11

PROBLEME DE DIAGNOSTIC

IMUNOFLUORESCENA DIRECT O ABORDARE ACTUALIZAT A APLICAIILOR I TEHNICII N PEMFIGUSURI

Direct immunofluorescence an updated view on the technique and applications in pemphigus
Dr. Adina Alexandru, Dr. Carmen Maria Slvstru, Dr. Rzvan Andrei, Dr. Tiberiu Tebeica, Dr. Sabina Zurac, Dr. Florica Stniceanu, Prof. Dr. George-Sorin iplica Spitalul Colentina, Bucureti

REZUMAT
Imunouorescena reprezint un instrument util n diagnosticul i monitorizarea evoluiei pemgusurilor. Prin efectuarea imunouorescenei directe a fost evideniat prezena depozitelor imune cu dispunere specic att la nivel cutanat, ct i la nivelul folicului pilos anagen n cazul pacienilor cu pemgus vulgar. Utilizarea folicului pilos ca substrat pentru efectuarea imunouorescenei directe are potenialul de a nlocui fragmentele cutanate sau mucoase prelevate prin biopsie, dar este necesar investigarea unui numr mai mare de pacieni pentru validarea metodei. Cuvinte cheie: imunouorescen, pemgus, folicul pilos

ABSTRACT
Immunouorescence is an useful tool for diagnosing and monitoring disease remission in pemphigus group of disorders. We demonstrated the presence of characteristic immune deposits by performing direct immunouorescence both on skin fragments and anagen hair follicles in pemphigus vulgaris patients. Using the hair follicles as an alternate substrate for direct immunouorescence has the potential of substituting skin or mucosal fragments taken by biopsies but a larger number of cases is needed in order to validate the method. Key words: immunouorescence, pemphigus, hair follicle

INTRODUCERE
Imunouorescena reprezint o tehnic de imunohistochimie prin marcare cu compui uoresceni, utilizat pentru demonstrarea prezenei anticorpilor xai la nivelul esuturilor sau circulani n uidele organismului. Aceast metod este utilizat n dermatologie att pentru investigarea ziopatologiei afeciunilor cutanate, ct i n scop diagnostic n multiple patologii, cu o valoare semnicativ mai ales n cazul afeciunilor buloase autoimune i a bolilor autoimune de esut conjunctiv. Imunouorescena direct (IFD) este o procedur ce determin identicarea anticorpilor legai de

antigene tisulare utiliznd un fragment de esut obinut de la pacient. n mod clasic se descriu dou tipuri de probe ce pot examinate prin IFD, respectiv fragmente de tegument sau mucoase prelevate prin biopsie. IFD este o metod extrem de valoroas pentru conrmarea unui diagnostic de suspiciune i pentru efectuarea diagnosticului diferenial ntre maladiile imunobuloase. Imunouorescena indirect (IFID) este util n situaiile n care metoda direct este negativ sau nespecic (1). Diagnosticul pemgusurilor Pemgusurile sunt afeciuni buloase autoimune caracterizate de apariia autoanticorpilor ndreptai

Adresa de coresponden: Dr. Adina Alexandru, Spitalul Clinic Colentina, os. Stefan cel Mare Nr. 19-21, Bucureti e-mail: dr_adinaalexandru_ro@yahoo.com

230

REVISTA MEDICAL ROMN VOLUMUL LIX, NR. 3, An 2012

REVISTA MEDICAL ROMN VOLUMUL LIX, NR. 3, An 2012

231

mpotriva unor proteine desmozomale keratino-citare, n principal desmogleina 3 i 1. Diagnosticul de pemgus se stabilete pe baza examinrii clinice, a examenului histopatologic i este conrmat prin imunouorescen. Depunerea de IgG la nivel intercelular reprezint marca pemgusurilor (cu excepia pemgusului cu IgA) i testarea prin IFD este pozitiv n 90-100% dintre cazurile de boal activ dac fragmentul de esut este prelevat corespunztor (1). Pattern-ul de uorescen apare sub forma unor depozite liniare tipice pe suprafaa keratinocitar, descris clasic sub form de reea. Valoarea predictiv pozitiv a IFD pentru diagnosticul pemgusurilor este de aproximativ 100%, n sensul c n cazul pozitivrii acestui test probabilitatea conrmrii diagnosticului de pemgus este de circa 100% (1). Valoarea predictiv negativ se refer la situaia n care un pacient cu un rezultat negativ al testrii nu prezint boala. n cazul pemgusurilor aceast valoare se situeaz la circa 8590%, deoarece exist posibilitatea apariiei unor rezultate fals negative (1). IFD efectuat pe folicul pilos n pemgusuri Desmogleinele 3 i 1, proteine transmembranare din familia caderinelor, au fost identicate att la nivelul epidermului interfolicular, ct i la nivelul foliculului pilos (FP), cu o dispunere specic diferenierii (2,3): desmogleina 1 se exprim la nivelul tecii epiteliale interne (TEI) i straturilor interne ale tecii epiteliale externe (TEE), desmogleina 3 se exprim la nivelul tuturor straturilor TEE. Prezena depozitelor imune specice pemgusului la nivelul FP a fost demonstrat anterior (4-7) prin efectuarea IFD. Cercetare personal Au fost analizate 9 cazuri de pemgus vulgar (PV): 3 cazuri la debut nainte de iniierea terapiei, 5 pacieni cu boal activ n curs de tratament i un caz n remisiune clinic. Pentru ecare pacient s-au prelevat biopsii cutanate pentru efectuarea examenului histopatologic i a IFD convenionale cutanate. S-au prelevat, de asemenea, re de pr anagene de la nivelul scalpului pentru efectuarea IFD pe FP. Prin IFD s-a evaluat exprimarea IgA, IgM, IgG, C3 i brinogen, att la nivel cutanat, ct i la nivelul FP. n cazul unui pacient s-au prelevat i re de pr axilare i inghinale ce au fost testate prin IFD.

