ACADEMIA DE ŞTIINŢE A MOLDOVEI

INSTITUTUL DE MICROBIOLOGIE ŞI BIOTEHNOLOGIE

Cu titlu de manuscris
C.Z.U.: 579.22+547.917+664.872

CHISELIŢA OLEG

CARACTERELE FIZIOLOGO-BIOCHIMICE ALE UNOR

DROJDII VINICOLE ŞI PROCEDEE DE OBŢINERE A
BIOPRODUSELOR VALOROASE

SPECIALITATEA 03.00.07 – MICROBIOLOGIE

Teză de doctor în biologie

Conducător ştiinţific: Agafia USATÎI doctor habilitat în

biologie, profesor cercetător

Consultant ştiinţific: Valeriu RUDIC doctor habilitat în

biologie, profesor universitar,
academician, Om emerit al
Republicii Moldova

Autorul Oleg Chiseliţa

CHIŞINĂU, 2010
© Chiseliţa Oleg, 2010

2
 CUPRINS

ADNOTĂRI........................................................................................................................ 5
LISTA ABREVIERILOR.................................................................................................... 8
INTRODUCERE……………………………………………………................................. 9
1. DROJDIILE GENULUI SACCHAROMYCES – SURSĂ DE CARBOHIDRAŢI ŞI
ALTE SUBSTANŢE BIOLOGIC ACTIVE......................................................................... 16
1.1. Conţinutul cantitativ şi calitativ al carbohidraţilor şi altor substanţe biologic active
în drojdiile genului Saccharomyces..................................................................................... 16
1.2. Activitatea biologică a carbohidraţilor drojdiilor genului Saccharomyces................... 25
1.3. Influenţa condiţiilor şi modului de cultivare asupra sintezei carbohidraţilor la
microorganisme.................................................................................................................... 27
1.3.1. Influenţa surselor de carbon şi azot asupra sintezei carbohidraţilor la
microorganisme.................................................................................................................... 27
1.3.2. Compuşii coordinativi ai metalelor de tranziţie – factori reglatori ai proceselor
biosintetice microbiene........................................................................................................ 32
1.3.3. Influenţa factorilor fizici ai mediului de cultivare asupra sintezei carbohidraţilor la
microorganisme.................................................................................................................... 36
1.4. Concluzii la capitolul 1................................................................................................. 37
2. METODOLOGIA CERCETĂRII ŞTIINŢIFICE............................................................ 39
2.1. Obiectul de cercetare…................................................................................................. 39
2.2. Metode de investigaţie.................................................................................................. 40
3. MORFOLOGIA, FIZIOLOGIA ŞI PARTICULARITĂŢILE SINTEZEI
CARBOHIDRAŢILOR LA TULPINILE DE DROJDII SACCHAROMYCES
CEREVISIAE CNMN-Y-20 ŞI SACCHAROMYCES CEREVISIAE CNMN-Y21
SELECTATE DIN SEDIMENTE DE VIN.......................................................................... 42
3.1. Caracteristica taxonomică a tulpinilor de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S.
cerevisiae CNMN-Y-21 selectate ca producători activi de carbohidraţi............................. 42
3.2. Efectele nutrienţilor şi ale factorilor de mediu asupra multiplicării şi acumulării
carbohidraţilor în celulele drojdiilor S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21.. 48
3.2.1. Efectele surselor de carbon asupra multiplicării drojdiilor S. cerevisiae CNMN-Y-
20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 şi biosintezei carbohidraţilor............................................ 49
3.2.2. Efectele sărurilor minerale, acetaţilor şi compuşilor coordinativi ai Mn (II) şi Zn
(II) asupra productivităţii şi biosintezei carbohidraţilor la drojdiile S. cerevisiae CNMN-

3
Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21...................................................................................... 54
3.2.3. Efectele temperaturii, pH-ului iniţial al mediului nutritiv, duratei de cultivare
asupra multiplicării şi biosintezei carbohidraţilor la drojdiile S. cerevisiae CNMN-Y-20
şi S. cerevisiae CNMN-Y-21............................................................................................... 62
3.3 Elaborarea regulamentului de obţinere din drojdii a bioprodusului Glucolev – 20....... 69
3.4. Concluzii la capitolul 3................................................................................................. 78
4. OBŢINEREA BIOPRODUSELOR VALOROASE DIN DROJDIILE
SEDIMENTELOR DE VIN................................................................................................. 80
4.1 Procedee de obţinere a unor fracţii glucidice din drojdiile sedimentelor de vin............ 80
4.2. Procedee de obţinere a bioproduselor complexe din drojdiile sedimentelor de vin..... 91
4.2.1. Studiul compoziţiei biochimice a drojdiilor din sedimente de vin............................ 92
4.2.2. Optimizarea condiţiilor de prelucrare a drojdiilor sedimentelor de vin şi schema
tehnologică de obţinere a produsului proteic furajer Prolevin............................................. 95
4.3. Concluzii la capitolul 4................................................................................................. 106
CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI……………………………................... 107
BIBLIOGRAFIE…………………………………………………….................................. 110
ANEXE…………………………………………………………….................................... 127
Anexa 1: Brevet de invenţie. 3792 G2, MD, A01K 61/00 Furaj pentru larve şi puiet de
peşte/ Cererea depusă 2008.08.07, BOPI nr. 1/2009............................................................. 128
Anexa 2: Brevet de invenţie. 4048 B1, MD, C12N 1/16 Tulpină de drojdie Saccharomyces
cerevisiae-sursă de β-glucani/ Cererea depusă 2010.02.11, BOPI nr. 6/2010........................... 130
Anexa 3: Act de implementare a rezultatelor Nr.1 eliberat de ÎI „Marin-Alexandru” la
30.06.2009............................................................................................................................ 132
Anexa 4: Act de implementare a rezultatelor Nr.64A eliberat de CNMN a IMB a AŞM
la 17.05.2010........................................................................................................................ 133
Anexa 5: Diploma European Exhibition of Creativity and Inovation „EUROINVENT”
2009 Bronze Medal „Feed for fish larvae and young fish”................................................. 137
Anexa 6: Diplomă Expoziţia Internaţională Specializată „INFOINVENT” 2009 Medalia
de Argint „Bioproduse din drojdiile sedimentelor vinicole pentru furajarea peştilor”........ 138
DECLARAŢIA PRIVIND ASUMAREA RĂSPUNDERII................................................ 139
CV-ul AUTORULUI........................................................................................................... 140

4
 ADNOTARE
Chiseliţa Oleg „Caracterele fiziologo-biochimice ale unor drojdii vinicole şi procedee de
obţinere a bioproduselor valoroase”. Teză de doctor în biologie, Chişinău, 2010. Teza constă
din introducere, 4 capitole, concluzii şi recomandări, bibliografie ce conţine 244 titluri, 6 anexe,
109 pagini conţinut de bază, 20 tabele, 37 figuri. Rezultatele au fost expuse în 18 publicaţii.
Cuvinte-cheie: Saccharomyces cerevisiae, drojdii de vin, carbohidraţi, compuşi coordinativi,
acetaţi, preparate din drojdii.
Domeniul de studiu: 03.00.07 – Microbiologie.
Scopul lucrării: studierea caracterelor fiziologo-biochimice ale unor tulpini de drojdii de vin cu
potenţial sporit de biosinteză a carbohidraţilor şi elaborarea procedeelor de obţinere a
bioproduselor valoroase.
Obiective: izolarea din sedimentele de vin, selectarea şi studierea caracterelor morfo-culturale şi
fiziologo-biochimice ale tulpinilor de drojdii cu potenţial sporit de biosinteză a carbohidraţilor;
evidenţierea factorilor care asigură un nivel optim al productivităţii şi acumulării carbohidraţilor
în celulele drojdiilor selectate; elaborarea procedeelor de cultivare dirijată a tulpinilor de drojdii
şi obţinere a biomasei cu conţinut prognozat de carbohidraţi; elaborarea procedeelor de obţinere
a unor bioproduse valoroase din drojdiile sedimentelor de vin.
Noutatea şi originalitatea ştiinţifică. Au fost selectate tulpinile de drojdii S. cerevisiae CNMN–
Y-20 şi S. cerevisiae CNMN–Y-21 cu capacitate înaltă de sinteză a carbohidraţilor, stabilite
caracterele morfo-culturale şi fiziologo-biochimice, evidenţiaţi factorii determinanţi de dirijare a
proceselor de biosinteză a carbohidraţilor la tulpinile menţionate. A fost demonstrată eficienţa
melasei şi clorurii de tricloracetat de zinc în stimularea sintezei carbohidraţilor la drojdii.
Problema ştiinţifică. Argumentarea ştiinţifică a căilor de dirijare a biosintezei carbohidraţilor la
tulpinile de drojdii selectate, utilizând ca reglatori nutrienţii preferenţiali şi factorii fizico-chimici.
Semnificaţia teoretică. Au fost obţinute date noi referitor la răspunsul fiziologic al drojdiilor de
vin la acţiunea factorilor de cultivare dirijată. Lucrarea argumentează posibilitatea valorificării
levurilor din sedimentele de vin pentru obţinerea unor bioproduse valoroase noi.
Valoarea aplicativă: Tulpina de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 se recomandă pentru
cultivarea industrială în calitate de sursă de preparate glucidice. Tehnologia de procesare a
biomasei drojdiilor din sedimentele de vin se recomandă pentru producerea industrială a
bioproduselor naturale şi obţinerea substanţelor biologic active cu utilizare în diferite domenii.
Implementarea rezultatelor ştiinţifice. Tulpinile de drojdii selectate sunt depozitate ca
producători de carbohidraţi şi utilizate în cercetările CNMN. Bioprodusul Prolevin R a fost
implementat la crescătoriile piscicole ale Î.I. „Marin-Alexandru”.

5
 РЕЗЮМЕ
Киселица Олег „Физиолого-биохимические свойства некоторых винных дрожжей и
способы получения ценных биопродуктов”. Диссертация доктора биологических наук,
Кишинёв, 2010 г. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и рекомендаций,
библиографии, содержащей 244 наименования, 6 приложений, 109 страниц основного
текста, 20 таблиц и 37 рисунков. Результаты исследований представлены в 18 публикациях.
Ключевые слова: Saccharomyces cerevisiae, винные дрожжи, углеводы, координационные
соединения, ацетаты, дрожжевые препараты.
Область исследования: 03.00.07 – Микробиология.
Цель работы: изучение физиолого-биохимических свойств некоторых штаммов винных дрожжей с
высоким потенциалом биосинтеза углеводов и разработка способов получения ценных биопродуктов.
Задачи: выделение из винных осадков, отбор и изучение морфо-культуральных и физиолого-
биохимических свойств штаммов дрожжей с высоким потенциалом биосинтеза углеводов;
выявление факторов, которые обеспечивают максимальный уровень продуктивности и
накопления углеводов в клетках отобранных дрожжей; разработка способов направленного
культивирования дрожжей и получения биомассы с прогнозируемым содержанием углеводов;
разработка способов получения ценных биопродуктов из осадочных винных дрожжей.
Научная новизна и оригинальность. Были отобраны штаммы дрожжей S. cerevisiae CNMN–
Y-20 и S. cerevisiae CNMN–Y-21 с высоким потенциалом синтеза углеводов, определены их
морфо-культуральные и физиолого-биохимические свойства, выявлены факторы управления
процессом биосинтеза углеводов у вышеуказанных штаммов. Была доказана эффективность
мелассы и трихлорацетат хлорида цинка в стимуляции синтеза углеводов у дрожжей.
Научная проблема. Научная аргументация способов направленного биосинтеза углеводов
у отобранных штаммов дрожжей, используя в качестве регуляторов необходимые
источники питания и физико-химические факторы.
Теоретическое значение. Получены новые данные относительно физиологического ответа винных
дрожжей на действие факторов направленного культивирования. Работа аргументирует возможность
использования осадочных винных дрожжей для получения новых ценных биопродуктов.
Прикладное значение: Штамм дрожжей S. cerevisiae CNMN–Y-20 рекомендуется для
промышленного культивирования в качестве источника углеводных препаратов. Технология
переработки осадочных винных дрожжей предлагается для промышленного производства натуральных
биопродуктов и получения биологически активных веществ с применением в различных областях.
Внедрение научных результатов. Отобранные штаммы дрожжей хранятся как
продуценты углеводов и применяются в научных исследованиях НКНМ. Биопродукт
Prolevin R был внедрен в рыбных хозяйствах И.П. „Marin-Alexandru”.

6
 ABSTRACT
Chiselita Oleg „The physiological and biochemical properties of some wine yeasts and the obtaining
procedures of valuable bioproducts.” Thesis of doctor degree in biology, Chisinau, 2010. The thesis consists
of introduction, 4 chapters, conclusions and recommendations, bibliography, containing 244 references, 6
anexes, 109 pages of the base text, 20 tables and 37 figures. The results are presented in 18 publications.
Key words: Saccharomyces cerevisiae, wine yeast, carbohydrates, coordination compounds,
acetates, yeast preparations.
Field of study: 03.00.07 - Microbiology.
Goal of the work: the studying of physiological and biochemical characteristics of some of wine
yeasts strains with a high potential of carbohydrates biosynthesis and the elaboration of
procedures of obtaining of bioactive products.
Objectives: isolation from the wine sediments, the selection and the studying of their morphological,
cultural, physiological and biochemical characteristics of yeast strains with high potential for the
carbohydrates biosynthesis; the establishing of the medium factors that provides the optimal level of
productivity and the carbohydrates biosynthesis in the selected yeasts; the elaboration of procedures for
directed cultivation of yeasts and the biomass obtaining with an estimated carbohydrate content; the
elaboration of procedures of obtaining of some valuable bioproducts from the wine sedimentary yeasts.
Scientific novelty and originality. For the first time were selected two yeast strains S.
cerevisiae CNMN-Y-20 and S. cerevisiae CNMN-Y-21 with a high potential of carbohydrates
biosynthesis, were established their morphological, cultural, physiological and biochemical
characteristics and factors that determinate the processes of carbohydrates biosynthesis at
mentioned strains. The efficiency of molasses and trichloroacetate chloride of zinc to stimulate
the processes of carbohydrates biosynthesis in the mentioned strains has been demonstrated.
Scientific problem. Scientific argumentation for directing pathways of carbohydrate biosynthesis
at selected yeast strains, using as regulators preferred nutrients and physico-chemical factors.
Theoretical value. The new data on the physiological response of wine yeast on the action of
factors of directed cultivation. The work argues the possibility of the wine sedimentary yeasts
using for a new valuable bioproducts obtaining.
Application value. The strain S. cerevisiae CNMN–Y-20 is recomended for the industrial
cultivation as a source of carbohydrates preparations. The technology of processing of biomass
of wine sedimentary yeasts is recomended for the industrial obtaining of natural bioproducts and
bioactive substances with the utilization in different fields.
Implementation of scientific results. The selected yeast strains are stored as carbohydrates
producers and used in the investigations within CNMN. The bioproduct Prolevin R was
implemented at the fish farms of I.E. „Marin-Alexandru”.

7
 LISTA ABREVIERILOR

ADN - acid dezoxiribonucleic

ARN - acid ribonucleic
ATP – adenozin trifosfat
BAU – biomasă absolut uscată
CNMN – Colecţia Naţională de Microorganisme Nepatogene
CS I – chitinsintetaza unu
CS II – chitinsintetaza doi
CS III – chitinsintetaza trei
GAT - glutamintransferaza
GDF - guanozindifosfat
GFI - glicozilfosfatidilinozitol
MGYP - malţ, glucoză, extract de drojdii, pepton
OZT - oligozahariltransferaza
SOD - superoxiddismutaza
S.U. – substanţă uscată
UDF - uridindifosfat
YPG - extract de drojdii, pepton, glucoză
1,3-β-GS - 1,3-β-glucansintetaza
%M – procent la martor

8
 INTRODUCERE
Actualitatea şi importanţa cercetărilor
Una din problemele stringente ale actualităţii este căutarea noilor surse de materie primă
pentru elaborarea preparatelor medicamentoase şi profilactice, suplimentelor alimentare şi
furajere biologic active. În ultimii ani în calitate de aşa surse sunt studiate microorganismele şi în
special drojdiile, capabile să sintetizeze un complex de substanţe bioactive, inclusiv carbohidraţi
care au un rol impunător în activitatea vitală a organismelor vii.
Interesul sporit faţă de polizaharidele bioactive naturale, remarcat în ultimii ani, se
datorează multiplelor aplicaţii ale acestora în cele mai diverse ramuri: industria alimentară,
cosmetologie, medicină, farmaceutică, zootehnie, veterinărie, acvacultură, ecologie şi protecţia
plantelor [125, 152, 168, 175, 206, 207]. În această ordine de idei prezintă un interes deosebit
polizaharidele microbiene, obţinerea cărora din punct de vedere economic este mult mai
avantajoasă decât a celor de origine animală şi vegetală.
În membrana celulară a drojdiilor se conţin mai multe tipuri de glucide, de bază fiind
mananul legat cu proteinele învelişului celular şi glucanul. β-glucanii intră în structura stratului
interior al peretelui celular, iar învelişul exterior al lui este format din manan. β-glucanii
peretelui celular al drojdiilor posedă activitate imunomodulatoare [97, 98, 113, 215, 234, 236],
antivirală şi antibacteriană [165, 183, 201], anticancerigenă [237, 239, 243], de aceea îşi găsesc
utilizare la producerea preparatelor medicamentoase, ca componente ale remediilor
cosmetologice, ca agenţi de viscozitate în industria alimentară [227].
Masa uscată a celulelor de drojdii şi conţinutul de polizaharide variază în funcţie de
specie, precum şi în dependentă de compoziţia mediului şi condiţiile de cultivare. Relaţia
matematică între ele nu a fost însă bine stabilită. Această corelaţie între concentraţia
componentelor mediului, biosinteza carbohidraţilor şi masa de celule uscate este importantă la
cultivarea microorganismelor din punct de vedere al controlului şi optimizării procesului.
Sinteza polizaharidelor microbiene este determinată de componenţa mediului nutritiv
(natura surselor de C, N, P şi concentraţia lor, raportul C/N, ionii metalelor), factorii fizico-
chimici (temperatură, pH-ul, nivelul de aeraţie), durata ciclului periodic de cultivare. În
dependenţă de condiţiile de cultivare ale producătorului se schimbă componenţa chimică a
polizaharidelor, masa lor moleculară, conţinutul cantitativ al părţilor componente, ceea ce are
influenţă nemijlocită asupra viscozităţii lor, parametru ce determină în mare măsură importanţa
lor practică [35, 69, 114].
Relatări referitor la sinteza carbohidraţilor de către microorganisme sunt numeroase, însă
problema selectării unor tulpini cu activitate sporită rămâne a fi actuală, acest fapt fiind

9
determinat atât de instabilitatea capacităţii de producere caracteristică microorganismelor, cât şi
de lipsa mediilor de cultură, procedeelor de sinteză orientată, specifice producătorului.
Producători de carbohidraţi de performanţă sunt drojdiile genului Saccharomyces [78,
127, 138, 170], activitatea cărora poate fi substanţial sporită prin varierea factorilor de nutriţie,
parametrilor de cultivare, stimulatorilor şi reglatorilor [42, 84, 88, 92, 96, 109, 133, 138, 161,
170, 217, 219, 222, 228, 244].
În acest context importante şi necesare sunt investigaţiile destinate selectării tulpinilor cu
activitate biosintetică înaltă, a defini nutrienţii preferenţiali şi parametrii optimi de cultivare şi
drept rezultat a elabora procedee de sinteză orientată a carbohidraţilor. Din acest punct de vedere
drojdiile genului Saccharomyces – producători recunoscuţi de carbohidraţi bioactivi reprezintă
un obiect biotehnologic de mare perspectivă.
Un interes aparte prezintă obţinerea bioproduselor bogate în carbohidraţi din drojdiile
sedimentelor de vin. Actualmente, în lume se acordă mare atenţie problemei utilizării deşeurilor
generate de industria vinului. Deşeurile de la vinificaţie se caracterizează prin prezenţa
antioxidanţilor naturali, care recent se utilizează în industria alimentară. Mai mult decât atât,
deşeurile de vin ar putea fi eventual utilizate ca bioamendament de sol, îngrăşăminte, ca
adsorbent pentru metale grele şi pentru producerea de polizaharide [146]. Biomasa drojdiilor are
capacitatea de a elimina din organismul uman metalele grele, diferiţi metaboliţi toxici, posedă
acţiune antibacteriană, antivirală şi proprietăţi probiotice. Unele principii bioactive din biomasa
drojdiilor manifestă capacităţi anticancerigene, antisclerotice pronunţate. De asemenea, sunt utile
concentratele şi autolizatele de drojdii, preparatele vitaminice şi enzimatice ce se folosesc în
industria de panificaţie. Sedimentele de drojdii au o preţioasă compoziţie chimică. Ele conţin
până la 25% substanţă uscată, dintre care în %: substanţe minerale - 5-10, carbohidraţi - 25-50,
compuşi azotaţi (calcul după azot)-5-12, proteine-30-75, lipide-2-5. Partea principală a
substanţelor minerale o alcătuiesc derivaţii acidului fosforic (până la 50%) şi diferiţi compuşi ai
potasiului (până la 25%). Carbohidraţii sunt prezentaţi prin hemiceluloze şi polizaharidele
peretelui celular (glucani, manani), glicogen şi monozaharidele din citoplasma celulară.
Sedimentele de drojdii conţin practic toţi aminoacizii cunoscuţi (de la 1 până la 11%) şi
vitamine, care au utilizare largă în farmaceutică. În levurile uscate se conţin până la 22-30%
compuşi ai acidului vinic [8].
Actualitatea utilizării deşeurilor industriei vinicole se datorează cerinţelor crescânde
înaintate problemei de utilizare a drojdiilor de la vinificaţie şi perspectivei elaborării preparatelor
ecologic pure cu valoare biologică şi nutritivă înaltă, în special pentru domeniul alimentar,
farmaceutic, de cosmetice, agricol.

10
 Analiza domeniilor de utilizare şi mecanismelor de acţiune ale carbohidraţilor de origine
microbiană demonstrează importanţa acestor studii şi pune în evidenţă incontestabilitatea
desfăşurării cercetărilor atât în direcţia căutării noilor tulpini de microorganisme producătoare de
aceste substanţe, cât şi de utilizare a surselor netradiţionale de obţinere a lor, cum ar fi drojdiile
din sedimentele de vin.
Reieşind din cele expuse, scopul cercetărilor constă în studierea caracterelor fiziologo-
biochimice ale unor tulpini de drojdii de vin cu potenţial sporit de biosinteză a carbohidraţilor şi
elaborarea procedeelor de obţinere a bioproduselor valoroase.
Obiectivele cercetărilor:
٠Izolarea din sedimentele de vin, selectarea şi studierea caracterelor morfo-culturale şi fiziologo-
biochimice ale tulpinilor de drojdii cu potenţial sporit de biosinteză a carbohidraţilor.
٠Evidenţierea factorilor care asigură un nivel optim al productivităţii şi acumulării
carbohidraţilor în celulele drojdiilor selectate.
٠Elaborarea procedeelor de cultivare dirijată a tulpinilor de drojdii şi obţinere a biomasei cu
conţinut prognozat de carbohidraţi.
٠Elaborarea procedeelor de obţinere a unor bioproduse valoroase din drojdiile sedimentelor de vin.
Noutatea şi originalitatea ştiinţifică
Pentru prima dată au fost selectate două tulpini de drojdii S. cerevisiae CNMN–Y-20 şi S.
cerevisiae CNMN–Y-21, care se caracterizează prin capacitate înaltă de sinteză a carbohidraţilor
şi stabilite caracterele lor morfo-culturale şi fiziologo-biochimice [4, 18].
În premieră a fost demonstrată posibilitatea dirijării proceselor de biosinteză a
carbohidraţilor la tulpinile S. cerevisiae CNMN–Y-20 şi S. cerevisiae CNMN –Y-21 prin
includerea în mediul nutritiv a diferitor surse de carbon, acetatului de zinc şi compusului
coordinativ clorură de tricloracetat de zinc. A fost evaluat răspunsul fiziologic al tulpinilor
selectate la acţiunea factorilor fizici ai mediului de cultivare (temperatura, durata cultivării, pH-
ul mediului).
A fost elaborat în premieră regulamentul cultivării S. cerevisiae CNMN –Y-20 cu
utilizarea factorilor optimizaţi, care permite producerea industrială a biomasei de drojdie cu
conţinut maxim prognozat de carbohidraţi.
Au fost obţinute date originale privind compoziţia biochimică a drojdiilor din
sedimentele de vin, elaborată schema tehnologică de prelucrare a acestora şi obţinere a
bioproduselor valoroase ce conţin aminoacizi esenţiali şi imunoactivi, carbohidraţi, în special
proteomanani şi β–glucani, ergosterol şi acizi graşi nesaturaţi.

11
 În premieră a fost demonstrat, că bioprodusul obţinut din drojdiile sedimentelor vinicole
are capacitatea de a spori semnificativ viabilitatea, indicii corporali şi caracteristicile productive
ale larvelor şi puietului de peşte [7].
Problema ştiinţifică importantă soluţionată în lucrare constă în argumentarea căilor de
dirijare a biosintezei carbohidraţilor la tulpinile de drojdii selectate, utilizând ca factori reglatori
nutrienţii, stimulatorii specifici şi factorii fizico-chimici de cultivare.
Semnificaţia teoretică constă în stabilirea răspunsului fiziologic al drojdiilor de vin S.
cerevisiae CNMN–Y-20 şi S. cerevisiae CNMN –Y-21 la acţiunea factorilor de cultivare,
conform căruia biosinteza carbohidraţilor poate fi dirijată prin varierea surselor specifice de
carbon, unor compuşi coordinativi ai biometalelor, valorilor de temperatură, pH, duratei de
cultivare adecvate cerinţelor tulpinii producătoare.
Lucrarea argumentează posibilitatea valorificării levurilor din sedimentele de vin în
calitate de obiect biotehnologic pentru obţinerea unor bioproduse valoroase noi.
Valoarea aplicativă a lucrării:
٠se propun spre valorificare două tulpini de drojdii S. cerevisiae CNMN–Y-20 şi S.
cerevisiae CNMN –Y-21 cu un conţinut sporit de carbohidraţi;
٠regulamentul de cultivare dirijată a drojdiei S. cerevisiae CNMN–Y-20 elaborat oferă
facilităţi în obţinerea bioprodusului Glucolev - 20 cu conţinut prognozat de carbohidraţi;
٠tehnologia de prelucrare a drojdiilor din sedimentele de vin permite obţinerea
bioprodusului Prolevin R cu destinaţie furajeră.
Aprobarea rezultatelor lucrării. Rezultatele cercetărilor au fost comunicate la
Conferinţa internaţională IX Международная конференция молодых учёных «Пищевые
технологии и биотехнологии» (Cazani, 2008; 2009), Conferinţa internaţională consacrată
comemorării m.c. al AŞM Petru Ungurean (1894-1975) (Chişinău, 2008), Conferinţa
internaţională a tinerilor cercetători a IV ediţie (Chişinău, 2008), Conferinţa internaţională
„Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и
применения” (Crimeea, Ucraina, 2009), Conferinţa ştiinţifică naţională cu participare
internaţională consacrată celei de-a 50 aniversări de la fondarea Secţiei de Microbiologie
„Probleme actuale ale microbiologiei şi biotehnologiei” (Chişinău, 2009), Expoziţia
internaţională Specializată „MOLDECO” ediţia a VII (Chişinău, 2007), European exhibition of
creativity and innovation „EUROINVENT” (Iaşi, 2009), (anexa 5), Expoziţia internaţională
specializată „INFOINVENT” (Chişinău 2009), (anexa 6), Salonul internaţional al cercetării,
inovării şi inventicii „PROINVENT”, ediţia a VIII-a (Cluj – Napoca, 2010).

12
 Publicaţii la tema tezei. În baza materialelor tezei au fost publicate 18 lucrări ştiinţifice,
inclusiv 5 articole în reviste recenzate (2 în monoautorat), 9 rezumate ale comunicărilor
ştiinţifice, 2 brevete de invenţie.
Cuvinte cheie: Saccharomyces cerevisiae, drojdii de vin, carbohidraţi, compuşi
coordinativi, acetaţi, preparate din drojdii.
Volumul şi structura tezei. Teza constă din introducere, patru capitole, concluzii
generale şi recomandări, şase anexe, cu volumul de bază de 109 pagini. Lucrarea conţine 20
tabele şi 37 figuri. Lista surselor bibliografice citate include 244 titluri.
Implementarea rezultatelor ştiinţifice. Tulpinile de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20
şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 sunt depozitate ca producători de carbohidraţi şi utilizate în
cercetări de Colecţia Naţională de Microorganisme Nepatogene (Act de implementare Nr. 64A
din 17.05.2010), anexa 4. Bioprodusul Prolevin R a fost implementat la crescătoriile piscicole ale
Î.I. „Marin-Alexandru” (Act de implementare Nr. 1din 30.06.2009), anexa 3.

Capitolul 1. „Drojdiile genului Saccharomyces – sursă de carbohidraţi şi alte

substanţe biologic active” prezintă o analiză amplă şi minuţioasă a publicaţiilor ştiinţifice de
ultimă oră la tema de cercetare, care reflectă următoarele aspecte: compoziţia biochimică a
drojdiilor, conţinutul calitativ şi cantitativ al carbohidraţilor drojdiilor genului Saccharomyces;
importanţa drojdiilor S. cerevisiae ca producători de carbohidraţi; mecanismele de sinteză a
carbohidraţilor în celulele de drojdii; proprietăţile, efectele biologice şi domeniile de utilizare a
carbohidraţilor din biomasa drojdiilor; căile şi mecanismele de inducere a procesului de
biosinteză a carbohidraţilor.

Capitolul 2. „Metodologia cercetării ştiinţifice”. Aspectele elucidate în capitol ţin de

reflectarea obiectelor de studiu a lucrării, metodelor microbiologice de selectare, izolare şi
clasificare a microorganismelor studiate, metodelor de determinare a carbohidraţilor, proteinelor,
lipidelor şi altor substanţe biologic active, mediilor de nutriţie utilizate la cultivarea drojdiilor şi
substanţelor folosite ca precursori şi stimulatori ai procesului de sinteză a carbohidraţilor la
drojdii. De asemenea, sunt elucidate metodele eficiente de dezintegrare a pereţilor celulari la
drojdii, care facilitează extragerea eficientă a substanţelor biologic active şi obţinerea
bioproduselor din biomasa levuriană. Utilizarea metodelor descrise în acest capitol a permis
obţinerea unor rezultate adecvate şi reproductibile, care elucidează valoarea fundamentală a
cercetărilor şi subliniază aspectul lor aplicativ.

13
 Capitolul 3 „Morfologia, fiziologia şi particularităţile sintezei carbohidraţilor la
tulpinile de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 selectate din
sedimente de vin” elucidează rezultatele cercetărilor destinate selectării şi obţinerii în cultură
pură a unor tulpini de drojdii de vin cu capacităţi sporite de sinteză a carbohidraţilor. În
continuare a fost cercetată posibilitatea sporirii productivităţii şi sintezei carbohidraţilor de către
tulpinile S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21, selectate din sedimentele de
vin, prin includerea în mediul nutritiv a diferitor surse de carbon, (utilizate separat) ca: glucoza,
zaharoza, fructoza, manoza şi melasa des folosite în practica microbiologică. A fost demonstrată
capacitatea tulpinilor de a asimila eficient sursele de carbon cercetate şi posibilitatea majorării
productivităţii şi conţinutului de carbohidraţi în biomasa drojdiilor prin substituirea în mediul
nutritiv Rieder a glucozei prin melasă, zaharoză şi fructoză. La etapa următoare a fost cercetată
influenţa sulfaţilor de mangan şi de zinc, acetaţilor de sodiu şi de zinc, unor compuşi coordinativi
ai Mn (II) şi Zn (II) asupra productivităţii şi biosintezei carbohidraţilor la tulpinile de drojdii în
studiu. S-a demonstrat că compusul coordinativ clorura de tricloracetat de zinc în concentraţii de
5-20 mg/l şi acetatul de Zn în concentraţie de 10-20 mg/l pot fi utilizaţi în calitate de stimulatori
specifici ai sintezei carbohidraţilor şi multiplicării tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20. În
continuare s-au stabilit parametrii de temperatură, pH şi durată de cultivare optimi pentru
multiplicarea tulpinilor în studiu şi sinteza carbohidraţilor. În baza acestor rezultate a fost
elaborat un procedeu de cultivare a tulpinii de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20, care prevede
dirijarea biosintezei carbohidraţilor prin asocierea surselor specifice de carbon, compusului
coordinativ clorură de tricloracetat de zinc, valorilor de temperatură, pH şi durată de cultivare
adecvate producătorului. În baza procedeului susmenţionat s-a elaborat tehnologia de obţinere a
bioprodusului Glucolev – 20.

Capitolul 4 „Obţinerea bioproduselor valoroase din drojdiile sedimentelor de vin”.

În acest capitol s-a demonstrat că autoliza şi ultrasonarea drojdiilor prezintă un procedeu
eficient pentru dezintegrarea pereţilor celulari, în vederea obţinerii carbohidraţilor. Complexul de
polizaharide care alcătuieşte baza peretelui celular al drojdiilor de la vinificaţie este compus
preponderent din glucani şi proteomanani, identificaţi în cantităţi semnificative atât la drojdiile
din sedimentele de la vinurile roşii, cât şi în cele de la vinurile albe.
Pentru extracţia fracţionată a complexului de carbohidraţi din drojdiile de la vinificaţie mai
adecvat s-a dovedit a fi procedeul cu utilizarea apei, soluţiilor de alcalii şi acizi. Utilizarea acestui
procedeu permite obţinerea din drojdiile provenite de la vinurile roşii şi albe a 4 fracţii de glucide: 1)
hidrosolubilă (mono-, dizaharide), 2) alcalinsolubilă (mananproteine), 3) solubilă în acizi (de tip

14
glicogen) şi 4) insolubilă în alcalii şi acizi (β-glucanii) valorile cărora variază în dependenţă de
provenienţa biomasei.
În continuare s-a constatat că compoziţia biochimică a drojdiilor din sedimentele de vin
variază în limite largi. A fost scoasă în evidenţă prezenţa conţinutului echilibrat de proteină
bogată în aminoacizi esenţiali şi imunoactivi, carbohidraţi, acizi graşi polinesaturaţi, care indică
posibilităţile utilizării drojdiilor din sedimentele de vin în calitate de sursă de substanţe biologic
active. Prin investigaţii de evaluare şi optimizare a condiţiilor de obţinere a bioproduselor din
drojdiile de la vinificaţie s-a elaborat tehnologia de obţinere a bioprodusului Prolevin R.
Bioprodusul Prolevin – R (obţinut prin autoliza levurilor din sedimente de la vinuri de masă
roşii) utilizat în proporţie de 48 – 50% la unitate masă în furaje pentru creşterea larvelor şi
puietului de peşte a condus la sporirea semnificativă a viabilităţii larvelor, masei medie a unei
larve şi ihtiomasei generale medii.
Prin urmare, această lucrare dezvăluie mai multe aspecte, scopul final al cărora este
studierea caracterelor fiziologo-biochimice ale unor tulpini de drojdii selectate din sedimente de
vin, elaborarea procedeelor de biosinteză dirijată a carbohidraţilor la drojdii şi obţinerea
bioproduselor din drojdiile sedimentelor de vin şi deci prezintă importanţă teoretică, cât şi valoare
aplicativă.

15
 1. DROJDIILE GENULUI SACCHAROMYCES - SURSĂ DE
CARBOHIDRAŢI ŞI ALTE SUBSTANŢE BIOLOGIC ACTIVE

1.1. Conţinutul cantitativ şi calitativ al carbohidraţilor şi altor substanţe biologic

active în drojdiile genului Saccharomyces
Microorganismele cunoscute sub denumirea de drojdii nu formează o unitate taxonomică
bine delimitată, ci prezintă un grup artificial complex şi eterogen în care sunt încadraţi taxoni
micotici cu caractere relativ intermediare între organismele procariote şi eucariote. Studiile
întreprinse asupra drojdiilor, intensificate în ultimele decenii, se justifică nu numai prin
aplicaţiile lor practice în industrie, ci şi prin importanţa lor ca model experimental către care şi-
au îndreptat atenţia cercetătorii din cele mai diverse specialităţi – citologie, microbiologie,
biotehnologie, biochimie, biologie celulară, genetică.
Drojdiile sunt folosite în mod frecvent pentru explicarea sau confirmarea unor aspecte
fundamentale de biologie celulară şi moleculară şi, în special, a celor care deosebesc celula
eucariotă de cea procariotă. Potenţialele multiple, pe care le prezintă drojdiile au dus la folosirea
lor pentru înţelegerea multor aspecte legate de originea, evoluţia, compoziţia chimică,
ultrastructura şi rolul fiziologic al unor organite celulare şi la rezolvarea multor probleme de
biologie şi genetică moleculară [1].
În timpul de faţă produsele biotehnologiilor levuriene pătrund tot mai mult în diferite
domenii ale economiei, utilizăndu-se la producerea produselor alimentare, băuturilor alcoolice şi
nealcoolice, biocombustibilului, chimicalelor, fermenţilor, suplimentelor furajere, preparatelor
medicale, în agricultură şi rezolvarea multor probleme ecologice [195].
Celula drojdiilor, similar cu cea a eucariotelor vegetale, are două învelişuri – peretele
celular şi plasmolema (membrana celulară) – care, deşi se individualizează clar unul de altul din
punct de vedere fizic, chimic şi arhitectural, îndeplinesc funcţii, în bună parte, asemănătoare sau
complementare. Proprietăţile de protecţie, reglatoare (selective), informaţionale etc. sunt
rezultatul intimei cooperări funcţionale între aceste două structuri de suprafaţă. În membranele
celulare se află în mediu de la 2 până la 5% de carbohidraţi din masa membranelor. La
majoritatea microorganismelor în componenţa membranelor intră glicolipide şi glicoproteine.
Practic toate bacteriile grampozitive, drojdiile şi ciupercile conţin în regiunea membranei
citoplasmatice acizi teihoici (1-2% B.A.U.) – polizaharide acide (glicerofosfaţi) ce pot forma
compuşi cu glicolipidele şi fosfolipidele (acizi lipoteihoici). Glicolipidele participă la biosinteza
polizaharidelor şi transportul zaharurilor. Acizii teihoici reglează schimbul de ioni (leagă cationii

16
bivalenţi, ceea ce este necesar pentru funcţionarea normală a fermenţilor localizaţi în
membrană), asigură legătura între membrană şi peretele celular, posedă activitate antigenă [34,
36].
Peretele celular este o structură extracelulară cu o compoziţie foarte variabilă la diferite
grupuri taxonomice. Însă, necătând la diferenţe, această structură extracelulară indiferent de
provinienţa ei prezintă un ansamblu proteico-polizaharidic, care include în calitate de monomeri
glucoza, manoza, galactoza, xiloza, arabinoza, glucozamina şi alţi hidraţi de carbon [145].
Componenţa polizaharidică a diferitor reprezentanţi ai ciupercilor miceliale poate fi
diferită, însă componentele de bază ale peretelui celular pot fi repartizate în două grupe. Prima
grupă este reprezentată de aşa componente structurale ca poliaminozaharide (chitină, chitozan) şi
glucani care au β-(1-3), β-(1-4), β-(1-6) legături, cea de a doua de mananproteine,
galactomananproteine, etc. Studiul carbohidraţilor diferitor specii de microorganisme deseori se
axează pe doi polimeri: chitina şi glucani [44, 75].
În peretele celular al diferitor drojdii au fost identificate xiloza, manoza, fructoza,
galactoza, alte mono- şi dizaharide care indică prezenţa heteroglicanilor [78].
Peretele celular îndeplineşte funcţii importante pentru celulă: reglează nivelul secreţiilor,
are rol homeostatic şi este elementul indispensabil în menţinerea integrităţii şi durităţii celulei
[124].
Peretele celular al drojdiei, denumit de fiziologi regiunea metabolică externă a celulei,
reprezintă circa 1/10 din volumul celulei şi aproximativ 15 - 30% din greutatea substanţei uscate
şi este compus în mare măsură din polizaharide (~ 85%) şi proteine (~ 15%). Analizele
biochimice extensive arată că glucoza, N-acetilglucosamina şi manoza reprezintă 80 – 90%, 1 –
2% şi 10 – 20% din totalul de glucide, respectiv [163].
Cercetările legate de peretele celular al drojdiilor au relevat atât unitatea, cât şi
diversitatea biochimică a acestuia. Unitatea este asigurată de prezenţa a trei componente majore:
glucani, mananproteine şi chitină (figura 1.1), care împreună reprezintă 60 – 80% din substanţa
uscată a peretelui [36]. Diversitatea este consecinţa modificării raporturilor cantitative şi
structurii particulare a unor componente chimice parietale. Variaţiile biochimice pot apărea la
aceeaşi tulpină în funcţie de condiţiile de cultivare şi etapa ciclului de viaţă [112].
Polizaharidele sunt polimeri constituiţi din cel puţin 11 unităţi monozaharidice. Ele pot fi
alcătuite din unul sau mai multe tipuri de monozaharide. Corespunzător se disting
homopolizaharidele şi heteropolizaharidele. Polizaharidele sunt componentele de bază ale tuturor
organismelor vii şi reprezintă majoritatea carbohidraţilor din natură.

17
 Fig. 1.1. Reprezentarea schematică a componentelor peretelui celular la drojdii
şi legăturile lor. După Lesage G., 2006 [172].
Legendă:
(A) arhitectura laterală a peretelui celular. β-1-3, β-1-4, şi β-1-6 legături glicozidice sunt reprezentate prin
verde, albastru şi portocaliu, respectiv. Mananoproteinele peretelui celular (CWP), pot fi legate de β-1-3-glucan,
prin intermediul legăturilor alcalino sensibile (ASB) sau de proteine (PIR), prin intermediul unor legături disulfidice
(SS). GPI proteinele peretelui celular (GPI-CWP) sunt anexate la β-1-6-glucan, printr-o ancoră rămăşiţă GPI (GPI
real). Legăturile între β-1-3-glucan şi β-1-6-glucan sau proteine PIR sunt încă puţin caracterizate.
(B) Adunarea elementelor constitutive ale septului peretelui celular în timpul înmuguririi la celula mamă şi
fiică (imagine din stânga şi mijloc), precum şi în cicatricea pe celula mamă. (imagine din dreapta). Gri deschis -
membrana plasmatică, gri închis - inel de chitină, culoare roz - sept chitinos primar, galben – glucan, verde -
mananoproteine la baza septului secundar şi albastru - cicatrice chitinoasă la celula mamă.
(C) Structura peretelui celular la ascospori. Glucan-mananoproteinele, chitina şi straturi ditirosin sunt
prezentate în verde, albastru şi violet respectiv. Poduri de conectare interspore bogate în chitosan sunt prezentate în
albastru.

