacteriilor (luminobacterii) este dependent de activitatea metabolic. Este astfel posibil de a construi biosenzori microbieni puternic senzitivi
prin combinarea acestor fotobacterii cu un fotodetector.
Luminescena in vivo a fotobacteriilor se produce prin urmtoarele reacii enzimatice:
NAD ( P ) FMN
NAD( P ) H + H + + FMN
NAD( P) + FMNH 2
oxidoreductaza
91
Biosenzorii microbieni pot fi construii prin plasarea microorganismelor imobilizate n imediata vecintate a unui termistor care msoar cldura metabolic absorbit sau
cedat produs de acetia (Fig. 5.3). Acest tip de senzor se bazeaz pe principiul general
al msurrii schimbului de entalpie. Deoarece multe reacii metabolice sunt nsoite de o
evoluie considerabil a cldurii, calorimetria se poate aplica pentru a msura o larg varietate de analii. Lipsa specificitii datorate principiului de detecie n general este compensat adecvat prin utilizarea biocatalizatorilor specifici, imobilizai. Oricum, partea cea
mai mare a cldurii eliberat n reaciile metabolice poate fi pierdut n soluie fr a fi
detectat de termistor i limiteaz sensibilitatea acestei tehnici.
Tipuri de msurtori: entalpia reaciilor metabolice, clduri specifice, latente.Termistorii, elementul de transducie, sunt cei mai utilizai ei fiind realizai de obicei din materiale semiconductoare (n majoritate materiale oxidice i au n general un coeficient de
temperatur negativ). Dei au fost raportate foarte multe cazuri de aplicaii ale calorimetriei n analizele biochimice, ea nu poate fi folosit ca o analiz de rutin datorit
costurilor ridicate ale instrumentelor sensibile i complexe ce trebuiesc folosite pentru
acest tip de msurtori. Ca exemplu, gelul de drojdie de bere este introdus n coloana separatoare de sticl care constituie ieirea termistorului. Soluia ce trebuie analizat este
pompat printr-un schimbtor de caldur ce se afl n baia de ap, controlat termostatic
i apoi prin coloana de sticl. Prin acest procedeu se poate msura glucoza , fructoza i
caseina.
Recent microminiaturizarea i introducerea elementelor de microfluidic a condus
la o nou generaie de termistori microbieni care pot senza efecte termice de la un numr
relativ mic de microorganisme.
Un microtermistor microbian cons din asamblarea tuturor componentelor direct pe
suprafaa semiconductoare a oxidului respectiv (figura 5.3b).
92
b
a
Figura 5.3 Tipuri de termistori microbieni,
a) cu reactor termostatat
93
de tipul ISFET. Se mai poate utiliza microbalana cu cristal piezoelectric, detector optoelectronic, termistori, sau ISFET dar electrodul de oxigen predomin n senzorii microbieni. Produii metabolici ca lactatul sau piruvatul, dioxidul de carbon , ionii de amoniu i
de hidrogen sulfurat sunt determinai poteniometric cu electozi ion selectiv (ISE). Combinaia direct a microorganismelor cu un tranzistor cu efect de cmp (FET) a fost
dezvoltat pentru estimarea glucozei a alcoolului cu Acetobacter i a xilozei bazat pe celule de Gluconobacter oxidans. S-a constatat c o serie de mediatori solubili cu potenial
redox, cum ar fi etosulfatul de fenazina, fericianida sau fericianida n combinaie cu benzochinona, au posibilitatea msurrii directe a electronilor urmrind activitatea metabolic a celulelor. Recent au fost utilizai mediatori insolubili cum sunt ferocenii, tetrahiafulvalenele i tetracianochinodimetanul, care au fost incorporate n paste de carbon n
contact cu Paracoccus denitrificans .(figura 5.5).
O alt tehnic interesant de biosenzor microbian a fost creat prin luminiscena fotobacteriilor conectate cu un detector optic. Astfel a fost creat i descris un senzor
microbian pentru determinarea ionilor de metal i a ionilor aromatici. Prin inginerie genetic genele ce rspund de emiterea luminii de la fotobacteria Vibri au fost transferate n
structura genetic a bacteriilor Escherichia coli sau Seratia marscescens. Viitorul traductorilor n biosenzorii microbieni l dein ns cristalele piezoelectrice, microbalanele cu
cuar cu unul din electrozi funcionalizai.
Prin combinarea microorganismelor cu enzime este posibil s creasc selectivitatea
senzorului microbian. Aceste combinaii sunt capa-bile s determine biopolimeri, cum ar
fi amidonul, proteinele i lipidele, ce nu pot fi apreciai cu ajutorul microorganismelor.
Pentru aceasta microorganismele au fost combinate cu hidrolaze. A rezultat astfel
un senzor hibrid, amperometric, pentru determinarea NAD+, ce are la baz celule de E.
coli i NADase. Ureea i creatinina s-a determinat utiliznd o combinaie de bacterii nitrificatoare i ureaz sau creatinaz. Din experimente cu senzorul BOD s-a ajuns la concluzia c se pot combina mai multe specii de microorganisme i se pot utliza mai multe
substraturi n acelai experiment. Un alt exemplu tipic de biosenzor coninnd populaii
mixte din specii diferite de microorganisme avnd capaciti metabolice specifice l reprezint biosenzorul cu bacterii nitrificatoare. Acest senzor care a fost dezvoltat n special
95
pentru investigarea apelor uzate conine culturi mixte din specii de Nitrosomonas sp. i
Nitrobacter sp. n acest caz s-a folosit un sistem amperometric de msurare pentru determinarea amoniacului. Controlul oxigenului prin senzorul de oxigen este necesar pentru
msurarea concentraiei de amoniac n eantionul de msurat.
Pentru c biosenzorul reacioneaz i cu ali nitrii sau uree, de obicei se nsumeaz
cantitile de substane nitrificatoare. Principalul impediment este surplusul de substrat
(amoniac sau uree). Acest procedeu, al combinrii diferitelor specii de microorganisme,
este folosit cu succes i n domeniul toxicologiei. De obicei se poate folosi un inhibitor
atunci cnd concentraia substratului este prea mare. O posibilitate este folosirea membranelor de dializ, atunci cnd substratul este n exces.
Senzor electrochimic microbian: detector de gaze.
Acest tip de senzori este uor de fabricat i utilizat, deoarece obinerea unui semnal
electro- chimic este cea mai rspndit metod de obinere a semnalului de rspuns.
Dispozitivele poteniometrice msoar densitatea de sarcin acumulat la suprafaa
unui electrod. Un exemplu de senzor care utilizeaz voltametria ciclic este senzorul cu
gaz. Senzorul CO2 folosete bacterii autotrofe. Este cel mai rspndit din punct de vedere
comercial, dar prezint dezavantajul c diverii acizi ionici i acizi organici sau anorganici volatili afecteaz potenialul din interiorul celulei, pH-ul i membrana gaz permeabil ce acoper electrodul. Bacteria autotrof, Pseudomonas S-17, care se poate dezvolta
numai n prezena carbonailor, este sursa de obinere a carbonatului. Ea este incubat n
condiii aerobe la 300C, timp de o lun i este imobilizat pe vrful electrodului de oxigen.
Pentru mrirea domeniului de selectivitate celula se acoper cu o membrana
semipermeabil de PTFE. Sensibilitatea msu-rtorilor se obine folosind o soluie tampon, saturat n oxigen cu pH=6,5, coninnd ioni metalici i 20 moli de glucoz. Timpul
de via al senzorului este mai mare de o lun. Fiind un senzor micro-bian, se utilizeaz la
testarea alimentelor.
Aplicatii ale biosenzorilor microbieni
S-au construit multe tipuri de biosenzori microbieni ce sunt utilizai n monitorizarea virusurilor i n industria alimentar [3]. n tabela 5.1 sunt prezentate cteva din
multitudinea aplicatiilor biosenzorilor microbieni.
96
Brevibacterium
Electrod O2
lactofermentum
Glucoza
Pseudomonas
Electrod O2
fluorescens
Acid acetic
Trichosporon
Electrod O2
brassicae
Etanol
Trichosporon
Electrod O2
brassicae
Metanol
Unidentified bacteria Electrod O2
Acid formic
Citrobacter freunca Celula
combustie
Metan
Methylomonas
Electrod O2
flagellata
Acid glutamic
Escherichia coli
Electrod O2
Cepholosorin
Citobacter freunda Electrod pH
BOD
Trichosporon
Electrod O2
cutaneum
Lisina
Escherichia coli
Electrod O2
Amoniu
Nitrilying
Electrod O2
bacteria
Dioxid de azot
Nitrilying
Electrod O2
bacteria
Nistatin
Saccharomices
Electrod O2
cerevisiae
Acid nicotinic
Lactobacillus
Electrod pH
araboesis
Vitamina B1
Lactobacillus
Celula
fermenti
combustie
comumitate
-----Celula
microorganisme
combustie
mutageni
Bacillus subtilis ree Electrod O2
Nota: a-mmol; b-p.p.m ; c- unit/cm3; d-numr/cm3
Timp
de Domeniu
raspuns
De masura
min
mgxdm-3
10
10-200
10
2-2510
10
3-60
10
3-25
10
30
5-2510
10-103
0-6,6a
5
10
15
8-800
100-55*102
3-60
5
10
10-107
0,05-1
0,51-255b
1h
0,5-0,54c
1h
10-5-5
6h
103-107
15
108-109 d
1h
1,6-2,85*103
97
5.3 Referine
1
98
Tranzistorul cu efect de cmp (FET) este adesea folosit ca traductor pentru senzorii
i biosenzorii electrochimici. FET este un traductor ce poate converti o informaie chimic ntr-un semnal electric. FET are un rspuns rapid i selectiv pentru analit, un timp de
via de ordinul lunilor i permite un nalt nivel de integrare i miniaturizare. Din principiul de funcionare FET-urile sunt capabile s msoare conductana unui semiconductor funcie de un cmp electric perpendicular pe suprafata oxidului de la poart. n cea mai
simpl versiune (ex.: MOSFET metal oxid-semiconductor FET) el este alctuit dintrun substrat de siliciu dopat tip p ce conine dou regiuni de difuzie de tip n (sursa i drena). Dac substratul este dopat n atunci poarta i drena sunt dopate cu acceptori p. Structura este acoperit cu un strat dielectric de bioxid de siliciu pe care este depus un electrod
de metal ( figura 6.1). Cnd un potenial este aplicat la electrodul poart purttorii minoritari din substrat sunt atrai la suprafaa semiconductorului. Astfel, conducia electric
dintre surs i dren este modificat funcie de potenialul aplicat dintre poart i substrat
[1-5]. n cazul ISFET (ion-selective field effect transistor), electrodul de metal de la poart al MOSFET-ului este nlocuit de o soluie de electrolit care este n contact cu electrodul
de referin i cu bioxidul depus pe poart. SiO2 (figura 6.1b). Electrodului de referin
poate fi considerat ca poart pentruMOSFET.
poart datorit acumulrilor de sarcin la interfaa oxid-electrolit. Cnd SiO2 este utilizat
ca dielectric, natura chimic a oxidului de la interfa este reflectat n mrimea curentului surs dren. Suprafaa oxidului de la poart conine grupe funcionale OH, care
se afl n echilibru electrochimic cu ionii din soluia probei (H+ i HO-). Grupele hidroxil
de la suprafaa oxidului de la poart pot accepta sau ceda protoni iar o schimbare de pH
va modifica potenialul de la suprafaa SiO2. Cinetica disocierii locale descrie traducerea
semnalului n funcie de starea de ionizare a grupelor SiOH de la suprafaa amfoteric.
Valorile standard ale sensibilitii pH msurate cu ISFET_SiO2 sunt 37 40
mV/unitate pH. Selectivitatea i sensibilitatea ISFET sunt controlate complet de proprietile la interfaa electrolit/dielectric. Alte materiale anorganice de poart pentru senzorii
pH ca Al2O3, Si3N4, Ta2O5 au proprieti mai bune dect SiO2 la rspuns n pH, histerezis
sau drift mai mic.ISFET-urile au fost alese ca elemente traductoare pentru c suprafaa de
SiO2 conine grupe reactive SiOH care pot fi folosite pentru atari covalente ale moleculelor organice i polimerilor [6-10].
MEMFET, SURFET
ISFET-ul poate fi modificat cu o membran sensibil, ce conine ionofori. Dac
oxidul este acoperit cu o membran sensibil la ioni, acest lucru este cunoscut sub
denumirea de MEMFET. n acest caz, stratul este penetrabil pentru ionii specifici iar
potenialul membranei se modific fiind detectat de structura FET. Un FET sensibil la
ionii de potasiu K+ a fost obinut prin acoperire din solveni cu o membran PVC plastifiat coninnd valomicina la suprafaa oxidului de la poarta. SURFET este un ISFET cu
un strat ce blocheaz anumite specii de ioni, sensibili la pH ul dielectricului porii. La
suprafaa acestui strat, potenialul de suprafa este stabilit de asocierea selectiv a ionilor. Un exemplu de SURFET este ISFET-ul cu poart de perilen cu molecule benzo 18crown-6 ionofore ce selecioneaza ionii de potasiu. n contrast cu MEMFET, unde coeficientul de asociere al ionoforilor cu ionii recunoscui de membran determina selectivitatea, n SURFET este acelai proces dar faza apoas (electrolitul) controleaz selectivitatea.[7-12,18,21]
CHEMFET
ISFET-urile modificate cu membrane plastifiante PVC sunt lipsite de o interfa
bine definit. Studiile au artat c schimbri n concentraiile de dioxid de carbon influeneaz puternic msurtorile. Acest lucru a fost atribuit difuziei dioxidului de carbon
prin membran cu formarea acidului carbonic la interfaa dintre membran i oxidul de la
poart. Consecutiv, concentraia protonilor, care determina potenialul la interfaa membran-dielectric, prezint variaii mari. Acest fenomen se explic prin existena unei cantiti mari de ap n PVC n consecin i o concentraie apreciabil de H+. Rolul de interpunere a CO2, duce la necesitatea unei mari cantiti de ap din interiorul matricei membranei, n consecin un nou tip de membran se impune. Dup mai multe ncercri descrise n literatura de specialitate, s-a gsit soluia de a modifica direct suprafaa oxidului
prin ataarea de grupe funcionale sau de membrane funcionalizate cu 3(trimetoxi-silil)
propil metacrilat. Noile tipuri de senzori se numesc CHEMFET (chemically modified
100
FET) care pare s rezolve n mare masur problemele. Suprafaa modificat cu metacrilat
poate mai departe reaciona cu monomerii vinil, metacril sau prepolimeri.
