Metode de Determinare Nutrienti

Republica Moldova
GUVERNUL
HOTRRE Nr. 686
din 13.09.2012
cu privire la aprobarea unor metode de analiz
pentru controlul nutreurilor
Publicat : 21.09.2012 n Monitorul Oficial Nr. 198-204 art Nr : 741 Data intrarii in
vigoare : 21.12.2012
n conformitate cu prevederile Legii nr.221-XVI din 19 octombrie 2007 privind activitatea
sanitar-veterinar (Monitorul Oficial al Republicii Moldova, 2008, nr.51-54, art.153), cu
modificrile i completrile ulterioare, precum i n vederea transpunerii prevederilor
Regulamentului nr. 152/2009/CE din 27 ianuarie 2009 de stabilire a metodelor de eantionare
i analiz pentru controlul oficial al furajelor, publicat n Jurnalul Oficial al Uniunii Europene
seria L nr.54 din 26 februarie 2009 n baza normativ naional, Guvernul HOTRTE:
1. Se aprob:
Metodele de eantionare pentru controlul oficial al nutreurilor, n vederea determinrii
constituenilor, aditivilor i a substanelor nedorite, cu excepia reziduurilor de pesticide i a
microorganismelor, conform anexei nr. 1;
Metodele de preparare a eantioanelor pentru analiz i exprimarea rezultatelor, conform
anexei nr. 2;
Metodele de analiz privind controlul compoziiei materiilor prime pentru nutreuri i a
nutreurilor combinate, conform anexei nr. 3;
Metodele de analiz pentru controlul nivelului admisibil de aditivi n nutreuri, conform
anexei nr. 4;
Metodele de analiz pentru controlul substanelor nedorite n nutreuri, conform anexei nr.
5;
Metodele de analiz privind determinarea constituenilor de origine animal pentru
controlul oficial al nutreurilor, conform anexei nr. 6;
Metodele de determinare a valorii energetice a nutreurilor combinate pentru psrile de
cresctorie, conform anexei nr. 7.
2. Prezenta hotrre intr n vigoare la 3 luni de la data publicrii n Monitorul Oficial al
Republicii Moldova.
3. Controlul asupra executrii prezentei hotrri se pune n sarcina Ministerului
Agriculturii i Industriei Alimentare.
Prim-ministru
Vladimir FILAT
Contrasemneaz:
Ministrul agriculturii
i industriei alimentare
Vasile Bumacov
Nr. 686. Chiinu, 13 septembrie 2012.
Anexa nr. 1
la Hotrrea Guvernului nr.686
din 13 septembrie 2012
Metodele de eantionare pentru controlul oficial al nutreurilor, n
vederea determinrii constituenilor, aditivilor i a substanelor nedorite, cu
excepia reziduurilor de pesticide i a microorganismelor
1. Definiii
n sensul prezentului act normativ noiunile utilizate au urmtoarele semnificaii:
lot eantionat cantitate de produs care constituie o unitate i care are caracteristici
presupuse a fi uniforme;
eantion elementar cantitate prelevat dintr-un punct al lotului eantionat;
eantion colectiv colecie de eantioane elementare prelevate din acelai lot uniform;
eantion redus parte reprezentativ a eantionului colectiv, obinut din acesta
printr-un proces de reducere;
eantion final parte din eantionul redus sau din eantionul colectiv omogenizat.
2. Metode de eantionare
Eantioanele destinate controlului oficial al nutreurilor se preleveaz de ctre personal
calificat i se consider reprezentative.
2.1. Dispozitive
Aparatura de prelevare de eantioane trebuie s fie realizat din materiale care nu
contamineaz produsele de eantionat. Aceast aparatur, cu excepia celei descrise n
subpunctele 2.2.1., 2.2.1.1. i 2.2.1.2., trebuie verificat de ctre Autoritatea Naional de
Metrologie.
2.2. Aparatura recomandat pentru prelevarea eantioanelor din nutreuri solide
2.2.1. Prelevarea manual.
2.2.1.1. Lopat plat cu margini verticale.
2.2.1.2. Sond de eantionare cu o fant lung sau compartimentat. Dimensiunile
sondei de eantionare trebuie s fie adecvate caracteristicilor lotului eantionat (adncimea
recipientului, dimensiunile sacului etc.) i dimensiunilor particulelor nutreului.
2.2.2. Prelevarea mecanic.
Pentru prelevarea de eantioane din nutreurile n micare poate fi utilizat aparatur
mecanic verificat.
2.2.3. Separatorul.
Aparatura destinat divizrii eantionului n pri aproximativ egale poate fi folosit
pentru prelevri de eantioane elementare i pentru prepararea eantioanelor reduse i finale.
3. Cerine cantitative
A. n relaie cu controlul substanelor sau produselor uniform distribuite n
nutreuri
3.1. Lot eantionat
Mrimea lotului eantionat trebuie s permit eantionarea fiecrei pri constituente.
3.2. Eantioane elementare
3.2.1. Nutreuri n vrac i numrul minim de eantioane elementare:
a) pentru loturile eantionate care nu depesc 2,5 tone metrice apte;
b) pentru loturile eantionate care depesc 2,5 tone metrice 20 nmulit cu numrul
de tone metrice care compune lotul eantionat (n cazul n care numrul obinut este o fracie,
aceasta se rotunjete la numrul ntreg imediat superior), pn la maximum 40 de eantioane

elementare.
3.2.2. Nutreuri ambalate i numrul minim de ambalaje de eantionat:
3.2.2.1. Ambalajele care depesc 1 kg:
a) pentru loturile eantionate care reprezint unul pn la patru ambalaje toate
ambalajele;
b) pentru loturile eantionate care reprezint 5 pn la 16 ambalaje patru;
c) pentru loturile eantionate care reprezint mai mult de 16 ambalaje numrul de
ambalaje care compun lotul eantionat (n cazul n care numrul obinut este o fracie, aceasta
se rotunjete la numrul ntreg imediat superior), ajungnd pn la un maximum de 20 de
ambalaje.
3.2.2.2. Ambalajele care nu depesc 1 kg, numrul minim de eantioane elementare
constituie patru.
3.2.3. Nutreuri lichide sau semilichide i numrul minim de recipiente de eantionat
(n cazul ambalajelor sau recipientelor care nu depesc 1 kg sau un litru i n cazul blocurilor
sau brichetelor de sare care nu cntresc mai mult de 1 kg fiecare, un eantion elementar este
reprezentat de coninutul unui ambalaj sau recipient original, un bloc sau o brichet de sare):
3.2.3.1. Recipiente care depesc un litru:
a) pentru loturile eantionate de unul pn la patru recipiente toate recipientele;
b) pentru loturile eantionate de 5 pn la 16 recipiente patru;
c) pentru loturile eantionate care reprezint mai mult de 16 recipiente numrul de
recipiente care compune lotul eantionat (n cazul n care numrul obinut este o fracie,
aceasta se rotunjete la numrul ntreg imediat superior), pn la maximum 20 de recipiente.
3.2.3.2. Recipientele care nu depesc un litru, numrul minim de eantioane
elementare constituie patru.
3.2.4. Blocuri de nutreuri i brichete minerale cu numrul minim de blocuri sau
brichete de eantionat.
Pentru un bloc sau o brichet per lot eantionat de 25 de uniti, numrul minim de
blocuri sau brichete de eantionat nu depete patru blocuri sau brichete.
3.3. Eantioane colective
3.3.1. Nutreuri n vrac, cantitatea total de eantioane elementare care constituie
eantionul colectiv este de 4 kg.
3.3.2. Nutreuri ambulate:
a) pentru ambalajele care depesc 1 kg, cantitatea total de eantioane elementare care
constituie eantionul colectiv este de 4 kg;
b) pentru ambalajele care nu depesc 1 kg, cantitatea total de eantioane elementare
care constituie eantionul colectiv reprezint greutatea coninutului a patru ambalaje originale.
3.3.3. Nutreuri lichide sau semilichide:
a) pentru recipientele care depesc un litru, cantitatea total de eantioane elementare
care constituie eantionul colectiv este de 4 litri;
b) pentru recipientele care nu depesc un litru, cantitatea total de eantioane
elementare care constituie eantionul colectiv reprezint volumul coninutului a patru
recipiente originale.
3.3.4. Blocuri de nutreuri sau brichete minerale:
a) cntresc mai mult de 1 kg fiecare, cantitatea total de eantioane elementare care
constituie eantionul colectiv este de 4 kg;
b) cntresc cel mult 1 kg fiecare, cantitatea total de eantioane elementare care
constituie eantionul colectiv constituie greutatea a patru blocuri sau brichete originale.
3.4. Eantioane finale
Dac este cazul, eantionul final provine din eantionul colectiv, prin reducere. Se
analizeaz cel puin un eantion final.
3.4.1. Nutreuri solide.
Cantitatea din eantionul final de analizat constituie 500 g.
3.4.2. Nutreuri lichide sau semilichide
Cantitatea din eantionul final de analizat constituie 500 ml.
B. n funcie de controlul substanelor sau produselor nedorite care pot fi
distribuite neuniform n masa de nutreuri, cum ar fi aflatoxinele, cornul-secarei, ricinul
i crotalaria din materiile prime pentru nutreuri
3.1. Lot eantionat
Mrimea lotului eantionat trebuie s permit eantionarea fiecrei pri constituente.
3.2.1. Nutreuri n vrac i numrul minim de eantioane elementare:
a) pentru loturile eantionate care nu depesc 2,5 tone metrice apte;
b) pentru loturile eantionate care depesc 2,5 tone metrice 20 nmulit cu numrul
de tone metrice care compune lotul eantionat (n cazul n care numrul obinut este o fracie,
aceasta se rotunjete la numrul ntreg imediat superior), pn la maximum 40 de eantioane
elementare.
3.2.2. Nutreuri ambalate i numrul minim de ambalaje de eantionat:
a) pentru loturile eantionate care numr de la 1 pn la 4 ambalaje toate ambalajele;
b) pentru loturile eantionate care numr de la 5 pn la 16 ambalaje patru.
c) pentru loturile eantionate care numr mai mult de 16 ambalaje numrul de
ambalaje care compun lotul eantionat (n cazul n care numrul obinut este o fracie, aceasta
se rotunjete la numrul ntreg imediat superior), ajungnd pn la maximum 40 de ambalaje.
3.3. Eantioane colective
Greutatea total a eantioanelor elementare care constituie eantionul colectiv nu poate
fi mai mic de 4 kg.
3.3.1. Nutreuri n vrac
Greutatea lotului eantionat n tone metrice:
a) pn la 1 ton, numrul minim de eantioane colective per lot eantionat reprezint
unu;
b) mai mult de 1 i pn la 10, numrul minim de eantioane colective per lot
eantionat reprezint doi;
c) mai mult de 10 i pn la 40, numrul minim de eantioane colective per lot
eantionat reprezint trei;
d) mai mult de 40, numrul minim de eantioane colective per lot eantionat reprezint
patru.
3.3.2. Nutreuri ambalate
Mrimea loturilor eantionate pentru nutreurile ambalate, n numr de ambalaje:
a) de la 1 pn la 16, numrul minim de eantioane colective per lot eantionat
constituie unu;
b) de la 17 pn la 200, numrul minim de eantioane colective per lot eantionat
constituie doi;
c) de la 201 pn la 800, numrul minim de eantioane colective per lot eantionat
constituie trei;
d) mai mult de 800, numrul minim de eantioane colective per lot eantionat
constituie patru.
3.4. Eantioane finale
Eantionul final provine din fiecare eantion colectiv, prin reducere. Se cere analiza a
cel puin un eantion final per eantion colectiv. Greutatea eantionului final de analizat nu
poate fi mai mic de 500 g.
4. Instruciuni pentru prelevarea, prepararea i ambalarea eantioanelor
4.1. Cerine generale
Eantioanele se preleveaz i se prepar ct mai rapid posibil, pentru a evita
posibilitatea ca produsul s fie modificat sau contaminat.
Instrumentele, suprafeele de lucru i recipientele destinate eantionrii trebuie s fie
curate i uscate.
4.2.1. n relaie cu controlul substanelor sau produselor uniform distribuite n nutreuri
Eantioanele elementare trebuie prelevate n mod aleatoriu din ntregul lot eantionat,
iar dimensiunile lor trebuie s fie aproximativ egale.
4.2.2. Nutreuri n vrac
Lotul eantionat se mparte n mod imaginar n mai multe pri aproximativ egale. n
mod aleator, se selecteaz un numr de pri corespunztor numrului de eantioane
elementare necesare, n conformitate cu litra A, punctul 3.2. din prezenta anex, i se
preleveaz cel puin un eantion din fiecare din aceste pri.
Dac este cazul, eantionarea poate fi efectuat atunci cnd lotul este n micare
(ncrcare sau descrcare).
4.2.3. Nutreuri ambalate
Dup selectarea pentru eantionare a numrului necesar de ambalaje, conform
indicaiilor de la litera A punctul 3.2. din prezenta anex, o parte a coninutului fiecrui
ambalaj se scoate folosind o sond sau o lopat. Dac este cazul, eantioanele se preleveaz
dup ce ambalajele au fost golite separat. Orice aglomerri se destram, dac este cazul prin
separarea lor de eantion, urmat de rencorporare n eantion, pentru fiecare eantion colectiv
n parte.
4.2.4. Nutreuri lichide sau semilichide, omogene sau omogenizabile
Dup selectarea pentru eantionare a numrului necesar de recipiente, n conformitate
cu indicaiile de la litera A punctul 3.2. din prezenta anex, coninutul lor se omogenizeaz,
dac este necesar, i se preleveaz o cantitate din fiecare recipient.
Eantioanele elementare pot fi prelevate la descrcarea coninutului.
4.2.5. Nutreuri lichide sau semilichide, neomogenizabile
Dup selectarea pentru eantionare a numrului necesar de containere, n conformitate
cu indicaiile de la litera A punctul 3.2. din prezenta anex, eantioanele se preleveaz de la
diferite niveluri.
Eantioanele se pot preleva i n timpul descrcrii coninutului, dar primele fraciuni
se ndeprteaz.
n oricare dintre cazuri, volumul total prelevat nu trebuie s fie mai mic de 10 litri.
4.2.6. Blocuri de nutreuri i brichete minerale
Dup selectarea pentru eantionare a numrului necesar de blocuri sau brichete,
conform indicaiilor de la litera A punctul 3.2. din prezenta anex, se preleveaz o parte din
fiecare bloc sau brichet.
4.2.7. n relaie cu controlul substanelor sau al produselor nedorite care ar putea fi
distribuite neuniform n masa de nutreuri, cum ar fi aflatoxinele, cornul-secarei, ricinul i
crotalaria din materiile prime pentru nutreuri
Lotul eantionat se mparte n mod imaginar n mai multe pri aproximativ egale,
corespunztoare numrului de eantioane colective prevzute la liera B punctul 3.3. din
prezenta anex. Dac acest numr este mai mare dect 1, numrul total de eantioane
elementare prevzute la litera B punctul 3.2. din prezenta anex se distribuie aproximativ egal
ntre diferitele pri.
n continuare se preleveaz eantioane cu mrimi aproximativ egale, iar pentru
nutreurile ambalate, o parte a coninutului ambalajelor de eantionat se preleveaz prin
utilizarea unei sonde sau a unei lopei, dup golirea separat a ambalajelor, dac este cazul,
astfel nct cantitatea total a eantioanelor provenite din fiecare parte s nu fie mai mic dect
cantitatea minim de 4 kg necesar pentru fiecare eantion colectiv.
Eantioanele elementare prelevate din diferite pri nu se consider colective.
4.3. Prepararea eantioanelor colective
4.3.1. n relaie cu controlul substanelor produselor cu distribuie uniform n masa de
nutreuri
Eantioanele elementare se amestec pentru a forma un singur eantion colectiv.
4.3.2. n relaie cu controlul substanelor sau produselor nedorite care ar putea fi
distribuite neuniform n masa de nutreuri, cum ar fi aflatoxinele, cornul-secarei, ricinul i
crotalaria din materii prime pentru nutreuri
Eantioanele elementare prelevate din fiecare parte a lotului eantionat se amestec i
se constituie numrul de eantioane colective prevzute la litera B punctul 3.3. din prezenta
anex, notnd proveniena fiecrui eantion colectiv.
4.4. Prepararea eantioanelor finale
Materialul din fiecare eantion colectiv se amestec cu grij pentru a se obine un
eantion omogenizat.
Orice aglomerri se destram (dac este cazul prin separarea lor de eantion urmat de
rencorporarea lor n eantion), pentru fiecare eantion colectiv n parte.
Dac este necesar, eantionul colectiv se reduce mai nti la cel puin 2 kg sau doi litri
(eantion redus), fie prin utilizarea unui separator mecanic sau automat, fie prin metoda
sferturilor.
Se prepar apoi cel puin trei eantioane finale avnd aproximativ aceeai cantitate, n
conformitate cu cerinele cantitative prevzute la litera A punctul 3.4. sau litera B punctul 3.4.
din prezenta anex.
Fiecare eantion se pune ntr-un recipient corespunztor. Se iau toate precauiile
necesare pentru evitarea oricrei modificri de compoziie a eantionului, a contaminrii sau a
falsificrii, care ar putea avea loc n timpul transportrii sau depozitrii.
4.5. Ambalarea eantioanelor finale
Recipientele sau ambalajele se sigileaz i se eticheteaz (eticheta complet se
ncorporeaz n sigiliu), astfel nct ele s nu poat fi deschise fr a deteriora sigiliul.
5. Procesul-verbal de prelevare i destinaia eantioanelor
Pentru fiecare eantionare se ntocmete un proces-verbal, care permite identificarea
lotului eantionat.
Pentru fiecare eantion colectiv se trimite, ct mai repede posibil, ctre laboratorul de
analize desemnat, cel puin un eantion final, mpreun cu informaiile necesare specialistului.
Anexa nr. 2
Metodele de preparare a eantioanelor pentru analiz i
exprimarea rezultatelor
1. Prepararea eantioanelor pentru analiz
1.1. Cerine generale
Procedurile descrise se refer la prepararea pentru examinarea eantioanelor finale,

trimise laboratoarelor de control desemnate dup eantionare, conform indicaiilor din anexa
nr. 1 la prezenta hotrre.
Prepararea acestor eantioane trebuie astfel efectuat nct cantitile prelevate, n
conformitate cu dispoziiile din metoda de analiz, s fie omogene i reprezentative pentru
eantioanele finale.
1.2. Msurile de precauie
Procedura de preparare a eantioanelor care trebuie urmat este dependent de metodele
de analiz utilizat i este de importan major a se asigura ca procedura de preparare a
eantioanelor urmat s fie adecvat metodei de analiz utilizate.
Toate operaiunile necesare se efectueaz astfel nct s se evite contaminarea
eantionului i modificarea compoziiei acestuia.
Mcinarea, amestecarea i cernerea se efectueaz ct mai repede posibil n condiiile
unei expuneri minime a eantionului la aer i la lumin. Nu se utilizeaz rnie sau aparate de
mcinat care ar putea cauza nclzirea semnificativ a eantionului.
Se recomand ca nutreurile foarte sensibile la cldur s fie mcinate manual. De
asemenea, aparatura folosit nu trebuie s constituie o surs de contaminare cu oligoelemente.
Dac prepararea nu poate fi efectuat fr modificri semnificative ale coninutului
umed al eantionului, se determin coninutul umed nainte i dup pregtire, n conformitate
cu metoda menionat n capitolul I din anexa nr. 3 la prezenta hotrre.
1.3. Procedura de preparare
Se divizeaz eantionul n subeantioane adecvate, n vederea analizrii i trimiterii, prin
utilizarea unor tehnici adecvate de separare, cum ar fi eantionarea alternativ cu ajutorul
lopeii sau eantionarea n condiii staionare sau rotative.
Formarea unui con i selectarea de sferturi nu este recomandat deoarece ar putea s se
formeze subeantioane care s dea natere la erori de separare mari.
Eantionul de trimis se pstreaz ntr-un recipient adecvat, curat i uscat, prevzut cu un
capac ermetic, iar subeantioanele de analizat, cu greutate de cel puin 100 g, se prepar n
modul indicat n subpunctele 1.3.1. 1.3.4. din prezenta anex.
1.3.1. Nutreuri care pot fi mcinate ca atare
Dac nu se specific altfel n metodele de analiz, se cerne ntregul eantion printr-o sit
cu orificii ptrate cu latura de 1 mm, dup mcinare, dac este cazul. Se evit mcinarea
exagerat.
Se amestec eantionul trecut prin sit i se pune ntr-un recipient adecvat, curat i uscat,
dotat cu un capac ermetic. Se amestec din nou, imediat nainte de a preleva eantionul pentru
analiz.
1.3.2. Nutreuri care pot fi mcinate dup uscare
Dac nu se specific altfel n metodele de analiz, eantionul se deshidrateaz astfel
nct umiditatea sa s se reduc la 8-12%, n conformitate cu procedura de preuscare, descris
n subpunctul 1.4.3. din metoda de determinare a umiditii, menionat n capitolul I din
anexa nr. 3.
n continuare se procedeaz astfel cum se indic n subpunctul 1.3.1 din prezenta anex.
1.3.3. Nutreuri lichide sau semilichide
Eantioanele se recolteaz ntr-un recipient adecvat, curat i uscat, dotat cu un capac
ermetic. Se amestec minuios, imediat nainte de prelevarea eantionului de analizat.
1.3.4. Alte nutreuri
Eantioanele care nu pot fi preparate conform unei proceduri indicate anterior se
trateaz prin orice alt procedur prin care se asigur c eantioanele prelevate n vederea
analizrii snt omogene i reprezentative pentru eantioanele finale.
1.4. Depozitarea eantioanelor
Eantioanele trebuie pstrate la o temperatur care s nu le altereze compoziia.

Eantioanele destinate analizrii prezenei vitaminelor sau substanelor foarte sensibile la
lumin se pstreaz n recipiente de sticl brun.
2. Cerinele fa de reactivi i aparatajul utilizat n metodele de analiz
2.1. Dac nu se specific altfel n metodele de analiz, toi reactivii destinai analizelor
trebuie s fie puri din punct de vedere analitic. Pentru analiza prezenei oligoelementelor,
puritatea reactivilor se controleaz printr-un test martor. n funcie de rezultatele obinute,
poate fi necesar o purificare suplimentar a reactivilor.
2.2. Pentru orice operaie care implic prepararea soluiilor, diluia, cltirea sau splarea,
menionate n metodele de analiz i pentru care nu exist indicaii referitoare la natura
solventului sau diluantului, se utilizeaz apa. Ca regul general, se utilizeaz ap
demineralizat sau distilat. n cazuri speciale, care snt indicate n metodele de analiz, apa
trebuie supus unor proceduri de purificare speciale.
Avnd n vedere dotarea uzual a laboratoarelor de control, n metodele de analiz se
menioneaz doar instrumentele i aparatura destinat pentru acest scop. Ele trebuie s fie
curate, n special n cazul determinrii unor cantiti foarte mici de substane.
3. Aplicarea metodelor de analiz i exprimarea rezultatelor
3.1. Procedura de extracie
O serie de metode determin o procedur de extracie specific. Ca regul general, se
pot aplica alte proceduri de extracie dect cea la care se face referire n metod, dac s-a
dovedit c procedura de extracie utilizat are, pentru matricea analizat, o eficien de
extracie echivalent cu procedura menionat n metod.
3.2. Procedura de purificare
O serie de metode determin o procedur de purificare specific. Ca regul general, se
pot aplica alte proceduri de purificare dect cea la care se face referire n metod, dac s-a
dovedit c procedura de purificare utilizat determin, pentru matricea analizat, rezultate
analitice echivalente cu procedura menionat n metod.
3.3. Raportarea metodei de analiz utilizate
n general, pentru determinarea fiecrei substane n nutreuri se stabilete o singur
metod de analiz. n cazul n care snt indicate mai multe metode, n buletinul de analiz se
specific metoda aplicat de laboratorul de control desemnat.
3.4. Numrul determinrilor
Rezultatul indicat n buletinul de analiz reprezint valoarea medie obinut n urma a
cel puin dou determinri, efectuate pe poriuni distincte ale eantionului, cu repetabilitate
satisfctoare.
Totui, n cazul analizelor de detectare a substanelor indezirabile, dac rezultatul primei
determinri este semnificativ (> 50 %) mai mic dect specificaia de control, nu snt necesare
alte determinri, cu condiia s fie aplicate procedurile calitative adecvate.
n cazul controlului privind coninutul declarat pentru o anumit substan sau un
anumit ingredient, dac rezultatul primei determinri confirm coninutul declarat, adic
rezultatul analizei se situeaz n interiorul intervalului de variaie acceptat, nu snt necesare
alte determinri, cu condiia s fie aplicate procedurile calitative adecvate.
3.5. Raportarea rezultatului analitic
Rezultatul analitic se exprim n maniera indicat n metoda de analiz, printr-un numr
adecvat de cifre semnificative i se ajusteaz, dac este cazul, la coninutul de umiditate al
eantionului final nainte de preparare.
3.6. Incertitudinea de msurare i rata de recuperare n cazul analizelor de
detectare a substanelor nedorite
n ceea ce privete substanele nedorite, inclusiv dioxina i policlorobifenil (PCB)
asemntori dioxinei, un produs destinat utilizrii n nutreuri se consider neconform n ceea
ce privete coninutul maxim acceptat, dac rezultatul analitic este considerat c depete
coninutul maxim, innd cont de incertitudinea de msurare extins i ajustarea pentru
recuperare. Pentru a evalua conformitatea, concentraia analizat se utilizeaz dup ce a fost
corectat pentru recuperare i dup deducerea incertitudinii de msurare extinse. Aceast
procedur este aplicabil doar n cazurile n care metoda de analiz permite estimarea
incertitudinii de msurare i ajustarea pentru recuperare (de exemplu, imposibil n cazul
analizelor la microscop).
Rezultatul analitic se raporteaz n modul urmtor (n msura n care metoda de analiz
utilizat permite estimarea incertitudinii de msurare i a ratei de recuperare):
a) ajustat pentru recuperare, nivelul de recuperare fiind indicat. Ajustarea pentru
recuperare nu este necesar n cazul n care rata de recuperare este ntre 90 i 110 %;
b) ca x +/ U, unde x este rezultatul analitic i U este incertitudinea de msurare
extins, folosind un factor de acoperire 2, care d un nivel de ncredere de aproximativ 95 %.
Dac rezultatul analizei este semnificativ (> 50 %) mai mic dect specificaia de control
i cu condiia ca procedurile calitative corespunztoare s fie aplicate i analiza s serveasc
doar verificrii conformitii cu prevederile legale, rezultatul analitic ar putea fi raportat fr
ajustare pentru recuperare, iar raportarea ratei de recuperare i a incertitudinii de msurare ar
putea fi omis n aceste cazuri.
Anexa nr. 3
Metodele de analiz privind controlul compoziiei materiilor
prime pentru nutreuri i a nutreurilor combinate
I. Determinarea umiditii
1.1. Obiectiv i domeniu de aplicare
Prezenta metod permite determinarea coninutului de umiditate al nutreurilor. n
cazul nutreurilor care conin substane volatile, cum snt acizii organici, este de notat c o dat
cu determinarea coninutului de umiditate se determin i cantiti semnificative de substane
volatile.
Metoda nu se aplic n cazul analizei produselor lactate utilizate ca materii prime
pentru nutreuri, analizei substanelor minerale i a mixturilor compuse n principal din
substane minerale, analizei grsimilor i uleiurilor de origine animal i vegetal sau analizei
seminelor i a fructelor oleaginoase.
1.2. Principiul de aplicare
Eantionul se deshidrateaz n condiii specificate, care variaz n funcie de natura
nutreurilor. Scderea greutii se determin prin cntrire. Este necesar s se efectueze o
uscare prealabil atunci cnd se analizeaz nutreuri solide cu coninut ridicat de umiditate.
1.3. Dispozitive
1.3.1. Moar construit dintr-un material care nu absoarbe umiditatea, uor de curat,
care permite o zdrobire rapid i uniform, fr a provoca o nclzire semnificativ, care evit
pe ct este posibil contactul cu aerul exterior i care corespunde cerinelor menionate la
subpunctele 1.4.1.1. i 1.4.1.2. din prezenta anex (de exemplu, micromori cu ciocane sau
rcite cu ap, mori conice pliabile sau mori cu mecanism lent sau cu discuri dinate).
1.3.2. Balan analitic, cu toleran de 1 mg.
1.3.3. Recipiente uscate din metal care nu se corodeaz sau din sticl cu capace
ermetice; suprafaa de lucru permite mprtierea eantionului pn la aproximativ 0,3 g/cm2.
1.3.4. Cuptor izoterm cu nclzire electric ( 2C), ventilat corespunztor i care
asigur o reglare rapid a temperaturii (1).
1.3.5. Cuptor vidat cu nclzire electric, reglabil, dotat cu o pomp de ulei i cu:
a) fie un mecanism de introducere a aerului fierbinte uscat;
b) fie un agent de desicare (de exemplu, oxid de calciu).
1.3.6. Desicator cu o plac din metal sau porelan, groas, perforat, coninnd un agent
de desicare eficient.
1.4. Procedura de analiz
Operaiile descrise n aceast seciune se efectueaz imediat dup deschiderea
ambalajelor care conin eantioanele. Analizele trebuie s fie efectuate cel puin n duplicat.
Pentru uscarea cerealelor, a finii fine, a trelor i a finii grunjoase, cuptorul trebuie
s aib o capacitate termic astfel nct, atunci cnd temperatura este prestabilit la 131C, va
reveni la temperatura respectiv n mai puin de 45 de minute dup ce n interior a fost plasat
un numr maxim de eantioane de testat, n vederea uscrii simultane. Ventilaia trebuie s fie
astfel nct, atunci cnd un numr ct mai mare de eantioane de gru comun pe care le poate
conine snt supuse uscrii timp de dou ore, rezultatele difer de cele obinute dup patru ore
de uscare cu mai puin de 0,15 %.
1.4.1. Metodele de preparare
1.4.1.1. Nutreuri care nu snt menionate la subpunctele 14.1.2. i 1.4.1.3.
Se preleveaz cel puin 50 g de eantion. Dac este necesar, se zdrobete sau se
divizeaz astfel nct s se evite orice variaie a coninutului de umiditate.
1.4.1.2. Cereale i tre
Se preleveaz cel puin 50 g de eantion. Se macin n particule din care cel puin 50%
trec printr-o sit cu orificii de 0,5 mm i care nu determin un reziduu mai mare de 10% n
cazul folosirii unei site cu orificii rotunde cu diametru de 1 mm.
1.4.1.3. Nutreuri lichide sau pstoase, nutreuri constituite n mod predominant din
uleiuri i grsimi
Se preleveaz aproximativ 25 g din eantion, se cntrete cu o abatere de 10 mg, se
adaug o cantitate adecvat de nisip anhidru cntrit cu o abatere de 10 mg i se amestec
pn la obinerea unui produs omogen.
1.4.2. Procedura de uscare
1.4.2.1. Nutreuri care nu snt menionate la subpunctele 1.4.1.2. i 1.4.1.3.
Se cntrete un recipient, conform descrierii de la subpunctul 1.3.3., mpreun cu
capacul su, cu o abatere de 1 mg. n recipientul respectiv se cntrete, cu o abatere de 1 mg,
o cantitate de 5 g de eantion i se mprtie uniform. Recipientul se introduce, fr capac, n
cuptorul nclzit n prealabil la 103C. Pentru a mpiedica scderea inadecvat a temperaturii
din cuptor, recipientul se introduce ct mai rapid posibil. Se las la uscat timp de patru ore,
calculate din momentul n care temperatura din cuptor revine la 103C. Se pune capacul pe
recipient, acesta din urm se scoate din cuptor, se las s se rceasc timp de 30-45 de minute
n desicator, conform descrierii de la subpunctul 1.3.6. i se cntrete cu o abatere de 1 mg.
n cazul nutreurilor constituite n mod predominant din uleiuri i grsimi, uscarea n
cuptor se prelungete cu 30 de minute, la 103C. Diferena ntre cele dou cntriri nu trebuie
s depeasc 0,1 % n umiditate.
1.4.2.2. Cereale, fin fin , tre i fin grunjoas
capacul su, cu o abatere de 0,5 mg. n recipientul respectiv se cntrete, cu o abatere de 1
mg, o cantitate de aproximativ 5 g de eantion mcinat i se mprtie uniform.
10
Recipientul se introduce, fr capac, n cuptorul nclzit n prealabil la 130C. Pentru a

mpiedica scderea inadecvat a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce ct mai rapid
posibil. Se las la uscat timp de dou ore, considerate din momentul n care temperatura din
cuptor revine la 130C. Se pune capacul pe recipient, acesta din urm se scoate din cuptor, se
las s se rceasc timp de 30-45 de minute n desicator, conform descrierii de la subpunctul
1.3.6. i se cntrete cu o abatere de 1 mg.
1.4.2.3. Nutreuri combinate care conin peste 4 % zaharoz sau lactoz: materii prime
pentru nutreuri precum seminele de rocove, produsele cerealiere hidrolizate, seminele de
mal, buci de sfecl uscat, solubilizate de pete i zaharuri, nutreuri combinate care conin
peste 25% sruri minerale care nglobeaz ap de cristalizare.
capacul su, cu o abatere de 0,5 mg. n recipientul respectiv se cntrete, cu o abatere de 1
mg, o cantitate de aproximativ 5 g de eantion i se mprtie uniform. Recipientul se
introduce, fr capac, n cuptorul vidat, conform descrierii de la subpunctul 1.3.5., nclzit n
prealabil la o temperatur cuprins ntre 80 i 85C. Pentru a mpiedica scderea inadecvat a
temperaturii din cuptor, recipientul se introduce ct mai rapid posibil.
Se aduce presiunea la 100 Torr i se las la uscat, la aceast presiune, timp de patru
ore, fie ntr-un curent de aer uscat i cald, fie cu ajutorul unui agent de desicare (aproximativ
300 g pentru 20 de eantioane). n al doilea caz, pompa de vid se deconecteaz dup ce se
obine presiunea recomandat. Durata de uscare se calculeaz din momentul n care
temperatura n cuptor revine la o valoare cuprins ntre 80 i 85C. Presiunea cuptorului se
readuce cu grij pn la nivelul presiunii atmosferice. Se deschide cuptorul, se aeaz imediat
capacul pe recipient, se scoate recipientul din cuptor, se las s se rceasc timp de 30-45 de
minute n desicator, conform descrierii de la subpunctul 1.3.6. i se cntrete cu o abatere de 1
mg. Uscarea n cuptorul vidat se prelungete cu nc 30 de minute la o temperatur cuprins
ntre 80 i 85C i se recntrete. Diferena ntre cele dou cntriri nu trebuie s depeasc
0,1 % n umiditate.
1.4.3. Uscarea prealabil
1.4.3.1. Nutreuri care nu snt menionate n subpunctul 1.4.3.2.
Nutreuri solide al cror coninut de umiditate este ridicat, fcnd dificil zdrobirea,
trebuie s fie supuse uscrii prealabile, dup cum urmeaz:
se cntresc, cu o abatere de 10 mg, 50 g de eantion nemcinat (dac este cazul,
nutreurile comprimate sau aglomerate pot fi divizate cu aproximaie) ntr-un recipient
corespunztor (de exemplu, un taler de aluminiu de 20 12 cm cu bordur de 0,5 cm). Se las
la uscat ntr-un cuptor la o temperatur cuprins ntre 60 i 70C, pn ce coninutul de
umiditate s-a redus la o valoare cuprins ntre 8 i 12%. Se scoate din cuptor, se las s se
rceasc, neacoperit, n laborator, timp de o or i se cntrete cu o abatere de 10 mg. Se
zdrobete imediat conform indicaiilor de la subpunctul 1.4.1.1. i se usuc conform
indicaiilor de la subpunctul 1.4.2.1. sau subpunctul 1.4.2.3, n funcie de natura nutreului.
1.4.3.2. Cereale
Grunele cu un coninut de umiditate mai mare de 17% trebuie s fie supuse uscrii
prealabile, dup cum urmeaz:
se cntresc, cu o abatere de 10 mg, 50 g de grune nemcinate ntr-un recipient
corespunztor (de exemplu, un taler de aluminiu de 20 12 cm cu bordur de 0,5 cm). Se las
la uscat ntr-un cuptor, timp de 5-7 minute, la o temperatur de 130C. Se scot din cuptor, se
las s se rceasc, neacoperit, n laborator, timp de dou ore i se cntresc cu o abatere de 10
mg. Se macin imediat conform indicaiilor de la subpunctul 1.4.1.2. i se usuc conform
indicaiilor de la subpunctul 1.4.2.2.
1.5. Calcularea rezultatelor
11
Coninutul de umiditate (X) al eantionului, n procente, se calculeaz prin utilizarea

formulelor urmtoare:
1.5.1. Uscare fr uscare prealabil
X = (mm 0 )/m 100,
unde:
m = greutatea iniial, n grame, a eantionului de testat;
m 0 = greutatea, n grame, a eantionului de testat uscat.
1.5.2. Uscare cu uscare prealabil
X p = [(m 2 m 0 ) m 1 / m 2 + mm 1 ] 100/m = 100 (1 m 1 m 0 /m m 2 ),
unde:
m = greutatea iniial, n grame, a eantionului de testat;
m 1 = greutatea, n grame, a eantionului de testat dup uscare prealabil;
m 2 = greutatea, n grame, a eantionului de testat dup zdrobire sau mcinare;
m 0 = greutatea, n grame, a eantionului de testat uscat.
1.5.3. Repetabilitatea
Diferena dintre rezultatele obinute n dou determinri paralele efectuate pe acelai
eantion nu depete 0,2 % din valoarea absolut pentru umiditate.
1.6. Observaii
Dac zdrobirea se dovedete a fi necesar i dac aceast aciune poate modifica
coninutul de umiditate al produsului, rezultatele analizei referitoare la componentele
nutreurilor trebuie ajustate n funcie de coninutul de umiditate al eantionului n starea lui
iniial.
II. Determinare umiditii din grsimile i uleiurile animale i vegetale
Prezenta metod permite determinarea coninutului n ap i substane volatile din
grsimile i uleiurile animale i vegetale.
Eantionul se usuc pn la atingerea greutii constante (pierderea de greutate ntre
dou cntriri succesive este mai mic sau egal cu 1 mg) la 103C. Pierderea de greutate se
determin prin cntrire.
2.3. Dispozitive
2.3.1. Vas cu fund plat, din material rezistent la coroziune, cu diametru de 8-9 cm i
adncime de aproximativ 3 cm.
2.3.2. Termometru cu bulb ntrit i cu tub de expansiune la captul superior, gradat de
la aproximativ 80C pn la cel puin 110C i lung de aproximativ 10 cm.
2.3.3. Cuv cu nisip sau plit.
2.3.4. Desicator, care conine un agent de uscare eficient.
2.3.5. Balan analitic.
Se cntresc, cu o abatere de 1 mg, aproximativ 20 g din eantionul omogenizat, n
recipientul uscat i cntrit, conform descrierii de la subpunctul 2.3.1., care conine un
termometru, conform descrierii de la subpunctul 2.3.2. Se nclzete pe cuva cu nisip sau pe
12
plit, conform descrierii de la subpunctul 2.3.3., se amestec continuu cu termometrul, astfel

nct temperatura s ajung la 90C n aproximativ 7 minute.
Se reduce intensitatea cldurii, urmrind frecvena cu care bulele se ridic de pe fundul
vasului. Temperatura nu trebuie s depeasc 105C. Se continu amestecarea, rzuind fundul
vasului, pn cnd bulele nceteaz s se mai formeze.
Pentru a asigura eliminarea complet a umiditii, se renclzete de cteva ori la 103
2C, rcind la 93C ntre nclziri succesive. n continuare se las s se rceasc la temperatura
camerei n desicator, conform descrierii de la subpunctul 1.3.4. i se cntrete. Se repet
aceast operaie pn cnd pierderea de greutate dintre dou nclziri succesive nu depete 2
mg.
O cretere a greutii eantionului dup nclzire repetat indic oxidarea grsimilor,
caz n care rezultatul se calculeaz prin cntrirea imediat nainte ca greutatea s nceap s
creasc.
Coninutul de umiditate (X), ca procentaj din eantion, este dat de urmtoarea formul:
X = (m 1 m 2 ) 100/m,
unde:
m = greutatea, n grame, a eantionului de testat;
m 1 = greutatea, n grame, a vasului mpreun cu coninutul su nainte de nclzire;
m 2 = greutatea, n grame, a vasului mpreun cu coninutul su dup nclzire.
Rezultatele mai mici de 0,05 % se nregistreaz ca fiind sub 0,05 %.
Repetabilitatea
Diferena de umiditate dintre rezultatele a dou determinri paralele efectuate pe
acelai eantion nu trebuie s depeasc 0,05 %, n valoare absolut.
III. Determinarea coninutului de proteine brute
Prezenta metod permite determinarea coninutului de proteine brute din nutreuri pe
baza coninutului de azot, determinat conform metodei Kjeldahl.
Eantionul se dizolv cu acid sulfuric n prezena unui catalizator. Soluia acid se
alcalinizeaz cu soluie de hidroxid de sodiu. Amoniacul se distileaz i se colecteaz ntr-o
cantitate msurat de acid sulfuric, al crei exces se titreaz cu o soluie etalon de hidroxid de
sodiu.
Ca alternativ, amoniacul eliberat se distileaz ntr-o soluie de acid boric n exces,
urmat de titrare cu o soluie de acid clorhidric sau acid sulfuric.
3.3. Reactivi utilizai
3.3.1. Sulfat de potasiu.
3.3.2. Catalizator: oxid de cupru (II) CuO sau sulfat de cupru (II) pentahidrat, CuSO 4
5H 2 O.
3.3.3. Zinc granulat.
3.3.4. Acid sulfuric, 20 = 1,84 g/ml.
3.3.5. Acid sulfuric, soluie volumetric standard, c(H 2 SO 4 ) = 0,25 mol/l.
3.3.8. Indicator rou de metil; se dizolv 300 mg de rou de metil n 100 ml de etanol,
= 95-96 % (v/v).
3.3.9. Soluie de hidroxid de sodiu (se poate utiliza soluie de calitate tehnic)
13
= 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.3.10. Hidroxid de sodiu, soluie volumetric standard, c(NaOH) = 0,25 mol/l.
3.3.11. Hidroxid de sodiu, soluie volumetric standard, c(NaOH) = 0,1 mol/l.
3.3.12. Piatr ponce granulat, splat n acid clorhidric i calcinat.
3.3.13. Acetanilid (m.p. = 114C, coninutul n N = 10,36 %).
3.3.14. Zaharoz (fr azot).
3.3.15. Acid boric (H 3 BO 3 ).
3.3.16. Soluie indicator de rou de metil: se dizolv 100 mg de rou de metil n 100 ml
de etanol sau metanol.
3.3.17. Soluie de verde de bromocrezol: se dizolv 100 mg de verde de bromocrezol n
100 ml de etanol sau metanol.
3.3.18. Soluie de acid boric (10-40 g/l, n funcie de aparatura utilizat).
Cnd se aplic detectarea prin colorimetrie a punctului final, indicatorii rou de metil i
bromocrezol trebuie adugai la soluiile de acid boric. Dac se prepar 1 litru de soluie de
acid boric, nainte de ajustarea de volum, se adaug 7 ml de soluie de indicator rou de metil,
conform descrierii de la subpunctul 3.3.16. i 10 ml de soluie verde de bromocrezol, conform
descrierii de la subpunctul 3.3.17.
n funcie de apa utilizat, pH-ul soluiei de acid boric difer de la lot la lot. Adesea
este necesar o ajustare cu ajutorul unui mic volum de substan alcalin pentru a obine un
martor pozitiv.
Adugarea a aproximativ 3-4 ml de NaOH, conform descrierii de la subpunctul 3.3.11.
n 1 litru de acid boric 10 g/l boric ofer, de obicei, ajustri bune. Soluia se pstreaz la
temperatura camerei i, pe durata pstrrii, se protejeaz de lumin i de surse de vapori de
amoniac.
3.3.19. Acid clorhidric, soluie volumetric standard, c(HCl) = 0,1 mol/l.
Dac n calcule se fac ajustrile necesare, se pot folosi alte concentraii de soluii
volumetrice, conform descrierii de la subpunctele 3.3.5., 3.3.6., 3.3.7., 3.3.10., 3.3.11. i
3.3.19. Concentraiile se exprim ntotdeauna cu patru zecimale.
3.4. Dispozitive
Aparatur adecvat pentru efectuarea dizolvrii, distilrii i titrrii conform procedurii
Kjeldahl.
3.5.1. Dizolvarea
Se cntrete 1 g de eantion cu o abatere de 0,001 g i se transfer eantionul n vasul
aparatului de dizolvare. Se adaug 15 g de sulfat de potasiu, conform descrierii de la
subpunctul 3.3.1., o cantitate adecvat de catalizator, conform descrierii de la subpunctul
3.3.2. [0,3-0,4 g oxid de cupru (II) sau 0,9-1,2 g sulfat de cupru (II) pentahidrat], 25 ml de acid
sulfuric, conform descrierii de la subpunctul 3.3.4. i, dac este necesar, cteva granule de
piatr ponce, conform descrierii de la subpunctul 3.3.12., apoi se amestec.
Se nclzete vasul, la nceput moderat, agitnd circular din cnd n cnd, dac este
cazul, pn ce materia s-a carbonizat i spuma a disprut; apoi se nclzete mai intens, pn
cnd lichidul fierbe constant. nclzirea este adecvat dac acidul aflat n fierbere se
condenseaz pe peretele vasului. Se previne supranclzirea marginilor i lipirea particulelor
organice de acestea.
Cnd soluia devine limpede i de culoare verde deschis, se continu fierberea timp de
nc dou ore, apoi se las s se rceasc.
3.5.2. Distilarea
Se adaug cu atenie ap suficient pentru a asigura dizolvarea complet a sulfailor. Se
las la rcit i apoi se adaug, dac este cazul, cteva granule de zinc, conform descrierii de la
14
subpunctul 3.3.3. Se procedeaz n conformitate cu cele descrise la subpunctul 3.5.2.1. sau