Carbohidraţii se află în natură sub formă liberă sau de polimeri, de sine stătători şi în
complexe cu acizii nucleici, proteinele, lipidele, fosfaţii. Structura şi compoziţia
microorganismelor în general, şi cea a carbohidraţilor, în particular este foarte diversă şi
complicată. Carbohidraţii microbieni în dependenţă de localizarea lor se împart în intracelulari
(din citoplasmă, membrane şi pereţii celulari) şi extracelulari (din capsule, mucozităţi şi cei
eliminaţi în mediul de cultivare) [34].
În dependenţă de funcţie, carbohidraţii se împart în următoarele grupe: a) de rezervă
(tregaloza, glicogenul amorf sau granular din citoplasmă), b) substanţele structurale ale peretelui
celular (chitina, glucanul, mananul), c) polizaharidele membranei celulare (glicolipidele şi

18
glicoproteinele), care participă la transportul substanţelor nutritive şi d) polizaharide ce se
elimină în mediu. Ultimele se mai numesc extracelulare.
O proprietate importantă a polizaharidelor este viscozitatea înaltă, gelatinizarea,
elasticitatea şi capacitatea de a forma emulsii apoase stabile. Rolul lor este de a forma o barieră
fizico-chimică între celulă şi mediul înconjurător, ceea ce protejează celula de uscare şi atacurile
patogenilor [36].
Este bine cunoscut faptul că carbohidraţii de rezervă a drojdiilor sunt glicogenul şi
tregaloza [117, 185]. Conţinutul acestor carbohidraţi, în dependenţă de condiţiile de cultivare,
poate ajunge la 25% din substanţa uscată. Tregaloza şi glicogenul se sintetizează ca răspuns la
aşa condiţii nefavorabile de cultivare ca temperaturile înalte şi joase, presiunea osmotică înaltă şi
carenţa în surse nutritive [83, 187, 203, 222]. Tregaloza se sintetizează preponderent la drojdiile
cultivate în condiţii aerobe, iar glicogenul - la cele cultivate anaerob [36, 133]. Funcţia de bază a
tregalozei şi glicogenului este protecţia membranelor celulare şi a proteinelor de denaturare [36,
83]. Complexul de fermenţi ce catalizează biosinteza tregalozei participă şi în reglarea căii
glicolitice la S. cerevisiae [120].
Carbohidraţii din citoplasmă pot forma complecşi cu ADN, ARN, proteinele, lipidele şi
fosfaţii. În afară de funcţia de substanţă de rezervă participă în mecanismele reglatoare ale
celulei ce controlează sinteza diferitor substanţe, creşterea şi multiplicarea celulei. Ca exemplu
pot servi complexele glicogenribosomale care controlează biosinteza proteinelor.
Însă cel mai mare interes ştiinţifico-practic la momentul actual îl prezintă polizaharidele
de bază ale peretelui celular al drojdiilor, şi anume glucanii şi mananii care au cea mai largă şi
vastă utilizare în diverse domenii [125, 152, 168, 175, 206, 207].
Glucanul este un polizaharid complex, prezent la drojdii, compus din unităţi de D-
glucopiranoză legată β-(1→6) şi β-(1→3). Molecula de glucan din peretele S. cerevisiae este
ramificată, fiind formată dintr-un lanţ axial în care reziduurile de D-glucopiranoză sunt β-(1→6)
legate şi catene laterale cu legături β-(1→3). Forma generală a moleculei de glucan poate fi
asemănată cu o panglică lungă şi răsucită având o latură hidrofilă, datorită concentrării grupărilor
hidroxilice, şi alta hidrofobă pe care s-au concentrat grupările metilice. Dacă se admite o
asemenea structură, extinderea suprafeţei peretelui celular poate fi considerată ca rezultat al
alunecării lanţurilor de glucan, unul de-a lungul celuilalt sau clivajul enzimatic al lanţurilor de
glucan preformate prin activarea glucanazelor parietale [171].
Moleculele de glucan se asociază (probabil prin legături de hidrogen laterale), formând
subunităţi microfibrilare similare cu cele de celuloză şi chiar de xilan. La rândul lor,
microfibrilele de glucan se asociază, organizând în interiorul matrixului parietal o reţea cu o

19
arhitectură şi topografie complicată. Experienţele pe protoplaştii de drojdii au arătat că aceştia
regenerează pe suprafaţa lor o structură reticulară glucanică, dar care pare să difere de glucanii
insolubili ai peretelui nativ, ce rămân după extracţia mananproteinelor [170].
Sinteza peretelui celular la drojdii este localizată pe membrana plasmatică şi este
dependentă de proteinchinazele secretorii şi controlată de un sistem enzimatic echilibrat, care
conţine hidrolaze, glicozidaze, glicoziltransferaze, şi transglicozilaze. Acest sistem numit GH72,
ce conţine 72 de enzime, este prezent în organismele fungice şi posedă funcţia importantă de a
sintetiza unităţile de structură şi a alungi (1-3, 1-6) lanţuri de glucan. Cu toate acestea,
mecanismele moleculare care controlează echilibrul între hidroliză şi transglicozilare în aceste
sisteme nu sunt pe deplin înţelese [131, 144, 210].
β-1,6-glucanul este o componentă specifică esenţială a peretelui celular al S. cerevisiae
care interconectează toate celelalte componente din perete într-un grilaj. Eforturi considerabile
au fost îndreptate la identificarea şi caracterizarea etapelor implicate în biosinteza sa din punct de
vedere genetic şi biochimic. Studiile arată că acest polimer joacă un rol central în structura
peretelui, şi este legat prin intermediul lanţurilor de glucan β-1,3 şi chitină de mananproteine.
Cercetările genetice au identificat genele care duc la defecte de diversă severitate în structura β-
1,6-glucanului, de multe ori cu consecinţe letale. Produsele activităţii acestor gene au fost
localizate în întreaga cale secretorie şi la suprafaţa celulelor. Cu toate acestea, activitatea celor
mai multe dintre aceste gene identificate rămâne necunoscută, ceea ce face neclar în ce măsură şi
mod acestea contribuie la defectarea compoziţiei acestui polimer Date curente structurale şi
genetice au permis dezvoltarea unor modele pentru a prezice evenimentele biosintetice. Pe baza
cunoştinţelor despre sinteza glucanilor şi a chitinei, este probabil că cea mai mare parte a lor se
sintetizează la suprafaţa celulelor, dar necesită în prealabil evenimente cheie intracelulare. [99,
174, 177, 211].
Responsabil de rigiditatea peretelui celular al drojdiilor este β(1-3)-glucanul, care este
sintetizat de 1,3-β- GS (glucansintetaza), localizată pe membrana plasmatică şi care este o
enzimă foarte mobilă, schimbându-şi încontinuu locul de acţiune. Imobilizarea acestei enzime
duce la sinteza neuniformă a glucanilor în pereţii celulari şi, ca rezultat, la liza şi moartea
celulelor de drojdii [122, 231].
Toate investigaţiile de până acum au dat rezultate negative privind prezenţa glucanului la
suprafaţa peretelui celular. Ca urmare, testele imunochimice nu au putut fi utilizate pentru
localizarea glucanului în cadrul peretelui celular de drojdii. Interacţiunea sa cu alte substanţe
chimice parietale poate duce la apariţia unor funcţii noi sau la potenţarea componentelor ataşate.

20
Faptul, că numai o parte din glucanul parietal este susceptibil la hidroliza acidă blândă denotă, că
glucanul este strâns conexat cu celelalte componente chimice parietale.
Mananii reprezintă cea de a doua componentă majoră a peretelui celular al drojdiilor cu
multiple şi complexe funcţii (structurală, informaţională, imună, protectoare etc.). Mananii
formează, de regulă, complexe stabile cu proteinele peretelui şi se caracterizează printr-o
accentuată eterogenitate, determinată de gradul de polimerizare al unităţilor manozil, de tipurile
de legături ce se stabilesc, de prezenţa şi a altor tipuri de reziduuri ozidice dar şi de modul de
complexare cu alte tipuri de molecule. Molecula mananproteică prezintă un ax principal în care
reziduurile manopiranozice sunt legate α -(1→6) şi numeroase lanţuri laterale cu legături α -
(1→2). O particularitate majoră a componentei glucidice a mananproteinelor din peretele celular
al S. cerevisiae este diferenţierea lanţului polizaharidic într-un miez („core”) şi lanţ periferic
(extern). Miezul se individualizează prin faptul că unele lanţuri laterale sunt ataşate la axul
principal prin legături α -(1→3) şi prin aceea că prima unitate manozică este legată β -(1→4) la
unitatea di-N-acetilchitobioză. Miezul mananproteinelor din peretele celular al drojdiilor este
identic în privinţa multor trăsături structurale cu oligozaharidele similare din glucoproteinele
mamiferelor. Enzimele cheie în N-glicozilarea proteinelor şi sinteza mananproteinelor la drojdii
sunt manoziltransferazele, numite OZT, responsabile de translarea eficientă a proteinelor
glicozilate la locul de sinteză şi alungirea lanţului polizaharidic. Variate studii biochimice şi
genetice au arătat, că setul de OZT la S. cerevisiae este compus din nouă subunităţi: Wbp1,
Swp1, Stt3, Ost1, Ost2, Ost3, Ost4, Ost5, şi Ost6 [134, 229].
O altă cale distinctă de sinteză a mananproteinelor la drojdii este cea care foloseşte ca
unităţi de sinteză O-oligozaharidele, ce constau din lanţuri scurte de până la cinci unităţi de
manoză, cu primele două reziduuri α-1-2 legate şi cele ulterioare α-1-3 legate. Aceste unităţi de
structură sunt legate de proteină în domeniile bogate în serină/treonină. Etapa iniţială a O-
manozilării are începutul în reticolul endoplazmatic, în cazul în care un singur reziduu de
manoză este transferat de la O-dodecil-fosfat-manoză pe reziduurile de serină/treonină, de un
complex de şapte enzime O-manoziltransferaze. Etapele ulterioare se derulează în aparatul Golgi
şi sunt catalizate de manoziltransferaze utilizând GDF-manoza. Manozilfosfaţii servesc ca donori
de zahăr principali în ambele căi de sinteză a mananilor [105, 128, 181, 184].
Un rol important în biosinteza mananilor din pereţii celulari ai drojdiilor S. cerevisiae îl
joacă GFI, codificat de gena MCD4. Scăderea nivelului de GFI ataşat de proteinele din peretele
celular determină de asemenea o scădere a nivelurilor de manan şi o creştere a nivelului de β –
(1,6) glucan alcalinoinsolubil şi chitină în peretele celular [178]. Unele GFI proteine sunt ele
însele transglicozidaze active ce joacă un rol indispensabil în sinteza peretelui celular [126].

21
 Imobilizarea celulelor de S. cerevisiae stimulează biosinteza polizaharidelor şi
mananproteinelor peretelui celular. Imobilizarea are loc datorită reacţiei între grupările
aldehidice ale substratului şi aminogrupele proteinelor disponibile ale suprafeţei celulare. Faptul
acesta duce la majorarea sintezei β-1,3-, β-1,6-glucanilor şi mananproteinelor [151].
Mananproteinele joacă un rol predominant în menţinerea integrităţii peretelui celular,
supus acţiunii diferitor enzime, presiunilor înalte şi temperaturilor scăzute [118].
Lanţurile mananproteice sunt principalele imunogene la drojdii, iar la S. cerevisiae
manoza terminală, legată α (1→3), este şi imunodominantă. Datele sumare privind determinanţii
imunochimici la drojdii sugerează că aceştia au o structură şi funcţie comparabilă cu cea a
antigenelor bacteriene [93, 220].
Studiile referitor la localizarea mananproteinelor în pereţii celulari ai drojdiilor din mai
multe genuri au arătat că ele reprezintă învelişul exterior al peretelui celular, având legături de
diferită natură cu fosfaţii, piruvaţii, acizii glucuronici, etc. Fosfatul din mananproteinele peretelui
celular este sursa majoră a sarcinilor electrice negative de pe suprafaţa celulelor de drojdii [93,
199].
Chitina - alt polizaharid detectat prin diferite metode (acetilare alcalină parţială, difracţie
în raze X, absorbanţă în infraroşu) în pereţii celulari ai multor genuri de drojdii: Hansenula,
Pichia, Zygosaccharomyces, Saccharomyces, Candida, Nadsonia ş.a. Chitina este un
aminopolizaharid cu moleculele liniare constituite în exclusivitate din reziduuri de N-
acetilglucozamină legate β-(1→4). Lanţurile lungi au o greutate moleculară comparabilă cu a
celulozei. Chitina din pereţii celulari ai drojdiilor are, de regulă, caracter amorf. Chitina cristalină
formează o unitate celulară care este ortorombică ( a=4,76Å; b =10,28Å; c =18,25Å), conţinând
4 reziduuri de N-acetilglucozamină. Rezistenţa sa la hidroliza acidă se explică prin hidroliza
legăturilor amidice din lanţurile laterale acetil-aminate, care lasă expuse grupele amino-
cationice. Ea reprezintă circa 1 - 2% din substanţa uscată a peretelui celular al drojdiilor care
înmuguresc şi de 3 ori mai mult la formele fusionabile şi miceliene. Se apreciază, că la drojdiile
care înmuguresc chitina este localizată la nivelul cicatricei mugurale, iar septul transversal
primar ce separă celula mugurală de celula-mamă este constituit numai din acest
aminopolizaharid [172]. Chitina formează în peretele celular un strat intern de microfibrile
cristaline implantate într-un strat amorf. Se presupune că defectele peretelui celular sunt
compensate de majorarea activităţii chitinsintetazei şi creşterea sintezei chitinei [45].
Sinteza peretelui celular, în special sinteza elementelor structurale – chitinei şi glucanilor
este strâns legată de membrana plasmatică şi elementele ei. Aşa, formarea chitinei este
coordonată prin biosinteza fosfatidilcolinei şi sterinelor. Veziculele microorganismelor ce

22
sintetizează chitină conţin 3 chitinsintetaze, numite CS I, CS II şi CS III, care sunt active la
diferite valori ale pH-ului, în prezenţa ionilor de Mg2+ şi Co2+, iar membranele lor sunt bogate în
lipide [172, 205].
Conform ipotezelor actuale sinteza predecesorului chitinei - UDF-N-acetil-D-
glucozaminei se începe de la [14C] tregaloză [92, 172]. Conform uneia din aceste ipoteze, la
temperaturi înalte tregalozo-6-fosfatul diminuează stabilitatea termică a primei enzime a
biosintezei zaharurilor – glutamin fructozo-6-fosfat-amino-transferazei şi a altor enzime din
metabolismul chitinei. Mutaţiile în sinteza tregalozei sunt înalt pleotrofe şi pot acţiona asupra
metabolismului carbohidraţilor care nu au legătură directă cu sinteza tregalozei. În aşa mod,
sinteza chitinei în peretele celular al fungilor corelează, probabil, cu sinteza lipidelor
membranare şi a tregalozei care stabilizează membranele la stresuri, evitând distrugerea lor
[182].
Chitina are un important rol structural: prezenţa ei conferă peretelui celular o deosebită
rezistenţă la acţiunea unor agenţi fizici, chimici şi biologici. Peretele celular al S. cerevisiae este
o structura elastica care asigură o protecţie osmotică şi stabileşte forma celulei. Stratul interior
este în mare măsură responsabil de rezistenţa mecanică a peretelui şi oferă de asemenea site-uri
de racordare pentru proteinele care formează stratul exterior al peretelui. Stratul exterior de
proteine, de asemenea, limitează permeabilitatea peretelui celular, astfel protejând membrana
plasmatică de atacurile diferitor enzime străine şi altor compuşi care-i perturbează structura.
Principalele caracteristici ale organizării moleculare a peretelui de drojdii sunt acum cunoscute.
Important este, că compoziţia moleculară şi de organizare a peretelui celular poate varia
considerabil. De exemplu, încorporarea multor proteine în peretele celular este temporară şi
depinde mult de condiţiile de mediu. În mod similar, formarea complexelor proteico –
polizaharidice, specifice peretelui celular, este puternic afectată de condiţiile externe, ceea ce
indică asupra unui regulament strict de construcţie a peretelui celular [163].
Drojdiile genului Saccharomyces au o istorie lungă de utilizare în diferite ramuri ale
economiei. Datorită eficacităţii in producerea etanolului, S. cerevisiae fără dubii este cel mai
principal microorganism comercial. Folosit la producerea pâinii, berii şi vinurilor, cel mai vechi
utilizat de om microorganism a stat şi la baza primelor procese biotehnologice din lume. Cu
dezvoltarea metodelor noi ale geneticii contemporane S. cerevisiae din nou se află în prim planul
perfecţionărilor în biotehnologie.
Drojdiile prezintă numeroase avantaje pentru cercetările de inginerie genetică, cu scopul
obţinerii unor preparate farmaceutice şi vaccinuri noi, servind în biotehnologia modernă ca
„instrumente” de manipulare a genelor.

23
 Tulpinile de drojdii S. cerevisiae genetic modificate cultivate pe medii nutritive cu
diferite surse de N, C, P, săruri minerale, ioni ai metalelor, vitamine şi inhibitori ai
scualensintetazei, sintetizează cantităţi esenţiale de farnezolă şi geranilgeraniolă, care au
capacitatea de a fixa moleculele de proteină pe membrana celulară şi posedă capacităţi
antimicrobiene, antivirale şi antitumorale, ce dă posibilitatea de a le folosi la tratarea bolilor
neurodegenerative imune, trombozei, aterosclerozei, cancerului şi la inhibarea procesului de
îmbătrânire a pielii [191].
Tulpina S. cerevisiae 60-Д578 genetic modificată este producător activ al interleukinei-2
umane [66].
Biomasa unei tulpini de drojdii S. cerevisiae cultivată pe medii semisintetice serveşte ca
materie primă pentru producerea unei mărci comerciale de preparate medicinale ce posedă
acţiune antioxidantă, anticitolitică şi antiinflamatoare - „Рексод”. Substanţa funcţională de bază
a preparatului este superoxiddismutaza (SOD) recombinantă a omului. Tehnologia dă
posibilitatea de a obţine cantităţi considerabile de SOD cu o activitate de 500.000 un/mg.
Preparatul are mari perspective de utilizare în oftalmologie, traumatologie, terapia şocurilor
termice şi traumatice, la tratarea maladiilor acute şi cronice ale ficatului, bolilor cardiace, diferitor
stări de gripă şi boli ale pielii [67].
Biomasa drojdiilor S. cerevisiae conţine cantităţi relevante de proteină, bogată în
aminoacizi esenţiali şi imunoactivi: izoleucina, leucina, tirozina, valina, fenilalanina, arginina
etc. [156, 208, 221], ubichinonă (compus glicoproteic) şi diferiţi compuşi lipidici, aşa ca sterolii,
acizii graşi polinesaturaţi: linoleic C18:2 şi α-linolenic C18:3 şi toată gama acizilor graşi
polinesaturaţi ω 3 şi 6, ce se folosesc la tratarea bolilor cardio-vasculare, distrofiei musculare,
paradantozei, diabetului zaharat şi care de asemenea, minimalizează efectul toxic al preparatelor
chimioterapeutice [135, 136, 149, 190 233].
Biomasa de drojdii S. cerevisiae este o sursă excepţională de fosfolipide şi conţine:
lecitina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol şi
fosfatidilinozitol, fapt care relevă, că această biomasă este o materie primă de perspectivă pentru
obţinerea fosfolipidelor destinate producerii medicamentelor [137, 193].
Pentru obţinerea ergosterolului (provitamina D - substanţă antirahitică), larg aplicată în
medicină şi veterinărie, sunt utilizate diferite tulpini de drojdii S. cerevisiae [77, 115 198].
Steroizii hidroxilaţi şi acetilaţi sintetizaţi de drojdiile genului Saccharomyces cultivate pe
medii de cultură ce conţin predecesori ai acestora (∆5 şi ∆4-3ß-hidroxisteroizi, pregnenolon,
dehidroepiandrosteron ş.a.) şi-au găsit utilizare la tratarea maladiilor sistemului imunitar,

24
diferitor forme ale cancerului, boli ale sistemului cardiovascular şi a maladiilor
neurodegenerative, ca de exemplu boala Parkinson şi Alzheimer [188].
În baza biomasei de drojdii îmbogăţite cu iod şi cu ioni de Cr, Fe, Se, Zn şi Mn se
elaborează preparate curative şi profilactice, diferite suplimente alimentare şi furajere [61, 232].
Esenţială pentru valorificarea drojdiilor de vin este şi prezenţa complexului de vitamine
B. Conform informaţiilor din literatură în biomasa lor este prezentă întreaga gamă a vitaminelor
grupei B, riboflavina, tiamina, acidul nicotinic şi folic [33, 37, 58].
Astfel, S. cerevisiae prezintă un mare potenţial pentru dezvoltarea unor tehnologii
orientate spre producerea substanţelor biologic active de mare valoare, cum ar fi carbohidraţii,
proteinele şi lipidele.

1.2. Activitatea biologică a carbohidraţilor drojdiilor genului Saccharomyces

Carbohidraţii reprezintă cele mai cunoscute şi răspândite substanţe pe Pământ şi se
caracterizează printr-o structură foarte variată. Polizaharidele sunt polimeri biologici cu un rol
impunător în activitatea vitală a organismelor vii, fapt care este determinat atât de complexitatea
lor structurală, cât şi de compoziţia monozaharidică variată şi tipurile de legături glicozidice
dintre acestea. Interesul sporit faţă de polizaharidele bioactive naturale, remarcat în ultimii ani,
se datorează multiplelor aplicaţii ale acestora în cele mai diverse ramuri: industria alimentară şi
cea a cosmeticelor, medicină şi farmaceutică, zootehnie şi veterinărie, ecologie şi protecţia
plantelor, industriile extractibile etc. În această ordine de idei, un interes deosebit prezintă
polizaharidele microbiene, obţinerea cărora din punct de vedere economic este mult mai
avantajoasă celor de origine animală şi vegetală.
Un loc deosebit printre polizaharidele microbiene îl ocupă proteomananii şi β-glucanii, ce
formează straturile externe şi interne ale pereţilor celulari şi sunt componenţii polimerici de bază
a drojdiilor şi bazidiomicetelor, îndeplinind funcţia de barieră osmotică, protecţie contra
agenţilor patogeni, adeziune celulară, de menţinere a structurii şi rigidităţii celulare etc. β-
glucanii drojdiilor au o semnificaţie biomedicală deosebită datorită activităţii lor antivirale şi
antibacteriene [165, 183, 201], imunomodulatoare [98, 113, 215, 236] şi anticancerigene [237,
239, 243]. Derivaţii sulfataţi ai β-glucanilor au demonstrat in vitro activitate antiproliferativă
impotriva celulelor sarcomei 180 (S-180) [240]. Mai mult ca atât, β-glucanii prezintă substanţa
activă de bază la elaborarea noilor vaccinuri anticancerigene polivalente [196]. În combinaţie cu
alte substanţe biologic active, β-glucanii au capacitatea de a reduce disponibilitatea toxinelor din
tractul digestiv, mecanismul acestui proces fiind bazat pe complexarea toxinelor cu catena
polizaharidică cu ajutorul legăturilor de hidrogen şi Van der Waals [242].

25
 În experienţele asupra şobolanilor s-a demonstrat acţiunea inhibitoare a β-glucanilor
asupra paradontozei, influenţa lor reglatoare asupra sistemului hipotalamo-hipofizo-
corticosuprarenal, de stimulare a fagocitozei, precum şi eficacitatea lor în tratarea diabetului
zaharat [91 100].
Există date recente în literatura de specialitate care sugerează posibila aplicare a
derivaţilor β-glucanilor de drojdii în tratamentul artritei [164].
Recent s-au dovedit proprietăţile hipocholesterolemice, anticoagulante, anticitotoxice,
antimutagene, antiproliferative [179] şi antioxidante [213] ale β-glucanilor, făcându-le substanţe
promiţătoare ca promotori de sănătate.
(1-3)-β-glucanul este un marcher pentru diagnosticarea infecţiilor pulmonare cu genul
Aspergillus şi de evaluare a efectului terapeutic al tratamentului administrat [238]. Actualmente
se desfăşoară studii vaste asupra posibilităţii utilizării β-glucanului din drojdiile S. cerevisiae ca
imunomodulator care poate avea o acţiune favorabilă asupra simptomelor de astm şi alte boli
alergice. Acestea sunt primele studii care arată că administrarea subcutanată a particulelor de β -
1-3-glucan duce la creşterea în ser a nivelului de interleukină-10 la astmatici, ce ar face posibilă
modularea sensibilităţii alergice [209].
O direcţie de perspectivă a aplicării β-glucanilor este acvacultura. În experienţele asupra
crevetelor şi peştilor s-au demonstrat efectele acestora asupra diferenţierii celulelor T helper,
profilarea expresiei genice, acţiunea benefică asupra nivelului funcţional prin inducerea de
rezistenta la boli, creşterea viabilităţii şi masei larvelor [106, 154].
Polizaharidele obţinute din S. cerevisiae prezintă un interes special în domeniul
produselor alimentare, iar acest microorganism, datorită faptului că a fost utilizat de către om
pentru fabricarea produselor alimentare de secole, oferă cea mai bună garanţie a inofensivităţii
lor. Administrarea orală a β-D-glucanilor este bine tolerată, nu afectează palatabilitatea
produselor alimentare şi nu are efecte toxice. Efectele lor bioactive şi funcţionale sunt
determinate de greutatea moleculară, gradul de ramificare şi natura acestora. Având în vedere
efectele sănătoase ale β-glucanilor, este recomandată ingestia de alimente bogate în aceste
substanţe. Astfel de alimente sunt legumele, cerealele şi în special fibra de drojdii
Saccharomyces, care conţine β-glucani cu cel mai mare număr de proprietăţi benefice raportate
[152].
Glucanii pot fi folosiţi ca agenţi de îngroşare pentru produsele alimentare, cum ar fi
cremele, îngheţata, sosurile, etc. şi utilizate, datorită capacităţii lor de a absorbi şi reţine cantităţi
mari de apă, pentru stabilizarea emulsiilor şi mărirea viscozităţii produselor. În plus, atunci când
sunt adăugate la produsele alimentare lichide, acestea provoacă senzaţia de o consistenţă grasă,

26
chiar dacă polizaharidele sunt lipsite de grăsimi libere. Polizaharidele nominalizate sunt adecvate
pentru utilizarea ca adjuvant tehnologic în prepararea produselor de panificaţie, cum ar fi pâinea,
biscuiţii, produsele de patiserie şi altele [227].
Glucomananii drojdiilor posedă acţiune radio-fotoprotectoare semnificativă împotriva
consecinţelor patologice ale expunerii pielii la lumină solară cu lungimea de undă scurtă, razele
ultraviolete (UV), radiaţii. Experienţele in vivo şi in vitro au arătat, că mecanismele de protecţie
a pielii se bazează pe expresia factorului nuclear kappa B indusă de sintaza oxidului nitric,
suprimarea prostaglandinei E2 şi interleukinei 1α. şi, cel mai important, pe stimularea
hematopoezei [206, 230]. Aceste proprietăţi ale polizaharidelor face posibilă utilizarea lor
practică în farmaceutică şi cosmetologie ca parte componentă a diferitor geluri şi creme [68].
Mananoligozaharidele drojdiilor posedă capacităţi de diminuare a acţiunii toxice a
aflatoxinelor, care reprezintă una din cele mai periculoase grupe de micotoxine permanente în
furaje, prin intermediul cărora nimeresc în produsele lactate şi agricole consumate de om [175,
207]. Mecanismul acţiunii este bazat pe capacitatea mananilor de a diminua deteriorarea ADN-
ului, indusă de aflatoxine, prin formarea unui complex supramolecular între toxine şi manan
[176].
Suplimentarea raţiei furajere a animalelor cu pereţii celulelor de drojdii îmbunătăţesc
răspunsul imun împotriva infecţiilor, fapt care se datorează prezenţei mananilor în peretele
celular şi relevă posibilitatea folosirii acestora ca adjuvant în furaje [125].
Caracteristicile importante ale mananilor izolaţi din pereţii celulari de drojdii, cum ar fi
solubilitatea înalta în apă, greutatea moleculară relativ mică (15-30 kDa), proprietăţile
antimutagenice şi antioxidante, bazate pe reducerea radicalilor reactivi de oxigen, sunt
promiţătoare pentru utilizarea lor ca un potenţial protector antimutagenic natural [168].

1.3. Influenţa condiţiilor şi modului de cultivare asupra sintezei carbohidraţilor la

microorganisme

1.3.1. Influenţa surselor de carbon şi azot asupra sintezei carbohidraţilor la

microorganisme
Cele mai multe specii de drojdii se dezvoltă pe medii ce conţin zaharuri ca sursă de
carbon, săruri de amoniu ca donori de azot, săruri minerale şi factori de creştere.
Deoarece drojdiile genului Saccharomyces pot asimila numai hexoze, pentru cultivarea
lor se folosesc materiile prime cu conţinut de amidon sau de alţi hidraţi de carbon ce pot fi
scindaţi în hexoze. Tot mai des ca materie primă se utilizează melasa din sfeclă de zahăr, foarte

27
accesibilă economic, care pe lângă zaharoză mai conţine şi o serie de alţi componenţi, aşa ca
zahărul invertit (amestec de D-glucoză şi D-fructoză), betaina, acizi organici [2].
În cazul obţinerii unor produse de înaltă puritate, folosite ulterior la producerea
chimicalelor, medicamentelor, remediilor cosmetice, adaosurilor alimentare şi furajere, ca sursă
de carbon este utilizată pe larg glucoza [24].
Glucoza este cel mai abundent monozaharid în natură, precum şi sursa de carbon şi de
energie preferată pentru cele mai multe organisme, inclusiv drojdii [94, 153, 169].
Calea pentru catabolismul glucozei în S. cerevisiae este glicoliza, dar o varietate de alte
zaharuri de asemenea poate fi utilizată ca sursă de carbon şi energie prin această cale. Fructoza şi
glucoza sunt uşor fosforilate şi intră în glicoliză în mod direct, în timp ce galactoza şi manoza
sunt mai întâi convertite la glucoză-6-fosfat şi fructoză-6-fosfat, respectiv, înainte de a intra în
glicoliză. Di-, tri- şi oligozaharidele trebuie să fie hidrolizate în monozaharide, care pot intra în
calea glicolitică. Zaharoza, prin urmare, este hidrolizată în glucoză şi fructoză de invertază,
maltoza în glucoză prin maltaze (α-D-glucozidază) şi melibioza în galactoză de melibiaze (α-D-
galactozidaze). Poli- şi trizaharidele constând din unul sau mai multe tipuri de zahăr sunt
hidrolizate în monozaharide printr-o combinaţie de enzime. Rafinoza, de exemplu, este redusă în
monozaharidele galactoza, glucoza şi fructoza prin eforturile combinate ale melibiazei şi
invertazei. Amidonul necesită glucoamilaze pentru a fi hidrolizat până la glucoză [238].
Mecanismele prin care celulele de drojdii detectă prezenţa surselor de carbon în mediul de
cultură au fost investigate de mai mulţi autori [94, 153, 200]. Cele mai multe dintre aceste lucrări
s-au concentrat pe glucoză, cu toate că există date importante privind utilizarea surselor de
carbon, cum ar fi galactoza şi maltoza. S. cerevisiae este o drojdie glucofilă care s-a adaptat
pentru a utiliza optim o gamă largă de concentraţii de glucoză şi alte zaharuri [169]. Această
specie este într-adevăr caracterizată de mai multe mecanisme de înaltă specializare, care să-i
permită să perceapă şi să comunice rapid nivelul de glucoză din mediu mecanismelor de
reglementare a celulei, fapt ce rezultă cu utilizarea rapidă şi totală a glucozei din mediu.
Reglementarea transportului surselor de carbon, nivelul de exprimare a genelor ce reglează calea
glicolitică sunt exemple de mecanisme direct reglementate de glucoză, care permit S. cerevisiae
a răspunde eficient la fluctuaţiile concentraţiei glucozei în mediul nutritiv [119].
Tulpinile de drojdii de vin S. cerevisiae cultivate pe medii de nutriţie cu conţinut mixt de
glucoză şi fructoză, asimilează în primul rînd glucoza, fructoza nefiind asimilată complect. În
acelaşi timp, în mediile ce conţin numai una din aceste 2 hexoze, fructoza este asimilată mai
rapid şi cu o eficienţă mai mare. Însă, în timpul fermentaţiei, această preferinţă nu este un
parametru fix şi depinde de proprietăţile inerente ale tulpinii de drojdie şi condiţiile externe.

28
Adăugarea de etanol în mediu are un efect inhibitor asupra utilizării fructozei, iar suplimentarea
cu azot asimilabil inhibă utilizarea glucozei [87].
Mecanismul metabolic cel mai proeminent pentru detecţia glucozei implică hexochinaze,
enzime necesare pentru fosforilarea hexozelor înainte de intrarea în glicoliză. Genele
responsabile de gluconeogeneză şi respiraţie, precum şi de utilizarea surselor de carbon
alternative, cum ar fi maltoza sau zaharoza, sunt grav reprimate în prezenţa glucozei sau altor
surse de carbon rapid fermentabile [121].
Glucoza este un compus indispensabil şi strict necesar pentru buna sinteză a peretelui
celular şi funcţia sinergică a glucozidazelor şi tuturor enzimelor implicate în acest proces [214].
Ea este responsabilă de activarea enzimelor membranei plasmatice. Aceste enzime au roluri
multiple în organisme: mediază fluxul de ioni şi protoni în membrana celulară, reglînd pH-ul şi
protejează celula de cationii toxici [80, 86].
UDF-D-glucoza, precursorul şi donatorul de zahăr de bază în procesul de sinteză a β-
glucanului şi a formării peretelui celular, este sintetizat de la D-glucoză. Celulele de drojdii S.
cerevisiae au o rezervă citoplasmatică mare de UDF-D-glucoză care ar putea fi folosită pentru
sinteza peretelui celular [107, 223].
Un număr mare de studii sugerează, că sensibilitatea celulelor la oxidanţi şi stresul
oxidativ depinde de intensitatea metabolismului celular şi de concentraţia de glucoză. De fapt,
celulele de drojdii care folosesc surse de carbon fermentabile şi, prin urmare, se bazează în
principal pe glicoliză pentru producerea energiei sunt mai sensibile la stresul oxidativ.
Întreţinerea şi adaptarea metabolismului energetic joacă un rol important în capacitatea celulei de
a răspunde la deteriorarea ADN-ului. Conţinutul mare de glucoză în mediul de cultivare
declanşează o inhibiţie rapidă a respiraţiei, care este însoţită de o suprimare puternică a
glicolizei. În plus, are loc activarea căii pentozo-fosfat şi acumularea de glicogen şi tregaloză.
Aceste condiţii în cele din urmă duc la o scădere semnificativă a nivelului de ATP [162].
Spre deosebire de drojdiile saharomicete, drojdiile din genul Kluyveromyces au un
răspuns complet diferit la majorarea concentraţiei glucozei în mediul de cultivare. Ca exemplu
poate servi tulpina K. marxianus ATCC 26548, care fiind cultivată în condiţii aerobe, la pH-5,0,
temperatura 30°C şi concentraţii mari de glucoză ca unică sursă de carbon sintetizează până la
71,9% S.U. de proteine şi numai 9,6% S.U. de carbohidraţi [129].
La cultivarea S. cerevisiae pe medii cu glucoză, peptonă, extract de drojdii, extract de
malţ, cu adăugarea ionilor de Mn2+ şi Mg2+, după optimizarea parametrilor de cultivare s-a reuşit
majorarea randamentului de obţinere a β-glucanului în intervalul ± 3,5% şi de biomasă în
limitele ± 5,5% [161].

29
 La cultivarea continuă a S. cerevisiae pe medii cu diferite concentraţii de glucoză s-a
determinat, că conţinutul de β-glucan şi rezistenţa peretelui celular la β-glucanază a fost mai
mare în faza staţionară de creştere şi dezvoltare a drojdiei. Pe baza rezultatelor obţinute a fost
selectată pentru producţia β-glucanului solubil o tulpină de S. cerevisiae cu productivitatea de β-
glucani de 0,095 g/l [170].
Influenţa ingredientelor mediului de cultură, cum ar fi sursa de carbon şi azot, ioni
anorganici, precum şi activitatea enzimelor implicate în sinteza mananproteinelor la S. cerevisiae
a fost evaluată pe mediu de cultură care conţine 4,9 g/100 ml zaharoză, 4,4 g/100 ml pepton, 3,1
g/100 ml extract de drojdii şi 2,2 g/100 ml glicerol. Pe acest mediu sinteza mananului a crescut
de la 82,7 ± 3,4 mg/100 ml la 162,5 ± 3,5 mg/100 ml. A fost evaluată şi influenţa pH-ului iniţial,
volumului inocumului şi a mediului de cultură, temperaturii asupra sintezei mananului. În
conformitate cu datele obţinute, acest parametru a fost maxim la pH- 5, volumul inocumului - 5
ml, temperatura +32°C. Producţia maximă de manani a crescut până la 258,5 ± 9,1 mg/100 ml
[138]. Este evident că producţia de manani este în mod semnificativ influenţată de compoziţia
mediului de cultură şi de condiţiile de cultivare.
Sinteza polizaharidelor la S. cerevisiae este de asemenea influenţată şi de GFI-proteinele
peretelui celular. Diminuarea nivelului acestor proteine în peretele celular duce la scăderea
nivelului de manan şi creşterea nivelului de β-1-6-glucan insolubil şi chitină [178].
După cum a mai fost menţionat, drojdiile pot să crească pe diferite surse de carbon, care
influenţează dezvoltarea lor. Astfel, trebuie să se aştepte la o modificare a compoziţiei şi
structurii peretelui celular induse de natura sursei de carbon. Cu toate acestea, trebuie luat în
considerare şi modul de cultivare, pentru că în flacoane cu agitare parametrii de cultivare, cum ar
fi pH-ul şi disponibilitatea oxigenului sunt stabilite la începutul cultivării şi foarte mult variază în
funcţie de evoluţia dezvoltării microorganismului, în timp ce în reactoare aceşti parametri pot fi
păstraţi constanţi pe tot parcursul procesului de fermentaţie. Cultivarea drojdiei S. cerevisiae în
aceste două moduri diferite în prezenţa diferitor surse de carbon a condus la date relevante
despre structura peretelui celular şi proporţia relativă β-glucan: manan, care a variat în
dependenţă de natura sursei de carbon. Aceste variaţii au fost mai evidente în celulele de drojdii
cultivate în flacoane la agitator, decât în fermentator. În termeni cantitativi, s-a constatat că
drojdiile cultivate în fermentator au avut masa peretelui celular cu 20-35% mai mică şi conţineau
de 2-3 ori mai multă chitină decât drojdiile cultivate în flacoane pe agitator. Studiul conţinutului
de β-glucani în drojdiile cultivate în prezenţa diferitor surse de carbon a arătat o majorare a
cantităţii glucanilor de la 14 ± 2,5% S.U. în culturile crescute pe glucoză, manoză şi zaharoză
până la 21 ± 3% S.U. în cele cultivate pe etanol. În acelaşi timp, la aceste culturi peretele celular

30
a constituit doar 10-12% din masa uscată, iar celulele au fost mai rezistente la acţiunea litică a
zimolazelor şi a dispozitivelor mecanice de distrugere a pereţilor celulari [78].
Zaharoza ca sursă de carbon şi sulfatul de amoniu ca sursă de azot s-au dovedit a fi
optime pentru sinteza exopolizaharidelor de către tulpina de drojdii Sporobolomyces
salmonicolor AL1. Sinteza polizaharidelor este însoţită de micşorarea pH-ului mediului de la 5,3
iniţial până la 1,7-2,0 final. În timpul procesului de biosinteză, indicele viscozităţii dinamice a
mediului de cultivare cu 5,0% zaharoză şi 0,25% sulfat de amoniu a crescut până la 15,37 mPas,
iar cantitatea de polizaharide a ajuns până la 5,63 g/l la o cultivare la temperatura de +22°C timp
de 120 ore. Polizaharidul extras are un grad înalt de puritate şi este constituit din glucoză
(54,1%), manoză (42,6%) şi fucoză (3,3%) [192].
Acumularea carbohidraţilor de rezervă, glicogenului şi tregalozei în culturile de S.
cerevisiae corelează negativ cu rata specifică de creştere. În acelaşi timp, surplusul de glucoză în
mediul de nutriţie şi limitarea elementelor nutritive N, P, Ca duce la acumularea intensă a acestor
carbohidraţi de stocare [130, 133, 185].
Pentru studierea influenţei surselor de carbon nefermentabile asupra conţinutului de
tregaloză şi glicogen la drojdiile din genul Pichia, acestea au fost cultivate pe medii cu glicerină
şi metanol. La cultivarea pe mediul cu metanol cantitatea tregalozei şi glicogenului acumulat a
fost foarte mic, în special la P. anomala. Însă, tot această cultură pe mediul cu glicerină a
sintetizat cantităţi substanţiale de tregaloză (9,3 mg/g de biomasă umedă). În biomasa de P.
anomala şi P. farinosa cultivate pe medii cu glicerină conţinutul de glicogen de asemenea a fost
mic. Totodată, la creştere pe metanol conţinutul de tregaloză la P. farinosa s-a majorat până la
5,8 mg/g. Pe mediul cu glicerină P. farinosa a sintetizat mai multă tregaloză. Pe acelaşi mediu P.
angusta a acumulat cantităţi esenţiale de glicogen şi tregaloză - 4,9 şi 12,3 mg/g biomasă umedă,
respectiv. Cultivarea drojdiei S. cerevisiae pe mediul cu glicerină duce la majorarea drastică a
conţinutului de glicogen şi tregaloză în biomasă. Acumularea tregalozei se începe la sfîrşitul fazei
lag şi rămâne la nivel înalt pe toată durata fazei staţionare [74].
Cercetătorii Babitskaya V. şi Shcerba V. au studiat sinteza endo- şi exopolizaharidelor de
către Ganoderma lucidum pe medii cu diferite surse de carbon: glucoză, arabinoză, xiloză,
galactoză, manoză, lactoză, amidon, fructoză, zaharoză şi maltoză. Pentru sinteza
polizaharidelor, mai eficiente s-au dovedit a fi glucoza, lactoza şi amidonul. Conţinutul de
endopolizaharide a constituit 8,5-9,5 g/l, de exopolizaharide – 4,0 – 4,8 g/l. Cantitatea de
polizaharide şi productivitatea ciupercii se majorau odată cu creşterea concentraţiei sursei de
carbon în mediu. Însă eficacitate economică optimă (calculată conform raportului dintre
cantitatea de sursă introdusă în mediu şi cantitatea produsului final) s-a obţinut pe mediile cu

31
concentraţia surselor de carbon de 30 g/l. Mărirea concentraţiei până la 50 g/l nu a dus la
majorarea conţinutului de polizaharide sintetizate. Studiind acţiunea diferitor surse de azot
organice şi anorganice introduse în mediul nutritiv împreună cu cantităţi minime de extract de
porumb (0,2%) asupra sintezei polizaharidelor la G. lucidum, rezultate remarcabile s-au obţinut
numai pentru sulfatul de amoniu. Cantităţi maxime de endopolizaharide s-au obţinut pentru
raportul C:N în mediul nutritiv egal cu 18, iar de exopolizaharide - pentru raportul de 25.
Optimizând mediile nutritive, s-a reuşit o majorare a cantităţii de endopolizaharide sintetizate cu
17,6 – 32,6%, iar de exopolizaharide - cu 29,2– 57,5% [35].
Ca şi în cazul surselor de carbon, S. cerevisiae a dezvoltat mecanisme care permit
utilizarea rapidă şi optimă a mai multor surse de azot preferenţiale şi reprimarea utilizării
surselor de azot mai puţin favorabile. Acest fenomen şi mecanismul de bază au fost denumite
„regulamentul de azot”. Surse de azot, precum amoniacul, glutamatul şi glutamina sunt descrise
ca surse de azot preferenţiale, care asigură o rată de creştere mult mai ridicată decât sursele
considerate sărace, cum ar fi prolina, arginina sau ureea [116, 147]. Pentru a utiliza orice compus
care conţine azot, celule de drojdie trebuie să-l transforme în glutamină sau glutamat. Compuşii
azotaţi se sintetizează în celulele de drojdii, folosind produsele asimilării sursei de carbon şi
glutamatul sau glutamina ca donator de azot [226].
Astfel, drojdiile S. cerevisiae sunt capabile să utilizeze o gamă largă de surse de carbon şi
azot, dar nu toate dintre acestea sunt utilizate cu o eficienţă egală.

