Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

INTRODUCERE
Omul a utilizat dintotdeauna plante pentru vindecare i aproape imediat ce a nvat s scrie, el a consemnat descrieri ale proprietilor curative ale acestora n tratate despre plante. Primul tratat despre plante cunoscut a fost scris n urm cu aproape 5000 de ani, se numea Pen Tsao i coninea descrieri ale utilizrilor medicinale a peste 300 de plante. Prin 2000 .Hr., egiptenii antici utilizau plante n medicin, n cosmetic i n mblsmare. Grecii i romanii au perfecionat cteva dintre aceste tehnici i au dezvoltat altele noi, proprii. S-a aflat despre studiile lor din scrierile lui Hipocrat din secolul al V-lea .Hr. i din crile De Materia Medica a lui Dioscoride i Naturalis Historia a lui Pliniu cel Btrn (ambele din secolul I d.Hr.). n Europa de vest existau dou tradiii de fitoterapie. Una era de natur superstiioas: unele plante fceau parte din leacurile populare deoarece se credea c seamn cu anumite pri ale corpului uman. De exemplu, iarba plmnului are frunze n form de plmni i astfel era folosit pentru tratarea tusei; aceast metod de fitoterapie este cunoscut ca doctrina semnturilor. Cealalt tradiie naturist se baza pe experimente tiinifice care la nceput au fost efectuate de clugri n grdinile mnstirilor. n secolul XIII, Londra a devenit un centru comercial important pentru plante i condimente; plante medicinale originale i cvasi-originale se gseau de vnzare peste tot. Plantele cu proprieti medicinale, luate individual, erau numite simple; combinaiile de dou sau mai multe plante erau numite medicamente. n secolele XVI i XVII, popularitatea fitoterapiei a dus la nfiinarea primelor grdini botanice dedicate n principal speciilor de plante medicinale, unde se efectuau cercetrile i nvau studenii. Prima a fost nfiinat n Pisa n 1543 i a fost urmat de una din Padova, n 1545. Dup aceea, rspndirea lor a fost constant la Leiden n 1587, Copenhaga n 1600, Londra 1606, Paris 1635, Berlin 1679, Tokyo 1684 i Calcutta n 1787. Multe progrese mari au fost fcute n cea de-a doua jumtate a secolului al XVIII-lea, prin activitatea a doi mari oameni de tiin suedezi, botanistul Carl Linnaeus (1707-1778) i chimistul Carl Wilhelm Scheele (1742-1786). n 1753, Linnaeus a introdus un nou sistem de nomenclatur pentru plante: aceasta a ajutat la identificarea cu exactitate a plantelor i a deschis calea spre compilaia din Farmacopei, cri oficiale care enumer medicamentele i
6

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) descriu modul lor de preparare. Scheele a izolat din plante muli acizi organici, care de atunci sunt utilizai n medicina convenional. Plantele sunt surse importante de compui farmaceutici, aromatici i industriali, omenirea fiind indisolubil legat de lumea vegetal, aceasta constituind de milenii sursa major de obinere a unor bioproduse eseniale pentru supravieuirea ntregului regn animal. n prezent zestrea botanic a planetei stocheaz numeroase resurse nc insuficient cunoscute. Statisticile evideniaz faptul c peste 1500 de compui noi sunt identificai anual n diferite specii de plante i c un sfert dintre medicamentele prescrise conin substane de origine vegetal. Lucrarea de fa, intitulat Caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutic a unor specii din genul Plantago structurat n dou pri, urmrete din punct de vedere teoretic i practic, caracterizarea botanic, studiul calitativ i cantitativ al unor compui bioactivi prezeni n plante aparinnd genului Plantago, Fam Plantaginaceae, precum i aplicaiile farmaceutice ale acestora. O gam larg de activiti biologice au fost atribuite extractelor sau compuilor izolai din aceste plante, cum ar fi activitatea cicatrizant, antimicrobian, antileukimic. Din punct de vedere botanic, s-a urmrit examinarea macroscopic i microscopic n vederea stabilirii identitii speciilor pentru plantele studiate. Din punct de vedere fitochimic, s-a realizat identificarea calitativ prin reacii de culoare a principalelor grupe de compui bioactivi din plantele Plantago: carotenoide, clorofile, iridoide, flavonoide, mucilagii, polizaharide, steroli i grsimi, precum i dozarea prin metode spectrofotometrice sau volumetrice a unor pigmeni, polifenoli, flavonoide i vitamine prezeni n plantele studiate. Ca aplicaie farmaceutic a plantelor studiate s-a ales prepararea unui sirop pe baz de extract de ptlagin, form farmaceutic recunoscut pentru utilizarea terapeutic a acestei plante. Rezultatele obinute arat bogia acestor plante n compui bioactivi i susin efectele terapeutice demonstrate pentru plantele din speciile Plantago. antiinflamatoare, antiastmatic, antitusiv, imunomodulatoare i

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

CAPITOLUL 1 CONSIDERAII BOTANICE PRIVIND GENUL PLANTAGO

Familia Plantaginaceae grupeaz plante erbacee sau arbustive, cu frunze dispuse de obicei n rozet bazal, uneori fiind opuse sau alterne, nestipelate, iar florile actinomorfe, de regul hermafrodite, bracteate, dispuse de obicei n spice. Sepalele sunt concrescute la baz, persistente, corola gamopetal, scarioas iar filamentele staminelor sunt lungi cu anterele evidente. Ovarul este superior, 1-4 locular, cu unul sau numeroase ovule axilare sau bazale. Fructele sunt capsule circumscrise sau indehiscente.

Genul Plantago este un gen format din aproximativ 200 de specii de plante mici, printre care: - Plantago lanceolata; - Plantago media; - Plantago major; - Plantago alpina; - Plantago arenaria; - Plantago argentea; - Plantago cordata; - Plantago coronopus; - Plantago cornuti; - Plantago gentianoides; - Plantago maritima; - Plantago maxima; - Plantago palmata; - Plantago tenuiflora.

Plantaginis folium reprezint amestec de frunze care se recolteaz de la trei specii de Plantago: Plantago major, Plantago media i Plantago lanceolata din familia Plantaginaceae, denumit popular i nedifereniat ptlagin. Speciile de ptlagin sunt rspndite n Europa i Asia. Principalii furnizori ai produselor vegetale sunt rile fostei Uniuni Sovietice, rile fostei Iugoslavii, Bulgaria, Romnia, Polonia, Ungaria, Olanda, Germania.

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

1.1. ncadrare sistematic

Regn:

Plantae

Magnoliophyta ncrengtura:

Clasa:

Magnoliopsida

Ordinul:

Lamiales

Familia:

Plantaginaceae

Plantago L. Gen:

Specie:

P. media P. major

P. lanceolata

Figura 1 ncadrarea sistematic a speciilor Plantago major, Plantago lanceolata i Plantago media

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

1.2. Descrierea speciilor

1.2.1. Plantago media L. (Ptlagin moale)
Plant erbacee, peren, xeromezofil spre mezofil, amfitolerant la temperatur, slab acid-neutrofil spre neutro-bazifil, comun n toat ara, prin pajiti uscate, locuri ierboase, culturi de trifoi, marginea drumurilor, locuri ruderale,de la cmpie pn la munte. Se mai numete: iarba de cale, limba-mnzului, limba-oii, minciun, patlanjer. Dacii o numeau patlajer i o foloseau n afeciuni pulmonare, rni, bube, umflturi, furuncule. Rizomul este pivotant din care pornesc numeroase rdcini. Frunzele sunt ovale sau eliptice, surii dispers-proase, cu nervuri laterale puin arcuite i reunite la vrf, dispuse n rozet, cu o lungime de 10-12 cm i o lime de 3-4 cm. Tulpina este scap florifer lung de 2050 cm, spre vrf alipit pros. Flori sunt albe, gamopetale, cu filamentele staminelor lungi, violete, grupate ntr-un spic cilindric, lung de 2-8 cm. Fructul este o capsul de 3-4mm, semine negre, slab-zgrbunoase.

Figura 2 Plantago media Sursa: http://en.wikipedia.org

Vegeteaz pe orice tip de sol, uscat i reavn-jilave, fr ap stagnant, n afar de solurile grele. Suport temperaturile excesive din var i iarn.

10

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Frunzele (Plantaginis folium) se recolteaz nainte de nflorire sau n timpul nfloririi, din mai pn n octombrie, pe timp uscat, dup ce se ridic roua. Tierea frunzelor se face la nivelul solului. Se usuc la umbr, n locuri bine aerate, n strat subire. Uscarea artificial se face la 40-50 C.

1.2.2. Plantago lanceolata L. (Ptlagina ngust)

Este o plant erbacee, peren, spontan i cultivat, hemicriptofit, amfitolerant la umiditate, temperatur i pH, comun n toat ara, prin pajiti aride, puni, fnee, la marginea drumurilor, de la cmpie pn n zona montan. Se mai numete: cruele, coada oricelului de cru, iarba-tieturii, limba-blilor, limba-broatei, limba-oii, limba-arpelui, limbari, minciun, protagin. Dacii o numeau spioox-spioac (I. Pachia Tatomirescu, 1997) i o foloseau pentru combaterea tusei, a rcelilor, a bolilor de piept, a ofticii (tuberculozei) i durerilor de stomac, iar extern contra rnilor i tieturilor pe care se aplicau frunze pentru a opri sngerarea i a grbi vindecarea. Se mai folosea contra furunculelor. Rizomul este gros i scurt din care pornesc numeroase rdcini fasciculate. Tulpina este scapiform, florifer, erect, nefoliat, nalt de 5-50 cm. Frunze sunt lanceolate pn la liniar lanceolate, uor ngustate n peiol, cu trei - apte nervuri, mai mult sau mai puin proase sau glabrescente, cu o lungime de 30 cm i o lime de 2-3 cm. Florile sunt foarte mici, tipul 4, glbui-brune, grupate ntr-un spic ovoidal sau scurt-cilindric, gros de 5-8mm; caliciul cu sepale ovate, bicarenate, puin proase pe marginea superioar i caren; corol gamopetal, actinomorf; androceu cu 4 filamente staminale albicioase, lungi i antere glbui; gineceu cu stigmat filiform. Fructul este o capsul ovoidal. Seminele sunt negricioase, mici, lungi de 2 mm. Vegeteaz bine pe orice tip de sol, n afar de solurile grele. Prefer solurile cernoziomice i pe cele de lunc. Nu are pretenii deosebite fa de lumin; suport semiumbra.

11

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

Figura 3 Plantago lanceolata Sursa: http://en.wikipedia.org

Frunzele (Plantaginis folium) sau frunzele cu scapul florilor (Plantaginis herba) se recolteaz n timpul nfloririi deoarece atunci au un coninut maxim de aucubin (2,80-3,20 %). Recoltarea se face numai pe timp uscat, dup ce s-a ridicat roua. Frunzele mpreun cu scapul florilor se taie de la suprafaa pmntului. Se usuc la umbr n strat subire, n camere bine aerate. Uscarea artificial se face la 40-50C. Frunzele de ptlagin ngust se folosesc i n stare proaspt.

1.2.3. Plantago major L. (Ptlagina lat)

Plant erbacee, peren, hemicriptofit, mezofil, amfitolerant la temperatur i pH, comun n toat ara, ntlnit la marginea drumurilor, locuri cultivate i necultivate, puni umede, fnee, locuri bttorite, nisipoase, de la cmpie pn la zona subalpin. Se mai numete: batlagin, iarb de cale, iarba-bubei, iarb gras de grdin, iarbmare, limba-boului, limba-oii, mama ploaie, mama-pdurii, minciun, palagin. Dacii o numeau scinpocul, schinpocul, ptlagina lat, ptlagina mare. Rspndire pe tot globul.

12

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Rizomul este scurt, gros, din care pornesc rdcini fasciculate. Tulpina este scapiform, cilindric, neted, nalt de 10-40 cm. Frunze sunt lat-ovalate, glabre, cu 3-7 nervuri, brusc-atenuate n peiol, dispuse n rozet, cu o lungime de 20-25 cm i o lime de 810 cm. Florile galbene-albicioase sunt grupate ntr-un spic cilindric lung; caliciul cu sepale lat-eliptice, verzi, cu marginea alb-membranoas; corol gamopetal, actinomorf, cu lacinii nguste; androceu cu 2 filamente staminale ieite mult afar din corol i terminate cu cte o anter, la nceput palid-violet apoi galben; gineceu cu stigmat filamentos ieit mult din corol. Fructul este o capsul ovoidal, bilocular. Semine sunt brune-nchis.

Figura 4 Plantago major Sursa: http://en.wikipedia.org

Frunzele (Plantaginis folium) se recolteaz n timpul nfloritului, pe timp uscat, dup ce se ridic roua. Frunzele i scapul florilor se taie de la suprafaa pmntului. Se usuc la umbr n strat subire. Uscare artificial se face la 40-50 C.

13

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

CAPITOLUL 2 DATE PRIVIND COMPOZIIA CHIMIC A SPECIILOR DIN GENUL PLANTAGO

Cele trei specii au compoziie chimic asemntoare. Produsul vegetal, reprezentat de frunze, conine:

Mucilagiu ozuronic Pectine Iridoide (aucubin sau aucubozid) Pigmeni (clorofile i carotenoide) Flavonoide Acizi polifenolcarboxilici Taninuri

Compui fenilpropanici
Vitamine (A, C,K) -sitosterli

Alantoin Acizi grai

Compui triterpenici

Enzime proteolitice Sruri minerale

2.1. Mucilagii
Mucilagiile sunt substane inerte din punct de vedere chimic, care formeaz cu apa soluii coloidale, cu consisten i rol asemntoare mucusului, protejnd astfel mucoasele. Sunt nrudite cu pectinele, conin n structura lor galactani, arabani, xilani sau asocieri ale acestora (galacto- arabo- xilani), la care se adaug sau nu acizi uronici. Se ntlnesc n tot regnul vegetal, att la plantele inferioare, ct i la plantele superioare. Dintre mucilagiile obinute de la plantele inferioare cu utilizri industriale i medicale se pot aminti agar-agarul, carrageenanul (din alge roii) i acidul alginic sub form de alginai. Mucilagiile de la plantele superioare se gsesc fie n esuturi externe la anumite semine (de exemplu la in i gutui), fie intern n vacuolele cu mucilagii (de exemplu la Malvaceae). Mucilagiile posed multiple caliti: - protectoare i calmante pentru mucoasa gastrointestinal inflamat;
14

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) - antiinflamatoare decongestive ale mucoaselor digestive; - ngreuneaz absorbia fie a unor substane medicamentoase (care vor aciona retard), fie a unor substane toxice sau a enterotoxinelor (acionnd ca antidoturi nespecifice); - adsorbante pentru substane toxice, toxine etc., nepermind adsorbia din tubul intestinal; - atenueaz aciunea iritant a unor substane asupra mucoasei gastrointestinale; - mucilagiile sunt i lubrifiante, folosite mult ca laxative, n constipaiile uoare; - sunt emulgatoare datorit macromoleculelor pe care le au n compoziie care mresc stabilitatea suspensiilor, emulsiilor etc.; - sunt foarte bune vehicule pentru diverse medicamente administrate per os sau per rect. Mucilagiile se utilizeaz n medicin datorit aciunilor emoliente, avnd proprieti cicatrizante, antiinflamatoare, fiind folosite n tratamentul tusei, ca antiulceroase gastrice, n bi oculare, n tratamentul furunculozelor sau ca diuretice. Mucilagiul ozuronic din Plantaginis folium este constituit din D-xiloz, D-galactoz, L-arabinoz i acizi uronici n proporie de aproximativ 40%.

2.2. Pectine
Pectinele sunt polizaharide de natur necelulozic, care se gsesc n structura peretelui celular al plantelor, mai ales n fructe (aproximativ 30%), n bulbi i fibre vegetale. Pectinele sunt substane hidrofile, care prin mbibare cu apa se transform n mucilagii. n fructele coapte pectinele se combin cu ap, glucide i acizi n diferite concentraii i dau natere la geluri. Pectinele intr n compoziia membranei celulare, dar se pot acumula i n vacuole. Aceste substane au aciune coagulant. Pectinele reprezint un grup de polizaharide de origine vegetal care intr n structura pereilor celulari. Aceti compui se comport n organismul uman ca glucide neenergetice, fiind considerate, alturi de celuloz, fibre alimentare. Aciune: bacteriostatic, hipocolesterolemiant, hemostatic.

15

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Nefiind digerate, pectinele ajung n colon unde sunt scindate sub aciunea florei bacteriene pn la acizi pectici, puin polimerizai. Acetia formeaz un film (hidrocoloid) protector pentru mucoase i creeaz un pH nefavorabil dezvoltrii florei microbiene patogene implicat n dereglarea tranzitului intestinal. Pectinele ntrzie absorbia alimentelor, scad glicemia i nevoia de insulin, din care cauz se recomand ca adjuvante n tratamentul diabetului. Determinnd o hipersecreie de acizi biliari, mobilizeaz colesterolul n sinteza acestora i scad astfel colesterolemia (previn maladiile cardiovasculare). Aplicate pe esuturi i tegumente dezintegrate (plgi, escare) pectinele acioneaz ca bacteriostatice (inhib hialuronidaza i mpiedic astfel difuziunea bacteriilor n esuturi). Acioneaz asupra trombocitelor, mrind viteza de coagulare a sngelui. Se folosesc n tratamentul diareei, a unor gastroenterite mai ales la copii sau ca pansament gastric n ulcer. n industria farmaceutic se folosete ca vscozifiant la prepararea unor suspensii, emulsii sau siropuri.

2.3. Iridoide
Iridoidele sunt metabolii secundari care se gsesc n peste 500 de familii de plante. n momentul de fa se cunosc peste 2500 de iridoide diferite. Iridoidele reprezint clasa cea mai ampl de glicozide cu agliconi terpenoidici, prezente n speciile de Plantago. Iridoidele sunt reprezentate, n principal, de aucubozide (aucubin, rinantin) i catalpozide (catalpol). Aucubina este labil i, n timpul conservrii, sufer un proces de hidroliz transformndu-se n agliconul corespunztor denumit aucubigenol. Acesta, fiind instabil ca atare, polimerizeaz. Polimerul format are o culoare brun nchis (mai ales la pstrarea n condiii necorespunztoare).

OH +HCl O HOH2C O glucoza aucubozida

OH O HOH2C OH aucubigenol

16

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Din speciile de ptlagin s-au izolat i ali compui iridoidici, i anume: melitozida, monomelitozida, 10-acetil-monomelitozida (din Plantago media L.), maiorozida (din Plantago major L.).
OH

OH

O
O

HOH2C

C6H11O5

HOH2C

C6H11O5

Figura 5 Aucubina

Figura 6 Catalpol

2.4. Pigmeni (clorofilieni i carotenoidici)

a) Pigmenii clorofilieni sunt pigmenii verzi ai plantelor. Au rol esenial n reaciile fotochimice ale fotosintezei. Molecula lor prezint dou pri: una hidrofil, nucleul porfirinic tetrapirolic, n mijlocul cruia se afl un atom de magneziu neionizat i care prezint lateral un rest al acidului propionic de care este legat fitolul (C20H39OH), care reprezint a doua parte a moleculei, hidrofob, foarte flexibil i lipofil.

