Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Coordonatori:
Simona Ivana
Autori:
MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR
Volumul I
Editura Asclepius
Bucureti, 2011
Toate drepturile sunt rezervate autorului. Tiprit n Romnia.
Nici o parte din aceast lucrare nu poate fi reprodus sub nici o
form, prin nici un mijloc, mecanic sau electronic sau stocat ntr-
o baz de date, fr acordul prealabil, n scris, al autorului.
2
Cuvnt nainte,
3
Cuprins
4
6.4. Influena presiunii osmotice asupra microorganismelor ........................... 123
6.5. Influena presiunii hidrostatice asupra microorganismelor ....................... 125
6.6. Influena energiei radiante asupra microorganismelor .............................. 125
6.6.1. Influena radiaiilor corpusculare asupra microorganismelor ............ 128
6.6.2. Influena radiaiilor luminoase asupra microorganismelor ................ 128
6.6.3 Influena radiaiilor neionizante asupra microorganismelor ............... 129
6.7. Influena undelor sonore asupra microorganismelor................................. 131
6.8. Influena unor compui chimici asupra microorganismelor...................... 131
6.8.1. Influena halogenilor asupra microorganismelor ............................... 134
6.8.2. Influena alcoolilor asupra microorganismelor .................................. 137
6.8.3. Influena peroxidului de hidrogen asupra microorganismelor ........... 137
6.8.4. Influena detergenilor asupra microorganismelor ............................. 138
6.8.5. Influena spunurilor asupra microorganismelor ............................... 139
6.8.6. Influena compuilor metalelor grele asupra microorganismelor ...... 139
6.8.7. Influena aldehidelor asupra microorganismelor ............................... 140
6.8.8. Influena coloranilor anilinici asupra microorganismelor ................ 141
6.8.9. Influena acizilor organici asupra microorganismelor ....................... 142
6.8.10. Influena unor decontaminani gazoi asupra microorganismelor ... 142
6.9. Influena altor organisme asupra bacteriilor ............................................. 143
6.10. Influena parametrilor intrinseci i extrinseci ai alimentelor asupra
microorganismelor ........................................................................................... 149
6.10.1. Influena parametrilor intrinseci ai alimentelor asupra
microorganismelor ....................................................................................... 149
6.10.1.1. Influena pH-ul alimentului asupra microorganismelor .......... 149
6.10.2. Influena parametrilor extrinseci ai alimentelor asupra
microorganismelor ....................................................................................... 164
Capitolul 7 Genuri bacteriene izolate frecvent din alimente ............................ 168
Capitolul 8 Ciuperci microscopice izolate frecvent din alimente .................... 180
8.1. Mucegaiuri izolate frecvent din alimente.................................................. 180
8.2. Principalele genuri de levuri izolate din alimente ..................................... 186
8.3. Particulariti morfologice i taxonomice ................................................. 190
8.4. Forme de multiplicare ale ciupercilor microscopice ................................. 191
8.5. Caracteristicile levurilor i mucegaiurilor ............................................ 192
Capitolul 9 Virusuri cu importan n microbiologia alimentelor .................... 195
Capitolul 10 Prionii i importana lor n microbiologia alimentelor ................ 199
Capitolul 11 Principalele caractere difereniale ntre bacterii, virusuri i ciuperci
microscopice .................................................................................................... 201
Capitolul 12 Sursele principale de microorganisme prezente n alimente i
controlul lor...................................................................................................... 202
12.1. Solul i apa.......................................................................................... 202
12.2. Plantele i produsele vegetale ............................................................. 203
12.3. Materialele de manipulare a alimentelor ............................................ 204
12.4. Manipulatorii alimentelor ................................................................... 206
12.5. Hrana animalelor ................................................................................ 207
12.6. Aerul i praful ..................................................................................... 207
Capitolul 13 Tipuri de fermentaii utilizate n industria alimentar ................ 210
5
13.1. Fermentaia lactic .............................................................................. 211
13.2. Fermentaia malo-lactic .................................................................... 215
13.3. Fermentaia alcoolic .......................................................................... 216
13.4. Fermentaia propionic ....................................................................... 218
13.5. Fermentaia butiric ............................................................................ 219
13.6. Fermentaii oxidative (aerobe) ............................................................ 219
13.6.1. Fermentaia acetic ...................................................................... 219
13.6.2. Fermentaia citric ........................................................................... 223
13.6.3. Fermentaia oxalic.......................................................................... 224
13.6.4. Fermentaia succinic, fumaric i malic ....................................... 225
13.7. Fermentaia celulozei .......................................................................... 225
13.8. Fermentaia anaerob metanic .......................................................... 225
Capitolul 14 Recoltarea probelor alimentare ................................................... 228
14.1. Noiuni introductive ............................................................................ 228
14.2. Recoltarea probelor de carne .............................................................. 228
14.3. Recoltarea probelor de conserve i semiconserve .............................. 229
14.4. Recoltarea probelor de lapte i produse din lapte ............................... 230
14.5. Recoltarea probelor de pete ............................................................... 231
14.6. Ambalarea i expedierea probelor recoltate din alimente ................... 231
14.7. Primirea i prelucrarea probelor n laborator ...................................... 231
Capitolul 15 Tehnici de diagnostic de laborator .............................................. 236
15.1. Aparatura utilizat n laboratorul de microbiologie ............................ 237
15.2. Sterilizarea .......................................................................................... 238
15.3. Controlul eficacitii sterilizrii .......................................................... 241
15.4. Transportul i concervarea probelor ................................................... 242
15.5. Triajul de calitate al probelor.............................................................. 243
15.6. Conduita general a identificrii bacteriilor ....................................... 244
Capitolul 16 Medii de cultur, reactivi i diluani utilizai n diagnosticul de
laborator ........................................................................................................... 249
16.1. Caractere generale .............................................................................. 249
16.2. Medii de cultur folosite n diagnosticul de laborator ........................ 250
16.3. Prepararea mediilor de cultur ............................................................ 252
16.4. Clasificarea mediilor de cultur .......................................................... 253
Norme de protecia muncii n laboratorul de microbiologie ............................ 287
Bibliografie selectiv ....................................................................................... 290
6
Motto:
The most important discoveries of the laws,
methods and progress of nature have nearly
always sprung from the examination of the
smallest objects which it contains.
Capitolul 1
Scurt istoric al microorganismelor din alimente
7
numr foarte mare de bacterii. De unde vin aceste bacterii, dac ele nu se
gsesc n alimentele proaspete? Unii cercettori au presupus c sunt nite
germeni care ptrund n aer, n alimente, iar alii c acetia apar spontan
din materia inert. Pentru prima dat Pasteur a demonstrat c aceste
structuri se gsesc n aer, de unde ptrund n materia n putrefacie. El a
gsit spontan n aerul obinuit o varietate de structuri solide de 0,01-1 mm.
Multe dintre aceste structuri aparineau sporilor de ciuperci, chitilor de
protozoare i altor celule microbiene. Acesta a concluzionat c
microorganismele din materiile intrate n putrefacie i au originea n aer.
El a postulat ideea c aceste corpuri microscopice se depoziteaz pe toate
obiectele din mediul ambiant. A folosit pentru prima dat cldura ca
mijloc de sterilizare pentru eliminarea contaminanilor. n acelai timp mai
muli cercettori au artat c o soluie cu nutrient, dac este fiart nu mai
intr n putrefacie.
Principiile tehnicilor aseptice sunt primele lucruri pe care le nva
un microbiolog. Dup ce Pasteur a descoperit sterilizarea prin fierbere,
unii cercettori au demonstrat c aceasta este insuficient. Astzi, noi tim
c exist lucruri rezistente la temperatura de fierbere care poart
denumirea de endospori. Iniial, s-au ocupat de acest lucru doi cercettori:
John Tyndall, n Anglia i Ferdinand Cohn, n Germania. Ei au observat c
unele alimente (de exemplu: sucul de fructe) se sterilizeaz n 5 minute,
prin fierbere, pe cnd altele au nevoie de o perioad mai lung de timp.
Pentru prima dat Cohn a descoperit la microscop, n culturile
vechi endosporul la unele specii din genul Bacillus.
Descoperirile fcute de ctre Ignaz Semmelweis i Joseph Lister au
artat c unii germeni se pot transmite de la o persoan la alta putnd
provoca mbolnviri.
Koch a publicat n 1876 studiile sale timpurii privind bacilul
antraxului. El a descoperit c acesta exist n sngele animalelor infectate.
Koch a demonstrat c dac recolteaz snge de la un animal bolnav i l
inoculeaz la altul, acesta se mbolnvete i moare. Repetnd aceast
procedur de 20 de ori (transfer de snge de la un animal la altul) a
demonstrat c bacteria este capabil s produc antrax. Cel de al
douzecilea animal a murit la fel ca primul. n primul caz, Koch a
demonstrat prin microscopie, c sngele animalului mort conine un numr
mare de bacterii. Koch a dus experimentul mai departe i a demonstrat c,
dac bacteria este cultivat n afara corpului pe medii de cultur
reprezentate de medii nutritive, poate cauza boala cnd este reinoculat la
un animal sntos. Att bacteriile izolate din infecii, ct i cele din bulion
nutritiv induc aceleai simptome dup inocularea animalelor sntoase.
Pe baza acestor experimente i a altora Koch a formulat nite
concluzii care poart denumirea de postulatele lui Koch:
8
1. microorganismele patogene pot fi izolate constant de la
animalele bolnave i nu sunt prezente la cele sntoase;
2. microorganismele pot fi recoltate de la animalele bolnave i
cultivate pe medii de cultur;
3. dac un patogen este inoculat la un animal susceptibil acesta se
va infecta i vor fi reproduse simptomele caracteristice bolii;
4. microorganismele reizolate de la animale de experien i
cultivate din nou n laborator sunt aceleai cu acelea care au produs
infecia original.
Postulatele lui Koch au prezentat o importan deosebit nu numai
pentru c au artat c bolile infecioase sunt produse de microorganisme,
dar au participat i la dezvoltarea microbiologiei prin cultivarea acestora n
condiii de laborator.
Cu toate c este dificil precizarea cu exactitate a nceputul
cunotinelor n ceea ce privete prezena i rolul microorganismelor din
alimente, la aceast dat este cunoscut c acestea devanseaz nsi
microbiologia ca tiin de sine stttoare.
Perioada ce precede stabilirea microbiologiei ca tiin ar putea fi
definit ca era pretiinific. Aceast er poate fi la rndul ei divizat n
dou perioade: perioada culegtorilor i perioada cultivatorilor.
