Crioconservarea

Victor Voicu

Crioconservarea este un proces n cazul n care celule sau esuturi ntregi

sunt conservate prin rcire, sub-zero temperaturi sczute, cum ar fi (de obicei) 77
K sau -196 C (punctul de fierbere de azot lichid). La aceste temperaturi sczute,
orice activitate biologic, inclusiv reacii biochimice care ar conduce la moartea
celulelor,este efectiv oprit. Cu toate acestea, atunci cand solutiile crioprotector nu
sunt utilizate, celulele fiind conservate sunt de multe ori avariate din cauza
congelarii n timpul abordarea la temperaturi sczute sau nclzirea latemperatura
camerei.
Temperatura
Depozitarea produselor criogenate la temperaturi foarte sczute presupune a oferi o
durat nedeterminat, dac nu chiar n apropierea de infinit, longevitatea la celule,
dei real "termenul de valabilitate", este destul de dificilde dovedit. n
experimentele cu
uscate, semine, cercettorii au constatat
c nu
a existat
variabilitate,deteriorare evident n cazul n care probele au fost inute diferit
"ngheate" la temperaturi ultra-chiar i cele rece. Temperaturi sub punctul de
tranziie de sticl (Tg) de ap (n jur de minus 136 C), par a fi acceptate ca limite
n care activitatea biologic foarte substanial ncetinete, i minus 196 C (fazei
lichide de azot lichid) este temperatura preferat pentru depozitare a exemplarelor
importante. n timp ce frigidere, congelatoare profund i extra congelatoare rece
adncime, toate similare cu cele interne, sunt utilizate pentru multe elemente, n
general,ultra rece de azot lichid la -196 C este necesar pentru conservarea cu
succes a structurilor mai complexe biologice pentru a opri aproape
toate activitiile biologice.
Riscuri
Fenomene care pot cauza deteriorarea celulelor n timpul crioconservari au loc n
principal n timpul etapei decongelare, i includ: soluie de efecte, formarea
extracelulara de ghea, deshidratare i formarea intracelular de ghea. Multe
dintre aceste efecte pot fi reduse prin cryoprotectants.Atunci cnd au ajuns n faza
de congelate, materialul este relativ conservat n condiii de siguran fata de
viitoarele daune(distrugeri). Cu toate acestea, estimri bazate pe acumularea de
radiaii induse de deteriorarea ADN-ului n timpul depozitrii criogenice au sugerat
o perioad maxim de depozitare de 1000 de ani .

Efecte si soluii
Deoarece cristalele de ghea cresc dizolvarea substanelor n ap de congelaresunt excluse,pt ca le determin s devin concentrate n ap rmasa lichid.
Concentraii ridicate din unele substane dizolvate poate fi foarte duntoare.
Formarea extracelular de ghea
Atunci cnd esuturile sunt rcite lent, apa migreaz din celule i forme de ghea
n
spaiul
extracelular.Prea
mult ghea extra
celulara poate provoca leziuni mecanice membranei celulelor din cauza de zdrobir
e.
Deshidratarea
Migraia de ap care cauzeaz formarea extracelulara de ghea poate provoca, de
asemenea, deshidratarea celulelor. Asociate pe celul pot provoca daune n
mod direct.
Formarea intracelular de ghea
n timp ce unele organisme i esuturi pot tolera ceva ghea extracelulara, orice
ghea semnificativ intracelulara este aproape ntotdeauna fatala n celule.
Prevenirea riscurilor
Vitez controlat-i congelare lent sunt bine stabilite tehnici de pionier la nceputul
anilor 1970, care a permis embrionului uman prima natere congelata
(Zoe Leyland) n 1984. De atunci, mainile care congeleaza probebiologice
utiliznd paii programabili, sau ratele controlate, au fost utilizat n ntreaga lume
pentru a oamenilor,animalelor i biologiei celulare- "nghearea joasa" o prob
pentru o mai bun pstrare, pentru decongelare ncele din urm, nainte de a fi
congelate, sau crioconservate, n azot lichid. Aceste maini sunt utilizate
pentru nghearea
ovocitului, a pielii,
a produselor din
snge, embrionilor,
spermei , celulelor stem i conservarea general de esut n spitale,in practicile
de uz veterinar i in laboratoarele de cercetare din ntreaga lume. Ca unexemplu,
estimrile au pus numrul de nateri vii de la lent ngheate ", la aproximativ
300.000 de la 400.000 sau20 de embrioni congelai '% din cele aproximativ 3
milioane nateri din fertilizarea in vitro.Letala este nghearea intracelulara, care

