CURS BIOFIZICA

Şef lucr. Dr.

Sorin Dan MIRON
METODE FIZICE ŞI BIOFIZICE CU
APLICAŢII ÎN MEDICINĂ

1. Metode electroforetice
2. Metode cromatografice
3. Metode de difracţie cu raze X + proteine
4. Metode de microscopie electronică
(de balaiaj, prin transmisie)
5. Tipuri de MO
 IV. Metode de microscopie
electronică

Principiul fizic al microscopiei

electronice

10/29/2017 3
 Ecuaţia lui de Broglie:
 = h/p = h/mv

unde
h = constanta lui Planck
p = impulsul particulei
m = masa particulei
v = viteza particulei

ORICE PARTICULĂ ÎN MIŞCARE ARE O

LUNGIME DE UNDĂ ASOCIATĂ ()

10/29/2017 4
 Dacă viteza creşte,  descreşte,
puterea de rezoluţie creşte:

p = 1/d = n sinu / 
 = h/p = h/mv
unde
p = putere de rezoluţie
d = distanţa minimă între 2 puncte care poate fi distinsă
separat
n = indicele de refracţie
u = unghiul

Un fascicul de electroni accelerat:

10/29/2017 - la 10 kV,  asociat este 130 nm (13 Å), 5

- la 100 kV,  asociat este 30 nm (3 Å)

 Semnalele emise de un material supus
unui bombardament electronic

sau

Reprezentarea schematică a
interacţiei unui fascicul de electroni
(sonda electronică) cu o probă
studiată.
10/29/2017 6
10/29/2017 7
MET MEB
microscop electronic prin transmisie microscop electronic cu baleiaj

10/29/2017 8
 MICROSCOPUL
ELECTRONIC
CU BALEIAJ

Rezoluţia este mai

scăzută decât în MET.

Imagini pseudo-3D.

10/29/2017 9
10/29/2017 10
 Microscopul electronic cu baleiaj
Principiu
Un spot de electroni baleiază
suprafaţa probei.
Electronii secundari de energie mică
(0-50 eV), emişi în urma împrăştierii
neelastice, sunt captaţi şi, după o
procesare electronică, formează
imaginea pe un ecran fluorescent, sau
pe o peliculă fotografică.
Luminozitatea fiecărui punct al imaginii
depinde de numărul de electroni
secundari înregistraţi din poziţia
corespunzătoare a probei.
Se obţin imagini ale suprafeţei unei
celule, a unui microorganism sau a unui
ţesut, de unde impresia de imagine
tridimensională.
Mărire maximum 200 000 x, cu o
rezoluţie
10/29/2017
de 3,5 nm.
Alcătuire
Tun electronic - fascicol de
electroni cu diametrul de circa
50 nm.
2-3 lentile condensoare -
diametrul până la 2 nm (spot mic,
deoarece secţiunea sa determină
pe imagine un singur punct).
O lentilă condensoare care
reglează dimensiunea finală a
spotului şi focalizează imaginea
pe ecran.
Electronii secundari sunt captaţi
de un detector de Al care acoperă
un cristal de scintilaţie al unei
sonde de scintilaţie, semnalul
obţinut este amplificat electronic
şi formează imaginea pe ecranul
unui tub catodic sau al unui
monitor. 11
 Microscopul electronic de baleiaj
- Exemple -

Etapele de transformare in Eritrocite umane îmbătrânite

echinocit
10/29/2017 12
 ?

10/29/2017 13
 ?

10/29/2017 14
 ?

10/29/2017 15
 !
10/29/2017 16
 Microscopul electronic de baleiaj
- Exemple -

E. coli

ochi de
muscă

limfocit

10/29/2017 17
 Microscopul electronic de baleiaj
- Exemple -

Contact între un limfocit

Contact între un limfocit (în
(imunofluorescenţă verde)
galben) şi o celulă
şi o celulă dendritică ce
dendritică ce prezintă un
prezintă un antigen.
antigen (în albastru).
Microscopie cu contrast de
Microscopie electronică cu
fază.
10/29/2017 baleiaj. 18
 Pereche de cromosomi umani, X şi Y, după
10/29/2017 19
Nature (2003) 423: 810-812.
 ?

10/29/2017 20
 ?

10/29/2017 21
 Microscopul electronic de baleiaj
- Exemple -

10/29/2017 Fibre de sticla 22

 Microscopul electronic de baleiaj
- Exemple -

Cristale componente ale ceramicii (x 4000); cu verde -

particule îmbogăţite în calciu, în albastru - particule
care conţin fosfor. © Didier COT/IEM/CNRS
10/29/2017 23
 Microscopul electronic de baleiaj
- Exemple -

- granule de polen

10/29/2017 24
 MICROSCOPUL ELECTRONIC
PRIN TRANSMISIE

10/29/2017 25
 relatia lui de Broglie:
λ = h/p = h/mv
Se folosesc electronii împrăştiaţi neelastic transmişi prin probă
(preparatul de examinat).

Înainte de a ajunge la preparat (probă) electronii proveniţi de la sursa

de electroni (tunul de electroni) sunt focalizaţi de două lentile
condensor (electromagnetice). Ei sunt mai mult sau mai puţin absorbiţi
(spunem despre preparat că este mai mult sau mai puţin dens pt.
electroni).

Utilizează marcheri electrono-opaci.

Imaginea se formează în spatele preparatului pe un ecran fluorescent.

