Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
65
Tratat de Biotehnologie
n timpul procesului de replicare monocatenele ADN (att cele vechi, ct i cele nou sintetizate)
sunt stabilizate i protejate de aciunea nucleazelor, de ctre o clas special de proteine numite
proteine Ssb (Single Stranded Binding)
terminarea replicrii unei molecule de ADN difer ntre moleculele circulare i cele lineare
la moleculele circulare, ntlnite n majoritatea cazurilor la cromozomul bacterian i la plasmide,
cele 2 bifurcaii de replicare se ntlnesc ntr-o regiune denumit ter.
la moleculele ADN lineare din cromozomii de la eucariote, capetele acestora (telomerele) sunt
replicate printr-un mecanism diferit, iar fragmentele sunt apoi unite de ADN ligaze
Complementaritatea dintre bazele azotate de pe cele 2 catene ale moleculei de ADN determin
o structur perfect adaptat funciei de replicare, fiecare dintre cele 2 catene servind drept matri
pentru sinteza unei catene complementare.
In majoritatea cazurilor, replicarea se realizeaz pe model semiconservativ, macromoleculele
de ADN fiice fiind formate dintr-o caten veche i una nou (Figura 4.2).
66
Tratat de Biotehnologie
Mai mult chiar, apar diferene i datorate structurii teriare. Cromozomul bacterian are o
structur circular i, ca urmare, cele 2 bifurcaii de replicare se ntlnesc la nivelul secvenei ter
(Figura 4.5). Cromozomul de tip eucariot are o structur linear, iar capetele lui (denumite telomere)
se replic diferit de restul cromozomului.
67
Tratat de Biotehnologie
68
Tratat de Biotehnologie
n procesul de replicare a ADN, n diverse etape, apar zone monocatenare ce sunt stabilizate
(i aprate) fa de aciunea nucleazelor prin ataare de proteine de tip Ssb (Single Stranded Binding
proteine ce se ataeaz la monocatene ADN).
4.1.2.2 Topoizomerazele
Superspiralizarea cromzomului bacterian impune intervenia unor enzime care s realizeze
relaxarea dublului helix ADN. Aceste enzime se numesc topoizomeraze i acioneaz asupra
topoizomerilor ADN (Figura 4.9). Topoizomerii sunt molecule ADN cu structur primar i secundar
identic i care difer n structura teriar.
Dou molecule ADN d.c. ce au aceeai secven de nuceotide dar numr diferit de nlnuiri i
suporarsuciri sunt topoizomere datorit diferenelor de natur topologic.
La bacterii, ca de altfel i la eucariote, exist 2 clase de topoizomeraze cu mecanisme diferite
de aciune (Figura 4.9) :
topoizomeraze tip I induc rupturi monocatenare (i tranzitorii) n ADN
topoizomeraze tip II induc rupturi bicatenare n ADN (Figura 4.10)
La bacterii, topoizomeraza de tip I cea mai bine caracterizat este TopA de la E.coli, care
relaxeaz suprarsuciri negative nalt rsucite. Topoizomerazele de tip II, n absena ATP, au rolul de a
relaxa macromolecula ADN ca i TopA, n timp ce n prezena ATP induc suprarsuciri negative n
moleculele circular covalent nchise (CCC) relaxate. Cea mai cunoscut enzim din aceast clas este
ADN giraza, care poate introduce aproximativ 100 de suprarsuciri negative per minut.
Figura 4.9 Desfacerea dublului helix ntr-o bifurcaie de replicare, prin aciunea topoizomerazelor.
69
Tratat de Biotehnologie
Figura 4.11 Rolul secvenelor terminator i al proteinelor Tus n replicarea cromozomului la E.coli.
70
Tratat de Biotehnologie
ADN polimeraza I (ADN pol I) este codificat de gena polA i are o g.m. de aprox 100 Md.
n celula de E.coli exist circa 400 molecule de ADN pol I care are o vitez de polimerizare de 667
nucleotide / min. n afar de activitatea de polimerizare, aceast enzim poate desfura i activitate de
exonucleaz (adic de desfacere de legturi fosfo-diesterice i eliminare de nucleotide dintr-o caten).
