JUSTIFICAREA ALEGERII TEMEI

Dei drojdiile au fost folosite din vremuri strvechi la prepararea alimentelor i buturilor, utilizarea lor n nutriia uman sau pentru furajarea animalelor este de dat mult mai recent. Deficitul de proteine din timpul primului rzboi mondial a impulsionat cercetrile pentru cultivarea drojdiilor n scopuri furajere. Microorganismele cele mai frecvent utilizate ca surs de proteine n nutriia omului i animalelor sunt drojdiile. Datele experimentale atest c proteina din drojdii poate nlocui proteinele vegetale i animale tradiionale. S-a constatat c drojdiile sunt capabile s sintetizeze vitaminele hidrosolubile din grupa B, dar i s le nmagazineze n celul n cantiti la fel de mari sau chiar mai mari dect cele din esuturile animale recunoscute ca surse importante de vitamine. n condiiile adncirii crizei alimentare, fabricarea proteinelor de biosintez reprezint una dintre cile de perspectiv pentru asigurarea necesarului de proteine. Tehnologia obinerii proteinelor de biosintez prezint urmtoarele avantaje: permite obinerea de proteine cu valoare biologic ridicat din materii prime disponibile n cantiti mari, constituite n mare msur din subproduse sau deeuri i reziduuri industriale; ofer posibilitatea, n raport cu substratul folosit, obinerii de proteine cu randament mult mai mare n comparaie cu cele de origine animal; prin utilizarea deeurilor i reziduurilor industriale se realizeaz i o depoluare a mediului. Pentru utilizare in hrana Salmonidelor, drojdia trebuie sa fie producatoare de astaxantina, compus carotenoidic care intensifica culoarea carnii acestor pesti. Studiul intreprins a urmarit izolarea unei drojdii producatoare de astaxantina si investigarea conditiilor de cultivare care sa permita obtinerea compusului carotenoidic cu randament ridicat, astfel incat biomasa acestei drojdii sa se poata utilize in alimentatia Salmonidelor.

CAPITOLUL I
MICROORGANISME IMPLICATE IN OBTINEREA DROJDIEI FURAJERE
Microorganismele utilizate in procesul de multiplicare industriala a drojdiilor trebuie sa indeplineasca o serie de conditii cum ar fi: - timp de generatie cat mai scurt; - randament de fabricatie si continut de proteine ridicat; - vitalitate ridicata, mai ales in cazul multiplicarii continue; - sensibilitate redusa la infectii, inhibitori si la variatiile calitative ale mediului; De obicei, tipurile de drojdii se aleg in functie de natura mediilor de cultura. Data fiind marea viabilitate si adaptabilitate a drojdiilor la diversele conditii de mediu, se pot cultiva cu rezultate bune diferite rase, tulpini, specii si chiar genuri de drojdii sau ciuperci pe lesiile sulfitice reziduale si pe prehidrolizate. Alte substraturi utilizate cu success la obtinerea drojdiilor furajere sunt reprezentate de subproduse ale industriei alimentare: melasa, radicele da malt, ape de inmuiere a porumbului (extract de porumb). Dintre tulpinile de drojdii folosite in practica pentru formarea de biomasa, se pot mentiona urmatoarele: - Torula utilis (Candida utilis) este cea mai folosita la fabricarea drojdiei furajere. Ea asimileaza diferite glucide (hexoze, pentoze) alcool etilic, alcooli superiori, aldehide, glicerina si acizi organici. - Micotorula se dezvlota bine pe medii de cultura care contin cantitati mari de pentoze. - Candida tropicalis se multiplica intens pe borhotul rezultat de la fabricarea alcoolului. Ea asimileaza mult mai bine xiloza in comparatie cu Torula utilis. De obicei, in linurile de multiplicare a drojdiei se gaseste un amestec de Torula utilis si Candida tropicalis, chiar si atunci cand initial s-a efectuat numai

inocularea cu Torula utilis. Astfel la cultivarea drojdiei Torula utilis prin procedeul continuu pe borhot de melasa, pot apare in scurt timp si alte drojdii printre care si Candida mycoderma, a carei proportie poate creste pana la 90%. Aceste contaminari nu sunt periculoase in masura in care nu conduc la micsorarea randamentului si a continutului in proteine a produsului finit. In fabricile de drojdie furajera se folosesc de obicei pentru inoculare amestecuri de 3-4 tulpini de drojdii (Torula utilis, Candida tropicalis, Candida lypolitica), proportia dintre ele modificandu-se esential in timpul fabricatiei. La fabricarea drojdiilor furajere Torulopsis etc. - Candida tropicalis realizeaza o productivitate mica, desi utilizeaza in proportie insemnata zaharurile din solutie (75-80%), pe care le consuma specific, sintetizand cantitati mari de acid glutamic si tirozina. Amestecurile de Candida tropicalis, Candida arboreea si T. utilis multiplicate in comun, se plaseaza sub aspectul epuizarii zaharurilor in zona valorilor satisfacatoare (78%), reprezentand in acelasi timp o compozitie aminoproteica de buna calitate. - Candida scottii se prezinta, din punct de vedere morfologic, sub forma de celule oval elipsoidale dispuse sub forma de lant, cate 5-7-12 celule cu inmugurire multipolara. Coloniile dezvoltate pe agar de bere sunt de culoare alb-crem, cu suprafata marunt ridata, cu granulatie fina. Aceste drojdii asimileaza bine atat hexozele cat si pentozele, precum si acizii organici si uronici. Avand un mare randament in biomasa si continut ridicat de proteine drojdia Candida scottii poate fi introdusa in fabricatie industriala atat sub forma de cultura pura cat si sub forma de cultura mixta, in combinatie cu celelate specii de drojdie Candida. - Trichosporon cutaneum are o viteza de crestere comparativ redusa cu celelalte tipuri de drojdii, insa asigura o asimilare mai profunda a substantelor organice, in particular a acizilor organici. - Candida mycoderma face parte din microflora epifita a fructelor si a unor legume, in cazuri rare se intalneste in microflora semintelor oleaginoase si cerealiere. se pot utilize si amestecuri de microorganisme din diferite genuri: genul Candida, genul Trichosporon, genul

Asimileaza glucoza, zaharoza, maltoza, lactoza si poate utiliza etanolul ca unica sursa hidrocarbonata. Formeaza glucoza, fructoza, zaharoza. Nu formeaza rafinoza. Poate consuma CH3COOH din mediu simultan cu etanolul si are sulfitorezistenta redusa. Temperatura propice de inmultire este de: minim 6-16C, maxim 24-36C, iar cea de crestere optima este de 18-22C. Coloniile pe mediu solidificat prezinta un perimetru slab-lobat, neregulat cu diameter cuprinse intre 2,5-5,8mm. Suprafata coloniei are un aspect mat, cutat, de culaoare alb-cenusiu sau alb-crem. In mediu lichid formeaza un voal alb (pelicula) subtire, la suprafata mediilor slab-alcoolice. In timp voalul se destrama si se depune in sediment pulverulent. Rhodotorula glutinis formeaza pe MEA, dupa 3 zile de cultivare, colonii cu diametrul de 1,5-3mm, convexe, cu perimetru circular, cu suprafata lucioasa sau aspect mucos, de culaore rosu pastelat. Dupa 7 zile, coloniile ajung la diametrul de 510mm dar isi mentin caracterele morfologice. Celulele dezvoltate pe MEA timp de 3 zile au forma elipsoidala si dimensiuni medii de 4-5,5m reproducerea are loc prin imugurire pe intreaga suprafata. Unele tulpini pot forma celule alungite. Se pot dezvolta pe mediul Czapek, cand formeaza celule cu dimensiuni de 2,3-5m sau 12-16m si pseudomiceliu. Poate deci folosi azotati ca sursa de azot. Nu se dezvolta pe MEA cu 0.5% acid acetic. Se dezvolta in domeniul de temperaturi de la 25C la 35C in produse cu aw minim de la 0,92. Cresterea este oprita in medii cu pH 2,2 sau in prezenta de conservanti. Acidul benzoic sau acidul sorbic ii inhiba cresterea la concentratii mai mici de 100mg/kgsi pH4. Sunt drojdii termorezistente. Sunt inactivate prin incalzire la 62,5C timp de 10 min. Asimileaza glucoza, galactoza, zaharoza, maltoza, xiloza, celobioza, alcoolul etilic, glicerolul si acizi organici (lactic, succinic si citric). Rhodotorula glutinis, ca si Rhodotorula rubra, este larg raspandita pe suprafata fructelor si legumelor proaspat recoltate dar produce rar alterari ale acestora. Se intalneste in microbiota epifita a frunzelor si tulpinilor, a boabelor de cereale, a maslinilor. Poate produce alterari ale sucurilor de mere si capsuni insuficient pasteurizate.