Utilizarea monomerilor fotopolimerizabili hidroxietil metacrilat (HEMA) este
avantajos din punct de vedere al produciei a CHEMFET-urilor, care este n general bazat pe fotolitografie. Introducerea unui asemenea strat de hidro-gel, n care o soluie apoas
tampon de sruri poate fi absorbita, ntre oxidul de la poart i membran elimin
interferarea CO2 la rspunsul CHEMFET. Mai mult, acesta stabilizeaz potenialul dezvoltat n membrana senzitiv (figura 6.2). Rspunsul pentru diferite valori de pH respectiv pentru diferite poteniale de referin sunt prezentate n figura 6.3.
a
b
Figura 6.2 a) Model de senzor CHEMFET, cu electrodul de referin (RE) n soluie tampon b)
Reprezentarea schematic a dispunerii n CHEMFET a straturilor de polimer modificat pe poarta de
SiO2,.Rolul hidrogelului HEMA i a membranei modificate chimic de selectare ioni i transfer de ioni
Figura 6.3 - a) Caracteristici ale sistemului CHEMFET electrod de referin Ag/AgCl- nregistrate pentru o
soluie tampon cu pH=4, b) Curentul de dren , Ids, n diferite soluii tampon (pH=4, pH=7, pH=10)
pentru acelai potenial Vref= -2V
catoare de ioni REFET, schimbul de ioni este neglijabil i n acest caz potenialul electric
msurat este potenialul suprafeei rezultate din reaciile reversibile ion-compleci de la
interfaa polimerului [8-20].
103
6.2 Referine
1.
2.
3.
4.
5.
6.
104
R a
R b
3
4
A
R
B
Led
FD
C
Senzori optici:
A- principiu de functionare: 1-fibra optica incidenta
2-radiatia reflectata, 3-fereastra, 4- reactiv -R
B- tipuri de senzori: a-cu fibra optica bifurcata,
b- monofibra cu separare radiatie incidenta/reflectata
c- transmisie
C- senzor otic pentru determinarea albuminei
O-film albumina, ///-membrana bromcrezol,verde
FD- fotodioda
Ei ncorporeaz una sau dou fibre optice. Dac este folosit doar o fibr optic,
este necesar ca cele dou radiaii luminoase: cea incident i cea de referin, s se modifice n timp i de asemenea s i modifice lungimea de und.Lumina incident trebuie s
fie n limitele unghiului de reflexie total, deci forma geometric a suprafeei senzorului
are o importan esenial (figura 7.1 A). Cel mai important domeniu de aplicaie al unui
asemenea tip de senzor este determinarea fluorescenei celulei, care depinde de raportul
NADH/NAD intracelular, obinnd asfel o msurare precis a strii celulei.
Senzorii optici prezint urmtoarele avantaje:
Nu sunt perturbai de cmpul electric,
Pot fi utilizai n msurtori repetate n msurtori repetate,
n timpul msurtorilor proba rmne neschimbat, din punct de vedere chimic i fizic
Se folosete cu protecie la ntuneric; lumina diurn influeneaz procesele
de msurare.
Pe lng fibra optic, aceti senzori mai conin o surs de lumin i un traductor de
semnal. Principiul de funcionare se bazeaz pe dependena dintre concentraia substratu105
lui i absorbia luminii sau variaia oricrui tip de proprietate optic. Membrana sau suportul senzorului, acoperit cu coninut de oxigen sau cu ali indicatori de pH, markeri
fluoresceni, prezint reacii de cuplaj cu diferite enzime cum ar fi conversia glucozei,
lactozei, etanolului si complexului antigen anticorp.
Senzori optici cu oxidani imobilizai pentru determinarea glucozei, acidului uric i
penicilinei au fost obtinui de Kobayashi [1]. n acest caz msurarea semnalului se face
prin chemiluminiscen care depinde de conversia peroxidului de hidrogen la luminol.
Semnalul de rspuns al suprafeei respective la lumina transmis de fibr, sub aciunea
peroxizilor permite msurarea peroxidului de hidrogen, ATP-ului i NADH-ului [2].n
figura. 7.1.C este prezentat senzorul optic pentru determinarea albuminei serului uman.
Schimbarea culorii bromcrezolului verde este folosit pentru msurarea semnalului. Shimbarea polarizrii luminii sau a grosimii substratului ne dau informaii asupra
cuplajului molecular cnd nu intervin reacii auxiliare. Prin aceast metod, formarea
complexului de molecule mari antigen- anticorp absorbit de o suprafa reflectant de siliciu poate fi sesizat direct ( figura 7.2)
V(mV)
gelatina
Cuva
1
Anti IgG
IgG
T(min)
Imunosenzor reflectometric
1-radiatie laser incidenta,
2- radiatia reflectata
3- fotodioda
Dependenta semnalului
masurat functie de grosimea
stratului data de reactia dintre
G(IgG) si anti IgG; gelatina este
adaugata prin absorbtie nespecifica oe suprafata substratului de
siliciu
n 1870 Tyndall (figura 7.3) a demonstrat c lumina se poate propaga ntr-un jet de
ap curbat. Acesta poate fi considerat ca primul pas spre comunicaii prin medii optice
Spre sfritul secolului, Alexander Graham Bell a fost primul care a ncercat
s transmit informaii n sensul modern, folosind lumina. Dispozitivul su
se numea fototelefon i era folosit pentru a transmite voce cu ajutorul luminii
solare pn la distana de 200 m. Lumina solar era modulat de emitor cu
ajutorul unei diafragme acionat de microfon. Receptorul capta lumina
emis de emitor i o concentra pe o rezisten de seleniu prin care trecea un
curent, proporional cu fluxul luminos care cdea pe rezisten
n anul 1934, americanul Morman French a patentat un dispozitiv numit telefon optic, dispozitiv care unea ideile lui Bell si Tyndall. Patentul descria un
aparat care transmitea vocea cu ajutorul luminii, ca mediu de comunicaie
fiind folosit un cablu optic
106
n anul 1964, Premiul Nobel a fost atribuit inventatorilor laserului ntr-un articol publicat n anul 1966 n Anglia Charles Kao si George Hockham susineau c fibra optic putea fi folosit pentru a transmite informaii; totui,
exista o problem: pentru a putea face posibil transferul prin fibra optic,
aceasta trebuia s aib o atenuare mai mic de 20 dB/km, comparat cu 1000
dB/km obinui n acel moment.
n anul 1970 compania Corning Glass Works din Statele Unite a reuit s obin o atenuare mai mic de 20 db/km cu fibr optic multimod step index la
633 nm
n anul 1972 se fabricau fibre optice multimod cu index gradient ce aveau o
atenuare de 4 dB/km.
n prezent, atenuarea unei fibre optice monomod cu index treapt este mai
mic de 0,20 dB/km la lungimea de und de 1550nm.
Fibra optica este un mediu de comunicaie folosit pentru a transmite semnalele luminoase. n termeni tiinifici, fibra optic este un ghid de unda pentru radiaiile electromagnetice. Avantaje ale fibrei optice asupra tehnologiilor convenionale:
Distane mari ntre repetoare (peste 120 km comparat cu 2 km la sistemele
bazate pe pulsuri electrice mare importan pentru comunicaiile de date i
pentru aplicaiile industriale o are faptul c transmisiile prin fibra optic sunt
imune la interferene exterioare
Distanele mari ntre repetoare la fibr optic sunt posibile datorit atenurii
mici a semnalului; fibrele optice singlemode au o atenuare mai mic de 0,20
dB/km, ceea ce nseamn c dup 40 de km parcuri n fibr, 10% din semnal rmne
Tehnicile de msurare optic au aparut de mai mult de un secol, dar actualul
reviriment n domeniul deteciilor cu fibra optic a nceput n deceniul 7, odat cu dezvoltarea conecticii pe baza de fibra optica pentru industria de telecomunicaii. Anterior,
cu citeva mici excepii, msuratorile precise cu ajutorul fibrelor optice erau efectuate n
laboratoarele metrologice. La sfritul anilor 1970, a devenit tot mai evident c fibrele optice ar putea fi utilizate pentru a conecta sursa optica i aparatura electronica de detecie
pentru msurtori, permind chiar folosirea celor mai sensibile tehnici interferometrice n
medii ostile precum tuneluri de vnt i n mediul submarin. Cercetrile iniiale s-au axat
pe folosirea senzorilor cu fibr optic pentru monitorizarea parametrilor fizici precum
temperatura i presiunea, dar in deceniul 8 s-a constatat ca exista un potential real in domeniul chimic si medical. Un fapt important a intervenit n anul 1989 cnd s-a inventat o
tehnic simpl de producere a fibrelor optice cu reele Bragg. Figura 7.4 arat construcia
unei fibre optice tipice din silice (bioxid de siliciu). Un miez cilindric din sticl este nconjurat de ctre un nveli construit dintr-o sticl cu un indice de refracie mai mic.
107
Pentru protecie sunt adugate mantale de plastic. Fibrele optice pot fi ntr-o varietate de mrimi, dar un invelis obinuit are un diametru de 125 micrometri, n timp ce
miezul variaz de la civa micrometri pn la 50 micrometri. Proprietile de baz privind
propagarea luminii pot fi inelese din punct de vedere conceptual prin principiul reflexiei
interne totale [3], care se refer la incidena unei unde de lumin la contactul dintre dou
materiale cu indici de refracie diferii. Cnd fasciculul de lumin trece dintr-un mediu cu
indice de refracie mare ntr-un mediu cu un indice de refracie mai mic, acesta apare la
un unghi r mai mare decat unghiul de incidenta i (Figura 7.5a). Aceasta nseamn c, n
cazul creterii unghiului i, se va ajunge ca unghiul r sa fie de 900, cunoscut ca unghi critic
(ic) (Figura 7.5b). Dac unghiul de inciden este mai mare de ic, atunci radiaia luminoas este reflectat, nveliul exterior comportndu-se ca o oglinda (Figura 7.5c). n
cazul unei fibre optice, att timp ct fasciculul este incident pe suprafaa de contact dintre
nveli i miez, la un unghi mai mare dect cel critic, acesta va fi reflectat si deci confinat
n miez.
Recent, au inceput sa fie produse fibre optice avnd n componena lor goluri de aer
dispuse axial, de diferite forme. Prima categorie se compune din fibre n care zona conductoare este format dintr-un defect constnd dintr-un gol de aer ntr-o structur omogen (Figura 7.6b,c).
108
n figura 7.6 b fibra este format prin adugarea goluri suplimentare n structura
fibrei. n acest caz, miezul este cel care are un indice de reflexie mai redus prin comparaie cu materialul ce-l nconjoar astfel, propagarea nu poate surveni prin aplicarea
principiului reflexiei interne totale. n schimb, n partea alcatuit din goluri axiale propagarea este oprit pentru o anumit lungime de und. n figura 7.6 c defectul are un indice de refracie mai mare fa de miezul fibrei: propagarea luminii se realizeaz prin acelai proces ca i la fibrele convenionale, defectul formnd un miez cu un indice de reflexie ridicat n timp ce structura ncojurtoare defectului se comport ca un nveli cu un
indice de reflexie mai sczut dect cel al miezului, determinat de forma i proporiile relative ale aerului i sticlei;
7.2 Fibre optice cu reele Bragg induse
Reele de tip Bragg sunt o modificare local n structura intern a fibrei prin reflectarea unui fascicul de lumin de o anumit lungime de und, n timp ce le permite celorlalte s treac. Lungimea de und pentru care un fascicul de lumin este reflectat de-pinde
de presiunea sau temperatura aplicat n zona reelei Bragg; astfel, prin activarea unei
surse de lumin cu un spectru larg de lungimi de und n fibra optic i prin monitorizarea lungimii de und a razei reflectate, cu ajutorul unui spectrometru, se poate msura temperatura sau presiunea aplicat.
Reelele Bragg prezint un interes special pentru c acestea se formeaz n interiorul fibrei. Senzorul astfel format este extrem de compact si poate fi nglobat cu uurin
n alte materiale compozite. n plus, cteva reele Bragg pe aceeai fibr permite funcionarea lor n sistem multiplex, permind astfel msurtoro n multiple zone. Printre
senzori de un considerabil interes actual se afl fibrele optice cu reele Bragg [4]. Acesta
este un sensor intrinsec cruia i-a fost impus o modulare periodic spaiala a indicelui de
refracie a miezului unei fibre monomod. Modulaia este produs n mod normal de expunerea fibrei la dou unde de lumin ultraviolet; interferena lor produce o distribuie n
variatia intensitatii axiale (Figura 7.7). Modificarea indicelui de refracie este continu.
Sensibilizarea la lumina ultraviolet se produce n mod obinuit datorit dopantilor
folosii pentru controlarea indicelui de refracie a miezului. Soluia alternativ const n
sensibilizarea fibrei prin expunerea la hidrogen, prin expunere la presiune mare [5].
109
Fibra optic ca senzor poate fi plasat n pielea pacientului sau n interiorul corpului lui pentru a msura direct parametri biomedicali. Senzorul cu fibr optic este propus a se folosi n multe i rapide determinri medicale, iar aplicaiile lui se extind continuu. Indubitabil, proliferarea acestor tipuri de aplicaii pentru senzorul cu fibr optic
conduce la un numr mare de aplicaii i combinaii ale acestora care n viitor vor conduce la microminiaturizare, versatilitate, funcionalitate. El poate fi ataat n interiorul unui
cateter i introdus n esutul hipodermic, realiznd o minim monitorizare acolo unde este
nevoie. Senzorul cu fibr optic este netoxic, inert chimic, i se poate folosi cu succes n
interiorul organismului. El se poate asocia cu echipamente pentru monitorizarea pacientului. Este simplu de manipulat cu greutate neglijabil. Evoluia senzorului medical cu
fibr optic se bazeaz pe multiplele performane i biocompatibilitate.