i al FP n toate cazurile de pemgus investigate (Fig. 1, 2). Depozitele de C3 au fost identicate n FP ntr-un procent mai mic dect la nivel cutanat i cu o intensitate mai sczut a uorescenei. Cu toate acestea, aspectul n reea pentru IgG evideniat la nivelul FP a prezentat caractere specice pentru diagnosticul de pemgus, similar aspectului IFD efectuat pe fragmente cutanate. Testarea pentru IgA, IgM, brinogen a fost negativ (Fig. 3).

FIGURA 1. IFD cutanat depozite IgG cu aspect de reea

FIGURA 2. IFD folicul pilos depozite IgG cu aspect de reea

REZULTATE
Depozitele imune de IgG cu dispunere caracteristic n reea au fost identicate la nivel cutanat
FIGURA 3. IFD pe folicul pilos rezultat negativ

232

REVISTA MEDICAL ROMN VOLUMUL LIX, NR. 3, An 2012

DISCUII
Sensibilitatea diagnostic a IFD pe FP la cazurile investigate, comparativ cu testarea cutanat, este similar, dar n mod evident este necesar investigarea unui lot lrgit de pacieni n scopul validrii metodei. Este remarcabil concordana rezultatelor obinute n contextul includerii n lotul de pacieni investigat a forme diferite de PV din punct de vedere al duratei de evoluie: att cazurile la debut, ct i cele cu evoluie mai ndelungat sau chiar n remisiune clinic i sub tratament la momentul examinrii au prezentat rezultate pozitive. Prelevarea relor de pr a fost efectuat de la nivelul scalpului, indiferent dac pacienii prezentau sau nu leziuni vizibile la acest nivel. Apariia acantolizei i clivajului suprabazal, caracteristice PV, este evideniabil la nivelul epiteliului folicular i poate constitui un indiciu preliminar pentru diagnosticul precoce al acestei afeciuni la examinarea histopatologic, ntruct poate limitat strict la acest nivel, fr a regsit la nivelul epidermului (8). Pozitivarea IFD efectuat pe FP prelevat de la nivelul scalpului ar putea evideniat att la pacienii care prezint leziuni ale scalpului, ct i n cazul n care nu se constat prezena acestor leziuni, n condiiile n care boala este imunologic activ. n cazul unui pacient cu PV la debut a fost efectuat IFD pe FP recoltnd re de pr att de la nivelul scalpului, ct i de la nivel axilar i inghinal. Rezultatele au fost pozitive pentru toate tipurile de re recoltate, dar cu o intensitate mai sczut a uorescenei la nivelul relor axilare i inghinale comparativ cu cele de la nivelul scalpului, constatare explicabil prin prisma cantitii mari de antigene specice PV de la nivelul scalpului comparativ cu alte zone anatomice (9). Nu au fost testate prin aceast metod alte forme clinice de pemgus. Raportri anterioare (7) relev faptul c aspecte similare pentru IFD au fost identicate i n cazuri de pemgus vegetant, foliaceu sau eritematos. IFD pe FP n PV aat n remisiune clinic A fost testat prin IFD efectuat pe FP recoltat de la nivelul scalpului un pacient aat n remisiune clinic la momentul investigrii, diagnosticat anterior cu PV i aat la momentul testrii n curs de tratament cu o doz sczut de corticosteroizi sistemici. Testarea a fost pozitiv pentru IgG. Acest rezultat demonstreaz faptul c afeciunea se aa n remisiune clinic, dar nu imunologic. Aceast constatare poate pune n discuie valoarea efecturii IFD pe folicul pilos n cazul

