TRANSFERUL GENETIC LA

BACTERII
• Bacteriile schimbă materialul genetic prin mecanisme diferite, toate implicând un anumit tip
de transfer de ADN și recombinare între ADN transferat și cromozomul bacterian.
 Transferul de material genetic la bacterii se realizeaza prin intermediul a trei procese:
 Conjugarea;
 Transformarea și
 Transducția.
• Toate cele trei procese necesită ca ADN transferat să fie supus unei recombinări cu
cromozomul bacterian pentru ca acesta să fie moștenit în mod stabil.
• Fiecare tip de transfer genetic poate fi folosit pentru a realizarea hartilor genetice la
bacterii.
• Indiferent de natura sa, transferul de gene reprezintă un fenomen în care moeculele
informaţionale îşi schimbă gazda, având de traversat două bariere celulare:
 una la ieşire din celula donatoare şi
 alta la intrarea în celula receptoare.
 CONJUGAREA BACTERIANĂ

• Conjugarea reprezinta transferul unidirecţional de material genetic de la o bacterie la alta prin

intermediul unei legături intercelulare directe (pil de sex) şi condiţonat de prezenţa în bacteria
donatoare a unui element genetic specializat numit conjugon.

• La majoritatea bacteriilor, conjugarea depinde de un factor de fertilitate (plasmida F) care este

prezent în celula donor și absent în celula receptor.

• Celulele care conțin factorul F sunt denumite F+, iar celulele care nu au F sunt notate F-.

• Fenomenul conjugării a fost descoperit în 1946 (de către Lederberg şi Tatum) în urma
experimentelor cu tulpini de Escherichia coli ce conţineau sau nu o plasmidă specifică notată F.

• În cazul bacteriilor Gram negative, în afară de plasmida F, funcţiile necesare procesului de

conjugare se găsesc la nivelul mai multor plasmide. De exemplu:

 plasmidele de rezistenţă la antibiotice (plasmida RP4) şi plasmidele Col ce conţin determinanţi

genetici pentru sinteza colicinelor.
 Caracteristicile plasmidei F
• Plasmida F este alcătuita din ADN dublu catenar circular cu o
lungime de de aproximativ 100 kb şi în număr de 1-2 copii/celulă.
La nivelul ei se gasesc:
 Originea replicarii (oriV) si
 Originea procesului de transfer (oriT)
• In absenta procesului de transfer din zona oriV, replicarea
plasmidei F se face bidirectional
• Zona oriT este bogata in A-T si reprezinta zona de recunoastere
pentru o enzima (tip endonucleaza), care cresteaza una dintre
catenele ADN.
IS2 si IS3 – secvente de insertie;
• Transferul prin conjugare al acestor plasmide se datorează Tn – transpozon;
oriV- originea replicarii;
prezenţei unei regiuni specifice, regiunea tra, ce reprezintă cca 30
oriT – originea transferului; regiunea
% din lungimea plasmidei F. tra – regiunea de transfer
• Regiunea tra include:
 gena pentru pilina și genele de reglare, care
împreună formează pili pe suprafața celulară, si
 genele pentru proteine care se atașează la suprafața
bacteriilor F- și inițiază conjugarea.

Cu excepţia fectorului F, celelalte plasmide conjugative

pot include şi alte tipuri de gene:

• pentru rezistenţa la antibiotice,

• toleranţă la metale grele,

• virulenţă patogenitate etc.

• Tipurile de factori F de la E. coli, rolul lor in conjugare si tipurile de conjugare realizate de factorii F
sunt redate in tabelele de mai jos:
 Conjugarea F+ x F-

• Reprezintă un mod de transfer unidirecţional de ADN de la o celulă donatoare (F+) la o celulă

receptoare (F-) prin intermediul unei legături intercelulare directe (pil de sex).

Etape:

• Formarea şi stabilirea agregatelor de conjugare;

• Pregătirea ADN pentru transfer;

• Transferul ADN conjugativ;

• Refacerea structurii circulare şi dublu catenare a ADN transferat.

