Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Cap 3 Cromozomul La Organisme Pro Si Eucariote
Cap 3 Cromozomul La Organisme Pro Si Eucariote
Figura 3.1 Modelul Pettijohn de structur a nucleoidului din bacteria Escherichia coli. ntre 40 i 50 de bucle suprarsucite radiaz dintr-un miez proteic (dup Brown, 2002).
45
Tratat de Biotehnologie
46
Tratat de Biotehnologie
eucariote, denumite structuri nucleosom-like (chiar i n condiii n vitro), n care sunt cuprinse circa 200 pb/nucleosom. Structurile nucleosom-like nu sunt statice, ci se afl ntr-un echilibru dinamic. Studii mai ample au demonstrat faptul c proteina HU nu este o simpl protein structural a arhitecturii cromozmului bacterian, ci are rol foarte important n diverse procese din celula bacterian n mod special n procese ce implic interaciuni ADN-proteine, situaie n care moleculele HU favorizeaz ataarea altor proteine la ADN. Dei proteinele histone-like au fost studiate extensiv la E.coli, totui au fost identificate proteine cu funcii omoloage i la alte genuri i specii bacteriene. Pe de alt parte, s-a constatat c o serie de microorganisme din grupul Archaea prezint proteine histone-like cu structur intermediar ntre cele de la Bacteria i histonele de la Eukarya.
Deinococcus radiodurans R1
Molecule ADN 1 molecul circular 2 molecule circulare 1 cromozom 1 megaplasmid 4 molecule circulare Cromozom 1 Cromozom 2 Megaplasmid Plasmid 7 8 molecule circulare 11 molecule lineare Cromozom linear Plasmid circular cp9 Plasmid circular cp26 Plasmid circular cp32 Plasmid linear lp17 Plasmid linear lp25 Plasmid linear lp28-1 Plasmid linear lp28-2 Plasmid linear lp28-3 Plasmid linear lp28-4 Plasmid linear lp36 Plasmid linear lp38 Plasmid linear lp54 Plasmid linear lp56
0.911 0.009 0.026 0.032 0.017 0.024 0.027 0.030 0.029 0.027 0.037 0.039 0.054 0.056
47
Tratat de Biotehnologie
Proteina HU este cea mai important protein histone-like de la E.coli au fost descrise proteine tip HU la toate bacteriile studiate ca i histonele de la organismele eucariote, proteina HU se ataeaz la molecule de ADN d.c. indiferent de secvena de nucleotide, deci situs - nespecific are un caracter bazic i o greutate molecular de 9,7 kd funcioneaz ca dimer un monomer este format din 2 polipeptide, denumite HU- i HU- i codificate de gene diferite: hup A i, respectiv, hup B. are proprieti fizice i compoziie total n aminoacizi similar cu histonele de la eucariote, dar secvena de aminoacizi este diferit de acestea. ca i histonele de la eucariote, proteina HU are un grad nalt de conservare n lumea bacterian exist aproximativ 25000 de molecule HU per genom de E.coli, dar aceste molecule nu sunt dispuse uniform de-a lungul cromozomului bacterian, ci sunt mai dense la periferia nucleoidului (n zonele extrem de active transcripional)
Proteina IHF Alte proteine histone-like de la E.coli sunt proteina H (similar cu histona H2A de la eucariote), proteina H1, proteina H-NS, proteina IHF. Proteina IHF (Integration Host Factor, g.m.=20 kd) 9a fost descoperit n studiile privind integrarea genomului fagului n cromozomul de E. coli ; ulterior, s-a constatat c aceast protein intervine i ntr-o serie de alte procese din celula bacterian 9este format din 2 subuniti codificate de genele him A i him B. 9spre deosebire de alte proteine histone-like, moleculele de IHF se ataeaz la ADN ntr-o manier situs-specific (adic doar la anumite secvene de nucleotide) 9moleculele de IHF nu sunt necesare pentru recombinarea bacterian omoloag, dar par s intervin n fenomene de recombinare neomoloag, specializat, cum sunt de altfel, procesele de transpoziie i de conjugare bacterian
48
Tratat de Biotehnologie