1.3.2. Compuşii coordinativi ai metalelor de tranziţie – factori reglatori ai proceselor

biosintetice microbiene
Cercetări vaste, ce ţin de utilizarea compuşilor coordinativi în biotehnologie în scopul
reglării cantitative şi calitative a proceselor de biosinteză a substanţelor bioactive au fost iniţiate
de către academicianul Valeriu Rudic şi continuate de discipolii săi. Aceste cercetări au
demonstrat eficienţa aplicării compuşilor coordinativi în calitate de reglatori ai productivităţii şi
biosintezei substanţelor bioactive (proteine, ficobiliproteine, carotenoizi, polizaharide, lipide,
acizi graşi polinesaturaţi, astaxantină ş.a.) de către diferite tulpini de microalge şi cianobacterii
[9, 10, 14, 15, 23, 26, 71, 204].
Diferite grupuri taxonomice de microorganisme utilizează metalele în diverse scopuri.
Cianobacteriile, de exemplu, utilizează cuprul pentru sinteza plastocianinei tilacoidale, zincul
pentru sinteza anhidrazei carbonice, cobaltul pentru sinteza cobalaminei, magneziul pentru
sinteza clorofilei α, fierul pentru sinteza ficobilinelor, molibdenul pentru sinteza nitrogenazei
heterocistice, manganul pentru funcţionarea sistemului de fotooxidare a apei ş.a. [81, 90, 202].

32
 Cuprul este un metal esenţial pentru toate organismele vii, inclusiv microorganisme,
deoarece mediază o mare varietate de procese biochimice importante. Însă în concentraţii înalte
cuprul este extrem de toxic pentru celula gazdă. Acest caracter paradoxal necesită o procedură
foarte reglementată de acumulare, transport, şi excreţie a cuprului în celulă. Un grup important
de proteine implicate în specificarea acţiunii ionilor de cupru la eucariote sunt metaloproteinele.
Datele microscopiei luminiscente, de emisie şi spectrale demonstrează, ca ionii de cupru sunt
încorporaţi în metaloproteinele celulelor de drojdie S. cerevisiae. Aceste tehnici furnizează
informaţii cu privire la mecanismul de absorbţie a cuprului de către drojdii. Acest mecanism este
compus din 2 etape, prima dintre care durează 6 ore, are o rată de absorbţie înaltă şi este
dependentă de concentraţia iniţială de cupru în mediul de cultivare. A doua etapă are o rată mai
lentă a absorbţiei, dar cinetica este independentă de concentraţia iniţială. În final acest proces
duce la stocarea ionilor cupru sub forma de Cu-metalotionină [194].
Transportul de magneziu în mitocondrii joacă un rol important în Mg2+-homeostaza
celulară şi în regulamentul funcţiilor celulare şi mitocondriale. Studiile fiziologice indică faptul
că absorbţia mitocondrială a Mg2+ este un proces electrogen, dependent de potenţialul negativ al
membranei plasmatice. Dar proteinele implicate în acest proces rămân necunoscute, şi afluxul
ionilor de Mg2+ în mitocondrii se efectuează mai degrabă prin căi de scurgere nespecifice, decât
cu ajutorul proteinelor de transport specifice [157]. Sulful are o importanţă colosală în iniţierea
replicării ADN-ului şi diviziunii celulare, ca parte componentă a enzimelor cheie ale acestui
proces [89]. Ionii de Fe2+ determină conţinutul vitaminei B2 în celulele drojdiilor [232].
Acetaţii, de regulă, acţionează ca inductori în unele procese de biosinteză a principiilor
bioactive [20]. Rolul acetaţilor în procesul de biosinteză a carbohidraţilor, constă în includerea
lor în procesul de biosinteză al acetil coenzimei A, care este o verigă indispensabilă în diverse
procese metabolice. Metabolizarea ulterioară a acetil coenzimei A are loc în ciclul acizilor
tricarboxilici (Krebs) (figura 1.2), care la microorganismele eucariote este o cale metabolică, cu
funcţii energetice şi biosintetice. În aşa mod acetil CoA serveşte ca precursor în procesele de
biosinteză a acizilor graşi, lipidelor, unor aminoacizi şi a carbohidraţilor. Gluconeogeneza începe
de la oxaloacetat, produs intermediar al ciclului Krebs care se petrece în mitocondrii. Deoarece
membrana mitocondriala este impermeabilă pentru acesta, el este convertit în malat sub acţiunea
malatdehidrogenazei mitocondriale, în prezenţa de NADH provenit din degradarea acizilor grasi.
Memebrana mitocondriala fiind permeabila pentru malat, acesta ajunge în citoplasmă, unde este
reconvertit la oxaloacetat sub acţiunea malatdehidrogenazei citoplasmatice. În continuare,
oxaloacetatul ajuns în citosol sub acţiunea fosfoenolpiruvat carboxichinazei formeaza
fosfoenolpiruvatul. Fosfoenolpiruvatul este apoi convertit la fructozo-1,6-bifosfat, prin

33
parcurgerea în sens invers a reacţiilor glicolizei. Prin pierderea unei molecule de fosfor cu
participarea fructozobifosfatazei, fructozo-1,6-bifosfat este transformat în fructozo-6-fosfat, care
la rândul său sub acţiunea hexozoizomerazei este transformat în glucozo-6-fosfat, care conduce
la formarea de glucoză sau de glucozo-1-fosfat, utilizat în sinteza polizaharidelor.

Acetat exogen

Fig. 1.2. Ciclul acizilor tricarboxilici (Krebs), după Thomas M. Devlin 2006 [228].

Sunt bine studiate efectele multor ioni bivalenţi: Mn2+, Mg2+, Ca2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+
si Cd2+ asupra activităţii manoziltransferazelor implicate direct în sinteza mananproteinelor.
Rezultatele au arătat, că activitatea enzimatică a fost diminuată în absenţa ionilor de metal. În
acelaşi timp absenţa ionilor de Mn2+ a dus practic la inhibarea totală a activităţii
manoziltransferazelor [229].
Ionii de Mn2+ întră în componenţa unor metaloenzime reprezentate prin fosfodiesteraze,
glutationsintetaze, acetil-CoA-sintetaze, cu rol în diverse funcţii biosintetice în celula microbiană
(sinteza carbohidraţilor, proteinelor, lipidelor) [20].
Alt microelement indispensabil pentru creşterea şi dezvoltarea microorganismelor este
Zn, ionii căruia se acumulează preponderent în vacuolele celulare. El este un microelement
important cu proprietăţi antioxidante, care iniţiază numeroase reacţii biochimice şi fiziologice în
celulă. Din multitudinea de enzime zinccomponente, un rol important le revine anhidrazei
carbonice, carboxipeptidazei, fosfatazei alcaline, ADN şi ARN polimerazei, unor dehidrogenaze

34
[148, 197]. Prin intermediul acestora, zincul participă la procesele de oxido-reducere, sinteza
substanţelor biologic active.
Răspunsul drojdiilor S. cerevisiae la disponibilitatea ionilor de Zn2+ a fost investigat la o
rată fixă de creştere în conformitate cu limitarea şi abundenţa sursei de Zn în cultura chemostat
cu adiţionarea diferitor surse de carbon, azot şi aeraţie. Rezultatele au arătat o scădere
substanţială a nivelului de glicogen şi tregaloză în culturile limitate după Zn2+. S-a demonstrat
rolul zincului în reglementarea genelor Zn2+dependente, implicate în depozitarea şi metabolismul
glucidelor. Aceste date sugerează o implicare mai proeminentă a ionilor de Zn2+ în biogeneza şi
funcţiile celulei de drojdie, decât era relevat până în prezent [109].
Acumularea ionilor de Zn2+ în celulele drojdiilor de bere S. cerevisiae (carlsbergensis)
din mediul de cultură, inclusiv din mustul de malţ, este rapidă şi începe imediat după inocularea
tulpinii. În contrast, la debutul fermentării, asimilarea altor cationi bivalenţi, cum ar fi Mg2+ si
Ca2+ nu este la fel de pronunţată. Diminuarea cantităţii de Zn2+ în mediul de cultivare duce la
stoparea esenţială a creşterii şi diviziunii celulelor de drojdii. Aceste date sunt importante, aşa
cum procesele de fermentaţie industrială pot fi ocazional suprimate din cauza deficienţii de zinc
[110].
În acelaşi timp, creşterea optimă este limitată la o gamă îngustă de Zn2+ concentraţii, care
ilustrează echilibrul dintre deficitul de micronutrienţi şi toxicitate [82].
Cultivarea drojdiilor S. cerevisiae pe medii cu includerea unor microelemente, zinc, cupru,
mangan în concentraţie de 0,1 g/l, la diferite condiţii de aerare şi pH stimulează productivitatea
culturii. În condiţii anaerobe prezenţa microelementelor duce la creşterea productivităţii biomasei
cu 10%. La o aerare minimă productivitatea biomasei creşte cu 30%. Valorile optimale ale pH-ului
mediului pentru toate microelementele s-au dovedit a fi 4,0-5,0 [217].
Datele disponibile sugerează că superoxiddismutaza (SOD), care joacă un rol important
în protejarea celulei eucariote împotriva modificărilor oxidative, ce duc la îmbătrânirea celulelor,
conţine cupru şi zinc (Cu-ZnSOD). Epuizarea Cu-ZnSOD în celule de S. cerevisiae duce la o
reducere a nivelului de proteine specifice, responsabile de transportul substanţelor nutritive în
mitocondrii. Aceste modificări duc la mitocondriopatie şi, ulterior, la diminuarea duratei de viaţa
şi afectarea procesului de multiplicare a celulelor de drojdii [159].
Cercetările recente ale savanţilor moldoveni au evaluat efectul stimulator al
compuşilor coordinativi ai manganului şi zincului asupra sintezei carbohidraţilor de către
cianobacterii [20], a SOD de către cianobacterii şi microalge [22].
Deci, din cele menţionate anterior, putem evidenţia rolul important al microelementelor
în procesele metabolice ale microorganismelor.

35
 1.3.3. Influenţa factorilor fizici ai mediului de cultivare asupra sintezei
carbohidraţilor la microorganisme
Factorii fizici ai mediului de cultură au, de asemenea, o influenţă semnificativă asupra
creşterii şi metabolismului microorganismelor. Temperatura de cultivare, pH-ul, aeraţia mediului
şi durata procesului de cultivare determină activitatea fiziologică a culturilor şi acţionează asupra
proprietăţilor şi compoziţiei biochimice a microorganismelor.
Cercetările privind influenţa temperaturii, pH-ului şi aeraţiei mediului de cultivare asupra
sintezei polizaharidelor de către Ganoderma lucidum au arătat, că temperatura de +25-30ºC este
optimală pentru aceste procese. Cultura posedă capacitate de a creşte într-un spectru larg de
valori ale pH-ului de la 3,0 până la 7,5 şi mai sus. Productivitatea maximală după biomasă s-a
determinat la un pH iniţial de 6,0-7,0 şi o aeraţie a mediului de 0,555-0,325 g O2/l oră. Scăderea
pH–lui de la 6,0 la 4,0 şi a aeraţiei până la 0,155 g O2/l oră a dus la intensificarea sintezei
polizaharidelor. Optimizarea condiţiilor de cultivare nu a avut niciun efect asupra compoziţiei
calitative a polizaharidelor, glucanii constituind partea principală a lor [35]. Date similare au
obţinut şi alţi autori [114].
Temperaturile scăzute activează mecanismele responsabile de creşterea şi multiplicarea
drojdiei de vin şi măresc viabilitatea celulelor. În plus, vinurile fermentate la temperaturi scăzute
posedă calităţi organoleptice înalte. Acest fapt corelează cu creşterea sintezei de către drojdii a
acizilor graşi cu catena scurtă (C4-C8), şi a esterilor corespunzători, responsabili de calităţile
organoleptice ale vinului [123].
Şocul termic duce la schimbări radicale în metabolismul celulei, provocând deteriorarea
membranelor, denaturarea şi agregarea proteinelor celulare. Majorarea temperaturii induce
sinteza proteinelor şi tregalozei, care protejează celula de aceste deteriorări. Datele din literatură
ne indică faptul, că în timpul şocului termic la drojdiile S. cerevisiae creşte esenţial concentraţia
formelor active a oxigenului ce conţin anioni superoxidanţi (O2-), peroxid de hidrogen (H2O2) şi
radicali hidroxili (OH-) toxici pentru celulă. Sinteza acestor compuşi toxici duce la distrugerea
membranelor, denaturarea proteinelor şi ADN- ului şi moartea celulelor [108, 218].
Temperatura optimală de creştere şi dezvoltare (µmax 0,159-0,156 oră-1) a tulpinii de
drojdii Yarrowia lipolytica №1 la pH-ul mediului de 4,5 este de 27-28°C. La scăderea
temperaturii până la 23°C se micşorează puţin şi viteza specifică de multiplicare a culturii (µmax
0,143 oră-1), iar majorarea ei până la 29-30°C duce la scăderea esenţială a acestui parametru de
cca 1,9 ori (µmax 0,097 oră-1). Temperatura în acest interval practic nu influenţează asupra
conţinutului de proteină din biomasă. Majorarea temperaturii de cultivare până la 29-30°C
influenţează, însă, conţinutul de microelemente din biomasă (cantitatea de Fe, Zn şi Ca creşte, iar

36
de P, Mg şi Cu - scăde). pH-ul optim de cultivare la 28°C este de 4,0-5,0 ( µmax 0,198-0,199 oră-
1
). În intervalul de pH de la 7,0 până la 3,2 viteza specifică de multiplicare se păstrează la un
nivel înalt (µmax 0,163-0,182 oră-1), iar la scăderea pH-ului mai jos de 3,2 are loc inhibarea
esenţială a dezvoltării drojdiei (µmax 0,043 oră-1) şi activităţi lipolitice a tulpinii [46].
Temperatura optimă de acumulare a biomasei de către Agaricus blazei este de +28°C, iar
de biosinteză a polizaharidelor - de +30°C. Însă polizaharidele sintetizate la această temperatură
se caracterizează printr-o activitate biologică scăzută, în comparaţie cu cele sintetizate la
temperatura de +24°C. Acest fapt se datorează conţinutului sporit de β-glucan în polizaharidele
sintetizate la temperatura mai joasă [103].
Experienţele asupra ciupercii Aspergillus niger au demonstrat, că cantitatea şi calitatea
glucanilor şi chitinei depinde de stadiul ontogenezei şi că acumularea complexului chitino-
glucanic este strâns legată de stoparea proceselor de multiplicare. Prin urmare, procesul de
majorare a cantităţii de chitină şi glucani în celulă este o reacţie de răspuns a acesteia la acţiunea
factorilor nefavorabili ai mediului, adică a factorilor de stres [75].
Procesele de acumulare a biomasei şi polizaharidelor la cultivarea submersă a culturii
Bacillus subtilis practic coincid în timp şi depind mult de temperatura de cultivare şi de pH-ul
iniţial al mediului nutritiv [54].
La cultura de actinomicete Nocardia dassonvillei procesul de biosinteză a polizaharidelor
începe în faza lag de dezvoltare a microorganismului şi îşi atinge maximul în faza staţionară. În
faza de declin sinteza polizaharidelor se micşorează. Componenţa calitativă a polizaharidelor din
citoplasmă şi peretele celular este similară, fiind diferit raportul cantitativ dintre monomerii
constitutivi [166].
Celule de drojdie S. cerevisiae prezintă o durată de viaţă finită, care este în general
dependentă de numărul de diviziuni suportate. Drept consecinţă a îmbătrânirii, celulele de drojdii
suferă modificări în termeni de fiziologie, morfologie şi expresie a genelor. Aceste caracteristici
influenţează absorbţia de zahăr, producţia de metaboliţi, proprietăţile de floculare, care depind de
structura peretelui celular. Proprietăţile de fermentare, potenţialul de floculare şi hidrofobic al
celulelor de drojdii cresc odată cu vârsta. Toţi aceşti parametri în final determină eficacitatea
industrială a tulpinilor de drojdii [104].

1.4. Concluzii la capitolul 1

Sinteza cunoştinţelor acumulate până acum în ceea ce priveşte conţinutul cantitativ şi
calitativ al carbohidraţilor, acţiunea lor biologică impunătoare şi perspectiva utilizării în diverse
domenii ale farmaceuticii, cosmetologiei, veterinăriei, industriei alimentare, precum şi

37
posibilităţile utilizării drojdiilor S. cerevisiae în calitate de producători ai acestor compuşi
confirmă faptul că:
٠Printre microorganismele capabile să sintetizeze carbohidraţi, specia S. cerevisiae se
evidenţiază ca un producător performant, depăşind esenţial alte microorganisme, proteomananii
şi β-glucanii reprezentând substanţele de bază ale complexelor glucidice fungice.
٠Datorită proprietăţilor antivirale şi antibacteriene, imunomodulatoare şi imunostimulatoare,
hipocolesterolemice, anticoagulante, antitoxice, antimutagene, antiproliferative şi radio-
fotoprotectoare, carbohidraţii sunt recunoscuţi în calitate de substanţe biologic active, cu efect
benefic general asupra organismelor vii şi deschid calea de utilizare în cele mai diverse domenii.
٠Stimularea sintezei carbohidraţilor poate fi obţinută prin varierea componentelor
mediului nutritiv (sursei de carbon şi azot, stimulatorilor şi precursorilor specifici) şi condiţiilor
de cultivare (temperatura, pH-ul, durata de cultivare, aeraţia).
٠Căutarea noilor producători de carbohidraţi şi utilizarea surselor netradiţionale de aceşti
compuşi, cum ar fi drojdiile din sedimentele de vin, a fost şi rămâne actuală în prezent.
Problema de cercetare care rezultă din analiza efectuată constă în necesitatea depistării
producătorilor performanţi, selectarea mediilor şi condiţiilor optime de cultivare a acestora, care ar asigura
obţinerea biomasei cu un conţinut sporit de carbohidraţi ce garantează un efect economic înalt.
Direcţiile de soluţionare a problemei în viziunea autorului acestei lucrări sunt: selectarea
tulpinilor de drojdii cu potenţial sporit de biosinteză al carbohidraţilor, elaborarea procedeelor de
cultivare a drojdiilor cu un potenţial biosintetic înalt prin asigurarea unei cantităţi maxime de
biomasă cu conţinut prognozat de carbohidraţi, prin aplicarea mediilor de cultură necostisitoare
şi realizarea procesului de cultivare la parametrii fizico-chimici optimi.
Soluţionarea problemei este posibilă prin realizarea scopului acestei lucrări: studierea
caracterelor fiziologo-biochimice ale unor tulpini de drojdii de vin cu potenţial sporit de
biosinteză a carbohidraţilor şi elaborarea procedeelor de obţinere a bioproduselor valoroase, care
va fi atins prin realizarea următoarelor obiective:
٠Izolarea din sedimentele de vin, selectarea şi studierea caracterelor morfo-culturale şi
fiziologo-biochimice ale tulpinilor de drojdii cu potenţial sporit de biosinteză a carbohidraţilor.
٠Evidenţierea factorilor care asigură un nivel optim al productivităţii şi acumulării
carbohidraţilor în celulele drojdiilor selectate.
٠Elaborarea procedeelor de cultivare dirijată a tulpinilor de drojdii şi obţinere a biomasei
cu conţinut prognozat de carbohidraţi.
٠Elaborarea procedeelor de obţinere a unor bioproduse valoroase din drojdiile
sedimentelor de vin.

38
 2. METODOLOGIA CERCETĂRII ŞTIINŢIFICE
Cercetările au fost efectuate pe parcursul anilor 2007-2010 în cadrul laboratorului
Oleobiotehnologie al Institutului de Microbiologie şi Biotehnologie al AŞM.

2.1. Obiectul de cercetare

Ca obiecte de studiu au servit tulpinile de drojdii Saccharomyces cerevisiae CNMN-Y-20
şi Saccharomyces cerevisiae CNMN-Y-21, izolate în cultură pură din microflora spontană a
sedimentelor de la vinul roşu (Cabernet) şi alb (Chardonnay), oferite de Institutul Naţional
pentru Viticultură şi Vinificaţie din Republica Moldova, precum şi biomasa de drojdii din
sedimentele de vin. Tulpinile au fost izolate prin însămânţare în mai multe etape pe medii lichide
şi agarizate, în cadrul laboratorului Oleobiotehnologie al Institutului de Microbiologie şi
Biotehnologie al AŞM. Drept tulpini de referinţă au servit culturile de drojdii Saccharomyces
cerevisiae Rară-Neagră-2 şi Saccharomyces cerevisiae Cabernet-5 din CNMIV [29].
În calitate de reglatori şi stimulatori ai multiplicării, productivităţii şi activităţii
biosintetice a tulpinilor au fost utilizate o serie de zaharuri, acetaţi ai sodiului şi zincului, săruri
minerale şi compuşi coordinativi ai manganului şi zincului.
Zaharuri:
Glucoza, zaharoza, fructoza, manoza. Ca sursă complexă de carbon, azot, microelemente
şi vitamine s-a utilizat melasa.
Compuşii coordinativi:
1. Mn2Ac(2PyFX) – 1,7-Bis(piridin)malonodihidrazid-dimangan-acetat;
2. Mn2Ac(2PyTCH) - 1,5-Bis(piridin)tiocarbohidrazid-dimangan-acetat;
3. Mn2Cl2(2PyFX) – 1,7-Bis(piridin)malonodihidrazid-dimangan-diclorură, sintetizaţi de
D-l doctor V.Lozan (Institutul de Chimie al AŞM);
4. [Mn(Gly)2] Cl2 – sintetizat de dl acad. C. Turtă (Institutul de Chimie al AŞM);
5. clorură de monocloroacetat de zinc (LP-1);
6. clorură de tricloroacetat de zinc (LP-2);

7. clorură de tricloroacetat de zinc γ, γ΄ dipiridil (LP-3);

8. tartrat de zinc imidazol (acid vinic) (LP-4) – sintetizaţi în laboratorul Chimie
anorganică al USM sub conducerea academicianului A. Gulea.
Săruri minerale:
Sulfat de mangan - (MnSO4•4H2O);
Sulfat de zinc – (ZnSO4•7H2O).

39
 Acetaţi:
Acetat de sodiu – (CH3COONa)•3H2O;
Acetat de zinc – (CH3COO)2Zn•2H2O).
Mediile de cultură:
Rieder: 30,0 g/l glucoză, 3,0 g/l (NH4)2SO4, 0,7 g/l MgSO4•7H2O, 0,5 g/l NaCl, 0,4 g/l
Ca(NO3)2, 1,0 g/l KH2PO4, 10 ml autolizat de drojdii, apă potabilă 1 l, pH- 5,0-6,0 [3].
Must de malţ [2].
YPD: 2% extract de drojdie, 2% pepton, 3% glucoză [79].
MGYP: 10 ml extract de malţ, 10 ml extract de drojdie, 5 g/l pepton, 10 g/l glucoză, 1l
apă distilată, pH-5,5 [161].

2.2. Metodele de investigaţie

În scopul realizării sarcinilor propuse au fost utilizate un şir de metode ce ţin de
determinarea productivităţii tulpinilor de drojdii, precum şi metode de investigare a conţinutului
biochimic al biomasei de drojdii, lichidului cultural şi extractelor obţinute din biomasă.
Caracterele morfologo-culturale şi fiziologice ale tulpinilor de drojdii au fost studiate
conform metodelor descrise în literatura de specialitate [2, 32, 85, 167].
Determinarea productivităţii şi substanţei uscate a tulpinilor a fost efectuată gravimetric
conform [41].
Determinarea numărului de celule la un volum de lichid cultural a fost efectuată
colorimetric conform [36].
Determinarea conţinutului de carbohidraţi în biomasa de drojdii şi lichidul cultural a
fost efectuată conform metodei spectrofotometrice cu utilizarea reactivului antron şi D-glucozei
în calitate de standard [21, 112].
Extragerea fracţionată a carbohidraţilorlor a fost efectuată conform procedeelor
descrise în literatura de specialitate ce au la bază utilizarea soluţiilor alcaline şi acide [28, 72].
Componenţa calitativă a fracţiilor glucidice a fost determinată prin metoda cromatografiei
în strat subţire (CSS) pe plăci Sorbfil. Compoziţia monozaharidică a glucidelor fiecărei probe a
fost determinată prin hidroliza cu soluţie de 1N H2SO4 în fiole sudate, la temperatura de 1000C
timp de 5 ore. Hidrolizatul obţinut a fost neutralizat cu BaCO3 şi centrifugat, supernatantul uscat
la +40 0C [132]. Developarea cromatogramelor a fost efectuată cu revelatori specifici în sistemul
„n-butanol-acid acetic-apă” (4:5:1) prin teste de reactivitate [47]. Plăcile cromatografice au fost
developate cu anilinftalat (aldopentoze – culoare roşie, aldohexoze - culoare cafenie) [132]. În
calitate de martor au fost utilizate glucidele simple din setul standard “SIGMA”.

40
 Extragerea lipidelor din biomasa de drojdii a fost efectuată prin metoda propusă de Folch
şi Bligh, preluată de Kates [160] şi adaptată la obiectul de studiu [5].
Extragerea fosfolipidelor s-a efectuat cu acetonă rece [160].
Extragerea sterolilor din drojdii a fost efectuată după metoda Lucniţkii [64] şi Usatîi [6].
Determinarea componenţei calitative a lipidelor a fost efectuată prin cromatografie în
strat subţire şi densitometrie [52], utilizând martori „SIGMA”.
Acizii graşi au fost determinaţi prin cromatografia gaz lichidă a esterilor metil ai acizilor
graşi [70] la cromatograful „CROM-5” în cadrul Institutului Ştiinţifico-Practic de Horticultură şi
Tehnologii Alimentare, cu aportul specialistului Soboleva I.
Proteina a fost determinată spectrofotometric conform metodei Lowry [173].
Componenţa aminoacizilor şi azotului aminic au fost determinaţi în hidrolizatele acide
cu ajutorul analizatorului AAA-339 „Microtechna” (Cehia) [53] la Institutul de Fiziologie şi
Sanocreatologie al AŞM.
Pentru optimizarea condiţiilor de spălare, obţinere a autolizatului şi uscare a drojdiilor
din sedimentele de vin, au fost cercetate unele procedee care au la bază utilizarea diferitor
volume de apă, soluţii de NaCl, regimuri de temperatură şi durate de timp propuse în brevetele
de invenţii [59, 62, 63].
Analiza statistică şi regresională a datelor obţinute în 3 serii de determinări a fost
realizată prin metodele propuse de Maximov [50] şi Dospehov [40].

41
 3. MORFOLOGIA, FIZIOLOGIA ŞI PARTICULARITĂŢILE SINTEZEI
CARBOHIDRAŢILOR LA TULPINILE DE DROJDII SACCHAROMYCES
CEREVISIAE CNMN-Y-20 ŞI SACCHAROMYCES CEREVISIAE CNMN-Y-
21 SELECTATE DIN SEDIMENTE DE VIN
Diversitatea carbohidraţilor cu efect fiziologic pronunţat, precum şi spectrul larg al
domeniilor de utilizare al acestora relevă importanţa lucrărilor de selectare a producătorilor activi.
Studiul comparativ cu referinţă la potenţialul biosintetic al drojdiilor este un factor
determinant pentru screening-ul celor mai productive tulpini.
Capacitate de a sintetiza carbohidraţi posedă microorganisme din diferite grupe
taxonomice [75, 95, 101, 102, 141, 155, 166, 212].
Printre producătorii de polizaharide sunt reprezentanţi ai diferitor clase, familii, genuri şi
specii, însă cei mai mulţi aparţin drojdiilor şi bacteriilor. Din rândul drojdiilor din clasa Fungi
imperfecti putem menţiona genurile Candida, Rhodotorula, Torulopsis, iar din clasa Ascomyces
– genurile Saccharomyces, Hansenula, Debariomyces, care conţin până la 40-50% polizaharide
intracelulare [42].
Cercetând componenţa monozaharidică a carbohidraţilor la unele specii de drojdii, s-a
constatat preponderenţa glucozei, manozei, galactozei [51, 72, 73].
Drojdiile genului Saccharomyces sunt recunoscute ca producători performanţi de manani
şi β-glucani [78, 127, 138, 170].
Cercetările legate de structura peretelui celular la drojdiile genului Saccharomyces au
relevat trei componente majore: glucanii, mananproteinele şi chitina, care împreună prezintă în
aproximativ 90% din substanţa uscată a peretelui celular [13, 36, 163].
În vederea completării stocurilor de informaţii privind drojdiile cu potenţial înalt de
producere a carbohidraţilor, sunt necesare cercetări detaliate despre potenţialul bioproductiv al
acestora, componenţa monozaharidică a glucidelor, a zaharurilor complexe сu evidenţierea,
drept rezultat, a tulpinilor de perspectivă în vederea utilizării lor în diverse procese
biotehnologice.

3.1. Caracteristica taxonomică a tulpinilor de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S.

cerevisiae CNMN-Y-21 selectate ca producători activi de carbohidraţi
Scopul cercetărilor rezumate în compartimentul ce urmează este izolarea din sedimentele
de vin a tulpinilor de drojdii cu capacitate sporită de sinteză a carbohidraţilor şi studierea
caracterelor lor morfo-culturale şi fiziologice.

42
 Obiecte ale studiului au servit tulpinile de drojdii izolate din microflora spontană a
sedimentelor de la vinul roşu (Cabernet) şi alb (Chardonnay), oferite de Institutul Naţional
pentru Viticultură şi Vinificaţie din Republica Moldova. Drept tulpini de referinţă au servit S.
cerevisiae Rară-Neagră-2 şi S. cerevisiae Cabernet-5 din CNMIV [29].
La etapa iniţială, prin mai multe pasaje pe medii agarizate prin metoda diluţiilor zecimale, au
fost izolate circa 700 colonii de drojdii din sedimentele de vin de masă roşu şi alb. Cercetările au
arătat, că caracterele culturale ale acestor drojdii variază în dependenţă de provenienţă. Culturile de
drojdii cu caractere asemănătoare au fost repartizate în 26 grupe (13 grupe provenite din sedimente
vinicole ale vinului alb şi 13 - din sedimentele vinului roşu). Din fiecare grupă a fost selectată câte o
tulpină denumită simbolic A1, A2,......A13 şi R1, R2,......R13. Ulterior la tulpinile selectate, au fost
studiate caracterele morfo-culturale şi determinat conţinutul de carbohidraţi la cultivare pe must de
malţ agarizat la temperatura de +28°C timp de 72 ore. Rezultatele sunt expuse în tabelul 3.1. Valorile
înregistrate ale conţinutului de carbohidraţi variază de la 10,6 la 30,5% S.U. Cantităţile maximale de
carbohidraţi au fost determinate la tulpinile A2 (29,7% S.U.) şi R4 (30,5% S.U.).
În continuare, la 14 din cele 26 tulpini de drojdii, caracterizate prin conţinut înalt de
carbohidraţi, au fost determinaţi indicii productivităţii biomasei şi capacităţii biosintetice la cultivarea
lor în profunzime pe 2 medii lichide - must de malţ şi Rieder, cu compoziţia, g/l: glucoză - 30,0,
(NH4)2SO4 - 3,0, MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl - 0,5, Ca(NO3)2 - 0,4, KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii -
10 ml, apă potabilă 1 l, pH- 5,0 [3], cu agitare (200 r.p.m.), la temperatura de +22-23°C timp de 72
ore. Conform rezultatelor obţinute, din cele 7 tulpini de drojdii selectate din sedimentele de vin roşu
(Cabernet), productivitate maximă manifestă culturile R4 şi R8, care au acumulat pe mediul must de
malţ 8,3 şi respectiv 7,3 g/l de biomasă uscată (figura 3.1). La determinarea conţinutului de
carbohidraţi în biomasa drojdiilor cercetate s-a constatat, că în condiţii similare de cultivare
tulpinile sintetizează cantităţi diferite de carbohidraţi şi au valori care variază între 21,3 – 30,8%
S.U., valoarea maximală înregistrându-se la tulpina R4 (figura 3.1).
Productivitatea tulpinilor de drojdii selectate din sedimentele de vin alb (Chardonnay)
variază de la 5,9 până la 7,1 g/l de biomasă uscată pe mediul cu must de malţ. Valorile maximale
au fost remarcate pentru tulpinile A2 şi A3 (7,1 g/l BAU) (figura 3.2). Conţinutul de carbohidraţi
la aceste tulpini pe mediul de cultură dat a variat între 25,8 - 33,1% S.U., valoarea maximală
aparţinându-i tulpinii A2 (figura 3.2).
Deoarece mediul în bază de must de malţ este un mediu natural, compoziţia biochimică a
căruia depinde de mai mulţi factori, în cercetările ulterioare ca mediu de referinţă a fost utilizat
mediul Rieder, care asigură sinteza unor cantităţi aproximativ echivalente de carbohidraţi şi
compoziţia căruia poate fi modificată după necesitate.

43
 Tabelul 3.1. Caracterele morfo-culturale şi conţinutul de carbohidraţi ai unor tulpini de drojdii
cultivate pe medii agarizate
№ de Tulpini de Tipul, Consistenţa Nuanţa, Carbohidraţi, Interval de
ordine drojdii diametrul coloniei culoarea % S.U. confidenţă
coloniei coloniei X1± x1
1 A4 R, ø 4mm Păstoasă, Cremă 14,3±0,00 14,33÷14,35
rotunde lucioasă deschis
2 A8 S, ø 4mm Păstoasă, Cremă 16,6±0,26 16,13÷17,03
ovale mată deschis
3 A1 S, ø 4mm Mucoidă, Albă 17,5±1,81 14,33÷20,61
rotunde lucioasă
4 A11 S/R, ø 5mm Păstoasă, Albă 17,7±0,39 17,02÷18,37
rotunde mată
5 A10 R, ø 3mm Păstoasă, Albă-gălbui 17,9±0,52 17,03÷18,82
ovale lucioasă
6 A7 S, ø 4mm Mucoidă, Albă-gălbui 18,6±0,65 17,47÷19,71
rotunde mată
7 A6 S, ø 6mm Mucoidă, Albă 20,6±0,51 19,72÷21,5
rotunde mată
8 A12 S, ø 6mm Mucoidă, Albă-gălbui 21,3±0,91 19,71÷22,85
rotunde lucioasă
9 A9 S, ø 5mm Mucoidă, Cremă 22,2±0,39 21,5÷22,85
apiculate mată
10 A13 S, ø 4mm Mucoidă, Albă 22,2±0,39 21,5÷22,85
rotunde mată
11 A5 S, ø 3mm Mucoidă, Albă-gălbui 23,1±0,39 22,4÷23,74
ovale lucioasă
12 A3 S/R, ø 6mm Mucoidă, Albă 25,9±0,52 25,09÷26,88
rotunde lucioasă
13 A2 S, ø 5mm Mucoidă, Albă-gălbui 29,7±0,84 28,22÷31,13
rotunde lucioasă
14 R11 S/R, ø 4mm Grăsoase, Albă 10,6±2,58 6,12÷15,06
rotunde mate
15 R5 R, ø 3mm Păstoasă, Albă 11,3±2,17 7,53÷15,06
ovale mată
16 R12 S, ø 6mm Grăsoase, Albă-roz 12,8±1,41 10,35÷15,24
rotunde lucioase
17 R7 S/R, ø 4mm Păstoasă, Albă-roz 16,7±1,22 14,59÷18,82
rotunde lucioasă
18 R2 S, ø 3mm Mucoidă, Albă-roz 19,8±0,54 18,82÷20,7
apiculate mată
19 R8 S/R, ø 4mm Mucoidă, Albă 20,0±1,49 17,41÷22,59
ovale mată
20 R1 S, ø 4mm Mucoidă, Albă-roz 20,9±0,95 19,3÷22,59
rotunde lucioasă
21 R9 S, ø 5mm Mucoidă, Albă 22,3±1,77 19,29÷25,41
rotunde mată
22 R13 S, ø 5mm Mucoidă, Albă-roz 24,7±0,14 24,47÷24,94
ovale mată
23 R6 R, ø 3mm Mucoidă, Albă 25,3±1,29 23,06÷27,53
rotunde lucioasă
24 R6 R, ø 3mm Mucoidă, Albă 25,3±1,29 23,06÷27,53
rotunde lucioasă
25 R10 S, ø 4mm Mucoidă, Albă-roz 30,1±0,55 29,16÷31,06
rotunde mată
26 R4 S, ø 5mm Mucoidă, Albă-roz 30,5±0,75 29,17÷31,76
rotunde lucioasă
Legenda: S – netedă, R – rugoasă, S/R – intermediară. În tabel nu s-au inclus tulpinile cu conţinut scăzut de carbohidraţi.

44
 Carbohidraţi pe mediul must de malţ
Carbohidraţi pe mediul Rieder
Productivitatea pe mediul must de malţ

Carbohidraţi, % S.U.
Productivitatea pe mediul Rieder
40 10
30 8

BAU, g/l
6
20
4
10 2
0 0
R3 R4 R6 R8 R9 R10 R13

Tulpina de drojdii

Fig. 3.1. Cantitatea de biomasă şi conţinutul de carbohidraţi la tulpinile de drojdii

selectate din sedimentele de la vinul roşu (Cabernet).

Carbohidraţi pe mediul must de malţ

Carbohidraţi pe mediul Rieder
Carbohidraţi, % S.U.

Productivitatea pe mediul must de malţ

Productivitatea pe mediul Rieder
40 8

BAU, g/l
30 6
20 4
10 2
0 0
A2 A3 A5 A6 A9 A12 A13

Tulpina de drojdii

Fig. 3.2. Cantitatea de biomasă şi conţinutul de carbohidraţi la tulpinile de drojdii

selectate din sedimentele de la vinul alb (Chardonnay).

În rezultatul selectării se propun în calitate de potenţiali producărori de carbohidraţi

tulpinile de drojdii R4 şi A2 cu capacitatea de a sintetiza până la 30,8 şi respectiv 33,1% S.U. de
carbohidraţi.
În continuare a fost studiată productivitatea, conţinutul de glucide şi componenţa
cantitativă a fracţiilor de carbohidraţi ai tulpinilor selectate la cultivarea lor pe mediile de cultură
Rieder [3] şi YPD cu compoziţia %: 2% extract de drojdie, 2% pepton, 3% glucoză [79], la
temperatura +22 - 23°C, pH-ul 5,5, timp de 5 zile.
Extragerea fracţionată a carbohidraţilor din biomasa de drojdii a fost efectuată conform
procedeului cu utilizarea apei, soluţiilor de alcalii şi acizi (vezi fig. 4.4, cap.4). Conţinutul
cantitativ al carbohidraţilor în biomasă şi în fracţiile obţinute a fost determinat prin metoda
spectrofotometrică [21, 112].

45
 În rezultatul cercetărilor s-a stabilit, că productivitatea ambelor tulpini selectate este mai
înaltă pe mediul YPD - 6,6-6,7 g/l BAU, comparativ cu 3,9-3,5 g/l BAU pe mediul Rieder.
Fracţia β-glucanilor insolubilă în alcalii şi acizi este predominantă la ambele tulpini, independent
de natura mediului de cultivare. Însă, valorile acestei fracţii sunt mai semnificative la cultivarea
tulpinilor pe mediul Rieder şi constituie 22,6 şi 21,0% S.U pentru tulpina R4 şi A2, respectiv.
Tulpinile de referinţă S. cerevisiae Cabernet-5 şi S. cerevisiae Rară-Neagră-2 la cultivare pe
mediul nutritiv Rieder sintetizează mai puţini carbohidraţi decât tulpinile selectate – 24,0 şi
respectiv 21,3% S.U. Fracţia β-glucanilor la aceste tulpini, de asemenea, este fracţia de bază a
carbohidraţilor, însă are valori mai mici şi constituie 16,0% S.U. la S. cerevisiae Cabernet-5 şi
14,2% S.U. la S. cerevisiae Rară-Neagră-2. Rezultatele sunt expuse în tabelul 3.2.
Deci, tulpinile selectate ca perspectivi producători de carbohidraţi posedă o activitate
biosintetică mai înaltă faţă de alţi producători cunoscuţi [78, 79]. În baza acestor rezultate a fost
obţinut un brevet de invenţie [4], vezi anexa 2.

Tabelul 3.2. Productivitatea, conţinutul cantitativ şi calitativ al carbohidraţilor la tulpinile

selectate, cultivate pe medii lichide
N Parametrul Tulpina R4 Tulpina A2 S. cerevisiae S. cerevisiae
r precăutat Cabernet-5 Rară-Neagră-2
Mediul Mediul Mediul Mediul Mediul Medi Mediul Medi
Rieder YPD Rieder YPD Rieder ul Rieder ul
YPD YPD
1 BAU,
g/l X1± x1 3,9±0,03 6,6±0,06 3,5±0,00 6,7±0,02 3,5±0,30 - 3,3±0,30 -
2 Carbohidraţi,
% S.U. X1± x1 33,5±1,45 16,7±1,46 30,5±0,95 14,9±1,14 24,0±0,81 - 21,3±0,80 -
3 Fracţia solubilă
în H2O
1,5±0,26 0,3±0,05 1,5±0,20 0,4±0,05 1,3±0,03 - 1,6±0,03 -
(mono-, di-
zaharide),
% S.U. X1± x1
4 Fracţia solubilă
în NaOH 3%
3,4±0,54 0,8±0,01 5,2±0,17 0,9±0,05 4,1±0,03 - 3,8±0,06 -
(mananproteine),
% S.U. X1± x1
5 Fracţia solubilă
în H2SO4 2% (de
1,7±0,26 0,2±0,05 1,4±0,14 0,3±0,09 1,7±0,11 - 1,2±0,05 -
tip glicogen),
% S.U. X1± x1
6 Fracţia insolubilă
în alcali şi acizi
22,6±0,49 15,3±1,33 21,0±0,56 12,2±0,41 16,0±0,23 - 14,2±0,60 -
(β-glucani),
% S.U. X1± x1
7 Σ fracţiilor,
% S.U. X1± x1 29,2±1,56 16,7±1,42 29,1±1,08 13,8±0,59 23,1±0,4 - 20,8±0,74 -

46
 Caracterele morfo-culturale şi fiziologo-biochimice ale tulpinilor de drojdii selectate
Pentru a determina apartenenţa taxonomică a tulpinilor R4 şi A2 au fost examinate
caracterele lor morfo-culturale şi fiziologice conform criteriilor clasice [2, 85, 167].
Tulpina R4, izolată din sedimente de la vinul roşu la cultivare pe must de malţ agarizat,
timp de 96 ore formează colonii rotunde, netede, mucoide, lucioase, de culoare alb-roză şi
mărimea 4-6 mm (figura 3.3). Celulele se reproduc prin înmugurire, uneori formează pseudohife,
tipul respiraţiei-aerob, formează asce persistente direct din celula diploidă şi ascospori rotunzi
sau ovali netezi, nu formează peliculă, pe medii lichide la frontiera dintre faza lichidă şi gazoasă
formează un inel caracteristic pe pereţii vasului, nu asimilează nitraţi şi ureaza. Fermentaţia +,
testul diazonium blue B (DBB) - . Asimilează glucidele: D-glucoza, zaharoza, fructoza, D-
maltoza, D-galactoza, D-manoza, D-xiloza, D-tregaloza. Nu asimilează: L-ramnoza, L-
inozitolul, D-manitolul, D-lactoza, D-celobioza, D-sorbitolul şi dulcita.
Temperatura optimă de dezvoltare a tulpinii de drojdii este de +15...20°C, pH-ul 5,5 –
6,5. Tulpina creşte bine pe mediul lichid must de malţ. La cultivare în profunzime pe mediul dat,
tulpina acumulează 8,3 g/l BAU, dintre care 30,8 % S.U. carbohidraţi.