3.5.2.2.
3.5.2.1. Distilarea n acid sulfuric
n vasul de colectare al aparatului de distilare se introduce o cantitate de 25 ml de acid
sulfuric, conform descrierii de la subpunctul 3.3.5. sau 3.3.7., msurat cu exactitate, n funcie
de coninutul estimat de azot. Se adug cteva picturi de indicator rou de metil, conform
Se conecteaz vasul de dizolvare la condensatorul aparatului de distilare i se scufund
captul condensatorului n lichidul din vasul de colectare pn la o adncime de cel puin 1 cm
(a se vedea observaia de la subpunctul 3.8.3.). Se toarn ncet 100 ml de soluie de hidroxid
de sodiu, conform descrierii de la subpunctul 3.3.9. n vasul de dizolvare, fr pierderi de
amoniac (a se vedea observaia de la subpunctul 3.8.1.). Se nclzete vasul pn la distilarea
complet a amoniacului.
3.5.2.2. Distilarea n acid boric
n cazul n care titrarea amoniacului coninut n distilat se face manual, se aplic
procedura indicat n continuare.
n cazul n care unitatea de distilare este complet automatizat, inclusiv titrarea
amoniacului coninut n distilat, se urmeaz instruciunile de operare a unitii de distilare puse
la dispoziie de productor.
n cazul unei uniti de distilare semiautomate, adugarea hidroxidului de sodiu n
exces i distilarea n vapori se efectueaz automat.
Sub orificiul de evacuare al condensatorului se aeaz un vas de colectare care conine
25-30 ml de soluie de acid boric, conform descrierii de la subpunctul 3.3.18., astfel nct tubul
de evacuare se afl sub nivelul suprafeei soluiei de acid boric n exces. Se regleaz unitatea
de distilare astfel nct s elibereze 50 ml de soluie de hidroxid de sodiu, conform descrierii de
la subpunctul 3.3.9. Unitatea de distilare se opereaz n conformitate cu instruciunile
productorului, distilndu-se complet amoniacul eliberat prin adugarea de soluie de hidroxid
de sodiu. Distilatul se colecteaz n soluia de acid boric receptoare. Cantitatea de distilat
(timpul de distilare n vapori) depinde de cantitatea de azot din eantion. Se urmeaz
instruciunile productorului.
3.5.3. Titrarea
Se procedeaz ca n cazul descrierilor de la subpunctul 3.5.3.1. sau 3.5.3.2.
3.5.3.1. Acid sulfuric
Se titreaz excesul de acid sulfuric n vasul de colectare cu soluie de hidroxid de
sodiu, conform descrierii de la subpunctul 3.3.10. sau 3.3.11., n funcie de concentraia
acidului sulfuric utilizat, pn se atinge punctul final.
3.5.3.2. Acid boric
Cu ajutorul unei biurete se titreaz coninutul vasului de colectare cu soluie
volumetric standard de acid clorhidric, conform descrierii de la subpunctul 3.3.19. sau cu
soluie volumetric standard de acid sulfuric, conform descrierii de la subpunctul 3.3.6. i se
citete cantitatea de soluie de titrare utilizat.
Cnd se aplic detectarea colorimetric a punctului final, acesta este atins la prima
apariie n coninut a culorii roz. Citirea biuretei se estimeaz cu o abatere de 0,05 ml.
Vizualizarea punctului final poate fi facilitat de o plac de agitator magnetic iluminat sau de
un detector fotometric.
Aceasta poate fi efectuat automat prin utilizarea unui aparat de distilare cu vapori cu
titrare automat.
n cazul n care se utilizeaz un sistem automat de titrare, aceasta ncepe imediat dup
nceperea distilrii i se utilizeaz soluia de acid boric 1 %, conform descrierii de la
subpunctul 3.3.18.
15
Operarea specific a aparatului de distilare sau a celui de distilare/titrare se face

conform instruciunilor productorului.
n cazul n care se utilizeaz o unitate de distilare complet automat, titrarea automat a
amoniacului poate fi efectuat, de asemenea, prin detectarea punctului final cu ajutorul unui
sistem pH poteniometric.
n acest caz, se utilizeaz un aparat de titrare automat, cu pH-metru. pH-metrul se
calibreaz corespunztor n intervalul de pH 4-7, folosindu-se proceduri de laborator normale
de calibrare a pH-ului.
Punctul final al titrrii exprimat n pH este atins la valoarea de 4,6, reprezentnd
punctul cel mai de jos al curbei de titrare (punctul de inflexiune).
3.5.4. Testul martor
Pentru a confirma faptul c reactivii nu conin azot, se efectueaz un test martor
(dizolvare, distilare i titrare), folosind 1 g de zaharoz, n locul eantionului.
Calcularea se efectueaz n conformitate cu prevederile subpunctului 3.6.1. sau 3.6.2.
3.6.1. Calcularea titrrii n conformitate cu subpunctul 3.5.3.1.
Coninutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculeaz conform
urmtoarei formule:
(V 0 V 1 ) c 0,014 100 6,25 / m,
unde:
V 0 = volumul (ml) de NaOH (conform indicaiilor de la subpunctul 3.3.10. sau 3.3.11.)
folosit n testul martor;
V 1 = volumul (ml) de NaOH (conform indicaiilor de la subpunctul 3.3.10. sau 3.3.11.)
folosit n titrarea eantionului;
c = concentraia (mol/l) a hidroxidului de sodiu (conform indicaiilor de la subpunctul
3.3.10. sau 3.3.11.);
m = greutatea (g) a eantionului.
3.6.2. Calcularea titrrii n conformitate cu subpunctul 3.5.3.2.
3.6.2.1. Titrare cu acid clorhidric
urmtoarei formule:
(V 1 V 0 ) c 1,4 6,25/ m,
unde:
m = greutatea (g) a prii de testat;
c = concentraia (mol/l) a soluiei volumetrice standard de acid clorhidric, conform
indicaiilor de la subpunctul 3.3.19.;
V 0 = volumul (n ml) de acid clorhidric utilizat n testul martor;
V 1 = volumul (n ml) de acid clorhidric utilizat n partea de testat.
3.6.2.2. Titrare cu acid sulfuric
urmtoarei formule:
(V 1 V 0 ) c 2,8 6,25 / m,
unde:
m = greutatea (g) a prii de testat;
16
c = concentraia (mol/l) a soluiei volumetrice standard de acid sulfuric, conform

indicaiilor de la subpunctul 3.3.6.;
V 0 = volumul (n ml) de acid sulfuric, conform indicaiilor de la subpunctul 3.3.6.
utilizat n testul martor;
V 1 = volumul (n ml) de acid sulfuric, conform indicaiilor de la subpunctul 3.3.6.
utilizat n testul martor.
3.7. Verificarea metodei
Diferena dintre rezultatele a dou determinri paralele efectuate pe acelai eantion nu
trebuie s depeasc:
a) 0,2 % n valoare absolut, pentru un coninut de proteine brute mai mic de 20 %;
b) 1 % relativ la valoarea mai mare, pentru un coninut de proteine brute cuprins ntre
20 i 40 %;
c) 0,4 % n valoare absolut, pentru un coninut de proteine brute mai mare de 40 %.
3.7.2. Acurateea
Analiza (dizolvare, distilare i titrare) se efectueaz pe 1,5-2 g acetanilid, conform
indicaiilor de la subpunctul 3.3.13., n prezena a 1 g zaharoz, conform indicaiilor de la
subpunctul 3.3.14.; 1 g de acetanilid consum 14,8 ml de acid sulfuric. Recuperarea trebuie
s fie de cel puin 99 %.
3.8. Observaii
3.8.1. Aparatura poate fi de tip manual, semiautomat sau automat. Dac aparatura
necesit un transfer ntre etapele de dizolvare i distilare, acest transfer trebuie realizat fr
pierderi. Dac vasul aparatului de distilare nu este prevzut cu o plnie de picurare, se adaug
hidroxidul de sodiu imediat nainte de conectarea vasului la condensator, turnnd ncet lichidul
pe marginea vasului.
3.8.2. Dac produsul de dizolvare se solidific, se rencepe determinarea folosind o
cantitate mai mare de acid sulfuric, dect cele descrise n subpunctul 3.3.4., menionat
anterior.
3.8.3. Pentru produsele cu coninut sczut de azot, volumul de acidul sulfuric, descris
n subpunctul 3.3.7. care trebuie introdus n vasul de colectare poate fi redus, dac este cazul,
la 10 sau 15 ml i completat pn la 25 ml cu ap.
3.8.4. Pentru analizele curente, n vederea determinrii coninutului de proteine brute
se pot aplica metode alternative de analiz, dar metoda Kjeldahl descris n capitolul III al
prezentei anexe este metoda de referin. Echivalena dintre rezultatele obinute cu metoda
alternativ i cele obinute prin metoda de referin trebuie demonstrat pentru fiecare matrice
n mod individual. ntruct rezultatele obinute cu o metod alternativ, chiar i dup
verificarea echivalenei, pot devia uor fa de rezultatele obinute cu metoda de referin, este
necesar de a meniona n raportul analitic metoda de analiz utilizat pentru determinarea
coninutului de proteine brute.
IV. Determinarea ureei
Prezenta metod permite determinarea coninutului de uree din nutreuri.
Eantionul este pus n suspensie n ap, n care s-a adugat un produs de limpezire.
Suspensia se filtreaz.
17
Coninutul n uree al filtratului este determinat dup adugarea de 4

dimetilaminobenzaldehid (4-DMAB), prin msurarea densitii optice la o lungime de und
de 420 nm.
4.3.1. Soluie de 4-dimetilaminobenzaldehid: se dizolv 1,6 g de 4-DMAB n 100 ml
de etanol 96 % i se adaug 10 ml de acid clorhidric (20 1,19 g/ml). Acest reactiv se conserv
timp de maximum dou sptmni.
4.3.2. Soluie Carrez I: se dizolv 21,9 g de acetat de zinc, Zn(CH 3 COO) 2 2H 2 O i 3 g
de acid acetic glacial n ap. Se completeaz cu ap pn la 100 ml.
4.3.3. Soluie Carrez II: se dizolv 10,6 g de ferocianur de potasiu, K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O
n ap. Se completeaz cu ap pn la 100 ml.
4.3.4. Crbune activ care nu absoarbe ureea (de controlat).
4.3.5. Uree, soluie 0,1 % (greutate/volum).
4.4. Dispozitive
4.4.1. Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.
4.4.2. Eprubete: 160 16 mm cu dopuri de sticl lefuit.
4.4.3. Spectrofotometru.
4.5.1. Analiza eantionului
Se cntresc 2 g de eantion cu abatere de 1 mg i se introduc mpreun cu 1 g de
crbune activ, n conformitate cu specificaiile de la subpunctul 4.3.4., ntr-un balon gradat de
500 ml. Se adaug 400 ml de ap i 5 ml de soluie Carrez I, n conformitate cu specificaiile
de la subpunctul 4.3.2., se amestec timp de aproximativ 30 secunde i se adaug 5 ml de
soluie Carrez II, n conformitate cu specificaiile de la subpunctul 4.3.3. Se amestec timp de
treizeci de minute n agitator. Se completeaz volumul cu ap, se agit i se filtreaz.
Se ndeprteaz 5 ml de filtrat transparent i incolor, se introduc n eprubete cu dop de
sticl lefuit, se adaug 5 ml de soluie de 4-DMAB, n conformitate cu descrierile de la
subpunctul 4.3.1. i se amestec. Se introduc eprubetele ntr-o baie de ap la 20C ( 4C).
Dup cincisprezece minute se msoar densitatea optic a soluiei de eantion cu
spectrofotometrul la 420 nm. Se compar cu soluia de reactivi pentru testul martor.
4.5.2. Curba de calibrare
Se ndeprteaz volume de 1, 2, 4, 5 i 10 ml din soluia de uree, n conformitate cu
descrierile de la subpunctul 4.3.5., se introduc n baloanele gradate de 100 ml i se
completeaz volumul cu ap. Se ndeprteaz 5 ml din fiecare soluie, se adaug n fiecare 5
ml de soluie 4-DMAB, n conformitate cu descrierile de la subpunctul 4.3.1., se
omogenizeaz i se msoar densitatea optic la 420 nm cu o soluie martor care conine 5 ml
de 4-DMAB i 5 ml de ap n care nu exist uree. Se traseaz curba de calibrare.
Se determin cantitatea de uree din eantion cu ajutorul curbei de calibrare.
Se exprim rezultatul ca procent din eantion.
4.7. Observaii
4.7.1. n cazul unui coninut de uree care depete 3 %, se reduce greutatea
eantionului la 1 g sau se dilueaz soluia iniial astfel nct s nu fie mai mult de 50 mg de
uree n 500 ml.
4.7.2. n cazul unui coninut mic n uree, se crete greutatea eantionului att timp pn
cnd filtratul rmne transparent i incolor.
4.7.3. Dac eantionul conine compui de azot simpli, cum ar fi aminoacizii,
densitatea optic se msoar la 435 nm.
V. Determinarea bazelor azotate volatile
18
A. Prin microdifuzie
Prezenta metod permite determinarea coninutului de baze azotate volatile, exprimate
ca amoniac, din nutre.
Eantionul este supus extraciei cu ap, iar soluia este limpezit i filtrat. Bazele
azotate volatile snt dislocate prin microdifuzie cu ajutorul unei soluii de carbonat de potasiu,
colectate ntr-o soluie de acid boric i titrate cu acid sulfuric.
5.3.1. Acid tricloracetic, soluie 20 % (greutate/volum).
5.3.2. Indicator: se dizolv 33 mg de verde de bromocrezol i 65 mg de rou de metil n
100 ml de alcool etilic 95-96 % (v/v).
5.3.3. Soluie de acid boric: ntr-un balon gradat de 1 l se dizolv 10 g de acid boric n
200 ml de alcool etilic 95-96 % (v/v) i 700 ml de ap. Se adaug 10 ml de indicator, conform
descrierii de la subpunctul 5.3.2. Se amestec i, dac este necesar, se ajusteaz coloraia
soluiei la rou deschis prin adugarea unei soluii de hidroxid de sodiu. 1 ml din aceast
soluie permite fixarea a maximum 300 g de NH 3 .
5.3.4. Soluie saturat de carbonat de potasiu: se dizolv 100 g de carbonat de sodiu n
100 ml de ap la temperatura de fierbere. Se las s se rceasc i se filtreaz.
5.3.5. Acid sulfuric 0,01 mol/litru.
5.4. Dispozitive
5.4.1. Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.
5.4.2. Celule Conway, din sticl sau din material plastic.
5.4.3. Microbiurete gradate la 1/100 ml.
Se cntresc 10 g de eantion cu abatere de 1 mg i se introduc mpreun cu 100 ml de
ap ntr-un balon gradat de 200 ml. Se amestec sau se agit n agitator timp de 30 de minute.
Se adaug 50 ml de soluie de acid tricloracetic, conform specificaiilor de la subpunctul
5.3.1., se completeaz volumul cu ap, se agit cu putere i se filtreaz printr-un filtru cutat.
Cu ajutorul unei pipete se introduce 1 ml de soluie de acid boric, conform descrierii de
la subpunctul 5.3.3., n partea central a celulei Conway i 1 ml de filtrat de eantion n
coroana celulei. Se acoper parial cu ajutorul unui capac lubrifiat. Se picur cu rapiditate 1 ml
de soluie saturat de carbonat de potasiu, conform descrierii de la subpunctul 5.3.4., n
coroan i se nchide capacul astfel nct celula este ermetizat. Se ntoarce celula cu precauie,
rotind-o n plan orizontal, astfel nct cei doi reactivi se amestec. Se las la incubat fie timp de
cel puin patru ore la temperatura camerei, fie timp de o or la 40C.
Cu ajutorul unei microbiurete, conform specificaiilor de la subpunctul 5.4.3., se
titreaz bazele volatile din soluia de acid boric cu acid sulfuric, conform indicaiilor de la
subpunctul 5.3.5.
Se efectueaz un test martor aplicnd aceeai procedur, dar fr a analiza un eantion.
1 ml de H 2 SO 4 0,01 mol/litru corespunde la 0,34 mg de amoniac.
Repetabilitatea
eantion nu depete:
a) 10 %, n valoare relativ, pentru un coninut n amoniac mai mic de 1 %;
b) 0,1 %, n valoare absolut, pentru un coninut n amoniac de 1 % sau mai mare.
5.7. Observaii
19
Dac coninutul n amoniac al eantionului depete 0,6 %, se dilueaz filtratul iniial.

B. Prin distilare
Prezenta metod permite determinarea coninutului de baze azotate volatile, exprimate
ca amoniac, a finii din pete care practic nu conine deloc uree. Ea este aplicabil doar n
cazul unui coninut n amoniac mai mic de 0,25 %.
Eantionul este supus extraciei cu ap, iar soluia este limpezit i filtrat. Bazele
azotate volatile snt dislocate la punctul de fierbere prin adugare de oxid de magneziu i
colectate ntr-o cantitate determinat de acid sulfuric, al crui exces este retitrat cu o soluie de
hidroxid de sodiu.
5.3.2. Oxid de magneziu.
5.3.3. Emulsie antispumant (de exemplu, silicon).
5.3.4. Acid sulfuric 0,05 mol/litru.
5.3.5. Soluie de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru.
5.3.6. Soluie de rou de metil 0,3 % n etanol 95-96 % (v/v).
5.4. Dispozitive
5.4.1. Mixer (agitator): aproximativ 35-40 de rpm.
5.4.2. Aparat de distilat de tip Kjeldahl.
Se cntresc 10 g de eantion cu abatere de 1 mg i se introduc mpreun cu 100 ml de
ap ntr-un balon gradat de 200 ml. Se amestec sau se agit n agitator timp de 30 de minute.
Se adaug 50 ml de soluie de acid tricloracetic, conform indicaiilor de la subpunctul 5.3.1.,
se completeaz volumul cu ap, se agit cu putere i se filtreaz printr-un un filtru cutat.
Se preleveaz o cantitate de filtrat limpede adecvat pentru coninutul n baze azotate
volatile presupus (100 ml este de obicei suficient). Se dilueaz la 200 ml i se adaug 2 g de
oxid de magneziu, precum i cteva picturi de emulsie antispumant. Soluia trebuie s fie
alcalin la testul cu turnesol; dac nu este, se adaug oxid de magneziu. Se continu ca la
subpunctul 5.5.2. i 5.5.3. al metodei de analiz pentru determinarea coninutului de proteine
brute, descris n capitolul III al prezentei anexe.
Se efectueaz un test martor aplicnd aceeai procedur, dar fr a analiza un eantion.
1 ml de H 2 SO 4 0,05 mol/litru corespunde la 1,7 mg de amoniac.
Repetabilitatea
eantion nu depete, n valoare relativ, 10 % amoniac.
VI. Determinarea aminoacizilor (cu excepia triptofanului)
Prezenta metod permite determinarea aminoacizilor liberi (sintetici i naturali) i
totali (legai n peptide i liberi) din nutreuri, folosind un analizator de aminoacizi. Ea este
aplicabil urmtorilor aminoacizi: cist(e)in, metionin, lizin, treonin, alanin, arginin, acid
aspartic, acid glutamic, glicin, histidin, izoleucin, leucin, fenilalanin, prolin, serin,
tirozin i valin.
Metoda nu deosebete srurile aminoacizilor i nu permite diferenierea ntre formele
D i L ale aminoacizilor. Ea nu este valabil pentru determinarea triptofanului sau a analogilor
hidroxilai ai aminoacizilor.
20

6.2.1. Aminoacizi liberi
Aminoacizii liberi se extrag cu acid clorhidric diluat. Macromoleculele azotate
coextrase se precipit cu acid sulfosalicilic i se ndeprteaz prin filtrare. Soluia filtrat se
ajusteaz la pH-ul de 2,2. Aminoacizii se separ prin cromatografie cu schimb de ioni i se
determin prin reacie cu ninhidrin cu detecie fotometric la 570 nm.
6.2.2. Aminoacizi totali
Procedura aleas depinde de aminoacizii care snt analizai. Cist(e)ina i metionina
trebuie oxidate la acid cisteic i, respectiv, metionin sulfon nainte de hidroliz. Tirozina
trebuie determinat n hidrolizate de eantioane neoxidate. Toi ceilali aminoacizi enumerai
la punctul 6.1. se pot determina fie n eantionul oxidat, fie n eantionul neoxidat.
Oxidarea se realizeaz la 0C cu ajutorul unui amestec de acid performic i fenol.
Reactivul de oxidare n exces se descompune cu disulfit de sodiu. Eantionul oxidat sau
neoxidat se hidrolizeaz cu acid clorhidric, conform specificaiilor de la subpunctul 6.3.20.,
timp de 23 de ore. Hidrolizatul se ajusteaz la pH-ul de 2,2. Aminoacizii se separ prin
cromatografie cu schimb de ioni i se determin prin reacie cu ninhidrin folosind detecia
fotometric la 570 nm (440 nm pentru prolin).
Trebuie utilizat ap dublu distilat sau ap de calitate echivalent (conductivitate < 10
S).
6.3.1. Peroxid de hidrogen, g (g/g) = 30 %.
6.3.2. Acid formic, g (g/g) = 98-100 %.
6.3.3. Fenol.
6.3.4. Disulfit de sodiu.
6.3.5. Hidroxid de sodiu.
6.3.6. Acid 5-sulfosalicilic dihidrat.
6.3.7. Acid clorhidric, cu densitate de aproximativ 1,18 g/ml.
6.3.8. Citrat trisodic dihidrat.
6.3.9. 2,2'-tiodietanol (tiodiglicol).
6.3.10. Clorur de sodiu.
6.3.11. Ninhidrin.
6.3.12. Eter de petrol, interval de fierbere 40-60C.
6.3.13. Norleucin sau alt compus adecvat pentru a fi utilizat ca etalon intern.
6.3.14. Azot, gaz (< 10 ppm oxigen).
6.3.15. 1-octanol.
6.3.16. Aminoacizi.
6.3.16.1. Substane standard enumerate la punctul 6.1. Compui puri care nu conin
deloc ap de cristalizare. nainte de utilizare, se usuc n vid cu ajutorul P 2 O 5 sau al H 2 SO 4 ,
timp de 1 sptmn.
6.3.16.2. Acid cisteic.
6.3.16.3. Metionin sulfon.
6.3.17. Soluie de hidroxid de sodiu, c = 7,5 mol/l.
Se dizolv 300 g de NaOH n ap i se completeaz pn la 1 litru.
6.3.18. Soluie de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l
Se dizolv 40 g de NaOH n ap i se completeaz pn la 1 litru.
6.3.19. Soluie de acid formic-fenol:
Se amestec 889 g de acid formic cu 111 g de ap i se adaug 4,73 g de fenol.
21
6.3.20. Mixtur de hidroliz, c = 6 mol HCl/l coninnd 1 g de fenol/l:

Se adaug 1 g de fenol la 492 ml de HCl i se completeaz cu ap pn la 1 litru.
6.3.21. Mixtur de extracie, c = 0,1 mol HCl/l coninnd 2 % tiodiglicol: se iau 8,2 ml
de HCl, se dilueaz cu aproximativ 900 ml de ap, se adaug 20 ml de tiodiglicol i se
completeaz cu ap pn la 1 litru (nu se amestec direct acidul clorhidric i tiodiglicolul).
6.3.22. Acid 5-sulfosalicilic dihidrat, = 6 %:
se dizolv 60 g de acid 5-sulfosalicilic n ap i se completeaz cu ap pn la 1 litru.
6.3.23. Mixtur de oxidare (acid performic-fenol):
Se amestec 0,5 ml de peroxid de hidrogen cu 4,5 ml soluie de acid formic-fenol ntrun mic pahar de laborator. Se incubeaz la 20-30C timp de 1 or pentru a se forma acid
performic, apoi se rcete n baie de ap cu ghea (15 minute) nainte de a se aduga la
eantion.
Atenie: a se evita contactul cu pielea i a se purta mbrcminte protectoare.
6.3.24. Soluie tampon de citrat, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,2:
Se dizolv 19,61 g de citrat de sodiu, 5 ml de tiodiglicol, 1 g de fenol i 16,5 ml de
HCl, cu densitate de aproximativ 1,18 g/ml n aproximativ 800 ml de ap. Se ajusteaz pH-ul
la 2,2. Se completeaz cu ap pn la 1 litru.
6.3.25. Soluii tampon de eluie, preparate n conformitate cu condiiile pentru
analizorul utilizat n subpunctul 6.4.9.
6.3.26. Reactiv ninhidrin, preparat n conformitate cu condiiile pentru analizorul
utilizat n subpunctul 6.4.9.
6.3.27. Soluii etalon de aminoacizi. Aceste soluii se pstreaz la o temperatur sub
5C.
6.3.27.1. Soluie etalon stoc de aminoacizi, conform indicaiilor de la subpunctul
6.3.16.1.
c = 2,5 mol/ml pentru fiecare, n acid clorhidric.
Se pot obine din surse comerciale.
6.3.27.2. Soluie etalon stoc de acid cisteic i metionin sulfon, c = 1,25 mol/ml.
Se dizolv 0,2115 g de acid cisteic i 0,2265 g de metionin sulfon n soluie tampon
de citrat, conform specificaiilor de la subpunctul 6.3.24., ntr-un balon gradat de 1 litru i se
completeaz pn la semn cu soluie tampon de citrat. Se pstreaz la o temperatur sub 5C,
nu mai mult de 12 luni. Aceast soluie nu se utilizeaz dac soluia etalon stoc conine acid
cisteic i metionin sulfon.
6.3.27.3. Soluie etalon stoc de etalon intern, de exemplu, norleucin, c = 20 mol/ml.
Se dizolv 0,656 g de norleucin n soluie tampon de citrat ntr-un balon gradat i se
completeaz cu soluie tampon de citrat pn la 250 ml. Se pstreaz la o temperatur sub 5C,
nu mai mult de 6 luni.
6.3.27.4. Soluie de calibrare a aminoacizilor standard pentru utilizare cu hidrolizate, c
= 5 nmol/50 l de acid cisteic i metionin sulfon i c = 10 nmol/50 l din ceilali aminoacizi.
Se dizolv 2,2 g de clorur de sodiu ntr-un pahar de laborator de 100 ml care conine 30 ml
soluie tampon de citrat. Se adaug 4 ml de soluie etalon stoc de aminoacizi, 4 ml soluie
etalon stoc de acid cisteic i metionin sulfon i 0,5 ml soluie etalon stoc de etalon intern,
dac este cazul. Se ajusteaz pH-ul la valoarea 2,2 cu hidroxid de sodiu.
Se transfer cantitativ ntr-un balon gradat de 50 ml, se completeaz pn la semn cu
soluie tampon de citrat i se amestec.
Se pstreaz la o temperatur sub 5C, nu mai mult de 3 luni.
6.3.27.5. Soluie de calibrare a aminoacizilor standard pentru utilizare cu hidrolizate
preparat n conformitate cu subpunctul 6.5.3.3.1. i pentru utilizare cu extracte, conform
22
descrierilor de la subpunctul 6.5.2. Soluia de calibrare se prepar n conformitate cu

prevederile subpunctului 6.3.27.4. dar omind clorura de sodiu.
Se pstreaz la o temperatur sub 5C, nu mai mult de 3 luni.
6.4. Dispozitive
6.4.1. Balon cu fund rotund de 100 sau 250 ml dotat cu un condensator cu reflux.
6.4.2. Sticl din borosilicat, de 100 ml, cu un dop filetat cu cptueal de cauciuc/teflon
pentru utilizare n cuptor.
6.4.3. Cuptor cu ventilaie forat i un regulator de temperatur cu precizie mai mare
de 2C.
6.4.4. pH-metru (cu trei zecimale).
6.4.5. Filtru cu membran (0,22 m).
6.4.6. Centrifug.
6.4.7. Evaporator rotativ cu vid.
6.4.8. Agitator mecanic sau magnetic.
6.4.9. Analizor de aminoacizi sau echipament HPLC cu coloan schimbtoare de ioni,
dispozitiv pentru ninhidrin, derivare post-coloan i detector fotometric.
Coloana este umplut cu rini de polistiren sulfonat capabile s separe aminoacizii
unul de altul, precum i de materiale care conin ninhidrin. Fluxul din liniile cu soluie
tampon i ninhidrin este asigurat de pompe care au o stabilitate a fluxului de 0,5 % n
perioada care include att funcionarea n vederea calibrrii standardului, ct i analiza
eantionului.
n cazul unor analizori de aminoacizi se pot utiliza proceduri de hidrolizare n care
hidrolizatul are o concentraie de sodiu de c = 0,8 mol/l i conine ntreaga cantitate de acid
formic rezidual din etapa de oxidare.
Ali analizori nu ofer o separare satisfctoare a anumitor aminoacizi dac hidrolizatul
conine exces de acid formic i/sau concentraii mari de ioni de sodiu. n acest caz, volumul de
acid se reduce prin evaporare la aproximativ 5 ml dup hidroliz i nainte de ajustarea pHului. Evaporarea se face sub vid, la o temperatur maxim de 40C.
6.5.1. Prepararea eantionului
Se macin eantionul astfel nct poate trece printr-o sit cu ochiuri de 0,5 mm.
Eantioanele cu un coninut ridicat de umiditate trebuie fie uscate la aer, la o temperatur de
maximum 50C, fie liofilizate nainte de mcinare. Eantioanele cu un coninut ridicat de
substane grase se extrag cu eter de petrol nainte de mcinare.
6.5.2. Determinarea aminoacizilor liberi n nutreuri i n premixuri
Se cntrete cu o abatere de 0,2 mg o cantitate adecvat (1-5 g) din eantionul
preparat, conform prevederilor subpunctului 6.5.1., ntr-un flacon tip Erlenmeyer i se adaug
100 ml de extract de mixtur. Se agit mixtura timp de 60 minute cu ajutorul agitatorului
mecanic sau magnetic. Se las s se decanteze sedimentul i se pipeteaz 10 ml din soluia
supernatant ntr-un pahar de laborator de 100 ml.
Se adaug 5 ml de soluie de acid sulfosalicilic n cursul agitrii i se continu agitarea
cu ajutorul agitatorului magnetic timp de 5 minute. Se filtreaz sau se centrifugheaz
supernatantul pentru a se ndeprta orice precipitat. Se introduc 10 ml din soluia rezultat ntrun pahar de laborator de 100 ml i se ajusteaz pH-ul la valoarea de 2,2 cu ajutorul soluiei de
hidroxid de sodiu, se transfer ntr-un balon gradat de volum adecvat utilizndu-se soluie
tampon de citrat i se completeaz pn la semn cu soluia tampon.
Dac se utilizeaz etalon intern, se adaug 1 ml de etalon intern pentru fiecare 100 ml
de soluie final i se completeaz pn la semn cu soluie tampon.
Se trece la etapa de cromatografie conform prevederilor subpunctului 6.5.4.
23
Dac extractele nu se examineaz n aceeai zi, trebuie pstrate la o temperatur sub

