UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE ,,GR. T.

POPA IAI FACULTATEA DE FARMACIE

DEZVOLTAREA I VALIDAREA METODEI DE DETERMINARE A ETANOLULUI PRIN GC-HS I STUDII PRIVIND DOZAREA ETANOLULUI DIN DIFERITE FLUIDE BIOLOGICE PRIN GC-HS
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conductori tiinifici PROF. DR. ELENA BUTNARU PROF. DR.VASILE ASTRSTOAE Doctorand DIANA FILARET DORUBE

IAI 2011

Decizia de numire a comisiei nr. 22083 din 13.10.2011 Data susinerii publice 09.12.2011

Cuprinsul tezei de doctorat

I. Introducere. Obiectivele propuse STADIUL CUNOATERII II. Consideraii generale privind alcoolul etilic II.1. Alcoolul etilic i clasificarea buturilor alcoolice II.2. Proprieti fizico-chimice. Prepararea alcoolului etilic. Etanolul-carburant II.3. Evaluarea toxicologic a etanolului II.3.1. Particulariti toxicocinetice II.3.2. Particulariti toxicodinamice II.3.3. Simptomatologia II.3.3.1. Intoxicaia acut II.3.3.2. Intoxicaia cronic (alcoolismul) II.4. Situaia consumului de alcool n lume II.5. Situaia consumului de alcool n Uniunea European II.5.1. Impactul alcoolului asupra Europei II.5.2. Patologia generat de consumul de alcool n Uniunea European II.5.3. Alcoolul i economia Europei II.5.4. Folosirea alcoolului n Europa II.6. Situaia consumului de alcool n Romnia II.6.1. Morbiditatea generat de consumul de alcool n Romnia II.6.2. Interaciunea alcoolului cu medicamentele III. Metode chimico-toxicologice de investigare a alcoolului etilic III.1. Analiza etanolului metode clasice III.2. Metode gaz cromatografice III.2.1. Noiuni generale de gaz cromatografie III.2.2. Mrimi ce definesc repartiia cromatografic III.2.3. Procesul cromatografic de separare III.2.4. Cromatograma III.2.5. Mrimi ce caracterizeaz separarea cromatografic III.2.6. Structura sistemului cromatografic III.2.7. Limitrile tehnicilor gaz-cromatografice pe Coloan III.2.8. Informaia cantitativ n analiza cromatografic III.2.9. Informaia calitativ n analiza cromatografic III.2.10. Istoricul analizelor headspace III.2.11. Principiile de baza n analiza headspace 4 4 6 7 7 11 20 20 22 25 27 29 31 31 32 34 36 37 38 38 39 39 40 40 41 43 44 46 47 48 49 51 1

CONTRIBUII PERSONALE IV. Consideraii generale asupra consumului de alcool n Judeul Vaslui IV.1. Motivarea studiului IV.2. Metoda i probele biologice IV.3. Rezultate i discuii IV.3.1. Rezultate obinute la determinarea cantitativ a alcoolului etilic n probele de snge provenite de la conductorii auto IV.3.2. Rezultate obinute la determinarea cantitativ a alcoolului etilic n probele de snge provenite de la peroane decedate IV.4. Concluzii V. Stabilirea unor corelaii ntre valoarea alcoolemiei i cauzele de deces V.1 Motivarea studiului V.2. Materiale i metod V.3. Rezultate i discuii V.4. Concluzii VI. Studii chimico-toxicologice de determinare a alcoolului etilic prin GC-HS VI.1. Validarea metodei de dozare a etanolului din snge prin GC-HS folosind izopropanolul ca standard intern VI.1.1. Motivarea studiului VI.1.2. Principiul metodei VI.1.3. Materiale i aparatur VI.1.4. Validarea metodei VI.1.4.1. Specificitatea metodei VI.1.4.2. Liniaritatea VI.1.4.3. Exactitatea i precizia metodei VI.1.4.4. Reproductibilitatea i precizia intermediar VI.1.4.5. Limita de detecie i limita de cuantificare VI.1.5. Concluzii VI.2. Dezvoltarea i validarea metodei de determinare a etanolului din diverse fluide biologice folosind ter-butanolul, drept standard intern VI.2.1. Motivarea studiului VI.2.2. Principiul metodei VI.2.3. Materiale i aparatur VI.2.4. Validarea metodei VI.2.4.1. Specificitatea metodei VI.2.4.2. Liniaritatea metodei VI.2.4.3. Precizia VI.2.4.4. Repetabilitatea

55 55 56 56 56 61 66 68 68 69 70 108 110 110 110 110 111 112 112 114 117 118 122 122 124 124 124 124 126 126 128 130 133
4

VI.2.4.5. Acurateea VI.2.4.6. Limita de detecie i limita de cuantificare VI.2.5. Concluzii VI.3. Prezentarea comparativ a concentraiei alcoolului etilic determinat din fluide biologice prin metoda GC-HS i metoda Cordebard VI.3.1. Motivarea studiului VI.3.2. Principiul metodelor utilizate VI.3.3. Materiale i aparatur VI.3.4. Rezultate i discuii VI.3.5. Concluzii VI.4. Aplicarea metodei de dozare a etanolului prin GC-HS din fluide biologice recoltate post-mortem folosind terbutanolul, drept standard intern VI.4.1. Motivarea studiului VI.4.2. Prezena post mortem a alcoolului VI.4.3. Materiale i aparatur VI.4.4. Consideraii asupra recoltrii fluidelor biologice post mortem VI.4.5. Rezultate i discuii VI.4.5.1. Determinarea concentraiei alcoolului din snge VI.4.5.2. Determinarea concentraiei alcoolului din urin VI.4.5.3. Determinarea concentraiei alcoolului n umoarea vitroas VI.4.5.4. Determinarea concentraiei alcoolului n lichidul cefalorahidian VI.4.6. Concluzii VII. Concluzii generale. Contribuii originale. Perspective de cercetare VIII. Bibliografie ANEXA 1

134 141 145 147 147 147 147 150 157 158 158 159 163 164 168 169 179 182 188 192 194 201

CAPITOLUL IV CONSIDERAII GENERALE ASUPRA CONSUMULUI DE ALCOOL N JUDEUL VASLUI

Scopul studiului a fost de a evidenia situaia consumului de alcool la conductorii auto i nivelul alcoolemiei la persoanele decedate din diferite cauze. IV.2. Metod i probe biologice Probele biologice au fost analizate prin metoda Cordebard, modificat dup Banciu i Droc. Probe biologice - snge venos de la conductori auto; - snge din vena femural recoltat de la persoane decedate. IV.3. Rezultate i discuii IV.3.1. Rezultate obinute la determinarea cantitativ a alcoolului etilic n probele de snge provenite de la conductorii auto n perioada 2005-2010 n Laboratorul de Toxicologie din cadrul Serviciului Judeean de Medicin Legal Vaslui, au fost analizate n medie 1076 probe pe an. Numrul determinrilor efectuate la conductorii auto i valorile alcoolemiei sunt prezentate n tabelul 1.
Tabelul 1. Repartiia numeric a valorilor alcoolemiei determinate la conductorii auto din judeul Vaslui, n perioada 2005-2010 Valoarea alcoolemiei (g) Nr. Anul deter. 0 0-0,8 0,8-2 2-3 >3 2005 1092 490 216 367 19 0 2006 957 382 123 422 30 0 2007 1024 345 77 520 82 0 2008 1260 375 91 671 114 9 2009 1063 244 86 601 129 3 2010 1064 212 47 643 155 7 Total 6460 2048 640 3224 529 19

Repartiia procentual a cazurilor analizate n perioada 2005-2010, n funcie de valoarea alcoolemiei, este prezentat n figura 1.
6

4,42 2010 2009 2008 2007 2006 2005 0% 0 19,92 22,95 8,09 60,43 56,54 14,57

0,66

0,28 12,14 0,72 29,76 7,22 53,25 9,05 0 33,69 7,52 50,78 8,01 0 3,13 39,92 12,85 44,1 0 44,87 19,78 33,61 1,74 20% 0-0,8 g 40% 0,8-2 g 60% 2-3 g 80% > 3 g 100%

Fig. 1. Repartizarea procentual a alcoolemiilor efectuate la conductorii auto, n perioada 2005-2010, n Judeul Vaslui

Din cele 6460 determinri efectuate n perioada 2005-2010, 3772 (58,39%) au prezentat alcoolemie peste 0,8 g, limit considerat penal n cazul conductorilor auto, conform legislaiei n vigoare n Romnia. Acest procent foarte mare impune un control mai riguros al conductorilor auto i n acelai timp o mbuntire a metodelor de determinare deoarece o mare parte din conductorii auto ajung s conteste aceste rezultate i pot eluda prevederile legale. Dac avem n vedere c aceste persoane sunt conductori auto, este predictibil riscul pe care l prezint atunci cnd sunt n trafic. Nu sunt de neglijat nici cazurile cu alcoolemie sub limita penal deoarece n funcie de reactivitatea individual o alcoolemie sub 0,8 g poate afecta reflexele persoanei respective cu consecine sociale grave. Numrul cazurilor cu alcoolemie peste valoarea de 0,8 g a crescut de la an la an, de la 386 (35,35%) cazuri n anul 2005 la 805 cazuri (75,66%) n anul 2010. Comparativ cu media determinrilor naionale, pentru judeul Vaslui se observ o cretere a consumului de alcool la conductorii auto, cretere care este mai important pentru intervalul de concentraie 0,8-2 g (cretere cu aproape 20%), mai ales n anii 2007-2010. Msurile impuse de autoriti pentru a reduce consumul de
7

alcool n rndurile conductorilor auto, cum sunt creterea frecvenei controalelor n trafic, creterea nivelului amenzilor, nu au determinat o reducere real a consumului de alcool. IV.3.2. Rezultate obinute la determinarea cantitativ a alcoolulul etilic n probele de snge provenite de la persoane decedate n perioada 2005-2010 n Laboratorul de Toxicologie din cadrul Serviciului Judeean de Medicin Legal Vaslui, au fost efectuate n medie 743 de determinri pe an (tabelul 2).
Tabelul 2. Repartiia numeric a alcoolemiilor determinate la cadavru, n perioada 2005-2010, n judeul Vaslui Valoarea alcoolemiei (g) Nr. Anul deter. 0 0-0,8 0,8-2 2-3 >3 2005 707 359 62 118 114 54 2006 629 344 65 102 92 26 2007 674 348 72 105 99 50 2008 904 471 90 168 129 46 2009 661 283 99 127 101 51 2010 884 390 132 158 120 84 Total 4459 2195 520 778 655 311

n cazul alcoolemiei determinate la cadavru, putem considera cel puin teoretic c valori de peste 2 g pot constitui o cauz de deces mai ales dac individul n cauz prezint fenomene patologice cardiace, renale sau hepatice. Din cele 4459 de determinri efectuate n perioada 2005-2010, 14,69% (655 cazuri) au prezentat valori ale alcoolemiei ntre 2 i 3 g, iar 6,97% (311 cazuri) au prezentat valori ale alcoolemiei peste 3 g (figura 2).

2010 2009 2008 2007 2006 2005 0% 0 g

44,12 42,81 52,1 51,63 54,69 50,78 20% < 0,8 g 40%

14,93 14,98 9,96

17,87 19,21 18,58

13,58

9,5

15,28 7,72 14,27 5,09 14,69 7,42

10,68 15,58 10,33 16,22 8,77 60% 2-3 g 16,69

14,63 4,13 16,12 7,64 100%

80% > 3 g

0,8-2 g

Fig. 2. Repartizarea procentual a alcoolemiilor efectuate la persoane decedate, n perioada 2005-2010, n Judeul Vaslui

IV.4. Concluzii Privind toate aceste date prezentate putem clar s afirmm c de la an la an n perioada analizat, observm o cretere continu a cazurilor cu alcoolemie de peste 0,8 g. Comparnd mediile cu media naional, observm diferene importante pentru valorile zero i cele cuprinse ntre 0,8 i 2. Numrul cazurilor cu alcoolemie ntre 0,8 i 2 g fiind cu 13 uniti procentuale, mai multe n judeul Vaslui dect la nivel naional. La persoanele decedate se observ o cretere de la an la an a alcoolemiei cu valori mai mari de 3 g, ceea ce presupune de multe ori c alcoolul reprezint o cauz direct de deces.