I n prima etapă :

• are loc sinteza de către celula donatoare a pililor de sex – structuri specializate, tubulare,
localizate la suprafaţa celulară, alcătuite din molecule de pilină (proteină a cărei sinteză este
codificată de gene plasmidiale).
A 2-a etapă a conjugării presupune:

 Intervenţia unei enzime, codificată de genele

plasmidiale, care are rolul de a realiza o
crestătură monocatenară la nivelul genei oriT
(originea transferului).

 La nivelul capătului 5’ al catenei de ADN

crestată, se leagă o proteină specifică (codificată
tot de gene plasmidiale de la nivelul regiunii tra).

 Are loc apoi, transferul catenei crestate,

începând cu capătul 5’ , transferul fiind cuplat
cu procesul de replicare al plasmidei, conform
modelului cercului rotativ.
• In acelaşi timp, în celula donatoare are loc
restabilirea structurii dublu catenare a
factorului F.
• Integrarea factorului F în cromosomul bacterian nu se
• Astfel, la nivelul populaţiei de bacterii, realizează la întâmplare , ci la nivelul unor situsuri ce
consecinţa transferului factorului F este prezintă omologie între cele două tipuri de molecule.
masculinizarea acesteia.
 Conjugarea Hfr x F -
• In unele cazuri foarte rare, factorul F se poate integra în cromozomul
bacterian.

• In acest caz, celulele care poartă factorul F integrat în cromozomul

bacterian se numesc celule Hfr (high frequency of recombination =
frecvenţă înaltă de recombinare).

• În aceasta stare integrată, factorul F îşi pierde capacitatea de a se replica

autonom şi se supune controlului cromozomului circular bacterian.

• După crestarea monocatenară la nivelul secvenţei oriT, incepe transferul

ADN monocatenar, alcatuit dintr-o scurtă secvenţă din plasmida F şi o
secvenţă din ADN cromozomal al gazdei.

• Replicarea are loc tot după modelul inelului rotativ numai că, de aceasta
dată în prelungirea monocatenei factorului F angajată cu capătul 5’ în
deplasarea prin tubul de conjugare se află, legată covalent, şi un
fragment din cromozomul bacterian principal.

• Pe măsură ce are loc pătrunderea în celula receptoare F-, monocatena

este copiată în direcţia 5’→ 3’, rezultând o structură bicatenară (Fig. 2).
• Celulele Hfr, spre deosebire de celulele F+, au astfel capacitatea de a transfera şi material genetic din
cromozomul bacterian, astfel că ele condiţionează realizarea recombinării genetice.

• Cantitatea de informaţie genetică transferată, proprie celulei donatoare, este direct proporţională cu timpul
în care cele două celule au stat în contact: cu cât contactul este mai lung, cu atât segmentul de ADN
transferat va fi mai mare.

 Astfel, la E. coli, pentru transferul complet al ADN cromozomal sunt necesare aproximativ 90 - 120 minute
de contact între celule,

 în timp ce transferul plasmidei F din bacteria F+ într-o bacterie F – durează 2 - 3 min.

• Procesul de conjugare dintre celulele Hfr şi celulele de tip F – serveşte la realizarea hărţilor cromosomale
la bacterii , distanţa dintre gene (dispuse în ordine pe segmentul transferat) exprimându-se în unităţi de timp
(minute).

