Elemente de virusologie

CUPRINS
Virusurile:
 Caractere generale

 Clasificarea

 Morfologie

 Structură

Multiplicarea virusurilor
Metode de cultivare a virusurilor
(animale de laborator, ouă embrionate,
culturi de celule)
 Introducere
 Virusologia medicala se ocupă cu studiul virusurilor umane si animale,
cu implicarea acestora in patologia infecţioasă corespunzătoare.

 Virusurile – sunt agenţi infecţioşi cu dimensiuni foarte reduse, care

prezintă parazitism strict intracelular.

 Studii de dată recentă au evidenţiat agenţi subvirali cu potenţial patogen

pentru plante, animale si om.
 Viroizii – sunt molecule de ARN circular, alcătuit din 200-400 nucleotide,
fără capsidă sau anvelopă, care determină boli la plante.
 Virusoizii (agenţi sateliţi) au genomul alcătuit din cca. 1000 nucleotide si
care se pot replica în asociere cu un alt virus a cărui capsida o folosesc.
Exemplu: virusul hepatitei D (delta) al cărui genom format din ARN se
acoperă cu antigenul de suprafaţă al virusului hepatitei B (Ag HB S).
 Transpozomii – sunt fragmente de genom mobile, capabile să-şi modifice
poziţia.
 Prionii – sunt agenţi infecţioşi neconvenţionali de natură proteică(proteine
infecţioase) care se pot replica la nivelul sistemului nervos central,
determinând leziuni ireversibile.
Caractere generale
 Caractere generale
 Dimensiunile sunt reduse variind între 10-300 nm si pot fi evidenţiate
numai prin examinare electronooptică;

 Virusurile sunt alcătuite dintr-un miez de acid nucleic fie ARN fie ADN
(niciodată ambele la acelaşi virus), înconjurat de proteine aşezate după o
anumită simetrie care alcătuiesc capsida virală.
 Acidul nucleic viral conţine întreaga informaţie genetică necesară
multiplicării şi codificării celorlalte structuri virale care alcătuiesc particula
infectantă (virionul);
 Virusurile se cultivă numai pe substraturi celulare vii, ele prezentând
parazitism strict intracelular (nu se pot multiplica decât într-o celulă vie
vegetală, bacteriană sau animală, folosind aparatul ribozomal al acesteia
pentru programarea sintezelor proprii prin devierea metabolismului celulei
parazitate);
 Virusurile nu sunt sensibile la antibiotice;
 Replicarea virală induce sinteza unor substanţe numite interferoni care
induc în celulele încă neinfectate rezistenţă la infecţie (acţiune antivirală);
 Infecţia virală a celulelor organismului declanşează viroza, care evoluează
fie inaparent, fie cu manifestări fiziopatologice şi clinice caracteristice;
Clasificarea virusurilor
 Clasificarea virusurilor
Clasificarea epidemiologică este foarte utilă pentru clinician şi se referă la calea de transmitere a virusului:
virusului:
 virusuri enterice cu transmitere fecal-orală (ex. poliovirusurile);
 virusuri respiratorii cu transmitere aeriană (ex. virusurile gripale);
 virusuri cu transmitere sexuală (ex. HIV);
 virusuri cu transmitere prin sânge (ex. virusul hepatitei B, C);
 virusuri cu transmitere prin artropode (ex. arbovirusurile);
 virusuri cu transmitere verticală, materno fetală (ex. virusul rubeolos, CMV).
• Clasificarea virusurilor după dimensiuni:
 virusuri mici: au  cuprins între 15-30 nm
 de ex. Picornavirusurile (enterovirusurile)
 virusuri mijlocii: au  cuprins între 70-180 nm
 de ex. mixovirusurile, virusurile din grupul herpes, HIV;
 virusuri mari: au  cuprins între 200-300 nm de ex. pox-virusurile.
 Clasificarea virusurilor după tropism:
 virusuri dermotrope: de exemplu. herpesvirusurile, poxvirusurile, virusul rujeolos, virusul rubeolic;
 virusuri enterotrope: de exemplu. enterovirusurile, rotavirusurile;
 virusuri neurotrope: de exemplu. arbovirusurile, v. rabic;
 virusuri cu tropism pentru căile respiratorii: de ex. mixovirusurile, adenovirusurile, rinovirusurile;
 virusuri hepatotrope: ex. virusurile hepatitice A, B, C;
 virusuri limfocitotrope: ex. HIV, v. rujeolos.
 Clasificarea virusurilor după acidul nucleic conţinut:
  