Perioada culegtorilor i are debutul odat cu originea omului (n urm
cu un milion de ani) i se ncheie n urm cu aproximativ 8000 de ani. n
aceast perioad se presupune c oamenii erau carnivori, plantele intrnd
mult mai trziu n dieta lor. Tot n acea vreme se consider c pentru
prima dat s-a recurs la prepararea termic a hranei. Perioada ce a urmat
acesteia se presupune c a fost cea n care au aprut problemele legate de
alterarea alimentelor gtite i conservate n condiii necorespunztoare. De
altfel prima consemnare despre alterarea alimentelor este semnalat n
jurul anului 6000 Hr.
n urma cercetrii unor documente din antichitate istoricii au
stabilit c n acea perioad exista o legtur destul de puternic ntre
coacerea cerealelor i fabricarea berii. Berea preparat n antichitate avea
aspectul unei grsimi groase, nchise la culoare, era slab alcoolizat, dar
nutritiv. Cercetarea urmelor de cereale i bere gsite n mormintele
Egiptului antic au demonstrat c zahrul necesar pentru fermentaie
influeneaz calitatea acestora. Tablele babiloniene de lut din 4300 Hr.
descriu n detaliu reetele de fabricare a berii. Berea a fost preparat i n
China antic, n imperiul inca i de ctre asirieni. Un text egiptean datat
din 1600 Hr. prezint peste 100 de feluri diferite de preparare a berii.
Fabricarea i comercializarea berii a nceput n 1200 dHr. n
Germania, pentru ca n 1506 s fie emis aa numita Lege German a
Puritii Berii care stabilete c ingredientele berii sunt numai: apa pur,
9
hameiul, orzoaica i grul, ajungndu-se n zilele noastre la peste 20.000
de tipuri de bere fabricate n ntreaga lume. Pentru prima dat mbutelierea
berii s-a realizat n 1605, cunoscndu-se n zilele noastre peste 180 de
moduri de mbuteliere.
Primele vase de fiert au fost folosite n Orientul Apropiat acum
aproximativ 8000 de ani. Cu ajutorul lor s-a realizat fierberea cerealelor,
prepararea berii i s-au conservat alimentele. n Babilon berea a fost
preparat pentru prima dat n jurul anului 7000 Hr. Sumerienii (anul
3000 Hr.) au fost primii cresctori de animale i primii care au preparat
untul. Tot ei au produs o serie de preparate din carne, pete, unc, piei
uscate srate, gru, ovz. Vasele de lut au fost aduse din Orientul Apropiat
n Europa de Vest n jurul anul 5000 Hr.
Laptele i brnza au fost folosite de egipteni nc de acum 3000 de
ani Hr. Evreii au folosit ntre anii 3000 -1200 Hr sarea din Marea
Moart pentru conservarea diferitelor alimente. Chinezii i grecii foloseau
n dieta lor petele srat, iar romanii crnurile murate.
Vinul a fost preparat pentru prima dat de ctre asirieni n anul 3500
Hr. Crnaii fermentai au fost fcui i consumai pentru prima dat de
ctre babilonieni i chinezi nc din anul 1500 Hr. O alt metod de
conservare aprut n aceast perioad presupunea utilizarea diferitelor
uleiuri precum cel de msline sau de susan.
Conform relatrilor lui Seneca, romanii foloseau nc din anii 1000
Hr. zpada pentru conservarea fructelor de mare i a altor alimente
perisabile. Se pare c tot n aceast perioad au aprut practica afumrii
crnurilor, fabricarea brnzeturilor i a vinurilor. Este ndoielnic faptul c
oamenii din acel timp au neles natura acestor noi tehnici de conservare i
modul de transmitere a diferitelor toxiinfecii alimentare sau pericolul
consumului de carne de la animalele bolnave. Pn la nelegerea naturii
toxiinfeciilor alimentare i a alterrii alimentelor, n perioada 0-1100 dHr.
ergotoxina (Ergot) produs de Claviceps purpurea a fost cauza multor
mbolnviri i decese. n 943 dHr. au fost nregistrai peste 40.000 de
mori numai n Frana, netiindu-se c aceast boal este produs de toxina
unui mucegai.
Meseria de mcelar este menionat pentru prima dat n 1156 n
Elveia, iar din 1248 elveienii au nceput s mpart crnurile n
comerciabile i necomerciabile. n 1276 a fost nfiinat primul abator la
Augsburg.
Cu toate c n secolul al XIII-lea oamenii erau contieni de
atribuiile calitii crnii, legtura dintre calitatea crnurilor i
microorganisme era foarte puin cunoscut.
Prima persoan care a fcut referire la rolul microorganismelor din
alimentele alterate a fost A. Kircher, un clugr care n anul 1658 a
10
examinat cadavrele n descompunere, carnea, laptele etc., descriind
microorganismele ca pe nite viermi invizibili. Descrierile acestuia nu
erau precise i nu au fost acceptate pe scar larg.
n 1765, Lazzaro Spallanzani (1729-1799) a fiert carnea de vit timp
de o or, a sigilat-o i a observat c aceasta nu s-a alterat. Spallanzani a
fcut acest experiment pentru a respinge doctrina ce susinea apariia
spontan a vieii.
n 1837, Schwann a artat c infuziile nclzite rmn sterile dac se
introduce aer prin intermediul unor spirale nclzite. Cu toate c ambii
cercettori au demonstrat ideea sterilizrii alimentelor prin cldur nici
unul nu s-a folosit n practic de aceste descoperiri.
Conservarea termic a alimentelor a fost realizat i de D. Papin i
G. Leibniz la nceputul secolului 18.
Istoria fabricrii primelor conserve necesit o scurt biografie a lui
Nicolas Appert (1749-1841). Acest francez a muncit n vinoteca tatlui
su. mpreun cu cei doi frai a deschis n 1778 o berrie. Dup
descoperirea unei modaliti de conservare (1789-1793) a deschis o
fabric de conserve n 1802 i a nceput s exporte produsele i n alte ri.
n 1809 un ministru francez l-a ncurajat s-i promoveze descoperirea. n
1810 a publicat metoda sa i a fost recompensat cu 12.000 franci. Acesta a
fost nceputul conservrii n cutii, care este practicat i n ziua de astzi.
Acest experiment a avut loc cu 50 de ani nainte ca L. Pasteur s
demonstreze rolul microorganismelor n alterarea vinului. n 1837 acesta a
demonstrat c acrirea laptelui se datoreaz aciunii microorganismelor i a
folosit pentru prima dat cldura pentru a distruge microorganismele din
vin i bere. Acest mod de sterilizare este cunoscut n ziua de astzi sub
denumirea de pasteurizare. Dup ce Pasteur a descris fermentaia alcoolic
ca fiind un proces biologic complex, Buchner, n 1897 demonstreaz
natura enzimatic a acesteia.
Louis Pasteur (1822 - 1895), geniu al microbiologiei, dar i chimist,
biolog si imunolog este cel care a nfiinat primele laboratoare de
cercetare, iar contribuiile sale n domeniul microbiologiei alimentare sunt,
printe multe altele, despre cauzele alterrii perioadice a vinului. Acesta a
fost angajat de ctre productorii francezi de vin care vroiau s afle ce st
la baza transformrii vinului n oet i a gustului acru rezultat. Pn la acel
moment, formarea vinului fusese considerat un proces strict chimic.
Dup studierea aprofundat a fabricrii berii i a folosirii strugurilor la
producerea vinurilor, Pasteur a ajuns la concluzia c vinul, att cel fin ct
i cel mai puin fin, era rezultatul unei aciuni microbiene asupra sucului
de struguri, iar mbolnvirea acestuia era produs de microorganismele
contaminate care produceau produse nedorite (de exemplu: acid). La acea
vreme nu se tia c rspunztori de aciditatea vinurilor erau probabil
11
contaminanii bacterieni, cum ar fi Acetobacter sau Gluconobacter
introdui odat cu strugurii, aerul sau aparatura de preparare a vinului.
Aceste bacterii Gram negative obinuite reduc n continuare etanolul n
acid acetic fiind utilizate n prezent n producia industrial de oet.
Astfel, Pasteur dovedete c fermentaia este un act corelativ unui
proces vital, i c o fermentaie determinat are fermentul su
determinant. Prin extinderea cercetrilor asupra fermentaiilor, el a reuit
s evidenieze originea infecioas ntr-o serie de boli ale berii i vinului.
Demonstrarea rolului crucial al drojdiilor n procesul fermentaiilor a
constituit primul concept care asocia modificrile fizico-chimice ale
materiei organice cu activitatea unui microorganism. Pentru a soluiona
problema degradrii vinului i berii, Pasteur propune o tehnic care i
astzi este utilizat: nclzirea slab sau pasteurizarea sucului de struguri
pentru distrugerea contaminanilor urmat de inocularea acestuia cu o
cultur pur de levuri. El a lansat de asemenea ideea c un singur microb
poate fi rspunztor att de degradarea produsului ct i de mbolnvirea
acestuia. Tehnica pasteurizrii a fost ulterior aplicat n industrializarea
laptelui i ca procedeu de sterilizare n practica medical. De asemenea,
Pasteur stabilete c ntre activitatea unui agent patogen i particularitile
pe care le determin exista o anumit specificitate.
Descoperiri istorice
Conservarea alimentelor
1782 Se semnaleaz pentru prima dat conservarea oetului la cutii
de ctre un chimist suedez.
1810 n Frana, Nicolas Appert patenteaz conservarea
alimentelor, iar n Marea Britanie, Peter Durand obine un patent de
conservare a alimentelor n sticle, vase de lut, de tabl i alte metale sau
materiale potrivite. Patentul este achiziionat mai trziu de ctre Hall,
Gamble i Donkin (probabil de la Appert).
1813 Se introduce practica incubrii la postprocesare a alimentelor
conservate de ctre Donkin, Hall i Gamble.
1825 T. Kensett i E. Daggett ctig n SUA un patent destinat
conservrii alimentelor n cutii de metal.
1835 Newton obine un patent n Anglia pentru producerea laptelui
condensat.
1837 Se conserv porumbul la cutii de ctre I. Winslow.
1839 n SUA se folosesc pe scar larg cutiile de tabl.
1840 Se conserv pentru prima dat n cutii fructele i petele.
1843 I. Winslow n Maine ncearc pentru prima dat sterilizarea
cu aburi.
12
1845 S. Elliott introduce n Australia conservarea la cutii.
1853 Se obine un patent pentru sterilizarea mncrii prin
autoclavare de ctre R. Chevallier Appert.
1854 Pasteur ncepe cercetrile pe vin. ndeprtarea
microorganismelor prin nclzirea acestuia este utilizat pe scar larg din
1867 1868.
1855 Grimwade obine laptele praf n Anglia.
1856 n SUA este introdus un patent pentru producerea de lapte
condensat nendulcit de ctre Gail Borden.
1865 n Statele Unite se utilizeaz pe scar larg nghearea
artificial a petelui.
1874 Se utilizeaz uzual gheaa la conservarea crnii transportate
pe mare.
1878 Are loc primul transport de carne din Australia ctre Anglia.
1880 n Germania este introdus pasteurizarea laptelui.
1882 Krukowitsch descrie pentru prima dat efectul distructiv al
ozonului asupra bacteriilor.
1886 Se ncearc pentru prima dat un proces mecanizat de uscare
a fructelor i legumelor de ctre A.F. Spawn.
1886 n SUA se pune la punct tehnologia ngherii artificiale a
oulor.
1890 n SUA este utilizat pasteurizarea comercial a laptelui. Se
pune la punct tehnologia refrigerrii mecanice a fructelor depozitate.
1895 Russel realizeaz primul studiu bacteriologic al alimentelor
conservate.