5C.
6.5.3. Determinarea coninutului total n aminoacizi
6.5.3.1. Oxidare
Se cntresc cu o abatere de 0,2 mg ntre 0,1 i 1 g de eantion preparat, conform
prevederilor subpunctului 6.5.1. ntr-un (ntr-o):
a) balon cu fund rotund de 100 ml, conform specificaiilor de la subpunctul 6.4.1.,
pentru hidroliz n mediu deschis, potrivit descrierilor de la subpunctul 6.5.3.2.3.; sau
b) balon cu fund rotund de 250 ml, conform specificaiilor de la subpunctul 1.4.1., dac
este necesar o concentraie mic de sodiu, conform prevederilor subpunctului 6.5.3.3.1.; sau
c) sticl de 100 ml dotat cu un dop filetat, potrivit prevederilor subpunctului 6.4.2.
pentru hidroliz n mediu nchis, conform descrierilor de la subpunctul 6.5.3.2.4.
Poria de eantion cntrit are un coninut de azot de aproximativ 10 mg i un coninut
de umiditate de maximum 100 mg.
Se introduce balonul/sticla ntr-o baie de ap cu ghea i se rcete la 0C, se adaug 5
ml de mixtur de oxidare i se amestec cu ajutorul unei spatule de sticl cu vrf ncovoiat. Se
etaneizeaz balonul/sticla coninnd spatula cu ajutorul unei pelicule ermetizante, se introduce
baia de ap cu ghea coninnd recipientul etaneizat ntr-un frigider la 0C i se las timp de
16 ore. Dup 16 ore, se scoate din frigider, iar excesul de reactiv de oxidare se descompune
prin adugarea a 0,84 g de disulfit de sodiu.
Se trece la procedura specificat n subpunctul 6.5.3.2.1.
6.5.3.2. Hidroliza
6.5.3.2.1. Hidroliza eantioanelor oxidate
La eantioanele oxidate preparate n conformitate cu subpunctul 6.5.3.1. se adaug 25
ml de mixtur hidrolizat avnd grij s se spele orice reziduu de eantion de pe pereii vasului
i de pe spatul.
n funcie de procedura de hidrolizare utilizat, se trece la metoda descris n
subpunctul 6.5.3.2.3. sau 6.5.3.2.4.
6.5.3.2.2. Hidroliza eantioanelor neoxidate
Se cntresc 0,1-1 g de eantion preparat, cu o abatere de 0,2 mg, fie ntr-un balon cu
fund rotund de 100 ml sau 250 ml, fie ntr-o sticl de 100 ml dotat cu dop filetat. Poria de
eantion cntrit trebuie s aib un coninut de azot de aproximativ 10 mg. Se adaug cu grij
25 ml de mixtur hidrolizat i se amestec cu eantionul. Se procedeaz conform descrierilor
de la subpunctul 6.5.3.2.3. sau 6.5.3.2.4.
6.5.3.2.3. Hidroliza n mediu deschis
Se adaug 3 mrgele de sticl n mixtura din balon (preparat conform meniunilor de
la subpunctul 6.5.3.2.1. sau 6.5.3.2.2.) i se fierbe n clocot continuu sub reflux timp de 23 de
ore. La ncheierea hidrolizei, se spal condensatorul cu 5 ml de soluie tampon de citrat. Se
deconecteaz balonul i se rcete ntr-o baie de ap cu ghea.
Se procedeaz conform prevederilor descrise n subpunctul 6.5.3.3.
6.5.3.2.4. Hidroliza n mediu nchis
Sticla coninnd mixtura preparat conform prevederilor subpunctului 6.5.3.2.1. sau
6.5.3.2.2. se introduce n cuptor, conform specificaiilor de la subpunctul 6.4.3., la 110C.
n timpul primei ore, pentru a se preveni o cretere progresiv a presiunii (datorat
expansiunii substanelor gazoase) i pentru a se evita o explozie, se plaseaz dopul filetat la
nivelul extremitii superioare a vasului. A nu se nchide vasul cu dopul respectiv. Dup o or,
se nchide vasul cu dopul respectiv i se las n cuptor, conform specificaiilor de la
subpunctul 6.4.3, timp de 23 de ore. La ncheierea hidrolizei, se ndeprteaz sticla din cuptor,
se scoate cu grij dopul de la nivelul sticlei, iar aceasta se introduce ntr-o baie de ap cu
ghea. Se las s se rceasc.
24
n funcie de procedura de ajustare a pH-ului, se transfer cantitativ coninutul sticlei

ntr-un pahar de laborator de 250 de ml sau ntr-un balon cu fund rotund, utiliznd soluie
tampon de citrat.
Se procedeaz conform prevederilor descrise n subpunctul 6.5.3.3.
6.5.3.3. Ajustarea pH-ului
n funcie de tolerana la sodiu a analizorului de aminoacizi, pentru ajustarea pH-ului
se procedeaz conform metodei descrise n subpunctul 6.5.3.3.1. sau 6.5.3.3.2.
6.5.3.3.1. Pentru sistemele cromatografice analizorul de aminoacizi necesitnd o
concentraie de sodiu mic
Este recomandabil s se utilizeze o soluie etalon stoc intern n cazul n care se
folosesc analizori de aminoacizi necesitnd o concentraie mic de sodiu (n cazul n care
volumul de acid trebuie redus).
n acest caz, la hidrolizat se adaug 2 ml de soluie etalon stoc intern nainte de
evaporare.
La hidrolizatul obinut conform prevederilor subpunctului 6.5.3.2.3. sau 6.5.2.3.4. se
adaug 2 picturi de 1-octanol.
Utiliznd un evaporator rotativ se reduce volumul la 5-10 ml n condiii de vid la 40C.
Dac volumul este redus accidental la mai puin de 5 ml, hidrolizatul trebuie aruncat, iar
analiza trebuie repetat.
Se ajusteaz pH-ul la 2,2 cu ajutorul soluiei de hidroxid de sodiu i se procedeaz n
conformitate cu descrierea de la subpunctul 6.5.3.4.
6.5.3.3.2. Pentru toi ceilali analizori de aminoacizi
Hidrolizatele obinute ca la subpunctul 6.5.3.2.3. sau 6.5.3.2.4. se neutralizeaz parial
prin adugarea cu grij, n condiii de agitare continu, a 17 ml de soluie de hidroxid de sodiu,
asigurndu-se c temperatura este meninut sub 40C.
Se ajusteaz pH-ul la valoarea de 2,2 la temperatura camerei prin utilizarea soluiei de
hidroxid de sodiu, potrivit prevederilor subpunctului 6.3.17. i n cele din urm a soluiei de
hidroxid de sodiu, potrivit prevederilor subpunctului 6.3.18. Se trece la subpunctul 6.5.3.4.
6.5.3.4. Soluia de eantion pentru cromatografie
Se transfer cantitativ hidrolizatul cu pH ajustat, potrivit prevederilor subpunctului
6.5.3.3.1. sau 6.5.3.3.2., cu soluie tampon de citrat ntr-un balon gradat de 200 ml i se
completeaz pn la semn cu soluie tampon.
Dac nu s-a utilizat deja un etalon intern, se adaug 2 ml de etalon intern i se
completeaz pn la semn cu soluie tampon de citrat. Se amestec minuios.
Se trece la etapa cromatografic, conform prevederilor descrise n subpunctul 6.5.4.
Dac soluiile de eantion nu se examineaz n aceeai zi, ele se pstreaz la o
temperatur sub 5C.
6.5.4. Cromatografia
nainte de cromatografie se aduce extractul, descris n subpunctul 6.5.2. sau
hidrolizatul, specificat n subpunctul 6.5.3.4. la temperatura camerei. Se agit mixtura i se
filtreaz o cantitate potrivit printr-un filtru cu membran cu orificii de 0,22 m. Soluia
limpede rezultat se supune cromatografiei prin schimb ionic, utiliznd un analizor de
aminoacizi.
Injectarea poate fi efectuat manual sau automat. Este important ca aceeai cantitate de
soluie 0,5 % s fie adugat n coloan pentru analizarea etaloanelor i a eantioanelor cu
excepia situaiilor n care se utilizeaz un etalon intern i ca raporturile sodiu:aminoacizi n
soluiile de etalon i n cele de eantion s fie ct mai similare posibil.
n general, frecvena manevrelor de calibrare depinde de stabilitatea reactivului
ninhidrin i a sistemului analitic.
25
Etalonul sau eantionul se dilueaz cu soluie tampon de citrat pentru a genera o arie a
vrfului pentru etalon de 30-200% din aria vrfului pentru eantionul de aminoacid.
Cromatografia aminoacizilor va varia uor n funcie de tipul analizorului i de rina
utilizate. Sistemul ales trebuie s fie capabil s separe aminoacizii unul de altul, precum i de
materiale care conin ninhidrin. n cursul operaiilor, sistemul cromatografic genereaz un
rspuns linear la modificrile cantitilor de aminoacizi adugai la coloan.
n cursul etapei cromatografice se aplic rapoartele nlimii corespunztoare punctului
minim:vrfului menionate n continuare, n cazul n care se analizeaz o soluie echimolar
(de aminoacizi analizai). Aceast soluie echimolar trebuie s conin cel puin 30 % din
cantitatea maxim de aminoacizi care poate fi msurat cu precizie cu ajutorul sistemului
analizor de aminoacizi.
Pentru separarea treoninei-serinei, n cazul suprapunerii a doi aminoacizi, raportul
punct minim/vrf corespunztor aminoacidului situat mai jos pe cromatogram nu trebuie s
depeasc 2:10.
Dac se determin doar cist(e)ina, metionina, treonina i lizina, separarea insuficient a
vrfurilor nvecinate va influena n mod negativ determinarea.
Pentru toi ceilali aminoacizi, separarea trebuie s fie mai bun de 1:10.
Sistemul trebuie s asigure c lizina se separ de artefactele de lizin i de ornitin.
Aria vrfului pentru eantion i etalon se msoar pentru fiecare aminoacid n parte, iar
cantitatea (X) se msoar n g de aminoacid per kg de eantion.
X = A c M V / B m 1 000,
Dac se utilizeaz un etalon intern se multiplic cu: D/C
A = aria vrfului, hidrolizat sau extract;
B = aria vrfului, soluia etalon de calibrare;
C = aria vrfului, etalon intern n hidrolizat sau extract;
D = aria vrfului, etalon intern, soluia etalon de calibrare;
M = greutatea molar a aminoacidului determinat;
c = concentraia de standard n mol/ml;
m = greutatea eantionului (g) (corectat pentru a obine greutatea original
dac produsul este uscat sau degresat);
V = total hidrolizat n ml, potrivit prevederilor specificate n subpunctul 6.5.3.4.
sau volumul de diluie total calculat pentru extract, n ml, potrivit
prevederilor specificate n subpunctul 6.6.1.
Cistina i cisteina se determin amndou ca acid cisteic n hidrolizate de eantion
oxidat, dar se calculeaz ca cistin (C 6 H 12 N 2 O 4 S 2 , M 240,30 g/mol) folosind M 120,15 g/mol
(= 0,5 240,30 g/mol).
Metionina se determin ca metionin sulfon n hidrolizate de eantion oxidat, dar se
calculeaz ca metionin folosind M pentru metionin: 149,21 g/mol.
Metionina liber adugat se determin dup extracie ca metionin, pentru calculare
folosindu-se aceeai M.
6.6.1. Volumul total de diluie al extractelor (F) pentru determinarea aminoacizilor
liberi, potrivit prevederilor subpunctului 6.5.2., se calculeaz dup cum urmeaz:
F = 100 ml (10 ml + 5 ml) /10 ml V/10,
26
unde:
V = volumul extractului final.
6.7. Observaii
6.7.1. Din cauza diferenelor dintre analizorii de aminoacizi, concentraiile finale ale
soluiilor de calibrare pentru aminoacizii standard, menionate n subpunctele 6.3.27.4. i
6.3.27.5. i pentru hidrolizat, descris n subpunctul 6.5.3.4., se consider orientative.
Intervalul rspunsului liniar al aparatului trebuie verificat pentru toi aminoacizii.
Soluia etalon se dilueaz cu soluie tampon de citrat pentru a genera arii de vrf situate
la mijlocul intervalului.
6.7.2. n cazul n care pentru analizarea hidrolizatelor se folosete aparatur de
cromatografie lichid de nalt performan, condiiile experimentale trebuie optimizate n
conformitate cu recomandrile productorului.
6.7.3. Prin aplicarea metodei la nutreurile care conin peste 1% clorur (concentrat,
nutreuri minerale, nutreuri suplimentare) poate aprea o subestimare a metioninei, ceea ce
necesit un tratament special.
VII. Determinarea triptofanului
Metoda permite determinarea n nutreuri a triptofanului total i liber. Ea nu face
distincie ntre formele D i L.
Pentru determinarea triptofanului total, eantionul se hidrolizeaz n mediu bazic cu o
soluie de hidroxid de bariu saturat i se nclzete la 110C timp de 20 de ore. Dup
hidroliz, se adaug etalon intern.
Pentru determinarea triptofanului liber, eantionul se extrage n mediu uor acid n
prezena etalonului intern.
Triptofanul i etalonul intern din hidrolizat sau din extract se determin prin HPLC
prin detectarea fluorescenei.
7.3.1. Se utilizeaz ap dublu distilat sau ap de calitate echivalent (conductivitate <
10 S/cm).
7.3.2. Substan etalon: triptofan (puritate/coninut 99 %), uscat sub vid pe pentoxid
fosforic.
7.3.3. Substan etalon intern: -metil-triptofan (puritate/coninut 99 %), uscat sub
vid pe pentoxid fosforic.
7.3.4. Hidroxid de bariu octahidratat (se evit expunerea excesiv la aer a Ba(OH) 2 8
H 2 O pentru a se evita formarea de BaCO 3 , care ar putea perturba determinarea) (a se vedea
meniunea de la subpunctul 7.8.3.).
7.3.5. Hidroxid de sodiu.
7.3.6. Acid ortofosforic, g (g/g) = 85 %.
7.3.7. Acid clorhidric, 20 1,19 g/ml.
7.3.8. Metanol, de calitate HPLC.
7.3.9. Eter de petrol, interval de fierbere 40-60 C.
7.3.10. Soluie de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l:
Se dizolv 40 g de NaOH n ap i se completeaz pn la 1 litru cu ap, conform
7.3.11. Acid clorhidric, c = 6 mol/l:
27
Se iau 492 ml HCl, menionat n subpunctul 7.3.7. i se completeaz pn la 1 litru cu

ap.
7.3.12. Acid clorhidric, c = 1 mol/l:
Se iau 82 ml HCl, menionat n subpunctul 7.3.7. i se completeaz pn la 1 litru cu
ap.
7.3.13. Acid clorhidric, c = 0,1 mol/l:
Se iau 8,2 ml HCl, menionat n subpunctul 7.3.7. i se completeaz pn la 1 litru cu
ap.
7.3.14. Acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l:
Se iau 34 ml de acid ortofosforic, specificat n subpunctul 7.3.6. i se completeaz pn
la 1 litru cu ap, conform descrierii de la subpunctul 7.3.1.
7.3.15. Soluie concentrat de triptofan, menionat n subpunctul 1.3.2., c = 2,50
mol/ml:
ntr-un balon gradat de 500 ml se dizolv 0,2553 g de triptofan (a se vedea meniunea
de la subpunctul 1.3.2) n acid clorhidric, descris n subpunctul 7.3.13. i se completeaz pn
la semn cu acid clorhidric (se vedea meniunea de la subpunctul 7.3.13.). Se pstreaz la
18C timp de maximum 4 sptmni.
7.3.16. Soluie de etalon intern concentrat, c = 2,50 mol/ml:
ntr-un balon gradat de 500 ml se dizolv 0,2728 g de -metil-triptofan (a se vedea
meniunea de la subpunctul 7.3.3) n acid clorhidric, descris n subpunctul 7.3.13. i se
completeaz pn la semn cu acid clorhidric (a se vedea meniunea de la subpunctul 7.3.13.).
Se pstreaz la 18C timp de maximum 4 sptmni.
7.3.17. Soluie etalon de calibrare pentru triptofan i etalon intern:
Se iau 2 ml din soluia concentrat de triptofan, descris n subpunctul 7.3.15., i 2 ml
din soluia concentrat de etalon intern (-metil-triptofan), indicat n subpunctul 1.3.16. Se
dilueaz cu ap, conform descrierii de la subpunctul 7.3.1. i metanol (a se vedea meniunea de
la subpunctul 7.3.8.) pn se ajunge la un volum aproximativ egal i la aproximativ aceeai
concentraie de metanol (10-30 %) ca i hidrolizatul final.
Aceast soluie trebuie proaspt preparat nainte de fiecare utilizare.
n timpul preparrii se protejeaz de lumina solar direct.
7.3.18. Acid acetic.
7.3.19. 1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol.
7.3.20. Etanolamin g (g/g) > 98 %.
7.3.21. 1 g de soluie de 1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol n 100 ml de metanol.
7.3.22. Faz mobil pentru HPLC: 3 g de acid acetic + 900 ml ap, conform descrierii
de la subpunctul 1.3.1. + 50 ml soluie (a se vedea meniunea de la subpunctul 1.3.21.) de
1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol n metanol (1 g/100 ml). Se ajusteaz pH-ul la valoarea 5 cu
ajutorul etanolaminei, indicat n subpunctul 7.3.20. Se completeaz pn la 1 000 ml cu ap,
conform descrierii de la subpunctul 7.3.1.
7.4. Dispozitive
7.4.1. Echipament de HPLC cu detector spectrofluorometric.
7.4.2. Coloan pentru cromatografie lichid, 125 mm 4 mm, C 18 , particule de 3 m
sau echivalent.
7.4.3. pH-metru.
7.4.4. Vas de polipropilen, cu capacitate de 125 ml, cu gt larg i dop filetat.
7.4.5. Filtru cu membran, 0,45 m.
7.4.6. Autoclav, 110 ( 2) C, 1,4 ( 0,1) bar.
7.4.7. Agitator mecanic sau amestector magnetic.
7.4.8. Mixer Vortex.
28
7.5.1. Prepararea eantioanelor

Eantionul se macin astfel nct acesta poate trece printr-o sit cu ochiuri de 0,5 mm.
nainte de mcinare, eantioanele cu un coninut ridicat de umiditate trebuie fie uscate la aer la
o temperatur de maximum 50C, fie liofilizate.
nainte de mcinare, eantioanele cu un coninut ridicat de substane grase se extrag cu
eter de petrol, conform indicaiilor de la subpunctul 7.3.9.
7.5.2. Determinarea triptofanului liber (extract)
Se cntrete cu o abatere de 1 mg o cantitate adecvat (1-5 g) din eantionul preparat,
conform descrierii de la subpunctul 7.5.1., ntr-un flacon tip Erlenmeyer. Se adaug 100 ml de
acid clorhidric (a se vedea meniunea de la subpunctul 7.3.13.) i 5 ml din soluia etalon intern
concentrat. Se agit sau se amestec timp de 60 minute cu ajutorul unui agitator mecanic sau
al unui amestector magnetic. Se las s se decanteze sedimentul i se pipeteaz 10 ml din
soluia supernatant ntr-un pahar de laborator. Se adaug 5 ml de acid ortofosforic. Se
ajusteaz pH-ul la valoarea 3 utiliznd hidroxid de sodiu. Se adaug suficient metanol pentru a
obine o concentraie de metanol n volumul final de 10-30 %. Se transfer ntr-un balon
gradat de volum corespunztor i se dilueaz cu ap pn la un volum necesar pentru
cromatografie (aproximativ acelai volum ca i soluia etalon de calibrare, conform indicaiilor
de la subpunctul 7.3.17.).
Se filtreaz cteva ml de soluie printr-un filtru cu membran cu orificii de 0,45 m
nainte de a se injecta n coloana de HPLC. Se trece la etapa de cromatografie conform
descrierilor de la subpunctul 7.5.4.
Soluia etalon i extractele se protejeaz de lumina solar direct. Dac analizarea
extractelor nu este posibil n aceeai zi, ele pot fi depozitate la 5C, cel mult 3 zile.
7.5.3. Determinarea triptofanului total (hidrolizat)
Se cntresc cu o abatere de 0,2 mg ntre 0,1 i 1 g din eantionul preparat, conform
prevederilor subpunctului 7.5.1., ntr-un vas de polipropilen (a se vedea meniunea de la
subpunctul 7.4.4.). Poria de eantion cntrit are un coninut de azot de aproximativ 10 mg. Se
adaug 8,4 g de hidroxid de bariu octahidrat i 10 ml de ap. Se amestec ntr-un mixer Vortex
sau ntr-un amestector magnetic. Magnetul nvelit n teflon se las n amestec. Se spal pereii
vasului cu 4 ml de ap. Se pune dopul filetat i se nchide vasul neermetic. Se transfer ntr-o
autoclav (a se vedea meniunea de la subpunctul 7.4.6.) cu ap clocotit i se expun la vapori
de ap timp de 30-60 minute. Se nchide autoclava i se autoclaveaz la 110 ( 2)C timp de
20 de ore.
nainte de a deschide autoclava se reduce temperatura la o valoare imediat sub 100C.
Pentru a se evita cristalizarea Ba(OH) 2 8H 2 O, se adaug la amestecul cald 30 ml ap la
temperatura camerei. Se agit sau se amestec uor. Se adaug 2 ml din soluia concentrat de
etalon intern (-metil-triptofan), conform specificaiilor de la subpunctul 7.3.16. Se rcesc
vasele ntr-o baie de ap/ghea timp de 15 minute.
Apoi, se adaug 5 ml de acid ortofosforic. Se menine vasul n baia de rcire i se
neutralizeaz cu HCl (a se vedea meniunea de la subpunctul 7.3.11.) amestecnd continuu,
apoi se ajusteaz pH-ul la valoarea 3 utiliznd HCl, conform prevederilor subpunctului 7.3.12.
Se adaug suficient metanol pentru a obine o concentraie de metanol n volumul final de 1030 %. Se transfer ntr-un balon gradat de volum corespunztor i se dilueaz cu ap pn la
volumul definit necesar pentru cromatografie (de exemplu 100 ml). Adugarea de metanol nu
provoac precipitare.
Se filtreaz civa ml de soluie printr-un filtru cu membran cu orificii de 0,45 m
nainte de a se injecta n coloana HPLC. Se trece la etapa de cromatografie, conform
prevederilor descrise n subpunctul 7.5.4.
Soluia etalon i hidrolizatele se protejeaz de lumina solar direct. Dac analizarea
hidrolizatelor nu este posibil n aceeai zi, ele pot fi depozitate la 5C, cel mult 3 zile.
29
7.5.4. Determinarea prin HPLC

Urmtoarele condiii pentru eluia izocratic snt oferite n scop orientativ; se pot aplica
alte condiii cu condiia ca acestea s determine rezultate echivalente (a se vedea, de
asemenea, observaiile de la subpunctele 7.8.1. i 7.8.2.), conform indicaiilor din tabelul nr. 1.
Tabelul nr. 1
Condiiile pentru obinerea eluiei izocratice
Tehnica de msurare
Coloana pentru cromatografie lichid,
conform specificaiilor de la subpunctul 7.4.2.
Temperatura coloanei
Faza mobil (a se vedea meniunea de la
subpunctul 7.3.22.)
Rata fluxului
Valorile indicate
125 mm 4 mm, C 18 , particule de 3 m sau
echivalent
temperatura camerei
3 g acetic acid (7.3.18.) + 900 ml ap (7.3.1.)
+ 50 ml soluie (7.3.21.) de 1,1,1-triclor-2metil-2-propanol n metanol (1 g/100 ml). Se
ajusteaz pH-ul la valoarea 5 utiliznd
etanolamin. Se completeaz pn la 1 000 ml
cu ap, conform descrierii de la subpunctul
7.3.1
1 ml/minut
Timpul total de desfurare

Lungimea undei de detecie
Volumul de injectare
aproximativ 34 min
excitare: 280 nm, emisie: 356 nm
20 l

Se calculeaz cantitatea de triptofan (X), n g per 100 g de eantion.
X = A B V 1 c V 2 M / C D V 3 10 000 m,
unde:
A = aria vrfului etalonului intern, soluia etalon de calibrare (a se vedea meniunea de
la subpunctul 7.3.17.);
B = suprafaa vrfului pentru triptofan, extract, conform prevederilor subpunctului
7.5.2. sau hidrolizat, conform prevederilor subpunctului 7.5.3.;
V 1 = volumul n ml (2 ml) al soluiei concentrate de triptofan adugat la soluia de
calibrare (a se vedea meniunea de la subpunctul 7.3.17.);
c = concentraia n mol/ml (= 2,50) a soluiei concentrate de triptofan adugat la
soluia de calibrare;
V 2 = volumul n ml al soluiei etalon intern concentrate adugat la extract, conform
prevederilor subpunctului 7.5.2. (= 5 ml) sau la hidrolizat, conform prevederilor subpunctului
7.5.3. (= 2 ml);
C = aria vrfului etalonului intern, extract, conform prevederilor subpunctului 7.5.2 sau
hidrolizat, conform prevederilor subpunctului 7.5.3.;
D = aria vrfului pentru triptofan, soluia etalon de calibrare (a se vedea meniunea de
la subpunctul 7.3.17.);
V 3 = volumul n ml (= 2 ml) al soluiei de etalon intern concentrate adugat la soluia
etalon de calibrare (a se vedea meniunea de la subpunctul 7.3.17.);
30
m = greutatea eantionului n g (corectat pentru a obine greutatea original dac

produsul este uscat i/sau degresat);
M = masa molar a triptofanului (= 204,23 g/mol).
7.7. Repetabilitatea
Diferena dintre rezultatele a dou determinri paralele realizate pe acelai eantion nu
trebuie s depeasc 10 % din rezultatul cel mai mare.
7.8. Observaii
7.8.1. Respectarea urmtoarelor condiii speciale de cromatografie, conform
prevederilor tabelului nr. 2, poate conduce la o mai bun separare a triptofanului de -metiltriptofan.
Eluia izocratic este urmat de curarea coloanei prin gradient.
Tabelul nr.
2
Condiiile speciale pentru cromatografie
Tehnica de msurare
Coloana pentru cromatografie lichid
Temperatura coloanei
Faza mobil
Programul gradientului
Rata fluxului
Timpul total de desfurare
Valorile indicate
echivalent
32C
A: 0,01 mol/l KH 2 PO 4 /metanol, 95 + 5 (V + V).
B: Metanol
0 minute
100 % A
0%B
15 minute
100 % A
0%B
17 minute
60 % A
40 % B
19 minute
60 % A
40 % B
21 minute
100 % A
0%B
33 minute
100 % A
0%B
1,2 ml/minut
aproximativ 33 min
7.8.2. Cromatografia variaz n funcie de tipul de HPLC i de materialul utilizat la

umplerea coloanei. Sistemul ales trebuie s fie capabil s stabileasc o separare iniial de
referin ntre triptofan i etalonul intern. n plus, este important ca produii de degradare s fie
bine separai de triptofan i de etalonul intern. Se efectueaz o operaie de prob pe hidrolizate
fr etalon intern pentru a verifica prezena impuritilor la nivelul liniei de baz
corespunztoare etalonului intern. Este important ca durata eluiei pentru toi produii de
degradare s fie suficient de lung, altfel prezena unor vrfuri de eluie ntrziate poate
interfera cu operaiile ulterioare de cromatografie.
n cursul operaiilor, sistemul cromatografic ofer un rspuns linear. Acest rspuns
linear se msoar n condiii de concentraie constant (normal) a etalonului intern i de
concentraii variabile a triptofanului. Este important c nlimea vrfurilor pentru triptofan i
pentru etalonul intern s se situeze n gama linear a sistemului HPLC/fluorescen. Dac
vrfurile pentru triptofan i/sau pentru etalonul intern snt prea joase sau prea nalte, analiza se
repet cu un eantion de o alt dimensiune i/sau un volum final modificat.
7.8.3. Hidroxid de bariu
31
Cu timpul, hidroxidul de bariu devine mai dificil de dizolvat. Aceasta genereaz o

soluie lipsit de limpezime pentru determinarea HPLC, ceea ce poate conduce la rezultate
slabe pentru triptofan.
VIII. Determinarea coninutului de uleiuri i grsimi brute
Prezenta metod este destinat determinrii n nutreuri a coninutului de uleiuri i
grsimi brute. Ea nu este aplicabil analizrii seminelor i fructelor oleaginoase.
Utilizarea procedurilor descrise n subpunctele 8.1.1. i 8.1.2. depinde de natura i
compoziia nutreului i de motivul efecturii analizei.
8.1.1. Procedura A Uleiuri i grsimi brute care pot fi extrase direct
Aceast metod este aplicabil materiilor prime pentru nutreuri de origine vegetal, cu
excepia celor descrise n subpunctul 8.1.2.
8.1.2. Procedura B Uleiuri i grsimi brute totale
Aceast metod este aplicabil materiilor prime pentru nutreuri de origine animal i
tuturor nutreurilor combinate. Ea trebuie folosit pentru toate materiile din care uleiurile i
grsimile nu pot fi extrase complet fr hidroliz prealabil (de exemplu, gluten, drojdie,
proteine din cartofi i produse supuse unor procese cum ar fi extrudarea, transformarea n fulgi
i nclzirea).
8.1.3. Interpretarea rezultatelor
n toate cazurile n care se obine un rezultat superior folosind procedura menionat n
subpunctul 8.1.2. comparativ cu cel obinut prin folosirea procedurii indicate n subpunctul
8.1.1., rezultatul obinut prin procedura descris n subpunctul 8.1.2. se accept ca valoarea
real.
8.2.1. Procedura A
Eantionul se extrage cu eter de petrol. Solventul se ndeprteaz prin distilare, iar
reziduul se usuc i se cntrete.
8.2.2. Procedura B
Eantionul se trateaz la cald cu acid clorhidric. Amestecul se rcete i se filtreaz.
Reziduul se spal i se usuc, apoi se supune determinrii n conformitate cu procedura A.
8.3.1. Eter de petrol, interval de fierbere: 40-60C. Indicele de brom trebuie s fie mai
mic de 1, iar reziduul dup evaporare sub 2 mg/100 ml.
8.3.2. Sulfat de sodiu, anhidru.
8.3.3. Acid clorhidric, c = 3 mol/l.
8.3.4. Agent de filtrare, de exemplu Kieselguhr, Hyflo-supercel.
8.4. Dispozitive
8.4.1. Aparat de extracie. Dac este dotat cu un sifon (aparat Soxhlet), rata refluxului
este astfel nct s produc aproximativ 10 cicluri pe or; dac aparatul este de tip fr sifon,
rata refluxului este de aproximativ 10 ml pe minut.
8.4.2. Cartue de extracie, lipsite de materie solubil n eter de petrol i cu o porozitate
compatibil cu cerinele menionate la subpunctul 8.4.1.
8.4.3. Cuptor de uscare, fie cu vid reglat la 75 3C, fie cu aer reglat la 100 3 C.
8.5. Procedura de aplicare
8.5.1. Procedura A (a se vedea specificaia de la subpunctul 8.8.1.)
Se cntresc 5 g de eantion cu o abatere de 1 mg, se transfer ntr-un cartu de
extracie i se acoper cu un tampon de vat lipsit de grsimi.
32
Cartuul se introduce ntr-un extractor i se extrage timp de ase ore cu eter de petrol.
Se colecteaz extractul de eter de petrol ntr-un vas uscat i cntrit, care conine fragmente de
piatr ponce.
n cazul n care uleiurile sau grsimile trebuie supuse unor teste de calitate ulterioare,
fragmentele de piatr ponce se nlocuiesc cu mrgele de sticl.
Solventul se ndeprteaz prin distilare. Se usuc reziduul, pstrnd vasul timp de o or
i jumtate n cuptorul de uscare. Se las s se rceasc ntr-un desicator i se cntrete. Se
usuc din nou timp de 30 minute pentru a asigura c greutatea uleiurilor i grsimilor rmne
constant (pierderea de greutate ntre dou cntriri succesive trebuie s fie mai mic sau egal
cu 1 mg).
8.5.2. Procedura B
Se cntresc 2,5 g de eantion cu o abatere de 1 mg (a se vedea meniunea de la
subpunctul 8.8.2.), se introduc ntr-un pahar de laborator de 400 ml sau ntr-un flacon tip
Erlenmeyer de 300 ml i se adaug 100 ml de acid clorhidric i fragmente de piatr ponce. Se
acoper paharul de laborator cu o sticl de ceas sau se conecteaz un condensator cu reflux la
flaconul tip Erlenmeyer. Se aduce amestecul la fierbere uoar deasupra unei flcri mici sau
pe o plit i se pstreaz n aceast stare timp de o or. Trebuie s se mpiedice lipirea
produsului de prile laterale ale recipientului.
Se rcete i se adaug o cantitate de adjuvant de filtrare suficient pentru a evita orice
pierdere de ulei i grsime n timpul filtrrii. Se filtreaz printr-un filtru de hrtie dubl,
umezit i lipsit de grsimi. Se spal reziduul n ap rece pn se obine un filtrat neutru. Se
verific filtratul ca s nu conin deloc uleiuri i grsimi.
Prezena acestora indic faptul c eantionul trebuie extras cu eter de petrol, folosind
procedura A, nainte de hidroliz.
Se aeaz filtrul de hrtie dubl care conine reziduul pe o sticl de ceas i se usuc
timp de o or i jumtate n cuptorul cu aer la 100 3C.
Se aeaz filtrul de hrtie dubl care conine reziduul uscat ntr-un cartu de extracie i
se acoper cu un tampon de vat lipsit de grsimi. Cartuul se introduce ntr-un extractor i se
procedeaz astfel cum se menioneaz n subpunctul 8.5.1.
8.6. Exprimarea rezultatului
Greutatea reziduului se exprim ca procent din eantion.
Diferena dintre rezultatele a dou determinri paralele efectuate pe acelai eantion de
acelai laborant nu depesc:
a) 0,2 % n valoare absolut, pentru un coninut n uleiuri i grsimi brute mai mic de 5
%;
b) 4 % relativ la rezultatul cel mai mare pentru un coninut cuprins ntre 5 i 10 %;
c) 0,4 % n valoare absolut, pentru un coninut mai mare de 10 %.
8.8. Observaii
8.8.1. Pentru produse cu un coninut mare de uleiuri i grsimi, care snt dificil de
mcinat sau care snt improprii prelevrii unui eantion de testare redus omogen, se
procedeaz dup cum urmeaz.
Se cntresc 20 g de eantion cu o abatere de 1 mg i se amestec cu o cantitate de 10 g
sau mai mare de sulfat de sodiu anhidru. Se extrage cu eter de petrol astfel cum se indic n
subpunctul 8.5.1. Se completeaz extractul obinut pn la 500 ml cu eter de petrol i se
amestec. Se iau 50 ml de soluie i se introduc ntr-un vas mic, uscat i cntrit, care conine
fragmente de piatr ponce. Se elimin solventul prin distilare, se usuc i se procedeaz astfel
cum se indic n subpunctul 8.5.1.
33
Se elimin solventul din reziduul de extracie rmas n cartu, se macin reziduul pn

la o finee de 1 mm, se reintroduce n cartuul de extracie (nu se adaug sulfat de sodiu) i se
procedeaz astfel cum se menioneaz n subpunctul 8.5.1.
Coninutul de uleiuri i grsimi se calculeaz ca procent din eantion folosind
urmtoarea formul:
(10 m 1 + m 2 ) 5,
unde:
m 1 = greutatea n grame a reziduului dup prima extracie (parte alicot din extract);
m 2 = greutatea n grame a reziduului dup a doua extracie.
8.8.2. Pentru produsele cu coninut mic de uleiuri i grsimi, masa eantionului de
testat se poate mri la 5 g.
8.8.3. Este posibil ca, nainte de hidroliz i extracie, hrana pentru animalele de
companie cu coninut mare de ap s fie amestecat cu sulfat de sodiu anhidru, conform
procedurii B, descrise n subpunctul 8.5.2.
8.8.4. La subpunctul 8.5.2., poate fi mai eficient folosirea apei calde n locul apei reci
pentru splarea reziduului dup filtrare.
8.8.5. Este posibil ca timpul de uscare de 1,5 h s necesite a fi prelungit pentru unele
nutreuri. Uscarea excesiv se evit, ntruct acest fapt poate determina rezultate slabe. Se
poate folosi, de asemenea, un cuptor cu microunde.
8.8.6. Preextracia prin procedura A, descris n subpunctul 8.5.1. nainte de hidroliz
i de reextracie prin procedura B, indicat n subpunctul 8.5.2., se recomand, n cazul n care
coninutul de uleiuri/grsimi brute este mai mare de 15 %. ntr-o anumit msur, acest fapt
depinde de natura nutreului i de natura uleiurilor/grsimilor din nutre.
IX. Determinarea coninutului de fibre brute
Prezenta metod permite determinarea n nutreuri a substanelor organice lipsite de
grsimi care snt insolubile n mediu acid i alcalin i care snt descrise n mod convenional ca
fibre brute.
Eantionul, degresat, se trateaz succesiv cu soluii de acid sulfuric i hidroxid de
potasiu, de concentraii specifice, n stare de fierbere. Reziduul se separ prin filtrare printr-un
filtru de sticl sinterizat splat, uscat, cntrit i calcinat la o temperatur cuprins ntre 475 i
500C. Pierderea de greutate rezultat prin calcinare corespunde fibrelor brute din eantionul
testat.
9.3.1. Acid sulfuric, c = 0,13 mol/l.
9.3.2. Agent antispumant (de exemplu n-octanol).
9.3.3. Agent de filtrare (Celite 545 sau echivalent), nclzit la 500C timp de patru ore,
conform descrierilor de la subpunctul 9.8.6.
9.3.4. Aceton.
9.3.5. Eter de petrol cu interval de fierbere ntre 40 i 60C.
9.3.6. Acid clorhidric, c = 0,5 mol/l.
9.3.7. Soluie de hidroxid de potasiu, c = 0,23 mol/l.
9.4. Dispozitive
9.4.1. Unitate de nclzire pentru dizolvare cu acid sulfuric i soluie de hidroxid de
potasiu, echipat cu un suport pentru creuzetul filtrant (a se vedea meniunea de la subpunctul
34
9.4.2.) i dotat cu un tub de evacuare prevzut cu un dop la orificiul de ieire pentru lichide i
de creare de vid, posibil i cu aer comprimat. nainte de fiecare utilizare zilnic, unitatea se
prenclzete cu ap aflat n stare de fierbere, timp de 5 minute.
9.4.2. Creuzet filtrant de sticl cu plac filtrant de sticl sinterizat fuzionat, cu pori
de 40-90 m. nainte de prima utilizare se nclzete la 500C timp de cteva minute, iar apoi
se rcete, conform indicaiilor de la subpunctul 9.8.6.
9.4.3. Cilindru de cel puin 270 ml cu condensator cu reflux, care poate fi supus
fierberii.
9.4.4. Cuptor de uscare, cu termostat.
9.4.5. Cuptor cu mufl, cu termostat.
9.4.6. Unitate de extracie compus dintr-o plac de sprijin pentru creuzetul filtrant,
conform descrierii de la subpunctul 9.4.2. i cu o eav de evacuare prevzut cu un dop la
orificiul de creare de vid i de ieire a lichidelor.
9.4.7. Inele de conectare utilizate pentru a asambla unitatea de nclzire, creuzetul i
cilindrul, precum i pentru a conecta unitatea de extracie la rece cu creuzetul.
Se cntrete 1 g de eantion preparat cu o abatere de 1 mg i se introduce n creuzet, (a
se vedea observaiile indicate n subpunctele 9.8.1., 9.8.2. i 9.8.3.) i se adaug 1 g de
adjuvant de filtrare.
Se asambleaz unitatea de nclzire i creuzetul filtrant, apoi se ataeaz cilindrul la
creuzet. Se toarn 150 ml de acid sulfuric aflat n stare de fierbere n ansamblul cilindrucreuzet i, dac este necesar, se adaug cteva picturi de agent antispumant.
Se aduce lichidul la fierbere n decurs de 5 2 minute i se fierbe viguros exact 30 de
minute.
Se deschide dopul evii de evacuare, indicat n subpunctul 9.4.1., i, n condiii de vid,
se filtreaz acidul sulfuric prin creuzetul filtrant, apoi se spal reziduul cu trei porii
consecutive de 30 ml de ap aflat n stare de fierbere, asigurndu-se c reziduul se filtreaz
uscat dup fiecare splare.
Se nchide dopul orificiului de evacuare i se toarn 150 ml de soluie de hidroxid de
potasiu aflat n stare de fierbere n ansamblul cilindru-creuzet, apoi se adaug cteva picturi
de agent antispumant. Se aduce lichidul la punctul de fierbere n decurs de 5 2 minute i se
fierbe viguros exact 30 de minute. Se filtreaz i se repet procedura de splare utilizat n
etapa cu acid sulfuric.
Dup splarea i uscarea final, se deconecteaz creuzetul mpreun cu coninutul su
i se reconecteaz la unitatea de extracie la rece. Se creeaz vidul, iar reziduul se spal n
creuzet cu trei porii consecutive de aceton de 25 ml, asigurndu-se c reziduul se filtreaz n
starea uscat dup fiecare splare.
Creuzetul se usuc n cuptor la 130C pn se ajunge la o greutate constant. Dup
fiecare uscare, se rcete n desicator i se cntrete rapid. Se introduce creuzetul ntr-un
cuptor cu mufl i se calcineaz pn se atinge o greutate constant (pierderea de greutate ntre
dou cntriri succesive trebuie s fie mai mic sau egal cu 2 mg) la o temperatur cuprins
ntre 475C i 500C timp de cel puin 30 de minute.
Dup fiecare nclzire, nainte de cntrire se rcete mai nti n cuptor, iar apoi n
desicator.
Se efectueaz un test martor fr eantion. Pierderea de greutate rezultat din calcinare
nu trebui s depeasc 4 mg.
Coninutul de fibre brute exprimat ca procent din eantion este dat de formula:
X = (m 0 m 1 ) 100 / m,
35
unde:
m = greutatea eantionului n g;
m 0 = pierderea de greutate dup calcinare n cursul determinrii, n g;
m 1 = pierderea de greutate dup calcinare n cursul testului martor, n g.
trebuie s depeasc:
a) 0,6 % n valoare absolut pentru un coninut de fibre brute mai mic de 10 %;
b) 6 % relativ la rezultatul mai mare, pentru un coninut de fibre brute egal sau mai
mare de 10 %.
9.8. Observaii
9.8.1. Nutreurile care au coninut de grsimi brute mai mare de 10 % trebuie s fie
degresate nainte de a fi supuse analizei cu eter de petrol. Creuzetul filtrant (a se vedea
meniunea de la subpunctul 9.4.2.) mpreun cu coninutul su se conecteaz la unitatea de
extracie la rece, conform prevederilor subpunctului 9.4.6. i se creeaz vidul, apoi se spal
reziduul cu trei porii consecutive de eter de petrol de 30 ml, asigurndu-se c reziduul este
uscat. Creuzetul mpreun cu coninutul su se conecteaz la unitatea de nclzire i se
continu astfel cum se descrie la punctul 9.5.
9.8.2. Nutreurile care conin grsimi care nu pot fi extrase direct cu eter de petrol
trebuie degresate astfel cum se indic la subpunctul 9.8.1. i degresate nc o dat dup
fierbere cu acid. Dup fierbere cu acid i splare consecutiv, creuzetul mpreun cu coninutul
su se conecteaz la unitatea de extracie la rece, apoi se spal de trei ori cu 30 ml aceton,
urmat de trei splri suplimentare cu porii de eter de petrol de 30 ml. Se filtreaz sub vid pn
la uscare, iar analizarea se continu astfel cum se descrie la punctul 9.5., ncepnd cu
tratamentul cu hidroxid de potasiu.
9.8.3. Dac nutreul conine mai mult de 5 % carbonai, exprimai ca i carbonat de
calciu, se conecteaz creuzetul mpreun cu eantionul cntrit la unitatea de nclzire.
Eantionul se spal de trei ori cu 30 ml acid clorhidric. Dup fiecare adugare, se las
eantionul s stea timp de aproximativ 1 minut nainte de filtrare.
Se spal o singur dat cu 30 ml ap, iar apoi se continu astfel cum se descrie la
punctul 9.5.
9.8.4. Dac se utilizeaz aparatur n form de stativ (o serie de creuzete ataate la
aceeai unitate de nclzire) nu se efectueaz dou determinri individuale pe acelai eantion
de analizat n aceeai serie.
9.8.5. Dac dup fierbere este dificil s se filtreze soluiile acide i alcaline, se
utilizeaz aer comprimat introdus prin eava de evacuare a unitii de nclzire i apoi se
continu filtrarea.
9.8.6. Temperatura de calcinare nu depete 500C pentru a se putea prelungi timpul
de utilizare a sticlei creuzetului filtrant. Trebuie acordat atenie pentru a se evita ocurile
termice excesive n cursul ciclurilor de nclzire i rcire.
X. Determinarea zaharurilor
Prezenta metod permite determinarea cantitii de zaharuri reductoare i a zaharurilor
totale dup inversie, exprimate ca glucoz sau, acolo unde este cazul, ca zaharoz, prin
conversie cu factorul 0,95. Ea este aplicabil nutreurilor combinate. Pentru alte tipuri de
nutreuri exist metode specifice. Dac este necesar, lactoza se determin separat, inndu-se
cont de aceasta la calcularea rezultatelor.
36