 În funcţie de tipul de acid nucleic viral, există următoarele familii cu importanţă medicală:
  
 RIBOVIRUSURI (Virusuri ARN) ARN) 
 DEZOXIRIBOVIRUSRI (Virusuri AND)
 RIBOVIRUSURI (virusuri ARN):
Clasificarea virusurilor
  
 1. Familia PICORNAVIRIDAE – are 5 genuri:
 Enterovirus (virusurile polio, Coxsackie, ECHO)
 Cardiovirus (virusul encefalomiocarditei)
 Rhinovirus (agenţii guturaiului)
 Aphtovirus (virusurile febrei aftoase)
 Heparnavirus (virusul hepatitei A)
 În această familie virusurile sunt fără anvelopă, cu diametrul de 27-30 nm, au capsida cu simetrie icosaedrică, au genom ss, cu polaritate pozitivă şi infecţios.
  
 2. Familia CALICIVIRIDAE – cuprinde virusuri fără anvelopă, cu simetrie icosaedrică, cu diametrul 35-40 nm. Ex. coronavirusuri,
coronavirusuri, astrovirusuri,
astrovirusuri, agentul Norwalk
  
 3. Familia TOGAVIRIDAE – include 4 genuri:
 Alfavirus (virusurile encefalitelor ecvine de vest şi est, de Venezuela etc.)
 Rubivirus (virusul rubeolos)
 Hepacivirus (virusul hepatitei C)
 Pestivirus (virusul diareei bovine)
 Aceste virusuri sunt anvelopate cu diametrul de 60-70 nm, cu simetrie icosaedrică, au genom ss cu polaritate pozitivă, infecţios.
 4. Familia FLAVIVIRIDAE – include virusurile febrei galbene, Denga, encefalitei ruse de primăvară-vară etc.
  
 5. Familia ARTERIVIRIDAE – cuprinde virusul arteritei ecvine.
  
 6. Familia BUNYAVIRIDAE – cuprinde virusurile encefalitei de California, virusul febrei hemoragice de Crimeea etc.
  
 7. Familia ORTHOMIXOVIRIDAE – include 3 tipuri de virusuri gripale – Influenzavirus A, B, C. Sunt virusuri anvelopate cu simetrie helicoidală, dimensiuni de ~ 80-120 nm, genom ss, segmentat, cu polaritate negativă.
  
 8. Familia PARAMIXOVIRIDAE – include genurile:
 Morbillivirus (virusul rujeolos)
 Pneumovirus (virusul respirator sinciţial)
 Paramixovirus (paramixovirusuri şi virusul urlian)
 Acestea sunt virusuri cu diametrul 100-150 nm cu caractere asemănătoare ortomixovirusurilor, cu genom nesegmentat care îi conferă stabilitate antigenică.
  
 9. Familia RHABDOVIRIDAE (ex. virusul rabic etc.) - grupează virusuri anvelopate cu simetrie helicoidală, cu genom ss nesegmentat cu polaritate negativă.
  
 10. Familia FILOVIRIDAE – include virusuri cauzatoare de febre hemoragice (virusul Marburg, virusul Ebola).
  
 11. Familia CORONAVIRIDAE – cuprinde virusuri cu genom ss cu polaritate pozitivă.
  
 12. Familia REOVIRIDAE - are ca patogeni umani genurile:
 Reovirus conţine virusuri cu tropism respirator şi intestinal
 Orbivirus include virusuri encefalitogene
 Rotavirus cuprind virusuri cauzatoare de gastroenterite la nou-născuţi şi copii mici
  
 13. Familia RETROVIRIDAE – include subfamiliile:
 Oncovirinae – virusuri oncogene ARN, exemplu HTLV1,2 (Human T Cell Leukemia Virus)
 Lentivirinae – agenţi ai unor boli degenerative ale SNC şi HIV (agentul cauzal al bolii SIDA)
 Spumavirinae – cauzează infecţii cronice, asimptomatice
 Sunt virusuri cu: simetrie icosaedrică, genom ARN ss în două copii identice, având prezentă o enzimă cu rol în replicare = reverstranscriptaza.
reverstranscriptaza.
  
  
 Clasificarea virusurilor
 RIBOVIRUSURI (virusuri ARN):
  
 8. Familia PARAMIXOVIRIDAE – include genurile:
 Morbillivirus (virusul rujeolos)
 Pneumovirus (virusul respirator sinciţial)
 Paramixovirus (paramixovirusuri şi virusul urlian)
 Acestea sunt virusuri cu diametrul 100-150 nm cu caractere asemănătoare ortomixovirusurilor, cu genom nesegmentat care îi conferă
stabilitate antigenică.
  
