OPERAŢII DE STERILIZARE LA NIVEL INDUSTRIAL

• Procesele de fermentaţie industriale sunt procese monoseptice (cultivarea în biotreactoare a

unui singur microorganism).
• In bioreactorul conţinând mediul de cultivare nu trebuie sa existe nici un alt microorganism,
înaintea inoculării cu microorganismul util;
• Toate substanţele cu care bioreactorul se alimentează pe parcursul fermentaţiei trebuie să fie
sterile.
• Asigurarea condiţiilor de cultivare monoseptică se realizează practic prin sterilizarea
mediilor, a instalaţiei biotehnologice şi a aerului tehnologic.
• Operaţia de sterilizare este o operaţie preliminară absolut obligatorie pentru orice proces de
fermentaţie industrială, neefectuarea ei având ca urmare contaminarea mediului de
fermentaţie, cu următoarele implicaţii:
 elementele nutritive disponibile sunt convertite în produşi nedoriţi;
 condiţiile de mediu se modifică, astfel că microorganismul devine incapabil de a produce
sau mediul devine incapabil de a menţine produsul de biosinteză.
 se pot forma enzime ce degradează produsul principal de biosinteză.
 Prin sterilizare se înţelege distrugerea tuturor formelor de viaţă dintr-un mediu, în sensul
reducerii totale a viabilităţii acestora.
• Procesele de biosinteză industrială impun lipsa totală a sporilor de microorganisme străine
(provenite din apă, aer, materii prime), care s-ar putea dezvolta în faza de fermentaţie,
contaminând cultura unică a microorganismului util.
 Practic, prin sterilizare se urmăreşte distrugerea sau îndepărtarea tuturor formelor vegetative
şi de rezistenţă a microorganismelor patogene şi nepatogene din:
 preparate (mediul de cultivare, soluţii de elemente nutritive adăugate pe parcursul
fermentaţiei, soluţii de acizi şi baze folosite pentru corectarea pH-ului pe parcursul
fermentaţiei, antispumanţi);
 utilităţi tehnologice (aer);
 obiecte (bioreactoare, conducte, filtre, etc.);

Clasificarea metodelor de sterilizare

• Metodele de sterilizare folosite în biotehnologiile din industria de medicamente se pot
împărţi în 4 grupe, fiecare dintre ele având o anumită contribuţie la scară industrială:
1) Sterilizarea termică
 cu abur sub presiune, adică prin încălzire umedă
 prin încălzire uscată
1) Sterilizarea chimică;
2) Sterilizarea prin filtrare;
3) Sterilizarea prin iradiere;
Sterilizarea fermentatoarelor a conductelor şi a valvelor
• În funcţie de cerinţele tehnologice impuse de bioprocese, fermentatoarele se pot steriliza:
 separat sau
 împreună cu mediul de cultivare.
• În general, sterilizarea fermentatoarelor se realizează prin încălzire cu vapori de apă saturaţi
(încălzire umedă), la temperaturi cuprinse între 1210C şi 1400C.
• Pentru realizarea temperaturilor cuprinse în acest interval, aburul se introduce sub presiune,
prin fiecare ştuţ al bioreactorului.
• Temperatura de sterilizare este corelată cu presiunea aburului, conform tabelului urmator
Sterilizarea discontinuă a mediilor de cultură cu abur sub presiune
• Implică:
 încălzirea mediului la 1200C prin forţarea aburului sub presiune prin fiecare ştuţ al
bioreactorului (90 de minute pt. un volum de volum de 20 m3 mediu)
  menţinerea acestei temperaturi o anumită prioadă de timp (30 de minute)
 în final răcirea mediului până la temperatura de cultivare indicată tehnologic (120 de
minute)
• Se consideră că sterilizarea are loc efectiv în toate cele trei perioade: încălzire, menţinere şi
răcire.
• În general, un de mediu dintr-un bioreactor clasic poate fi sterilizat complet în aproximativ 4
ore
• Pentru sterilizarea particulelor solide din mediu este necesară asigurarea unei agitări
corespunzătoare în timpul acestei operaţii tehnologice, astfel încât fiecare particulă a
mediului de cultură să fie încălzită la temperatura de sterilizare pentru cel puţin 15 minute.
Anumite „buzunare reci” în care s-ar putea aduna fluid nesteril trebuie evitate prin
proiectarea şi construcţia corectă a fermentatorului.
• La prepararea mediilor industriale de cultură ce urmează a fi sterilizate prin această metodă
trebuie ţinut cont de faptul că în urma sterilizării volumul de mediu poate creşte cu până la
20%, ca urmare a diluării cu apa rezultată din condensarea aburului.
Dezavantajele sterilizarii discontinue cu abur
 1) durata prelungită a sterilizării
 2) riscul degradării avansate a mediului.