Zaharurile se extrag n etanol diluat; soluia se limpezete cu soluii Carrez I i II. Dup
eliminarea etanolului, cantitile pre- i post-inversie se determin prin metoda Luff-Schoorl.
10.3.1. Soluie de etanol cu concentraie de 40 % (v/v): 0,948 g/ml la 20C, neutralizat
cu fenolftalein.
10.3.2. Soluie Carrez I: se dizolv 21,9 g de acetat de zinc Zn(CH 3 COO) 2 2H 2 O i 3 g
10.3.3. Soluie Carrez II: se dizolv 10,6 g de ferocianur de potasiu,
K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O n ap. Se completeaz cu ap pn la 100 ml.
10.3.4. Metiloranj, soluie 0,1 % (greutate/volum).
10.3.5. Acid clorhidric 4 mol/litru.
10.3.6. Acid clorhidric 0,1 mol/litru.
10.3.7. Soluie de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru.
10.3.8. Reactiv Luff-Schoorl:
Amestecnd cu grij, se toarn soluia de acid citric (a se vedea meniunea de la
subpunctul 10.3.8.2.) n soluia de carbonat de sodiu, descris la subpunctul 10.3.8.3. Se
adaug soluia de sulfat de cupru, conform descrierilor de la subpunctul 10.3.8.1., i se
completeaz pn la 1 litru cu ap. Se las la decantare peste noapte i se filtreaz.
Se verific concentraia reactivului obinut (Cu 0,05 mol/litru; Na 2 CO 3 1 mol/litru).
ph-ul soluiei este aproximativ 9,4.
10.3.8.1. Soluie de sulfat de cupru: se dizolv 25 g de sulfat de cupru, CuSO 4 5 H 2 O,
lipsit de fier, n 100 ml de ap.
10.3.8.2. Soluia de acid citric: se dizolv 50 gr. de acid citric (C 6 H 8 O 7 x H 2 O) n 50
ml de ap.
10.3.8.3. Soluie de carbonat de sodiu: se dizolv 143,8 g de carbonat de sodiu anhidru
n aproximativ 300 ml de ap cald. Se las s se rceasc.
10.3.9. Soluie de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru.
10.3.10. Soluie de amidon: se adaug un amestec de 5 g de amidon solubil cu 30 ml de
ap la un litru de ap n stare de fierbere. Se fierbe timp de 3 minute, se las s se rceasc i,
dac este necesar, se adaug 10 mg de iodur de mercur ca agent de conservare.
10.3.11. Acid sulfuric 3 mol/litru.
10.3.12. Iodur de potasiu, soluie 30 % (greutate/volum).
10.3.13. Granule de piatr ponce fierte n acid clorhidric, splate n ap i uscate.
10.3.14. 3-metilbutan-l-ol.
10.4. Dispozitiv
Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.
10.5.1. Extracia eantionului
Se cntresc 2,5 g de eantion cu o abatere de 1 mg i se introduc ntr-un balon gradat
de 250 ml. Se adaug 200 ml etanol i se amestec timp de o or n agitator. Se adaug 5 ml de
soluie Carrez I i se amestec timp de aproximativ 30 de secunde. Se adaug aproximativ 5
ml de soluie Carrez II i se amestec din nou timp de un minut. Se completeaz pn la volum
cu etanolul, se omogenizeaz i se filtreaz. Se ndeprteaz 200 ml de filtrat i se evapor
pn la aproximativ jumtate din volum n scopul eliminrii majoritii etanolului. Reziduul
rmas dup evaporare se transfer cantitativ ntr-un balon gradat de 200 ml cu ajutorul apei
calde, se rcete, se completeaz pn la volum cu ap, se omogenizeaz i, dac este necesar,
se filtreaz. Aceast soluie se va utiliza pentru determinarea cantitii zaharurilor reductoare
i, dup inversie, a zaharurilor totale.
10.5.2. Determinarea zaharurilor reductoare
37
Cu ajutorul unei pipete se ndeprteaz maximum 25 ml din soluia care conine mai
puin de 60 mg de zaharuri reductoare exprimate ca glucoz. Dac este necesar, se
completeaz pn la 25 ml cu ap distilat i se determin coninutul n zaharuri reductoare
prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul se exprim sub form de coninut procentual de glucoz
n eantion.
10.5.3. Determinarea zaharurilor totale dup inversie
Cu ajutorul unei pipete se recolteaz 50 ml de soluie i se transfer ntr-un balon
gradat de 100 ml. Se adaug cteva picturi de soluie de metiloranj, apoi, amestecnd
continuu, se adaug cu grij acid clorhidric (a se vedea meniunea de la subpunctul 10.3.5.)
pn cnd lichidul vireaz ntr-un rou bine definit. Se adaug 15 ml de acid clorhidric (a se
vedea meniunea de la subpunctul 10.3.6.), se scufund balonul ntr-o baie de ap clocotind i
se menine acolo timp de 30 de minute. Se rcete rapid la aproximativ 20C i se adaug 15
ml de soluie de hidroxid de sodiu. Se completeaz cu ap pn la 100 ml i se omogenizeaz.
Se ndeprteaz maximum 25 ml din soluia care conine mai puin de 60 mg de zaharuri
reductoare exprimate ca glucoz. Dac este necesar, se completeaz pn la 25 ml cu ap
distilat i se determin coninutul n zaharuri reductoare prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul
se exprim n procente de glucoz sau, dac este cazul, de zaharoz, prin multiplicare cu
factorul 0,95.
10.5.4. Titrare prin metoda Luff-Schoorl
Cu ajutorul unei pipete se recolteaz 25 ml de reactiv Luff-Schoorl i se transfer ntrun flacon Erlenmeyer de 300 ml; se adaug exact 25 ml din soluia de zaharuri limpezit. Se
adaug 2 granule de piatr ponce, se nclzete, amestecnd manual, deasupra unei flcri
libere cu nlime medie, aducndu-se lichidul la fierbere n aproximativ 2 minute. Flaconul
Erlenmeyer se aeaz imediat pe o plas de srm acoperit cu azbest avnd un orificiu cu
diametru de aproximativ 6 cm sub care exist o flacr aprins. Flacra se regleaz astfel nct
s se nclzeasc doar baza flaconului Erlenmeyer. La flaconul Erlenmeyer se monteaz un
condensator cu reflux. Se fierbe exact zece minute. Se rcete imediat n ap rece i, dup
aproximativ 5 minute, se titreaz dup cum urmeaz:
Se adaug 10 ml de soluie de iodur de potasiu i, imediat dup aceea (cu grij, din
cauza riscului formrii unei spume abundente), se adaug 25 ml de acid sulfuric. Se titreaz n
continuare cu soluie de tiosulfat de sodiu pn la apariia unei coloraturi galben ters,
adugnd ca indicator soluia de amidon i ncheind titrarea.
Se efectueaz aceeai titrare pe un amestec de 25 ml de reactiv Luff-Schoorl cu 25 ml
de ap, msurat cu precizie, dup ce s-au adugat 10 ml de soluie de iodur de potasiu i 25
ml de acid sulfuric, fr a se fierbe.
Utiliznd datele indicate n tabelul nr. 3 se stabilete cantitatea de glucoz n mg care
corespunde diferenei dintre valorile celor dou titrri, exprimate n mg de tiosulfat de sodiu
0,1 mol/litru. Rezultatele se exprim ca procent din eantion.
10.7. Proceduri speciale
10.7.1. n cazul nutreurilor bogate n melase i al altor nutreuri care nu snt n mod
particular omogene, se cntresc 20 g i se introduc, mpreun cu 500 ml de ap, ntr-un balon
gradat de 1 litru. Se amestec timp de o or n agitator. Se limpezete cu ajutorul reactivilor
Carrez I i II astfel cum se descrie n subpunctul 10.5.1, utiliznd, de data aceasta, o cantitate
de patru ori mai mare din fiecare reactiv. Se completeaz pn la volum cu etanol 80 % (v/v).
Se omogenizeaz i se filtreaz. Se elimin etanolul astfel cum se descrie n subpunctul
10.5.1. n absena amidonului dextrinizat, se completeaz pn la volum cu ap distilat.
10.7.2. n cazul melaselor i al materiilor prime pentru nutreuri bogate n zaharuri i
aproximativ lipsite de amidon (rocove, fulgi de rdcin de sfecl uscai etc.), se cntresc 5
g, se introduc ntr-un balon gradat de 250 ml, se adaug 200 ml ap distilat i se amestec n
38
agitator timp de o or sau, dac este necesar, mai mult. Se limpezete cu ajutorul reactivilor
Carrez I i II astfel cum se descrie n subpunctul 10.5.1. Se completeaz pn la volum cu ap
rece, se omogenizeaz i se filtreaz. Pentru determinarea cantitii totale de zaharuri, se
continu astfel cum se descrie n subpunctul 10.5.3.
10.8. Observaii
10.8.1. n scopul prevenirii formrii de spum este recomandabil s se adauge
(indiferent de volum) aproximativ 1 ml de 3-metilbutan-l-ol nainte de fierbere cu reactiv LuffSchoorl.
10.8.2. Diferena dintre coninutul total de zaharuri dup inversie exprimat ca glucoz
i coninutul de zaharuri reductoare exprimat ca glucoz, multiplicat cu 0,95, reprezint
coninutul procentual de zaharoz.
10.8.3. Pentru a determina coninutul de zaharuri reductoare, cu excepia lactozei, se
pot adopta dou metode:
10.8.3.1. Pentru un calcul aproximativ, coninutul de lactoz stabilit printr-o metod de
analiz diferit se multiplic cu 0,675, iar rezultatul obinut se scade din coninutul de zaharuri
reductoare.
10.8.3.2. Pentru un calcul precis al zaharurilor reductoare, cu excepia lactozei, se
utilizeaz acelai eantion n cele dou determinri finale. Una dintre analize se efectueaz pe
o parte din soluia obinut n conformitate prevederile subpunctului 10.5.1, alta pe o parte din
soluia obinut n cursul determinrii lactozei prin metoda stabilit n acest sens (dup
fermentarea celorlalte tipuri de zaharuri i limpezire).
n ambele cazuri, cantitatea de zaharuri prezent se determin prin metoda LuffSchoorl i se calculeaz n mg de glucoz. Una dintre valori se scade din cealalt, iar diferena
se exprim ca procent din eantion.
Tabelul nr.
3
Tabel de valori pentru 25 ml de reactiv Luff-Schoorl
ml de Na 2 S 2 O 3 0,1 mol/litru, dou minute nclzire, zece minute fierbere
Na 2 S 2 O 3
0,1
mol/litru
ml
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Glucoz, fructoz
zaharuri
invertite
C 6 H 12 O 6
mg
2,4
4,8
7,2
9,7
12,2
14,7
17,2
19,8
22,4
25,0
27,6
30,3
diferen
2,4
2,4
2,5
2,5
2,5
2,5
2,6
2,6
2,6
2,6
2,7
2,7
Lactoz
C 12 H 22 O 11
mg
3,6
7,3
11,0
14,7
18,4
22,1
25,8
29,5
33,2
37,0
40,8
44,6
diferen
3,7
3,7
3,7
3,7
3,7
3,7
3,7
3,7
3,8
3,8
3,8
3,8
Maltoz
C 12 H 22 O 11
mg
3,9
7,8
11,7
15,6
19,6
23,5
27,5
31,5
35,5
39,5
43,5
47,5
diferen
3,9
3,9
3,9
4,0
3,9
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,1
Na 2 S 2 O 3
0,1
mol/litru
ml
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
39
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
33,0
35,7
38,5
41,3
44,2
47,1
50,0
53,0
56,0
59,1
62,2
2,7
2,8
2,8
2,9
2,9
2,9
3,0
3,0
3,1
3,1
48,4
52,2
56,0
59,9
63,8
67,7
71,7
75,7
79,8
83,9
88,0
3,8
3,8
3,9
3,9
3,9
4,0
4,0
4,1
4,1
4,1
51,6
55,7
59,8
63,9
68,0
72,2
76,5
80,9
85,4
90,0
94,6
4,1
4,1
4,1
4,1
4,2
4,3
4,4
4,5
4,6
4,6
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
XI. Determinarea lactozei

Aceast metod permite determinarea coninutului de lactoz n nutreurile care au un
coninut de lactoz mai mare de 0,5 %.
Zaharurile se dizolv n ap. Soluia este supus fermentaiei de ctre drojdia
Saccharomyces cerevisiae care nu descompune lactoza. Dup limpezire i filtrare, coninutul
de lactoz al filtratului se determin prin metoda Luff-Schoorl.
11.3.1. Suspensie de Saccharomyces cerevisiae: se suspend 25 g de drojdie proaspt
n 100 ml de ap. Suspensia se pstreaz n frigider o perioad de maximum o sptmn.
11.3.2. Soluie Carrez I: se dizolv 21,9 g de acetat de zinc, Zn(CH 3 COO) 2 2H 2 O i 3
g de acid acetic glacial n ap. Se completeaz cu ap pn la 100 ml.
11.3.3. Soluie Carrez II: se dizolv 10,6 g de ferocianur de potasiu
K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O n ap. Se completeaz cu ap pn la 100 ml.
11.3.4. Reactiv Luff-Schoorl:
Amestecnd cu grij, se toarn soluie de acid citric (a se vedea meniunea de la
subpunctul 11.3.4.2.) n soluia de carbonat de sodiu, conform prevederilor subpunctului
11.3.4.3. Se adaug soluia de sulfat de cupru (a se vedea meniunea de la subpunctul
11.3.4.1.) i se completeaz pn la 1 litru cu ap. Se las la decantare peste noapte i se
filtreaz. Se verific concentraia reactivului obinut astfel (Cu 0,05 mol/litru; Na 2 CO 3 1
mol/litru). ph-ul soluiei este aproximativ 9,4.
11.3.4.1. Soluie de sulfat de cupru: se dizolv 25 de g de sulfat de cupru,
CuSO 4 5H 2 O, lipsit de fier, n 100 ml ap.
11.3.4.2. Soluie de acid citric: se dizolv 50 g de acid citric, C 6 H 8 O 7 H 2 O, n 50 ml
de ap.
11.3.4.3. Soluie de carbonat de sodiu: se dizolv 143,8 g de carbonat de sodiu anhidru
n aproximativ 300 ml de ap cald. Se las s se rceasc.
11.3.5. Granule de piatr ponce fierte n acid clorhidric, splate n ap i uscate.
11.3.6. Iodur de potasiu, soluie 30 % (greutate/volum).
11.3.7. Acid sulfuric 3 mol/litru.
11.3.8. Soluie de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru.
11.3.9. Soluie de amidon: se adaug un amestec de 5 g de amidon solubil cu 30 ml de
ap la un litru de ap n stare de fierbere. Se fierbe timp de 3 minute, se las s se rceasc i,
dac este necesar, se adaug 10 mg de iodur de mercur ca agent de conservare.
11.4. Dispozitiv
Baie de ap cu termostat reglat la 38-40C.
40

Se cntrete 1 g de eantion cu o abatere de 1 mg i se introduce ntr-un balon gradat
de 100 ml. Se adaug 25-30 ml de ap. Balonul se introduce ntr-o baie de ap aflat la
temperatura de fierbere, timp de 30 de minute, apoi se rcete la aproximativ 35C. Se adaug
5 ml de suspensie de drojdie (a se vedea meniunea de la subpunctul 11.3.1.) i se
omogenizeaz. Balonul se las s stea timp de dou ore ntr-o baie de ap la temperatura de
38-40C. Se rcete la aproximativ 20C.
Se adaug 2,5 ml de soluie Carrez I i se amestec timp de treizeci de secunde, apoi se
adaug 2,5 ml de soluie Carrrez II i se amestec din nou timp de treizeci de secunde. Se
completeaz cu ap pn la 100 ml, se amestec i se filtreaz. Cu ajutorul unei pipete, se
ndeprteaz o cantitate de filtrat care nu depete 25 ml i care conine, de preferin, 40-80
mg de lactoz, apoi se transfer ntr-un flacon Erlenmeyer de 300 ml. Dac este necesar, se
completeaz cu ap pn la 25 ml.
Se efectueaz un test martor n acelai mod cu 5 ml de suspensie de drojdie, conform
prevederilor subpunctului 11.3.1. Se determin coninutul de lactoz prin metoda LuffSchoorl, dup cum urmeaz: se adaug exact 25 ml de reactiv Luff-Schoorl i dou granule de
piatr ponce. Se amestec manual concomitent cu nclzirea deasupra unei flcri libere de
nlime medie, iar lichidul se aduce la fierbere n aproximativ dou minute. Flaconul
Erlenmeyer se aeaz imediat pe o plas de srm acoperit cu azbest avnd un orificiu cu
diametru de aproximativ 6 cm sub care exist o flacr aprins. Flacra se regleaz astfel nct
s se nclzeasc doar baza flaconului Erlenmeyer. La flaconul Erlenmeyer se monteaz un
condensator cu reflux. Se fierbe exact zece minute. Se rcete imediat n ap rece i, dup
aproximativ 5 minute, se titreaz dup cum urmeaz:
Se adaug 10 ml de soluie de iodur de potasiu i, imediat dup aceea (cu grij, din
cauza riscului formrii unei spume abundente), se adaug 25 ml acid sulfuric. Se titreaz cu
soluie de tiosulfat de sodiu pn la apariia unei culori galben ters, se adaug soluia de
amidon i se finalizeaz titrarea.
Se efectueaz aceeai titrare pe un amestec de 25 ml de reactiv Luff-Schoorl cu 25 ml
de ap, msurat cu precizie, dup ce s-au adugat 10 ml de soluie de iodur de potasiu i 25
ml de acid sulfuric, fr a se fierbe.
Utiliznd datele indicate n tabelul nr. 3, se stabilete cantitatea de lactoz n mg care
corespunde diferenei dintre rezultatele celor dou titrri, exprimate n ml de tiosulfat de sodiu
0,1 mol/litru.
Rezultatul pentru lactoza anhidr se exprim ca procent din eantion.
11.7. Observaii
Pentru produsele care conin mai mult de 40 % zahr fermentescibil, se utilizeaz mai
mult de 5 ml de suspensie de drojdie, specificat n subpunctul 11.3.1.
XII. Determinarea amidonului

Metoda polarimetric
Prezenta metod permite determinarea n nutreuri a coninutului de amidon i a
produselor de degradare a amidonului cu mas molecular mare cu scopul de a se verifica
conformitatea cu valoarea energetic declarat, conform prevederilor descrise n anexa nr. 7 la
prezenta Hotrre.
41
Metoda cuprinde dou determinri. n prima, eantionul este tratat cu acid clorhidric
diluat. Dup limpezire i filtrare, se msoar rotaia optic a soluiei prin polarimetrie.
n cea de-a doua, eantionul este extras cu etanol 40 %. Dup acidificarea filtratului cu
acid clorhidric, limpezire i filtrare, se msoar rotaia optic la fel ca n prima determinare.
Diferena dintre cele dou msurtori, multiplicat cu un factor cunoscut, ofer
coninutul de amidon al eantionului.
12.3.1. Acid clorhidric, soluie cu concentraie 25 % (g/g): 1,126 g/ml.
12.3.2. Acid clorhidric, soluie 1,13 % (greutate/volum)
Concentraia se verific prin titrare folosind o soluie de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru
n prezena roului de metil 0,1 % (greutate/volum) n etanol 94 % (v/v). Pentru neutralizarea a
10 ml snt necesari 30,94 ml de NaOH 0,1 mol/litru.
12.3.3. Soluie Carrez I: se dizolv 21,9 g de acetat de zinc Zn(CH 3 COO) 2 2H 2 O i 3 g
12.3.4. Soluie Carrez II: se dizolv 10,6 g de ferocianur de potasiu K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O
12.3.5. Etanol, soluie cu concentraie de 40 % (v/v): 0,948 g/ml la 20C.
12.4. Dispozitive
12.4.1. Flacon Erlenmeyer de 250 ml cu mbinare de sticl lefuit standard i cu
condensator cu reflux.
12.4.2. Polarimetru sau zaharimetru.
12.5. Procedura de aplicare
Eantionul se zdrobete pn cnd devine suficient de fin pentru a trece complet printr-o
sit cu orificii rotunde de 0,5 mm.
12.5.2. Determinarea rotaiei optice totale (P sau S) (a se vedea observaia de la
subpunctul 12.7.1.)
Se cntresc 2,5 g din eantionul zdrobit cu abatere de 1 mg i se introduc ntr-un balon
gradat de 100 ml. Se adaug 25 ml de acid clorhidric, conform prevederilor subpunctului
12.3.2., se agit pentru a obine o distribuie uniform a eantionului de testat i se adaug nc
25 ml de acid clorhidric (a se vedea meniunea de la subpunctul 12.3.2.). Se scufund balonul
ntr-o baie de ap care fierbe, agitndu-se cu putere i n mod constant n primele trei minute
pentru a preveni formarea de aglomerri. Cantitatea de ap din baia de ap trebuie s fie
suficient pentru ca baia s rmn la punctul de fierbere atunci cnd balonul este introdus n
ea. Balonul nu trebuie s fie scos din baie n timp ce este agitat. Dup exact 15 minute, se
scoate din baie, se adaug 30 ml de ap rece i se rcete imediat la 20C.
Se adaug 5 ml de soluie Carrez I i se agit timp de aproximativ 30 de secunde. Apoi
se adaug 5 ml de soluie Carrez II i se agit din nou timp de aproximativ 30 de secunde. Se
completeaz cu ap pn la volum, se amestec i se filtreaz. Dac filtratul nu este perfect
limpede (ceea ce se ntmpl rar), se repet determinarea folosind o cantitate mai mare din
soluiile Carrez I i II, de exemplu 10 ml.
Se msoar rotaia optic a soluiei ntr-un tub de 200 mm cu polarimetrul sau cu
zaharimetrul.
12.5.3. Determinarea rotaiei optice (P' sau S') a substanelor solubile n etanol 40 %
Se cntresc 5 g din eantion cu abatere de 1 mg, se introduc ntr-un balon gradat de
100 ml i se adaug aproximativ 80 ml de etanol (a se vedea observaia de la subpunctul
12.7.2.). Se las balonul s stea timp de o or la temperatura camerei; n acest timp, se agit cu
putere de ase ori astfel nct eantionul de testat s se amestece complet cu etanolul. Se
completeaz pn la volum cu etanol, se amestec i se filtreaz.
42
Se pipeteaz 50 ml de filtrat (corespunde la 2,5 g de eantion) ntr-un flacon

Erlenmeyer de 250 ml, se adaug 2,1 ml de acid clorhidric (a se vedea meniunea de la
subpunctul 12.3.1.) i se agit puternic. La flaconul Erlenmeyer se monteaz un condensator
cu reflux, iar vasul se scufund ntr-o baie de ap n fierbere. Dup exact 15 minute, se scoate
flaconul Erlenmeyer din baie, se transfer coninutul ntr-un balon gradat de 100 ml, cltind cu
puin ap rece i se rcete la 20C.
Se limpezete folosind soluiile Carrez I i II, se completeaz pn la volum cu ap, se
amestec, se filtreaz i se msoar rotaia optic astfel cum se indic la subpunctul 12.5.2.
Coninutul de amidon (%) se calculeaz dup cum urmeaz:
12.6.1. Msurare cu polarimetrul
Coninut de amidon (%) = 2 000 (P P1) / [] D 20,
unde:
P = rotaia optic total n grade unghiulare;
P' = rotaia optic n grade unghiulare a substanelor solubile n etanol 40 % (V/V);
[] D 20 = rotaia optic specific a amidonului pur. Valorile numerice acceptate n mod
convenional pentru acest factor snt urmtoarele:
+ 185,9 : amidon din orez
+ 185,7 : amidon din cartofi
+ 184,6 : amidon din porumb
+ 182,7 : amidon din gru
+ 181,5 : amidon din orz
+ 181,3 : amidon din ovz
+ 184,0 : alte tipuri de amidon i amestecuri de amidon n nutreuri combinate.
12.6.2. Msurare cu zaharimetrul

Coninut de amidon (%) = 2 000 / [] D 20 (2N 0,665) (S S1) / 100 26,6N (S S1) /
[] D 20,
unde:
S = rotaia optic total n grade zaharimetrice;
S' = rotaia optic n grade zaharimetrice a substanelor solubile n etanol 40 % (v/v);
N = greutatea (g) zaharozei n 100 ml de ap determinnd o rotaie optic de 100 grade
zaharimetrice msurat cu un tub de 200 mm
16,29 g pentru zaharimetrele franceze
26 g pentru zaharimetrele germane
20 g pentru zaharimetrele mixte;
[] D 20 = rotaia optic specific a amidonului pur (a se vedea indicaiile de la
subpunctul 12.6.1.).
trebuie s depeasc 0,4 n valoare absolut pentru un coninut de amidon mai mic de 40 % i
1 % n valoare relativ n cazul coninutului de amidon egal sau mai mare de 40 %.
12.7. Observaii
43
12.7.1. n cazul n care eantionul conine mai mult de 6 % carbonai, calculai sub
form de carbonat de calciu, acetia trebuie distrui prin tratare cu o cantitate perfect adecvat
de acid sulfuric diluat naintea determinrii rotaiei optice totale.
12.7.2. n cazul produselor cu un coninut mare de lactoz, cum ar fi zerul praf sau
laptele praf degresat, se procedeaz dup cum urmeaz dup adugarea a 80 ml etanol. La
balon se fixeaz un condensator cu reflux, iar balonul se scufund ntr-o baie de ap la 50C
timp de 30 minute. Se las s se rceasc i se continu analiza astfel cum se indic la
subpunctul 12.5.3.
12.7.3. n cazul n care snt prezente n cantiti semnificative n nutreuri, urmtoarele
materii prime pentru nutreuri snt cunoscute ca dnd natere la interferene atunci cnd
coninutul de amidon se determin prin metoda polarimetric i, din acest motiv, se pot obine
rezultate incorecte:
produse din sfecl (de zahr), precum pulp de sfecl (de zahr), melas de sfecl (de
zahr), pulp melasat de sfecl (de zahr), vinas de sfecl (de zahr), zahr (din sfecl);
pulp de citrice;
semine de in; rot de semine de in; rot de semine de in rezultat dup extracie;
semine de rapi; rot de semine de rapi; rot de semine de rapi rezultat dup
extracie; coji de semine de rapi;
semine de floarea soarelui; rot de semine de floarea soarelui rezultat dup extracie;
semine de floarea soarelui parial decorticate, rezultate dup extracie;
rot de copra; rot de copra rezultat dup extracie;
pulp de cartofi;
drojdie deshidratat;
produse bogate n inulin (de exemplu, fulgi i fin de topinambur);
jumri.
XIII. Determinarea coninutului de cenu brut
Prezenta metod permite determinarea n nutreuri a coninutului de cenu brut.
Eantionul se calcineaz la 550C; reziduul se cntrete.
13.3. Reactiv utilizat
Nitrat de amoniu, soluie 20 % (greutate/volum).
13.4. Dispozitive
13.4.1. Plit.
13.4.2. Cuptor electric cu mufl, dotat cu termostat.
13.4.3. Creuzete pentru calcinare fabricate din silice, porelan sau platin, de form
rectangular (aproximativ 60 40 25 mm) sau circular (diametru: 60-75 mm, nlime: 2040 mm).
Se cntresc aproximativ 5 g de eantion cu o abatere de 1 mg (2,5 g pentru produsele
cu tendin de umflare) i se introduc ntr-un creuzet pentru calcinare, care n prealabil a fost
nclzit la 550C, rcit i tarat. Se aeaz creuzetul pe plit i se nclzete progresiv pn la
carbonizarea materialului. Se calcineaz n conformitate cu meniunile de la subpunctul 13.5.1.
sau 13.5.2.
13.5.1. Se introduce creuzetul n cuptorul cu mufl calibrat, reglat la 550C. Se
menine la aceast temperatur pn la obinerea unei cenui albe, gri deschis sau roiatice,
aparent lipsit de particule carbonizate. Se introduce creuzetul ntr-un desicator, se las s se
rceasc i se cntrete imediat.
44
13.5.2. Se introduce creuzetul n cuptorul cu mufl calibrat, reglat la 550C. Se

calcineaz timp de 3 ore. Se introduce creuzetul ntr-un desicator, se las s se rceasc i se
cntrete imediat. Se calcineaz din nou timp de 30 minute pentru a asigura c greutatea
cenuii rmne constant (pierderea de greutate ntre dou cntriri succesive trebuie s fie mai
mic sau egal cu 1 mg).
Greutatea reziduului se calculeaz prin deducerea tarei.
Rezultatul se exprim ca procent din eantion.
13.7. Observaii
13.7.1. Cenua substanelor dificil de calcinat trebuie supus unei calcinri iniiale timp
de cel puin trei ore, urmat de rcire i de adugarea ctorva picturi de soluie de nitrat de
amoniu 20 % sau de ap (cu grij, pentru a evita dispersarea cenuii i formarea de
aglomerri). Se continu calcinarea dup uscarea n cuptor. Operaia se repet pn cnd
calcinarea este complet.
13.7.2. n cazul substanelor rezistente la tratamentul descris n subpunctul 13.7.1., se
procedeaz n felul urmtor: dup calcinare timp de trei ore, se introduce cenua n ap cald i
se filtreaz printr-un filtru mic, lipsit de cenu. Filtrul i coninutul su se calcineaz n
creuzetul iniial. Filtratul se introduce n creuzetul rcit, se evapor pn la uscare, se
calcineaz i se cntrete.
13.7.3. n cazul uleiurilor i grsimilor, se cntresc cu precizie 25 g de eantion ntr-un
creuzet de dimensiuni adecvate. Se carbonizeaz prin aprinderea materialului cu ajutorul unei
benzi de filtru de hrtie, lipsit de cenu. Dup combustie, se umecteaz cu ct mai puin ap.
Se usuc i se calcineaz astfel cum se descrie n subpunctul 13.5.
XIV. Determinarea cenuii insolubile n acid clorhidric
Prezenta metod permite determinarea n nutreuri a coninutului de substane minerale
insolubile n acid clorhidric.
Se pot utiliza dou metode, n funcie de natura eantionului.
14.1.1. Metoda A: aplicabil materiilor prime pentru nutreuri organice i majoritii
nutreurilor combinate.
14.1.2. Metoda B: aplicabil compuilor i amestecurilor minerale, precum nutreurilor
combinate al cror coninut de substane insolubile n acid clorhidric, determinat conform
metodei A, este mai mare de 1 %.
14.2.1. Metoda A: eantionul se calcineaz, cenua se fierbe n acid clorhidric, iar
reziduul insolubil se filtreaz i se cntrete.
14.2.2. Metoda B: eantionul se trateaz cu acid clorhidric. Soluia se filtreaz, reziduul
se calcineaz, iar cenua astfel obinut se trateaz conform metodei A.
14.3.1. Acid clorhidric 3 mol/litru.
14.4. Dispozitive
14.4.1. Plit.
14.4.2. Cuptor electric cu mufl, dotat cu termostat.
14.4.3. Creuzete pentru calcinare fabricate din silice, porelan sau platin, de form
rectangular (aproximativ 60 40 25 mm) sau circular (diametru: 60-75 mm, nlime: 2040 mm).
45
14.5.1. Metoda A:
Eantionul se calcineaz pentru determinarea cenuii brute. Se poate utiliza i cenu
obinut din analiza respectiv.
Se introduce cenua ntr-un pahar de laborator de 250-400 ml, utiliznd 75 ml de acid
clorhidric. Se aduce lent la fierbere i se fierbe ncet timp de cincisprezece minute. Soluia
cald se filtreaz printr-un filtru de hrtie lipsit de cenu, iar reziduul se spal cu ap cald
pn cnd reacia acid nu mai este vizibil. Filtrul care conine reziduul se usuc i se
calcineaz ntr-un creuzet tarat, la o temperatur de minimum 550C i maximum 700C. Se
rcete ntr-un desicator i se cntrete.
14.5.2. Metoda B
Se cntresc 5 g de eantion cu o abatere de 1 mg i se introduc ntr-un pahar de
laborator de 250-400 ml. Se adaug succesiv 25 ml ap i 25 ml acid clorhidric, se amestec i
se ateapt ca efervescena s nceteze. Se adaug nc 50 ml de acid clorhidric. Se ateapt ca
degajarea de gaz s nceteze, apoi se introduce paharul de laborator ntr-o baie de ap la
temperatura de fierbere i se menine acolo timp de 30 de minute sau, dac este necesar, mai
mult, pentru ca amidonul eventual prezent s se hidrolizeze complet. Se filtreaz pn este nc
cald, printr-un filtru lipsit de cenu, iar filtrul se spal n 50 ml de ap cald (a se vedea
observaia indicat n subpunctul 14.7.). Se introduce filtrul care conine reziduul ntr-un
creuzet pentru calcinare, se usuc i se calcineaz la o temperatur de minimum 550C i
maximum 700C. Se introduce cenua ntr-un pahar de laborator de 250-400 ml, utiliznd 75
ml de acid clorhidric; se continu astfel cum se descrie n subpunctul 14.5.1.
Se calculeaz greutatea reziduului prin deducerea tarei. Rezultatul se exprim ca
procent din eantion.
14.7. Observaie
Dac filtrarea se dovedete dificil, se reia analiza, nlocuind cei 50 ml de acid
clorhidric cu 50 ml de acid tricloracetic 20 % i splnd filtrul ntr-o soluie cald de acid
tricloracetic 1 %.
XV. Determinarea carbonailor
Prezenta metod permite determinarea n majoritatea nutreurilor a cantitii de
carbonai, exprimai n mod convenional ca i carbonat de calciu.
Carbonaii se descompun n acidul clorhidric; dioxidul de carbon eliberat se colecteaz
ntr-un tub gradat, iar volumul su se compar cu cel eliberat n aceleai condiii de o cantitate
cunoscut de carbonat de calciu.
15.3.1. Acid clorhidric, concentraie 1,10 g/ml.
15.3.2. Carbonat de calciu.
15.3.3. Acid sulfuric, aproximativ 0,05 mol/litru, colorat cu rou de metil.
15.4. Dispozitiv
Aparat Scheibler-Dietrich.
Coninutul de carbonai, exprimai ca i carbonat de calciu, se calculeaz prin utilizarea
urmtoarei formule:
X = V 100 / V 1 2m,
46
unde:
X = % (g/g) de carbonai n eantioane, exprimai ca i carbonat de calciu;
V = ml de CO 2 eliberat de poria de eantion;
V 1 = ml de CO 2 eliberat de 0,5 g de CaCO 3 ;
m = greutatea, n grame, a poriei de eantion.
XVI. Determinarea fosforului total

Metoda fotometric
Prezenta metod permite determinarea n nutreuri a coninutului de fosfor total. Ea
este indicat n special pentru analiza produselor srace n fosfor. n anumite cazuri (produs
bogat n fosfor), se poate utiliza o metod gravimetric.
Eantionul se mineralizeaz, fie prin combustie uscat (n cazul nutreurilor organice),
fie prin dizolvare n mediu acid (n cazul nutreurilor combinate minerale i al celor lichide),
iar apoi se introduce n soluie acid.
Soluia se trateaz cu reactivul molibdovanadat. Densitatea optic a soluiei galbene
astfel formate se msoar cu un spectrofotometru la 430 nm.
16.3.1. Carbonat de calciu.
16.3.2. Acid clorhidric, 20 = 1,10 g/ml (aproximativ 6 mol/litru).
16.3.3. Acid azotic, 20 = 1,045 g/ml.
16.3.4. Acid azotic, 20 = 1,38-1,42 g/ml.
16.3.5. Acid sulfuric, 20 = 1,84 g/ml.
16.3.6. Reactiv molibdovanadat: se amestec 200 ml de soluie de heptamolibdat de
amoniu (a se vedea meniunea de la subpunctul 16.3.6.1.), 200 ml de soluie de monovanadat
de amoniu, conform indicaiilor de la subpunctul 16.3.6.2. i 134 ml de acid azotic, indicat n
subpunctul 16.3.4., ntr-un balon gradat de 1 litru. Se completeaz pn la volum cu ap.
16.3.6.1. Soluie de heptamolibdat de amoniu: se dizolv n ap fierbinte 100 g de
heptamolibdat de amoniu (NH 4 ) 6Mo 7 O 24 4H 2 O. Se adaug 10 ml de amoniac (concentraie
0,91 g/ml) i se completeaz cu ap pn la 1 litru.
16.3.6.2. Soluie de monovanadat de amoniu: se dizolv 2,35 g de monovanadat de
amoniu NH 4 VO 3 n 400 ml de ap fierbinte. Amestecnd constant, se adaug lent 20 ml de
acid azotic diluat [7 ml de HNO 3 , indicat n subpunctul 16.3.4., + 13 ml de H 2 O] i se
completeaz cu ap pn la 1 litru.
16.3.7. Soluie etalon de 1 mg de fosfor per ml: se dizolv 4,387 g de fosfat diacid de
potasiu KH 2 PO 4 n ap. Se completeaz cu ap pn la 1 litru.
16.4. Dispozitive
16.4.1. Creuzete pentru calcinare din silice, porelan sau platin.
16.4.2. Cuptor cu mufl electric, dotat cu termostat reglat la 550C.
16.4.3. Flacon Kjeldahl de 250 ml.
16.4.4. Baloane gradate i pipete de precizie.
16.4.6. Eprubete cu diametru de aproximativ 16 mm, cu dopuri gradate la un diametru
de 14,5 mm; capacitate: 25-30 ml.
47

16.5.1. Prepararea soluiei
n funcie de natura eantionului, soluia se prepar astfel cum se indic n subpunctul
16.5.1.1. sau 16.5.1.2.
16.5.1.1. Procedura uzual
Se cntrete 1 g de eantion, sau mai mult, cu o abatere de 1 mg. Se introduce
eantionul de testat ntr-un flacon Kjeldahl, se adaug 20 ml de acid sulfuric, se agit pentru a
impregna complet substana cu acid i pentru a preveni ca substana s adere pe pereii
flaconului, se nclzete i se menine la punctul de fierbere timp de 10 minute. Se las s se
rceasc uor, se adaug 2 ml de acid azotic (a se vedea meniunea de la subpunctul 16.3.4.),
se nclzete uor, se las s se rceasc uor, se mai adaug puin acid azotic, indicat n
subpunctul 16.3.4. i se readuce la punctul de fierbere. Se repet aceast procedur pn se
obine o soluie incolor. Se rcete, se adaug puin ap, se decanteaz lichidul ntr-un balon
gradat de 500 ml cltind flaconul Kjeldahl cu ap fierbinte. Se las s se rceasc, se
completeaz pn la volum cu ap, se omogenizeaz i se filtreaz.
16.5.1.2. Eantioane care conin substane organice i snt lipsite de fosfai diacizi de
calciu i magneziu
Se cntresc aproximativ 2,5 g de eantion cu abatere de 1 mg ntr-un creuzet de
calcinare. Se amestec eantionul de testat cu 1 g de carbonat de calciu pn cnd se obine un
amestec complet omogen. Se calcineaz n cuptor la 550C pn se obine o cenu alb sau gri
(o cantitate mic de crbune se ignor). Se transfer cenua ntr-un pahar de laborator de 250
ml. Se adaug 20 ml de ap i acid clorhidric pn cnd efervescena nceteaz. Se adaug nc
10 ml de acid clorhidric. Se aeaz paharul de laborator pe o baie de nisip i coninutul se
evapor pn la uscare, pentru a face silicea insolubil. Se redizolv reziduul n 10 ml de acid
azotic (a se vedea meniunea de la subpunctul 16.3.3.) i se fierbe pe baia de nisip sau pe o
plit timp de 5 minute, fr a se evapora pn la uscare. Se decanteaz lichidul ntr-un balon
gradat de 500 ml, cltind paharul de mai multe ori cu ap fierbinte. Se las s se rceasc, se
completeaz pn la volum cu ap, se omogenizeaz i se filtreaz.
16.5.2. Apariia coloraiei i msurarea densitii optice
Se dilueaz o parte alicot de filtrat obinut ca la subpunctul 16.5.1.1. sau 16.5.1.2.
pentru a obine o concentraie de fosfor de maximum 40 g/ml. Se introduc 10 ml din aceast
soluie ntr-o eprubet, descris n subpunctul 16.4.6 i se adaug 10 ml de reactiv
molibdovanadat. Se omogenizeaz i se las s stea timp de cel puin 10 minute la 20C.
Densitatea optic se msoar cu un spectrofotometru la 430 nm, prin comparaie cu o soluie
obinut prin adugarea de 10 ml de reactiv molibdovanadat la 10 ml de ap.
16.5.3. Curba de calibrare
Din soluia etalon (a se vedea meniunea de la subpunctul 16.3.7.) se prepar soluii
care conin 5, 10, 20, 30 i 40 g de fosfor per ml, respectiv. Se iau 10 ml din fiecare din
aceste soluii i se adaug la 10 ml de reactiv molibdovanadat. Se omogenizeaz i se las s
stea timp de cel puin 10 minute la 20C. Densitatea optic se msoar astfel cum se indic n
subpunctul 16.5.2.
Se traseaz curba de calibrare prin nscrierea grafic a densitilor optice n raport cu
cantitile corespunztoare de fosfor. Pentru concentraii cuprinse ntre 0 i 40 g/ml, curba va
fi liniar.
Cantitatea de fosfor din eantionul de testat se determin prin utilizarea curbei de
calibrare.
Rezultatul se exprim ca procent din eantion.
48
Repetabilitatea
eantion nu depesc:
3 %, relativ la rezultatul mai mare, pentru un coninut de fosfor mai mic de 5 %;
0,15 % n valoare absolut, pentru un coninut de fosfor egal sau mai mare de 5 %.
XVII. Determinarea clorului din cloruri
Prezenta metod permite determinarea cantitii de clor din clorurile solubile n ap,
exprimate convenional ca clorur de sodiu. Este aplicabil tuturor nutreurilor.
Clorurile se dizolv n ap. Dac produsul conine materii organice, se limpezete.
Soluia se acidific uor cu acid azotic, iar clorurile se precipit sub form de clorur de argint
cu ajutorul unei soluii de nitrat de argint. Excesul de nitrat de argint se titreaz cu o soluie de
tiocianat de amoniu, prin metoda Volhard.
17.3.1. Soluie de tiocianat de amoniu 0,1 mol/litru.
17.3.2. Soluie de nitrat de argint 0,1 mol/litru.
17.3.3. Soluie saturat de sulfat feric de amoniu (NH 4 )Fe(SO 4 ) 2 .
17.3.4. Acid azotic, concentraie: 1,38 g/ml.
17.3.5. Eter dietilic.
17.3.6. Aceton.
17.3.7. Soluie Carrez I: se dizolv 21,9 g de acetat de zinc Zn(CH3 COO) 2 2H 2 O i 3 g
17.3.8. Soluie Carrez II: se dizolv 10,6 g de ferocianur de potasiu K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O
17.3.9. Crbune activ, lipsit de cloruri i fr a le absorbi.
17.4. Dispozitiv
Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.
17.5.1. Prepararea soluiei
n funcie de natura eantionului, se prepar o soluie conform indicaiilor menionate
n subpunctul 17.5.1.1., 17.5.1.2. sau 17.5.1.3.
n acelai timp, se efectueaz un test martor fr eantionul de analizat.
17.5.1.1. Eantioane fr materii organice
Se cntresc maximum 10 g de eantion cu o abatere de 1 mg, care conin maximum 3
g de clor sub form de cloruri. Se introduc, mpreun cu 400 ml de ap, ntr-un balon gradat de
500 ml la aproximativ 20C. Se amestec timp de treizeci de minute n agitator, se aduce la
volum, se omogenizeaz i se filtreaz.
17.5.1.2. Eantioane care conin materii organice, cu excepia produselor menionate n
subpunctul 17.5.1.3.
Se cntresc aproximativ 5 g de eantion cu o abatere de 1 mg i se introduc, mpreun
cu 1 g de crbune activ, ntr-un balon gradat de 500 ml. Se adaug 400 ml ap la aproximativ
20C i 5 ml de soluie Carrez I, se amestec timp de 30 de secunde, apoi se adaug 5 ml de
soluie Carrez II. Se amestec timp de treizeci de minute n agitator, se aduce la volum, se
omogenizeaz i se filtreaz.
17.5.1.3. Nutreuri preparate termic, turte i fin de in, produse bogate n fin de in i
alte produse bogate n mucilagii sau n substane coloidale (de exemplu amidon dextrinat)
49
Se prepar soluia astfel cum se descrie n subpunctul 17.5.1.2., dar nu se filtreaz. Se

decanteaz (dac este necesar, se centrifugheaz), se ndeprteaz 100 ml lichid supernatant i
se transfer ntr-un flacon de msurare de 200 ml.
Se amestec cu aceton i se aduce la volum cu acest solvent, se omogenizeaz i se
filtreaz.
17.5.2. Titrarea
Cu ajutorul unei pipete, se transfer ntr-un flacon Erlenmeyer o cantitate cuprins ntre
de 25 i 100 ml de filtrat (n funcie de coninutul anticipat de clor), obinut astfel cum se
descrie n subpunctul 17.5.1.1., 17.5.1.2. sau 17.5.1.3. Poria alicot nu trebuie s conin mai
mult de 150 mg de clor (Cl). Dac este necesar, se dilueaz cu maximum 50 ml de ap, se
adaug 5 ml acid azotic, 20 ml de soluie saturat de sulfat feric de amoniu i dou picturi de
soluie de tiocianat de amoniu transferat cu ajutorul unei biurete umplute pn la gradaia
zero. Cu ajutorul unei biurete, se transfer soluia de nitrat de argint astfel nct s se obin un
exces de 5 ml. Se adaug 5 ml de eter dietilic i se agit puternic pentru a coagula precipitatul.
Excesul de nitrat de argint se titreaz cu soluia de tiocianat de amoniu pn cnd coloraia
maro-rocat a persistat timp de un minut.
Cantitatea de clor (X), exprimat ca % de clorur de sodiu, se calculeaz cu ajutorul
urmtoarei formule:
X = 5,845 (V 1 V 2 ) / m,
unde:
V 1 = ml de soluie de nitrat de argint 0,1 mol/l adugat;
V 2 = ml de soluie de tiocianat de amoniu 0,1 mol/l utilizat la titrare;
m = greutatea eantionului.
Dac testul martor indic un consum de soluie de nitrat de argint 0,1 mol/l, se deduce
aceast valoare din volum (V 1 V 2 ).
17.7. Observaii
17.7.1. Titrarea se poate face i prin poteniometrie.
17.7.2. n cazul produselor foarte bogate n uleiuri i grsimi, se procedeaz mai nti la
o degresare cu eter dietilic sau cu eter de petrol.
17.7.3. n cazul finii de pete, titrarea se poate efectua prin metoda Mohr.
Anexa nr. 4
la Hotrrea Guvernului
nr.686
Metodele de analiz pentru controlul nivelului
admisibil de aditivi n nutreuri
I. Determinarea vitaminei A
Prezenta metod permite determinarea nivelului de vitamin A (retinol) din nutreuri i
premixuri. Vitamina A include alcoolul all-trans-retinil i izomerii si cis, care se determin
prin aceast metod. Coninutul de vitamin A se exprim n uniti internaionale (UI) per kg.
O UI corespunde activitii a 0,3 g de alcool all-trans-vitamin A sau a 0,344 g all-transvitamin A acetat sau 0,550 g all-trans-vitamin A palmitat.
Limita de cuantificare este 2 000 UI de vitamin A/kg.
50