CH CH2 CH3 H3 C N Mg N C2H5 H3 C

CH CH2 CHO N Mg N C2H5

N N H 3C * CH3 * H * H CH2 C O COOCH3 CH2 H COO C H2 CH CH3 3 Clorofila a

CH3 CH3 CH3

N N H 3C * CH3 * H H CH2 C* O COOCH3 CH2 H COO C H2 CH CH3 3

CH3 CH3 CH3

Clorofila b
Figura 7 Structura clorofilelor a i b

17

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Clorofilele a i b difer una de cealalt prin radicalul situat n poziia 3 pe nucleul porfirinic; clorofila a conine un radical metilic (-CH3), iar clorofila b un radical formil (CHO). Clorofilele a i b prezint maxime ale absorbiei radiaiilor luminoase n albastru ctre 450 nm i rou ctre 650 nm; au o consisten ceroas, sunt insolubile n ap, dar solubile n solveni organici. n soluie, sunt uor oxidabile n prezena luminii. n mediul acid clorofilele pierd atomul de magneziu, rezultnd feofitina de culoare brun. Raportul dintre clorofila a i b rmne, n general, constant 3:1. Pentru fiecare pigment exist mai multe forme. De exemplu pentru clorofila a au fost identificate n plantele verzi superioare, dup spectrele de absorbie, trei forme: clorofila a-673, clorofila a-683 i clorofila a-695 (dup unii autori 700), cifrele indicnd lungimea de und la care se situeaz maximele lor de absorbie n spectrul vizibil. Mai simplu, cele trei complexe de clorofila sunt notate P673, P683, P700. Analiza clorofilelor extrase din plante a demonstrat c aceste forme sunt identice din punct de vedere chimic. nseamn deci, c diferenele constatate in vivo n spectrul de absorbie se datoreaz, probabil, modului n care sunt dispuse n celule i complexrii lor cu diferite proteine cu care sunt asociate.

b) Carotenoidele sunt pigmeni naturali, mai ales de natur vegetal, de culoare galben, portocalie, roie, violet i mai rar albastr, care conin n molecula lor opt uniti izoprenoidice. Sunt prezeni n toate celulele fotosintetizante, fiind ns vizibili numai toamna cnd clorofila se dezintegreaz. Au structur tetraterpenic. Dup structur se pot deosebi dou grupe: caroteni (hidrocarburi) i xantofile (compui oxigenai). Carotenii sunt derivai ai izoprenului, nu conin oxigen. Culoarea lor variaz de la portocaliu la rou intens. Cei mai importani caroteni sunt: -carotenul, -carotenul, carotenul i licopenul. -, - si - Carotenii au formula molecular C40H56, sunt rspndii n natur i sunt solubili n benzen, sulfur de carbon, eter de petrol. -carotenul este o hidrocarbur nesaturat cu formula brut C40H56; este rspndit la unele alge i la plantele superioare n cantitate mare. Este constituit din dou resturi de ionon ( i ) unite prin patru resturi de izopren.
18

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

Figura 8 Structura -carotenului

n organism -carotenul este scindat oxidativ cu ajutorul enzimei carotenaz, n ficat , producnd ruperea dubei legturi C15=C15 i formarea vitaminei A1. Intermediar, se formeaz retinal (aldehida vitaminei A1) care este redus la retinol ( vitamina A1). Se conchide c carotenul este provitamina A. Carotenul se gsete n cantitate mic n cloroplastele de la plantele superioare, dar este mult rspndit i n cromatoforii de la algele sifonale.

Figura 9 Structura -carotenului

Carotenul se gsete n cantitate mai mic, comparativ cu celelalte carotine, n frunzele verzi ale plantelor superioare i n fructe.

Figura 10 Structura -carotenului

Licopenul are culoare roie i este considerat precursorul carotenoizilor din plante.

Figura 11 Structura licopenului

Carotenoidele au rol de antioxidani, acionnd contra radicalilor liberi (acioneaz contra mbtrnirii premature i contra apariiei petelor pe piele). Carotenoidele faciliteaz
19

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) comunicarea celular. Ele se transform n vitamina A cnd este necesar (mai ales betacarotenul).

2.5. Flavonoide
Flavonoidele reprezint un grup de substane naturale de origine vegetal, derivai ai benzopiranului, avnd un radical fenil ca substituent n poziia 2 sau 3, i care constituie o parte din pigmenii colorai din flori i fructe. Sunt substane foarte rspndite, pn n prezent au fost identificate peste 500 de flavonoide naturale, prezente n special la plantele superioare. La cele inferioare au fost identificate doar la cteva specii, iar n regnul animal prezena acestora se datoreaz alimentaiei bogate n flavonoide. Marea majoritate a flavonoidelor se gsesc sub form de glicozide, glicozidul flavonic cel mai rspndit fiind rutina. Familiile de plante cele mai bogate n flavonoide sunt: Hamamelidaceae, Urticaceae, Euphorbiaceae, Ericaceae, Asteraceae, Polygonaceae, Caryophyllaceae, Brasicaceae, Apocynaceae, Malvaceae, Sterculiaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Fabaceae, Rosaceae, Umbelliferae, Verbenaceae, Rutaceae, Myrtaceae, Iridaceae, Amaranthaceae, Cactaceae. Principalele clase de flavonoide sunt: flavonele i izoflavonele, antocianidinele, proantocianidinele i catehinele. Structura flavonelor corespunde la 2-fenilcromona, iar a izoflavonelor la 3fenilcromona. Se cunosc i derivai cum ar fi flavanone, flavonoli i flavanolone.
5 6 7

O
4 1 3 2' 1' 5' 3' 4'

O O Izoflavona (3-fenil-cromona)

O 2 8 Flavona 6' (2-fenil-cromona)

O O Flavanona (2,3-dihidro-flavona)

O OH O Flavonol (3-hidroxi-flavona)
20

O OH O Flavanolona (3-hidroxi-2,3-dihidro-flavona)

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)
Figura 12 Structurile de baz ale flavonelor i izoflavonelor

n viaa plantelor, flavonoidele au rolul de a absorbi radiaii ultraviolete, protejnd citoplasma i clorofila, fapt ce poate explica prezena lor n cantiti mai mari, la plantele din zonele tropicale, ecuatoriale i, n special n cele alpine. O plant poate s conin una sau mai multe substane flavonoidice. Flavonoidele se gsesc n toate organele plantei, frunze tinere, boboci, muguri sau flori abia deschise (acestea sunt mai bogate n flavonoide). n celule, flavonoidele se gsesc dizolvate n sucul vacuolar, iar prin uscare sunt absorbite pe pereii membranei celulare. Flavonoidele prezint numeroase proprieti farmaceutice: diuretice, hipotensive, diaforetice, antimicrobiene, antivirale, scad timpul de sngerare i de coagulare a sngelui. Un numr mic dintre ele sunt dotate cu proprieti antimitotice (inhib nmulirea necontrolat a celulelor) in vitro. Principala aciune a flavonozidelor este aceea de vitamine P sau factori P (factori de permeabilitate). Acioneaz prin legarea de proteinele intracelulare, scznd permeabilitatea capilarelor sanguine i crescndu-le rezistena (sunt potenial venoactive). Noiunea de factor P este legat de observaii asupra rolului n tratamentul unor forme de scorbut, cu acid ascorbic ca atare (vitamina C) sau cu suc de lmie. Unele blocarea flavonozide (apigenolul, i/sau crisolul, taxifolol, enzime ce gossipina) intervin n au aciune biosinteza

antiinflamatoare in vitro datorit influenei asupra metabolismului acidului arahidonic, prin ciclooxigenazei lipoxigenazei, prostaglandinelor proinflamatorii i n coagularea sngelui; altele pot fi antialergice (izobutirina, hispidulina), hepatoprotectoare (flavanolol, lignanii, silibina, silidianina, silicristina), antispastice (liquiritigenol), hipocolesterolemiante. Prin urmare flavonoidele sunt ntrebuinate la prepararea diferitelor medicamente.

2.6. Polifenoli
Prin intermediul acidului shikimic n urma unor procese de aromatizare, se formeaz derivai acizi care conin un numr variabil de funcii fenolice. Datorit caracterului polifenolic acetia sunt denumii pe scurt polifenoli, dar aceast denumire generic este limitat i destul de discutabil.
21

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) n regnul vegetal aceti compui se gsesc sub form de esteri, glicozide sau acilglicozide. Speciile din genul Plantago conin: acid cinamic, acid p-cumaric, acid salicilic, acid clorogenic, acid neoclorogenic, acid siringic, acid vanilic, acid gentisic. Acidul clorogenic propriu-zis (acid 3-cafeoilchinic) se gsete n plante singur sau nsoit de o serie de izomeri:
HOOC OH

HOOC
O OH OH OH OC

OH

HO

HO OH

OH

Figura 13 Acid clorogenic

Figura14 Acid chinic

COOH

HO OH

Figura 15 Acid cafeic

Polifenolii prezint urmtoarele avantaje:

-

mbuntesc memoria i puterea de concentrare; protejeaz organismul de boli cardiovasculare - previn formarea colesterolului ru, fluidific sngele i scad tensiunea arterial; menin structura acidului nucleic, micornd riscul apariiei cancerului; reduc inflamaiile i stimuleaz imunitatea; regleaz funcia sexual; previn apariia bolii Alzheimer i a sindromului oboselii cronice; poteneaz efectul benefic al vitaminelor i mineralelor din legume i fructe, meninnd sntatea pn la vrste naintate.

22

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

2.7. Taninuri
Taninurile sunt substane de natur vegetal, deosebit de heterogene, care nu conin n molecula lor azot i aparin clasei polifenolilor. Dup structura chimic se mpart n: taninuri galice (galotaninuri, taninuri hidrolizabile) i taninuri catehice (taninuri nehidrolizabile sau condensate), ambele avnd o structur polifenolic. Sunt n general produi amorfi, solubili n ap, cu srurile ferice formeaz coloraii sau precipitate: taninurile catehice verzi, taninurile galice albastre. Cu proteinele formeaz compui impermeabili i imputrescibili. Taninurile galice (hidrolizabile) sunt substane naturale, de origine vegetal, care prin hidroliz acid sau n prezena tanazelor, pun n libertate o oz, de obicei glucoz i acid galic sau un derivat al acidului galic, ca acid m-digalic sau acid elagic.

Figura 16 Structurile acidului elagic i ale acidului m-digalic

Taninurile care conin acid galic se numesc galotaninuri, iar cele care conin acid elagic se numesc elagotaninuri. Din categoria galotaninurilor fac parte taninul turcesc i taninul chinezesc. O molecul de tanin turcesc elibereaz prin hidroliz cinci molecule de acid galic i o molecul de glucoz, iar o molecul de tanin chinezesc elibereaz prin hidroliz nou molecule de acid galic i o molecul de glucoz. Prin hidroliza elagotaninurilor rezult acid elagic i glucoz sau acid elagic, acid galic i glucoz. Prin nclzirea galotaninurilor la temperaturi ridicate se formeaz pirogalol.

23

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

Figura 17 Structurile unor galotaninuri

Taninuri catehice (nehidrolizabile) sunt derivai de 2-fenil-dihidrobenzopiran-3-ol (flavan 3-ol). Nu pot fi descompuse n prile lor componente dect prin topire alcalin. Ele nu conin glucoz.
OH

Figura 18 2-fenil-dihidrobenzopiran-3-ol (flavan-3-ol)

Taninurile nehidrolizabile rezult prin condensarea derivailor catehinici i au o structur neelucidat complet pn n prezent. Prin nclzire n prezen de hidroxizi alcalini elibereaz pirocatechin (ortodifenol).

Figura 19 Structurile catehinei i epicatehinei

24

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

Figura 20 Structura galatului de catehin (format prin condensarea acidului galic cu catehina)

Taninurile sunt foarte rspndite n regnul vegetal, mai ales, n familiile: Rosaceae, Fagaceae, Polygonaceae, Fabaceae, Myrtaceae, Gentianaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Vitaceae, Anacardiaceae, Hamamelidaceae, Abietaceae. Mai puin bogate sunt familiile: Ranunculaceae i Labiatae, iar la familiile Papaveraceae i Cruciferae taninurile nu sunt prezente. n celule, taninurile se gsesc dizolvate n sucul vacuolar. La unele specii de plante (Quercus sp., Rosa sp., Onobrychis vicifolia), exist celule secretoare tanifere speciale (idioblaste tanifere). n produsele uscate, taninurile se afl sub form de cristale depuse pe pereii celulelor componente. Plantele acumuleaz taninurile n diferite organe: scoar (Quercus, Salix), organe subterane (Geum urbanum, Polygonum bistorta), frunze (Cotinus coggygria, Hamamelis virginiana), fructe (Rubus idaeus, Rubus caesius), centrul tulpinii (la arbori), formaiuni patologice (gale). n organismul vegetal, rolul taninurilor const n aceea c mresc rezistena plantelor la atacurile virusurilor i microorganismelor. Fiind substane puternic reductoare, acioneaz ca antioxidani, protejnd materia vie mpotriva aciunii oxigenului. De asemenea, intervin n reaciile redox din metabolismul celular i n procesele de respiraie celular, mai ales catehinele care acioneaz ca transmitori de hidrogen. Se consider c taninurile ar reprezenta i substane de rezerv pentru plante, un argument n acest sens fiind faptul c taninurile depozitate n semine dispar n timpul nfloririi.

25

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Taninurile determin valoarea alimentar i gustativ a multor fructe i produse alimentare (vin, ceai, cafea, cacao etc). Principala proprietate chimic a taninurilor este precipitarea proteinelor. Precipitarea sau coagularea proteinelor este cuplat cu retractarea (sngerarea) esuturilor, fenomen reversibil, cunoscut sub denumirea de astringen, taninurile fiind din acest punct de vedere substane puternic astringente. Procesul de tbcire a pielii se bazeaz pe formarea unor compui stabili, neputrescibili ai colagenului din piele cu substanele tanante. De asemenea, proprietile antiseptice ale taninurilor i gsesc explicaia n aciunea de precipitare a proteinelor microorganismelor de ctre substanele tanante. Aceeai explicaie are i aciunea hemostatic a acestor substane. Taninurile au largi utilizri n medicin, n industria pielriei, n medicina tradiional. n medicin pot fi administrate intern i cu aciune antidiareic, antimicotic i antiseptic, ca urmare a precipitrii proteinelor bacteriene i fungice. Administrarea intern se face mai ales sub form de decocturi, n tratamentul diareei, ulcerului, colitelor i ca antidot n intoxicaii cu alcaloizi. Proprietile farmacodinamice ale taninurilor sunt foarte bine apreciate. Taninurile formeaz, prin precipitarea straturilor superficiale ale mucoaselor sau anestezie local, de inhibare a secreiilor, bactericid. Combinaiile taninurilor cu proteinele, fiind i imputrescibile, protejeaz plgile externe mpotriva infeciilor, iar n anumite condiii de concentraie i dozaj fiind reversibile, dau posibilitatea esutului s se regenereze. Dac ns doza este mult depit, combinaiile formate sunt ireversibile. n tractul gastro-intestinal, taninurile acioneaz ca substane antidiareice i antimicrobiene. Ele intervin aglutinnd bacteriile din flora intestinal, ceea ce oprete fermentaia, coaguleaz plgile sangvinolente de pe intestin, dndu-i posibilitatea acestuia s se refac, retracteaz intestinul i diminueaz secreiile, prin uoara tbcire a mucoasei intestinale, n felul acesta, traficul de ap este oprit i diareea stopat (Ciulei, Grigorescu, Stnescu, 1993). esuturilor, o membran de coagulat, determinnd o aciune antiiritativ, antiinflamatoare, o uoar

26

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) De asemenea, taninurile acioneaz ca: inhibitori ai peroxidrii lipidelor, captatori de radicali liberi, inhibitori ai formrii de ion superoxid. Au fost descrise efectele inhibitoare asupra implicrii virusurilor. Acestea se datoreaz denaturrii proteinelor virale. Taninurile au efect inhibitor enzimatic manifestat asupra: 5-lipooxigenazei, enzimei de conversie a angiotensinei i activeaz hialuronidaza, glucoziltransferazele microorganismelor implicate n cariogenez. Monomerii i dimerii au proprieti de vitamin P (cresc rezistena i scad permeabilitatea capilarelor, cresc tonusul venos, stabilizeaz colagenul). Taninurile elagice acioneaz asupra mecanismelor imunitare (stimuleaz fagocitoza), efect evideniat i pentru galatul de epicatehin i galatul de epigalocatehin.

2.8. Vitamine (A, C, K)

Vitaminele sunt o clas de substane cu rol biocatalitic, indispensabile organismului. Au rol n creterea, dezvoltarea, reproducerea i reglarea tuturor proceselor metabolice din organism. Dei, pentru ndeplinirea rolurilor funcionale ale vitaminelor, organismul are nevoie de cantiti foarte mici, lipsa lor declaneaz stri patologice specifice, numite avitaminoze. Majoritatea vitaminelor sunt sintetizate de organismul vegetal. Animalele nu le pot sintetiza pe cele mai multe dintre ele, trebuind s le procure din alimentaie. Vitaminele se distribuie n diferite esuturi unde i exercit rolul biochimic i fiziologic, unele dintre ele acumulndu-se n cantitate mare n anumite organe sau esuturi. La plante se acumuleaz n frunze, fructe, semine, polen etc. Vitaminele sunt foarte heterogene n ceea ce privete structura chimic. Exist i cazul de vitamere, cnd vitamine distincte din punct de vedere chimic, dar nrudite structural ndeplinesc aceleai funcii, carena lor determinnd aceeai simptomatologie. Dup solubilitate, criteriu de clasificare empiric dar acceptat, vitaminele se mpart n: hidrosolubile (solubile n ap) i liposolubile (solubile n lipide).

27

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Vitaminele hidrosolubile Vitaminele din complexul B sunt cofactori n diverse reacii enzimatice. Prezint n special, rol de coenzime n cele mai multe reacii metabolice. Acestea sunt: vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, vitamina PP, vitamina B12, acidul folic, biotina, acidul pantotenic, acidul p-aminobenzoic, vitamina C. Vitamina C (acidul ascorbic) se numete i acid ascorbic deoarece lipsa sa produce boala numit scorbut. Este cea mai rspndit vitamin natural. Se gsete n cantitate mare n fructele de mcee, citrice, fragi, zmeur, mure, afine, ardei etc. Acidul ascorbic are numeroase implicaii biochimice i fiziologice. Particip la diferite procese metabolice datorit capacitii sale de a forma un sistem oxidoreductor reversibil. Are aciune antitoxic mrind rezistena organismului fa de infecii; favorizeaz coagularea sngelui, transportul i depozitarea fierului, participnd la buna funcionare a aparatului cardio-vascular i a sistemului nervos.
OH H OH O O

OH

OH

Figura 21 Structura acidului ascorbic

Carena n acid ascorbic provoac boala numit scorbut caracterizat prin hemoragii, iniial la nivelul gingiilor, mucoaselor, gurii i a tractului gastro-intestinal, tulburri la nivelul esutului conjunctiv i ale fibrelor de colagen. n stadiul mai avansat al scorbutului, apar gangrene, hemoragii viscerale, necroze osoase. Moartea este deseori provocat de complicaii pulmonare ca: pleurezii, pneumonii, tuberculoz. Necesarul zilnic de vitamina C pentru un adult este de 50-100 mg, respectiv aproximativ, 1 mg/kg corp. Necesitile sunt mai mari la copii, femei gravide, convalesceni.

28

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Vitamine liposolubile Vitamina A (retinolul, vitamina antixeroftalmic) se gsete n natur sub form de caroteni cu o larg rspndire n toate plantele. Carotenoizii , , (provitaminele A), la nivelul peretelui intestinal, sunt disociai oxidativ n prezena enzimei carotenaza i rezult vitamina A, care n corpul animal se acumuleaz, mai ales, n ficat, ovare, lapte, glbenu de ou sub form de esteri cu acizi grai superiori.
H3 C

CH3

CH 3

CH3

OH

CH3

Figura 22 Structura vitaminei A

Vitamina A se prezint n dou forme structurale: vitamina A1 (retinol) i vitamina A2 (dehidroretinol). Vitamina A ndeplinete funcii biologice i fiziologice multiple: stimuleaz procesul de cretere al animalelor tinere; previne apariia unor leziuni ale esutului epitelial; previne cheratinizarea epidermei i a mucoaselor; intervine n biosinteza peptidoglicanilor; stimuleaz organele hematopoetice; are activitate antiinfecioas i confer rezisten organismului; asigur funcionarea normal a aparatului genital; asigur funcionarea normala a ochiului. Carena acesteia la om produce boli grave precum: hemeralopia, xeroftalmia, etc. Vitamina K (vitamina antihemoragic). Este sintetizat numai de plante i de microflora din intestinul gros. Vitamina K se prezint n natur sub dou forme: vitamina K1 (filochinona), care se gsete n plante; vitamina K2 reprezentat de un grup de compui numii menachinone (MK-n, n fiind numrul de uniti isoprenil din lanul lateral al moleculei), care sunt sintetizai de bacterii la nivelul tractului intestinal uman i a diferitor alte animale. Vitamina K3 (menadiona) este un compus de sintez care poate fi transformat n vitamina K1 la nivelul tractului intestinal. Este folosit doar n hrana animalelor.