Astfel, ADN pol I are un domeniu polipeptidic ce realizeaz activitate exonucleazic n direcie 3 5
, activitate foarte important ce i asigur enzimei i posibilitatea de a i corecta singur eventualele
erori de ncorporare a unor nucleotide mperecheate greit. Aceast funcie este denumit citire
corect (proof-reading). Totodat, ADN pol I poate desfura i activitate exonucleazic n direcie
5 3, activitate ce i permite ndeprtarea primerilor ARN.
ADN polimeraza II (ADN pol II) este codificat de gena polB. i aceast enzim poate avea
i activitate exonucleazic 5 3.
ADN polimeraza III (ADN pol III) este principala replicaza a cromozomului bacterian i
reprezint un adevrat complex enzimatic format din cel puin 10 subuniti funcionale (Tabelul din
Figura 4.12).
Figura 4.12 Subunitile ADN polimerazei III de la procariote.
Denumirea
subunitii
Masa
molecular
130
27
10
71
47
35
33
15
12
40
Gena
pol C (dnaC)
dnaQ
holE
dnaXZ
dnaXZ
holA
holB
holC
holD
dnaN
Funcii
Subansamblu
Holoenzima ADN pol III acioneaz ca dimer, fiecare din cei 2 monomeri realiznd sinteza pe
una din cele 2 catene. O excepie o reprezint complexul care acioneaz doar pe catena ntrziat.
71
Tratat de Biotehnologie
72
Tratat de Biotehnologie
73
Tratat de Biotehnologie
RepB este o primaz care sintetizeaz un primer ARN necesar iniierii polimerizrii ADN;
RepC este o protein iniiator care se ataeaz la secvenele iteroni din oriV.
Replicarea pornete de la dou origini (ssiA i ssiB) simetrice i adiacente, ce funcioneaz n
forma monocatenar i sunt situate pe cele 2 catene. Procesul de replicare ncepe cnd aceste 2 origini
sunt expuse monocatenar.
Etape
Procesul de replicare SD se desfoar n urmtoarele etape:
1.
monomeri ai proteinei RepC se ataeaz la secvene iteroni din oriV;
2.
proteina RepA (helicaza) se ataeaz la regiunea din oriV bogat n A/T, determinnd
desfacerea dublului helix;
3.
proteina RepB (primaza) se ataeaz la bucla A/T i sintetizeaz un primer ARN;
4.
ncepe procesul de polimerizare ADN;
5.
helicaza RepA faciliteaz dislocarea catenei parentale nereplicate sub forma unei bucle D.
Produsele intermediare ale unui proces de replicare SD sunt:
- o molecul ADN circular d.c.
- o molecul ADN circular m.c. pe aceasta va fi iniiat un nou proces de replicare
care va conduce la formarea catenei complementare, i deci, a formei dublucatenare a
plasmidului.
n cazul unui asemenea mecanism de replicare sinteza celor dou catene noi ale moleculei de
ADN nu este cuplat i simultan.
4.1.3.2.3 Mecanismul ROLLING-CIRCLE (RC)
Denumirea provine din faptul c n timpul procesului, molecula de ADN are forma unui cerc
rotativ. Acest mecanism de replicare este ntlnit la plasmide din multe bacterii Gram-pozitive, de
exemplu plasmidul pT181 (de la Staphylococcus), pUB110 i pC194 (de la Bacillus subtilis).
Ca i n cazul mecanismului SD, replicarea de tip RC depinde de o protein iniiator codificat
plasmidial (propteina Rep) i de o serie de proteine codificate pe cromozomul bacterian.