Sterilizarea continua cu abur

• Avantaje:
 1) conservarea mai bună a proprietăţilor nutritive ale mediului, ca urmare a expunerii
limitate la temperaturi ridicate;
 2)utilizarea mai raţională a aburului;
 3)productivitate şi eficacitate sporită;
 Condiţia principală a aplicării procedeului de sterilizare continuă este reprezentată de
posibilitatea controlului riguros al spumării mediului şivîscozitatea redusă a acestuia.
• Sterilizarea continuă se realizează la 120 sau 1400C; în ultimul caz se lucrează în instalaţii
care permit răcirea rapidă a mediului supraîncălzit.

Instalaţia pentru sterilizarea continuă la 1200C – 1250C

• este compusă din trei elemente:
 coloana de sterilizare,
 menţinător şi
 răcitor
 Coloana de sterilizare este formată din 2 ţevi concentrice:
o cea interioară este folosită pentru circulaţia aburului de 5 atm; pe ea se află din loc în loc
nişte fante prin care aburul barbotează în mediul de sterilizat;
o mediul de sterilizat circulă prin spaţiul dintre cele două ţevi.
o In aceaste condiţii, încălzirea mediului până la 1200C are loc în 4-5 secunde; din coloana de
sterilizare mediul, încălzit la 1200C, este trimis în menţinător
 Mentinatorul este un vas cu manta, în care temperatura mediului se menţine la 1200C,
datorită faptului că prin mantaua vasului circulă abur de 1200C sub presiune.
o Staţionarea mediului în aceste condiţii, timp de 15-20 minute, asigură distrugerea tuturor
microorganismelor străine capabile de multiplicare.
 Răcitorul ţeavă în ţeavă, este format din doua tevi concentrice, în care temperatura
mediului sterilizat scade de la 1200C la 35-400C, ca urmare a transferului de căldură de la
mediu la apa care circulă prin răcitor.
 În acest procedeu de sterilizare, durata perioadei de încălzire-răcire reprezintă 5-6% din
durata totală a sterilizării.
 Instalaţia pentru sterilizarea continuă la 1200C – 1250C

Sterilizarea continuă la 1350C -1400C

• se poate realiza în 2 tipuri de instalaţii:
 instalaţii cu injecţie directă a aburului şi
 instalaţii cu schimbătoare de căldură cu plăci.
• În aceste instalaţii, sterilizarea este eficientă în condiţiile unui timp de expunere scurt la
temperatura de sterilizare, care nu afectează proprietăţile fizico-chimice ale compuşilor din
mediul de cultură.
Instalaţia de sterilizare prin injecţie directă a aburului
• Aburul este injectat direct în mediu printr-un ventil (1), amplasat la începutul unei
serpentine de sterilizare (2), astfel încât temperatura mediului urcă aproape instantaneu la
valoarea prescrisă pentru sterilizare.
• Durata de menţinere a mediului la temperatura de 1350C - 1400C variază în funcţie de
lungimea serpentinei de menţinere (2).
• Răcirea mediului se realizează instantaneu în momentul când acesta trece printr-o valvă de
expansiune (3) într-un vas de expansiune (4), care este un recipient vidat.
• Prin expansiune şi destindere sub vid, temperatura scade brusc, însă, ca urmare a evaporării,
se pierde o cantitate de apă, care trebuie avută în vedere la prepararea mediilor de cultură.

Instalaţia de sterilizare prin injecţie directă a aburului

Instalaţia de sterilizare cu schimbătoare de căldură cu plăci
• se compune din :
 răcitor cu plăci (1),
 preîncălzitor (2),
 sterilizatorul (3),
 serpentina de menţinere (4).