Fig. 3.3. Aspectul coloniilor tulpinii R4 la cultivare pe mediul must de malţ agarizat, (scara 1:2).

Tulpina A2, izolată din sedimente de la vinul alb la cultivare pe must de malţ agarizat,
timp de 96 ore formează colonii rotunde, netede, mucoide, lucioase, de culoare albă-gălbuie şi
mărimea de 4-6 mm (figura 3.4). Celulele înmuguresc polar, uneori formează pseudohife, tipul
respiraţiei-aerob, formează asce persistente direct din celula diploidă şi ascospori rotunzi sau
ovali netezi, nu formează peliculă, pe medii lichide la frontiera dintre faza lichidă şi gazoasă
formează un inel caracteristic pe pereţii vasului. Fermentaţia + ; nitrat - ; ureaza - ; testul
diazonium blue B (DBB) - . Asimilează glucidele: D-glucoza, zaharoza, fructoza, D-maltoza, D-

47
galactoza, D-manoza, D-tregaloza, D-xiloza. Nu asimilează: L-ramnoza, L-inozitolul, D-
manitolul, D-lactoza, D-celobioza, D-sorbitolul şi dulcita.
Temperatura optimă de dezvoltare a tulpinii de drojdii este de +15...20°C, pH-ul de 4,5 –
5,5. Tulpina creşte bine pe mediul lichid must de malţ. Cultivată în profunzime pe acest mediu,
tulpina acumulează 7,1 g/l BAU, dintre care 33,1% S.U. carbohidraţi.
Conform criteriilor sistematice a fost stabilit, că tulpinile de drojdii R4 şi A2 corespund următoarei
clasificări: încrengătura Eumycota, subîncrengătura Ascomycotina, clasa Hemiascomycetes, ordinul
Endomycetales, familia Saccharomycetaceae, genul Saccharomyces, specia cerevisiae [2, 85, 167].

Fig. 3.4. Aspectul coloniilor tulpinii A2 la cultivare pe mediul must de malţ agarizat, (scara 1:2).

Tulpinile studiate au fost determinate şi depozitate în Colecţia Naţională de Microorganisme

Nepatogene sub denumirea de specie: (R4) - Saccharomyces cerevisiae CNMN-Y-20 şi (A2) -
Saccharomyces cerevisiae CNMN-Y-21 ca potenţiali producători de carbohidraţi [18], anexa 4.
Astfel, screening-ul a 26 de tulpini de drojdii din sedimente de vin a evidenţiat un nivel
variat al conţinutului de carbohidraţi în biomasa lor, cuprins între 10,6 – 30,5% S.U., la cultivare
pe mediu must de malţ agarizat.
Tulpinile de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 cultivate pe
mediul Rieder se caracterizează prin valori înalte ale conţinutului de carbohidraţi (33,5 şi 30,5%
S.U. respectiv) şi β-glucan, valorile căruia ajung la 21,0 - 22,6% S.U. şi reprezintă obiecte de
perspectivă pentru biotehnologie.

3.2. Efectele nutrienţilor şi ale factorilor de mediu asupra multiplicării şi acumulării

carbohidraţilor în celulele drojdiilor S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21
Eficacitatea procesului biotehnologic bazat pe cultivarea în profunzime a
microorganismelor este determinată de mai mulţi parametri. Factorii de bază care influenţează rata

48
de creştere şi biosinteza produsului final sunt concentraţia substratului nutritiv, temperatura şi
durata de cultivare, pH-ul mediului, aeraţia.
În funcţie de particularităţile fiziologo-biochimice ale tulpinilor microbiene, necesităţile
nutritive şi parametrii de cultivare sunt specifice fiecărui microorganism.
Scopul investigaţiilor la acest subcapitol este elucidarea preferinţelor nutritive ale tulpinilor
de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 pentru acumularea biomasei şi
sinteza carbohidraţilor în funcţie de sursele de carbon, microelemente sub formă de săruri minerale
sau compuşi coordinativi, precum şi determinarea condiţiilor fizico-chimice optime de cultivare.

3.2.1. Efectele surselor de carbon asupra multiplicării drojdiilor S. cerevisiae

CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 şi biosintezei carbohidraţilor
Organismele heterotrofe se bazează pe ingestia de molecule organice sau nutrienţi din
mediul înconjurător pentru a susţine producerea de energie şi biomasă. Organismele unicelulare au
o capacitate limitată de a stoca nutrienţi şi sunt, prin urmare, în modul cel mai direct dependente de
disponibilitatea lor. La astfel de organisme au evoluat numeroase mecanisme de adaptare şi
supravieţuire în condiţiile de schimbare permanentă a compoziţiei mediului de nutriţie. Natura
fenomenelor fenotipice, fiziologice şi moleculare induse de aceste schimbări a fost studiată bine,
mai ales la drojdiile S. cerevisiae. Aceste studii au scos la iveală o reţea de mecanisme de detectare
şi de semnalizare, care generează şi transmit informaţii despre starea nutriţională a mediului către
celule, care la rândul său pun în aplicare programe de dezvoltare specifice [119].
Componenţa mediului nutritiv influenţează în mare măsură proprietăţile morfologice şi
fiziologo-biochimice ale celulelor de drojdii. Studiul unor aspecte ale nutriţiei microbiene, legate
de creşterea, productivitatea biomasei, sporogeneza, biosinteza principiilor bioactive şi
dependenţa acestor parametri de condiţiile de cultivare, este necesar pentru elaborarea diferitor
metode de reglare a acestor procese. Optimizarea parametrilor de cultivare şi ca rezultat creşterea
acumulării biomasei şi biosintezei principiilor biologic active influenţează mult calitatea şi
productivitatea procesului biotehnologic, calitatea şi activitatea biologică a preparatelor.
Procesele metabolice sunt influenţate de sursele de nutriţie, de introducerea în mediul de
nutriţie a diferitor precursori ai biosintezei, elementelor chimice indispensabile, vitaminelor şi
stimulatorilor. Cunoaşterea interdependenţei dintre condiţiile de cultivare şi procesele fiziologice
din celulele microbiene permite de a regla creşterea şi dezvoltarea microorganismelor, precum şi
biosinteza produşilor necesari. Astfel, menţinând condiţiile de cultivare necesare, pot fi dirijate,
într-o anumită măsură, procesele fermentative şi acumularea biomasei cu conţinut biochimic
prognozat [42].

49
 Eficacitatea procesului biotehnologic bazat pe cultivarea în profunzime a
microorganismelor este determinată în primul rând de parametrii fizici şi chimici ai mediului de
cultură lichid, de calitatea şi cantitatea surselor de carbon şi azot.
Din cele expuse, este evidentă oportunitatea selectării unor componente ale mediului de
cultivare, care ar putea fi utilizate în scopul sporirii productivităţii drojdiilor şi obţinerii biomasei
cu conţinut sporit de carbohidraţi.
În vederea stabilirii mediului optim ce va asigura cantităţi înalte de carbohidraţi, a
fost evaluat gradul de biosinteză al acestor compuşi la cultivarea tulpinilor S. cerevisiae
CNMN-Y 20 şi S. cerevisiae CNMN-Y 21 pe medii nutritive lichide, folosite în practica
microbiologică pentru cultivarea producătorilor de carbohidraţi. Rezultatele sunt expuse în
tabelul 3.3.

Tabelul 3.3. Evaluarea productivităţii şi sintezei carbohidraţilor tulpinilor S. cerevisiae CNMN-Y

20 şi S. cerevisiae CNMN-Y 21 la cultivarea pe medii lichide cu compoziţie diversă
Nr Denumirea Sursa S. cerevisiae CNMN-Y-20 S. cerevisiae CNMN-Y-21
mediului bibliografică BAU, Carbohidraţi, BAU, Carbohidraţi,
g/l % S.U. g/l % S.U.
X1 ± x 1 X1 ± x 1 X1 ± x 1 X1 ± x 1
1 YPD Aguilar-
Uscanga B. 6,6±0,06 16,7±1,46 6,7±0,02 14,9±1,14
2007 [79]
2 MGYP Kiran M.
2005 [161] 3,8±0,03 13,9±0,20 - -
3 Must de malţ Anghel I.
1991 [2] 8,3±0,50 30,8±2,30 7,1±0,03 33,1±1,50
4 Rieder Anghel I.
1993 [3] 3,9±0,03 33,5±1,45 3,5±0,01 30,5±0,95

Conform rezultatelor, tulpinile studiate sintetizează cantităţi semnificative de carbohidraţi

pe mediul sintetic Rieder, iar productivitatea este maximală pe mediile mai bogate în azot: YPD
şi must de malţ. Acest fapt se explică prin aceea, că în mediile bogate în azot are loc
multiplicarea rapidă şi acumularea intensă de biomasă, pe când în mediile limitate după azot,
după epuizarea acestuia, se intensifică procesele biosintetice în celulă.
Conform studiilor de specialitate, microorganismele utilizează un număr variat de
substanţe organice ca sursă principală de carbon şi energie.
Glucoza este utilizată pentru cultivarea drojdiilor şi producerea de antibiotice, steroli,
xantan şi diferite heteropolizaharide, acid butiric, tartric, acetic, aminoacizi, etc. [24, 186].

50
Zaharoza, adăugată în mediul de cultură sub formă de melasă sau pură este utilizată ca substrat
major pentru obţinerea acidului citric, producerea drojdiei de bere, panificaţie şi a adaosurilor
biologic active în baza lor, acizilor organici, aminoacizilor, polizaharidelor [2, 25, 39, 60, 192].
Maltoza prezentă în malţ provenit de la fabricarea berii, este folosită pe larg la prepararea
mediilor de laborator pentru cultivarea drojdiilor [2].
Vital pentru microorganisme este azotul. El este adăugat în mediile de nutriţie sub formă
de săruri de nitraţi sau amoniu [57, 61]. Frecvent se utilizează ureea, extractul sau autolizatul de
drojdie, extractul de porumb, făina de soia şi porumb, pepton, etc. [150, 191, 241].
În această ordine de idei, în faza ulterioară a investigaţiilor a fost studiată influenţa
separată a unor surse de carbon asupra multiplicării tulpinilor de drojdii S. cerevisiae
CNMN-Y 20 şi S. cerevisiae CNMN-Y 21 şi biosintezei carbohidraţilor. Ca mediu nutritiv
de referinţă pentru cultivarea submersă a drojdiilor a fost folosit mediul Rieder [3], deoarece
este un mediu cu o compoziţie biochimică determinată, în care putem substitui sursa de
carbon, celelalte componente rămânând nemodificate. În unele variante experimentale
concentraţia glucozei din mediul Rieder a fost modificată în limitele de concentraţie de la 20
la 100 g/l, iar în alte variante glucoza a fost substituită cu monozaharidele: fructoza (în
concentraţie de la 20 la 100 g/l), manoza (de la 20 la 80 g/l); dizaharidul zaharoza (20 - 100
g/l). De asemenea, în loc de glucoză a fost utilizată melasa – sursă de C, N, microelemente şi
vitamine în concentraţie de 10 - 80 g/l. Cultivarea s-a efectuat pe un agitator rotativ (200 r. p.
m.), la temperatura de 23-25°C, timp de 72 ore.
Rezultatele cercetărilor ale indicilor multiplicării şi sintezei carbohidraţilor pentru
tulpinile S. cerevisiae CNMN –Y-20 şi S. cerevisiae CNMN –Y-21 sunt reflectate în
tabelul 3.4 şi 3.5, respectiv.
Prin analiza datelor obţinute s-a constatat, că sursele de carbon prezente în mediul
nutritiv manifestă acţiune selectivă asupra multiplicării şi sintezei carbohidraţilor la
tulpinile în studiu.
Productivitatea maximală a drojdiilor s-a înregistrat pe mediul în care glucoza a
fost substituită prin melasă, sporul de biomasă variind în dependenţă de concentraţia
utilizată de la 7,4 până la 192,6% faţă de martor la tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20
(tabelul 3.4) şi de la 45,8 până la 212,5% faţă de martor la S. cerevisiae CNMN-Y-21
(tabelul 3.5).
Substituirea glucozei din mediul martor cu zaharoză şi manoză nu a influenţat
semnificativ multiplicarea drojdiilor, numărul de celule oscilând în jurul valorilor mediului
martor.

51
 Multiplicarea activă a ambelor tulpini de drojdii a fost observată şi în variantele ce
conţin diferite concentraţii de fructoză. Numărul de celule a fost cu 10,6 – 45,5% mai mare
comparativ cu martorul pentru S. cerevisiae CNMN –Y-20 (tabelul 3.4) şi 5,6 – 37,1%
pentru S. cerevisiae CNMN –Y-21 (tabelul 3.5).
La estimarea activităţii de sinteză a carbohidraţilor am stabilit, că substituirea
glucozei prin sursele de carbon cercetate, cu excepţia manozei, asigură valori mai ridicate
ale conţinutului de carbohidraţi, comparativ cu cele determinate pe mediul de referinţă.

Tabelul 3.4. Influenţa sursei de carbon asupra multiplicării şi sintezei carbohidraţilor de către
tulpina de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20
Nr Sursa de Conc. Numărul %M Produc %M Carbohidraţ %M
carbon sursei de de celule, tivitate i, % S.U.
carbon, 1x 106 ml-1 BAU X1 ± x 1
g/l X1 ± x 1 g/l
1 Glucoza 20 11,9±0,42 96,7 2,7 100 26,2±0,45 86,7
40 12,8±0,94 104,1 2,4 88,9 27,9±0,74 92,4
60 14,7±1,19 119,5 2,9 107,4 33,2±3,14 110,0
80 14,6±1,60 118,7 2,7 100 26,6±3,13 88,1
100 14,1±0,84 114,6 2,7 100 27,3±3,78 90,4
2 Zaharoza 20 12,4±1,16 100,8 2,4 88,9 29,5±0,39 97,7
40 13,9±1,15 113,0 2,9 107,4 36,4±3,59 120,5*
60 13,5±0,51 109,7 3,3 122,2 31,6±2,95 104,6
80 13,4±0,91 108,9 3,3 122,2 30,3±3,67 100,3
100 13,0±0,65 105,7 2,9 107,4 29,4±4,25 97,3
3 Fructoza 20 13,6±0,12 110,6 2,9 107,4 27,3±0,57 90,4
40 16,3±0,05 132,5* 3,3 122,2* 30,2±0,03 100,0
60 16,6±0,11 134,9* 3,5 129,6* 39,1±0,84 129,5*
80 17,5±0,24 142,2* 3,5 129,6* 32,5±0,30 107,6
100 17,9±0,02 145,5* 3,5 129,6* 30,6±1,38 101,3
4 Manoza 20 12,3±0,22 100,0 2,7 100 27,6±0,93 91,3
40 13,0±0,22 105,7 2,7 100 25,0±0,31 82,8
60 14,2±0,45 115,4 2,7 100 22,5±0,05 74,5
80 13,0±0,21 105,7 2,9 107,4 24,0±1,37 79,5
5 Melasa 10 14,0±0,80 113,8 2,9 107,4 32,9±2,69 108,9
20 22,4±1,29 182,1* 4,9 181,5* 40,9±2,31 135,4*
40 28,7±1,51 233,3* 6,8 251,8* 32,8±0,45 108,6
60 34,0±1,21 276,4* 7,9 292,6* 31,8±1,32 105,3
80 31,4±2,66 255,2* 7,5 277,8* 31,0±0,87 101,3
6 Rieder
(martor) 30 12,3±0,68 100 2,7 100 30,2±1,26 100

* - veridicitatea în comparaţie cu martorul - p<0,05

Efect stimulator pentru ambele tulpini S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae

CNMN –Y-21 a fost obţinut la substituirea în mediul nutritiv a glucozei prin zaharoză –

52
60 g/l, fructoză în concentraţie de 60 g/l, sau melasă – 20 g/l, în prezenţa cărora tulpina
S. cerevisiae CNMN-Y-20 a acumulat cu 20,5 - 35,4% mai mulţi carbohidraţi faţă de
mediul martor, iar tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-21, la aceste concentraţii a acumulat cu
38,3 - 43,8% mai mulţi carbohidraţi. Majorarea concentraţiei sursei de carbon în mediul
de cultură până la 80-100 g/l în majoritatea cazurilor condiţionează un efect mai moderat
în acumularea carbohidraţlor de către ambele tulpini.
Efectul moderat al manozei se explică prin necesitatea convertirii ei în fructozo–6 fosfat
înainte de a intra în procesele metabolice.

Tabelul 3.5. Influenţa sursei de carbon asupra multiplicării şi sintezei carbohidraţilor de către
tulpina de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-21
Nr Sursa de Conc. Numărul %M Produc % M Carbohidraţ %M
carbon sursei de de celule, tivitate i, % S.U.
carbon, 1x 106 ml-1 BAU X1 ± x 1
g/l X1 ± x 1 g/l
1 Glucoza 20 11,4±0,26 91,9 2,7 112,5 20,9±1,19 92,5
40 11,9±0,03 95,9 2,1 87,5 23,6±2,44 104,4
60 13,9±0,32 112,1 2,4 100 21,4±2,10 94,7
80 15,1±0,97 121,8 2,4 100 24,3±4,23 107,5
100 12,4±1,16 100,0 2,1 87,5 21,9±2,33 96,9
2 Zaharoza 20 13,2±0,33 106,4 2,9 120,8* 29,7±1,61 131,4*
40 13,8±0,68 111,3 2,4 100 31,4±1,55 138,9*
60 14,0±0,37 112,9 2,7 112,5 26,6±2,74 117,7
80 13,2±1,20 106,4 2,9 120,8* 29,1±1,80 128,8*
100 13,1±0,73 105,6 2,4 100 25,4±2,91 112,4
3 Fructoza 20 13,1±0,25 105,6 2,7 112,5 25,7±0,36 113,7
40 15,3±0,18 123,4* 2,9 120,8* 31,8±0,78 140,7*
60 16,2±0,33 130,6* 3,2 133,3* 32,5±1,29 143,8*
80 17,0±0,32 137,1* 3,5 145,8* 32,2±1,04 142,5*
100 15,9±0,13 128,2* 2,9 120,8* 30,5±1,04 134,9*
4 Manoza 20 13,0±0,22 104,8 2,5 104,2 29,1±0,76 128,8*
40 12,6±0,44 101,6 2,4 100 22,9±0,22 101,3
60 13,4±0,42 108,1 2,4 100 21,8±0,19 96,5
80 10,8±0,22 87,1 2,1 87,5 22,0±0,80 97,3
5 Melasa 10 15,3±1,51 123,4* 3,5 145,8* 27,4±2,34 121,2*
20 25,2±1,58 203,2* 4,8 200,0* 29,8±0,10 131,8*
40 30,4±2,06 245,2* 7,0 291,7* 25,8±3,54 114,2*
60 39,6±4,41 319,3* 7,5 312,5* 28,1±3,06 124,3*
80 38,6±3,95 311,3* 7,4 308,3* 29,1±0,99 128,8*
6 Rieder
(martor) 30 12,4±0,55 100 2,4 100 22,6±0,37 100
* - veridicitatea în comparaţie cu martorul - p<0,05

Efectul benefic semnificativ al celorlalte surse de carbon cercetate asupra procesului de sinteză a
carbohidraţilor se datorează probabil faptului (conform ipotezei lui Berthels [87]), că mecanismele

53
metabolice la drojdiile de vin sunt îndreptate preponderent spre detecţia şi asimilarea surselor de carbon
preferenţiale, care reprezintă două hexoze (glucoza şi fructoza) uşor fosfatate şi care intră direct în
gluconeogeneză. Glucoza este materia primă de bază în sinteza uridindifosfatglucozei (UDF-D-glucoză),
precursorul şi donatorul de zahăr de bază în procesul de sinteză a β-glucanului şi formării peretelui
celular. În acelaşi timp, în mediile ce conţin numai o singură hexoză, fructoza este asimilată mai
rapid şi la un grad mai înalt ca glucoza [87], fapt care explică rezultatele mai semnificative
obţinute în probele cu fructoză în comparaţie cu cele cu glucoză. Efectul pozitiv al zaharozei, care
prezintă prin sine un dizaharid, este şi el explicabil, ţinând cont de faptul, că ea este uşor
hidrolizată de invertază în glucoză şi fructoză, iar a melasei, prin compoziţia biochimică bogată.
Generalizând rezultatele obţinute privitor la rolul carbonului se poate afirma, că drojdiile
S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 metabolizează eficient melasa, fructoza,
glucoza şi zaharoza. Primele 2 asigură o creştere activă şi o acumulare semnificativă de glucide,
iar ultimele influenţează pozitiv numai procesul de biosinteză a carbohidraţilor.
Aşa dar, un efect benefic asupra productivităţii tulpinilor S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S.
cerevisiae CNMN –Y-21 şi sintezei carbohidraţilor exercită substituirea glucozei (30 g/l) în
mediul nutritiv Rieder prin melasă (20 g/l) şi fructoză (40 şi 60 g/l), care se propun pentru
cultivarea tulpinilor de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21, în
calitate de sursă de carbon şi energie, cu scopul majorării productivităţii şi conţinutului de
carbohidraţi în biomasă.
Rezultatele cercetărilor pot fi valorificate la diversificarea mediilor nutritive pentru
cultivarea drojdiilor producătoare de carbohidraţi.

3.2.2. Efectele sărurilor minerale, acetaţilor şi compuşilor coordinativi ai Mn (II) şi

Zn (II) asupra productivităţii şi biosintezei carbohidraţilor la drojdiile S. cerevisiae
CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21
Tot mai vaste devin cercetările bazate pe studierea capacităţii diferitor compuşi fiziologic
activi de a influenţa şi regla creşterea şi productivitatea microorganismelor. Activitatea
biosintetică a microorganismelor, în general, şi a drojdiilor, în particular, este în dependenţă
directă atât de condiţiile de cultivare (temperatura, pH-ul mediului, durata de cultivare), cât şi de
prezenţa cantităţilor suficiente ale oligoelementelor în mediul de cultivare. În această ordine de
idei, un loc deosebit le revine compuşilor coordinativi, care se utilizează cu succes în industrie,
agricultură, medicină. Astfel, preparatele medicamentoase, ce conţin în calitate de substanţe
active complexe metalice ale cuprului, zincului, manganului, cobaltului şi altor metale, se
utilizează în tratamentul unor afecţiuni (procese inflamatorii, ulcer, cancer, diabet, boli

54
cardiovasculare şi ale sistemului nervos) graţie acţiunii lor antiinflamatorii, antitumorigene,
antimicrobiene şi antivirale.
Compuşii coordinativi sunt prezenţi în organismele vii sub formă de complexe a ionilor
metalici (Fe, Cu, Mg, Mn, Mo, Co, Zn ş.a.) cu proteine (metaloproteine), vitamine, enzime ş.a.
Metaloproteinele joacă un rol important în multe procese biologice, aşa ca respiraţia, fotosinteza,
protecţia de acţiunea substanţelor toxice. Majoritatea enzimelor-cheie în lanţurile metabolice
conţin în calitate de centru activ atomi ai metalelor, în special ai celor de tranziţie. Datorită
acestui fapt, metalele şi, în special, complexele metalice, influenţează vădit procesele metabolice
în celulă [20].
Studiul literaturii de specialitate ne-a permis să evidenţiem necesitatea microorganismelor
în metale. O mare importanţă o au diferiţi ioni necesari pentru asimilarea substratului nutritiv,
sau în calitate de cofactori ai biosintezei carbohidraţilor. Unii, ca de exemplu cei de fosfor (în
cantităţi excesive) acţionează ca inhibitori ai sintezei hidraţilor de carbon. Alţii, ca cei ai Fe2+, au
efect pozitiv asupra biosintezei carbohidraţilor de către Pseudomonas aeruginosa şi sintezei
levanzaharazei de Ganoderma oxidans. Ionii de Zn2+, Mn2+ sunt necesari pentru biosinteza
glucanului la Rhizobium japonicum şi mananului la S. cerevisiae, ionii de Mg2+ şi Ca2+ au impact
pozitiv asupra sintezei dextranilor Leuconostoc mesenteroides şi exopolizaharidelor Azotobacter
vinelandii [34].
Numeroasele cercetări realizate la cultivarea unor tulpini de microorganisme (bacterii,
drojdii, ciuperci), în scopul reglării proceselor de biosinteză cu utilizarea unor compuşi
coordinativi ai metalelor de tranziţie, confirmă eficienţa aplicării lor pentru dirijarea
productivităţii şi biosintezei principiilor bioactive de către diferite grupe taxonomice de
microorganisme [11, 30].
În acest context, scopul cercetărilor a constat în estimarea influenţei unor sulfaţi,
acetaţi şi compuşi coordinativi ai Mn (II) şi Zn (II) în calitate de stimulatori ai procesului de
biosinteză a carbohidraţilor, şi multiplicării drojdiilor de vin în vederea elaborării unor
procedee noi de dirijare a biosintezei carbohidraţilor.
Obiecte ale studiului au servit tulpinile de drojdii producători activi de carbohidraţi S.
cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 [4, 18], izolate în cultură pură din
microflora sedimentelor de drojdii de la vinurile roşii (Cabernet) şi albe (Chardonnay).
Ca medii nutritive de referinţă au servit mediul MGYP cu următoarea compoziţie, g/l:
glucoză – 10, peptonă – 5, extract de drojdii – 3, must de malţ – 3, apă distilată – 1l [161] şi
mediul Rieder [3].

55
 Cultivarea tulpinilor s-a efectuat la temperatura +23 - 25°C, timp de 120 ore, pe un
agitator rotativ (200 r.p.m.). Mostrele experimentale au fost prelevate la 24; 48; 72; 96 şi 120 ore
de cultivare a drojdiilor.
Ca reglatori ai proceselor biosintetice au fost cercetaţi: din gama sărurilor minerale -
sulfatul de mangan (MnSO4•4H2O) şi sulfatul de zinc (ZnSO4•7H2O); din gama acetaţilor -
acetatul de sodiu (CH3COONa)•3H2O şi acetatul de zinc (CH3COO)2Zn•2H2O); din gama
compuşilor coordinativi - 3 compuşi coordinativi ai Mn (II) cu diferiţi liganzi:
٠[Mn2Ac(2PyFX)–1,7-Bis(piridin)malonodihidrazid-dimangan-acetat],
٠[Mn2Ac(2PyTCH)-1,5 Bis(piridin)tiocarbohidrazid-dimangan-acetat],
٠[Mn2Cl2(2PyFX)–1,7-Bis(piridin)malonodihidrazid-dimangan-diclorură)],
sintetizaţi de dl doctor V. Lozan şi un compus al manganului [Mn(Gly)2] Cl2, sintetizat de dl
acad. C. Turtă în Institutul de Chimie al AŞM; 4 compuşi ai Zn (II): clorură de monocloroacetat

de zinc (LP-1); clorură de tricloroacetat de zinc (LP-2); clorură de tricloroacetat de zinc γ, γ΄

dipiridil (LP-3); tartrat de zinc imidazol (acid vinic) (LP-4), sintetizaţi în laboratorul Chimie
anorganică al USM sub conducerea dlui academician A. Gulea.
Pentru a selecta compuşii de perspectivă, s-a comparat nivelul multiplicării şi
productivităţii tulpinilor S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 cu cantitatea de
carbohidraţi în biomasa obţinută.

Efectele acţiunii sulfaţilor de Mn(II) şi Zn (II)

De obicei, în componenţa mediilor de cultivare se includ microelemente sub formă de
săruri anorganice, în special sub formă de sulfaţi sau acetaţi, care pot reprezenta surse de
cofactori ai sistemelor enzimatice. Unii autori indică, că componenţii minerali şi organici ai
apelor subterane pot fi folosiţi ca o nouă sursă nutritivă pentru cultivarea drojdiilor. Folosirea
acestor ape la cultivarea drojdiilor duce la majorarea productivităţii, permeabilităţii membranei
citoplasmatice, stabilizării structurilor celulare, activarea fermenţilor complexelor zimazic şi
maltazic, biosintezei proteinei, carbohidraţilor, substanţelor minerale şi a aminoacizilor,
substanţe ce determină valoarea lor biologică [55, 56].
Ţinând cont de importanţa oligoelementelor în procesul de cultivare a microorganismelor,
în experienţele noastre a fost cercetată influenţa sulfatului de mangan şi sulfatului de zinc asupra
activităţii tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20. Sărurile au fost incluse în mediul nutritiv MGYP în
concentraţie de 5 mg/l. Iniţial s-a cercetat efectul sulfaţilor de mangan şi zinc asupra multiplicării
în dinamică a drojdiilor timp de 120 ore. Rezultatele studiului sunt prezentate în figura 3.5. S-a

56
stabilit că maximul de multiplicare este înregistrat după 72 ore de cultivare pentru MnSO4•4H2O
şi după 96 ore - pentru ZnSO4•7H2O.

MnSO4 5 mg/l ZnSO4 5 mg/l martor

140
120
100
%M

80
60
40
20
24 48 72 96 120
Durata de cultivare, ore

Fig. 3.5. Influenţa sulfatului de Mn2+ şi sulfatului de Zn2+ asupra multiplicării tulpinii S.
cerevisiae CNMN-Y-20 cultivată pe mediul MGYP, % faţă de martor.

Următoarea etapă a studiului a fost stabilirea efectului sărurilor asupra conţinutului de

carbohidraţi în biomasa drojdiei (figura 3.6). S-a constatat că sinteza carbohidraţilor practic nu
este influenţată de către compuşii cercetaţi. Efectul moderat, cât al MnSO4•4H2O, atât şi al
ZnSO4•7H2O în concentraţia studiată, asupra productivităţii drojdiei şi acumulării carbohidraţilor
la tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20 denotă faptul, că aceşti compuşi nu pot fi incluşi în lista
factorilor limitativi de cultivare a drojdiilor de vin.

MnSO4 5 mg/l ZnSO4 5 mg/l

120 martor
100
80
%M

60
40
20
0
productivitate endopolizaharide exopolizaharide

Fig. 3.6. Influenţa sulfatului de Mn2+ şi sulfatului de Zn2+ asupra productivităţii tulpinii S. cerevisiae
CNMN-Y-20 şi sintezei carbohidraţilor, la cultivare pe mediul MGYP, % faţă de martor.

57
 Efectele acţiunii acetaţilor de Na şi Zn (II)
Pornind de la aceea că acetaţii, de regulă, acţionează ca inductori în unele procese de
biosinteză a principiilor bioactive [20], în continuare s-a urmărit influenţa acetatului de sodiu şi
acetatului de zinc, adăugaţi în mediul nutritiv Rieder în concentraţie de 10, 20, 30, mg/l, asupra
multiplicării tulpinilor de drojdii şi sintezei carbohidraţilor.
Analiza rezultatelor a arătat, că efectul acetaţilor este variabil şi depinde de metal,
concentraţie şi specia de drojdii. Spre exemplu, acetatul de zinc în concentraţie de 10 şi 20 mg/l
sporeşte conţinutul de carbohidraţi în biomasa tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 cu 26 şi 14 %
respectiv faţă de martor (figura 3.7).

Numărul de celule Carbohidraţi Martor

150
130
110
90
70
%M

50
30
10
10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30

CH3COONa (CH3COO)2Zn CH3COONa (CH3COO)2Zn

S. cerevisiae CNMN-Y-20 S. cerevisiae CNMN-Y-21

conc., mg/l

Fig. 3.7. Influenţa acetatului de sodiu şi acetatului de zinc asupra multiplicării tulpinilor S.
cerevisiae CNMN-Y-20, S. cerevisiae CNMN-Y-21 şi sintezei carbohidraţilor la cultivare pe
mediul Rieder, % faţă de martor.

Majorarea conţinutului de carbohidraţi are loc pe fundalul descreşterii multiplicării.

Asupra tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-21 compuşii chimici cercetaţi au avut un efect moderat,
în unele cazuri stimulând productivitatea şi inhibând uşor sinteza carbohidraţilor.

Efectele acţiunii compuşilor coordinativi ai Mn(II) şi Zn (II)

Pentru evidenţierea modului în care compuşii coordinativi influenţează dinamica
procesului de multiplicare a tulpinilor S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21,
compuşii Mn2Ac(2Py FX), Mn2Cl2 (2Py FX) şi Mn2Ac(2PyTCH) au fost incluşi în mediul de
cultivare MGYP în patru concentraţii (figura 3.8). S-a stabilit că în mediul în care s-a utilizat
compusul Mn2Ac(2PyTCH) maximul multiplicării este înregistrat după 48-72 ore de cultivare,

58
ceea ce demonstrează că faza de accelerare a ritmului de creştere intervine mai rapid faţă de cea
în cazul utilizării sulfaţilor de mangan şi zinc.

170 24 ore 48 ore 72 ore 96 ore martor

150
130
%M

110
90
70
50
5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20

Mn2Ac(2PyFX) Mn2Cl2(2PyFX) Mn2Ac(2PyTCH)

conc., mg/l

Fig. 3.8. Influenţa compuşilor coordinativi ai Mn (II) asupra dinamicii multiplicării tulpinii S.
cerevisiae CNMN-Y-20 la cultivare pe mediul MGYP, % faţă de martor.

Investigaţiile influenţei compuşilor coordinativi asupra productivităţii şi procesului de

biosinteză a carbohidraţilor de către drojdiile de vin au demonstrat, că compusul
Mn2Ac(2PyTCH) în concentraţia de 10-15 mg/l are efect pozitiv neesenţial asupra conţinutului
de endopolizaharide la drojdia S. cerevisiae CNMN-Y-20, fiind cu 7-11% mai mare faţă de
martor (figura 3.9), iar compuşii Mn2Ac(2PyFX), şi Mn2Cl2(2PyFX) exercită efect neutru.
Compusul coordinativ al manganului cu aminoacidul glicina [Mn(Gly)2] Cl2, inclus în
mediul de cultivare Rieder în concentraţie de 5-20 mg/l, s-a evidenţiat prin efect specific în
funcţie de specia de drojdii (figura 3.10). S-a constatat influenţa moderat stimulatoare (cu 18%
faţă de martor) asupra biosintezei carbohidraţilor la tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi
acţiunea inhibitoare pentru tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-21. Efectul pozitiv al compusului
probabil poate fi datorat îmbinării reuşite dintre metal şi glicină, care influenţează pozitiv
activitatea manoziltransferazelor implicate în sinteza mananproteinelor, un component de bază al
carbohidraţilor drojdiilor de vin [229].
Pentru compuşii coordinativi ai zincului observăm următoarele: în seriile de experienţe
menite să elucideze în dinamică influenţa acestora s-a constatat, că din 4 compuşi cercetaţi
atenţie deosebită în calitate de stimulator al multiplicării tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20
merită compusul Zn LP-2 – clorură de tricloracetat de zinc, care în concentraţie de 5 şi 20 mg/l,
după 48 ore de cultivare a drojdiei, influenţează pozitiv procesul de multiplicare a celulelor,

59
numărul acestora la un volum de mediu majorându-se cu 17% comparativ cu martorul (figura
3.11).

productivitate endopolizaharide
exopolizaharide martor
130
110
90
%M

70
50
30
5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20

Mn2Ac(2PyFX) Mn2Cl2(2PyFX) Mn2Ac(2PyTCH)

conc., mg/l

Fig. 3.9. Influenţa compuşilor coordinativi ai Mn (II) asupra productivităţii tulpinii S. cerevisiae
CNMN-Y-20 şi sintezei carbohidraţilor la cultivare pe mediul MGYP, % faţă de martor.

Numărul de celule Carbohidraţi Martor

130
110
90
%M

70
50
30
10
5 10 20 5 10 20

[Mn(Gly)2] Cl2 [Mn(Gly)2] Cl2

S. cerevisiae CNMN-Y-20 S. cerevisiae CNMN-Y-21

conc., mg/l

Fig. 3.10. Influenţa compusului coordinativ [Mn(Gly)2] Cl2 asupra multiplicării tulpinilor S.
cerevisiae CNMN-Y-20, S. cerevisiae CNMN-Y-21 şi sintezei carbohidraţilor la cultivare pe
mediul Rieder, % faţă de martor.

Ulterior s-a studiat capacitatea tulpinii de a sintetiza carbohidraţi (figura 3.12). După cum
reiese din rezultatele reflectate în figură, compusul Zn LP-2 - clorură de tricloracetat de zinc se
caracterizează prin proprietăţi de stimulare a sintezei endopolizaharidelor. În concentraţie de 5 şi
10 mg/l compusul intensifică sinteza carbohidraţilor intracelulari, cu 18 şi 25 % respectiv faţă de
martor (figura 3.12).

60
 24 ore 48 ore 72 ore 96 ore 120 ore martor
130
120
110
%M
100
90
80
70
60
5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20

Zn LP -1 Zn LP -2 Zn LP -3 Zn LP -4
conc., mg/l

Legendă: ZnLP-1 - clorură de monocloroacetat de zinc; ZnLP-2 - clorură de tricloroacetat de zinc;

ZnLP-3 - clorură de tricloroacetat de zinc γ, γ΄ dipiridil; ZnLP-4 - tartrat de zinc imidazol (acid vinic).

Fig. 3.11. Influenţa compuşilor coordinativi ai Zn (II) asupra dinamicii multiplicării tulpinii S.
cerevisiae CNMN-Y-20 la cultivare pe mediul MGYP, % faţă de martor.

productivitate endopolizaharide
140 exopolizaharide martor
130
120
110
%M

100
90
80
70
60
5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20

Zn LP -1 Zn LP -2 Zn LP -3 Zn LP -4
conc. mg/l

Legenda: ZnLP-1 - clorură de monocloroacetat de zinc; ZnLP-2 - clorură de tricloroacetat de zinc;

ZnLP-3 - clorură de tricloroacetat de zinc γ, γ΄ dipiridil; ZnLP-4 - tartrat de zinc imidazol (acid vinic)

Fig. 3.12. Influenţa compuşilor coordinativi ai Zn (II) asupra productivităţii tulpinii S. cerevisiae
CNMN-Y-20 şi sintezei carbohidraţilor, la cultivare pe mediul MGYP, % faţă de martor.

Acest studiu ilustrează influenţa neunivocă a oligoelementelor Mn (II) şi Zn (II), utilizate

în diferite forme chimice, asupra productivităţii şi biosintezei carbohidraţilor la drojdiile de vin.
Rezultatele obţinute denotă, că MnSO4•4H2O şi ZnSO4•7H2O având un efect moderat, nu pot fi
aliniaţi la factorii care limitează metabolismul drojdiilor de vin.
Un important factor de dirijare a biosintezei carbohidraţilor sunt acetaţii utilizaţi în
procesele de cultivare ale drojdiilor în studiu. Rezultatele indică un răspuns specific al tulpinilor

61
de drojdii la prezenţa acetaţilor în mediul de cultivare. Pentru tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20
s-a constatat o corelare a acţiunii acetatului de Zn(II) cu concentraţiile utilizate, astfel că
creşterea concentraţiei de (CH3COO)2Zn•2H2O) de la 10 la 30 mg/l duce la scăderea conţinutului
de carbohidraţi în biomasa drojdiei.
Cercetările prin care s-a încercat stimularea biosintezei carbohidraţilor la unele drojdii de
vin prin suplimentarea mediului de cultivare cu compuşi coordinativi ai Mn (II) şi Zn (II) ca
surse de cofactori ai sistemelor enzimatice şi ca stimulatori ai biosintezei carbohidraţilor au dus
la rezultate, prin care putem afirma eficienţa înaltă a clorurei de tricloracetat de zinc.
Proprietăţile reglatoare ale complexelor coordinative ale metalelor studiate asupra productivităţii
şi biosintezei carbohidraţilor la drojdiile S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21
sunt determinate cât de metal, atât şi de natura ligandului.
Efectul pozitiv al compuşilor chimici sub formă de acetaţi ai Zn (II) asupra procesului de
sinteză a carbohidraţilor poate fi explicat atât prin faptul includerii ionilor de Zn2+, în calitate de
cofactori strict necesari, în enzimele cheie pentru biosinteza glucanilor şi mananilor de către
microorganisme şi în special drojdii [34], cât şi prin implicarea lor în reglarea genelor Zn2+-
dependente responsabile de depozitarea şi metabolismul glucidelor [109].
Astfel, includerea în mediul de cultură a compusului ZnLP-2 - clorură de tricloracetat de
zinc în concentraţie de 5 şi 20 mg/l a relevat o sporire maximală a multiplicării drojdiei S.
cerevisiae CNMN-Y-20 cu 17%. Acest compus a avut efect maximal şi asupra procesului de
acumulare a carbohidraţilor în biomasa drojdiilor. Adăugat la mediul de cultivare în concentraţie
de 5-10 mg/l, compusul ZnLP-2 - clorură de tricloracetat de zinc a majorat substanţial conţinutul
de carbohidraţi în biomasa drojdiilor S. cerevisiae CNMN-Y-20.
Reieşind din cele relatate, compusul coordinativ ZnLP-2 - clorură de tricloracetat de zinc
se recomandă a fi utilizat în calitate de stimulator specific al sintezei carbohidraţilor şi
multiplicării la cultivarea submersă a tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20.