• Procesul de transfer de segmente cromozomale din bacteria donor Hfr în cea acceptoare F – este urmat de
cele mai multe ori de transformare genetică (fenomen controlat de o serie de enzime sintetizate de gazdă) astfel
ca, porţiuni din respectivul segment se integrează în genomul noii gazde fiind menţinut şi transmis constant
în generaţiile următoare.
 Conjugarea F′ x F – (sexducţia)

 In cazul bacteriilor Hfr, plasmidele F rămân în mod normal integrate, astfel încât diviziunile celulare
succesive produc clone Hfr.
 In anumite situaţii, tulpinile Hfr au tendinţa de a redeveni F+, prin reversia plasmidei F de la starea
integrată la starea autonomă în citoplasmă.
 Excizia plasmidei F poate fi corectă sau eronată, în ultimul caz având loc un schimb de material
genetic între plasmida F şi cromosomul gazdei, prin care plasmida incorporează una sau mai
multe gene cromozomale.
 Ca urmare, se formează o plasmidă F modificată, denumită F′ (F prim) care, în cursul procesului de
conjugare, este capabilă de a transmite genele cromozomale integrate unei alte bacterii
acceptoare.
 Transferul de gene cromozomale bacteriene mediat de plasmidele de sex este numit SEXDUCŢIE.
In urma conjugării F’x F- se obţin doar celule de tip F’ care sunt parţial “diploide” (merozigoţi) -
celule conţinând alături de genele proprii şi gene similare provenite de la bacteria donoare.
 Conjugarea F′ x F
-

Ocazional, factorul F integrat poate părăsi cromozomul

gazda și reveni in citoplasmă.
În cazuri rare, factorul F poate încorpora gene gazdă
devenind F '.
F 'poate transfera aceste gene altor celule, cu o eficiență
ridicată, deoarece ele fac parte din genomul F' .
 TRANSFORMAREA GENETICĂ

• Fenomenul de transformare genetică a fost evidenţiat prima dată în 1928 de către Griffith, în
urma experimentelor realizate cu pneumococii Pneumococcus pneumoniae (cunoscut in prezent
Streptococcus pneumoniae) asupra şoarecilor, iar apoi la Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Haemophilus influenzae, Staphylococcus sp., etc.
• Ulterior, în 1944, Avery, Mac Leod şi McCarthy, au descoperit că agentul transformant este
reprezentat de ADN izolat din celulele bacteriene.

• Transformarea genetică la bacterii presupune absorbția ADN din mediul înconjurător și

încorporarea acestuia în cromozomul bacterian sau într-o plasmidă.

• Se poate întâmpla în mod natural atunci când bacteriile moarte se descompun și eliberează
fragmente de ADN în mediu.

• Informaţia genetică nou integrată în cromozomul bacteriei receptoare este transmisă stabil de-a
lungul generaţiilor bacteriene.
• Pentru a putea prelua ADN exogen din mediul extracelular, celulele receptoare trebuie să
manifeste o anumită stare specifică numită stare de competenţă.

• Starea de competenţă presupune ca peretele celular şi membrana celulară ale celulei

bacteriene receptoare să fie permeabile pentru ADN exogen, iar celula să se afle într-o
anumită fază a ciclului de viaţă care să permită acceptarea acestuia.

• Competența este influențată de stadiul de creștere, de concentrația ADN exogen disponibil și

de compoziția mediului de cultura.

• La unele specii bacteriene, starea de competenţă este o stare naturală, fiziologică, apărând într-o anumită
etapă a ciclului de viaţă şi durează un anumit interval de timp. De exemplu, la Azotobacter, Staphylococcus,
Pneumococcus competenţa este maximă pe parcursul fazei logaritmice, în timp ce la alte specii, precum:
Bacillus, Pseudomonas, Methylobacterium- competenţa este maximă la trecerea de la faza logaritmică la
cea staţionară.

• În cazul altor specii, starea de competenţă poate fi indusă prin tratamente specifice (şoc de temperatură,
adăugarea unor ioni etc.).
 Într-o populaţie bacteriană, proporţia celulelor capabile de a prelua ADN exogen poate fi
estimată pe baza frecvenţei de transformare, urmărind un anumit marker genetic.

 Pentru a se obţine o frecvenţă ridicată de integrare/ transformare, este necesar ca ADN

transformant să provină de la o tulpină bacteriană înrudită (ADN omolog).

 În cazul utilizării unor organisme neînrudite (ADN heterolog), eficienţa procesului de

transformare este foarte scăzută.