Fig. 1. Drojdii utilizate ca drojdii furajere a - Rhodotorula glutinis; b - Trichosporon cutaneum; c - Candida tropicalis

CAPITOLUL II
MATERIALE SI METODE UTILIZATE IN EXPERIMENTARILE DE OBTINERE A DROJDIEI FURAJERE 2.1. MATERIALE 2.1.1. Microorganisme utilizate in scopul produceri de drojdii furajere pentru salmonide
Phaffia rhodozyma tulpina izolata de pe mere.

2.1.2. Medii de cultura

Compozitia mediilor de cultura si scopul in care acestea au fost folosite in experimentari sunt prezentate in tabelul 1. Tabel 1. Medii de cultura utilizate in cadrul experimentelor de laborator

Denumire mediu Must de malt cu agar/ Extract de malt cu agar Mediu de cultura cu melasa si adaos de uree

Cod MMA/ MEA

Compozitie Extract de malt 30g, agar 20g, apa pana la 1000ml Melasa-40% (NH4)2HPO4-0,02% (NH4)2SO4-0,01% MgSO47H2O-0,005% H2O- ~60% Uree

pH 5.5

Utilizari Izolarea drojdiilor, descrierea caracterelor morfologice obtinere inocul. Mediu de cultura de utilizat pentru cultivarea drojdiilor

MMu

5,5-6

Mediu de cultura cu melasa si adaos de extract de porumb Mediu de cultura cu melasa si adaos de extract de drojdie

MMp

MMd

Mediu de cultura cu melasa

MM

Melasa-40% (NH4)2HPO4-0,02% (NH4)2SO4-0,01% MgSO47H2O-0,005% H2O- ~60% Extract de porumb Melasa-40% (NH4)2HPO4-0,02% (NH4)2SO4-0,01% MgSO47H2O-0,005% H2O- ~60% Extract drojdie Melasa-40% (NH4)2HPO4-0,02% (NH4)2SO4-0,01% MgSO47H2O-0,005% H2O- ~60%

5,5-6

Mediu de cultura de utilizat pentru cultivarea drojdiilor

5,5-6

Mediu de cultura de utilizat pentru cultivarea drojdiilor

5,5-6

Mediu de cultura de utilizat pentru cultivarea drojdiilor

2.1.3. Substante utilizate ca adaos la mediile de cultura

Ureea este prima substan de tip organic obinut artificial, n laborator, din substane anorganice (cianatul de amoniu - NH4NCO), creatorul ei fiind Friedrich Whler, n 1828. Acesta :

se prezinta sub forma de granule albe sau slab colorate; prezinta in compozitia sa azot (raportat la substanta uscata) min 46%

Ureea este utilizata ca ingrasamant de suprafata si ca adaos la mediile de cultura, fiind o excelenta sursa de azot pentru microorganisme.

este solubil in apa

Extractul de porumb prezinta aminoacizi ce au rol de biostimulatori si vitamine, dintre care biotina este prezenta in cantitati apreciabile(150 200 mg/100g produs) Extractul de porumb este folosit la fabricarea drojdiei de panificaie cu un consum de 60 kg/t melas, poate crete productivitatea cu 46%, n schimb prezint inconvenientul c este un produs deficitar i este folosit preponderent n industria antibioticelor. Se constat de asemenea c proteinele din extract pot lega biotina ntr-o form inaccesibil pentru celula de drojdie. Extractele de drojdie sunt folosite n principal ca poteniatori de arome sau chiar arome. Alte autolizate de drojdie pot masca gustul amar sau acru, pot mri gradul de arom i pot servi ca ageni de colorare sau antioxidani.

2.2. METODE UTILIZATE IN EXPERIMENTARI

2.2.1. Metode de izolare

Metodele prin raspandire sunt larg raspandite deoarece sunt usor de executat, avand ca principiul raspandirea celulelor aflate in populatii eterogene in medii naturale, prin diluare in medii lichide sau raspandire pe suprafata mediilor sterile solidificate. Metoda Koch se bazeaza pe raspandirea microorganismelor recoltate din medii naturale intr-un mediu nutritiv si fixarea distantata a celulelor in urma solidificarii mediului cu formare prin multiplicare de colonii izolate intre ele. Metoda este folosita in special pentru izolarea culturilor pure de drojdii. Mediul de raspandire este mustul de malt cu gelatina, repartizat cate 20 cm in 3 eprubete, fluidificat si mentinut la 35-40C. Din proba aleasa pentru izolare se recolteaza celulele cu ajutorul unei anse, care apoi este trecuta succesiv in cele 3 eprubete. Dupa inoculare si uniformizare, continutul fiecarei eprubete se repartizeaza in cate o placa Petri, iar prin solidificarea mediului celulele care raman fixate in gel vor forma prin multiplicare colonii izolate. In functie de densitatea celulelor recoltate initial, in placa a 2-a sau a 3-a pot exista colonii izolate, iar dupa studiul caracterelor microscopice ale coloniilor reprezentative se face repicarea in ebrubete cu slant agar, obtinandu-se culturi pure. Fig. 3.

Metoda in strii se aplica in cazul contaminarii cu microorganisme straine a culturilor pure in timpul conservarii acestora. Este similara cu metoda scarificata, in schimb drept mediu de raspandire se foloseste mediul inclinat din 2-3 eprubete, in care se realizeaza transferul succesiv de celule, prin trasarea de striuri la suprafata mediului

10

2.2.2 Metode de numararea celulelor

Stabilirea numarului de celule de drojdii dintr-un produs sau cultura pura se realizeaza prin diferite tehnici : -numararea directa a celulelor de drojdii; -numararea indirecta (metoda culturala-Koch); Celulele de drojdii si sporii de mucegai se pot numara, prin examen microscopic direct, cu ajutorul citometrelor ( camerelor de numarat ). Un citometru este o lama de sticla groasa, prevazuta cu 3 platforme separate intre ele prin rigole in sticla. Platforma centrala este denivelata fata de celelalte doua cu o inaltime de 0,1- 0,2 mm (inscrisa pe fiecare camera ). Pe platforma centrala este gravata o retea de linii perpendiculare, care delimiteaza o anumita suprafata divizata de catre linii perpendiculare in microcelule de forma patratica (patratele elementare ). Se cunosc mai multe tipuri de citometre: Thoma, Trk, Brker, Rosenthal, construite pe acelasi principiu. Diferentierea dintre tipurile de citometre consta in marimea variabila a suprafetei unui patratel elementar. Citometrul Thoma are suprafata de 1mm divizata de catre linii in 400 de patratele elementare cu latura de 1/20 mm ( suprafata unui patratel elementar = 1/400 mm ). Pentru numarare se plaseaza o picatura din suspensia de celule de analizat pe platforma centrala, in dreptul suprafetei delimitate. Peste suspensie se plaseaza o lamela care se sprijina pe cele doua platforme laterale si astfel intre lamela si citometru se creeaza o pelicula de lichid cu inaltime egala cu denivelarea platformei centrale ( 0,1 mm ). Astfel, volumul de lichid plasat pe fiecare patratel elementar este 1 cm 3 . 6 4 10

Preparatul obtinut se studiaza la microscop cu obiectiv cu grosisment x 40, cand in campul microscopic poate fi vizualizat un grup de 16 patratele elementare, din care se numara celulele a caror suprafata se afla mai mult de jumatate in interiorul careului de 4x4 patratele elementare. Se fac numarari de celule din mai multe campuri

11

microscopice ( elementar ( n =

n = 100 ) si se calculeaza numarul mediu de celule pe un patratel n ). 10 16

Numarul de celule prezente intr-un cm de suspensie de analizat se determina cu formula: N= n 4 10 6 k In care: n- numarul mediu de celule pe un patratel elementar; k- coefficient de dilutie;

Fig. 4. Profilul si reteaua citometrului Thoma

2.2.3. Metode de selectionare a drojdiei producatoare de pigmenti carotenoidici

Metodele de selectie a microorganismelor in general , in cazul nostru al drojdiilor urmeaza niste etape prestabilite:

A. Izolarea care presupune parcurgerea mai multor etape:

1.Recoltarea probelor biologice presupune recoltarea unor mostre in cantitati mici din care sa se izoleze drojdiile cautate. Probele biologice pot consta in resturi alimentare, resturi vegetale, medii specifice (apa de mare, saramura, nisip, plante acvatice, fructe, etc).