Plasmidele ce se replic prin mecanism RC au doua secvene ori situate distanat una de alta:
dso (double-stranded origin), de la care este iniiat replicarea primei catene noi (catena
leading); dso are 2 regiuni: regiunea bind, la care are loc ataarea proteinei iniiator Rep i
regiunea nick, n care proteina Rep produce ruptura monocatenar initial
sso (single-stranded origin), de la care este iniiat sinteza celei de-a doua catene noi (catena
lagging)
Etape
n procesul de replicare RC se parcurg urmtoarele etape:
- proteina Rep se ataeaz la regiunea bind a secvenei dso;
- proteina Rep taie o legtur fosfodiesteric (ruptur monocatenar) i rmne ataat la
capul 5 Tyr-fosfodiesteric; capul 3 va servi ca primer pentru sinteza catenei leading;
- n procesul de sintez a catenei leading intervin o serie de proteine codificate pe
cromozomul bacterian: helicaza, Ssb, ADN polimeraza III;
- replicarea catenei leading continu mai mult de o rund complet depind regiunea dso;
- pentru terminarea replicrii catenei leading are loc o reacie de transfer de caten: prin
monomerul liber, proteina Rep atac regiunea dso a catenei vechi, taie o legatur fosfodiesteric i
reface alta, rezultnd o molecul circular d.c. care a eliberat i un dimer de Rep inactiv i, respectiv, o
molecul circular m.c. pe care, de la sso, este sintetizat un primer i apoi o caten noua
Deci, i n cazul acestui mecanism sinteza celor dou catene ADN noi nu este cuplat.
Intr-un asemenea proces proteina Rep are un rol mai complex dect ntr-o replicare SD :
- se ataeaz la dso, avnd rol n iniierea replicrii;
- taie o legtur fosfodiesterica, producnd nick-ul iniial;
- la terminarea sintezei primei catene noi, Rep taie i reface legturi fosfodiesterice
Datorit activitatii sale catalitice, proteina Rep de la plasmidele ce se replic printr-un
mecanism RC este similar cu topoizomerazele din clasa I.
74
Tratat de Biotehnologie
n general, plasmidele ce se replic prin RC au o alctuire modular, cel mai important modul
fiind LIC (Leading strand Initiation and Control region) care este format din dso, gena rep i
elemente de control al replicrii plasmidei. Pe baza structurii LIC au fost definite 4 familii de plasmide
ce se replic prin mecanism RC, familii ce au drept reprezentani urmatoarele plasmide: pT181,
pC194, pMV158, pSN2. Alte module importante n aceste plasmide sunt: 1-2 sso, 1 mob, 1 gen de
antibiorezisten.
75
Tratat de Biotehnologie
Meninerea stabil a lui pSC101 n celula bacterian presupune intervenia a mai multor clase
de proteine: DnaA (esenial i n iniierea replicrii cromosomului bacterian), IHF (Integration Host
Factor, protein histone-like implicat n reglarea unei serii de procese celulare), DnaB, DnaC,
DnaG (primaza), componente ale holoenzimei ADN polimeraza III.
Regiunea ori din plasmidul pSC101 conine situsuri multiple de legare pentru proteine
eseniale n replicarea plasmidial:
- un situs de ataare a proteinei DnaA
- 2 secvene repetate, formate din cte 13 pb (13-mer), omoloage cu secvenele din
oriC i la care se ataeaz complexul DnaB-DnaC
- o regiune bogat n A/T
- ntre regiunea A i regiunea T se gasete situsul pentru IHF
- un cluster de 3 secvene repetate direct RS1 (24 pb), RS2 (18 pb), RS3 (24 pb) la
care se atasaza proteina RepA
- ARN polimeraza se ataeaza la un promotor localizat n i ntre aceste 3 secvene
RS (promotorul pentru ARN-Y)
Procesul de transcriere n regiunea oriV i implicat n iniierea replicrii este un fenomen
extrem de frecvent n lumea bacterian, att pentru replicarea cromosomului, ct i a unor plasmide. n
cazul lui pSC101, printr-un asemenea proces de transcriere la origine, este sintetizat ARN-Y care
ncepe din mijlocul lui RS2. Acest proces nu se afl sub controlul proteinei RepA, iar rolul moleculei
ARN-Y pare s fie acela de a facilita deschiderea dublului helix ADN n regiunea ori.
Regiunea par nu este esenial pentru replicare (plasmidele par- se replic), dar este esenial
pentru stabilitatea plasmidelor n celula bacterian, probabil prin situsul pentru giraza.
76
Tratat de Biotehnologie
Legarea simultan a proteinelor Rep A, IHF, Dna A, DnaB-Dna C este favorizat de curbarea
ADN determinat de legarea IHF (curbeaza dublul helix ADN cu150o la situsul de atasare), i
determin formarea REPLISOMULUI.