29

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)
O

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

Figura 23 Structura vitaminei K1

Cele mai bune surse alimentare de vitamina K1 sunt legumele cu frunze verzi, printre care spanacul, broccoli, varza de Bruxelles, varza i salata verde. Alte surse bogate sunt anumite uleiuri vegetale. Surse bune mai sunt i ovzul, cartofii, sparanghelul i untul. Niveluri sczute se gsesc n carnea de vit, carnea de porc, unc, lapte, morcovi, porumb, cele mai multe fructe i multe alte legume. O surs important de vitamina K2 o reprezint flora bacterian din partea anterioar a intestinului jejun i ileon. Rolul biologic fundamental al vitaminelor K este n procesul coagulrii sngelui datorit participrii acestora la biosinteza protrombinei, o glicoproteid care intervine n coagularea sngelui. Un alt rol al vitaminelor K este acela de a interveni n reacii de oxidoreducere, participnd la procesele de respiraie celular. n tratamentul cu antibiotice trebuie s se administreze vitamine din complexul B care protejeaz flora intestinal productoare de vitamina K.

2.9. Fitosteroli
Fitosterolii se pot gsi n marea majoritate a plantelor i astfel n alimente. Au o structur asemntoare colesterolului produs de organismele animale. Beta-sitosterolul este unul din sterolii (fitosterolii) de origine vegetal.

30

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

H H H HO H

Figura 24 Structura -sitosterolului

Se presupune c -sitosterolul reduce nivelul colesterolului din snge i este uneori folosit n tratarea hipercolesterolemie. -sitosterolul inhib, de asemenea, absorbia colesterolului n intestin, reduce riscul cancerului de colon i atenueaz simptomele ce nsoesc hiperplazia benign a prostatei (HBP), precum i emisia de urin repetat n timpul nopii. Nu se cunoate mecanismul exact al aciunii -sitosterolului, acesta ar putea avea legtur cu metabolismul colesterolului sau cu unele efecte antiinflamatorii. Exist cteva dovezi c -sitosterolul reduce simptomele n cadrul HBP, totui acestea nu sunt destul de convingtoare.

2.10. Acizii grai

Acizii grai sunt lanuri hidrocarbonate, avnd la un capt o grupare carboxil. Intr n structura tuturor lipidelor, pn la ora actual, depistndu-se peste 100 de acizi grai diferii. Majoritatea acizilor grai din lipidele naturale sunt acizi monocarboxilici alifatici cu caten normal saturat sau nesaturat i cuprind un numr par de atomi de carbon. n structura unor lipide, se ntlnesc i acizi grai ciclici, cu caten ramificat, cu numr impar de atomi de carbon sau care cuprind i alte grupri funcionale. Numrul atomilor de carbon n acizi grai este pn la 32. Acizii grai saturai sunt cei mai rspndii n lipide. Au formula chimica CH3-(CH2)n COOH. Dintre acetia citm: acidul lauric se extrage din Laurus nobilis, acidul miristic se extrage din Myristica fragrans, acidul palmitic se extrage din palmierul Elaeris, acidul stearic se extrage din Arachis hypogaea.

31

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Acizii grai nesaturai conin n molecula lor una sau mai multe duble legturi. Difer ntre ei prin lungimea lanului i prin numrul i poziia dublelor legturi. Cei mai importani acizi grai nesaturai sunt: acidul oleic (se afl n majoritatea lipidelor), acidul linolic (se afl n toate lipidele), acidul linolenic (se afl n uleiul de in).
CH3 (CH2)4 CH CH CH2 CH CH (CH2)7 COOH CH3 CH2 CH CH CH2 CH CH CH2 CH CH (CH2)7 COOH acid linolic cis cis cis

acid linolenic

H C (CH2)7 CH3 H C (CH2)7 COOH acid oleic (cis-9-octadecenoic)

Figura 25 Structurile unor acizi grai nesaturai

Acizii grai eseniali nu sunt sintetizai de organismul animal. De exemplu, acizii linoleic i linolenic sunt sintetizai numai de plante. Acizii grai eseniali sunt precursorii prostaglandinelor, hormonii paracrini, de o importan biologic deosebit. Pn nu demult, aceti hormoni erau considerai specifici organismelor animale. Recent, s-a descoperit c i esuturile i organele vegetale elaboreaz prostaglandine. Astfel, ei au fost evideniai la plante precum Populus i Larix. Carena acizilor grai eseniali determin tulburri grave, printre care oprirea creterii. Diferii acizi grai se utilizeaz ca emulgatori, alii ca baze de unguent sau cu alte roluri de substane auxiliare, la prepararea unor produse farmaceutice.

32

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

CAPITOLUL 3 DATE FARMACOLOGICE I UTILIZRI TERAPEUTICE ALE SPECIILOR DE PLANTAGO

Plantele din speciile de Plantago au utilizri terapeutice n medicina uman i veterinar, cult i tradiional. Principiile lor active acioneaz ca: emoliente, expectorante, hemostatice, cicatrizante, bactericide, astringente, antiinflamatoare, diuretice, hepatoprotectoare i imunostimulatoare. Intern frunzele de ptlagin (Plantaginis folium) se utilizeaz n tratamentul afeciunilor respiratorii (bronite cronice, faringite, laringite, astm bronic), gastrointestinale (ulcer gastric, gastrit hiperacid, enterite, dizenterii), hepatice i urinare (nefrite cronice), hipercolesterolemie i hipertensiune arterial. Extern frunzele de ptlagin se administreaz n: afeciuni respiratorii (bronite, faringite, laringite, astm bronic, guturai); afeciuni oculare (conjunctivitele blefaritelor); afeciuni dermatologice (acnee, furunculoza, nepturi de insecte, mucturi de arpe, ulceraii cutanate, Zona zoster, ulcer varicos); afeciuni dentare (gingivite, stomatite). Cercetrile efectuate de Grigorescu E. i colaboratorii (1973) au contribuit la elucidarea mecanismului de aciune al frunzelor de ptlagin, aplicate local, n tratamentul furunculozei. Astfel, ntr-o prim faz, mucilagiul nmoaie tegumentul permind enzimelor proteolitice s macereze pielea i, ca urmare, furunculul erupe. Compuii cu structur polifenolic sterilizeaz plaga deschis. Carotenoidele, fitosterolii, acizii grai contribuie ulterior la regenerarea esutului, iar taninurile acioneaz ca cicatrizani. Aciunea emolient a extractelor apoase din Plantaginis folium este datorat mucilagiilor. La administrarea acestora, mucilagiul acoper mucoasa inflamat cu un film protector. Aciunea expectorant este datorat tot mucilagiului care exercit o aciune iritant slab asupra mucoasei gastrice declannd, pe cale reflex, o hipersecreie traheobronic. Extractele de ptlagin dezvolt i efecte antidiareice, antisecretoare, antimicrobiene, cicatrizante, hemostatice datorit taninurilor pe care le conin. De asemenea, taninurile acioneaz antiinflamator i spasmolitic.

33

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) La locul de aplicare, taninurile precipit proteinele formnd o pelicul impermeabil i neputrescibil. Astfel, prin precipitarea proteinelor de la suprafaa mucoasei intestinale, taninurile formeaz un film care, fiind impermeabil, nu permite trecerea apei din esuturi n lumenul intestinal, dar, n acelai timp, apa i toxinele din intestin nu sunt resorbite (efect antidiareic). Prin precipitarea proteinelor suprafaa leziunilor de la nivelul mucoaselor i pielii se reduc (efect cicatrizant). De asemenea, taninurile precipit proteinele sanguine (efect hemostatic) i proteinele din membrana celular a microorganismelor (efect antimicrobian). De asemenea, aciunea antimicrobian a extractelor din frunze de ptlagin este datorat unui fitocomplex din care fac parte, pe lng taninuri, i ali compui cu structur polifenolic (flavone, acizi polifenolcarboxilici, derivai fenilpropanici), dar i derivaii hemostatic a frunzelor de ptlagin contribuie i vitamina K. Flavonele i triterpenele imprim proprieti diuretice extractelor din Plantaginis folium. Cercetri recente au evideniat faptul c in vitro, aucubina poate fi utilizat ca precursor n sinteza prostaglandinelor. Dintre acestea, prostaglandina I2 dezvolt efecte antiulceroase prin inhibarea secreiei gastrice acide, reglarea secreiei de mucus protector, precum i a fluxului sanguin n mucoasa gastric. n consecin exist posibilitatea ca i n organism compuii iridoidici de tip aucubin s funcioneze ca precursori n biosinteza de prostaglandine justificnd astfel, n parte, aciunea antiulceroas a frunzelor de ptlagin. n prezent, n multe ri, aucubina este utilizat ca sinton n sinteza de prostaglandine de interes terapeutic. Efectul hepatoprotector al preparatelor de ptlagin este atribuit, n principal, compuilor iridoidici. Experimentele in vivo au evideniat faptul c aucubina exercit un efect hepatoprotector puternic n intoxicaiile cu ciuperci aparinnd genului Amanita care, prin coninutul n -amanitin i faloidin, sunt puternic hepatotoxice. Hepatotoxicitatea amanitinei i faloidinei este datorat inhibrii sintezei de ARN la nivel hepatic. Aucubina acioneaz hepatoprotector prin anihilarea acestui efect. . [ Stnescu U., Hncianu M., Miron A., Aprotosoaie C., 2004] Iniial, aucubinei i s-au atribuit proprieti antibiotice. Ulterior s-a constat c, de fapt, nu aucubina este rspunztoare de acest efect, ci agliconul corespunztor aucubinogenolul
34

iridoidici. La aciunea

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) care se formeaz din aucubin sub aciunea unei -glucozidaze i care este, sub aceast form, puin stabil. Unii autori consider c aciunea antibiotic este datorat unui produs de degradare al aucubinogenolului. Prin polimerizarea aucubinogenolului aciunea antibiotic dispare. Astfel se explic de ce extractele apoase preparate la rece, sucul de presare i extractele fluide au evideniat in vitro proprieti bactericide i bacteriostatice, n timp ce infuziile i decocturile s-au dovedit a fi inactive. n extractele preparate la rece, -glucozidaza este activ i hidrolizeaz n timp aucubina cu eliberarea aucubigenolului. Temperaturile ridicate din timpul infuzrii i decociei inactiveaz -glucozidaza i, ca urmare, aucubinogelul nu se mai formeaz, extractele respective fiind lipsite de proprieti antibiotice. 1 mL de soluie apoas 2% de aucubin are, n prezena -glucozidazei (cnd se realizeaz scindarea glucozidei cu eliberarea aucubigenolului), o activitate antibiotic asupra tulpinilor de Staphylococcus aureus comparabil cu cea determinat de 600 U.I. de penicilin. Se apreciaz c o ceac de ceai preparat din 1,5g produs vegetal i 150 mL ap conine aproximativ 14 mg aucubin. Poliholozidele izolate din frunzele de ptlagin au proprieti imunostimulatoare. Astfel, testele in vitro au evideniat, pentru fraciunile PMI50 i PMII50 din frunzele de Plantago major L. (Samuelsen A.B. i colab., 1995) proprietatea de a activa complementul seric i de a induce sinteza de factor tumor-necrotic (TNF-) de ctre macrofage. Pe de alt parte, cercetri realizate de Miron A. (1997) au pus n eviden, pentru fraciuni macromoleculare glucidice izolate din frunzele speciilor Plantago media L. i Plantago lanceolata L., capacitatea de a activa procesele de fagocitoz (studii in vivo). Tinctura din frunze de ptlagin nu conine mucilagiul emolient i expectorant (insolubil n solvenii care conin alcool) i se folosete n tratamentul unor disfuncii minore ale tractului gastrointestinal i n afeciuni dermice inflamatorii (aplicaii locale). Pentru extractele din Plantaginis folium nu au fost semnalate contraindicaii, efecte adverse sau interaciuni cu alte preparate medicamentoase. n schimb, la administrare intern, aucubina pur determin gastroenterite i chiar paralizie.

35

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

3.1. Modaliti de utilizare ale frunzelor de ptlagin

3.1.1. Uz intern
1. Infuzie: 1 linguri de frunze uscate la 200 mL de ap clocotit; se infuzeaz 15 minute, se strecoar, se ndulcete i se ia cte o lingur la 2 ore n tratarea ulcerului gastric i duodenal, enterite, diaree, hemoroizi interni, intoxicarea sngelui, astm, bronite cronice, tuse, laringite, rgueal, alergii, anemie, retenie urinar, ateroscleroz. Se mai poate folosi amestecul, n pri egale, din ptlagin i cimbrior pentru boli de ficat i splin. Alte amestecuri se pot face cu plante expectorante, emoliente i cicatrizante (nalba mare, mueel, lumnrica, mierea ursului). 2. Infuzie din amestec de 50 g de frunze de ptlagin, 5 g de fructe de anason la 1 litru de vin fiert; se las s infuzeze 10-15 minute, se strecoar i se beau 3-4 ceti pe zi, cu nghiituri rare, de ctre bolnavii de flebite i cei care scuip snge. 3. Decoct din 1 lingur de frunze uscate la 250 mL de ap sau lapte; se fierbe 5 minute, se infuzeaz 10 minute, se strecoar i se d cte o lingur la intervale de 2 ore timp de 6 sptmni la bolnavii de tuberculoz pulmonar i copiilor cu limbrici. 4. Decoct din semine de ptlagin folosit n boli de rinichi, vezic urinar i hematurie. 5. Sirop de ptlagin din 100 g de frunze proaspete, bine splate care se toac mrunt; se fierbe n 1.250 mL de ap, la care se adaug 300 g de zahr i 250 g de miere de albine nezaharisit. Se amestec la foc mic pn se obine o consisten groas ce se toarn n sticlue sau borcane bine nchise i se ine la frigider. Se ia cte o linguri nainte de mese timp de 3 sptmni, avnd efecte excelente n bronite, tuse seac, curirea sngelui de toxine, rahitism i n boli cronice de inim, plmni i ficat. 6. Suc din frunze proaspete, splate, mrunite i presate care se amestec cu miere, se fierbe 20 minute i se iau cte 2 linguri pe zi n bolile cilor respiratorii, n purificarea sngelui, limbrici i incontinen urinar. 7. Pulbere din 1 g de frunze uscate i mcinate fin care se ia de 2-3 ori pe zi, dup mesele principale, n ulcer gastric i duodenal. 8.Semine de ptlagin (8 g pe zi) cu cteva nghiituri de ceai din cicoare cu efecte n prevenirea formrii pietrelor n litiaza biliar i renal.
36

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

3.1.2. Uz extern
1. Tinctura de ptlagin din 100 g de frunze uscate n 1 litru de alcool de 70; se las la macerat 24 ore, se strecoar, se stoarce tifonul i se pun 2-3 comprese pe ten cu acnee, n zona Zoster, inflamaii, nepturi de insecte sau se fac splturi bucale (gargara) n stomatite, faringite, laringite, afte, dureri de dini i alte infecii ale gurii. 2. Decoct din 100 g de frunze uscate la 300 mL de ap rece; se fierbe 15-20 minute, se infuzeaz acoperit pn la rcire i se pun comprese pentru cicatrizarea plgilor deschise i purulente sau arsuri grave. 3. Ulei de ptlagin din 400 g de frunze proaspete, mrunite, 300 mL de alcool de 70, 500 mL de ulei de floarea soarelui; se las la macerat 3-4 zile, se fierbe n baie de ap 34 ore, se strecoar cu stoarcerea reziduurilor i se fac badijonri n caz de acnee, rni, ulceraii, eczeme infectate, prurit, ulcer varicos, zona Zoster, inflamaii i nepturi de insecte. 4. Unguente din 5 mL de suc de frunze proaspete, 40 g de vaselina, 5 g de lanolina; se folosete n iritaii cutanate nezemuinde i n inflamaii. 5. Bi locale cu infuzie din 100 g de frunze uscate n 3 litri de apa clocotit; se las vasul acoperit timp de 20-30 de minute, se strecoar n ap de baie la temperatura de 37C i care se st 15-20 minute, pentru a trata ulcerul varicos i alte ulceraii ale pielii. Infuzia se mai folosete n boli de ochi (conjunctivita, blefarit), eventual cu adaus de sulfin i albstrele. 6. Cataplasme cu frunze proaspete, splate i strivite, care se aplic cu o bucat de tifon pe zonele afectate ale pielii: abcese, herpes, bube, tieturi, furuncule, rni sngernde, tromboze, inflamaii articulare de natura reumatic, cancer de piele, afeciuni maligne glandulare, ulcer varicos (se amestec cu sare). Are efecte cicatrizante, calmante, antipruriginoase i antiinflamatorii, datorit coninutului n aucubozid i substane antibiotice. 7. Persoanele care merg pe distane lungi pot pune frunze proaspete n pantofi, pentru a evita bicarea sau se mbiaz picioarele n infuzie de ptlagin amestecat cu nalb i coada calului, iar rnile vor fi unse cu alifie de glbenele.

37

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

3.2. Preparate farmaceutice pe baz de ptlagin

1. Sirop de ptlagin Aciune: Expectorant i emolient (combate starea de uscciune a mucoaselor). Indicaii: Bronite acute i cronice cu expectoraie vscoas. Compoziie: Extract de ptlagin (Folium Plantaginis), zahr, vitamina C, benzoat de sodiu. Frunzele de ptlagin conin o multitudine de substane complexe, printre care se numr taninurile i mucilagiile. O parte din aceste substane se regsesc n extractul apos i confer produsului aciunea expectorant. Contraindicat: n diabet. Mod de administrare: Copii 1-5 ani = 2-3 lingurie pe zi; Copii 6-12 ani = 4-5 lingurie pe zi; Copii peste 12 ani i aduli = 3-4 lingurie pe zi. Durata unei cure este de minim 5 zile.

2. Unguent cu ptlagin Recomandri: ulcer varicos. Compoziie: extract de ptlagin, vaselin, lanolin,cear, parfum. Indicaii: eczeme, plgi, rni, ulceraii, iritaii ale pielii, ulcer varicos, ulcere cutanate, hemoroizi, bici, nepturi de insecte, umflturi ale picioarelor. Administrare: aplicaii locale cu masaj uor.

3. Tinctur de ptlagin Recomandri: ulcer varicos, conjunctivit. Compoziie: glicozizi iridoidici, acizi polifenolici, flavonoide, cumarine, triterpene, steroli, polizaharide, acid silicic, sruri minerale (Zn, K), colina.
38

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Indicaii: bronite cronice, astm bronic, diaree, ulcer gastro-duodenal,

hipercolesterolemie, hipertensiune, ateroscleroz, iritaii provocate de nepturi de insecte, ulcer varicos, ulceraii cutanate, conjunctivite, blefarite, laringite, traheite, gingivite, rni purulente, ulceraii. Administrare: Intern 30 picturi de 3 ori pe zi, diluate n puin ap (100 mL). Extern 1 linguri tinctur diluat n 50 mL ap fiart i rcit. Se spal zona inflamat i se aplic comprese.

