FIZIOLOGIA BACTERIILOR. METABOLISMUL MICROBIAN.

NUTRIIA I RESPIRAIA BACTERIILOR Fiziologia bacterian studiaz viaa i activitile bacteriilor nutriia, respiraia, creterea i multiplicarea, condiiile de cultivare a bacteriilor. Metabolismul bacterian reprezint ansamblul de reacii biochimice care au loc n celula vie. Catabolism reacii chimice de descompunere a substanelor complexe n elemente simple, nsoit de degajarea energiei (metabolism energetic) Anabolism reacii chimice de sintez a substanelor complexe din elemente simple, necesit energie (metabolism constructiv, de sintez) Particularitile metabolismului bacterian: Este un metabolism necompartimentat , toate procesele metabolice se desfoar intr-o singur celul Este foarte flexibil, realizndu-se prin diverse ci metabolice (bacteriile se adapteaz rapid la condiiile mediului) Este foarte intens (viteza reaciilor este mare) Produsele intermediare din procesele catabolice pot fi utilizate direct n calitate de precursori pentru reaciile anabolice (amfibolism) n toate reaciile metabolice intervin catalizatori proteici specifici - enzimele Enzimele bacteriene. Caractere generale: Substane proteice Active n limite largi de temperaturi (0-65C) i de pH (2-9) Specificitate de substrat i de aciune (reacioneaz cu un substrat cataliznd un tip de reacie) Specificitatea este determinat de centrul activ al enzimei, complementar cu receptorul de pe substrat Nu se modific n cursul reaciei Clasificarea enzimelor Constitutive (permanente) Inductive (adaptive), se sintetizeaz n prezena substratului (ex.: lactaza) Represive, sinteza lor este inhibat de acumularea n exces a produsului reaciei catalizate Dup locul de aciune (exoenzime, endoenzime) Dup tipul reaciei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze, ligaze) Dup impactul asupra ma/o Enzime metabolice Enzime de patogenitate, responsabile de modificri patologice ale esuturilor, celulelor ma/o : hialuronidaza, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, lecitinaza, proteaze, etc. Importana practic a studierii enzimelor Rol n identificarea i clasificarea bacteriilor (enzimele determin activitatea biochimic specific a bacteriilor) Unele substane chimice, antibiotice interfereaz cu activitatea unor enzime, inhibnd creterea bacteriilor (tratament) Determinarea mecanismelor patogenezei infeciilor (unele enzime sunt responsabile de producerea leziunilor n esutul gazdei) Aplicarea industrial a enzimelor NUTRIIA BACTERIAN 1

Nutriia modalitile prin care bacteriile asimileaz din mediu substanele necesare pentru metabolism. Modul (tipul) de nutriie la bacterii este absorbtiv. Nutrieni substane, soluiile crora pot traversa MCP pentru a fi antrenate n metabolismul celulei. Se obin din alimente prin solvire (sruri minerale, CO2, O2) sau dup o digestie prealabil (proteine, polizaharide, lipide). La bacterii digestia este extracelular (la bacteriile G- n spaiul periplasmic) Nutrienii servesc n calitate de material de construcie i surs de energie pentru sinteza compuilor i meninerea vieii bacteriei.

Transportul transmembranar 1. Difuzie simpl (conform gradientului de concentraie, fr utilizarea energiei): O2, CO2, acizi grai, nutrieni liposolubili 2. Difuzie facilitat (conform gradientului de concentraie) permite transportul transmembranar al moleculelor mari prin intermediul proteinelor de transport specifice - permeaze. 3. Transport activ (contra gradientului de concentraie, necesit energie). Particip permeazele i alte proteine de transport specifice. Nutrienii nu suport modificri. 4. Translocaie substratul este modificat (ex.: fosforilat) n timpul transportului membranar; necesit energie Substanele care au ptruns n citoplasm sunt descompuse de ctre enzimele bacteriene conform cilor metabolice proprii fiecrei specii bacteriene (ex.: Embden-Meyerhof, Entner-Doudoroff, ciclul pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obine energie i precursori care vor fi antrenai n biosintez (anabolism). Excreia metaboliilor difuzie, proteine de transport, liza bacteriei

