Activitatea antioxidanta si antibacteriana a extractului din seminte de struguri

2009

CAPITOLUL .

Semintele folosite la obtinerea extractului Semintele de struguri folosite in producerea extractelor din seminte de struguri comerciale sunt derivate ale unei varietati de struguri pentru vin (Vitis vinifera).Acesti struguri pot avea un nivel de polifenoli de 12 ori mai mare decat cel gasit in varietatile fara seminte.In mod natural semintele din strugurii de vin contin 50-1000mg/kg(mai putin de 1 procent) monomer, 120-1400mg/kg oligomeri si 1250-1700mg/kg polimeri sau substante tanante cu masa moleculara mare. Sursa si soiul semintelor din struguri de vin utilizate la producerea extractului din seminte de struguri pot afecta compozitia extractului. Bourzeix a compara continutul de proantocianidine a unor soiuri de seminte de struguri iar continutul a variat de la 51mg/kg in semintele Carignan la 1100mg/kg in seminte de struguri Pinot Noir, Cabernet Sauvignon-ul avand 285mg/kg. Proantocianidinele oligomere au variat intre 114mg/kg in semintele Carignan pana la 1275 mg/kg in semintele Pinot Noir, in timp ce Cabernet Sauvignon-ul a avut 371mg/kg.Polimerii au variat de la 6-73 procente. Atat semintele din struguri rosii cat si albi sunt folosite in producerea extractului commercial din seminte de struguri.In general semintele din struguri rosii au un continut mai mare de polifenoli decat semintele albe de struguri;3500mg/kg pentru cei rosii in comparatie cu 2800mg/kg pentru cei albi. Semintele folosite in producerea extractului din seminte de struguri pot fi achizitionate din urma operatiilor de producere a sucului de struguri sau de la producatorii de vin. Semintele de struguri rosii obtinute dintr-o unitate producatoare de vin acompaniaza sucul de struguri si pielitele pe parcursul procesului de fermentatie si pierd aproxiamtiv 30-50% din continutul lor de polifenoli.In fapt continutul de polifenoli al vinului rosu (extras din seminte) este cel care confera vinului calitatea astringenta.Semintele din strugurii albi pe de alta parte sunt indepartate din suc inainte de fermentatie prin urmare retin o portie semnificativ mai mare de polifenoli. Un alt factor care afecteaza continutul polifenolic al semintelor este chiar procesul de obtinere a vinului numit vinificatie. Majoritatea vinurilor sunt obtinute prin proceduri conventionale, dar unele vinuri cum ar fi Nouveau se bazeaze pe maceratia carbonica. Termovinificarea este utilizata in zone unde vinul rosu este obtinut din struguri care sunt mai saraci din punct de vedere al culorii, de exemplu in zonele reci este dificil de obtinut struguri complet copti. In medie vinificatia conventional indeparteaza 30% mai multi polifenoli din seminte decat termovinificarea si macerarea carbonica.

