Disciplina de Microbiologie UMF Tg.

Mure LP4

Medii de cultur
Medii de cultur: complexe de substane care permit creterea i multiplicarea bacteriilor (conin substane nutritive, au pH corespunztor, umiditate corespunztoare, sunt sterile, atmosfer corespunztoare - aero/anaerobioza)

Clasificare
Dup consisten: lichide (repartizate n eprubete) solide (geloza dreapt, nclinat, n plac) semisolide (n eprubete)

Dup coninutul de substane nutritive: 1. Medii naturale: conin substane nutritive n forma lor natural, fr a fi prelucrate n prealabil: mediul cu bil, mediul cu lapte, mediul cu ou, ser de bou coagulat 2. Medii artificiale: A) Medii de baz pentru germeni nepretenioi 1) bulion simplu 2) geloza simpl bulion + agar-agar (un extract de alge care asigur consistena solid, nu are proprieti nutritive) B) Medii compuse 1) Medii complexe: mediu de baz + substane organice (snge, ser, glucoz), sunt folosite pentru cultivarea germenilor pretenioi (geloza snge) 2) Medii de mbogire: conin ageni selectivi, care inhib dezvoltarea unor bacterii i permit creterea altora 3) Medii speciale mediul Lwenstein-Jensen pt. cultivarea micobacteriilor mediul Sabouraud pt. cultivarea levurilor (Candida) mediul chocolat neisserii, hemofili

4) Medii difereniale i selectiv-difereniale: indicator de culoare, +/- substane selective (inhib creterea unor bacterii) + zaharuri/polialcooli ; sunt folosite pentru izolare i identificare (geloza lactozat, TSI, SIM, Leifson, Chapman)

-1-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

Caractere de cultur
1. se studiaz aspectul macroscopic al coloniilor bacteriene izolate Coloniile de tip S (smooth) colonii rotunde margini regulate, bombate suprafaa neted, translucid uor detaabile de pe mediu suspensionate n sol. saline produc suspensii omogene (ser fiziol.) reprezint forma normal pentru majoritatea bacteriilor patogene, fiind dotat cu caliti optime de structur antigenic i de patogenitate. 2. Coloniile de tip R (rough) colonii neregulate plate, uscate suprafaa zbrcit aderente la mediu n soluii saline produc suspensii neomogene (fenomenul de aglutinare spontan) este caracteristic, n general, bacteriilor nepatogene, cu 3 excepii: Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphtheriae 3. 4. Forme intermediare: S-R , R-S Coloniile de tip M aspect mucos foarte mari foarte bombate foarte lucioase cu tendin de curgere i de confluare caracteristice bacteriilor care posed capsul (de ex. Klebsiella) 5. Coloniile pufoase mucegaiuri 6. Fenomen de crare Proteus: pe medii simple crete sub forma unui vl care acoper toat suprafaa mediului (nu apar colonii) -2-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

Caracterele biochimice i de metabolism ale germenilor

studiaz metabolismul bacterian i prezena diferitelor enzime specifice studierea acestor caractere permit ncadrarea bacteriilor n specie

1. Metabolismul glucidic
se studiaz pe medii de cultur difereniale sau selectiv-difereniale urmrete descompunerea diferitelor zaharuri de ctre bacterii (glucoz, lactoz, zaharoz, manitol) prin descompunerea zaharului de ctre bacterii mediul se acidific, iar indicatorul de culoare schimb culoarea mediului de cultur

2. Metabolismul proteic
se studiaz pe medii de cultur difereniale prin descompunerea proteinelor de ctre bacterii se elibereaz metabolii precum indol, H2S sau amoniac indolul i H2S se evideniaz cu ajutorul unor hrtii de filtru mbibate n reactiv specific (reactiv Kovacs pentru indol i sruri de Pb pentru H2S) prezena amoniacului se evideniaz cu ajutorul unui indicator de culoare

3. Enzimele bacteriene
hemolizinele enzime care lizeaz hematiile (altereaz hemoglobina) prezena acestei enzime se evideniaz pe mediu geloz-snge principalele tipuri de hemoliz: o alfa () - apare ca o zon verzuie n jurul coloniei o beta () - sngele este descompus total, n jurul coloniei este o zon clar, transparent catalaza - descompune apa oxigenat n ap i oxigen - oxigenul eliberat se evideniaz prin formarea bulelor de gaz coagulaza determin coagularea plasmei recoltate pe anticoagulant

oxidaza enzime oxidative acioneaz asupra unor substane producnd compui colorai -3-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