Eantionul se hidrolizeaz cu o soluie de hidroxid de potasiu etanolic, iar vitamina A
se extrage cu eter de petrol.
Solventul se ndeprteaz prin evaporare, iar reziduul se dizolv n metanol i, dac
este cazul, se dilueaz pn la concentraia necesar. Coninutul de vitamin A se determin
prin cromatografie lichid de nalt performan cu faz inversat (RP-HPLC) cu ajutorul unui
detector de UV sau de fluorescen. Parametrii cromatografiei se aleg astfel nct s nu existe
separaie ntre alcoolul all-trans-vitamina A i izomerii si cis.
1.3.1. Etanol, = 96 %.
1.3.3. Metanol.
1.3.4. Soluie de hidroxid de potasiu, c = 50 g/100 ml.
1.3.5. Soluie de ascorbat de sodiu, c = 10 g/100 ml (a se vedea observaiile de la
subpunctul 1.7.7.).
1.3.6. Sulfur de sodiu, Na 2 SxH 2 O (x = 7-9).
1.3.6.1. Soluie de sulfur de sodiu, c = 0,5 mol/l n glicerol, = 120 g/l (pentru x = 9)
(a se vedea observaiile de la subpunctul 1.7.8.).
1.3.7. Soluie de fenolftalein, c = 2 g/100 ml n etanol.
1.3.8. 2-propanol.
1.3.9. Faz mobil pentru HPLC: amestec de metanol i ap, de exemplu 980 + 20 (v +
v). Proporia exact este determinat de caracteristicile coloanei folosite.
1.3.10. Azot, lipsit de oxigen
1.3.11. All-trans-vitamin A acetat, extra pur, cu activitate certificat, de exemplu
2,80 106 UI/g
1.3.11.1. Soluie stoc de all-trans-vitamin A acetat: se cntresc 50 mg de vitamin A
acetat cu o abatere de 0,1 mg ntr-un balon gradat de 100 ml. Se dizolv n 2-propanol i se
completeaz pn la semn cu acelai solvent.
Concentraia nominal a acestei soluii este de 1 400 UI vitamin A per ml. Coninutul
exact se determin n conformitate cu indicaiile de la subpunctul 1.5.6.3.1.
1.3.12. All-trans-vitamin A palmitat, extra pur, cu activitate certificat, de exemplu
1,80 106 UI/g
1.3.12.1. Soluie stoc de all-trans-vitamin A palmitat: se cntresc 80 mg de vitamin
A palmitat cu o abatere de 0,1 mg ntr-un balon gradat de 100 ml. Se dizolv n 2-propanol i
se completeaz pn la semn cu acelai solvent. Concentraia nominal a acestei soluii este de
1 400 UI vitamin A per ml. Coninutul exact se determin n conformitate cu indicaiile de la
subpunctul 1.5.6.3.2.
1.3.13. 2,6-di-ter-butil-4-metilfenol (BHT) (a se vedea observaiile de la subpunctul
1.7.5.).
1.4. Dispozitive
1.4.1. Evaporator rotativ cu vid.
1.4.2. Sticlrie laborator brun.
1.4.2.1. Baloane cu fund plat sau flacoane tip Erlenmeyer, 500 ml, cu orificiu din sticl
lefuit.
1.4.2.2. Baloane gradate cu dopuri de sticl lefuit, cu gt ngust, de 10, 25, 100 i 500
ml.
1.4.2.3. Plnii de separare, conice, 1 000 ml, cu dopuri de sticl lefuit.
1.4.2.4. Flacoane piriforme, 250 ml, cu orificiu din sticl lefuit.
1.4.3. Condensator Allihn, cu lungime a mantalei de 300 mm, cu mbinare de sticl
lefuit i cu adaptor pentru conduct de alimentare cu gaz.
51
1.4.4. Filtru de hrtie plisat pentru separarea fazelor, cu diametru de 185 mm (de
exemplu Schleicher & Schuell 597 HY 1/2).
1.4.5. Echipament HPLC cu sistem de injecie
1.4.5.1. Coloan pentru cromatografie lichid, 250 mm 4 mm, C 18 , cu particule de 5
sau 10 m, sau echivalent (criteriu de performan: un singur vrf pentru toi izomerii de
retinol n condiiile HPLC).
1.4.5.2. Detector de UV sau de fluorescen, cu ajustare variabil a lungimii de und.
1.4.6. Spectrofotometru cu celule de cuar de 10 mm.
1.4.7. Baie de ap cu agitator magnetic.
1.4.8. Aparat de extracie compus din:
1.4.8.1. Cilindru din sticl cu capacitatea de 1 l prevzut cu gt i dop de sticl lefuite.
1.4.8.2. Pies din sticl lefuit echipat cu o tij lateral i un tub reglabil care trece
prin centru. Tubul ajustabil are un capt inferior n form de U i o duz la captul opus,
astfel nct stratul superior de lichid din cilindru s poat fi transferat ntr-o plnie de separare.
Vitamina A este sensibil la lumin (UV) i la oxidare. Toate operaiunile se
efectueaz n absena luminii (se utilizeaz sticlrie brun sau protejat cu o folie de aluminiu)
i a oxigenului (alimentare cu azot). n timpul extraciei, aerul de deasupra lichidului se
nlocuiete cu azot (a se evita excesul de presiune slbind din cnd n cnd dopul).
Se macin eantionul astfel nct s poat trece printr-o sit cu ochiuri de 1 mm,
evitndu-se producerea de cldur. Mcinarea se efectueaz imediat nainte de cntrire i
saponificare, altfel pot exista pierderi de vitamin A.
1.5.2. Saponificarea
n funcie de coninutul de vitamin A, se cntresc 2-25 g de eantion cu o abatere de
1 mg ntr-un balon cu fund plat sau ntr-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml. Se adaug,
agitnd circular, 130 ml de etanol, aproximativ 100 mg de 2,6-di-ter-butil-4-metilfenol (BHT),
2 ml de soluie de ascorbat de sodiu i 2 ml de soluie de sulfur de sodiu. Se monteaz un
condensator (a se vedea meniunea de la subpunctul 1.4.3.) la balon i acesta se scufund ntro baie de ap cu agitator magnetic. Se nclzete pn la fierbere i se las s reflueze timp de
5 minute. Apoi se adaug 25 ml de soluie de hidroxid de potasiu prin condensatorul Allihn i
se las s reflueze timp de nc 25 min, amestecnd continuu sub un jet slab de azot. Apoi se
cltete condensatorul cu aproximativ 20 ml de ap, iar coninutul balonului se las s se
rceasc la temperatura camerei.
1.5.3. Procedura de extracie
Se transfer cantitativ prin decantare soluia de saponificare cltind cu un volum total
de 250 ml de ap ntr-o plnie de separare de 1 000 ml sau n aparatul de extracie. Se cltete
balonul utilizat la saponificare succesiv cu 25 ml de etanol i 100 ml de eter de petrol, iar
lichidul de cltire se transfer n plnia de separare sau n aparatul de extracie. Proporia de
ap i etanol n soluiile combinate trebuie s fie de aproximativ 2:1. Se agit energic timp de
2 minute i se las la decantat timp de 2 minute.
1.5.3.1. Extracia cu ajutorul unei plnii de separare (a se vedea meniunea de la
subpunctul 1.4.2.3.)
Cnd straturile s-au separat (a se vedea observaia de la subpunctul 1.7.3.), se transfer
stratul de eter de petrol ntr-o alt plnie de separare. Se repet de dou ori aceast extracie cu
100 ml de eter de petrol, apoi de nc dou ori cu 50 ml de eter de petrol.
Se spal de dou ori extractele combinate n plnia de separare agitnd circular uor
(pentru a se evita formarea de emulsii) cu porii de 100 ml de ap i repetnd agitarea cu alte
porii de ap de 100 ml pn cnd apa rmne incolor la adugarea de soluie de fenolftalein
52
(patru splri snt de obicei suficiente). Se filtreaz extractul splat cu un filtru plisat uscat
pentru separarea fazelor cu scopul de a se ndeprta apa suspendat ntr-un balon gradat de 500
ml. Se cltete plnia de separare i filtrul cu 50 ml de eter de petrol, se completeaz pn la
semn cu eter de petrol i se amestec bine.
1.5.3.2. Extracia cu ajutorul unui aparat de extracie (a se vedea meniunea de la
subpunctul 1.4.8.)
Cnd straturile s-au separat (a se vedea observaia de la subpunctul 1.7.3.), se
nlocuiete dopul cilindrului de sticl cu piesa din sticl lefuit i se amplaseaz captul
inferior n form de U a tubului reglabil astfel nct s se afle exact deasupra nivelului
interfeei. Aplicnd o presiune din linia de azot asupra tijei laterale, se transfer stratul superior
de eter de petrol ntr-o plnie de separare de 1 000 ml. Se adaug 100 ml de eter de petrol n
cilindrul de sticl, se pune dopul i se agit energic. Se las straturile s se separe i se
transfer stratul superior n plnia de separare. Se repet procedura de extracie cu nc 100 ml
de eter de petrol, apoi de dou ori cu porii de 50 ml de eter de petrol i se adaug straturile de
eter de petrol n plnia de separare.
Se spal extractele combinate de eter de petrol astfel cum se descrie la subpunctul
1.5.3.1. i se procedeaz astfel cum se descrie la subpunctul respectiv.
1.5.4. Prepararea soluiei eantion pentru HPLC
Se pipeteaz o porie alicot din soluia de eter de petrol (de la subpunctul 1.5.3.1. sau
1.5.3.2.) ntr-un flacon piriform de 250 ml. Se evapor solventul aproape pn la uscare n
evaporatorul rotativ cu presiune redus la o temperatur a bii care s nu depeasc 40C. Se
restabilete presiunea atmosferic prin admisia azotului i se ndeprteaz flaconul din
evaporatorul rotativ. Se elimin restul de solvent cu un jet de azot, iar reziduul se dizolv
imediat ntr-un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (concentraia de vitamin A trebuie s
fie cuprins n intervalul 5-30 UI/ml).
Vitamina A se separ pe o coloan cu faz inversat C 18 (a se vedea meniunea de la
subpunctul 1.4.5.1.), iar concentraia se msoar cu un detector de UV (325 nm) sau un
detector de fluorescen (excitaie: 325 nm, emisie: 475 nm) (1.4.5.2.).
Se injecteaz o porie alicot (de exemplu 20 l) din soluia metanolic obinut la
subpunctul 1.5.4. i se elueaz cu faza mobil, descris n subpunctul 1.3.9. Se calculeaz
nlimea medie a vrfului (aria) mai multor injectri ale aceleiai soluii de eantion i
nlimile (ariile) medii ale vrfurilor mai multor injectri ale soluiilor de calibrare, conform
prevederilor subpunctului 1.5.6.2.
Condiii HPLC
Urmtoarele condiii specificate n tabelul nr. 1 din prezenta anex se ofer cu titlu
orientativ; se pot aplica alte condiii cu condiia ca ele s genereze rezultate echivalente.
Tabelul nr. 1
Condiii HPLC
Tehnica de msurare
conform specificaiilor de la subpunctul
1.4.5.1.
subpunctul 1.3.9.)
Rata fluxului
Valorile indicate
10 m sau echivalent
Mixtur de metanol (a se vedea meniunea de
la subpunctul 1.3.3.) i ap, de exemplu 980 +
20 (v + v)
1 -2 ml/minut
53
Detector (a se vedea meniunea de la Detector de UV (325 nm) sau detector de

fluorescen (excitaie: 325 nm/emisie: 475
nm)
1.5.6. Calibrarea
1.5.6.1. Prepararea soluiilor etalon de lucru
Se pipeteaz 20 ml de soluie stoc de vitamin A acetat sau 20 ml de soluie stoc de
vitamin A palmitat ntr-un balon cu fund plat sau ntr-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml i
se hidrolizeaz astfel cum se descrie n subpunctul 1.5.2., dar fr a se aduga 2,6-di-ter-butil4-metilfenol (BHT). n continuare se extrage cu eter de petrol conform prevederilor descrise n
subpunctul 1.5.3. i se completeaz pn la 500 ml cu eter de petrol. Se evapor 100 ml din
acest extract n evaporatorul rotativ (a se vedea meniunea de la subpunctul 1.5.4.) aproape
pn la uscare, se ndeprteaz solventul care rmne cu un jet de azot i se redizolv reziduul
n 10 ml de metanol. Concentraia nominal a acestei soluii este de 560 UI vitamin A per ml.
Coninutul exact se determin n conformitate cu indicaiile de la subpunctul 1.5.6.3.3.
Soluia etalon de lucru trebuie proaspt preparat nainte de utilizare.
Se pipeteaz 2 ml din aceast soluie etalon de lucru ntr-un balon gradat de 20 ml, se
completeaz pn la semn cu metanol i se amestec. Concentraia nominal a acestei soluii
etalon de lucru diluate este de 56 UI de vitamin A per ml.
1.5.6.2. Prepararea soluiilor de calibrare i curba de calibrare
Se transfer 1, 2, 5 i 10 ml din soluia etalon de lucru diluat ntr-o serie de baloane
gradate de 20 ml, se completeaz pn la semn cu metanol i se amestec. Concentraiile
nominale ale acestor soluii snt de 2,8, 5,6, 14 i respectiv 28 UI de vitamin A per ml.
Se injecteaz de mai multe ori cte 20 l din fiecare soluie de calibrare i se determin
nlimile medii (ariile) ale vrfurilor. Utiliznd nlimile (ariile) medii ale vrfurilor, se
traseaz o curb de calibrare innd cont de rezultatele obinute cu soluia de control UV (a se
vedea indicaia de la subpunctul 1.5.6.3.3.).
1.5.6.3. Standardizarea UV (sub aciunea razelor ultraviolete) a soluiilor etalon
1.5.6.3.1. Soluia stoc de vitamin A acetat
Se pipeteaz 2 ml din soluia stoc de vitamin A acetat ntr-un balon gradat de 50 ml i
se completeaz pn la semn cu 2-propanol. Concentraia nominal a acestei soluii este de 56
UI de vitamin A per ml. Se pipeteaz 3 ml din aceast soluie diluat de vitamin A acetat
ntr-un balon gradat de 25 ml i se completeaz pn la semn cu 2-propanol. Concentraia
nominal a acestei soluii este de 6,72 UI de vitamin A per ml. Se msoar spectrul UV al
acestei soluii comparativ cu cel al soluiei de 2-propanol, n spectrofotometru, n intervalul
300-400 nm. Maximumul de extincie trebuie s fie ntre 325 i 327 nm.
Calculul coninutului de vitamin A:
UI vitamin A/ml = E 326 19
(E 1 1 % cm pentru vitamin A acetat = 1 530 la 326 nm n 2-propanol)
1.5.6.3.2. Soluia stoc de vitamin A palmitat
Se pipeteaz 2 ml de soluie stoc de vitamin A palmitat ntr-un balon gradat de 50 ml
i se completeaz pn la gradaie cu propanol-2. Concentraia nominal a acestei soluii este
de 56 UI de vitamin A per ml. Se pipeteaz 3 ml din aceast soluie diluat de vitamin A
palmitat ntr-un balon gradat de 25 ml i se completeaz pn la semn cu 2-propanol.
Concentraia nominal a acestei soluii este de 6,72 UI de vitamin A per ml. Se msoar
spectrul UV al acestei soluii comparativ cu cel al soluiei de 2-propanol, n spectrofotometru,
n intervalul 300-400 nm. Maximumul de extincie trebuie s fie ntre 325 i 327 nm.
54

UI vitamin A/ml = E 326 19
(E 1 1 % cm pentru vitamin A palmitat = 957 la 326 nm n 2-propanol)
1.5.6.3.3. Soluia etalon de lucru de vitamin A
Se pipeteaz 3 ml din soluia etalon de lucru nediluat de vitamin A, preparat
conform prevederilor descrise n subpunctul 1.5.6.1, ntr-un balon gradat de 50 ml i se
completeaz pn la semn cu 2-propanol. Se pipeteaz 5 ml din aceast soluie ntr-un balon
gradat de 25 ml i se completeaz pn la semn cu 2-propanol. Concentraia nominal a acestei
soluii este de 6,72 UI de vitamin A per ml. Se msoar spectrul UV al acestei soluii
comparativ cu cel al soluiei de 2-propanol, n spectrofotometru, n intervalul 300-400 nm.
Maximumul de extincie trebuie s fie ntre 325 i 327 nm.
UI vitamin A/ml = E 326 18,3
(E 1 1 % cm pentru vitamin A alcool = 1 821 la 325 nm n 2-propanol)
Din nlimea (aria) medie a vrfurilor de vitamin A ale soluiei de eantion se
determin concentraia soluiei de eantion n UI/ml prin referire la curba de calibrare.
Coninutul w de vitamin A al eantionului, n UI/kg, este dat de urmtoarea formul:
w = 500 c V 2 1 000 / V 1 m [UI/kg],
n care:
c = concentraia de vitamin A a soluiei de eantion (a se vedea meniunea de la
subpunctul 1.5.4.), n UI/ml;
V 1 = volumul soluiei de eantion ((a se vedea meniunea de la subpunctul 1.5.4), n
ml;
V 2 = volumul de alicot prelevat la subpunctul 1.5.4., n ml;
m = greutatea poriei de testat, n g.
1.7. Observaii
1.7.1. Pentru eantioanele cu concentraii mici de vitamin A poate fi util combinarea
extractelor cu eter de petrol provenite din dou operaii de saponificare (cantitate cntrit: 25
g) ntr-o soluie de eantion pentru determinare prin HPLC.
1.7.2. Greutatea eantionului prelevat pentru analiz nu conine mai mult de 2 g de
grsimi.
1.7.3. Dac separarea fazelor nu are loc, se adaug aproximativ 10 ml de etanol pentru
a fragmenta emulsia.
1.7.4. n cazul uleiului din ficat i al altor grsimi pure, timpul de saponificare se
prelungete la 45-60 minute.
1.7.5. Hidrochinona poate fi folosit n locul 2,6-di-ter-butil-4-metilfenol (BHT).
1.7.6. Utilizndu-se o coloan cu faz normal, separarea izomerilor de retinol este
posibil. Dar n acest caz, nlimile (ariile) vrfurilor izomerilor all-cis i all-trans trebuie
nsumate pentru a face calcule.
55
1.7.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg de soluie de acid ascorbic n locul soluiei de
ascorbat de sodiu.
1.7.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg de EDTA n locul soluiei de sulfur de sodiu.
1.7.9. n cazul analizei vitaminei A n nlocuitorii de lapte, se acord o atenie
deosebit la:
saponificare: din cauza cantitii de grsimi prezente n eantion, poate fi necesar
creterea cantitii de soluie de hidroxid de potasiu;
extracie: din cauza prezenei emulsiilor, poate fi necesar adaptarea valorii raportului
de 2:1 pentru ap/etanol.
Pentru a verifica dac metoda de analizare aplicat genereaz rezultate fiabile pentru
aceast matrice specific (nlocuitor de lapte), se aplic un test de recuperare pe o porie
suplimentar de testat. Dac rata de recuperare este mai mic de 80 %, rezultatul analitic
trebuie corectat n funcie de recuperare.
eantion nu trebuie s depeasc 15 % relativ la rezultatul mai mare.
II. Determinarea vitaminei E
Prezenta metod permite determinarea nivelului de vitamin E din nutreuri i
premixuri. Coninutul de vitamin E se exprim ca mg DL--tocoferol acetat per kg. 1 mg DL-tocoferol acetat corespunde la 0,91 mg DL--tocoferol (vitamin E).
Limita de cuantificare este 2 mg de vitamin E/kg. Aceast limit de cuantificare se
obine doar cu detectorul de fluorescen. Cu un detector de UV, limita de cuantificare este 10
mg/kg.
Eantionul se hidrolizeaz cu o soluie etanolic de hidroxid de potasiu, iar vitamina E
se extrage cu eter de petrol. Solventul se ndeprteaz prin evaporare, iar reziduul se dizolv n
metanol i, dac este necesar, se dilueaz pn la concentraia necesar. Coninutul de vitamina
E se determin prin cromatografie lichid de nalt performan cu faz inversat (RP-HPLC),
utiliznd un detector de fluorescen sau de UV.
2.3.1. Etanol, = 96 %.
2.3.3. Metanol.
2.3.4. Soluie de hidroxid de potasiu, c = 50 g/100 ml.
2.3.5. Soluie de ascorbat de sodiu, c = 10 g/100 ml (a se vedea observaiile de la
subpunctul 2.7.7.).
2.3.6. Sulfur de sodiu, Na 2 SxH 2 O (x = 7-9).
2.3.6.1. Soluie de sulfur de sodiu, c = 0,5 mol/l n glicerol, = 120 g/l (pentru x = 9)
(a se vedea observaiile de la subpunctul 2.7.8.).
2.3.7. Soluie de fenolftalein, c = 2 g/100 ml n etanol.
2.3.8. Faz mobil pentru HPLC: amestec de metanol i ap, de exemplu 980 + 20 (v +
v). Proporia exact este determinat de caracteristicile coloanei folosite.
2.3.9. Azot, lipsit de oxigen.
2.3.10. DL--tocoferol acetat, extra pur, cu activitate certificat
2.3.10.1. Soluie stoc de DL--tocoferol acetat: se cntresc 100 mg de DL--tocoferol
acetat cu o abatere de 0,1 mg ntr-un balon gradat de 100 ml. Se dizolv n etanol i se
completeaz pn la semn cu acelai solvent. 1 ml din aceast soluie conine 1 mg de DL--
56
tocoferol acetat. (pentru control UV a se vedea descrierea de la subpunctul 2.5.6.1.3.; pentru

stabilizare a se vedea observaiile de la subpunctul 2.7.4.).
2.3.11. DL--tocoferol, extra pur, cu activitate certificat
2.3.11.1. Soluia stoc de DL--tocoferol: se cntresc 100 mg de DL--tocoferol cu o
abatere de 0,1 mg ntr-un balon gradat de 100 ml. Se dizolv n etanol i se completeaz pn
la semn cu acelai solvent. 1 ml din aceast soluie conine 1 mg de DL--tocoferol (pentru
control UV a se vedea meniunea de la subpunctul 2.5.6.2.3.; pentru stabilizare a se vedea
observaiile de la subpunctul 2.7.4.).
2.3.12. 2,6-di-ter-butil-4-metilfenol (BHT) (a se vedea observaiile de la subpunctul
2.7.5.).
2.4. Dispozitive
2.4.1. Evaporator rotativ cu generare de film.
2.4.2. Sticlrie laborator brun.
2.4.2.1. Baloane cu fund plat sau flacoane tip Erlenmeyer, 500 ml, cu orificiu din sticl
lefuit.
2.4.2.2. Baloane gradate cu dopuri de sticl lefuit, cu gt ngust, de 10, 25, 100 i 500
ml.
2.4.2.3. Plnii de separare, conice, 1 000 ml, cu dopuri de sticl lefuit.
2.4.2.4. Flacoane piriforme, 250 ml, cu orificiu din sticl lefuit.
2.4.3. Condensator Allihn, cu lungime a mantalei de 300 mm, cu mbinare de sticl
lefuit i cu adaptor pentru conduct de alimentare cu gaz.
2.4.4. Filtru de hrtie plisat pentru separarea fazelor, cu diametru de 185 mm (de
exemplu Schleicher & Schuell 597 HY 1/2).
2.4.5. Echipament HPLC cu sistem de injecie.
2.4.5.1. Coloan pentru cromatografie lichid, 250 mm 4 mm, C 18 , particule de 5 sau
10 m, sau echivalent.
2.4.5.2. Detector de fluorescen sau de UV, cu ajustare variabil a lungimii de und.
2.4.6. Spectrofotometru cu celule de cuar de 10 mm.
2.4.7. Baie de ap cu agitator magnetic.
2.4.8. Aparat de extracie.
Vitamina E este sensibil la lumin (UV) i la oxidare. Toate operaiunile se efectueaz
n absena luminii (n recipiente de sticl brun sau protejate cu folie de aluminiu) i n absena
oxigenului (se expune unui flux de azot). n timpul extraciei, aerul de deasupra lichidului se
nlocuiete cu azot (a se evita excesul de presiune slbind din cnd n cnd dopul).
2.5.1. Pregtirea eantionului
Se macin eantionul pentru a trece printr-o sit cu ochiuri de 1 mm, evitndu-se
producerea de cldur.
Mcinarea trebuie efectuat imediat nainte de cntrire i saponificare, n caz contrar
riscndu-se pierderi de vitamina E.
2.5.2. Saponificarea
n funcie de greutatea coninutului de vitamina E, se cntresc, cu o abatere de 0,01 g,
2-25 g de eantion ntr-un balon cu fund plat sau ntr-un flacon tip Erlenmeyer, de 500 ml. Se
adaug succesiv, agitnd circular, 130 ml de etanol, cca 100 mg de 2,6-di-ter-butil-4metilfenol (BHT), 2 ml de soluie de ascorbat de sodiu i 2 ml de soluie de sulfur de sodiu (a
se vedea meniunea de la subpunctul 2.3.6). Se monteaz un condensator la vas i se introduce
vasul ntr-o baie de ap cu agitator magnetic. Se nclzete pn la fierbere i se las s
reflueze timp de 5 minute. Apoi se adaug 25 ml de soluie de hidroxid de potasiu prin
condensator i se las s reflueze timp de nc 25 minute, amestecnd sub un flux uor de azot.
57
Apoi se cltete condensatorul cu circa 20 ml de ap i se rcete coninutul vasului la

temperatura camerei.
Se transfer cantitativ prin decantare soluia saponificat, prin cltire cu un volum total
de 250 ml de ap ntr-o plnie de separare de 1 000 ml sau n aparatul de extracie. Se cltete
succesiv vasul de saponificare cu 25 ml de etanol i 100 ml de eter de petrol i se transfer
lichidul de cltire n plnia de separare sau n aparatul de extracie. Proporia de ap i etanol n
soluiile combinate trebuie s fie de cca 2:1. Se agit energic timp de 2 minute i se las s se
sedimenteze timp de 2 minute.
2.5.3.1. Extracia utiliznd o plnie de separare (a se vedea meniunea de la subpunctul
2.4.2.3)
Cnd straturile s-au separat (a se vedea observaia de la subpunctul 2.7.3.), se transfer
stratul de eter de petrol ntr-o alt plnie de separare. Se repet aceast extracie de dou ori cu
100 ml eter de petrol i de dou ori cu 50 ml eter de petrol.
Se spal de dou ori extractele combinate n plnia de separare amestecnd uor
(pentru a se evita formarea de emulsii) cu cantiti de 100 ml de ap i din nou, prin agitare
repetat cu alte cantiti de ap de 100 ml pn cnd apa rmne incolor dup adugarea unei
soluii de fenolftalein (patru splri snt n general suficiente). Se filtreaz extractul splat cu
un filtru cutat uscat pentru separarea fazelor pentru a se elimina apa n suspensie i se transfer
ntr-un balon gradat de 500 ml. Se cltesc plnia de separare i filtrul cu 50 ml eter de petrol, se
completeaz pn la semn cu eter de petrol i se amestec bine.
2.5.3.2. Extracia utiliznd un aparat de extracie (a se vedea meniunea de la
subpunctul 2.4.8.)
Cnd straturile s-au separat (a se vedea observaia de la subpunctul 2.7.3.), se
nlocuiete dopul cilindrului de sticl prin inserie de sticl lefuit i se amplaseaz
extremitatea inferioar n form de U a tubului reglabil astfel nct s se afle exact deasupra
nivelului interfeei. Aplicnd o presiune de la generatorul de azot prin braul lateral, se
transfer stratul superior de eter de petrol ntr-o plnie de separare de 1 000 ml. Se adaug 100
ml de eter de petrol n cilindrul de sticl, se pune dopul i se agit energic. Se las straturile s
se separe i se transfer stratul superior n plnia de separare. Se repet procedura de extracie
cu nc 100 ml eter de petrol, apoi de dou ori cu cantiti de 50 ml eter de petrol i se adaug
straturile de eter de petrol n plnia de separare.
Se spal extractele combinate de eter de petrol conform procedurii descrise n
subpunctul 2.5.3.1. i se procedeaz conform punctului menionat.
2.5.4. Prepararea soluiei de eantion pentru HPLC
Se pipeteaz o parte alicot din soluia de eter de petrol (de la subpunctul 2.5.3.1. sau
2.5.3.2.) ntr-un balon piriform de 250 ml. Se evapor solventul aproape n totalitate pe
evaporatorul rotativ, cu presiune redus, la o temperatur a bii de ap de maximum 40C. Se
restabilete presiunea atmosferic prin admisie de azot, conform prevederilor subpunctului
2.3.9. i se ndeprteaz balonul de pe evaporatorul rotativ. Se elimin restul de solvent cu un
curent de azot (a se vedea observaia de la subpunctul 2.3.9.) i se dizolv imediat reziduul
ntr-un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (concentraia de DL--tocoferol trebuie s fie
de ordinul a 5-30 g/ml).
Vitamina E se separ pe o coloan C 18 cu faz inversat (a se vedea meniunea de la
subpunctul 2.4.5.1.), iar concentraia se msoar cu un detector de fluorescen (excitaie: 295
nm, emisie: 330 nm) sau cu un detector de UV (292 nm), conform prevederilor descrise n
subpunctul 2.4.5.2.
Se injecteaz o parte alicot (de exemplu 20 l) din soluia metanolic obinut
conform prevederilor indicate n subpunctul 2.5.4. i se elueaz cu faza mobil (a se vedea
58
meniunea de la subpunctul 2.3.8.). Se calculeaz nlimile (ariile) medii ale vrfurilor pentru
mai multe injectri ale aceleiai soluii eantion i nlimile (ariile) medii ale vrfurilor pentru
mai multe injectri ale soluiilor de calibrare, conform prevederilor subpunctului 2.5.6.2.
Condiii HPLC
Urmtoarele condiii specificate n tabelul nr. 2 snt propuse cu titlu orientativ; se pot
aplica i alte condiii, dac acestea conduc la rezultate echivalente.
Tabelul nr. 2
Condiii HPLC
Tehnica de msurare
conform specificaiilor de la subpunctul
2.4.5.1.
subpunctul 2.3.8.)
Debit
Detector (a se vedea meniunea de la
Valorile indicate
10 m sau echivalent
Amestec de metanol i ap de exemplu 980 +
20 (v + v)
1 -2 ml/minut
Detector de fluorescen (excitaie: 295
nm/emisie: 330 nm) sau detector de UV (292
nm)
2.5.6. Calibrarea (acetat de DL--tocoferol sau DL--tocoferol)

2.5.6.1. Etalon de acetat de DL- -tocoferol
2.5.6.1.1. Prepararea soluiei etalon de lucru
Se picur din pipet 25 ml din soluia stoc de acetat de DL--tocoferol (a se vedea
meniunea de la subpunctul 2.3.10.1.) ntr-un balon cu fundul plat sau ntr-un flacon tip
Erlenmeyer, de 500 ml i se hidrolizeaz conform procedurii descrise la subpunctul 2.5.2. Se
realizeaz apoi extracia cu eter de petrol conform descrierii de la sunpunctul 2.5.3. i se
completeaz pn la 500 ml cu eter de petrol. Se las s se evapore 25 ml din acest extract
aproape n totalitate n evaporatorul rotativ (a se vedea observaia de la subpunctul 2.5.4.), se
ndeprteaz solventul rmas ntr-un curent de azot i se dizolv din nou reziduul n 25 ml de
metanol. Concentraia nominal a acestei soluii este de 45,5 g DL--tocoferol per ml,
echivalent cu 50 g acetat de DL--tocoferol per ml. Soluia etalon de lucru trebuie s fie
preparat imediat nainte de utilizare.
2.5.6.1.2. Prepararea soluiilor de calibrare i a curbei de calibrare
Se transfer 1, 2, 4 i 10 ml din soluia etalon de lucru ntr-o serie de baloane gradate
de 20 ml, se completeaz pn la semn cu metanol i se amestec. Concentraiile nominale ale
acestor soluii snt 2,5, 5, 10 i 25 g/ml acetat de DL--tocoferol, echivalent cu 2,28, 4,55, 9,1
g/ml i 22,8 g/ml DL--tocoferol.
nlimile (ariile) medii ale vrfurilor. n funcie de nlimile (ariile) medii ale vrfurilor, se
traseaz o curb de calibrare.
2.5.6.1.3. Standardizarea UV (sub aciunea razelor ultraviolete) a soluiei stoc de acetat
de DL- -tocoferol (a se vedea meniunea de la subpunctul 2.3.10.1.)
Se dilueaz 5 ml din soluia stoc de acetat de DL--tocoferol n 25 ml de etanol i se
msoar spectrul UV al acestei soluii fa de etanol n spectrofotometru, ntre 250 nm i 320
nm.
Absorbia maxim este de 284 nm:
59
E 1 1 % 1 cm = 43,6 la 284 nm n etanol