 9. Familia RHABDOVIRIDAE (ex. virusul rabic etc.) - grupează virusuri anvelopate cu simetrie helicoidală, cu genom ss nesegmentat cu
polaritate negativă.
  
 10. Familia FILOVIRIDAE – include virusuri cauzatoare de febre hemoragice (virusul Marburg, virusul Ebola).
  
 11. Familia CORONAVIRIDAE – cuprinde virusuri cu genom ss cu polaritate pozitivă.
  
 12. Familia REOVIRIDAE - are ca patogeni umani genurile:
 Reovirus conţine virusuri cu tropism respirator şi intestinal
 Orbivirus include virusuri encefalitogene
 Rotavirus cuprind virusuri cauzatoare de gastroenterite la nou-născuţi şi copii mici
  
 13. Familia RETROVIRIDAE – include subfamiliile:
 Oncovirinae – virusuri oncogene ARN, exemplu HTLV1,2 (Human T Cell Leukemia Virus)
 Lentivirinae – agenţi ai unor boli degenerative ale SNC şi HIV (agentul cauzal al bolii SIDA)
 Spumavirinae – cauzează infecţii cronice, asimptomatice
 Sunt virusuri cu: simetrie icosaedrică, genom ARN ss în două copii identice, având prezentă o enzimă cu rol în replicare = reverstranscriptaza.
reverstranscriptaza.
  
  
 Clasificarea virusurilor
 DEZOXIRIBOVIRUSURI (Virusuri ADN):
  
 1. Familia PARVOVIRIDAE – cuprinde virusuri mici (18-26 nm) fără anvelopă, genom ss. Infectează celulele stem ale
măduvei osoase hematogene determinând boli hematologice.
  
 2. Familia PAPOVAVIRIDAE – include virusuri grupate în:
 subfamilia Polymixovirinae care determină tumori cu multiple localizări
 subfamilia Papillomavirinae ce determină veruci sau papiloame cutanate
 Sunt virusuri cu diametrul de 40-50 nm fără anvelopă, cu o capsidă icosaedrică şi un genom ADN ds circular.
  
 3. Familia ADENOVIRIDAE – cuprinde agenţi virali cu tropism adeno-faringo-conjunctival. Sunt virusuri cu diametrul
65-85 nm, fără anvelopă, ce au capsidă icosaedrică şi genom ds circularizat.
  
 4. Familia HEPADNAVIRIDAE – conţine virusuri cu tropism hepatic (virusul hepatitei B la om) cu diametrul 42 nm,
genom parţial ds, aproape circular.
  
 5. Familia HERPESVIRIDAE include 8 reprezentanţi cu importanţă maximă în patologia umană: virusurile herpes
simplex tip 1 şi 2 (HSV 1 şi 2), virusul citomegalic (CMV sau Human Herpes Virus 3 – HHV-3), virusul varicelo-zosterian
(HHV-4), virusul Epstein-Barr (HHV-5) şi HHV 6,7,8.
 Sunt virusuri anvelopate cu învelişuri suplimentare pericapsidare, cu diametrul variabil între 120-300 nm, capsida cu
simetrie icosaedrică genom linear ds.
  
 6. Familia POXVIRIDAE – include: virusul vaccinia, virusul variolic, virusul Molluscum contagiosum,
contagiosum, agenţii Orf
(parvaccinia). Sunt virusuri mari cu diametrul 200-350 nm cu anvelopă, de formă paralelipipedică.
Morfologia virusurilor
 Morfologia virusurilor
 Forma virusurilor
 cilindrică – de exemplu unele virusuri vegetale de tipul virusului
mozaicului tutunului;
 sferoidală – de exemplu virusurile gripale;
 cristaliformă (poliedrică) – de exemplu enterovirusurile;
 prismă sau cărămidă – de exemplu poxvirusurile.
Figure 1 An array of viruses. (a) The helical virus of rabies. (b) The segmented
helical virus of influenza. (c) A bacteriophage with an icosahedral head and
helical tail. (d) An enveloped icosahedral herpes simplex virus. (e) The
unenveloped polio virus. (f) The icosahedral HIV with spikes on its envelop
MICROSCOPIA ELECTRONICĂ
 MICROSCOPIA ELECTRONICĂ