Activitatea antioxidanta si antibacteriana a extractului din seminte de struguri

2009

Cel mai important aspect al semintelor utilizate la obtinerea extractului este totusi uscarea, separarea si depozitarea, care pot avea un effect dramatic asupra potentei si viabilitatii semintelor precum si asupra produsului extras. Ideal ar fi ca semintele folosite la producerea extractului din seminte de struguri sa fie procesate imediat adica separate de pielitele macerate si supuse imediat la procesul de extractie dar in mod practice acest lucru nu este posibil. Pentru inceput strugurii de vin sunt o recolta sezoniera prin urmare cantitati mari de pielite si seminte macerate ( numite tescovina) trebuie sa fie achizitionate intr-o perioada scurta de timp.Aceasta perioada dureaza in mod obisnuit din August pana in Noiembrie in emisfera Nordica si din Februarie pana in Aprilie in emisfera sudica. Tescovina de struguri are un continut de umiditate mare si este puternic perisabila, semintele trebuind sa fie separate de pielite si conservate cat mai repede posibil.Mai multe metode de uscare sunt folosite incluzand si uscarea la soare sau cea mecanica folosind cuptoare.O alta metoda de conservare a semintelor este sa le separam de pielite si sa le supunem inghetului. Semintele trebuie sa fie depozitate in mod corespunzator pentru a preveni mucegairea sau oxidarea. Semintele depozitate impropriu isi pierd rapid proprietatile nemaifiind optime pentru supunerea la procesul de extractie. Proantocianidinele oligomere sunt prezente in stratul exterior al semintelor de struguri, puse acolo de mama natura pentru a proteja samanta si a ajuta la propagarea specie.Dupa indepartarea din vin proantocianidinele servesc ca linie principala de aparare a semintelor impotriva elementelor oxidante precum soarele (razele UV) si aer (oxigen), care pot distruge membranele celulare ale semintelor si sa deterioreze AND-ul in acelasi mod in care cauzeaza deteriorari celulare la oameni.Prin indepartarea umiditatii in exces si minimizarea expunerii lor la elementele oxidante, semintele din struguri pot fi depozitate perioade lungi in timp ce isi mentin potentialul. Procesarea semintelor: Deosebirea primara intre varietatile de extracte din struguri disponibile pe piata consta in procesul de fabricare sau extractive. Fiecare din aceste procese prezinta avantaje si dezavantaje care pot afecta compozitia, potentialul,costul etc. Desi detaliile despre procese sunt informatii ce il privesc pe producator exista 2 abordari de baza: 1) extractia cu solvent 2) extractia cu etanol si apa. Extractia cu solvent foloseste unul sau mai multi solventi organici precum acetona, clorura de metil sau toluen pentru a indeparta si separa proantocianidinele oligomere din semintele de struguri. Solventii sunt apoi recuperati iar concentratul rezultat este apoi fie uscat prin pulverizare fie prin vacuum si macinat.

Activitatea antioxidanta si antibacteriana a extractului din seminte de struguri

2009

Proceduri similare de fabricare sunt angajate si in unele procese cu apa si etanol in timp ce altele implica filtrare complexa, concetrare si pasi de purificare. Desi apa si etanolul pot fi folosite intr-un proces de extractie cu solvent, termenul extractie cu apa si etanol ar trebui sa fie rezervat pentru procese care folosesc doar apa si etanol si nu folosesc si alti solvent organici. Metode de analiza Extractul din seminte de struguri este un ameste heterogen de acid galic, monomeri,dimeri,trimeri, tetramer, polimeri si alti oligomeri. Moleculele de baza sunt catehinele, epicatehinele, esterii acidului galic, glicozide si peptide. Datorita gradului mare de heterogenitate, sunt necesare mai multe tehnici analitice pentru a caratcteriza extractul din seminte de struguri. Cromatografia in strat subtire:

Ce este masurat: separaraea calitativa a fenolilor, folosita pentru a determina daca este extractul este din struguri Tipul metodei: Cromatografica, bazat pe marimea si polaritatea fenolilor Standard: acid galic, catehine, epicatehina si extract de seminte de struguri comercial Dezavantaje: doar calitativ, nu poate distinge intre pielita de strugure si samanta de strugure

Comitetul Metodelor de Evaluare a semintelor de struguri a adoptat aceasta metoda industrial pentru a determina calitativ daca un extract este bazat pe strugure

Aceasta procedura include o separare prin cromatografie in strat subtire a extractelor sub forma de pudra preacetilate.

In 1998 trei laboratoare independente au validat metoda cromatografiei in strat subtire prin testarea a 14 extracte din seminte de struguri, ceai verde, picnogenol si merisor precum si a 13 produse in stare finala. Acesta este un teste calitativ facut pentru a identifica extractul din seminte de struguri si pentru a-l diferentia de alte extracte care ar putea avea componente similare. Valoarea procianidolica si Valoarea Porter Proba Procianidolica mai este denumita si proba Bate-Smith. Ce este masurat:fenolii demeri si mai mari, valoarea calitativa ce indica prezenta relativa

Activitatea antioxidanta si antibacteriana a extractului din seminte de struguri

2009

Tipul metodei: spectrofotometrica, bazata pe hidroliza acida si formarea de culoare Standard:nici unul Dezavantaje: reproductibilitate slaba Comitetul de Evaluare al semintelor din struguri nu recomanda aceste metode pentru cuantificarea continutului total de fenoli sau a proantocianidinelor oligomere in extractele din seminte de struguri.