Biocompatibilitatea este primul pas n confortul pacientului, biosenzorul nu trebuie
s afecteze parametrii fiziologici a organismului dar nici funcionalitatea lui nu trebuie
compromis de produii de dezasimilaie a pacientului. Senzorii cu fibr optic pot fi
clasificai ca extrinseci, fibra acioneaz ca o cale pentru semnal i intrinseci, interaciile
survin n fibra nsi. Se disting trei tipuri de FOBS:
110
n ultimul deceniu fibr optic este un produs foarte folosit n toate domeniile de
vrf ale tiinei i tehnologiilor avansate. Era de ateptat ca i tiintele medicale s beneficieze de aceste avantaje pe care le ofer fibra optic, atat n ceea ce privete costurile dar
i competenele acestui material nou. Avnd n vedere uurina cu care se poate manipula, posibiliti nelimitate de sterilizare, costuri reduse, se poate estima c acest produs va
cuceri tot mai mult piaa medical. Pn n prezent se cunosc urmtoarele domenii medicale care au recurs la folosirea de biosenzori cu fibr optic:
n medicina de urgen i n cardiologie: analiza elementelor sngelui, saturaia n oxigen a hematiilor, analiza gazelor sngelui, pH ul sngelui.
n monitorizarea respiraiei
n angiologie:,monitorizarea perfuziilor microvasculare.
n aprecierea refluxului biliar prin absorbia direct a bilei de ctre pigmentul
biliar, bilirubin.
Determinarea facil a pH-ului stomacului; se introduce un microabsorbant
indicator si modulator de pH, acid alcalin.
n oncologie se urmrete monitorizarea temperaturii n timpul curelor de
terapie citostatic, sau se diagnosticheaz tumorile de dimensiuni mici i
foarte mici, greu abordabile.
n oftalmologie, se poate depista o cataract la debutul ei.
n dermatologie se poate testa calitatea i integritatea straturilor pielii, se pot
depista tumori de dimensiuni mici, se poate folosi n cosmetic pentru refacerea esuturilor prin stimulare, sau n eritema. In ceea ce privete diagnosticul unor piodermite se poate folosi un biosenzor cu fibr optic, care se
bazeaz pe consumul de oxigen (BOD ).
n stomatologie se pot diagnostica cariile de dimensiuni foarte mici care sunt
inaparente, sau cele de sub alte lucrri dentare. De asemeni se poate aprecia
culoarea dinilor sau integritatea nervului dintelui.[6].
Principalele tipuri de aplicaii ale senzorilor n scopuri biomedicale sunt prezentate
n tabelul 7.1:
111
Saturarea cu oxigen a
sngelui
PH-ul sngelui
Continutul de gaze din
snge PCO2 (presiunea
parial)
Monitorizarea respiratiei
1.
2.
Angiologie
1.
2.
3.
4.
Perfuzie microvasculara
Fluidica sngelui
Fluxuri biliare
pH - stomacului
Oncologie
1. Monitorizarea
temperaturii n timpul
terapiei
2. Diagnoza tumoral
3. Presiune
Oftalmologie
Atenuarea fluorescenei
Recunoaterea naturii tumorii prin tehnici de autofluorescenta:
excitare cu laser He-Ne a unui tesut si analiza fluorescentei prin
fibre optice
Interferometrie FabryProt
Dermatologie
Controlul dermatologic
pielii
Stomatologie
1. Culoarea dentara
2. Starea pulpei dentare
al
Umiditatea pielii
Spectroscopie de reflexie de banda larga
Saturarea cu oxigen a pulpei dentare
Ca rspuns la cererile medicilor, senzorii cu fibr optic pot monitoriza acum electroliii din snge precum potasiu, sodiu i calciu, in plus fata de coninutul de gaze n snge. Aici miniaturizarea fibreilor optice este din plin folosit. n figura 7.8 este prezentat
un cateter din fibre optice (0,5 mm diametru) ce poate fi introdus n aorta descendent capabil prin cele trei tipuri de fibre s msoare concentraia de gaze i pH ul sngelui: msu112
rarea saturatiei oxigenului, care reprezinta cantitatea de oxigen transportata de hemoglobina din hematii n funcie de capacitatea sa maxim. Materialele din care sunt alctuii traductorii chimici sunt ionofori care se pot fixa reversibil de electrolit un separator
molecular (spacer) i respectiv fluoroforul. Gradul de fluorescen, prin excitaie cu diode
electroluminiscente n violet, este modulat de ionofori proporional cu concentraia de
analit.Senzorul este utilizat fie extracorporal n circuitul extern de analiz a gazelor din
snge fie intracorporal pentru monitorizarea continu a gazelor sanguine n cazul situaiilor critice ale bolilor copiilor nou nscui.
Caria dentar este o afeciune multifactorial, o afeciune bacterian, care este caracterizat de o demineralizare a poriunii anorganice a dintelui i de o distrucie orga113
Figura 7.9- Senzor cu fibr optic pentru investigarea microorganismelor din saliv i organul cutanat
116
8. Celule de biocombustie
O major provocare pentru dezvoltarea aparatelor medicale implantabile este gsirea surselor de curent potrivite. Acestea trebuie s fie capabile s genereze energie electric pentru perioade lungi de timp.
Celulele sau pilele de biocombustie (BFC) promit mult n acest sens prin funcionarea lor pe baza reaciilor pereche oxidarea glucozei reducerea oxigenului molecular la
ap. n condiii ideale, produsele secundare ale BFC ar fi dioxidul de carbon i apa.
Glucoza i oxigenul sunt amndou prezente n celulele i esuturile tuturor organismelor eucariote, inclusiv ale oamenilor. Este posibil, dealtfel, introducerea lor ntre
resursele organismului, chiar i a proprietilor metabolice ale celulelor noastre pentru a
genera suficient energie pentru alimentarea aparatelor clinice cum ar fi sisteme de
transport al medicamentelor, aparate de diagnosticare i dispozitive de cretere uman.
8.1 Necesitatea implementrii surselor alternative de energie
Celulele sau pilele de combustie sunt dispozitive care transform energia chimic a
combustibililor (hidrogen, gaz natural, gazolin, etc.) i a oxidantului (oxigen sau aer) n
energie electric. Prile componente ale unei celule combustibile sunt: electrozii (locul
de producere a reaciilor electrochimice), electrolitul (asigur transferul ionilor de la anod
la catod) i conductorii electrici (asigur transferul electronilor prin circuitul exterior).
Sub influena catalizatorilor, de obicei metale platinice sau aliaje ale acestora, la
anod se produce oxidarea hidrogenului, iar la catod reducerea oxigenului cu formarea i
eliminarea produilor finali (ap, electricitate i cldur). Principiile care guverneaz
performana pilelor de combustie sunt cele termodinamice i cinetica proceselor de electrod pentru reaciile care au loc la interfeele electrod electrolit. Celulele de combustie
se clasific n principal dup dou criterii. Unul ia n considerare temperatura de funcionare iar cellalt electrolitul pe care-l utilizeaz.
Clasificarea se poate face innd seama i de natura combustibilului (gazos sau
lichid) sau de faptul c pila este alimentat direct cu combustibil sau cu produsul obinut
dup o prealabil reformare a acestuia. Dup natura electrolitului utilizat se deosebesc
urmtoarele tipuri de pile de combustie[1]:
Celule de combustie cu electrolit alcalin (AFC)
Celule de combustie cu membrane schimbtoare de protoni (PEMFC)
Celule de combustie cu electrolit acid fosforic (PAFC)
Celule de combustie pe baz de metanol (DMFC)
Celule de combustie cu electrolit de tip carbonat topit (MCFC)
Celule de combustie cu electrolit de tip oxid solid (SOFC)
Celule de combustie regenerative (RFC)
118
nrii deeurilor de natur organic n mediul ambiant prin transformarea lor n fertilizatori
organici. Procesele biochimice pot genera energie prin degradarea cu randament ridicat a
materiei organice la temperaturi moderate, n soluii neutre sau aproape neutre [12, 13].
Celulele de biocombustie folosesc biocatalizatori pentru conversia energiei chimice
n energie electric [14 a-h]. Aa cum cele mai multe substraturi organice sufer o ardere
cu eliberare de energie termic, oxidarea n prezena biocatalizatorilor a substanelor organice de ctre oxigen sau ali oxidani la interfeele a doi electrozi furnizeaz mijloace
pentru conversia energiei chimice n energie electric. Materiale organice abundente cum
ar fi metanolul, acizii organici sau glucoza pot fi folosite ca substraturi pentru procesele
de oxidare i oxigenul molecular ori H2O2 se pot comporta ca substraturi, fiind reduse.
Puterea disponibil a celulelor de combustie (Pcel) este:
8.1
unde Ecel este tensiunea electromotoare a celulei i curentul acesteia, Icel dac este
aplicat o sarcin electric.
Tensiunea ideal a celulei este afectat de diferena dintre potenialele convenionale ale oxidanilor i compuilor combustibili (Eox - E.comb), pierderi ireversibile n
tensiune ca rezultat al limitrilor cinetice ale proceselor transferului de electroni la nivelul
electrozilor, rezistenei ohmice interne i gradienilor de concentraie, care duc la
descreterea valorilor. Curentul celulei este controlat prin dimensiunile electrozilor,
perme-abilitatea ionic i viteza de transfer prin membrana ce separ compartimentele
anodului i catodului biocelulei.
Celulele de biocombustie folosesc biocatalizatori, enzime i chiar organisme celulare ntregi ntr-unul sau dou moduri. Fiecare (i) biocatalizator poate genera substrat
combustibil pentru celul prin transformri biocatalitice sau procese metabolice, ori (ii)
biocatalizatorii pot participa la transferul n lan al electronilor ntre substratul combustibil i suprafeele electrozilor. ns cele mai multe enzime redox nu particip la transferul
direct de electroni cu electrozii, i astfel o varietate de mediatori electronici sunt folosii
pentru contactul electric dintre biocatalizator i electrozi [15]. Recent, au fost dezvoltate
noi abordri cu privire la rolul suprafeelor electrozilor cu monostrat i multistrat constnd
n enzime redox, electrocatalizatori i bioelectrocatalizatori care stimuleaz transformrile
electrochimice la nivelul electrozilor [16].
8.4 Clasificare
n compartimentul anodic s-a preparat o soluie de glucoz de 200g/l n care s-a introdus diferite microorganisme. O sarcin de 1 Kohm a fost meninut pe tot parcursul
experimentelor. n figura 8.3 este prezentat rspunsul a trei specii de microorganisme, E.
Coli, Klebsiela i S. Aureus. Cele trei tipuri de microorganisme rspund diferit ceea ce
face ca MFC s devin un biosenzor de identificare i analiz a comportrii acestora.[21,
22,23]. Au fost folosite bacteriile prezente n apa menajer n MFC. Aa cum s-a artat,
bacteriile apei menajere se dovedesc a fi biocatalizatori potrivii pentru producerea de
electricitate [24,25].
123
Apa menajer a avut un pH ntre 7,3 i 7,6 i un coninut chimic de oxigen (COD)
de 200-300 mg/L. a fost deasemenea folosit un mediu de glucoz (170-1200 mg/L) cu
urmtorul coninut (per litru): NH4Cl, 310 mg; KCl, 130 mg; NaH2PO4H2O, 4,97 g;
Na2HPO4H2O, 2,75 g; mine-rale (12,5mL)
i vitamine (12,5mL) [26].
Microorganismele au abilitatea de a
produce substane active electrochimic,
substane ce pot fi intermediari metabolici
sau produi finali ai respiraiei anaerobe. n
scopul generrii de energie, aceste substane combustibile pot fi produse ntr-un loc i
transportate la celulele de biocombustie
pentru a fi folosite drept combustibil. n
acest caz, reactorul microbian biocatalitic
produce biocombustibil iar partea biologic
a aparatului nu are contact direct cu partea
electrochimic. Aceast schem permite
prii electrochimice s opereze n condiii
care nu sunt compatibile cu partea biologic a aparatului. Aceste dou pri pot fi
chiar separate n timp, funcionnd complet Figura 8.3-Rspunsul a trei tipuri de microorganisme n MFC (putere funcie de timp,
individual. Cel mai folosit combustibil n
min)
aceast schem este hidrogenul gazos, ce
permite buna dezvoltare i eficien marea celulelor de combustie H2/O2 n operarea alturi de bioreactoare. n Figura 8.4 se arat cum (A): Cu un bioreactor microbian separat
de restul celulei se furnizeaz combustibilul n compartimentul anodic i cum (B). Cu un
bioreactor microbian se furnizeaz combustibilul direct n compartimentul anodic al celulei combustibile.
Potrivit unei alte abordri, procesul de fermentare micro-biologic continu direct
n compartimentul anodic al unei celule de combustie, alimentnd anodul cu produse de
fermentaie generate in situ. n acest caz, condiiile de operare din compartimentul anodic
sunt dictate de sistemul biologic, aa c exist o diferen semnificativ ntre acestea i
celulele de combustie convenionale. Exist o diferen ntre o adevrat celul de biocombustie i o simpl combinaie a unui bioreactor cu o celul de combustibie convenional. Aceast ultima configuraie se bazeaz de asemenea n mod frecvent pe producerea biologic a hidrogenului, dar oxidarea electrochimic a H2 se face n prezena
compuilor biologici n condiii blnde. n acest tip de sistem sunt deasemenea folosite i
alte produse metabolice (alcooli, H2S).
124
Etem =
Gr
Gr0
0
=
; Etem
znF
znF
8.4
RT
ln
znF
8.5
MFC =
8.7
Ecel = EC E A IRe
8.8
126
n experimente, msurarea potenialelor de electrod pentru determinarea potenialelor la anod, EA, i catod, EC, se raporteaz la un electrod de referin situat n vecintatea acestora. n consecin valorile experimentale nu coincid cu Etem respectiv cu Etem0
din relaia 8.5. n practic pentru o celul ideal cu un cuplu de reacii reversibile se
consider o tensiune electromotoare msurat Ee i o tensiune electromotoare standard de
echilibru Ee0 iar expresia 8.5 se modific corespunztor. Considernd o concentraie de
oxidani, cO respectiv de produi redui, cR atunci relaia 8.5 ia forma:
Ee = Ee0 +
RT
c
ln o
znF cR
8.9
care pentru echilibru ar valorile msurate n circuit deschis trebuie s fie apropiate de Ee.