Virusul Pox Virusul HIV (ME prin baleiaj)

Virusul
Virusul rubeolic Virusul hepatitic A stomatitei veziculoase
 ADN VIRUSURI

Parvo virus adenovirus Papillomavirus

Hepatitis B virus

Molluscum contagiosum
(Pox virus)
Herpesvirus
 ARN VIRUSURI

Enterovirus Influenza viruses Paramyxovirus

Rotavirus
 Morfologia virusurilor
 Structura virală
 Virionul, denumit şi particulă virală elementară, este alcătuit dintr-un miez genomic, capsidă şi uneori
anvelopa (peplos):
 a) Miezul genomic (genomul viral, nucleoidul) este alcătuit din ADN sau ARN cu structură
polinucleotidică. Conţine informaţia genetică necesară pentru multiplicarea virală şi devierea
metabolismului celulei gazdă în sensul sintezei constituenţilor virali;
 Genomul ADN poate fi simplu (ss) sau dublu (ds) spiralat, linear, circular sau supraânfăşurat;
 Genomul ARN poate fi ss sau ds, continuu sau fragmentat. Unele virusuri cu genom ARNss pot fi cu
polaritate pozitivă când genomul serveşte ca ARNm sau cu polaritate negativă când numai spira
complementară poate să funcţioneze ca ARNm .
 Acidul nucleic viral conţine suportul infectivităţii virale.
 b) Capsida reprezintă învelişul extern al genomului viral, pe care îl protejează. Este formată din
subunităţi identice denumite capsomere. Din punct de vedere structural acestea sunt alcătuite din:
proteine simple (ex. virusul polio), hetero-proteine (ex. virusul gripal) sau glicoproteine virale (ex.
HIV).
 Genomul viral împreună cu capsida alcătuiesc nucleocapsida. Acestea sunt elemente structurale
obligatorii ale particulei virale.
 c) Învelişul (peplos, manta, anvelopă) este un element structural facultativ, fiind alcătuit din
subunităţi denumite peplomere, de natură proteică. Este prezent la unele virusuri, de exemplu HIV,
virusul gripal, etc. Proteinele componente ale învelişului extern sunt evidenţiate la microscopul
electronic ca nişte proiecţii pe suprafaţa virionului. Aceste proteine reprezintă material viral propriu sau
material celular “împrumutat” de la celula gazdă, de exemplu lipoproteine, glicoproteine. Exemple:
glicoproteinele 120, 41 ale HIV-ului şi hemaglutinina, neuraminidaza prezente la virusurile gripale.
Învelişul viral păstrează stabilitatea nucleocapsidei şi asigură fixa rea virionului pe celula gazdă pe care
o infectează.
infectează.
 Tipu

Structura virala
Structura virală
 b) Capsida reprezintă învelişul extern al genomului viral, pe care îl
protejează. Este formată din subunităţi identice denumite capsomere. Din
punct de vedere structural acestea sunt alcătuite din: proteine simple (ex.
virusul polio), hetero-proteine (ex. virusul gripal) sau glicoproteine virale
(ex. HIV).
 Genomul viral împreună cu capsida alcătuiesc nucleocapsida. Acestea
sunt elemente structurale obligatorii ale particulei virale.
 c) Învelişul (peplos, manta, anvelopă) este un element structural
facultativ, fiind alcătuit din subunităţi denumite peplomere, de natură
proteică. Este prezent la unele virusuri, de exemplu HIV, virusul gripal,
etc. Proteinele componente ale învelişului extern sunt evidenţiate la
microscopul electronic ca nişte proiecţii pe suprafaţa virionului. Aceste
proteine reprezintă material viral propriu sau material celular “împrumutat”
de la celula gazdă, de exemplu lipoproteine, glicoproteine. Exemple:
glicoproteinele 120, 41 ale HIV-ului şi hemaglutinina, neuraminidaza
prezente la virusurile gripale. Învelişul viral păstrează stabilitatea
nucleocapsidei şi asigură fixarea virionului pe celula gazdă pe care o
infecteaza
Viral Structure

Nucleic acid
Nucleocapsid
Capsid

Envelope protein
Viral envelope**
Membrane
protein
 Viral Structure
 Varies in size, shape and symmetry
 VIP for classification
 3 types of capsid symmetry:
• Cubic (icosahedral)
 Has 20 faces, each an equilateral triangle. Eg. adenovirus
• Helical
 Protein binds around DNA/RNA in a helical fashion eg.
Coronavirus
• Complex
 Is neither cubic nor helical eg. poxvirus
 Basic virus structure

 Nucleoprotein:
• Helix: capsomers associate with helical nucleic
acid
• Icosahedron: the capsomers form a regular solid
structure enfolding the viral genome

 Each type of virus has unique arrangement of the

capsid around its viral genetic material.