Instalaţie de sterilizare cu schimbătoare de căldură cu plăci

o Mediul de sterilizat se introduce în preîncălzitor (2), circulaţia acestuia realizându-se prin

curgere peliculară pe tăvile incălzite în interior de mediul steril care vine din zona de
menţinere(4).
o Mediul preîncălzit ajunge apoi în sterilizatorul cu plăci (3), unde este încălzit la temperatura
de sterilizare de aburul sub presiune care circulă în interiorul plăcilor.
o De aici, mediul trece în zona de menţinere (4), în care îşi păstrează temperatura de
sterilizare.
o Răcirea mediului sterilizat se realizează prin revenirea acestuia în preîncălzitorul (2) şi apoi
prin trecerea în răcitorul cu plăci 1, în care căldura mediului este transferată agentului de
răcire, care este apa.
o Timpul de încălzire şi răcire a mediului de cultură în această instalaţie este mai mare decât
în instalaţia cu injecţie directă de abur, respectiv încălzirea se face în 15 - 20 de secunde, iar
răcirea în 20 -30 de secunde.
o În instalaţii de sterilizare continuă la 1350C -1400C contribuţia perioadei de încălzire-răcire
la ciclul de sterilizare nu depăşeşte 1-2%.

Sterilizarea aerului tehnologic

• Aerul tehnologic cu care sunt alimentate bioreactorele se sterilizează prin filtrare.
• Filtrele sterilizante sunt alcătuite din materiale fibroase.
• Aproape orice material fibros (zgură, bumbac, sticlă) poate steriliza aerul, dacă este alcătuit
din fibre cu diametru adecvat şi dacă este comprimat la o densitate adecvată, cu condiţia ca
aerul să traverseze materialul filtrant cu o viteză corespunzătoare.
• În general fibrele cu diametrul mai mic sunt mai eficiente.
• In prezent se folosesc filtre sterilizante conţinând următoarele tipuri de materiale fibroase
comprimate:
 fibre de sticlă cu diametrul cuprins între 5 –18 μ;
 nitrat de celuloză (pentru filtre tip membrană);
 teflon (material cu caracter hidrofob şi rezistenţă termică mare, de până la 3000C, care se
foloseşte sub formă de folii sau în amestec cu polietilenă)
  poliamidă (nylon), cu rezistenţă termică, elasticitate, durabilitate şi caracter hidrofob.
• Procedeul de sterilizare a aerului prin filtrare se realizează în cadrul unei instalaţii de tipul
celei prezentate
Instalatia de sterilizare a aerului tehnologic
• Este compusă din următoarele elemente:
 filtru cu saci (1), în care se realizează separarea particulelor solide din aer;
 compresorul (2), în care aerul este comprimat adiabatic la presiunea de 3 – 3,5 at,
temperatura crescând la 1500C – 1600C;
 schimător de căldură (3), în care aerul comprimat este răcit;
 separator de picături (4), în care este îndepărtată apa datorată umidităţii existente în aer
(eficienţa sterilizării aerului prin filtrare se micşorează ca urmare a pătrunderii umidităţii din
aer sau a uleiului din compresor în materialul filtrant)
 filtrul principal cu material fibros (5), în care se realizează practic prima treaptă de
sterilizare;
 filtrul individual cu material fibros (6), în care se realizează a doua treaptă de sterilizare,
după care aerul steril este introdus în fermentator.

Instalatia de sterilizare a aerului tehnologic

 GENERALITATI PRIVIND MICROORGANISMELE UTILIZATE IN
BIOTEHNOLOGIILE APLICATE IN INDUSTRIA DE MEDICAMENTE

Caracteristici generale de importanta practica ale microorganismelor

 1. dimensiuni reduse (permit cultivarea in bioreactoare de capacitate adecvata necesitatilor
tehnologice)
 2. activitate metabolica intensa (suprafata mare de contact a celulelor cu mediul
inconjurator permite schimburi multiple cu mediul si desfasurarea reactiilor cu viteza mare)
 3. multiplicare rapida (se poate obtine o cantitate relativ mare de biomasa si implicit de
metaboliti de interes, intr-un timp scurt)
 4. mentinerea constanta a proprietatilor fiziologice in conditii de mediu constante
(asigura reproductibilitatea proceselor biochimice si a produselor obtinute, daca se respecta
parametrii tehnologici specifici)
 5. diversitatea cailor metabolice (permite utilizarea, ca substraturi nutritive a unei game
largi de substante, inclusiv a unor substante existente in materii prime regenerabile, cu
influenta favorabila asupra costurilor de productie

Microorganisme utilizate pentru producerea de metaboliti de interes farmaceutic

 procariote (bacterii)
 eucariote (drojdii, fungi)