Necesitile nutritive ale bacteriilor Necesiti elementare, de baz: C, H, O, N n cantiti importante; S, P, Fe, Ca, Mg, K n cantiti mici i urme de Co, Cu, Zn, Mo. Bacteriile prototrofe sunt capabile a-i realiza integral sinteza metaboliilor eseniali. - Necesiti specifice. Bacteriile auxotrofe solicit suplimentar compui organici preformai (factori de cretere), care nu pot fi sintetizai de bacterie (ex.: AA, baze purinice, pirimidinice, vitamine). Prezena lor n mediul de cultur este indispensabil creterii acestor bacterii. Clasificarea bacteriilor dup sursa de carbon Bacterii autotrofe utilizeaz CO2 ca unic surs de carbon (nepatogene) Bacterii heterotrofe utilizeaz carbonul din compuii organici (glucide, acizi grai, alcooli, etc) Bacteriile care utilizeaz materia organic moart sunt saprofite (reciclarea materiei organice) Bacteriile parazite (obligate, facultative) triesc pe contul organismelor vii, aducndu-le prejudicii Bacteriile patogene reprezint parazite care afecteaz grav gazda, provocnd maladie sau moarte. Surse de azot AA sau acizi nucleici Sruri de amoniu, nitrii, azot atmosferic Surse de substane minerale: S - din AA, sulfuri, sulfai; P - din fosfai; K, Mg, Ca, Na - din sruri minerale; Zn, Cu, Mn, Mo din ap 2

Clasificarea bacteriilor dup sursa de energie Bacterii fototrofe utilizeaz energia solar (fotosint) Bacterii chemotrofe folosesc energia degajat din reaciile chimice de oxido-reducere. Ele necesit un substrat donor de hidrogen (e- i H+) i un substrat acceptor de hidrogen. n transfer particip transportori intermediari de electroni (lanul respirator, NAD, NADH, FAD, etc.) Bacteriile chemolitotrofe donorul de H este o substan anorganic Bacteriile chemoorganotrofe donorul de H este o substan organic (glucoza, lipide...) Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe Mecanismele de obinere a energiei la chemoorganotrofe n funcie de acceptorul final de H : Respiraie aerob. Acceptorul final este oxigenul gazos. Implic lanul respirator de transport al electronilor asociat MCP. Produs final H2O sau H2O2 . Respiraie anaerob. Acceptori finali compui anorganici (nitrat, sulfat, S). Transportul de electroni prin lanul respirator. Produse finale nitritul, amoniacul, sulfura (n prezena O H2O2). Fermentaie. Substratul organic este metabolizat fr intervenia unui agent oxidant extern. Const n procese de ox-red care realizeaz numai o oxidare parial a substratului, donorul i acceptorul de H+ fiind substane organice. Astfel se ajunge de la un substrat mai redus la o molecul mai oxidat (ex.: fermentare lactic, fermentare alcoolic, acid mixt, acetoinic, etc). Fermentaia se poate desfura n prezena O2, dar fr intervenia acestuia. Conservarea energiei O parte din energia eliberat se pierde sub form de cldur sau poate fi utilizat direct sub form de energie electro-chimic (fpm) la nivelul MCP (ex.: rotaia flagelilor, transport transmembranar) sau stocat n compui chimici macroergici bogai n energie: ATP (sintetizat prin fosforilare oxidativ sau fosforilare la substrat), fosfoenol-piruvat, acetilfosfat i acetil-CoA. n procesele de respiraie se elimin mai mult energie dect din fermentaie (n glicoliz dintr-un mol de glucoz - 38 moli ATP, prin fermentaie - 2 moli ATP). n procese de fermentare se formeaz deeuri rejetate de ctre celul. Clasificarea bacteriilor dup sursele de energie i carbon Bacterii fotoautotrofe (energie solar, CO2) Bacterii fotoheterotrofe (en. sol., subst.org) Bacterii chemoautotrofe Bacterii chemoheterotrofe (chemolitoheterotrofe, chemoorganoheterotrofe) CRETEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILOR Creterea mrirea coordonat a masei i volumului structurilor bacteriene ca rezultat al proceselor de sintez Multiplicarea creterea numrului de celule pe o unitate de suprafa sau de volum Diviziune binar Inmugurire (levuri, ciuperci levuriforme) Autoreproducere (virusuri) Spori (micete) Fragmentare (actinomicete) Ciclul celular procesele care au loc de la formarea celulei pna la urmtoarea diviziune Faza C replicarea ADN Faza G de laten, segregarea cromozomilor Faza D de diviziune, formarea septului 3