1907 E. Metchnikoff izoleaz din iaurt o bacterie pe care a
denumit-o Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, iar BTP Barker
studiaz rolul bacteriilor acido-acetice n producerea cidrului.
1908 Se utilizeaz primul conservant - benzoatul de sodiu - n
Statele Unite.
1916 nghearea rapid a alimentelor este pentru prima dat
folosit n Germania de ctre R. Plank, E. Ehrenbaum i K. Reuter.
1917 Franks patenteaz prezervarea fructelor i legumelor folosind
dioxidul de carbon.
1920 Biogelow i Esty efectueaz primul studiu sistematic al
rezistenei endosporilor la cldur.
1922 Esty i Meyer au stabilit valoarea lui z=18oF pentru
endosporii de Clostridium botulinum.
1929 n Frana este patentat folosirea radiaiilor de nalt energie
n procesarea alimentelor.
1943 B.E. Proctor folosete n SUA radiaiile ionizante pentru
conservarea crnii de hamburger.
13
1950 Conceptul de valoare D (temperatura) a intrat n uzul general.
1955 Se aprob folosirea acidului ascorbic pentru conservarea
diferitelor alimente i a clortetraciclinei la carnea proaspt de pui i mai
trziu a oxitetraciclinei. n 1966 se renun la folosirea acestor antibiotice.
1967 n SUA are loc pentru prima dat iradierea alimentelor.
1988 Nizinei i se acord statutul de GRAS (generally regarded as
safe) n SUA.
1990 n SUA este aprobat utilizarea iradierii la carnea de pui.
1997 n SUA este aprobat iradierea crnii proaspete de vit la un
nivel maxim de 4,5 kGy i a crnii de vit ngheate la 7,0 kGy. Tot n
SUA ozonul este declarat GRAS.
Alterarea alimentelor.
1659 Kircher demonstreaz prezena bacteriilor din lapte, fapt
confirmat de Bondeau n 1847.
1680 Antonie van Leewenhoek (1632-1723), prima persoan care
observ prin mrirea cu ajutorul microscopului simplu (o singur lentil de
construcie personala), intuiete existena drojdiilor. Astfel, Leewenhoek a
atras atenia asupra microorganismelor, fr a le conferii statutul de
organisme aparte.
1780 Scheele, chimist suedez, identific acidul lactic (acidul 2-
hidroxipropanoic) ca fiind principalul acid din laptele acru.
1839 Latour demonstreaz existena drojdiilor.
1857 Pasteur arat c acrirea laptelui este produs de
microorganismele care se dezvolt n el.
1866 Se public lucrarea Etude sur la Vin a lui Pasteur.
1873 Se comunic un prim studiu despre deteriorarea
microbiologic a oulor, realizat de ctre Gayon. Lister izoleaz pentru
prima dat Lactococcus lactis n cultur pur.
1878 Cienkowski face un prim studiu microbiologic al zahrului
deteriorat, din care izoleaz microorganismul Leuconostoc mesenteroides
1887 Forster demonstreaz pentru prima dat abilitatea unor culturi
pure de bacterii de a crete la 0C.
1888 Miquel a fost primul care a studiat bacteriile termofile.
1895 Pentru prima dat este determinat numrul de bacterii din
lapte de ctre Von Geuns n Amsterdam.
1902 Termenul psihrofil este pentru prima dat folosit de ctre
Schmidt-Nielsen pentru microorganismele care se dezvolt la temperaturi
sczute.
1912 Termenul osmofil este dat de ctre Richter pentru a descrie
fungii care se dezvolt bine ntr-un mediu cu presiune osmotic mare.
1915 Bacillus coagulans este pentru prima dat izolat din laptele
14
coagulat de ctre B.W. Hammer.
1917 Geobacillus stearothermophilus este pentru prima dat izolat
din crema cu cereale de ctre PJ Donk.
1933 n Anglia Oliver i Smith observ alterarea produs de
Byssochlamys fulva; a fost descris pentru prima dat n SUA n 1969 de
ctre D. Maunder.
Alimente nocive.
1820 Poetul german Justinus Kerner face o descriere a crnailor
otrvii (cel mai probabil fiind vorba de botulism) i a ratei lor nalte de
fatalitate.
1857 n Penrith, Anglia, laptele este incriminat n transmiterea
febrei tifoide de ctre W. Taylor.
1870 Francesco Selmi a avansat teoria otrvirii cu ptomain pentru
a explica mbolnvirile contactate n timpul consumului de alimente.
1888 Gaertner izoleaz pentru prima dat Salmonella enteritidis
dintr-o prob de carne care a determinat 57 cazuri de toxiinfecie
alimentar.
1894 T Denys este primul care asociaz stafilococii cu
toxiinfeciile alimentare.
1896 Se descoper Clostridium botulinum de ctre Van Ermengen.
1904 Tulpinile de tip A de C. botulinum sunt identificate de G.
Landman.
1906 Se recunosc toxiinfeciile alimentare produse de Bacillus
cereus. Se identific primul caz de difilobotriaz.
1926 Pentru prima dat se face legtura dintre intoxicaii i
streptococi ca ageni etiologici de ctre Linden, Turner i Thom.
1937 Tulpinile de tip E de C. botulinum au fost identificate de L.
Bien i E. Hazen.
1938 n Ilinois (SUA) sunt semnalate epidemii produse de
Campylobacter enteritis.
1939 Se descriu pentru prima dat gastroenterite cauzate de
Yersinia enterocolitica de ctre Schleifstein i Coleman.
1945 Mc Clung izoleaz pentru prima dat Clostridium perfringens
(welchii) din cazuri de toxiinfecii alimentare.
1951 Vibrio parahaemolyticus este recunoscut drept agent cauzal
al toxinfeciilor alimentare pe baza studiilor lui T. Fujino n Japonia.
1955 S. Thompson evideniaz asemnrile dintre holer i
gastroenteritele produse de E. coli la copii.
Au fost recunoscute intoxicaiile cu scombroid (produs
asociat cu histamina).
1960 Se identific tipul F de C. botulinum. Se raporteaz producia
15
de aflatoxine de ctre Aspergillus flavus.
1969 Se pune n eviden enterotoxina lui C. perfringens de ctre
C.L. Duncan i D.H. Strong. Gimenez i Ciccarelli izoleaz pentru prima
dat tipul G de C. botulinum.
1971 n statul Maryland (SUA) are loc prima epidemie de
gastroenterit cu Vibrio parahaemolyticus.
1975 L.R. Koupal i R.H. Deibel demonstreaz prezena
enterotoxinei stafilococice.
1976 Gastroenteritele cu Yersinia enterocolitica apar pentru prima
dat n USA, la New York
1978 n Australia apar pentru prima dat epidemii de gastroenterite
cu virusul Norwalk.
1979 Apar n Florida gastroenterite cauzate de Vibrio cholerae
non-01. Mai devreme au aprut n Cehoslovacia (1965) i Australia (1973)
1983 Ruiz-Palacios et al. descriu enterotoxina produs de
Campylobacter jejuni.
1981-1984 Prusiner demonstreaz c moleculele proteice numite
prioni pot fi infecioase pentru om i animal. Este descris encefalopatia
spongiform bovin n Regatul Unit al Marii Britanii i Irlandei de Nord.
16
considerat printele acestei tiine.
n timp, microscoapele au evoluat devenind instrumente complexe
i perfecionate, prin adugarea unor lentile mai fine, a unui condensator, a
unor dispozitive de reglare, precum i a unor surse de lumin incorporate
n microscop.
Prototipul microscopului modern, folosit de la mijlocul anilor 1800
este capabil de o mrire de 1000 ori sau mai mult. Microscoapele moderne
nu difer mult ca structur i funcie de baz de unele microscoape iniiale.
17
de idei care exprim sau explic multe aspecte ale unui fenomen. Nu este
o explicaie confuz i ubred, ci o declaraie viabil, care a rezistat
probei timpului, dar care mai poate fi nc infirmat, prin argumente
tiinifice serioase.
De cele mai multe ori se ntmpl ca o teorie s se dezvolte i s
progreseze pe parcursul a mai multor decenii de cercetare, putnd fi
completat i modificat prin date noi.
La un moment dat, dovada exactitii i previzibilitii unei teorii,
devine att de convingtoare, nct este atins nivelul urmtor de ncredere,
iar teoria devine lege sau principiu. De exemplu, dei ne mai putem referi
nc la teoria germenilor ca o cauz a bolilor, au mai rmas att de
puine ndoieli cu privire la faptul c microbii pot provoca boli i astfel
este clar c teoria a devenit lege.
Caracteristicile care fac ca oamenii de tiin s fie eficieni n
munca lor sunt curiozitatea, lipsa de prejudeci, scepticismul,
creativitatea, cooperarea i faptul c sunt de acord s-i revizuiasc
prerile asupra proceselor naturale.
Capitolul 2
Clasificarea microorganismelor
i rolul lor n alimentaie
19
distincte este posibil deducerea unor asemnri ntre acestea (de
exemplu: toi membrii familiei Enterobacteriaceae sunt bacili, facultativ
anaerobi i Gram-negativi).
Trebuie reinut c taxonii sunt ntr-o continu schimbare,
dependent de nivelul de cunoatere al fiecrui organism i de descifrarea
relaiilor evoluioniste. n lumea tiinific raportarea la un anumit
microorganism se face prin precizarea numelui tiinific. n nomenclatura
binomial, organismele sunt definite prin utilizarea a dou cuvinte
(excepie fac virusurile), ce corespund numelui de gen i specie - dou
nivele taxonice succesive. n transcrierea numelui sunt utilizate o serie de
convenii internaionale, aa numitele convenii ale nomenclaturii
binominale:
- Genul se pune naintea speciei (ex.: Escherichia coli);
- Numele genului este ntotdeauna scris cu liter mare (ex:
Escherichia);
- Numele speciei nu este niciodat scris cu liter mare (ex.:
Escherichia coli);
- Ambele nume sunt ntotdeauna scrie fie n italic, fie cu subliniere
(ex.: Escherichia coli sau Escherichia coli);
- Numele genului poate fi utilizat i singur, dar niciodat nu se
utilizeaz singur doar numele speciei (se poate spune sau scrie
Escherichia dar nu este aprobat exprimarea sau scrierea coli);
- Numele genului poate fi abreviat, dar la prima utilizare a lui
trebuie folosit fr abreviere, dac va fi utilizat abrevierea aceasta se
folosete mpreun cu numele speciei (ex: E. coli). Abrevierea nu trebuie
s fie ambigu. Dac abrevierea prin utilizarea primei litere nu este
ambigu, ea trebuie utilizat doar pentru acel gen (ex. abrevierea E. coli
este pertinent dac n lucrarea respectiv nu mai este prezentat un alt gen
al crui nume ncepe cu aceeai liter). Abrevierea genului este acceptat
numai n conjuncie cu numele speciei (ex. E. coli).
20
definirea unei specii bacteriene. Identificarea unei specii i determinarea
limitelor acesteia reprezint cele mai provocatoare aspecte ale
clasificrilor biologice pentru orice tip de organism.
O modalitate oficial de identificare a speciilor bacteriene este
utilizarea unei chei dihotomice de ghidare a seleciei testelor utilizate n
determinarea proprietilor bacteriene relevante la identificarea bacteriilor.