Bacteriile
• Sunt microorganisme unicelulare, cu structură foarte simplă (conţin un nucleu difuz), ce pot
fi caracterizate în funcţie de următoarele criterii:
 morfologie: (coci, bacili, vibrioni, etc.);
 afinitatea faţă de coloranţii de anilină: gram-pozitive şi gram-negative
 proprietăţi biologice:
 tipul de nutriţie,
 respiraţie,
 patogenitate,
 stabilitate termică,
 existenţa şi tipul formaţiunilor de diferenţiere celulară primitivă:
- nesporulate (Micrococcus, Leuconostoc, Propionibacterium, etc.)
- sporulate sub diferite forme: endospori rezistenţi la temperatură (Bacillus subtilis),
conidiospori (Streptomicete), sporangiofori (unele actinomicete).
• De menţionat că genul Micromonospora formează conidii izolate pe miceliul din substrat iar
Nocardia formează endospori.
• Endosporii sunt formaţiuni sferice sau ovale ce conţin aceleaşi elemente ca şi celula
vegetativă, dar în proporţii diferite, şi sunt caracterizaţi printr-o stabilitate termică mult mai
mare decât a formelor vegetative.
Actinomicetele
• Sunt un grup de bacterii cu morfologie specială
• Dintre acestea, următoarele genuri sunt utilizate şi în industria de medicamente:
 Arthrobacter,
 Micromonospora,
 Mycobacterium,
 Nocardia,
 Propionibacterium,
 Streptomyces.
• Actinomicetele prezintă o serie de proprietăţi caracteristice bacteriilor (absenţa membranei
nucleare, compoziţia chimică a peretelui celular, parazitarea de către bacteriofagi) şi altele,
 specifice fungilor (celule alungite în formă de filamente neseptate, cu tendinţă de ramificare
foarte pronunţată, formând hife).
• Toate actinomicetele sunt gram-pozitive şi formează spori rezistenţi la temperatură.
• Proprietatea unor bacterii, inclusiv actinomicete, de a forma spori termostabili este
importantă pentru operaţiile de sterilizare, care trebuie astfel conduse încât să asigure nu
numai distrugerea tuturor formelor vegetative (ceea ce se întâmplă la 1000C) ci şi a celor
sporulate, ceea ce presupune temperaturi mai ridicate (1200C).
Fungii
• Sunt microorganisme eucariote, cu o mare capacitate de a se adapta la condiţii variate, în
general nefavorabile pentru alte microorganisme (presiune osmotica mare, aciditate,
uscăciune).
• Printre caracteristicile generale ale acestora se numără următoarele:
 formează micelii alcătuite dintr-o reţea de filamente ramificate, care cresc în aer, la
suprafaţa mediului; la unele specii se pot dezvolta şi sub forma unor hife care pătrund în
substrat, asigurând fixarea miceliului şi absorbţia substanţelor nutritive;
 unele genuri prezintă pereţi despărţitori sau septuri ce divizează filamentele miceliene,
prezenţa sau absenţă septului fiind un caracter stabil, folosit în în sistematică, pentru
diferenţierea fungilor;
 se multiplică asexuat prin spori nerezistenţi la temperatură (sporangiofori, ascospori,
conidii) sau sexuat, printr-un proces analog conjugării;
 sunt saprofiţi (se pot dezvolta pe compuşi intraţi în putrefacţie şi nu produc boli) sau paraziţi
(produc boli).
• exigenţele nutritive diferă de la un gen la altul, însă în ceea ce priveşte sursa de carbon, toate
au nevoie de o substanţă organică; marea majoritatea a fungilor descompun glucidele
(amidonul şi alte poliglucide complexe), proteinele şi mai puţin lipidele.
 sunt microorganisme strict aerobe;
 au un echipament enzimatic foarte bogat, ceea ce le conferă o mare adaptabilitate la mediu.
proprietatea de a forma cantităţi de enzime
Drojdiile
• Reprezintă un grup de fungi saprofiţi unicelulari, cu o diversitate filogenetică deosebită, care
şi-au pierdut capacitatea de a forma micelii filamentoase.
• Sunt încadrate în două clase taxonomice majore:
 Ascomycotina
 Basidiomycotina
• Drojdiile se înmulţesc pe mai multe căi şi anume:
 pe cale vegetativă prin înmugurire,
 prin diviziune directă (simplă),
 prin ascospori (asexuat) şi
 sexuat.
• Din punct de vedere fiziologic, drojdiile se aseamănă foarte mult cu bacteriile.
• Clasificarea drojdiilor în genuri şi specii se bazează pe morfologia stărilor vegetative şi
sexuate şi pe teste fiziologice, ultimele permiţând identificarea drojdiilor la nivel de specie.
 Caracteristici de diferenţiere ale microorganismelor procariote şi eucariote utilizate în
biotehnologiiile industriale