Mărirea, raportul dintre mărimea imaginii/mărimea obiectului,

rezoluţia, cu atât mai bună cu cât  este mai mică şi apertura mare
(care, însă, măreşte aberaţiile de sfericitate); la diafragme de
20-70 m rezoluţia este 0,1-0,2 nm.

Luminozitatea imaginii depinde de numărul de electroni transmişi,

10/29/2017 26
intensitatea fascicolului incident, caracteristicile probei.
 Microscopul electronic de transmisie
- Exemple -

MET - PMN

MET - limfocit
10/29/2017 27
 mitocondrie

aparat Golgi

membrana

nucleu

10/29/2017 reticul 28

endoplasmic rugos
 Microscopul electronic de transmisie
- Exemple, comparatie cu alte tipuri de microscopie -

MO
Limfocit - MEB

10/29/2017 MET 29
Hematii

MO AFM

MEB
MET

10/29/2017
Microscopul electronic de transmisie 30
- Exemple, comparatie cu alte tipuri de microscopie -
 V. TIPURI DE
MICROSCOAPE OPTICE

10/29/2017 31
 1 MICROSCOPUL OPTIC

Pentru a creste P (descreste ε):

- descreste  (390 - 720 nm)
- creste n
10/29/2017 32
 V. lucrarea practica Legile osmozei
difuziunea si osmoza!!!

Cellules turgescentes -------> Cellules

plasmolysées

10/29/2017 33
 2 MICROSCOPUL OPTIC
cu imersie

10/29/2017 34
 3 Microscopul polarizant
- lumina polarizata
Pune in evidenta fenomenul de
birefringenta a unor structuri, - 2 nicoli
expresie a anizotropiei acestora.
- Cruce de Malta

10/29/2017 35
 4 Ultramicroscopul (microscopul
cu fond intunecat)

Iluminarea este din lateral.

Condensorul este de tip cardioid sau
paraboloid.
Se bazeaza pe fenomenul Tyndall
10/29/2017 (de difuzie a luminii). 36
 Fenomenul Tyndall

10/29/2017 37
5 Microscopul cu contrast de faza
Prezinta o lama
sfert de unda
care transforma
defazajul luminii
imperceptibil
ochiului uman
intr-o variatie de
intensitate
celula epiteliala perceptibila
vizual
(transforma deci
un contrast de
faza in contrast
de amplitudine).
Permite
observarea
ciclul celular celulelor
10/29/2017
necolorate. 38
 6 Microscopul cu fluorescenta

Principiul fenomenului de
fluorescenţă:
1. Energia este absorbită de un
atom
2. Electronul sare pe un nivel
superior de energie.
3. Ulterior, electronul revine la
starea initiala si emite un foton –
fenomenul de fluorescenţă

- utilizează markeri fluorescenţi -

10/29/2017 39
 O sursa UV.
Ecran filtrant care lasa sa treaca doar radiatiile
UV excitatoare ale fluorescentei.

10/29/2017 celule epiteliale 40

GFP - Green Fluorescent Protein The Nobel Prize in Chemistry 2008
238 aa, 26.9 kDa was awarded jointly to Osamu
Shimomura, Martin Chalfie and
Do you Roger Y. Tsien "for the discovery
Nobel Chemistry 2008 and development of the green
remember?
fluorescent protein, GFP".

10/29/2017 41
 Bibliografie selectivă

 Aurengo A., Grémy F., Petitclerc T. - Biophysique, Médecine-Sciences

Flammarion, Paris, 1998.
 Dimoftache C., Herman S. – Principii de Biofizică umană, Ed. Universitară
“Carol Davila”, Bucureşti, 2003.
 Duncan G, Physics in the Life Sciences, Blackwell Scientific Publications,
The Alden Press, Oxford, 1990.
 Durand A., Escanyé J-M., Naoun A. La biophysique en 1001 QCM, Ed.
Ellipses, 2004.
 Goldfarb D. Biophysics DeMYSTiFieD. McGraw-Hill Companies, 2011.
 Herman S. Aparatura medicală. Principiile fizice ale aparaturii medicale
moderne,Ed.Teora,Bucureşti, 2000.
 Nölting, Bengt. Methods in Modern Biophysics. Springer. 2003.
 Pascu M., Rusu V., Vasile C., Spectrometria in IR in medicina si farmacie,
Editura BIT, 2003.
 Popescu A., Bazele Opticii, Ed. Universităţii „Al. I. Cuza”, Iaşi, 1988.
 Rusu V., Baran T., Brănişteanu D. D. - Biomembrane şi patologie, vol. I, Ed.
Medicală, Bucureşti, 1988, 63-92, 286-292.
 Rusu V. Note de curs. 2010.
 Rusu V. – Nobel – Retrospectivă 1905 – 1995 – Laureaţii premiului pentru
fiziologie şi medicină, Ed. Omnia, Iaşi, 1996.
 Rusu V si colab. Lucrări practice şi demonstraţii de Biofizică şi Fizică
Medicală, Ed. „Gr. T. Popa” Iaşi, 2003.
 Rusu V. – Dicţionar medical, Ed. Medicală, Bucureşti, ed. IV, 2011.
 Skoog D. A., Holler F. J., Nieman T. A., Principes d’analyse instrumentale,
De Boeck Université, Paris, 2003.
 Ştefănescu C, Rusu V. Biophysics and Medical Physics: An Introduction, Ed.
10/29/2017
Tehnopress, 2008. 42