3.2.3. Efectele temperaturii, pH-ului iniţial al mediului nutritiv, duratei de cultivare asupra
multiplicării şi biosintezei carbohidraţilor la drojdiile S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S.
cerevisiae CNMN-Y-21.
Cei mai importanţi factori fizici care reglează creşterea şi metabolismul
microorganismelor sunt temperatura de cultivare, pH-ul şi aeraţia mediului. Aceşti factori
influenţează solubilitatea sărurilor, compoziţia ionică a substraturilor, morfologia şi structura
celulelor, determină activitatea fiziologică a culturilor şi acţionează asupra proprietăţilor pereţilor
celulari, transportului de substanţe nutritive, proceselor şi reacţiilor chimice din membrane,

62
vitezei de creştere şi multiplicare, structurii populaţiei şi, de asemenea, capacităţii de a asimila
una sau alta sursă nutritivă [38, 88, 225].
Drojdiile utilizate în industrie manifestă diferite cerinţe de hrană şi condiţii specifice de
mediu. În general, orice microorganism are nevoie de o sursă de energie, concentraţii optime de
elemente nutritive, alte cerinţe specifice.
Tulpinile genului Saccharomyces în majoritatea sa sunt culturi mezofile [3, 96]. Un factor
semnificativ de influenţă asupra creşterii, dezvoltării şi activităţii biosintetice a
microorganismelor este temperatura. Sub acţiunea temperaturii se modifică durata etapelor de
dezvoltare a microorganismului – lag-faza, faza exponenţială, faza staţionară şi termenii de
manifestare a activităţii biochimice - biosinteza enzimelor, proteinelor şi altor substanţe biologic
active [84].
Valoarea pH-ului este, alături de temperatură, un parametru important în procesele de
biosinteză. În general microorganismele au un domeniu optim de pH pentru dezvoltare, în care
viteza specifică de creştere atinge valoare maximă. pH-ul mediului de cultivare influenţează
activitatea sistemului enzimatic corespunzător, care se implică nemijlocit în procesele de
biosinteză. Pentru drojdiile genului Saccharomyces domeniul optim se situează între valorile
de pH 4-5 şi prezintă avantajul unui risc mai scăzut de contaminare bacteriană, ceea ce este în
mod deosebit de apreciat în cazul unei cultivări industriale.
Până în prezent a fost acumulat un material teoretic şi experimental amplu privind
influenţa temperaturii şi pH-ului mediului de cultivare asupra creşterii şi biosintezei hidraţilor
de carbon la microorganisme din diverse clase şi genuri.
Aşa de exemplu, tulpina de drojdii S. cerevisiae CEN.PK133-7D are optimul de creştere
la +30°C şi pH-ul mediului de cultivare 5,0. Modificările pH-ului cauzează unele fluctuaţii în
nivelurile de β-glucan, manan şi chitină, dar nu a existat nici o relaţie evidentă între aceste
fluctuaţii şi pH-ul mediului. Proporţia relativă a β-1,6-glucanului în fracţiunea β-glucanilor a
scăzut cu circa 40% la creşterea pH-ului de la 4,0 la 6,0, iar sensibilitatea celulelor la zimolaze a
crescut. Deşi creşterea temperaturii de cultivare de la 22 la +37°C a dus la majorarea nivelului de
chitină şi conţinutului β-1,6-glucan în fracţiunea β-glucanilor, aceste fluctuaţii nu au influenţat în
mod vădit nivelul de manani. Micşorarea conţinutului de O2 dizolvat în mediul de cultivare
conduce la o reducere de până la 25% din masa peretelui celular şi de 3 ori a conţinutului de
chitină, în timp ce nu au existat schimbări majore în nivelul de β-glucani şi manani. Scăderea
conţinutului de chitină ar putea fi cauzată de reducerea activităţii glutamintransferazei (GAT) în
celulele hipoxice, ca urmare a represiunii acestei enzime de către proteinfosfataze a căror
activitate este crescută în condiţii anaerobe [92, 219, 244]. Aceste observaţii sunt în concordanţă

63
cu alte date din literatură, care indică, că drojdiile de bere cultivate la pH 3,5 au dobândit o
rezistenţă mai mare la β-1,3-glucanază, decât cele cultivate la 5,5 şi această rezistenţă a fost
asociată cu inducţia sintezei glicozilfosfatidilinozitol (GFI)-proteinelor peretelui celular [158].
Astfel, optimizând regimul de fermentare, pot fi activizate sistemele metabolice
responsabile de multiplicarea şi biosinteza carbohidraţilor în celula de drojdii. Pentru o
caracterizare mai completă a capacităţii de creştere a tulpinilor S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S.
cerevisiae CNMN-Y-21, scopul cercetărilor în acest subcapitol constă în stabilirea temperaturii,
pH-ului şi duratei de cultivare optime multiplicării şi acumulării carbohidraţilor de către tulpinile
în studiu.
Pentru a studia acţiunea temperaturii de cultivare asupra multiplicării şi biosintezei
carbohidraţilor, au fost cercetate regimurile de temperatură +15, 20, 25 şi 30°C. Tulpinile au fost
cultivate pe mediul nutritiv Rieder modificat (30 g/l glucoză au fost substituite cu 20 g/l melasă),
pH-5,5. Cultivarea s-a realizat pe un agitator rotativ (200 r.p.m.). Mostrele au fost prelevate la
24, 48, 72 şi 96 ore de cultivare.
În rezultatul cercetărilor am stabilit, că temperatura optimă pentru multiplicare este de
+15°C, la care tulpinile cultivate timp de 48 ore (S. cerevisiae CNMN-Y-20) şi 72 ore (S.
cerevisiae CNMN-Y-21) acumulează o cantitate maximală de celule la o unitate de volum.
Majorarea temperaturii de cultivare până la +30ºC induce o încetinire a procesului de
multiplicare a celulelor (figurile 3.13, 3.14).

40
35
celule, 1x 106 ml-1

30
15ºC
25 20ºC
20 25ºC
15 30ºC
10
5
0
0 24 48 72 96
Durata de cultivare, ore

Fig. 3.13. Efectul temperaturii de cultivare asupra multiplicării tulpinii

S. cerevisiae CNMN –Y-20.

Acest fapt poate fi explicat prin creşterea esenţială a concentraţiei compuşilor toxici
(formelor active ale oxigenului ce conţin anioni superoxidanţi, peroxid de hidrogen (H2O2) şi
radicali hidroxili (OH-)) în celulele de drojdii la cultivarea lor la temperaturi înalte. Sinteza

64
acestor compuşi duce la distrugerea membranelor, denaturarea proteinelor şi ADN-ului şi
moartea celulelor [108, 218].

45
40

celule, 1x 106 ml-1

35 15ºC
30
25 20ºC
20 25ºC
15
10 30ºC
5
0
0 24 48 72 96

Durata de cultivare, ore

Fig. 3.14. Efectul temperaturii de cultivare asupra multiplicării tulpinii

S. cerevisiae CNMN –Y-21.

În ansamblu, rezultatele obţinute confirmă datele din literatură, conform cărora

temperaturile scăzute stimulează creşterea şi multiplicarea drojdiilor de vin, iar schimbarea
temperaturii de cultivare duce la modificarea duratei etapelor de dezvoltare a drojdiilor [84, 123].
Referitor la acumularea carbohidraţilor s-a stabilit, că tulpinile S. cerevisiae CNMN –Y-
20 şi S. cerevisiae CNMN –Y-21 manifestă activitate maximală în regimurile de cultivare +20 şi
+25°C (figura 3.15). Majorarea temperaturii de cultivare până la +30°C duce la încetinirea
procesului sintezei hidraţilor de carbon în ambele cazuri. Acest fapt poate fi explicat prin
reducerea activităţii glicoziltransferazelor, responsabile de sinteza polizaharidelor peretelui
celular la drojdii în condiţii de majorare a temperaturii.

Saccharomyces cerevisiae CNMN-Y-20

Saccharomyces cerevisiae CNMN-Y-21
35
Carbohidraţi, % S.U.

30
25
20
15
10
15 20 25 30
Temperatura de cultivare,°C

Fig. 3.15. Influenţa temperaturii de cultivare asupra acumulării carbohidraţilor la tulpinile S.

cerevisiae CNMN –Y-20 şi S. cerevisiae CNMN –Y-21.

65
 În continuare a fost cercetată capacitatea de multiplicare şi de biosinteză a carbohidraţilor la
tulpinile în studiu în condiţii diferite de pH al mediului de cultivare. A fost utilizat mediul nutritiv
Rieder modificat (30 g/l glucoză au fost substituite cu 20 g/l melasă) cu diferite valori ale pH-ului
iniţial: 3,5; 5,5; 6,5; şi 8,0. Temperatura de cultivare a fost menţinută la valoarea de +20°C. Pentru
evaluarea dinamicii schimbării pH-ului mediului nutritiv au fost preluate mostre la 12, 24, 48 şi 72
ore de cultivare.
Din rezultatele cercetărilor (figurile 3.16, 3.17) este evident, că ambele tulpini de drojdii
posedă un puternic mecanism de reglare a pH-ului mediului de cultură, activitatea acestuia fiind
atât mai pronunţată, cu cât este mai nefavorabil pH-ul iniţial al mediului. Stabilizarea valorilor pH-
ului pentru ambele tulpini se produce după 48 ore de cultivare.

9
8
7 pH iniţial-3,5
6 pH iniţial-5,5
pH-ul

5 pH iniţial-6,5
4 pH iniţial-8,0
3
2
1
0 12 24 48 72
Durata de cultivare, ore

Fig. 3.16. Evoluţia în timp a pH-ului mediului de cultivare la tulpina

S. cerevisiae CNMN –Y-20.

7
pH iniţial-3,5
pH-ul

5 pH iniţial-5,5
pH iniţial-6,5
3 pH iniţial-8,0

1
0 12 24 48 72
Durata de cultivare, ore

Fig. 3.17. Evoluţia în timp a pH-ului mediului de cultivare la tulpina

S. cerevisiae CNMN –Y-21.

66
 În literatură se indică, că majoritatea drojdiilor cresc şi se dezvoltă la valorile de pH 3,0 –
8,0. La categoria acestora pot fi raportate şi drojdiile de vin S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S.
cerevisiae CNMN-Y-21. Comparând numărul de celule şi conţinutul de carbohidraţi la drojdiile
cultivate pe mediul Rieder, constatăm o asemănare în ceea ce priveşte atitudinea culturilor faţă
de pH (figurile 3.18, 3.19). pH-ul optim al multiplicării şi biosintezei carbohidraţilor de către
aceste tulpini coincide şi are valoarea de 5,5.
Efectul se explică prin aceea, că la pH 5,5 sunt active majoritatea enzimelor
microorganismului implicate în sinteza substanţelor bioactive şi multiplicarea celulară. Limitele de
pH scăzut, specifice creşterii drojdiilor de vin, diminuează posibilitatea de contaminare bacteriană.

Carbohidraţi Numărul de celule

celule, 1x 106 ml-1

50 29,5
Carbohidraţi, % S.U.

40 29
28,5
30
28
20
27,5
10 27
0 26,5
3,5
1 5,5
2 6,5
3 8,0
4

pH-ul iniţial

Fig. 3.18. Influenţa pH-ului mediului asupra multiplicării celulare şi sintezei carbohidraţilor la
tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20.

Carbohidraţi Numărul de celule

30 34
Carbohidraţi, % S.U.

celule, 1x 106 ml-1

25 32
20
30
15
28
10
5 26
0 24
1
3,5 2
5,5 3
6,5 4
8,0

pH-ul iniţial

Fig. 3.19. Influenţa pH-ului mediului asupra multiplicării celulare şi sintezei carbohidraţilor la
tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-21.

67
 Este cunoscut, că sinteza unui anumit produs la microorganisme este asociată cu fazele
proceselor de creştere. Din aceste considerente este important de a stabili pentru tulpinile de
drojdii selectate, relaţiile dintre procesul de multiplicare a populaţiei şi biosinteză a
carbohidraţilor în dinamică. Cercetările au fost efectuate la cultivarea tulpinilor pe mediul
nutritiv Rieder cu pH-ul 5,5, la temperatura de +20°C, pe un agitator rotativ (200 r.p.m.),
concentraţia O2 în mediu - 7,3 mg/l, timp de 7 zile. La fiecare 24 ore de cultivare au fost
prelevate probe pentru a cerceta multiplicarea tulpinilor şi conţinutul de carbohidraţi în biomasă.
Datele ce reflectă dinamica multiplicării şi biosintezei hidraţilor de carbon ai tulpinilor în
studiu sunt prezentate în figurile 3.20 şi 3.21.

Carbohidraţi Numărul de celule

Carbohidraţi, % S.U.

35 25

celule, 1x 106 ml-1

30 20
25 15
20 10
15 5
10 0
0 24 48 72 96 120 144 168

Durata de cultivare, ore

Fig. 3.20. Dinamica multiplicării şi acumulării carbohidraţilor la tulpina

S. cerevisiae CNMN –Y-20.

Carbohidraţi Numărul de celule

Carbohidraţi, % S.U.

35 25
celule, 1x 106 ml-1

30 20
25 15
20 10
15 5
10 0
0 24 48 72 96 120 144 168

Durata de cultivare, ore

Fig. 3.21. Dinamica multiplicării şi acumulării carbohidraţilor la tulpina

S. cerevisiae CNMN –Y-21.

68
 La analiza rezultatelor obţinute s-a constatat, că la ambele tulpini multiplicarea şi
acumularea biomasei este intensă în primele 48 ore de cultivare, după care aceste procese se
stabilizează şi începe faza staţionară de dezvoltare a culturilor.
O acumulare semnificativă de glucide în biomasa drojdiilor (30,9% S.U. – S. cerevisiae
CNMN-Y-20 şi 27,5% S.U. – S. cerevisiae CNMN-Y-21) se produce începând cu 120 ore de
cultivare submersă, valori care practic nu se modifică pe parcursul următoarelor 48 ore de cultivare.
Majorarea conţinutului de carbohidraţi în biomasă în faza staţionară de dezvoltare a
drojdiilor poate fi explicată prin diminuarea conţinutului de azot în mediul de cultură, fapt ce
duce la stoparea proceselor de multiplicare şi activizarea proceselor biosintetice a
microorganismului şi poate fi considerat o adaptare la condiţiile mediului nutritiv. Aceste date
corelează cu datele altor autori [170].
Aşa dar, culturile S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 posedă
capacitate de a creşte într-un spectru larg de valori ale temperaturii şi pH –ului. Temperatura
optimă de multiplicare a tulpinilor în studiu este de +15°C, iar de biosinteză a hidraţilor de carbon
+20°C.
Tulpinile cercetate posedă un mecanism puternic de autoreglare a pH-ului mediului de
cultivare. pH-ul optim de multiplicare coincide cu cel al biosintezei carbohidraţilor şi are valoarea
de 5.5. Tulpinile în studiu acumulează cantitatea maximală de celule la o unitate de volum după
48 ore de cultivare în profunzime pe mediul Rieder, iar valori maximale ale conţinutului de
carbohidraţi s-au înregistrat în faza staţionară de dezvoltare a acestora după 120 ore de cultivare.

3.3. Elaborarea regulamentului de obţinere din drojdii a bioprodusului Glucolev – 20

În baza principiilor bioactive microbiene se produc diferite tipuri noi de suplimente
alimentare şi furajere. Drojdiile S. cerevisiae, S. carlsbengesis, S. delbruecki şi S. boulardii sunt
folosite la elaborarea unor adaosuri alimentare destinate bolnavilor ce suferă de diferite forme de
hepatită cronică sau acută, cancer, ciroză, hipertonie şi alte maladii. Adaosurile normalizează
nivelul glutamatpiruvattransaminazei, fosfatazei alcaline şi dehidrogenazei şi dau posibilitate de
a obţine rezultate pozitive la tratarea acestor boli [140, 189].
Cu utilizarea biomasei drojdiilor de vin Saccharomyces vini sunt produse o serie întreagă
de preparate cu proprietăţi pre- şi probiotice aşa ca: „Рекицен-РД 100 г”, „Фервитал”,
„Эубикор” şi altele, ce conţin aminoacizi esenţiali, microelemente, vitamine (în special ale
grupei B şi D), pectină şi fibre alimentare. Preparatele sunt recomandate pentru normalizarea
microflorei tractului gastro-intestinal, pentru tratarea sindromului metabolic al obezităţii şi
diabetului, ajută la dispariţia senzaţiilor de greaţă, vomă şi a arsurilor gastrice, posedă acţiune

69
antiinflamatorie accentuată. În caz de procese infecţioase şi imunodeficienţă activizează
segmentul humoral al sistemului imunitar (creşte concentraţia imunoglobulinelor). Preparatele
diminuează nivelul glucozei în sânge şi nivelul colesterinei, măreşte potenţialul antioxidant al
organismului, ajută la procesul de digestie in cazul unor maladii ale ficatului, stomacului şi
intestinelor [58, 139].
Cercetătorii ruşi Abramov şi Cotenco au determinat, că tulpinile Saccharomyces
oviformis Y-2635 şi Saccharomyces vini Ф-5, cultivate pe diverse medii nutritive, au biomasa cu
o valoare biologică înaltă datorită conţinutului sporit de riboflavină, tiamină, acid nicotinic şi
folic [33].
Una din variantele optimale pentru obţinerea preparatelor proteico-vitaminice şi un aspect
important al utilizării drojdiilor este autoliza biomasei lor. Valorile biologică şi nutritivă înalte
ale autolizatelor de drojdii se explică prin faptul, că în timpul procesului de autoliză, sub acţiunea
propriilor fermenţi, are loc distrugerea biopolimerilor drojdiei, ceea ce măreşte accesibilitatea
substanţelor biologic active din biomasă. Alt aspect important al procesului de autoliză constă în
faptul, că pe durata lui are loc distrugerea acizilor nucleici şi repartizarea produselor
descompunerii între fazele lichidă şi solidă ale autolizatului [76].
Producerea preparatelor proteico-vitaminice cu destinaţie furajeră şi alimentară se poate
cumula cu tehnologia de autoliză a drojdiilor şi de obţinere a siropurilor glucozo-galactozice [49].
Reieşind din cele menţionate, scopul cercetărilor în acest subcapitol este elaborarea
regulamentului de cultivare a tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi obţinere din drojdii a
bioproduselor valoroase.
Dat fiind faptul, că în experienţele anterioare au fost stabiliţi parametrii optimi de
cultivare şi sinteză a carbohidraţilor (temperatura, pH-ul iniţial al mediului nutritiv, durata de
cultivare) şi efectele stimulatoare ale unor surse de carbon, acetaţi, compuşi coordinativi asupra
productivităţii şi biosintezei carbohidraţilor, scopul cercetărilor ulterioare constă în elaborarea
unui mediu nutritiv, care ar asigura o cantitate de biomasă maximă cu un conţinut sporit de
carbohidraţi la tulpinia S. cerevisiae CNMN-Y-20.
Pentru rezolvarea obiectivelor propuse, tulpina a fost cultivată în condiţiile prestabilite:
temperatura +20°C, concentraţia O2 în mediu - 7,3 mg/l, pH-ul iniţial - 5,5 durata de cultivare -
120 ore, în 5 variante de medii nutritive cu compoziţia, g/l:
Varianta 1 - melasă – 20,0, (NH4)2SO4 - 3,0, MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl - 0,5, Ca(NO3)2 -
0,4, KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii - 10 ml, apă potabilă 1 l;
Varianta 2 – glucoza – 30,0, (NH4)2SO4 - 3,0, MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl - 0,5, Ca(NO3)2 - 0,4,
KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii - 10 ml, cloruruă de tricloracetat de zinc - 10 mg/l, apă potabilă 1 l;

70
 Varianta 3 – glucoza – 30,0, (NH4)2SO4 - 3,0, MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl - 0,5, Ca(NO3)2
- 0,4, KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii - 10 ml, acetat de zinc - 10 mg/l, apă potabilă 1 l;
Varianta 4 - melasă - 20,0, (NH4)2SO4 - 3,0, MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl - 0,5, Ca(NO3)2 -
0,4, KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii - 10 ml, cloruruă de tricloracetat de zinc - 10 mg/l, apă
potabilă 1 l;
Varianta 5 – melasă-20,0, (NH4)2SO4 - 3,0, MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl - 0,5, Ca(NO3)2 -
0,4, KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii - 10 ml, acetat de zinc - 10 mg/l, apă potabilă 1 l.
Ca mediu de referinţă a servit mediul Rieder.
Rezumând rezultatele prezentate în figura 3.22 putem concluziona că productivitatea şi
conţinutul maximal de carbohidraţi 4,9 g/l BAU şi respectiv 44,6% S.U. (ceea ce este cu 63,3%
şi respectiv 44,3% mai mult faţă de varianta martor) a tulpinii se realizează pe mediul în
compoziţia căruia au fost incluse melasa (20 g/l) şi compusul coordinativ cloruruă de
tricloracetat de zinc (10 mg/l) - varianta 4 de mediu.

Carbohidraţi Productivitate

50 6
Carbohidraţi, % S.U.

45 5
40 4

BAU, g/l
35 3
30 2
25 1
20 0
Martor 1 2 3 4 5
(Rieder)
Variantele mediului de cultivare

Fig. 3.22. Productivitatea şi conţinutul de carbohidraţi la drojdia S. cerevisiae CNMN-Y-20 la

cultivare submersă în condiţiile prestabilite pe medii cu diferită compoziţie biochimică.

Rezultatele obţinute experimental demonstrează influenţa factorilor de mediu asupra

multiplicării şi activităţii vitale a celulei microbiene şi reacţionarea acesteia prin modificări de
biosinteză şi a duratei etapelor de dezvoltare. Corelarea dată prezintă un mecanism puternic de
reglare a relaţiilor ,,microorganism - mediu,, şi creează posibilităţi de orientare a proceselor
metabolice la drojdii în scopuri de utilizare practică.
Efectul pozitiv manifestat de influenţa simultană a tuturor factorilor fizico-chimici
permite de a propune un procedeu nou de cultivare dirijată a drojdiilor şi obţinere a biomasei cu
conţinut sporit de carbohidraţi. Schema de realizare a procedeului este prezentată în figura 3.23.

71
 Procedeul propus prevede cultivarea submersă a tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 –
producător activ de carbohidraţi, pe mediul cu următoarea compoziţie g/l: (NH4)2SO4 - 3,0,
MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl - 0,5, Ca(NO3)2 - 0,4, KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii - 10 ml,
melasă - 20,0, clorură de tricloracetat de zinc - 10 mg/l, apă potabilă 1 l, pH- 5,5.
Procesul de cultivare decurge conform parametrilor optimizaţi: temperatura mediului
în timpul procesului de cultivare se menţine +200C, pH-ul iniţial al mediului 5,5, durata
procesului de cultivare 120 ore, agitare permanentă.

Prepararea mediului de cultivare în

baza mediului Rieder (în care 30
g/l glucoză se substituie cu 20 g/l
melasă). Sterilizare la 1210C,
timp de 30 minute, la 1,0 +10 mg/l clorură de tricloracetat
atmosferă. de zinc (condiţii sterile).

Inocularea S. cerevisiae CNMN-Y-20,

50 ml/l

Cultivare la temperatura +20°C, pH-

ul iniţial al mediului - 5,5, Prepararea inoculumului (1,5-2 x106 ml-1 celule)
concentraţia O2 în mediu - 7,3 mg/l, prin cultivarea S. cerevisiae CNMN-Y-20 pe mediu
must de malţ lichid timp de 48 ore, t+20°C
durata cultivării 120 ore.

Biomasa Determinarea
Centrifugare
carbohidraţilor

Lichidul cultural

Fig.3.23. Schema realizării procedeului de obţinere a biomasei de drojdii cu conţinut

sporit de carbohidraţi.

Avantajul procedeului constă în majorarea productivităţii tulpinii S. cerevisiae

CNMN-Y-20 cu 63,3% şi a conţinutului de carbohidraţi cu 44,3% faţă de procedeul martor.
Reieşind din cele menţionate şi în baza rezultatelor cercetărilor s-a elaborat
tehnologia de obţinere a bioprodusului Glucolev - 20 cu conţinut sporit de carbohidraţi.
Schema tehnologică de obţinere a bioprodusului Glucolev – 20 este prezentată în figura 3.24.
Tehnologia propusă e bazată pe:
٠Utilizarea tulpinii de drojdie S. cerevisiae CNMN-Y-20 cu potenţial înalt de
biosinteză a carbohidraţilor.

72
٠Cultivarea tulpinii producătoare conform procedeului de cultivare submersă ce
include:
- utilizarea la etapa fermentării a melasei şi clorurei de tricloracetat de zinc;
- utilizarea parametrilor de temperatură, pH, durata de cultivare, optimizaţi pentru
producătorul dat;
- obţinerea a 4,7...5,0 g/l biomasă uscată cu un conţinut de carbohidraţi de
44,2...45,3% S.U., proteină 39,2...40,0% S.U., lipide 7,0...8,0% S.U.;
٠Separarea biomasei de lichidul cultural.
٠Autoliza biomasei de drojdii conform procedeului elaborat [17, 19].
٠Uscarea produselor.
٠Determinarea compoziţiei biochimice.
٠Ambalarea, marcarea bioproduselor.

Cultivarea submersă a producătorului

pe mediul nutritiv cu parametrii fizico-
chimici optimizaţi timp de 120 ore.

Separarea biomasei de lichidul cultural prin

centrifugare la 3000 r.p.m., timp de 20 min.

Biomasa
Prepararea suspensiei biomasă:apă (1:4) după
substanţă uscată
Lichid cultural,
Concentrare prin
evaporare la +60-
65°C în vid, sterilizare Autoliza suspensiei la +55°C
timp de 1 oră la 1 atm. timp de 8-12 ore cu adăugare
a 3-5 ml acid acetic la 1 l de
suspensie

Bioprodusul Uscarea autolizatului până la

Glucolev - 20 greutate constantă la +60°C în vid.

Dozarea, ambalarea,
Determinarea compoziţiei
marcarea bioproduselor
biochimice

Fig. 3.24. Schema tehnologică de obţinere a bioprodusului Glucolev – 20.

73
 • Caracteristica producătorului
Tulpina de drojdie S. cerevisiae CNMN-Y-20, selectată din sedimente de vin roşu,
este depozitată în Colecţia Naţională de Microorganisme Nepatogene şi brevetată ca
producător de β-glucani [4].
Proprietăţile morfologice, culturale şi fiziologice ale tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-
20 sunt descrise în subcapitolul 3.1.
• Descrierea procesului de cultivare dirijată a drojdiei S. cerevisiae CNMN-Y-
20 şi obţinere a bioprodusului Glucolev – 20
Procesul constă din trei etape de bază:
I – Obţinerea materialului semincer (inoculum).
II – Procesul de cultivare submersă a drojdiei şi biosinteză a carbohidraţilor.
III – Obţinerea produsului finit.

I. Obţinerea materialului semincer (inoculum)

Materialul semincer se cultivă în două generaţii:
I - în tuburi pe medii agarizate;
II - în baloane cu medii lichide.
a) Cultivarea materialului semincer în tuburi cu gel înclinat
S. cerevisiae CNMN-Y-20 se însămânţează în tuburi cu must de malţ agarizat. Mediul
pregătit se toarnă câte 6-7 ml în tuburi cu volumul de 13 ml, se sterilizează în autoclav la
temperatura de 115-118°C timp de 25 minute. După sterilizare, mediul din tub se înclină.
Însămânţarea în tuburi se efectuează transferând celulele de pe suprafaţa mediului
solid cu ajutorul ansei. Tuburile se incubează la temperatura de 20°C, 5 zile, după ce cultura
poate fi folosită ca material semincer pentru cultivare în baloane.
Materialul semincer se păstrează pe must de malţ agarizat în frigider la temperatura de
+ 4...+5°C, pe parcursul a 1-2 luni.
Fiecare lot de material semincer trebuie să fie paşaportizat. Pe tub se indică:
٠Denumirea drojdiilor;
٠Numărul lotului şi data pregătirii;
٠Data controlării lotului şi activitatea biosintetică;
٠Rezultatele controlului acestui lot asupra prezenţei sau lipsei microflorei străine;
٠Termenul valabilităţii.
b) Cultivarea materialului semincer în baloane

74
 Pentru obţinerea inoculatului în baloane se utilizează cultura de drojdii S. cerevisiae
CNMN-Y-20, cultivată anterior pe mediul agarizat înclinat.
Cultivarea are loc în baloane Erlenmeyer cu volumul 500 ml, a câte 100 ml mediu
lichid must de malţ, care se sterilizează la 112-1150C timp de 30 minute.
Materialul semincer se cultivă pe parcursul a 48 ore, pe agitator rotativ (200 r.p.m.) la
temperatura +200C.
Calitatea materialului semincer se controlează prin microscopie sau recoltându-l în
bulionul nutritiv. Apariţia spumei excesive ne indică infectarea culturii de drojdii.
Materialul semincer steril (maiela) cultivat în baloane (inoculum) poate fi utilizat
timp de 10 zile, se păstrează la temperatura de +4 +60C în frigider.

II. Procesul de cultivare submersă a drojdiilor şi biosinteză a carbohidraţilor

Procesul tehnologic constă din următoarele etape:
٠Pregătirea baloanelor pentru cultivare;
٠Pregătirea mediului nutritiv steril;
٠Însămânţarea culturii de drojdii pe mediul nutritiv;
٠Cultivarea submersă a producătorului
a) Pregătirea baloanelor pentru cultivare
Baloanele Erlenmeyer cu volumul 1000 ml destinate cultivării preventiv se
sterilizează 1 oră la temperatura de 160°C.
b) Pregătirea mediului nutritiv steril
Pentru cultivarea submersă a culturii S. cerevisiae CNMN-Y-20 se utilizează mediul
cu următoarea compoziţie g/l: melasă - 20,0, (NH4)2SO4 - 3,0, MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl -
0,5, Ca(NO3)2 - 0,4, KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii - 10 ml, clorură de tricloracetat de
zinc - 10,0 mg/l, apă potabilă 1 l, pH- 5,5. Procesul de sterilizare la 1210C, timp de 30
minute, la 1,0 atmosferă.
c) Însămînţarea culturii de drojdii pe mediul nutritiv
Inoculumul se adaugă în mediul nutritiv sterilizat şi răcit în volum de 5-10 % din
volumul mediului de fermentare aproximativ 1,5-2 x106 ml-1 celule.
d) Cultivarea submersă a producătorului
Procesul de cultivare decurge conform următorilor parametri:
٠Temperatura mediului în timpul procesului de cultivare se menţine +200C;
٠pH-ul iniţial al mediului 5,5;
٠Durata procesului de cultivare 120 ore, agitare permanentă;

75
 ٠Nu se permite poluarea cu microfloră străină.

III. Obţinerea produsului finit

Procesul tehnologic constă din următoarele etape:
٠Separarea biomasei celulare de lichidul cultural prin centrifugare;
٠Autoliza biomasei;
٠Concentrarea şi sterilizarea lichidului cultural;
٠Uscarea biomasei autolizate;
٠Determinarea compoziţiei biochimice a bioproduselor;
٠Dozarea, ambalarea, marcarea bioproduselor.
a) Separarea biomasei celulare de lichidul cultural
La finalul procesului de cultivare, se efectuează separarea biomasei de drojdii de
lichidul cultural, prin centrifugare, timp de 20 minute la 3000 (r.p.m.).
b) Autoliza biomasei
Autoliza biomasei se petrece conform procedeului descris în [17, 19].
c) Concentrarea şi sterilizarea lichidului cultural
Lichidul cultural colectat în condiţii aseptice se concentrează la temperatura de 60-
65°C pentru a mări concentraţia substanţelor biologic active la un volum de lichid şi se
sterilizează prin autoclavare timp de 1oră la 1 atm.
d) Uscarea biomasei autolizate
Biomasa autolizată se usucă până la greutate constantă la +60-65°C.
e) Determinarea compoziţiei biochimice a bioproduselor
Cu utilizarea metodelor biochimice se determină compoziţia bioproduselor.
f) Dozarea, ambalarea, marcarea bioproduselor
Bioprodusul se ambalează steril în pachete a câte 3 sau 5 g. Se indică denumirea,
destinaţia, condiţiile şi termenul de păstrare.

Caracteristica biochimică a bioprodusului Glucolev – 20

Bioprodusul Glucolev – 20 se caracterizează prin conţinut înalt de carbohidraţi
(44,2% S.U.) (figura 3.25). Din conţinutul sumar de carbohidraţi circa 77,3% revin β-
glucanilor, circa 11,5% mananilor, valorile celorlalte fracţii de glucide oscilează între
5,2 şi 5,9% din suma fracţiilor (figura 3.26).

76
 Proteină
Carbohidraţi
Lipide

9,5%
7,1%
39,2%

44,2%

Fig. 3.25. Compoziţia biochimică a bioprodusului Glucolev – 20, % S.U.

5,2%
11,5%
5,9%

77,3%

Fracţia solubilă în H2O (mono-dizaharide) Fracţia solubilă în 3% NaOH (mananproteine)

Fracţia solubilă în 2% H2SO4 (glicogen) Fracţia insolubilă în alcali şi acizi (β-glucani)

Fig. 3.26. Componenţa fracţionară a carbohidraţilorlor bioprodusului

Glucolev – 20, % din suma fracţiilor.

O parte semnificativă a bioprodusului Glucolev – 20 o constituie proteinele,

alcătuind 39,2% S.U. (figura 3.25), care se caracterizează printr-un conţinut bogat de
aminoacizi esenţiali - 36,8% şi imunoactivi - 56,1% din suma aminoacizilor identificaţi.
Se poate evidenţia conţinutul înalt de aminoacizi esenţiali: valina, treonina, leucina,
lizina şi imunoactivi: glicina, alanina, serina, acid asparagic şi glutamic (tabelul 3.6).
A treia componentă majoră a bioprodusului o constituie lipidele, conţinutul
cărora este de 7,1% S.U. (figura 3.25), inclusiv acizii graşi nesaturaţi: palmitoleic C 16:1
– 56,2% şi oleic C 18:1 – 31,0% din suma acizilor graşi.

77
 Tabelul 3.6. Conţinutul de aminoacizi în bioproprodusul Glucolev – 20, % din sumă
Aminoacizii Conţinutul, %
Acidul cisteinic 0,6
Taurina 0,3
Acidul asparagic** 11,8
Treonina* 4,8
Serina** 5,3
Acidul glutamic** 27,1
Prolina 3,2
Glicina** 5,1
Alanina** 5,9
Valina* 4,5
Cisteina** 0,9
Metionină* 0,1
Izoleucina* 3,9
Leucina* 6,5
Tirozina* 3,1
Fenilalanina* 3,6
Triptofan* 1,0
Ornitina 0,2
Lizina* 8,0
Histidina 2,8
Arginina* 1,3
* - aminoacizi esenţiali; ** - aminoacizi imunoactivi.

Aşadar analiza comparativă a compoziţiei biochimice şi efectele benefice ale produselor

glucidice estimate în literatura de specialitate [125, 152], asemănătoare cu cea a bioprodusului
Glucolev -20, ne permite să propunem bioprodusul obţinut prin tehnologia elaborată, pentru
utilizare în industria farmaceutică ca aditiv alimentar şi preparat nutraceutic.

3.4. Concluzii la capitolul 3

٠Culturile de drojdii izolate din sedimentele de vin prezintă un nivel variat al conţinutului
de carbohidraţi în biomasă, cuprins între 10,6 – 30,5% S.U. şi caractere morfo-culturale diferite
la cultivare pe mediul cu must de malţ agarizat.
٠Tulpinile de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 cultivate pe
mediu Rieder se caracterizează prin valori înalte ale conţinutului de carbohidraţi (33,5 şi 30,5%
S.U. respectiv) şi conţinut înalt de β-glucan, valorile căruia ajung la 21,0 - 22,6% S.U. şi
reprezintă obiecte de perspectivă pentru biotehnologie.

78
 ٠Drojdiile S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 metabolizează
eficient melasa, fructoza, glucoza şi zaharoza. Primele 2 asigură o creştere activă şi o acumulare
semnificativă de carbohidraţi, iar ultimele influenţează pozitiv numai procesul de biosinteză a
carbohidraţilor.
٠Pentru cultivarea tulpinii de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 în scopul majorării
productivităţii şi conţinutului de carbohidraţi în biomasă, în calitate de sursă de carbon şi energie
este adecvată utilizarea melasei în concentraţie de 20 g/l sau fructozei în concentraţie de 60 g/l, şi
a melasei în concentraţie de 20 g/l sau fructozei în concentraţie de 40 g/l pentru tulpina S.
cerevisiae CNMN-Y-21.
٠Compusul coordinativ clorură de tricloracetat de zinc în concentraţie de 10 mg/l se
manifestă în calitate de stimulator specific al multiplicării şi sintezei carbohidraţilor la cultivarea
submersă a tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20.
٠Acetatul de zinc în concentraţie de 10 şi 20 mg/l prezintă efect de stimulare cu 14...26% a
biosintezei carbohidraţilor la tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20.
٠Culturile S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 posedă capacitatea de a
creşte într-un spectru larg de valori ale temperaturii şi pH –ului. Temperatura optimă de
multiplicare a tulpinilor în studiu este de +15°C, de biosinteză a hidraţilor de carbon +20°C,
durata de cultivare 120 ore.
٠Combinarea aplicării surselor de carbon preferenţiale şi stimulatorilor cu varierea
condiţiilor de cultivare (temperatura, pH) permite de a spori esenţial (cu 44,3%) conţinutul
carbohidraţilor la tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20.
٠Regulamentul de cultivare a tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 permite valorificarea
maximală a potenţialului biosintetic şi asigură obţinerea concomitentă a 2 bioproduse valoroase:
Glucolev -20 (biomasă de drojdii autolizată) şi concentratul lichidului cultural.
Problema ştiinţifică soluţionată în acest capitol a constat în selectarea tulpinilor înalt-
productive de drojdii din sedimentele de vin şi evidenţierea factorilor care asigură un nivel optim
al productivităţii şi acumulării carbohidraţilor în biomasă.

79
 4. OBŢINEREA BIOPRODUSELOR VALOROASE DIN DROJDIILE
SEDIMENTELOR DE VIN
Drojdiile din sedimentele de vin sunt considerate deşeuri ale industriei vinicole şi nu
sunt valorificate. În Republica Moldova numai 70% din materia primă se foloseşte pentru
obţinerea produsului final, iar 30% din cauza lipsei tehnologiilor de utilizare a deşeurilor se
pierd. Anual cantitatea totală a acestor pierderi constituie 100-200 mii tone. Anume deşeurile
constituie problema ecologică principală a industriei vinicole. Realizările tehnico-ştiinţifice
actuale permit de a găsi căi de utilizare a deşeurilor de la vinificaţie cu obţinerea unui profit
economic uneori mai înalt decât profitul de la producerea vinului şi rezolvarea multor
probleme ecologice [8].
Actualitatea utilizării deşeurilor industriei vinicole se datorează cerinţelor crescânde
înaintate problemei de utilizare a drojdiilor de la vinificaţie şi perspectivei elaborării
preparatelor ecologic pure cu valoare biologică şi nutritivă înaltă, în special pentru domeniul
alimentar, farmaceutic, de cosmetice, agricol.
Drojdiile de vin, care după recuperarea alcoolului sunt aruncate, pot servi ca o
excelentă sursă de bioproduse deosebit de valoroase (concentrate proteico–vitaminice bogate
în aminoacizi esenţiali şi imunoactivi, lipide, bogate în acizi graşi polinesaturaţi, ergosterol -
provitamina D, glucide, etc.). Produsele din drojdiile de vin pot fi obţinute la un preţ
convenabil pentru a putea fi acceptate de potenţialii beneficiari.

4.1. Procedee de obţinere a unor fracţii glucidice din drojdiile sedimentelor de vin
În prezent, carbohidraţii sintetizaţi de microorganisme sunt utilizaţi pe larg în diferite
sfere de activitate a societăţii: medicină, cosmetologie, industria farmaceutică, alimentară, alte
domenii. Utilizarea pe larg a carbohidraţilor microbieni este determinată de proprietăţile lor:
viscozitate, caracterele reologice, capacitatea de gonflare, specificul de interacţiune cu structuri
determinante.
În farmaceutică polizaharidele se utilizează ca substrat pentru pregătirea
medicamentelor: emulgatori sau stabilizatori ai suspensiilor, agenţi de adeziune a
componentelor în comprimate, etc. Polizaharidele asigură stabilitatea şi rezistenţa îndelungată
a produselor terapeutice. Totodată, polizaharidele pot fi aplicate ca remedii medicamentoase.
Produsul „Zimozan”, sub formă de suspensie de polizaharide extrase din drojdiile S. cerevisiae
(ca substanţă activă se prezintă glucanii), se utilizează pentru stimularea leucopoiezei [236]. Β-
glucanii posedă proprietăţi imunomodulatoare pronunţate [113, 142, 180].

80
 Mananii extraşi din drojdia Rhodotorula rubra sunt componentul de bază la producerea
remediului terapeutic „Ronassan”, care micşorează conţinutul de colesterol şi trigliceride în serul
sanguin, îmbunătăţeşte indicii imunologici [48].
Polizaharidele microbiene sunt utilizate ca gelifianţi la prepararea produselor cosmetice: în
creme, şamponuri, loţiuni, ca tampon hidrofil şi substanţă gonflabilă. Firma „Skincode” a brevetat
şi utilizează în toate tipurile de produse cosmetice produsul, extras din drojdiile de panificaţie cu
substanţa activă glucan (carboximetilglucan), ce posedă activitate de stimulare a mecanismelor de
protecţie a pielii. β-1-3-glucanii se utilizează la tratamentul bolilor pielii [111, 216].
În alimentaţie polizaharidele se utilizează, sub formă de peliculă, pentru produsele
alimentare (caşcaval), în calitate de stabilizator la fabricarea îngheţatei, la producerea sucurilor
de fructe, ca agenţi de viscozitate a siropurilor şi gemurilor, altor produse culinare [227].
Importanţa practică a polizaharidelor microbiene necesită studii detaliate privitor la
componenţa calitativă şi cantitativă a lor.
La microorganisme, în dependenţă de specie, conţinutul de carbohidraţi variază de la 20
la 60%. Spre exemplu, polizaharidele peretelui celular al S. cerevisiae constituie aproximativ
90% din masa peretelui celular. Compoziţia biochimică a carbohidraţilor peretelui celular al
drojdiilor poate varia în funcţie de specie, condiţii şi medii de cultivare, alţi factori,
componentele majore fiind glucanii, mananproteinele şi chitina [34, 36].
Pentru extragerea diferitor clase de carbohidraţi se utilizează diferite procedee. Glucanii
şi mananii parietali din drojdiile de vin, care se deosebesc prin solubilitatea în apă, alcalii şi
acizi, pot fi extraşi din pereţii celulari prin metoda alcali-acidă [12].
Mai multe fracţii polizaharidice din celulele drojdiei Rh. rubra au fost extrase după o
schemă elaborată prin utilizarea hidroxidului de sodiu şi etanolului [72].
Studiul realizat asupra relevării şi separării carbohidraţilor algali a permis extragerea
fracţionată a mono- şi dizaharidelor solubile în alcool, a fracţiei carbohidraţilor hidrosolubili,
fracţiei polizaharidelor de tipul hemicelulozei şi pectinei, fracţiei polizaharidelor de tipul
celulozei [28].
Posibilităţile de utilizare practică a polizaharidelor microbiene şi metodele de obţinere a
unor fracţii de carbohidraţi din drojdii nu sunt pe deplin elucidate. Studiul detaliat al
carbohidraţilor microbieni va deschide noi perspective şi va contribui la lărgirea posibilităţilor
industriei microbiologice.
Scopul cercetărilor în acest subcapitol constă în stabilirea metodelor eficiente de extracţie
a carbohidraţilor din drojdiile de la vinificaţie şi identificarea componenţei calitative a acestora.