4. Alte teste
Mobilitatea bacteriile flagelate sunt mobile i migreaz ntr-un mediu de cultur semisolid, deviaz de la locul de inoculare (traiectul de neptur) Mirosul la multe specii, coloniile au miros caracteristic

Producerea de pigment Pigmeni nedifuzibili nu difuzeaz n mediu, vor colora doar colonia (ex. Staphylococcus aureus pigment auriu) Pigmeni difuzibili difuzeaz n mediu, coloreaz i mediul (ex. Pseudomonas pigment verde).

-4-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

Identificarea microorganismelor pe baza structurii antigenice

Identificarea antigenic se bazeaz pe specificitatea reaciei antigen-anticorp.
Antigen se consider orice substan care, ptruns n organism, provoac rspuns imun din partea acestuia, ceea ce rezult n producerea de anticorpi.

Reacia antigen anticorp este specific, antigenul poate fi legat numai de anticorpul ce s-a produs ca rspuns la stimulul antigenic respectiv. ag + ac ag-ac

Aceste reacii pot fi folosite pentru detectarea unui antigen necunoscut cu ajutorul unui anticorp cunoscut (metode de diagnostic directe): ag? + ac ag-ac

Elementele reaciei sunt antigenul necunoscut i anticorpul cunoscut reprezentat de seruri imune de referin. n cazul n care antigenul corespunde anticorpului, se formeaz complexul imun antigen-anticorp. n funcie de cum se vizualizeaz/detecteaz formarea complexului imun exist mai multe metode bazate pe reacii antigen-anticorp: reacii de precipitare: complexele imune formeaz precipitat, reacii de aglutinare: complexele imune formeaz aglutinat, RFC se detecteaz consumarea complementului (acesta se leag de complexele imune distrugnd antigenul), reacii n care elementul cunoscut este marcat se detecteaz elementul marcat din complexul imun format.

-5-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

Reacia de aglutinare
Antigenele: corpusculare, aglutinogene Anticorpii: aglutinine Complexul imun: aglutinat Are loc ntre antigenele de pe suprafaa celulei microrganismelor i anticorpii corespunztori. Frecvent se realizeaz pe lam de microscop. Pe o lam de microscop curat i degresat se depune la un capt 1 pictur de ser aglutinant polivalent iar n cellalt capt 1 pictur de soluie salin izoton (martor). n fiecare pictur se suspensioneaz cu ansa un fragment din colonie. Dac microorganismul are antigene specifice serului aglutinant, n 1-2 minute apare aglutinarea (grunji vizibili cu ochiul liber sau cu lupa). n pictura martor i n cazul reaciei negative, amestecul rmne opalescent, uniform.

Reacia de precipitare
Antigenele: de natur coloidal (solubile), precipitinogene Anticorpii: precipitine Complexul imun: precipitat. Pot avea loc n medii lichide (metode folosite n bacteriologie) sau n medii solide.

Reacii de precipitare n mediu solid

Precipitinele, precipitogenele au capacitatea de a difuza n gel de agaroz. Unde se ntlnesc n cantiti echivalente se formeaz precipitat vizibil cu ochiul liber. Metoda Mancini imunodifuzia simpl (radial). Elementul cunoscut (ag) se inglobeaz n gel de agaroz. Gelul topit se toarn n plci, dup solidificare se decupeaz godeuri. n godeuri se introduce elementul necunoscut al reaciei (serul de cercetat:

ac?). Se incubeaz n camer umed peste noapte la temperatura camerei. Anticorpii

din serul cercetat difuzeaz n gel, dac corespund antigenului inglobat, are loc reacia antigen-anticorp. n zona echivalenei se formeaz precipitat circular. Se msoar diametrul precipitatului, se raporteaz la curbe etalon, astfel

precizndu-se cantitatea de anticorpi din ser (metod cantitativ). 3 -6-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

Metode moderne metode care folosesc un reactant imunologic marcat Reacia de imunofluorescen (RIF)
Principiu: identificarea antigenelor necunoscute montate pe lam cu ajutorul anticorpilor cunoscui marcai fluorocrom fluorocromii: emit fluorescen dac se expun la raze UV, izotiocianatul de fluorescein (galben-verzui), rodamina (portocalie) preparatul se examineaz la microscopul cu fluorescen puncte fluorescente pe fond ntunecat: n preparatul examinat au fost prezente

antigenele cutate (rezultat pozitiv) absena punctelor fluorescente: n preparat nu au fost prezente antigenele

cutate (rezultat negativ). dezavantaje: preparatele sunt instabile nu pot fi pstrate n timp este necesar microscop special.