12

La stabilirea sursei de izolare se au in vedere urmatoarele criterii: a)o asociere intre microorganism si substrat (amidon-tarate, faina, paine, suprafata fructelor etc); b)densitatea microorganismului in mediul din care se face izolarea; c)variatia densitatii celulelor in functie de conditiile de mediu (pentru a crea acest fenomen numarul de tulpini izolate in aceasta etapa trebuie sa fie de ordinul sutelor si de obicei mai mult de 500). Pentru a facilita izolarea de tulpini variate se aplica metode selective de izolare. Aceste metode se bazeaza pe prop biologice si de termorezistenta a sporilor. Tulpinile izolate nu au identitate si poarta denum de izolat. Fiecare tulpina izolata se pastreaza in 2 exemplare si pentru a evita degenerarea acestora se pastreaza in stare liofilizata. 2.Controlul puritatii culturii care se realizeaza prin examen macroscopic si

microscopic si se studiaza caracterele culturale prin cultivare pe medii specifice cu agar rezultand colonii la care se urmaresc caracterele macroscopice: - pigmentatia, - aspectul, - diametrul coloniei si caracterele microscopice: - forma - dimensiunea celulelor, - prezenta sporilor, - unele particularitati privind reproducerea, etc In urma acestui studiu fiecare tulpina este asociata unei specii si unui gen. Lucrul acesta poate sa ofere date privind puritatea izolatelor si stabilitatea genetica.

B. Selectia propriu-zisa (screening-ul) urmareste identificarea tulpinilor

active, care corespund cerintelor noastre. Prin selectie se elimina din competitie tulpinile inactive si slab active si se evidentiaza tulpinile inalt active. Selectia se realiz in 2 etape:

13

1.Preselectia (selectia calitativa) se aplica tuturor tulpinilor izolate si urmareste eliminarea tulpinilor inactive. De obicei se aplica cultivarea in placi Petri pe medii de cultura cu agar iar drept criterii de selectie se utilizeaza urmatoarele: -dezvoltarea coloniala exprimata prin diametrul coloniei, acesta se exprima in mm sau viteza de dezvoltare coloniala care se masoara in mm/h; -consumul de substrat se exprima semicantitativ printr-un raport consum/ colonie; .2.Selectia cantitativa se aplica tulpinilor selectionate in etapa anterioara iar drept criteriu de selectie este randam de biosinteza. Daca este vorba de un compus extracelular randamentul se masoara in g/dm3 mediu de cultura. Daca ne referim la o enzima UA/dm3 mediu de cultura. Daca ne referim la compusi mintracelulari unitatea de masura este g/g s.u. biomasa. Si cantitatea de enzime intracelulare se masoara deasemeni in UA/g s.u biomasa. In aceasta etapa cultivarea se realizeaza pe mediu lichid in culturi pe agitator sau in bioreactoare de mica capacit aceasta insemnand de la 1-3 litri. In urma selectiei se mentin in competitie 1-5 tulpini inalt active. In urma selectiei tulpinii de drojdie, am observat urmatoarele: - pigmentatia: rosu-portocaliu(specifica pigmentilor carotenoidici); - aspectul coloniilor este rugos si mat; - diametrul coloniei variaza intre 2 si 4 mm; - forma coloniei este ovoidala; - dimensiunea celulelor variaza inte 4 si 4,8 m; - nu prezinta spori.

2.2.4. Tehnici de executare si studiul caracterelor microscopice

14

Pentru a studia caracterele microscopice ale coloniilor reprezentative s-a folosit un preparat in stare proaspata (preparate umede, preparat intre lama si lamela). In general preparatele proaspete sunt folosite pentru cercetarea miscroorganismelor in stare vie. Cercetarea celulei microbiene in stare vie permite studierea formei ei reale. Executarea unui preparat umed s-a facut tinand cont de urmatoarele etape: - pregatirea lamei si lamelei- lama curate si degresata se sterilizeaza trecand ambele suprafete prin flacara becului de gaz. Lamela se sterge cu hartie de filtru; - realizarea suspensiei de celule pe lama- se depune o picatura de apa sterila pe lama de sticla sterilizata, in zona centrala. Pentru recoltarea microorganismelor aflate in mediul lichid, in vederea realizari suspensiei, se foloseste ansa sau pipeta sterile. - realizarea preparatului intre lama si lamela- dupa obtinerea suspensiei de celule, lamela curata se sprijina si se deplaseaza pe lama la un unghi de 45, pana cand devine tangenta la picatura, apoi es lasa sa cada peste aceasta. Lichidul in exces se absoarbe pe marginile lamelei cu hartie de filtru. Un preparat bun nu trebuie sa prezinte bule de aer, acestea putand determina aglomerari de celule si ingreuna studiul preparatului microscopic. Toate manipularile se realizeaza in conditii aseptice.Preparatele umede se mai numesc si preparate temporare, deoarece, prin folosirea apei sau a serului fiziologic steril ca lichid de relizare a suspensiei de celule, studiul trebuie efectuat imediat pentru ca se produce destul de rapid uscarea preparatului.

2.2.5. Aparatura utilizata in experimentari

Principalele aparate de laborator folosite pentru determinarea diversilor parametrii sunt prezentate in tabelul 2.

Tabel 2. Aparatura utilizata in experimentele de laborator

15

Tipul aparatului Microscop Karl Zeiss Jena Balanta analitica Balanta precizie 0.001g. Denver Balanta precizie 0.1g Spectrofotometru pH-metru Termostat Centrifuga Etuva

Scopul utilizarii Dimensionarea, numararea si fotografierea microorganismelor. Determinari gravimetrice Determinari spectrofotometrice Determinari de pH ale mediilor de cultura Cultivarea microorganismelor Separari de biomasa Determinari de umiditate si uscare

2.2.6. Medii de cultura comerciale Sunt gata preparate si se prezinta sub forma de granule, pudra, tablete, in ambalaje ermetic inchise. Pentru obtinerea mediilor de cultura uzuale se face dizolvarea conform indicatiilor de pe eticheta, repartizarea in vase si sterilizarea. Mediile comerciale pot fii livrate si sub forma de medii solidificate si sterilizate in ambalaje de sticla si care necesita doar incalzirea pentru a fi fluidificate, urmate de repartizarea in vasele de cultivare si inocularea cu microorganismele de cultivat . Folosirea in laborator a mediilor deshidratate prezinta o serie de avantaje si anume: -ocupa un volum redus; -sunt usor conservabile; -pot fi usor rehidratate cand este necesar. In lipsa mediilor gata preparate, reteta poate fi folosita in laborator pentru obtinerea mediilor respective. Mediile de cultura se pot folosi: sub forma lichida - in acest caz se face imediat repartizarea si sterilizarea sub forma solida

Bulionul de carne este un mediu general pentru cultivarea bacteriilor si actinomicetelor. Se prepara din carne de vita degresata. Se cantaresc 500g carne tocata si

16

se adauga 1000cm apa de retea. Se pastreaza amestecul timp de 24 de ore la rece apoi se face fierberea timp de 30 de minute. Dupa filtrare in strat de vata se completeaza volumul la 1000cm si se adauga suplimentar 1-10g peptona si 5g NaCl. Se ajusteaza pH-ul la 7,00. Se foloseste sub forma lichida sau ca mediu dens, prin adaugare de agenti de solidificare. Sterilizarea se face timp de 20 min la 121C. In locul bulionului de carne se poate folosi extract de carne in concentratie de 3g la 1000cm apa. Mustul de malt - este un mediu general pentru cultivarea drojdiilor si mucegaiurilor. Se obtine din faina de malt si apa de retea in proportie de 1:4. Se cantaresc 50g faina de malt si se introduc intr-un vas tarat si se amesteca cu 200 cm apa cu temperature de 47 C, astfel incat temperatura amestecului sa fie de 45C. Se mentine aceasta temperatura timp de 30 min ,in conditii de agitare a probei. In acest interval de timp, denumit interval de proteoliza, sub actiunea enzimelor proteolitice din malt are loc hidroliza protidelor cu formarea de compusi solubili (peptone, peptide, aminoacizi). Se ridica progresiv temperature, cu 1C /pe min, pana la 70 C, se adauga 100cm cu aceasi temperatura si se mentine la aceasta temperatura timp de 10-30 min, interval in care sub actiunea enzimelor amilolitice (-amilaza si - amilaza) are loc zaharificarea amidonului pana la compusi care nu mai dau coloratie cu solutia de Lugol. Dupa zaharificare se face racirea si se adauga apa pana la greutatea finala de 450g. Extractul se obtine dupa filtrarea plamezii prin strat de vata sau hartie de filtru cutata. In filtrate se determina concentratia cu un aerometru Balling sau gradul refractometric. Pentru obtinera mustului cu o anumita concentratie se face diluarea corespunzatoare cu apa de retea. Pentru cultivarea mucegaiurlor se recomanda must cu 3-4 Bllg, pentru drojdii cu 6-8 Bllg, pentru bacterii lactice 8-12 Bllg. Sterlizarea mustului se face la 0,5atm, timp de 20-30 min.