81
 Ca obiect de studiu au servit drojdiile din sedimentele de vin roşu (Cabernet) şi alb
(Chardonnay), oferite de Institutul Naţional de Viticultură şi Vinificaţie în anul 2008.
Determinarea substanţei uscate, conţinutul sumar de carbohidraţi, extragerea fracţionată,
purificarea şi conţinutul calitativ al carbohidraţilor au fost efectuate prin metodele descrise în
capitolul 2.
Pentru început a fost studiat conţinutul sumar de carbohidraţi în biomasa drojdiilor din
sedimentele de vin. S-a determinat că drojdiile provenite de la vinul roşu conţin 23,2±0,13%
S.U. de carbohidraţi, iar cele provenite de la vinul alb - 31,1±0,54% S.U. Drojdiile din
sedimentele cercetate în anii precedenţi conţineau 28,4±0,31% S.U. carbohidraţi pentru cele
provenite de la vinul roşu şi 33,6±0,43% S.U. - pentru cele de la vinul alb.
Ţinând cont de rezistenţa mecanică deosebită a peretelui celular al drojdiei de vin,
biomasa microbiană a fost supusă unor tratamente pentru spargerea peretelui celular şi eliberarea
conţinutului acestuia. Aceste tratamente au inclus:٠autoliza drojdiilor,٠dezintegrarea cu
ultrasunet.
٠Autoliza a fost efectuată conform procedeului elaborat şi descris [17, 19], care constă
din 2 etape:
٠Purificarea sedimentelor: a) spălarea biomasei de drojdii cu apă în proporţie de 1:3,
timp de 10-15 minute. Decantarea fazei lichide. b) spălarea biomasei de drojdii cu soluţie de
bicarbonat de sodiu de 1 % sau 5 % în proporţie de 1:3, urmată de separarea biomasei de la
supernatant prin decantare.
٠Autoliza drojdiilor. Prevede utilizarea drojdiilor proaspete sau păstrate în stare
congelată, purificarea sedimentelor prin spălare cu apă sau soluţie de 1% de NaCl (în volum 1:3),
efectuarea autolizei drojdiilor (biomasă:apă - 1:4 după substanţă uscată) timp de 8 ore, având ca
factor de inducţie acidul acetic glacial (3 sau 5 ml la 1 l suspensie drojdii) şi temperatura de
+550C.
٠Dezintegrarea biomasei de drojdii prin ultrasonare a fost efectuată la frecvenţa de 22
Hz timp de 1, 2 şi 3 minute. Metoda prevede utilizarea drojdiilor proaspete sau păstrate în stare
congelată. Biomasa de drojdii se diluează cu apă distilată în raport de 1:3 pentru sporirea
eficacităţii procesului de distrugere a pereţilor celulari.
Conţinutul de carbohidraţi a fost determinat în autolizatul integral şi în fracţia pereţilor
celulari separată de supernatant prin centrifugare.
Din analiza rezultatelor obţinute se vede, că în biomasa de drojdii dezintegrată cu
ultrasunet timp de 2 minute se conţin 45,7% S.U. de carbohidraţi pentru drojdiile de la vinul roşu
şi 41,9% S.U. - pentru cele de la vinul alb. Autoliza biomasei la temperatura de 550C cu

82
adăugarea acidului acetic de asemenea duce la rezultate bune, conţinutul de carbohidraţi
ajungând în drojdiile de la vinul roşu până la 42,7% S.U., şi în cele de la vinul alb - până la
48,4% S.U. În fracţia pereţilor celulari s-a determinat o cantitate de glucide mai mică comparativ
cu fracţia integrală, ceea ce poate fi explicat prin absenţa mono- şi dizaharidelor, care sunt
eliminate cu faza lichidă. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4.1.

Tabelul 4.1. Conţinutul de carbohidraţi în drojdiile sedimentelor vinicole supuse autolizei şi

dezintegrării cu ultrasunet, (% S.U. X1± x1)
Fracţia Drojdii din sedimente de la vinul roşu Drojdii din sedimente de la vinul alb
Autoli Autoliza Ultra Ultra Ultra Autoli Autoliza Ultra Ultra Ultra
za 550C+ sunet sunet sunet za 550C+ sunet sunet sunet
0 0
55 C acid 1 min 2 min 3 min 55 C acid 1 min 2 min 3 min
acetic acetic
Integra 40,8± 42,7± 38,5± 45,7± 42,9± 45,2± 48,4± 42,6± 41,9± 37,5±
lă 0,01 0,33 1,40 1,89 0,01 1,80 0,87 0,98 0,01 1,61
Pereţi 28,2± 29,6± 23,1± 42,5± 30,0± 36,9± 36,7± 36,2± 38,9± 32,3±
celulari 0,85 0,57 0,57 0,79 0,01 0,90 0,29 1,21 2,12 1,99

Astfel, rezultatele au condus la concluzia, că maximumul de eficienţă a spargerii celulei se

obţine prin ambele procedee. Dar, deoarece din punct de vedere economic procesul de autoliză este
mai puţin costisitor, ca metodă de distrugere a pereţilor celulari al drojdiilor din sedimente de vin
se propune autoliza la +550C cu adăugarea acidului acetic (5 ml la 1l de suspensie).
Unii autori relatează despre prezenţa la drojdii a diferitor fracţii de carbohidraţi,
predominante fiind mananii şi glucanii. Conform informaţiilor despre structura peretelui celular
al drojdiilor, în stratul exterior se află proteomananii solubili în alcalii, iar stratul interior
insolubil în alcalii este prezentat de microfibre de chitină asociată cu β-1,3, 1,6 glucani [172].
În baza acestor argumente, dar şi din necesitatea de a stabili prezenţa tuturor grupelor de
carbohidraţi, în cercetările noastre ca bază au fost utilizate 2 metode de extracţie, prima propusă
de Tihomirova (1998), care prevede extracţia cu alcool, apă şi alcalii a carbohidraţilor din
drojdiile genului Rhodotorula [72], şi a doua aplicată de Rudic et al. (2008), conform căreia
extracţia fracţionată a complexului de carbohidraţi din alge se efectuează cu apă, alcool şi acid
sulfuric [28], metodele fiind ajustate de noi pentru drojdiile de la vinificaţie.
În primul set de experienţe, fracţiile de carbohidraţi din drojdiile sedimentelor de vin au
fost obţinute conform schemei descrise în figura 4.1, fiind aplicate procedee de extragere cu
alcool, apă şi alcalii. Ca material de lucru a servit biomasa drojdiilor din sedimentele de vin
păstrată la congelator -180C, decongelată, spălată 1-2 ori cu apă în raport de 1:3, timp de contact
15 min. şi biomasa drojdiilor supusă adăugător autolizei în termostat la + 550C, în prezenţa
acidului acetic (5ml la 1 l de suspensie), timp de 8 ore, cu agitare periodică.

83
 Drojdii de la vinificaţie congelate
/decongelate sau autolizate

Extracţia cu alcool etilic 80%, raport

1:2, 70-800C, 15 min. (3 ori)

Precipitat Supernatant. Fracţia I

Extracţia cu apă, raport 1:2, Carbohidraţi extraşi cu

40-450C, 10 min. 3 ori
alcool

Precipitat
Supernatant. FracţiaII

Extracţia cu NaOH 3%, raport Carbohidraţi extraşi cu apă

1:3, 1000C, 1 oră

Precipitat. Fracţia IV Supernatant. Fracţia III

Carbohidraţi insolubili în Carbohidraţi solubili în

alcalii alcalii

Fig. 4.1. Schema extracţiei fracţionate cu alcool, apă şi alcalii a carbohidraţilor din
biomasa drojdiilor de la vinificaţie, după Tihomirova [72].

Procedeul de extragere fracţionată a complexului de carbohidraţi se desfăşoară conform

operaţiunilor tehnologice: probele se prelucrează cu alcool etilic de 80 % în raport de 1:2, pe baie
de apă 70-800C, timp de 15 min. se supun centrifugării la 6000 r.p.m. timp de 20 min. Procedura
se repetă de 3 ori, supernatantele se reunesc. Aceasta este fracţia I. Sedimentul rezultat se
tratează cu apă distilată în raport de 1:2 pe baie de apă 40-450C, timp de 10-15 min. şi se
centrifughează la 6000 r.p.m. timp de 20 min. Procedura se execută de 3 ori, supernatantele unite
formează fracţia II.
În continuare sedimentul rezultat este tratat cu NaOH 3%, raport 1:3, pe baie de apă la
0
100 C, timp de 1 oră (pentru extragerea proteomananilor). Probele se centrifughează la 6000
r.p.m. timp de 20 min. În continuare precipitatul se spală de 2 ori cu apă distilată şi se
centrifughează. Supernatantele reunite se neutralizează cu acid acetic glacial, se centrifughează şi

84
se obţine fracţia III solubilă în alcalii, care conform informaţiilor din literatură conţine proteo-
manani [12].
Sedimentul rezultat de la extracţia cu NaOH 3% constituie fracţia IV insolubilă în alcalii.
Conform unor surse bibliografice de specialitate [12, 143], această fracţie insolubilă în alcalii
este constituită din glucani fibrilari.
În rezultatul analizei colorimetrice cu reactivul antron a fracţiilor obţinute din drojdiile
congelate/decongelate s-a constatat, că fracţia IV insolubilă în alcalii este fracţia majoră a glucidelor
drojdiilor, care constituie 17,7% S.U. pentru drojdiile provenite de la vinul roşu şi 24,8% S.U. pentru
cele provenite de la vinul alb. Fracţia III a carbohidraţilor solubili în alcalii la drojdiile provenite de la
vinul roşu constituie 3,0% S.U. La drojdiile provenite de la fermentaţia vinului alb această fracţie
constituie 4,5% S.U. Împreună aceste 2 fracţii constituie circa 92% din suma carbohidraţilor la
drojdiile de la vinul roşu şi circa 96% la drojdiile de la vinul alb. Rezultatele sunt prezentate în
tabelul 4.2.

Tabelul 4.2. Componenţa fracţionară a carbohidraţilor din drojdiile sedimentelor de vin

congelate/decongelate obţinute prin extracţie cu alcool, apă şi alcalii, după Tihomirova [72]
№ Fracţia Drojdii din sediment de Drojdii din sediment de
la vinul roşu la vinul alb
% S.U. X1±x2 % din Σ % S.U. X1±x2 % din Σ
fracţiilor fracţiilor
I Alcoolsolubilă 1,3±0,05 5,7 0,9±0,07 2,8
II Hidrosolubilă 0,4±0,07 1,9 0,3±0,01 1,0
III Solubilă în alcalii 3,0±0,03 13,5 4,5±0,33 14,7
IV Insolubilă în alcalii 17,7±0,31 78,8 24,8±0,99 81,4
V Σ Fracţiilor 22,5±0,15 100 30,5±0,6 100

În tabelul 4.3 sunt expuse rezultatele analizei fracţiilor similare, obţinute din drojdiile
supuse autolizei. Ca şi în cazul precedent, majoră este fracţia IV insolubilă în alcalii, constituind
31,7% S.U pentru drojdiile provenite de la vinul roşu şi 35,0% S.U. pentru cele de la vinul alb.
Aceste valori, cât şi ale celorlalte fracţii sunt de 1,5-2 ori mai mari ca în cazul drojdiilor nesupuse
autolizei, ceea ce denotă eficacitatea autolizei ca metodă de distrugere a pereţilor celulari.
În următorul set de experienţe, pentru extracţia fracţionată a complexului de carbohidraţi
ca bază a fost utilizată metoda fracţionării în 4 etape cu utilizarea alcoolului, apei şi acidului
sulfuric aplicată pentru alge de Rudic şi coaut. [28] şi ajustată de noi pentru drojdii. Ca material

85
de lucru a servit biomasa drojdiilor din sedimentele de vin, păstrată la congelator -180C, spălată
şi supusă aceloraşi tratamente ca şi în setul precedent de experienţe.

Tabelul 4.3. Componenţa fracţionară a carbohidraţilor din drojdiile sedimentelor de vin supuse
autolizei obţinute prin extracţie cu alcool, apă şi alcalii, după (Tihomirova 1998) [72]
№ Fracţia Drojdii din sediment de Drojdii din sediment de
la vinul roşu la vinul alb
% S.U. X1±x2 % din Σ % S.U. X1±x2 % din Σ
fracţiilor fracţiilor
I Alcoolsolubilă 2,8±0,03 6,8 4,6±0,65 9,4
II Hidrosolubilă 2,0±0,01 5,0 2,9±0,01 5.8
III Solubilă în alcalii 4,1±0,09 10,1 6,5±0,42 13,2
IV Insolubilă în alcalii 31,7±0,56 78,1 35,1±0,7 71,5
V Σ Fracţiilor 40,7±0,48 100 49,0±0,36 100

Fracţionarea biomasei de drojdii a fost executată în 4 etape. La prima etapă au fost extrase mono-
şi dizaharidele cu alcool etilic de 80 %, în raportul 1:2, pe o baie de apă, la temperatura +70-800C, timp de
15 min., după ce amestecul a fost centrifugat la 6000 r.p.m. Procedura a fost efectuată de 3 ori,
supernatantele s-au reunit - fracţia I. Precipitatul a fost tratat cu apă caldă în raportul 1:2, pe o baie de apă
la temperatura +40-450C, timp de 10-15 min., după care a fost centrifugat. Procedura a fost repetată de 3
ori, supernatantele s-au reunit. Astfel, a fost obţinută fracţia II compusă din polizaharide coloidale.
Polizaharidele de tipul hemicelulozei şi compuşilor pectici au fost extrase prin hidroliza
precipitatului cu o soluţie de 2% de H2SO4 pe o baie de apă la temperatura +1000C, timp de 5 ore.
Extractul a fost centrifugat la 6000 r.p.m. Precipitatul a fost spălat repetat cu apă. Supernatantul s-
a reunit cu apele de spălare a precipitatului şi s-a neutralizat cu BaCO3 - fracţia III.
Fracţia a IV-a (polizaharidele de tipul celulozei) a fost obţinută prin hidroliza restului
probei (precipitatului) cu soluţie de 80% de H2SO4, timp de 2 ore. Extractul obţinut a fost
neutralizat cu BaCO3. Schema obţinerii fracţiilor glucidice este expusă în figura 4.2.
În toate fracţiile a fost determinat conţinutul de carbohidraţi după metoda colorimetrică
cu reactivul antron. Rezultatele cercetărilor au demonstrat, că fracţia III obţinută din drojdiile
autolizate constituie 12,3% S.U. la cele de la vinul roşu şi 23,6% S.U. la cele de la vinul alb.
Aceeaşi fracţie III, extrasă din sedimentul numai congelat/decongelat este de 2 ori mai mică.
Fracţiile I şi II din drojdiile congelate/decongelate de asemenea sunt de 2-2,5 ori mai mici ca cele
din drojdiile supuse autolizei, fapt ce denotă eficacitatea autolizei. Fracţia IV în toate probele
constituie de la 16,9 până la 17,3% S.U. Rezultatele sunt expuse în tabelul 4.4.

86
 Drojdii de la vinificaţie congelate /
decongelate sau autolizate

Extracţia cu alcool etilic 80%, raport 1:2,

70-800C, 15 min, centrifugare 6000 r.p.m.,
20 min.,3 ori

Precipitat Supernatant. Fracţia I

Extracţia cu apă raport 1:2, Carbohidraţi extraşi cu

40-450C, 10 min. 3 ori alcool

Precipitat
Supernatant. FracţiaII

Hidroliza în H2SO4 (2%),

Carbohidraţi extraşi cu apă
1000C, 5 ore, centrifugare,
neutralizare cu BaCO3

Precipitat Supernatant. Fracţia III

Hidroliza în H2SO4 (80%), Carbohidraţi hidrolizaţi în

temp. camerei, 2 ore, H2SO4 (2%)
centrifugare. Fracţia IV

Fig. 4.2. Schema extragerii fracţionate cu alcool, apă şi acid sulfuric a carbohidraţilor din
biomasa drojdiilor de la vinificaţie, după Rudic şi coaut. [28].

Tabelul 4.4. Componenţa fracţionară a carbohidraţilor din drojdiile sedimentelor de vin

obţinute prin extracţia cu alcool, apă şi acid sulfuric, după Rudic şi coaut. [28]
Drojdii de la Drojdii de la Drojdii de la Drojdii de la
vinul roşu vinul roşu vinul alb vinul alb
cong./decong. autolizate cong./decong. autolizate
№ Fracţia % % % %
% S.U. din Σ % S.U. din Σ % S.U. din Σ % S.U. din Σ
X1±x2 fracţii X1±x2 fracţii X1±x2 fracţii X1±x2 fracţii
lor lor lor lor
I Alcool
1,4±0,03 5,9 2,2±0,03 6,6 1,6±0,12 5,5 3,8±0,78 8,1
solubilă
II Hidro
0,7±0,16 3,0 1,2±0,01 3,6 0,9±0,03 3,0 2,2±0,33 4,6
solubilă
Hidrolizată
III cu H2SO4 5,1±0,46 21,1 12,3±0,27 37,4 10,2±0,68 34,3 23,6±0,25 50,7
2%
Hidrolizată
IV cu H2SO4 16,9±0,14 70,0 17,3±0,08 52,4 16,9±0,55 57,1 17,1±0,18 36,6
80%
V Σ
24,2±0,13 100 33,0±0,39 100 29,7±0,29 100 46,7±1,54 100
Fracţiilor

87
 Pentru a identifica complexul de carbohidraţi extraşi din biomasa drojdiilor de la
vinificaţie, a fost utilizată metoda cromatografiei în strat subţire pe plăci Sorbfil. Analiza
rezultatelor a arătat, că fracţia III extrasă cu soluţie NaOH 3% (conform procedeului I) are ca
monozaharide constituente D-manoza, fapt ce ne permite să afirmăm că la utilizarea solventului
dat din biomasa de drojdii a fost extras mananul, parte componentă a peretelui celular al
drojdiilor.
Fracţia III extrasă cu soluţie H2SO4 2% (conform procedeului II) are ca monozaharide
constituente D-glucoza şi D-manoza, fapt care se explică prin aceea, că în acest caz am extras
mananii şi fracţia glicogenului solubilă în soluţii de acid.
Aşadar, în rezultatul cercetărilor s-a constatat eficienţa înaltă a ambelor metode de
extracţie fracţionată a carbohidraţilor din biomasa de drojdii. Cantităţi apropiate de carbohidraţi
au fost stabilite pentru fracţiile I şi II obţinute prin ambele metode. Însă, variaţiile semnificative
ale conţinutului fracţiilor III şi IV, care se presupune că sunt constituite din manani şi β-glucani,
argumentează necesitatea efectuării cercetărilor de perfecţionare a procedeelor cunoscute şi a
elabora altă schemă de obţinere a polizaharidelor din drojdiile sedimentelor de vin.
În baza rezultatelor obţinute, în continuare cercetările au fost axate pe separarea
fracţionată succesivă a carbohidraţilor conform solubilităţii lor în apă, alcalii şi acizi. Ca cerinţe
de bază au fost respectate: randamentul de extragere cât mai înalt şi puritatea produselor extrase.
Ca material de lucru au servit drojdiile rezultate în urma fermentării vinurilor de masă
roşii şi albe, păstrate la congelator la -18°C.
La prima etapă probele au fost supuse extracţiei cu apă distilată în raportul de 1:2
(biomasă : apă) pe o baie de apă la temperatura +40-450C, timp de 10 -15 min., după care au fost
centrifugate la 6000 r.p.m. timp de 20 min. Procedura a fost executată de 2 ori, iar supernatantele
au fost reunite. Astfel, a fost obţinută fracţia I, care reprezintă glucidele hidrosolubile (mono- şi
dizaharide), sedimentate din faza lichidă cu etanol de 96%, în raportul de 1:2 (supernatant :
alcool). Aplicând metoda spectrofotometrică cu reactivul antron a fost stabilit, că fracţia I
constituie 2,9 - 3,4% S.U. în dependenţă de provenienţa drojdiilor (figura 4.3). Componenţa
calitativă a glucidelor fracţiei este practic similară în toate probele.
Prin cromatografierea în strat subţire a glucidelor fracţiei I a fost identificată prezenţa
pentozelor şi hexozelor – glucoza, manoza, fructoza, arabinoza şi galactoza. Glucoza şi fructoza
sunt principalele monozaharide care formează „zahărul liber reducător”. Aceste două
monozaharide împreună cu zaharoza formează „zahărul total liber”. Zahărul total liber se extrage
cu uşurinţă din produse vegetale cu alcool etilic, separându-se astfel de glucidele neconstitutive

88
(amidon, fructozani), precum şi de cele cu rol constitutiv (celuloza, hemiceluloza, etc.). Fracţia I
pe lângă glucide conţine proteine hidrosolubile, acizi nucleici, alţi polimeri uşor solubili în apă.
Sedimentul (fracţia pereţilor celulari) a fost tratat cu o soluţie de 3% de NaOH în raportul
precipitat:sol. alcalină - 1:3, la temperatura1000C, timp de 1 oră şi apoi centrifugat. Procedura a
fost repetată de 2 ori. Precipitatul a fost spălat repetat cu apă distilată. Supernatantele s-au reunit,
constituind fracţia II, care reprezintă glucidele solubile în alcalii - mananproteinele, precipitate
din soluţie cu etanol de 96% în raport de 1:2 (supernatant:alcool). La drojdiile
congelate/decongelate fracţia II variază de la 3,1 până la 3,9% S.U. (figura 4.3).

40
Carbohidraţi, % S.U.

35
30
25
20 Drojdii din sedimente de
la vin roşu
15
10 Drojdii din sedimente de
la vin alb
5
0

Fig. 4.3. Raportul cantitativ al fracţiilor de carbohidraţi la drojdiile din sedimentele de vin.

Sedimentul rămas, insolubil în alcalii, a fost identificat drept un complex de polizaharide

formate numai din glucoză, denumite în general glucani sau glucozani. Din această clasă fac
parte glicogenul şi celuloza. În continuare, sedimentul susmenţionat a fost tratat cu soluţie de
H2SO4 de 2% (pentru eliminarea glicogenului) în raportul precipitat:acid 1:2, pe o baie de apă la
temperatura +1000C, timp de 1 oră, fiind apoi centrifugat. Extracţia a fost repetată de 2 ori.
Precipitatul a fost spălat repetat cu apă, iar supernatantele reunite, rezultând fracţia III
reprezentată de glicogen. Fracţia III constituie, în dependenţă de provenienţa drojdiilor, 3,6 -
7,6% S.U. (figura 4.3).
Sedimentul rămas, insolubil în alcalii şi acizi, după spălări succesive cu apă, alcool etilic,
centrifugare şi uscare a fost identificat ca fracţia IV, reprezentând fracţia β-glucanilor. În drojdiile
sedimentelor de vin ea este dominantă cantitativ indiferent de provenienţa lor şi variază între 16,3
şi 17,4 % S.U. la drojdiile provenite din sedimentele vinurilor roşii şi albe, respectiv (figura 4.3).
Schema de realizare a procedeelor propuse este prezentată în figura 4.4.

89
 Astfel, procedeul propus se deosebeşte de procedeele cercetate prin aplicarea succesivă a
alcaliilor şi acizilor, ceea ce dă posibilitate de a separa fracţiile alcalinosolubile de cele solubile
în acizi, obiectiv irealizabil prin utilizarea altor procedee.

Drojdii de la vinificaţie congelate /

decongelate sau autolizate

Extracţia cu apă raport biomasă-apă 1:2,

40-450C, 10-15 min. 2 ori.
Centrifugare la 6000 rot./min. 20 min.

Precipitat Supernatant.

Extracţia cu NaOH 3%, raport

1:3, 1000C, 1 oră, 2 ori. Spălare Fracţia I
repetată cu apă, centrifugare la Carbohidraţi extraşi cu apă şi
6000 rot./min. 20 min. precipitaţi cu alcool în raport 1:2

Supernatant.
Precipitat

Extracţia cu H2SO4 (2%) în FracţiaII

raport 1:2, 1000C, 1 oră, 2 ori. Carbohidraţi extraşi cu soluţii
Spălare repetată cu apă, slabe alcaline şi precipitaţi cu
centrifugare la 6000 rot./min. alcool în raport 1:2
20 min.

Supernatant. neutralizare cu
Precipitat BaCO3

Spălare repetată cu apă, alcool

etilic, filtrare, uscare la 40-450C Fracţia III
- Fracţia IV – carbohidraţi Carbohidraţi extraşi cu soluţii
insolubili în alcalii şi acizi slabe de acid şi precipitaţi cu
alcool în raport 1:2

Fig. 4.4. Schema extragerii fracţionate cu apă, alcalii şi acizi a carbohidraţilor din biomasa
drojdiilor de la vinificaţie.

Acest procedeu permite obţinerea din drojdiile sedimentelor de vin a 4 fracţii glucidice:
1) hidrosolubilă (mono- şi dizaharide), ce constituie 2,9 – 3,4% S.U., 2) alcalinosolubilă
(manani) - 3,1 – 3,9% S.U., 3) solubilă în acizi (de tip glicogen) - 3,6 - 7,6% S.U., 4) insolubilă
în alcalii şi acizi (β-glucani) - 16,3 - 17,4 %S.U. în dependenţă de originea biomasei.
Rezultatele obţinute referitor la compoziţia şi conţinutul cantitativ al glucidelor din
drojdiile sedimentelor de vin roşu şi alb au o importanţă majoră pentru utilizarea lor practică ca

90
una din surse alternative pentru obţinerea polizaharidelor valoroase pentru medicină,
cosmetologie, industria alimentară şi alte domenii ale economiei ţării.
Generalizând rezultatele obţinute în subcapitolul 4.1, putem conchide, că autoliza şi
ultrasonarea drojdiilor prezintă un procedeu eficient pentru distrugerea peretelui celular, valorile
obţinute de carbohidraţi variind între 42,7 - 48,4% S.U. comparativ cu 23,2 - 31,1% S.U. în
sedimentele nesupuse tratamentelor susmenţionate.
Complexul de polizaharide care alcătuieşte baza peretelui celular al drojdiilor de la
vinificaţie este compus preponderent din glucani şi proteomanani, identificaţi în cantităţi
semnificative atât la drojdiile din sedimentele de la vinurile roşii, cât şi în cele de la vinurile albe.
Pentru extracţia fracţionată a complexului de carbohidraţi din drojdiile de la vinificaţie se
propune procedeul de extracţie cu utilizarea apei, soluţiilor slabe de alcalii şi acizi.
Utilizarea acestui procedeu, permite obţinerea din drojdiile provenite de la vinurile roşii
şi albe a 4 fracţii de glucide: 1) hidrosolubilă (mono- dizaharide), 2) alcalinsolubilă
(mananproteine), 3) solubilă în acizi (de tip glicogen), 4) insolubilă în alcalii (β-glucanii).

4.2. Procedee de obţinere a bioproduselor complexe din drojdiile sedimentelor de vin

În baza principiilor bioactive microbiene se elaborează diferite tipuri noi de suplimente
alimentare şi furajere. Din seria companiilor producătoare de suplimente fac parte aşa firme
cunoscute, cum ar fi Alltech (Nicolasvilli, Kenttukki, SUA); Biokon (Leksington, Kenttukki,
SUA); Biotal (Izen Preari, Minesota, SUA). Graţie interesului faţă de problema în discuţie,
cercetările privind evidenţierea de noi surse pentru obţinerea principiilor bioactive au fost reluate
şi continuate în mod intensiv.
În grupul denumit generic „drojdii de vin” sunt incluse şi speciile genului
Saccharomyces, care pot fi active în condiţiile existente în mustul de struguri, caracterizat printr-
un conţinut sporit de glucide şi pH acid. Cantitatea depunerilor de drojdii variază între 5-12 %
din volumul vinului.
Determinarea componenţei biochimice a biomasei drojdiilor de la vinificaţie, ca resurse
secundare, este importantă pentru obţinerea preparatelor de perspectivă. Actualitatea acestei
direcţii se datorează cerinţelor crescânde înaintate problemei de utilizare a drojdiilor de la
vinificaţie şi perspectivei elaborării preparatelor ecologic pure, precum şi sporirii importanţei lor
biologice şi nutritive pentru necesităţile economiei republicii, în special pentru sectorul zootehnic.
Scopul cercetărilor în subcapitolul 4.2 constă în determinarea componenţei biochimice a
drojdiilor din sedimentele de vin, eficientizarea prelucrării lor pentru obţinerea diferitor tipuri de
suplimente furajere.

91
 4.2.1. Studiul compoziţiei biochimice a drojdiilor din sedimente de vin
Cercetările au avut ca material biologic drojdiile de vin din sedimente de la vinurile de
masă roşii (varianta I), albe (varianta II), oferite de colaboratorii Institutului Naţional pentru
Viticultură şi Vinificaţie şi sedimente de la vinurile de masă albe de la Fabrica de vinuri din
Străşeni (varianta III) în anul 2006. Pentru înlăturarea impurităţilor mecanice, drojdiile au fost
spălate (1 volum sediment + 3 volume apă) şi filtrate.
În primul set de experienţe a fost studiat conţinutul de proteină şi aminoacizi. Analizând
datele conţinutului de proteină, se constată că valorile acesteia variază de la 41,3 la 52,2% S.U.
în dependenţă de provenienţa drojdiilor (figura 4.5). Azotul total constituie 8,3% S.U. (varianta
I), 6,6% S.U. (varianta II) şi 7,6% S.U. (varianta III).

Proteină Azotul total

60
Concentraţia, % S.U.

50
40
30
20
10
0
varianta I varianta II varianta III

Fig. 4.5 Conţinutul de proteină şi azot total în drojdiile din sedimente vinicole.

Valoarea nutritivă a proteinelor depinde de calitatea aminoacizilor. În general, drojdiile

de vin sunt valoroase prin conţinutul înalt al aminoacizilor şi din acest punct de vedere ele sunt
comparabile cu carnea.
În rezultatul cercetării conţinutului de aminoacizi în biomasa drojdiilor de la fermentarea
vinului roşu şi alb a fost stabilit, că cantitatea sumară a aminoacizilor alcătuieşte 42,7 - 67,9%
S.U. Drojdiile se caracterizează printr-un conţinut înalt de aminoacizi esenţiali 20,4 – 29,8%
S.U. (tabelul 4.5), în special treonină, valină, izoleucină, leucină, lizină şi arginină.
Conţinutul aminoacizilor imunoactivi constituie 28,7 - 40,7% din totalul aminoacizilor
identificaţi (tabelul 4.6). Drojdiile de la vinurile roşii (varianta I) conţin cantităţi importante de
serină, glicină, alanină, valină. În drojdiile provenite de la vinurile albe prevalează acidul
asparagic (3,0 % S.U.) şi arginina (7,2 % S.U.) (variantele II şi III).

92
 Astfel, sedimentele de drojdii de la fermentarea vinurilor roşii şi albe constituie o bună
sursă de proteine, valoarea nutritivă a cărora este condiţionată de conţinutul înalt al
aminoacizilor esenţiali şi imunoactivi. Drojdiile din sedimentele de vin pot fi unul din
componentele de bază eficiente pentru elaborarea suplimentelor nutriţionale şi adaosurilor
furajere.

Tabelul 4.5. Conţinutul de aminoacizi esenţiali în drojdiile de la vinificaţie, % S.U

Aminoacizii Varianta I Varianta II Varianta III
Treonina 2,7 2,5 1,7
Valina 2,1 1,2 1,4
Metionina 0,1 0,01 0,01
Izoleucina 3,7 2,2 2,2
Leucina 4,9 3,1 4,1
Fenilalanina 1,9 1,2 1,3
Lizina 4,7 3,4 4,3
Histidina 2,0 0,9 1,2
Triptofan - - -
Arginina 6,2 5,9 7,2
Total 28,4 20,4 29,8

Tabelul 4.6. Conţinutul de aminoacizi imunoactivi în drojdiile de la vinificaţie, % S.U

Aminoacizii Varianta I Varianta II Varianta III
Acid asparagic 1,3 3,0 2,6
Treonina 2,7 2,5 1,7
Serina 6,2 1,9 2,7
Acid glutamic 11,6 9,7 10,8
Glicina 4,9 1,9 2,1
Alanina 5,2 1,9 2,1
Valina 2,1 1,2 1,4
Cisteina 0,5 0,4 0,5
Triptofan - - -
Arginina 6,2 5,9 7,2
Total 40,7 28,7 31,1

93
 În cadrul următoarei etape de lucru, în drojdiile din sedimentele de vin a fost studiat
conţinutul de carbohidraţi. Carbohidraţii, compuşi, produşi de multe microorganisme, inclusiv de
drojdii, sunt unii din principiile bioactive des utilizate în industriile alimentară, cosmetică,
farmaceutică. Peretele celulei de drojdie este alcătuit în proporţie de 90% din glucani, mananproteine
şi chitină. Drojdiile din sedimentele de vin sunt deosebit de valoroase, deoarece conţin mai multe
tipuri de polizaharide, care sunt reprezentate în special de glucani, manani, glicogen [12].
Pentru a determina conţinutul carbohidraţilor în biomasă, drojdiile de vin au fost spălate
pentru separarea impurităţilor mecanice (resturi de pieliţe şi seminţe) şi lăsate 24 ore la
temperatura ambiantă. Rezultatele cercetărilor demonstrează, că drojdiile din sedimentele de vin
conţin 28,4 - 35,5% S.U. de carbohidraţi (tabelul 4.7).
Studiul lipidelor, ca substanţe de rezervă cu un înalt nivel energetic, demonstrează că
conţinutul lor ajunge la 5,4-6,6% în biomasa uscată a drojdiilor de la vinificaţie (tabelul 4.7), cea mai
mare valoare fiind obţinută la drojdiile de la vinurile albe de la INVV. Compoziţia lipidelor din
drojdii este deosebit de variată şi importantă pentru obţinerea emulgatorilor, deoarece conţin clase de
compuşi organici, în special fosfolipide, care formează emulsii stabile [43, 188, 193, 224, 233, 241].

Tabelul 4.7. Conţinutul carbohidraţilor şi lipidelor în drojdiile de la vinificaţie, % S.U. X1± x1

Principii bioactive Varianta I Varianta II Varianta III
Carbohidraţi 28,4 ± 0,31 33,6 ± 0,43 35,5 ± 0,10
Lipide 6,1 ± 0,20 6,6 ± 0,15 5,4 ± 0,10

Profilul componenţei fracţionare a lipidelor stabileşte prezenţa fosfolipidelor, sterolilor,

acizilor graşi liberi, mono-, di- şi trigliceridelor (tabelul 4.8). Conţinutul fosfolipidelor diferă în
variantele cercetate şi oscilează între 3,7 şi 4,4% din suma fracţiilor lipidice. Conţinutul acizilor
graşi liberi în biomasa drojdiilor variază în limitele 4,4 - 8,6%, mono- şi digliceridele constituie
10,2 - 15,5% din suma fracţiilor lipidice, iar conţinutul trigliceridelor este de 17,4 - 22,1%.
Drojdiile de la vinificaţie se caracterizează prin conţinutul înalt al sterolilor (provitamina D),
care constituie până la 14,3% din suma lipidelor (varianta I).
Proprietăţile lipidelor din membrana celulară în mare măsură depind de gradul de
saturare a acizilor graşi. Activitatea biologică a acizilor oleic, linolic, linolenic este importantă
prin implicarea lor în numeroase procese fiziologice. Conform datelor din literatură, drojdiile de
vin din genul Saccharomyces conţin în jur de 80,7...88,2% acizi graşi nesaturaţi, în care
prevalează acidul palmitoleic (pînă la 47,9% din sumă) şi acidul oleic, care constituie
32,8...56,5% din suma acizilor graşi [42]. Cercetările privind spectrul de acizi graşi din lipidele

94
drojdiilor de la vinurile roşii şi albe evidenţiază o compoziţie deosebit de valoroasă, conţinutul
de acizi esenţiali faţă de suma acizilor identificaţi constituind: linolic 5,6 – 8,0% şi linolenic 3,2 -
5,6%. Conţinutul procentual al acizilor graşi saturaţi variază de la 20,9 la 39,1%, cel al acizilor
nesaturaţi constituie 60,9 – 79,9% (tabelul 4.9). Compoziţia biochimică a lipidelor indică
posibilitatea utilizării lor în cosmetologie.

Tabelul 4.8. Componenţa fracţionară a lipidelor la drojdiile de la vinificaţie, (% din suma fracţiilor)
Principii bioactive Varianta I Varianta II Varianta III
Fosfolipide 4,4 4,2 3,7
Sterine 14,3 13,1 11,0
Acizi graşi liberi 8,6 5,7 4,4
Mono-,digliceride 12,4 10,2 15,5
Trigliceride 17,4 18,5 22,1
Eteri de sterine şi ceruri 37,1 42,6 36,9

Tabelul 4.9. Conţinutul principalilor acizi graşi în lipidele drojdiilor de la vinificaţie

Varianta Acizii graşi, % din sumă Suma acizilor, %
C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
(miris (pal (palmit (stea (ole (lino (lino Satu Nesatu
tinic) mitic) oleic) ric) ic) lic) lenic) raţi raţi
I 16,8 9,5 40,9 12,7 10,0 6,8 3,2 39,1 60,9
II 9,3 7,7 58,6 4,0 13,3 8,0 - 20,9 79,9
III 16,8 17,7 23,4 0,9 29,9 5,6 5,6 35,5 64,5

Aşadar, drojdiile din sedimentele de vin prezintă o sursă valoroasă de proteină ce conţine
practic toţi aminoacizii esenţiali şi imunoactivi, carbohidraţi, lipide bogate în fosfolipide,
gliceride, ergosterol (provitamina D), acizi graşi esenţiali [16]. După compoziţia biochimică
drojdiile de vin îmbină în mod specific proprietăţile utile şi pot constitui una din componentele
de bază eficiente pentru elaborarea suplimentelor nutriţioniste, adaosurilor furajere,
concentratelor vitaminice, remediilor cosmetice.

4.2.2. Optimizarea condiţiilor de prelucrare a drojdiilor sedimentelor de vin şi

schema tehnologică de obţinere a produsului proteic furajer Prolevin
Standardele UE referitor la asigurarea calităţii nutreţurilor cu impact asupra sănătăţii
animalelor interzic utilizarea pulberilor de origine animală în furajarea animalelor şi păsărilor.
De aceea necesarul de proteină furajeră trebuie suplinit din alte surse. Din sursele

95
neconvenţionale fac parte proteinele furnizate de microorganisme, alge etc. Drojdiile din
sedimentele de vin pot asigura cerinţele în substanţe proteice şi pot fi utilizate pentru producerea
unor biopreparate în baza produselor metabolice (aminoacizi, carbohidraţi, steroli,vitamine, etc.).
Un aspect important al utilizării drojdiilor este obţinerea autolizatelor din biomasa lor.
Valoarea biologică şi nutritivă înaltă a autolizatelor de drojdii se explică prin faptul, că în timpul
procesului de autoliză, sub acţiunea propriilor fermenţi are loc distrugerea biopolimerilor
drojdiei, ceea ce măreşte accesibilitatea substanţelor biologic active din biomasă.
În baza autolizatelor de drojdii sunt elaborate o serie de suplimente alimentare biologic
active „Нагипол”, „Aвимин”, eficacitatea cărora în calitate de preparate bioreglatorii a fost
demonstrată printr-un şir de experienţe clinice [76].
Una din variantele optimale pentru obţinerea preparatelor proteico-vitaminice este
autoliza biomasei diferitor tulpini de drojdii. Pentru a asigura necesităţile economiei în preparate
proteico-vitaminice de înaltă calitate la un preţ convenabil pentru beneficiari, se propun
următoarele metode: 1) Realizarea autolizei numai cu utilizarea enzimelor native specifice
tulpinii date şi respectarea parametrilor de timp şi temperatură; 2) Utilizarea în calitate de
materie primă a sedimentelor de drojdii de la uzinele de bere şi vinificaţie; 3) Producerea
preparatelor proteico-vitaminice cu destinaţie furajeră şi alimentară cu cumularea tehnologiilor
de autoliză a drojdiilor şi de obţinere a siropurilor glucozo-galactozice [49].
O fază importantă în procesul de prelucrare a drojdiilor din sedimentele de vin este
purificarea lor (eliminarea impurităţilor, rămăşiţelor de alcool, sărurilor acidului tartric,
diminuarea acidităţii) şi uscarea ulterioară a autolizatelor în condiţii optime de temperatură
pentru a asigura conţinutul maxim al substanţelor biologic active în biomasa uscată.
Ca obiecte de cercetare au servit drojdiile din sedimentele de vinuri roşii şi albe de la
INVV, prelevate în anul 2007.
Pentru selectarea condiţiilor de spălare, obţinere a autolizatului şi uscare a drojdiilor din
sedimentele de vin au fost testate unele procedee, care au la bază utilizarea diferitor volume de
apă, soluţii de NaHCO3, regimuri de temperatură şi durată propuse în brevetele de invenţie [59,
62, 63].
Iniţial în scopul stabilirii parametrilor optimi de purificare (eliminarea impurităţilor, rămăşiţelor
de alcool, diminuarea acidităţii) a drojdiilor din sedimentele de vin, acestea au fost supuse spălării cu:
a) apă în proporţie de 1:3 – (Varianta 1); 1:5 – (Varianta 2), la temperaturi de +5, 10, 150C,
timp de 10, 15, 30, 40 min., urmată de separarea biomasei prin decantare.
b) soluţie de bicarbonat de sodiu de 1% - (Varianta 3); 5% - (Varianta 4); 10% - (Varianta
5) în proporţie de 1:2, urmată de separarea biomasei prin decantare.

96
 Eficacitatea a fost apreciată după valorile pH-ului biomasei (indice precăutat la
elaborarea furajelor şi suplimentelor furajere). Ca martor a servit pH-ul iniţial al sedimentelor de
drojdii. Din analiza datelor se constată, că valorile iniţiale ale pH-ului sedimentelor variază în
limitele 3,7 – 3,8. Valorile pH-ului practic rămân neschimbate în probele cu diferite durate de
spălare cu apă, raporturile sediment:apă sau diapazonul de temperaturi ale apei utilizate pentru
spălare. Astfel, tratamentul sedimentelor de drojdii cu soluţia de bicarbonat de sodiu de 1%; 5%;
10% în proporţie de 1:2 duce la diminuarea acidităţii biomasei de drojdii. Valorile optime ale
pH-ului, ce corespund normelor de elaborare a furajelor şi suplimentelor furajere [49], se obţin în
varianta a 3-a pentru drojdiile de la vin roşu şi în varianta a 4-a pentru drojdii de la vin alb, în
care a fost utilizată soluţia de bicarbonat de sodiu (NaHCO3) de 1% şi 5%, respectiv (figura 4.6
A şi B).

martor I spălare II spălare martor I spălare II spălare

9 8
8 7
7 6
6 5
pH-ul
pH-ul

5 4
4
3
3
2
2
1 1
0 0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Varianta Varianta

A B
Legendă: 1 - Biomasă : apă (1:3); 2 - Biomasă : apă (1:5); 3 - Biomasă : NaHCO3 1% (1:2); 4 - Biomasă:
NaHCO3 5% (1:2); 5 - Biomasă : NaHCO3 10% (1:2)

Fig. 4.6. Valorile pH-ului sedimentelor de drojdii de la vinul roşu (A) şi alb (B), purificate prin spălare.

Astfel, în scopul evitării majorării preţului final al produselor, pentru purificarea

sedimentelor de drojdii vinicole de impurităţi, rămăşiţe de alcool, diminuarea acidităţii, se
propun, în dependenţă de scopul utilizării produsului finit, procedeele ce includ:
٠spălarea biomasei de drojdii cu apă în proporţie de 1:3, timp de 10-15 min. (1-2 ori) şi
decantarea fazei lichide;
٠spălarea biomasei de drojdii cu soluţie de bicarbonat de sodiu de 1% sau 5% în proporţie
de 1:2, urmată de separarea biomasei de supernatant prin decantare.