21
Plantae (plantele)
Fungi (fungii)
Animalia (animalele)
Protista (eucariotele unicelulare)
Monera (procariotele)
22
endosimbiozei cu eubacteriile (exemplu: mitocondriile).
Fig 2.1. Clasificarea lumii vii n concepia lui Haeckel (1866). Aici toate
23
microorganismele sunt n Protista i printre primele ramuri sunt observate
grupuri microbiene nc recunoscute astzi (bacteii, alge, protozoare).
.
Fig. 2.3. Arborele filogenetic universal al lui Carl Woese (1988)
24
determinat prin compararea ARN ribozomal.
Clasificarea virusurilor
25
de Taxonomie Viral este engleza, tot mai muli virusologi renun la
traducerea numelui virusurilor numele proprii nu se traduc - referirea la
un anume virus fcndu-se, fie prin utilizarea integral a numelui
englezesc, fie a iniialelor numelui acestuia (exemplu: Bovine Leukaemia
Virus sau BLV).
Taxonomia cifric
Studiaz legturile dintre taxoni. Taxonomia numeric sau cifric
se bazeaz pe faptul c odat cu creterea numrului de caracteristici
observate la organisme crete i precizia identificrii asemnrilor i
respectiv a deosebirilor dintre acestea. Dac aceste caracteristici sunt
determinate genetic atunci, cu ct organismele prezint mai multe
caracteristici comune, cu att acestea sunt mai strns nrudite filogenetic.
n esen taxonomia numeric reprezint evaluarea cifric a asemnrilor
dintre entitile sau unitile taxonomice i ordonarea acestor uniti ntr-
un taxon pe baza nrudirii acestora.
Omologia genetic
Prin omologie se nelege corespondena de structur a unuia sau a
mai multor organe la dou specii diferite, datorit originii lor comune.
Analogia ADN-ului (ARN-ului) a dou sau mai multe organisme poate fi
realizat printr-o serie de mijloace cum ar fi determinarea compoziiei n
baze nucleotidice, secvena nucleotidic sau rata de hibridizare. Aceste
metode sunt foarte precise n stabilirea poziiei organismelor izolate,
putndu-se determina cu certitudine dac acestea fac parte din specii
diferite (organisme distincte) i ct de nrudite sunt filogenetic (cu ct
genotipurile sunt mai omoloage cu att organismele sunt mai nrudite pe
scara evolutiv). Dezavantajul utilizrii omologiei genetice n taxonomie
este dat de preul de cost ridicat al unui asemenea laborator, dar acesta
poate fi suplinit de precizie. Prin omologia genetic se stabilesc legturile
evolutive fr influena fenotipului organismelor.
26
informaii genotipice precise, fiind furnizate date noi necesare n stabilirea
relaiilor evolutive. Totui, la fel ca orice alt tehnic a biologiei
moleculare, determinarea secvenei ADN sau ARN necesit timp i costuri
mari. ARN-ul este adesea secvenializat prin convertirea lui ntr-o
molecul ADN sau prin secvenializarea genei ADN utilizat ca matri
pentru ARN.
Hibridizarea ADN
Aceast tehnic recurge la proprietatea ADN-ului de a-i cliva cele
dou lanuri nucleotidice la cldur, prin ruperea punilor de hidrogen.
Lsnd soluia de ADN s se rceasc acesta-i va reface (realinia) dublu-
helixul. Dac ADN-ul ce provine de la dou organisme diferite este pus
mpreun i supus unui asemenea tratament, realinierea obinut la final va
fi influenat de nivelul omologiei celor dou secvene ADN (cu ct
similitudinea lor este mai exact, cu att sunt mai mult aliniate). Refacerea
helixului este dependent de gradul de nrudire pe scara evolutiv a celor
dou organisme.
Identificarea tulpinilor
Uzual organismele strns nrudite, cum ar fi membrii aceleiai
specii, sunt foarte asemntoare i de aceea au fost necesare metode
suplimentare, capabile s le diferenieze pe baza anumitor elemente de
detaliu. Aceste metode sunt: determinarea profilului proteic,
imunodiagnosticul i tipizarea fagic. Prin aceste metode se compar
fenotipurile, motiv pentru care nu constituie instrumente de identificare a
relaiilor evoluioniste, ele nefiind la fel de precise ca homologia genetic.
Imunodiagnosticul
Abilitatea anticorpilor de a se cupla i/sau inactiva
microorganismele poate fi exploatat n determinarea legturilor
evoluioniste. Dou organisme care se pot cupla cu acelai anticorp sunt
considerate mai nrudite comparativ cu un al treilea, care nu se cupleaz
specific cu acest anticorp.
Tipizarea fagic
Bacteriofagii, la fel ca anticorpii, pentru a putea infecta o anumit
27
celul bacterian trebuie s se cupleze cu aceasta. Fagii nu sunt capabili s
infecteze unele celule naintea adsorbiei lor datorit existenei unor
endonucleaze de restricie care previn replicarea acestora. Unele tulpini
microbiene care posed receptori de suprafa diferii, sisteme de restricie
sau profagi vor favoriza creterea unor tipuri diferite de fagi. Exploatnd
aceast specificitate a patternului este posibil utilizarea tipizrii fagice n
diferenierea tulpinilor.
Tulpina tip
n clasificarea microoranismelor de un real ajutor sunt tulpinile
microbiene standard (tulpina tip) fa de care se analizeaz
microorganismul izolat. Adesea tulpina tip este primul exemplar al unei
specii sau tulpini. Speciile tip sunt pstrate n colecii sau bnci
microbiene naionale i n laboratoare de referin naionale i
internaionale.
Manualul Bergey
Metodele de identificare i difereniere a bacteriilor sunt reunite n
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. La utilizarea acestui
manual se bacteriile nu sunt prezentate de o manier care s reflecte
interrelaiile lor evolutive. Acesta grupeaz bacteriile ntr-o manier mult
mai practic n identificarea lor. La acest moment lumea tiinific nu
dispune de suficiente informaii pentru a schia un arbore genealogic
complet pentru bacterii.
n ultimele dou decade au avut loc multe modificri n clasificarea
sau taxonomia bacteriilor. Muli dintre aceti noi taxoni sunt rezultatul
apelrii la metodele geneticii moleculare cu sau fr asociere cu cele
tradiionale:
1. Omologia ADN-ului i mol% G+C din ADN;
2. Asemnri de secvene ntre 23S, 16S i 5S ARNr;
3. Catalogarea oligonucleotidelor;
4. Analiza taxonomic numeric a proteinelor solubile totale sau a
unui set de caractere morfologice i biochimice;
5. Analiza peretelui celular;
6. Profilul serologic;
7. Profiluri de acizi grai celulari.
28
Prima bacterie cu genomul secvenializat complet a fost
Haemophilus influenzae (Fleischmann, R. D. i col., 2005). Interesul
pentru genomul procariotelor este din ce n ce mai mare i obiectivul
major n determinarea secvenei genomice complete a unui organism este
nelegerea mai bun a biologiei i evoluiei microbilor (Chan V.L., 2006).
Dei unele metode sunt folosite de mult timp (exemplu: analiza
peretelui celular, profilul serologic) altele au nceput s fie folosite pe
scar larg abia dup dup 1980 (exemplu: analiza ARNr-ului). Cele mai
folosite instrumente n taxonomia bacterian vor fi prezentate n
continuare.
(a) (b)
Fig 2.5. Ribozomul. Vedere din fa i lateral a subunitii mari de 50S(a)
i a subunitii mici de 30S (b).
30
Analiza ADN-ului
Coninutul mol procentual n G+C al ADN-ului bacterian a fost
utilizat timp de mai multe decenii n taxonomia bacterian, iar prin
coroborarea acestor date cu cele furnizate de secvenializarea ARNr 16S i
ARNr 5S are loc o cretere semnificativ a valorii acesteia. Prin analiza
ARN-ului ribozomal 16S, bacteriile Gram-pozitive se mpart n doua
grupe la nivel de familie: un grup cu mol% G + C >55 i un grup cu mol%
G + C <50 (Woese, CR. 1987). Din primul grup fac parte genuri ca
Propionibacterium, Streptomyces, Corynebacterium, Micrococcus,
Bifidobacterium sau Brevibacterium, iar din al doilea grup genuri ca
Listeria, Bacillus, Staphylococcus, Pediococcus, Lactobacillus,
Leuconostoc, Erysipelothrix sau Clostridium. Cnd continutul n G+C al
dou organisme difer cu mai mult de 10%, acestea au puine secvene de
baze comune. Hibridizrile ADNADN sau ADNARN au fost utilizate o
perioad de timp i continu s fie extrem de valoroase n sistematizarea
bacterian. S-a constatat c sistemul de referin ideal pentru taxonomia
bacterian este secvenializarea complet a ADN-ului unui organism
(Wayne, L.G. i col. 1987). Este general acceptat faptul c specia
bacterian poate fi definit filogenetic, prin intermediul hibridizarii ADN
ADN, n care o similitudine de 70% sau mai mare i un punct de topire
(Tm) de 5C sau mai mic definete o specie (Wayne, L.G. i col. 1987).
Dei prin cele prezentate pn acum o definire filogenetic satisfctoare a
unui gen bacterian nu este posibil, utilizarea pe mai departe a tehnicilor
acizilor nucleici n conjuncie cu metodele mai sus amintite ar trebui s
duc la o sistematizare bacterian bazat pe sistemul filogenetic. ntre
timp sunt ateptate modificri ale poziiei taxonilor (Lane, DJ. i col
1985).
Pe lng hibridizarea ADN i studiile pe ARNr 16S, mai sunt
recomandate i alte teste genotipice pentru evaluarea bacteriilor izolate n
vederea cunoaterii genului i speciei. Dintre acestea amintim
electroforeza n gel n cmp pulsatoriu (PFGE Pulsed Field gel
electrophoresis), amplificarea randomizat a ADN-ului polimorfic (RAPD
Randomly Amplyfied Polymorphic DNA) i determinarea elementelor
genetice extracromozomiale.
31
Capitolul 3
Structura celulei procariote
Istoria evoluiei bacteriilor a nceput cu aproximativ 3,5 miliarde
de ani n urm continund i n prezent. Faptul c aceste microorganisme
unicelulare, simple au rezistat un timp att de ndelungat ntr-o diversitate
de habitate arat c structura i funciile lor sunt uimitor de adaptabile.
Celula bacterian apare de o simplitate neltoare, dac este examinat la
microscopul obinuit. Celulele procariote sunt cele mai simple celule, dar
dac sunt examinate la microscopul electronic sau investigate prin studii
biochimice, complexitatea lor funcional devine evident. Fac parte din
microorganismele cele mai obinuite i mai ubicvitare de pe pmnt,
avnd rol esenial n echilibrul naturii precum i n viaa animalelor i a
omului.