Metoda imunoperoxidazic (IPO)

marcare enzimatic peroxidaz (descompune peroxidul); vizualizarea se realizeaz prin adugarea substratului cromogen rezult un precipitat maroniu, insolubil, vizibil la microscopul optic, se realizeaz la fel ca i RIF, avantaje: preparatele pot fi pstrate n timp nu este necesar microscop special.

-7-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

Metode imunoenzimatice (RIE, ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay)

Permit detectarea antigenelor libere i a anticorpilor. Este posibil determinare cantitativ. La reacii particip: un reactant imunologic cunoscut ataat de un suport solid (plci cu godeuri, lame, baghete) un reactant imunologic marcat enzimatic peroxidaza, substrat specific (cromogenic). Se produce o modificare de culoare detectabil spectrofotometric (determinare cantitativ), substane pentru stoparea reaciei (baze sau acizi puternici).

Reaciile au loc n aparate automate, semiautomate. ntre reacii splare cu soluii tampon.

Detectarea antigenelor
anticorpi specifici

anticorpi marcai enzimatic

antigen? substrat cromogen

-8-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

Identificarea microorganismelor prin detectarea acizilor nucleici

Genomul microorganismului conine secvene specifice, detectarea prezenei acestora ntrun produs patologic sau n culturi celulare are valoare diagnostic.

Metode de hibridizare
Principiu: fragmente monocatenare de oligonucleotide marcate (sonde), avnd secven cunoscut (caracteristic unui microorganism) se vor ataa pe baza complementaritii de secvene complementare situate pe acizii nucleici ale virusului de identificat. Etape de lucru: extragerea acizilor nucleici, denaturarea acizilor nucleici i fixarea acestora pe un suport, hibridizare: adugarea sondelor (marcate enzimatic, cu fluorocrom sau cu substane radioactive) i ataarea acestora de secvenele omoloage, eliminarea sondelor nefixate, vizualizarea hibridizrii.

Vizualizarea se face n funcie de tipul marcajului folosit.

A T C G G C T A T G C A A T C G G C T A

denaturare

Reacia n lan a polimerazei (PCR polimerase chain reaction)

Se detecteaz secvene specifice de acid nucleic dup o prealabil amplificare. Etapele de lucru detectarea ADN-ului, extragerea ADN-ului, amplificarea: o se realizeaz n aparatul PCR i const din mai multe cicluri identice: denaturare (90C), -9-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

alinierea primerilor (50C) 2 secvene de oligonucleotide care se leag prin complementaritate pe cele dou catene la o anumit distan ntre ele. sinteza lanurilor complementare (70C ) elongaie; este necesar prezena enzimei polimeraz (Taq) i a nucleotidelor se formeaz lanurile complementare astfel se dubleaz cantitatea de ADN, reluarea ciclului de n ori se obin 2n copii ale secvenei de identificat, vizualizarea produilor de amplificare: o produii de amplificare obinui se separ electroforetic, o colorare cu bromur de etidiu o vizualizare cu raze UV prelucrare computerizat. Multiplex PCR se amplific mai multe gene odat. Real time PCR. RT-PCR - este necesar revers-transcriptaza.

Boala experimental
Studiul pe animale se face doar n cazurile n care celelalte metode de identificare sunt nestisfctoare. Este necesar cunoaterea metodelor de contenie a animalelor. nainte de inoculare animalele sunt marcate, dac este necesar sunt anesteziate (intervenii dureroase), iar locul inoculrii se epileaz i se antiseptizeaz. Inocularea se face prin diferite ci: intradermic, subcutanat, intramuscular, intravenos, intraperitoneal, intranazal, intracerebral. Suspensiile microoranismelor sunt inoculate prin injecie, inhalare, ingestie, badijonare, etc Se urmrete patogenitatea bacteriilor, virusurilor, paraziilor, prin studiul modificrilor care apar la animalul inoculat.

-10-