CAPITOLUL 4 SIROPURI

39

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Siropurile sunt preparate farmaceutice lichide cu un coninut crescut n zahr, de consisten vscoas, destinate administrrii interne (SIRUPI F.R. X). Siropurile pot conine 2/3 din greutatea lor zahr; siropurile industriale au cel puin 40% zahr. n general, sunt preparate cu zaharoz n concentraie de 65% i au o densitate de 1.32 g/mL, care le asigur protecia antimicrobian. Prin convenie, o soluie cu o concentraie de 45% zaharoz este numit sirop. n categoria siropuri sunt incluse toate preparatele lichide cu gust dulce, dense, sub form de soluii de uz intern, care au ca vehicul siropul. Zaharoza poate fi nlocuit cu glucoz, fructoz, zahr invertit sau alte zaharuri i de asemenea pot fi obinute siropuri din polioli naturali, cu gust dulce, ca glicerol, sorbitol i xilitol, ct i cu edulcorani sintetici sau ageni vscozifiani, pentru a le conferi vscozitate asemntoare siropului de zahr. Siropurile pot conine una sau mai multe substane medicamentoase, ct i substane auxiliare ca aromatizani, colorani, ageni antimicrobieni, numele i concentraia acestora trebuind s fie indicate pe eticheta preparatului. Unele siropuri nu conin substane medicamentoase, ele sunt destinate a fi utilizate ca vehicul pentru diferite forme farmaceutice lichide de uz intern. Industria de medicamente prepar i alte forme farmaceutice destinate realizrii de siropuri: a. Pulberi pentru siropuri prezentare utilizat de industrie pentru unele specialiti cu stabilitate foarte limitat, care nu pot fi stocate sub form lichid (de exemplu unele antibiotice). b. Granule pentru siropuri de asemenea, o form farmaceutic solid, prezentat n flacoane, care conin granule bogate n zahr i substane medicamentoase, solubile sau insolubile. n momentul ntrebuinrii, bolnavul adaug o cantitate determinat de ap peste pulberea sau granulatul din flacon i prin agitare se obine ex tempore o soluie sau o suspensie zaharat, care se administreaz cu linguria dozatoare, ce nsoete flaconul n ambalajul industrial. Siropul obinut se poate pstra o sptmn, la temperatura obinuit.

40

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) c. Doze unitare de pulberi sau granulate condiionate n plicuri termosudabile, care se dizolv n ap, n momentul ntrebuinrii; sunt cele mai moderne. Aceste tipuri de prezentri rezolv, pentru industria farmaceutic, problema ntrebuinrii unor substane medicamentoase instabile n soluie. d. Concentrate pentru siropuri sunt preparate extractive cu volum redus, obinute prin diferite procedee de dizolvare, extracie i concentrare a unor produse vegetale. Aceste soluii concentrate sunt diluate cu sirop i alcool, pentru a obine o concentraie alcoolic final de 20, care faciliteaz conservarea. Forma farmaceutic de sirop ofer o serie de avantaje: - preparatele prezint gust dulce, aromat, culoare atractiv, miros plcut, fiind preferate n special n medicaia pediatric; - corecteaz gustul i mirosul neplcut al unor substane, permind astfel o administrare uoar; - se pot asocia diferite substane medicamentoase; - concentraia mare n zahr are i rolul de a asigura conservarea siropului, avnd totodat i valoare nutritiv; - rezolv problemele de instabilitate a unor substane (antibiotice mai ales), n mediu apos granulate sau concentrate pentru siropuri, care sunt transformate n form lichid, de ctre bolnav, ex tempore; - siropurile, ca soluie apoas, ofer o mare biodisponibilitate, fiind forme farmaceutice cu eliberare rapid; - comparativ cu soluiile apoase de uz intern, asigur o protecie, asupra mucoasei gastrice, la aciunea iritativ a unor componente asociate n sirop (ex. cloralhidrat). Printre dezavantaje putem enumera: - stabilitatea redus a substanelor medicamentoase n soluie; - stabilitate mai mic dect soluiile la contaminarea cu microorganisme, fungi, pot fermenta uor; - ca i soluiile ocup un volum i prezint o mas mai mare dect cele ale formelor solide, ceea ce impune spaii mari de depozitare, transport dificil al recipientelor; - sunt contraindicate la diabetici (siropurile cu zahr).

4.1. Clasificarea siropurilor

41

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Siropurile se pot clasifica n funcie de: 1. Coninut: - siropuri simple cu o singur substan medicamentoas; - siropuri compuse cu mai multe componente. 2. Modul de formulare: - siropuri oficinale; - siropuri industriale. 3. Forma farmaceutic: - siropuri medicamentoase; - pulberi pentru siropuri; - granulate pentru siropuri; - concentrate pentru siropuri. 4. Modul de fabricare: - siropuri obinute prin dizolvarea la rece sau la cald a zahrului n ap, sucuri de plante, soluii extractive etc; - siropuri obinute prin amestecarea siropului simplu cu alte forme lichide, tincturi, extracte. 5. Modul de utilizare: - siropuri medicamentoase conin substane medicamentoase cu aciune terapeutic; - siropuri aromatizante se utilizeaz ca edulcorante pentru acoperirea gustului neplcut al unor substane medicamentoase, din diferite forme farmaceutice lichide; - siropuri cu rol de vehicul, n medicaia pediatric; - siropuri cu rol protector contra aciunii iritante a unor substane medicamentoase (ex. cloralhidrat). 6. Aciunea terapeutic: - expectorante; - tonice; - sedative; - purgative; - antiparazitare; - cu antibiotice; - cu chimioterapice; - antianemice.

4.2. Formularea siropurilor

42

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Siropurile se administreaz numai pe cale oral, pentru o aciune general mai ales (cele medicamentoase). Obiectivele formulrii unui sirop constau n principal n: - realizarea solubilitii substanelor medicamentoase; - asigurarea stabilitii siropurilor; - asigurarea caracteristicilor subiective (organoleptice) n scopul mririi acceptabilitii la bolnav; - eficiena terapeutic. n general, fa de forma farmaceutic de soluie, siropurile prezint o stabilitate bun datorit coninutului ridicat n zahr, iar fabricarea la cald, prin sterilizare, asigur protecia contra microorganismelor. n timp i pstrate n condiii necorespunztoare, sub influena factorilor interni i externi, siropurile sufer modificri importante urmate de alterarea calitii lor. Cele mai importante modificri sunt: cristalizarea zahrului, hidroliza, fermentaia, apariia filamentelor de mucegaiuri, schimbarea culorii etc. Hidroliza zaharozei poate s se produc n cursul fabricrii siropului i s se accentueze n cursul depozitrii, dar aceasta nu este considerat o alterare. Viteza de hidroliz este mult mai mare n siropuri acide; este accelerat de lumin, favorizat de dou enzime, glucozidaza (maltaza) i zaharaza (invertaza), prima acionnd la pH neutru, a doua la pH 4.7, la care aciunea maltazei este nul. Proprietile eseniale ale siropurilor nu sunt radical schimbate, dar aceste transformri grbesc alterarea. Alte tipuri de alterri sunt date de substanele medicamentoase particulare din diferite siropuri. Prezena alcoolului n unele siropuri faciliteaz conservarea lor, dar utilizarea acestora este contraindicat la copii. La formulare se vor stabili tehnologia de fabricaie, modul de condiionare i depozitare a siropurilor.

Pentru prepararea siropurilor se utilizeaz:

43

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) - substane medicamentoase; - substane auxiliare: zahrul; - vehicule ca: apa, ape aromatice, soluii extractive; - adjuvani i aditivi. n cea mai mare parte a siropurilor, pentru preparare se utilizeaz zahrul oficinal, cristalizat sau buci, care conine 98-99.5% zaharoz, 0.25-0.50% ap, solubil pn la o concentraie de 85%, n ap fiind stabil la pH 4-8. Se poate asocia cu sorbitolul, glicerina sau alte substane, care reduc tendina zaharozei la cristalizare. Glucoza lichid este de asemenea utilizat n locul zahrului; ea este vscoas i confer soluiilor un miros i gust plcut. Ca solveni se utilizeaz: apa, soluii apoase concentrate, ape aromatice, soluii extractive (apoase, hidroalcoolice), sucuri de fructe etc. Substanele adjuvante i aditivii sunt n general aceiai care sunt indicai i pentru soluiile de uz intern: ageni de mrire a solubilitii, stabilizani, aromatizani, corectori de gust i miros, colorani, conservani. n plus se utilizeaz o serie de substane cu rol de clarificare, decolorare etc. a siropurilor (crbune, caolin etc). Siropurile cu o concentraie mai mic n zahr, dect a siropului simplu (64% zahr) se conserv cu amestec de ageni antimicrobieni 1.5% nipagin-nipasol 1:9, sau ali conservani ca: acid benzoic, clorur de benzalconiu, clorur de decualiniu, prin dizolvare n alcool i amestecare cu sirop. Extractele concentrate pentru siropuri se prepar numai n industrie; ele se utilizeaz la fabricarea siropurilor prin amestecarea cu siropul simplu, n proporiile indicate; n general, se amestec 3 pri sirop i 1 parte extract. De asemenea, tot n industrie se prepar i sucurile de fructe care sunt utilizate pentru siropurile medicamentoase.

CAPITOLUL 5
44

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

PARTEA EXPERIMENTAL STUDIUL COMPOZIIEI PRINCIPIILOR ACTIVE DIN UNELE SPECII DIN GENUL PLANTAGO I UTILIZAREA LOR FARMACEUTIC

5.1. Obiective
Utilizarea plantelor pentru prevenirea i tratarea bolilor reprezint cea mai veche form de medicin cunoscut. Plantele sunt surse importante de compui farmaceutici, aromatici i industriali, omenirea fiind indisolubil legat de lumea vegetal, aceasta constituind de milenii sursa major de obinere a unor bioproduse eseniale pentru supravieuirea ntregului regn animal. n prezent zestrea botanic a planetei stocheaz numeroase resurse nc insuficient cunoscute. Statisticile evideniaz faptul c peste 1500 de compui noi sunt identificai anual n diferite specii de plante i c un sfert dintre medicamentele prescrise conin substane de origine vegetal. Printre plantele medicinale, plantele din genul Plantago, se remarc prin efectele lor terapeutice recunoscute ca tratamente excelente n tratarea multor boli, nc din antichitate. n medicina popular ptlagina era utilizat pentru vindecarea de otrviri, de febr, rni, prostat (cu frunze de ptlagina). n zilele noastre ptlagina constituie un remediu excelent n vindecarea

furunculelor, bolilor canceroase de glande, abceselor, vindecarea persoanelor ce au zona Zoster, bronitei, diareei, arteriosclerozei, mucturilor de arpe (peste rni se aplic terci de ptlagin tnr), astmului, rguelii, ulcerului duodenal, tusei, bolilor cilor respiratorii, hemoroizilor, guei, tumorilor maligne. Avnd n vedere aceste beneficii, n partea experimental a lucrrii de fa s-a urmrit studiul botanic i analiza calitativ i cantitativ a unor compui bioactivi (carotenoide, clorofile, iridoide, flavonoide, mucilagii, polizaharide, vitamine, steroli i grsimi), prezeni n dou specii ale genului Plantago: Plantago lanceolata i Plantago media, n vederea evidenierii complexitii compoziiei acestora n compui bioactivi ce explic numeroasele lor efecte terapeutice.

45

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Ca aplicaie farmaceutic a plantelor studiate s-a ales prepararea unui sirop pe baz de extract de ptlagin, form farmaceutic recunoscut pentru utilizarea terapeutic a acestei plante.

5.2. Materiale, metode i tehnici de lucru

Studiile s-au realizat folosind material vegetal autohton, plante din speciile Plantago: Plantago media i Plantago lanceolata. Reactivii utilizai n analizele efectuare au fost de calitate Merck, Flucka. Analizele prin cromatografie n strat subire au fost realizate pe plci de silicagel 60F254 Merck, cu detecie n UV la 254 i 365nm. Pentru dozrile spectrofotometrice s-a folosit spectrofotometrul UV-VIS Double Beam PC 8 Scanning Autocell, UVD-3200, Labomed, Inc (Departamentul de Chimie, Fizic i Mediu, Facultatea de tiine i Mediu). Pentru studiile microscopice s-a folosit microscopul optic model B-500 iar imaginile au fost realizate cu aparatul de fotografiat Kodak-8,1 megapixeli, ale Facultii de Medicin i Farmacie.

5.2.1. Obinerea i identificarea calitii materiilor prime vegetale

5.2.1.1. Obinerea materiilor prime vegetale Recoltarea: Materialul vegetal a fost recoltat de la dou specii din genul Plantago: Plantago media i Plantago lanceolata manual, pe timp uscat i nsorit din Grdina Botanica din Galai, n luna iunie. Sortare, uscare, ambalare: Materialul vegetal, reprezentat de frunzele speciilor de Plantago media i Plantago lanceolata, au fost supuse primei sortri pentru ndeprtarea corpilor strini i a impuritilor din aceeai plant. Dup terminarea procesului de sortare, produsul vegetal a fost supus uscrii timp de 2 sptmni la temperatura camerei, n strat subire. Dup uscare, produsul vegetal a fost din nou sortat ndeprtnd produsele vegetale degradate n timpul uscrii (brunificate, mucegite etc). Produsul vegetal rezultat a fost depozitat n pungi de hrtie, n ncperi bine aerisite.

46

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) 5.2.1.2. Verificarea identitii produselor vegetale Pentru evitarea impurificrii n timpul recoltrii cu organele altor specii, s-a efectuat examenul macroscopic i microscopic pentru fiecare produs vegetal, conform etapelor analizei farmacognostice. 1. Examenul macroscopic Prin acest examen, care reprezint primul stadiu de investigare al produselor noi sau cunoscute, se urmrete stabilirea caracterelor morfologice observate cu ochiul liber sau cu lupa, precum i cele care pot fi determinate prin perceperea mirosului i a gustului. Conform literaturii de specialitate [Farmacopeea Romn Ed. a X-a, 2011], examenul macroscopic se realizeaz dup cum urmeaz: A. Produse vegetale ntregi Adeseori produsele vegetale ntregi pot fi identificate numai prin controlul macroscopic. Controlul macroscopic al organelor subterane trebuie s conduc la stabilirea naturii organului (rdcin sau tulpin subteran) i la precizarea caracterelor acestora. Caracterizarea organelor subterane se refer la forma produsului, la modul de prezentare i de condiionare (ntreg, tiat longitudinal sau transversal, curat sau nu de suber), la prezena sau absena striaiilor (longitudinale, transversale), la profunzimea acestora, la prezena unor cicatrice (de radicele, rdcini sau muguri foliari), la fractur (neted, granuloas, lignificat, spongioas, pulverulent, fibroas etc.), la dimensiuni, culoare, miros i gust. Determinarea dimensiunilor (lungime, grosime etc.) se efectueaz n regiunea cea mai dezvoltat a organului subteran, cu ajutorul unei rigle gradate. Culoarea se observ pe produsul uscat, att la exterior ct i la interior, pe fractura proaspt. Controlul macroscopic al tulpinilor aeriene (parte component a produselor vegetale cunoscute sub numele de herba) stabilete forma, suprafaa (pubescent, striaii), fractura (neted, fibroas, granuloas, pulverulent etc.), dimensiunile (lungime, grosime), culoarea la exterior i n interior, mirosul i gustul.

47

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Controlul macroscopic al scoarelor stabilete caracterele suprafeelor externe i interne (prezena sau absena suberului, a striaiilor, a lenticelelor, a lichenilor), fractura transversal (neted, fibroas, spongioas etc.), dimensiunile (lungime, grosime), culoarea celor dou suprafee, mirosul i gustul. Controlul macroscopic al frunzelor i foliolelor stabilete forma, prezena sau absena pubescenei ambelor fee, grosimea nervurilor i proeminena sau invaginaia acestora pe suprafaa superioar i inferioar a frunzei, culoarea ambelor fee corelat cu pubescena, dimensiunile, mirosul i gustul. Forma i dimensiunile se determin pe produsul vegetal umectat i ntins pe o plac de sticl, n cazul frunzelor subiri; frunzele groase sau coriacee nu se umecteaz, ele pstrndu-i forma i dup uscare. Produsul se umecteaz prin introducerea ntr-un flacon cu ap nclzit la aproximativ 50C, n care se ine timp de cteva minute, apoi se ntinde pe o plac de sticl. Controlul macroscopic al florilor stabilete dac produsul este constituit din flori complete sau incomplete, izolate sau reunite n inflorescene, precum i stadiul lor de dezvoltare. Controlul macroscopic, efectuat pe produsul uscat sau umectat, implic analiza floral, cu ajutorul creia se stabilete totodat poziia sistematic a plantei de la care s-a recoltat produsul vegetal. Particularitile unui produs vegetal constituit din flori se stabilete prin examinarea fiecrei piese florale separate. Pe produsul vegetal uscat se determin pubescena, tipul inflorescenei, culoarea i mirosul. Pe produsul umectat, ntins pe o plac de sticl, se determin dimensiunile (diametrul florii sau inflorescenei, lungimea i limea pieselor florale) i gustul. Controlul macroscopic al fructelor stabilete tipul de fruct i stadiul n care a fost recoltat (matur sau imatur), forma fructului ntreg sau a fragmentului, suprafaa (striaii, coaste, diverse formaiuni, pubescen), culoarea, mirosul i gustul, precum i dimensiunile (lungime, lime, grosime, diametru), care se determin cu ajutorul unei rigle gradate sau cu hrtie milimetric. Controlul macroscopic al seminelor (produse vegetale ca atare sau care nsoesc fructele) stabilete forma seminei, aspectul suprafeei tegumentului exterior (pubescen, prezena sau absena striaiilor, a hilului, a rafeelor, a eventualelor anexe), dimensiunile, mirosul i gustul. Dimensiunile (lungimea i diametrul) se stabilesc cu ajutorul hrtiei milimetrice sau prin cernere, folosindu-se o sit ale crei ochiuri au latura de dimensiuni adecvate.
48

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Determinarea mirosului produselor vegetale ntregi se efectueaz dup frecarea ntre degete a produsului vegetal ca atare, fragmentat sau pulverizat. Determinarea gustului produselor vegetale ntregi se efectueaz pe un fragment al produsului vegetal umectat sau pe decoctul 10% al acestuia. B. Produse vegetale mrunite Controlul macroscopic al acestor produse, constituite din fragmente variate ca form, cu lungimea de 2-10 mm, se efectueaz prin metode similare metodelor folosite la produsele ntregi. Se stabilesc ntotdeauna forma i dimensiunile fragmentelor. C. Produse vegetale pulverizate Controlul macroscopic al acestor produse stabilete gradul de mrunire, culoarea, mirosul i gustul acestora. Determinarea mirosului i a gustului se efectueaz conform prevederilor de la produse vegetale ntregi. Gustul amar al produselor vegetale, ntregi, mrunite sau pulverizate, arat posibilitatea prezenei unor alcaloizi, a unor anumite glicozide sau principii amare; gustul aromat poate fi atribuit unor uleiuri volatile sau balsamuri; gustul astringent presupune prezena taninurilor, iar cel dulce arat prezena glucidelor. Controlul macroscopic poate fi nsoit, n vederea identificrii produselor vegetale, de un control chimic prin care pot fi evideniai unii constitueni chimici. 2. Examenul microscopic Conform literaturii de specialitate [Farmacopeea Romn Ed. a X-a, 2011], controlul microscopic al produselor vegetale se efectueaz diferit, n funcie de modul de prezentare al produsului vegetal. A. Controlul microscopic al produselor vegetale ntregi sau mrunite a. Seciuni transversale Produsul vegetal, adus la consisten corespunztoare prin fierbere sau prin macerare cu ap sau cu un amestec de volume egale de alcool (R) i glicerin (R) (n cazul produselor vegetale care conin mucilagii), este secionat cu ajutorul unei lame, al unui brici sau al unui microtom.