de ADN giraz, aceste secvene avnd deci rol n mpachetarea nucleoidului. Tot la aceste secvene se leag i ADN polimeraza intervenind n procese de replicare i reparare ADN. Situsuri Chi Un situs Chi are o lungime de 8 pb: 5 GCTGGTGG 3 Datorit faptului c reprezint situsul de recunoatere i tiere a moleculelor ADN de ctre endonucleaza RecBCD, secvenele Chi stimuleaz recombinarea omoloag mediat de RecA i RecBCD. S-a mai constatat c efectul recombinativ al situsului Chi este polar: stimuleaz recombinarea la capatul 5 al lui Chi, i nu la 3. Situsuri Chi au fost identificate att pe cromosom, ct i pe unele plasmide de la E.coli. Mai mult chiar, s-a constatat c secvenele Chi reprezint situsuri de stimulare a recombinrii genetice la toi membrii familiei Enterobacteriaceae. n contrast, la Pseudomonadaceae, complexul enzimatic RecBCD nu acioneaz la situsuri Chi. In cromosomul de E.coli au fost identificate aproximativ 950 de situsuri Chi, ce par s fie distribuite relativ uniform (1 situs Chi la 5 kbp), cu excepia zonei adiacente regiunii oriC, unde exist un cluster de 22 de situsuri Chi. Situsuri Dam sunt formate din 4 bp (5 GATC 3) i reprezint situsurile de metilare a adeninei (adenina este metilat la poziia N6). Cromosomul de E.coli conine foarte multe situsuri Dam (peste 18.000) care, dac ar fi dispuse randomizat ar exist 1 situs Dam/250 bp. i n acest caz sa constatat un numar foarte mare de situsuri Dam n, i n jurul, regiunii oriC: n cele 245 bp ce definesc oriC la E.coli exist 8 situsuri Dam, iar n cele 350 bp ce flancheaza oriC exist nc 12 situsuri Dam.
49
Tratat de Biotehnologie
1. poziia genei pe cromosom, de-a lungul unui gradient pornind de la oriC spre regiunea ter. n timpul replicrii cromosomului bacterian, n funcie de poziia lor pe cromosom, unele gene sunt deja replicate, n timp ce altele nc nu. Astfel, unele gene se gasesc ntr-un numr mai mare de copii dect altele. 2. copii ale unei gene cromosomale pot exist i pe plasmide. n aceast situaie se folosete termenul de meroploidie parial, care se refer la o ploidie parial ce afecteaz anumite gene, fr s existe multiplii de cromosomi ntregi (este cazul genelor prezente i pe cromosom i pe un plasmid). 3. ntr-o celula bacterian pot exist mai multe copii ale ntregului cromosom. La anumite specii bacteriene exist mai multe copii cromosomale n aceeai celul: Desulfovibrio vulgaris (4 copii), D.gigas (17 copii), Azotobacter chroococcum (20-25 de copii), A.vinelandii (40-80 de copii cromosomale). Este de subliniat faptul c la majoritatea speciilor bacteriene cu copii cromosomale multiple exist procese de inactivare cromosomal ce asigur funcionarea unui singur cromosom i inactivarea celorlali.
50
Tratat de Biotehnologie
51
Tratat de Biotehnologie
Orice aranjament nerandomizat al genelor duce la ipoteza c poziia genelor ar putea afecta funcionarea lor, deducndu-se astfel o organizare mai nalt dect operonul sau reglonul. La cele mai bine studiate specii de Pseudomonas (P.aeruginosa, P.putida) s-a constatat c genele cu funcii housekeeping (gene implicate n metabolismul central al oricrei celule, precum i n metabolismul anabolic) sunt grupate n jumtate din harta circular a cromosomului. n acelasi timp, genele implicate n metabolismul catabolic par s fie dispuse randomizat n cealalt jumatate a cromosomului bacterian. Acest mod de dispunere a genelor ar putea reflecta istoria construciei cromosomului din pri separate: genele pentru metabolismul esenial ar fi existat probabil n acel genom ancestral mai mic, care a fost ulterior mrit la actuala dimensiune prin fuziune cu un alt element genetic sau prin transfer de material genetic (transformare, conjugare, transducie). n general, s-a constatat c la foarte multe bacterii clusterii genici din jurul regiunilor oriC i ter sunt foarte similari ntre taxoni bacterienei foarte indeprtai filogenetic, fapt ce susine ipoteza c iniierea i terminarea replicrii cromosomului bacterian sunt procese extrem de vechi i sunt coordonate prin mecanisme similare la marea majoritate a bacteriilor.