Replicarea ADN depinde de masa critic a celulei, iar separarea cromozomilor i diviziunea intervin in momentul cnd celula atinge o lungime - limit

Perioada dintre 2 diviziuni reprezint timpul (perioada) de generaie (TG). Durata TG depinde de specie i de condiiile de cretere (condiii optime vitez maxim)

Creterea bacteriilor in laborator cultivare. Se cultiv bacteriile pentru izolarea lor din medii naturale (prelevate patologice, alimente, ap, etc). Izolarea bacteriilor se realizeaz pentru: Identificarea mi/o (scop de diagnostic) Testarea sensibilitii lor fa de antibiotice Obinerea unor produi de biosintez (antibiotice, AA), bioconversie (hormoni steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici, etc), producerea vaccinurilor, probioticelor... Pentru cretere bacteriile au nevoie de nutrieni i condiii fizico-chimice adecvate. Condiiile (principiile) de cultivare Surs nutritiv adecvat Surs de energie Ap Temperatura potrivit pH adecvat Concentraie optim a oxigenului i a CO2 Presiune osmotic adecvat Temperatura de cretere Exist temperaturi minime, maxime i optime de dezvoltare a bacteriilor. In raport cu temperatura optim deosebim: Bacterii psichrofile t optim 10-20 grade C. Cresc i la 0 gr C. Bacterii mezofile optimum 30-37 grade C (limite 15-45 gr C) Bacterii termofile optimum 50-60 grade C (pn la 95 grC) Bacterii hipertermofile (cresc la 70110 gr C) pH

Bacterii neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) pH 6-7,5 Bacterii acidofile pH 2-6 (Lactobacillus) Bacterii alcalofile pH >8 (Pseudomonas, Vibrio)

Presiunea osmotic Bacterii halotolerante (osmotolerante) cresc n concentraii reduse de NaCl (mediu izotonic cu mediul intern al gazdei) mi/o patogene Bacterii halofile prefer concentraii mari de NaCl (1-30%) stafilococi, vibrioni (Vibrio parahaemolyticus) Oxigenul Bacterii strict aerobe cresc doar n prezena O2. Obin energia prin respiraie aerob Bacterii microaerofile necesit concentraii reduse de O2 i 2-10% CO2. Obin energia prin respiraie sau fermentaie (Neisseria, Brucella, Campylobacter)

Bacterii strict anaerobe cresc doar in absena O2. Obin energia prin fermentaie sau uneori respiraie anaerob. Toxicitatea O2 formarea H2O2, a radicalilor superoxizi O2-, sau peroxizi O22- pe care anaerobii nu le pot descompune (absena catalazei, superoxid dismutazei, peroxidazei) Clostridium, Bacteroides Bacterii anaerobe aerotolerante pot crete n prezena O2, obin energia prin fermentaie, posed peroxidaz (Lactobacillus, streptococi) Bacterii facultativ anaerobe cresc in orice condiii, obin energia prin respiraie sau fermentaie