 Multe bacterii se pot liza în mod natural, mai ales în timpul etapelor finale ale ciclului celular.

• În aceste condiţii, ADN este eliberat în mediu extracelular de unde poate fi preluat de alte
bacterii aflate în aceeaşi populaţie.

 In acest caz, procesul natural de transformare genetică (cu fragmente de ADN cromozomal
eliberat prin metoda lizei celulelor bacteriene) se realizează în mai multe etape:
 Preluarea ADN exogen de către celulele
competente;

 Legarea reversibilă (adsorbţia) a moleculelor de

ADN dublu catenar, la nivelul situsurilor receptoare
aflate pe suprafaţa celulară;

 Convertirea ADN dublu catenar la forma

monocatenară, prin degradarea uneia dintre
catenele moleculei iniţiale;

 Integrarea segmentului de ADN monocatenar în

cromozomul celulei receptoare;

 Segregarea şi exprimarea fenotipică a noii

a) Preluarea ADN exogen de la bacteria moarta; adsorbtia ADN dublu catenar,
informaţii genetice integrate în genomul celulei la nivelul situsurilor receptoare aflate pe suprafaţa celulară; degradarea
uneia dintre catenele moleculei iniţiale de catre enzime specifice;
gazdă. Integrarea segmentului de ADN monocatenar în cromozomul celulei
receptoare.
b) Odată ajuns în interiorul celulei, ADN este încorporat în cromozomul
bacterian prin recombinare.
• Procesul de transformare este destul de răspândit în natură, mai ales în cazul tulpinilor
bacteriene înrudite, el jucând un rol important în evoluţia bacteriilor.

• Această concluzie este întărită şi de observaţia că transferul de gene prin transformare genetică
are loc nu numai pe orizontală (între bacterii înrudite) ci şi între grupe de organisme neînrudite
(fenomen ce explică, de exemplu, răspandirea rezistenţei la antibiotice).

 Transferul orizontal de gene numit si transfer lateral de gene este procesul prin care un
organism incorporeaza material genetic de la un alt organism fara a fi un descendent al acestuia.

 In transferul vertical de gene, un organism primeste material genetic de la un stramos (parinte,

genitor, sau o specie din care a evoluat).

In general in genetica s-a studiat mai mult transferul vertical de gene, dar acum se stie ca
transferul orizontal de gene este un fenomen semnificativ.
 Transferul artificial de gene este folosit in ingineria genetica.

• Transformarea, ca și conjugarea, este folosită pentru a realizarea hartilor genetice la bacterii, în

special la acele specii care nu pot realiza conjugarea sau transducția.
 TRANSDUCŢIA FAGICĂ
• Transducţia fagică este procesul prin care un fragment din cromozomul bacterian este
transferat de la o bacterie la alta prin intermediul capsidei (învelişului proteic) anumitor
bacteriofagi temperaţi (fagi lizogeni, integrati in cromozomul gazdei).

• Fenomenul a fost descris iniţial la bacteriofagi specifici unor tulpini de Salmonella

typhimurium, iar ulterior el a fost mai bine studiat în cazul fagului λ (lamba) specific
tulpinilor de Escherichia coli.

• In funcţie de structura genetică a fagilor transductori şi de mecanismul de formare a

materialului genetic al particulelor fagice, au fost descrise două tipuri de transducţie fagică:

1. transducţie generalizată şi

2. transducţie specializată.

• În transducția generalizată, orice genă poate fi transferată.

• În transducția specializată, sunt transferate doar câteva gene.