Excesul de energie liber n sistem indus de suplimentarea de oxidani i de combustibil raportat la valorile de echilibru va conduce la un suprapotenial Ecel mai mare de
Ee. Pentru a maximiza performanele celulei i a obine o tensiune optim este necesar a
maximiza (EC-EA) i de a reduce valorile rezistenelor interne. Densitatea de putere a celulei de combustie se raporteaz la aria electrozilor sau la aria echivalent de catalizatori.
127
8.7 Referine
130
9. Nanoparticule n medicin
Am putea spune c acest domeniu s-a nscut o dat cu experimentele lui Albert
Einstein, care ntr-un capitol al lucrrii sale de doctorat, a calculat mrimea unei singure
molecule de zahr ntr- un experiment de difuzie a zahrului n ap. Experimentul su a
artat c fiecare molecul msoar aproximativ un nanometru n diametru.
Domeniul este relativ nou i a evoluat o dat cu creterea necesitii de a gsi noi
materiale cu biocompatibilitate ct mai mare pentru reducerea intoleranei organismelor
vii. ncepnd cu protezele i aliajele dentare, componente artificiale pentru nlocuirea de
pri ale organelor sau chiar integral ( rinichi, ficat, piele, componente ale inimii, esofag,
plmni,ochi etc) au fost dezvoltate noi materiale cu proprieti din cele mai sofisticate.
Aria sintezei nanomaterialelor a permis o nou abordare. Binecunoscute din tiina
coloizilor nanomaterialele au surmontat principalul inconvenient- pot fi stabile fr a fi
necesar stabilizri n diferite micelii. Nanomaterialele nu sunt altceva dect tot ce cunoatem ca materiale la scal macroscopic dar reduse la nivel nanometric ele prezint ori noi
proprieti ori cele clasice sunt amplificate. Nanomaterialele nu sunt produse prin tehnicile up-down adic formarea lor prin reducere dimensional ci inversbottom-up
mprumutnd mult din tehnicile chimiei supramoleculare, coloizilor, sol-gel, inginerie genetic, biologie/ biochimie molecular. Peste acestea s-au suprapus noile metode de manipularea i sinteza cu microscopia de fore atomice, metode de autoasamblare (SAM), manipularea cu fascicule laser (tweezer), inscripionarea direct prin ink-jet etc.
Dimensiunile lor fiind sub sau comparabile cu cele ale virusurilor (figura 9.1); activitatea lor este adeseori amplificat datorit mesostructurii i forelor superficiale total
diferite de ce se ntmpl la dimensiuni normale. Interesul n poteniale aplicaii biomedicale ale nanomaterialelor i ale materialelor nanostructurate, provine din percepia c
ele sunt capabile s interacioneze cu biomolecule individuale, celule i prile lor individuale i alte structuri biologice. Pe o scal a mririlor pentru inspecia microscopic
(figura 9.1) se observ c domeniul dimensional al nanoparticulelor acoper o vast arie
dimensional n scala nanometrilor compatibil cu microorganismele i virusurile.Vor fi
abordate cteva din aspectele impactului nanoparticulelor n medicin unele din ele fiind
elaborate i dezvoltate n aceast lucrare.
1. Nanofibrile, Nanoparticule de carbon existente n mediul nconjurtor, datorit emanaiilor de gaze incomplet arse- pot fi inhalate i ajung localizate
n diferite organe dar cel mai adesea n circuitul sanguin unde cu glucoza,
hemul i ali mediatori mpreun cu microorganisme patogene pot forma
adevrate celule miniaturizate bioelectrochimice ce pot produce electricitate
iar ca produi pot varia de la cei inofensivi ( ex CO2) la gaze combustibile,
uneori accelereaz formarea toxinelor.Astzi exist largi studii de a crea
miniroboi ce folosesc substanele din circuitul metabolic ce produc electricitate i energia necesar pentru a transporta medicamentele la o int pre131
cizat. Ansamblul gastrobot medicament nvelit n filme inteligente cu recunoatere molecular a celulelor bolnave- unitate de transport format din cili
biomimetic- este intens studiat ca domeniu specific de drug deliveytransport inteligent de medicamente. Structura i activitatea specific a
nanoparticulelor de carbon rezultate din sinteza prin piroliz laser , a artat
c n anumite situaii pot accelera transportul de oxigen spre microorganismele aerobe jucnd rol de pompe de oxigen
Figura 9.1 Comapraie dintr dimensiunile microorganismel i nanoparticule pe o scal a mririlor acoperind
microscopia optic i de fore atomice
2. Nanocompozite/nanobiocompozite- ca definiie acceptat orice compozit care conine cel puin un material nanometric ntr-o matrice dat se numete
nanocompozit. Dac matricea conine materiale biologice sau biocompatibile
ele capt denumirea generic de nanobiocompozite. Nu vom intra n detalii
asupra diferitelor metode de formare a nanocompozitelor. De reinut c orice
tip de matrice de la gel pn la polimeri sau alte solide care conin materiale
nanometrice dispersate, funcionalizate, legate chimic, etc formeaz clasa
nanocompozitelor ( dispersiile lichide, coloizii sunt clase distincte). n aceast lucrare s-a studiat dezvoltara de medii de cultur ce pot induce creterea
accelerat a unor tipuri de microorganisme reducndu-se astfel timpii de
incubare la jumtate n scopul unui diagnostic mai rapid. Ulterior s-a
constatat c o combinaie de creteri pemedii de cultur pe baz de nanocarboni i transferul acestora ntr-o celul de biocombustie cu electrozi pe
baz de nanotuburi de carbon se pot identifica tipule de microorganisme
datorit specificitii lor n mecanismele de transfer de electroni.
132
gram care n comparaie cu microfibrilele cu zeci de metri patrai. Filtrele din nanofibrile
sunt foarte utile n procesul de purificare a apelor, procese de dializ dar i n prevenirea
i combatere a bioterorismului.
Recent a fost raportat obinerea unor filtre ce sunt capabile s rein metalele grele,
viruii i bacteriile din ap i s separe proteinele.Aceste filtre au fost fabricate din nanofibrile de alumin (Al2O3) de Aragonide Sanfort [7]. Alumina nanofibrilar atinge
dimensiuni impresionabile de 2 nm n diametru i o suprafa de contact de 500-650
m2/gram. Un exemplu interesant despre cum se asambleaz peptidele pe nanofibrile a fost
descris recent n [8]. Autorii studiaz sinteza moleculelor de peptide molecule amfifile
care se autoasambleaz reversibil cu nanofibrile rezultnd un gel apos. Aceste structuri
sunt n continuare polimerizate pentru a mbunti stabilitatea lor. Nanofibrilele sunt
utilizate ca abloane pentru producerea de nanotuburi prin acoperirea acestora cu un alt
material care dup procesare se poate elimina miezul format din polimer
Nanomaterialele i nanfibrilele nu snt invenia genial a unui creier uman, ele sunt
larg rspndite n natur. Diferite materiale naturale cum ar fi: lemnul, mtasea, prul,
conexiunile celulare, oasele, pielea i celulele vaselor de snge, toate aceste formaiuni
sunt produse prin repetarea regulat a aranjamentului nanofibrilelor alctuite din proteine
i polizaharide. Moleculele de ADN, sunt un exemplu de nanofibrile de 2 nm n diametru
i de 100 nm lungime.
Un exemplu interesant de material nanostructurat utilizat sau produs n natur, este
cel al culorii albastre a penajului la psri. Aceast culoare nu este dat de un pigment albastru al penajului ci de un sofisticat aranjanjament nanostructurat. Culoarea albastr a
penajului la psri este dat de lumina ce este mprtiat coerent pe aranjamentul de fibrile de keratin i bulele de aer ce alctuiesc fulgul penei.[9, 10].Un alt exemplu interesant ce conine nanofibrile naturale este cel al polimerizarii fibrinogenului i formrii
cheagului de snge. Este un exemplu magistral de aranjament nanostructurat de macromolecule i este rezultatul stadiului final al coagularii n cascad. Ansamblu coagulrii
const dintr-o succesiune de etape distincte care influeneaz rata asamblrii fibrelor de
fibrin i aranjamentul final al fibrilelor n procesul coagulrii. Primul pas n procesul de
clivare proteolitic a proteinei plasmatice fibrinogen (factorul 1. n sistemul coagulrii
celulare ), este ndeplinit de enzima numit trombin.Trombina cliveaz peptidele moleculare, mici, cunoscute cu denumirea de fibrinopeptide A i fibrinopeptide B ale moleculei de fibrinogen. Oligomerele cresc i dau protofibrile, care la rndul lor formeaz
fibrilele finale n procesul de coagulare. Dup atingerea unei mase critice protofibrilele
formeaz fibrile i n final o reea sub form de cheag.[11,12]. In vivo, fibrina monomeric n mod spontan formeaz un polimer solid care se leag covalent de celulele sngelui printr-o enzim plasmatic transglutaminaza i se transform ntr-un polimer
insolubil. In vitro, polimerul de fibrin trebuie s polimerizeze reversibil i apoi s repolimerizeze n structura mai sus amintit.
Este posibil s se formeze o fibrin lucrtoare, cu un larg spectru, cu fibrile de grosimi diferite, realiznd n final un polimer de porozitate diferit, cu pori distribuii diferit.
134
Numeroi factori contribuie la determinarea final a diametrului fibrilelor i la funcionarea sistemului[13,14]: tria ionic, pH, raportul fibrinogen / trombin, prezena
altor proteine plasmatice. Autoasamblarea fibrinei apare n special via legturile necovalente A- i B- dintre siturile localizate de polimerizare din domeniile E centrale i
domeniile D periferice ale fibrinei. Natura fizico- chimic a legturilor covalente depinde
de interaciunile electrostatice i legtura de hidrogen ce nsoete resturile de aminoacizi
n cursul procesului de asamblare a fibrilelor de fibrin. Este semnificativ observaia c
efectul triei ionicei ce nsoete procesul de polimerizare, influenaz rata de polimerizare. Deasemeni interaciile hidrofobe particip la polimerizarea fibrinei.
Studiul asupra nanostucturilor de fibrin este de mare interes pentru lumea academic i medical, att n ceea ce privete noua viziune asupra conceptului de boal a
coagulrii ct i n ceea ce privete noile perspective ce se deschid, fibrina are un potenial
important n industria medicamentelor i n cea a esuturilor de susinere.
Nanofibrile carbonice
ACF- fibrele de carbon activate, sunt materiale fibroase nanostructurate, ce au mare potenial n medicina aplicat. Diametru acestor fibrile este de ordinul micrometrilor,
au mari suprafee interne i sunt clasificate n funcie de dimensiunea porilor n trei categorii:
micro, au porii mai mici de 2nm,
mezo, au porii ntre 2-50 nm,
macro, cu porii mai mari de 50nm.
Aceast clasificare se bazeaz pe diferena n mecanismul de adsorbie a gazelor,
clasificare realizat la recomandrile IUPAC. Toate cele trei tipurile de pori contribuie la
nanostructurarea ACF.
GAC- fibre de carbon gaz adsorbante, sunt utilizate cu succes n purificarea sngelui extracorporal, hemoperfuzii.
Rezultate preliminarii comparative ntre cele dou nanostructuri, ACF i GAC au
condus la idea c au un potenial deosebit n aplicaiile medicale.
Aplicaii medicale ale ACF i GAC
Bactericid puternic, dovedit prin impregnarea fibrilelor de carbon activ cu cupru i
amestecarea lor cu un mediu nutritiv pentru culturi de: Pseudomonas mirabilis, E. coli,
Stafiloccocus aureus sau Pseudomonas aeruginosa. n toate cazurile din aceste culturi nu
s-a observat dezvoltarea coloniilor de microorganisme. Importante rezultate pozitive i ncurajatoare sunt n tratarea tumorilor, prin reducerea dimensiunilor acestora sau dispariia
lor. Experimentele s-au efectuat pe animale de laborator dar i pe voluntari umani.
Imobilizarea endotoxinei bacteriene de la Stafilococul auriu, cu ACF (SAC-ACF)
sau de la E.coli (BET-ACF), se poat folosi pentru experimente de tratare a cancerului la
animalele de laborator. n aceste cazuri durata de supravetuire a fost mrita de la 52 zile
la 76 zile, prin hemoperfuzii. Rezultatele sumarizate din literaturt arat marile posibiliti ce se ofer aplicaiilor medicale prin folosirea nanomaterialelor cum ar fi nanofibrin i ACF sau GAC.
135
Peretele bacterian are o compoziie i structur complex. Exist dou tipuri principale de structuri ale acestuia care determin clasificarea bacteriilor n dou clase: Gram
pozitiv i Gram negativ. Aceast denumire provine de la metoda Gram de identificare a
bacteriilor ce folosete violetul de genian (un colorant bazic trifenil-metanic) i o soluie
apoas de iod i iodur de potasiu. Dup splare cu alcool, bacteria fie va reine coloraia
puternic violet a violetului de genian, fie va fi complet decolorat. Uneori se aplic i o
colorare suplimentar cu fucsin sau eozin pentru a da bacterilor decolorate o culoare
roiatic i a le face mai vizibile. Bacteriile ce rein culoarea violet sunt cele Gram
pozitiv, iar n caz contrar sunt Gram negativ [18].
Toate bacteriile, cu excepia micoplasmelor, posed un perete bacterian iar principala component a acestuia este mureina, un peptidoglican, care contribuie la rigiditatea
mecanic a acestuia. Toate bacteriile Gram negativ conin un strat adiional n structura
peretelui celular, o membran extern, care este localizat deasupra stratului peptidoglicanic, astfel c la o seciune prin nveliul bacteriilor de acest tip vazut la microscopul electronic apare o structur trilaminar [19]. O alt deosebire dintre cele dou
grupuri const n grosimea stratului peptidoglicanic, care este mult mai mare la cele Gram
pozitiv.