97
 În al doilea set de experienţe, obiectivul de bază al cercetărilor a fost de a spori valoarea
nutritivă a suplimentului furajer prin aplicarea autolizei drojdiilor.
Pentru optimizarea condiţiilor de autoliză a drojdiilor ca material de lucru a fost
folosită biomasa de drojdii de vin purificată, care a fost supusă diferitor condiţii de autoliză:
٠o variantă a fost termostatată la temperatura de 37 şi 550C timp de 12, 24, 48 ore;
٠altă variantă a fost preventiv supusă congelării/decongelării, la -180C, apoi termostatării
în condiţiile descrise în varianta a).
Estimarea randamentului procedeelor utilizate a fost efectuată prin microscopia
autolizatului, determinarea proteinei totale, în unele cazuri a conţinutului de azot aminic, care
este proporţional cantităţii aminogrupelor eliberate.
Astfel, valorile conţinutului de proteină pentru ambele tipuri de drojdii sunt mai mari în
mostrele obţinute prin metoda de autoliză a biomasei congelate de drojdii în condiţiile utilizării
temperaturii de +550C şi durata de 12 ore (tabelul 4.10, 4.11). Conţinutul de proteină în
variantele cu drojdii congelate de la vinul alb constituie 26,8% S.U, iar în variantele cu drojdii
congelate de la vinul roşu - 39,9% S.U. Drojdiile ne congelate necesită o durată mai lungă pentru
autoliză, astfel că conţinutul maximal de proteină se obţine în mostrele autolizate la temperatura
+550C timp de 48 ore. Ca martor au servit drojdiile din sedimente de la vinul roşu şi alb
nesupuse congelării/decongelării şi autolizei. Estimarea efectuată prin microscopia autolizatelor a
confirmat faptul, că gradul de distrugere a peretelui celular al drojdiilor supuse autolizei la +370C
şi +550C este diferit. În acest caz microscopia probelor autolizate poate servi ca un indiciu
orientativ.

Tabelul 4.10. Conţinutul de proteină în autolizatele drojdiilor din sedimentul de la vinul alb în
dependenţă de temperatură, durata autolizei şi congelarea/decongelarea biomasei
Nr Varianta Drojdii din sedimente Drojdii din sedimente
d/o
necongelate congelate/decongelate
Proteină, % - Martor Proteină, % - Martor
% S.U. % S.U.
X1± x1 X1± x1
1 Martor 19,6±0,19 100 20,9±0,57 100
0
2 37 C / 12 ore 17,4±1,02 88,6 20,9± 0,65 100
3 37 0C / 24 ore 14,0±0,82 71,5* 20,6 ±1,48 98,7
4 37 0C / 48 ore 17,6±0,20 89,6 20,3 ±1,96 97,3
5 55 0C / 12 ore 23,9±1,24 121,7* 26,8 ±0,14 128,2*
6 55 0C / 24 ore 24,6±2,32 125,7* 26,3 ±0,72 126,0*
0
7 55 C / 48 ore 25,0±2,08 127,8* 24,8 ±0,87 118,5*
* - veridicitatea în comparaţie cu martorul - p<0,05

98
 Tabelul 4.11.Conţinutul de proteină în autolizatele drojdiilor din sedimentele de la vinul roşu în
dependenţă de temperatura, durata autolizei şi congelarea/decongelarea biomasei
Nr Varianta Drojdii din sedimente Drojdii din sedimente
d/o necongelate congelate/decongelate
Proteină, % - Martor Proteină, % - Martor
% S.U. X1± x1 % S.U. X1± x1
1 Martor 31,8 ±0,46 100 35,7± 0,35 100
2 37 0 C / 12 ore 26,2 ±1,38 82,3* 30,8 ±4,59 86,3
3 37 0 C / 24 ore 27,0± 0,93 84,8* 29,7 ±4,13 83,1*
0
4 37 C / 48 ore 26,9 ±1,40 84,4* - -
0
5 55 C / 12 ore 31,9 ±0,57 100,2 39,9 ±0,32 112,0
0
6 55 C / 24 ore 35,1 ±0,45 110,4 40,3 ±2,82 112,9*
0
7 55 C / 48 ore 36,4 ±0,30 114,3* 36,3 ±1,50 101,6
* - veridicitatea în comparaţie cu martorul - p<0,05

În conformitate cu rezultatele obţinute a fost stabilit, că autoliza drojdiilor sedimentelor

vinicole decurge mai eficient conform procedeelor:
٠pentru drojdiile congelate – autoliza la temperatura de +550C timp de 12 ore, amestecare
periodică.
٠pentru drojdiile necongelate – autoliza la temperatura de +550C timp de 48 ore,
amestecare periodică.
În următorul set de experienţe pentru sporirea gradului de autoliză şi scindare a proteinei
ca factor de inducţie al autolizei celulelor de drojdii au fost folosite diferite combinaţii de
substanţe chimice şi temperatură. Au fost cercetate 5 variante:
Varianta I (martor) – a fost utilizată lizocima, enzimă folosită în industria alimentară
pentru producerea suplimentelor nutritive [65]. Drojdiile sedimentelor de vin păstrate timp de 2-
3 luni la 12-200C au fost încălzite până la 370C, la masa lor au fost adăugate 0,1- 0,2% lizocimă,
s-au amestecat şi s-au expus la temperatura dată 1,5-2,0 ore. În continuare a fost adăugat zahărul
în proporţie de 1:2, s-a omogenizat la 50-550C, amestecul obţinut fiind menţinut timp de 2-3 zile.
În toate variantele experimentale biomasa păstrată la -18°C a fost purificată prin spălare
cu apă în raport 1:3, timp de 5-10 min. (1-2 ori). După decantarea fazei lichide, suspensia de
drojdii (biomasă+apă -1:4 după substanţă uscată) a fost supusă autolizei la temperatura +55°C
prin adăugarea componenţilor respectivi:
Varianta II – 3 ml acid acetic glacial la 1 l suspensie;
Varianta III – 5 ml acid acetic glacial la 1 l suspensie;
Varianta IV – temperatura de +550C;

99
 Varianta V – soluţie de 1% de NaHCO3
Toate variantele au fost supuse autolizei timp de 4, 8, 12, 24 şi 48 ore.
Produsul obţinut a fost uscat în vid la +550-600C până la substanţa absolut uscată de 90%.
Controlul procesului a fost efectuat după valorile azotului aminic şi proteinei.
Rezultatele dinamicii valorilor azotului aminic şi proteinei în procesul de autoliză a
drojdiilor sunt expuse în figurile 4.7 şi 4.8.

autoliza 4 ore autoliza 8 ore autoliza 12 ore

autoliza 24 ore autoliza 48 ore
Azot aminic, % S.U.

4
3
2
1
0
I II III IY Y

Varianta

Fig. 4.7. Evoluţia valorilor azotului aminic (% S.U.) în procesul de autoliză

a drojdiilor de la vinul alb.

autoliza 4 ore autoliza 8 ore autoliza 12 ore

autoliza 24 ore autoliza 48 ore
50
Proteina, % S.U.

40
30
20
10
0
I II III IY Y
Varianta

Fig. 4.8. Evoluţia valorilor proteinei (% S.U.) în procesul de autoliză

a drojdiilor de la vinul alb.

Valorile maxime ale conţinutului de azot aminic în autolizat se evidenţiază după 4-8 ore
în varianta III (în care s-a utilizat 5 ml acid acetic glacial la 1 l suspensie). Valorile azotului
aminic constituie 3,0-3,5% S.A.U, ceea ce depăşeşte martorul cu 20,0-44,9% (figura 4.7). În
varianta martor, în care ca factor de inducţie a autolizei a fost utilizată lizocima, valorile azotului

100
aminic constituie 2,1- 2,8% S.A.U. Rezultatele obţinute relevă faptul că acidul acetic contribuie la
sporirea randamentului procesului de autoliză şi scindare a proteinei drojdiilor din sedimentele de vin.
În cazul analizei rezultatelor evoluţiei conţinutului de proteină se constată, că în
autolizatele variantelor experimentale II-V scindarea proteinelor diferă semnificativ faţă de
varianta I (martor) după 24-48 ore (figura 4.8).
Datele obţinute la analiza pH -ului autolizatelor variantelor experimentale nu prezintă
diferenţe substanţiale faţă de martor.
Reieşind din sinteza rezultatelor obţinute, putem aprecia că variantele optimale de
obţinere a autolizatului din drojdiile sedimentelor de vin congelate sunt variantele cu utilizare a 3
sau 5 ml acid acetic glacial, temperatura de +550C, durata procesului de 4 sau 8 ore [19].

Optimizarea condiţiilor de uscare şi obţinere a preparatelor din drojdiile

sedimentelor de vin
Pentru a standardiza produsul finit după conţinutul de substanţă uscată a fost utilizat
procedeul de uscare în dulapul de uscare cu vid (SPT-200).
Pentru aceasta au fost cercetate 3 variante:
٠Concentrarea prin evaporarea lichidului din centrifugatul autolizei la temperatura de
+650C timp de 4, 8, 12 ore, urmată de filtrarea şi sterilizarea în autoclav, în regim moderat, câte 30
min. 3 zile consecutiv pentru a putea fi propus ca produs lichid bogat în substanţe biologic active.
٠Uscarea fracţiei pereţilor celulari la temperatura +65 şi 1050C timp de 12 - 24 ore.
٠Uscarea autolizatului integral la temperatura +65 şi 1050C timp de 12 - 24 ore.
Gradul de uscare a fracţiei pereţilor celulari şi autolizatului integral a fost evaluat după
conţinutul de substanţă uscată (greutatea părţii solubile a autolizatului) în raport cu valorile iniţiale.
Rezultatele demonstrează, că conţinutul substanţei uscate 90% de la masa iniţială se
obţine în regimul de uscare pentru:
٠concentrarea centrifugatului autolizei prin evaporare (pentru a spori conţinutul de principii
bioactive la o unitate de produs finit) se petrece la temperatura +650C timp de 4-8 ore.
٠pereţii celulari la temperatura de +650C timp de 12 ore.
٠autolizatul integral la temperatura de +650C timp de 12-18 ore.
În baza rezultatelor obţinute privind eficientizarea parametrilor de prelucrare a drojdiilor
din sedimentele de vin este propusă schema tehnologică de obţinere a bioproduselor valoroase
din biomasa drojdiilor (figura 4.9), care include etapele:
٠purificarea drojdiilor din sedimente;
٠autoliza drojdiilor;

101
 ٠uscarea produselor;
٠determinarea conţinutului biochimic al produselor;
٠ambalarea bioproduselor.

Drojdii din sedimentele de vin proaspete sau

decongelate
Purificare

Spălare cu apă în proporţii 1:3 timp de 10-15 min. 1-2 ori

Decantare

Suspensie: biomasă + apă 1:4

Autoliza

Drojdii decongelate + 3-5 ml Drojdii proaspete + 3-5 ml

acid acetic gl. la 1 l suspensie, acid acetic gl. la 1 l
t=55°C, 4-8 ore suspensie, t=55°C, 12 ore

1. Centriugatul autolizei Uscarea produselor 2. Pereţii celulari se

se concentrează la usucă la temperatura de
temperatura de +650 C în +650C în vid timp de
vid timp de 4-8 ore 12 ore

3. Autolizatul integral se usucă la temperatura

de +650C în vid timp de 12-18 ore
Prolevin

Determinarea compoziţiei biochimice

Cântărirea, ambalarea, marcarea produselor

Fig. 4.9. Schema tehnologică de prelucrare a drojdiilor din sedimentele de

vin şi obţinere a 3 bioproduse.

Descrierea etapelor tehnologice de obţinere a bioproduselor din drojdiile de la vinificaţie:

٠Purificarea drojdiilor din sedimente.
Purificarea drojdiilor din sedimentele de vin de impurităţi, rămăşiţe de alcool, săruri ale
acidului tartric, aciditate se efectuează prin spălarea biomasei de drojdii cu apă în proporţie de
1:3, timp de 10-15 minute, urmată de separarea biomasei de la supranatant prin decantare.
٠Autoliza drojdiilor.

102
 Prevede utilizarea drojdiilor proaspete sau păstrate în stare congelată, purificate. În
biomasa purificată de drojdie (biomasă:apă -1:4 după substanţă uscată) se adaugă acid acetic
glacial (3-5 ml la 1 l suspensie drojdie) şi amestecul se supune autolizei la +550C timp de 4-8
ore, cu agitare periodică.
Autolizatul integral se usucă, sau prin centrifugare se separă în 2 fracţii – centrifugatul
autolizei şi pereţii celulari.
٠Uscarea produselor:
a) centrifugatul autolizei se concentrează la temperatura de +650C timp de 4-8 ore;
b) pereţii celulari se usucă la temperatura de +650C timp de 12 ore;
c) autolizatul integral se usucă la temperatura de +650C timp de 12-18 ore.
٠Componenţa biochimică şi particularităţile fizico-chimice de bază ale produselor:
Se determină conţinutul de proteină, glucide, lipide, aminoacizi, steroli utilizând procedee
biochimice cunoscute.
٠Ambalarea, marcarea bioproduselor:
Pulberea de preparat se condiţionează cantitativ şi se ambalează în pachete. Pe etichetă se
imprimă: denumirea preparatului, destinaţia, numărul seriei obţinute, componenţa, volumul, data
obţinerii şi data expirării, modul de utilizare. Termenul de valabilitate 1 an de la data obţinerii,
bioprodusul se păstrează la temperatura camerei.
Centrifugatul autolizei – primul bioprodus obţinut conform schemei este un produs
lichid şi reprezintă un extract proteico-vitaminic, care conţine cantităţi semnificative de mono- şi
dizaharide.
Pereţii celulari – al doilea bioprodus este un produs solid în componenţa căruia întră β-
glucani, proteomanani şi lipide.
Autolizatul integral – al treilea bioprodus se prezintă sub formă de pulbere, în
componenţa căruia intră un complex de principii bioactive.
Studiul conţinutului de principii bioactive în bioprodusele Prolevin obţinute din
drojdii procesate conform schemei tehnologice elaborate.
În continuare este expusă compoziţia biochimică a acestui bioprodus denumit Prolevin.
Ca material de cercetare au servit drojdiile din sedimente de vin de roşu (Cabernet) şi alb
(Chardonnay), oferite de ÎNVV în anul 2008.
Conform rezultatelor obţinute, compoziţia biochimică a bioproduselor Prolevin R şi
Prolevin A variază în limite largi în funcţie de originea sedimentelor de vin (tabelul 4.12).
La analiza datelor scrise în tabelul 4.12 se constată, că bioprodusele conţin în cantităţi
echilibrate proteine, carbohidraţi, lipide, ergosterol. Se evidenţiază conţinutul ridicat în proteină,

103
bogată în aminoacizi esenţiali şi imunoactivi, unii din care nu pot fi sintetizaţi de animale şi om,
astfel încât aceştia trebuie incluşi în hrană în proporţii corespunzătoare (tabelul 4.13).

Tabelul 4.12. Compoziţia biochimică a bioproduselor Prolevin obţinute din drojdiile

sedimentelor de vin roşu şi alb, % S.U. X1± x1
Componente Prolevin – R Prolevin – A
(drojdiile sedimentelor (drojdiile sedimentelor
de la vinul roşu) de la vinul alb)
Proteine 36,8±0,57 26,8±0,14
Carbohidraţi 44,9±0,71 27,6±1,04
Lipide, inclusiv 15,8±2,36 13,7±0,86
Ergosterol 10,5±0,23 6,5±0,37

Rezultatele studiului compoziţiei lipidelor din aceste bioproduse denotă prezenţa

conţinutului înalt de steroli (35,7-38,2%), fosfolipide (10,2-13,5%), gliceride (inclusiv mono-di-
şi trigliceride), acizi graşi liberi utili pentru organismul uman şi animal.
Bioprodusele conţin cantităţi importante de acizi graşi nesaturaţi, aşa ca oleic, linoleic,
linolenic, şi saturaţi palmitic şi arahinic (tabelul 4.14).

Tabelul 4.13. Conţinutul de aminoacizi în bioprodusele Prolevin obţinute din drojdiile de la

vinificaţie (% din suma aminoacizilor)
Aminoacizii Prolevin - R Prolevin - A
Acidul cisteinic 2,2 2,2
Taurină 0,1 0,5
Acidul asparagic** 7,3 11,2
Treonină* 3,8 4,6
Serină** 4,8 6,0
Acidul glutamic** 22,4 18,6
Prolină 4,6 4,7
Glicină** 5,2 4,9
Alanină** 5,8 5,5
Valină* 4,9 5,1
Cisteină** 0,9 0,9
Metionină* 0,1 0,1
Izoleucină* 3,3 3,9
Leucină* 8,0 6,8
Tirozină* 3,7 3,6
Fenilalanină* 4,3 4,0
Triptofan* 2,4 1,7
Ornitină 0,3 0,1
Lizină* 9,9 10,0
Histidină 3,9 3,7
Arginină* 1,7 1,6
* - aminoacizi esenţiali; ** - aminoacizi imunoactivi

104
 Tabelul 4.14. Conţinutul de acizi graşi în bioprodusele Prolevin obţinute din drojdiile de la
vinificaţie, (% din suma acizilor identificaţi)
Acizi graşi Prolevin - R Prolevin - A
C 12:0 (laurinic) 2,3 6,9
C 14:0 (miristinic) 2,5 2,4
C 16:0 (palmitic) 35,9 37,6
C 16:1 (palmitooleic) 3,5 8,9
C 17:0 (margarinic) 0,8 1,3
C 18:0 (stearic) 7,3 9,6
C 18:1 (oleic) 8,1 5,9
C 18:2 (linoleic) 25,5 10,2
C 18:3 (linolenic) 7,2 2,2
C 20:0 (arahinic) 1,1 -
Suma acizilor graşi saturaţi 49,9 57,7
Suma acizilor graşi nesaturaţi 44,2 27,3
Coeficient de saturaţie C s 1,1 2,1

Aşadar, bioprodusele obţinute conform procedeelor propuse prezintă un complex de

principii bioactive- aminoacizi esenţiali şi imunoactivi, acizi graşi (omega-3) polinesaturaţi,
carbohidraţi, ergosterol şi pot fi propuse ca suplimente alimentare, furajere, produse cu efect
sanogen.
În colaborare cu cercetătorii laboratorului Ihtiologie al Institutului de Zoologie al AŞM a
fost testat în condiţii experimentale furajul pentru creşterea larvelor şi puietului de peşte, în care
unul din ingrediente a fost bioprodusul Prolevin – R (produs obţinut prin autoliza levurilor din
sedimente de la vinuri de masă roşii). Bioprodusul Prolevin - R utilizat în proporţie de 48...50 %
la unit. masă în furajul pentru creşterea larvelor şi puietului de peşte a condus la sporirea
semnificativă a viabilităţii larvelor (cu 22,2%), masei medie a unei larve (cu 19,0%)şi ihtiomasei
generale medii (cu 45,2%) faţă de martor [7, 31].
Astfel, rezultatele cercetărilor efectuate în cadrul subcapitolului 4.2. au demonstrat, că
compoziţia biochimică a drojdiilor din sedimentele de vin variază în limite largi. A fost scoasă în
evidenţă prezenţa conţinutului echilibrat de proteină bogată în aminoacizi esenţiali şi
imunoactivi, carbohidraţi, acizi graşi polinesaturaţi, care indică posibilităţile utilizării drojdiilor
din sedimentele de vin în calitate de sursă de substanţe biologic active.
Prin investigaţiile de evaluare şi optimizare a condiţiilor de obţinere a bioproduselor din
drojdiile de la vinificaţie a fost elaborată tehnologia care include etapele: purificarea biomasei de
drojdii din sedimente; autoliza drojdiilor conform procedeului nou; uscarea produselor conform
parametrilor optimizaţi; determinarea componenţei biochimice a bioproduselor; ambalarea şi
marcarea lor.

105
 Bioprodusul Prolevin – R utilizat în proporţie de 48…50 % la unitate masă în furaje
pentru creşterea larvelor şi puietului de peşte contribuie la sporirea semnificativă a viabilităţii
larvelor, masei medii a unei larve şi ihtiomasei generale medii.

4.3. Concluzii la capitolul 4

٠Autoliza şi ultrasonarea drojdiilor prezintă un procedeu eficient pentru spargerea
pereţilor celulari, valorile obţinute de carbohidraţi fiind în jur de 42,7 - 48,4 % S.U. comparativ
cu 23,2 - 31,1 % S.U. în sedimentele nesupuse tratamentelor susmenţionate.
٠Complexul de polizaharide care alcătuieşte baza peretelui celular a drojdiilor de la
vinificaţie este compus preponderent din glucani şi proteomanani, identificaţi în cantităţi
semnificative atât la drojdiile din sedimentele de la vinurile roşii, cât şi în cele de la vinurile albe.
٠Pentru extracţia fracţionată a complexului de carbohidraţi din drojdiile de la vinificaţie
se propune procedeul de extracţie cu utilizarea apei, soluţiilor slabe de alcalii şi acizi. Utilizarea
acestui procedeu permite obţinerea din drojdiile provenite de la vinurile roşii şi albe a 4 fracţii de
glucide: 1) hidrosolubilă (mono- dizaharide), 2) alcalinsolubilă (mananproteine), 3) solubilă în
acizi (glicogenul), 4) insolubilă în alcalii şi acizi (β-glucanii).
٠Compoziţia biochimică a drojdiilor din sedimentele vinicole variază în limite largi. Se
evidenţiază conţinutul înalt de proteină (41,3-52,2% S.U.), bogată în aminoacizi esenţiali (20,4-
29,8 %S.U.) şi imunoactivi (28,7-40,7% S.U.), carbohidraţi (28,4-35,5% S.U.), acizi graşi
polinesaturaţi C18:2 linolic, C18:3 linolenic, care indică posibilităţile utilizării drojdiilor din
sedimentele de vin în calitate de sursă de substanţe biologic active valoroase.
٠Bioprodusul Prolevin obţinut conform tehnologiei elaborate prezintă un complex de
principii bioactive- aminoacizi esenţiali şi imunoactivi, acizi graşi (omega-3) polinesaturaţi,
carbohidraţi, ergosterol şi pot fi propuse ca suplimente, furajere, produse cu efect sanogen.
Bioprodusul Prolevin – R utilizat în proporţie de 48...50 % la o unitate de masă în furaje pentru
creşterea larvelor şi puietului de peşte a condus la sporirea semnificativă a viabilităţii larvelor,
masei medii a unei larve şi ihtiomasei generale medii faţă de martor [7], anexa 1.
Problema ştiinţifică soluţionată în acest capitol a constat în determinarea compoziţiei
biochimice a drojdiilor din sedimentele vinicole şi elaborarea procedeelor de obţinere a
bioproduselor în baza lor.

106
 CONCLUZII GENERALAE ŞI RECOMANDĂRI

Teza de doctorat „Caracterele fiziologo-biochimice ale unor drojdii vinicole şi procedee de

obţinere a bioproduselor valoroase” reflectă rezultatele cercetărilor, efectuate conform
obiectivelor trasate, obţinerea cărora a asigurat atingerea scopului final - studierea caracterelor
fiziologo-biochimice ale unor tulpini de drojdii de vin cu potenţial sporit de biosinteză a
carbohidraţilor şi elaborarea procedeelor de obţinere a bioproduselor valoroase.
Analiza situaţiei în domeniul de cercetare referitor atât la compoziţia, activitatea
biologică înaltă şi diversele domenii de utilizare a carbohidraţilor din drojdii, cât şi oportunitatea
utilizării drojdiilor din sedimentele de vin ca sursă de substanţe biologic active în general, a
evidenţiat actualitatea direcţiei de cercetare.
Pornind de la varietatea mare a substanţelor cu activitate biologică înaltă, care pot fi
obţinute din microorganisme, la prima etapă au fost examinate în calitate de materie primă
pentru obţinerea carbohidraţilor drojdiile genului Saccharomyces. Pentru studiu au fost izolate
din sedimente de vin culturi de drojdii în baza a două criterii: productivitatea şi conţinutul de
carbohidraţi. În baza rezultatelor obţinute au fost selectate două tulpini de drojdii S. cerevisiae
CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 de interes biotehnologic cu o productivitate înaltă şi
un conţinut înalt de carbohidraţi. În continuare asupra tulpinilor selectate au fost efectuate
cercetări aprofundate, având drept scop obţinerea prin cultivare submersă a biomasei de drojdii
cu un conţinut prognozat de carbohidraţi cu utilizarea mediilor nutritive, în care în calitate de
sursă de energie s-au folosit diferite surse de carbon şi azot, iar în calitate de precursori şi
stimulatori specifici ai procesului de biosinteză a carbohidraţilor - sulfatul de mangan şi sulfatul
de zinc, acetaţii de Na şi Zn, compuşi coordinativi ai Mn(II) şi Zn(II), diferite regimuri de
temperatură, pH şi durată a procesului de cultivare.
Astfel, a fost demonstrată experimental influenţa factorilor de mediu asupra multiplicării
şi activităţii vitale a celulei microbiene şi reacţionarea acesteia prin modificări de biosinteză şi a
duratei etapelor de dezvoltare. Corelarea dată prezintă un mecanism puternic de reglare a
relaţiilor microorganism - mediu şi creează posibilităţi de orientare a proceselor metabolice la
drojdii în scopuri de utilizare practică.
Rezultatele obţinute au servit drept reper pentru elaborarea unui procedeu de cultivare
dirijată a tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 în vederea obţinerii biomasei cu un conţinut sporit
de carbohidraţi, care prevede utilizarea în mediul nutritiv a sursei de carbon preferabile, clorurii
de tricloracetat de zinc şi factorilor de mediu optimizaţi (temperatura, pH-ul iniţial, durata de
cultivare). A fost elaborat regulamentul de obţinere a bioprodusului Glucolev -20, care prevede

107
utilizarea în calitate de materie primă a biomasei de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 cu
conţinut sporit de carbohidraţi, obţinute prin procedeul descris, autoliza masei celulare pentru a
distruge pereţii celulari şi a majora disponibilitatea principiilor bioactive.
Deoarece în ultimul timp tot mai des este abordată problema utilizării deşeurilor
industriei vinicole în vederea obţinerii substanţelor biologic active şi evitării poluării mediului,
următoarea etapă de cercetări a fost orientată spre elaborarea unei tehnologii de procesare a
drojdiilor din sedimentele de vin cu scopul obţinerii unor bioproduse naturale valoroase cu
utilizare în diferite domenii. Schema elaborată în cadrul acestei lucrări este clară şi simplu de
realizat, ceea ce asigură succesul economic al implementării ei industriale. Rezultatele obţinute
în cadrul acestor studii au stat la baza elaborării unui nou bioprodus Prolevin-R utilizat la
furajarea larvelor şi puietului de peşte.
Prin urmare, scopul înaintat în faţa acestui studiu şi obiectivele formulate pentru fiecare
etapă ale cercetării au fost realizate integral. Problema ştiinţifică importantă ce ţine de
argumentarea căilor de dirijare a biosintezei carbohidraţilor la tulpinile de drojdii selectate,
utilizând ca factori reglatori nutrienţii, stimulatorii specifici şi factorii fizico-chimici de cultivare
a fost rezolvată, iar rezultatele pot fi exprimate prin următoarele concluzii:
٠Studiul caracterelor morfologice, culturale şi fiziologo-biochimice a permis de a evidenţia
două tulpini de drojdii, ulterior depozitate în CNMN sub denumirea de Saccharomyces cerevisiae
CNMN-Y-20 şi Saccharomyces cerevisiae CNMN-Y-21. Tulpinile prezintă interes în calitate de
producători de carbohidraţi (30,8 şi respectiv 33,1% glucide S.U) la cultivare pe mediul nutritiv
cu must de malţ. Tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20 este brevetată ca producător de β-glucani
[4].
٠Productivitatea tulpinilor S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21
sporeşte esenţial (cu 81,5 – 100,0% la biomasă şi cu 31,8-35,4% la carbohidraţi) în cazul
substituirii glucozei în mediului nutritiv Rieder cu melasă în cantitate de 20 g/l.
٠Din compuşii chimici testaţi a fost evidenţiat în calitate de stimulator compusul
coordinativ clorura de tricloracetat de zinc, care în concentraţia de 10 mg/l în mediul de cultivare
asigură sporirea cantităţii de carbohidraţi cu 25,0%.
٠Tulpinile S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 posedă capacitatea de
a creşte într-un larg diapazon a valorilor de temperatură şi pH. Optimul pentru biosinteza
carbohidraţilor este temperatura +20°C, pH-5,5 durata de cultivare 120 ore.
٠Tehnologia elaborată, bazată pe elemente noi – tulpină înaltproductivă, mediu nutritiv
eficient, parametri de temperatură, pH, durată de cultivare, specifici producătorului, permite

108
obţinerea a 4,7-5,0 g/l bioprodus Glucolev-20 cu un conţinut de carbohidraţi de 44,2% la S.U.,
fracţia majoră constituind-o β-glucanii – 77,3% din suma fracţiilor glicidice.
٠Compoziţia biochimică a drojdiilor din sedimentele de vin variază în limite largi şi se
evidenţiază printr-un conţinut înalt de proteină (de la 41,3 la 52,2% S.U) bogată în aminoacizi
esenţiali şi imunoactivi, carbohidraţi (28,4 - 35,5% S.U.), lipide (5,4 – 6,6% S.U.) acizi graşi
polinesaturaţi (60,9 – 79,9% din suma acizilor identificaţi) şi indică asupra posibilităţii utilizării
drojdiilor din sedimentele de vin în calitate de sursă de substanţe biologic active.
٠Tehnologia elaborată de prelucrare a drojdiilor din sedimentele de vin, bazată pe
procedee de purificare, autoliză şi uscare, permite obţinerea concomitentă a 3 bioproduse
proteico-glucidice valoroase.

Recomandări practice:
٠Tulpina de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 se recomandă pentru cultivarea industrială,
conform regulamentului elaborat şi utilizare în calitate de sursă de preparate glucidice cu un
spectru larg al domeniilor de aplicare.
٠Biotehnologia de procesare a biomasei drojdiilor din sedimentele de vin se recomandă
pentru producerea industrială a bioproduselor naturale proteice şi glucidice cu utilizare în diferite
domenii.
٠Bioprodusul Prolevin R se recomandă pentru utilizare în calitate de supliment la furajarea
larvelor şi puietului de peşte, animalelor şi păsărilor.

109
 BIBLIOGRAFIE
1. Anghel I. ş.a. Biologia şi tehnologia drojdiilor. Bucureşti: Editura Tehnică, 1989, vol. 1. 384 p.
2. Anghel I. ş.a. Biologia şi tehnologia drojdiilor. Bucureşti: Editura Tehnică, 1991, vol. 2. 385 p.
3. Anghel I. ş.a. Biologia şi tehnologia drojdiilor. Bucureşti: Editura Tehnică, 1993, vol. 3. 308 p.
4. Brevet de invenţie. 4048 B1, MD, C12N 1/16 Tulpină de drojdie Saccharomyces cerevisiae-
sursă de β-glucani/ Chiseliţa O. ş.a. (MD). Cererea depusă 2010.02.11, BOPI nr. 6/2010.
5. Brevet de invenţie. 1930 G2,MD, C11B 1/10 Procedeu de extragere a lipidelor din drojdii/
Usatîi A. ş.a. (MD). Cererea depusă 2000.05.29, BOPI nr. 5/2002.
6. Brevet de invenţie. 3570 G2, MD, C12P 33/00 Procedeu de obţinere a ergosterolului din
drojdii Saccharomyces/ Usatîi A. ş.a. (MD). Cererea depusă 2007.09.07, BOPI nr. 4/2008.
7. Brevet de invenţie. 3792 G2, MD, A01K 61/00 Furaj pentru larve şi puiet de peşte/ Usatîi A.,
Chiseliţa O. ş.a. (MD). Cererea depusă 2008.08.07, BOPI nr. 1/2009.
8. Bulimaga C. Deşeuri viniviticole: Formarea şi tehnologiile de prelucrare, tratare şi valorificarea
lor. Chişinău, 1999. 40 p.
9. Bulimaga V. ş.a. Evaluarea schimbărilor calitative ale proteinelor sumare extrase din biomasa
cianobacteriei S. platensis, cultivată în prezenţa unor compuşi coord. ai Zn(II). În: Anale ştiinţ.
ale USM, Seria „Ştiinţe chimico-biologice”, 2004, p. 84-87.
10. Bulimaga V. Studiul acţiunii unor compuşi coordinativi heteropolinucleari ai fierului asupra
conţinutului în biomasa de spirulină a unor substanţe cu efect antioxidant. În: Anale ştiinţifice
ale USM, Seria „Ştiinţe chimico-biologice”, 2005, p. 224-227.
11. Burţev S. Substanţe bioactive ale streptomicetelor (Biosinteza şi perspectivele utilizării).
Autoref. tezei de dr. hab. în biologie. Chişinău, 2002. 39 p.
12. Buţu A., Tudora C. Studii de eficientizare a prelucrării şi valorificării drojdiilor de vin. In:
Rom. Biol. Scienc., 2004, vol. 2(1,2), p. 99–108.
13. Buţu A., Tudora C. Optimisation studies for polysaccharides extraction from the parietal
component of wine yeast. In: Rom. Biol. Scienc., 2005, vol. 3(1-2), p. 93-102.
14. Cepoi L. Particularităţile fiziologo-biochimice de cultivare a algei roşii marine P. cruentum
CNM-AR-01-sursă de substanţe bioactive: Autoref. tezei de dr. în biol. Chişinău, 1995. 21 p.
15. Chiriac T. Biotehnologia cultivării spirulinei şi obţinerii produselor cu conţinut prognozat de
zinc şi principii bioactive valoroase. Autoref. tezei de dr. în biologie. Chişinău, 2003. 23 p.
16. Chiseliţa O. ş.a.. Componenţa biochimică a drojdiilor din sedimente vinicole. În: Buletinul
AŞM, Ştiinţele vieţii, 2008, vol. 1, p.132-137.
17. Chiseliţa O. ş.a. Utilizarea sedimentelor de drojdii – deşeu al industriei vinicole. În: Mediul
ambiant, 2009, nr. 2(44), p. 23-26.

110
18. Chiseliţa O. Studii privind izolarea din microflora sedimentelor vinicole a unor tulpini de
drojdii cu potenţial sporit de biosinteză a carbohidraţilor. În: Mediul ambient, 2009, nr. 4(46) p.
26-29.
19. Chiseliţa O. Studii de eficientizare a prelucrării sedimentelor de drojdii de la vinificaţie. În:
Studia Universitatis, 2009, nr. 6(26) p. 107-111.
20. Cojocari A. Paricularităţile fiziologo-biochimice şi biotehnologice ale tulpinii N. linckia (Roth)
Born et Flah CNM-CB-03 sursă de substanţe bioactive. Teza de dr. în biologie. Chişinău,
2006. 139 p.
21. Duca M., Savca E., Port A. Fiziologia vegetală. Tehnici speciale de laborator. Chişinău: USM,
2001. 173 p.
22. Efremova N. Elaborarea procedeelor de obţinere a preparatelor antioxidante pe baza
substanţelor bioactive ale cianobacteriilor şi microalgelor. Autoref. tezei de dr. în biol.
Chişinău, 2009. 29 p.
23. Ghelbet V. Endo- şi exopolizaharidele algei roşii P. cruentum CNM-AR-01. Biotehnologii de
obţinere şi perspective de utilizare. Autoref. tezei de dr. în biologie. Chişinău, 2003. 21 p.
24. Moldoveanu D., Militaru C., Moldoveanu I. Microbiologie şi Inginerie genetică. Bucureşti,
2001. p. 46-50.
25. Oniscu C., Caşcaval D. Inginerie Biochimică şi Biotehnologie. Iaşi, 2002. 451 p.
26. Rudi L. Utilizarea unor compuşi coordinativi ai Zn(II) cu aminoacizi în reglarea lipidogenezei
la S. platensis. Chişinău. Cerc. în dom. Chimiei, Realizări şi perspective. Ed. Ştiinţa 2003, vol.
2. p. 218-221.
27. Rudic V. ş.a. Studii asupra complexului de glucide ale cianobacteriei N. linckia (Roth.) Born et
Flah CNM CB 03. Anale ştiinţ. ale USM. Seria „Ştiinţe chimico-biologice”, 2003, p. 187-189.
28. Rudic V. ş.a. Despre compoziţia biochimică a unor complexe glucidice algale. În: Studia
Universitatis. Seria „Ştiinţe ale naturii”. Chişinău, CEP USM, 2008, nr. 7(17), p. 33-38.
29. Taran N. ş.a. Levuri active autohtone de colecţie. Perspective de implementare şi producere. În:
Realizări inovative în domeniul viti vinicol. Tezele conf. internaţionale consacrate comemorării
m.c. AŞM P. Ungurean (1894-1975), INVV, 2008, p. 174-177.
30. Usatîi A. Bazele fiziologo-biochimice şi biotehnologice de cultivare a drojdiilor oleogene şi
obţinerea preparatelor bioactive. Autoref. tezei de dr. hab în biologie. Chişinău, 2002. 36 p.
31. Usatîi A., Chiseliţa O.ş.a. Eficienţa utilizării noului bioprodus din drojdiile de la vinificaţie în
hrana larvelor de peşte. În: Buletinul AŞM, Ştiinţele vieţii, 2009, nr. 1(307), p. 101-104.
32. Zarnea G., Mihăescu Gh., Velahorschi T. Principii şi tehnici de microbiologie generală.
Bucureşti, 1992. vol. 1. 141 p.

111
33. Абрамов Ш. А., и др. Содержание витаминов в дрожжах рода Saccharomyces в
зависимости от состава питательной среды. В: Прикл. биохимия и микробиол. 2003, т.
39(4), с. 438-440.
34. Аркадьева З. А., и др. Под ред. Егорова Н. С. Промышленная микробиология: Учебное
пособие для вузов по спец. «Микробиология» и «Биотехнология». М.: Высш. шк., 1989.
688 с.
35. Бабицкая В. Г., и др. Факторы, влияющие на образование полисахаридов G. lucidum. В:
Прикл. Биохим. и Микробиол. 2005, т. 41(2), с. 194-199.
36. Бурьян Н. И. Практическая микробиология виноделия. Симферополь: Таврида, 2003. 560 с.
37. Вржесинская О. А., Коденцова В. М. Соотношение витаминов В1 и В2 как способ
идентификации пивных и пищевых дрожжей. В: Вопр. Питания. 2004, т.73(3), c. 22-25.
38. Горшина Е. С., Скворцова М. М., Бирюков В. В. Технология получения биоактивной
субстанции. В: Биотехнол. 2003, т. 2, c. 45-53.
39. Градова Н. Б., Бабусенко Е. С. Белково-полимикроэлементные БАД на основе биомассы
дрожжей. В: Биотехнология: состояние и перспективы развития. Мат. конгр. ч.2,
Москва, 2005, c. 104.
40. Доспехов Б. А. Методика полевого опыта. Москва: Колос, 1985. 336 c.
41. Егоров Н. С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. МГУ, 3-e изд.,
1995. 224 с.
42. Залашко М. B. Физиологическая регуляция метаболизма дрожжей. Мн.: Навука i
тэхнiка, 1991. 332 c.
43. Залашко М. В., Салохина Г.А., Королева И. Ф. Влияние стрессовых воздействий на
состав липидов дрожжей. В: Прикл. Биохим. и Микробиол. 2000, т. 36(1), с. 37-40.
44. Ившина Т. Н., и др. Выделение хитин-глюканового комплекса из плодовых тел
шляпочных грибов. В: Прикл. Биохим. и Микробиол. 2009, т. 45(3), с. 348-353.
45. Калебина Т. С., и др. Универсален ли механизм «хитиновой репарации» у дрожжей?
Докл. РАН. 2004, т. 399(4), с. 554-557.
46. Камзолова С. В., и др. Исследование влияния температуры, pH и концентрации этанола
на максимальную удельную скорость роста и состав биомассы мутантного штамма Y.
lipolytica №1. В: Микробиология, 1996, т. 65(2), c. 202-207.
47. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. в 2-х т. М.: Мир, 1981. т.1. 615 с., т.2. 523 с.
48. Литвинова Е. В., и др. Лекарственные средства на основе субстанций микробного
происхождения. В: Современное состояние и перспективы развития микробиологии и
биотехнологии. Сборник трудов международной конф. Минск, 2008, т. 2, с. 60-62.

112
49. Луканин А. В., Кривой Б. А., Вышелесский А. Б. Автолизаты-белково-витаминные и
кормовые добавки. В: Биотехнология: состояние и перспективы развития. Мат. конгр.
ч.2, Москва, 2005, c. 268.
50. Максимов В. Н. Многофакторный эксперимент в биологии. Москва: МГУ, 1980. 280 c.
51. Мамеева О. Г., и др. Внеклеточные полисахариды дрожжей C. albidus (Saito) skinner. В:
Mikpoбiол. i бiотехнол. 2008, т. 1, c. 29-34.
52. Новицкая Г. Н. Методическое руководство по тонкослойной хроматографии
фосфолипидов. М.,Наука, 1974. 82 с.
53. Овчиников Ю. А Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. Перевод с
англ., M. Наука, 1974. 462 с.
54. Осадчая А. И., и др. Способность бактерий рода Bacillus гидролизовать ксилан. В:
Мiкробiол. i Бiотехнол. 2009, т. 7 с. 63-69.
55. Патент 2084519 РФ C12N1/18, Cпособ получения питательной среды для выращивания
хлебных дрожжей./ Абрамов Ш. А., и др. (RU) Прикасп. инст. биол. рес. Дагестанского
НЦ РАН. № 5048579/13, Заявл. 29.04.92.; Опубл. 20.07.97 Бюл.№20. c. 270.
56. Патент 215179 РФ C12N1/16, C12N1/18 Cпособ получения сушеных дрожжей./ Абрамов
Ш. А., и др. (RU) Прикаспийский инст. биол. ресурсов Дагестанского научн. центра
РАН №99107057/13. Заявл.31.03.1999; Опубл.27.06.2000, Бюл. №18. c. 138.
57. Патент 2220590 РФ МПК7 А23К 1/65, С12N 1/16; Способ получения кормового белка на
основе зернового сырья./ Воробьева Г. И., и др. (RU) Федер. гос. унитар. Предпр. «Гос.
НИИ биосинт. белк. веществ».-№2002108581/13; Заявл.04.04.02; Опубл.10.01.04, Бюл. №1.
58. Патент 2233320 РФ МПК7 С12/N 1/16; №2001104412/13; Способ получения биол.
активного препарата, (БАД) к пище пребиотического действия, приводящая к коррекции
метаболического синдрома и лекарственный препарат для регуляции микробиоценоза
желудочно-кишечного тракта./ Гриневич В. Б. Заявл.13.02.01; Опубл.27.07.04, Бюл.№21.
59. Патент 2105503 РФ A23L1/30, Способ получения биоактивной пищевой добавки./
Дмитриев А. Д., и др. (RU) № 96124734/13, Заявл. 30.12.96 Опубл. 27.02.98.
60. Патент 2201445 РФ МПК7 С12/N 1/18, Способ получения сухих дрожжей./ Дмитриев К.
С., и др. (RU) ОАО «Самар. дрожжев. з-д», Приволжск. мал. науч. общ. фирма патент.
услуг и работ «Потенциал». - №99105859/13; Заявл.22.03.99; Опубл.27.03.03, Бюл. №9.
61. Патент 2203941 РФ МПК7 С12N 1/18, Способ получения дрожжей, обогащенных
йодом./ Корнеев А. Д. (RU) №2002100308/13, Заявл.14.01.02; Опубл.10.05.03, Бюл. №13.
62. Патент 2136172 РФ A23J1/18, Способ получения биoактивных веществ./ Крылов И. А., и
др. (RU) Ф. "Филантроп Интерн.", №98122876/13, Заявл. 23.12.98, Опубл. 10.09.99.