 Capsid is a fundamental criterion in the classification

of viruses
Basic virus structure
Basic virus structure
 Structura virala

Virus gripal

Virus HIV
 Simetrie virala
 Tipuri de simetrie virală
 Capsomerele se pot aşeza spaţial în trei modele de simetrie
virală:
 simetrie helicoidală (helicală): acidul nucleic este situat
central răsucit ca o elice, iar capsomerele identice sunt
aşezate metameric. Exemple: virusul mozaicului tutunului,
virusurile gripale, virusul rabic.
 Simetrie icosaedrică (cubică): capsomerele sunt aşezate
după axe de simetrie riguroase (dictate de genom), realizând
în spaţiu o figură geometrică denumită icosaedru (figură
geometrică cu 12 vârfuri, 20 de feţe cu formă de triunghi
echilateral şi 30 de muchii). Conturul nucleocapsidei privită
în plan apare ca un hexagon. Exemple: enterovirusuri,
adenovirusuri, herpesvirusuri.
 Simetrie mixtă (complexă) – prezentă la poxvirusuri.
Simetrie virala
Enveloped helical virus Enveloped icosahedral virus
Virusuri bacteriene-Bacteriofagii
 Morfologia tipică a bacteriofagilor constă în prezenţa capului
(gâtului) şi a cozii.
 CAPUL – este format dintr-un miez de acid nucleic ADN sau ARN
care reprezintă 50 % din greutatea uscată a bacteriofagului se
găseşte capsida formată din capsomere identice aşezate sub
formă de prismă hexagonală.
 GÂTUL – face legătura dintre cap şi coadă.
 COADA – este formată în general din trei părţi:
o miezul lacunar;
o teaca contractilă;
o placa bazală (terminală) care poartă ataşate fibrele cozii.
Există şi forme atipice de bacteriofagi de exemplu: bacteriofagi lipsiţi
de coadă, bacteriofagi filamentoşi.
Virusuri bacteriene
DIAGNOSTICUL
VIRUSOLOGIC
Metode de diagnostic virusologic
1. Evidențierea directă a virusurilor – ME,
imunofluorescență, identificarea antigenelor
virale

2. Izolarea virusurilor

3. Diagnostic imunobiologic – evidențierea

răspunsului imun umoral și celular
Evidențierea directă a virusurilor
1. Detectarea antigenelor virale: imunofluorescență, ELISA etc.

2. Microscopia electronică: morfologia particulelor virale imuno-

electrono-microscopie

3. Microscopie optică: evidențierea incluziilor virale

intracelulare

4. Detectarea genomului viral: hibridizarea cu sonde de acizi nucleici,

reacția de polimerizare în lanț
(PCR)
 Microscopia electronica

Pentru vizualizare e necesara o concentratie de 106 particule de virus pe

ml, în mod normal se foloseste o marire de 50.000 – 60.000 ori. Viruşii
pot fi detectate în următoarele specimene:

Fecalele: rotavirus, Adenovirus, virus Norwalk, Astrovirus, calicivirusul

Fluid vezicular: virusul Herpes Simplex, virusul varicella-zoster

Raclaj cutanat: papilomavirus, virusuri ORF, virusul molluscum

contagiosum
 Microscopia electronică

Adenovirus Rotavirusului
 Imuno-Electrono-
Microscopia
Sensibilitatea şi specificitatea EM poate fi îmbunătățită
prin imunoelectronomicroscopie. Există două variante:

Microscopia clasice de electroni imunitar (IEM) - proba este

tratat cu specifice anti-seruri înainte de a fi pus în EM.
Particule virale prezente vor fi agglutinated şi, astfel, aduna
împreună de anticorpi.
Solid phase microscopie imunitar de electroni (SPIEM) - reţea
este acoperit cu specifice anti-seruri. Virus particule prezentă
în eşantion va fi absorbită pe grila de anticorpi.
 Dezavantaje ale microscopiei
electronice
 Aparatura este extrem de scumpa
 Intretinerea aparaturii este
costisitoare
 ONU Necesita Experienţă personală
cu
 Adesea sensibilitatea este slaba
Izolarea virusurilor
Metode de cultivare a virusurilor