Index-ul Procianidolic (denumit deasemenea Proba Bates-Smith) implica o metode de tetstare care masora schimbarea culorii atunci cand produsul este amestecat cu diverse chimicale, cu cat se schimba culoarea mai mult cu atat continutul de proantocinidine oligomere este mai mare. Totusi Index-ul Procianidolic este o valoare relativa ce poate fi mult peste 100. Analizele Porter si Procianodolic sunt teste colorimetrice bazate pe hidroliza acida. Dimerii si moleculele mai mari sunt transformate in antocianidine prin hidroliza acida. Un grafic standard nu este incorporat iar rezultatele pot fi raportate doar ca valori, nu ca si procentaje.Este de asemenea foarte greu sa obtii rezultate reproductibile cu proba Valoarea procianidolica, deoarece rezultatele depind foarte mult de condtitiile de testare iar cianidina (antocianidina formata in timpul hidrolizei acide) este relativ instabila. Trei laboratoare independente au desfasurat un studiu atat asupra Valorii Porter cat si asupra Valorii Procianodolic si au gasit variatii mari de la laborator la laborator in cazul valorii Procianodolic. Unele companii folosesc un test Bate-Smith modificat pentru a creste reproductibilitatea rezultatelor. Proba Assay contine sulfat feroso-amoniacal, care stabilizeaza reactia mai bine decat in proba Procianodolica si da rezultate mai putin dependente de conditii. Proba Procianodolica: Proantocianidine (dimeri si mai mari) + HCl/izopropanol + caldura = cinidina, absorbtie la 550 nm Proba Porter: Proantocianidine (dimeri si mai mari) + NH4Fe(SO4)2 12 H2O + HCl /n-butanol + caldura = cianidina, absorbtie la 550 nm Reactia chimica din dreapta descrie atat valoarea Porter cat si valoarea Procianodolica. Continutul total de fenoli (Folin-Ciocalteu) Ce este masurat: concentratia totala de fenoli Tipul metodei:spectrofotometrica, bazata pe o reactie colorimetrica Standard:acid galic

Activitatea antioxidanta si antibacteriana a extractului din seminte de struguri

2009

Dezavantaje: toate grupurile fenolice sunt cantitative ( antocianii, fenolii din ceaiul verde) nu se poate preciza daca un extract este contrafacut nu se poate diferentia tipul de fenoli prezenti ( monomer, dimer, trimer) prezenta proteinelor a acizilor nucleici si a acidului ascorbic poate modifica raspunsul

Metoda este folosita in industria vinului de peste 30 ani Comitetul de Evaluare a Metodelor de analiza a semintelor din struguri a fost de acord sa examineze aceasta metoda ca una ce poate fi utilizata in industrial.

Este o metoda colorimetrica care masoara toate moleculele fenolice fara sa faca vreo diferentiere intre acid galic, monomeri, dimeri si compusi fenolici mai mari.Este utilizat un grafic standard a acidului galic iar rezultatele sunt exprimate ca echivalenti de acid galic (GAE).Prima hartie despre aceasta metoda a fost publicata in 1927 iar in 1965 Singleton si Rossi au imbunatatit reproductibilitatea probei. Swain si Goldstein a considerat aceasta metoda ca fiind cea potrivita in estimarea fenolilor totali din produse complexe din plante. Este o metoda sensibila de analiza cantitativa independent de gradul de polimerizare. Fenoli+alcalin+reactiv FC+heat= produs colorat in albastru, Abs 755 nm Reactivul Folin Ciocalteu este un agent de oxidare este compus din molibdat heteropolifosfotungstenat. A fost initiat un studiu pentru a determina daca monomerii reactioneaza diferit fata de moleculele mai mari in acest test. Rezultatele preliminare arata ca testul standard FC oate fi partinitor in favoarea extractelor din seminte de struguri cu continut mai mare de monomeri din moment ce monomerii si proantocianidinele oligomere din extractele din seminte de struguri factori de raspuns diferiti.Metoda poate fi folosita pentru standardizare dar nu si pentru cuantificare directa. Aceasta metoda a fost citata ca fiind metoda Asociatiei Oficiale de Chimisti Agriculturali pentru determinarea continutului total de polifenoli din vinuri. Testul cu vanilina: Cu metanol ca solvent:

