S2 – 05.03.

2018
Cultivarea bacteriilor
Produsele patologice ajunse in laborator sunt evaluate pentru a vedea daca recoltarea a fost
corespunzatoare.
Daca sunt corect recoltate, probele sunt receptionate in sistemul electronic in care s-a facut solicitarea si
apoi introduse in registrul de lucru al laboratorului.
In cazul in care prepraratele microscopice ofera informatii sugestive, se fac in paralel insamantarea
produselor pe medii de cultura.
Mediile de cultura sunt substraturi solide, semisolide sau lichide, in/pe care pot fi cultivate bacterii in
vitro. Mediile folosite pentru bacterii se numesc medii acelulare, pentru a se face diferenta fata de
sistemele biologice ce ofera celule vii utilizate in virusologie.

Clasificarea mediilor de cultura

A. Dupa utilizare
I. Medii de izolare:
- mediile pe care sunt insamantate produsele recoltate de la pacient in vederea obtinerii unei culturi pure
din bacteria sau bacteriile care sunt agenti etiologici ai unei infectii
- pot fi de 3 feluri:
1) Medii elective = de electie:
- contin unul sau mai multi nutrienti care favorizeaza dezvoltarea unei specii bacteriene in defavoarea
altora
- specia favorizata se va dezvolta alert ocupand tot mediul de cultura si eliminand astfel prin competitie alte
specii
- in practica este favorizata specia patogena suspectata, fiind excluse bacteriile din flora normala a
produsului
2) Medii selective: contin un agent antimicrobian care omoara bacteriile din flora normala si nu afecteaza
specia patogena
3) Medii de imbogatire: contin atat agenti selectivi cat si electivi, fiind favorizata bacteria patogena si
excluse/omorate bacteriile din flora normala
II. Medii de transport: permit pastrarea bacteriilor fara alterarea proprietatilor lor, perioade scurte de timp
(din momentul recoltarii pana in momentul prelucrarii in laborator)
III. Medii de conservare: permit pastrarea bacteriilor fara alterarea proprietatilor lor perioade indelungate
(spatamani, luni sau chiar ani)
IV. Medii diferentiale = medii de identificare:
- permit stabilirea genului sau speciei bacteriene
- contin un substrat care sufera modificari vizibile cu ochiul liber datorate metabolismului bacterian
- substratul poate fi:
• o proteina: poate fi degradata sau nu de catre bacterii
• un glucid: poate fi fermentat sau nu de catre bacterii
• o substanta chimica: poate fi oxidata sau redusa de catre bacterii
V. Medii cu destinatie speciala – ex.: mediul Müller-Hinton folosit pentru antibiograma

B. Dupa starea de agregare

I. Medii lichide – ex.: bulionul de carne
II. Medii semisolide: contin 0.5g% agar  ex.: mediul Cary-Blair
III. Medii solide: contin 2g% agar  ex.: geloza simpla

C. Dupa provenienta
I. Medii pe baza de proteine vegetale: contin extracte de cartof, linte, fasole, mazare, etc.
II. Medii pe baza de proteine animale: contin macerate de carne de vita, cal, pasare (prepelita, porumbel,
gaina, cocos), berbec, ovine, caprine, iepure, extracte de cord si creier
III. Medii pe baza de proteine cu provenienta diferita (mixta, vegetala si animala)

D. Dupa natura ingredientelor

I. Medii naturale – ex.: lapte sau bila
II. Medii artificiale – ex.: bulion simplu sau geloza simpla doar cu agaruri
III. Medii mixte – ex.: bulion-sange, geloza-sange