monitorizrii remisiunii clinice i imunologice la pacienii cu pemgus. Monitorizarea remisiunii n pemgusuri i decizia de ntrerupere a terapiei se bazeaz pe criterii clinice sau/i imunologice, opiunea clinicianului ind la baza acestei decizii. Din punctul de vedere al monitorizrii remisiunii imunologice, clasic efectuat prin IFID, aceasta se poate realiza, conform studiilor publicate, prin IFD, ntr-un mod chiar mai ecient dect prin IFID (10). Managementul acestor pacieni presupune inducerea remisiunii clinice i imunologice a bolii prin terapia instituit, pentru ca ulterior aceasta s poat ntrerupt i reiniiat n cazul recderii. Un studiu recent (11) investigheaz posibilitatea efecturii IFD pe FP (re de pr anagen recoltate de la nivelul scalpului) n scopul monitorizrii remisiunii imunologice a pemgusurilor, analiznd 55 de pacieni diagnosticai cu PV, aai n remisiune clinic i n curs de tratament de ntreinere, prin efectuare att a IFD pe FP, ct i IFD convenional (piele sau mucoase). IFD efectuat pe FP a fost pozitiv n 65,5% din totalul pacienilor pe cnd IFD convenional a fost pozitiv n 50,9% dintre cazuri. Prin urmare, au existat cazuri n care, dei IFD convenional era negativ, activitatea imunologic era nc prezent i relevat de pozitivarea IFD pe FP. n aceste situaii ntreruperea tratamentului doar pe baza rezultatului IFD convenional ar fost prematur. Manevra de prelevare a relor de pr este facil, nedisconfortant pentru pacient i mai ieftin dect efectuarea biopsiilor cutanate sau mucoase, aplicabil i n cazul pacienilor la care biopsiile sunt dicile (copii, localizri mucoase, aduli necooperani). Astfel, acest tip de testare ar putea utilizat ca metod diagnostic sau de monitorizare prin IFD a remisiunii imunologice n pemgusuri fr a exista dicultatea efecturii biopsiilor seriate.

CONCLUZII
Aceste constatri preliminare necesit investigare suplimentar prin constituirea unor loturi lrgite de pacieni astfel nct metoda sa poat vericat din punct de vedere al sensibilitii n diagnosticul i monitorizarea remisiunii imunologice n pemgusuri. Avantajele utilizrii unei astfel de metode sunt prelevarea facil a probelor comparativ cu IFD convenional sau chiar o posibil sensibilitate mai mare a acestui tip de testare comparativ cu testarea cutanat sau mucoas n cazurile de pemgus n re misiune clinic.

REVISTA MEDICAL ROMN VOLUMUL LIX, NR. 3, An 2012 BIBLIOGRAFIE

1. Mutasim D.F., Adams B.B. Immunouorescence in dermatology. J Am Acad Dermatol 2001; 45:803-822 2. Wu H., Stanley J.R., Cotsarelis G. Desmoglein isotype expression in the hair follicle and its cysts correlates with type of keratinization and degree of differentiation. J Invest Dermatol 2003; 120:1052-7. 3. Wilson C.L., Dean D., Wojnarowska F. Pemphigus and the terminal hair follicle. J Cutan Pathol 1991; 18:428-31 4. Schaerer L., Trueb R.M. Direct immunouorescence of plucked hair in pemphigus. Rao R., Shenoi S.D., Balachandran C. Arch Dermatol 2003; 139:228-9 5. Demonstration of pemphigus specic immunouorescence pattern by direct immunouorescence of plucked hair. J Am Acad Dermatol 2008; 58:AB85. 6. Daneshpazhooh M., Asgari M., Naraghi Z.S. et al. A study on plucked hair as a substrate for direct immunouorescence in pemphigus vulgaris. J Eur Acad Dermatol Venereol 2009; 23:129-31

233

7. Kumaresan M., Rai R., Sandhya V. Immunouorescence of the outer root sheath: an aid to diagnosis in pemphigus. Clin Exp Dermatol 2011; 36(3):298-301 8. Mahalingam M. Follicular acantholysis: a subtle clue to the early diagnosis of pemphigus vulgaris. Am J Dermatopathol 2005; 27:237-239 9. Ioannides D., Hytiroglou P., Phelps R.G., Bystryn J.C. Regional variation in the expression of pemphigus foliaceus, pemphigus erythematosus and pemphigus vulgaris antigens in human skin. J Invest Dermatol 1991; 96; 159-161 10. David M., Weissman-Katzenelson V., Ben-Chetrit A. et al. The usefulness of immunouorescent tests in pemphigus patients in clinical remission. Br J Dermatol 1989; 120:391-5. 11. Daneshpazhooh M., Zahra S., Naraghi Z.S. et al. Direct immunouorescence of plucked hair for evaluation of immunologic remission in pemphigus vulgaris. J Am Acad Dermatol 2011 June 21, ahead of print, doi:10.1016/j.jaad.2010.09.721