Figura 9.2-Fragment de
peptidoglican
grupele hidroxil prezente sub forma de CH2OH din catenele principale. De asemenea,
datorit spaiilor relativ mari dintre catene, polimerul peptidoglicanic este mbibat cu molecule de ap, care sunt i ele reinute prin legturi de hidrogen, ceea ce d natere unei
faze de gel n care sunt dispersate o varietate de alte molecule mici.
Polimerul peptidoglicanic nu este lipit direct de membrana intern lipidic, ntre
acestea existnd un spaiu n care se afl apa, numit periplasma. Unii autori consider c
la bacteriile Gram negative i peptidoglicanul este o component a acestei periplasme. O
alt caracteristic a bacteriilor Gram negative o constitiue prezena n membrana extern
a unor lipopolizaharide precun i a unor pori, cu deschidere de circa 1-2 nm, indui de
proteine specifice, numite porine. Cele Gram pozitive prezint la exterior polizaharide
specifice ancorate n perete, precum i polimeri filiformi de tip acid teichoic (ancorat tot
n perete) si lipoteichoic (ancorat in membrana de baza), acizi cu compozitie complexa de
tip poliesteri fosforici ai glicerinei cu resturi de alanina, zaharuri cu/far lipide. De asemenea, bacteriile posed pentru locomoie mai muli flageli care ncastrai n peretele
celular ce asigura deplasarea acestora spre sursele de nutrieni i oxigen. Alte structuri
filiforme prezente pe peretele bacterian sunt pilii. Ei sunt formai din proteine tubulare cu
rolul de a ajuta bacteria s adere la celula gazda , folosind de asemenea la transferul
informatiei genetice de la o celula bacterian la alta prin mecanismul de conjugare,
Multe bacterii prezint pe exteriorul peretelui bacterian un strat mucoid, foarte
puternic imbibat cu ap, numit capsul, ce are o grosime apreciabil. El are n compoziie,
spre exemplu la bacilul de antrax, un polimer al acidului glutamic, iar la alte bacterii
conine polizaharide. Rolul su pare a fi de protecie a bacteriei mpotriva mecanismelor
de aprare a gazdelor infectate.
n afara de proteinele din membrana de baz, se mai gsesc, lipoproteine, i multe
alte tipuri de proteine cu diverse roluri ( de transport, catalitice, antene pentru diverse
semnale, de adeziune etc) [20].
Un alt fapt ce trebuie menionat esta c o mare parte din antibiotice acioneaz prin
blocarea biosintezei peretelui bacterian, n spe deregleaz sinteza peptidoglicanului. n
absena unui perete funcional, materialul bacterian din interiorul celulei este expulzat
afar i bacteria moare [4].
Tabloul zugrvit succinct relev marea complexitate i varietate, dar i importana
nveliului bacterian. Proprietile acestuia l fac apt s interacioneze n multiple moduri
cu suprafaa nanoparticulelor n particular cele carbonice, determinnd o schimbare profund a comportamentului bacteriilor.
Tipuri de nanocarboni
sunt dimensiunea cristalitelor i aria suprafeei. Datele au artat c abilitatea acestui tip de
carbon de a accepta/dona electroni este funcie de densitatea de defecte pe suprafaa negrului de fum [25].
Transferul de electroni este esenial n multe procese celulare, cum ar fi de exemplu
cele de fotosintez i de respiraie. Se poate presupune asftel i posibiltatea existenei
unui schimb electronic la contactul bacteriilor cu nanoparticulele carbonice, prin intermediul proteinelor existente n peretele bacterian.
Dei suprafaa carbonulului este de obicei hidrofob, structura chimic se poate
modifica pentru a crete hidrofilicitatea [26]. S-a amintit mai sus c oxigenul reacioneaz
cu suprafaa carbonic cconducnd la diverse grupri, polare, cu caracter puternic hidrofil.
Aceste grupri pot atrage nu doar moleculele de ap dar i alte grupe polare ce se
gsesc din abunden pe suprafaa peretelui bacterian, astfel ele pot adera foarte strns la
nanoparticulele de carbon.
Trebuie reinut c grupele carboxil si hidroxil fenolic de la suprafaa carbonului pot
ioniza cu formare de ioni de tip Ar-COO i Ar-O, unde Ar reprezint restul carbonic cu
caracter aromatic. De asemenea, aceste grupe pot interaciona cu structurile ce prezint
molecule ionizate pozitiv de la suprafaa peretelui celular, cu formare de legturi ionice
puternice.
Suprafaa specific foarte mare ca i porozitatea acestor nanoparticule permit adsorbia prin legturi slabe a oxigenului din aer dar i a unor nutrienti din mediul de cultur. Aceste substane adsorbite vor fi eliberate ctre bacteriile care aderente la nanoparticule, fenomen ce poate constitui o explicaie pertinent pentru dezvoltarea foarte rapid a coloniilor de microorganisme.
n concluzie, suprafaa carbonului conine o proportie variabila de situsuri active,
constituite de catre valentele nesaturate de la marginea straturilor grafenice formate de
atomii de carbon, proportie ce creste desigur cu cresterea porozitatii si a dimensiunii suprafeei; pe de alt parte, prezena unor heteroatomi cum sunt n principal oxigenul, hidrogenul si azotul de asemenea introduce situsuri active la suprafaa carbonului, si deci
aceasta suprafaa nu e deloc inert cum ar parea [10].
Un alt aspect demn de a fi luat in cosideraie este acela al Hidrocarburilor Aromatice Polinucleare (PAH-uri), care sunt prezente ntotdeauna adsorbite la suprafaa
particulelor nanometrice de carbon, stiindu-se faptul ca aceste PAH-uri apar ca intermediari in procesele pirolitice ce au ca precursori hidrocarburi in stare de gaz sau vapori.
Aceste molecule ar putea interaciona cu bacteriile n dou moduri: pe de o parte
ar putea fi oxidate de aparatul enzimatic al acestora i s aib loc astfel un fenomen de
biodegradare [27], iar pe de alta parte aceste PAH-uri ar putea strabate barierele membranare si odata ajunse in interiorul celulei sa interfere cu mecanismul de multiplicate al
acizilor nucleici bacterieni, provocnd mutaii genetice cu diverse consecinte [28].
Medii de cultura specifice bionanocompozite cu nanomateriale carbonice
Interacia nanoparticulelor cu structurile vii este studiat la ora actual att din
punctul de vedere al nanotehnologiei dedicate aplicaiilor n biologie i medicin, ct i
din perspectiva contaminrii mediului ambiant i implicit al organismelor cu aceste nano140
Nanocarbonii folosii provin din piroliz laser sau din descompunere n plasm
(sursa Institutul Naional Fizica Laserilor Plasm i Radiaii). Ca referin s-au studiat i
specimene de negru de fum. Caracteristicile materialelor sunt prezentate n tabela 9.1.
Structura lor este prezentat n figura 9.5. Se observ c fiecare tip de nanocarbon are o
topografie sppecific cu o structur turbostratic difereniate prin natura compoziiei lor i
a gruprilor funcionale induse din procesele de sintez.
Tabela 9.1 -Nanocarboni compatibili cu aerosolii din mediu folosii n BNC
Tipul
Sursa/metoda
Caracteristici principale
Componeni
Impuriti: oxigen, hidrogen,
CB R
Ardere
Aria specific:
sulf.
Negru de
incompleta a
10-150 m2/g msurat prin
Oxigenul i hidrogenul sunt
fum de canal acetilenei
absoria de azot (metoda
covalent legai de carbonul
BET)
Diametrul: min20- max 300 de pe supraa particulei
Raportul O/H depinde de
nm. Distribuie aleatorie
condiiile arderii incomplete.
In cazul negrului de fum de
canal, coninutul de oxigen
Pigment-negru cu arie
Ardere
Pigment
este de 2-5% iar cel de
specific: 300-500 m2/g.
incomplet n
negru
hidrogen este de 0.5%;
furnal cu
CB- P
n negrul de fum de furnal
ciclonizare
(negru de
coninutul de oxigen este
fum de
dependent de debitul de
furnal)
alimentare a hidrocarburilor
NC-LP1
Precursori etilen, Structur trubostratic,
Hidrogen adsorbit pe
NC- CVD1
butadien
suprafa
NC- LP2
Acetilena cu
Structur trubostratic
Sulf i fluor sunt prezente n
sensibilizator SF6
cantiti apreciabile
NC-LP3
Benzene
Fragmente fullerenice n
Multiple structuri policantiti mici,
aromatice (PAH)
NC-CVD2
Benzene, toluene,
142
A. a)
a Sferule de CB
B-R, scala 100nm
m; b) model penntru CB,
distrribuie aleatoare a planelor grafeenice (BSU) n sfferula de
CB c) CB tratat termic
t
la 3000K
K, alinierea BS
SU- este
circu
umferenial d) dispunerea grrafenelor n CB
B e) CBpariial corodat n pllasm-deschiderrea canalelor cu formare
de nanopori
n
[11,14, 16]
B)
B) NC-LP1-precurs
N
pic a) scala 1000nm b) 10 nm c) Detalii
or etilen/acetilenre, structur turbostratic tip
morffologice d) HRT
TEM- contrast dee faz- se distingg grafenele dispuuse circumferenial
C) LP-NC3
L
din preccursor de benzen
n, structur cu ffullerene
multtistrat i mari can
niti de PAH
D) NC-CVD2,
N
din precursor
p
toluen
n, sferule de nannocarbon
multtistratificate
D)
Figu
ura 9.5-Structurri de nanocarboni utilizai la fo
formarea de medii bionanocom
mpozite (BNC) cu
c matrice
biologic pee baz de medii de cultur Chapm
man i AABTL
Mattricea biologiic:
Pentru miccroorganismeele Gram poziitiv, respectiv
v culturi de Sttaphylococcu
us aureus,
s-a ales un mediuu Chapman cuu adaos de m
manitol.
143
S-au testat totodat tipurile de nanocarbon conform cu tabela 9.1 (nanocarboni din ardere incomplet, carbon turbostratic cu alchene i carbon
aromatic (benzen, toluen), care are un coninut ridicat de hidrocarburi poliaromatice i fragmente de fulerene.
n figura 9.6 sunt prezentate colonii de Staphylococcus aureus crescute pe mediul
de referin i pe bionanocompozite cu concentraii diferite.
Se observ c:
BNC cu CB-R ( negru defum de canal) i CB-P (negru de fum de furnal), nu
prezint nici o mbuntire important, coloniile sunt slab dezvoltate,
aleator dispersate, de dimensiuni mici. Pigmentogeneza lipsete sau este slab
reprezentat.( din tabela 9.1)
BNC cu NC-LP1 (nanocarbon din piroliz laser, precursori etilen):
La concentraia de 0,01% coloniile sunt bine dezvoltate similare
cu referina sau uor mai mari. Pigmentogeneza este normal.
La concentraia 0,1% creterea este exploziv cu pigmentogenez remarcabil.
Peste aceast concentraie, la 1%, creterea este slab reprezentat, atipic iar pigmentogeneza lipsete.
BNC cu NC-LP3 ( nanocarbon cu fragmente fullerenice i PAH-uri):
La concentraii de 0,01% se observ o cretere atipic de colonii.
La 0,1% creterea este remarcabil i pigmentogeneza bine reprezentat.
La 1% creterea un este evident, colonii slab reprezentate
Toate aceste observaii sunt sumarizate n tabela 9.2.
Tabela 9.2-Comparaie calitativ a virulenei n BNC
BNC
0.01%
0.1%
1%
CB-R
N. O
M
Ca in R
CB-P
N.O
M to WD
Ca in R
NC-LP1
WD
Pigmentare
Exploziv
atipic
NC-LP2
slab
Nu
nu
NC-LP3 &
Forme
W. D ,
neconclude
NC-CVD2
atipice
pigmentare
nt
atipica
N.O- diferene neobservabile M-evoluie moderat ;
WD-colonii bine dezvoltate, R-referina
Figura 9.6- Creterea de colonii de Staphyloccocus
aureus pe BNC cu diferite specii de nanocarboni i la
diferite concentraii
reprezint dependena dezvoltrii de colonii funcie de timpul de incubare pentru dou din
concentraiile de nanocarboni din BNC considerate optime.Se constat c diagnosticul
microbioogic poate fi redus de la 24-48 de ore la 4-8 ore Creterea accelerat a acestor
tipuri de microorganisme cu dezvoltare de colonii viguroase i pigmentogenez bine reprezentat este consecina interaciei acestora cu nanocarbonii din mediul de cultur bionanocompozit.
Microorganismele aerobe, precum Staphylococcus aureus au nevoie de oxigen pentru
dezvoltare iar nanocarbonul are o foarte mare afinitate de a adsorbi oxigenul din atmosfer i al concentra. Acesta este fenomenul principal ce st la baza relaiei nanocarbonmicroorganism. Nanocarbonul are funcia de a pompa oxigenul n mediul cultur prin
urmtorul mecanism: adsorbia preferenial a oxigenului din atmosfer i concentrarea n
jurul su. Mecanismul de transport implicat este diferena de concentraie i difuzia prin
microporii bionanocompozitului.
Din datele de analiz structural i spectroscopie FT-IR arat prezena de grupri OH
i carbonil legate covalent de suprafaa nannocarbonilor ce au proprieti de schimbtori
de ioni. Aceasta este benefic pentru microorganismele aerobe mari consumatoare de oxigen dar ar putea avea un impact major negativ atunci cnd vin n contact cu tegumentele
i pielea. Caracterul de nanoelectrolit al nanocarbonilor poate schimba pH-ul local al
filmelor hidrolipidice i aciditatea pielii favoriznd astfel atacul microorganismelor. Astfel se deschid multe canale pentru infecia microbian.
n concluzie se poate afirma:
Figura 9.6-Rata de cretere la dou concentraii BNC001 i BNC01 raportate la referin funcie de timpul de
incubare. Sgeata indic momentul vizibil al creterii sub lupa microscopic [24]
miez de ioni n jurul cruia graviteaz electronii genernd un spectru discret similar dar la
energii mult mai mici.