Alcoolul este un determinant al strii de sntate, responsabil pentru 7,4% din totalitatea invaliditilor i deceselor premature n UE. Aproape 1 din 3 brbai i 1 din 5 femei consum alcool peste limitele de sigurana acceptate n prezent. Studiul a urmrit stabilirea unei corelaii ntre concentraia alcoolului n diferite fluide biologice i cauza de deces stabilit de medicul legist i evidenierea influenei nefaste a consumului de alcool asupra vieii oamenilor. Probe biologice luate n lucru: snge ven femural, umoare vitroas, urin, snge cord, snge hematom subdural. Concentraia alcoolului a fost determinat prin metoda Cordebard, modificat dup Banciu i Droc. Au fost analizate 356 de cazuri n care valoarea alcoolului a fost mai mare de 0,40 g. Cazurile au fost analizate n perioada 2008-2010, n judeul Vaslui (fr oraul Brlad). V.3. Rezultate i discuii n colaborare cu medicul legist, care a stabilit diagnosticul de deces, lund n consideraie rezultatele macroscopice ale autopsiei, raportul toxicologic, raportul histopatologic, rezultatele tanatochimice i datele anchetei, cazurile au fost clasificate n funcie de diagnosticul de deces (figura 3).
afe ciuni cardiace spnz urare 8,15% 8,15% 6,46% 6,46% 8,15% 6,46% 12,92% 7,30% 14,04% 21,91% com e tilic hipote rmie accide nte omucide re intoxicaii ne c traumatisme alte cauz e

CAPITOLUL V STABILIREA UNOR CORELAII NTRE VALOAREA CONCENTRAIEI ALCOOLULUI I CAUZELE DE DECES

Fig. 3. Repartiia procentual a cazurilor luate n studiu, n funcie de cauza decesului

10

Decese care au survenit n urma unor afeciuni cardiace asociate cu consumul de etanol Dintre afeciunile cardiace cel mai frecvent identificate au fost arteroscleroza coronarian, cardiomiopatia dilatativ i hipertrofic, valvulopatiile, miocardiofibroza i pericardita. Au fost analizate 78 de cazuri n perioada 2008-2010 cu vrsta cuprins ntre 23-81 de ani, cu o medie de 58,38 ani n anul 2008; 55,50 ani n anul 2009 i 55,81 ani n anul 2010. Datele obinute la analiza toxicologic a probelor provenite de la persoanele care au decedat din cauza unor afeciuni cardiace asociate cu consumul de alcool (cu alcoolemie peste 1,5 g - vena femural) sunt prezentate n tabelele 3-5.
Tabelul 3. Cazurile analizate n anul 2008 cu alcoolemie peste valoarea de 1,5 g (vena femural) i cu afeciuni cardiace Concentraie alcool (g) Nr. Vrsta Mediul Sexul caz (ani) femural urin 4 1,65 2,35 42 R M 23 1,65 0,55 78 U M 121 2,15 2,05 72 R F 144 1,55 1,35 35 R M 172 2,20 2,95 64 R M 221 2,45 2,35 66 R M 222 2,40 2,75 68 R M 244 2,30 68 R M 235 2,15 2,60 42 R M 271 1,90 2,15 59 R M 273 1,65 72 R M 280 2,40 2,20 69 R F 317 2,05 2,55 81 R M 338 2,35 2,95 63 R M 342 1,80 2,90 72 R F

11

Tabelul 4. Cazurile analizate n anul 2009 cu alcoolemie peste valoarea de 1,5 g (vena femural) i cu afeciuni cardiace Concentraie alcool (g) Nr. Vrsta Mediul Sexul caz (ani) femural urin 20 1,50 1,95 78 R M 36 1,80 2,35 44 R M 54 1,95 52 R M 79 2,10 2,30 53 U M 83 1,65 2,25 53 R M 187 2,65 2,95 36 R M 193 1,95 2,50 50 U M 211 1,90 2,25 52 R M 214 2,15 2,25 59 R M 222 2,30 2,60 70 R M 260 2,40 59 R F 304 2,75 3,05 63 R M 310 2,40 2,95 58 R M 306 1,65 32 R F Tabelul 5. Cazurile analizate n anul 2010 cu alcoolemie peste valoarea de 1,5 g (vena femural) i cu afeciuni cardiace Concentraie alcool (g) Nr. Vrsta Mediul Sexul caz (ani) femural urin 72 3,30 3,50 69 R F 97 2,25 57 R F 100 1,90 74 U M 129 2,95 3,15 39 R M 143 1,60 2,10 44 R M 168 2,50 3,10 34 R M 178 1,70 2,80 55 U M 218 2,25 2,50 51 R M 226 1,60 59 R M 228 1,65 62 U M 240 3,25 3,20 53 R M 248 2,00 2,10 66 U M 261 2,40 2,80 23 U M 297 2,45 3,00 64 R M 330 1,90 2,20 81 R M 340 1,90 2,20 33 R M 364 2,45 2,60 59 U M 398 2,65 2,90 69 R F
12

Consumul de alcool este specific brbailor, dar am identificat i cazuri n care femei cu afeciuni cardiace au fost depistate la analiza post-mortem cu alcoolemie peste valoarea zero. n lotul total, 13 au fost femei (16,67%) i 65 (83,33%) au fost brbai (figura 4).
femei brbai

2010

22,23%

77,77%

2009 10,00% 2008 16,13% 0% 20% 40%

90,00%

83,87% 60% 80% 100%

Fig. 4. Repartiia procentual a cazurilor cu afeciuni cardiace i alcoolemie peste valoarea 0,40 g, n funcie de sex

17 cazuri (21,79%) din lotul total, provin din mediul urban i 61 (78,21%) din mediul rural. Calculnd pentru lotul total valoarea medie a alcoolemiei n funcie de mediul de provenien, se observ c pentru mediul urban valoarea este de 1,35 g, iar pentru mediul urban 1,71 g. Se observ din figura 5, c n toi aceti trei ani luai n studiu, cele mai mari valori ale alcoolemiei au fost situate ntre 1-2 g i mai mari de 2 g, ceea ce explic i numrul mare de decese de diferite cauze n care este implicat i consumul de alcool.
50% 45,00% 40% 30% 20,00% 29,63% 20% 10% 0% < 1 g 1-2 g > 2 g 25,80% 45,17% 2008 2009 2010

33,34%

Fig. 5. Repartiia procentual a cazurilor n funcie de valoarea alcoolemiei

13

29,03%

35,00%

37,03%

n acest studiu, din 78 de cazuri diagnosticate cu boli cardiace asociate consumului de alcool doar 16 cazuri au avut valori ale alcoolemiei mai mici de 1 g, respectiv 6 cazuri n 2008, 6 cazuri, n 2009, 4 cazuri n 2010. Cardiomiopatia alcoolic este o afeciune n care consumul excesiv de alcool pe o perioada ndelungat slbete muchiul cardiac i determin insuficien cardiac. Consumul de alcool este asociat cu o varietate de afeciuni cardiovasculare: fibrilaia atrial, flutterul atrial, alte aritmii supraventriculare, extrasistole ventriculare, moarte subit, hipertensiune i atac cerebral. Cardiomiopatia alcoolic reprezint 4% dintre toate cauzele cardiomiopatiilor. Consumul de alcool pe termen lung reprezint a doua cauz principal a cardiomiopatiei dilatative. Decese care au survenit n urma intoxicaiilor etilice acute - comele alcoolice Alcoolul este un drog, o substan psihoactiv i un toxic celular cu efect deprimant asupra sistemului nervos central. Rezultatele obinute, la analiza celor 46 de cazuri de persoane care au decedat n perioada 2008-2010 prin intoxicaie etanolic acut i care au prezentat alcoolemie peste 1,5 g au fost sintetizate n tabelele 6-8.
Tabelul 6. Concentraia alcoolic la persoanele decedate prin intoxicaie etilic acut-com etilic n anul 2008 Concentraie alcool (g) Nr. Vrsta Mediul Sexul caz (ani) femural urin 8 2,30 2,85 50 U M 36 3,30 3,55 55 R M 51 2,65 3,75 32 R M 52 3,15 3,30 49 U M 113 3,65 41 R M 115 1,80 1,95 53 R M 240 3,15 3,35 76 U M 241 3,05 3,80 68 R M 269 3,85 3,90 47 R F 288 3,65 3,45 42 U M 327 3,30 55 U M 326 2,95 3,45 64 R M
14

Tabelul 7. Concentraia alcoolic la persoanele decedate prin intoxicaie etilic acut-com etilic n anul 2009 Concentraie alcool (g) Nr. Vrsta Mediul Sexul caz (ani) femural urin 31 3,65 3,70 44 U M 155 2,55 2,80 50 U M 167 3,95 2,25 26 U M 191 2,50 3,00 41 R M 229 4,60 3,70 53 U M 271 3,30 78 R F 273 3,00 53 U M 285 3,55 3,95 58 R M 297 3,85 72 R F 323 3,80 3,85 38 R M Tabelul 8. Concentraia alcoolic la persoanele decedate prin intoxicaie etilic acut-com etilic n anul 2010 Concentraie alcool (g) Nr. Vrsta Mediul Sexul caz (ani) femural urin 7 2,00 1,85 56 U M 19 3,20 3,90 42 U M 89 4,10 4,70 41 R M 86 2,40 45 R M 107 3,55 3,70 54 R M 110 3,85 4,35 41 R F 112 3,65 3,85 48 R M 116 3,55 3,85 38 U M 123 4,65 3,85 62 R M 155 3,40 3,90 63 R M 167 3,95 3,40 65 R F 169 3,50 4,00 55 R M 198 3,60 4,50 42 R F 181 2,25 4 R F 183 3,35 2,95 62 U F 265 4,15 3,85 47 R F 268 3,20 73 U F 277 3,30 3,85 18 R M 280 3,50 4,20 61 R M 303 2,90 3,15 54 R M 341 4,55 4,60 61 U M
15

343 347 391

4,50 4,50 3,50

3,90 4,60 3,95

38 31 73

R R R

M F F

Vrsta medie a pacienilor a fost de 52,66 ani (2008), 51,30 ani (2009) i 48,91 ani (2010); cu o medie pentru lotul total de 50,41 ani, ceea ce nseamn o populaie relativ tnr, apt de munc. Se constat c n general numrul de decese survenite prin com etilic a fost mai mare n mediu rural. Din datele prezentate, se observ c valorile medii ale alcoolemiilor n toi anii la brbai sunt de peste 3,50 g, iar la femei peste 2,99 g (figura 6).
5 alcoolemie medie 4 3,85 3,59 anul 3 2,99 2 1 0 2008 2009 2010 3,57 feminin masculin

3,45

Fig. 6. Valorile medii ale alcoolemiei (g) n funcie de sex pentru cazurile cu deces prin com etilic

Aciunea alcoolului asupra sistemului nervos central se desfoar progresiv n strns legtur cu cantitatea de alcool din snge. Mai nti sunt afectate emisferele cerebrale care prin scoara cerebral cenuie constituie centrul contiinei, a raiunii, precum i locul central de recepionare a diferitelor senzaii. Consumul cronic de alcool determin modificri morfopatologice cerebrale, astfel atrofia cerebral i degenerescena cerebeloas alcoolic intereseaz n special vermisul cerebelos i respectiv cortexul frontal, n stadiile avansate devine sever i difuz cu marcant lrgire a spaiilor lichidiene externe i interne.

3,52

16

Decese care au survenit n urma suicidului prin spnzurare asociate cu consumul de etanol Interaciunile dintre alcoolism, depresie i anxietate sunt foarte complexe, iar persistena depresiei i/sau a anxietii, netratate la timp i integrat, nrutete calitatea vieii crescnd i riscul suicidar. Rezultatele obinute la analiza probelor provenite de la persoane care s-au sinucis prin spnzurare i la care alcoolemia a fost peste valoarea de 1,5 g (vena femural) sunt prezentate n tabelele 9-11.
Tabelul 9. Cazurile depistate cu alcoolemie peste 1,5 g (vena femural) i care s-au sinucis prin spnzurare, n anul 2008 Concentraie alcool (g) Nr. Vrsta Mediul Sexul caz (ani) femural urin 5 2,00 2,70 30 R M 118 2,80 3,05 40 R F 131 2,60 72 R M 159 1,80 2,30 61 U M 266 2,40 3,15 39 R M 330 1,80 1,90 55 R M Tabelul 10. Cazurile depistate cu alcoolemie peste 1,5 g (vena femural) i care s-au sinucis prin spnzurare, n anul 2009 Concentraie alcool (g) Nr. Vrsta Mediul Sexul caz (ani) femural urin 27 2,70 3,25 44 R M 28 1,75 48 R M 43 2,60 2,95 24 R M 51 2,10 41 U M 64 1,90 2,35 34 R M 68 3,15 3,40 38 R F 95 1,55 1,65 44 R M 134 2,25 2,70 61 R M 189 2,55 3,00 38 R M 198 2,50 2,70 28 U M 220 1,60 2,10 46 R M 245 2,05 2,70 35 R M 266 1,60 41 R M 264 2,60 2,90 34 R F 275 2,35 2,90 49 R M 290 2,75 3,10 48 U M 294 1,50 1,85 66 U M
17