Reglarea numrului de copii plasmidiale la pSC101 i, probabil, i la alte plasmide i sisteme
similare, nu este produsul unui singur mecanism de reglare, ci este o rezultant a unui set de
interaciuni moleculare (ADN-proteine, ADN-ADN, proteine-proteine), fiecare dintre ele contribuind
la replicarea, stabilitatea i partiia eficient a plasmidului.
77
Tratat de Biotehnologie
Figura 4.17 Reprezentarea schematizat a unui proces de transcriere monocistronic i, respectiv, policistronic.
4.2.2 Enzime
Procesul de transcriere genetic este catalizat de o clas special de enzime numite ARN
polimeraze.
La organismele procariote eixst cte o singur specie molecular de ARN polimeraz per
celul, aceasta realiznd sinteza tuturor tipurilor de ARN din celul.
La eucariote, majoritatea celulelor dein cte 3 specii moleculare de ARN polimeraze, fiecare
dintre ele sintetiznd anumite specii de ARN.
78
Tratat de Biotehnologie
4.2.3.2 Terminatori
Transcrierea genetic continu de la promotori pn la terminatori. Acetia reprezint regiuni
din molecula ADN ce prezint o anumit secven de nucleotide:
- 2 copii ale unei secvene poli-GC n repetiie invers; aceast regiune prezint
complementaritate intracatenar i determin formarea n transcriptul ARN a unei structuri n ac-depr (hairpin) ce mpiedic avansarea ARN polimerazei
- o regiune format din 4 10 adenine (ce corespunde pe transcript cu 4 10 resturi de uracil)
care reprezint semnalul propriu-zis de terminare a transcrierii
Dei regiunile terminator sunt identificate pe molecula ADN, terminarea transcrierii este de
fapt realizat de catena ARN (Figura 4.19).
Pn n prezent au fost identificate 2 clase de terminatori la procariote:
- terminatori Rho independeni : sunt regiuni de tip terminator n care cele 2 secvene poliGC prezint complementaritate intracatenar perfect, realiznd o structur n ac-de-pr stabil
- terminatori Rho dependeni : sunt regiuni terminator n care cele 2 poli-GC nu prezint
complementaritate intracatenar perfect; n acest caz structura n ac-de-pr este stabilizat de ctre o
protein numit proteina Rho (de la litera greceasc Rho - ) care alunec pe molecula ARN pn la
acul-de-pr i l stabilizeaz.
79
Tratat de Biotehnologie
80
Tratat de Biotehnologie
81
Tratat de Biotehnologie
82
Tratat de Biotehnologie
Factori generali
de transcriere
TBP
TFIIA
TFIIB
TFIIE
TFIIF
TFIIH
proteine TAF
Numrul de
subuniti
1
2
1
2
3
9
11
83
Tratat de Biotehnologie
BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P., 2002, Molecular Biology of the Cell. 4th ed.,
Garland Publishing House, New York.
Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., 2002, Biochemistry. , W. H. Freeman and Co., New York.
Brown T.A., 2002, Genomes. 2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd, Oxford, UK.
Campbell A.M., 1992, Chromosomal insertion sites for phages and plasmids. Journal of Bacteriology
174(23):7495-7499.
Cohen S.N., 1993, Bacterial plasmids: their extraordinary contribution to molecular genetics. Gene 135:67-76.
Cooper G.M., 2000, The Cell - A Molecular Approach. 2nd ed., Sinauer Associates, Inc., SUA.
Cornea C.P., 1998, Elemente de Inginerie Genetic, Editura ALL, Bucureti.
Covic M., tefnescu D., Sandovici I., 2004, Genetic medical, Editura Polirom.
Dale J.W., 1998, Molecular Genetics of Bacteria, 3rd Edition.Anonymous Chichester, UK:John Wiley & Sons.
Del Solar G., Giraldo R., Ruiz-Echevarria M.J., Espinosa M., Diaz-Orejaz R., 1998, Replication and control of
circular bacterial plasmids. Microbiol Molec Biol Rev 62(2):434-464.
Embley T.M., Hirt R.P., Williams D.M., 1994, Biodiversity at the molecular level: the domains, kingdoms and
phyla of life. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 345(1311):21-33.
Espinosa M., del Solar G., Rojo F., Alonso J.C., 1995, Plasmid rolling circle replication and its control. FEMS
Microbiol Lett 130:111-120.
Freifelder D., 1987, Microbial Genetics. Jones and Bartlett Publishers. Boston, USA.