Termodinamica descompunerii fazei prin difuzie controlat a unei soluii suprasaturate a fost dezvoltat i experimentat pe aliaje metalice artnd c pot fi formate particule nanometrice stabile. Chimia colizilor a furnizat procedee de stabilizare fr nglobare n structuri micelare. Sintezele sol-gel de preparare de nanoparticule au devenit un
instrument uzual.
Istoric
1973 LEO ESAKI primete premiul nobel pentru dezvoltarea de structuri cuantice
semiconductoare, teoria confinrii unidimensionale.[29]
1980. EKIMOV i. EFROS, de la Institutul IOFFE, au observat formarea de puncte
cuantice n structura unei sticle coninnd Pb S.[30]
1983 LOUIS BRUS s-a ocupat de confinarea tridimensional de puncte cuantice
crescute in lichide organice.[31]
1984 TADASHI ITOH dezvolt teoria confinrii tridimensionale n punctele
cuantice crescute n volumul cristalelor de clorur de cupru i clorur de sodiu.
1997, profesor WARREN CHAN, de la Universitatea din Indiana a pus n eviden
o metod pentru vizualizarea unei singure proteine i a virusului n actiune. n acelai an a
fost posibil demonstrarea prezenei oligonucleotidelor legate de DNA, prin legarea lor
de punctele cuantice, un pas important n domeniul analizelor genetice.[32]. Ulterior
bioconjugatele coninnd puncte cuantice au artat un drum nou pentru studiile fundamentale n biologie.
AKERMAN si echipa sa au demonstrat n 2002, c polimeri ce au n componenta
lor puncte cuantice au fost folositi pentru diagnosticul cancerului la soareci.[33]. NIE i
GAO, 2002, Universitatea Emory- Giorgia Tech, au injectat polimeri cu puncte cuantice
la oareci urmrind procesul de carcinogenez i de metastazare.
2003, la Universitatea din Toronto, profesorul RED SARGENT i grupul su au
observat electroluminiscena n infrarou (1000-1600 nm) a nanocristalelor de sulfur de
plumb, imersate ntr-un polimer semiconductor. Aceste nanocristale sau materiale de polimeri hibrizi constituie platforma de plecare pentru electronica integrat, tehnologia
optic i cea a comunicatiilor.Toate aceste importante descoperiri ale electroluminiscentei
sau fluorescentei, bazate pe prezena punctelor cuantice are utilizri n biologie i
medicin, cu conditia s fie biocompatibile, netoxice. n acest sens pledeaz si experimentul efectuat n anul 2002, cnd s-a reusit ncorporarea de puncte cuantice in micele
de fosfolipide, rezultnd un polimer fluorescent.[34]
Puncte cuantice-nanocristale semiconductoare
150
151
Studiile au artat c toxicitatea punctelor cuantice cu miez de CdSe se datoreaz ionilor de Cd ce se elibereaz n celul. Fenomenul se datoreaz aciunii oxigenului ca rezultat al expunerii la UV timp ndelungat al punctelor cuantice.
Acoperirea cu ZnS creaz o suprafa mai benign la aceste fenomene. Desigur
punctele cuantice se pot acoperi cu polimeri ns n foarte multe cazuri aceti produc
moartea prematur a celulelor. Studiile de citotoxicitate au artat c sistemele InGaP/ZnS
sunt mult mai limitate n toxicitate [35, 36,37]
Un exemplu al cercetrilor actuale cu tipul 2 este prezentat n figura 9.10 unde
WSQD sunt utilizate n investigarea tumorilor prin tehnici de imagistic n domeniul NIR
152
( infrarou ndeprtat) unde esuturile sunt transparente iar tumorile pot fi puse n eviden
prin fluorescen direct.n figura 9.10 este prezentat un exemplu pe un oarece cu o
tumor cruia i s-a injectat 100 pmol de WSQD tipul 2 diluate n ser fiziologic . Se observ un contrast evident dintre localizarea tumorii i esuturile normale. Distribuia prin
sistemul limfatic, vezica urinar i ficat practic este inexistent. Investigarea prin imagistic optic n domeniul NIR combinat cu punctele cuantice poate produce un impact
major n detecia i diagnosticul i tratamentul cancerelor
Punctele cuantice un instrument versatil n tiintele vieii
Imagistic molecular
Detecia timpurie a bolilor i monitorizarea tratamentului
Modaliti multiple de imagistic non invaziv (PET, SPECT, MRI, UV-Viz,
ageni de contrast optic)
Selecii i sortri de nalt performan a materialelor biologice
Microarii (proteomic, genomic)
Coduri de bare
Citometrie reologic
Msurarea multipl i simultan a parametrilor celulari (coninutul de acizi
nucleici, activitatea enzimatic, fluxul de calciu, potenialul membranei, pH)
Sortarea celular (separarea celulelor sau a sub compo-nentelor acestora)
Fluorescen rezonant cu transfer de energie (FRET)
Identificarea interaciei dintre dou sau mai multe molecule
nlocuirea fluoroforilor clasici i extinderea domeniului de fluorescena cu
surse de excitaie minime
Se constat c punctele cuantice deschid o nou etap ntehnicile de analiz i investigare datorit fotostabiltii mult mai mari fa de fluoroforii clasici cu fluorescen
ndelungat permind astfel s se investighezemecanisme moleculare i s elimine contaminrile spectrale ce necesit metode de corecii suplimentare. Montajul de figura 9.11
descrie eficiena noilor materiale ca instrumente de investigare a materiei vii.
Figura 9.11. Metod de investigare a sturcturilor
organismelor vii prin metoda microscopiei de
fluorescn confocale cu fibr optic. Fibra optic este
format dintr-un set de microfibre din care una este de
excitaie. Unitatea laser de scanare conine
microscopul confocal, optica de mrire i detectorul
CCD de prelucrare imagin ( 20-50 cadre/sec).Dioda
laser cu =488nm poate excita toat gama de puncte
cuantice dar i fluoroflori clasici (Syto13, Yoyo1,
FITC, CellTracker Green, Calcein, Rhodamine, 123 or
6G, Cy3,). Sunt prezentate trei aplicaii: acces extern,
endoscopic i invaziv minimal ( cu permisiunea
Cellvizio tech)
Explorarea
transformrii
liniilor celulare mamliene
cu Q-dots
Carcinom de colon- liniile
HT29 i SW 1222
(detalii,evitenttechnology.c
om)
Figura 9.12 a. Celule neoplazice etichetate cu Qdot conjugate. Marcherul cancerului de plmni, Her2, s-a
detectat pe celule cu o combinaie de Herceptin biotinilat
Cercetri n neurotiine
*Imagistic n adncimea
creierului
*Neurogenez
Postnatal
*Boli neuro-degenerative
Celule stem & terapie
regenerativ
*Reparaii neuronale
Figura 912b Explorri neuronale, investigri cu puncte cuantice funcionalizate
Cercetarea cancerului
Observaii histologice in
vivo
Angiogeneza tumorilor
Imunoterapie
Caracterizare criptfoci
Cancere colorectale
Microvascularizare a mesenterului
Leucocite
Figura 9.12.d- Explorri sanguine
155
Figura 9.12-e Exemple de aplicii ale punctelor cuantice n medicin i biologie, explorri genetice
Materiale
Punctele cuantice utilizate n experimente au fost achiziionate de la Evident
technology, SUA. Protocoalele de funcionalizare s-au derulat sub asistena firmei care a
6. sulfo-NHS
Echipamente
Ultracentrifug
Lamp UV
Baie ultrasonic
A) Activare carboxi-EVITAG prin combinare a urmtorilor reactivi, incubare la
temperatura camerei 30h, agitare manual
2ml EviTag
0.4ml fodfat de sodiu
20mg EDC
15mg sulfo-NHS
B) Desalinizare mixtura de reacie prin ultracentrifugare ( max 140000 g), 40 min
C) Aspirare ( prelevare) supernatant cu verificare fluorescen
D) Conjugare .
0.5ml streptavidin, 10mg/ml)
1.5ml ap distilat
0.4ml sodium borate buffer
E) Incubare RT n baie ultrasonic pn cnd precipitatul se dizolv
F) Agitare fiol timp de 2h
G) Stocare 12 h n fiol nchis
H) Centrifugare la 40000 rpm min 80 min
I) Recuperare supernatant n fiol cu 5ml ap
J) Se repet paii H-I dac controlul fluorescenei nu este corect sau prezint turbiditate
peste noapte
K) Pstrare: 40C la ntuneric
Acest protocol este n general satisfctor pentru analize curente de microscopie de
fluorescen pentru investigri uzuale i n parazitologie [39, 40]
Protocol 3
Cuplare oligonucleotide sulfhidril modificate la puncte cuantice EviTags funcionalizate
cu grupri aminice
A) activare amin-EviTags cu sulfo-SMCC
Combinare 1:1 molar echivalent de sulfo-SMCC i amin EviTag n 50mM
de soluie tampon de fosfat de sodiu pH 7,4 ( PBS , pH7 este deasemeni
recomandat)
Incubare 60 minutes la RT ( temperatura camerei)
Eliminarea excesului de reticulator cu coloan de desalinizare echilibrat cu
soluie tampon de conjugare (1mM EDTA, 0.1M fosfat, 0.15MNaCl, pH 7.2;
pentru preparare se adaug 20l de 0.5M EDTA la 10ml de PBS pentru
158
160
coproparazitologic direct
161
9.4 Referine
1 Frenot A., Chronakis I.S. Current Opinion in Colloid and Interface Science; 8: 6475.
(2003)
2 Bognitzki M., Czado W., Frese T., et al. Adv Mater,13,70. (2001)
3 Ko F., Gogotsi Y., Ali A., et al.,Adv Mater; 15,1161-5 (2003)
4 Kenawy E.R., Bowlin G.L., Mansfield K., et al. J Contr. Release; 81:5764. (2002)
5 Boland E.D., Wnek G.E., Simpson D.G., Pawlowski K.J., Bowlin G.L. J Macromol Sci,
38:123143.(2001)
6 Matthews J.A., Wnek G.E., Simpson D.G., Bowlin G.L. Biomacromolecules; 3, 2328.
(2002)
7 Tepper F., Lerner M., Ginley D.American Ceramic Society Bulletin, 80, 57-60. (2001)
8 Hartgerink,J.D., Beniash E., Stupp S.I, PNAS; 99, 51338 (2002).
9 Prum R.O., Torres R.H., Williamson S., Dyck J. Nature, 396, 289. (1998)
10. Shawkey M.D., Estes A.M., Siefferman L.M., Hill G.E. Proc Roy Soc, Ser B; 270,
1455-60. (2003)
11 Doolittle R.F. Fibrinogen and fibrin. Ann Rev Biochem; 53, 195-229. (1984)
12. Henschen A. Thromb Res;Suppl 5, 27-39(1983)
13 Doolittle R.F., Blomback M., Henschen A., et al. Nature; 218, 130-4. (1968)
14 Kudryk B., Reuterby J., Blomback B. Thromb Res; 2, 297-303,(1973)
15 a.Boland E. D., Wnek G. E., Simpson D. G., Pawlowski K. J., Bowlin G. L., J.
Macromol.Sci.,38, 1231-43.(2001)
b.Bognitzki M, Hou H., Ishaque M.,et al. Adv Mater; 12: 637-40. (2000)
c.Hartgerink, J. D., Beniash E., Stupp S. I., PNAS; 99, 5133-8. (2002)
d.Matthews J. A., Wnek G. E., Simpson D. G., Bowlin G. L. Biomacromolecules;
43:4403-12. (2002)
16 D. B. Warheit, Materials today, 32-36 (2004)
17 P.H.M.Hoet, I. Bruske-Hohlfeld, O. Salata, J. of Nanobiotechnology,2:12, (2004)
18 A.M. Glauert, M.J. Thorley, Annu. Rev. Microbiol, 23, 159-198, (1969)
19 Microsoft Encarta Encyclopedia 2002
20 Balbaie V., Posogy N. editori, Epidemiologie medicala, vol II, Ed Medical, Bucureti, (1985)
21 J. Riviera-Utrilla, I. Bautista-Toledo, M.A. Ferro-Garcia, C. Moreno-Castilla, Carbon,
41, 323-329 (2003)
22 H. Le Pape, F. Solano-Serena, P. Contini, C. Devillers, A. Maftah, P. Leprat, Carbon,
40, (2002), 2497-2954
23 M.A. Montez-Moran, D. Suarez, J.A. Menendez, E. Fuente, Carbon, 42, (2002),
24 Stamatin Luminita, Stamatin I., Nanobiocomposites based on nanocarbon for cell culture media, in Nanoengineered Nanofibrous Materials, Ed. Y. Gogotsi, S. Kacac,
Kluwer, pp289-298 (2004)
162
25 Goeringer S., Tacconi N.R., Chenthamarakshan C.R., Rajeshwar K., Wampler W.A.,
Carbon, 39, 512-522, (2001)
26 F.Rodriguez-Reinoso, Carbon, 36, 159-175,(1998)
27 Habe H., Omori T., Biosci, Biotechnol, Biochem., 67, 225-43, (2003)
28 I. Alfheim, A. Lindskog, Sci. Total Environ, 15, 203-22 (1984)
29 http://nobelprize.org
30 Golubkov V, Ekimov A., Onushenko A., Tzehomskii V., Sov. Phys.and Chem.of
glass, 6, 511, (1980 )
31 Rosseti R., Nakahara S., Brus L., J.of Chem Phys, 79,1086, (1983)
32 C. B. Murray, C. R. Kagan, M. G. Bawendi,Annual Review of Materials Science, 30,
545-610, (2000)
33 kerman Maria E., Warren C. W. Chan, Pirjo Laakkonen, Sangeeta N. Bhatia, Erkki
Ruoslahti , PNAS, 99, 20-27 (2002
34 Zhang Q, et all, PNAS, 104, 17843-8.(2007)
35 Christian Kirchner, Tim Liedl, Stefan Kudera, Nano Letters, 5, 2, 331-338, (2005)
36 Austin M. Derfus, Warren C. W. Chan, et al Nano Letters,4, 1, 11-18 (2004)
37 Florescu L. Gavrila, Fleaca C., Voicu I., Morjan I., Stamatin L., Stamatin Ioan, Appl
Surf Sci. 253,19, 7729-7732, (2007)
38 Grabarek Gergely Anal. Biochem. 15;185,131-5 (1990)
39 G.T Hermanson,. Bioconjugate Techniques, Academic Press, New York; pp226,
(1996).
