MICROREACTOARE ENZIMATICE

1. Introducere
Microreactoare sunt n general definite ca sisteme de reacie miniaturizate fabricate prin
utilizarea, cel puin parial, prin metode de microtehnologie i inginerie de precizie.Termenul
"microreactor" este numele propus pentru o gam larg de dispozitive cu dimensiuni mici, i o
divizie viitoare n funcie de mrime n nano, micro i minireactorare. Majoritatea dispozitivelor
construite n prezent pot s profite de microfluide i nanofluide, care permite utilizarea unor volume
mici de specii reactive i asigur o eficien ridicat, precum i repetabilitatea proceselor
biocatalitice. Microreactoarele sunt folosite n sinteza organic. Un exemplu de aplicare in
biotehnologie este sinteza rapidade peptide sintetice.
Principalele beneficii ale aplicrii microreactoarelor n industrie sunt:
- transfer mai rapid al rezultatelor muncii de dezvoltare n producie
- producie la costuri mai mici
- capacitate de producie
- costuri mai mici pentru transport
- materiale i energie
- rspuns mai flexibil la cerinele pieei.
Dei majoritatea lucrrilordescriu microreactoarele ca componente ale dispozitivelor de
microfluidic, acest termen este folosit n contextul sistemelor auto-organizate, cum ar fi micelii ,
lipozomi i microemulsii.
Sistemele de analiz care cuprind microreactoare se ateapt s fie caracterizate prin
repetabilitate deosebite i reproductibilitatea. Posibilitatea de a efectua analize similare n paralel
este o caracteristic atractiv. Microreactoarele au fost integrate n sistemele analitice automatizate
precum i de acordarea de beneficii de automatizare ;aceste sisteme elimin, de asemenea erori
asociate cu protocoale manuale.. Metodele de injectare a fluidelor n microcanale dar i conectarea
si interfaarea microreactoarelor cu alte componente ale sistemului, sunt de asemenea mbuntite.
Aceasta ar trebui s contribuie la eliminarea oricror obstacole rmase n preluarea mai larg a
tehnologiei .
Microreactoare enzimatice au fost dezvoltate pentru a facilita munca de rutin n analize
biochimice, precum i, de asemenea, au aplicaii n biocataliza. O cheltuial redus a enzimei este
adesea un rezultat de imobilizare sale. Cu toate acestea, intervalul de enzime disponibile cu
caracteristici satisfctoare este nc limitat . Urmtoarele enzime sunt folosite pe scar industrial:
izomeraza de glucoza, h-galactozidaza, penicilin ,d-aminoacid oxidaza, glutaril amidaz,
termolizina, nitrilaz.
Microreactoare enzimatice au fost folosite pentru aplicaii analitice drept componente ale
sistemelor integrate, adesea denumite lab-on-a-chip. Dei primele microreactoare enzimatice au fost
construite n anii 1970 i 1980, creterea n aplicaiile lor practice dateaz de la sfritul anilor 1990.
Exemple de microreactoare enzimatice au fost incluse n prima carte cuprinzatoare privind
microreactoare publicat n 2000.
Este util s mpart cererile analitice ale microreactoare enzimatice n dou clase. n primul
rnd, cele care folosesc biocataliza, n scopul de a transforma un analit dificil de msurat ntr-o
form uor msurabile. n al doilea rnd, microreactoare proiectate pentru screening-ul de
substraturi, enzime si de a examina caracteristicile lor cinetice. Prima categorie este exemplificat
prin numrul mare de microsisteme concepute pentru digestia proteinelor pentru a le converti in
peptide msurate. Un alt exemplu este oxidarea glucozei de ctre glucoz oxidaz, urmat de
msurarea chemiluminescen de luminol oxidat de peroxidul de hidrogen, format n reacia primar
. A doua categorie este exemplificat prin munc prezentat de Seong et al. (2003) pentru a msura
cantitativ cinetica enzimei ntr-un sistem microfluidic cu flux continuu.