Tabelul 11. Cazurile depistate cu alcoolemie peste 1,5 g (vena femural) i care s-au sinucis prin spnzurare, n anul 2010 Concentraie alcool (g) Nr. Vrsta Mediul Sexul caz (ani) femural urin 53 1,90 2,55 39 U M 65 2,30 2,80 40 U M 106 1,70 49 R M 118 2,15 32 R M 146 1,65 38 U M 153 2,75 3,15 47 R M 158 2,65 36 R M 197 2,40 51 R M 255 2,20 2,50 38 R M 258 2,35 2,95 55 R M 295 2,30 30 R M 328 3,20 39 R M 374 1,75 1,35 33 U F 386 1,75 2,10 36 U M

n perioada 2008-2010 au fost nregistrate 50 de cazuri de suicid prin spnzurare, cu o vrst medie a indivizilor de 44,63 ani, dar cu variaii de: 53 ani (2008), 44,70 ani (2009) i 40,80 ani n anul 2010. 76% din cazuri sunt persoane din mediul rural i 24% din mediul urban. Se poate observa c n perioada analizat ponderea sinuciderilor prin spnzurare a fost mai mare n mediul rural. Din lotul total analizat 92% sunt brbai i doar 8% sunt femei. Variaia alcoolemiei medii funcie de sex n cazurile de deces prin spnzurare este prezentat n figura 7.
3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 masculin fe minin 2,8 1,86 2,88 1,83 1,86 1,75

alcoolemie medie

2008

2009

2010

anul

Fig. 7. Valorile medii ale alcoolemiei (g) n funcie de sex pentru cazurile cu deces prin spnzurare
18

n anul 2000, s-au sinucis aproximativ 815.000 de persoane n ntreaga lume. Aceasta nseamn o rat a mortalitii de circa 14,5 la 100.000 de locuitori sau un deces la fiecare 40 de secunde. Sinuciderea reprezint a 13-a cauz de deces n lume. Alcoolodependena asociat cu o tulburare depresiv comport un mare risc autolitic, ceea ce argumenteaz necesitatea depistrii i tratrii active a alcoolicilor deprimai. Datele prezentate, indic faptul c n marea majoritate a cazurilor, persoanele care au ales s fac acest gest, indiferent de motivaiile fiecruia sau de mediul din care a provenit, au consumat cantiti impresionante de alcool (48,97% din indivizi cu alcoolemie peste 2 g), care indirect, putem sugera c a fost una din cauzele care au dus la gestul suicidal. Decese care au survenit n urma hipotermiei asociat cu consumul de etanol Alcoolicii beau mai mult pe vreme geroas, pentru a se nclzi, dar cldura astfel obinut, prin vasodilataie, este neltoare. Majoritatea cazurilor de hipotermie apar n lunile de iarn. Factorii de risc includ vrstele extreme (n special persoanele n vrst), cei fr locuin, consumatorii de alcool, malnutriia, srcia, bolile psihice, folosirea de neuroleptice i hipotiroidismul. Hipotermia este ntlnit la persoanele intoxicate cu alcool, intoxicaia inhibnd mecanismul de aprare mpotriva frigului. Valori mai mari ale concentraiei alcoolului n urin, aa cum se observ n numeroase cazuri de persoane decedate prin hipotermie, arat c alcoolul era n faz de eliminare i c la aceste persoane decesul prin hipotermie s-a produs mai trziu dect consumul de alcool. Doar n patru cazuri concentraia alcoolului n snge a fost mai mare dect n urin, acesta fiind n faza de absorbie ceea ce indic faptul c decesul a survenit rapid dup consumul de alcool. Vrsta medie pentru lotul total a fost de 59,26 ani, cu urmtoarele medii pe ani: 62 ani (2008), 51 ani (2009) i 59,88 ani n 2010. Din 26 de cazuri n care persoanele au decedat prin hipotermie asociat cu un consum mare de alcool, 11,54% au provenit din mediul urban i 88,46% din mediul rural.
19

Din lotul total, 18 (69,23%) sunt brbai i 8 (30,77%) sunt femei. Valorile medii ale alcoolemiei funcie de sex pentru cazurile de deces prin hipotermie, sunt aproape duble la brbai comparativ cu femeile (figura 8).
2,5 feminin masculin

alcoolemie medie

2 1,5 1 0,5 0 1,13

2,25

2,33

1,58

0,65 2008 2009 2010

anul

Fig. 8. Valorile medii ale alcoolemiei (g) n funcie sex pentru cazurile de deces prin hipotermie

Conform rapoartelor poliiei privind aceste cazuri o parte din persoane erau oameni fr adpost care consumau frecvent alcool i cdeau pe strzi unde datorit gradului avansat de ebrietate, adormeau. Valorile n umoarea vitroas, la cadavrele unde s-a putut preleva, au fost mult mai mari dect n vena femural, ceea ce ne arat ca dup cdere ei au mai trit, erau n faza de eliminare a alcoolului, de aceea valorile n vitros sunt mult mai mari dect n vena femural. Decese care au survenit n urma accidentelor rutiere/ feroviare asociate cu consumul de etanol Intoxicaia alcoolic diminueaz (ntr-un raport direct proporional cu gradul intoxicaiei) toate calitile care se cer unui bun conductor autor: atenia continu, coordonarea micrilor, rapiditatea judecrii unei situaii, reflexele intacte pentru a putea interveni prompt n situaii dramatice. Rezultatele obinute la analiza probelor provenite de la persoanele decedate n urma unor accidente rutiere sau feroviare sunt prezentate n tabelele 12-14.

20

Tabelul 12. Cazurile de deces prin accident rutier sau feroviar i cu o concentraie alcoolic peste 1,5 g (2008) Concentraie alcool (g) Nr. Vrsta Mediul Sexul caz (ani) femural urin 11* 1,65 2,35 50 R M 50 1,75 1,40 57 R F 191 2,35 2,70 21 R M 223 1,65 1,65 43 R M 2,70-craniu; 248 3,20 36 R M 2,60-torace 264 2,25 2,90 27 R M * accident feroviar

Pentru cazul 248, datorit exanguinrii cadavrului, nu s-a putut preleva snge din vena femural, dar valoarea alcoolemiei din umoarea vitroas corelat cu cea din urin au putut oferi informaii preioase medicului legist asupra concentraiei etanolului.
Tabelul 13. Cazurile de deces prin accident rutier sau feroviar i cu o concentraie alcoolic peste 1,5 g (2009) Concentraie alcool (g) Nr. Vrsta Mediul Sexul caz (ani) femural urin 10 2,55 2,75 45 R M 59 3,10 2,25 20 R M 227 3,10 72 R M Tabelul 14. Cazurile de deces prin accident rutier sau feroviar i cu o concentraie alcoolic peste 1,5 g (2010) Concentraie alcool (g) Nr. Vrsta Mediul Sexul caz (ani) femural urin 40 1,70 2,35 42 R M 207 1,95 2,75 30 R M 250 2,30 2,25 39 R M 260 2,40 2,05 60 U M 316 2,20 2,40 68 U M 324 1,55 1,60 33 R M 325 1,95 2,10 50 R M * accident feroviar

Lotul total a fost format din 23 de cazuri cu vrsta medie de 43 ani, cu urmtoarele valori medii pe an: 39,63 ani (2008), 46,20 ani
21

(2009) i 46 ani n anul 2010. Din 23 de cazuri analizate, 26,08% dintre cazuri provin din mediul urban i 73,92% din mediul rural. Valorile medii ale alcoolemiei au oscilat ntre 0,65 g (mediu urban) i 2,91 g (mediu rural) valoarea cea mai mare fiind nregistrat n anul 2009 (figura 9).
3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 alcoolemie medie 2,91 2,25 1,58 0,65 2,3 1,89 urban rural

2008

2009

2010

anul

Fig. 9. Valorile medii ale alcoolemiei (g) n funcie de mediul de provenien, pentru cazurile cu deces prin accidente rutiere sau feroviare

95,65% sunt brbai i 4,35% femei, iar valoarea medie a alcoolemie depete valoarea 1,67 g (figura 10).
feminin masculin 1,75 1,67 2,01 2

alcoolemie medie

2,5 2 1,5 1 0,5 0 2008 2009 2010

anul

Fig. 10. Valorile medii ale alcoolemiei (g) n funcie de sex, pentru cazurile cu deces prin accidente rutiere sau feroviare

Conform Poliiei Rutiere Romne, una dintre principalele cauze ale producerii accidentelor rutiere este conducerea autovehiculelor sub influena buturilor alcoolice. n Romnia, se nregistreaz ,n medie, 2794 de decese cauzate de accidente rutiere,potrivit datelor adunate de Organizaia Mondial a Sntii,
22

Eurostat i Banca Mondial i 126 de decese la un milion de locuitori. Astfel,Romnia se afl pe locul cinci n Europa i Asia Central,din punctul de vedere al costurilor provocate de accidentele rutiere,se arat ntrun studiu publicat de Poliia Rutier Romn. n cazurile examinate n judeul Vaslui care au decedat n urma acestor tipuri de accidente valoarea alcoolemiei a fost de cele mai multe ori extrem de mare. n cazul accidentelor rutiere, toate persoanele decedate au fost conductori auto. Decese care au survenit n urma intoxicaiilor cu diferite substane asociate cu consumul de etanol Din 23 de cazuri luate n studiu, 16 cazuri au fost intoxicaii acute cu monoxid de carbon. Doar 3 persoane au avut o valoare a alcoolului mai mic de 1 g (cte un caz pentru fiecare an). n 11 cazuri s-au nregistrat valori ale alcoolemiei de peste 1,5 g, ceea ce duce la incoordonare motorie, la afectarea memoriei i a nelegerii. Vrsta medie pentru lotul analizat a fost de 57,86 ani, cu urmtoarele medii anuale: 50 ani n 2008, 58,66 ani n 2009 i 62,90 ani n 2010. Din cele 16 cazuri intoxicate cu monoxid de carbon, trei (18,75%) provin de mediul urban i 13 din mediul rural (81,25%), marea problem n mediul rural reprezentnd-o sobele care nu sunt ntreinute corespunztor, provocnd an de an tragedii n rndul populaiei. n toi anii luai n studiu, valorile medii ale alcoolemiei, la persoanele decedate prin intoxicaii, sunt peste 1,50 g (figura 11).
2,5 alcoolemie medie 2 1,5 1 0,5 0 2008 2009 2010 anul 1,65 1,8 1,89 1,78 1,93 urban rural

Fig. 11. Valorile medii ale alcoolemiei (g) n funcie de mediul de provenien, pentru cazurile cu deces prin intoxicaie
23

Pentru lotul total, 13 sunt brbai (56,52%) i 10 femei (43,48%), ponderea fiind destul de echilibrat n privina acestui tip de decese. Alcoolemia medie la lotul studiat (2008-2010) a variat ntre 1,26 i 2,3 g la femei, iar la brbai ntre 1,66 i 2,15 g (figura 12).
2,5 alcoolemie medie 2 1,5 1 0,5 0 2008 2009 2010 anul 1,6 1,71 2,3 1,66 1,26 2,15 feminin masculin

Fig. 12. Valorile medii ale alcoolemiei (g) n funcie de sex, pentru cazurile cu deces prin intoxicaie

Datele provenite de la cele 356 de cazuri analizate sunt prezentate n tabelul 15.
Tabelul 15. Tabel centralizator cu persoanele decedate din anumite cauze i consum de alcool Vrsta Mediu Sex Cauza Nr. Alcoolemie medie decesului cazuri medie (g) urban rural M F (ani) Boli cardio78 56,75 1,62 17 61 65 13 vasculare Spnzurare 50 44,70 1,86 12 38 46 4 Com etilic 46 50,41 3,40 16 30 34 12 Hipotermie 26 52,26 1,59 3 23 18 8 Accidente rutiere/ 23 43 1,78 6 17 22 1 feroviare Omucidere 29 48,48 2,20 3 26 22 7 Intoxicaii 23 57,86 1,77 3 20 13 10 nec 23 55,34 1,90 6 17 19 4 Traumatisme 29 57,13 1,81 8 21 20 9 prin cdere Alte cauze 29 52 1,45 9 20 26 3 Total/medii 356 52,48 1,98 83 273 285 71
24

Din datele centralizate n tabelul 15 se constat c indiferent de cauza de deces media de vrst este ntre 43 i 58 de ani, ceea ce nseamn o populaie relativ tnr, activ n cmpul muncii. Se poate observa c media de vrst cea mai mic este n cazul accidentelor rutiere (43 ani) i n cazul sinuciderilor (44 ani). n marea majoritate a cazurilor valoarea medie a alcoolemiei a fost peste 1,5 g. Din totalul de 356 de cazuri studiate cele mai multe decese (76,69%) au fost n mediul rural. La sexul masculin s-au nregistrat 80,05% decese n timp ce la femei 19,95% Se observ c pe perioada celor trei ani luai n studiu, cele mai multe decese sunt produse prin moarte cardiac asociat cu consum de etanol, valoarea medie a concentraiei de alcool fiind de 1,62 g. Urmeaz sinuciderile prin spnzurare i comele etanolice fiecare reprezentnd mai mult de 10%, respectiv 14,04% i 12,92%, restul cauzelor de deces fiind sub 10%. Att n cazul sinuciderilor ct i al comelor etanolice, valorile concentraiilor etanolului sunt mari 2,2 g respectiv 3,4 g (figura 13).
alcoolemie 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 hipotermie com etilic spnzurare omucidere afectare cardiac accidente intoxicaii nec

2008 2009 2010

cauza decesului

Fig. 13. Repartiia pe ani n funcie de cauza de deces i valoarea medie a alcoolemiei (g)

Indiferent de cauza decesului valorile medii ale alcoolemiilor sunt foarte mari (peste 1,5 g), ceea ce nseamn deja pierderea
25

traumatisme

coordonrii musculare, tulburri de mers, confuzie mintal, exagerarea strilor emoionale, ameeli, scderea rspunsului la durere, dezorientare i afectarea vorbirii. V.4. Concluzii Din analiza rezultatelor obinute, pentru o perioad de trei ani (2008-2010) se constat c: numrul de decese prin afectare cardiac, asociat cu concentraii mari al alcoolului a crescut de la an la an, valorile maxime alcoolemiei determinate fiind: 2,45 g (2008); 2,75 g (2009) i 3,30 g (2010); n cazul deceselor prin spnzurare datele obinute ne indic valori ale alcoolemiei peste 1,80 g; pentru persoanele decedate prin com etilic valorile medii ale concentraiei alcoolice la brbai sunt peste 3,50 g, iar la femei peste 2,99 g; au fost nregistrate la 50 de cazuri de siucid prin spnzurare; concentraia alcoolic n vena femural a variat ntre 1,40-2,60 g (2008); 0,50-3,15 g (2009) i 0,40-3,20 g (2010). n perioada 2008-2010 n judeul Vaslui au decedat 23 de persoane din cauza intoxicaiilor cu diferite substane i consum de alcool; cele mai multe intoxicaii au fost cu monoxid de carbon (16 cazuri).