40 Baoquan Sun, et al., Journal of Immunological Methods 249 85-89. (2001)
41 Luminita Stamatin, Cercetri asupra structurilor de biosenzori implicai n diagnosticarea i monitorizarea bolilor parazitare ale pielii, Tez doctorat, 2006, coord
T. esan
163
164
10 Nanotuburi de carbon
Nanotuburile de Carbon (CNT-carbon nanotubes) i microscopia de fore atomice
pot fi considerate promotorii nanotehnologiei. CNT-urile au entuziasmat lumea tiinific
prin proprietile lor remarcabile electronice, mecanice i termice. Posibilitatea funcionalizrii lor a deschis calea spre noi funcii specifice conexiunea spre nanobiotehnologie
i a materialelor avansate, econanotehnologie. CNT-urile au un potenial ridicat pentru
aplicaiile posibile n ramura energiei, a electronicii, IT-ului. Totui, datorit insolubilitii nanotuburilor n solveni, chimici, biochimici i biologici, folosirea acestor
materiale a fost mai degrab limitat. CNT-urile solubile n ap i solveni organici reprezint un interes din moment ce pot deschide noi abordri n dezvoltarea de nanocompozite, nanosenzori, electronic molecular.
10.1 Istoric
Descoperirea lor este legat de cea a fullerenelor, forme alotropice ale carbonului,
molecule compuse din carbon n forma unor sfere, elipsoid sau de tuburi. Fullerenele
sferice se numesc buckyball i acelea cilindrice se numesc buckytub sau simplu
nanotuburi de carbon (CNT). Fiecare dintre ele poate fi considerat ca un mod de
organizare spaial a grafenelor (planele bazale din grafit). Fullerenele au fost descoperite
de n 1985 de Curl, Kroto i Smalley la Universitatea Sussex, UK i Rice University
(Houston, Texas) iar denumirea lor provine de la arhitectul Richard Buckminster Fuller
care a construit un dom cu acest tip de geometrie [1]. n 1996 cei trei chimiti primesc
premiul Nobel pentru aceast descoperire. Aceast familie era diferit de cea a grafitului
i diamantului, C60 este o molecul format din 60 de atomi de carbon.Totul a nceput de
fapt cnd experimentele lui Kroto au fost fcute cu ajutorul unui instrument realizat de
Smalley ce studia clusterii moleculari. Kroto era interesat de tehnica lui Smalley, aceea a
vaporizrii laser, pentru a verifica o teorie despre existena lanurilor lungi de carbon din
spaiul interstellar. Kroto s-a gndit c stelele roii gigante bogate n carbon produc forme
complexe ale carbonului pe care radioastronomia putea s le detecteze. Acest grup de cercetare a ncercat s identifice structura chimic a acestei noi familii folosind un spectrometru de mas. Smalley a alturat mai multe poligoane lipindu-le cu o band izolatoare
obinnd structura perfect simetrica a C60. Aceast nou molecula de carbon (C60) a primit numele de buckyball. n timp ce grafitul conine atomi de carbon sub forma plane
grafenice suprapuse, buckyballs sunt similare unor cuti sferice ce au legturile carbon-carbon foarte puternice cu acelai tip de hibridizare ca n planele grafenice.
n 1991, au fost descoperite nanotuburi de carbon n funinginea depus pe un catod
de carbon a unui arc voltaic. Acestea au fost descoperite de Sumio Iijima n laboartoarele
de cercetare fundamental a firmei NEC din Tsukuba, Japonia. Micrografiile observate cu
165
n tabela 10.1 sunt prezentate cele mai importante din realizrile tiinifice cu nanotuburi de carbon
166
n prezent se cerceteaz descoperirea de noi forme ale carbonului, fizico-chimia fullerenelor, producerea de cantiti industriale de CNT, metode de purificare, solubilizare,
funcionalizare, separare dup natura metalic sau semiconductoare, definirea cu exactitate a proprietilor.
Nanotuburile pot avea proprieti metalice comparabile sau mai bune dect ale cuprului sau pot fi semiconductori, ca siliciul n tranzistori, totul depinznd de structura lor.
Pot conduce de asemenea cldura similar diamantului, i din moment ce este carbon, chimitii pot crea legturi ntre atomii de carbon a fullerenelor i nanotuburilor cu
ali atomi sau molecule. Aceast abilitate de a lega sau ataa alte molecule sau atomi de
nanotuburi sau/i buckyballs le fac s fie un nou nanomaterial ce se poate folosi n sistemele biologice sau s fie legate n materialele compozite.
Teoretic s-a calculat c din nanotuburi se vor face cele mai puternice fibre vreodat
( aproximativ de 100 de ori mai puternice ca oelul), cu doar 1/6 din greutatea lor. Se poate afirma c nanotuburile i buckyball-urile sunt cele mai interesante materiale descoperite n ultimele decade. De notat c din procesele de sintez rezult ntotdeauna mnunchiuri de NT terminate cu jumti de fullerene.
Structura geometric din care provine un nanotub este rezultatul nchiderii unui
care este o combinaie liplan grafenic dup o ax chiral definit de un vector chiral
niar a vectorilor celulei unitare a planului grafenic (figura 10.2):
, , unde n i m sunt ntregi (nm) [7]. Vectorul chiral poate fi privit ca vectorul ce
conecteaz dou puncte identice din cadrul planului grafenic definind direcia de roluire.
Unghiul chiral , a nanotubului este definit ca unghiul dintre vectorul reelei, , i
vectorul chiral, , fiind dat de
arctan 3 /
2 . Numai tuburile zigzag i
167
Din procesele de sintez toate nanotuburile au capetele nchise terminate cu hemisfere de fullerene. n cazul nanotubului (5,5) i (9,0) tuburile se nchid cu hemisfere de
C60, n timp ce nanotuburile mai mari n diametre se nchid dup regula pentagonului
izolat: un numr optim de hexagoane la fiecare pentagon din fulleren. n general exist
ase pentagoane izolate pentru fiecare set de hexagoane n aa fel nct s se minimizeze
deformrile geometrice [24]
168
Rute de sintez
Diametrul mediu pentru SWCNT depinde de ruta de sintez prin care este produs.
n tabela 10.2 sunt prezentate cele mai curente metode.
Tabela 10.2- Diametrele SWCNT funcie de metoda de sintez
Metoda de sintez
Diametrul mediu, nm
(variana, )
Evaporare laser pulsat
~1.3 0.1
(PLV)
Descrcare n arc electric
~1.4
Metoda HiPCO,
~1.0 0.2
descompunere n faz
gazoas la presiune nalt
CVD- catalitic pe suport
~1.0 0.1
solid (CTR-CVD)
~1.4 0.2
~0.8
Referine
[25,26]
[27]
[26, 28]
[29]
[30]
[31]
Cel mai subire nanotub raportat n literatur a avut diametrul de aprox 0.3 nm cu
toate c acestea pot fi observate n cadrul MWNT [32]. Aceste tuburi s-au atribuit la (2,2)
armchair coninnd dou jumti de C12 capete terminale. n toate metodele de sintez
nanotuburile se formeaz sub form de mnunchiuri datorit tendinei lor pronunate de
aderen. Numrul de tuburi din mnunchi este variabil atingnd ca ordin de mrime 100
per mnunchi. mpachetarea lor n mnunchi este trigonal iar energia de coeziune atinge
0.2-0.3 eV/ [33 a,b]. Metodele CVD catalitice permit creterea individual de nanotuburi cu diametre controlate de diametrul i natura catalizatorului respectiv a substratului
de cretere. De notat cteva din inconvenientele metodelor de sintez: 1. Producerea de
nanotuburi nu controleaz chiralitatea; 2. ntotdeauna nanotuburile sunt nchise la capete
i necesit prelucrri i tratamente chimice pentru deschiderea lor.
10.3 Funcionalizare
n aceast seciune se prezint o scurt sintez referitoare la: purificare chimic i
oxidativ; dizolvarea CNT n ap i n solveni organici prin modificri chimice i fizice
precum i a aplicaiilor lor din domeniul chimic i biologic; separarea SWNT metalice i
a SWNT semiconductoare.
10.3.1 Purificarea nanotuburilor
Toate metodele de purificare ale nanotuburilor se bazeaz pe unul sau mai muli
pai: oxidarea cu gaz sau cu vapori, oxidarea chimic, centrifugarea sau filtrarea (incluznd metode cromatografice).
Oxidarea chimic are loc n acid nitric diluat (2.6 M) n reflux pentru a elimina
carbonul amorf sau alte impuriti, catalizatorii. Pentru cantiti mici de material acidul
poate fi ndeprtat prin filtrare sub vid urmat de splarea cu o baz diluat (solubilizarea
catalizatorilor prin trecerea n sruri i a carbonului amorf n acid carboxilic). Pentru
169
170
171
Sortarea SWNT dup lungimea lor devine extrem de important pentru aplicaii.
De exemplu, nanotuburile cu lungimi scurte (ex: 20-250 nm) sunt ideale pentru nano i
micro electronic sau de ordinul micronilor preferate pentru aplicaii n materiale structurale i de compozite. Tehnici variate au fost folosite pentru a obine SWNT sortate n
funcie de lungime. Aceasta este de obicei realizat prin tehnici cromatografice, electroforez capilar i fracionare. Au fost folosii surfactani pentru a obine soluii de SWNT
dispersate.
Separarea NT dup diametru i a chirilitii se realizeaz prin metodele specifice de
sintez i nu prin procesare fizico chimic. Cele mai cunoscute metode sunt creterile din
structuri mezoporoase cu pori controlati. Tang et al.[35] au raportat decurnd c SWNT
cu diametru de 0.4 nm, cresc ntr-un singur cristal AlPO4-5 zeolit, atingnd o chirilitate
preferenial- care este, (5,0) de form zigzag- opus celorlalte dou chiriliti posibile de
diametru similar (3,3) armchair i (4,2) chirale. Controlul diametrului cavitilor unidimensionale ale zeoliilor mezoporoi ar putea conduce la materiale care s poat servi
drept abloane pentru creterea selectiv de SWNT monodisperse. Tehnicile bazate pe
CVD pe catalizatori suportai de zeolii duc la creteri selective n diametre. Combinnd
dezvoltrile recente din separarea SWNT metalice i semiconductoare, mpreun cu cercetrile n curs pentru a produce nanotuburi cu o distribuie limitat dup diametre se va
atinge condiiile minimale de aplicaii n nanoelectronic
Tierea i oxidarea CNT se poate realiza dup urmtoarea metod:
La 2 mg SWNT se adaug 1ml 3:1(V/V) H2SO4 i HNO3 concentrat. Mixtura este
sonicat 2,4,6,8,10, 12,14 ore funcie de lungimea ce surmrete a fi obinut. Temperatura de lucru se menine la 200C prin rcire cu ghea. Dup sonicare se dilueaz cu 250 ml
ap DI i se filtreaz pe un filtru de PTFE de 40 microni. Splare cu ap pn la pH deasupra lui 5 urmat cu splare n etanol i uscare n vid.[36]
Prin utilizare de acelai raport de acizi i concentraii dar cu tratament la 40-700C
pentru cteva ore cu sonicare se obin CNT scurtate i cu grupri carboxilice ataate.
Acesta este cel mai simplu procedeu de a pregati CNT n vederea funcionalizrii i
solubilizrii [37,38]. Prin fierberea nanotuburilor ntr-un amestec de H2SO4/HNO3 a
rezultat o soluie limpede, incolor care la evaporarea solventului i eliminarea excesului
de acid, rezult un solid alb ce conine nanotuburi funionalizate. Neutralizarea soluiei
acide de ctre o baz rezult un precipitat solid de culoare maro ce conine nanotuburi.
10.3.4 Separarea CNT dup proprietile lor metalice sau semiconductoare
Aminele sunt reactivi care au atras cea mai mare atenie. Sunt trei tipuri de reacii a
aminelor cu gruprile carboxilice: amidarea; interacia acid-baz; condensarea. De altfel,
aminele pot fi adsorbite fizic n pereii nanotuburilor. n acest sens exist o literatur
bogat asupra proceselor de solubilizare, funcionalizare, amidare ce poate fi consultat
pentru o reacie specific [39].
175
10.4 Referine
18 Derycke V, Martel R., Appenzeller J., Avouris P., Nano Lett. 1 453456. (2001)
19 Bachtold A., Hadley P., Nakanishi T., Dekker C., Science 294 13171320. (2001)
20 Postma H.W.C., Teepen T., Yao Z., Grifoni M., Dekker C., Science 293 7679. (2001)
21 M.J. OConnell, et al. Science 297 593596. (2002)
22 M. Freitag, V. Perebeinos, J. Chen, A. Stein, J.C. Tsang, J.A. Misewich, R. Martel, P.
Avouris, Nano Lett. 4 1063 -1066. (2004)
23 Vitali L., Burghard M., Schneider M.A., Liu L., Wu S.Y., Jayanthi C.S., Kern K.,
Phys. Rev. Lett. 93, Art. no.136103. (2004)
24 Harris P.J.F., Carbon Nanotubes and Related Structures, Cambridge Univ. Press,
(1999).