 Izolarea pe culturi celulare

 Izolarea pe ou embrionat de găină

 Izolarea pe animale de laborator

 Metode de cultivare a virusurilor
1. Culturi celulare: linii celulare (rinichi de câine, Hibridoma)
Evidențierea efectelor virus specifice: efect
citopatic, efect hemadsorbant, efect
transformat, efect de interferență
Evidențierea virusurilor prin imunofluorescență

2. Cultivare pe ouă embrionate: moartea embrionului, leziuni aparute pe membrana

corioalantoidiana, efectul hemadsorbant al
lichidului amniotic/alantoidian

3. Izolarea pe animale de laborator: apariția unor leziuni virus specifice, moartea

animalului
 Izolarea virusurilor

Există 3 tipuri principale de culturi celulare:

1. Linii celulare primare – ex. Rinichi de maimuță, rinichi de câine
2. Linii celulare semi-continue – ex. rinichi embrionar uman,
fibroblaste dermice
3. Linii celulare continue – ex. HeLa, Vero, Hep2, LLC-MK2, MDCK

Culturile celulare primare sunt cele mai bune deoarece pot servi pentru
izolarea unei game largi de virusuri. Însă sunt scumpe și greu de obținut
în cantități mari. Liniile celulare continue sunt ușor de întreținut, dar gama
de virusuri ce pot fi izolate este destul de restrânsă.
IZOLAREA PE CULTURI CELULARE
 Efecte virus-specifice pe
culturile celulare

Virusurile ce cresc pe culturile celulare pot produce:

1. Efect citopatic (ECP) – efect balonizant, formarea de sinciții sau
moartea celulelor. Efectul citopatic poate fi specific sau nespecific.
2. Efect hemadsorbant – celulele sunt capabile să lege eritrocitele de

mamifere. Ex – virusurile gripale.

3. Efect transformant – celulele din cultură se malignizează. Ex. virusurile

4. Efect de interferență – infecția cu un virus împiedică apariția efectului

infecției cu cel de-al doilea virus. Ex –

Identificarea virusului izolat se poate face prin reacțiile de neutralizare,
inhibare a hemaglutinării sau imunofluorescență.
 IZOLAREA PE CULTURI CELULARE

Linie celulară MCF7 Linie celulară osteosarcom

Linie celulară
fibroblasti de soarece
 Incluzii virale

Incluzii nucleare în microglii

v. herpes simplex, ctomegalovirusul, v. varicella-zoster,
papovavirusurile, v. rujeolos.
Incluzii nucleare în infecţia cu CMV
Celule în “ochi de bufniţă”.

Incluzii celulare Incluzii celulare

V. rujeolos Corpi Negri in neuronii infectati cu v. rabic
 Efecte virus specifice

Efect citopatic CMV Efect citopatic Virus varicelo

zosterian-balonizare

(Courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)

 Efectul citopatic

Efectul citopatic al enterovirusului 71 și virusului herpetic – balonizarea celulelor.

Efectul citopatic

Efectul citopatic cu formare de

sinciții – virusul respirator
sincițial VRS (sus)Și virusul
rujeolos (jos)
 Efectul citopatic

Efectul citopatic al enterovirusului 71 și virusului herpetic – balonizarea celulelor.

Efectul citopatic

Efectul citopatic cu formare de

sinciții – virusul respirator
sincițial VRS (sus)Și virusul
rujeolos (jos)
 Efectul hemadsorbant

Efectul citopatic cu formare de sinciții produs de virusul urlian și

hemadsorbția eritrocitelor pe suprafața stratului celular.
 Dezavantaje ale culturilor
celulare
 Perioada lungă (până la 4 săptămâni) necesară pentru
obținerea rezultatului
 Sensibilitate slabă: sensibilitatea depinde în mare măsură
de starea probei.
 Sunt susceptibile la contaminare cu bacterii.
 Sunt sensibile la substanțe toxice ce pot fi prezente în
probă.
 Multe virusuri nu pot crește în culturi celulare – ex. virusul
hepatititic B, virusurile diareigene, parvovirusurile,
virusurile papilomului uman (VPU/HPV)
 Tehnici rapide de cultivare