26

CAPITOLUL VI STUDII CHIMICO-TOXICOLOGICE DE DETERMINARE A ALCOOLULUI ETILIC PRIN GC-HS VI.1. VALIDAREA METODEI DE DOZARE A ETANOLULUI DIN SNGE PRIN GC-HS FOLOSIND IZOPROPANOLUL CA STANDARD INTERN

Limitrile metodei Cordebard, omogenitatea variabil a probelor care induce erori la prelevarea eantionului pentru analiz, necesitatea alinierii metodelor de dozare a alcoolului etilic din probele biologice la cerinele analitice din rile Uniunii Europene, au impus necesitatea elaborrii unei noi metode analitice care s elimine pe ct posibil orice surs de eroare i s confere analistului sigurana unui rezultat corect. VI.1.2. Principiul metodei Alcoolul etilic separat din proba biologic n dispozitivul head space, este introdus n coloana cromatografic n care migreaz n funcie de afinitatea fa de faza staionar a coloanei i este vehiculat ctre detector. Semnalul generat n detector este vizualizat sub forma unui pic pe cromatogram, iar n funcie de curba de calibrare i aria pic-ului obinut la analiza probei se determin concentraia alcoolului etilic n proba respectiv. VI.1.3. Materiale i aparatur Reactivi i probe biologice etaloane standardizate (Restek, USA) de alcool etilic de concentraii: 0,5 g; 0,8 g; 1,0 g; 1,5 g; 2,0 g; 3,0 g; 4,0 g n ap bidistilat; probe de snge prelevate pe anticoagulant (NaF); izopropanol (standard intern) (Merck). Prelucrarea probelor Probele au fost prelevate de la conductori auto, la solicitarea poliiei, utiliznd truse speciale. n flaconul de headspace de 20 mL se introduc: 250 L prob, 1750 L soluie isopropanol 0,4 g n soluie sulfat de amoniu 1M.
27

Aparatur Condiiile pentru HS (G 1888): temperatura cuptorului 80C; temperatura buclei 90C; temperatura buclei de transfer 110C; timpul de echilibrare 15 minute; timpul unui ciclu GC 6 minute; timpul de injectare 0,5 minute. Condiiile pentru GC (Agilent, GC 6890 N): temperatur cuptor 60C izoterm; rata de splitare 5:1, gaz purttor - He; detectori: FID-1 260oC; FID-2 260oC; coloane: DB-ALC1 (30m x 0,32m x 1,8m) i DB-ALC2 (30m x 0,32m x 1,2m). VI.1.4. Validarea metodei VI.1.4.1. Specificitatea metodei n condiiile menionate metoda este specific pentru etanol, obinndu-se un timp de retenie bine definit pentru etanol i pentru izopropanol (figura 14).

Fig. 14. Cromatograma obinut la analiza unei soluii standard de etanol de concentraie 1 g

n funcie de tipul coloanei utilizate att pentru alcool etilic ct i pentru izopropanol au fost obinui timpi de retenie specifici: alcool etilic - 1,361 min. (coloana DB-ALC1), 1,311 min. (coloana DB-ALC2); izopropanol - 1,550 min. (coloana DB-ALC1), 1,457 min. (coloana DB-ALC2). Coloana DB-ALC1 are o grosime a fazei staionare de 1,8 m (comparativ cu 1,2 m pentru coloana DB-ALC2) i va determina creterea timpului de retenie a analitului n coloan. Rezoluia obinut a fost ntotdeauna > 3,5 ceea ce indic o foarte bun separare a picurilor.
28

VI.1.4.2. Liniaritatea Pentru evaluarea liniaritii s-a stabilit curba de etalonare format din 7 puncte. Pentru fiecare punct de pe curb s-au pregtit trei soluii, care au fost analizate n aceleai condiii i s-a calculat media determinrilor. Parametrii caracteristici curbelor realizate n cazul utilizrii coloanei DB-ALC1 i a detectorului FID-1A sunt prezentai n tabelul 16, iar curba de calibrare n figura 15.
Tabelul 16. Parametrii caracteristici curbei de etalonare
t R (min) Semnalul Concentraia soluiei de alcool etilic (g) 0,5 0,8 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 Media ariei picurilor 71,95158 121,20863 154,96611 224,55360 301,76907 453,08987 608,08527

1,362

coloana DB-ALC1 detector FID-1A

etanol, FID1 A Area Ratio = 0.09142198*AmtRatio -0.0058 Area Ratio Rel. Res%(3): 1.618 7 0.8 6 5 0.4 2 1 Correlation: 0.99958 0 5 Amount Ratio 3 4

0.6

0.2

Fig. 15. Curba de calibrare pentru coloana DB-ALC1, detector FID-1A

Ecuaiile dreptelor caracteristice celor dou curbe de calibrare sunt: pentru curba realizat pe coloana DB-ALC1, detector FID-1A pentru curba realizat pe coloana DB-ALC2, detector FID-2B
y = 158,84 conc 2,3269 R2 = 0,99953 y = 152,09 conc 1,5847 R2 = 0,99958

VI.1.4.3. Exactitatea i precizia metodei

29

Pentru determinarea exactitii i preciziei metodei s-au rulat etaloanele drept probe, obinndu-se concentraii apropiate de cele teoretice, procentul de regsire (acurateea) ncadrndu-se ntre 99,37% i 107,7%. Aceste valori ale procentelor de regsire subliniaz precizia i exactitatea metodei elaborate. Datele obinute sunt prezentate n tabelul 17 (coloan DBALC1; detector FID-1A).
Tabelul 17. Rezultatele obinute la evaluarea exactitii i preciziei metodei, utiliznd soluii de etanol n ap Concentraia Concentraia tR Media ariei Regsirea teoretic determinat (min) picurilor (%) (g) (g) 1,362 76,73072 0,5 0,53854 107,70% 1,361 153,04187 1,0 1,02518 102,51% 1,361 227,03665 1,5 1,53140 102,09% 1,360 457,00775 3,0 2,96672 98,89% 1,361 618,54785 4,0 3,97495 99,37%

Valorile pentru deviaia standard relativ corespunztoare concentraiei (RDS), calculat pe baza programului Chem Station au fost ntre 0,5 i 3,5%. VI.1.4.4. Reproductibilitatea i precizia intermediar Pentru a evidenia repetabilitatea metodei s-au rulat mai multe zile la rnd eantioane pregtite din acelai probe de snge care au fost realizate zilnic n aceleai condiii ca i curba de etalonare. Rezultatele inter-day au fost foarte bune, obinndu-se de la o zi la alta diferene de concentraii ntre 0,01 i 0,05 g. Valoarea RSD (corespunztoare concentraiei) pentru prima zi a fost de 3,412 i 2,484 pentru a doua zi. Pentru matricile omogene valorile RSD au fost cuprinse ntre 0,5 i 3,5%. Obinerea unor valori ale RSD sub 3,5% subliniaz nc odat superioritatea metodei de analiz prin gaz cromatografie cuplat cu head space comparativ cu metoda Cordebard unde pentru aceste probe neomogene apar erori la separarea alcoolului etilic din proba biologic. Datorit individualitii probelor de snge (matrice complex i unic fiecrui pacient) s-a verificat i precizia per probe reale. Astfel prin rularea unor probe de snge de la 3 pacieni diferii, cte
30

6 determinri pentru 2 pacieni, respectiv 5 determinri la ultimul pacient. Valorile RSD obinute pentru cele trei probe au fost de: 1,72 (pacientul 1), 2,60 (pacientul 2) i 1,61 (pacientul 3), valori care demonstreaz repetabilitatea metodei. VI.1.4.5. Limita de detecie i limita de cuantificare Rezultatele sunt prezentate n tabelul 18.
Tabelul 18. Limitele de detecie i limitele de cuantificare Semnalul ES a LD (g) LC (g) 2 2,96415 158,84 0,055 0,186 1 2,69742 152,09 0,053 0,177

VI.1.5. Concluzii Rezultatele obinute arat c pe domeniul de concentraie studiat (0,5-4,0 g) metoda este liniar, exact i precis (RDS 3,5%). Aceast metod este rapid (6 minute), sngele nu necesit prelucrri suplimentare, doar o diluie cu standard intern. Omogenitatea matricei este direct proporional cu exactitatea rezultatelor, obinndu-se pentru aceste probe valori ale RDS 1,5%.

31

VI.2. DEZVOLTAREA I VALIDAREA METODEI DE DETERMINARE A ETANOLULUI DIN DIVERSE FLUIDE BIOLOGICE FOLOSIND TER-BUTANOLUL, DREPT STANDARD INTERN

Pentru a elimina interferena isopropanolului, care este un produs de descompunere a probelor biologice, am nlocuit standardul intern cu ter-butanolul care nu apare n procesele de descompunere a fluidelor biologice sau a esuturilor. VI.2.3. Materiale i aparatur Reactivi i probe biologice soluii etalon standardizate (Restek, USA) de alcool etilic de concentraii: 0,5 g; 0,8 g; 1,0 g; 1,5 g; 2,0 g; 3,0 g; 4,0 g, n ap bidistilat; probe de snge de control (probe standardizate) (Medichem) care conin alcool etilic, de concentraii: 0,5 g; 0,8 ; 1,1 ; probe de snge prelevate pe anticoagulant (NaF) de la conductori auto i probe de snge prelevate de la cadavre (din vena femural) ter-butanol (standard intern) (Merck); soluie sulfat de amoniu 1M n ap bidistilat. Prelucrarea probelor n flaconul de headspace de 20 mL se introduc: 250 L prob, 1750 L soluie ter-butanol 0,4 g n soluie sulfat de amoniu 1M. Aparatur Condiiile pentru HS (G 1888): temperatura cuptorului 80C; temperatura buclei 90C; temperatura buclei de transfer 110C; timpul de echilibrare 15 minute; timpul unui ciclu GC 6 minute; timpul de injectare 1,0 min. Condiiile pentru GC (GC 6890 N): temperatura cuptorului 40C (izoterm); rata de splitare 5:1; presiunea 18,8 psi (constant); gaz purttor - He; make-up - He- pentru detector, hidrogen i aer sintetic; detectori: FID-1A 260oC i FID-2B 260oC; coloane DBALC1 (30m x 0,32m x 1,8m) i DB-ALC2 (30m x 0,32m x 1,2m).

32

VI.2.4. Validarea metodei VI.2.4.1. Specificitatea metodei Specificitatea metodei este demonstrat de timpii de retenie diferii pentru alcoolul etilic i standardul intern (figura 16).

Fig. 16. Cromatograma obinut la analiza soluiei etalon de alcool etilic 0,5 g pe cele dou coloane specifice analizei alcoolului

n funcie de tipul coloanei s-au obinut urmtorii timpi de retenie: - alcool etilic - 1,593 min. (coloana DB-ALC1); 1,544 min. (coloana DB-ALC2); - ter-butanol - 2,252 min. (coloana DB-ALC1); 2,155 min. (coloana DB-ALC2). Rezoluia obinut a fost ntotdeauna > 3,5 ceea ce indic o foarte bun separare a picurilor aa cum se poate i observa din cromatogram. VI.2.4.2. Liniaritatea metodei Pentru evaluarea liniaritii s-a stabilit curba de etalonare format din 7 puncte. Din fiecare concentraie s-au rulat cte 3 flacoane, iar n tabelul 19 este trecuta media ariilor picurilor obinute pentru coloana DB-ALC1 i detectorul FID-1A. Curba de calibrare este prezentat n figura 17.