2. Aplicatii ale microreactoarelor enzimatice

Realizrile n sistemele chimice i biochimice nainte de 2000 au fost evideniate de ctre
Haswell i Skelton (2000). Evoluia reactoarelor enzimatice au fost discutate de Krenkova'andForet
(2004). Girelli i Mattei (2005) au trecut n revist recent aplicaiile de reactoare de enzim
imobilizat n cromatografie lichid de nalt performan: cea mai mare parte a reactoarelor
construite folosc enzime legate covalent la suport . Gruprile funcionale implicate n legarea erau
amino, epoxyl, carboxil, diol i fenolic. Exemplele au fost date de reacii catalizate de enzime
efectuate nainte sau dup separarea pe coloan, precum i n coloan.

2.1 Analiza speciilor chimice

Aceast seciune ncepe cu acoperire a tipurilor de microreactoare utilizate, cu clasificarea n
biocataliza omogen i eterogen. Toate exemplele de aplicare cu succes a microreactoarelor
enzimatice cu enzime imobilizate prezentate n aceast analiz poate fi clasificate n urmtoarele
grupe: (i) analiza proteinelor, (ii) analiza acizilor nucleici, i (iii) sisteme de model enzimatice.
Subcapitolele separate descriu fiecare la rndul su.

2.1.1Biocataliza omogene i eterogene

Microreactoare poate utiliza o enzim imobilizat, sau soluia sa poate fi injectat n zona de
reacie; cele dou abordri cuprind biocataliza eterogen i omogen. Majoritatea cererilor publicate
se refer la utilizarea de enzime imobilizate. Un exemplu de biocataliza omogena la microscar este
microanaliza electroforetic mediata (EMMA), descris pentru prima dat de Bao i Regnier (1992) i
mai trziu denumit EMMA , care face uz de mobilitatea diferit a unei enzime i substratul su,
pentru a amesteca ambele zone i pentru a realiza bioconversia substratului la produs. Soluia de
enzim se injecteaz ntr-o coloan capilar de silice, urmat de injectarea substratului su, iar
capilarul este considerat ca microreactor . n ciuda complexitii aparente, o astfel de configuraie
este adecvat pentru automatizare i control al timpului de contact dintre catalizator i substratul
su. Cu toate acestea, metoda EMMA este posibil numai n cazul proceselor catalitice rapide,
deoarece timpii de contact sunt n mod tipic n milisecunde . EMMA este avantajoas deoarece
cantitile de enzim i substrat utilizate sunt extrem de mici.

2.1.2. Analiza proteinelor

Cel mai mare numr de cereri recente ale microreactoarelor enzimatice se refer la proteine
i cartografierea peptidei , un proces esenial n identificarea i succesiunea de proteine. Enzima cea
mai frecvent folosita este tripsina, enzima care catalizeaz procesul de digestia proteinelor prin
hidroliza legturilor peptidice la un rest bazic.
Un exemplu de astfel de sistem implic un microreactor de cas cu tripsin imobilizat pe
sticl cu pori controlai .Microreactorul a fost preparat prin uscare ntr-un capilar de silice topit sub
tratament cu ultrasunete. O coloan HPLC a fost folosit ca un rezervor care conine granulele
tripsin. O presiune sczut a gazului (argon) a fost aplicat pentru a conduce soluia tampon
coninnd o prob de protein prin capilar. Debitul n sistem a fost calibrat prin colectarea i
cntrirea cantitatea de soluie n curs de dezvoltare din microreactor ntr-un timp msurat. Sistemul
poate fi construit n 30 min.