Mediile cu care se mai poate lucra in laborator sunt:

17

Mediul Andreev

Mediul Rieder

-H3PO4(1-10%)= 1,9ml; -CH3COOH (1-10%)= 8,0ml; -KCl = 0,15g; -MgSO47 H2O= 0,075g; -Ca(HSO4)2
NH4H2PO4) (se poate inlocui cu

-glucoza =30 g; -(NH4)2SO4 =3 g; -MgSO47H2O =0,7 g; -NaCl =0,5 g -Ca(NO3)2 =0,4 g; -KH2PO4 =1 g; -autolizat de drojdie =10ml; -apa potabila =1000ml ;

= 0,0125g = 1,0ml;

-NH4OH (20%) -NaOH(0,1N) = 2 ml ; -glucoza = 30 g;

-autolizat de drojdie = 5 ml ; -apa potabila = 1000 ml ; 2.2.7. Medii industriale pentru obtinerea drojdiei furajere Producerea industrial de drojdie furajer se realizeaz n mare subproduse sau deeuri i reziduuri industriale ca: - deeuri celulozice: hidrolizate de sulf, paie de gru, coceni de porumb, msur din coji de floarea-soarelui, rumegu de lemn, leii bisulfitice; - ape reziduale din industria alimentar; - zer (deeu de la fabricarea brnzeturilor care conine ca surs de carbon lactoza); - melas i borhot de melas de la fabricarea alcoolului; - petrol lampant; - motorin; - cear de parafin care conine hidrocarburi saturate aciclice; - metan; - alcool metilic; - alcool etilic. Materia prim utilizat n instalaiile industriale este selectat n funcie de o serie de factori, dintre care cei mai importani sunt disponibilitatea, costul i capacitatea de

18

asimilare.n aceste materii prime utilizate ca medii de cultur pentru drojdii se gsesc, n anumite cantiti, o serie de glucide cum sunt: glucoza, xiloza, maltoza, zaharoza, manoza, galactoza, arabinoza, pe care drojdiile le pot folosi ca surs de carbon i energie. n majoritatea rilor productoare de proteine de biosintez se folosesc leiile bisulfitice rezultate de Ia fabricarea hrtiei i celulozei (S.U.A., Frana, Germania). n fosta U.R.S.S., se folosesc leiile bisulfitice i borhotul de la fabricarea alcoolului, iar n Bulgaria, n afara leiilor bisulfitice rezultate din hidroliza lemnului, se folosesc i cele obinute din hidroliza cocenilor de porumb i cojilor de floarea-soarelui. La noi n ar, multe secii i fabrici de drojdie furajer ca de pild Piteti, Comneti, Blaj, Suceava, Drobeta Turnu-Severin folosesc apele reziduale de la fabricarea plcilor fibrolemnoase, iar Zrneti - Braov, Letea - Bacu, Piatra-Neam folosesc leiile bisulfitice de la fabricarea celulozei. n paralel cu valorificarea i diversificarea reziduurilor industriale, n ultimii ani s-au ntreprins cercetri pentru biosinteza proteinelor pornind de la fraciuni de hidrocarburi petroliere.

2.2.8. Componente ale mediului de cultura utilizat in laborator Melasa Prin melas se nelege ultimul reziduu care rmne de la fabricarea zahrului, n urma cristalizrii repetate a zaharozei i din care nu se mai poate obine economic zahr prin cristalizare. n timpul primului rzboi mondial, ca urmare a faptului c cerealele nu mai erau n cantiti suficiente, la fabricarea drojdiei plmezile amidonoase zaharificate au fost nlocuite cu melas, care avea un pre mai convenabil i era mai uor de depozitat dect cerealele. n prezent, n S.U.A., Europa, Australia ca i la noi n ar, melasa este principala materie prim folosit la fabricarea drojdiei de panificaie drojdie de panificaie Caracteristici fizico-chimice i n condiii dirijate, 4 g melas (aproximativ 2 g zaharoz) pot contribui la obinerea unui gram de

19

Din punct de vedere fizic, melasa se prezint ca un lichid vscos, avnd o culoare brun-neagr, cu miros plcut de cafea proaspt prjit i un gust dulce-amrui. Reacia melasei este, de regul, uor alcalin. Compoziia chimic a melasei variaz n funcie de materia prim folosit la fabricarea zahrului (sfecl sau trestie de zahr) i de procesul tehnologic aplicat n fabricile de zahr (tabelul 3). Tabelul 3. Compoziia chimic a melasei din sfecl i trestie de zahr Compusul Ap, % Substan uscat, % Zahr total, % Zahr invertit, % Rafinoz, % Azot total, % Substane minerale, % PH Proveniena melasei Sfecl de zahr Trestie de zahr 20-25 15-20 75-80 80-85 44-52 50-55 0,1-0,5 20-23 0,6-1,8 1,2-2,4 0,3-0,6 7,6-12,3 10-12 6,0-8,6 <7

Melasa din sfecl de zahr are avantajul c favorizeaz obinerea unui produs de culoare mai deschis, n schimb conine betain ce nu este asimilat de ctre drojdie i astfel prin deversarea apelor reziduale crete consumul biochimic de oxigen. De asemenea poate fi deficitar n biotin, vitamin necesar creterii drojdiilor.

Tabelul 4. Compoziia chimic i indicii de calitate ai melasei din sfecl de zahr Indicatorul de calitate Minim Maxim Optim pentru fabricarea Standard Romnia

20

Substan uscat, % Zahr (polarimetric), % Zahr invertit, % Rafinoz, % Azot total, % Azot aminic, % Cenu (fr Ca), % Potasiu (K2O),% Calciu (CaO), % Biotin, mg/t SO2(anhidrid sulfuric),% Acizi volatili, % Culoare, ml iod 0,1 n la 100ml melas 2% Ph

71,0 40,0 9,1 0,5 0,1 5,0 2,0 0,1 30 0,01 0,5 0,4 4,9

85,0 54,0 10,0 2,5 2,1 0,5 12,0 5,0 1,5 125 0,07 1,8 10,0 8,5

drojdiei 74,0 46,050,0 max. 1,0 max. 1,0 min. 1,4 min. 0,3 max. 7,0 min.3,5 max. 1,0 200 max. 0,05 max. 1,2 max. 2,0 6,58,5

min. 75,0 min. 45,0 max. 1,0 min. 1,4 min. 0,4 max. 12 max. 0,08 max. 1,2 min. 7,0

Melasa din trestie de zahr este bogat n biotin, n schimb biomasa de drojdie obinut are o culoare mai nchis, nct sunt necesare operaii suplimentare de splare. Pentru a asigura un mediu optim de cretere, se pot folosi melase cupajate n care se adaug fosfai, surse de azot, factori de cretere; totui, la noi n ar se prefer utilizarea melasei din sfecl de zahr la fabricarea drojdiei de panificaie, melasa din trestie de zahr fiind folosit la fabricarea alcoolului. Compoziia chimic a melasei obinut la fabricarea zahrului din sfecl de zahr este prezentat n tabelul 4 Concentraia n substan uscat a melasei se exprim n practic n grade Balling (Bllg) sau Brix (Bx), care reprezint procente masice de substan uscat dizolvat. Glucidele din melasa de sfecl de zahr sunt reprezentate n cea mai mare parte din zaharoz, alturi de care se mai gsesc cantiti mici de rafinoz i zahr invertit. Un procent mai ridicat de 1% denot contaminarea melasei cu microorganisme care produc invertirea zaharozei. Nezahrul melasei cuprinde att substane organice (substane azotoase i neazotoase) ct i sruri minerale. Substanele cu azot sunt reprezentate n special prin produse de descompunere a proteinelor i n mai mic msur prin proteine macromoleculare. Dintre acestea n

21

cantitatea cea mai mare se gsete betaina, care poate s ajung pn la circa 5% fa de melas. Dintre aminoacizi n cantitatea cea mai mare se afl acidul glutamic. Cantitatea de substane azotoase, exprimate sub form de azot total variaz ntre 1,2 i 2,4%, din care azotul asimilabil reprezint 0,40,6%, cantitate care este insuficient pentru nutriia drojdiei. Din aceast cauz, att la fabricarea alcoolului ct i a drojdiei este absolut necesar adugarea de sruri de azot sub form de sulfat de amoniu, fosfat de amoniu, ap amoniacal, uree, .a. Substanele fara azot cuprind: pectine, hemiceluloze i produsele lor de hidroliz (arabinoz i galactoz) sruri ale acizilor organici.