33

Tabelul 19. Parametrii caracteristici curbei de etalonare realizat pe coloana DB-ALC1 pentru analiza etanolului tR Concentraia soluiei Media ariilor Semnalul (min) de alcool etilic (g) picurilor 0,5 94,48441 0,8 143,54817 1,0 179,07971 coloana DB-ALC1 1,593 1,5 263,82382 detector FID-1A 2,0 355,03076 3,0 574,42194 4,0 728,93152
etanol, FID1 A Area Ratio = 0.03674466*AmtRatio -0.0007516 Area Ratio 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 5 1 Correlation: 0.99994 Amount Ratio 2 3 4 5 6 Rel. Res%(1): -1.522 7

Fig. 17. Curba de calibrare obinut la analiza alcoolului etilic pe coloana DB-ALC1 i detectorul FID-1A

Ecuaiile dreptelor caracteristice celor dou curbe de calibrare sunt: pentru curba realizat pe coloana DB-ALC1, detector FID-1A pentru curba realizat pe coloana DB-ALC2, detector FID-2B
y = 185,77 x 5,512 R2 = 0,99993 y = 178,55 x 3,774 R2 = 0,99994

VI.2.4.3. Precizia Precizia sistemului a fost stabilit prin rularea unor probe de snge de la pacieni diferii, cte 5 determinri pentru fiecare pacient. n cazul analizei probelor de la primii doi pacieni (probele au fost perfect omogene) valorile RSD au fost sub 1%: 0,905325 (pacientul 1) i 0,961965 (pacientul 2). Analiznd proba provenit de la al treilea pacient s-a obinut un RSD de 2,518, ceea ce dovedete c atunci cnd sngele nu este perfect omogen valoarea RSD crete, dar creterea este n limita
34

acceptat de specificaiile tehnice ale aparatului (maxim 5%). Precizia intermediar i reproductibilitatea, urmeaz a fi demonstrate n colaborare cu colegii din celelalte laboratoare. VI.2.4.4. Repetabilitatea Repetabilitatea analizei (precizia intra-proba) s-a stabilit prin efectuarea a cte 9 determinri pentru fiecare nivel de concentraie cunoscut, n cadrul aceleai zile. Datele obinute la analiza soluiilor de concentraie de 1,5 g; 2,5 g i 3 g, cu media, deviaiile standard (SD) i valorile RSD sunt prezentate n tabelul 20.
Tabelul 20. Rezultatele obinute la evaluarea repetabilitii analizei (precizia intra-prob) Date practice obinute la analiza soluiei etalon Nr. de concentraie determinrii 1,5 g 2,5 g 3 g 1 1,53333 2,51206 3,00373 2 1,53338 2,45475 3,00767 3 1,54975 2,46245 3,01235 4 1,52861 2,50904 3,02735 5 1,52984 2,50282 3,01935 6 1,54295 2,51022 3,07797 7 1,53315 2,51201 3,00975 8 1,53320 2,45571 3,03135 9 1,54379 2,46131 3,02147 Media 1,536444 2,486708 3,023443 SD 0,007235 0,026948 0,022415 RSD (CV) 0,470905 1,083699 0,741383

etaloanele cu alcool n ap drept probe, obinndu-se concentraii apropiate de cele teoretice, procentul de regsire ncadrndu-se ntre 100,39% i 102,2% (n funcie de coloan i detector), etaloane de snge de control care conin etanol cu urmtoarele concentraii: 0,25 g; 0,5 g; 0,8 g; 1,1 g, procentele de regsire fiind intre 99,61% i 103,12%. Pentru fiecare concentraie s-au rulat cte 3 flacoane, n tabel fiind trecut media.
35

rulat:

VI.2.4.5. Acurateea Pentru determinarea acurateei (exactitatea) metodei s-au

Datele obinute pentru toate cele 7 puncte din curba de etalonare i regsirea pentru soluiile etalon de etanol n ap sunt prezentate n tabelul 21.
Tabelul 21. Rezultatele obinute la evaluarea acurateei metodei, utiliznd soluii de etanol n ap tR Media ariilor Concentraia Concentraia Regsirea (min) picurilor teoretic (g) determinat (g) (%) 1,589 94,48441 0,5 0,50194 100,39% 1,591 143,54817 0,8 0,80912 101,14% 1,591 179,07971 1,0 1,01051 101,05% 1,592 263,82382 1,5 1,53338 102,22% 1,591 355,03076 2,0 2,03223 101,61% 1,590 574,42194 3,0 3,00767 100,25% 1,593 728,93152 4,0 4,07141 101,78%

Pentru sigurana rezultatelor zilnice, n fiecare zi trebuie verificat curba de etalonare din ziua precedent, evalundu-se cel puin 2, 3 puncte de pe curb, de concentraii cunoscute. Dac, n urma verificrilor curba corespunde, se introduc probele de snge de control, corespunztoare la minim 2 puncte din curba de etalonare i abia apoi se introduc probele de la pacieni. Dup ce a fost verificat curba de etalonare utiliznd soluii de etalon n ap corespunztoare la trei puncte din curb, s-a trecut la verificarea concentraiilor unor probe standardizate de etanol n snge, rezultatele fiind prezentate n tabelul 22.
Tabelul 22. Datele obinute la analiza probei standardizate de etanol n snge (coloana DB-ALC1, detector FID-1A) tR Media ariilor Concentraia Concentraia Regsirea (min) picuril teoretic (g) determinat (g) (%) 1,594 98,41310 0,5 0,53014 106,03 1,594 138,54683 0,8 0,82873 103,59 1,593 191,59000 1,1 1,14448 104,04

Se observ c procentele de regsire, la analiza probelor standardizate de etanol n snge, sunt mai mari comparativ cu cele determinate la analiza soluiilor de etanol n ap, ele ncadrndu-se n limitele cerute pentru validarea metodelor pe produse biologice (20%) i n limitele intervalului de ncredere recomandat de
36

productori. Cu toate acestea, utilizarea sngelui de control, care este un sistem foarte stabil, permite utilizarea zilnic a acestor probe pentru o perioad mai lung de timp, astfel se pot utiliza probe zilnice pentru o perioad de cel puin o lun fr s prezinte modificri semnificative ale concentraiilor de etanol. Rezultatele obinute la realizarea curbelor de calibrare i la analiza probelor de snge standardizate n etanol au fost aplicate la analiza probelor de snge. Din fiecare prob s-au rulat cte 5-8 flacoane. Valorile pentru deviaia standard relativ (RSD), calculat pe baza programului ChemStation au fost ntre 0,5-3,5%. S-a stabilit acurateea metodei i pe snge, realiznd o curb de calibrare cu etanol n snge standardizat (Medichem), n 5 puncte de concentraii (tabelul 23). Pentru curba de calibrare respectiv coeficientul de corelaie a fost 0,99921, ceea ce indic o foarte bun liniaritate a metodei i pe standarde de snge. Dup stabilirea liniaritii s-au rulat probe cu snge de control standardizate de aceleai concentraii ca i cele din curb.
Tabelul 23. Caracteristicile curbei de calibrare cu etanol n snge standardizat Concentraia Media tR Semnalul soluiei de ariilor (min) alcool (g) picurilor 0,25 48,45324 0,40 74,32893 coloana DB-ALC1 1,593 0,50 90,43574 detector FID-1A 0,80 150,34129 1,10 213,73936

Dup realizarea curbei de etalonare cu probe de snge standardizate n etanol, exactitatea i precizia metodei au fost stabilite prin verificarea punctelor de pe curb, rezultatele sunt prezentate n tabelul 24 (coloana DB-ALC1, detector FID-1A).

37

Tabelul 24. Datele obinute la evaluarea exactitii i preciziei metodei n cazul utilizrii unor probe de snge standardizate n etanol t R Media ariilor Concentraia Concentraia Regsirea (min) picurilor teoretic (g) determinat (g) (%) 1,593 75,12577 0,25 0,24702 98,80% 1,593 75,12577 0,40 0,39488 98,72% 1,592 97,59976 0,50 0,50845 101,69% 1,597 145,86461 0,80 0,81571 101,96% 1,593 223,48657 1,10 1,13307 103,00%

Procentele de regsire calculate la verificarea punctelor din curba de calibrare, cuprinse ntre 98,72 i 103%, ne indic faptul c, n condiiile utilizate, metoda de separare a etanolului din proba biologic cu o compoziie complex (snge), prin utilizarea metodei GC-HS asigur obinerea unor rezultate foarte exacte, cu posibilitatea verificrii zilnice a curbei de calibrare i implicit a echipamentului. VI.2.4.6. Limita de detecie i limita de cuantificare Rezultatele sunt prezentate n tabelul 25.
Tabelul 25. Limitele de detecie i de cuantificare calculate la analiza alcoolului etilic prin GC-HS Semnal ES a LD (g) LC (g) 1 4,470 187,055 0,071 0,238 2 4,708 194,137 0,072 0,242

VI.2.5. Concluzii Rezultatele obinute arat c pe domeniul de concentraie studiat (0,062-4,0 g) metoda este liniar, exact i precis (RDS 3,5%), rapid, iar sngele nu necesit prelucrri suplimentare, doar o diluie cu standard intern. Omogenitatea matricei este direct proporional cu exactitatea rezultatelor, obinndu-se pentru probele omogene valori ale RDS 1,5%. Metoda va putea fi aplicat n laboratoarele institutelor i serviciilor de medicin legal care astfel se vor alinia prevederilor normelor internaionale. Sugerm s se lucreze probele n duplicat, s se fac media lor i s se calculeze zilnic biasul (deplasarea fa de int) sau incertitudinea de msurare.
38

Pentru a substitui n cadrul laboratoarelor de toxicologie medico-legal metoda utilizat n prezent i anume metoda Cordebard, este necesar s fie evideniate avantajele noii metode elaborate. Pentru a arta acest lucru s-a efectuat un studiu comparativ al celor dou metode. VI.3.3. Materiale i aparatur Probe biologice probe biologice provenite de la persoane decedate - 22 de probe de snge recoltat din vena femural i 9 probe de urin; probe biologice provenite de la 50 de conductori auto. VI.3.4. Rezultate i discuii Rezultatele obinute la analiza prin cele dou metode, a probelor recoltate de la persoane decedate, sunt prezentate comparativ n figurile 18 i 19.
5 4 3 2 1 0 303 295 108 107 112 117 118 98 106 116 89 87 79 63 65 171 170 167 155 159 153 158 Metoda Cordebard Metoda GC-HS

VI.3. PREZENTAREA COMPARATIV A CONCENTRAIEI ALCOOLULUI ETILIC DETERMINAT N FLUIDE BIOLOGICE PRIN METODA GAZ-CROMATOGRAFIC I METODA CORDEBARD

Fig. 18. Prezentarea grafic comparativ a rezultatelor obinute la determinarea concentraiei alcoolului n probele de snge, provenite de la cadavre, prin metoda Cordebard i metoda GC-HS

39

5 4 3 2 1 0 295

Metoda Cordebard Metoda GC-HS

108

107

112

116

89

159

153

158

Fig. 19. Prezentarea grafic comparativ a rezultatelor obinute la determinarea concentraiei alcoolului n probele urin, provenite de la cadavre, prin metoda Cordebard i metoda GC-HS

Analiza datelor indic faptul c la valori mari ale alcoolemiei, exist diferene mari ntre cele dou metode, probabil datorit n principal faptului c metoda Cordebard este liniar doar pn la valori n jur de 2,5-2,8 g n timp ce metoda GC-HS este liniar pe un interval mai mare de valori. Probele care depesc aceste valori ar trebui diluate i reanalizate prin medota Cordebrad. n cazurile n care prin metoda Cordebard avem valori mult mai mari comparativ cu gaz cromatografia explicaia ar putea fi c metoda Cordebard nefiind specific etanolului, n cazul n care n matricea de interes sunt i alte substane volatile acestea interfer cu etanolul, ceea ce duce la valori fals crescute pentru etanol. Pentru 13 din cele 22 de probe de snge analizate, concentraia etanolului n vena femural, determinat prin metoda GC-HS este mai mare dect cea determinat prin metoda Cordebard, n timp ce la analiza probelor de urin pentru toate cazurile analizate concentraia alcoolului determinat prin GC-HS este mai mare dect pentru metoda Cordebard. Pentru probele de snge concentraia mai mare obinut prin metoda GC-HS a fost observat n cazul n care concentraia alcoolului a depit valoarea de 2 g. Fenomenul a fost observat i la analiza probelor de urin (figura 19) unde n toate cazurile concentraia alcoolului a depit valoarea de 2 g prin metoda Cordebard, respectiv 2,5 g prin metoda GC-HS. Diferenele nregistrate au fost cuprinse ntre 0,25 i 1,19 g.
40

Diferenele sunt foarte importante pentru medicina legal, avnd n vedere c analiza datelor statistice indic faptul c la valori ale alcoolemiei de peste 2 g sunt nregistrate cele mai multe decese sau fapte antisociale. Au fost realizate i determinri comparative, prin cele dou metode, pe 50 de probe provenite de la conductori auto. Au fost analizate probe n duplicat, iar n lucrare este prezentat media celor dou determinri. Rezultatele obinute au fost grupate n funcie de valoarea alcoolemiei determinat prin metoda Cordebard, astfel: alcoolemie 0-0,5 g; alcoolemie 0,5-1 g, alcoolemie 1-1,5 g, alcoolemie 1,5-2 g i alcoolemie peste 2 g (figurile 20-24).
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 2 37 Metoda Cordebard Metoda GC-HS

alcoolemie

46

proba

Fig. 20. Prezentarea grafic comparativ a rezultatelor obinute la determinarea alcoolemiei, prin metoda Cordebard (alcoolemie 0-0,5 g) i metoda GC-HS
alcoolemie 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 5 6 11 19 20 22 10 31 38 39 47 48 proba
Metoda Cordebard Metoda GC-HS

Fig. 21. Prezentarea grafic comparativ a rezultatelor obinute la determinarea alcoolemiei, prin metoda Cordebard (alcoolemie 0,5-1 g) i metoda GC-HS
41

1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 7 8

Metoda Cordebard

Metoda GC-HS

alcoolemie

14 16 17 18 21 23 25 28 32 33 40 42 43 45 49 proba

Fig. 22. Prezentarea grafic comparativ a rezultatelor obinute la determinarea alcoolemiei, prin metoda Cordebard (alcoolemie 1-1,5 g) i metoda GC-HS
2,5 2 alcoolemie 1,5 1 0,5 0 1 12 13 15 24 27 29 30 34 35 36 41 44 50 proba Metoda Cordebard Metoda GC-HS

Fig. 23. Prezentarea grafic comparativ a rezultatelor obinute la determinarea alcoolemiei, prin metoda Cordebard (alcoolemie 1,5-2 g) i metoda GC-HS