25 Kukovecz A., Pichler T., Pfeiffer R., Kramberger C., Kuzmany H., Phys. Chem.
Chem. Phys. 5 582587. (2003)
26 Hulman M., Plank W., H. Kuzmany, Phys. Rev. B 6308, Art. no. 081406(2001
27 Journet C., Maser W.K., Bernier P., Loiseau A., De la Chapelle M.L., Lefrant S., P.
Deniard, R. Lee, J.E. Fischer, Nature 388 756758. (1997)
28 A. Kukovecz, C. Kramberger, V. Georgakilas, M. Prato, H. Kuzmany, Eur. Phys. J. B
28 223230. (2002)
29 An L., Owens J.M., McNeil L.E., Liu J., J. Am. Chem. Soc. 124 1368813689,(2002)
30 Choi H.C., Kim W., Wang D.W., Dai H.J. J. Phys. Chem. B 106 1236112365,(2002)
31 Bachilo S.M., et all, J. Am. Chem. Soc. 125,11186 11187 (2003)
32 Zhao X., et all, Phys. Rev. Lett. 92 Art. no. 125502. (2004)
33 a. Monthioux M., et all, Carbon 39 12511272. (2001)
b. Girifalco L.A., Hodak M.,Lee R.S., Phys. Rev. B 62, 1310413110. (2000)
34 Itkis M.E., et all NanoLett. 2 ,p. 155. (2002)
35 Tang Y.H., Lee C.S., Lee S.T., Appl. Phys. Lett. 73, 3902-3904 (1998)
36 Marshall Matthew W., Popa-Nita Simina, Shapter Joseph G.,Carbon 44 11371141,
(2006)
37 Hamon M. A., et all, Appl. Phys. A 74, 333 (2002).
38 .a Sun Y.P., Fu K., Lin Y. Huang W., Acc. Chem. Res. 35, 1096 (2002);
b. Niyogi S.,et all, Acc. Chem. Res. 35, 1105 (2002);
c. Hirsch A., Angew. Chem.Int. Ed. 41, 1853 (2002);
d. Banerjee S, Kahn C, Wong S., Chem.Eur. J. 9, 1898 (2003);
e. Tasis D., Tagmatarchis N., Georgakilas V. Prato M.,Chem. Eur. J. 9, 4000
(2003);
39 Naotoshi Nakashima, Int.J. of Nanoscience vol. 4, no. 1 119137, (2005)
177
178
11 Nanofire, nanosenzori
Detecia speciilor chimice i biologice constituie placa turnant din multe arii din
sntate i tiinele vieii acoperind diagnoza bolilor, descoperirea de noi medicamente
sau de noi droguri. Dezvoltarea de noi dispozitive senzoriale pentru analize rapide a acestor specii la limita de sub picomoli va avea un impact asupra societii n multiple
moduri. Dispozitive ultrasensibile dezvoltate pe nanofire va crea o nou clas de nanosenzori capabili s detecteze proteine, ADN, molecule specifice designului de noi medicamente. Cheia central n recunoaterea molecular este transducia semnalului asociat
cu recunoaterea selectiva speciilor de interes. Nanostructuri cum sunt nanofirele [1-7] i
nanocristale [8-12] ofer posibilitatea unic de a construi dispozitive nanometrice de
senzare. Diametrele lor sunt comparabile cu dimensiunile speciilor biologice i chimice,
prin urmare, intuitiv, reprezint un promitor mijloc de transducie de semnal i interfaare cu instrumentele macroscopice. Nanofirele anorganice i nanocristalele prezint
proprieti electrice [2-5, 13-28] i optice [8-12] unice ce pot fi exploatate pentru senzare.
Dependena de dimensiunea nanocristalelor a proprietilor de emisie i a culorii
deschide mari oportuniti de etichetare respectiv marcare i detecie optic a speciilor
biologice prin comparaie cu coloranii i markerii chimici fluoresceni utilizai curent [812]. Proprietile de comutaie electronic a nanofirelor semiconductoare furnizeaz
modalitatea de senzare i indexare electric cu citire direct. Aceasta devine extrem de
atractiv pentru multiple aplicaii [29-37]. Semnalele electrice de la un asemenea tip de nanodispozitiv pot fi direct rutate spre exterior iar acesta pot fi direct integrat n sisteme
miniaturizate. Detecia de semnale electrice direct de la speciile moleculare reduce timpul
de indexare cu markeri chimici. n paragrafele urmtoare se vor prezenta cteva din aplicaiile dispozitivelor pe baz de nanofire care se pare vor revoluiona, prin proprietile
lor remarcabile, detecia n biologie i medicin.
180
Figura 11.1-Trecerea FET de la tehnologia planar (a) unde potenialul de pe poarta G moduleaz sarcina
superficial dintre surs i dren , respectiv conductana la tehnologia pe nanofire (b,c). n (b) este descris
formarea unui nanofir de Si prin corodare n plasm sau cretere pe structura Si-SiO2 ntre contactele sursdren. n (c) este descris conectarea unui nanofir de Si construit pe un ablon de Ge iar poarta este un
electrod de Au depus pe un film dielectric cu permitivitate nalt. Acest tip de structur este proiectat pe un
strat complex de poart format din 2 oxizi SiO2-ZrO2- dielectric high k. Nanofirul Ge-Si formeaz o structur
de benzi de tipul vale cuantic (e) , BV-banda de valen, BC-banda de conducie, EF nivelul Fermi.
Figura 11.2- Principiul de construcie a unui NFET (a) pe structura din figura 11.1b. Fluidul cu analit este
condus spre nanofirul de Si (SiNW) printr-un microcanal. Ataarea de grupe funcionale (b) conduce la
modificarea acumulrilor de sarcin i n consecin conductana se modific n timp (c).
181
Figura 11.3-Schem de realizare a unui NFET funcionalizat cu grupe silanol (a) respectiv amino (b) pentru
msurarea de pH.Rspunsul ipotetic n conductan pentru silanol(1) respectiv amino (2), graficul (d)
corespunde rspunsului n timp la diferite valori de pH.
Figura 11.4- Formarea de NFET din mnunchiuri de nanotuburi prin evaporarea celor metalice i selectarea
SWNT semiconductoare
sunt funionalizate cu grupri carboxilice sau amidice prin procedeele schiate n seciunea 10 pe care se pot ataa receptorii. Figura 11.4 arat c SWNT pot fi folosite ca simple nanofire prin care se poate senza un semnal electric prin simpl ataare de molecule
sau prin aplicarea unui potenial pe poart se transform ntr-un FET.
Fie c este un nanofir de Si sau SWCNT senzarea de macromolecule biologice cum
ar fi proteine sau acizi nucleici care n soluii apoase sunt ncrcate electric se poate realiza prin ataarea la suprafaa lor de receptori convenabili alei. Primul exemplu de cuplul
de detecie a proteinelor este molecula de biotin care are o selectivitate mare la streptavidin. Cnd o soluie de streptavidin este n contact cu nanofirul funcionalizat cu biotin
interacia lor modific conductana. Acelai procedeu se aplic i la indexarea ADN ului
prin ataarea de secvene complementare pe nanofir [33-48]. Extinderea de atari de
diferii receptori i crearea de arii cu anticorpi se pot genera platforme de detecie de
virui, droguri.[49-67].
11.2
cu D coeficientul de difuzie a analitului din soluie. Fluxul de molecule de analit spre
suprafaa senzorului de arie AD:
183
11.3
unde I este fluxul incident de analit pe o arie AD. Rspunsul n timp este dat prin rezolvarea ecuaiilor 11.1 i 2 unde este necesar cunoaterea ratelor de captur respectiv de detaare a analitului la receptori. Lund n considerare dinamica capturii de biomolecule
dezvoltate n [65] cu raportul ratelor de regul kF/kR~105 [66] i pentru concentraii de
N0~104 /m2.[67] ecuaia cineticii 11.1 se reduce la:
11.4
iar fluxul n condiii staionare:
11.5
,
unde densitatea fluxului de analit,CD,SS este capacitana de difuzie echivalent pentru
cazul cnd concentraia 0 a analitului rmne constant la o distan W de suprafaa senzorului (tabela 11.1). Cum fluxul de analit trebuie sa fie echilibrat de viteza de ataare
analit-receptor avem condiia j=dN/dt. Rezolvnd ecuaiile 11.4-5 se obine:
,
11.6
184
Figura 11.5-Estimarea concentraiei limit (0) de detecie pentru un timp prestabilit de saturare (tS). Pentru
un timp de detec,ie prestabilit la 100s structurile cilindrice (nanofirele) respectiv sferice pot detecta
concentraii de ordinul pmol n timp ce ISFET ca structur planar are limita de detecie de ordinul
nanomolar.
Tabela 11. 1- Geometrii 1D, 2D i 3D de nanosenzori i caracteristicile lor pentru regim staionar de detecie a
analiilor
Tip de
model
W
AD,
CD,SS
CD(t)
MD
kD
senzor
ISFET
1
1/2
2
planar
2
1D
Nanosenzor
cilindric
2D
Nanosenzor
sferic
3D
185
11.3 Referine
1. Morales, A. M., and Lieber, C. M., Science 279, 208(1998)
2. Hu, J., et al., Acc. Chem. Res. 32 (5), 435(1999)
3. Lieber, C. M., MRS Bull. 28 (7), 486(2003)
4. Cui, Y., et al., In: Nanowires and Nanobelts Materials, Properties and Devices,
Wang, Z. L., (ed.), Kluwer Academic Publishers (2003), 3
5. Samuelson, L., Materials Today 6 (10), 22 (2003)
6. Xia, Y., et al., Adv. Mater. 15 (5), 353 (2003)
7. Wang, Z. L., Materials Today 7 (6), 26 (2004)
8. Niemeyer, C. M., Angew. Chem. Intl. Ed. 40 (22), 4128 (2001)
9. Chan, W. C. W., et al., Curr. Opin. Biotechnol. 13 (1), 40 (2002)
10. West, J. L., and Halas, N. J., Annu. Rev. Biomed. Eng. 5, 285 (2003)
11. Alivisatos, P., Nat. Biotechnol. 22, 47 (2004)
12. Gould, P., Materials Today 7 (2), 36 (2004)
13. Cui, Y., et al., J. Phys. Chem. B 104 (22), 5213 (2000)
14. Duan, Y., et al., Nature 409, 66 (2001)
15. Cui, Y., and Lieber, C. M., Science 291, 851 (2001)
16. Huang, Y., et al., Science 294, 1313 (2001)
17. Gudiksen, M. S., et al., Nature 415, 617 (2002)
18. Huang, Y., et al., Nano Lett. 2 (2), 101 (2002)
19. Lauhon, L. J., et al., Nature 420, 57 (2002)
20. Cui, Y., et al., Nano Lett3 (2), 149. (2003)
21. McAlpine, M. C., et al., Nano Lett3 (11), 1531.(2003)
22. Zhong, Z., et al., Science 302, 1377 (2003)
23. Panev, N., et al., Appl. Phys. Lett. 83 (11), 2238 (2003)
24. Jin, S., et al., Nano Lett.) 4 (5), 915 (2004
25. Greytak, A. B., et al., Appl. Phys. Lett. 84 (21), 4176 (2004)
26. Wu, Y., et al., Nature 430, 61 (2004)
27. Zheng, G., et al., Adv. Mater. 16 (21), 1890 (2004)
28. Bjork, M. T., et al., Nano Lett. 4 (9), 1621 (2004)
29. Cui, Y., et al., Science 293, 1289 (2001)
30. Comini, E., et al., Appl. Phys. Lett. 81 (10), 1869 (2002)
31. Zhou, H. T., et al., Chem. Phys. Lett. 369 (1-2), 220 (2003)
32. Li, C., et al., Appl. Phys. Lett. 82 (10), 1613 (2003)
33. Hahm, J., and Lieber, C. M., Nano Lett. 4 (1), 51 (2004)
34. Wang, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 3208 (2005)
35. Patolsky, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 14017 (2004)
36. Kolmakov, A. and Moskovits, M., Annu. Rev. Mater. Res. 34, 151 (2004)
37. Wan, Q., et al., Appl. Phys. Lett. 84 (18), 3654 (2004)
38. Sze, S. M., Physics of Semicondutor Devices, Wiley, New York), 431(1981
186
39. Bergveld, P., IEEE Trans. Biomed. Eng. BME-19, 342 (1972)
40. Blackburn, G. F., In: Biosensors: Fundamentals and Applications, Turner, A. P. F.,
et al. (eds.), Oxford University Press, (1987),
41. Hafeman, D. G., et al., Science 240, 1182 (1988)
42. Cui, Y., et al., Appl. Phys. Lett. 78 (15), 2214 (2001)
43. Wu, Y., et al., Nano Lett. 4 (3), 433 (2004)
44. Iler, R. K., The chemistry of silica, John Wiley & Sons, New York (1979)
45. Bartlett, P. N., In: Handbook of Chemical and Biological Sensors, Taylor, R. F.,
Schultz, J. S. (eds.), IOP Publishing, Philadelphia 139 (1996),
46. Bolt, G. H., J. Phys.Chem. 61 (9), 1166 (1957)
47. Bayer, E. A., and Wilchek, M., Methods Enzymol. 184, 49 (1990)
48. Nielsen, P. E., et al., Science 254, 1497 (1991)
49. Jensen, K. K., et al., Biochem. 36 (16), 5072 (1997)
50. He, L., et al., J. Am. Chem. Soc. 122 (38), 9071 (2000)
51. Hook, F., et al., Langmuir 17 (26), 8305 (2001)
52. Grosios, K., Traxler, P., Drugs Future 28, 679 (2003)
53. Strausberg, R. L, Schreiber, S. L., Science 300, 294 (2003)
54. Stockwell, B. R., Trends Biotechnol. 18 (11), 449 (2000)
55. Becker, J., Nat. Biotechnol. 22, 15 (2004)
56. Blume-Jensen, P., and Hunter, T., Nature 411, 355 (2001)
57. Stadler, K., et al., Nat. Rev. Microbiol. 1, 209 (2003)
58. Atlas, R. M., Nat. Rev. Microbiol. 1, 70 (2003)
59. Niiler, E., Nat. Biotechnol. 20, 21(2002)
60. Weiss, S., Nat. Struct. Biol 7, 72. (2000)4
61. Zhuang, X., Rief, M., Curr. Opin. Struct. Biol. 13 (1), 88 (2003)
62. Huang, Y., et al., Science 291, 630 (2001)
63. Whang, D., et al., Nano Lett3 (9), 1255 (2003)
64. Whang, D., et al., Jpn. J. Appl. Phys. 43 (7B), 4465(2004)
65. Berg H. C., Random Walks in Biology Princeton University Press,NJ,(1993).
66. Lohse J., Dahl O. Nielsen P. E, Proc. Natl. Acad. Sci (PNAS). 96,11804 (1999)
67.Fritz J, E. B. Cooper, Gaudet S,. Sorger P. K, Manalis S. R., PNAS.. 99, 14142 (2002).
68.Gruner G.,Anal Bioanal Chem 384: 322335 (2006)
187