Dintre vitamine s-au gsit n melasa din sfecl de zahr, tiamina, piridoxina i acidul pantotenic. Coninutul melasei n vitamine prezint o mare importan la fabricarea alcoolului i mai ales a drojdiei. Srurile minerale se afl n proporie de 68% fa de melas i sunt reprezentate de sruri de K, Na, Ca i Mg ale acizilor carbonic, sulfuric, fosforic, .a. Coninutul n fosfor al melasei este foarte sczut, de aceea n procesul de fabricaie se procedeaz la corectarea coninutului n fosfor al melasei prin adaos de superfosfat sau fosfat de amoniu. Melasa conine cantiti suficiente de Ca, n timp ce coninutul ei n magneziu este sczut, n special atunci cnd se trateaz zemurile pentru purificare cu schimbtori de ioni. Deficitul de magneziu al melasei se corecteaz prin adaos de sulfat de magneziu. Dioxid de sulf ce provine din procesul tehnologic de obinere a zahrului, fiind folosit pentru decolorarea zemurilor de difuziune, ct i nitrii formai prin reducere din nitrai. Prezena SO2 i nitriilor este nedorit deoarece inhib activitatea drojdiilor. Din acest motiv coninutul melaselor n SO2 nu trebuie s depeasc 0,008% (Hopulele, T., 1980).Un loc aparte n compoziia melasei l ocup coloizii de natur proteic, pectic, melanoidinic, care mpiedic funcionarea normal a celulei de drojdie i produc o spum abundent, nedorit, n linurile de fermentare. Din aceast cauz este necesar limpezirea melasei.

22

Melasa mai conine substane colorante, care se compun din melanoidine, melanine, caramel, ct i suspensii formate prin coagularea coloizilor i precipitarea unor sruri anorganice i organice. Compoziia i calitatea melasei difer de la fabric la fabric i chiar n cadrul aceleai campanii, n raport cu: calitatea sfeclei de zahr; natura solului pe care a fost cultivat sfecla de zahr; cantitatea i calitatea ngrmintelor aplicate solului; factorii meteorologici i climatici; procesul tehnologic de extracie a zahrului; condiiile de depozitare a melasei. Compoziia chimic medie a melasei, n principalele microelemente este prezentat n tabelul 5 Tabelul 5. Compoziia chimic medie a melasei din sfecl de zahr (%) Carbon Azot Fosfor Potasiu Magneziu Calciu 33 1,52 0,03 6 0,025 0,3

Vitaminele din melas sunt reprezentate, n principal, din biotin, acid pantotenic i inozitol (tabelul 6) Tabelul 6. Coninutul n vitamine al melasei (mg/t melas) Melas din: Vitamine B7 (Biotin) B5 sfecl de zahr 40 130 5 *104 11*104 trestie de zahr 2700 3200 5*104 6*104 Cantitatea necesar pentru un randament optim de fabricaie drojdie 250 44000

23

(Acid pantotenic) B9 (Inozitol) 570*104 800*10

4

600*104

1000000

Calitatea melasei, ca materie prim este deosebit de important la multiplicarea drojdiei de panificaie. Industrial, se prefer numai utilizarea melasei din sfecl de zahr, care este mai puin contaminat comparativ cu melasa din trestie de zahr. n afar de substanele valoroase, melasa poate s conin i substane cu efect inhibitor asupra activitii fiziologice a drojdiilor, formate n procesul de obinere a melasei. Dintre acestea fac parte : imidodisulfonatul de potasiu, care n cantiti mai mari de 5%, inhib activitatea drojdiilor. Rezult din nitrii i sulfii care ajung n melas prin activitatea unor bacterii; nitriii prezeni n melas n concentraie mai mare de 0,02%, inhib multiplicarea drojdiilor; acidul acetic, acidul butiric, n concentraii mai mari de 0,11%, inhib multiplicarea drojdiilor (Dan, V., 1999). Dintre aceste substane cea mai mare influen o exercit nitriii rezultai n urma reducerii nitrailor din melas, sub aciunea bacteriilor denitrificatoare. Acestea pot folosi nitraii ca acceptori de hidrogen, n locul oxigenului, n procesul de respiraie. Astfel, se produce reducerea nitrailor pn la azot sau amoniac. Bacteriile denitrificatoare conin enzime induse, ca nitrat-reductaza i nitritreductaza, care realizeaz denitrificarea. La prezena n mediu a nitratului i oxigenului molecular, denitrificatorii produc respiraia oxigenat a nitriilor i doar la deficit de O2, ele trec la denitrificare. Aciunea duntoare a nitriilor const n modificarea morfologiei celulelor, ntrzierea respiraiei, inhibarea nmulirii i activitii fermentative a celulelor de drojdie. Cea mai mare sensibilitate a fost semnalat n faza logaritmic de multiplicare a drojdiilor. La un coninut n mediu de numai 0,0005% este inhibat nmugurirea normal

24

a drojdiilor. Coninutul n nitrii de 0,0004% reduce nmulirea drojdiilor de cultur cu 50%, iar n cantitate de 0,02%, inhib aproape n totalitate creterea i nmulirea celulelor, iar o parte din drojdii mor, n primul rnd mugurii. Dac concentraia nitriilor n mediu se micoreaz de la 0,0037 la 0,001 % n cursul nmulirii drojdiilor, randamentul drojdiei se mbuntete cu 810%, iar de la concentraii de 0,009 la 0,002% cu 1721% (Notkima, 1975). Melasa are o ncrcare microbian ridicat i se consider o melas bun aceea care conine pn la 2103 celule/g; cea de calitate inferioar are peste 3104 celule/g. n mod curent, decadal, se efectueaz analiza fizico-chimic i microbiologic la melasa existent n stoc i care urmeaz a fi utilizat n producie. Analizele microbiologice constau n : determinarea numrului total de bacterii aerobe, mezofile, mediu bulion de carne gelozat, termostatare 48 ore (350), n UFC/g melas; determinarea numrului de drojdii i mucegaiuri, mediu must de mal agar cu pH = 3,5 ajustat la repartizare, termostatare 3 zile la 250C, n UFC/g melas; test calitativ de evideniere a bacteriilor din genul Leuconostoc, specia Leuconostoc mesenteroides prin cultivare din diluii decimale n mediu mbogit cu 15% zahr; determinarea numrului de drojdii (osmofile) n mediu cu must de mal i 10% zahr, termostatare 3 zile la 250C, n UFC/g melas; examen microscopic al coloniilor caracteristice n scopul identificrii.

Substane nutritive i factori de cretere Att la fabricarea alcoolului ct i a drojdiilor este necesar adugarea de substane nutritive care conin azot, fosfor, magneziu, .a., ct i factori de cretere pentru a compensa deficitul substratului n aceste substane necesare n cantiti bine determinate pentru nutriia drojdiei. Sulfatul de amoniu-(NH4)2SO4 se utilizeaz ca surs de azot asimilabil. Este o pulbere alb-glbuie, cristalin, solubil n ap, care se prepar industrial prin tratarea acidului sulfuric cu amoniac gazos. Coninutul de azot variaz ntre 2021%.

25

Fosfatul diamoniacal tehnic (ngrmntul complex), se utilizeaz ca surs de fosfor i azot asimilabil n procesul de multilplicare a drojdiei. Este un amestec de mono i diamonofosfai, (NH4)H2PO4 i (NH4)2HPO4, cu un coninut foarte ridicat de fosfor (54% P2O5) i de azot (21% N2). Este solubil n ap (42 g/100 ml la 25 0C, 47,5 g/100 ml la 500C i 51,5 g/100 ml la 700C). Este insolubil n alcool etilic. Soluia apoas 1% are pH-ul = 4,7, iar soluia saturat are pH-ul = 3,1. Produsul trebuie s conin minimum 95 % substan pur, max. 3 mg As/kg, max. 10 mg Pb/kg i max. 20 mg/kg alte metale grele. Sulfatul de magneziu (MgSO4 7H2O) se utilizeaz ca surs de magneziu la multiplicarea drojdiei. Produsul pulbere trebuie s conin 16,3% MgO i s nu conin arsen mai mult de 0,0005%. Amoniacul (NH3) se comercializeaz sub form de soluie de amoniac de sintez dizolvat n ap, cu o concentraie minim de 25%. Se utilizeaz ca surs de azot i pentru corectarea pH-ului. Amoniacul se adaug, de regul, sub form de ap amoniacal obinut prin diluarea amoniacului cu ap n raport de 1:5. Superfosfatul de calciu se obine prin tratarea finii de oase cu acid sulfuric i este un amestec format din 3 moli de fosfat monocalcic i 7 moli sulfat de calciu. Este o surs de fosfor ce conine 1618% P2O5. Coninutul n arsen trebuie s fie de maximum 0,006%. Ureea este o sare solubil n ap ce conine circa 46% azot din s.u., utilizndu-se sub form de soluie prin diluare cu ap n cantitate de 1012 litri la 1 kg de substan. Acidul ortofosforic (H3PO4) se utilizeaz ca surs de fosfor i pentru reglarea pHului plmezilor. n industria drojdiei de panificaie se utilizeaz H3PO4 tehnic, care s conin minimum 73% H3PO4 i maximum 0,0001% As. Clorura de potasiu (KCl) se folosete pentru corectarea plmezilor de melas n potasiu. Trebuie s conin minimum 5760% KCl pur. Factorii de cretere. Pentru multiplicare, drojdiile sunt dependente de prezena n mediul de cultur a unor substane numite factori de cretere.