Cunoaterea structurii i a comportamentului celulelor procariote
este fundamental pentru studiile ulterioare privind: genetica, controlul
alimentelor, bolile infecioase i terapia medicamentoas. Problemele
principale tratate n acest capitol sunt elemente de anatomie i
ultrastructura celulei bacteriene, de fiziologie, de multiplicare, de
comportare fa de factorii de mediu precum i de ecologie i
microbiologie alimentar.
nainte de a ne ocupa mai ndeaproape de anatomia celulei
bacteriene, trebuie menionat faptul c multe din cunotinele privind
detaliile descrise rezult din studii electronomicroscopice i nicidecum din
experiene directe de laborator. Dei microfotografiile structurilor celulare
au un aspect plan, trebuie reinut faptul c acestea exist ntr-o
configuraie tridimensional. Detaliile de structur ale celulei bacteriene se
refer la eubacterii. Pentru stabilirea principalelor caracteristici anatomice
ale celulei procariote vom efectua n continuare o disecie microscopic,
urmnd un traseu ce ncepe de la structurile celulare externe i merge spre
coninut.
32
Schema 3.1. Analiza structurii celulei procariote
Ribozomi
Citoplasma Pigmeni
Celula Coninut
Incluzii
procariot (protoplasm)
Mezozomi
Vacuole
Granule
Cromozom (nucleoid, corp cromatinic)
Genomul bacterian Plasmide
Organite Flageli (cili) filamente axiale
celulare Pili i fimbrii
33
Proteina major care intr n structura flagelilor se numete
flagelin, fiind asemntoare miozinei sau proteinelor contractile. n stare
monomer aceasta are forma unei particule sferice cu diametrul de 4,6
nanometri, greutatea molecular de 40.000 daltoni i o compoziie n
aminoacizi variabil de la o specie la alta. Crligul i corpul bazal sunt
alctuite din aproximativ nou proteine diferite de proteina flagelului
propriu-zis. Creterea flagelului se face ntotdeauna la vrf i nu la baz
(ca la firul de pr). Flagelina (aparatul de locomoie al flagelului) este
sintetizat n celul i difuzeaz n canalul central al flagelului fie activ,
fie pasiv (dup un gradient de concentraie) pn la captul distal (liber) al
acestuia unde se dispune simetric. Sinteza flagelinei, se realizeaz printr-un
proces de autoasamblare (selfasamblare), toate informaiile necesare
aflndu-se n structura subunitilor proteice ale acestuia.
Flagelina asigur creterea flagelului bacterian cu o vitez de
aproximativ 0,15 nm/minut la temperatura de 37C.
ndeprtarea mecanic a flagelilor duce la refacerea spontan a
acestora ca numr i lungime (caracteristice speciei) n aproximativ o
generaie. Creterea flagelilor, reprezint un proces mai mult sau mai puin
continuu ce se realizeaz pn n momentul atingerii lungimii optime a
speciei bacteriene respective. n momentul diviziunii celulare, noul flagel
se formeaz la nivelul septului de diviziune astfel nct celulele fiice apar
echipate complet din acest punct de vedere. Flagelina prezint proprieti
antigenice, reprezentnd la bacteriile flagelate antigenul H (hauch = vl,
membran). La bacteriile peritrihe se presupune c flagelii sunt distribuii n
timpul diviziunii celulare ntre cele dou celule fiice n mod egal, urmnd
ca dup aceea s fie sintetizai restul acestora, n locurile libere.
Crligul, tubular curbat este fixat de celul prin corpusculul bazal,
compus dintr-o serie de inele fixate solid n peretele celular, spaiul
periplasmic i membrana celular. Mecanismul crlig (articulaie),
corpuscul bazal se aseamn foarte mult cu micarea unei mingii aruncate
la co. Acest aranjament permite crligului s realizeze mpreun cu
filamentul su o rotaie de 360o executnd o micare de rotaie i nainte ca
o lovitur de bici. Prin rotirea flagelului ntr-o anumit direcie, corpul
celular se rotete n direcie opus, iar acest lucru i confer o micare
nainte.
Corpusculul bazal reprezint partea cea mai important, servind
ca articulaie flexibil universal. La bacteriile Gram pozitive (de
exemplu: Bacillus subtilis) corpul bazal e format din dou discuri notate
cu S i M, iar la cele Gram negative (de exemplu: Escherichia coli) din
patru discuri notate cu S, M, P i L. Discul S se afl la nivelul spaiului
periplasmic, iar M se rotete liber n membrana celular. Discul P se afl
la nivelul peretelui celular (stratul de peptidoglican), iar inelul L la nivelul
34
lipopolizaharidelor din membrana extern.
Cuplul de fore de torsiune care determin rotaia axului ia natere
ntre discul M cu rol de rotor i discul S care acioneaz ca stator.
n funcie de numrul i aranjamentul (distribuia) lor pe suprafaa
celulei bacteriene exist trei tipuri flagelare, i anume:
flagel cu dispoziie polar, atunci cnd sunt ataai la unul sau
la ambele capete ale celulei. n cadrul acestui tip pot fi descrise trei
subtipuri:
subtipul monotricha, cu un singur flagel;
subtipul lofotricha, cu mici fascicule sau smocuri de flageli care
ies din acelai loc;
subtipul amfitricha, cu flageli la ambii poli ai celulei.
Cilii polari sunt caracteristici pentru familia Pseudomonadaceae i
genul Vibrio.
flageli cu dispoziie peritricha care sunt dispersai la ntmplare
pe toat suprafaa celulei. Acetia sunt caracteristici pentru bacteriile
enterice (20-30 cili), de exemplu Proteus vulgaris, precum i speciile din
genul Clostridium. n cazul majoritii bacteriilor flagelate peritrich
numrul cililor poate ajunge la cteva sute.
flageli cu dispoziie subpolar care sunt implantai (n numr de
1-2) ntre cei doi poli. Acest tip de aranjament este caracteristic
enterococilor precum i bacteriilor din genul Vibrio.
Tipul flagelilor constituie deseori un criteriu de clasificare a
bacteriilor mobile. n ceea ce privete forma cililor, aceasta este n general
cilindric ns uneori pot aprea i turtii ca o panglic. Diametrul variaz
ntre 12-25 nm, lungimea lor fiind n medie de 25-30 . La unii spirili
saprofii, lungimea cililor poate ajunge pn la 72 .
Pentru identificarea direct a unei bacterii mobile se impune
folosirea unor tehnici speciale de colorare (Leifson, Cassares Gill) sau prin
microscopie electronic prin colorare negativ, deoarece flagelii sunt prea
mici pentru a fi vizibili n preparate vii, necolorate la microscopul
obinuit.
Deseori este suficient s se tie pur i simplu dac o specie
bacterian posed capacitatea de micare (mobilitate). Un mijloc de
evideniere indirect a mobilitii const n nsmnarea unei mase mici
de celule bacteriene ntr-un mediu semisolid. O cretere care se
rspndete rapid n toat suprafaa mediului denot faptul c bacteria
respectiv este mobil.
Examinarea mobilitii se poate realiza i prin examen microscopic
ntre lam i lamel sau n pictur suspendat. Dac bacteria cercetat
este mobil aceasta va traversa cmpul microscopic dintr-o parte n cealalt
prin micri de naintare sau n zig-zag, n timp ce o celul imobil se va
35
legna pe loc i nu se va deplasa n nici o direcie a cmpului microscopic.
Detalii privind modul de deplasare al flagelilor. Flagelii
reprezint organite de micare cu ajutorul crora bacteriile se deplaseaz
cu o vitez de 20-80 /s, ceea ce echivaleaz cu de 70 ori lungimea
corpului bacterian pe secund (ghepardul, cel mai rapid animal, alearg cu
o vitez care nu depete de 3 ori lungimea corpului pe secund).
Filamentul flagelului este pus n micare de motorul rotativ care se
nvrte n jurul propriului su ax, ca o elice submicroscopic, propulsnd
n felul acesta celula.
Bacteriile cilogene nu conin sisteme enzimatice pentru
transformarea energiei chimice n energie mecanic, la baza micrii stnd
interaciunea dintre ncrctura electric de sens contrar de pe discurile
M i S. Acest fapt determin translocaia activ a ionilor de pe discul
M genernd o rotaie a acestuia cu o vitez de 40-50 ture pe minut. n
funcie de sensul micrii rotatorii a discului M bacteriile vor realiza o
micare de rostogolire dac rotorul se va nvrti n sensul acelor de
ceasornic sau o deplasare n linie dreapt n cazul rotaiei acestuia n sens
antiorar. Micarea celulelor peritriche este diferit de cea a celulelor
monoflagelate sau lofotriche.
n mod normal la Escherichia coli flagelii se rotesc antiorar
(opus acelor de ceasornic), formnd un fascicul n urma celulei, pe care o
propulseaz spre a se deplasa n linie dreapt. Cnd sensul rotirii se
schimb, devenind orar (n sensul acelor de ceasornic) fascicolul de
flageli se rsfir, fiecare trgnd n alt direcie, iar bacteria se rostogolete.
Cnd rostogolirea s-a terminat fascicolul se reface din nou, i celula,
dirijat ntr-o nou direcie, aleas la ntmplare, i reia drumul drept.
Deci, rotaia n sens antiorar asigur deplasarea n linie dreapt, iar cea
n sens orar rostogolirea.
n cazul bacteriilor cu flageli polari deplasrile n linie dreapt sunt
ntretiate de scurte micri de recul, determinate de rotaia n sens orar,
urmate apoi de reluarea drumului drept ntr-o direcie aleatorie.
Bacteriile flagelate polar se deplaseaz mult mai rapid dect cele
care prezint cili pe toat suprafaa celulei.
Bacteriile mobile pot executa unele aciuni oarecum sofisticate. Ele
se pot mica spre surse poteniale de nutriie i la distan de condiiile de
mediu adverse. Acest tip de comportament poart numele de chimiotactism
sau chimiotaxie. Chimiotactismul pozitiv este micarea n direcia unui
stimul chimic favorabil, spre substane utile metabolismului bacterian
numite substane atractante. Acestea sunt reprezentate de zaharuri, amino-
acizi, oxigen, Ca2+, Mg2+, etc.
Chimiotactismul negativ este micarea unei celule n direcia opus
unor substane potenial nocive sau a unor produi de excreie rezultai de
36
cele mai multe ori din suprapopularea mediului de cultur, care se numesc
substane repelente. Dintre acestea fac parte acizii grai, alcooli, H+, OH-,
cationii de metale grele, etc.
Adler a demonstrat c adugarea de substane repelente n mediul
de cultur duce la sporirea rostogolirilor, iar durata deplasrilor n linie
dreapt crete favoriznd astfel apropierea de substane necesare metabo-
lismului celulei bacteriene acolo unde acestea se afl n concentraie mai
mare.
Efectul final este acela c bacteriile se acumuleaz aproape de
sursa de atractant i departe de repelent.
Chimiotaxia poate fi studiat uor prin tehnica capilaritii care
const n introducerea unui tub capilar (care conine un atractant, un
repelent sau o soluie salin), ntr-un vas care conine o suspensie de
bacterie mobil. Se va observa c:
n tubul cu atractant se produce o acumulare de bacterii care
traverseaz pereii capilarului;
n tubul cu repelent concentraia de bacterii va fi mai mic dect
n afara acestuia;
n cel cu soluie salin concentraia de bacterii din tub devine
egal cu cea din afara lui.