Exista Tehnici de cultivare de îngrijire rapidă prin care

agenții virali sunt detectați în 2-4 zile de la inoculare.
De exemplu prin testul CMV DEAFF:
 Cultura de celule este realizată într-un flacon de plastic
 După inoculare, flaconul este centrifugat la viteza mica timp
de o oră (pentru a accelera adsorbţia virusului) şi apoi incubat
timp de 2 până la 4 zile.
 Vasele sun scoase din incubator şi examinate pentru prezenţa
de antigene precoce CMV prin imunofluorescenţă.
Testul DEAFF pentru CMV
 Virusuri izolate pe culturi
celulare
Virusuri izolate uşor pe Virusuri izolate mai rar
culturi celulare
Virusul Herpes Simplex Varicela-Zoster
Citomegalovirus Virusul rujeolos
Adenovirus Virusul rubeolos
Poliovirusuri Rinovirusuri
Virusurile Coxsackie A Virusurile Coxsackie A
Virusurile ECHO
Virusurile gripale
Virusurile paragripale
Virusul urlian
Virusul respirator sinciţial
INOCULAREA PE OU
INOCULAREA PE OU

Embrion mort

Embrion viabil
INOCULAREA PE ANIMAL
 Acute Hepatitis B Virus Infection with Recovery
Typical Serologic Course
Symptoms
HBeAg anti-HBe

Total anti-HBc
Titre

HBsAg IgM anti-HBc anti-HBs

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 100

Weeks after
 Hepatitis A Infection
Typical Serological Course
Symptom Total anti-
s
HAV

Titre ALT

Fecal
HAV
IgM anti-HAV

0 1 2 3 4 5 6 12 24
Months after exposure
 Complement Fixation Test

Complement Fixation Test in Microtiter Plate. Rows 1 and 2 exhibit complement

fixation obtained with acute and convalescent phase serum specimens,
respectively. (2-fold serum dilutions were used) The observed 4-fold increase is
significant and indicates recent infection.
 ELISA

Microplate ELISA : coloured wells indicate reactivity

HEMAGLUTINARE PASIVĂ
 Western Blot

HIV-1 Western Blot

 Lane1: Positive Control
 Lane 2: Negative Control
 Sample A: Negative
 Sample B: Indeterminate
 Sample C: Positive
Diagnostic rapid pe baza detectării
antigenelor virale
Aspirat nazo-faringian
RSV
Virus gripal de tip A şi B
Parainfluenza
Adenovirus
Materii fecale:
Rotaviruses
Adenoviruses
Astrovirus
Piele
HSV
VZV

Sânge
CMV (Ag pp65)
Imunofluorescență

Test pozitiv de imunofluorescenţă

pentru antigenului virusului rabic
(Sursa: CDC)
Testarea antigenului
pp65 al CMV
 Avantajele şi dezavantajele

Avantajele
 Rezultatul disponibile rapid, de obicei, în câteva ore.

Potenţiale probleme
 Deseori, sensibilitate foarte mult redusă în comparaţie cu culturi
de celule, poate fi la fel de mici ca 20%. Specificitatea de multe
ori săraci, de asemenea.
 Necesită specimene bun.
 Procedurile implicate sunt de multe ori plictisitor si
consumatoare de timp şi, astfel, scumpe în termeni de timp de
laborator.
Specimenele de rutină, teste de

Clinical Category Blood Throat Faeces CSF Other

swab
1. Meningitis + + + +
2. Encephalitis + + + + Brain biopsy
3. Paralytic disease + + + +
4. Respiratory illness + + Nasopharyngeal aspirate
5. Hepatitis +
6. Gastroenteritis +
7. Congenital diseases + Urine, saliva
8. Skin lesions + + Lesion sample e.g. vesicle
fluid, skin scrapping
9. Eye lesions Eye swab
10.Myocarditis + Pericardial fluid
11.Myositis + +
12.Glandular fever +
13.Post Mortem + Autopsy

After use, swabs should be broken into a small bottle containing 2 ml of virus transport medium.
Swabs should be sent to the laboratory as soon as possible without freezing. Faeces, CSF, biopsy or
autopsy specimens should be put into a dry sterile container.
 Metodele Moleculara