26

Biotina intervine n multe din reaciile metabolismului glucidelor i azotului i n biosinteza proteic (n carboxilarea acidului piruvic, n sinteza acizilor nucleici, n formarea bazelor purinice i pirimidinice) i n sinteza acizilor grai. Celula de drojdie nu este capabil s sintetizeze biotina, dar prezena ei n mediu este necondiionat legat de o producie rentabil. Cerina drojdiei n biotin scade parial la prezena n mediu a aminoacizilor dicarboxilici (acid aspartic i acid glutamic). Eficacitatea aminoacizilor se mrete n condiii de aerare intens. De exemplu, dac la aerarea slab a mediului, care conine aminoacizi dicarboxilici, la 100 g drojdie sunt necesare 200 g biotin, atunci n condiii de aerare intens sunt suficiente 50 g. n melas biotina se gsete n cantitate de aproximativ 80 g/kg. Acizii grai, saturai si nesaturai cu lan de 16 si 18 atomi de C i esterii lor etilici adugai mpreun cu acidul aspartic sunt capabili s nlocuiasc biotina n creterea drojdiilor de panificaie n condiii aerobe. Acidul pantotenic influeneaz metabolismul drojdiilor att n condiii aerobe ct i anaerobe. El particip n transferul gruprii acyl, ca un component al coenzimei A, n metabolismul glucidelor i al acizilor grai. Vitamina B3 este unul din cei mai importani stimulatori ai creterii i activitii fermentative a drojdiilor. Ea se gsete n melas n cantiti suficiente (50 ppm). Inozitolul stimuleaz creterea drojdiilor, deficitul n inositol producnd o slbire a metabolismului glucozei att n condiii aerobe ct i anaerobe. Inositolul, n special ataat de lipide, acioneaz ca un component structural. Activitatea fosfofructokinazei este afectat de deficitul n inositol (Ghosh si Bhattacharyya, 1967). Tiamina catalizeaz decarboxilarea acizilor -cetonici, ca acidul piruvic, acidul -cetoglutaric, are un rol fundamental n metabolismul aerob al glucidelor. Derivatul tiaminei, tiamino-pirofosfatul este cofactor pentru multe enzime, care catalizeaz procesele de decarboxilare: piruvatdecarboxilaza, piruvat-dehidrogenaza. Celula de drojdie este capabil s sintetizeze tiamina n prezena ATP i ionilor de magneziu, totui adaosul de tiamin n mediu stimuleaz suplimentar creterea culturii. Tiamina este termostabil rezistnd la sterilizarea mediului.

27

Piridoxina

particip

la

decarboxilarea,

dezaminarea

transaminarea

aminoacizilor absorbii, iar acidul paraaminobenzoic la fixarea polipeptidelor. Riboflavina este sintetizat de ctre toate drojdiile. Derivaii riboflavinei, cum ar fi flavinadenindinucleotidul (FAD), flavinmono-nucleotidul(FMN) i alii, sunt cofactorii multor oxidoreductaze i joac un rol important n reaciile de oxidoreducere. Riboflavina este termostabil. Atunci cnd celulele de drojdie de panificaie sunt transferate din condiii anaerobe de cultur n condiii aerobe, n timpul propagrii industriale, coninutul de riboflavin crete, iar creterea este maxim n faza de cretere semiaerob. Produse biostimulatoare: Extractul de porumb - obinut prin concentrarea apelor de nmuiere ale porumbului i obinerea de amidon poate fi o surs de microelemente i vitamine din grupul B. Compoziia sa este prezentat n tabelul 7 n extract se afl aminoacizi cu rol de biostimulatori i vitamine, dintre care biotina este prezent n cantiti apreciabile (150200 mg/100 g).

Tabelul 7. Compozitia chimica a extractului de porumb Apa Azot total Azot amoniacal Acid lactic Cenu Biotin 3060% 2,74,5% s.u. 12 % s.u. 511,5% s.u. 810% (Ca, P, Cu, Fe, Mg, S, Zn, Co) 150200 mg/100g

Extractul de porumb folosit la fabricarea drojdiei de panificaie cu un consum de 60 kg/t melas, poate crete productivitatea cu 46%, n schimb prezint inconvenientul c este un produs deficitar i este folosit preponderent n industria antibioticelor. Se

28

constat de asemenea c proteinele din extract pot lega biotina ntr-o form inaccesibil pentru celula de drojdie. Extractul apos din radicele de mal Prin obinerea de extracte 1:10 i pstrare 2 ore la 500C i filtrare, filtratul poate conine 1,9% glucide/s.u. i 2,3% azot solubil/s.u. Prin concentrare la 50% substan uscat se poate conserva. Radicelele de mal conin vitamine din grupul B, vitamina E, provitaminele A i D, biotin i aminoacizi cu rol biostimulativ. Compoziia chimic medie a radicelelor de mal este prezentat n tabelul 8. Tabelul 8.Compoziia chimic medie a radicelelor de mal Componente proteine lipide substane extractive neazotoase celuloz umiditate g% 25 2 42 14 10

Germeni de cereale (gru i porumb). Germenii de cereale sunt subproduse rezultate din procesul de mcinare, n proporie de pn la 10% din greutatea cerealelor supuse prelucrrii. Germenii de cereale conin pe lng lipide, protide, numeroase substane care ndeplinesc rolul de factori de cretere pentru drojdii (vitamine i aminoacizi), i conin n cenu, microelemente cu rol de activatori ai enzimelor celulare participante la Germenii de gru sunt utilizai i ca surs de vitamin E. Valorificarea principal a germenilor de porumb o constituie extragerea uleiului care are un coninut ridicat de acid linoleic i, prin aceasta, proprieti dietetice. metabolismul fermentativ/oxidativ al drojdiei-tabelul 9.

29

Tabelul 9. Compoziia germenilor de cereale (gru i porumb) n substane cu rol favorizant n activizarea drojdiei Saccharomyces cerevisiae

Vitamine (g/g) Niacina (PP) Acid pantotenic (B) Acid folic Tiamina (B1) Riboflavina (B2) Piridoxina (B6) Tocoferol (E)

Germeni de gru 71,573,5 17,9 25,7 2,65 2,59 22,9724,02 5,766,25 9,3110,82 5,920,1

Germeni de porumb 1,08 1,08 4,0 1,2 1,2 36,8 1216

Germenii de porumb se caracterizeaz i prin coninut deosebit de valoros n substane minerale, cu rol de biostimulatori tabelele 10-11
Tabelul 10.

Aminoacizi g / 100g extract Arginina Lizina Metionina Valina Histidina Izoleucina Leucina Treonina Cisteina Fenilalanina Triptofan Tirozina 0,38 0,34 0,08 0,27 0,15 0,28 0,42 0,4 0,09 0,19 0,06 0,24 0,51 0,36 0,1 0,33 0,19 0,26 0,44 0,28 0,08 0,31 0,08 0,35

Tabel 11.

Substane minerale Ca P K Na Mg Zn Fe

Concentraie 0,014 0,018% 2,33 2,34% 2,34 2,36% 0,092% 0,11,23% 201 ppm 203 ppm

30

Mn Cu

54 ppm 15,5 ppm

31

Acidul sulfuri se utilizeaz pentru corectarea Ph-ului mediilor de cultur. Are o concentraie de circa 9698% substan pur. Se folosete acid sulfuric obinut prin procedeul de contact care conine o cantitate redus de arsen de max. 10 mg/kg. ntruct la diluarea acidului sulfuric se dezvolt o cantitate mare de cldur este interzis s se toarne ap n acid, ci n mod treptat acid n ap, sub agitare. Substanele antispumante La fabricarea alcoolului i n special a drojdiei de panificaie i furajere se formeaz cantiti mari de spum datorit coloizilor din melas care se dispun la suprafaa bulelor de aer care barboteaz n mediu, stabiliznd spuma format. Cu ct melasa este mai bogat n substane coloidale i deci insuficient limpezit cu att cantitatea de spum format este mai mare. Substanele antispumante se utilizeaz pentru mpiedicarea formrii spumei sau pentru distrugerea spumei deja formate. Ca antispumani se utilizeaz acidul oleic, uleiul siliconic, octadecanolul, polipropilenglicolul, hidrocarburi parafinice, .a. Substanele antispumante folosite trebuie s fie inofensive pentru drojdie sau chiar asimilabile, s nu produc murdrirea utilajelor i conductelor tehnologice i s nu influeneze negativ asupra aspectului exterior, gustului i mirosului drojdiei de panificaie. Substanele antiseptice i dezinfectante Att la fabricarea alcoolului ct i a drojdiei sunt folosite o serie de substane cu aciune antiseptic sau dezinfectant. Substanele antiseptice se folosesc pentru combaterea microorganismelor de contaminare n cursul fermentaiei plmezilor, n doze bine stabilite, la care s nu fie influenat negativ activitatea fermentativ a drojdiei.Dintre antisepticii mai des utilizai sunt acidul sulfuric, formalina i pentaclorfenolatul de sodiu. Prin adugare de acid sulfuric n plmezile de drojdie se creeaz o aciditate ridicat care inhib dezvoltarea bacteriilor de contaminare, n timp ce activitatea drojdiei este puin influenat. Prin tratarea laptelui de drojdie cu acid sulfuric pn la un pH sczut de 2,02,4 se realizeaz, de asemenea, o purificare a drojdiei n vederea nsmnrii.

