Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Caiet Probleme - Biochimie Analitica PDF
Caiet Probleme - Biochimie Analitica PDF
MM
200000
116000
97000
66000
45000
31000
21500
14400
lg MM
5,30103
5,064458
4,986772
4,819544
4,653213
4,491362
4,332438
4,158362
C%=1,72%
T=7,5%
4,75 g
0,25 g
0,375 g
Componenta
Acrilamida
Bis
T=5%
4,75 g
0,25 g
T=7,5%
7,125 g
0,375 g
T=10%
9,5 g
T=10%
9,5 g
0,5 g
D (cm)
0,15
0,25
0,4
0,56
0,77
1
1,2
D (cm) 35
30
25
20
15
10
5
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
V*h*103
1,2
1,4
20. In cazul cromatografiei de schimb ionic se poate vorbi de void volume? Ce proprieti
trebuie s aib o substan pentru msurarea acestuia?
Void volume se poate determina i n cazul cromatografiei de schimb ionic. n acest caz,
se introduce pe coloan o protein care posed aceeai sarcin superficial ca i sarcina
schimbtorului de ioni. Aceast protein nu va interaciona deloc cu schimbtorul de ioni,
astfel nct se poate determina volumul spaiului gol ca fiind volumul necesar eluiei
proteinei pe coloan.
23. Preparai 10 ml gel poliacrilamid cu T=10% dintr-un amestec acrilamidbisacrilamid 29,2:0,8 g/100 ml. Calculai C%. Calculai volumul de ap tiind c
amestecul de polimerizare conine 2.5 ml tampon Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8, 0.1 ml APS
10% ; 0.05 ml TEMED i 0.1 ml SDS. Care este rolul : APS, TEMED i SDS? Ce fel
de gel s-a preparat? Care este rolul su n separarea electroforetic? Peste acest gel se
toarn un nou gel cu T=4%, dar tamponul utilizat are pH 6,8. Care este rolul acestui
gel? Modificarea lui T% conduce la modificarea C%?
29,2 g acrilamid i 0,8 g bisacrilamid
C%=
T=10%
10 g acrilamid+bisacrilamid
xg
x=1 g acrilamid+bisacrilamid
100 ml
10 ml
T% initial=30%
30 g
100 ml
1 g acrilamid+bisacrilamid
y=3,33 ml soluie acrilamid + bisacrilamid
VH20=10-(3,33+2,5+0,1+0,05+0,1)=3,92 ml
Gelul preparat reprezint un gel de poliacrilamid cu SDS i are rolul de a separa proteinele n
funcie de masa lor molecular, fiind gel de separare ntr-o electroforez in sistem
discontinuu.
Gelul cu T=4% reprezint gelul de concentrare i are rolul de a stivui componentele probei n
benzi subiri, proteinele migrnd sub aceast form n gelul de separare, unde sunt rezolvate.
Modificarea T% nu duce la modificarea C%.
26. Definii urmtorii termeni : eluie, faza mobil, faza staionar, constanta de
distribuie, timp de retenie, factor de selectivitate, nlimea talerului teoretic,
rezoluia coloanei, eluent.
Eluie trecrea compuilor pe coloan la adugarea continu de faz mobil
Faza mobil solventul utillizat pentru eluia probelor
Faza staionar mediul utilizat n cromatografie prin care componentele probei trec
i unde sunt separate n funcie de tria interaciei stabilite cu faza staionar
Constanta de distribuie raportul dintre concentraia molar a solutului din faza
staionar i concentraia molar a solutului din faza mobil
Timp de retenie timpul necesar unui compus s treac printr-o coloan
cromatografic
Factor de selectivitate raportul dintre constanta de distribuie a speciei mai puternic
reinut de coloan i constanta de distribuie a speciei mai puin reinut de coloan.
nlimea talerului teoretic raportul dintre lungimea coloanei mpachetate i numrul
talere teoretice; la nivelul fiecrui taler teoretic se stabilete un echilibru ntre faza
mobil i faza staionar.