La aceast diluie trebuie s se obin o valoare de extincie ntre 0,84 i 0,88.
2.5.6.2. Etalonul de DL- -tocoferol
2.5.6.2.1. Prepararea soluiei etalon de lucru
Se pun cu pipeta 2 ml din soluia stoc de DL--tocoferol ntr-un balon gradat de 50 ml,
se dizolv n metanol i se completeaz pn la semn cu metanol. Concentraia nominal a
acestei soluii este de 40 g DL--tocoferol per ml, echivalent cu 44 g acetat DL--tocoferol
per ml. Soluia etalon de lucru trebuie s fie preparat imediat nainte de utilizare.
2.5.6.2.2. Prepararea soluiilor de calibrare i a curbei de calibrare
Se transfer 1, 2, 4 i 10 ml din soluia etalon de lucru ntr-o serie de baloane gradate
de 20 ml, se completeaz pn la semn cu metanol i se amestec. Concentraiile nominale ale
acestor soluii snt 2, 4, 8 i 20 g/ml DL--tocoferol, echivalent cu 2,2, 4,4, 8,79 g/ml i 22
g/ml acetat de DL--tocoferol.
nlimile (ariile) medii ale vrfurilor. n funcie de nlimile (ariile) medii ale vrfurilor, se
traseaz o curb de calibrare.
2.5.6.2.3. Standardizarea UV (sub aciunea rezelor ultraviolete) a soluiei stoc de DL-
-tocoferol (a se vedea observaia de la subpunctul 2.3.11.1.)
Se dilueaz 2 ml din soluia stoc de DL--tocoferol n 25 ml de etanol i se msoar
spectrul UV al acestei soluii fa de etanol n spectrofotometru ntre 250 nm i 320 nm.
Absorbia maxim este de 292 nm:
E 1 1 % 1 cm = 75,8 la 292 nm n etanol
La aceast diluie trebuie s se obin o valoare de extincie de 0,6.
Pornindu-se de la nlimile (ariile) medii ale vrfurilor de vitamina E ale soluiei de
eantion, se determin concentraia soluiei de eantion n g/ml (calculat ca acetat de tocoferol) prin referire la curba de calibrare (vezi subpunctul 2.5.6.1.2. sau 2.5.6.2.2.).
Coninutul w de vitamina E al eantionului, exprimat n mg/kg, este dat de urmtoarea
formul:
w = 500 c V 2 / V 1 m [mg/kg],
unde:
c = concentraia de vitamina E (ca acetat de -tocoferol) al soluiei de eantion (a se
vedea meniunea de la subpunctul 2.5.4.) n g/ml;
V 1 = volumul soluiei de eantion (a se vedea meniunea de la subpunctul 2.5.4.), n
ml;
V 2 = volumul prii alicote luate conform subpunctului 2.5.4., n ml;
m = greutatea poriunii de testat, n g.
2.7. Observaii
60
2.7.1. Pentru eantioanele cu o concentraie redus de vitamina E, poate fi util

combinarea extractelor n eter de petrol provenite din dou saponificri (cantitate cntrit: 25
g) ntr-o soluie de eantion pentru determinarea prin HPLC.
2.7.2. Eantionul prelevat pentru analiz nu conine mai mult de 2 g de grsime.
2.7.3. Dac nu are loc separaia fazelor, se adaug cca 10 ml de etanol pentru a
fragmenta emulsia.
2.7.4. Odat efectuat msurtoarea spectrofotometric a soluiei de acetat de DL-tocoferol sau de DL--tocoferol, conform prevederilor subpunctului 2.5.6.1.3. sau 2.5.6.2.3.,
se adaug cca 10 mg de 2,6-di-ter-butil-4-metilfenol (BHT) la soluie (a se vedea meniunea
de la subpunctul 2.3.10.1.) i se conserv soluia la frigider (durata maxim de stocare patru
sptmni).
2.7.5. 2,6-di-ter-butil-4-metilfenol (BHT) poate fi nlocuit cu hidrochinon.
2.7.6. Utilizndu-se o coloan n faz normal este posibil separarea tocoferolilor , ,
i .
2.7.7. Soluia de ascorbat de sodiu poate fi nlocuit cu cca 150 mg de acid ascorbic.
2.7.8. Soluia de sulfur de sodiu poate fi nlocuit cu cca 50 mg de EDTA.
2.7.9. Acetatul de vitamina E hidrolizeaz foarte rapid n condiii alcaline fiind, prin
urmare, foarte sensibil la oxidare, mai ales n prezena oligoelementelor, cum ar fi fierul sau
cuprul. Determinarea vitaminei E n premixuri la niveluri de peste 5 000 mg/kg ar avea drept
consecin o degradare a vitaminei E. Prin urmare, pentru confirmare se recomand o metod
HPLC care include o formul pentru dizolvarea enzimatic a vitaminei E n absena fazei de
saponificare alcalin.
Diferena dintre rezultatele a dou determinri paralele realizate pe acelai eantion nu
trebuie s depeasc 15 % din rezultatul superior.
III. Determinarea oligoelementelor fier, cupru, mangan i zinc
Prezenta metod permite determinarea oligoelementelor fier, cupru, mangan i zinc din
nutreuri. Limitele de cuantificare snt:
fier (Fe): 20 mg/kg;
cupru (Cu): 10 mg/kg;
mangan (Mn): 20 mg/kg;
zinc (Zn): 20 mg/kg.
Eantionul este pus n soluie de acid clorhidric dup distrugerea materiei organice,
dac aceasta este prezent. Se determin elementele fier, cupru, mangan i zinc, dup o diluare
corespunztoare, cu ajutorul spectrometriei de absorbie atomic.
Pentru prepararea reactivilor i a soluiilor analitice se folosete ap fr cationii care
urmeaz s fie determinai, obinut fie prin distilarea dubl a apei ntr-un distilator din sticl
borosilicat sau din cuar, fie prin dublu tratament cu rin schimbtoare de ioni.
Reactivii trebuie s fie cel puin de calitate analitic. Absena elementului care urmeaz
s fie determinat trebuie verificat ntr-un experiment martor. Dac este necesar, reactivii
trebuie s fie purificai n continuare.
3.3.1. Acid clorhidric (d: 1,19 g/ml).
3.3.2. Acid clorhidric (6 mol/litru).
3.3.3. Acid clorhidric (0,5 mol/litru).
61
3.3.4. Acid fluorhidric 38-40 % (v/v) cu un coninut de fier (Fe) de mai puin de 1
mg/litru i un reziduu dup evaporare de mai puin de 10 mg (ca sulfat)/litru.
3.3.5. Acid sulfuric (d: 1,84 g/ml).
3.3.6. Peroxid de hidrogen [circa 100 volume de oxigen (30 % n greutate)].
3.3.7. Soluie etalon de fier (1 000 g Fe/ml) preparat conform prevederilor descrise
n subpunctul 3.3.7.1. sau o soluie echivalent folosit n comer: se dizolv 1 g de srm de
fier n 200 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (a se vedea observaia de la subpunctul 3.3.2.), se
adaug 16 ml de peroxid de hidrogen i se completeaz pn la un litru cu ap.
3.3.7.1. Soluie etalon de lucru de fier (100 g Fe/ml) preparat dilund o parte din
soluia etalon cu 9 pri de ap.
3.3.8. Soluie etalon de cupru (1 000 g Cu/ml) preparat conform indicaiilor descrise
n subpunctul 3.3.8.1. sau o soluie echivalent folosit n comer: se dizolv 1 g de praf de
cupru n 25 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (a se vedea observaia de la subpunctul 3.3.2.), se
adaug 5 ml de peroxid de hidrogen i se completeaz pn la un litru cu ap.
3.3.8.1. Soluie etalon de cupru de lucru (10 g Cu/ml) preparat dilund o parte din
soluia standard (a se vedea meniunea de la subpunctul 3.3.8.) cu 9 pri de ap i apoi dilund
o parte din soluia rezultat cu 9 pri de ap.
3.3.9. Soluie etalon de mangan (1000 g Mn/ml) preparat conform prevederilor
descrise n subpunctul 3.3.9.1. sau o soluie echivalent folosit n comer: se dizolv 1 g de
praf de mangan n 25 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (a se vedea meniunea de la subpunctul
3.3.2.) i se completeaz pn la un litru cu ap.
3.3.9.1. Soluie etalon de lucru de mangan (10 g Mn/ml) preparat dilund o parte din
soluia etalon cu 9 pri de ap i apoi dilund o parte din soluia rezultat cu 9 pri de ap.
3.3.10. Soluie etalon de zinc (1 000 g Zn/ml) preparat conform indicaiilor descrise
n subpunctul 3.3.10.1. sau o soluie echivalent utilizat n comer: se dizolv 1 g de zinc sub
form de benzi sau folii n 25 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (a se vedea meniunea de la
subpunctul 3.3.2.) i se completeaz pn la un litru cu ap.
3.3.10.1. Soluie etalon de lucru de zinc (10 g Zn/ml) preparat dilund o parte din
soluia etalon cu 9 pri de ap i apoi dilund o parte din soluia rezultat cu 9 pri de ap.
3.3.11. Soluie de clorur de lantan: se dizolv 12 g de oxid de lantan n 150 ml de ap,
se adaug 100 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (a se vedea meniunea de la subpunctul 3.3.2.)
i se completeaz pn la un litru cu ap.
3.4. Dispozitive
3.4.1. Cuptor cu mufl cu reglare de temperatur i, preferabil, cu dispozitiv de
nregistrare.
3.4.2. Sticlria trebuie s fie de tip borosilicat rezistent i se recomand folosirea
aparaturii rezervate exclusiv pentru determinarea oligoelementelor.
3.4.3. Spectrofotometru de absorbie atomic care ndeplinete cerinele metodei cu
privire la sensibilitatea i precizia n intervalul necesar.
Este important ca atunci cnd se msoar oligoelementele s se in cont de riscul de
contaminare, n special cu zinc, cupru i fier. Din acest motiv, echipamentul folosit n cursul
preparrii eantioanelor trebuie s nu conin aceste metale.
Pentru reducerea riscului general de contaminare, se lucreaz ntr-o atmosfer fr
praf, folosind un echipament curat cu mare atenie i o sticlrie splat cu grij.
Determinarea zincului este n mod special sensibil la multe tipuri de contaminare, de exemplu
prin intermediul sticlriei, al reactivilor, al prafului etc.
Greutatea eantionului care urmeaz s fie calcinat rezult din cantitatea aproximativ
de oligoelemente din nutreuri n raport cu sensibilitatea spectrofotometrului folosit. Pentru
62
anumite tipuri de nutreuri, srace n oligoelemente, poate fi necesar s se nceap cu un

eantion de 10-20 g i s se completeze soluia final numai pn la 100 ml.
Arderea trebuie efectuat ntr-un cuptor nchis fr injectare de aer sau de oxigen.
Temperatura indicat de pirometru nu trebuie s depeasc 475C.
3.5.1. Eantioane care conin materie organic
3.5.1.1. Arderea i prepararea soluiei pentru analiz
3.5.1.1.1. Respectnd prevederile pct.3.5. se introduc 5-10 g de eantion cntrit cu o
abatere de 0,2 mg ntr-un creuzet de cuar sau platin, se usuc ntr-un cuptor la 105C i se
introduce creuzetul n cuptorul cu mufl nenclzit. Se nchide cuptorul i se mrete treptat
temperatura pn la 450-475C, timp de circa 90 minute. Se menine temperatura timp de 4-16
ore (de exemplu, peste noapte), pentru a ndeprta materialul carbonic i apoi se deschide
cuptorul i se las s se rceasc.
Se umezete cenua cu ap i se transfer substana obinut ntr-un pahar de laborator
de 250 ml. Se spal creuzetul cu o cantitate total de circa 5 ml de acid clorhidric (a se vedea
observaia de la subpunctul 3.3.1.) i se adaug acesta din urm ncet i cu atenie n paharul
de laborator (poate aprea o reacie puternic din cauza formrii de CO 2 ). Se adaug acid
clorhidric (a se vedea meniunea de la subpunctul 3.3.1.), pictur cu pictur, agitndu-se,
pn cnd efervescena nceteaz. Se evapor pn la uscare, agitndu-se din cnd n cnd cu o
baghet de sticl.
Se adaug apoi 15 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (a se vedea observaia de la
subpunctul 3.3.2.) la reziduu, apoi circa 120 ml de ap. Se amestec cu bagheta de sticl, care
se las n paharul de laborator, i se acoper paharul cu o sticl de ceas. Se aduce ncet la
fierbere i se menine la punctul de fierbere pn cnd cenua se dizolv complet. Se filtreaz
cu hrtie de filtru lipsit de cenu i se colecteaz filtratul ntr-un balon gradat de 250 ml. Se
spal paharul de laborator i se filtreaz cu 5 ml de acid clorhidric 6 mol/litru fierbinte (a se
vedea observaia de la subpunctul 3.3.2.) i de dou ori cu ap fiart. Se umple balonul gradat
cu ap pn la semn (concentraia de HCl: circa 0,5 mol/litru).
3.5.1.1.2. Dac reziduul din filtru este negru (crbune), se reintroduce n cuptor i se
calcineaz din nou la 450-475C.
Calcinarea, care necesit numai cteva ore (circa 3-5 ore), este complet cnd cenua
este alb sau aproape alb.
Se dizolv reziduul cu aproximativ 2 ml de acid clorhidric, conform prevederilor
subpunctului 3.3.1., se evapor pn la uscare i se adaug 5 ml de acid clorhidric 6 mol/litru
(a se vedea meniunea de la subpunctul 3.3.2). Se nclzete, se filtreaz soluia n balonul
gradat i se umple cu ap pn la semn (concentraia HCl: circa 0,5 mol/litru).
3.5.1.2. Determinarea spectrofotometric
3.5.1.2.1. Pregtirea soluiilor de calibrare
Pentru fiecare dintre elementele care urmeaz s fie determinate se prepar din soluiile
etalon de lucru descrise n subpunctele 3.3.7.1., 3.3.8.1., 3.3.9.1. i 3.3.10.1. o gam de soluii
de calibrare, fiecare soluie de calibrare avnd o concentraie de HCl de aproximativ 0,5
mol/litru i (n cazul fierului, manganului i zincului) o concentraie de clorur de lantan
echivalent cu 0,1 % La (g/v).
Concentraiile de oligoelemente selectate trebuie s se situeze n intervalul sensibilitii
spectrofotometrului utilizat. Tabelele nr. 3, nr.4, nr.5 i nr.6 indic compoziiile unor seturi
tipice de soluii de calibrare.
Tabelul nr. 3
Concentraia de fier
Unitatea de msur
Valorile indicate
63
g Fe/ml
0
0,5
1
2
3
4
5
ml de soluie etalon de lucru (a se
0
0,5
1
2
3
4
5
vedea meniunea de la subpunctul
3.3.7.1.) (1 ml = 100 g Fe)
7
7
ml HCl (a se vedea meniunea de la
7
7
7
7
7
subpunctul 1.3.2.)
+ 10 ml de soluie de clorur de lantan (descris n subpunctul 3.3.11.) i se completeaz pn la 100
ml cu ap
Tabelul nr. 4
Concentraia de cupru
Unitatea de msur
g Cu/ml
3.3.8.1.) (1 ml = 10 g Cu)
subpunctul 3.3.2.)
0
0
0,1
1
Valorile indicate
0,2
0,4
0,6
2
4
6
8
0,8
8
1
10
Tabelul nr. 5
Concentraia de mangan
Unitatea de msur
Valorile indicate
g Mn/ml
0
0,1
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0
1
2
4
6
8
10
3.3.9.1.) (1 ml = 10 g Mn)
7
7
7
7
7
7
7
subpunctul 3.3.2.)
+ 10 ml de soluie de clorur de lantan (menionat n subpunctul 3.3.11.) i se completeaz pn la
100 ml cu ap
Tabelul nr. 6
Concentraia de Zinc
Unitatea de msur
Valorile indicate
g Zn/ml
0
0,05
0,1
0,2
0,4
0,6
0,8
ml de soluie etalon de lucru (a se 0
0,5
1
2
4
6
8
3.3.10.1.) (1 ml = 10 g Zn)
ml HCl (a se vedea meniunea de la 7
7
7
7
7
7
7
subpunctul 3.3.2.)
+ 10 ml de soluie de clorur de lantan (menionat n subpunctul 3.3.11.) i se completeaz pn la
100 ml cu ap
3.5.1.2.2. Prepararea soluiei pentru analiz
Pentru determinarea cuprului, soluia preparat la subpunctul 3.5.1.1. poate fi, n mod
normal, folosit direct. Dac este necesar s se obin o concentraie situat n intervalul
soluiilor de calibrare, o parte alicot poate fi pipetat ntr-un balon gradat de 100 ml i
completat pn la semn cu acid clorhidric 0,5 mol/litru (a se vedea meniunea de la
subpunctul 3.3.3.).
64
Pentru determinarea fierului, manganului i zincului, se pipeteaz o parte alicot din

soluia preparat la subpuntul 3.5.1.1. ntr-un balon gradat de 100 ml, se adaug 10 ml de
soluie de clorur de lantan i se completeaz pn la semn cu acid clorhidric 0,5 mol/litru,
specificat n subpunctul 3.3.3. (a se vedea punctul 3.8. din prezenta anex).
3.5.1.2.3. Experiment martor
Experimentul martor trebuie s includ toate etapele prevzute n procedura de
preparare, cu excepia faptului c materialul eantion este omis. Soluia de calibrare 0 nu
trebuie s fie folosit ca martor.
3.5.1.2.4. Msurarea absorbiei atomice
Se msoar absorbia atomic a soluiilor de calibrare i a soluiei care urmeaz s fie
analizat folosind o flacr aer-acetilen oxidant, la urmtoarele lungimi de und:
Fe: 248,3 nm
Cu: 324,8 nm
Mn: 279,5 nm
Zn: 213,8 nm
Fiecare msurtoare se realizeaz de patru ori.
3.5.2. Nutreuri minerale
Dac eantionul nu conine materie organic, calcinarea prealabil nu este necesar. Se
procedeaz conform descrierii de la subpunctul 3.5.1.1.1. Evaporarea cu acid fluorhidric poate
fi omis.
Folosind o curb de calibrare, se calculeaz concentraia de oligoelemente n soluia
care urmeaz s fie analizat i se exprim rezultatul n mg de oligoelemente per kg de
eantion (ppm).
Diferena dintre rezultatele a dou determinri paralele efectuate pe acelai eantion de
ctre acelai laborant nu depete:
a) 5 mg/kg, n valoare absolut, pentru coninutul de oligoelement n cauz pn la 50
mg/kg;
b) 10 % din valoarea superioar, pentru un coninut de oligoelement n cauz de la 50
pn la 100 mg/kg;
c) 10 mg/kg, n valoare absolut, pentru un coninut de oligoelement n cauz de la 100
pn la 200 mg/kg;
d) 5 % din valoarea superioar, pentru un coninut de oligoelement n cauz mai mare
de 200 mg/kg.
3.8. Observaii
Prezena de cantiti mari de fosfai ar putea interfera cu determinarea fierului,
manganului i zincului. Astfel de interferene trebuie s fie corectate adugnd soluie de
clorur de lantan. Dac, ns, n eantion, raportul de greutate Ca + Mg/P este > 2, adugarea
soluiei de clorur de lantan la soluia de analizat i la soluiile de calibrare poate fi omis.
IV. Determinarea coninutului de halofuginon
DL-trans-7-brom-6-clor-3-[3-(3-hidroxi-2-piperidil)acetonil]-chinazolin-4-3H)-onhidrobromid
Prezenta metod permite determinarea coninutului de halofuginon din nutreuri.
Limita de cuantificare este de 1 mg/kg.
65
Dup tratarea cu ap fierbinte, halofuginona se extrage ca baz liber n acetat de etil i

ulterior se separ ca hidroclorid, ntr-o soluie apoas de acid. Extractul se purific prin
cromatografie prin schimb ionic. Coninutul de halofuginon se determin prin cromatografie
lichid de nalt performan cu faz inversat (RP-HPLC), prin utilizarea unui detector de
raze UV.
4.3.1. Acetonitril, de calitate HPLC.
4.3.2. Rin Amberlit XAD-2.
4.3.3. Acetat de amoniu.
4.3.4. Acetat de etil.
4.3.5. Acid acetic glacial.
4.3.6. Substana etalon halofuginon (DL-trans-7-brom-6-clor-3-[3-hidroxi-2piperidil)acetonil]chinazolin-4-(3H)-on hidrobromid, E 764)
4.3.6.1. Soluie etalon stoc de halofuginon, 100 g/ml
Se cntresc, cu o abatere de 0,1 mg, 50 mg de halofuginon ntr-un balon gradat de
500 ml, apoi se dizolv n soluie tampon de acetat de amoniu, se completeaz pn la semn cu
soluie tampon i se amestec. Aceast soluie este stabil timp de trei sptmni, la 5C, dac
este depozitat la ntuneric.
4.3.6.2. Soluii de calibrare
Se transfer 1, 2, 3, 4 i 6 ml de soluie etalon stoc ntr-o serie de baloane gradate de
100 ml. Se completeaz pn la semn cu faz mobil (a se vedea meniunea de subpunctul
4.3.21.) i se amestec. Soluiile au concentraii de 1, 2, 3, 4 i 6 g/ml de halofuginon.
Aceste soluii se prepar imediat nainte de utilizare.
4.3.7. Acid clorhidric (20 aproximativ 1,16 g/ml).
4.3.8. Metanol.
4.3.9. Nitrat de argint.
4.3.10. Ascorbat de sodiu.
4.3.11. Carbonat de sodiu.
4.3.12. Clorur de sodiu.
4.3.13. EDTA (acid etilendiaminotetraacetic, sare disodic).
4.3.14. Ap, de calitate HPLC.
4.3.15. Soluie de carbonat de sodiu, c = 10 g/100 ml.
4.3.16. Soluie de carbonat de sodiu saturat cu clorur de sodiu, c = 5 g/100 ml
Se dizolv 50 g de carbonat de sodiu n ap, se dilueaz pn la 1 litru i se adaug
clorur de sodiu pn la saturarea soluiei.
4.3.17. Acid clorhidric, aproximativ 0,1 mol/l
Se dilueaz 10 ml de HCl n ap pn la 1 litru.
4.3.18. Soluie tampon de acetat de amoniu, aproximativ 0,25 mol/l
Se dizolv 19,3 g de acetat de amoniu i 30 ml de acid acetic glacial n ap de calitate
HPLC i se dilueaz pn la 1 litru.
4.3.19. Prepararea rinii de Amberlit XAD-2
Se spal cu ap o cantitate corespunztoare de Amberlit, pn la ndeprtarea tuturor
ionilor de clor, dup cum indic testul cu nitrat de argint, conform prevederilor subpunctului
4.3.20., efectuat pe faza apoas eliminat. Apoi se spal rina cu 50 ml de metanol, se elimin
metanolul i se depoziteaz rina n metanol proaspt.
4.3.20. Soluie de nitrat de argint, aproximativ 0,1 mol/l
Se dizolv 0,17 g de nitrat de argint n 10 ml de ap.
4.3.21. Faz mobil HPLC
Se amestec 500 ml de acetonitril, de calitate HPLC cu 300 ml soluie tampon de
acetat de amoniu i 1 200 ml de ap, de calitate HPLC. Se aduce pH-ul la valoarea 4,3 folosind
66
acid acetic glacial. Se trece printr-un filtru de 0,22 m (a se vedea meniunea de la subpunctul
4.4.8.) i se degazeaz soluia (de exemplu prin ultrasonare timp de 10 minute). Aceast
soluie este stabil timp de o lun dac este depozitat ntr-un recipient nchis, la ntuneric.
4.4. Dispozitive
4.4.1. Baie cu ultrasunete.
4.4.3. Centrifug.
4.4.4. Echipament HPLC cu detector de raze UV cu lungimi de und variabile sau
detector cu grup de diode
4.4.4.1. Coloan pentru cromatografie lichid, 300 mm 4 mm, C 18 , particule de 10
m sau o coloan echivalent.
4.4.5. Coloan de sticl (300 mm 10 mm) prevzut cu filtru de sticl sinterizat i
cu robinet de nchidere.
4.4.6. Filtre din fibr de sticl, cu diametru de 150 mm.
4.4.7. Filtre cu membran de 0,45 m.
4.4.8. Filtre cu membran de 0,22 m.
Halofuginona ca baz liber este instabil n soluii alcaline sau de acetat de etil. Ea nu
trebuie s rmn n acetat de etil mai mult de 30 de minute.
4.5.1. Aspecte generale
4.5.1.1. Se analizeaz un nutre martor pentru a verifica absena halofuginonei i a
substanelor interferente.
4.5.1.2. Se efectueaz un test de recuperare prin analiza nutreului martor care a fost
mbogit prin adugarea unei cantiti de halofuginon, similar cu cea prezent n eantion.
Pentru a obine o concentraie de 3 mg/kg se adaug 300 l din soluia etalon stoc la 10 g de
nutre martor, se amestec i se ateapt 10 minute nainte de a se ncepe etapa de extracie,
conform prevederilor descrise n subpunctul 4.5.2.
Conform acestei metode, nutreul martor este similar, ca tip, cu eantionul, iar la
analiz nu se detecteaz halofuginon.
Se cntresc, cu o abatere de 0,1 g, 10 g de eantion preparat, ntr-un tub de centrifug
de 200 ml, se adaug 0,5 g de ascorbat de sodiu, 0,5 g de EDTA (acid etilendiaminotetraacetic,
sare disodic) i 20 ml de ap, apoi se amestec. Se plaseaz tubul ntr-o baie de ap timp de 5
minute (80C). Dup rcire la temperatura camerei se adaug 20 ml soluie de carbonat de
sodiu i se amestec. Se adaug imediat 100 ml de acetat de etil i se agit energic cu mna
timp de 15 secunde. Apoi tubul se aeaz ntr-o baie cu ultrasunete timp de 3 minute i se
slbete dopul. Se centrifugheaz timp de 2 minute i se decanteaz faza de acetat de etil
printr-un filtru de fibr de sticl, ntr-o plnie de separare de 500 ml. Se repet extracia
eantionului cu o a doua cantitate de 100 ml acetat de etil. Se spal extractele combinate timp
de 1 minut cu 50 ml de soluie de carbonat de sodiu saturat cu clorur de sodiu i se
ndeprteaz stratul apos.
Se extrage stratul organic timp de 1 minut cu 50 ml de acid clorhidric. Se trece stratul
inferior de acid printr-o plnie de separare de 250 ml. Se extrage din nou stratul organic timp
de 1,5 minute, cu o alt cantitate de 50 ml acid clorhidric, apoi se combin cu primul extract.
Se spal extractele de acid combinate prin agitare circular timp de aproximativ 10 secunde cu
10 ml de acetat de etil.
Se transfer cantitativ stratul apos ntr-un balon cu fund rotund de 250 ml i se
ndeprteaz faza organic. Se evapor din soluia acid tot acetatul de etil rmas utiliznd un
evaporator rotativ cu generare de film.
67
Temperatura bii de ap trebuie s nu depeasc 40C. n condiiile unei presiuni de

aproximativ 25 mbar ntreaga cantitate de acetat de etil rezidual se ndeprteaz n 5 minute la
38C.
4.5.3. Curarea
4.5.3.1. Pregtirea coloanei de Amberlit
Pentru fiecare extract de eantion se pregtete cte o coloan XAD-2. Se transfer 10 g
de Amberlit preparat ntr-o coloan de sticl cu metanol. Se adaug un dop mic de vat de
sticl deasupra patului de rin. Se scurge metanolul din coloan i se spal rina cu 100 ml
de ap, oprind fluxul pe msur ce lichidul ajunge la partea superioar a patului de rin. Se
las coloana s se echilibreze timp de 10 minute nainte de utilizare. Niciodat nu se las
coloana s se usuce.
4.5.3.2. Curarea eantionului
Se transfer cantitativ extractul, obinut conform prevederilor subpunctului 4.5.2. n
partea superioar a coloanei de Amberlit preparat i se elueaz, ndeprtnd apoi eluatul. Rata
de eluare nu trebuie s depeasc 20 ml/minut. Se cltete balonul cu fund rotund cu 20 ml de
acid clorhidric, apoi acesta se folosete pentru splarea coloanei de rin. Se sufl orice urm
de soluie acid rmas cu ajutorul unui curent de aer. Se ndeprteaz lichidele de splare. Se
adaug 100 ml de metanol n coloan i se elueaz 5-10 ml; se colecteaz eluatul ntr-un balon
cu fundul rotund de 250 ml. Se las metanolul rmas timp de 10 minute s se echilibreze cu
rina i se continu eluarea la o rat care s nu depeasc 20 ml/minut, colectnd eluatul n
acelai balon cu fundul rotund. Se evaporeaz metanolul pe evaporatorul rotativ cu generare
de film; temperatura bii de ap trebuie s nu depeasc 40C. Se transfer cantitativ reziduul
ntr-un balon gradat de 10 ml, utiliznd faza mobil HPLC. Se completeaz pn la semn cu
ajutorul fazei mobile i se amestec. Se filtreaz o parte alicot printr-un filtru cu membran.
Aceast soluie se pstreaz pentru determinarea prin HPLC (a se vedea meniunea de
la subpunctul 4.5.4.).
4.5.4.1. Parametrii admisibili
aplica i alte condiii, dac acestea duc la rezultate echivalente.
Tabelul nr. 7
Condiii HPLC
Tehnica de msurare
Faza mobil
Debit
Volum de injecie
Valorile indicate
o coloan echivalent
Amestec descris n subpunctul 1.3.21.
1,5 -2 ml/minut
243 nm
40-100 l.
Stabilitatea sistemului cromatografic se verific prin injectarea de mai multe ori a

soluiei de calibrare, coninnd 3 g/ml, pn la obinerea de nlimi (sau de arii) ale vrfurilor
i de timpi de retenie constani.
4.5.4.2. Curba de calibrare
Se injecteaz fiecare soluie de calibrare de mai multe ori i se determin nlimile
(ariile) vrfurilor pentru fiecare concentraie. Se traseaz o curb de calibrare utiliznd
68
nlimile (ariile) medii ale vrfurilor soluiilor de calibrare ca ordonate i concentraiile

corespunztoare, n g/ml, ca abscise.
4.5.4.3. Soluia de eantion
Se injecteaz extractul de eantion (a se vedea meniunea de la subpunctul 4.5.3.2.) de
mai multe ori, utiliznd acelai volum ca cel utilizat pentru soluiile de calibrare i se
determin nlimea (aria) medie a vrfurilor pentru vrfurile de halofuginon.
Concentraia soluiei de eantion n g/ml se determin plecnd de la nlimea (aria)
medie a vrfurilor de halofuginon a soluiei de eantion prin referire la curba de calibrare.
Coninutul de halofuginon w (mg/kg) al eantionului este dat de formula urmtoare:
w = c 10 / m,
unde:
c = concentraia de halofuginon din soluia de eantion, n g/ml;
m = greutatea poriunii de testat, n grame.
4.7. Validarea rezultatelor
4.7.1. Identitatea
Identitatea analitului poate fi confirmat prin cocromatografie sau prin utilizarea unui
detector cu grup de diode cu care se compar spectrul extractului de eantion cu cel al soluiei
de calibrare, care conine 6 g/ml.
4.7.1.1. Cocromatografie
Un extract de eantion este mbogit prin adugarea unei cantiti corespunztoare de
soluie de calibrare. Cantitatea de halofuginon adugat trebuie s fie similar cu cantitatea
estimat de halofuginon gsit n extractul de eantion.
Dup luarea n considerare att a cantitii adugate, ct i a diluiei extractului, crete
numai nlimea vrfului de halofuginon. Lrgimea vrfului, la jumtate din nlimea sa
maxim, trebuie s se ncadreze ntr-o variaie de 10 % din lrgimea original.
4.7.1.2. Detecia cu grup de diode
Rezultatele se evalueaz dup urmtoarele criterii:
a) lungimea de und a absorbiei maxime a spectrelor eantionului i a etalonului,
nregistrat la vrful cel mai nalt al cromatogramei, trebuie s fie aceeai ntr-o marj
determinat de puterea de rezoluie a sistemului de detecie. Pentru detecia cu grup de diode,
aceasta este de obicei de 2 nm;
b) ntre 225 i 300 nm, spectrele eantionului i ale etalonului, nregistrate la vrful cel
mai nalt al cromatogramei, nu trebuie s fie diferite pentru acele pri ale spectrului situate
ntre 10 i 100 % din absorbana relativ. Acest criteriu este ndeplinit atunci cnd snt prezente
aceleai maxime i cnd deviaia dintre dou spectre nu depete n niciun punct observat 15
% din absorbana analitului etalon;
c) ntre 225 i 300 nm, spectrele curbei ascendente, ale punctului maxim i ale curbei
descendente ale vrfului produs de extractul de eantion nu trebuie s fie diferite unele de
altele pentru acele pri ale spectrului situate ntre 10 i 100 % din absorbana relativ. Acest
criteriu este ndeplinit atunci cnd snt prezente aceleai maxime i cnd deviaia dintre dou
spectre nu depete n nici-un punct observat 15 % din absorbana spectrului punctului
maxim.
Dac unul din aceste criterii nu este ndeplinit, prezena analitului nu a fost confirmat.
trebuie s depeasc 0,5 mg/kg pentru un coninut de halofugionon de pn la 3 mg/kg.
69
4.7.3. Procedura de recuperare

Pentru eantionul martor mbogit se realizeaz o recuperare de minimum
80 %.
V. Determinarea robenidinei
Clorhidrat de 1,3-bis[(4-clorbenziliden)amino]guanidin
Prezenta metod permite determinarea coninutului de robenidin din nutreuri. Limita
de cuantificare este de 5 mg/kg.
Eantionul se extrage cu metanol acidifiat. Extractul se usuc i o parte alicot se
cur ntr-o coloan de oxid de aluminiu. Robenidina se elueaz din coloan cu metanol, se
concentreaz i se completeaz pn la un volum adecvat cu faz mobil. Coninutul de
robenidin se determin prin cromatografie lichid de nalt performan cu faz inversat
(RP-HPLC), utiliznd un detector de radiaii UV.
5.3.1. Metanol.
5.3.2. Metanol acidifiat
Se transfer 4 ml de acid clorhidric (20 = 1,18 g/ml) ntr-un balon gradat de 500 ml,
se completeaz pn la semn cu metanol i se amestec. Soluia se prepar imediat nainte de
utilizare.
5.3.4. Sit molecular
Tip 3A, 8-12 noduri ale sitei (noduri de 1,6-2,5 mm, aluminosilicat cristalin, diametrul
porilor 0,3 mm).
5.3.5. Oxid de aluminiu, activitate acid grad I pentru cromatografia pe coloan
Se transfer 100 g de oxid de aluminiu ntr-un recipient adecvat i se adaug 2 ml de
ap. Se nchide i se agit aproximativ 20 de minute. Se pstreaz ntr-un recipient bine nchis.
5.3.6. Soluie de fosfat diacid de potasiu, c = 0,025 mol/l
Se dizolv 3,4 g de fosfat diacid de potasiu n ap (de calitate HPLC), ntr-un balon
gradat de 1 000 ml, se completeaz pn la semn i se amestec.
5.3.7. Soluie de fosfat acid disodic, c = 0,025 mol/l
Se dizolv 3,55 g de fosfat acid disodic anhidru (sau 4,45 g de dihidrat sau 8,95 g de
dodecahidrat) n ap (de calitate HPLC), ntr-un balon gradat de 1 litru, se completeaz pn la
semn i se amestec.
5.3.8. Faz mobil HPLC
Se amestec urmtorii reactivi:
650 ml de acetonitril, de calitate HPLC;
250 ml ap (de calitate HPLC);
50 ml soluie de fosfat diacid de potasiu;
50 ml soluie de fosfat acid disodic.
Se trece printr-un filtru de 0,22 m (a se vedea meniunea de la subpunctul 5.4.6.) i se
degazeaz soluia (de exemplu, prin ultrasonare timp de 10 minute).
5.3.9. Substana etalon
70
Robenidin pur: clorhidrat de 1,3-bis[(4-clorobenziliden)amino]guanidin.

5.3.9.1. Soluia etalon stoc de robenidin: 300 g/ml
Se cntresc, cu o abatere de 0,1 mg, 30 mg de substan etalon de robenidin pur. Se
dizolv n metanol acidifiat ntr-un balon gradat de 100 ml, se completeaz pn la semn cu
acelai solvent i se amestec. Se mpacheteaz balonul n folie de aluminiu i se pstreaz la
ntuneric.
5.3.9.2. Soluie etalon intermediar de robenidin : 12 g/ml
Se transfer 10 ml din soluia etalon stoc ntr-un balon gradat de 250 ml, se
completeaz pn la semn cu faza mobil HPLC i se amestec. Se mpacheteaz balonul n
folie de aluminiu i se pstreaz la ntuneric.
Se transfer 5, 10, 15, 20 i 25 ml de soluie etalon intermediar ntr-o serie de baloane
gradate de 50 ml.
Se completeaz pn la semn cu faz mobil i se amestec. Aceste soluii corespund
concentraiilor de 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 i 6 g/ml de robenidin. Soluiile se prepar imediat
nainte de a fi utilizate.
5.3.10. Ap de calitate HPLC.
5.4. Dispozitive
5.4.1. Coloan de sticl
Construit din sticl brun, prevzut cu robinet de nchidere i un rezervor cu
capacitatea de aproximativ 150 ml, diametru interior 10-15 mm, lungime 250 mm.
5.4.2. Agitator mecanic sau magnetic.
5.4.4. Echipament HPLC cu detector de radiaii UV cu lungimi de und variabile sau
cu detector cu grup de diode care funcioneaz n intervalul 250-400 nm
5.4.4.1. Coloan pentru cromatografie lichid: 300 mm 4 mm, C 18 , particule de 10
m sau echivalent.
5.4.5. Hrtie de filtru din fibr de sticl (Whatman GF/A sau echivalent).
5.4.6. Filtre cu membran, 0,22 m.
5.4.7. Filtre cu membran, 0,45 m.
Robenidina este sensibil la lumin. Pentru toate operaiile se folosete sticla brun.
5.5.1.1. Se analizeaz un nutre martor pentru a verifica absena robenidinei i a
substanelor interferente.
5.5.1.2. Se efectueaz un test de recuperare prin analizarea nutreului martor care a fost
mbogit prin adugarea unei cantiti de robenidin, similar cu cea prezent n eantion.
Pentru a obine o concentraie de 60 mg/kg, se transfer 3 ml din soluia etalon stoc ntr-un
flacon tip Erlenmeyer de 250 ml. Se evapor soluia pn la cca 0,5 ml ntr-un curent de azot.
Se adaug 15 g din nutreul martor, se amestec i se ateapt 10 minute nainte de a se ncepe
etapa de extracie, conform prevederilor subpunctului 5.5.2.
Pentru aceast metod, nutreul martor este similar, ca tip, cu eantionul, iar la analiz
nu se detecteaz robenidin.
Se cntresc cu o abatere de 0,01 g, aproximativ 15 g de eantion preparat. Se transfer
ntr-un flacon tip Erlenmeyer de 250 ml i se adaug 100 ml metanol acidifiat, se nchide i se
agit timp de 1 or n agitator. Se filtreaz soluia prin hrtie de filtru din fibr de sticl i se
colecteaz ntregul filtrat ntr-un flacon tip Erlenmeyer de 150 ml. Se adaug 7,5 g de sit
molecular, se nchide i se agit timp de 5 minute. Se filtreaz imediat prin hrtie de filtru din
71
fibr de sticl. Se conserv aceast soluie pentru etapa de purificare (a se vedea observaia de
la subpunctul 5.5.3.).
5.5.3. Procedura de purificare
5.5.3.1. Pregtirea coloanei de oxid de aluminiu
Se introduce un tampon mic de vat de sticl n captul inferior al coloanei de sticl i
se mpinge utiliznd o baghet de sticl. Se cntresc 11 g din oxidul de aluminiu preparat i se
transfer n coloan. Pe parcursul acestei etape este important ca expunerea la aer s fie redus
la minimum. Se lovete uor coloana ncrcat n partea inferioar pentru a permite
stabilizarea oxidului de aluminiu.
5.5.3.2. Purificarea eantionului
Se transfer n coloan cu pipeta 5 ml de extract de eantionul preparat, conform
prevederilor descrise n subpunctul 5.5.2. Vrful pipetei se menine aproape de peretele
coloanei i se permite ca soluia s fie absorbit de oxidul de aluminiu. Se elueaz robenidina
din coloan folosind 100 ml metanol, cu un debit de 2-3 ml/minut i se colecteaz eluatul ntrun balon cu fundul rotund de 250 ml. Se evapor soluia de metanol pn la uscare sub
presiune redus la 40C, prin intermediul unui evaporator rotativ cu generare de film. Se
redizolv reziduul n 3-4 ml de faz mobil HPLC i se transfer cantitativ ntr-un balon gradat
de 10 ml. Se cltete balonul de mai multe ori cu cantiti de 1-2 ml de faz mobil i se
transfer lichidul de cltire n balonul gradat. Se completeaz pn la semn cu acelai solvent
i se amestec. Se filtreaz o parte alicot printr-un filtru cu membran de 0,45 m. Aceast
soluie se pstreaz pentru determinarea prin HPLC.
Tabelul nr. 8
Condiii HPLC
Tehnica de msurare
Faza mobil
Debit
Volum de injecie
Valorile indicate
echivalent
Amestec descris n subpunctul 5.3.8.
1,5 -2 ml/minut
317 nm
20-50 l.
Se verific stabilitatea sistemului cromatografic, prin injectarea de mai multe ori a

soluiei de calibrare care conine 3,6 g/ml, pn la obinerea de valori de vrf i de timpi de
retenie constani.
Fiecare soluie de calibrare se injecteaz de mai multe ori i se determin nlimile
(ariile) vrfurilor pentru fiecare concentraie. Se traseaz o curb de calibrare utiliznd
nlimile sau ariile medii ale vrfurilor soluiilor de calibrare ca ordonate i concentraiile
corespunztoare, n g/ml, ca abscise.
72
Se injecteaz de mai multe ori extractul de eantion, obinut conform prevederilor

subpunctului 5.5.3.2., folosind acelai volum ca i n cazul soluiilor de calibrare i se
determin nlimea (aria) medie a vrfurilor pentru vrfurile de robenidin.
Din nlimea (aria) medie a vrfurilor robenidinei din soluia de eantion se determin
concentraia n g/ml a soluiei de eantion prin referire la curba de calibrare.
Coninutul de robenidin w (mg/kg) din eantion este dat de formula urmtoare:
w = c 200 / m,
unde:
c = concentraia de robenidin din soluia de eantion, n g/ml;
m = greutatea poriunii de testat, n grame.
5.7.1. Identitatea
Identitatea analitului poate fi confirmat prin cocromatografie sau prin folosirea unui
detector cu grup de diode, prin intermediul cruia se compar spectrul extractului de eantion
i cel al soluiei de calibrare coninnd 6 g/ml.
Un extract de eantion se mbogete prin adugarea unei cantiti adecvate de soluie
de calibrare.
Cantitatea de robenidin adugat trebuie s fie similar cu cantitatea estimat de
robenidin constatat n extractul de eantion.
Numai nlimea vrfului de robenidin crete dup luarea n considerare a cantitii
adugate i a diluiei extractului. Lrgimea vrfului la jumtatea nlimii sale maxime trebuie
s se ncadreze ntr-o variaie de aproximativ 10 % din lrgimea iniial.
Rezultatele se evalueaz dup urmtoarele criterii:
a) lungimea de und a absorbiei maxime a spectrelor eantionului i a etalonului,
nregistrat la vrful cel mai nalt al cromatogramei, trebuie s fie aceeai, ntr-o marj
determinat de puterea de rezoluie a sistemului de detecie. Pentru detectarea cu grup de
diode, aceasta este n mod normal de aproximativ 2 nm;
b) ntre 225 i 400 nm, spectrele eantionului i ale etalonului, nregistrate la vrful cel
mai nalt al cromatogramei, nu trebuie s fie diferite pentru acele pri ale spectrului situate
ntre 10 i 100 % din absorbana relativ. Acest criteriu este ndeplinit atunci cnd snt prezente
aceleai maxime i cnd deviaia dintre dou spectre nu depete n nici-un punct observat 15
% din absorbana analitului etalon;
criteriu este ndeplinit atunci cnd snt prezente aceleai maxime i cnd deviaia dintre spectre
nu depete n nici-un punct observat 15 % din absorbana spectrului punctului maxim.
trebuie s depeasc 10 % din valoarea superioar, pentru un coninut de robenidin mai mare
de 15 mg/kg.
Pentru un eantion martor mbogit, recuperarea este de cel puin 85 %.
73
VI. Determinarea coninutului de diclazuril

(+)-4-clorfenil [2,6-diclor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2yl)fenil]-acetonitril
Prezenta metod permite determinarea coninutului de diclazuril din nutreuri i
premixuri. Limita de detecie este de 0,1 mg/kg, iar limita de cuantificare este de 0,5 mg/kg.
Dup adugarea unui standard intern, eantionul este extras cu metanol acidifiat.
Pentru nutreuri, o parte alicot a extractului este purificat pe un cartu C 18 pentru extracie n
faz solid. Diclazurilul este eluat din cartu cu un amestec de metanol acidifiat i ap. Dup
evaporare, reziduul se dizolv ntr-un amestec DMF/ap. Pentru premixuri, extractul se
evapor i reziduul se dizolv ntr-un amestec DMF/ap. Coninutul de diclazuril se determin
prin cromatografie lichid de nalt performan (HPLC) cu gradient ternar i cu faz
inversat, prin utilizarea unui detector UV.
6.3.1. Ap, de calitate HPLC.
6.3.2. Acetat de amoniu.
6.3.3. Sulfat acid de tetrabutilamoniu (TBHS).
6.3.6. N,N-dimetilformamid (DMF).
6.3.7. Acid clorhidric, 20 = 1,19 g/ml.
6.3.8. Substan etalon: diclazuril II-24: (+)-4-clorfenil [2,6 diclor-4-(2,3,4,5tetrahidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-il) fenil] acetonitril, cu puritate garantat, E771
6.3.8.1. Soluie etalon stoc de diclazuril, 500 g/ml
Se cntresc, cu o abatere de 0,1 mg, 25 mg de substan etalon de diclazuril ntr-un
balon gradat de 50 ml.
Se dizolv n N,N-dimetilformamid (DMF), se completeaz pn la semn cu N,Ndimetilformamid (DMF) i se amestec. Se mpacheteaz balonul n folie de aluminiu sau se
utilizeaz un balon de culoare brun i se depoziteaz n frigider. La o temperatur 4 C,
soluia este stabil timp de o lun.
6.3.8.2. Soluia etalon de diclazuril, 50 g/ml
Se transfer 5 ml din soluia etalon stoc de diclazuril ntr-un balon gradat de 50 ml, se
completeaz pn la semn cu N,N-dimetilformamid (DMF) i se amestec. Se mpacheteaz
balonul n folie de aluminiu sau se utilizeaz un balon de culoare brun i se depoziteaz n
frigider. La o temperatur 4C, soluia este stabil timp de o lun.
6.3.9. Substan etalon intern: 2,6 diclor--(4-clorfenil)-4-[4,5-dihidro-3,5-dioxo1,2,4-triazin-2 (3H)-il]-metilben-zen-acetonitril
6.3.9.1. Soluie etalon stoc intern de diclazuril, 500 g/ml
Se cntresc, cu o abatere de 0,1 mg, 25 mg de substan etalon intern ntr-un balon
gradat de 50 ml. Se dizolv n N,N-dimetilformamid (DMF), se completeaz pn la semn cu
N,N-dimetilformamid (DMF) i se amestec. Se mpacheteaz balonul n folie de aluminiu
sau se utilizeaz un balon de culoare brun i se depoziteaz n frigider. La o temperatur
4C, soluia este stabil timp de o lun.
6.3.9.2. Soluie etalon intern, 50 g/ml
Se transfer 5 ml din soluia etalon stoc intern de etalon intern (a se vedea meniunea
de la subpunctul 6.3.9.1.) ntr-un balon gradat de 50 ml, se completeaz pn la semn cu N,Ndimetilformamid (DMF) i se amestec. Se mpacheteaz balonul n folie de aluminiu sau se
74
utilizeaz un balon de culoare brun i se depoziteaz n frigider. La o temperatur 4C,