 Transducția generalizată

• În ciclul litic al reproducerii fagului, cromozomul

bacterian este fragmentat în segmente aleatorii.
• Pentru unele tipuri de bacteriofagi, în loc de ADN-ul
fagului, un segment din cromozomul bacterian devine
ocazional ambalat într-o capsida fagica; aceste
particule de fag se numesc fagi transductori.
• Fagul de transfecție infectează o nouă celulă
bacteriana eliberând astfel ADN bacterian, iar genele
introduse pot deveni integrate în cromozomul
bacterian printr-un crosing-over dublu.
• Prin acest proces, genele bacteriene pot fi
transferate, de la o tulpină bacteriană la alta,
producând bacterii recombinante numite
transductanți.
 Transducția specializată
• Ca si transducția generalizată, prin transducție specializată are loc transferul de gene de la o bacterie la
alta prin intermediul fagilor, dar in acest caz sunt transferate numai gene din apropierea unor locuri
particulare ale cromozomului bacterian.

• Transducția specializată are loc la sfârșitul ciclului lizogen, când profagul este excizat din cromozomul
bacterian și bacteriofagul intră în ciclul litic.

• În timpul procesului de excizie din cromozomul gazdă, un fag poate îndepărta ocazional unele segmente de
ADN bacterian din apropierea situsului de integrare virală.

• ADN fagic și cel al gazdei, de la un capăt sau de la ambele capete ale situsului de integrare, sunt ambalate
în capsidă și transferate la noua gazdă infectată.

• Deoarece ADN transferat de către fag nu este ambalat în mod aleatoriu, ci este o secventă specifică de ADN
din apropierea locului de integrare a fagului, acest mecanism de transfer de gene este denumit transducție
specializată.
• În cazul fagilor ce determină transducţia specializată, ei produc particule ce conţin atât gene
fagice (majoritare) cât şi gene cromosomale bacteriene provenite dintr-o anumită regiune a
cromozomului bacterian.

• Cel mai cunoscut bacteriofag ce realizează transducţie specializată este fagul λ.

• În forma lui naturală, fagul λ poate prelua, ca fag transductor, doar scurte secvenţe de ADN
din genomul gazdei în care s-a multiplicat (după ce a parcurs ciclul lizogen), dimensiunea
acestora fiind limitată de capsida fagică.
 Diferența dintre transducția
generalizată, care este
procesul de transfer a oricărei
gene bacteriene la o alta
bacterie, printr-un bacteriofag
și o transducție specializată,
care este procesul de transfer a
anumitor gene bacteriene intr-o
alta bacterie.
 În timp ce transducția
generalizată poate să apară
aleatoriu și mai ușor,
transducția specializată
depinde de localizarea genelor
pe cromozom și de excizia
incorectă a unui profag.
 Mecanismele moleculare ale recombinării genetice

• Recombinările genetice se încadrează în cel puțin trei clase generale:

1. Recombinarea genetică omologă (denumită și recombinare generală) implică schimburi genetice

între două molecule de ADN (sau segmente ale aceleiași molecule) care au o regiune extinsă de
secvență aproape identică.

2. Recombinarea la situs specific. În acest caz, schimburile apar doar la o anumită secvență de ADN.

3. Recombinarea «nelegitimă» (neomoloaga). Este procesul prin care se unesc două segmente dublu
catenare de ADN neinrudite.

Există în plus o gamă largă de rearanjări genetice neobișnuite pentru care nu a fost încă propus niciun
mecanism sau scop, cum ar fi:
 Modelul "rupere-reunire”
 Modelul copierii alternative
 Modelul "rupere şi copiere“
1. Recombinarea genetică generală sau recombinarea omologă

 Reprezintă schimbul unor fragmente de ADN cu un grad înalt de omologie;

 Se manifestă atunci când gradul de omologie genetică între moleculele
parentale ce interacţionează este mare, prin omologie înţelegându-se identitate
de secvenţe nucleotidice.
 La eucariote, acest tip de recombinare are loc în cursul meiozei, implicând
participarea a doi cromozomi omologi,
 La procariote (la E.coli, de exemplu) fenomenul depinde de factori celulari
specifici (proteine de legare a ADN monocatenar, topoizomeraze, etc).
 Recombinarea genetică generală:
(1) contribuie la repararea mai multor tipuri de leziuni ADN;
(2) asigură, în celulele eucariote, segregarea ordonată a cromozomilor la prima
diviziune celulară meiotică; și
(3) sporește diversitatea genetică într-o populație.
2. Recombinarea la situs specific
Recombinarea la situs specific (numită şi specifică sau specială, localizată, integrativă,, aditivă etc):

 Se poate produce între molecule de ADN cu un grad mic sau chiar absent de omologie.