113
63. Патент 2087531 РФ C12N1/06, C12N1/16, Способ получения пищевого биоактивного
продукта переработки дрожжей./ Латов В. К., и др. (RU) №96109949/13, Заявл. 28.05.96,
Опубл. 20.08.97.
64. Патент 2080389 РФ, C12P33/00, C07J9/00, Способ получения эргостерина./ Лукницкий
Ф. И., и др. (RU) АООТ"Фармакон", №93007910/13; Заявл.10.02.1993; Опубл.27.05.1997.
65. Патент 2248137 РФ С1 А23L, Способ получения пищевой добавки-обогатителя./
Садовой В. В., Васюкова О. Н. CКГТУ №2003129755/13 Заявл.06.10.2003,
Опубл.20.03.05.
66. Патент 2230781 РФ МПК7 С12N 1/19, С07К 14/55, Штамм дрожжей S. cerevisiae 1-60-
Д578 (MSIL) – продуцент рекомбинантного интерлейкина-2 человека и способ его
получения./ Смирнов М. Н., Падкина М. В., Самбук Е. В. (RU) ООО «Биотех».-
№200235928/13; Заявл.27.12.02; Опубл.20.06.04, Бюл. №17.
67. Патент 2186848 РФ МПК7 С12N 9/02 Способ выделения СОД./ Соловьева Л. Я., и др.
(RU) №2001112992/13; Заявл.16.05.01; Опубл.10.08.02, Бюл. №22.
68. Патент 2216595 РФ МПК7 С12Р 19/04, С08В 37/00, Способ получения бета-глюканов
клеточной стенки дрожжей./ Тонева-Давидова Е. Г. (RU) ЗАО «ТЗФ ВАИГ».
№2002130728/13; Заявл.18.11.02; Опубл.20.11.03, Бюл. №32.
69. Пирог Т. П., Кузьминьска Ю. В. Влияние условий культивирования продуцентов
экзополисахаридов на их синтез и физ.-хим свойства. В: Бiополiм. i клiтина. 2003, т.
19(5), c. 393-413.
70. Прохорова М. И. Методы биохимических исследований. Ленинград, 1982. 272 с.
71. Рудик В., и др. Продуктивность и биохимический состав S. platensis (Nordst.) Geitl. Calu-
835) при культивировании в присутствии кординационных соединений Zn(II). В:
Альгология, 2003, т. 13(3), с. 322-329.
72. Тихомирова О. М., Витовская Г. А., Синицкая И. А. Изменения в составе клеточных
полисахаридов Rh. rubra (DEMME) Lodder в процессе биосинтеза экзоманнана. В:
Микробиология, 1998, т. 67(1), с. 79-84.
73. Тихомирова О. М., и др. Полисах. клеток C. laurentii (Kufferath) skinner – продуцента
внеклеточного гетерогликана. В: Микробиология, 1998, т. 67(1), с. 73-78.
74. Tюркел С. Сравнительный анализ накопл. гликогена и трегалозы у метило-и
неметилотрофных дрожжей. В: Микробиология, 2006, т. 75(6), c. 737-741.
75. Феофилова Е. П. и др. Состав и содержание хитин-глюканового комплекса в онтогенезе
гриба A. niger. В: Прикл. Биохим. и Микробиол. 2006, т. 42(6), с. 624-628.

114
76. Яшин Т. А., Волфович Д. И., Куликова В. П. Биологически активные пищевые добавки
на основе дрожжевых автолизатов. В: Биотехнология: состояние и перспективы
развития. Мат. конгр. ч.2, Москва, 2005, c. 173.
77. Abe F., Hiraki T. Mechanistic role of ergosterol in membrane rigidity and cycloheximide
resistance in S. cerevisiae. In: BBA, 2008, vol. 1, p. 1-10.
78. Aguilar-Uscanga B., Francois J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in
response to growth cond. and mode of cultiv. Lett. in Appl. Microbiol. 2003, vol. 37, p. 268-274.
79. Aguilar-Uscanga B., et al. Effect of A. tequilana juice on cell wall polysaccharides of three S.
cer. strains from different origins. In: Antonie van Leeuwenhoek. 2007, vol. 91(2), p. 151–157.
80. Alexis N. Campetelli, et al. Activation of the plasma membrane H+-ATPase of S. cerevisiae. by
glucose is mediated by dissociation of the H+-ATPase acetylated tubulin complex. In: FEBS J.,
2005, vol. 272(22), p. 5742-5752.
81. Andrews S., Robinson A., Rodriguez F. Bacterial iron homeostasis. In: FEMS Microbiol. Rev.,
2003, vol. 27, p. 215-231.
82. Annegret Boch, et al. Loss of Zhf and the tightly regulated zinc-uptake system SpZrt1 in S.
pombe reveals the delicacy of cell. zinc balance. In: FEMS Y. Res. 2008, vol. 8(6), p. 883–896.
83. Argiielles J. C. Physiological roles of trehalose in bacteria and yeast: a comparative analysis.
In: Arch. Microbiol. 2000, vol. 174, p. 217-224.
84. Barberis M., et al. Cell size at S phase initiation: an emergent property of the G1/S network In:
PLoS Comput. Biol., 2007, vol. 13, 3(4):e64.
85. Barnett J. A., Payne R. W., Varrow D. Yeasts: Characteristics and Identification. 3-rd edition,
Cambridge Univ. Press, 2000. 1150 p.
86. Belinchón M. M., Gancedo J. M. Glucose controls multiple processes in S. cerevisiae. through
diverse combinations of signaling pathways. In: FEMS Y. Res. 2007, vol. 7(6), p. 808–818.
87. Berthels N. J., et al. Discrepancy in glucose and fructose utilisation during fermentation by S.
cerevisiae wine yeast strains. In: FEMS Y. Res. 2004, vol. 4(7), p. 683-689.
88. Beuse M., et al. O2, pH value, and carbon source induced changes of the mode of oscillation in
synchronous continuous cult. of S. cer. In: Biotechnol. Bioeng. 1999, vol. 20, 63(4), p.410-417.
89. Blank H. M., et al. Sulfur metabolism actively promotes initiation of cell division in yeast. In:
PLoS One, 2009, vol. 24, 4(11):e8018.
90. Blenkowe D., Morby A. Zn(II) metabolism in prokaryotes. In: FEMS Microbiol. Rev., 2003,
vol. 27, p. 291-331.
91. Breivik Torbjorn., et al. Solubleβ-1,3/1,6-glucan from yeast inhibits experimental periodontal
disease in Wistar rats. In: J. of Clin. Periodont., 2005, vol. 32(4), p. 347-352.

115
92. Bulik D. A., et al. Chitin synthesis in S. cererevisiae in response to supplementation of growth
medium with glucosamine and cell wall stress. In: Eukaryot. Cell, 2003, vol. 2(5), p. 886-900.
93. Caridi A. New perspectives in safety and quality enhancement of wine through selection of
yeasts based on the parietal adsorption activity. In: Int. J. of Food Microbiol., 2007, vol.
120(1,2), 30, p. 167-172.
94. Carlson M. Glucose repression in yeast. In: Curr. Opin. Microbiol. 1999, vol.2, p.202–207.
95. Chagas B., et al. Extraction and purification of cell wall polysaccharides from P. pastoris
biomass. In: New Biotechnol., 2009, vol. 25(1), p. 214-218.
96. Charoenchai C., Fleet G., Henschke P. Effects of temperature, ph and sugar concentration on
the growth rates and cells biomass of wine yeasts. In: Am. J. of Enol. And Viticul., 1998, vol.
49, p. 283-288.
97. Chau G. P., et al. Beta-1,3-glucan effect on sow antibody production and passive
immunisation of progeny. In: Food and Agric. Immunol., 2009, vol. 20(3), p. 185-193(9).
98. Chaung H. C., et al. Immunomodulatory effects of beta-glucans on porcine alveolar
macrophages and bone marrow haematopoietic cell-derived dendritic cells. In: Vet Immunol
Immunopathol., 2009, vol. 131(3,4), p. 147-157.
99. Chavan M. T. et al. Genetic, biochemical, and morphological evidence for the involvement of
N-glycosylation in biosynthesis of the cell wall ß1,6-glucan of S. cerevisiae. In: Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 2003, vol. 100, p. 15381-15386.
100. Chen Jiezhong, Seviour Robert. Medicinal importance of fungal β-(1→3), (1→6)-glucans. In:
Mycol. Res., 2007, vol. 111(6), p. 635-652.
101. Chen W., et al. Optimization for the production of exopolysacch. from F. fomentarius in
submerged culture and its antitumor effect in vitro. In: Biores. Technol., 2008, vol. 99(8), p.
3187-3194.
102. Chi Z., Fang Y. Exopolysaccharides from marine bacteria. In: J. Ocean Univ. China, 2005,
vol. 4(1), p. 67-74.
103. Chin-Hang S., Ko-Jung L., Bor-Jiun W. Effects of culture temperature on the production of
bioactive polysaccharides by A. blazei in batch cultures. In: J. of Chem. Technol. &
Biotechnol., 2007, vol. 82(9), p. 831-836.
104. Chris D. P., David E. Q., Smart K. A. The impact of brewing yeast cell age on fermentation
performance, attenuation and flocculation. In: FEMS Y. Res., 2003, vol. 3(2), p. 149–157.
105. Conde R., Cueva R., Larriba G. Rsc14-controlled expression of MNN6, MNN4 and MNN1
regulates mannosylphosphorylation of S. cerevisiae cell wall mannoproteins. In: FEMS Y.
Res., 2007, vol. 7(8), p. 1248–1255.

116
106. Dalmo Roy A., Bogwald Jarl. ß-glucans as conductors of immune symphonies. In: Fish &
Shellfish Immunol., 2008, vol. 25(4), p. 384-396.
107. Danac R., et al. Synthesis of UDP-glucose deriv. modified at the 3-OH as potential chain
terminators of β-glucan biosynthesis. In: Carbohydrate Res., 2008, vol. 343(6,5), p. 1012-1022.
108. Davidson J. F., et al. Oxidative stress is involved in heat-induced cell deatherior S. cerevisiae.
In: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol. 93(10), p. 5116-5121.
109. De Nicola R., et al. Physiological and transcriptional responses of S. cerevisiae to zinc
limitation in chemostat cultures. In: Appl. Environ. Microbiol., 2007, vol. 73(23), p. 7680-7692.
110. De Nicola R., Graeme M. W. Accumulation and cellular distribution of zinc by brewing
yeast. In: Enz. and Microbial Technol., 2009,vol. 44(4,6), p. 210-216.
111. Dergunova M. A., et al. Characterization of the novel chemically modified fungal polysaccharides
as the macrophage stimulators. In:Int. Immunopharm. 2009, vol. 9(6), p. 729-733.
112. Dey, P. M. & Harborne, J. B. Methods in Plant Biochemistry. Carbohydr. Academic Press,
1993. vol. 2. 529 p.
113. Eicher, S. D., et al. Supplement vitamin C and yeast cell wall β-glucan as growth enhancers in
newborn pigs and as immunomodulators after an endotoxin challenge after weaning. In: J. of
Animal Sci., 2006, vol. 84(9), p. 2352-2360.
114. Fang Q. H., Zhong J. J. Effect of initial pH on production of ganoderic acid and
polysaccharides by submerged fermentation of G. lucidum. In: Proc.Biochem. 2002,vol.
37(7), p. 769-774.
115. Fei Shang, Zheng Wang and Tianwei Tan. High-cell-density cultivation for co-production of
ergosterol and reduced glutathione by S. cerevisiae. In: Appl. Microbiol. and Biotechnol.,
2008, vol. 77(6), p. 1233-1240.
116. Forsberg, H., Ljungdahl, P. O. Genetic and bioch. analysis of the yeast plasma membrane
Sy1p-Ptr3p-Sy5p sensor of extracellular amino acids. In: Mol. Cell Biol. 2001, vol. 21, p.
814–826.
117. Francois J., Parrou J. Reserve carbohydrates metabolism in the yeast S. cerevisiae. In: FEMS
Y. Microbiol. Rev., 2001, vol.25, p. 125-145.
118. Fumiyoshi Abe. Induction of DAN/TIR yeast cell wall mannoprotein genes in response to high
hydrostatic pressure and low temperature. In: FEBS Lett., 2007, vol. 581(25), p. 4993-4998.
119. Gagianoa M., Bauera F. F., Pretorius I.S. The sensing of nutritional status and the relationship
to filamentous growth in S. cerevisiae. In: FEMS Y. Res., 2002, vol. 2(4), p. 433-470.
120. Gancedoa C., Carmen-Lisset F. The importance of a functional trehalose biosynthetic
pathway for the life of yeasts and fungi. In: FEMS Y. Res., 2004, vol. 4(4,5), p. 351-359.

117
121. Gancedo, J. M. Yeast carbon catabolite repression. In: Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1998, vol.
62, p. 334–361.
122. Garcia, P., Tajadura, V., Sanchez, Y. The Rho1p Exchange Factor Rgf1p Signals Upstream
from the Pmk1 Mitogen-activated Protein Kinase Pathway in Fission Yeast. In: Mol. Biol.
Cell, 2009, vol. 20(2), p. 721-731.
123. Gemma Beltran, et al. Integration of transcriptomic and metabolic analyses for understanding
the global responses of low-temperature winemaking fermentations. In: FEMS Y. Res., 2006,
vol. 6(8), p. 1167–1183.
124. Gomez A., et al. Slt2 and Rim101 Contribute Independently to the Correct Assembly of the
Chitin Ring at the Budding Yeast Neck in S. cerevisiae. In: Eukar. Cell, 2009, vol. 8(9), p.
1449-1459.
125. Gómez-Verduzco G., et al. Dietary supplementation of mannan-oligosaccharide enhances
neonatal immune responses in chickens during natural exposure to Eimeria spp. In: Acta Vet
Scand., 2009, vol. 51, p. 11-18.
126. Gonzalez M., Lipke P. N., Ovalle R. Chapter 15 GPI Proteins in Biogenesis and Structure of
Yeast Cell Walls. In: The Enzymes, 2009, vol. 26, p. 321-356.
127. Gonzalez-Ramos D., Cebollero E., Gonzalez R. A. Recombinant S. cerevisiae Strain
Overproducing Mannoproteins Stabilizes Wine against Protein Haze. In: Appl. and Environ.
Microbiol., 2008, vol. 74(17), p. 5533-5540.
128. Goto M., et al. Protein O-Mannosyltransferases B and C Support Hyphal Development and
Differentiation in A. nidulans. In: Eukaryot. Cell, 2009, vol. 8(10), p. 1465-1474.
129. Gustavo G. Fonseca, et al. Physiology of the yeast K. marxianus during batch and chemostat
cultures with glucose as the sole carbon source. In: FEMS Y. Res., 2007, vol. 7(3), p.422-435.
130. Guillou V., et al. Role of reserve carbohydrates in the growth dynamics of S. cerevisiae. In:
FEMS Y. Res., 2004, vol. 4(8), p. 773-787.
131. Hashimoto K. Comprehensive analysis of glycosyltransferases in eukaryotic genomes for
structural and functional character. of glycans. In: Carbohydr. Res. 2009, vol. 344(7), p.881-887.
132. Hayashi T., et al. Calcium spirulan, an inhibitor of enveloped virus replication, from a blue-
green alga S. platensis. In: J. of Natur. Product, 1996, vol.59(1), p. 83-87.
133. Hazelwood L. A., et al. Identity of the growth-limiting nutrient strongly affects storage
carbohydrates accumulation in anaerobic chemostat cultures of S. cerevisiae. In: Appl
Environ Microbiol., 2009, vol. 75(21), p. 6876-6885.
134. Hese K., et al. The yeast oligosaccharyltransferase complex can be replaced by STT3 from L.
major. In: Glycobiol., 2009, vol. 19(2), p. 160-171.

118
135. Hisashi Yazawa, et al. Production of polyunsaturated fatty acids in yeast S. cerevisiae and its
relation to alkaline pH tolerance. In: Yeast, 2009, vol. 26(3), p. 167–184.
136. Hisashi Yazawa, et al. Improvement of polyunsaturated fatty acids synthesis by the
coexpression of CYB5 with desaturase genes in S. cerevisiae. In: Appl. Microbiol. and
Biotechnol., 2010, vol. 87(6), p. 2185-2193.
137. Hong-Chi T., et al. Lipidome profiling of S. cerevisiae reveals pitching rate-dependent
fermentative performance. In: Appl. Microbiol. and Biotechnol., 2010, vol. 87(4), p. 1507-
1516.
138. Hong-Zhi L., et al. Statistical optimization of culture media and conditions for production of
mannan by S. cerevisiae. In: Biotech. and Bioprocess Engineering, 2009, vol. 14(5), p. 577-583.
139. http://www.yarapteka.ru/modules.php?name=spr&inf=425.
140. http://www.kirkmanlabs.com/products/probiotics/saccharomyces/Saccharomyces C
141. Hu Shu-Hui, et al. Antihyperglycemic effect of polysaccharides from fermented broth of P.
citrinopileatus. In: Appl. Microbiol. and Biotechnol., 2006, vol. 70(1), p. 107-113.
142. Huff G. R., et al. Limited Treatment with β-1,3/1,6-Glucan Improves Production Values of
Broiler Chickens Challenged with E. coli. In: Poultry Science, 2006, vol. 85(4), p. 613-618.
143. Hunter K. W. Jr., Gault R. A., Berner M. D. Preparation of microparticulate β-glucans from S.
cerevisiae for use in immune potentiation. In: Lett. in Appl. Microbiol., 2002, vol. 35, p. 267-271.
144. Hurtado-Guerrero Ramon, et al. Molecular Mechanisms of Yeast Cell Wall Glucan
Remodeling. In: J. of Biol. Chem., 2009, vol. 284(13), p. 8461-8469.
145. International Application No. PCT/JP2006/317212 C13K 1/02, B09B 3/00 Method of
producing saccharide compositions starting with biomass. Hisamatsu M., Furujyo A. Oji
Paper Co., Ltd. WO/2007/026817, F. Date:31.08.06, P. Date:08.03.07.
146. Ioannis S. Arvanitoyannis, Ladas D., Mavromatis A. Potential uses and applied of treated
wine waste. In: Int. J. of F. Science & Technol., 2006, vol. 41(5), p. 475–487.
147. Iraqui I., et al. Amino acid signaling in S. cer.: a permease-like sensor of external amino acids
and F-Box protein Grr1p are required for transcriptional induction of the AGP1 gene, which
encodes a broad-specificity amino acid permease. In: Mol. Cell Biol. 1999, vol. 19, p. 989–
1001.
148. Iwanyshyn W., Han G., Carman G. Regulation of phospholipid synthesis in S. cerevisiae by
zinc. In: J. Biol. Chem., 2004, vol. 279(21), p. 21976-21983.
149. Jami B. O’Quin, Robert T. Mullen, John M. Dyer. Addition of an N-terminal epitope tag
significantly increases the activity of plant fatty acid desaturases expressed in yeast cells. In:
Appl. Microbiol. and Biotechnol., 2009, vol. 83(1), p. 117-125.

119
150. Jin H., Fang H., Zhuge J. Byoproduct formation by a novel glycerol-producing yeast C.
glycerinogenes with different O2 supplies. In: Biotechnol. Lett., 2003, vol.25(4), p. 311-314.
151. Jirku V., Masak J., Cejkova A. Yeast cell attachment: A tool modulating wall composition
and resistance to 5bromo-6azauracil. In: Enz. and Microb. Technol., 2000, vol. 26(9,10), p.
808-811.
152. Joaquín Pérez-Guisado. Argumentos a favor de la incorporación de los β-D-glucanos a la
alimentación. In: Endocrinol. y Nutrición, 2007, vol. 54(6), p. 315-324.
153. Johnston M. Fasting, feasting and fermenting: glucose sensing in yeast and other cells. In:
Trends Genet., 1999, vol. 15, p. 29–33.
154. Jorunn Skjermo, et al. Evaluation of β-(1→3, 1→6)-glucans and High-M alginate used as
immunostimulatory dietary supplements during first feeding and weaning of Atlantic cod (G.
morhua L.). In: Aquaculture, 2006, vol. 261(3), p. 1088-1101.
155. Joung Han Yim, et al. Antiviral effects of sulfated exopolysaccharides from the marine
microalga G. impudicum strain KG03. In: Mar. Biotechnol., 2004, vol. 6(1), p. 17-25.
156. Judith Dietvorst, et al. Amino acid residues involved in ligand preference of the Snf3
transporter-like sensor in S. cerevisiae. In: Yeast, 2010, vol. 27(3), p. 131–138.
157. Julian Weghuber, et al. Mutational analysis of functional domains in Mrs2p, the
mitochondrial Mg2+ channel protein of S. cerevisiae. In: FEBS J., 2006, vol. 273(6), p. 1198-
1209.
158. Kapteyn J. C., et al. Low external pH induces HOG1-dependent changes in the organization
of the S. cerevisiae cell wall. In: Mol Microbiol., 2001, vol. 39(2), p. 469-479.
159. Karachitosa A., et al. Cu, Zn-SOD is necessary for proper function of VDAC in S. cerevisiae
cells. In: FEBS Lett., 2009, vol. 583(2), p. 449-455.
160. Kates M. Separation of lipid mixtures. Techniques of Lipidology, Elsevier, 1988. p. 186-278.
161. Kiran M. Desai, et al. Use of an artificial neural network in modeling yeast biomass and yield
of β-glucan. In: Process Biochem., 2005, vol. 40(5), p. 1617-1626.
162. Kitanovic A., et al. Metabolic response to MMS-mediated DNA damage in S. cerevisiae is
dependent on the glucose concentr. in the medium. In: FEMS Y. Res., 2009, vol. 9(4), p. 535-
551.
163. Klis F. M., et al. Dynamics of cell wall structure in S. cerevisiae. In: FEMS Microbiol. Rev.,
2002, vol. 26, p. 239-256.
164. Kogan G., et al. Antioxidant properties of yeast (1-3)-β-d-glucan studied by electron
paramagnetic resonance spectroscopy and its activity in the adjuvant arthritis. In: Carbohydr.
Polymers, 2005, vol. 61(1), p. 18-28.

120
165. Kogan G., Kocher A. Role of yeast cell wall polysaccharides in pig nutrition and health
protection. In: Livestock Sci., 2007, vol. 109(1,3), p. 161-165.
166. Kotia N., Lomtatidze Z. Peculiarites of cell wall ultrastructure of N. dassonvilei. Georg. Med.
News, 2006, vol. 7(136), p. 125-128.
167. Kreger-Van Rij N.J.W. General classification of the yeasts. The yeast: Ataxonomic study,-3rd.
ed. Ed. N.J.W. Kreger-Van Rij-Amsterdam Elesevier Biomed. Preis, 1984. 1082 p.
168. Krizková L., et al. Antioxidant and antimutagenic activity of mannan neoglycoconjugates:
mannan-human serum albumin and mannan-penicillin G acylase. In: Mutat. Res., 2006, vol.
606(1,2), p. 72-79.
169. Kruckeberg A. L., Walsh M. C., Van Dam K. How do yeast cells sense glucose? In: Bio.
Essays, 1998, vol. 20, p. 972–976.
170. Kwang S. K., Hyun S. Y. Production of soluble β-glucan from the cell wall of S. cerevisiae.
In: Enz. and Microb. Technol., 2006, vol. 39(3), p. 496-500.
171. Latgé Jean-Paul. The cell wall: a carbohydrates armour for the fungal cell. In: Mol.
Microbiol., 2007, vol. 66(2), p. 279-290.
172. Lesage G., Bussey H. Cell Wall Assembly in S. cerevisiae. In: Microbiol. and Mol. Biol.
Rev., 2006, vol. 70(2), p. 317-343.
173. Lowry O. H., et al. Protein measurment with the Folin phenol reagent. In: J. Biol. Chem.,
1951, vol. 193, p. 265-275.
174. Machi K., et al. Rot1p of S. cerevisiae is a putative membrane protein required for normal
levels of the cell wall 1,6-ß-glucan. In: Microbiol., 2004, vol. 150, p. 3163-3173.
175. Madrigal-Santillán E, et al. Inhibitory effect of mannan on the toxicity produced in mice fed
aflatoxin B1 contaminated corn. In:Arch. Environ Contam. Toxicol., 2007, vol. 53(3), p. 466-472.
176. Madrigal-Santillán E, et al. Investigation on the Protective Effect of alpha-Mannan against the
DNA Damage Induced by Aflatoxin B(1) in Mouse Hepatocytes. In: Int. J. Mol. Sci., 2009,
vol. 10(2), p. 395-406.
177. Magnelli P., Cipollo J., Abeijon C. A refined method for the determination of S. cerevisiae
cell wall composition and ß1,6-glucan fine structure. In: Anal. Biochem., 2002, vol. 301, p.
136-150.
178. Maneesri Jaruwan, et al. Deletion of MCD4 involved in (GPI) anchor synthesis leads to an
increase in β-1,6-glucan level and a decrease in GPI-anchored protein and mannan levels in
the cell wall of S. cerevisiae. In: J. of Biosci. & Bioeng., 2005, vol. 99(4), p. 354-360.
179. Mantovani M. S., et al. β-Glucans in promoting health: Prevention against mutation and
cancer. In: Mut. Res./Rev. in Mut. Res., 2008, vol. 658(3), p. 154-161.

121
180. Morales R., et al. Effects on productive parameters and digestive mucosa of broilers caused
by feed supplemented with cell walls S. cerevisiae, beta-glucans and mannoproteins. In:
Poultry Sci., 2008, vol. 87(1), p. 173-178.
181. Nilsson T., Au C. E., John J. M. Bergeron. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi
apparatus. In: FEBS Lett., 2009, vol. 583(23), p. 3764-3769.
182. Nishida O., et al. Superior molasses assimilation, stress tolerance, and trehalose accumulation
of baker’s yeast isolated from dried sweet potatoes (hoshi-imo). In: Biosci. Biotechnol.
Biochem., 2004, vol. 68(7). p. 1442-1448.
183. Novak M., Vetvicka V. Glucans as Biological Response Modifiers. In: Endocrine Metabol. &
Immune Disorders-Drug Targets, 2009, vol. 9(1), p. 67-75.
184. Okamoto M., et al. The Cytoplasmic Region of {alpha}-1,6-Mannosyltransferase Mnn9p Is
Crucial for Retrograde Transport from the Golgi Apparatus to the Endoplasmic Reticulum in
S. cerevisiae. In: Eukaryot Cell, 2008, vol. 7, p. 310-318.
185. Paalman J. W., et al. Trehalose and glycogen accumulation is related to the duration of the G1
phase of S. cerevisiae. In: FEMS Y. Res., 2003, vol.3(3), p. 261-268.
186. Paraggio M., Fiore C. Screening of S. cerevisiae wine strains for the production of acetic acid.
In: World J. Microbiol. and Biotechnol., 2004, vol. 20(7), p. 743-747.
187. Parrou J., et al. Dynamic responses of reserve carbohydrates metabolism under carbon and
nitrogen limitation in S. cerevisiae. In: Yeast, 1999, vol. 15, p. 191-203.
188. Patent Australian 780186 С12Р 033/00 Method for preparing steroids modifieds by yeast
fermentation./ Cauet G., et al. Transgene S.A.№200076726, F.Date:04.10.00, P. Date:03.03.05.
189. Patent US 6753008 А61К 47/00, С12N 13/00. Dietary supplements beneficial for the liver./
Cheung L. Y. Ultra Biotech Ltd. №10/187112; F.Date:28.06.02; P.Date:22.06.04.
190. Patent US 6867024 А23L 1/30, Ubiquinone composition and methods related thereto./
Chokshi Dilip. Pharm. Lab., Inc.-№ 10/126476; F.Date:19.04.02, P.Date:15.03.05.
191. Patent US 6689593 С12N 9/02 С12Р 7/02, Production of farnesol and geranylgeraniol./
Millis J. R., Maurina-Brunker J., McMullin T. W. Arkion Life Sciences LLC.-№09/909558,
F.Date:20.07.01, P. Date:10.02.04.
192. Pavlova K., et al. Production and characterization of an exopolysaccharides by yeast. In:
World J. Microbiol. and Biotechnol., 2004, vol. 20(4), p. 435-440.
193. Philippis R., et al. Phospholipids and fatty acyl composition of S. cerevisiae. as affected by O2
and low growth temperature. In: Vitis: Viticulat. and Enol. Abstr., 2000, vol. 39(1,2). p.52-56.
194. Presta A., Stillman M. J. Incorporation of copper into the yeast S. cerevisiae identification of
Cu(I)-metallothionein in intact yeast cells. In: J. of Inorg. Bioch., 1997, vol. 66(4), p.231-240.

122
195. Pretorius I. S., du Toit Maret, van Rensburg P. Designer yeasts for the fermentation industry
of the 21st century. In: Food Technol. and Biotechnol., 2003, vol. 41(1), p. 3-10.
196. Rafael Ojeda, et al. Preparation of multifunctional glyconanoparticles as a platform for
potential carbohydrates-based anticancer vaccines. In: Carbohydr. Res., 2007, vol. 342(3,4),
p. 448-459.
197. Rebar E., Miller J. Design and applications of engineered zinc finger proteins. In: Bio. Tech.
Inter., 2004, vol. 16(2), p. 20-24.
198. Reiner S., et al. S. cerevisiae a model to study sterol uptake and transport in eukaryotes. In:
Biochem. Soc. Trans., 2005, vol. 33, p. 1186-1188.
199. Robert J. Karreman, et al. The stress response protein Hsp12p increases the flexibility of the
yeast S. cerevisiae cell wall. In: (BBA) - Proteins & Proteomics, 2007, vol. 1774(1), p. 131-
137.
200. Rolland F., Winderickx J., Thevelein J. M. Glucose-sensing mechanisms in eukaryotic cells.
In: Trends Biochem. Sci., 2001, vol. 26, p. 310–317.
201. Rondanelli M., Opizzi A., Monteferrario F. The biological activity of beta-glucans. In:
Minerva Med., 2009, vol. 100(3), p. 237-245.
202. Rosenzweig A. Metallochaperones: Bind and deliver. In: Chem. Biol., 2002, vol. 9, p. 673-677.
203. Roustan J. L., Sablayrolles J. M. Trehalose and glycogen in wine-making yeasts:
Methodological aspects and variability. In: Biotechnol. Lett., 2002, vol. 24(13), p. 1059-1064.
204. Rudic V., et al. The influence of some coordination compounds of Zn(II) on productivity and
biochemical compositions S. platensis (Nordst.)Geitl.Calu-835. „Metal Elements in
Environment, Medicine and Biol.” Publishing House „Eurobiot”, 2002, vol. 5, p. 339.
205. Ruiz-Herrera J., González-Prieto M. J., Ruiz M. R. Evolution and phylogenetic relationships
of chitin synthases from yeasts and fungi. In: FEMS Y. Res., 2002, vol. 1(4), p. 247-256.
206. Ruszova E., et al. Photoprotective effects of glucomannan isolated from C. utilis. In:
Carbohydr. Res., 2008, vol. 343(3), p. 501-511.
207. Sampaio B. A., et al. The capacity of manno-oligosaccharides, thermolysed yeast and active
yeast to attenuate aflatoxicosis. In: World J. Microbiol. and Biotechnol., 2004, vol. 20(5), p.
475-481.
208. Sankaranarayanan R., et al. The NMR solution structure of subunit G (G61–101) of the
eukaryotic V1VO ATPase from S. cerevisiae. In: (BBA) - Biomembranes, 2010, vol.
1798(10), p. 1961-1968.
209. Sarinho E., et al. Production of interleukin-10 in asthmatic children after Beta-1-3-glucan. In:
Allergol. et Immunopathol., 2009, vol. 37(4), p. 188-192.

123
210. Scrimale T., et al. The Unfolded Protein Response Is Induced by the Cell Wall Integrity
Mitogen-activated Protein Kinase Signaling Cascade and Is Required for Cell Wall Integrity
in S. cerevisiae. In: Mol. Biol. Cell, 2009, vol. 20(1), p. 164-175.
211. Shahinian S. & Bussey H. β-1,6-Glucan synthesis in S. cerevisiae. In: Mol. Microbiol., 2000,
vol. 35(3), p. 477-489.
212. Shu C. H., Wen B. J. Enhanced shear protection and increased production of an anti-tumor
polysaccharides by A. blazei in xanthan-supplemented cultures. In: Biotechnol. Lett., 2003,
vol. 25(11), p. 873-876.
213. Silke C. J., et al. Antioxidative activity of (1-3), (1-6)-β-d-glucan from S. cerevisiae grown on
different media. In: LWT-Food Sci. and Technol., 2008, vol. 41(5), p. 868-877.
214. Simons J. F., Ebersold M., Helenius A. Cell wall 1,6-ß-glucan synthesis in S. cerevisiae
depends on ER glucosidases I and II, and the molecular chaperone BiP/Kar2p. In: EMBO J.,
1998, vol. 17(2), p. 396-405.
215. Soltanian S., et al. The protective effect against V. campbellii in A. nauplii by pure β-glucan
and isogenic yeast cells differing in β-glucan and chitin content operated with a source-
dependent time lag. In: Fish & Shellfish Immunol., 2007, vol. 23(5), p. 1003-1014.
216. Son H. J, et al. Effects of β-glucan on proliferation and migration of fibroblasts. In: Curr.
Appl. Physics, 2005, vol. 5(5), p. 468-471.
217. Stehlik-Tomas V., et al. Zinc, copper and manganese enrichment in yeast S. cerevisiae. In:
Food Technol. and Biotechnol., 2004, vol. 42(2), p. 115-120.
218. Storz G., Imlay J.A. Oxidative stress. In: Curr. Opin. Microbiol., 1999, vol. 2(2), p.188-194.
219. Stuart G. R., et al Transcriptional response to mitochondrial NADH kinase deficiency in S.
cerevisiae. In: Mitochondrion, 2009, vol. 9(3), p. 211-221.
220. Stuart M. L, Charles A. S. The molecular basis for the immunogenicity of C. neoformans
mannoproteins In: FEMS Y. Res., 2006, vol. 6(4), p. 513–524.
221. Sylvain Brohée, et al. YTPdb: A wiki database of yeast membrane transporters. In: (BBA) -
Biomembranes, 2010, vol. 1798(10), p. 1908-1912.
222. Tai S. L., et al. Acclimation of S. cerevisiae to low temperature: a chemostat-based
transcriptome analysis. In: Mol Biol Cell, 2007, vol. 18(12), p. 5100-5112.
223. Takuji O., Yoshifumi J. Reconstruction de novo pathway for synthesis UDP-glucuronic acid
and UDP-xylose from intrinsic UDP-glucose in S. cerevisiae. In: FEBS J., 2006, vol. 273(12),
p. 2645-2657.
224. Tan T., Zhang M., Gao H. Ergosterol production by fed-batch fermentation of S. cerevisiae.
In: Enz. and Microb. Technol., 2003, vol. 33(4), p. 366-370.

124
225. Tang Y. J., Zhong J. J. Role of O2 supplied in submerged ferm. of G. lucidum for production
of Ganoderma polysaccharide and ganoderic acid. IN: Enz. and Microb. Technol., 2003, vol.
32(3,4). p. 478-484.
226. Ter Schure E. G., Van Riel N. A., Verrips, C. T. The role of ammonia metabolism in nitrogen
catabolite repression in S. cerevisiae. In: FEMS Microbiol. Rev., 2000, vol. 24, p. 67–83.
227. Thammakiti S., et al. Preparation of spent brewer's yeast β-glucans for potential applications
in the food industry. Int. J. of Food Sci. & Technol., 2004, vol. 39(1), p. 21-29.
228. Thomas M. Devlin.Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations. 6-th ed., Edited by
John Wiley & Sons, Inc., Publ., 2006, p. 543-550.
229. Toshihiko K., Yasunori C., Yoshifumi J. S. cerevisiae α1,6-mannosyltransferase has a
catalytic potential to transfer a second mannose molecule. In: FEBS J., 2006, vol. 273(22), p.
5074-5085.
230. Tubiana M. Prevention of cancer and the dose-effect relationship the carcinogenic effects of
ionizing radiations. In: Cancer Radiother., 2009, vol. 13(4), p. 238-258.
231. Utsugi T., et al. Movement of yeast 1,3-β-glucan synthase is essential for uniform cell wall
synthesis. In: Gen. to Cells, 2002, vol. 7(1), p. 1-9.
232. Varga E., Maraz A. Yeast cells as sources of essential microelements and vitamins B1 and B2.
In: Acta alim., 2002, vol. 31(4), p. 393-405.
233. Veen M., Lang C. Production of lipid compounds in the yeast S. cerevisiae. In: Appl.
Microbiol. and Biotechnol., 2004, vol. 63(6), p. 635-643.
234. Velazquez E. A., et al. Immunological Response to (1,4)-α-d-Glucan in the lung and spleen of
endotoxin-stimulated juvenil rats. In: Basic & Clinical Pharm. & Toxicol., 2009, vol. 105(5),
p. 301-306.
235. Vivier M., Lambrechts M., Pretorius I. Co-regulation of starch degradation and dimorphism
in the yeast S. cerevisiae. In: Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 1997, vol. 32, p. 405–435.
236. Volman J. J., Ramakers J. D., Plat J. Dietary modulation of immune function by beta-glucans.
In: Physiol Behav., 2008, vol. 23(94(2), p. 276-284.
237. Volman J. J., et al. Dietary (1>3), (1>4)-beta-D-glucans from oat activate nuclear factor-
kappa B in intestinal leukocytes and enterocytes from mice. In: Nutr. Res., 2010, vol. 30(1),
p. 40-48.
238. Wakako N., et al. Clinical significance of (1→3)-β-d-glucan in a patient with invasive sino-
orbital aspergillosis. In: Auris Nasus Larynx, 2009, vol. 36(2), p. 224-227.
239. Weihua Ni, et al. Preparation of a glucan from the roots of R. crataegifolius Bge. and its
immunological activity. In: Carbohydr. Res., 2009, vol. 344(18,14), p. 2512-2518.

125
240. Xiaohua W., Lina Z. Physicochemical properties and antitumor activities for sulfated
derivatives of lentinan In: Carbohydr. Res., 2009, vol. 344(16), p. 2209-2216.
241. Xue Dong-hua, et al. Screening of yeast strains for the biosynthesis of ergosterol. J.
Changchun Univ. Technol., 2003, vol. 24(3), p. 16-18.
242. Yiannikouris A., et al. Influence of pH on Complexing of Model β-D-Glucans with
Zearalenone. In: J.of Food Protect, 2004, vol. 67(12), p. 2741-2746.
243. Yoon T. J., et al. Anti-tumor metastatic activity of β-glucan purified from mutated S.
cerevisiae. In: Int. Immunopharm., 2008, vol. 8(1), p. 36-42.
244. Zheng N, et al. Structure of a c-Cbl-UbcH7 complex: RING domain function in ubiquitin-
protein ligases. In: Cell, 2000, vol. 18(102(4), p. 533-539.

126
ANEXE

127
 ANEXA 1
Brevet de invenţie. 3792 G2, MD, A01K 61/00 Furaj pentru larve şi puiet de peşte/ Cererea
depusă 2008.08.07, BOPI nr. 1/2009.

128
129
 ANEXA 2
Brevet de invenţie. 4048 B1, MD, C12N 1/16 Tulpină de drojdie Saccharomyces cerevisiae-sursă
de β-glucani/ Cererea depusă 2010.02.11, BOPI nr. 6/2010

130
131
 ANEXA 3
Act de implementare a rezultatelor Nr.1 eliberat de ÎI „Marin-Alexandru” la 30.06.2009.

132
 ANEXA 4
Act de implementare a rezultatelor Nr.64A eliberat de CNMN a IMB a AŞM la 17.05.2010.

133
134
135
136
 ANEXA 5
Diploma European Exhibition of Creativity and Inovation „EUROINVENT” 2009 Bronze Medal
„Feed for fish larvae and young fish”.

137
 ANEXA 6
Diplomă Expoziţia Internaţională Specializată „INFOINVENT” 2009 Medalia de Argint
„Bioproduse din drojdiile sedimentelor vinicole pentru furajarea peştilor”.

138
 Declaraţia privind asumarea răspunderii

Subsemnatul, Chiseliţa Oleg, declar pe răspundere personală că materialele prezentate în

teza de doctor sunt rezultatul propriilor cercetări şi realizări ştiinţifice. Conştientizez că, în caz
contrar, urmează să suport consecinţele în conformitate cu legislaţia în vigoare.

Chiseliţa Oleg

______________

______________
Data

139
 CV AL AUTORULUI
Nnme, prenume:
CHISELIŢA Oleg.
Data şi locul naşterii:
28 august 1972, or. Floreşti, R. Moldova
Studii:
1989-1995 Universitatea de Stat din Moldova, Facultatea de Biologie şi Pedologie, Specialitatea
„Biologie”.
1995-1998, 2007-2008 Institutul de Microbiologie şi Biotehnologie al AŞM, doctorand la
specialitatea „Microbiologie”.
Activitatea profesională:
1995-1998, 2007-prezent Institutul de Microbiologie şi Biotehnologie al AŞM, cercetător
ştiinţific.
Domenii de activitate ştiinţifică:
Microbiologie. Biotehnologie.
Specializare în domeniul biologiei drojdiilor, sintezei orientate a substanţelor biologic active.
Elaborarea procedeelor de cultivare dirijată a drojdiilor.
Elaborarea procedeelor de prelucrare a drojdiilor din sedimentele de vin şi obţinere a
biopreparatelor.
Lucrări ştiinţifice publicate 25, dintre care:
Articole în reviste recenzate -10, dintre care 3 în monoautorat;
Teze ale comunicărilor ştiinţifice-9;
Brevete de invenţie-3.
Participări la foruri ştiinţifice internaţionale:
Conferinţa internaţională IX Международная конференция молодых учёных
«Пищевые технологии и биотехнологии» (Cazani, 2008; 2009), Conferinţa internaţională
consacrată comemorării m.c. al AŞM Petru Ungurean (1894-1975) (Chişinău, 2008), Conferinţa
internaţională a tinerilor cercetători a IV ediţie (Chişinău, 2008), Conferinţa internaţională
„Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и
применения” (Crimeea, Ucraina, 2009), Conferinţa ştiinţifică naţională cu participare
internaţională consacrată celei de-a 50 aniversări de la fondarea Secţiei de Microbiologie

140
„Probleme actuale ale microbiologiei şi biotehnologiei” (Chişinău, 2009), Expoziţia
internaţională Specializată „MOLDECO” ediţia a VII (Chişinău, 2007), European exhibition of
creativity and innovation „EUROINVENT” (Iaşi, 2009), Expoziţia internaţională specializată
„INFOINVENT” (Chişinău 2009), Salonul internaţional al cercetării, inovării şi inventicii PRO
INVENT, ediţia a VIII-a (Cluj – Napoca, 2010).
Participarea la proiecte ştiinţifice naţionale:
Proiect instituţional (2006-2010) „Fundamentarea ştiinţifică a sintezei orientate a
substanţelor bioactive de către microorganisme” 06. 411. 015 F.
Proiect al tinerilor cercetători în sfera ştiinţei şi inovării (2007-2008) „Evaluarea
principiilor bioactive a levurilor de la vinificaţie ca sursă pentru obţinerea biopreparatelor”
07.411.11 IND A.
Proiect al tinerilor cercetători în sfera ştiinţei şi inovării (2009-2010) „ Procesarea
drojdiilor rezultate în urma vinificării în scopul obţinerii carbohidraţilor pentru utilizare în
diverse domenii” 09.819. 08. 03. IND F.
Cunoaşterea limbilor: română, rusă, spaniolă, portugheză.
Date de conntact:
Chiseliţa Oleg
MD 2028 Chişinău, str. Academiei 1, of. 202, tel. +373 (22) 73 80 13.
e-mail: chiselita@mail.ru

141