42

3 2,5 alcoolemie 2 1,5 1 0,5 0 3

Metoda Cordebard

Metoda GC-HS

26

proba

Fig. 24. Prezentarea grafic comparativ a rezultatelor obinute la determinarea alcoolemiei, prin metoda Cordebard (alcoolemie peste 2 g) i metoda GC-HS

Din cele 50 de probe analizate, n 424 de cazuri concentraia alcoolului determinat prin metoda GC-HS a fost mai mare dect cea determinat prin metoda Cordebard. Diferenele au fost observate mai ales n cazul probelor cu alcoolemie peste 1,5 g. Aceste diferene nregistrate au fost ntre 0,01 i 0,32 g. Au fost nregistrate i cazuri n care alcoolemia determinat prin metoda Cordebard a prezentat valori mai mici dect cea determinat prin metoda GC-HS, dar de aceast dat diferena dintre valorile nregistrate a fost mai mic, cuprins ntre 0,02 i 0,13 g. Diferenele, mai mari ntre rezultatele determinrilor efectuate la cadavre dect cele efectuate la persoanele vii, sunt determinate de caracteristicile probelor de snge recoltate de la aceti indivizi i subliniaz nc odat faptul c post-mortem au loc transformri n organism i care se reflect n concentraia alcoolului determinat. VI.3.5. Concluzii Prin metoda GC-HS probele se prelucreaz extrem de simplu i de rapid (6 minute). Probele trebuie s fie ct mai omogene, deoarece neomogenitatea lor determin creterea valorii RSD. Prin faptul c zilnic putem controla curba de calibrare, folosind att etaloane n snge ct i n ap, putem s calculm regsirea, deci implicit avem informaii asupra rezultatelor probelor de control, putem avea i certitudinea corectitudinii rezultatelor finale ale pacienilor.
43

Utilizarea sistemului HS(headspace) care folosete n analiz vaporii rezultai n urma volatilizrii alcoolului din prob, exclude riscul de contaminare a detectorului, de deteriorare sau contaminare a fazei staionare(coloanelor). Metoda Cordebard fiind manual, face ca erorile care apar zilnic s nu poat fi controlate. Faptul c metoda folosete cantiti mari de prob i probele nu pot fi lucrate n duplicat constituie alt dezavantaj. Deoarece post mortem pot apare n procesul de putrefacie i alte substane volatile cu molecule mici, care n metoda Cordebard interferau cu etanolul, folosind tehnica GC-HS aceste erori dispar cu desvrire.
VI.4. APLICAREA METODEI DE DOZARE A ETANOLULUI PRIN GC-HC DIN FLUIDE BIOLOGICE RECOLTATE POST-MORTEM

Eantionul ideal pentru determinarea alcoolului post mortem este sngele i anume sngele recoltat din venele periferice (femural, subclavicular), deoarece este cel mai puin expus modificrilor post mortem. Cnd nu se poate preleva o cantitate suficient din sngele periferic se recolteaz snge din diverse alte locuri din organism, dar n final rezultatele obinute trebuie corelate, deoarece concentraia alcoolului depinde de zona de unde a fost recoltat proba. Posibilele surse de etanol post mortem, pot fi, din ingestia antemortem, producia endogen antemortem i neoformarea microbian postmortem. Pentru a putea avea un tablou ct mai complet privind concentraia alcoolului la momentul morii s-au analizat probe biologice recoltate din diferite zone ale organismului. VI.4.3. Materiale i aparatur Probele au fost analizate prin GC-HS, utiliznd ter-butanolul ca standard intern. Toate probele au fost analizate n duplicat i s-a nregistrat media valorilor obinute. Probe biologice probe de snge prelevate din vena femural, artera aort (inima stng); artera pulmonar (inima dreapta); lichid pericardic (LP), lichid cefalorahidian (LCR), umoarea
44

vitroas (UV), urin. Au fost analizate probe biologice provenite de la 33 de cadavre n cadrul Serviciului Judeean de Medicina Legal Vaslui. Numrul cazurilor luate n lucru a fost de 150 de cadavre, din care au fost selectate cele care nu au fost putrefiate, care nu au suferit traumatisme severe i care au avut valori relativ mari ale alcoolemiei. VI.4.4. Rezultate i discuii Rezultatele obinute la analiza probelor biologice provenite de la cele 33 de cadavre, sunt prezentate n tabelul 26.
Tabelul 26. Concentraia alcoolului n fluidele biologice recoltate de la cadavre Snge Snge Nr. Snge artera vena UV LCR LP urin caz aort pulmonar femural 286 1,52 1,93 1,65 1,53 1,84 3,05 1,20 303 1,65 1,80 1,82 1,50 2,26 108 2,28 2,34 2,57 3,25 3,20 2,90 117 0,78 0,97 1,07 0,67 1,30 87 0,40 0,47 0,48 0,45 0,75 0,30 79 5,66 6,00 4,63 4,66 4,93 103 2,33 2,45 2,50 2,83 2,92 167 3,09 3,80 3,45 3,87 4,08 4,10 3,40 163 0,55 0,57 0,69 0,96 0,67 1,80 277 3,15 3,40 3,32 4,54 4,55 3,84 89 4,38 4,67 4,52 5,10 5,52 6,54 4,73 159 2,18 2,77 2,43 3,20 3,01 3,68 146 1,59 1,61 1,67 2,53 2,45 2,47 280 3,51 3,74 3,50 4,70 4,70 4,18 198 3,53 4,08 3,63 4,80 4,14 5,80 4,52 98 1,63 1,54 1,60 1,62 1,68 1,66 63 2,51 2,25 2,34 2,82 3,40 65 2,58 2,54 2,57 3,42 3,32 3,11 2,80 116 3,47 3,22 3,14 4,87 4,55 3,85 106 1,75 1,53 1,58 2,08 2,25 2,18 118 1,44 1,28 1,54 1,96 1,98 112 3,78 3,23 4,00 5,13 3,85 107 4,96 4,64 3,94 5,00 5,28 3,70 295 2,50 2,32 2,60 3,48 3,32 3,85
45

Nr. crt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

25 26 27 28 29 30 31 32 33

215 202 100 171 170 168 155 153 158

1,36 1,20 0,81 2,76 0,68 2,43 3,33 2,88 2,51

1,05 1,15 0,80 2,45 0,68 2,32 3,21 2,82 2,33

1,33 1,43 0,66 3,20 0,73 2,50 3,44 3,03 2,73

1,63 1,95 0,83 3,53 0,94 3,20 3,92 3,71 3,15

1,80 0,96 3,21 3,26 4,00 -

1,53 1,72 0,97 3,72 1,24 4,18 3,64 3,33

1,65 2,00 3,67 0,95 3,25 4,34 4,07

VI.4.5.1. Determinarea concentraiei alcoolului din snge Aa cum se poate observa din datele prezentate, n cazurile 1-15, valorile etanolului din sngele provenind din aort, sunt uor mai mari dect cele provenite din artera pulmonar. Aceste diferene ar putea fi explicate prin redistribuia postmortem a alcolului, astfel imediat dup deces acesta poate difuza datorit gradientului de concentraie din stomac ctre pericard i camerele cardiace. Fenomenul este uor de neles datorit poziiei anatomice a stomacului care se afl n apropiere de camera stng a inimii. Diferenele dintre cordul drept i respectiv cel stng depind n cea mai mare parte de concentraia etanolului n stomac la momentul decesului. Comparativ rezultatele obinute pentru cele dou pri ale inimii cu corespondent n artera aort i arterele pulmonare sunt prezentate n figura 25.
7 6 5 4 3 2 1 0
286 303 295 108 107 112 117 100 118 98 103 106 116 89 87 79 63 65 277 280 215 202 198 171 170 168 167 155 163 159 153 158 146

pulmonara aorta

Fig. 25. Prezentarea grafic comparativ a rezultatelor obinute la determinarea concentraiei alcoolului n artera aort i artera pulmonar
46

Un alt fenomen descris frecvent, i care a fost observat i n cazurile noastre a fost cel de redistribuie prin cile pulmonare, dac coninutul gastric este aspirat n aceste ci, ceea ce sugereaz c redistribuia are loc prin venele pulmonare ctre camera stng a inimii. Aspirarea poate s apar n timpul proceselor de agonie sau dup moarte n timpul relaxrii sfincterului gastro-esofagian. Este recomandat recoltarea sngelui din cordul drept (artere pulmonare) deoarece este mai puin influenat de redistribuie dect cel din cordul stng. Cnd concentraia este mai mare n inima dreapta dect n partea stng a inimii, cauza ar putea fi glicogenoliza hepatic post mortem: n urma acestui proces se elibereaz glucoz n inima dreapt prin venele hepatice i vena cav inferioar, ceea ce poate determina producia endogen de alcool post mortem. n studiul nostru au fost 7 cazuri cu regurgitare (1, 3, 8, 10, 11, 14, 15) n care valoarea etanolului a fost mai mare n sngele provenind din aort (inima stng) dect din artera pulmonar (dreapta). Media raportului dintre snge aort/snge femural (fig. 26) a fost de 0,97 i cel dintre artera pulmonar/snge femural este tot de 0,97. Se observ ca nu exist diferene mari de concentraii ale etanolului ntre camerele cardiace i sngele femural, probabil datorit faptului c n cadavrele studiate nu s-au observat semne de putrefacie i cadavrele nu au prezentat traumatisme severe care ar fi putut s influeneze aceste valori. n studiul nostru n cazurile 16, 18, 21, 26, 27, 30, 31, 32, 33, diferenele dintre cele dou camere ale inimii fiind foarte mici putem sugera c diferena se poate datora formrii de etanol post mortem n camera dreapt.

47

7 6 5 4 3 2 1 0

Vena femural Aort

Fig. 26. Prezentarea grafic comparativ a rezultatelor obinute la determinarea concentraiei alcoolului (g) n vena femural i artera aort

VI.4.5.2. Determinarea concentraiei alcoolului din urin Avantajul major al folosirii urinei comparativ cu sngele este acela c invazia bacteriilor i fungilor asupra vezicii urinare este extrem de mic, exceptnd cazurile de diabet. Rezultatele obinute la dozarea alcoolului din vena femural i urin sunt prezentate comparativ n figura 27.
5 4 3 2 1 0 286 303 108 117 87 167 163 277 89 159 146 280 198 65 116 112 107 295 215 202 171 170 168 153 158 Vena femural Urin

Fig. 27. Prezentarea grafic comparativ a rezultatelor obinute la determinarea concentraiei alcoolului din vena femural i urin

Raportul urin/snge, ne poate da informaii despre cinetica etanolului, dac a fost atins echilibrul n organism i dac alcoolul este n faz de eliminare sau de absorbie.
48

286 303 108 117 87 79 103 167 163 277 89 159 146 280 198 98 63 65 116 106 118 112 107 295 215 202 100 171 170 168 155 153 158

Conform datelor din literatura de specialitate ntre momentul realizrii concentraiei maxime a alcoolului n snge i al realizrii concentraiei maxime a alcoolului n urin exist o perioad de ntrziere i n funcie de aceasta se poate stabili dac individul a consumat recent sau nu, alcoolul care a fost determinat n fluidele biologice. n studiul nostru pe 33 de autopsii s-a gsit o medie a raportului urin/snge de 1,27, ceea ce sugereaz c marea majoritate a cazurilor luate n studiu au fost n faza de eliminare. VI.4.5.3. Determinarea concentraiei alcoolului n umoarea vitroas Datorit izolrii sale de restul corpului riscul de contaminare sau de difuzie a microorganismelor din stomac este mult redus sau chiar inexistent. Umoarea vitroas este ntr-un compartiment periferic al corpului i exist o ntrziere n absorbia i eliminarea alcoolului, comparativ cu sngele. O concentraie negativ a etanolului n vitros, i un rezultat pozitiv n snge, sugestioneaz c alcoolul din snge a fost produs post mortem i nu provine din ingestie. Datele din literatura de specialitate indic o medie a raportului vitros/snge cuprins ntre 0,91 i 1,34. n studiul nostru am obinut o medie a acestui raport de 1,22. n cazurile n care valoarea n vitros este mai mare dect n vena femural, se poate concluziona c alcoolul este n faza de eliminare. Comparativ rezultatele obinute la determinarea concentraiei alcoolului din vena femural i umoarea vitroas sunt prezentate n figura 28.

49

6 5 4 3 2 1 0

Ve na fe mural UV

Pentru cele trei lichide cu coninut apos ridicat, cum sunt urina, lichidul pericardic (LP) i umoarea vitroas, au fost analizate doar 21 de probe deoarece pentru celelalte cazuri nu a fost posibil recoltarea fluidului biologic. Se observ diferene relativ mici ntre cele trei fluide biologice care au un coninut mare de ap n compoziie, n 9 cazuri diferenele fiind aproape nesemnificative, ceea ce poate sugera c n cazurile cnd nu avem la dispoziie snge, oricare din aceste fluide ne poate ajuta s avem o orientare privind concentraia etanolului. VI.4.5.4. Determinarea concentraiei alcoolului n lichidul cefalorahidian Un alt fluid biologic luat n studiu a fost lichidul cefalorahidian (LCR), care poate s indice concentraia etanolului n sistemul nervos central. Pentru cazurile analizate (18 din 33 de probe) n cadrul studiului nostru, concentraia alcoolului n snge este n general mai mic dect cea determinat n LCR. Comparativ rezultatele obinute la analiza sngelui din vena femural i lichidul cefalorahidian sunt prezentate n figura 29. n cadrul studiului nostru raportul LCR/snge femural a fost de 1,19, raport ce este susinut i de datele din literatur, conform crora, acest raport ar trebui s fie de 1,2.