(după Săsărman E., Jurcoane S., Microbiologie industrială, Editura Mirton Timişoara, 2000)

Tip de microorganism
Proprietăţi Procariot (bacterii) Eucariot (fungi, drojdii)
membrana nucleară absentă prezentă
Structura şi nucleol absent prezent
funcţiile dublu catenar, circular, complexat cu histone,
nucleului ADN închis, necomplexat cu sub formă de cromozomi
histone
diviziune binară mitoză
transfer parţial de
material genetic prin:
transformare,
reproducere sexuată meioză
transducţie, sexducţie,
transfecţie, conjugare
fără fuziune celulară
introni în gene rari frecvenţi
conţine în mod frecvent
membrana citoplasmatică nu conţine steroli
steroli
Structura complexă: reticul
membrana internă simplă
citoplasmei endoplasmatic
mulţi ribozomi 70S ribozomi liberi 80S
ribozomi
liberi
enzime localizate pe prin organe speciali
membrana zate: mitocondrii
respiraţie
citoplasmatică;
mitocondrii absente
pe membrana internă
pigmenţi fotosintetizanţi cloroplaste
sau clorozomi
Peptidoglican (N- Drojdii: manani parţiali
acetulglucozamină şi fosforilaţi şi β-glucan
Structura polimerică a peretelui
acid muraminic legaţi Fungi: α şi β-glucani,
celular
prin punţi glicoproteine şi chitină
oligopeptidice)
foarte rezistenţi la absenţi
endospori
căldură
flageli sau cili fără
Mobilitate flageli cu mişcări rotative mişcări rotative, alcătuiţi
din microtuburi
microtuburi absente prezente
dimensiune <2μm 2 – 100 μm

Agenţi biologici bacterieni importanţi pentru industria de medicamente

 Grup – Familie Genul Specia Produsul obţinut
Bacterii gram-negative Acetobacter Sorboză (intermediar pentru sinteza
A. suboxidans
aerobe vitaminei C)
Pseudomonas P.denitrificans Vitamina B12
Xanthomonas X. campestris xanthan
E.coli – tulpini Enzime de interes industrial:
selecţionate prin penicilinacilaze, aspartază
mutageneză
Bacterii gram-negative Escherichia
E.coli - tulpini Proteine terapeutice: enzime,
facultativ anaerobe
modificate prin hormoni, interferoni)
inginerie genetică
Erwinia E.carotovora L-asparaginază
Seratia S. marcescens
Intermediari steroidici
Microccocus
Coci gram-pozitivi M. caseolyticus Metaloprotează neutră: termolizina
Leuconostoc L. mesenteroides dextran
B.subtilis enzime (proteaze)
B. termolizină
thermoproteolyticus
Bacili gram-pozitivi
Bacillus B. licheniformis bacitracină
formatori de endospori
B. brevis gramicidină S
B. polymyxa polimixină B
B. colistimus polimixină E (colisitin)
Actinomicete şi C. glutamicum aminoacizi, nucleotide corectoare de
Corynebacterium
microorganisme C. melassecola gust
înrudite, corineforme Arthrobacter A.symplex Intermediari steroidici
(bacterii gram-pozitive, Propionibacteriu P.shermanii Vitamina B12
diferite de cele m
formatoare de Micromonospora M. purpurea Gentamicină
endospori, de cocii Nocardia N. uniformis Norcardicină A
gram-pozitivi şi de
bacteriile asporogene),
altele decât Mycobacterium Intermediari steroidici
streptomicete
Antibiotice: aminoglicozidice,
tetracicline, macrolide,
Streptomicete Streptomyces diverse
griseofulvină, enzime
(glucozizomeraza)
 Fungi utilizaţi în industria de medicamente

Grup-Familie Genul Specia Produsul obţinut

Acid fumaric,
R. nigricans
Phycomycetes Rhyzopus Intermediari steroidici
R. arrhizus Intermediari steroidici
A.oryzae α-amilază
A. niger naringinaza, proteaze
Aspergillus
A. candidus manitol
Ascomycetes Aspergillus sp. acid kojic, aspertecina
Penicillium P. chrysogenum peniciline
Gibereline,
Fusarium Gibberella fujikuroi acid giberelic (regulatori
de creştere a plantelor)
M.meihei
Basidiomycetes Mucor renină
M. pussilus
Candida C. lipolitica lipază
Deuteromycetes Thricoderma T. reesii celulaze
Cephalosporium C. acremonium Cefalosporina C
Aureobasidium A. pullulans pullulan