poate fi
evitat dac
rcirea este
destul de
lenta pentru
a permite
suficient apei de a prsi celula n timpul nghearii progresive a lichidului extracel
ular.
Aceast rat difer ntre celulele de diferite dimensiuni i o permeabilitate a apei: o
rat tipic de rcire n jur de 1 C / minut este adecvat pentru multe
dintre celulele mamiferelor dup
tratamentul cu
crioprotectori, cum
ar fi
glicerolul sau sulphoxidul de dimetil, dar rata nu este un optim universal.Mai multe
studii independente au furnizat dovezi c embrionii congelai stocati ,utiliznd
tehnici de congelare lent-ar putea, n anumite moduri s fie "mai buna" dect n
stare proaspt a fertilizarii in vitro.Studiile au fost prezentate Societatii Americane
de Medicina Reproductiva la conferinta din San Francisco, SUA, 2008. Studiile
indic faptul c folosind embrioni congelai, mai degrab dect embrioni proaspei
a redus riscul de ft mort inatere prematur dei motivele exacte sunt nc
explorate.
n stabilirea metodelor de crioconservare, substantele dizolvate trebuie s ptrund
membrana celulelor, n scopul de a realiza viscozitatea a crescut i deprim
temperatura de congelare din interiorul celulei. Zaharurile nu ptrund cu
uurin prin membrana. Aceste substane dizolvate fac, cum ar fi sulfoxidul
de dimetil, un crioprotector comun,si sunt de multe ori toxice, n concentraie
mare. Unul dintre compromisurile dificile cu care se confrunt n
crioconservarea este vitrificarea ,de a limita daunele produse de crioprotector
insusi.
Tesuturi inghetate
n general, este mai uor de crioconservat pentru probe subtiri si tufe mici de celule
individuale, pentru cacestea pot fi rcite mai rapid i mai impun acest lucru doze
mai mici de crioprotectori toxici. Prin urmare, scopul de a crioconservare de ficat
uman i inimii pentru depozitare i de transplant este nc la distan.Cu toate
acestea, combinaii adecvate de crioprotectori i regimuri de rcire i cltire n
timpul nclzirii de crioconservare permite de multe ori cu succes a materialelor
biologice, suspensii special de celule sau probe deesuturi subire. Exemplele
includ:

Material seminal
Snge
Celule speciale pentru transfuzie
Celulele stem
Sngele ombilical din cordonul ombilical (mai multe informaii: Cord banca de
snge # Crioconservare)
Probe de esuturi cum ar fi tumori i seciuni transversale histologice
Ou (ovocitelor) A se vedea crioconservarea ovocitului
Embrionii care sunt 2, 4 sau 8 celule cand sunt inghetate
esut ovarian
Semine de plante sau lstarilor poate fi crioconservati n scopuri de conservare.
n plus, eforturile sunt n curs de a pstra om criogenic, cunoscut sub numele de
cryonics. n astfel de eforturi, fie a creierului n cadrul cap sau ntregul corp pot fi
supuse procesului de mai sus. Cryonics este ntr-o categorie diferit de exemplele
menionate anterior, cu toate acestea, n timp ce pentru nenumrate celule
crioconservate ,vaccinuri, esut i alte probe biologice au fost decongelate i
folosite cu succes, acest lucru nu a fost nc cazul,la toate pentru creier
crioconservat sau organisme. n cauz sunt criteriile de definire a "victoriei".
Sustinatorii cryonics fac un caz care crioconservare folosind tehnologia actual, n
special vitrificare a creierului, poate fisuficient pentru pstrarea persoanelor ntro informare "teoretica", sensul, astfel nct acestea ar putea firenviat i a fcut
foarte mult n ansamblu, prin avansarea tehnologiei in viitor.
n 1776 omul de tiin italian Lazzaro Spallanzani a ncercat pentru prima dat
crioconservarea spermei n zapad i a observat c spermatozoizi erau mobili dup
decongelare. La sfiritul secolului IX i nceputul secolului XX, oamenii de tiina
elucideaza cteva aspecte legate de adaptarea a materiei vii, n special plante i
fungi.