6.3.9.3. Soluie etalon intern pentru premixuri, p/1 000 mg/ml (p = coninut nominal
n diclazuril al premixului n mg/kg)
Se cntresc, cu o abatere de 0,1 mg, p/10 mg de substan etalon intern ntr-un balon
gradat de 100 ml, se dizolv n N,N-dimetilformamid (DMF) ntr-o baie cu ultrasunete,
conform prevederilor subpunctului 6.4.6., se completeaz pn la semn cu N,Ndimetilformamid (DMF) i se amestec. Se mpacheteaz balonul n folie de aluminiu sau se
utilizeaz un balon de culoare brun i se depoziteaz n frigider. La o temperatur 4C,
6.3.10. Soluie de calibrare, 2 g/ml
Se pipeteaz 2 ml din soluia etalon de diclazuril (a se vedea meniunea de la
subpunctul 6.3.8.2) i 2 ml din soluia etalon intern, specificat n subpunctul 6.3.9.2., ntr-un
balon gradat de 50 ml. Se adaug 16 ml de N,N-dimetilformamid (DMF), se completeaz
pn la semn cu ap i se amestec. Soluia trebuie preparat imediat nainte de utilizare.
6.3.11. Cartu C 18 pentru extracie n faz solid, de exemplu Bond Elut, mrime: 1 cc,
greutatea absorbentului: 100 mg.
6.3.12. Solvent de extracie: metanol acidifiat
Se pipeteaz 5 ml de acid clorhidric n 1 000 ml de metanol, de calitate HPLC i se
amestec.
6.3.13. Faz mobil pentru HPLC
6.3.13.1. Eluent A: acetat de amoniu soluie de sulfat acid de tetrabutilamoniu.
Se dizolv 5 g de acetat de amoniu i 3,4 g de sulfat acid de tetrabutilamoniu (TBHS)
n 1 000 ml de ap, de calitate HPLC i se amestec.
6.3.13.2. Eluent B: acetonitril, de calitate HPLC.
6.3.13.3. Eluent C: metanol, de calitate HPLC.
6.4. Dispozitive
6.4.1. Agitator mecanic.
6.4.2. Echipament pentru HPLC cu gradient ternar
6.4.2.1. Coloan pentru cromatografie lichid, Hypersil ODS, particule de 3 m, 100
mm 4,6 mm sau echivalent.
6.4.2.2. Detector UV cu ajustare variabil a lungimii de und sau detector cu grup de
diode.
6.4.4. Filtru cu membran, 0,45 m.
6.4.5. Distribuitor n vid.
6.4.6. Baie cu ultrasunete.
6.5.1.1. Nutre martor
Se analizeaz un nutre martor pentru a verifica absena diclazurilului i a substanelor
interferente. Nutreul martor este similar, ca tip, cu eantionul, iar prin analiz nu se detecteaz
nici diclazuril, nici substane interferente.
6.5.1.2. Test de recuperare
Se efectueaz un test de recuperare prin analiza nutreului martor mbogit prin
adugarea unei cantiti de diclazuril, similar cu cea prezent n eantion. Pentru a obine o
concentraie de 1 mg/kg, se adaug 0,1 ml din soluia etalon stoc, conform prevederilor
subpunctului 6.3.8.1., la 50 g din nutreul martor, se amestec bine i se las timp de 10
minute, amestecnd din nou de mai multe ori nainte de a continua (a se vedea meniunea de la
subpunctul 6.5.2).
75
Alternativ, dac nu este disponibil un nutre martor similar, ca tip, cu eantionul (a se

vedea prevederile descrise n subpunctul 6.5.1.1), testul de recuperare poate fi efectuat prin
metoda standard de adugare a etalonului. n acest caz, eantionul de analizat se mbogete
adugnd o cantitate de diclazuril similar celei deja prezente n eantion. Acest eantion este
analizat mpreun cu eantionul nembogit, iar recuperarea poate fi calculat prin scdere.
6.5.2.1. Nutreuri
Se cntresc, cu o abatere de 0,01 g, aproximativ 50 g de eantion. Se transfer ntr-un
flacon tip Erlenmeyer de 500 ml, se adaug 1 ml din soluia etalon intern (a se vedea
subpunctul 6.3.9.2.), 200 ml din solventul de extracie i se astup flaconul. Se agit amestecul
n agitator mecanic pe parcursul nopii. Se las s se sedimenteze timp de 10 minute. Se
transfer o parte alicot de 20 ml din supernatant ntr-un recipient de sticl adecvat i se
dilueaz n 20 ml ap.
Se transfer aceast soluie ntr-un cartu de extracie, specificat n subpunctul 6.3.11.
i se trece prin acesta prin aplicare de vid (a se vedea subpunctul 6.4.5.). Se spal cartuul cu
25 ml dintr-un amestec de solvent de extracie: metanol acidifiat i ap, 65 + 35 (V + V). Se
elimin fraciunile colectate i se elueaz compuii cu ajutorul a 25 ml dintr-un amestec de
solvent de extracie i ap, 80 + 20 (V + V). Se evapor aceast fraciune pn la uscare prin
intermediul evaporatorului rotativ la 60 C. Se dizolv reziduul n 1 ml N,N-dimetilformamid
(DMF), se adaug 1,5 ml de ap, de calitate HPLC i se amestec. Se filtreaz cu un filtru cu
membran. Se continu cu determinarea prin HPLC, conform prevederilor subpunctului 6.5.3.
6.5.2.2. Premixuri
Se cntresc, cu o abatere de 0,001 g, aproximativ 1 g de eantion. Se transfer ntr-un
flacon tip Erlenmeyer de 500 ml, se adaug 1 ml din soluia etalon intern (a se vedea
meniunea de la subpunctul 6.3.9.3.) i 200 ml din solventul de extracie i se astup flaconul.
Se agit amestecul n agitator mecanic pe parcursul nopii. Se las s se sedimenteze timp de
10 minute. Se transfer o parte alicot de 10 000/p ml (p = coninutul nominal n diclazuril al
premixului n mg/kg) din supernatant ntr-un balon cu fund rotund de dimensiuni adecvate. Se
evapor acest amestec pn la uscare, la presiune sczut i la 60C, cu ajutorul unui
evaporator rotativ. Se dizolv din nou reziduul n 10 ml de N,N-dimetilformamid (DMF), se
adaug 15 ml de ap, de calitate HPLC i se amestec. Se continu cu determinarea prin
HPLC, conform prevederilor subpunctului 6.5.3.
Tabelul nr. 9
Condiii HPLC
Tehnica de msurare
Faza mobil
Modul de eluie
Valorile indicate
Hypersil ODS, particule de 3 m, 100 mm
4,6 mm sau echivalent
Eluent A: Soluie apoas de acetat de
amoniu i sulfat acid de tetrabutilamoniu;
Eluent B: acetonitril, de calitate HPLC;
Eluent C: metanol, de calitate HPLC
Gradient linear;
Condiii iniiale: A + B + C = 60 + 20 +
20 (V + V + V);
76
Dup 10 min, eluia prin gradient timp de

30 min la: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V +
V + V).
Se cltete cu B timp de 10 minute.
Debit
Volum de injecie
1,5 -2 ml/minut
20 l
280 nm
Se verific stabilitatea sistemului cromatografic injectndu-se de mai multe ori soluia

de calibrare care conine 2 g/ml, pn cnd se obin valori de vrf i timpi de retenie
constani.
6.5.3.2. Soluia de calibrare
Se injecteaz 20 l din soluia de calibrare de mai multe ori i se determin nlimea
(aria) medie a vrfurilor de diclazuril i a vrfurilor etalonului intern.
Se injecteaz 20 l din soluia de eantion, obinut conform prevederilor subpunctului
6.5.2.1. sau 6.5.2.2. de mai multe ori i se determin nlimea (aria) medie a vrfului de
diclazuril i a vrfurilor etalonului intern.
6.6.1. Nutreuri
Coninutul n diclazuril w (n mg/kg) al eantionului este dat de urmtoarea formul:
w = h d,s h i,c / h i,s h d,c c d,c 10V / m [mg/kg],
unde:
h d,s = nlimea (aria) vrfului de diclazuril din soluia de eantion, preparat conform
prevederilor subpunctului 6.5.2.1.;
h i,s = nlimea (aria) vrfului etalonului intern din soluia de eantion, preparat
conform prevederilor subpunctului 6.5.2.1.;
h d,c = nlimea (aria) vrfului de diclazuril din soluia de calibrare, preparat conform
prevederilor subpunctului 6.3.10.;
h i,c = nlimea (aria) vrfului etalonului intern din soluia de calibrare, preparat
conform prevederilor subpunctului 6.3.10.;
c d,c = concentraia de diclazuril din soluia de calibrare n g/ml (a se vedea meniunea
de la subpunctul 6.3.10.);
m = greutatea poriunii de testat, n g;
V = volumul extractului de eantion conform prevederilor descrise n subpunctul
6.5.2.1. (adic 2,5 ml).
6.6.2. Premixuri
Coninutul n diclazuril w (n mg/kg) al eantionului este dat de urmtoarea formul:
w = h d,s h i,c / h i,s h d,c c d,c 0,02V p / m [mg/kg],
unde:
h d,s = nlimea (aria) vrfului de diclazuril din soluia de eantion, preparat conform
prevederilor subpunctului 6.5.2.2.;
h i,s = nlimea (aria) vrfului etalonului intern din soluia de eantion, preparat
conform prevederilor subpunctului 6.5.2.2.;
h d,c = nlimea (aria) vrfului de diclazuril din soluia de calibrare, preparat conform
prevederilor subpunctului 6.3.10.;
77
h i,c = nlimea (aria) vrfului etalonului intern din soluia de calibrare, preparat
conform prevederilor subpunctului 6.3.10.;
c d,c = concentraia de diclazuril din soluia de calibrare n g/ml (a se vedea meniunea
de la subpunctul 6.3.10.);
m = greutatea poriunii de testat, n g;
V = volumul extractului de eantion conform prevederilor descrise n subpunctul
6.5.2.2. (adic 25 ml);
p = coninutul nominal de diclazuril al premixului n mg/kg.
6.7.1. Identitatea
Identitatea analitului poate fi confirmat prin cocromatografie sau prin utilizarea unui
detector cu grup de diode care permite compararea spectrelor extractului de eantion, obinut
conform prevederilor descrise n subpunctul 6.5.2.1. sau 6.5.2.2. i ale soluiei de calibrare,
preparat conform prevederilor subpunctului 6.3.10.
Un extract de eantion, obinut conform prevederilor descrise n subpunctul 6.5.2.1.
sau 6.5.2.2., este mbogit prin adugarea unei cantiti adecvate din soluia de calibrare,
preparat conform prevederilor subpunctului 6.3.10. Cantitatea de diclazuril adugat trebuie
s fie similar cu cantitatea de diclazuril constatat n extractul de eantion.
Numai nlimea vrfului de diclazuril i a vrfului etalonului intern crete dup luarea
n considerare att a cantitii adugate, ct i a diluiei extractului. Lrgimea vrfului, la
jumtatea nlimii sale, trebuie s se ncadreze n 10 % din lrgimea iniial a vrfului de
diclazuril sau a vrfului etalonului intern al extractului de eantion nembogit.
Rezultatele se evalueaz n funcie de urmtoarele criterii:
a) lungimea de und a absorbiei maxime a spectrelor eantionului i etalonului,
nregistrat la vrful cel mai nalt al cromatogramei, trebuie s fie aceeai, ntr-o marj
determinat de puterea de rezoluie a sistemului de detecie. Pentru detecia cu grup de diode,
acest interval este n general de 2 nm;
b) ntre 230 i 320 nm, spectrele eantionului i etalonului nregistrate la vrful cel mai
nalt al cromatogramei nu trebuie s fie diferite pentru acele pri ale spectrului situate ntre 10
i 100 % din absorbana relativ. Acest criteriu este ndeplinit atunci cnd snt prezente
aceleai maxime i cnd deviaia dintre spectre nu depete n niciun punct observat 15 % din
absorbana analitului etalon;
criteriu este ndeplinit atunci cnd snt prezente aceleai maxime i cnd deviaia dintre spectre
nu depete n nici-un punct observat 15 % din absorbana spectrului celui mai nalt vrf al
cromatogramei.
trebuie s depeasc:
a) 30 % din valoarea superioar pentru un coninut n diclazuril situat ntre 0,5 i 2,5
mg/kg;
b) 0,75 mg/kg pentru un coninut n diclazuril situat ntre 2,5 i 5 mg/kg;
c) 15 % din valoarea superioar pentru un coninut de diclazuril mai mare de 5 mg/kg.
78
Pentru un eantion (martor) mbogit, recuperarea este de cel puin 80 %.

6.8. Observaii
Trebuie s se demonstreze n prealabil c reacia diclazurilului este liniar pentru toat
gama de concentraii msurate.
VII. Determinarea coninutului de lasalocid sodic
Sare sodic a unui acid monocarboxilic polieter, produs de Streptomyces lasaliensis
Prezenta metod permite determinarea coninutului n lasalocid sodic din nutreuri i
premixuri. Limita de detecie este de 5 mg/kg, iar limita de cuantificare este de 10 mg/kg.
Lasalocidul sodic este extras din eantion cu metanol acidifiat i dozat prin
cromatografie lichid de nalt performan cu faz inversat (RP-HPLC) cu ajutorul unui
detector spectrofluorimetric.
7.3.1. Fosfat diacid de potasiu (KH 2 PO 4 ).
7.3.2. Acid ortofosforic, g (g/g) = 85 %.
7.3.3. Soluie de acid ortofosforic, c = 20 %.
Se dilueaz 23,5 ml acid ortofosforic n 100 ml de ap.
7.3.4. 6-metil-2-heptilamin (1,5-dimetilhexilamin), g (g/g) = 99 %.
7.3.6. Acid clorhidric, densitate = 1,19 g/ml.
7.3.7. Soluie tampon de fosfat, c = 0,01 mol/1
Se dizolv 1,36 g de fosfat diacid de potasiu (KH 2 PO 4 ) n 500 ml de ap, de calitate
HPLC, se adaug 3,5 ml de acid ortofosforic i 10 ml de 6-metil-2-heptilamin. Se ajusteaz
pH-ul la 4 cu ajutorul soluiei de acid ortofosforic i se dilueaz cu ap, de calitate HPLC,
completndu-se pn la 1 000 ml.
7.3.8. Metanol acidifiat
Se transfer 5 ml de acid clorhidric ntr-un balon gradat de 1 000 ml, se completeaz
pn la semn cu metanol, de calitate HPLC i se amestec. Soluia trebuie preparat imediat
nainte de utilizare.
7.3.9. Faz mobil HPLC, soluie tampon de fosfat i metanol 5 + 95 (V + V)
Se amestec 5 ml de soluie tampon de fosfat cu 95 ml de metanol.
7.3.10. Substan etalon de lasalocid sodic cu puritate garantat, C 34 H 53 O 8 Na (sare
sodic a unui acid monocarboxilic polieter, produs de Streptomyces lasaliensis), E 763
7.3.10.1. Soluie etalon stoc de lasalocid sodic, 500 g/ml
Se cntresc, cu o abatere de 0,1 mg, 50 mg de lasalocid sodic, descris n subpunctul
7.3.10., ntr-un balon gradat de 100 ml, se dizolv n metanol acidifiat, se completeaz pn la
semn cu acelai solvent i se amestec. Soluia se prepar imediat nainte de utilizare.
7.3.10.2. Soluie etalon intermediar de lasalocid sodic, 50 g/ml
Se pipeteaz 10 ml din soluia etalon stoc (a se vedea meniunea de la subpunctul
7.3.10.1.) ntr-un balon gradat de 100 ml, se completeaz pn la semn cu metanol acidifiat i
se amestec. Soluia se prepar imediat nainte de utilizare.
Se transfer 1, 2, 4, 5 i 10 ml de soluie etalon intermediar ntr-o serie de baloane
gradate de 50 ml. Se completeaz pn la semn cu metanol acidifiat i se amestec. Aceste
79
soluii corespund concentraiilor de 1, 2, 4, 5 i 10 g de lasalocid sodic pe ml. Ele se prepar

imediat nainte de utilizare.
7.3.11. Ap de calitate HPLC.
7.4. Dispozitive
7.4.1. Baie cu ultrasunete (sau baie de ap cu agitare) cu reglaj de temperatur
7.4.2. Filtre cu membran, 0,45 m
7.4.3. Echipament HPLC cu sistem de injecie, permind injectarea de volume de 20 l
7.4.3.1. Coloan pentru cromatografie lichid de 125 mm 4 mm, faz inversat C 18 ,
particule de 5 m sau echivalent
7.4.3.2. Spectrofluorimetru cu ajustare variabil a lungimii de und pentru excitaie i
emisie
7.5.1.1. Nutre martor
Pentru a efectua testul de recuperare (a se vedea meniunea de la subpunctul 7.5.1.2.),
se analizeaz un nutre martor pentru a verifica absena lasalocidului sodic i a substanelor
interferente. Nutreul martor este similar, ca tip, cu eantionul; nu se detecteaz nici lasalocid
sodic, nici substane interferente.
7.5.1.2. Test de recuperare
Se efectueaz un test de recuperare prin analiza nutreului martor mbogit prin
adugarea unei cantiti de lasalocid sodic, similar cu cea prezent n eantion. Pentru a
obine o concentraie de 100 mg/kg, se transfer 10 ml de soluie etalon stoc (a se vedea
meniunea de la subpunctul 7.3.10.1.) ntr-un flacon tip Erlenmeyer de 250 ml i se evapor
soluia pn la aproximativ 0,5 ml. Se adaug 50 g de nutre martor, se amestec bine i se las
timp de 10 minute, amestecnd din nou de mai multe ori nainte de a trece la etapa de extracie,
conform prevederilor subpunctului 7.5.2.
Alternativ, dac nu este disponibil un nutre martor similar, ca tip, cu eantionul (vezi
prevederile subpunctului 7.5.1.1.), testul de recuperare poate fi efectuat prin metoda standard
de adugare a etalonului. n acest caz, eantionul de analizat este mbogit cu o cantitate de
lasalocid sodic asemntoare celei deja prezente n eantion. Acesta este analizat mpreun cu
eantionul nembogit, iar recuperarea se poate calcula prin diferen.
7.5.2.1. Nutreuri
Se cntresc cu o abatere de 0,01 g, de la 5 la 10 g de eantion ntr-un flacon tip
Erlenmeyer de 250 ml cu dop.
Se picur cu pipeta 100 ml de metanol acidifiat. Se nchide uor i se agit circular
pentru a se dispersa.
Flaconul se plaseaz ntr-o baie cu ultrasunete la aproximativ 40C timp de 20 de
minute, se scoate i se las s se rceasc la temperatura camerei. Se las n repaus timp de
aproximativ o or, pn la decantarea materiilor n suspensie, apoi se filtreaz o parte alicot
printr-un filtru cu membran de 0,45 m ntr-un recipient adecvat. Se continu cu
determinarea prin HPLC, conform prevederilor subpunctului 7.5.3.
7.5.2.2. Premixuri
Se cntresc, cu o abatere de 0,001 g, 2 g de premix nemcinat ntr-un balon gradat de
250 ml. Se adaug 100 ml de metanol acidifiat i se agit circular pentru a se dispersa. Se pune
balonul i coninutul acestuia ntr-o baie cu ultrasunete la aproximativ 40C timp de 20 de
minute, apoi se scoate i se las s se rceasc la temperatura camerei. Se completeaz pn la
semn cu metanol acidifiat i se amestec bine. Se las n repaus timp de aproximativ o or,
pn la decantarea materiilor n suspensie, apoi se filtreaz o parte alicot printr-un filtru cu
80
membran de 0,45 m. Se dilueaz un volum adecvat de filtrat limpede cu metanol acidifiat,

pentru a produce o soluie de testat final care s conin aproximativ 4 g/ml de lasalocid
sodic. Se continu cu determinarea prin HPLC, conform prevederilor subpunctului 7.5.3.
Tabelul nr.
10
Condiii HPLC
Tehnica de msurare
Faza mobil
Debit
Volum de injecie
Valorile indicate
125 mm 4 mm, faz inversat C 18 , particule
de 5 m sau echivalent
Amestec de soluie tampon de fosfat, obinut
conform prevederilor subpunctului 7.3.7. i
metanol, 5 + 95 (V + V)
1-2 ml/minut
20 l
Excitaie: 310 nm
Emisie: 419 nm
Se verific stabilitatea sistemului cromatografic, injectnd de mai multe ori soluia de

calibrare coninnd 4 g/ml, pn la obinerea de nlimi (arii) ale vrfurilor i de timpi de
retenie constani.
Se injecteaz fiecare soluie de calibrare de mai multe ori i se determin nlimile
(ariile) medii ale vrfurilor pentru fiecare concentraie. Se traseaz o curb de calibrare
utiliznd valorile (ariile) medii ale vrfurilor ca ordonate i concentraiile corespunztoare, n
g/ml, ca abscise.
Se injecteaz extractul de eantion, obinut conform prevederilor descrise n subpunctul
7.5.2.1. sau 7.5.2.2. de mai multe ori utiliznd acelai volum cu cel reinut pentru soluia de
calibrare i se determin nlimile (ariile) medii ale vrfurilor de lasalocid sodic.
Plecnd de la nlimea (aria) medie a vrfurilor soluiei de eantion, se determin
concentraia de lasalocid sodic (g/ml) prin referire la curba de calibrare.
7.6.1. Nutreuri
Coninutul de lasalocid sodic w (n mg/kg) al eantionului este dat de urmtoarea
formul:
w = c V 1 / m [mg/kg],
unde:
c = concentraia de lasalocid sodic a soluiei de eantion, preparat conform
prevederilor subpunctului 7.5.2.1., n g/ml;
V 1 = volumul extractului de eantion, conform prevederilor descrise n subpunctul
7.5.2.1., n ml (adic 100);
81
7.6.2. Premixuri
Coninutul de lasalocid sodic w (n mg/kg) al eantionului este dat de urmtoarea
formul:
w = c V 2 f / m [mg/kg],
unde:
c = concentraia de lasalocid sodic a soluiei de eantion, preparat conform
prevederilor subpunctului 7.5.2.2., n g/ml;
V 2 = volumul extractului de eantion, conform prevederilor descrise n subpunctul
7.5.2.2., n ml (adic 250);
f = factorul de diluie (a se vedea meniunea de la subpunctul 7.5.2.2.);
7.7.1. Identitatea
Metodele bazate pe spectrofluorimetrie snt mai puin supuse interferenelor dect cele
care utilizeaz un detector UV. Identitatea analitului poate fi confirmat de ctre
cocromatografie.
Un extract de eantion, preparat conform prevederilor subpunctului 7.5.2.1. sau
7.5.2.2., este mbogit prin adugarea unei cantiti corespunztoare de soluie de calibrare.
Cantitatea de lasalocid sodic adugat trebuie s fie asemntoare cantitii de lasalocid sodic
constatat n extractul de eantion. Numai nlimea vrfului corespunztor lasalocidului sodic
se mrete dup ce s-a luat n calcul cantitatea de lasalocid sodic adugat i diluia
extractului. Lrgimea vrfului, la jumtatea nlimii, trebuie s se ncadreze ntre 10 % din
lrgimea iniial a vrfului produs de extractul de eantion nembogit.
trebuie s depeasc:
15 % din valoarea superioar pentru un coninut de lasalocid sodic situat ntre 30 i 100
mg/kg;
15 mg/kg pentru un coninut de lasalocid sodic situat ntre 100 i 200 mg/kg;
7,5 % din valoarea superioar pentru un coninut de lasalocid sodic mai mare de 200
mg/kg.
Pentru un eantion de nutre (martor) mbogit, recuperarea este de cel puin 80 %.
Pentru eantioanele de premixuri mbogite, recuperarea este de cel puin 90 %.
Anexa nr. 5
nr.686
Metodele de analiz
pentru controlul substanelor nedorite n nutreuri
1. Determinarea coninutului de gosipol liber i total
82
Prezenta metod permite determinarea nivelurilor de gosipol liber, de gosipol total i

de substane chimic nrudite cu acesta din smn de bumbac, fin de smn de bumbac i
brichete de smn de bumbac i din nutreuri combinate care conin aceste materii prime
pentru nutreuri, atunci cnd gosipolul liber, gosipolul total i substanele chimic nrudite cu
acesta snt prezente n concentraie mai mare de 20 mg/kg.
Gosipolul se extrage n prezena a 3-aminopropan-1-ol, fie cu un amestec de propan-2ol i hexan, pentru determinarea gosipolului liber, fie cu dimetilformamid, pentru
determinarea gosipolului total. Gosipolul este convertit de anilin n gosipol-dianilin, a crei
densitate optic se msoar la lungimea de und de 440 nm.
1.3.1. Amestec de propan-2-ol-hexan: se amestec 60 de pri volumetrice de propan2-ol cu 40 de pri volumetrice de n-hexan.
1.3.2. Solvent A: Se plaseaz ntr-un balon gradat de 1 litru aproximativ 500 ml de
amestec de propan-2-ol-hexan, 2 ml de 3-aminopropan-1-ol, 8 ml de acid acetic glacial i 50
ml de ap. Se aduce la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan. Acest reactiv este stabil timp
de o sptmn.
1.3.3. Solvent B: Se pipeteaz 2 ml de 3-aminopropan-1-ol i 10 ml de acid acetic
glacial ntr-un balon gradat de 100 ml.
Se rcete la temperatura camerei i se aduce la volum cu N, N-dimetilformamid.
Acest reactiv este stabil timp de o sptmn.
1.3.4. Anilin: Dac densitatea optic a testului martor depete 0,022, se distileaz
anilina peste praf de zinc, ndeprtnd primele i ultimele fraciuni de 10 % de distilat. Rcit n
frigider i depozitat ntr-un vas din sticl brun cu dop, acest reactiv se pstreaz timp de
cteva luni.
1.3.5. Soluie etalon de gosipol A: Se plaseaz 27,9 mg de acetat de gosipol ntr-un
balon gradat de 250 ml. Se dizolv i se aduce la volum cu solvent A. Se pipeteaz 50 ml din
aceast soluie ntr-un balon gradat de 250 ml i se completeaz pn la volum cu solvent A.
Concentraia de gosipol a acestei soluii este de 0,02 mg/ml. Se las s stea timp de o or la
temperatura camerei nainte de utilizare.
1.3.6. Soluie etalon de gosipol B: Se plaseaz 27,9 mg de acetat de gosipol ntr-un
balon gradat de 50 ml, se dizolv i se aduce la volum cu solvent B. Concentraia de gosipol a
acestei soluii este de 0,5 mg/ml.
Soluiile etalon de gosipol A i B rmn stabile timp de 24 de ore dac snt protejate de
lumin.
1.4. Dispozitive
1.4.1. Mixer (agitator): aproximativ 35 rpm.
1.5.1. Eantionul de testat
Cantitatea de eantion de testat folosit depinde de coninutul estimat de gosipol al
eantionului. Este preferabil s se lucreze cu un eantion de testat mic i cu o parte alicot de
filtrat relativ mare, pentru a obine suficient gosipol pentru a permite msurarea fotometric
precis. Pentru determinarea gosipolului liber din smn de bumbac, fin de smn de
bumbac i din brichetele de smn de bumbac, eantionul de testat nu depete 1 g; pentru
nutreurile combinate, aceasta poate fi de maximum 5 g. O parte alicot de 10 ml de filtrat este
suficient n majoritatea cazurilor; aceasta conine ntre 50 i 100 g de gosipol. Pentru
determinarea gosipolului total, eantionul de testat este ntre 0,5 i 5 g, pentru ca o parte
alicot de 2 ml de filtrat s conin ntre 40 i 200 g de gosipol.
83
Analiza se efectueaz la o temperatur a camerei de aproximativ 20C.

1.5.2. Determinarea gosipolului liber
Se plaseaz eantionul de testat ntr-un balon cu gt lefuit de 250 ml, fundul balonului
fiind acoperit cu sticl pisat. Utiliznd o pipet, se adaug 50 ml de solvent A, se astup
balonul i se amestec timp de o or n mixer. Se filtreaz printr-un filtru uscat i se colecteaz
filtratul ntr-un balon mic cu gt lefuit. n timpul filtrrii, se acoper plnia cu o sticl de ceas.
Se pipeteaz pri alicote identice de filtrat coninnd 50-100 g de gosipol n fiecare
din cele dou baloane gradate de 25 ml (A i B). Dac este necesar, se aduce la volum pn la
10 ml cu solvent A. Apoi se completeaz coninutul balonului (A) pn la volum cu amestec de
propan-2-ol-hexan. Aceast soluie va fi folosit ca soluie de referin fa de care se msoar
soluia de eantion.
Se pipeteaz 10 ml de solvent A n fiecare din celelalte dou baloane gradate de 25 ml
(C i D). Se completeaz coninutul balonului (C) pn la volum cu amestec de propan-2-olhexan. Aceast soluie va fi utilizat ca soluie de referin fa de care se msoar soluia
testului martor.
Se adaug 2 ml de anilin n fiecare din baloanele (D) i (B). Se nclzesc timp de 30
de minute deasupra unei bi de ap n fierbere, pentru a aprea culoarea. Se rcesc la
temperatura camerei, se aduc la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan, se omogenizeaz i
se las s stea timp de o or.
Se determin densitatea optic a soluiei testului martor (D) prin comparaie cu soluia
de referin (C), precum i densitatea optic a soluiei de eantion (B) prin comparaie cu
soluia de referin (A), n spectrofotometru la 440 nm folosind celule de sticl de 1 cm.
Se scade densitatea optic a soluiei testului martor din cea a soluiei de eantion (=
densitatea optic corectat). Din aceast valoare se calculeaz coninutul n gosipol liber,
conform indicaiilor de la punctul 1.6.
1.5.3. Determinarea gosipolului total
Se plaseaz un eantion de testat coninnd 1-5 mg de gosipol ntr-un balon gradat de
50 ml i se adaug 10 ml de solvent B. n acelai timp, se prepar un test martor, plasndu-se
10 ml de solvent B n alt balon gradat de 50 ml. Se nclzesc cele dou baloane timp de 30 de
minute deasupra unei bi de ap n fierbere. Se rcesc la temperatura camerei i se
completeaz coninutul fiecrui balon pn la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan. Se
omogenizeaz i se las s se depun timp de 10-15 minute, apoi se filtreaz i se colecteaz
filtratele n baloane cu gt lefuit.
Se pipeteaz 2 ml de filtrat de eantion n fiecare din cele dou baloane gradate de 25
ml, i 2 ml de filtrat al testului martor n fiecare din celelalte dou baloane de 25 ml. Se
completeaz coninutul unui balon din fiecare serie pn la 25 ml cu amestecul de propan-2-olhexan. Aceste soluii snt utilizate ca soluii de referin.
Se adaug 2 ml de anilin n fiecare dintre celelalte dou baloane. Se nclzesc timp de
30 de minute deasupra unei bi de ap n fierbere, pentru a aprea culoarea. Se rcesc la
temperatura camerei, se aduc la volumul de 25 ml cu amestecul de propan-2-ol-hexan, se
omogenizeaz i se las s stea timp de o or.
Se determin densitatea optic, n conformitate cu indicaiile de la subpunctul 1.5.2.
pentru gosipolul liber. Din aceast valoare se calculeaz coninutul de gosipol total, n
conformitate cu indicaiile de la punctul 1.6.
Rezultatele pot fi calculate fie pe baza densitii optice specifice (a se vedea meniunea
de la subpunctul 1.6.1.), fie prin referire la o curb de calibrare, conform prevederilor descries
n subpunctul 1.6.2.
1.6.1. Cu ajutorul densitii optice specifice
Densitile optice specifice, n condiiile descrise, snt urmtoarele:
84
Gosipolul liber E 1 % / 1 cm = 625

Gosipolul total E 1 % / 1 cm = 600
Coninutul de gosipol liber sau de gosipol total al eantionului este calculat folosind
urmtoarea formul:
% gosipol : E 1 250 / E 1 %
1cm
p a,
unde:
E = densitatea optic corectat, determinat conform indicaiilor de la subpunctul
1.5.2.;
p = eantion de testat, n g;
a = partea alicot a filtratului, n ml.
1.6.2. Cu ajutorul curbei de calibrare
1.6.2.1. Gosipolul liber
Se prepar 2 serii de cinci baloane gradate de 25 ml. Se pipeteaz pri alicote de 2, 4,
6, 8 i 10 ml de soluie etalon de gosipol A n fiecare serie de baloane. Se aduc la volum pn
la 10 ml cu solventul A. Se completeaz fiecare serie cu un balon gradat de 25 ml coninnd
numai 10 ml de solvent A (testul martor).
Se aduc la volum baloanele din prima serie (inclusiv balonul testului martor) pn la 25
ml cu un amestec de propan-2-ol-hexan (serii de referin).
Se adaug 2 ml de anilin la fiecare din baloanele din a doua serie (inclusiv balonul
testului martor). Se nclzesc timp de 30 de minute deasupra unei bi de ap n fierbere, pentru
a aprea culoarea. Se rcesc la temperatura camerei, se aduc la volum cu un amestec de
propan-2-ol-hexan, se omogenizeaz i se las s stea o or (serii etalon).
Se determin, conform indicaiilor de la subpunctul 1.5.2, densitatea optic a soluiilor
din seriile etalon, prin comparaie cu soluiile corespunztoare din seriile de referin. Se
traseaz curba de calibrare prin reprezentarea grafic a densitilor optice n raport cu
cantitile de gosipol (n g).
1.6.2.2. Gosipolul total
Se prepar ase baloane gradate de 50 ml. n primul balon se plaseaz 10 ml de solvent
B, iar n celelalte 2, 4, 6, 8 i 10 ml de soluie etalon de gosipol B. Se completeaz coninutul
fiecrui balon pn la 10 ml cu solvent B. Se nclzesc timp de 30 de minute ntr-o baie de ap
n fierbere. Se rcesc la temperatura camerei, se completeaz volumul cu un amestec de
propan-2-ol-hexan i se omogenizeaz.
Se plaseaz 2 ml din aceste soluii n fiecare din cele dou serii de cte ase baloane
gradate de 25 ml. Se completeaz coninutul baloanelor din prima serie pn la 25 ml cu un
amestec de propan-2-ol-hexan (serii de referin).
Se adaug 2 ml de anilin la fiecare balon din a doua serie. Se nclzesc timp de 30 de
minute ntr-o baie de ap n fierbere. Se rcesc la temperatura camerei, se aduc la volum cu un
amestec de propan-2-ol-hexan, se omogenizeaz i se las s stea timp de o or (serii etalon).
Se determin, conform indicaiilor de la subpunctul 1.5.2., densitatea optic a soluiilor
din seriile etalon, prin comparaie cu soluiile corespunztoare din seriile de referin. Se
traseaz curba de calibrare prin reprezentarea grafic a densitilor optice n raport cu
cantitile de gosipol (n g).
trebuie s depeasc:
15 %, n valoare relativ, pentru un coninut de gosipol mai mic de 500 ppm;
75 ppm, n valoare absolut, pentru un coninut de gosipol de minimum 500 ppm i
maximum 750 ppm;
85
10 %, n valoare relativ la cea mai nalt valoare, pentru un coninut de gosipol mai
mare de 750 ppm.
2. Determinarea nivelurilor de dioxine (pcdd/pcdf) i al nivelurilor de
difenili policlorurai (pcb) asemntori dioxinei
I. Metode de eantionare i de interpretare a rezultatelor analitice
Eantioanele destinate controalelor oficiale ale nivelurilor de dioxine [dibenzo-pdioxine policlorurate (pcdd) i dibenzofurani policlorurai (pcdf)] i de difenili policlorurai
(pcb), indicai n tabelul nr.1 din prezenta anex, asemntori dioxinei din nutreuri se
preleveaz n conformitate cu indicaiile din anexa nr. 1. Este necesar s se aplice cerinele
cantitative referitoare la controlul substanelor sau produselor uniform repartizate n nutreuri,
n conformitate cu indicaiile de la capitolul 3 seciunea I anexa nr.1 din prezenta hotrre.
Eantioanele colective astfel obinute se consider ca reprezentative pentru loturile sau
subloturile din care snt prelevate. Respectarea coninuturilor maxime stabilite n Hotrrea
Guvernului nr. 1405 din 10 decembrie 2008 se stabilete pe baza coninuturilor determinate n
eantioanele de laborator.
2.2. Conformitatea lotului sau sublotului cu specificaiile

Lotul este acceptat dac rezultatul analitic al unei analize unice nu depete coninutul
maxim stabilit n Hotrrea Guvernului nr. 1405 din 10 decembrie 2008 Cu privire la
aprobarea Normei sanitar-veterinare privind igiena nutreurilor i coninutul substanelor
nedorite n nutreuri, lundu-se n considerare incertitudinea de msurare.
Lotul nu se conformeaz coninutului maxim stabilit n Hotrrea Guvernului nr. 1405
din 10 decembrie 2008 dac rezultatul analitic pentru limita superioar, confirmat de o analiz
paralel, depete, cu un grad de certitudine rezonabil, coninutul maxim, innd seama de
incertitudinea msurrii.
Tabelul nr. 1
Tabelul factorilor de echivalen toxic, TEF (= toxic equivalency factors),
pentru dioxine, furani i compui PCB asemntori dioxinei
Congener (acela grup)
Dibenzo-p-dioxine
(PCDD)
2,3,7,8-TCDD
1,2,3,7,8-PeCDD
1,2,3,4,7,8-HxCDD
1,2,3,6,7,8-HxCDD
1,2,3,7,8,9-HxCDD
1,2,3,4,6,7,8-HpCDD
OCDD
Valoare TEF
Congener (acela grup)