49

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Preparatele astfel obinute se clarific cu ap de Javel (R) sau cu cloral hidrat 800g/L (R), dup cum urmeaz: Clarificare cu apa de Javel. Produsul vegetal secionat se aduce ntr-un cristalizor n care se afl ap de Javel (R), se acoper cu o sticl de ceas i se las n soluie de la 15 min pn la cteva ore, n funcie de natura produsului vegetal. Soluia se ndeprteaz i seciunile se spal n mai multe rnduri cu ap, pn cnd nu se mai percepe miros de clor. Clarificare cu cloral hidrat 800g/L. Produsul vegetal secionat se aduce pe o lam de microscop pe care s-au pus cteva picturi de cloral hidrat 800 g/L (R); preparatul se nclzete uor, trecnd lama repede, de 2-3 ori, prin flacra unui bec de gaz. Colorarea seciunilor se efectueaz diferit, n funcie de natura esutului studiat: Pentru punerea n eviden a celulozei i a ligninei se folosete cel mai frecvent dubla colorare cu verde de iod-soluie (R) i carmin alaunat-soluie (R), procedndu-se n modul urmtor: seciunile clarificate se in n verde de iod-soluie (R) ntr-un cristalizor timp de aproximativ 1 minut; se ndeprteaz colorantul, iar preparatul se spal cu ap pn cnd lichidul de splare nu mai este colorat. Seciunile se in apoi n carmin alaunat-soluie (R), timp de 5-10 min, se ndeprteaz colorantul i se spal cu ap pn cnd lichidul de splare nu mai este colorat. Seciunile se examineaz la microscop ntr-o pictur de ap sau glicerol (R). n aceste condiii, pereii lignificai se coloreaz n albastru sau n albastru-verzui, iar cei celulozici n rou. Pentru punerea n eviden a suberului i a cutinei se folosete rou de Sudan Gglicerin (R), procedndu-se n modul urmtor: seciunile clarificate se pun pe o lam de microscop n colorantul rou de Sudan G-glicerin (R) i preparatul se nclzete uor, trecnd lama repede, de 2-3 ori, prin flacra unui bec de gaz i se las n repaus. Dup 30 minute se nltur colorantul prin splri repetate i preparatul se examineaz la microscop ntr-o pictur de ap sau glicerin (R); n aceste condiii, suberul i straturile cutinizate se coloreaz n rou portocaliu. Controlul microscopic al seciunilor prin organe subterane stabilete structura acestora, tipul de fascicul libero-lemnos, materiile de rezerv, prezena sau absena incluziunilor cristalizate, a esuturilor mecanice etc.

50

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Controlul microscopic al seciunilor prin tulpina aerian (parte component a produselor vegetale cunoscute sub numele de herba) stabilete structura fasciculelor liberolemnoase i a esuturilor mecanice, prezena sau absena perilor tectori i glandulari etc. Controlul microscopic al seciunilor prin scoar stabilete structura i dispoziia esuturilor mecanice i a razelor medulare, prezena sau absena incluziunilor cristalizate, a esuturilor secretoare etc. Controlul microscopic al seciunilor prin frunz stabilete caracterele epidermei, cu referire deosebit asupra perilor tectori i glandulari i a stomatelor, prezena sau absena esuturilor secretoare, a esuturilor mecanice i a incluziunilor cristalizate, structura fasciculului libero-lemnos etc. Controlul microscopic al seciunilor prin floare stabilete prezena sau absena perilor tectori i glandulari, a materiilor de rezerv, a incluziunilor cristalizate, structura grunciorilor de polen etc. Controlul microscopic al seciunilor prin fruct stabilete structura pericarpului, natura materiei de rezerva, prezena sau absena esuturilor secretoare, a incluziunilor cristalizate etc. Controlul microscopic al seciunilor prin smn stabilete caracterele tegumentului seminal, prezena sau absena esuturilor mecanice, a esuturilor secretoare pigmentate, natura materiei de rezerv etc. b. Preparatul de suprafa al produselor vegetale: Se efectueaz n cadrul controlului microscopic al fragmentelor provenite de la organe vegetale subiri (frunze, flori, tulpini ierboase) sau al unor esuturi (epicarp, tegument seminal) ndeprtate de pe organe vegetale consistente. Fragmentele vegetale sunt clarificate cu cloral hidrat 800 g/L (R) sau prin fierbere cu hidroxid de sodiu (R) 50 g/L. Dup clarificare, preparatul se spal de 3-4 ori cu ap, se aduce pe o lam de microscop, se secioneaz n dou i se ntoarce una din jumti, astfel nct dup includerea n ap sau n glicerin (R) i acoperirea cu lamel s se poat examina ambele suprafee. B. Controlul microscopic al produselor vegetale pulverizate Pulberea vegetal omogenizat se aduce pe o lam de microscop i se clarific fie cu cloralhidrat 800 g/L (R) sau cu amestec de volume egale de cloralhidrat 800 g/L (R) i
51

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) glicerin (R) (n acest caz preparatul se nclzete uor, n condiiile menionate anterior), fie cu glicerin (R) sau cu un amestec n volume egale de glicerin (R) i alcool (R). Pentru colorare se folosesc colorani specifici elementelor structurale care urmeaz a fi identificate. Controlul microscopic al produselor vegetale poate permite stabilirea poziiei taxonomice a plantelor de la care provin. n acest scop se examineaz perii glandulari, tipul stomatelor etc. n frunzele de dicotiledonate pot exista urmtoarele tipuri de stomate: - tip anomocitic, la care stomata este nconjurat de un numr variabil de celule nedifereniate de celelalte celule ale epidermei; - tip paracitic, la care stomata prezint dou sau mai multe celule anexe dispuse paralel cu axul longitudinal al ostiolei; - tip diacitic, la care stomata este nsoit de dou celule anexe paralele ntre ele i perpendiculare pe axul longitudinal al ostiolei; - tip anisocitic, la care stomata este nconjurat de trei celule anexe dintre care una este mai mic dect celelalte dou. n afar de aceste patru tipuri de stomate mai exist i tipul actinocitic la care stomata este nconjurat de celule anexe dispuse radial (Eucalypti folium).

3. Examenul histochimic Controlul microscopic al produselor vegetale poate fi nsoit de un control microchimic, prin care se evideniaz la microscop, n urma unor reacii de culoare, anumii constitueni chimici din celule, n vederea identificrii produselor vegetale. [Farmacopeea Romn Ed. a X-a, 2011] n cazul pulberilor, acestea pot fi tratate pe o lam de microscop cu cteva picturi de reactiv Steimetz, care datorit compoziiei sale complexe asigur att clarificarea seciunilor (prin cloralhidrat, alcool i glicerin), ct i colorarea selectiv a esuturilor. Astfel: - sulfatul de anilin coloreaz n galben esuturile lignificate (vase de lemn, celule pietroase, fibre lignificate, sclerenchimuri); - Sudanul III coloreaz n rou sau portocaliu uleiul volatil, picturile de ulei gras, rezinele, membranele cutinizate i ceroase, latexul;
52

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) - alaunul de fer (III) i amoniu d precipitate sau coloraii cu taninurile sau compuii fenolici; - mucilagiile i gumele din esuturi se identific datorit aspectului sidefos sau sticlos conservat n alcool i glicerin.

5.2.2. Examenul chimic general

Punerea n eviden a grupelor de principii active coninute n soluiile extractive obinute din produse vegetale se realizeaz prin examenul chimic calitativ general, care are la baz principiul extraciei succesive cu solveni de polariti diferite (eter etilic, alcool i ap) a compuilor bioactivi i identificarea lor prin reacii chimice specifice i prin metode cromatografice.

5.2.2.1. Obinerea extractelor vegetale 2.5g produs vegetal adus la gradul de mrunire necesar, se cern prin sita V (630m), se extrage cu 5-6 mL ap la fierbere i se filtreaz, obinndu-se extractul apos (soluia A). 2,5g produs vegetal mrunit se extrage cu un solvent nepolar (eter de petrol) n aparatul Soxhlet. n urma extraciei cu aparatul Soxhlet rezult extractul lipofil (soluia B) i produsul vegetal degresat, care se usuc la 50C (la etuv). Produsul vegetal degresat obinut se supune n continuare extraciei cu alcool etilic 70, apoi se agit timp de dou ore la 40C, pe plit electric cu agitator magnetic rezultnd extractul hidroalcoolic (soluia C).

53

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

Produs vegetal uscat i mrunit (frunze)

Extracie Soxhlet (eter de petrol)

Extract apos (Soluia A)

Produs vegetal degresat

Extract lipofil (Soluia B)

Uscare la etuv 50C

Extracie cu alcool etilic 70

Agitare 2 ore la 40C pe plita electric cu agitator magnetic

Extract hidroalcolic 70% (Soluia C)

54

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

Figura 26 Schema general de lucru pentru prepararea extractelor vegetale

5.2.2.2. Identificarea compuilor bioactivi Identificarea grupelor de principii active s-a fcut folosind cele trei extracte: apos (A), eteric (B) i alcoolic (C), prin reacii specifice i prin metode cromatografice. 1. Reacii de identificare 1. Identificarea aucubozidei: Peste 1mL soluie A se adaug 2 mL amestec etanol (R) glicerin (R), 1:1 i 3 picturi acid clorhidric concentrat (R). Se omogenizeaz prin agitare uoar i se menine 3 minute n baie de ap n fierbere. Apare o coloraie albastr sau verde-albastr (reacia Charaux). 2. Identificarea alantoinei: La 1 mL soluie A se adaug circa 0,05g pepton i se agit pentru dizolvare, dup care se aduce la baza eprubetei, cu o pipet, acid sulfuric concentrat (R), circa 1 1,5 mL. Se las n repaus, iar dup 3-4 ore, la limita de contact a celor dou lichide, se observ formarea unui inel violet care difuzeaz n stratul superior. Aceasta se datoreaz cuplrii acidului glioxilic rezultat din hidroliza succesiv a alantoinei (se formeaz mai nti acidul alantoic din care rezult ulterior acidul glioxilic) cu triptofanul din pepton (reacia Adamkiewicz Hopkins Cole).
NH2 O O C C NH NH CH NH alantoina NH2 C O H2 N O OH O C C NH CH NH acid alantoinic O + C CHO acid glioxilic OH - H2 O NH2 C O O C OH NH2

+2 O C CHO NH2 acid glioxilic uree COOH

COOH N H triptofan

COOH N N C H H produs de condensare

Figura 27 Reacia de identificare a alantoinei

55

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) 3. Identificarea carotenoizilor (reacia Winterstein): la 1mL soluie B se adaug 2 picturi de H2SO4 concentrat; apare o coloraie verde albstruie, ce atest prezena carotenoizilor. 4. Identificarea sterolilor - la 3mL soluie B se adaug 5mL cloroform i un volum egal de H2SO4 concentrat; la limita de separare apare un inel violet iar soluia cloroformic se coloreaz n verde , dovedind prezena sterolilor; 5. Identificarea taninurilor (reacia cu FeCl3): la 1 mL soluie B se adaug 1 mL ap i 1-2 picturi FeCl3 1%; apare o coloraie albastr (pentru taninuri galice), verde murdar (pentru taninuri catehice), verde-brun (pentru taninuri mixte), nsoite de un precipitat negru. 6. Identificarea polifenolilor se realizeaz prin: a) reacia cu clorur feric - la 1mL soluie C se adaug 1mL ap i 2 picturi de FeCl3, apariia coloraiei albastr atest prezena polifenolilor; b) reacia cu reactivul Folin Cioclteu - la 1mL soluie C se adaug 3-4 picturi reactiv i 1mL polifenolilor; c) reacia cu reactivul Fehling - la 1mL soluie C se adaug 3 picturi reactiv Fehling, se menine n baia de ap la 80C pn cnd apare un precipitat rou-crmiziu care sedimenteaz n timp i atest prezena polifenolilor. 7. Identificarea flavonelor se realizeaz prin : a) reacia cianidolului (Shibata) la 3-4 mL soluie C, se adaug 1-2 fragmente magneziu metalic i 0,5 mL acid clorhidric concentrat; apariia coloraiei portocalii, n 5 minute, atest prezena flavonelor; b) chelatarea cu sruri ale metalelor bi i trivalente - la 1mL soluie C se adaug 0,5 mL acetat de sodiu i 1 mL clorur de aluminiu 2,5%; astfel, apare o coloraie galben care se intensific, n cazul prezenei flavonelor. 8. Identificarea poliholozidelor mixte 2 mL soluie C se concentreaz la 1 mL, apoi se toarn n fir subire peste un volum de 5 mL metanol i se las n repaos 10-15 minute. Se obine un precipitat alb-floconos care se coloreaz n violet la adugarea de 2-3 picturi de hematoxilin. Dup filtrare, pe filtru se reine precipitatul colorat. soluie Na2CO3 20%, apariia unei coloraii albastre atest prezena

56

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

2. Metode cromatografice de separare i identificare Cromatografia reunete un grup important de metode de separare diverse care permit separarea, izolarea, identificarea i dozarea simultan a componenilor din amestecuri complexe pe baza repartiiei diferite a componentelor ntre o faz staionar i una mobil. Separarea compuilor prin cromatografie se datoreaz vitezei de migrare diferit a acestora de-a lungul fazei staionare, care este determinat de modul de distribuie a substanelor de separat ntre cele dou faze precum i de viteza de deplasare a fazei mobile. Faza staionar poate fi un solid adsorbant (cromatografie de adsorbie), un lichid depus pe suport solid (de repartiie), un schimbtor de ioni (cu schimb ionic) sau un gel (cromatografie de excluziune steric). Faza mobil poate fi gaz (Ar, He, N2) sau lichid (solvent sau amestecuri de solveni de nalt puritate, soluii tampon sau CO2 n condiii supercritice). La intrarea n coloana cromatografic, faza mobil poart numele de eluent sau developant, iar la ieire se numete efluent sau eluat. Sediul procesului de separare cromatografic este coloana cromatografic, spaiul n care se depune faza staionar. n funcie de forma coloanei n care este depus faza staionar se disting: cromatografia pe coloan nchis, cu umplutur (CC); cromatografia n tub deschis (de obicei o coloan de dimensiuni capilare pe al crei perete, un lichid sau un solid activ joac rol de faz staionar); cromatografia plan: cromatografia pe hrtie (CH) i cromatografia pe strat subire (CSS); cromatografia pe filament. Metodele cromatografice pot fi utilizate n scop analitic sau preparativ. Pentru efectuarea separrilor i analizelor cromatografice se parcurg urmtoarele stadii: 1) pregtirea probelor (extracie, purificare etc.); 2) aducerea n contact a amestecului de separat cu faza staionar (spotarea); 3) separarea cantitativ (developarea) componentelor prin eluare cu faza mobil; 4) detecia (identificarea sau revelarea) componentelor prin metode fizico-chimice adecvate. Cromatografia plan Cromatografia plan se caracterizeaz prin forma geometric plan a suportului fazei staionare. Aceast tehnic cromatografic include: cromatografia pe hrtie (CH) i cromatografia pe strat subire (CSS). Separarea se bazeaz pe distribuia componentelor ntre
57

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) dou faze, una mobil lichid i una staionar. n cromatografia pe hrtie (CH), faza staionar este fibra celulozic cu anumite caracteristici structurale i dimensionale. n cromatografia n strat subire (CSS), faza staionar este silicagelul, alumina, poliamide ca nylon-6 i nylon-6,6, celuloz aminoetilat, amidonul etc., toate avnd n mas un liant pentru formarea stratului subire pe un suport inert (plcue de sticl sau folii de aluminiu). Faza mobil este un amestec de solveni bine alei. Cromatografierea pe hrtie sau strat subire presupune developarea ntr-un spaiu nchis camer de developare (bac cromatografic) cu atmosfer saturat de solveni. Developarea poate fi ascendent sau descendent, orizontal, circular sau radial.

Modul de lucru Plcile pentru strat subire sunt pregtite n prealabil i activate. Ele au dimensiuni standard, iar adsorbantul se alege dup natura componenilor i amestecul de solveni pentru eluie. Amestecul de solveni se introduce n camera sau bacul de cromatografie i se ataeaz capacul pentru a se ajunge la saturaie cu vapori. Proba de analizat, dizolvat n general ntr-un solvent, se aplic la baza plcii sau hrtiei cromatografice, la 10-20 mm de margine, cu ajutorul unei capilare calibrate sau cu o sering special. Probele aplicate pe plci trebuie s conin minim 0,01% concentraie n componentele de separat, ns nu trebuie s fie prea concentrate, deoarece la concentraii mari separarea este difuz (spoturile nu sunt distincte) obinndu-se numeroase suprapuneri sau asimetrii. Dup aplicarea probelor, locurile de depunere aflate pe linia de start, trebuie uscate foarte bine, deoarece solvenii de extracie remaneni pot influena negativ separarea substanelor de analizat. Solvenii volatili se pot ndeprta cu uurin, prin simpla agitare n aer a cromatogramelor, n timp de solvenii cu puncte nalte de fierbere se ndeprteaz prin nclzirea plcilor cromatografice la temperaturi controlate, care s nu afecteze structura plcilor i componenii din prob. Dup evaporarea solventului de extracie, cromatoplaca se introduce n camera de developare care conine faza mobil. Dup ce developantul a atins distana de deplasare prevzut (marcat prin frontul developantului) placa sau hrtia cromatografic se scoate, se usuc i se trece la detecia componenilor. Revelarea este operaia de punere n eviden a zonelor separate, corespunztoare diferiilor componeni separai. Procedeele de vizualizare pot fi: fizice
58

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) expunerea cromatogramelor la lumin UV; chimice reacii de culoare efectuate prin stropirea plcii cu reactivi chimici; fizico-chimice stropirea cu reactivi chimici urmat de expunere la lumin UV; biochimice bioautografia, reacii enzimatice. Spotul poate fi analizat cantitativ prin decupare sau rzuire urmat de extracia componentului ntr-un volum determinat dintr-un solvent potrivit sau direct prin densitometrie optic. Modul general de evaluare a rezultatelor separrii este dat de valoarea Rf, care reprezint raportul dintre distana xi de la linia de start pn la centrul componentului separat i distana H de la linia de start la frontul fazei mobile: Rf = xi / H Pentru condiii identice de cromatografiere pe hrtie i strat subire (condiii standard), Rf-ul devine o constant de identificare a fiecrui component separabil. Metoda se aplic curent n analiza aminoacizilor din hidrolizate proteice, a zaharurilor i glicozidelor din produse naturale, n chimia heterociclurilor, sterolilor, carotinoidelor i multe altele. Cromatografia pe coloan Este cel mai vechi procedeu cromatografic (vet, 1906). Piesa esenial n aceast metod de separare o constituie coloana cromatografic, confecionat dintr-un tub de sticl, prevzut la partea inferioar cu un robinet, ales astfel nct raportul dintre diametrul coloanei i lungimea sa s fie de 1:5 pn la 1:20. n coloan se gsete faza staionar, care este un material adsorbant poros (de ex.: silicagel, alumin, crbune, carbonat de calciu, amidon, zaharoza, etc.). La partea superioar a coloanei se ataeaz o plnie de separare cu solvent pentru eluie. Modul de lucru: Pentru pregtirea coloanei, la captul inferior al coloanei se pune un dop mic din vat, dup care coloana se umple cu adsorbani activai n prealabil. Pentru depunerea omogen a adsorbantului, fr bule de aer, se poate recurge la trei procedee: 1) adsorbantul se toarn n stare uscat n tubul gol; 2) coloana se umple 50% cu solvent inert i se depune apoi adsorbantul, meninnd constant nivelul eluentului prin scurgerea concomitent pe la partea inferioar; 3) adsorbantul se toarn sub forma unei suspensii fine n eluent. Dup ndeprtarea solventului din coloan i splare cu solventul ce va fi utilizat n separare, la partea superioar a coloanei se introduce proba sub forma unei soluii concentrate, dizolvat ntr-un solvent bun. Se las s se distribuie uniform pe suprafaa
59

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) coloanei, eventual prin adaos cantiti limitate de solvent. Dup ce proba a ptruns complet n coloan, se adaug un strat de aproximativ 1 cm de nisip, dup care se ncepe adugarea de solvent (eluent) proaspt. Etapa corespunde developrii, cnd componentele probei analizate se distribuie pe coloan n raport cu afinitate a fiecruia fa de faza staionar. n urma eluiei cu solvent, compuii din amestec se pot separa sub form de benzi colorate, de-a lungul coloanei, fiecare band colorat putnd fi secionat i analizat ulterior, metoda fiind aplicabil amestecului de pigmeni de culori diferite (de ex. la separarea clorofilelor i pigmenilor nsoitori, caroteni i xantofile). O alt metod presupune eluia cu solveni pn cnd eluantul aduce la captul coloanei diverse fracii ce se colecteaz i se analizeaz sub aspectul compoziiei. Cea de-a doua variant se aplic la extracia -carotenului din plante, a flavonelor din materiale vegetale, a izomerilor HCH, a fitosterolilor, peptidelor etc. Adsorbantul din coloan poate fi regenerat i reutilizat. Pentru creterea vitezei de eluie pe nlimea coloanei, aceasta se poate ataa la un vas de tromp legat la vid sau se poate lucra sub aer comprimat (flash cromatography). n prezent se folosesc coloane cu adsorbani de mare specificitate, fa de care, compuii se separ prin inversie de faz. [ Jercan E.,1982] n lucrarea de fa metodele cromatografice au fost utilizate att pentru separarea ct i pentru identificarea unor principii active prezente n plantele studiate. Astfel, cromatografia pe coloan a fost utilizat pentru separarea pigmenilor carotenoidici, dup cum se va vedea mai departe n cadrul metodelor de dozare folosite. Cromatografia pe strat subire (CSS) a fost folosit pentru identificarea prezenei aucubinei n plantele din specia Plantago. Pentru aceasta, a fost necesar prepararea unei soluii de analizat prin extragerea pulberii de Plantaginis folium (1g) cu 60 mL metanol, prin nclzire timp de 10 minute n baie de ap la 60C, urmat de filtrare. Filtratul obinut a fost supus apoi evaporrii la sec. Reziduul obinut se dizolv n 2mL metanol, i se supune din nou filtrarii, dac este necesar. Soluia astfel obinut se va folosi pentru spotare pe cromatogram. Cromatografia se realizeaz pe plcue de Silicagel, folosind ca faz mobil amestecul n-propanol:toluen:acid acetic:ap (2,5:2:1:1 v/v), iar ca revelator benzidina.