 mediile de cultura sunt insamantate cu produsele patologice utilizand diverse metode de insamantare
1 / LP 2  M
 dupa insamantare sunt introduse in termostat la 37°C 24-72h in conditii de aerobioza, anaerobioza sau
in atmosfera de 5-8% CO2 ( favorizeaza dezvoltarea bacteriilor pretentioase care cresc cu dificultate in
vitro)
Metode de insamantare
I. Insamantarea in medii lichide
a) insamantarea cu ansa bucla
- se tine ansa cu degetele 1-2-3 ale mainii drepte ca pe un creion
- se ia in mana stanga recipientul deschis cu produsul care va fi insamantat (produs patologic lichid sau
solid, cultura bacteriana in mediu lichid sau pe mediu solid)
* observatii:
• daca recipientul e o lama/placa Petri, acesta este asezat pe masa cu capacul in jos
• daca recipientul e cu gura larga acoperit cu capac, se deschide capacul si se lasa rasturnat
• daca recipientul e cu gura ingusta, prezentand dop de mici dimensiuni (de vata, cauciuc etc.) se
scoate dopul cu degetele 4-5 ale mainii drepte
- se introduce ansa in recipientul cu produs si se incarca bucla cu produs
- se scoate bucla din recipient, iar recipientul se inchide si se lasa pe masa
- se ia in mana stanga o eprubeta cu mediul de cultura lichid steril in care se va face insamantarea
- se scoate cu degetele 4-5 ale mainii drepte dopul de vata al eprubetei
- se flambeaza gura eprubetei
- se introduce ansa in eprubeta si se descarca produsul din bucla prin agitare in mediul lichid
- se scoate ansa din eprubeta
- se flambeaza gura eprubetei
- se acopera eprubeta cu dopul de vata si se lasa intr-un stativ
• daca ansa utilizata a fost de unica folosinta se arunca in recipientul pentru materiale taietoare-
intepatoare
• daca sunt anse metalice se sterilizeaza prin incalzire pana la incandescenta
b) insamantarea cu pipeta
- se scoate pipeta din ambalajul de hartie in care a fost sterilizat (la Pupinel)
- se flambeaza pipeta tinand-o cu degetele 1-2-3 ale mainii drepte ca pe un creion
- se ia in mana stanga recipientul deschis cu produsul de insamantat
- se introduce pipeta in recipient si se umple cu produs
- se scoate pipeta din recipient tinand pulpa indexului pe extremitatea sa superioara
- se inchide recipientul cu produs si se lasa pe masa sau intr-un stativ
- se ia in mana stanga eprubeta cu mediul de cultura lichid steril in care se va face insamantarea
- se scoate dopul de vata al eprubetei cu degetele 4-5 ale mainii drepte
- se flambeaza gura eprubetei
- se introduce pipeta in eprubeta si se descarca produsul prin eliberarea extremitatii sale superioare
- se scoate pipeta din eprubeta
- se flambeaza gura eprubetei
- se pune pipeta in recipientul pentru obiecte taietoare-intepatoare contaminate
- se acopera eprubeta cu dopul de vata si se lasa intr-un stativ
c) insamantarea cu tampon
 se foloseste pentru produse patologice recoltate cu tamponul
- se tine tamponul cu degetele 1-2-3 ale mainii drepte
- se scoate dopul eprubetei cu degetele 4-5 ale mainii
- se flambeaza gura eprubetei
- se introduce tamponul in eprubeta si se lasa acolo fixand tija acestuia cu dopul de vata
II. Insamantarea pe medii solide
1. Medii solide turnate in placi Petri – cele mai des utilizate tehnici sunt:
a) cu ansa bucla:
• pe un sector de placa: se incarca bucla ansei cu produsul de insamantat si se traseaza striuri in zig zag
pe suprafata sectorului/mediului de cultura, tinand bucla ansei paralela cu mediul de cultura
• prin tehnica pentagonului:
 se foloseste pentru a obtine colonii bacteriene izolate
- se incarca ansa sterila cu produsul de insamantat
- se descarca produsul tinand bucla paralela cu mediul de cultura, trasand latura unui pentagon
- se schimba/sterilizeaza ansa in acest moment
- se traseaza o noua latura a unui pentagon din capatul primei laturi etc., iar in final ultima latura nu
trebuie sa intalneasca prima latura
2 / LP 2  M
  prin aceasta tehnica produsul este dispersat pe suprafata mediului pana la obtinerea de colonii
diferite izolate
b) cu pipeta – prin inundarea mediului:
- se incarca pipeta cu suspensia bacteriana si se descarca o mica cantitate in centrul placii Petri
- se imprima o miscare de rotatie placii, pana la intinderea lichidului pe toata suprafata mediului de
cultura
- se aspira surplusul de lichid cu o pipeta sterila
 se foloseste pentru antibiograme sau uroculturi
c) cu tamponul:
 se foloseste pentru produse patologice recoltate cu tamponul
- se descarca tamponul prin rotire pe o mica zona din mediul de cultura
- se disperseaza produsul cu o ansa sterila prin miscari de zig zag pe suprafata mediului
2. Medii solide turnate drept intr-un tub
- se sterilizeaza ansa
- se incarca ansa cu produs
- se scoate dopul tubului cu degetele 4-5 ale mainii drepte
- se flambeaza gura tubului daca este din sticla
- se introduce ansa ac in tub si se inteapa mediul solid vertical pana in profunzime
- se scoate ansa si se sterilizeaza/arunca
- se flambeaza gura tubului
- se acopera cu dopul si se lasa intr-un stativ
3. Medii solide turnate inclinat intr-un tub
- se pot utiliza ansa ac, ansa bucla sau pipeta
- se incarca ansa cu produs
- se scoate dopul
- se flambeaza gura tubului
- se introduce ansa in tub si se inteapa mediul in profunzime
- se traseaza striuri in zig-zag de jos in sus pe suprafata mediului
- se flambeaza gura tubului
- se acopera tubul cu dopul de vata
- se pune tubul intr-un stativ