2.1.3. Analiza acizilor nucleici

O realizare notabil a Microtehnologiei a fost crearea unor sisteme de microreactoare de
reacie n lan a polimerazei , care s permit automatizarea ADN-ului. Acest lucru a permis
construirea unor sisteme cu randament sporit pentru analiza rapida a materialului genetic. De obicei,
substraturile pentru reacia PCR i polimeraza sunt injectate n zona de reacie , i un program de
ciclism termic este aplicat pentru a permite amplificarea lanului ADN. In 2001 a fost produs un
microlaser cu microcamere de dimensiuni de 80x80 m si volum de 85 pl. Fiecare camer poate s
conin mai puin de o singur molecul nainte de amplificarea ADN-ului. In 2004 a fost conceput
un sistem bazat pe siliciu cu un volum in cavitatea intern de 7 l pentru detectarea rapid a ADNuluia caracteristicii secveniale pentru Mycobacterium tuberculosis, pe baza mutaie n regiunea 81
bp al genei rpoB. n comparaie cu metodele actuale de diagnostic a tuberculozei, aceast ofer
economii semnificative de timp i costuri de enzime i reactivi.
Ctiva autori au descris microdispozitivele pentru analize ulterioare a ADN-ului . Asimilarea
de astfel de sisteme ar putea mbunti automatizarea n furnizarea de hri de restricie pentru
plasmide, care sunt necesare in mod obisnuit in multe protocoale de cercetare in biologie
moleculara. Figura 2 prezint dispozitivul construit de Burns in 1998. Acesta include PCR, precum
separarea produsului cu electroforez capilar. Secvenierea ADN-ului n microsisteme a fost
examinat de ctre Kan (2004), precum i Lagally i Mathies (2004) au acoperit evoluiile recente n
tehnologiile disponibile pentru analize genetice pe o microscara.

Fig.2 Schema de dispozitiv integrat , cu dou probe lichide i electroforez pe gel pentru
analiza ADN-ului

2.1.4. Sisteme enzimatice model

O varietate de tehnici de imobilizare i modele microfluidice au fost folosite pentru a
construi microreactoare enzimatice concepute pentru a fi utilizate n analiza de specii chimice.
Suporturile cele mai utilizate de imobilizare a enzimelor sunt margele de siliciu sau de sticl, dei
exist numeroase soluii speciale, inclusiv imobilizarea pe pereii interiori ai canalelor microfluidice
si a capilarelor cu siliciu topit. Cele mai populare enzime pentru testarea eficienei imobilizarii i a
testarii procesului de microreactie sunt glucoz oxidaz , peroxidaz de hrean i a fosfatazei alcaline
. Aceste enzime sunt relativ ieftine i uor accesibile, precum i natura lor chimic i reaciile
catalizate de acestea sunt bine nelese. In locul de munca de la L'Hostis (2000) o
electrochimioluminiscen microscara (ECL) detector a fost utilizat pentru monitorizarea produselor
de conversie a glucozei de ctre glucoz oxidaz imobilizat pe bile de sticl cu luminol ca un
chelator. Aceasta a permis detectarea glucozei n cadrul biologic relevant gama 50-500 M. n
viitorul apropiat, este de ateptat ca munca pe baz de enzime model va fi majorat cu studii cu alte
enzime utile pentru analize analitice.

3. Concluzii si tendinte viitoare

Pn n prezent, foarte puine enzime au fost aplicate n cadrul microreactoarelor , dei se
pare c noile dispozitive vor fi dezvoltate nu numai ca sisteme model, dar acestea vor fi adresate
spre probleme specifice, dup cum se procedeaz n cazul digestie triptic i microreactoare PCR.
Exist cteva brevete obtinute care descriu construciea microreactoarelor enzimatice , ceea ce
indic faptul c evoluiile de aplicaii n acest domeniu sunt nc n faza iniial.
O aplicaie orientaca exemplu spre utilizare a microreactoarelor enzimatice este hidroliza
grsimi utilizate i de transformare a lor n combustibil diesel . Acest lucru indic, de asemenea, la
aspectele verzi ale microreactoarelor, datorit cerinelor de ntreinere reduse, precum i aplicaii
n protecia mediului. Exist un angajament imens impus de industria farmaceutic pentru cutarea
de noi inhibitori poteni ai lipaze, care pot fi utilizate n tratamentul obezitii , i proceduri analitice
rapide pentru aceste biocatalizatori sunt necesare. O varietate de lipaze imobilizate disponibile de la
o serie de furnizori (de exemplu Sigma Aldrich, Amano, BioChemika, Novozymes) pot fi utilizate
n microsisteme produse pentru screening rapid de inhibitori ai acestor enzime. Alte enzime
imobilizate sunt deja utilizate n sinteze industriale .