5.2.3. Dozarea compuilor bioactivi

60

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Determinarea cantitativ a coninutului n principii active s-a realizat prin metode spectrofotometrice, gravimetrice i volumetrice, folosind frunzele recoltate de la cele dou specii din genul Plantago: Plantago lanceolata i Plantago media.

5.2.3.1. Determinarea coninutului n poliholozide din Plantago lanceolata i Plantago media Poliholozidele mixte (mucilagii) sunt heteropoliholozide cu structur deseori puin cunoscut, care au un caracter neutru sau acid (imprimat de acizii uronici sau de gruparea ester sulfuric) i cu o mas molecular cuprins ntre 50.000 i 5 milioane de daltoni. Sunt substane solide, amorfe, incolore, care formeaz cu apa soluii coloidale. Sunt practic insolubile n solvenii organici nepolari. Pentru aprecierea coninutului n poliholozide se realizeaz iniial determinarea factorului de mbibare cu valoare orientativ i apoi determinarea gravimetric a poliholozidelor. a. Factorul de mbibare al produselor vegetale. Prin factor de mbibare se nelege volumul total (n mililitri) pe care l ocup 1g de produs vegetal dup mbibare cu ap. El furnizeaz informaii asupra coninutului n poliholozide mixte. Determinarea factorului de mbibare se efectueaz ntr-un cilindru sau ntr-o eprubet gradat de 25 mL, cu dop rodat, cu scar de gradaie nalt de 10-12,5 cm i cu subdiviziuni de 0,1 mL. Modul de lucru: 1g de produs vegetal, pulverizat, cntrit la balana analitic, se introduce n cilindru sau n eprubeta gradat descrise anterior i se umecteaz cu 1 mL alcool (R) sau cu 1 mL aceton (R). Se adaug pn la 25 mL ap i se agit energic timp de 1 or, astfel: primele 4 agitri la intervale de cte 5 minute, apoi din 10 n 10 minute, pn la 1 or, agitnd de fiecare dat cte 1minut. Se las n repaos timp de 5 ore, apoi se citete volumul ocupat de produsul vegetal i mucilagiul care ader de acesta. Pentru stabilirea factorului de mbibare se calculeaz valoarea medie a trei determinri i se raporteaz la 1g produs vegetal. b. Determinarea gravimetric a poliholozidelor. n vederea aprecierii coninutului, poliholozidele se precipit n metanol sau aceton i se determin gravimetric.
61

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Modul de lucru. Dup extracii succesive cu ap pn la epuizare a cte 50g produs vegetal, soluiile obinute se aduc n fir subire peste volume de etanol de 5-10 ori mai mari, cnd se separ mucilagiile sub form de precipitat alb floconos. Dup filtrare printr-un filtru tarat i uscarea precipitatului la 105C pn la pondere constant, se raporteaz precipitatul obinut la 100g produs vegetal (substan uscat). [Bucur L., 2007]

5.2.3.2. Determinarea coninutului de pigmeni clorofilieni din Plantago lanceolata i Plantago media Extracia pigmenilor clorofilieni: Materialul de analizat se cntrete (1g produs vegetal) se tritureaz cu nisip de cuar , apoi se adaug aceton 85% i se continu triturarea pn ce esutul este mcinat. Coninutul din mojar se transfer n plnia Buchner i se filtreaz la vid. Se repet procedura pn cnd esutul este lipsit de culoarea verde i splrile sunt incolore. Atunci cnd extracia este complet, din filtrat se pipeteaz o poriune de 25-50 mL n plnia care conine aproximativ 50 mL eter. Se adaug ap cu atenie pn cnd este evident c toi pigmenii solubili n grsime au intrat in stratul eteric. Se ndeprteaz statul apos. Stratul eteric din plnie se spal cu circa 100 mL ap. Se continu splarea soluiei de eter pn cnd toat acetona este eliminat (5-10 splri), apoi se transfer soluia de eter la balon cotat de 100 mL, se dilueaz la volum i se agit. Determinarea spectofotometric. 60 mL din soluia de eter care conine pigmentul se trateaz cu un vrf de spatul de Na2SO4 anhidru ntr-un pahar Berzelius. Dup limpezire, se decanteaz soluia eteric i se citete extincia la 660 i 642 nm. Dac este necesar, soluia eteric se dilueaz cu eter anhidru astfel nct extincia s aib valoarea de 0.2-0.8 la lungimea de und utilizat (valoarea optim este aproximativ 0.6 la 660 nm). Instrumentul se etaloneaz cu solventul folosit pentru fiecare lungime de und. [Furdui B., Dinic R., Georgescu M., 2010] Calculul concentraiei de pigmeni clorofilieni Calculul clorofilei totale i a componentelor a si b (mg/L): (1) Clorofila total = 7.12 A660 + 16.8 A642 (2) Clorofila a = 9.93 A660 0.777 A642 (3) Clorofila b = 17.6 A642 2.81 A660
62

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

5.2.3.3. Extracia i dozarea spectrofotometric a -carotenului din Plantago lanceolata i Plantago media [Furdui B., Dinic R., Georgescu M., 2010]: Separarea -carotenului: O prob de 1g material vegetal se introduce ntr-un mojar de porelan cu circa 5 g nisip de cuar sau sticl pisat i se tritureaz foarte bine. Se adaug un amestec eter de petrol:benzen (v:v=1:1) i se continu triturarea. Pentru separarea pigmenului carotenoidic de pigmenii clorofilieni i xantofilici, proba astfel pregtit se trece printr-o coloan de adsorbie, cu Al2O3 (4 7 cm nlime). Mojarul cu esut vegetal se spal cantitativ cu amestec eter de petrol:benzen (1:3), extractul rezultat trecndu-se n continuare pe coloan. Carotina i substanele solubile n solvent trec prin coloan, unde sunt reinui pigmenii inactivi, iar solventul i carotina activ se scurg la partea inferioar ntr-un balon conic, ca extract de culoare galben. Se continu procedura pn cnd, faza mobil care se colecteaz devine incolor. Se noteaz volumul de extract (Vex) carotenoidic colectat. Coloana de absorbie este un tub de sticl cu diametrul de 8-10 cm care, are la partea inferioar o prelungire subire de 6-7 cm, este fixat ntr-un vas de tromp prin intermediul unui dop de cauciuc. n tub se ataeaz un strat de vat degresat la partea inferioar, un strat de Al2O3 de 4-7 cm nlime i apoi un strat de nisip. Al2O3 este uscat n prealabil n etuv, timp de 1-2 ore la 105C. Pentru a mri viteza de deplasare a soluiei prin coloan, se poate face legtura vasului de tromp la o pomp de vid sau la trompa de ap. Dozarea spectrofotometric a -carotenului s-a fcut cu ajutorul spectrofotometrului UV-VIS Double Beam PC 8 Scanning Autocell, UVD-3200, Labomed, Inc. Se citete absorbana extractului carotenoidic la 436 nm. Dac este necesar extractul carotenoidic se dilueaz astfel nct absorbana s fie cuprins n domeniul curbei etalon. Concentraia n -caroten (Cx) a probelor de analizat se determin prin raportarea absorbanei obinute pentru probele de analizat la o curb etalon trasat cu soluii standard de -caroten, cu concentraii cuprinse ntre 2 i 10 g/mL, preparate prin diluarea la baloane cotate de 25 mL a unor volume diferite de soluie stoc de -caroten, cu concentraia de 20 g/mL (2.5; 5; 7.5; 10; 12.5 mL). Dac este necesar extractul carotenoidic se dilueaz astfel nct absorbana lui s fie cuprins n domeniul curbei etalon.

63

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Calculul coninutului de -caroten Coninutul n mg caroten/100g produs vegetal se determin cu ajutorul relaiei:

mgcarotin = %
unde:

C x f d Vex 101 m

Cx concentraia n caroten a probelor de analizat, extras din curba etalon (g/mL); fd factorul de diluie aplicat probelor de analizat, n vederea ncadrrii absorbanei lor n domeniul curbei etalon; Vex volumul de extract obinut (mL); m masa probei analizate (g). 5.2.3.4. Determinarea coninutului de acid ascorbic din Plantago lanceolata i Plantago media Vitaminele sunt substane biologic active indispensabile n funcionarea normal a organismului uman. Acestea nu sunt sintetizate de organismul uman, cu excepia vitaminelor K si B3. Astfel c, alimentele devin principala surs de vitamine. Vitamina C (acidul ascorbic) apare n echilibru redox ca acidul dehidro- i dihidroascorbic. Ambii compui au funcie biologic, de aceea, se poate doza n oricare din cele dou forme, cu condiia ca ntregul coninut de vitamin s fie adus n form redus (dihidroascorbic) i oxidat (dehidroascobic).
HOH2C
HO

HOH2C
O

CH H O

HO-CH O H O HO

O OH

Acid dehidroascorbic

Acid dihidroascorbic

Figura 28 Acid L- ascorbic (vitamina C)

Vitamina C este rspndit n plante, dar sensibilitatea sa fa de oxigen i ali oxidani, sau fa de efectul catalitic al metalelor grele, fac din aceasta una dintre cele mai labile vitamine, cu pierderi mari la procesare.
64

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Funcia sa esenial, att n organism, ct i n alimente, const n protecia antioxidant i participarea efectiv la reglarea rH-ului mediilor biologice.

Titrarea acidului ascorbic cu 2,6 diclorfenolindofenol: Metoda de determinare se bazeaz pe oxidarea selectiv a acidului dihidroascorbic la acid dehidroascorbic cu 2,6-diclorfenolindolfenol conform reaciei:
CH2OH HO CH H OH HO Acid ascorbic (acid dihidroascorbic) Colorant oxidat (2,6 diclorfenol indofenol) O O + HO N Cl Cl O CH2OH HO CH H O O + HO H N Leucoderivat (incolor) Cl Cl OH

O O Acid dehidroascorbic

Figura 29 Reacia acidului ascorbic cu reactivul Tillmans

Reactivi: - soluie apoas de acid acetic 10% - soluie tampon cu pH 6,9-7 obinut prin amestecarea a 120mL de NaHPO 4 (9.078g ntr-un L soluie) cu 180mL soluie Na 2HPO4. 2H2O (11.786g fosfat disodic ntr-un litru solutie) - soluie etalon de acid ascorbic M/1000: 0.176g acid ascorbic anhidru masa echivalent de hidrat, se aduc la balon cotat de 1000mL cu poiuni de HCl 2% pn la dizolvarea complet (titrul etalonului este de 0.176 mg/mL) - reactiv Tillmans 2,6-diclorfenolindofenol M/1000 de titru cunoscut: n 100 mL ap distilat fierbinte se adaug 0.15g 2,6-diclorfenolindofenol, 300 mL tampon cu pH 6,9-7 i ap distilat pn la 1 L. Se las la ntuneric 24 de ore i apoi se filtreaz cantitativ ntr-un flacon. Determinarea titrului reactivului Tillmans (TT): 10mL reactiv Tillmans se titreaz cu soluie etalon de acid ascorbic M/1000 pn cnd apare coloraia roz. TT= Vetal TC etal/ 10 unde: Vetal este volumul soluiei etalon acid ascorbic oxidat de reactivul Tillmans din cei 10mL soluie luai n lucru;
65

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) TC etal = 0.000176 g/mL = 0.176 mg vit. C/mL.

Modul de lucru: ntr-un mojar se aduc cantitativ 2g produs vegetal cu 10mL de acid acetic 10%. Se tritureaz cu nisip de cuar, se filtreaz pe hrtie cantitativ i soluia limpede, adus la balon cotat de 50 mL cu ap distilat, se supune analizei. Pentru determinarea vitaminei C din filtrat se iau 2 probe a cte 10mL i se titreaz fiecare cu reactiv Tillmans M/1000, pn la culoarea roz pal ce persist 10 sec. Se noteaz volumul de titrat pentru fiecare prob i se face media determinrilor. [Florea T., 2010] Calculul coninutului de acid ascorbic: La 1mL reactiv Tillmans M/1000 corespund 0.176 mg vitamin C/mL Concentraia de vitamin C n proba de analizat va fi: Acid ascorbic[mg/100g produs vegetal] = 100 (TT.V2.Vp)/mVBC Unde : TT - titrul reactivului V2 - volumul de reactiv folosit pentru titrare Vp - cantitatea luat din balonul cotat m - grame de plata mojarat i filtrat VBC - volumul balonului cotat .

5.2.3.5. Dozarea spectrofotometric a flavonelor i polifenolilor din Plantago lanceolata i Plantago media: Metodele de lucru utilizate au fost conform standardelor internaionale - ISO 14502-1. Determinarea spectrofotometric a concentraiei de flavone, respectiv polifenoli din probele de analizat impune construirea unei curbe de calibrare pentru fiecare din aceste dou grupe de principii active, cu o substan de referin reprezentativ pentru clasa de compui. n cercetarea farmaceutic, o curb de calibrare (curb etalon) este caracterizat prin determinarea rspunsului analitic, n cazul metodei spectrofotometrice, densitate optic (A), ntr-un interval adecvat de concentraii cunoscute ale substanei de referin. Probele

66

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) necunoscute se interpoleaz apoi pe aceast curb de calibrare n vederea determinrii valorii concentraiei. Ca substan de referin pentru flavonoide s-au ales quercitina i rutina, iar pentru polifenoli acidul tanic i acidul galic.
OH O HO O Rutina Glucoza Ramnoza OH O OH HO OH O OH O Quercetina

OH OH

OH HOOC OH OH acid galic

acid tanic

Figura 29 Structura substanelor etalon folosite pentru exprimarea coninutului de polifenoli i flavonoide

Prelucrarea materialului vegetal n vederea dozrii flavonoidelor i polifenolilor 1g plant uscat, mrunit i cernut prin sita de 630m, se trateaz cu 20 mL alcool etilic 70%. Amestecul se supune ultrasonrii timp de 1 or, dup care se filtreaz. Filtratul obinut (Vex) se aduce la balon cotat de 20 mL cu alcool etilic 70%. Pentru ndeprtarea pigmenilor clorofilieni i carotenoidici, extractul etanolic se supune extraciei repetate cu eter de petrol, pn la dispariia coloraiei verzi a acestuia. Faza etanolic obinut dup extracie se utilizeaz pentru dozarea flavonoidelor i polifenolilor. [Furdui B., Dinic R., Georgescu M., 2010] Dozarea flavonoidelor prin metoda spectrofotometric

67

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Metoda se bazeaz pe formarea unui complex galben, flavone-aluminiu i citirea absorbanei acestuia la 420 nm.
OH OH OH O OH O O OH OH

OH

OH OH O

Me

Figura 30 Reacia chimic ce st la baza determinrii cantitative a flavonoidelor

Construirea curbei etalon. n cinci eprubete diferite se introduc volume diferite de soluie standard de flavonoide (0,01%) (0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5mL) se adaug, 1 mL AlCl 3 (2,5%), 2 mL de CH3COONa (10%) i etanol 70% pn la 10 mL. Dup pstrarea la temperatura camerei timp de 30 de minute, se citete absorbana la 420 nm. Se reprezint grafic E=f(c). Prepararea soluiei de analizat. La 1 mL extract etanolic se adaug, 1 mL AlCl3 (2,5%), 2 mL de CH3COONa (10%) i etanol 70% pn la 10 mL. Dup pstrarea la temperatura camerei timp de 30 de minute, se citete absorbana la 420 nm. Concentraia (Cx) probelor de analizat se determin prin raportarea absorbanei obinute pentru probele de analizat la o curb etalon trasat cu soluii standard de polifenoli (quercetin i rutin), cu concentraii cuprinse ntre 10 i 50 g/mL.

Dozarea polifenolilor prin metoda spectrofotometric cu reactiv Folin-Cioclteu Fenolii reduc, n mediu alcalin, complexul fosfo-molibdenic (4MoO3 MoO2) H3PO4 la albastru de molibden. Construirea curbei etalon. n cinci eprubete gradate se introduc volume diferite de soluie standard de polifenoli (0.01%) (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mL), se adaug 5 mL reactiv Folin-Cioclteu (1:10), 4 mL de Na2CO3 (7.5%) i se aduce la un volum de 10 mL cu ap distilat. Dup un repaos temperatura camerei de 60 de minute, se citete absorbana la 765 nm. Se reprezint grafic E=f(c).

68

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Prepararea soluiei de analizat. 1 mL extract etanolic se trateaz 5 mL reactiv FolinCioclteu (1:10) i 4 mL de Na2CO3 (7.5%). Dup pstrarea la temperatura camerei timp de 60 de minute, se citete absorbana la 765 nm. Concentraia (Cx) probelor de analizat se determin prin raportarea absorbanei obinute pentru probele de analizat la o curb etalon trasat cu soluii standard de polifenoli (acid galic i acid tanic), cu concentraii cuprinse ntre 10 i 50 g/mL. [Furdui B., Dinic R., Georgescu M., 2010] Calculul concentraiei de polifenoli i flavone exprimate n g/100 produs vegetal uscat s-a realizat dup datele din curbele de etalon folosind formula:

C x ( g/mL) f d Vex 10 4 % flavonoide(polifenoli) = (g/100 g produs vegetal) m(g)

unde: Cx concentraia de flavonoide sau polifenoli a probelor de analizat, extras din curba etalon; fd factorul de diluie aplicat probelor de analizat, n vederea ncadrrii absorbanei lor n domeniul curbei etalon; Vex volumul extractului etanolic obinut din materialul vegetal ; m grame produs vegetal supus analizei.