Fig. 28. Prezentarea grafic comparativ a rezultatelor obinute la determinarea concentraiei alcoolului (g) din vena femural i umoarea vitroas

286 108 117 87 79 103 167 163 277 89 159 146 280 198 98 63 65 116 106 118 107 295 215 202 100 171 170 168 155 153 158

50

6 5 4 3 2 1 0
286 303 79 103 167 89 198 98 65 106 118 112 107 202

Vena femural LCR

100

171

168

Aa cum se poate observa din datele prezentate, concentraiile etanolului n LCR sunt apropiate de cele din vitros, ceea ce ar putea sugera c n lipsa vitrosului, poate fi utilizat LCR-ul alturi de snge pentru evaluarea cineticii etanolului. VI.4.6. Concluzii Datorit unei variabiliti extrem de mari a condiiilor i factorilor de mediu, de prelevare a probelor, de natura probelor, de starea cadavrului este extrem de dificil s exprimm cu certitudine valoarea concentraiei etanolului la momentul decesului. Lund n studiu probe de snge i patru tipuri de fluide biologice care nu conin hematii, fcnd corelaii ntre ele i raportnd rezultatele pentru fiecare caz la sngele din vena femural, se poate sugera c oricare din aceste fluide este extrem de folositor pentru a putea vedea cinetica alcoolului post mortem. Aa cum se poate observa din graficele prezentate, n funcie de starea cadavrului, se poate ncerca s se preleveze oricare fluid din cele prezentate, care este considerat a fi cel mai puin expus modificrilor post mortem specifice fiecrui decedat. Rezultate ct mai precise n interpretarea post mortem, putem avea ncercnd s reducem sursele de erori din faza preanalitic, astfel colectarea, pregtirea, stocarea probelor, s fie ct mai corect efectuate, s prelevm probe multiple din ct mai multe locuri din organism ncercnd s avem ct mai corect un indiciu despre cinetica etanolului la momentul morii, i ncercnd s determinm dac proba de interes conine i alte substane volatile n afar de etanol.
51

Fig. 29. Prezentarea comparativ a rezultatelor obinute la determinarea concentraiei alcoolului (g) din vena femural i lichidul cefalorahidian

155

VII. CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE

Lucrarea este structurat n dou pri: Stadiul cunoaterii - capitolele II i III. Contribuiile personale- capitolele IV, V i VI. Capitolul II conine date din literatura de specialitate referitoare la: sinteza i proprietile fizico-chimice ale alcoolul etilic; proprietile toxicologice i date privind situaia consumului de alcool n lume, Uniunea European i n Romnia. Capitolul III cuprinde date privind metodele chimicotoxicologice de investigare a alcoolului etilic. n capitolul IV sunt prezentate date asupra consumului de alcool n Judeul Vaslui. Pentru evaluarea consumului de alcool n judeul Vaslui, n perioada 2005-2010, au fost analizate 6460 de probe de snge provenite de la conductorii auto i 4459 de probe provenite de la cadavru. Probele au fost analizate prin metoda Cordebard (metoda oficial). Din cele 6460 probe provenite de la conductorii auto, n perioada 2005-2010, 3772 (58,39%) au prezentat alcoolemie peste 0,8 g, limit considerat penal, conform legislaiei n vigoare n Romnia. Numrul cazurilor cu alcoolemie peste valoarea de 0,8 g a crescut de la an la an, de la 386 (35,35%) cazuri n anul 2005, la 452 (47,23%) n 2006, 602 (58,79%) n 2007, 794 (63,02%) n 2008, 733 (68,96%) n anul 2009 i 805 (75,66%) n anul 2010. Datele ne arat c se impune un control mai riguros al conductorilor auto i n acelai timp o mbuntire a metodelor de determinare deoarece o mare parte din conductorii auto ajung s conteste aceste rezultate i pot eluda prevederile legale. Probele prelevate de la cadavru au fost repartizate astfel n funcie de valoarea alcoolemiei: 2195 cu alcoolemie 0 g; 520 cu alcoolemie ntre 0 i 0,8 g; 778 cu alcoolemie ntre 0,8 i 2 g; 655 cu alcoolemie ntre 2 i 3 g; 311 cu alcoolemie peste 3 g.
52

14,69% probe au prezentat valori ale alcoolemiei ntre 2 i 3 g, iar 6,97% au prezentat valori ale alcoolemiei de peste 3 g. n capitolul V sunt prezentate rezultatele studiului privind stabilirea unor corelaii ntre valoarea alcoolemiei i cauzele de deces. Au fost analizate probe prelevate de la 1300 de cadavre pe o perioad de 3 ani i au fost luate n studiu 356 de cazuri n care valoarea alcoolemiei a fost mai mare de 0,40 g. n aproape toate cazurile au fost analizate probe de snge din vena femural, i n mod variabil probe de urin i/sau umoare vitroas. Determinarea concentraiei alcoolului din fluide biologice recoltate s-a efectuat prin metoda Cordebard. Din rezultatele obinute, pentru o perioad de trei ani (2008-2010) se constat c: - la 78 persoane (21,91%) decesul s-a produs prin afectare cardiac, iar concentraiile maxime de alcool determinate au crescut de la an la an: 2,45 g (2008); 2,75 g (2009) i 3,25 g (2010); - n cazul persoanelor decedate prin com etilic (46 cazuri, 12,92%) valorile medii ale concentraiei alcoolice n toi anii la brbai sunt peste 3,50 g, iar la femei peste 2,99 g; - n perioada 2008-2010 s-a determinat concentraia alcoolului n 50 (14,04%) de cazuri de sinucidere prin spnzurare. Concentraia alcoolic medie n vena femural a variat ntre 1,40-2,60 g (2008); 0,50-3,15 g (2009) i 0,40-3,20 g (2010); - 26 (7,30%) de decese au fost determinate de hipotermia asociat cu consumul de alcool. Valoarea maxim a alcoolului din vena femural s-a nregistrat n anul 2009 (2,60 g); - s-au analizat 23 (6,46%) cazuri de deces prin accidente rutiere i feroviare; valorile medii ale alcoolemiei au oscilat ntre 0,65 g (mediu urban) i 2,91 g (mediu rural); - n perioada 2008-2010 n judeul Vaslui au decedat 23 (6,46%) de persoane din cauza intoxicaiilor cu diferite substane i consum de alcool; cele mai multe intoxicaii au fost cu monoxid de carbon (16 cazuri); - din rezultatele obinute pe perioada luat n studiu se constat c cel mai mare procentaj de decese sunt din cauz cardiac (21,91%) asociat cu consumul de alcool, urmeaz sinuciderile prin
53

spnzurare (14,04%) i comele etilice (12,92%). Capitolul VI cuprinde rezultatele studiilor chimicotoxicologice de determinare a alcoolului etilic prin GC-HS. n subcapitolul VI.1. sunt prezentate rezultatele privind elaborarea i validarea metodei de dozare a etanolului din snge prin GC-HS folosind izopropanolul ca standard intern. Pentru analiz s-a folosit un echipament Agilent, GC 6890 N, cu headspace G 1888 (HS). Parametrii obinui n urma validrii sunt: - specificitatea metodei - evideniat prin determinarea unor timpi de retenie diferii pentru analit (alcool etilic - 1,361 min. coloana DB-ALC1) i standardul intern (izopropanol - 1,550 min. - coloana DB-ALC1); - domeniul de liniaritate: 0,5-4,0 g; - limita de detecie: 0,053 g (coloana DB-ALC1), 0,055 g (coloana DB-ALC2); - limita de cuantificare: 0,177 g (DB-ALC1); 0,186 g (DB-ALC2); - precizia sistemului - RDS 3,5%; - exactitatea i precizia metodei: s-au determinat procentele de regsire ntre 99,37% i 107,7%. Metoda validat elimin orice surs de eroare i confer analistului sigurana unui rezultat corect. n subcapitolul VI.2. sunt prezentate rezultatele obinute la dezvoltarea i validarea metodei de determinare a etanolului din diverse fluide biologice folosind ter-butanolul drept standard intern. A fost necesar schimbarea standardului intern pentru a aplica metoda la analiza probelor biologice provenite de la cadavre unde au loc i procese de putrefacie, cnd se sintetizeaz izopropanol. Rezultatele obinute au demonstrat c metoda este: specific - pentru cei doi alcooli s-au obinut timpi de retenie diferii: alcool etilic - 1,593 min. (coloana DB-ALC1); 1,544 min. (coloana DB-ALC2); ter-butanol - 2,252 min. (coloana DB-ALC1); 2,155 min. (coloana DB-ALC2); liniar n intervalul de concentraie 0,5-4,0 g, curbele de calibrare fiind caracterizate prin coeficieni de corelaie de 0,99994 (coloana DB-ALC1) i 0,99993 (DB-ALC2);
54

 precis i exact: precizia sistemului a fost stabilit prin rularea unor probe de snge de la pacieni diferii, cnd s-au obinut valori ale RSD sub 1% pentru probele omogene i n jur de 2,5% pentru probe neomogene. Repetabilitatea analizei (precizia intra-prob) s-a analizat efectundu-se cte 9 determinri pe fiecare nivel de concentraie cunoscut, n cadrul aceleai zile. Rezultatele obinute ncadrndu-se n marja de eroare admisibil pentru acest tip de aparat (RSD < 5%) i pentru probele biologice (20). Pentru determinarea acurateei (exactitatea) s-au determinat valori ale procentul de regsire ntre 100,39% i 102,2% pentru soluiile de etanol n ap, respectiv ntre 99,61% i 103,12% pentru etaloane de snge de control care conin etanol. Determinrile efectuate pe probe cu omogenitate diferit au demonstrat c lipsa omogenitii matricei determin n mod proporional creterea valorii RSD ceea ce va induce erori de interpretare a rezultatelor. Limitele de detecie stabilite pentru aceast metod au fost: 0,071 g (coloana DB-ALC1) i 0,072 g (coloana DB-ALC2). Limitele de cuantificare: 0,238 g (coloana DB-ALC1) i 0,242 g (coloana DB-ALC2). Subcapitolul VI.3. cuprinde rezultatele obinute la analiza concentraiei alcoolului etilic din fluide biologice prin metoda GC-HS i metoda Cordebard. Au fost analizate 22 de probe de snge recoltate din vena femural de la cadavre, 9 probe de urin de la cadavre i 50 de probe de snge de la conductorii auto. Date obinute ne arat c, att la probele de snge ct i de urin exist diferene ale concentraiei alcoolului ntre cele dou metode i anume prin metoda GC-HS s-au obinut valori mai mari fa de metoda Cordebard mai ales pentru valori ale alcoolului mai mari de 2 g. Pentru probele provenite de la conductorii auto, n majoritatea cazurilor s-au gsit alcoolemii mai mari prin metoda GC-HS fa de metoda Cordebard. Rezultatele obinute la aplicarea metodei de dozare a etanolului prin GC-HS din fluide biologice recoltate post-mortem folosind ter-butanolul drept standard intern sunt prezentate n subcapitolul VI.4.
55

n funcie de starea cadavrului au fost recoltate probe de snge (vena femural, artera aort, artera pulmonar), umoare vitroas, lichid cefalorahidian, urin, lichid pericardic. Probele au provenit de la 33 de cadavre i au fost analizate n cadrul Serviciului Judeean de Medicin Legal Vaslui. Rezultatele obinute demonstreaz c: raportul concentraiilor medii ale alcoolului din snge aort/snge femural i artera pulmonar/snge femural a fost de 0,97. Valorile identice ale rapoartelor ar putea fi explicate prin faptul c aceste cadavre nu au prezentat semne de puterfacie sau de traumatisme; concentraia alcoolului n lichidul pericardic este semnificativ mai mare, ceea ce se poate datora cantitii mai mari de ap n acest fluid biologic; raportul concentraiilor alcoolului din urin/snge femural a fost de 1,27, ceea ce sugereaz ca marea majoritate a cazurilor luate n studiu au fost n faza de eliminare a alcoolului; raportul concentraiilor alcoolului umoare vitroas/snge femural a fost de 1,22. Analiznd concentraia alcoolului n trei tipuri de probe de snge i patru probe biologice cu coninut crescut n ap, corelnd datele i raportndu-le ntre ele, putem sugera c oricare din aceste fluide este extrem de folositor pentru a putea aprecia cinetica alcoolului post-mortem. Rezultatele obinute n urma studiilor efectuate subliniaz c problema analizei alcoolului din probele biologice nu este complet rezolvat i c n orice moment apar noi surse de variaii, iar analitii toxicologi trebuie s ncerce eliminarea acestora.