Rspunsul chimiotactic al bacteriilor este condiionat de prezena
unui chemosensor alctuit din dou componente dintre care unul
recunoate i leag substanele detectate numit chemoreceptor, iar cellalt
semnalizeaz flagelului modificarea produs n mediu, numit
semnalizator.
Chemoreceptorii se gsesc n spaiul periplasmic sau se leag lax
de membrana celular sub form de proteine de legare. Funciile lor sunt
acelea de a recunoate specific anumite substane i de a le transporta n
celula bacterian.
Specificitatea chemoreceptorilor nu este absolut. De exemplu,
chemoreceptorul (Che) pentru galactoz recunoate n acelai timp
glucoza i fructoza, iar Che pentru manoz recunoate i glucoza.
Proteinele chemotaxice metil acceptoare (MCPS) numite i
transductori au rolul de a lega receptorul de reglatorul rostogolirilor.
Fiecare transductor interacioneaz cu anumii receptori transmind
semnalele rezultate, direct la componenii sistemului de reglare. La
Escherichia coli exist patru tipuri de proteine MCP, denumite MCP I, II,
III, IV.
37
chimiotactic este condiionat de prezena metioninei. Metilarea lui MCPS
este produs prin cedarea unor grupri metil de ctre S-adenozilmetionin
(o form activ a metioninei) care poate aduga la fiecare molecul MCP
pn la patru grupri metil.
Adugarea unui atractant la suspensia bacterian induce o
suprimare imediat a rostogolirilor, ca rspuns la gradientul temporar, n
timp ce adugarea unui repelent induce imediat i continuu o serie de
rostogoliri. Dup un timp variabil (de la cteva secunde la cteva minute)
bacteriile i reiau modul iniial de not chiar dac repelentul sau
atractantul este prezent.
Cea de-a doua metod, prin care se poate demonstra mobilitatea
bacterian i chimiotaxia utilizeaz un microscop special construit pentru
a soluiona aceast problem care se numete microscop de urmrire
(tracking microscop). Acesta nregistreaz automat drumul parcurs i
viteza de deplasare a unui individ bacterian. Se pot calcula numrul de
drumuri n linie dreapt i numrul de rostogoliri.
Adugarea de atractani sau ndeprtarea repelenilor cresc
metilarea MCPS, n timp ce ndeprtarea atractanilor sau adugarea de
repeleni descrete metilarea.
Carboxilarea proteinelor este intim legat de procesul de adaptare a
bacteriilor la stimulii chemotaxici din mediu, reprezentnd mecanismul
biochimic esenial al acestei funcii.
Au fost identificate pn n prezent cel puin patru proteine
plasmatice cu rol n transmiterea excitaiei de la MCP la flagel. Dou
dintre aceste proteine controleaz direcia de rotaie a flagelului, iar
celelalte dou par s interacioneze n unele cazuri cu MCPS i s
transmit excitaia proteinelor flagelare de control de la nivelul corpuscu-
lului bazal. Studiul unor mutante bacteriene arat c proteinele implicate
n controlul flagelilor pot fi alternativ fosforilate i defosforilate, iar aceste
procese afecteaz funcia lor de control.
Modelul excitaiei flagelare arat c interaciunile dintre proteinele
citoplasmatice sunt atribuite CheA cu MCP metilat n unele cazuri cauznd
fosforilarea CheA. Dup aceea CheA transfer fosfatul spre o a doua
protein CheY care este capabil s produc rotaia flagelului n sensul
acelor de ceasornic, determinnd rostogolirea bacteriei.
Cnd MCP este demetilat, CheA i CheY sunt defosforilate, iar
flagelul este rotit invers acelor de ceasornic rezultnd deplasarea n linie
dreapt.
Au mai fost identificate i alte proteine de control ns funciile lor
nu sunt pe deplin cunoscute.
Celulele bacteriene prezint pe suprafaa lor un numr foarte mare
de receptori diferii, cei mai muli foarte specifici avnd afinitate mare
38
pentru una sau dou substane i alii cu afinitate mai slab. De exemplu,
la Escherichia coli au fost identificai aproximativ 30 de receptori dintre
care 18 pentru atractani i 12 pentru repeleni.
Capacitatea bacteriilor de a rspunde la aciunea diferitelor substane
chimice depinde de setul de receptori cu specificiti diferite de pe
suprafaa lor.
Cele mai rapide bacterii sunt cele cu flageli polari ca Thiospirillum
care atinge 5,2 mm/minut i Pseudomonas aeruginosa care noat cu 3,4
mm/minut. Bacteriile flagelate peritrich sunt mult mai ncete. De exemplu,
Escherichia coli nainteaz cu 1 mm/minut, iar Sporosarcina ureae cu
1,7mm/minut.
39
greutatea molecular de 16,6 kDa, formate din 163 de resturi de
aminoacizi asamblate dup o simetrie helical.
Ca i la pili, originea lor este intracelular pentru c rmn legate
de protoplati i sferoplati dup ndeprtarea peretelui celular al bacteriei.
Fimbriile prezint o tendin inerent de a adera unele la altele i la
suprafee, fiind deseori agregate dense de celule pe suprafaa unor lichide,
ct i la colonizarea microbian a unor suprafee neanimate (inerte), ca
roca i sticla. Unii ageni patogeni pot coloniza i infecta esutul gazd ca
urmare a aderenei etane ntre fimbriile lor i celulele invadate.
Prezena lor favorizeaz fixarea bacteriilor de celule i esuturi
mpiedicnd splarea acestora de ctre lichidele organismului i aderarea
la nivelul esuturilor pentru care prezint tropism. De exemplu,
Streptococcus pyogenes izolat din gt ader la esutul faringian,
Escherichia coli se implanteaz perfect n celulele intestinale, iar gonoco-
cul invadeaz esutul genito-urinar. n acelai timp, fimbriile confer
bacteriilor patogene mai mult virulen, asigurndu-le rezisten la
fagocitoz.
La nivelul celulei bacteriene fimbriile asigur creterea suprafeei
active n absorbia de substane nutritive i pot servi ca organite de
transport ale unor metabolii.
Pilii (numii i pilii de sex). Pilii sunt apendici filamentoi
pericelulari ai bacteriilor Gram negative, care prezint calea efectiv de
transfer a cromozomului bacterian prin fenomenul de conjugare i
acioneaz ca receptori specifici de fag.
Pilii de sex sunt n numr de 1 pn la 10 pe celul fiind
determinai de gene extracromozomale. Sunt prezeni pe suprafaa
celulelor (F+, Hfr i F) la Escherichia coli K12, Salmonella typhimurium,
Proteus mirabilis, Shigella flexneri, Caulobacter (Ottow).
Lungimea pililor poate ajunge pn la 20 de microni, avnd un
diametru mai mare dect al fimbriilor (6-15 nm). Mecanismul de cretere
este acelai cu cel al fimbriilor, numai c au capacitatea s ajung la
lungimea maxim n 1-5 minute.
Pilii de sex sunt de dou tipuri i anume: F i I.
Pilii F sunt sintetizai de o plasmid de sex F. Prezint o
structur tubular, avnd un canal axial cu diametrul de 2,5-3 nanometri,
care este delimitat de un perete format din molecule de pilin (fosfoglico-
protein cu greutatea molecular de 11800 dal) dispuse helical.
Pilii I sunt sintetizai de unii factori col de tip special, cu rol
de conjugon. Ei prezint o structur compact fr canal axial.
Extremitatea liber a unor pili prezint un buton terminal ce poate
avea forme diferite: de disc, de cup sau caliciu, sferic (vezicular),
compact sau cu structur laminar.
40
Pn n prezent pili adevrai s-au gsit numai la bacteriile Gram
negative unde ei sunt implicai, n special n procesul de conjugare.
Conjugarea reprezint transferul de material genetic de la o bacterie
donatoare la o bacterie receptoare, proces realizat prin intermediul unei
legturi intercelulare directe i condiionat de prezena n celula donatoare
a unui element cu funcie de plasmid de sex sau conjugon (plasmid F,
R i col).
Fenomenul de conjugare are loc de obicei ntre genuri i specii
foarte apropiate. Celulele opuse ca sexualitate ( i ) formeaz, dup o
serie de ciocniri ntmpltoare, perechi de ncruciare specific.
Pilii acioneaz ca o conduct (pipeline) sau ca o band
transportoare, prin care se transmite ADN cromozomal sau plasmidic.
O alt proprietate a pililor este aceea c poart receptori pentru
fagii fr coad, constituind o nsuire important n identificarea pililor
de sex prin electronografii i pentru diferenierea lor de fimbrii. n acest
caz, pilii suplinesc lipsa cozii acestor fagi servind drept conduct prin
care se realizeaz transferul genomului fagic n celula bacterian.
Pierderea pililor prin mutaie implic dobndirea rezistenei fa de fagii
respectivi.
41
3.2.1. Stratul mucos i capsula bacterian
Tabel 3.1
Tipuri capsulare la diferite specii bacteriene
Specia
Compoziia Denumire Evideniere
bacte- Consisten Grosimea
chimic Aspect Observaii
rian
anthracis
42
multocida pneumoniae
Polizaharidic
Pasteurella Klebsiella
Substan Se depune sub form de
(structur lamelar Sczut Groas difuz
mucoas mase vscoase fr
alctuit din straturi (mucoas) (20-25 nm)
capsular semnificaie anatomic
suprapuse)
Homopolizaharide
(cu un singur tip de
zahr-glucan)
Heteropolizaharide
Pseudomonas
polimeri de D-
aeruginosa
glucoz, D-
Moale
galactoz, D-
manoz, acid D-
glucuronic
Bacterii saprofite (n medii
Groas,
naturale)
compus din
Polizaharidic Moale colonii Zoogleea
mucilaginoase
de bacterii
44
ruperii cnd este umplut cu aer. Caracterul protector, relativ rigid al
peretelui se datoreaz unei macromolecule unice, numit peptidoglican.
Acesta este reprezentat de un polimer gigant compus din catene repetitive
lungi de glican legate ncruciat prin fragmente peptidice scurte.
Peptidoglicanul nu reprezint singurul component al peretelui celular, iar
cantitatea acestuia variaz n funcie de grupele bacteriene.
Semnificaia biomedical a peptidoglicanului din peretele
celular. Datorit faptului c majoritatea bacteriilor triesc n habitate care
conin i o cantitate considerabil de ap liber, acestea absorb n
permanen prin osmoz excesul de ap. Dac nu ar exista fora i
rigiditatea relativ a peptidoglicanului din peretele celular, acesta ar exercita
n curnd o presiune capabil de a rupe bacteriile. nelegerea funciei
legturi slabe a reprezentat un ajutor enorm pentru industria
medicamentelor folosite n tratamentul infeciilor (peniciline,
cefalosporine) acestea fiind eficiente, datorit faptului c mpiedic
formarea normal a stratului de peptidoglican al bacteriilor.
Astfel de celule, cu pereii incomplei sau abseni, sunt foarte slab
protejate mpotriva lizei. Unele dezinfectante (alcool, detergeni) omoar,
de asemenea, celulele bacteriene prin deteriorarea peretelui celular.