5.2.4. Prepararea unui sirop de ptlagin

F.R. X prevede metoda de preparare a siropurilor, care se poate aplica att n farmacie ct i n industrie, prin: dispersarea substanelor medicamentoase sau a extractelor vegetale n soluii concentrate de zahr sau n sirop simplu i completarea la masa prevzut (m/m). Dac este necesar, n farmacie, siropurile se prepar prin nclzire i se filtreaz imediat n recipiente uscate, de capacitate mic. n farmacie, prepararea siropurilor cuprinde urmtoarele etape: - cntrirea materiilor prime; - dizolvarea; - completarea la masa prevzut (m/m); - filtrarea siropului, eventual clarificarea sau decolorarea;
69

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) - condiionarea; - depozitarea. Siropurile oficinale se prepar, toate, prin dizolvarea zahrului la cald i amestecarea siropului simplu obinut cu soluia medicamentoas sau extractiv (tinctur). Se cntresc 64 g zahr (pentru 100g sirop simplu) i se dizolv n ap distilat. Se pot folosi urmtoarele metode de dizolvare a zahrului: la rece sau la cald. 1. Dizolvarea la rece se aplic n cazul n care vehiculul utilizat conine substane termolabile. Aceast metod evit: - alterarea substanelor medicamentoase; - hidroliza i caramelizarea zaharozei. Metoda prezint i o serie de dezavantaje: - timpul de dizolvare a zahrului este lung; - operaia de filtrare a siropului decurge cu vitez mic; - posibilitatea contaminrii cu microorganisme; - fermentarea siropurilor, provocat de eventualele enzime existente n vehicul (soluii extractive din plante), n cazul n care concentraia zahrului este sub 60%, ceea ce impune asocierea de conservani; - o uoar hidroliz a zahrului, care este mai pronunat la siropurile acide; - nu rezult siropuri limpezi n toate cazurile (depinde de sortul de zahr sau de vehicul utilizat). Pentru prepararea siropurilor la rece, se pot folosi urmtoarele metode: - dizolvarea zahrului per descensum; - dizolvarea zahrului prin percolare; - dizolvarea zahrului prin agitare mecanic. a. Dizolvarea per descensum, numit i dizolvarea circulant, este o metod mai veche, de preparare a siropului, n care zahrul se introduce ntr-un scule de pnz, care se suspend la suprafaa apei distilate (sau a unui vehicul). Apa dizolv treptat zahrul i n final se formeaz un strat de sirop dens, saturat, n jurul particulelor solide de zahr. Datorit forei gravitaionale, acest strat de sirop dens se deplaseaz la partea inferioar a recipientului, antrennd n micare o alt cantitate de ap n sus (care are o densitate mai mic); se creeaz astfel cureni de convecie, care dizolv
70

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) treptat tot zahrul. Dup dizolvarea ntregii cantiti de zahr, sculeul se stoarce i siropul se omogenizeaz prin agitare. Se filtreaz prin hrtie de filtru.

b. Dizolvarea prin percolare: n metoda percolrii se utilizeaz un vas de sticl cilindrico-conic, terminat cu un tub efilat i robinet, numit percolator (care se utilizeaz i pentru soluiile extractive).

Figura 31 Schema unui percolator

La partea inferioara a percolatorului se plaseaz un strat de vat, umectat cu ap distilat, deasupra se introduce zahrul sub form de cristale sau buci. Dac zahrul este pulverizat, el formeaz o mas compact, pe care apa sau alt lichid o strbat greu. n continuare, peste zahr se adaug apa distilat (sau alt vehicul); aceasta trece repede prin coloana de zahr, robinetul fiind deschis. Lichidul astfel obinut este adus din nou n percolator; se regleaz robinetul n aa fel nct debitul de curgere a siropului sa fie constant. n final, dup dizolvarea total a zahrului, percolatorul se spal cu ap distilat (i filtrul). Siropul se completeaz cu ap distilat la masa indicat i se omogenizeaz prin agitare; nu mai este necesar filtrarea. n laborator se utilizeaz aceast metod pentru prepararea a 1000 g sirop: n general se utilizeaz iniial 500-600 g ap distilat, restul servete pentru completarea la 1000 g sirop. c. Dizolvarea prin agitare const n agitarea energic a amestecului de zahr cu ap distilat sau alt vehicul, pn la dizolvarea complet ntr-un recipient nchis, care are o capacitate de dou ori mai mare ca volumul siropului. Metoda se aplic pentru prepararea unor cantiti de sirop pn la 2000 g. Dizolvarea decurge mai greu i este necesar o agitare prelungit.

71

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) 2. Dizolvarea la cald a zahrului n ap sau alt vehicul este o metod frecvent utilizat, deoarece ofer o serie de avantaje: - operaiile de dizolvare i filtrare decurg rapid; - posibilitatea de contaminare cu microorganisme i fermentarea siropului sunt mai reduse; - prin nclzirea la fierbere are loc i sterilizarea siropului; - se obin preparate clare i limpezi, prin coagularea substanelor albuminoase sau, eventual, a unor substane balast prezente n zahr, sucuri, soluii extractive etc. Dintre dezavantaje enumerm: - apariia de cristale, datorat hidrolizei zaharozei, sub aciunea cldurii, n glucoz i fructoz, zaharuri reductoare, cu solubilitate mai redus dect zaharoza i care separ. De asemenea, aceste dou oze pot favoriza alterarea siropului, prin fermentare; - posibilitatea caramelizrii zahrului. n aceast metod, zahrul se aduce, mpreun cu apa distilat sau alt vehicul, ntr-un recipient; amestecul se nclzete n baie de ap sau direct pe o surs de foc; se agit continuu, pn la dizolvarea complet a zahrului. Se prefer ca nclzirea s aib loc moderat; eventuala spum care se formeaz n timpul fierberii este ndeprtat. O parte din ap se poate evapora; n acest caz se adaug ap distilat fierbinte, pn la masa prevzut. n continuare se determin concentraia siropului; n farmacie se utilizeaz diferite mijloace: - prin introducerea unui termometru ntr-un sirop care fierbe i are concentraia corespunztoare; acesta indic temperatura de 105C; siropurile mai concentrate se dilueaz cu ap distilat la fierbere, omogeniznd i urmrind scala termometrului. - prin cntrirea la balan a siropului i compararea cu masa iniial; se completeaz tot cu ap distilat fierbinte. [Popovici I., Lupuleasa D., 2001] Mod de lucru: Pentru prepararea unui sirop de ptlagin, am realizat un macerat din frunze de ptlagina i separat un sirop simplu. Rp: Plantaginis folium Aqua destillata 5g 35g

72

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Cele 5g de frunze de ptlagin aduse la gradul de mrunire prevzut, se plaseaz pe o bucat de tifon i se trece sub un jet de ap pentru ndeprtarea impuritilor. Apoi, se introduc ntr-un pahar Berzelius i se adaug cele 35g ap distilat, se acoper paharul si se las n contact timp de 30 minute, agitnd de 5-6 ori. Lichidul obinut se decanteaz i se filtreaz prin vat. Filtratul se completeaz la masa prevzut prin splarea rezidului cu ap, fr a presa. [Farmacopeea Romn Ed. a X-a, 2011] Rp: Saccharum Aqua destillata 64g q.s. ad 100g

Siropul simplu se obine la cald prin dizolvarea zahrului prin nclzire, n ap, i se fierbe timp de 1-2 minute, agitnd continuu. O parte din ap se poate evapora; n acest caz se adaug ap distilat nclzit la 70C pn la masa prevzut, se omogenizeaz i apoi se filtreaz fierbinte. [Farmacopeea Romn Ed. a X-a, 2011] La obinerea siropului de ptlagin s-au luat 10g din extractul lichid obinut, care sau amestecat i omogenizat cu 90g sirop simplu. Determinarea densitii relative a siropului preparat: Densitatea relativ d2020 a unei substane este raportul dintre masa unui volum din acea substan la 20C i masa unui volum egal de ap la 20C. Densitatea relativ d120 a unei substane este raportul dintre masa unui volum din acea substan la 20C i masa unui volum egal de ap la 4. Masa volumetric (densitatea) 2n a unei substane este raportul masa i volumul substanei respective la 20C. Determinarea densitii relative, n funcie de precizia necesar se efectueaz cu densimetre, balana Mohr-Westphal sau cu picnometre. Tehnic de lucru: Se cntrete picnometrul gol, se umple cu ap la 20C i se cntrete din nou. Diferena dintre masa picnometrului cu ap i a picnometrului gol reprezint masa volumului de ap la 20C (m1). Picnometrul se golete, se usuc, se umple cu probade analizat adus la temperatura de 20C i se cntrete. Diferena dintre masa

73

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) picnometrului cu lichid i a picnometrului gol reprezint masa volumului de lichid la 20C (m). [Farmacopeea Romn Ed. a X-a, 2011]

Densitatea relativ a lichidului se calculeaz conform formulei:

n care: d2020 = densitatea relativ; m = masa volumului de lichid (n grame); m l = masa volumului de ap (n grame). Determinarea indicelui de refracie a siropului preparat: Prin indice de refracie fa de aer (n) se nelege raportul dintre viteza luminii n aer i viteza luminii n proba de analizat. Indicele de refracie este egal cu raportul dintre sinusul unghiului de inciden () i sinusul unghiului de refracie ().

Valoarea indicelui de refracie este n funcie de natura probei de analizat, de temperatur, de presiune i de lungimea de und a razei de lumin, iar n cazul soluiilor i de concentraia soluiei i de natura solventului. Determinarea indicelui de refracie se efectueaz cu ajutorul refractometrului. Prile principale ale unui refractometru sunt: dou prisme (ntre care se aduce lichidul de analizat), ocularul i scala cu diviziuni. n general refractometrul folosete lumina obinuit, ns fiind prevzut cu un compensator pentru lumina alb, citirea corespunde indicelui de refracie pentru lungimea de und a solidului.

74

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Etalonarea aparatului trebuieefectuat periodic cu ajutorul unor substane cu indice de refracie constant, exact stabilit (de exemplu monobrom-naftalina, cu indicede refracie 1,6588 la 20C sau cu ajutorul apei distilate, cu indice de refracie 1,3330 la 20C). Tehnica de lucru: Cteva picturi din lichidul de analizat se aduc ntre prismele refractometrului. n cmpul vizual al ocularului se observ dou zone, delimitate ntre ele: una luminoas i cealalt ntunecat. Limita dintre zona luminoas i cea ntunecat se aduce exact la punctul de ncruciare al firelor reticulare. Pe scala aparatului se citete direct valoarea indicelui de refracie raportat la lungimea de und D a solidului.[Farmacopeea Romn Ed. a X-a, 2011]

5.3. Rezultate i discuii

5.3.1. Rezultate privind analiza calitii materiei prime 5.3.1.1. Examen macroscopic Prin acest examen, care reprezint primul stadiu de investigare se urmrete stabilirea caracterelor morfologice ale speciei sau organului vegetal aflat n studiu. Forma frunzelor, variaz de la o specie la alta, fiind oval-eliptice la Plantago media i eliptic lanceolate, cu vrf ascuit la Plantago lanceolata. Marginea limbului poate fi uor sinuat la Plantago lanceolata sau ciliat la Plantago media. Limbul se prelungete la baz ntr-un peiol lung i n form de jgheab, lung i subire la Plantago lanceolata, scurt i lit la baz la Plantago media. Frunzele pot fi acoperite cu peri mtsoi, mai ales spre peiol la Plantago

lanceolata sau peri mici i dei pe ambele fee la Plantago media. Prezint numeroase nervuri i prin rupere, n dreptul nervurilor apar fire albicioase la ambele specii. Dimensiunile sunt cuprinse ntre 10-12 cm lungime i 3-4 cm lime la Plantago media, 10-30 cm lungime i 2-2.5 cm lime la Plantago lanceolata. Culoarea variaz de la verde la verde-brun. Gustul este amrui, uor astringent.

75

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Nu prezint miros. Examenul macroscopic confirm caracterele descrise n literatura de specialitate pentru cele dou specii de ptlagin. Pentru verificarea identitii speciei ct i pentru evidenierea prezenei unor grupe de compui bioactivi este necesar completarea acestor rezultate cu elemente puse n eviden de examenul microscopic pentru produsele vegetale luate n studiu, pe preparate microscopice adecvate (seciuni transversale sau pulberi). 5.3.1.2. Examen microscopic Acest examen reprezint o faz mai avansat a analizei n vederea stabilirii identitii urmrind stabilirea elementelor anatomice caracteristice ale seciunilor prin produsul vegetal. Seciunea transversal, prin frunz [figura 32; figura 33], se caracterizeaz la ambele specii prin structur heterogen asimetric avnd palisada alctuit din doua-trei rnduri de celule, mult mai dezvoltate la Plantago media, prezente ntre epiderm i esutul conductor. Fascicul libero-lemnos este de tip colateral protejat de un periciclu colenchimatos dezvoltat mai mult la Plantago media. Sunt prezeni peri glandulari, mai frecveni pe epiderma superioar i perii tectori.

Figura 32 Seciune transversal prin frunza de Plantago media

Figura 33 Seciune transversal prin frunza de Plantago lanceolata

La Plantago media perii tectori sunt pluricelulari, sclerificai, viguroi i se ntlnesc pe ambele epiderme. Perii glandulari au piciorul monocelular, scurt i glanda pluricelular. La Plantago lanceolata perii tectori sunt pluricelulari, cu celul bazal scurt,

puternic ngroat i cananiculat, noduroi la locul de articulare a celulelor (baza lor este

76

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) bifurcat). Perii glandulari au piciorul monocelular, scurt i glanda pluricelular, n form de tor. Aparatul stomatic este de tip anomocitic, specific familiei din care fac parte ambele specii, unde stomata este nconjurat de un numr variabil de celule nedifereniate. [Figura 34; Figura 35].

Figura 34 Epiderma inferioar Plantago media

Figura 35 Epiderma inferioara Plantago laceolata

5.3.1.3. Examen histochimic Controlul microscopic al produselor vegetale poate fi nsoit de un constitueni chimici din celule, n vederea identificrii produselor vegetale. Pulberea studiat la microscopul optic dup o prealabil clarificare i tratare cu reactivi specifici fiecrei grupe de constitueni chimici pune n eviden colorarea selectiv a esuturilor ct i existena unor grupe de compui biologic activi. Sulfatul de anilin coloreaz n galben esuturile lignificate [Figura 36A], sudanul III coloreaz n rou sau portocaliu uleiul volatil, picturile de ulei gras, rezinele, membranele cutinizate i ceroase, latexul [Figura 36B], alaunul de fer (III) i amoniu dau precipitate sau coloraii cu taninurile sau compuii fenolici [Figura 36C], mucilagiile i gumele din esuturi se identific datorit aspectului sidefos sau sticlos conservat n alcool i glicerin [Figura 36 D], iar cristalele de sulfat de calciu, datorit ionilor sulfat din reactiv. [Figura 36A]. control

histochimic, prin care se evideniaz la microscop, n urma unor reacii de culoare, anumii

77

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

A - Coloraie sulfat de anilina

B - Coloraie sudan III

C - Coloraie alaunul de fer (III) i amoniu

D impregnare cu alcool i glicerin

Figura 36 Pulbere de ptlagin impregnat cu diferii reactivi

Colorarea acestora.

selectiv

a esuturilor

ne permite o orientare n

vederea stabilirii

prezenei grupelor de compui biologic activi din speciile studiate i analiza ulterioar a

5.3.2. Rezultate privind examenul chimic general

5.3.2.1. Identificarea compuilor bioactivi 1. Reacii de identificare n urma analizei chimice generale, realizat pentru fiecare specie de Plantago n parte, pe soluiile extractive apoas (soluia A), eteric (soluia B) i alcoolic (soluia C) s-au obinut urmtoarele rezultate, prezentate n tabelul I.

78

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)
Tabelul I Rezultatele analizei chimice generale pe cele dou specii de Plantago

Identificare 1. Identificarea aucubozidei (reacia Charaux)

Mod de lucru 1mL sol. A + 2 mL amestec etanol glicerin + 3 pic HCl conc (R) agitare uoar i se menine 3 n baie de ap col albastr sau verdealbastr 1 mL sol. A + 0,05g pepton,se agit pentru dizolv. + 1-1.5 mL H2SO4 conc (R), repaus 3-4 ore inel violet care difuzeaz n stratul superior 3mL sol. B + 5mL cloroform + 5mL H2SO4 conc la limita de separare apare un inel violet iar soluia

Plantago lanceolata

Plantago media

2. Identificarea alantoinei (reacia Adamkiewicz Hopkins Cole) 3. Identificarea sterolilor

4.Identificarea carotenoizilor prin reacia Winterstein 5. Identificarea taninurilor (reacia cu FeCl3)

cloroformic se coloreaz n verde 1mL sol. B + 2 pic H2SO4 conc coloraie verde albstruie. 1 mL sol. B + 1 mL H2O + 1-2 pic FeCl3 1% verde-brun (tanin mixt)

6. Identificarea polifenolilor cu clorur feric - cu reactivul Folin Cioclteu

1mL sol. C + 1mL ap + 2 pic FeCl3 apare coloraia albastr 1mL sol. C + 3-4 pic reactiv + 1mL sol. Na2CO3 20% coloraie albastr . 1mL sol. C + 3 pic sol Fehling 1+2, se menine n baia de ap la 80C precipitat rou-crmiziu care se sedimenteaz n timp. 3-4 mL sol.C + 1-2 fragm. Mg metalic + 0,5 mL HCl conc coloraiei

- cu reactivul Fehling

7. Identificarea flavonelor - reacia cianidolului (Shibata) chelatarea cu sruri

portocalie n 5. ale 1mL sol. C + 0,5 mL + CH3COONa + 1 mL AlCl3 2,5% coloraie galben care se intensific 2 mL sol. C + 5 mL metanol repaos 79

metalelor bi i trivalente 8. Identificarea

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)
poliholozidelor mixte 10-15 precipitat alb-floconos + 2-3 pic hematoxilin violet .

Identificarea prezenei mai multor grupe de principii active n frunzele speciilor de Plantago, susine interesul terapeutic al plantelor din aceste specii.

2. Metode cromatografice de separare i identificare n urma aplicrii metodei de cromatografiere pe strat subire, s-a realizat

identificarea prezenei unor compui iridoidici, n particular evideniindu-se prezena aucubinei, n compoziia celor dou specii de Plantago, investigate. Astfel prin cromatografierea extractului preparat din Plantaginis folium pe plcu cu silicagel G, folosind ca sistem de elueni amestecul n-propanol:toluen:acid acetic:ap (2,5:2:1:1 v/v), iar pentru revelare o soluie de benzidin, s-a obinut cromatograma din figura 37.

Figura 37 CSS iridoide

Se poate constata apariia, dup pulverizarea cu benzidin, a unui spot rou-brun, Rf 0.35, corespunztor aucubinei. Se poate remarca de asemenea, apariia unor spoturi galbene i respectiv a spotului brun de la frontul de solveni.. Atribuirea spoturilor s-a fcut n conformitate cu datele din literatur. [Ciulei I, Istudor V. , 1995]

80

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) 5.3.3. Rezultate privind dozarea compuilor bioactivi 5.3.3.1. Analiza coninutului n poliholozide din Plantago lanceolata i Plantago media Rezultatele obinute la determinarea factorului de mbibare, urmat apoi de determinarea gravimetric a poliholozidelor (mucilagiilor) din cele dou specii din genul Plantago analizate, sunt prezentate n tabelul II.
Tabelul II Coninutul n poliholozide al frunzelor recoltate de la cele dou specii de Plantago

Specia Metoda Factorul de mbibare (F..) (Volum, mL/g) Coninutul (g poliholozide/100 g plant uscat)

Plantago lanceolata

Plantago media

15 16

14-15

6.13

5.5

Indicii asupra coninutului n poliholozide se obine convenional i cu ajutorul factorului de mbibare (F. .). Rezultatele obinute n cazul speciei Plantago lanceolata F. . = 14 15, n cazul speciei Plantago media F.. = 15-16, indic prezena unor cantiti ridicate de mucilagii n frunzele speciei. FR X prevede pentru produsele vegetale valori de cel puin 10-15 funcie de organ (Althaeae folium cel puin 10, Tiliae flores cel puin 15), ceea ce denot c produsele vegetale studiate se afl spre limita superioar a coninutului n mucilagii. Acest fapt este confirmat i de rezultatele determinrii gravimetrice care arat un coninut n poliholozide de 6,13% pentru Plantago lanceolata i de 5,5% pentru Plantago media.