Activitatea antioxidanta si antibacteriana a extractului din seminte de struguri

2009

Ce se masoara: flavan-3-oli Tipul metodei: spectrofotometrica Stadard:catehine Dezavantaje: producerea culorii depinde de multi factori Cineticile reactiei sunt complicate Este necesara o proba pura

Cu acid acetic glacial ca solvent: Ce se masoara: Flavan-3-oli Tipul metodei: spectrofotometrica, formarea de culoare este in legatura directa cu concentratia de falvonoli Standard: Catehine Dezavantaje:Concentratia de fenoli afecteaza gradul de polimerizare Este necesara o proba pura

Testul cu vanilina a fost utilizat in industria cerealelor din 1950. Cineticile reactiilor sunt diferite in cazul celor doi solventi ( metanol si acid acetic glacial) in cazul metanolului se produc cinetici complicate. In cazul acidului acetic glacial cinetica reactiilor sunt mai putin complexe, reactia are loc numai la grupurile finale, iar produsul colorat care se formeaza si este masurat este mai stabil. Obtinerea de rezultate reproductibile cu testul cu vanilina folosind ca solvent metanolul poate fi dificila. Persoana care face testul trebuie sa fie bine pregatita iar rezultatul este dependent de unghiul din care metanolul este adaugat in fiola. Cromatografia de lichide de inalta performanta cu faza inversa: Ce se masoara: % monomeri, oligomeri si polimeri, procentul de acid galic, catehinele si epicatehinele dupa greutate Tipul metodei: cromatografica, bazata pe polaritatea fenolilor

Activitatea antioxidanta si antibacteriana a extractului din seminte de struguri

2009

Comitetul de Evaluare a Metodelor de Analiza a semintelor de struguri a hotarat sa adopte aceasta metoda industrial pentru determinarea procentului de monomeri in extractul din seminte de struguri. Cu aceasta metoda procentul dupa greutate de acid galic si monomeri fenolici precum catehine, epicatehine poate fi determinat prin folosirea de stadarde disponibile. Din nefericire cu exceptia unui singur dimer, nici un fenol cu molecula mare nu este disponibil comercial. In experientele trecute producatorii de extract din seminte de struguri au descoperit ca nu exista o procedura standard a RP-HPLC printre laboratoarele independente si ca o simpla cerere de procentaj monomeric va produce rezultate diferite precum si compusi diferiti. Daca aceasta analiza este facuta de un laborator independent monomerii de interes ( cei aflati in mod obisnuit in extractul din seminte de struguri) trebuie sa fie declarati: catehine, epicatehine precum si acidul galic.In functie de solventul utilizat si de lungimea de unda unele peak-uri ale monomerilor pot co-elueze cu alti fenoli. Trebuie acordata atentie pentru a asigura ca peak-urile de interes sunt peak-uri pure. Cromatografia cu patrundere prin gel: Ce este masurat: Concentratia de fenoli totali Tipul metodei: cromatografica, bazata pe marimea fenolilor Dezavantaje: Durata de viata redusa a coloanei Nu toata lumea dispune de instrumentele necesare Dificultatea de a diferentia tipurile de fenoli prezenti ( monomer, dimer, trimer) Unii au observat ca moleculele mari se lipesc de coloana

Comitetul de evaluare al Metodelor a fost de acord sa examineze aceasta metoda ca o metoda ce poate fi folosita in industrie. Principiul cromatografiei cu patrundere prin gel este ca moleculel sunt separate dupa marime intr-o coloana specifica iar atunci cand elueaza intensitatea absorbantei este masurata la o lungime de unda specifica de 280 nm pentru fenoli.Toate moleculele tind sa elueze intr-o cocoasa iar aria peak-ului este direct proportionala cu concentratia fenolilor din acest produs.