Formalina se folosete ca antiseptic n special la fermentarea plmezilor din cereale i cartofi, fiind utilizat n doze de 0,0150,02% fa de plmad si deasemeni se folosete ca dezinfectant n soluii cu concentraia de 35% aldehid formic i chiar pn la 10% pentru dezinfectarea conductelor i utilajelor tehnologice. Fiind o substan volatil, se sporete eficiena ei prin introducere de abur n urma tratamentului cu formalin. Pentaclorfenolatul de sodiu se utilizeaz ca antiseptic la fermentarea plmezilor de melas n cantiti de 6090 g/tona de melas, sub forma unei soluii alcoolice cu concentraia de 1217% substan pur. Prin adaos de pentaclorfenolat de sodiu se pot fermenta plmezile din melas fr sterilizare termic. Nu se recomand folosirea acestui antiseptic atunci cnd din borhotul obinut de la fabricarea alcoolului din melas urmeaz s se produc drojdie furajer, deoarece antisepticul se acumuleaz n drojdie i este duntor pentru animale i psri. Substanele dezinfectante cele mai des utilizate pentru combaterea microflorei de contaminare la fabricarea alcoolului i a drojdiei sunt: formalina, clorura de var, laptele de var, soda caustic i soda calcinat. Clorura de var se folosete sub form de suspensie n ap cu concentraia de 13%, cu care se stropete suprafeele utilajelor i ncperilor tehnologice. Celelalte substane se folosesc n concentraii asemntoare de 1,55%.

CAPITOLUL III
IZOLAREA SI CARACTERIZAREA DROJDIEI Phaffia rhodozyma
3.1. Izolarea drojdiei Phaffia rhodozyma O drojdie cu caracteristici similare Phaffiei rhodozyma a fost izolata din microbiota epifita a marului, utilizand metoda de izolare Koch. Aceasta metoda se bazeaza pe formarea de colonii,in urma raspandirii microorganismelor recoltate din medii naturale pe suprafata unor medii nutritive solidificate

3.1.1. Caracterizarea unei drojdii producatoare de pigment carotenoidic Determinarea caracterelor drojdiei s-a realizat pe MEA la o temperatura de 25C/timp de 3 zile. Studiul microscopic s-a reazat cu obiective uscate, cu grosimea de x10 sau x40. Phaffia rhodozyma formeaza colonii cu perimetru circular iar celulele dezvoltate au forma ovoidala si dimensiuni medii de 4-5m. - pigmentatia: rosu-portocaliu(specifica pigmentilor carotenoidici); - aspectul coloniilor este rugos si mat; - diametrul coloniei variaza intre 2 si 4 mm; - forma coloniei este ovoidala; - dimensiunea celulelor variaza inte 4 si Fig.5. Phaffia rhodozyma 4,8 m

3.2.2. Multipicarea drojdiei Phaffia rhodozyma Pentru a obtine mai mult mediu de lucru s-a facut multiplicarea in 10 eprubete pe mediu MMA. Mediul de lucru astfel obtinut sa intodus la termostatare timp de 3 zie la temperaura de 25C.

Fig.6. Multiplicarea drojdiei Phaffia rhodozyma Drojdia izolata dintr-o colonie rosie rezultata din microbiota epifita a merelor a format pe MEA, dupa 3 zile de cultivare, colonii cu diametrul de 1,5-3mm, cu perimetrul circular, cu suprafata striata rosu caramiziu. Celulele dezvoltatepe MEA timp de trei zile au forma ovoidala si dimensiuni medii de 4-5m, reproducerea avand loc prin imugurire pe intreaga suprafata. Caracteristicile drojdiei sunt in concordonanta cu descrierea drojdiei Phaffia rhodozyma, drojdie izolata de catre Herman Paff in anul 1960 si cunoscuta pentru abilitatea sa de a produce o mare cantitate de astaxanthina. 35

Nr. Crt. 1 2

Drojdie Phaffia rhodozyma Drojdie izolata in laborator Phaffia rhodozyma Tulpina industriala

Caractere morfologice Macroscopice Microscopice Colonie cu 2-2,5 Dim.celulei 4,8m Perimetrul circular Forma ovoidala Colonie cu 1,5-5 Dim.celulei 4-5 m Perimetrul circular Forma ovoidala

In mod normal, pentru identificarea unei drojdii sunt necesare teste biochimice prin care se pune in evidenta capacitatea ei de a asimila si / sau fermenta anumite glucide, precum si preferintele acestora pentru anumite surse de azot. In lipsa posibilitatii de a investiga caracterele biochimice si fizice ale drojdiei izolate, se poate concluziona doar ca drojdiile izolate de pe mere ar putea fi din genul Phaffia.

36

CAPITOLUL IV
PRODUCEREA DE BIOMASA DE Phaffia rhodozyma

4.1. Producerea de biomasa In vederea obtinerii de biomasa de Phaffia rhodozyma, acesteia trebuie sa i se asigure un mediu de cultura cu un amestec de substante care asigura toate componentele necesare pentru procesele energetice ale celulei, si anume surse de carbon, azot, substante minerale, factori de crestere, la o concentratie a substantelor dizolvate corespunzatoare presiunii osmotice celulare, cu valori de pH si rH optime cresterii si multiplicarii microorganismelor de cultivat. Cultivarea in laborator s-a realizat pe un mediu pe baza de melasa a carei compozitie si pH sunt prezentate in tabelul 1, acesta fiind tinut pe agitator timp de 48h la o temperature de 25C . 4.2. Medii de laborator Se obtin prin dozarea si dizolvarea succesiva sau suspendarea in apa a unor ingrediente de natura organica / anorganica, conform retetelor de obtinere.Gratie utilizarii metodelor matematice de planificare a experientelor a fost elaborat un mediu de cultura, prin intermediul caruia este posibila majorarea productivitatii in biomasa drojdiei Phaffia rhodozyma. . Dupa sterilizarea mediului de cultura a avut loc inocularea acestuia. Inocularea s-a realizat cu ajutorul unui inocul ce contine o concentratie de 1,2 108cel/cm . Dozarea acestuia s
3

a facut astef incat mediu sa sa contina un numar de 3,610 cel/cm

6

Dupa inoculare paharele Erlenmayer s-au pus pe agitator timp de 24h. Urmatoarea operatie dupa agitare a fost colectarea lichidului de la suprafata mediului de cultura care a fost supus unei citiri cu refgractometrul, acest indice ajuta la determinarea cantitati de glucoza al lichidului cultural. In paralel cu probele de analizat s-a citit indicele de refractie si la lichidul prelevat de la mediul de cultura neinoculat. Rezultatele sunt afisate in tabelul 12 de mai jos: Nr.crt Lichidul supus citirii Indicele de refractie 37

. 1 2 3

Proba martor- mediu de cultura neinoculat Proba 1 Proba 2

3.8 1.1 1

Dupa cultivare, centrifugare si uscare biomasa a fost separata intr-un vas steril, in conditii aseptice, fiind mai apoi pastrata la frigider, pana in momentul extractiei, in vederea dezvoltarii cantitatii de astaxantina. Extractia de astaxantina s-a realizat amestecand 13 ml suspensie de drojdie cu 6 bile mici, de metal, dupa care s-a introdus in moara cu bile in vederea distrugerii peretilor celulari ai drojdiei. Extragerea metabolitului s-a realizat prin precipitare, folosidu-se ca agent de precipitare acetona. Procesut a trecut prin trei etape repetitive pana la colectarea finala, dupa care s-a efectuat o centrifugare la 3000 rot/min /10 min a lichidului final. Pentru determinarea randamentului de biosinteza s-a efectuat o citire la spectrofotometru. Carotenoizi totali (mg/g drojdie) = 10 ml eter petrol A474 100 / 21 38,03 s.u.biomasa Carotenoizi totali (mg/g drojdie) = 0,194 mg / m drojdie

4.3. Astaxanthina Principalul carotenoid produs de Phaffia rhodozyma este astaxanthina. Astaxanthina este pigmentul rosu care da speciilor de salmonide (somon, lostrita, pastrav), crevetilor si pasarilor Flamingo culoarea lor roz-rosie. Acest compus mareste pigmentarea animalelor de acvacultura si este cel mai scum ingredient din hrana acestor animale.