Compui PCB
dioxinei
1
1
0,1
0,1
0,1
0,01
0,0001
Non-orto PCB
PCB 77
PCB 81
PCB 126
PCB 169
Valoare TEF
asemntori
0,0001
0,0001
0,1
0,01
Mono-orto PCB
Dibenzofurani (PCDF)
2,3,7,8-TCDF
0,1
PCB 105
PCB 114
0,0001
0,0005
86
1,2,3,7,8-PeCDF
2,3,4,7,8-PeCDF
1,2,3,4,7,8-HxCDF
1,2,3,6,7,8-HxCDF
1,2,3,7,8,9-HxCDF
2,3,4,6,7,8-HxCDF
1,2,3,4,6,7,8-HpCDF
1,2,3,4,7,8,9-HpCDF
OCDF
0,05
0,5
0,1
0,1
0,1
0,1
0,01
0,01
0,0001
PCB 118
PCB 123
PCB 156
PCB 157
PCB 167
PCB 189
0,0001
0,0001
0,0005
0,0005
0,00001
0,0001
Not:
Abrevieri utilizate: T = tetra; Pe = penta; Hx = hexa; Hp = hepta; O = octa; CDD =
clordibenzo-p-dioxin; CDF = clordibenzofuran; CB =difenili clorurai.
Incertitudinea msurrii poate fi luat n considerare n una din urmtoarele dou
modaliti:
a) calculndu-se incertitudinea extins cu ajutorul unui coeficient de acoperire 2 care d
un nivel de ncredere de aproximativ 95 %. Un lot nu este conform dac valoarea msurat
minus U este mai mare de nivelul maxim.
n cazul unei determinri separate a dioxinelor i a PCB-urilor asemntori dioxinei,
suma incertitudinii extinse estimate a rezultatelor analitice separate ale dioxinelor i PCBurilor asemntori dioxinei se utilizeaz pentru suma dioxinelor i a PCB-urilor asemntori
dioxinei;
b) stabilindu-se limita de decizie (CC) limita la care i de la care este permis s se
concluzioneze cu probabilitatea de eroare c o prob nu este conform.
Limita de decizie se stabilete n conformitate cu cerinele n materie de identificare
sau de identificare i cuantificare.
Un lot este neconform dac valoarea msurat este egal sau mai mare dect CC.
II. Pregtirea eantioanelor i cerinele privind metodele de analiz
utilizate pentru controlul oficial al nivelurilor de dioxine (pcdd/pcdf) i de
pcb asemntori dioxinelor
Prezentele cerine se aplic atunci cnd nutreurile i materiile prime pentru nutreuri
snt analizate pentru a se determina dioxinele [dibenzo-p-dioxine policlorurate (PCDD),
dibenzofuranii policlorurai (PCDF)] i difenilii policlorurai asemntori dioxinelor (PCB).
Monitorizarea prezenei dioxinelor n nutreuri se poate realiza printr-o strategie care
implic o metod de depistare, cu scopul de a selecta acele eantioane cu niveluri de dioxine i
de PCB asemntori dioxinei care au valori cu mai puin de 25 % inferioare sau superioare
concentraiei de interes. Concentraia de dioxine din acele eantioane n care se identific
niveluri semnificative trebuie determinat/confirmat printr-o metod de confirmare.
Metodele de depistare snt metode utilizate pentru a se detecta prezena dioxinelor i a
PCB asemntori dioxinelor la concentraia de interes. Aceste metode au o capacitate mare de
procesare a eantioanelor i snt utilizate pentru a tria (a mpri pe categorii) un numr mare
de eantioane potenial pozitive. Snt concepute special pentru a evita rezultatele fals negative.
Metodele de confirmare snt metode care furnizeaz date complete sau complementare
care permit identificarea i cuantificarea cert a dioxinelor i a PCB-urilor asemntori
dioxinelor la concentraia de interes.
87
2.2. Context
Avnd n vedere faptul c eantioanele din mediu i cele biologice (inclusiv
eantioanele de nutreuri/materii prime pentru nutreuri) conin, n general, amestecuri
complexe de diveri congeneri ai dioxinelor, a fost elaborat conceptul factori de echivalen
toxic (TEF) pentru a facilita evaluarea riscurilor. Aceti TEF au fost stabilii pentru a
exprima concentraiile de amestecuri de PCDD i PCDF 2,3,7,8-substituii i de PCB non-orto
i mono-orto clor-substituii care au o activitate asemntoare dioxinei n echivaleni toxici
(TEQ) de 2, 3, 7, 8-TCDD. Concentraiile substanelor individuale ntr-un eantion anumit se
nmulesc cu valoarea TEF corespunztoare i apoi se adun, pentru a se obine concentraia
total de compui asemntori dioxinelor, exprimat ca TEQ.
Limita specific de cuantificare acceptat pentru un congener individual este
concentraia unui analit dintr-un extract de eantion care produce un rspuns instrumental
pentru doi ioni diferii, care trebuie monitorizai printr-un raport S/Z (semnal/zgomot) de 3:1
pentru semnalul cel mai puin sensibil, i ndeplinete condiiile de baz, cum snt, de
exemplu, timpul de retenie i raportul izotopic.
2.3. Cerine de asigurare a calitii care trebuie respectate n cursul
pregtirii eantioanelor
Se aplic dispoziiile generale privind prepararea eantioanelor pentru analiz, stabilite
n anexa nr. 2 la prezenta hotrre.
De asemenea, trebuie s se ndeplineasc urmtoarele cerine:
a) eantioanele se pstreaz i se transport n recipiente din sticl, aluminiu,
polipropilen sau polietilen. Din recipientul care conine eantionul trebuie ndeprtate
urmele de praf de hrtie. Sticlria se cltete cu solveni controlai n prealabil n vederea
detectrii dioxinelor;
b) se efectueaz o analiz martor prin efectuarea ntregii proceduri analitice, dar
omind numai eantionul;
c) greutatea eantionului utilizat pentru extracie trebuie s fie suficient pentru a
ndeplini cerinele referitoare la sensibilitate.
2.4. Cerinele aplicabile laboratorului/laboratoarelor desemnat/desemnate
1) Laboratorul/laboratoarele trebuie s demonstreze performana unei metode n zona
nivelului de interes, de exemplu de 0,5x, 1x i 2x nivelul de interes, cu un coeficient de
variaie acceptabil la repetarea analizei.
2) Limita de cuantificare pentru o metod de confirmare trebuie s se situeze ntr-un
interval de o cincime din nivelul de interes, pentru a garanta c n intervalul nivelului de
interes snt ndeplinii coeficieni de variaie acceptabili.
3) Ca msuri interne de control al calitii, trebuie efectuate periodic controale martor,
experimente cu eantioane contaminate sau analize ale unor eantioane de control (cu material
de referin certificat).
4) Participarea permanent la studii interlaboratoare pentru determinarea dioxinelor i
a PCB asemntori dioxinelor n structura alimentelor/nutreurilor.
5) Laboratoarele desemnate pentru analiza probelor prelevate n cadrul controalelor
oficiale trebuie s fie acreditate conform standardului naional SM SR EN ISO/IEC 17025
Cerine generale pentru competena laboratoarelor de ncercri i etalonri.
2.5. Cerine aplicabile procedurilor analitice pentru dioxine i PCB
asemntori dioxinelor
Cerine fundamentale pentru acceptarea procedurilor analitice:
1) Sensibilitate nalt i limite de detecie joase. Pentru PCDD i PCDF, cantitile
detectabile trebuie s fie de ordinul picogramelor TEQ (1012 g) din cauza toxicitii extreme
a unora dintre aceti compui. Este cunoscut faptul c PCB se afl la niveluri mai ridicate dect
PCDD i PCDF. Pentru majoritatea congenerilor de PCB, o sensibilitate de ordinul
88
nanogramelor (109 g) este deja suficient. Cu toate acestea, pentru msurarea congenerilor
PCB asemntori dioxinelor mai toxici (n special congeneri non-orto substituii), trebuie s
fie atins aceeai sensibilitate ca i pentru PCDD i PCDF.
2) Selectivitate (specificitate) nalt. Este necesar o distincie a PCDD, PCDF i PCB
asemntori dioxinelor n raport cu o multitudine de ali compui coextrai i cu posibile
interferene, prezeni n concentraii de pn la cteva ordine de mrime mai mari dect cele ale
analiilor studiai. Pentru metodele de cromatografie n faz gazoas/spectrometrie de mas
(CG/SM), este necesar o distincie ntre diferii congeneri, cum ar fi ntre compuii toxici (de
exemplu, cei aptesprezece PCDD i PCDF substituii la 2,3,7,8 i PCB asemntori
dioxinelor) i alii. Biotestele trebuie s permit determinarea selectiv a valorilor TEQ, ca
sum de PCDD, PCDF i PCB asemntori dioxinelor.
3) Acuratee ridicat (veridicitate i precizie). Este necesar ca determinarea s
furnizeze o estimare valid i fiabil a concentraiei reale dintr-un eantion. O acuratee
ridicat (acurateea msurtorii: gradul de apropiere dintre rezultatul unei msurtori i
valoarea real sau atribuit a mrimii de msurat) este necesar pentru a se evita respingerea
rezultatului analizei unui eantion din cauza fiabilitii reduse a estimrii TEQ. Acurateea este
exprimat ca veridicitate (diferena dintre valoarea medie msurat pentru un analit dintr-un
material certificat i valoarea certificat a acesteia, exprimat ca procentaj din aceast valoare)
i precizie (RSDR, deviaia standard relativ, calculat n baza rezultatelor generate n condiii
de reproductibilitate).
Metodele de depistare pot include biotestele i metodele CG/SM; metodele de
confirmare cuprind cromatografia n faz gazoas de nalt rezoluie/spectrometria de mas de
nalt rezoluie (HRGC/HRMS).
Pentru valoarea total TEQ, trebuie s se respecte urmtoarele criterii, indicate n
tabelul nr. 2:
Tabelul nr. 2
Valoarea total TEQ
Metode de depistare
Rat de fals negative
Veridicitate
Precizie RSD R
Metode de confirmare
<1%
< 30 %
20 % pn la + 20 %
< 15 %
2.6. Cerine specifice privind metodele CG/SM care trebuie respectate n

scop de depistare sau de confirmare
1) Adugarea de etaloane interne de PCDD/F 2,3,7,8 clor-substituite i de PCB
asemntori dioxinei marcate cu 13C trebuie s se efectueze chiar de la nceputul efecturii
metodei de analiz, de exemplu, naintea extraciei, pentru validarea procedurii analitice.
Trebuie adugat cel puin un congener pentru fiecare din grupele omoloage tetra-octoclorurate de PCDD/F i cel puin un congener pentru fiecare dintre grupele omoloage de PCB
asemntori dioxinei (alternativ, cel puin un congener pentru fiecare funcie de nregistrare a
ionului selecionat prin spectrometrie de mas, utilizat pentru monitorizarea PCDD/F i a PCB
asemntori dioxinei).
Este necesar s existe o preferin clar, mai ales n cazul metodelor de confirmare,
pentru utilizarea tuturor celor 17 etaloane interne de PCDD/F 2,3,7,8-clor-substituite marcate
cu 13C i a tuturor celor 12 etaloane interne de PCB asemntori dioxinei marcate cu 13C.
2) Se determin, de asemenea, factorii de rspuns relativ pentru acei congeneri pentru
care nu se adaug nici-un analog marcat cu 13C, utiliznd soluii de calibrare corespunztoare.
89
3) Pentru nutreurile de origine vegetal i nutreurile de origine animal care conin

mai puin de 10 % grsime, este obligatorie adugarea etaloanelor interne nainte de extracie.
Pentru nutreurile de origine animal ce conin mai mult de 10 % grsime, etaloanele interne
se pot aduga fie naintea extraciei, fie dup extracia grsimii. Se efectueaz o validare
adecvat a eficienei metodei de extracie, n funcie de etapa n care se introduce etaloanele
interne i de modul n care se consemneaz rezultatele (n funcie de produs sau de grsime).
4) naintea analizei CG/SM, trebuie s se adauge unul sau dou etaloane de recuperare
(surogat).
5) Este necesar controlul recuperrii. Pentru metodele de confirmare, recuperarea
etaloanelor interne individuale trebuie s se situeze n intervalul 60-120 %. Se accept i
recuperri inferioare sau superioare pentru congeneri individuali, n special pentru
dibenzodioxine i dibenzofurani hepta- i octo-clorurai, att timp ct contribuia acestora la
valoarea TEQ nu depete 10 % din valoarea TEQ total (bazat pe suma dintre PCDD/F i
PCB asemntori dioxinei). Pentru metodele de depistare, recuperarea trebuie s se situeze n
intervalul 30-140 %.
6) Separarea dioxinelor de compuii clorurai interfereni, cum snt PCB neasemntori
dioxinei i difenileterii clorurai, se realizeaz prin tehnici cromatografice adecvate (de
preferin pe coloan de florisil, alumin i/sau crbune).
7) Separarea izomerilor prin cromatografie n faz gazoas este suficient (< 25 % de
la vrf la vrf ntre 1,2,3,4,7,8-HxCDF i 1,2,3,6,7,8-HxCDF).
8) Determinarea dioxinei i furanilor tetra-octoclorurai se realizeaz prin metoda de
diluie a izotopilor HRGC/HRMS.
9) Diferena dintre limita superioar i limita inferioar trebuie s nu depeasc 20 %
pentru nutreurile caracterizate de o contaminare cu dioxine situat n interval sau peste nivelul
maxim de contaminare. Pentru nutreurile cu niveluri de contaminare mult sub nivelul maxim,
diferena se poate situa n intervalul 25-40 %.
2.7. Metode analitice de depistare
2.7.1. Introducere
Se pot aplica diferite abordri analitice utiliznd o metod de depistare: o abordare pur
de depistare i o abordare cantitativ.
Abordare de depistare
Rspunsul eantioanelor este comparat cu cea a unui eantion de referin la nivelul
de interes. Eantioanele cu un rspuns inferior celui de referin snt declarate negative, iar
cele cu rspuns superior snt presupuse pozitive.
Cerine:
1) n fiecare serie de testri trebuie s se includ un eantion martor i unul de
referin, care se supun extraciei i testrii n acelai timp i n condiii identice. Eantionul de
referin trebuie s prezinte un rspuns cu mult mai mare n comparaie cu un martor.
2) Se includ eantioane de referin suplimentare de 0,5x i 2x nivelul de interes,
pentru a se demonstra eficacitatea testului n intervalul de interes, pentru controlul nivelului de
interes.
3) Atunci cnd se testeaz alte matrice, trebuie s se demonstreze c eantionul
(eantioanele) de referin snt cele corespunztoare, de preferin prin includerea
eantioanelor la care s-a dovedit prin HRGC/HRMS c au un nivel TEQ n jurul celui al
eantionului de referin sau, altfel, a unui martor contaminat la nivelul respectiv.
4) Deoarece etaloanele interne nu se pot utiliza n bioteste, testele cu privire la
repetabilitate snt foarte importante, pentru a se obine informaii privind deviaia standard n
cadrul unei serii de teste. Coeficientul de variaie trebuie s fie inferior valorii de 30 %.
5) Pentru bioteste se definesc compuii-int, interferenele poteniale i nivelurile
maxime tolerabile ale martorului.
90
Abordare cantitativ
Aceasta necesit o serie de diluii standard, procese de curare i de msurare duble
sau triple, precum i controale de recuperare i ale martorului. Rezultatul poate fi exprimat ca
TEQ, presupunndu-se astfel c acei compui care se afl la originea semnalului corespund
principiului TEQ. Acest lucru se poate realiza prin utilizarea TCDD (sau a unui amestec etalon
de dioxin/furan/PCB asemntor dioxinei) pentru a se obine o curb de calibrare pentru
calculul nivelului TEQ din extract i, astfel, din eantion. Cantitatea obinut se corecteaz
apoi cu valoarea TEQ calculat pentru un eantion martor (pentru a se ine cont de impuritile
din solveni i din substanele chimice utilizate) i pentru recuperare (calculat n baza valorii
TEQ dintr-un eantion de control al calitii apropiat de limita de interes). Este esenial s se
in cont de faptul c o parte din aparenta pierdere de recuperare poate fi determinat de
efectele matricei i/sau de diferenele dintre valorile TEF n bioteste i valorile TEF oficiale
stabilite de OMS.
2.7.2. Cerine privind metodele analitice pentru depistare
1) Depistarea se poate face prin metode analitice CG/SM sau prin bioteste. Pentru
metodele CG/SM, trebuie utilizate cerinele prevzute la punctul 2.6. Pentru biotestele celulare
se stabilesc cerine specifice descrise la subpunctul 2.7.3., iar pentru biotestele realizate cu
ajutorul kiturilor de testat se stabilesc cerine specifice menionate n subpunctul 2.7.4.
2) Snt necesare informaii privind numrul de rezultate fals pozitive i fals negative
obinute pentru un set mare de eantioane peste sau sub nivelul maxim sau nivelul de
intervenie, prin comparaie cu coninutul TEQ determinat printr-o metod analitic de
confirmare. Ratele efective de rezultate fals negative trebuie s se situeze sub 1 %. Rata de
rezultate fals pozitive este suficient de sczut pentru a face ca utilizarea instrumentului de
depistare s fie avantajoas.
3) Rezultatele pozitive trebuie confirmate ntotdeauna printr-o metod analitic de
confirmare (HRGC/HRMS).
n plus, eantioanele dintr-o gam larg de TEQ se confirm prin HRGC/HRMS
(aproximativ 2-10 % din eantioanele negative). Se furnizeaz informaii privind
corespondena dintre rezultatele biotestelor i cele ale HRGC/HRMS.
2.7.3. Cerine specifice pentru bioteste celulare
1) Cnd se execut un biotest, fiecare testare necesit o serie de concentraii de referin
ale TCDD sau ale unui amestec de dioxin/furan (curb de rspuns pentru o doz complet cu
un R2 > 0,95). Cu toate acestea, n scopuri de depistare se poate utiliza o curb de nivel sczut
extins, pentru analiza eantioanelor cu coninut sczut.
2) Pentru rezultatul biotestului ntr-un interval de timp constant se utilizeaz pe o foaie
de control al calitii o concentraie TCDD de referin (aproximativ de 3x limita de
cuantificare).
3) Graficele de control al calitii pentru fiecare tip de material de referin se
nregistreaz i se verific pentru a se garanta c rezultatul este conform cu liniile directoare
stabilite.
4) Pentru calculele cantitative, realizarea diluiei eantionului trebuie s se situeze n
cadrul poriunii liniare a curbei de rspuns. Eantioanele situate deasupra poriunii liniare a
curbei de rspuns trebuie diluate i testate din nou. Se recomand testarea a cel puin trei
diluii o dat.
5) Procentul deviaiei standard nu depete 15 % ntr-o determinare tripl pentru
fiecare diluie a eantionului i 30 % pentru trei experimente independente.
6) Limita de detecie poate fi stabilit la de 3 ori valoarea deviaiei standard a
solventului martor sau a rspunsului de fond. Alt abordare const n aplicarea unui rspuns
care se situeaz deasupra rspunsului de fond (factor de inducie de 5x martorul solventului),
calculat din curba de calibrare a zilei. Limita de cuantificare poate fi stabilit ca o valoare de la
91
5x pn la 6x deviaia standard a martorului solventului sau a rspunsului de fond ori s se

aplice un rspuns ce este clar superior rspunsului de fond (factor de inducie de 10x martorul
solventului), calculat din curba de calibrare a zilei.
2.7.4. Cerine specifice pentru biotestele realizate pe baz de kituri
1) S se garanteze c biotestele pe baz de kituri au o sensibilitate i o fiabilitate
suficient pentru a fi aplicate nutreurile.
2) S fie respectate instruciunile productorului privind pregtirea i analiza
eantioanelor.
3) Kiturile de testare nu se utilizeaz dup data expirrii.
4) Nu se utilizeaz materiale sau componente destinate utilizrii cu alte kituri.
5) Kiturile de testare se pstreaz la o temperatur de depozitare situat n cadrul unui
interval specificat i se utilizeaz la temperatura de lucru specificat.
6) Limita de detecie pentru imunodozri este determinat ca suma mediei i a valorii
de 3x deviaia standard, bazat pe o serie de 10 analize repetate ale martorului i care este
mprit la valoarea pantei ecuaiei de regresie liniar.
7) Pentru testele realizate n laborator se utilizeaz etaloane de referin, pentru a
garanta c rspunsul la etalon se situeaz ntr-un interval acceptabil.
2.8. Raportarea rezultatelor
n msura n care procedura analitic utilizat permite acest lucru, rezultatele analitice
conin niveluri individuale ale congenerilor PCDD/F i PCB; rezultatele analitice se raporteaz
ca limit inferioar, limit superioar i limit medie, pentru a se include un maximum de
informaii n raportarea rezultatelor, permind astfel interpretarea rezultatelor n conformitate
cu cerinele specifice.
Raportarea include, de asemenea, coninutul de lipide al eantionului, precum i
metoda utilizat pentru extracia lipidelor.
Trebuie s fie disponibile informaii despre recuperrile etaloanelor interne
individuale, dac recuperrile se situeaz n afara intervalului menionat la punctul 2.6, dac
depesc nivelul maxim.
Dat fiind c, atunci cnd se stabilete conformitatea eantionului, este necesar s se in
cont de incertitudinea msurrii, acest parametru trebuie s fie de asemenea disponibil. De
aceea, rezultatul analizei se raporteaz ca x +/ U, unde x este rezultatul analitic i U este
incertitudinea de msurare extins, folosind un factor de acoperire 2, care d un nivel de
ncredere de aproximativ 95 %. n cazul unei determinri separate a dioxinelor i a PCB
asemntori dioxinei, suma incertitudinii extinse estimate a rezultatelor analitice separate ale
dioxinelor i PCB asemntori dioxinei se utilizeaz pentru suma dioxinelor i a PCB
asemntori dioxinei.
Dac incertitudinea de msurare se ia n considerare aplicndu-se CC, acest parametru
se comunic.
Anexa nr. 6
Metodele de analiz privind determinarea constituenilor
de origine animal pentru controlul oficial al nutreurilor
1. Condiii pentru detectarea, identificarea sau estimarea prin examinare
microscopic a constituenilor de origine animal n nutreuri
92
Prezentele condiii se utilizeaz n cazul n care detectarea constituenilor de origine

animal (definii ca produse rezultate din prelucrarea carcaselor sau a unor pri din corpul
mamiferelor, psrilor de cresctorie sau petilor) din nutreuri se realizeaz prin examinare
microscopic n cadrul unui program de inspecie coordonat n domeniul nutriiei animalelor.
1.2. Sensibilitate
n funcie de natura constituenilor de origine animal, este posibil detectarea unor
cantiti foarte mici (< 0,1 %) n nutreuri.
Pentru identificare se utilizeaz un eantion reprezentativ, prelevat n conformitate cu
indicaiile din anexa nr. 1 i care a fost supus unei preparri adecvate. Protocolul descris n
punctul 1.9. este adecvat pentru tratarea nutreurilor cu un coninut mic de umiditate.
Nutreurile cu un coninut de umiditate mai mare de 14 % se usuc (condenseaz) naintea
tratamentului. Nutreurile sau materiile prime pentru nutreuri speciale (de exemplu, grsimi,
uleiuri) necesit un tratament specific (a se vedea prevederile punctului 1.9.). Constituenii de
origine animal se identific pe baza caracteristicilor tipice, identificabile prin examinare
microscopic (adic fibre musculare i alte particule de carne, cartilagii, oase, coarne, pr, pr
de porc, snge, pene, coji de ou, oase i solzi de pete). Identificarea trebuie s se realizeze
att pentru fracia care a trecut prin sit, conform prevederilor descrise n subpunctul 1.6.1.,
precum i pentru sedimentul concentrat (a se vedea meniunea de la subpunctul 1.6.2.) de
eantion.
1.4.1. Agent de includere
1.4.1.1. Clorhidrat (soluie apoas, 60 % g/v).
1.4.1.2. Leie (NaOH 2,5 % g/v sau KOH 2,5 % g/v) pentru fraciile cernute.
1.4.1.3. Ulei de parafin sau glicerol (vscozitate: 68-81) pentru examinarea
microscopic a sedimentului.
1.4.2. Ageni de cltire
1.4.2.1. Alcool, 96 %.
1.4.2.2. Aceton.
1.4.3. Agent de concentrare
1.4.3.1. Tetracloretilen (densitate 1,62).
1.4.4. Reactivi de colorare
1.4.4.1. Soluie de iod/iodur de potasiu (se dizolv 2 g iodur de potasiu n 100 ml ap
i se adaug 1 g de iod agitnd frecvent).
1.4.4.2. Rou de alizarin (se dilueaz 2,5 ml acid clorhidric 1M n 100 ml ap i se
adaug 200 mg rou de alizarin n soluia obinut).
1.4.4.3. Reactiv cistin (2 g acetat de plumb, 10 g NaOH/100 ml H 2 O).
1.4.4.4. Soluie de iod/iodur de potasiu (dizolvat n etanol 70 %).
1.4.5. Reactiv decolorant
1.4.5.1 Soluie comercial de hipoclorit de sodiu (9,6 % clor activ).
1.5. Echipament i accesorii
1.5.1. Balan analitic (precizie de 0,01 g, cu excepia sedimentului concentrat: 0,001
g).
1.5.2. Dispozitiv de mcinat (moar de mcinat sau mojar, n special pentru nutreuri
ce conin > 15 % grsime, detectat la analiz).
1.5.3. Sit cu ochiuri ptrate cu lrgimea de maximum 0,5 mm.
1.5.4. Plnie de separare sau pahar de laborator de decantare cu fund conic.
1.5.5. Microscop stereoscopic (mrire de minimum 40 de ori).
1.5.6. Microscop compus (mrire de minimum 400 de ori), lumin transmis sau
lumin polarizat.
93
1.5.7. Sticlrie de laborator standard

Toat aparatura se cur cu grij. Plniile de separare i sticlria se spal n maina de
splat. Sitele se cur cu o perie cu peri aspri.
Dac ambele fracii se analizeaz ca eantioane individuale, nutreurile sub form de
pelete se cern n prealabil.
Cel puin 50 g de eantion se trateaz [dac este necesar, se macin cu grij cu un
dispozitiv de mcinare adecvat pentru a obine o structur corespunztoare]. Din materialul
mcinat se iau dou poriuni reprezentative, una pentru fracia cernut (cel puin 5 g) (a se
vedea meniunea de la subpunctul 1.6.1.) i una pentru sedimentul concentrat (cel puin 5 g) (a
se vedea subpunctul 1.6.2.). Pentru identificare, se poate aplica suplimentar colorarea cu
reactivi de colorare, conform prevederilor subpunctului 1.6.3.
Pentru a indica natura proteinelor animale i originea particulelor, se poate utiliza un
sistem de decizie asistat de tipul ARIES i pot fi documentate eantioane de referin.
1.6.1. Identificarea constituenilor de origine animal din fraciile cernute
Un eantion de cel puin 5 g se cerne prin sit n dou fracii.
Fracia (fraciile) cernut (cernute) cu particule mari (sau o parte reprezentativ a
fraciei) se aplic n strat subire pe un suport adecvat i se examineaz sistematic la
microscopul stereoscopic cu mriri diferite pentru detectarea constituenilor de origine
animal.
Lamelele preparate cu fracia (fraciile) cu particule fine se examineaz sistematic la
microscopul compus cu mriri diferite pentru detectarea constituenilor de origine animal.
1.6.2. Identificarea constituenilor de origine animal din sedimentul concentrat
Cel puin 5 g (cu o precizie de pn la 0,01 g) de eantion se transfer ntr-o plnie de
separare sau ntr-un vas de laborator de decantare cu fund conic i se trateaz cu cel puin 50
ml tetracloretilen. Amestecul se agit sau se amestec de mai multe ori.
1) Dac se utilizeaz o plnie de separare nchis, sedimentul se las s stea un timp
suficient (cel puin trei minute) nainte de a fi separat. Se repet agitarea i sedimentul se las
iar s stea timp de cel puin trei minute.
Se separ din nou sedimentul.
2) Dac se utilizeaz un pahar de laborator deschis, sedimentul se las s stea cel puin
cinci minute nainte de a fi separat.
Sedimentul total se usuc i apoi se cntrete (cu o precizie de 0,001 g). Cntrirea este
necesar doar dac este necesar o estimare. Dac sedimentul conine multe particule mari, se
poate cerne printr-o sit n dou fracii.
Sedimentul uscat se examineaz la microscopul stereoscopic i la microscopul compus
pentru detectarea constituenilor osoi.
1.6.3. Utilizarea agenilor de includere i a reactivilor de colorare
Pentru a facilita identificarea la microscop a constituenilor de origine animal se pot
utiliza ageni de includere i reactivi de colorare speciali.
Clorhidrat: Prin nclzire cu atenie, structurile celulare se vd mai clar, ca urmare a
faptului c granulele de amidon se gelatinizeaz, iar coninuturile celulare nedorite snt
eliminate.
Leie: Att hidroxidul de sodiu, ct i hidroxidul de potasiu limpezesc materialul
nutreului, facilitnd detecia fibrelor musculare, a prului sau a altor structuri cheratinoase.
Ulei de parafin i glicerol: Constituenii osoi pot fi identificai bine n acest agent de
includere pentru c majoritatea lacunelor rmn umplute cu aer i apar sub form de guri
negre de aproximativ 5-15 m.
94
Soluie de iod/iodur de potasiu: Se utilizeaz pentru detecia amidonului (culoare

albastr-violet) i a proteinelor (culoare galben-portocalie). Dac este necesar, soluiile pot fi
diluate.
Soluie de rou de alizarin: Coloraie roie/roz a oaselor, precum i a oaselor i
solzilor de pete. nainte de uscarea sedimentului (a se vedea subpunctul 1.6.2.), ntregul
sediment se transfer ntr-o eprubet de sticl i se cltete de dou ori cu aproximativ 5 ml de
alcool (de fiecare dat se utilizeaz un agitator, solventul se las s stea timp de aproximativ
un minut i se elimin). nainte de a utiliza acest reactiv de colorare, sedimentul se decoloreaz
adugndu-se cel puin 1 ml de soluie de hipoclorit de sodiu. Se permite ca reacia s continue
timp de 10 minute. Eprubeta se umple cu ap, se ateapt timp de 2-3 minute ca sedimentul s
se decanteze, iar apa i particulele n suspensie se elimin. Sedimentul se cltete de nc dou
ori cu aproximativ 10 ml de ap (de fiecare dat se utilizeaz un agitator, se las s stea i apoi
se elimin apa). Se adaug dou pn la zece sau mai multe picturi (n funcie de cantitatea de
reziduu) de soluie de rou de alizarin. Amestecul se agit i se permite desfurarea reaciei
timp de cteva secunde. Sedimentul colorat se cltete de dou ori cu aproximativ 5 ml de
alcool, apoi o dat cu aceton (de fiecare dat se utilizeaz un agitator, solventul se las s stea
timp de aproximativ un minut i se elimin). Astfel sedimentul este pregtit pentru a fi uscat.
Reactiv cistin: Prin nclzire cu atenie, constituenii care conin cistin (pr, pene
etc.) devin de culoare negru-maro.
1.6.4. Examinarea nutreurilor susceptibile de a conine fin de pete
Se examineaz la microscopul compus (a se vedea prevederile subpunctului 1.6.1. i
1.6.2.) cel puin o lamel din fracia fin cernut i din fracia fin de sediment.
Dac eticheta indic prezena finii de pete n ingrediente sau dac se suspecteaz sau
se detecteaz prezena finii de pete la examinarea iniial, se examineaz cel puin nc dou
lamele cu fracie fin cernut din eantionul original, precum i fracia de sediment total.
1.7. Calcul i evaluare
Autoritatea sanitar-veterinar competent supravegheaz ca procedurile descrise la
prezentul punct s fie utilizate pentru toate analizele oficiale n vederea estimrii cantitii (i
nu doar a prezenei) constituenilor de origine animal.
Calculul se poate realiza doar n cazul n care constituenii de origine animal conin
fragmente osoase.
Fragmentele osoase ale speciilor terestre cu snge cald (de exemplu, mamifere i
psri) se pot distinge de diferitele tipuri de os de pete pe o lamel microscopic, cu ajutorul
lacunei tipice. Proporia de constitueni de origine animal din eantion se estimeaz lund n
considerare urmtoarele:
a) proporia estimat (% greutate) de fragmente osoase n sedimentul concentrat; i
b) proporia (% greutate) de os din constituenii de origine animal.
Pentru estimare trebuie s se examineze (dac este posibil) cel puin trei lamele i cel
puin cinci cmpuri pentru fiecare lamel. n nutreurile combinate, sedimentul concentrat
conine, de regul, nu numai fragmente de oase de animale terestre i de oase de pete, ci i
alte particule cu greutate specific mare, cum ar fi minerale, nisip, fragmente de plante
lignificate i altele.
1.7.1. Valoarea estimat a procentajului de fragmente osoase
% de fragmente de oase de animale terestre = (S c)/g
% de fragmente de oase i solzi de pete = (S d)/g,
unde:
[S = greutatea sedimentului (mg), c = factor de corecie (%) pentru poriunea estimat
de oase de animale terestre din sediment, d = factor de corecie (%) pentru poriunea estimat
95
de fragmente de oase i solzi de pete din sediment, g = greutatea eantionului pentru

sedimentare (mg)].
1.7.2. Valoarea estimat a constituenilor de origine animal
Proporia de os din produsele de origine animal poate s varieze foarte mult.
(Procentajul de os este de ordinul a 50-60 % n cazul finii de oase i de 20-30 % n cazul
finii de carne; n cazul finurilor de pete, coninutul de os i de solzi variaz n funcie de
categoria i de originea finii de pete, fiind de regul de ordinul a 10-20 %).
Dac tipul finii de origine animal prezente n eantion este cunoscut, este posibil s
se estimeze coninutul:
estimat de constitueni al produselor din animale terestre (%) = (S c)/(g f) 100;
estimat de constitueni al produselor din pete (%) = (S d)/(g f) 100,
unde:
[S = greutatea sedimentului (mg), c = factor de corecie (%) pentru poriunea estimat
de constitueni de oase de animale terestre din sediment, d = factor de corecie (%) pentru
poriunea estimat de fragmente de oase i solzi de pete din sediment, f = factor de corecie
pentru proporia de oase din constituenii de origine animal din eantionul examinat, g =
greutatea eantionului pentru sedimentare (mg)].
1.8. Exprimarea rezultatelor examinrii
Raportul conine cel puin informaii privind prezena constituenilor derivai din
animale terestre i din fin de pete. Diferitele cazuri se raporteaz n modul descris n
subpunctele 1.8.1. i 1.8.2.
1.8.1. Referitor la prezena constituenilor derivai din animale terestre:
a) n msura n care a fost perceptibil la microscop, n eantionul analizat nu a fost
detectat niciun constituent derivat din animale terestre; sau
b) n msura n care a fost perceptibil la microscop, n eantionul analizat au fost
detectai constitueni derivai din animale terestre.
1.8.2. Referitor la prezena finii de pete:
a) n msura n care a fost perceptibil la microscop, niciun constituent derivat din pete
nu a fost detectat n eantionul analizat; sau
b) n msura n care a fost perceptibil la microscop, n eantionul analizat au fost
detectai constitueni derivai din pete.
Dac snt detectai constitueni derivai din pete sau din animale terestre, raportul
privind rezultatele examinrii, dac este necesar, poate s indice o estimare a cantitii de
componente detectate (x %, < 0,1 %, 0,1-0,5 %, 0,5-5 % sau > 5 %), alte specificaii privind
tipul animalului terestru, dac este posibil, precum i constituenii de origine animal
identificai (fibre musculare, cartilaj, oase, coarne, pr, peri de porc, pene, snge, coji de ou,
oase de pete, solzi).
Pentru cazul n care se estimeaz cantitatea de constitueni de origine animal, se
menioneaz factorul de corecie f utilizat.
Pentru cazul n care se identific componente osoase derivate din animalele terestre,
raportul conine meniunea suplimentar:
Nu se poate exclude posibilitatea provenienei din mamifere a constituenilor
menionai anterior.
Aceast meniune suplimentar nu este necesar n cazurile n care fragmentele osoase
provenite de la animale terestre snt specificate ca fragmente osoase provenite de la psri de
cresctorie sau mamifere.
96
1.9. Protocol facultativ pentru analiza grsimilor sau a uleiurilor

Pentru analiza grsimilor sau a uleiurilor se poate utiliza urmtorul protocol:
1) Dac grsimea este solid, aceasta se nclzete, de exemplu ntr-un cuptor cu
microunde, pn cnd devine lichid.
2) Cu ajutorul unei pipete, se transfer 40 ml de grsime din partea inferioar a
eantionului ntr-un tub de centrifug.
3) Se centrifugheaz timp de 10 minute la 4 000 rpm.
4) Dac grsimea se solidific dup centrifugare, aceasta se nclzete nc o dat ntrun cuptor pn cnd devine lichid. Se repet centrifugarea timp de cinci minute la 4 000 rpm.
5) Cu ajutorul unei linguri mici sau al unei spatule, se transfer jumtate din
impuritile decantate ntr-o plac Petri sau pe o lamel de microscop pentru identificarea
microscopic a unui posibil coninut de constitueni de origine animal (fibre de carne, pene,
fragmente osoase .a.). Ca agent de includere pentru microscopie, se recomand uleiul de
parafin sau glicerolul.
6) Impuritile rmase se utilizeaz pentru sedimentare, conform descrierii de la
subpunctul 1.6.2.
Anexa nr. 7
nr.686
Metoda de determinare a valorii energetice a
nutreurilor combinate pentru psrile de cresctorie
1. Metoda de calcul i exprimarea valorii energetice pentru psrile de
cresctorie
1.1. Valoarea energetic a hranei combinate pentru psrile de cresctorie se calculeaz
aplicndu-se formula specificat n punctul 1.2.
1.2. Aceast valoare se exprim n megajouli (MJ) de energie metabolizabil (EM),
corectat pentru azot, per kilogram de nutreuri combinate:
MJ/kg de EM = 0,1551 % protein brut + 0,3431 % grsime brut + 0,1669 %
amidon +
0,1301 % zaharuri totale (exprimate n zaharoz).
1.3. Prelevarea eantionului din nutreurile combinate i determinarea coninutului de
compui analitici indicai n metoda de calcul trebuie s se efectueze n conformitate cu
urmtoarele metode:
a) pentru determinarea coninutului de grsime brut: procedura B a metodei de
determinare a uleiurilor i a grsimilor brute, din anexa nr. 3, capitolul VIII;
b) pentru determinarea coninutului de amidon: metoda polarimetric, din anexa nr. 3,
capitolul XII.
2. Tolerane aplicabile valorilor declarate i exprimarea rezultatului
2.1. n cazul n care la inspecia oficial se constat o diferen (valoare energetic mai
mare sau mai mic a hranei pentru psri) ntre rezultatul inspeciei i valoarea energetic
menionat, se admite o toleran minim de 0,4 MJ/kg EM.
97
2.2. Rezultatul obinut prin aplicarea formulei indicate n punctul 1.2. se exprim cu o
zecimal.
98

Metode de Determinare Nutrienti

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Metode de Determinare Nutrienti

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Republica Moldova

aceasta se rotunjete la numrul ntreg imediat superior), pn la maximum 40 de eantioane

Procedurile descrise se refer la prepararea pentru examinarea eantioanelor finale,

Eantioanele trebuie pstrate la o temperatur care s nu le altereze compoziia.

Recipientul se introduce, fr capac, n cuptorul nclzit n prealabil la 130C. Pentru a

Coninutul de umiditate (X) al eantionului, n procente, se calculeaz prin utilizarea

plit, conform descrierii de la subpunctul 2.3.3., se amestec continuu cu termometrul, astfel

= 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

subpunctul 3.3.3. Se procedeaz n conformitate cu cele descrise la subpunctul 3.5.2.1. sau

Operarea specific a aparatului de distilare sau a celui de distilare/titrare se face

c = concentraia (mol/l) a soluiei volumetrice standard de acid sulfuric, conform

Coninutul n uree al filtratului este determinat dup adugarea de 4

Dac coninutul n amoniac al eantionului depete 0,6 %, se dilueaz filtratul iniial.

6.2. Principiul de aplicare

6.3.20. Mixtur de hidroliz, c = 6 mol HCl/l coninnd 1 g de fenol/l:

descrierilor de la subpunctul 6.5.2. Soluia de calibrare se prepar n conformitate cu

Dac extractele nu se examineaz n aceeai zi, trebuie pstrate la o temperatur sub

n funcie de procedura de ajustare a pH-ului, se transfer cantitativ coninutul sticlei

Se iau 492 ml HCl, menionat n subpunctul 7.3.7. i se completeaz pn la 1 litru cu

7.5.1. Prepararea eantioanelor

7.5.4. Determinarea prin HPLC

Timpul total de desfurare

7.6. Calcularea rezultatelor

m = greutatea eantionului n g (corectat pentru a obine greutatea original dac

7.8.2. Cromatografia variaz n funcie de tipul de HPLC i de materialul utilizat la

Cu timpul, hidroxidul de bariu devine mai dificil de dizolvat. Aceasta genereaz o

Se elimin solventul din reziduul de extracie rmas n cartu, se macin reziduul pn

10.2. Principiul de aplicare

XI. Determinarea lactozei

11.5. Procedura de preparare

XII. Determinarea amidonului

Se pipeteaz 50 ml de filtrat (corespunde la 2,5 g de eantion) ntr-un flacon

12.6.2. Msurare cu zaharimetrul

13.5.2. Se introduce creuzetul n cuptorul cu mufl calibrat, reglat la 550C. Se

XVI. Determinarea fosforului total

16.5. Procedura de preparare

Se prepar soluia astfel cum se descrie n subpunctul 17.5.1.2., dar nu se filtreaz. Se

1.2. Principiul de aplicare

Detector (a se vedea meniunea de la Detector de UV (325 nm) sau detector de

Calculul coninutului de vitamin A:

tocoferol acetat. (pentru control UV a se vedea descrierea de la subpunctul 2.5.6.1.3.; pentru

Apoi se cltete condensatorul cu circa 20 ml de ap i se rcete coninutul vasului la

2.5.6. Calibrarea (acetat de DL--tocoferol sau DL--tocoferol)

E 1 1 % 1 cm = 43,6 la 284 nm n etanol

2.7.1. Pentru eantioanele cu o concentraie redus de vitamina E, poate fi util

anumite tipuri de nutreuri, srace n oligoelemente, poate fi necesar s se nceap cu un

Pentru determinarea fierului, manganului i zincului, se pipeteaz o parte alicot din

Dup tratarea cu ap fierbinte, halofuginona se extrage ca baz liber n acetat de etil i

Temperatura bii de ap trebuie s nu depeasc 40C. n condiiile unei presiuni de

Stabilitatea sistemului cromatografic se verific prin injectarea de mai multe ori a

nlimile (ariile) medii ale vrfurilor soluiilor de calibrare ca ordonate i concentraiile

4.7.3. Procedura de recuperare

Robenidin pur: clorhidrat de 1,3-bis[(4-clorobenziliden)amino]guanidin.

Se verific stabilitatea sistemului cromatografic, prin injectarea de mai multe ori a

Se injecteaz de mai multe ori extractul de eantion, obinut conform prevederilor

VI. Determinarea coninutului de diclazuril

utilizeaz un balon de culoare brun i se depoziteaz n frigider. La o temperatur 4C,

Alternativ, dac nu este disponibil un nutre martor similar, ca tip, cu eantionul (a se

Dup 10 min, eluia prin gradient timp de

Se verific stabilitatea sistemului cromatografic injectndu-se de mai multe ori soluia

Pentru un eantion (martor) mbogit, recuperarea este de cel puin 80 %.

soluii corespund concentraiilor de 1, 2, 4, 5 i 10 g de lasalocid sodic pe ml. Ele se prepar

membran de 0,45 m. Se dilueaz un volum adecvat de filtrat limpede cu metanol acidifiat,