56

 S-a realizat un studiu statistic privind consumul de alcool n judeul Vaslui. S-au stabilit corelaii ntre valoarea alcoolemiei i cauzele de deces. S-a validat metoda de dozare a etanolului din snge prin GC-HS folosind izopropanolul ca standard intern. S-a dezvoltat i validat metoda de determinare a etanolului din diverse fluide biologice folosind ter-butanolul drept standard intern, metod aplicat la dozarea alcoolului din probe biologice recoltate de la cadavre. S-a efectuat un studiu comparativ al concentraiei alcoolului etilic din fluide biologice prin GC-HS i metoda Cordebard (oficial). Tema tezei de doctorat ofer posibilitatea orientrii ctre noi direcii de cercetare: aplicarea metodelor GC-HS validate la cercetarea principalilor metabolii ai etanolului: acetaldehida, acid acetic; dezvoltarea i validarea unei metode GC-HS pentru dozarea compuilor volatili care apar n timpul proceselor de descompunere i putrefacie a cadavrelor; validarea i dezvoltarea unei metode GC-MS pentru determinarea 5-hidroxitriptofolului (5HTOL) i a acidului 5-hidroxiindol acetic (5HIAA). Acetia sunt metabolii ai serotoninei i pot fi utilizai ca markeri biotoxicologici pentru a evidenia dac alcoolul provine din ingestia antemortem sau post-mortem.
PERSPECTIVE DE CERCETARE

CONTRIBUII ORIGINALE

57

VII. BIBLIOGRAFIE SELECTIV 1. Agarwall D.P., Seitz H.K. Alcohol in Health and Disease. Ed. Marcel Dekker, Inc., 2001. 2. Agoroaei L., Butnaru E. Toxici gazoi i volatili. Editura Gr. T. Popa, U.M.F. Iai, 2005. 3. Allen N.E., Beral V., Casabonne D. et al. Moderate alcohol intake and cancer incidence in women. Journal of the National Cancer Institute 2009; 101 (5): 296-305. 4. Aradottir S., Seidl S., Wurst F.M., Jonsson B.A., Alling C., Phosphatyidylethanol in humans organs and blood: a study on autopsy material and influences by storage conditions. Alcohol Clin. Exp. Res. 2004; 28: 1718-1723. 5. Athanaselis S., Stefanidou M., Koutselinis A. Interpretation of postmortem alcohol concentration. Forensic Sci. Int. 2005; 149: 289-291. 6. Bau P.F.D., Bau H.D.C., Rosito G.A., Manfroi W.C., Fuchs F.D. Alcohol consumption, cardiovascular health, and endothelial function markers. Alcohol 2007; 41 (7): 479-488. 7. Briglia E.J., Bidanset J.H., Dal Cortivo L.A. The distrbution of ethanol in post mortem blood specimens. J. Forensic Sci. 1992; 37: 991-998. 8. Brinkmann B., Fechner G., Karger B., DuChesne A. Ketoacidosis and lactic acidosis frequent causes of death in chronic alcoholics? Int. J. Legal Med. 1998; 111: 115-119. 9. Caballeria J. Current concepts in alcohol metabolism. Ann. Hepatolog. 2003; 2: 60-68. 10. Crabb D.W., Matsumoto M., Chang D., You M. Overview of the role of alcohol dehydrogenase and aldehid dehydrogenase and their variants in the genesis of alcohol related pathology. Proc. Nutr. Soc. 2004; 63: 49-63. 11. Cullen S.A., Mayers R.W. Alcohol discovered in the urine after death: ante-mortem ingestion or post-mortem artefact? Med. Sci. Law 2005; 45: 196-200. 12. De Lima I.V., Midio A.F. Origin of blood ethanol in decomposed bodies. Forensic Sci. Int. 1999; 106: 157-162. 13. De Zeeuw R.A. Laboratory guidelines in analytical toxicology-how to approach qualitative analysis. J. Forensic Sci. 1992; 37: 1437-1442. 14. Denmark L.N. The investigation of beta-hydroxybutyrate as a marker for sudden death due to hypoglycemia in alcoholics. Forensic Sci. Int. 1993; 62: 225-232.
58

15. Dermengiu D. Patologie medico-legal. Editura Viaa Medical Romneasc, Bucureti, 2002. 16. Dermengiu D. Tanatochimie medico-legal. Editura Bucura Mond, Bucureti, 1998. 17. Flanagan R.J., Connally C. Interpretation of analitycal toxicology results in life and at postmortem. Toxicol. Rev. 2005; 24: 51-62. 18. Flanagan R.J., Connally G., Evans J.M. Analytical toxicology: guideliness for sample collection postmortem. Toxicol. Rev. 2005; 24: 63-71. 19. Gagajewski A., Murakami M.M. et al. Measurement of chemical analytes in vitreous humour: stability and precision studies. J. Forensic Sci. 2004; 49: 371-374. 20. Gallardo E. i Queiroz J.A. The role of alternative specimens in toxicological analysis. Biomed. Chromatogr. 2008; 22: 795-821. 21. Garriot J.C. Analysis for alcohol in postmortem specimens. in: J.C. Garriot (Ed.), Medical and Legal Aspects of Alcohol, Lawyers & Judges Publishing Company, Tuscon, 2003, 163-176. 22. Grellner W., Iffland R. Assesment of postmortem blood alcohol by ethanol levels measured in fluids from putrefactive blisters. Forensic Sci. Int. 1997; 90: 57-63. 23. How C., Howton K. et al. Psychiatric and personality disorders in deliberate self-harm patients. British Journal of Psychiatry 2001; 178: 48-54. 24. Helander A., Dahl H. Urinary tract infection: a risk factor for false negative urinary ethyl glucuronide but not ethyl sulfate in the detection of recent alcohol consumption. Clin. Chem. 2005; 51: 1728-1730. 25. Helander A., Beck O., Jones A.W. Distinguishing ingested ethanol from microbial formation by analysis of urinary 5HTOL and 5HIAA. J. Forensic Sci. 1990; 40:95-98. 26. Helander A., Beck O., Jones A.W. Urinary 5HTOL/5HIAA as biochemical marker of postmortem ethanol synthesis. Lancet 1992; 340:1159. 27. Hilberg T., Rogden S., Morland J. Postmortem drug redistributionhuman cases related to results in experimental animals. J. Forensic Sci. 1999; 44: 3-9. 28. Honey D., Caylor C., Luthi R., Kerrigan S. Comparative alcohol concentrations in blood and vitreous fluid with illustrative case studies. J. Anal. Toxicol. 2005; 29: 365-369. 29. Johnson R.D., Lewis R.J., Angier M.K., Vu N.T. The formation of ethanol in postmortem tissue. Office of Aerospace Medicine 2004; 4: 1-10.
59

30. Johnson R.D., Lewis R.J., Canfield D.V., Dubowski K.M., Blank C.L. Utilizing the urinary 5-HTOL/5HIAA ratio to determine ethanol origin in civil aviation accident victims. J. Forensic Sci. 2005; 50: 670-675. 31. Jones A.W. Reference limits for urine/blood ratios of ethanol in two successive voids from drinking drivers. J. Anal. Toxicol. 2002; 26: 333-339. 32. Jones A.W. Are changes in blood-ethanol concentration during storage analytically significant? Importance of method imprecision. Clin. Chem. Lab. Med. 2007; 45: 1299-1304. 33. Jones A.W. Measuring alcohol in blood and breath for forensic purposes; A historical review. Forensic Sci. Rev. 1996; 8: 13-44. 34. Jones A.W., Fransson M. Blood analysis by headspace gas chromatography; Does a deficient sample volume distort ethanol concentration? Med. Sci. Law 2003; 43: 241-247. 35. Jones A.W., Holmgren H. Comparasion of blood-ethanol concentration in deaths attributed to acute alcohol poisoning and chronic alcoholism. J. Forensic Sci. 2003; 48: 874-879. 36. Jones A.W., Holmgren P. Uncertainty in estimating blood ethanol concentrations by analysis of vitreous humor. J. Clin. Pathol. 2001; 54: 699-70. 37. Jones A.W., Holmgren P. Urine/blood ratios of ethanol in deaths attributed to acute alcohol poisoning and chronic alcoholism. Forensic Sci. Int. 2003; 135: 206-212. 38. Kugelberg F.C., Jones A.W. Interpreting results of ethanol analysis in postmortem specimens: a review of the literature. Forensic Sci. Int. 2007; 165: 10-29. 39. Leikin J.B., Watson W.A. Post-mortem toxicology: what the dead can and cannot tell us. J. Toxicol. 2003; 41: 47-56. 40. Pelissier-Alicot A.L., Gaulier J.M., Champsaur P., Marquet P. Mechanism underlying postmortem redistribution of drugs: a review. J. Anal. Toxicol. 2003; 27: 533-544. 41. Ziavrou K., Boumba V.A.,Vougiouklakis Th.G. Insights into the origin of postmortem ethanol. Int. J. Toxicol. 2005; 24: 69-77. 42. * * * European Status Report on Alcohol and Health 2010, pg.285-286 http://www.euro.who.int/__data/assets/pdf_file/0004/128065/e94533.p df. 43. * * * Restek. A technical guide for static Headspace analysis using GC. 44. * * * SOFT/AAFS Forensic Laboratory Guidelines, 2002.

60

LISTA CU LUCRRI PUBLICATE

1. Dorube D.,Moldoveanu S.,Mircea C.,Butnaru E.,Astrstoae V. Development and validation of a quantitative determination method of blood ethanol bz gas chromatography with headspace(GC-HS), Rom.J.Leg.Med(4) 303-308(2009)

2. Dorube D.,Mircea C.,Astrstoae V., Butnaru E. Validation of a GC-HS method for ethanol quantitative analysis using as internak standard tert-butanol, Farmacia,(59) 5 ,2011

CURRICULUM VITAE Chimist principal DORUBE (FILARET) DIANA MDLINA e-mail: madfilaret@ yahoo.com STUDII 2007Doctorat fr frecven n specialitatea toxicologie: prezent Dezvoltarea i validarea metodei de determinare a etanolului prin GC-HS i studii privind dozarea etanolului din diferite fluide biologice prin GC-HS 2006-2007 Masterat n Toxicologie Clinic- Universitatea de Medicin si Farmacie GR.T.Popa Iai 1980-1984 Facultatea de Chimie Iai-specializarea chimie-fizic 1976-1980 Liceul de chimie Vaslui-profilul chimie SPECIALIZRI PROFESIONALE 1998 Chimist principal specialitatea Biochimie medical i enzimologie clinic 1993 Chimist specialist specialitateaBiochimie medical i enzimologie clinic PREGTIRE POSTUNIVERSITAR 2010 Curs postuniversitar Metabolismul mineral ,Disciplina de biochimie, Universitatea de Medicin si Farmacie GR.T.Popa Iai 2005 Curs postuniversitarBiochimia i explorarea funciilor ficatului ,Disciplina de biochimie, Universitatea de Medicin si Farmacie GR.T.Popa Iai EXPERIEN PROFESIONAL Perioada Funcia Locul de munc 2005Chimist Serviciul prezent principal- Judeean de manager Medicintehnic Legal Vaslui-lab.de toxicologie Sarcini i responsabiliti Efectuarea analizelor toxicologice i serologice destinate acestui tip de laborator 1

2007prezent

Chimist principalmanager tehnic

Clinica privat S.C.Teoclinik Vaslui

20052007

Chimist principalmanager tehnic

Laborator privat S.C. Eurotest Vaslui

19882005

Chimist principalmanager tehnic

Spitalul Judeean de Urgen Vasluilaboratorul clinic

Efectuarea analizelor biochimice, de coagulare, imunologie, validarea rezultatelor finale, supervizarea bilunar a controlului extern de calitate pe toate sectoarele laboratorului,pregtirea personalului mediu i superior din subordine Efectuarea analizelor biochimice, de coagulare, imunologie, validarea rezultatelor finale, supervizarea bilunar a controlului extern de calitate pe toate sectoarele laboratorului Efectuarea analizelor biochimice, de coagulare, imunologie, validarea rezultatelor finale, supervizarea bilunar a controlului extern de calitate pe toate sectoarele laboratorului

APARTENENA LA SOCIETI PROFESIONALE profesionale ORDINUL BIOCHIMISTILOR, BIOLOGILOR SI CHIMISTILOR IN SISTEMUL SANITAR DIN ROMANIA(OBBCSSR)

PARTICIPAREA LA MANIFESTRI TIINIFICE 2011 Congresul Naional de Medicin Legal, Poiana Braov 2010 Congresul Naional de Farmacie, Tg.Mure 2009 Congresul Naional de Medicin Legal, Bran 2008 Curs de management i asigurarea calitii n laboratoarele medicale-Spitalul Clinic Colea Bucureti 2007 Curs de gaz cromatografie cu headspace, Agilrom Scientific Bucureti A-III-a conferin a OBBCSSR cu participare internaional Bucureti 2006 Curs de gaz cromatografie cuplat cu spectrometrie de mas,Agilrom Scientific Bucureti Curs de specializare cu tema: determinarea alcoolemiei la persoanele implicate n traficul rutier i n cazuri medicolegale-Institutul deMedicin Legal Mina MinoviciBucureti A-II-a conferin a OBBCSSR cu participare internaional Bucureti 2005 Congresul Naional de Medicin Legal, Sibiu 2004 Congresul Balcanic de Medicin Legal,Macedonia 1997 Curs de imunologie clinic- Spitalul Clinic FundeniBucureti 1992 Curs de biochimie medical- Spitalul Clinic FundeniBucureti 1989 Curs de enzimologie clinic -Spitalul Clinic FundeniBucureti LUCRRI PUBLICATE
-Development and validation of a quantitative determination method of blood ethanol by gas chromatography with headspace (GC-HS), Rom J Leg Med (4) 303 - 308 (2009) - Validation of a GC/HS method for ethanol quantitative analysis using as internal standard tert-butanol , Farmacia, 2011, Vol. 59, 5

Limbi strine cunoscute: engleza avansat 3