52
Tratat de Biotehnologie
pe de o parte, rspndirea n populaiile de bacterii patogene a determinanilor de antibiorezisten, iar pe de alt parte, dezvoltarea unor mecanisme de antibiorezisten extrem de eficiente. n ceea ce privete originea genelor de antibiorezisten, au fost emise 2 ipoteze majore: a-genele de antibiorezisten existente n prezent n foarte multe bacterii patogene ar avea originea n gene similare prezente n bacteriile ce produc antibiotice (i care, de regul, sunt bacterii din sol); n aceast situaie se presupune c ar fi avut loc evenimente de transfer de gene pe orizontal ntre bacterii din sol i bacterii patogene; b-genele de antibiorezisten ar fi evoluat din gene house-keeping (de exemplu: proteinele ce efluxeaz tetraciclina ar putea s fi evoluat din proteinele de transport al nutrienilor). - gene de toleran la metale grele (ioni mercurici, derivati organomercurici, nichel, cobalt, plumb, cadmiu, bismut, antimoniu, zinc, argint) - gene de rezisten la ageni intercalani, radiaii UV, radiaii X, bacteriofagi, bacteriocine - gene ce codific factori de patogenitate i de virulen - gene ce codific bacteriocine - gene ce codific antibiotice - gene implicate n metabolismul opinelor (plasmidele Ti de la Agrobacterium) - gene ce codific capaciti metabolice deosebite, de exemplu folosirea unor substane xenobiotice ca surs unic de carbon i energie la specii de Pseudomonas - gene fixatoare de azot (genele nif de la Rhizobium i Bradirhizobium) - gene ce codific enzime proteolitice, amilolitice etc - gene ce codific transferul plasmidelor pe orizontal prin proces de conjugare bacteriana (regiunea tra) Deci, n afar de genele implicate n propria replicare, stabilitate i partiie, plasmidele mai pot purta i gene ce codific caractere - unele eseniale, altele neeseniale pentru bacteria gazd. Caracterele eseniale reprezint ci metabolice centrale ale celulei bacteriene, plasmidele purttoare fiind prezente la marea majoritate a izolatelor naturale ale unor tulpini bacteriene (de exemplu, unele plasmide mari de la Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium leguminosarum). Unele caractere neeseniale confer avantaje selective gazdelor purttoare, permind supravieuirea acestora n anumite condiii de mediu. n aceast categorie intr genele plasmidiale ce codific rezistena la antibiotice i tolerana la metale grele (asemenea gene sunt prezente la multe tulpini de bacterii patogene). n absena antibioticelor sau a metalelor grele ca factori de presiune selectiv, procesele de replicare, meninere i partiie a plasmidelor reprezint un efort metabolic suplimentar pentru celulele bacteriene. Ca urmare, n doar cteva pasaje, aceste plasmide sunt eliminate din populaia bacterian prin subreplicare. Ele se menin doar ntr-o proporie sczuta a populaiei bacteriene, fapt ce ar putea fi considerat o economie metabolic la nivelul ntregii populaii bacteriene. Exist ns i aa-numite plasmide criptice, care nu par s ofere gazdei nici un caracter avantajos. Interesant este faptul c, dei pot fi ncadrate n categoria selfish DNA (ADN egoist), totui i aceste plasmide sunt meninute ntr-o anumit proporie din populaiile bacteriene. n ansamblu, genomul bacterian se caracterizeaz printr-o intens circulatie pe orizontal a genelor, ntre diveri indivizi bacterieni (H.Tschape 1994). Aceast circulaie se desfaoar prin trei procese centrale - conjugare, transformare i transducie - dintre care, plasmidele sunt implicate n primele dou. Acest flux continuu de gene pare s fie o caracteristic definitorie a lumii bacteriene i s fi contribuit esenial la extrema versatilitate metabolic a bacteriilor n aproape toate mediile naturale.