 mediile de cultura insamantate sunt incubate la 37°C 24-72h (in termostat), in aerobioza, anaerobioza
sau in atmosfera de 5-8% CO2 ( favorizeaza cresterea bacteriilor fastidioase, foarte greu cultivabile)

Caractere de cultura in medii lichide

Mediile lichide sunt sterile, complet transparente inainte de insamantare. Dupa insamantare se pot
observa modificari datorate dezvoltarii bacteriene:
• turbiditatea lichidului (lichidul se tulbura omogen) – ex.: tulpinile virulente de stafilococi
• formarea unui depozit grunjos la fundul lichidului – ex.: tulpinile streptococice
• formarea unei pelicule la suprafata lichidului – ex.: bacilul piocianic
• formarea unui văl la suprafata lichidului – ex.: vibrionul holeric (agentul holerei)
• formarea unei membrane externe uscate la suprafata lichidului – ex.: genul Bacillus
• pigmentarea lichidului – ex.: bacilul piocianic
• formarea de bule de gaz – ex.: bacteriile anaerobe din genul Clostridium
• hemolizarea lichidului daca are sange
• schimbarea culorii lichidului ca urmare a fermentarii unui zahar

Caractere de cultura pe medii solide

Pe mediile solide, bacteriile cresc sub forma unor colonii care sunt formatiuni de cativa mm, de forme
diferite si consistente diferite, in functie de gen sau specia bacteriana. Caracteristicile coloniilor pot fi:
• dimensiunea: punctiforme pana la cativa mm – ex.: streptococii
• forma: rotunde, ovalare, elipsoidale, rombice, stelate, neregulate, conopidiforme
• contur: bine delimitate sau cu margini vagi
• consistenta: apoasa, cremoasa, vascoasa, mucoasa, gelatinoasa, pufoasa, uscata, rugoasa
• ridicarea in suprafata: plate, bombate, ombilicate (bombate cu depresiune centrala/gaura la mijloc),
mamelonate (cu proeminenta centrala)
• aspecte particulare anumitor specii sau genuri bacteriene:
- prezenta beta-, alfa- sau alfa’-hemolizei pe mediile cu sange
3 / LP 2  M
- schimbarea culorii mediului datorita fermentarii unui zahar din compozitia acestuia
- fenomenul de migrare sau catarare prezent la genul Proteus
- pigmentarea coloniilor sau a mediului din jur pe anumite medii de cultura

4 / LP 2  M