Activitatea antioxidanta si antibacteriana a extractului din seminte de struguri

2009

Un standard intern este folosit pentru a imbunatati acuratetea rezultatelor. Fuzzati a identificat trei regiuni separate ale cocoasei ca 1) monomeri, 2) dimeri si galatii lor si 3) trimeri bazandu-se pe un material de referinta bine caracterizat si spectroscopie de masa. O metoda imbunatatita de a caracteriza procianidinele din seminte de struguri prin tiolizaHPLC Procianidinele polimerice ale semintelor de struguri joaca un rol fundamental in determinarea sanatatii si caracteristicilor senzoriale ale produselor din struguri. Atat propritetatile organoleptice ale vinului cat si efectele biologice depind de unitati structurale si greutatea moleculara medie a acestor metaboliti ai strugurilor.
In acest studiu a fost realizata o extractie unica in faza solida pentru a obtine o serie de fractiuni supuse apoi HPLC in faza inversa dupa degradarea catalizata de un acid in prezenta toluen -tiol Un total de zece fractiuni purificate au fost obtinute si caracterizate de HPLC in faza inversa urmata de tioliza. Compusii cu cel mai mare grad de polimerizare detectati in extract au fost heptameri.Gradul de polimerizare mediu a fost 3.2 . Prin urmare in acest studiu manipularea cu atentie a pasului extractiei fazei solide a dat o metoda folositoare si potrivita pentru analiza proantocianidinelor polimerice.

Taninurile din seminte sunt flavon-3-oli polimerici ce pot contine subunitati de (+)catehine, (-) epicatehine si (-) galat de epicatehina legate prin legaturile interflavonice C4-C8.(Prieur, 1994) Ele poseda activitati antibacteriene(Scalbert, 1991) si antioxidante (Ricardo da Silva , 1991).
Mai mult abilitatea lor de a se comporta ca inhibitori ale unor activitati ale unor enzime si receptori (Zhu, 1997) si de a precipita proteinele salivare cauzand o senzatie astringenta (Haslam si Lilley, 1988) este bine documentata.Marea majoritate a acestor proprietati fiziologice sunt legate de abilitatea de a lega proteine iar reactivitatea lor fata de proteine tinta depinde de structura si masa lor moleculara. (Robichaud and Noble, 1990) Datorita numarului mare de structuri chimice existente intr-o populatie de polimeri avand lungimi variate si trei unitati posibile, analiza taninurilor individual este dificila. De obicei o secventa a metodelor cromatografice de a separa procianidinele oligomere dupa gradul lor de polimerizare este aplicata. Pana la urma separarea fractiunilor purificate rezultate in urma catalizarii acide este efectuata pentru a avea informatii despre compozitita subunitatii polimerilor.In acest pas acizi slabi si reactivi nucleofilici precum toluen--tiol (sau fluoroglucinol) reactioneaza cu procianidinele dand unitatile terminale ale polimerilor in forma lor libera si unitatile de extindere preum derivatii benzil tioeterului.

Activitatea antioxidanta si antibacteriana a extractului din seminte de struguri

2009

Analiza HPLC a numerosilor produsi de degradare formati ofera informatii asupra structurii polimerilor, gradului mediu de polimerizare (DPm) si proportia flavonolilor monomeri cuantificabili din care sunt constituite. Totusi folosirea mai multor tehnici cromatografice pentru a separa procianidinele polimerice este laborioasa si consuma timp. Mai mult abilitatea HPLC cu faza normala de a asigura informatii complete este chestionabila.

In acest studiu, pentru a descoperi un protocol mai eficient de purificare rapida pentru a fractiona procianidinele oligomere dupa gradul de polimerizare inainte de caracterizarea prin HPLC urmata de tioliza, a fost desfasurat o etapa imbunatatita de fractionare pe un Toyopearl
HW-40 (F) (este un este un polimer metacrilic hidroxilat pentru excludera dupa dimensiunea in

cromatografie) folosind un sistem FPLC ( Fast Protein Liquid Cromatography).

Rezultate si discutii: Cromatografia la presiune joasa a unui extract din seminte de struguri pe Toyopearl TSK-50F ne-a permis sa separam acizii fenolici, flavonolii si flavonolii monomeri in fractiunea A, din taninuri condensate in fractiunea B.De obicei extractul total B era fractionat prin cromatografie cu faza normala, in acest studiu o procedura de fractionare printr-un sistem FPLC a fost efectuata. Aceasta procedura ne-a permis sa obtinem direct 10 fractiuni purificate. (Fig.1)

Fig.1. Cromatograma prin patrundere prin gel a extractului procianidinic.