53
Tratat de Biotehnologie
regul, genele implicate n autotransferabilitate sunt grupate ntr-un operon (denumit operon tra), iar elementul genetic purttor este denumit conjugon. Conform acestui criteriu exist 3 clase de plasmide : 1) plasmide conjugative sunt plasmidele care prezint ntreg operonul tra i sunt autotransferabile, putnd genera proces de conjugare bacterian; 2) plasmide non-conjugative sunt plasmidele ce nu prezinta operonul tra, nu sunt autotransferabile (nu pot genera conjugare bacterian) i nici mobilizabile; 3) plasmide mobilizabile sunt plasmidele ce nu prezinta operonul tra (i, ca atare, nu sunt autotransferabile), dar au gene mob care le permit mobilizarea n evenimente de conjugare iniiate de alte plasmide ce sunt conjugative. b) criteriul structurii moleculare. Marea majoritate a plasmidelor sunt formate din ADN dublu catenar. Mai mult dect att, din punct de vedere al structurii moleculare, exista dou clase de plasmide : 1) plasmide circulare. Plasmidele circulare sunt alctuite din ADN d.c. circular, iar forma in vivo pare sa fie CCC (circular covalently closed); foarte rar i temporar se ntlnete forma CO (circular open), n care una din cele dou catene nu este continu avnd o legtur fosfodierica lips. Tot in vivo se mai ntlnesc i concatemeri (oligo/multimeri). 2) plasmide lineare. Asemenea plasmide sunt alctuite din ADN d.c. linear (L). Au fost descrise dou tipuri de plasmide lineare : 1. Plasmide lineare cu telomere hairpin (telomere n ac-de-pr). Acestea sunt ntlnite cu precdere la plasmidele lineare de la Borrelia (Figura 3.3). Spirochetele din genul Borrelia au structur genomic linear: toate speciile de Borrelia examinate au un cromosom linear de 950-1000 kb i mai multe plasmide lineare cu dimensiuni cuprinse ntre 5 i 200 kb (unele au i plasmide CCC). Toate plasmidele lineare de la Borrelia descrise pn n prezent au telomere de tip hairpin. Telomerele hairpin se caracterizeaz prin palindroame terminale bogate n A/T, la capete existnd o continuitate n legatura de tip covalent ntre cele 2 catene. Asemenea structuri (ADN d.c. L cu telomere de tip hairpin) mai exist i la ADNmt de la reprezentanii genului Pichia, la poxvirusuri i la plasmidele lineare din mitocondriile de fungi. 2. Plasmide cu telomere invertroni Asemenea telomere sunt ntlnite la plasmidele lineare de la genul Streptomyces plasmide cu dimensiune cuprins ntre 9 i 600 kbp. Ca i cele hairpin, telomerele invertroni prezint i ele palindroame terminale bogate n A/T. Diferena const ns n faptul c nu exist legatura covalent ntre capetele celor 2 catene, i, ca urmare, capetele 5 i 3 sunt libere. La capul 5 al fiecrei catene este ataat covalent o molecul proteic denumit proteina TP (Telomeric Protein) (Figura 3.3). Asemenea structuri ADN, cu palindroame terminale bogate n A/T i cu proteina TP ataat covalent la capul 5 au fost definite de K.Sakaguchi (1990) ca fiind elemente genetice mobile cu replicare autonoma i denumite INVERTRONI, similare funcional cu transposonii. Telomerele invertroni sunt caracteristice repliconilor lineari de la eucariote, n mod special la plasmidele lineare din mitocondriile de fungi i plante i din citoplasma de fungi.