Fig.9. Pigmentarea salmonidelor Din punct de vedere chimic are o structura asemanatoare cu - carotenul (din morcovi) si vitamina A.

38

Astaxanthina este consumata de multe organisme acvatice inclusiv crustacee, printer care si crevetele care secreta pigmentul in exoschelete si care ii da culaorea rosie. Crustaceele sunt la randul lor consumate de catre pesti (pastrav, somon) sau pasari (flamingo, pasari rosii). Acestea depoziteaza pigmentul la randul lor in piele si tesutul gras. Acesta este motivul pentru care somonul si celelalte animale au culoarea rosie. Astaxanthina nu-si pierde din intensitate si de aceea animalele raman cu coloratie roz-rosie. Prin includerea astaxanthinei in dieta pestilor, functionand si ca un puternic antioxidant, este responsabila si pentru cresterea duratei de viata, pentru imbunatatirea ratei de crestere si supravietuire a puietului, a imunitatii si rezistentei la stres si foarte important a fecunditatii. In prezent, pentru om, astaxanthina este utilizata ca un supliment alimentar. Cercetarile arata ca datorita activitatii astaxanthinei ca puternic antioxidant ar putea fi benefic si in anumite boli cardiovasculare si neurodegenerative. Cercetarile sustin ca imbunatateste sistemul imunitar prin cresterea numarului de celule care produc anticorpi.

CAPITOLUL V
39

Imbunatatirea compozitiei mediului de cultura in vederea produceri de astaxanthina

5.1. Imbunatatirea compozitiei mediului de cultura In vederea obtinerii unei cantitatati mai mare de produs de biosinteza, am adaugat o serie de factori de crestere pentru a imbunatati conditiile optime in care drojdia produce cea mai mare cantitate de astaxantina. Astfel am adaugat mediului de cultura, repartizat in mod egal in 6 eprubete, diverse adaosuri de: Extract de drojdie Extract de porumb si Uree . Amestecul din fiecare eprubeta a fost repartizat in cate o placa Petri si s-a procedat la inocularea punctiforma in 5 locuri distincte a fiecareia cu drojdia Phaffia rhodozyma, placile fiind termostatate timp de 3 zile la o temperatura de 25C. Rezultatele cultivarii sunt cel mai bine reprezentate de figura 8

a)

b)

40

c)

d)

e) adaos de diversi factori de crestere a - 0,1 ml. uree; c - 0,1 ml. extract de drojdie; e - 0,1 ml.. extract porumb; b - 0,2 ml. uree;

f)

Fig.8. Variatia intensitatii pigmetului la Phaffia rhodozyma, in urma cultivarii pe MM cu

d - 0,2 ml.. extract de drojdie; f - 0,2 ml. extract porumb

Dupa cum se observa si in imagini culoarea drojdiei Phaffia rhodozyma difera in functie de factorii de crestere folositi. Pe mediul cu uree culoarea este mult mai intensa.

41

CAPITOLUL VI
Obtinerea unui bun producator de pigmenti carotenoidici prin mutageneza
Cercetarile efectuate vizeaza reglarea proceselor de biosinteza la cultivarea drojdiilor pigmentate si sporirea continutului cantitativ de pigmenti carotenoidici. 6.1.Carotenoidele Reprezinta unul din cele mai numeroase si raspandite grupuri de pigmenti naturali. In functie de natura carotenoidului, in prezent, ei se obtin prin sinteza chimica, sinteza microbiana sau sunt extrasi din materie vegetala. Aproximativ 10% din carotenoizi sunt precursori ai vitaminei A. In multe tari pigmentii carotenoidici sunt utilizati ca supliment alimentar dar isi gasesc utilizarea si in cosmetologie si acvacultura. Cererea de pigmenti carotenoizi, care este in permanenta crestere, impune necesitatea maririi numarului de surse potentiale de obtinere a lor. 6.2. Imbunatatirea biosintezei de pigment prin mutageneza Pentru obtinerea unui bun producator de pigmenti carotenoidici s-a folosit ca agent mutagen inhibitor al sintezei de steroli sau carotenoizi- clotrimazolul. In acest scop s-au folosit trei eprubete cu continut de mediu initial si 2 % agar peste care s-a adaugat clotrimazol dupa cum urmeaza: in prima eprubeta 0,32 mg 1g10 mg clotrimazol 0,032 g.x mg clotrimazol

x = 0,32 mg clotrimazol

42

0,32 mg .9 ml clotrimazol y mg 100 ml clotrimazol

y = 3,555 mg clotrimazol

in cea de a doua eprubeta 0,67 mg

1g10 mg clotrimazol 0,067 g.x mg clotrimazol

x = 0,67 mg clotrimazol

0,67 mg .9 ml clotrimazol y mg 100 ml clotrimazol

y = 7,444 mg clotrimazol

in a treia eprubeta 1,02 mg

1 g10 mg clotrimazol 0,102 g.x mg clotrimazol

x = 1,02 mg clotrimazol

43

1,02 mg .9 ml clotrimazol y mg 100 ml clotrimazol

y = 11,333 mg clotrimazol

Continutul fiecarei eprubete se repartizeaza uniform in cate o placa Petri, iar dupa solidificarea mediului se trece la inteparea acestora cu drojdie Phaffia rhodozyma. Cele trei placi Petri sunt intoduse la termostatare timp de 3 zile la o temperatura de 25C.

Fig. 10. Inocularea placilor, cu continut de clotrimazol, cu drojdie Phaffia

44

Dupa termostatare s-a facut o observare vizuala, dupa cum reiese din urmatorul tabel: Tabel nr.13. Procentaj supravietuire 80% 80% 100%

Nr. crt. 1 2 3

Clotrimazol (g) 0,032 0,067 0,102

Numar replicate 5 5 5

Din prima placa s-au prelevat celule de drojdie si s-a facut inocularea in doua eprubete cu continut de MMA, in mod similar sa procedat si cu celelalte doua placi. Eprubetele astfel obtinute au fost supuse operatiei de termostatare timp de trei zile la o temperatura de 25C.

Fig. 11. Inocularea eprubetelor continand MMA cu drojdia de pe mediul cu clotrimazol Pentru continuarea experimentului s-au pregatit trei placi Petri ce contin mediu cu 2 % agar si diferite cantitati de uree : in prima placa 0,1 ml uree (2 picaturi), in a doua placa 0,4 ml uree (4 picaturi), iar cea de-a treia este folosita ca placa martor (fara uree). Din cele 6 eprubete,

45

scoase de la termostatare, s-a prelevat celule de drojdie si s-au inoculat in mediile pregatite, in prealabil, in cele 3 placi.

Fig. 12. Inocularea placilor cu continut de uree Printr-o simpla observare vizuala se poate vedea o mai buna dezvoltare si o culoare mult mai intensa a coloniilor de drojdie in placa cu continutul cel mai ridicat de uree. Clotrimazolul, in concentratiile testate, nu a fost un bun agent mutagen iar in cercetarile viitoare se va incerca imbunatatirea celulelor de drojdie, in vederea producerii de astaxantina, cu concentratii mai mari de clotrimazol.

46

CONCLUZII
1. S-a realizat izolarea unei drojdii de culoare rosie in vederea producerii de astaxantina. 2. Pe baza caracterelor morfologice de natura macroscopica si microscopica drojdia a fost identificata ca facand parte din genul Phaffia ssp. Rhodozyma 3. Drojdia izolata de pe mere si cultivata mai apoi pe mediu cu melasa a avut ca produs de biosinteza astaxantina. In urma biosintezei s-a obtinut o cantitate de pigmenti carotenoidici egala cu 0,194 mg / m drojdie. 4. In laborator s-au efectuat testari privind imbunatatirea mediului de cultura in vederea obtinerii unui randament ridicat de astaxantina. Mediul cu continutul cel mai mare de uree as-a dovetit a fi favorabil in vederea producerii unei cantitati mai mari de astaxantina fata de celelalte medii utilizate anterior. 5. S-a incercat obtinerea unui mutant de drojdii, folosind ca agent mutagen Clotrimazolul in concentratii de :
0,032 mg; 0,067 mg; 0,102 mg

In urma experimentelor incercate s-a observat ca agentul mutagen reprezentat de clotrimazol nu este un agent eficace deoarece nu s-au obtinut rezultatele dorite.

47