O contribuie remarcabila a avut-o Father Luyet, care este considerat fondatorul

criobiologiei. n 1938 Luyet i Hodapp au realizat vitrificarea spermei de
broasca si stocarea n azot lichid. n 1985 au raportat vitrificarea cu succes a unor
embrioni de oarece. Din 1990 vitrificarea a fost aplicat i pentru ovocite i esut
ovarian.
Crioconservarea este procesul prin care o celula sau un esut este pstrat la
temperaturi scazute -196 n azot lichid. La acest temperatur majoritatea
reaciilor chimice snt inhibate, apa existind sub forma de cristale.
Tranziia de la forma lichid la forma solid a apei este cel mai des fenomen
ntlnit n natur. Stocarea la temperaturi foarte joase ofera pastrarea pe o durat
nedeterminat a materialului biologic. Prin congelare, celula sau esutul sufer
diferite procese de transformare care pot interfera cu activitatea biologica dup
decongelare.
Un alt efect este legat de folosirea crioprotectantilor, care n concentraii
necorespunzatoare snt toxici pentru celula. Crioprotectanii snt substane chimice
cu greutate moleculara mai mica de 100 de Daltoni, care le permite penetrarea prin
membrana celulara, se dizolva n ap, scaznd punctual de nghe al acesteia.
Crioprotectanii cu aplicaie n criobiologie snt etilen glicolul, glicerol, propilen
glicol, dimetilsulf oxid (DMSO).
O celula sau un esut care va fi supus procesului de crioconservare, trebuie sa
ndeplineasc cteva condiii: sa fie o celula sau esut sntos, s nu fie
contaminat cu microorganisme si s fie ntr-un stadiu care s-i permit folosirea
dup decongelare ( cu potenial de diviziune).
Aplicarea criopreservrii n reproducerea uman asistat, ofer cuplurilor cu
embrioni supranumerari, posibilitatea pstrrii i utilizrii ulterioare a acestora,
dac emtriotransferul cu embrioni proaspei nu s-a finalizat cu sarcina.
Crioconservarea gameilor, esutului ovarian sau testicular au aplicabilitate n
pacienii oncologici naintea nceperii chimio sau radioterapiei.
n reproducerea uman asistat se folosesc n mod curent dou metode de
congelare.

1. Congelarea lenta ( Slow freezing) dupa cum i spune i numele congelarea se

face lent, scaderea punctului de nghe fcndu-se progresiv, volumul intracelular al
apei ramnnd n echilibru cu cel extracelular, deshidratarea celulei facndu-se sub
0C ( n timpul congelrii), la sfritul congelrii celula fiind deschidratat sau
ramnd un volum foarte mic de apa.
Concentraia crioprotectanilor n congelarea lent este mai mica, iar timpul de
expunere al celulei la crioprotectant este mai mare. Stocarea ovocitelor i a
embrionilor se face n paiete care dupa ncarcare snt sigilate i introduse n azot
lichid.
2. Vitrificarea ( congelarea rapida) reprezint o metode de congelare rapid prin
introducerea directa n azot lichid. Concentraia crioprotectaniilor pentru
vitrificare este mai mare dect n congelarea lenta, iar timpul de expunere este mai
mic. Diferena dintre congelarea lent i vitrificare const n faptul c expunerea
celulelor sau esutului la o concentraie mai mare de crioprotectani i introducerea
directa n azot lichid previne formarea cristalelor de gheata i astfel o supravieuire
mai buna dup decongelare. Celula este deshidrat nainte de introducerea n azot,
iar rata de nghe este 20.000C/ minut fa de congelarea lent n care punctul de
nghe scade cu 1C/minut. Rata de nghe depinde de dispozitivul folosit pentru
vitrificare. n practic sint folosite dou sisteme de vitrificare nchis i deschis.
Avantajele vitrificarii comparativ cu congelarea lent provin din faptul c nu
necesit dotari speciale, timpul alocat congelrii este mult redus de la 2 ore la 5-15
minute n funcie de materialul congelat i mediul folosit, rata de supravieuire
dupa decongelare este superioara fa de congelarea clasic .

Bibliografie:

1. Articol de Dr. Marilena Baluta, medic Obstetrica-Ginecologie, Embriolog.

Departamentul de Reproducere Umana Asistata
2. www.scribd.com/doc/43621534/crioconservarea