Lizozimul coninut n lacrimi i saliv, reprezint un mijloc de aprare
natural ce ajut la distrugerea anumitor bacterii prin dizolvarea
peptidoglicanului.
Diferene structurale privind peretele celular. Cu peste 100 de
ani n urm, cu mult nainte ca anatomia detaliat a bacteriilor s fie
cunoscut, un medic danez, Hans Christian Gram a elaborat o tehnic de
colorare (coloraia Gram) care delimiteaz dou grupe de bacterii complet
diferite. Dei cauzele nu au fost precizate, timp de muli ani, reaciile
contrastante care au loc prin aceast coloraie se datoreaz n totalitate
unor diferene fundamentale privind morfologia pereilor celulari
bacterieni.
Cele dou grupe principale evideniate prin aceast tehnic sunt
numite bacterii Gram pozitive i bacterii Gram negative. Deoarece,
coloraia Gram nu precizeaz natura acestor diferene fizice, trebuie s ne
adresm microscopiei electronice i analizei biochimice.
Coloraia Gram. n 1884, Hans Christian Gram, a elaborat o
tehnic de colorare, prin folosirea creia bacteriile au devenit mai vizibile
n probele infecioase prelevate. Tehnica sa a constat n aplicarea
secvenial de cristal violet (violet de geniana), colorantul principal,
Lgol (care reprezint mordantul pe baz de iod i iodur de potasiu),
alcool aceton (decolorantul) i safronin (fuxin) colorantul de contrast.
n final, bacteriile care se coloreaz n violet (purpuriu) au fost denumite
Gram pozitive, iar cele care se coloreaz n rou au fost denumite Gram
45
negative.
Dei, aceste reacii de colorare implic o atracie a celulei spre un
colorant ncrcat este important de menionat c termenii Gram pozitiv
i Gram negativ nu indic sarcina electric a celulelor sau coloranilor,
ci faptul c o celul reine sau nu complexul colorant principal mordant
dup decolorare. Nu este nimic specific n reacia celulelor Gram pozitive
la colorantul principal sau a celor Gram negative la colorantul de contrast.
Astzi, tim c teoria chimic privitoare la coloraia Gram, implic
diferene structurale ale peretelui celular i ale modului cum reacioneaz
acesta la aciunea reactivilor. n prima faz, cristalul violet (violetul de
geniana) coloreaz toate celulele unui eantion n aceeai culoare violet
(purpurie). Adugarea mordantului (intensificatorului) constituie o etap
cheie n diferenierea coloraiei deoarece mordantul, soluia Lgol,
formeaz cristale mari cu colorantul, care sunt dispuse n reeaua de
peptidoglican a peretelui celular. Deoarece, stratul de peptidoglican este
mai mare la celulele Gram pozitive reacia este mult mai ampl dect n
cele Gram negative cu perete mult mai subire. n plus, cnd se aplic
decolorarea, lipidele din membrana extern a celulelor Gram negative sunt
dizolvate n alcool aceton, ceea ce permite ndeprtarea colorantului, n
timp ce cristalele de colorant captat de peretele celular al bacteriilor Gram
pozitive sunt relativ inaccesibile i rezistente la ndeprtare. Deoarece,
bacteriile Gram negative vor fi incolore dup etapa aplicrii alcool
acetonei, prezena lor este demonstrat prin aplicarea colorantului de
contrast, fuxina (safronina).
Aceast metod veche de un secol, rmne baza universal pentru
taxonomia i identificarea bacteriilor. Ea permite diferenierea a patru
categorii principale pe baza reaciei de culoare i a formei: bacili
(bastonae) Gram pozitivi, coci Gram pozitivi, bacili Gram negativi, coci
Gram negativi. Pe lng utilizarea sa n clasificarea bacteriilor, coloraia
Gram reprezint o metod practic de diagnostic n infeciile bacteriene i
dirijarea tratamentului medicamentos.
De exemplu, frotiurile efectuate din probe de urin proaspt sau
exsudat faringian prin metoda Gram pot ajuta la depistarea cauzei posibile
a unei infecii putnd fi instituit tratamentul medicamentos. Chiar i astzi,
cnd exist o tehnologie medical complex i sofisticat coloraia Gram
rmne un prim instrument de diagnostic important i inegalabil.
Gradul de difereniere ntre bacteriile Gram pozitive i cele Gram
negative este demonstrat clar de aspectul fizic al nveliurilor lor celulare.
O seciune microscopic a peretelui celulelor Gram pozitive este
asemntoare unui sandvi (deschis anterior) alctuit din dou straturi:
peretele celular extern, gros, compus n special din peptidoglican i
membrana celular. innd seama de aceast structur, vom examina n
46
continuare pereii celor dou tipuri de celule.
47
pozitive, iar formarea lor este dependent de condiiile de cultivare i de
mediu. Se gsesc la suprafaa celulei i sunt legai covalent de stratul
peptidoglicanic al peretelui celular.
Acizii teichuronici sunt legai de peretele celular i pot fi gsii la
aceeai bacterie asociai cu acizii teichoici.
Acizii teichoici membranari sau lipoteichoici sunt legai covalent
de formaiunea glicolipidic a membranei plasmatice formnd o reea ntre
aceasta i peretele celular.
Asocierea lor covalent cu glicolipidele a dus la denumirea de acizi
lipoteichoici.
Datorit acestei aezri, acizii lipoteichoici rmn ancorai n
membrana protoplastului atunci cnd bacteriile Gram pozitive sunt
convertite la protoplati. Datorit faptului c pot fi izolai din
interaciunea intracelular a celulelor rupte sunt numii i acizi teichoici
intracelulari. Acizii lipoteichoici sunt constitueni mult mai caracteristici
pentru bacteriile Gram pozitive dect acizii teichoici, iar sinteza lor nu este
dependent de condiiile de cretere.
Rolul acizilor teichoici.
Funcia principal a acizilor teichoici const n meninerea
structurii tridimensionale a peptidoglicanului de care sunt legai, conferind
extinderea peretelui celular n cursul creterii i diviziunii celulare.
Contribuie de asemenea la ncrctura acid de pe suprafaa celulei.
Acizii teichoici au rol esenial n meninerea unei concentraii de
ioni metalici (Mg2+) n micromediul reprezentat de suprafaa extern a
membranei plasmatice. Ei funcioneaz ca un mecanism molecular de
cretere a concentraiei de Mg2+ pe suprafaa celular. Dovada o constituie
faptul c n culturi deficiente n Mg2+, cantitatea de acizi teichoici crete.
Acizii teichoici joac un rol important ca determinani de
patogenitate (inhib fagocitoza).
Acioneaz ca determinani ai reaciilor de hipersensibilitate.
Controleaz activitatea autolizinelor.
Acioneaz ca receptori de fagocitoz i colicine.
48
(35%); proteine (15%); lipopolizaharide (50%). Foia exterioar a
membranei externe este constituit dintr-un lipozaharid (LPS) care este n
principal un polizaharid integrat ntr-un strat de lipide. Lipozaharidele sunt
alctuite dintr-o component lipidic (lipidul A) legat covalent de un
oligozaharid (poriunea central R) care la rndul su este legat de un
polizaharid. Structura lipidului A i a poriunii R sunt relativ invariabile,
iar polizaharidul este foarte variabil ca structur i compoziie chimic
formnd antigenul O sau polizaharidul O. Structura LPS bacterian
este tipic la celulele ce aparin variantelor S (smooth), n timp ce
variantele R (rough) nu au polizaharid O, ci au de cele mai multe ori o
poriune R incomplet.
Polizaharidul O (regiunea I a LPS) are o structur de baz simpl
alctuit din secvene de glicozaharide repetitive care conin de obicei 2-4
componeni monozaharidici. Compoziia n zaharuri difer de la o specie
la alta i chiar n cadrul speciei, determinnd specificitatea antigenic a
bacteriilor respective precum i gruparea lor n serotipuri i chemotipuri
(difereniate biochimic) pe baza similaritii n compoziia chimic a AgO.
AgO acioneaz i ca situs receptor specific n procesul de fagocitoz.
49
infecia i parazitismul lui Bdellovibrio bacteriovorus mascnd sinusurile
receptoare pe care se fixeaz bacteria parazit nainte de a ptrunde n
bacteria gazd.
Stratul interior al peretelui bacteriilor Gram negative este constituit
dintr-un singur strat de peptidoglican i lipoproteine. Are o grosime de
1,5-3,0 nm, fiind electronodens. Este legat de membrana plasmatic prin
intermediul unor peptidoglicani n curs de formare. n acelai timp, stratul
peptidoglicanic este legat covalent de stratul membranei externe prin
intermediul unor molecule globulare de lipoproteine situate pe suprafaa sa
extern.
Stratul peptidoglicanic reprezint 2,4-10 % din greutatea peretelui
celular i o compoziie chimic foarte asemntoare la toate bacteriile
Gram negative.
Semnificaia biologic. Membrana extern a peretelui celular are
rolul unei site moleculare permind ptrunderea unor molecule relativ
mici cum ar fi oligopeptide, oligozaharide i a unor substane hidrofile cu
greutate molecular de ~700 Da. Accesul este realizat prin nite canale
transmembranare formate din molecule proteice, numite porine care se
gsesc n toat membrana extern.
Mrimea acestor porine poate fi modificat n aa msur, nct pot
bloca ptrunderea unor preparate chimice, ca de exemplu, anumite
antibiotice reprezentnd astfel i un mijloc de aprare a bacteriei Gram
negative.
Membrana extern reine n spaiul periplasmic enzimele
degradative sintetizate n celul dup ce au traversat membrana
citoplasmatic, precum i o larg varietate de molecule nutritive.
De asemenea, reprezint sediul unor sisteme de transport specifice
(pentru vitamina B12,, maltoz, nucleozide).
LPS din membrana extern poart un numr mare de determinani
antigenici care confer specificitatea n cazul antigenelor somatice
bacteriene (~1000 serotipuri de Salmonella).
Peretele celular reprezint sistemul de susinere mecanic, un fel
de corset neelastic al ntregii arhitecturi celulare; determin forma celulei
bacteriene datorit rigiditii sale; asigur protecia fa de ocul osmotic;
particip la procesul de cretere i diviziune celular urmnd membrana
citoplasmatic n formarea septurilor transversale care dup replicarea
cromozomului bacterian separ celula mam n cele dou celule fiice.
Semnificaia biomedical a diferenelor ntre pereii celulari.
Anatomia celor dou tipuri de bacterii, Gram pozitive i Gram negative,
presupune i alte diferene pe lng reacia de colorare. Am menionat mai
sus modul cum membrana extern constituie o barier n plus la bacteriile
Gram negative, pentru ncetinirea sau oprirea ptrunderii unor preparate
50
antimicrobiene. Din cauza acestei impermeabiliti, bacteriile Gram
negative sunt n general mai greu de inhibat sau de omort dect cele
Gram pozitive.
Tratamentul infeciilor provocate de bacteriile Gram negative
necesit deseori medicamente diferite i o terapie mai agresiv dect
tratamentul infeciilor produse de cele Gram pozitive.
De asemenea, bacteriile Gram pozitive sunt mai sensibile la
colorani i la unele tipuri de dezinfectante.