 Metode bazate pe detectarea genomului viral sunt, de asemenea,

cunoscute ca metode moleculare. Se spune adesea că metodele
moleculară este direcţia viitoare a diagnosticului virale.
 Cu toate acestea, în practică, deşi utilizarea acestor metode este
în creştere, într-adevăr, rolul jucat de metode moleculare într-un
laborator de rutină virus de diagnosticare este încă mic în
comparaţie cu metodele convenţionale.
 Cert este că, deşi rolul de metode moleculare va creşte rapid în
viitorul apropiat.
 Classical Moleculară Tehnici
de
 Dot-blot, Southern blot, in-hydridization in situ sunt
exemple de tehnici clasice. Ele depind de utilizare a ADN-
ului specifice / sonde de ARN-ului pentru hibridizare.
 Specificitatea reacţiei depinde de condiţiile de utilizat pentru
hibridizare. Cu toate acestea, sensibilitatea acestor tehnici nu
este mai bun decât metodele convenţionale virale de
diagnosticare.
 Cu toate acestea, deoarece acestea sunt de obicei mai
plictisitor şi mai costisitoare decât tehnici convenţionale, nu
au găsit de acceptare pe scară largă.
 Reacţie în lanţ a polimerazei (1)

 PCR permite amplificarea in vitro a specifice secvenţe ADN-ţintă cu un factor

de 106 şi este, aşadar, o tehnică extrem de sensibilă.
 Ea se bazează pe o reacţie enzimatică care implică utilizarea de oligonucleotides
sintetice flanca ţintă secvenţa nucleic de interes.
 Oligonucleotides Acestea acţionează ca grunduri pentru polimerazei termostabil
Taq. Cicluri repetate (de obicei 25 - 40) din denaturarea Template ADN-ului (la
94oC), recoacere de primeri pentru secvenţe complementare acestora (50oC), şi
extinderea primer (72oC), rezultat în producţia exponenţială a fragmentului ţintă
specifice.
 Sensibilitatea şi specificitatea suplimentare pot fi obţinute de către PCR
imbricate.
 Detectarea şi de identificare a produsului PCR este de obicei efectuată de către
agaroză electroforeză gel, hibridare cu o sondă oligonucleotidului specifice,
restricţii enzimă analiză, sau de secventiere ADN-ului.
De reacţie în lanţ a polimerazei (2)

 Avantaje al PCR:
• Extrem de sensibilitate ridicată, poate detecta în jos pentru a genomului viral pe un
eşantion de volum
• Uşor de configurat
• Fast timpul de răspuns
 Dezavantaje al PCR
• Extrem de natură să contaminare
• Înalt grad de calificare necesară operatorului
• Nu este uşor să creeze un test cantitativ.
• Un rezultat pozitiv poate fi dificil de interpretat, în special cu virusuri latente, cum ar
fi de CMV, în cazul în care orice persoană seropozitivi vor avea prezenta virusului in
sange, indiferent dacă aceştia au sau nu boala.
 Aceste probleme sunt abordate de sosirea comerciale sisteme inchise, cum ar fi Cobas
Roche Amplicor care necesită manipulare minime. Utilizarea sintetice obiective interne
competitive în aceste teste comerciale, a facilitat o cuantificare precisă a rezultatelor. Cu
toate acestea, aceste analize cantitative sunt foarte scumpe.
Schematică a reacției PCR

Fiecare ciclu dublează numărul de copii al ţintei

 Alte tehnici moleculare noi
 ADN-ul ramificat este, în esenţă o tehnica de sensibile hydridization care implică
amplificare liniară. Întrucât amplificare exponenţială are loc în PCR.
 Prin urmare, sensibilitatea de minciuni bDNA între tehnicilor de amplificare a
clasică şi PCR. De alte tehnici de Newer moleculare depinde de o anumită formă
de amplificare.
 Comerciale tehnici de proprietate, cum ar fi LCR, NASBA, TMA depinde de
amplificarea exponenţială a semnalului sau ţintă.
 Prin urmare, aceste tehnici sunt la fel de sensibile la contaminarea ca PCR şi
împărtăşesc aceleaşi avantaje şi dezavantaje.
 PCR şi tehnici legate sunt obligate să joace un rol din ce în ce mai important în
diagnosticul de infecţii virale.
 Cip ADN-ul este o altă tehnologie promiţătoare în cazul în care ar fi posibil
pentru a detecta un număr mare de viruşi, potenţialul lor patogene, precum şi
sensibilitatea lor de droguri, în acelaşi timp.
 Comparaţie între PCR şi alte tehnici de
amplificare a acizilor nucleici

Target Signal Commercial

Method Amplification Amplification Thermocycling Sensitivity Examples

PCR Exponential No Yes High Roche Amplicor

LCR No Exponential Yes High Abbot LCX

NASBA Exponential No No High Organon Teknika

TMA Exponential No No High Genprobe

Qß-Replicase No Exponential No High None

Branched DNA No Linear No Medium Chiron Quantiplex