Mediile de cultur soluii sau substrate solide care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare cultivrii bacteriilor. Ele pot fi utilizate pentru cultivarea (izolarea) bacteriilor, testarea sensibilitii la antibiotice, stocarea sau transportul culturilor bacteriene. Cerinele fa de mediile de cultur S asigure necesitile nutritive i energetice ale bacteriilor Umiditate optimal pH optimal (7,2-7,4) i constant (caracter de tampon) Potenial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH2<5, aerobi rH2>10) S fie izotonice (0,5% NaCl) S fie sterile i transparente CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTUR Dup provenien Empirice, naturale. Au la baz produse de origine animal sau vegetal (snge, ser, lapte, ou, cartof, extracte din carne, cord, creier, ficat, pete, levuri, etc). Compoziia lor chimic precis nu poate fi controlat Sintetice includ ingrediente chimice pure, compoziia chimic este cunoscut cu exactitate Semisintetice Dup consisten Medii lichide (bulion) utilizate pentru obinerea biomasei bacteriene i a produselor lor (antibiotice, enzime, toxine) Medii solide conin 10-15% gelatin sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge roii, t topire 80-100C, solidificare 42C). Placa de geloz n cutii Petri este utilizat pentru izolarea culturilor pure, geloza nclinat (n pant) pentru acumularea culturilor pure Medii semisolide 0,2 0,5 % agar-agar. Se utilizeaz pentru studierea activitii biochimice sau a mobilitii bacteriilor. Dup compoziia chimic (complexitate) i destinaie A. Medii uzuale (universale, simple) Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5% NaCl) Bulion peptonat BP (extract apos din carne + 1% pepton+0,5% NaCl) Geloza nutritiv (BP + 2-3% agar-agar) Gelatina nutritiv (BP + 10-15% gelatin) Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor nepretenioase la cultivare Sterilizarea prin autoclavare: 120C, 20 min B. Medii complexe I. Medii elective formate din medii simple cu adaos de componente care permit creterea mi/o exigente nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, geloz-snge streptococi, neisserii; ser coagulat corinebacterii, etc)

II. Medii selective medii solide cu adaos de componente sau cu condiii fizico-chimice particulare care stimuleaz creterea unor specii i inhib creterea altor specii (geloza salin - stafilococi, geloza alcalin vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc) Mediile de imbogire reprezint medii selective lichide, utilizate pentru imbogirea florei patogene i inhibarea florei de asociaie dintr-un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale). Etap premergtoare insmnrii pe medii selective. Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit ) Mediul Kauffmann (mediul Muller+bil+verde de briliant) Salmonella Bulion cu selenit Shigella, Salmonella Ap peptonat alcalin (pH=8) Vibrio cholerae Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat) pentru anaerobi III. Medii diferenial-diagnostice (DD) permit diferenierea speciilor bacteriene in baza activitii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere) Sunt construite dup urmtoarea schem: Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate) Medii DD pentru izolarea culturii pure Studierea proprietilor zaharolitice Endo (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit de Na) Levin (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen) Ploskirev (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de acizi biliari+verde de briliant) Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin) Studierea proprietilor de oxido-reducere Mediul cu sulfit de Bi pentru Salmonella (colonii negre reducerea sulfitului n sulfura de Bi) Mediul Klauberg (geloz-snge cu telurit de K) pentru Corynebacterium diphtheriae (colonii negre) Studierea proprietilor lipolitice Geloza cu glbenu de ou bacteriile cu lecitinaz formeaz un halou opac n jurul coloniei Studierea proprietilor hemolitice Geloza-snge (geloza+5-15% snge defibrinat) In cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o zon clar Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure i identificare preliminar Russel geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicator Kligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S) Olkeniki identic Kligler+1% zaharoz+uree Indicatorul Andrede fucsin+NaOH Scindarea glucidelor (acid - A, acid i gaz - AG) duce la modificarea pH i virajul culorii mediului din rou in galben. In pant se apreciaz lactoza/zaharoza (oxidare), in coloan-glucoza (fermentare). Producerea H2S innegrirea mediului Medii DD pentru identificarea final a culturii pure - irul pestri Hiss (lichid sau semi-solid) un ir de tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite glucide i indicator. Aprecierea dup modificarea culorii (acid - A) i apariia bulelor de gaz (acid i gaz - AG) 6

Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i indicatori

IV. Medii speciale pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu, Loewenstein-Jensen pentru agenii tuberculozei, Sabouraud fungi) V. Medii de transport destinate transportrii sau stocrii unui material (prelevat), care va fi examinat ulterior. Menine in via bacteriile, fr a favoriza multiplicarea lor. Mediul cu glicerin 30% Soluie tampon-fosfat Soluie NaCl 3% Mediul Cary-Blair Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) pentru anaerobi, neisserii, etc Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mic de material ce conine bacterii (inoculum) se introduce intr-un mediu de cultur (insmnare, inoculare), care ulterior va fi incubat in termostat (pentru asigurarea temperaturii optime). In timpul incubrii (18-24-48 ore..) bacteriile cresc i se divid, formnd o cultur bacterian (totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un mediu). M.tuberculosis 3-5 sptmni V.cholerae 6-12 ore

Cultur pur format din bacterii de aceeai specie (indispensabil identificrii) Cultur mixt compus din bacterii de specii diferite Tulpin populaie microbian constituit din descendenii unei singure izolri n cultur pur, care va fi studiat ulterior. Clon populaie care rezult din multiplicarea unei singure celule

Manifestarea creterii i multiplicrii bacteriilor In mediu lichid - Turbiditate uniform - Formarea unei pelicule la suprafaa mediului (vibrioni, yersinia) Formarea unui sediment la fundul tubului sau pe perei (streptococi, Bacillus anthracis) In mediu solid formarea coloniilor Colonie o aglomerare de bacterii care se dezvolt dintr-o singur celul sau un grup de celule (UFC unitate formatoare de colonii) pe suprafaa unui mediu solid Fiecare specie bacterian formeaz colonii specifice (caracter util in identificare)

Caracteristica coloniilor Dimensiuni colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm) Contur (margini) neted, ondulat, zimat, lobat, etc Suprafa plat, bombat, convex, ombilicat, etc Form punctiform, circular, filamentoas, neregulat Culoare (pigmentaie) alb, galben, aurie, etc Densitate opac, transparent, etc Consisten cremoas, untoas, uscat, mucoid Tipurile de colonii Colonii S (smouth) rotunde, netede, umede, lucioase

Colonii R (rough) margini neregulate, suprafaa uscat, rugoas Caracterele de cultur ale bacteriilor reprezint exigenele nutritive (medii, temperatur, pH, aerare, etc), timpul apariiei culturii i manifestarea creterii pe medii lichide i solide

Dinamica multiplicrii bacteriilor in culturi In funcie de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se disting: Culturi discontinue/periodice Culturi continue Culturi sincrone Culturile discontinue se obin la cultivarea bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel de culturi sunt obinute i utilizate n laboratorul microbiologic Fazele dezvoltrii unei culturi discontinue I. Faza de lag faza de adaptare la condiiile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc in dimensiuni, dar nu se divid. Durata este variabil (2-4 ore); depinde de starea bacteriei, condiiile mediului, etc II. Faza logaritmic bacteriile cresc i se divid cu vitez maximal constant, curba evolueaz exponenial. Bacteriile sunt foarte sensibile la ageni antimicrobieni (culturi utile pentru testarea sensibilitii la antibiotice). Durata 8-10 ore III. Faza staionar rata celulelor care se multiplic scade treptat, numrul celulelor vii rmne constant mai multe ore. Cauza consumarea nutrienilor, acumularea metaboliilor toxici. Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare). Sensibilitatea la agenii antimicrobieni scade. Durata 10-12 ore IV. Faza de declin (letalitate) bacteriile mor progresiv Cultura continu se realizeaz cnd mediul de cultur este continuu rennoit i imbogit cu oxigen cu evacuarea unei cantiti de cultur. Se realizeaz in chemostate sau turbidostate, cultura aflndu-se permanent in faza exponenial. Se utilizeaz in microbiologia industrial. In intestin culturi continue. Culturi sincrone culturi in care bacteriile se divid in acelai timp EXAMENUL BACTERIOLOGIC Examenul bacteriologic const in inocularea (insmnarea) prelevatelor pe medii de cultur pentru izolarea culturilor pure de bacterii (tulpinilor) care vor fi ulterior identificate, testate la sensibilitate vis-a-vis de antibiotice, eventual conservate. Examenul bacteriologic const din cteva etape succesive, de la prelevarea (recoltarea) probelor biologice pn la remiterea rezultatelor. Faza pre-analitic (responsabilitatea medicului) 1.Prescrierea investigaiei (in funcie de datele examenului clinic i paraclinic). In ordonan se fixeaz identitatea medicului, a pacientului, scopul analizei, manifestrile patologice, locul, data apariiei, alte date: imunosupresie, tratament cu antibiotice, graviditate, etc. 2.Prelevarea probelor Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplicrii sau/i din cile de eliminare ale agentului patogen) i momentul prelevrii 8