Gavril L., 2003, Genomica Un tratat despre genom, de la virusuri la om, vol.I, vol.II, Ed. Encicl., Bucureti.
Gilson E., Bachellier S., Perrin S., Perrin D., Grimont P.A.D., Grimont F., Hofnung M., 1990, Palindromic unit
highly repetitive DNA sequences exhibit species specificity within Enterobateriaceae.. Researches in
Microbiology 141:1103-1116.
Griffiths A.J.F., Miller J.H., Suzuki D.T., Lewontin R.C., Gelbart W.M., 1999, Introduction to Genetic
Analysis. 7th ed., W. H. Freeman & Co., New York.
Hardy K.G., 1988, Plasmids: A Practical Approach. IRL Pres. Oxford, UK.
Herlea V., 1998 Microbiologie general, Ed. Univ., Bucureti.
Hinnebusch H., Barbour A.G., 1992, Linear- and circular-plasmid copy numbers in Borrelia burgdorferi. J.Bact.
174(16):5251-5257.
Hinnebusch J., Tilly K., 1993, Linear plasmids and chromosomes in bacteria. Molecular Microbiology
10(5):917-922.
Hiraga S., 1992, Chromosome and plasmid partition in E.coli. Annu Rev Biochem 61:283-306.
Lewin B. , 1997, Genes. 6th ed., Oxford University Press, New York, USA.
Lodish H., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J.E., 2000, Molecular Cell Biology. 4th
ed., W. H. Freeman & Co. Publishing, New York.
Manen D., Caro L., 1991, The replication of plasmid pSC101. Molecular Microbiology 5(2):233-237.
Margulis L., 1992, Biodiversity: molecular biological domains, symbiosis and kingdom origins. Biosystems
27(1):39-51.
Moller-Jensen J., Gerdes K.J.R., 2000, Plasmid and chromosome segregation in prokaryotes. Trends in
Microbiology 8(7):313-320.
Nester E.W., Evans Roberts C., Nester M., 1995, Microbiology, A Human Perspective, WCB Publishers, SUA.
Pettijohn D.E., 1988, Histone-like proteins and bacterial chromosome structure. J Biol Chem 263(26):12793-6.
Prescott L.M., Harlez J.P., Klein D.A., 1996, Microbiology. Third Edition, WCB Publishers, SUA.
Raicu P., Stoian V., 1991, Genetica dezvoltrii la eucariote, Editura Academiei Romne.
Russel P.J., 1994, Fundamentals of Genetics, Harper Collins College Publishers, SUA.
Sakaguchi K., 1990, Invertrons, a class of structurally and functionally related genetic elements that includes
linear DNA plasmids, transposable elements and genomes of adeno-type viruses.. Microbiol Rev 54(1):66-74.
Stoica I., Vassu T., Ssrman E., 2002 Biologia i taxonomia molecular a microorganismelor. Colecia de
culturi microbiene. Ed. Arvin Press.
Strachan T., Read A.P., 1999, Human Molecular Genetics 2. 2nd ed., BIOS Sci. Publishers, Ltd,Oxford, UK.
Summers D.K., 1996, The Biology of Plasmids.Anonymous Anonymous Oxford, UK:Blackwell Science Ltd.
Sykora P., 1992, Macroevolution of plamids: a model for plasmid speciation. J Theor Biol 159:53-65.
Trun N.J., 1998, Architecture of a bacterial chromosome. ASM News 64(5):276-283.
Vassu T., Stoica I., Cstuak O., Muat F., 2001, Genetica microorganismelor i Inginerie genetic microbian.
Note de curs i Tehnici de laborator. Editura Petrion, Bucureti.
Watson J.D., Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R., 2004, Molecular Biology of the Gene. Fifth
Edition, CSHL Press.
Weaver R.F., 1999, Molecular Biology, WCB McGraw-Hill Press.
Woese C.R., Kandler O., Wheelis M.L. , 1990, Towards a natural system of organisms: proposal for the
domains Archaea, Bacteria and Eucarya., Proc Natl Acad Sci USA, 87, pp 4576-4579.
Zarnea G., Tratat de Microbiologie Generala. vol I (1983), II (1984) i V (1994), Editura Academiei Romane.
84