Rezoluia coloanei msur a capacitii coloanei de separare a 2 analii
Eluent volumul de faz mobil
34. Cromatograma de mai jos prezint modul de separare a celor doua proteine. Calculai
rezoluia de separare a celor dou proteine i factorul de asimetrie al acestora. Care
este factorul de trenare?
1,3
20 l
5 l
5 ml
3,33 ml
2,5
4,14
50 l
10 l
10 ml
0,75 ml
1,3 ml
2,925 ml
20 l
5 l
5 ml
x=0,225 g
y=0,75 ml acrilamid+bisacrilamid
3,33 ml
2,5 ml
4,14 ml
50 l
TEMED
Volum total
10 l
10 ml
100 ml......30 g
3,33 ml.....x
x=0,99 g
0,99 g...10 ml
T%...........100 ml
c. C% are aceeai valoare n ambele geluri i este egal cu C% din soluia iniial.
C%=
x100=1,66%
37. Tamponul de migrare utilizat este Tris-glicina pH 8,3. Explicai succint rolul glicinei
n separarea electroforetic a celor doua proteine.
Ionul glicinat are rol de ion terminal pentru c este un ion lent i migreaz ultimul.
ntre ionul glicinat i ionul clorur (care este ionul frontal, deoarece migreaz rapid n
cmpul electroforetic) se dispun componentele proteice ale probei, aceasta fiind
stivuite n gelul de concentrare i migrnd n gelul de separare sub aceast form.
38. Amestecul celor dou proteine se separ apoi prin electroforez pe gel de
poliacrilamid n prezen de SDS. Dupa colorare, proteina B conduce la dou benzi.
a. Ce se poate spune despre cele doua proteine?
b. Care este rolul SDS?
c. Care este rolul -mercaptoetanolului?
a. Proteina A este alctuit dintr-o singur caten polipeptidic, n timp ce proteina B
este o protein oligomer, fiind alctuit din 2 subuniti.
b. SDS este un detergent anionic, care are rolul de a conferi proteinelor o sarcin total
negativ, sarcinile intrinseci ale proteinelor devenind neglijabile, astfel nct separarea
se realizeaz numai n funcie de masa molecular.
c. -mercaptoetanolul este un agent reductor al punilor disulfurice i este implicat n
denaturarea proteinelor i separarea acestora n subunitile componente.
53. Diagrama Ferguson n cazul a dou proteine care difer prin sarcin dar au aceeai
dimensiune moleculara. Ce reprezint intersecia cu axa OY?
Diagrama Ferguson se obine prin separarea celor dou proteine n geluri cu T%
cresctor i reprezentarea grafic a mobilitii electroforetice relative (Rm, Rf) funcie
de T%. Panta dreptei obinute este o msur a masei moleculare i se numete factor
de retardare. Intersecia cu axa OY reprezint mobilitatea electroforetic relativ n
condiii libere i reprezint o msur a sarcinii electrice.
n acest caz, diagrama Ferguson va fi reprezentat de 2 drepte paralele, cu pant egal,
dar care vor intersecta axa OY n puncte diferite, n funcie de sarcina electric a
proteinelor.
59. Stabilii corespondena dintre proprietile proteinelor prezentate n coloana din stnga
i metodele de separare i purificare prezentate n dreapta.
a. Mrime
1. electroforeza
b. Sarcin
2. Gel filtrare
c. Legare specific
3. Salting-out
d. Solubilitate
4. Imunoprecipitare
5. focalizare izoelectric
6. cromatografie de afinitate
7. cromatografie de schimb ionic
8. ultracentrifugare zonal
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
a, b
a
d
c
b
c
b
a
64. Rolul Blue dextran 2000 n calcularea caracteristicilor unei coloane cromatografice.
66. Rolul albastrului de brom fenol n determinarea masei moleculare a proteinelor prin
electroforez.