Datorita conditiilor cromatografice folosite spectrul UV al materialului eluat, ordinea elutiilor observata anterior si compozitia fenolica a semintelor de struguri este rezonabil sa deducem ca

Activitatea antioxidanta si antibacteriana a extractului din seminte de struguri

2009

materialul eluat a constat in procianidine de marime decrescatoare. O confirmare a acestei ipoteze a fost data de analiza prin tioliza a fiecarei fractiuni. De fapt cand fractiunile colectate au fost supuse la tioliza catalizata de acid, gradul de polimerizare mediu este estimat prin calcularea raportului dintre numarul de unitati eliberate si numarul de unitati terminale (Fig.2).

Fig.2. Cromatograma unui mediu tiolizat a procianidinelor din seminte (fractiunea F3) detectata la 280 nm)

Informatiile cantitative obtinute la fiecare fractiune sunt prezentate in Fig.3.Gradul de polimerizare mediua calculat in urma rezultatelor tiolizei a fost 7 la fractiunea 1 si a scazut la celelalte. Aceste rezultate au mai fost observate pe Tannat (8.5) si Chardonnay (9,6) de Souquet in 2000.Grad de polimerizare mai mare a fost obtinut pentru procianidinele din seminte de struguri ale Merlot-ului (DPm= 9-12) (Soucier 2001, 2001) si ale Cabernet Franc (DPm=15.7) (Labarbe, 1999). Gradul de polimerizare ale extractului total a fost 3.73. Valori similare au fost gasite in literatura pentru vin Shiraz (4.8) si Chardonnay ( 2.7) ( Kennedy si Jones, 2001).

Fig.3.Gradul de polimerizare a fractiunilor procianidinelor din seminte de struguri determinate prin HPLC urmata de degradare prin tioliza

Activitatea antioxidanta si antibacteriana a extractului din seminte de struguri

2009

Toate fractiunile contineau trei monomeri flavonici diferiti a de procianidine(Fig.4 si 5) (-) epicatehina a reprezentta mai mult de 50% din unitatiile de extensie si maxim 22% din unitatile terminale, in care (+) catehina a ajuns la 47%. Proportia galatilor a variat intre 21.8 si 39.1% a fost asemanatoare cu valorile determinate pentru Merlot, Tannat, Negrette si Pinot noir.

Fig. 4. Compozitia ( unitatile de extindere) ale fractiunilor procianidinelor din seminte de struguri determinate prin HPLC urmata de degradare tiolitica.

CAT- catehine EPICAT-epicatehine EPICAT-G galat epicatehinic DPm- grad de polimerizare mediu

Activitatea antioxidanta si antibacteriana a extractului din seminte de struguri

2009

Fig. 5. Compozitia (unitatile terminale) ale fractiunilor procianidinelor din seminte de struguri determinate prin HPLC urmata de degradare tiolitica.

Pe baza greutatii probei de tanin ( obtinuta prin adunarea greutatii fiecarei fractiuni colectate), tetramerii si pentamerii (DPm=4.6) reprezinta 14%, eptamerii 10% si dimerii si monomerii mai putin de 20 % (Fig.6)

Fig. 6 Distributia( frecventa relativa a greutatii in procente) ale fractiunilor procianidinice din extrcatul din seminte de struguri.

Repetabilitatea acestei metode a fost derminata analizand un extract din seminte de struguri de sase ori. Coeficientul variatiei cunatificarii fenolilor cu masa moleculara mare este aproape 11%. Concluzii: Rezultatele acestui studiu au indicat ca ar trebui sa fie posibila fractionarea procianidinelor pe baza gradului lor mediu de polarizare printr-un singur pas de cromatografie

Activitatea antioxidanta si antibacteriana a extractului din seminte de struguri

2009

lichida pe Toypearl TSK-HW 50F eliminand pasul aditional de fractionare prin HPLC.Datorita simplitatii ei aceasta metoda poate fi usor adaptata la fractionarea procianidinelor. Prin urmare procianidinele oligomere fractionate cu grade diferite de polimerizare pot fi de asemenea utilizate in experimente pentru elucidarea mecanismului fiziologic ale taninurilor condensate si pot fi de asemenea utilizate pentru studii ulterioare in vivo.