a)
Figura 3.4 Structura telomerelor hairpin la Borrelia (a) i invertroni la Streptomyces (b) (dupa H.Hinnebusch, 1992). palindroame terminale, bogate n A-T
b)
54
Tratat de Biotehnologie
c)
criteriul incompatibilitii plasmidiale De-a lungul anilor, conceptul de incompatibilitate plasmidial a ridicat foarte multe probleme. Actualmente, acest concept este definit ca fiind incapacitatea a dou sau mai multe plasmide de a se menine i propaga stabil n aceeai linie celular. Plasmidele din acelai grup de incompatibilitate ce conin origini de replicare similare (deci, au acelai replicon-type), nu sunt motenite stabil n descenden i segreg una de cealalt. Cel mai probabil acest proces se datoreaz unei competiii moleculare ntre plasmide cu acelai replicon-type pentru aceleai proteine implicate n replicarea respectivelor plasmide proteine codificate cromozomal. La Enterobacteriaceae au fost descrise peste 30 de grupuri de incompatibilitate plasmidial. Un tip de incompatibilitate s-ar baza pe competiia ntre secvenele repetate RS (la care se ataeaz proteina RepA), dintre diferite plasmide existente n celula bacterian. Bazndu-se pe tipul de replicon a fost imaginat o metod nou de identificare plasmidial folosind o colectie de sonde rep (Sykora P. 1992). Procesul de gene-flow n lumea bacterian ar putea avea un rol important n evoluia bacteriilor. Cu toate acestea, procesele de transfer de material genetic pe orizontal nu par s afecteze stabilitatea speciilor taxonomice bacteriene. Din acest punct de vedere, plasmidele se gsesc intr-o situaie total diferit: gene-flow-ul ntre plasmide nenrudite pare s fie att de ridicat i de rspndit, nct nu se poate alctui o identificare taxonomic a plasmidelor doar pe baza unei liste a caracterelor pe care le codific. Se pare c biologia plasmidelor nu implic mecanisme de izolare taxonomic asemntoare cu speciile de plante i animale. n contrast, n lumea plasmidelor se observ un fenomen total diferit: izolarea plasmidelor individuale sau foarte asemntoare. Acest fenomen este cunoscut ca fenomenul de incompatibilitate plasmidial.
Cromatina se prezint sub 2 stri: eucromatina cromatin decondensat n interfaz i condesat n timpul diviziunii celulare se replic la nceputul fazei S a interfazei heterocromatina condensat permanent i se replic la sfritul fazei S. 55
Tratat de Biotehnologie
Heterocromatina se clasific n: - heterocromatin constitutiv este caracteristic zonelor centromerice i telomerice - heterocromatin facultativ - este caracteristic unuia din cromozomii X la femelele de mamifer i constituie cromatina sexual; apare datorit necesitii compensaiei de doz a genelor eseniale prezente pe cromozomul X - heterocromatin de citodifereniere apare prin inactivarea selectiv a unor gene n timpul proceselor de citodifereniere Eucromatina este caracteristic genelor active transcripional, n timp ce heterocromatina are rol preponderent reglator i structural.
Figura 3.5 Organizarea genelor pentru histone la D.melanogaster. regiuni reglatoare ale genelor (situsuri hipersensibile la nucleaz)
56
Tratat de Biotehnologie
n organizarea materialului genetic nuclear la organisme eucariote intervin i proteine nonhistonice. Acestea se submpart n mai multe clase: enzime ale metabolismului ADN: ADN polimeraze, ADN ligaze, ADN topoizomeraze, terminal-ADN-nucleotidil-transferaze enzime ale metabolismului ARN: ARN polimeraze, poliA polimeraze, enzime de splicing, RNaze enzime ce modific histonele: protein-kinaze, metilaze, acetilaze, esteraze, proteaze proteine structurale: proteinele fusului de diviziune, proteinele matricei nucleare, proteinele scaffold, proteinele particulelor RNP (RiboNucleoProtein) proteinele HMG (High Mobility Group) ce intervin n modificarea structurii cromatinei n vederea funcionrii genelor n replicare i transcriere: o HMG 1 i HMG 2 proteine omoloage cu g.m. 29 kd; o HMG 14 i HMG 17 - proteine omoloage cu g.m. 10-12 kd Proteinele HMG nlocuiesc histona H1 determinnd, alturi de topoizomeraze, relaxarea helixului ADN n iniierea transcrierii genelor.
57