Materiale de examinat (prelevate) de la pacieni: Secreii rino-faringiene, bronice Sput Puroi Exsudate, transsudate Snge LCR Urin, secreii genitale Mase fecale, bil, suc duodenal Bioptate, punctate Material cadaveric, etc Materiale de examinat din mediul extern: Ap Alimente Sol Aer Lavaje Vectori, etc -Modul de prelevare (recoltare) In recipiente sterile Respectnd regulile de autoprotecie La debutul bolii Pn la administrarea antibioticelor Cantitate suficient Transportarea Imediat sau utiliznd medii de transport, cu respectarea condiiilor speciale dup necesitate In ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...) In fia de insoire s fie indicat identitatea pacientului, vrsta, sexul, natura prelevatului, data, ora prelevrii, scopul investigaiei, .a.) EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURILE AEROBE Prelevatul este supus examenului macroscopic (modificarea aspectului, a mirosului, etc) - orientare in diagnostic Dup necesitate, probele sunt supuse pregtirii pentru investigaie (diluare, omogenizare, centrifugare, etc) Examinarea microscopic (preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen, Burri-Hinss...) prezena mi/o, forma, cantitatea, G+/-. I etap IZOLAREA CULTURILOR PURE Scopul izolrii - de a obine o cultur pur dintr-un melanj de celule bacteriene sau dintr-un produs patologic. O colonie separat constituie o cultur pur. Tehnici utilizate: Prin epuizarea inoculului pe suprafaa gelozei din cutia Petri (insmnare in striuri paralele, insmnare in cadrane, etalarea consecutiv pe trei cutii). Metoda diluiilor logaritmice a inoculului in geloz topit i rcit la 50 gradeC (10-1, 10-2,...), apoi turnate in cutii Petri sau eprubete. Incubare in termostat la 37 grade C, 18-24 h (in funcie de TG). 9

Metode speciale de izolare in culturi pure: A bacteriilor sporulate: inclzirea prealabil a prelevatului 80 grade C 20 min A bacteriilor acido-rezistente: tratarea prealabil cu acid a prelevatului i neutralizarea ulterioar cu o baz A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene: imbogirea prealabil a florei patogene utiliznd medii de imbogire A bacteriilor cu virulen inalt i pretenioase la cultivare: inocularea la animalele de laborator sensibile II etap ACUMULAREA CULTURII PURE Examinarea macroscopic a coloniilor crescute (form, culoare, dimensiuni, etc) Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte, confirmarea puritii culturii Repicarea coloniilor suspecte pe geloz in pant (inclinat) pentru acumularea culturii pure Termostat, 37 grade C, 18-24 ore III etap IDENTIFICAREA CULTURII PURE Verificarea puritii culturii (frotiu Gram) Identificarea culturii pure const n evidenierea unor caractere specifice ale acestei culturi pentru a o include intr-o familie, gen, specie, variant Se studiaz caracterele: Morfologice Tinctoriale De cultur Biochimice Antigenice (seroidentificarea) De patogenitate Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea) Sensibilitatea la antibiotice
-