5.3.3.2. Dozarea coninutului de pigmeni clorofilieni din Plantago lanceolata i Plantago media

81

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Conform metodei menionate anterior [5.2.3.2] au fost extrai i dozai spectrofotometric media. Pentru prepararea extractelor s-a lucrat cu cte 1 g plant uscat din ambele specii, citirile extinciilor la cele dou lungimi de und (660 nm i 642 nm) realizndu-se pe seturi de cte 3 probe din extractele respective, diluate corespunztor pentru obinerea unor valori optime ale absorbanelor. Calculul coninutului de clorofile n mg/L s-a realizat folosind o medie a extinciilor citite la cele dou lungimi de und. Pentru calculul concentraiei de clorofile n mg/100 g plant, se ine cont de volumul de extract acetonic obinut din materialul vegetal i de poriunea din filtrat supus extraciei cu eter. Rezultatele obinute pentru cele dou plante analizate sunt prezentate n Tabelul III. pigmenii clorofilieni, exprimndu-se coninutul n clorofil total, clorofila a i clorofila b din cele dou specii de ptlagin, Plantago lanceolata i Plantago

Tabelul III Dozarea coninutului de pigmeni clorofilieni din cele dou specii de Plantago

Proba Vex (mL) A660 A642

Plantago lanceolata 17 0.698 0.304

Plantago media 33 0.722 0.337

82

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)
Clorofila total (mg/L) Clorofila a (mg/L) Clorofila b (mg/L) Clorofila total (mg/100g plant) Clorofila a (mg/100g plant) Clorofila b (mg/100g plant) 382.88 390.24 669.49 690.75 10.0769 6.6949 3.8288 1007.69 10.8022 6.9075 3.9024 1080.22

Analiza comparativ a coninutului de pigmeni clorofilieni din cele dou specii de ptlagin arat c ambele specii conin o cantitate mare de pigmeni clorofilieni, asemntoare din punct de vedere cantitativ pentru cele dou specii. Se remarc de asemenea, un coninut mai ridicat de clorofil a, fa de clorofila b, n ambele specii de plante studiate 5.3.3.3. Extracia i dozarea spectrofotometric a -carotenului din Plantago lanceolata i Plantago media Conform procedurii experimentale descrise anterior [5.2.3.3] extractele carotenoidice din cele dou specii de ptlagin analizate s-au obinut plecnd de la 1g produs vegetal mrunit. Pentru citirea absorbanelor la dozarea spectrofotometric, extractele au fost diluate n raport 1:10, n vederea obinerii unei valori optime a absorbanei, la lungimea de und utilizat (436 nm), care s se ncadreze n domeniul dreptei de regresie trasat cu soluiile etalon de -caroten. [Figura 38] Rezultatele experimentale obinute i cele calculate sunt prezentate n tabelul IV.
Tabelul IV Dozarea coninutului de -caroten din Plantago lanceolata i Plantago media

Proba

Et1

Et2

Et3

Et4

Et5

Plantago lanceolata

Plantago media

Absorbana (= 436 nm) Concentraia -caroten

0.021

0.053

0.075

0.096

0.117

0.142 (fd = 1:10)

0.061 (fd= 1:10)

6 83

10

11.8728

5.0423

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)
(g/mL) Vex (mL) mg -caroten % 17 201.837 22 110.930

Dreapta de regresie a -carotenului are ecuaia y = 0,0118x + 0,0019, unde y este absorbana i x concentraia de caroten (g/ml). Curba de calibrare are o bun liniaritate cu un coeficient de regresie R2 = 0,9913. Cu ajutorul ecuaiei dreptei de regresie, s-au calculat concentraiile de -caroten din probele analizate, pentru specia Plantago lanceolata fiind necesar o extrapolare.

Figura 38 Graficul curbei de calibrare pentru determinarea spectrofotometric a coninutului de -caroten din specii de ptlagin

Din rezultatele obinute se poate observa c specia Plantago lanceolata (ptlagina ngust) are un coninut mai bogat n -caroten dect specia Plantago media (ptlagina moale).

5.3.3.4. Analiza coninutului de acid ascorbic din speciile Plantago lanceolata i Plantago media Dozarea coninutului de vitamina C din cele dou specii de ptlagin analizate s-a realizat prin metoda titrrii cu 2,6-diclorfenolindofenol descris n subcapitolul 5.2.3.4. Extracia vitaminei C s-a realizat folosind cte 2 grame de produs vegetal din cele dou specii de plante, pentru fiecare extract obinut realizndu-se ulterior cte 3 titrri cu
84

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) reactiv Tillmans. Media volumelor de reactiv merse la titrare (V2) a fost folosit pentru calcularea coninutului de vitamin C. Pentru determinarea titrului reactivului Tillmans la titrarea efectuat cu acid ascorbic etalon, s-au folosit 9 mL soluie de acid ascorbic etalon cu TCet=0.176 mg vit. C/mL. Prin urmare titrul soluiei de reactiv Tillmans utilizat a fost de TT= 0.15 mg/mL. Rezultatele experimentale obinute pentru determinarea coninutului de vitamin C din extractele vegetale sunt consemnate n Tabelul V.
Tabelul V Cantitatea de acid ascorbic din plantele de ptlagin

Proba Volumul mediu de reactiv Tillmans (V2, mL) Acid ascorbic (mg/100g produs)

Plantago lanceolata

Plantago media

60

45

5.3.3.5. Analiza cantitativ a flavonelor i a polifenolilor totali Dozarea coninutului de flavonoide i polifenoli totali prezeni n speciile de Plantago lanceolata i Plantago media s-a realizat folosind metodele spectrofotometrice consemnate n subcapitolul 5.2.3.5. Dozarea s-a realizat folosind extractele hidroalcoolice obinute din 1g produs vegetal, din specia Plantago lanceolata obinndu-se un volum de 17mL extract, iar din specia Plantago media obinndu-se 20mL extract. Calculul concentraiei de flavonoide i polifenoli totale s-a realizat cu ajutorul dreptelor de regresie prezentate n figurile 39-42, coninutul total de flavonoide exprimnduse n echivaleni de quercetin sau rutin n g/100g produs vegetal uscat, iar coninutul total de polifenoli exprimndu-se n echivaleni de acid galic sau tanic n g/100g produs vegetal uscat.
85

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Datele experimentale i calculate obinute sunt consemnate n tabelele VI-IX. Din graficele prezentate se observ c dreptele de regresie trasate pentru toate substanele etalon folosite au prezentat un grad de liniaritate foarte bune, cu coeficieni de regresie R2 ntre 0.97-0.99.

Tabelul VI Dozarea coninutului de flavonoide folosind ca substan standard quercetina

Proba Reactivi Soluie standard de quercetin 0.01mg/100mL (mL) Extract etanolic din Plantago (mL) Acetat de sodiu 10% (mL) Clorura de aluminiu 2.5% (mL) Etanol 70% (mL)

Et1 0.1

Et2 0.2

Et3 0.3

Et4 0.4

Et5 0.5

Plantago lanceolata -

Plantago media -

2 1 6.9

2 1 6.8

2 1 6.7

2 1 6.6

2 1 6.5

1 2 1 6

1 2 1 6

Agitare, repaus 30 minute

86

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)
Citire (= 420 nm), absorbana Concentraia quercetin(g/mL) % quercetin (g/100g plant) 0.113 10 0.191 20 0.284 30 0.316 40 0.450 50 0.274 (fd = 1:3) 30.37 0.154 0.343 (fd =1:2 ) 39 0.156

Figura 39 Curba de etalonare pentru determinarea coninutului de flavonoide exprimat n quercetin

Tabelul VII Dozarea coninutului de flavonoide folosind ca substan standard rutina

Proba Reactivi Soluie standard de rutin 0.01mg/100mL (mL) Extract etanolic din Plantago (mL) Acetat de sodiu 10% (mL) Clorura de aluminiu 2.5% (mL) Etanol 70% (mL)

Et1

Et2

Et3

Et4

Et5

Plantago lanceolata 1 2 1 6

Plantago media 1 2 1 6

0.1 2 1 6.9

0.2 2 1 6.8

0.3 2 1 6.7

0.4 2 1 6.6

0.5 2 1 6.5

Agitare, repaus 30 minute

87

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)
Citire (= 420 nm), extincia Concentraia rutin (g/mL) % rutin (g/100g plant) 0.274 (fd = 1:3) 43.063 0.343 (fd =1:2 ) 54.015

0.065 10

0.127 20

0.198 30

0.256 40

0.317 50

0.219

0.216

Figura 40 Curba de etalonare pentru determinarea coninutului de flavonoide exprimat n rutin

Tabelul VIII Dozarea coninutului de polifenoli folosind ca substan standard acidul galic

Proba Reactivi Soluie standard de acid galic 0.01mg/100mL (mL) Extract etanolic din Plantago (mL) Reactiv Folin-Cioclteu 1:10 (mL) Na2CO3 7.5% (mL) H2O dist. (mL)

Et1

Et2

Et3

Et4

Et5

Plantago lanceolata -

Plantago media -

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

5 4 0.9

5 4 0.8

5 4 0.7

5 4 0.6

5 4 0.5

1 5 4 -

1 5 4 -

Agitare, repaus 60minute Citire (= 765 nm), extincia 0.167 0.260 0.331 0.415 0.498 0.189 (fd = 1:4) 0.416 (fd =1:2)

88

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)
Concentraia acid galic (g/mL) % acid galic (g/100g plant)

10

20

30

40

50

12.182 0.082

39.865 0.159

Figura 41 Curba de etalonare pentru determinarea coninutului de polifenoli exprimat n acid galic Tabelul IX Dozarea coninutului de polifenoli folosind ca substan standard acidul tanic

Proba Reactivi Soluie standard de acid tanic 0.01mg/100mL (mL) Extract etanolic din Plantago (mL) Reactiv Folin-Cioclteu 1:10 (mL) Na2CO3 7.5% (mL) H2O dist. (mL)

Et1

Et2

Et3

Et4

Et5

Plantago lanceolata -

Plantago media -

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

5 4 0.9

5 4 0.8

5 4 0.7

5 4 0.6

5 4 0.5

1 5 4 -

1 5 4 -

Agitare, repaus 60minute Citire (= 765 nm), extincia Concentraia acid tanic 0.145 10 0.203 20 0.265 30 89 0.320 40 0.373 50 0.189 (fd = 1:4) 17.491 0.416 (fd =1:2 ) 57.315

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)
(g/mL) % acid tanic (g/100g plant) 0.118 0.229

Figura 42 Curba de etalonare pentru determinarea coninutului de polifenoli exprimat n acid tanic

Datele obinute arat prezena n plantele genului Plantago a unor concentraii de flavonoide ntre 0.154-0.156 g quercetin/100 g plant i 0.216-0.219 g rutin/100 g plant, respectiv a unor concentraii de polifenoli ntre 0.082-0.159 g acid galic/100 g plant i 0.118-0.229 g acid tanic/100 g plant. Rezultatele obinute dovedesc coninutul destul de ridicat de polifenoli i flavonoide n frunzele speciilor de Plantago studiate, ceea ce explic proprietile terapeutice ale plantelor respective. Coninutul de flavonoide i polifenoli exprimat n rutin i acid tanic este mai mare dect cel exprimat n quercetin i acid galic datorit faptului c extractele vegetale nu au fost supuse unei hidrolize prealabile S-a constat, de asemenea, un coninut asemntor n polifenoli i flavonoide n cele dou specii de Plantago studiate.

5.3.3. Caracterizarea preparatului obinut

90

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Am optat pentru realizarea extractului prin aceast metod, macerare, deoarece FR X indic utilizarea acestei metode n cazul produselor vegetale care conin principii active uor alterabile la cldur. Metoda se aplic produselor vegetale care conin mucilagii pentru a evita extragerea substanelor balast i obinerea unor soluii vscoase. Prin metoda indicat [5.2.4] s-a obinut un sirop limpede, vscos, slab opalescent, gust dulce i miros slab caracteristic. Are o densitate relativ d2020 = 1,294, un indice de refracie nD 20 = 1,4295 i o concentraie n zahr = 54,5

Figura 43 Aspectul siropului preparat

Deoarece siropul obinut are o concentraie n zahr de 54,5, deci o concentraie mai mic fa de cea a siropului simplu, FR X prevede adugarea de conservani antimicrobieni (1,5% amestecde p-hidroxibenzoat de metil i p-hidroxibenzoat de n-propil, n proporie de 9:1), sau ali conservani potrivii care trebuie menionai pe etichet. Posibilele aciuni ale siropul, realizat pin amestecarea frunzelor celor dou specii de ptlagina, pot fi: expectorant i mucolitic (datorit coninutului n mucilagii), antiinflamator, antibacterian (datorut aucubozidei), spasmolitic. Datorit aciunilor imprimate de principiile active coninute n plant, siropul de ptlagin este utilizat tradiional ca adjuvant n tuse, gripe, alergii, astm bronic, laringit, ulcer gastro-intestinal.

91

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen)

CONCLUZII
Lucrarea de licen intitulat Caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutic a unor specii din genul Plantago a avut ca principal scop caracterizarea botanic i fitochimic a dou lor farmaceutice. Lucrarea cuprinde 2 pri, o parte teoretic i una experimental, de cercetare. n partea teoretic a lucrrii au fost prezentate noiuni generale i particulare legate de caracteristicile botanice, compoziia chimic, date farmacologice i utilizri terapeutice ale plantelor medicinale din specia Plantago, precum i noiuni legate de tehnologia obinerii preparatelor farmaceutice de tip siropuri. n partea experimental s-a realizat studiul botanic, macroscopic, microscopic i histochimic, alturi de examenul fitochimic general al celor dou specii de ptlagin investigate precum i utilizarea lor la obinerea unui preparat farmaceutic de tip sirop.
92

specii de plante aparinnd genului Plantago, Plantago

lanceolata (ptlagin ngust) i Plantago media (ptlagin moale) n corelaie cu utilizrile

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) Examenul macroscopic i microscopic al organelor vegetale a stabilit identitatea

speciilor i poziia taxonomic, iar prin examenul histochimic al pulberilor vegetale s-a evideniat prezena unor grupe de produi bioactivi n plantele investigate de noi. n cadrul examenului fitochimic general s-a realizat identificarea, prin reacii de culoare specifice i cromatografie, a prezenei unor compui bioactivi generali sau specifici acestor specii de plante medicinale (iridoide, alantoin, poliholozide, pigmeni clorofilieni i carotenoidici, terpenoide, compui polifenolici, flavonoide, vitamine, fitosteroli) precum i dozarea prin metode spectrofotometrice, gravimetrice i volumetrice a ctorva din reprezentanii acestor categorii de compui, cum ar fi poliholozidele, pigmenii clorofilieni, -carotenul, vitamina C sau coninutul de polifenoli i flavonoide. Rezultatele obinute confirm complexitatea compoziiei speciilor cercetate din genul Plantago i susin efectele terapeutice ale acestora. Ca aplicaie farmaceutic a plantelor studiate s-a realizat prepararea, cu bune rezultate, a unui sirop coninnd extract de ptlagin (Plantaginis folium), un amestec ntre cele dou specii, cu posibile aciuni: expectorant, mucolitic, antiinflamator, antibacterian, spasmolitic.

BIBLIOGRAFIE

1. Avram R., Andronescu Ecaterina, Fusi I. - Botanic Farmaceutic - Ed. Didactic i Pedagogic, Bucureti, 1981; 2. Ardelean A., Mohan G. - Flora medicinal a Romniei - Editura ALL Bucureti, . 2008; 3. Balaban A., Banciu M., Pogany I. - Aplicaii ale metodelor fizice i chimice n chimia organic - Ed. tiinific i Enciclopedic, Bucureti, 1983; 4. Balandrin MJ, Klocke JA - Medicinal aromatic and industrial materials from plants, Springer Verlag - Berlin, Heidelberg,, 1988; 5. Bucur L. Plante cu potenial terapeutic din flora Dobrogean. Contribuii la studiul speciei Elaeagnus angustifolia L. Rezumatul tezei de doctorat - UMF Carol Davila Bucureti, 2007;

93

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) 6. Chis E.J. - Chimie i biochimie vegetal - Universitatea Braov, 1991; 7. Ciulei I, Grigorescu E, Stnescu U - Plante medicinale, fitochimie i fitoterapie - Ed. Medical, Bucureti, 1993; 8. Ciulei I, Istudor V. - Analiza Farmacognostic i fitochimic a produselor vegetale Editura Tehnoplast, Bucureti, 1995; 9. Crc, Geta - Chimie analitic Instrumente i principii de analiz, Editura Fundaiei Universitare Dunrea de jos, Galai , 2005; 10. Ciocrlan V. - Flora ilustrata a Romniei - Ediia a doua revzut i adugit, Editura Ceres Bucureti, 2000; 11. Coiciu Evdochia, Racz,G. - Plante medicinale i aromatice - Editura Academiei RPR, 1962; 12. Cercasov C, E. Oprea, Popa C-V - Compui naturali cu aciune terapeutic - Ed. Universitii din Bucureti, 2009; 13. Dinu V., Trutia Eug., Popa Cristea E., Popescu A.- Biochimie medical, Editura Medical Bucureti, 1996; 14. Doni N., Ivan D., Coldea Ghe., Sanda V., Popescu A., Chifu Th., Mihaela PaucaComnescu, Mititelu D. - Vegetaia Romniei - Ed. Tehnic Agricol Bucureti, 1992; 15. Florea T. Lucrri practice de chimia alimentelor - Editura Academica, 2010; 16. Florea T., Furdui B., Dinic R., Creu R. - Chimie organic. Sintez i analiz funcional - Editura Academic Galai, 2009; 17. Furdui B., Dinica R., Georgescu M. Chimie organic. Noiuni teoretice i practice Editura Galai University Press, 2010; 18. Grigorescu E, Lazr MI, Stnescu UH, Ciulei I. - Index fitoterapeutic - Ed. Cantes, Iai, 2001; 19. Ghiuru E. - Lucrri practice de botanic farmaceutic - Ed. Gr. T. Popa, Iai, 1997; 20. Grigorescu E.,Silva Felix - De la etnomedicin la fitoterapie - Ed. Spiru Haret Iai, 1997 21. Horea Iustin NACU, Lorentz JNTSCHI - Chimie Analitic i Instrumental Academic Pres &AcademicDirect, 2006.

94

Adina Zaharia Obinerea, caracterizarea principiilor active i utilizarea terapeutica a unor specii din genul Plantago (lucrare de licen) 22. Iovu M. - Chimie organic - Ed. Didactic i Pedagogic, Bucureti, 1999; 23. Istudor V. - Farmacognozie. Fitochimie. Fitoterapie, vol I i II - Ed. Medical Bucureti, 2001; 24. Jercan E. Analiza cromatografic Ed. Academiei, Bucureti, 1982; 25. Mohan, G. - Atlasul plantelor medicinale din Romnia Ed.Corint Press, Bucureti, 2001; 26. Neamu G., Ionela Popescu, t. Lazr, I. Burnea, I. Brad, Gh. Cmpeanu, T. Galben Chimie i biochimie vegetal - Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti, 1983; 27. Oroian Silvia - Botanic Farmaceutic - Ed. Tipomur, 2000; 28. Prvu C - Universul plantelor; Mica enciclopedie ediia a IV-a - Editura ASAB, Bucureti, 2006; 29. Popovici I., Lupuleasa D. Tehnologie farmaceutic, vol I Ed. Polimorf, Iai, 2001; 30. Rice-Evan, C. A., & Packer, L., 2003 - Flavonoids in Health and Disease, New York: Marcel Dekker Inc

31. Stnescu U, Miron A, Aprotosoaie C Bazele farmaceutice, farmacologice i clinice ale fitoterapiei - Ed. Gr. T. Iai, 2002; 32. Stnescu U., Hncianu M., Miron A., Aprotosoaie C. Plante medicinale de la A la Z, vol. II - Editura Gr. T. Popa, U.M.F. Iai, 2004; 33. Temelie Mihaela - Enciclopedia plantelor medicinale cultivate din Romania, 2009; 34. Tutunaru Dana - Biochimie medical - Editua Europlus, Galati 2007; 35. Vasilca-Mozceni A. - Ghidul plantelor medicinale - Ed. Polirom, Iai, 2003; 36. Zaharia Adina, Bnic Roxana - Studiul compuilor bioactivi a unor specii din genurile Artemisia i Plantago, Sesiune tiinific Galai, Mai 2012. *** Farmacopeea Romn Ed. a X-a, Editura Medical, Bucureti, 2011; *** www. wikipedia.com.

95