 Acest tip de recombinare se realizează la nivelul unor situsuri particulare, localizate pe una
sau pe amândouă dintre catenele parentale.

 In derularea procesului respectiv sunt implicate enzime care recunosc în mod specific aceste
secvenţe.

 Au fost descrise două variante ale recombinării la situs specific:

• la situs specific dublu şi

• la situs specific unic.

Acest tip de recombinare este utilizată atât de eucariote, cât și de procariote pentru a regla
expresia genelor și pentru a crește gama genetică a organismelor.
 3. Recombinarea «nelegitimă» (neomoloagă)

• Este procesul prin care se unesc două segmente dublu catenare de ADN neinrudite (cum ar fi, de
exemplu, formarea fagului transductor specializat prin excizie eronată).

• Recombinarea ilegitimă este un proces natural care a fost întâi descoperit ca fiind prezent la E. coli.

• Prin acest mecanism secvențe genetice scurte sunt introduse în alte locații din genomul bacterian
fapt ce conduce adesea la o schimbare a expresiei gene învecinate.

• La procariote, recombinarea ilegitimă are ca rezultat o mutație a secvenței genetice.

• La eucariote, acest mecanism tinde să ducă la ruperea genelor cauzând o exprimare

necorespunzatoare a proteinei pe care o codifică.

• Una dintre căile primare prin care acest lucru se va întâmpla este mecanismul de reparare cunoscut sub
numele de îmbinare finală neomoloagă prin care două secvente de ADN neomoloage vor fi unite
prin mecanismele de reparare a genei .
• Acest proces este comun pentru celulele eucariote și tinde să acționeze ca un mecanism de
reparare, dar poate duce la mutații dacă se produce recombinarea ilegitimă.

• Intr-un organism eucariot recombinarea ilegitimă va lua adesea forma unor aberații
cromozomiale mari, deoarece segmentele de ADN sunt mult mai mari decât cele din celulele
procariote.

• Modelul "rupere-reunire", derivat din studiile genetice efectuate pe bacteriofagi, presupune ca prim
eveniment al recombinării, ruperea celor două genomuri parentale la nivele similare pe ambele molecule
de ADN.
• Fragmentele rezultate se reunesc apoi încrucişat, prin crossing-over, formând genomuri recombinate.
• Recombinarea determină formarea de molecule ce provin, integral, din moleculele de ADN parentale.
• În acest fel informaţia genetică este transferată între cele două genomuri parentale.
• Modelul copierii alternative consideră că nu ar exista un schimb de ADN între genomul donatorului şi
cel al receptorului iar sinteza moleculei de ADN recombinat are loc în cursul replicării prin folosirea
alternativă, ca matriţă, a unei catene de ADN de la donator şi a alteia de la receptor.
• Ca urmare, în una dintre catenele de ADN nou sintetizat o secvenţă de nucleotide a avut ca model
secvenţa omologă din ADN exogen si nu cea corespunzatoare.
• În conformitate cu această ipoteză, cromozomii recombinaţi sunt integral sintetizaţi "de novo" şi nu rezultaţi
prin reunirea încrucişată a unor fragmente din cromozomii parentali preexistenţi.

• Modelul "rupere şi copiere" preconizează formarea cromozomilor recombinaţi prin secţionarea fizică a
unui genom parental şi copierea celuilalt.
• Prin acest mecanism, în cazul existenţei a doi cromozomi parentali, se poate forma un cromozom
recombinat prin legarea unor fragmente vechi cu fragmente nou sintetizate ce au fost copiate după
celălalt cromozom parental.