STUDIEREA ACTIVITII BIOCHIMICE A BACTERIILOR Activitatea zaharolitic (irul Hiss, coagularea laptelui, etc) Activitatea proteolitic Degradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea laptelui, etc) Evidenierea enzimelor ce intervin in degradarea AA (decarboxilaze, dezaminaze, desulfhidraze, etc) cu detectarea produsele finale ale descompunerii AA: H2S, NH3, indol, etc Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de fier de culoare neagr in mediile multitest Kligler, Olkeniki, etc; plasarea unei benzi de hrtie de filtru imbibat cu acetat de Pb deasupra BP in care crete cultura studiat (formarea sulfurii de Pb innegrete hrtia) Depistarea indolului (produs al hidrolizei triptofanului) benzi de hrtie imbibate cu acid oxalic. In prezena indolului indicatorul vireaz in roz. Depistarea amoniacului (ureaza) hrtia de turnesol se coloreaz in albastru. Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2) (cultura se amestec cu o pictur de ap oxigenat apariia bulelor de gaz) Depistarea oxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei din lanul respirator) Reactiv di (tetra)metil-parafenilen-diamin (benzi sau rondele de hrtie mbibate cu reactiv, creioane, etc) Oxidarea reactivului culoare violet-neagr Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas 10

Oxidazo- : Enterobacteriaceae Depistarea lecitinazei mediu cu glbenu de ou 10% - formarea unui halou opac in jurul coloniilor Depistarea lipazei mediu cu Twin 80 1% halou opac in jurul coloniilor (precipitarea acizilor grai) Depistarea hemolizinei geloz-snge 5-10% - zon clar in jurul coloniei Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc Probele sunt incubate la 37 grade C, 18-24 h Identificarea rapid Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde (economie de timp, spaiu, material) Sistemul API o galerie din plastic format din numeroase alveole care conin fiecare un mediu deshidratat diferit (glucide, AA, etc). Alveolele sunt inoculate cu o suspensie bacterian testat i incubate. Ulterior la necesitate se adaug reactive pentru detectarea metaboliilor particulari. Lectura conform unui cod de cifre sau computerizat IV etap EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA SI ELIBERAREA RSPUNSULUI Compararea rezultatelor obinute cu caracterele speciilor bacteriene cunoscute pentru a gsi asemnri. Exemplu de rspuns: Din proba examinat a fost izolat tulpina de Corynebacterium diphtheriae, biovar gravis, tox+, sensibil la ...., rezistent la ..... EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI ANAEROBE (clostridiene, neclostridiene) Condiia principal cultivare in absena oxigenului 1.Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat 100 grade C, 20 min, rcit, acoperit cu vazelin; insmnarea in geloz in coloan) 2. Crearea condiiilor de anaerobioz Metoda fizic utilizarea anaerostatului Metoda chimic in exicator se introduc substane ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz); utilizarea gas-pachetelor Metoda biologic Fortner cultivarea concomitent a aerobilor i anaerobilor Recoltarea cu precauie, evitnd contactul cu aerul (in seringi, utiliznd medii speciale) I etap IMBOGIREA ANAEROBILOR Insmnarea prelevatului in 2 eprubete cu mediul Kitt-Tarrozzi regenerat Inclzirea unui tub la 80 grade C, 20 min distrugerea florei nesporogene Incubarea la 37 grade C, 24-48 h (va avea loc inmulirea anaerobilor) II etap - IZOLAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI Studierea caracterelor de cultur tulburarea mediului, descompunerea bucilor de ficat, etc Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (insmnarea a 0,1 ml din mediul K-T pe 3 cutii cu geloz-snge glucozat consecutiv). Incubarea in anaerostat/exicator/gas-pack, 24-48 h Metoda Weinberg diluii succesive ale culturii in geloz glucozat lichefiat i aspirarea in tuburi lungi i inguste, inchise ermetic. Incubarea in termostat, 24 h III etap - ACUMULAREA CULTURII PURE Studierea macroscopic a coloniilor Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte 11

Repicarea in mediul K-T regenerat pentru acumularea culturii pure Incubarea in termostat, 24 h

IV etap - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI Verificarea puritii culturii pure (frotiu Gram) Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiiilor de anaerobioz) V etap - EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA I ELIBERAREA RSPUNSULUI

12