Peretele celular sau prile sale constituente pot interaciona cu
esuturile omului i animalelor i pot contribui la mbolnvire. LPS din
membrana extern a bacteriilor Gram negative constituie un factor
patogen n unele boli datorit toxicitii lor la om i mamifere.
Proteinele ataate de poriunea extern a peretelui celular al mai
multor specii Gram pozitive, incluznd genurile Corynebacterium i
Staphylococcus au de asemenea proprieti toxice.
Lipidele din pereii celulari ai anumitor specii de Mycobacterium
sunt nocive i pentru celulele mamiferelor i ale omului. Deoarece
majoritatea macromoleculelor din pereii celulari nu exist la animale i
om, ele stimuleaz sistemul imun s produc anticorpi.
51
Excepii privind peretele celular. Mai multe grupe bacteriene
sunt lipsite de structura peretelui celular al bacteriilor Gram pozitive sau
Gram negative, iar unele bacterii nu au deloc perete celular dei aceste
forme excepionale se pot colora pozitiv sau negativ prin metoda Gram.
Examinarea ultrastructurii lor i a componentelor chimice arat c aceste
bacterii nu corespund ntocmai descrierii celulelor Gram pozitive sau
Gram negative.
De exemplu, bacteriile din genul Mycobacterium i Nocardia
conin peptidoglican i se coloreaz Gram pozitiv, dar partea principal a
peretelui lor celular cuprinde tipuri unice de lipide. Unul dintre acestea
este un acid gras, cu lan foarte lung, numit acid micolic sau factor cord
cu rol n patogenitatea bacteriei.
Caracterul dens i ceros conferit peretelui celular de aceste
lipide este de asemenea rspunztor de un grad mare de rezisten la
anumite substane chimice i la anumii colorani. O astfel de
rezisten constituie baza coloraiei Ziehl Neelsen sau Kinyoun folosite
pentru diagnosticarea tuberculozei. n aceast coloraie fuxina Ziehl
fierbinte se fixeaz solid de aceste celule, astfel nct o soluie alcoolic
acid nu ndeprteaz colorantul.
Un grup neobinuit de bacterii, numite arhebacterii au de
asemenea perei celulari chimic diferii i compleci. Unele dintre aceste
bacterii au perei compui aproape n totalitate din polizaharide, altele pur
proteici, dar ca grup toate sunt lipsite de structura peptidoglicanic
propriu-zis, descris mai sus. Deoarece cteva arhebacterii i toate
micoplasmele sunt total lipsite de perete celular, membrana acestora
trebuie s ndeplineasc att funcia de protecie ct i pe cea de transport.
Aceste forme au o membran celular stabilizat i ntrit de tipuri
speciale de lipide.
Unele bacterii, care n mod obinuit posed perete celular l pot
pierde n cursul unei pri a ciclului lor vital. Aceste forme lipsite de
perei sunt denumite forme L sau variante ale fazei L. Formele L se nasc
natural printr-o mutaie n genele formatoare de perei sau pot fi induse
artificial prin tratare cu o substan chimic, ca lizozim sau penicilin, care
rup peretele celular. Cnd o celul Gram pozitiv este expus uneia dintre
aceste dou substane, aceasta i pierde complet peretele celular i devine
un protoplast (o celul fragil mrginit numai de o membran foarte
sensibil la liz). O celul Gram negativ expus acelorai substane pierde
peptidoglicanul, dar i menine membrana extern, formnd un sferoplast.
Exist dovezi n sensul unui rol al formelor L n anumite infecii
(de exemplu n boala ghearelor de pisic).
Formele L au fost numite astfel dup iniiala institutului Lister,
n care s-a fcut prima observaie, au fost descoperite de Klienebergir-
52
Mobel (1935) la Streptobacillus moniliformis, fiind considerate entiti
biologice independente provenite dintr-o contaminare exogen. Ulterior au
mai fost descrise i alte bacterii: Proteus vulgaris, Escherichia coli,
Haemophilus influenzae, Salmonella, Shigella, Bacillus, Clostridium,
Neisseria, Streptococcus, Staphylococcus etc. Se caracterizeaz prin
absena peretelui celular pe lng unele aspecte morfologice i culturale
particulare, o mare sensibilitate la variaiile de presiune osmotic, dar pot
supravieui i se pot dezvolta dac mediul este echilibrat din punct de
vedere osmotic. Au fost descrise trei tipuri de forme L:
1. Forme L stabile sau de tip A (forme L veritabile) care nu
se ntorc niciodat la forma bacterian tipic.
2. Forme L instabile sau de tip B care pstreaz elemente ale
peretelui celular care revin constant la forma bacterian tipic i corespund
sferoplatilor
3. Forme L sau de tip C care pstreaz elemente din peretele
celular dar pierd progresiv capacitatea de revenire la normal.
Supravieuirea acestor forme depinde de gradul de tamponare
osmotic a mediului de cultur, putnd fi meninui viabili n medii
artificiale, tamponate osmotic pn la echivalentul mediului lor intern,
medii hipertonice (cu coninut solvit crescut, 10-20%). n medii sub
izotonia mediului lor intern, aceste forme se umfl prin imbibiie,
membrana citoplasmatic se rupe i citoplasma se elimin, mor.
Protoplatii sunt n general neviabili, greu adaptabili, chiar n
medii artificiale foarte bine tamponate. Sferoplatii sunt mai rezisteni, n
medii de cultur optime, lipsite de factorul care a indus defeciunea
(lizozim, antibiotice), ei sunt uor reversibili la bacteria parental normal
cu perete. Reversibilitatea are loc uor pe oul embrionat de gin. Testul
cel mai eficient prin care se observ c a avut loc recuperarea peretelui
este revenirea colorabilitii prin metoda Gram pentru bacteriile Gram
pozitive. Lipsa mucocomplexului la protoplati determin apariia formelor
sferoidale de dimensiuni diferite, granulare, globulare, gigante, indiferent
care este forma bacteriei din care provin.
Sferoplatii, bacterii cu schelet defectiv iau forme mai diferite:
filamentoase, piriforme, aspecte de nmugurire, etc.
53
Cuvntul membran ca atare desemneaz orice nveli inclusiv
structuri multicelulare ca mucoasele corpului. Privind ns prin perspectiva
unei singure celule, o membran reprezint o fie foarte subire compus
din molecule lipidice specializate (reprezentnd n medie 40% din
coninut) i molecule proteice (aproximativ 60%).
Excepiile principale la aceast descriere sunt reprezentate de
membranele micoplasmelor care conin o cantitate mare de lipide numite
steroli (molecule rigide care au funcia de stabilizare a membranei)
precum i de membranele arhebacteriilor (care conin lipide cu acizi grai
liberi).
Membranele apar n mai multe regiuni ale unei celule, dar rolul lor
principal este acela de membran celular sau citoplasmatic care
nconjoar protoplasma.
Membrana celular este att de subire (are n medie o grosime de
0,007m) nct nu poate fi vizualizat la microscopul optic obinuit.
Examinat la microscopul electronic pe seciuni ultrafine are un aspect
asemntor unei ine de tren aprnd ca o formaiune triplu stratificat
alctuit din dou straturi ntunecate care separ un strat mai clar.
Robertson a denumit aceast structur unitate de membran
(unit-membrane) datorit faptului c ea reprezint unitatea structural
din care sunt alctuite straturile membranare complexe (de exemplu: teaca
de mielin a fibrelor nervoase medulare).
n urma unei analize microscopice i chimice mai detaliate S.J.
Singer i C.K. Nicholson au emis o teorie simpl i interesant privind
structura membranelor numit modelul mozaicului fluid. Conform
acestei teorii o membran este constituit dintr-un dublu strat de fosfolipide
amfipatice, cu orientare polar a regiunilor hidrofile spre exterior,
respectiv interior, i a celor hidrofobe fa n fa. Acest strat bimolecular
fosfolipidic i confer membranei rolul de barier osmotic i ofer
proteinelor enzimatice un sediu care permite deplasarea lor ctre exteriorul
sau interiorul celulei. Poziia lor este proeminent spre una sau ambele fee
ale membranei. Fosfolipidele formeaz un film fluid, discontinuu n care
plutesc proteinele globulare, n timp ce glucidele interacioneaz fie cu
unele, fie cu altele.
Membrana citoplasmatic poate fi pus n eviden la microscopul
fotonic, fie dup o colorare cu albastru Victoria sau n cazul bacteriilor vii,
n cmp ntunecat apare ca o linie net, luminoas, strlucitoare.
Lipidele se gsesc n membran sub form de fosfolipide care sunt
molecule amfipatice cu structur complex ce posed o extremitate polar,
hidrofil (hidrosolubil n stare izolat) i o regiune nepolar, hidrofob
(insolubil n ap) care reprezint cozile moleculei format din doi acizi
grai. n soluie apoas se organizeaz spontan, moleculele aranjndu-se
54
coad la coad astfel nct lanurile hidrofile (polare) s fie expuse spre
soluia apoas, iar lanurile hidrofobe (nepolare) s fie orientate n direcia
opus contactului cu apa. Astfel, cele dou monostraturi de molecule vor
forma mpreun dou straturi hidrofile periferice separate de poriunea
central hidrofob.
Fiecare dublu strat fosfolipidic este un lichid bidimensional n
care moleculele lipidice difuzeaz lateral, schimbndu-i poziia pn la
un milion de ori pe secund. Moleculele se deplaseaz de pe un monostrat
pe altul (tranziia flip-flop) foarte rar (cel mult o dat pe lun pentru o
molecul dat) ceea ce permite meninerea compoziiei membranei i a
structurii ei caracteristice.
Prezena mai multor tipuri de fosfolipide confer o arhitectur mai
fluid care faciliteaz transportul activ prin biomembrane.
Fosfolipidele sunt rspunztoare de integritatea structural a
membranei citoplasmatice i i confer acesteia impermeabilitate la cele
mai multe molecule hidrosolubile care sunt insolubile n regiunea
uleioas a prii de mijloc a membranei.
Proteinele. n funcie de poziia lor n membran sunt de dou
tipuri:
1. integrate (intrinsece) insolubile n ap, nu pot fi ndeprtate
fr ruperea stratului dublu de lipide. Orientarea lor este fix, fiecare
protein de acelai tip fiind ndreptat n aceeai direcie.
Proteinele integrate pot s strbat toat grosimea membranei
celulare (proteine transmembranare) sau se pot gsi fie pe suprafaa
intern (care vine n contact cu citoplasma), fie pe suprafaa extern.
2. de suprafa (periferice sau extrinsece) sunt n general
hidrosolubile i se gsesc fie pe faa extern, fie pe cea intern a dublului
strat lipidic, fiind de regul legate de proteinele integrate.
Proteinele de membran joac rolul de: enzime, de proteine de
transport, asigurnd transportul moleculelor solubile din mediu n celul i
invers, de citocromi i alte proteine care aparin sistemului transportor de
electroni, de proteine cu activitate adenozintrifosfatazic (ATP-az), de
fosfolipaze, de proteaze, pepsidaze, etc.
Glucidele se gsesc sub forma unor polizaharide legate fie de
proteine (glicoproteine) fie de lipide (glicolipide).
Semnificaia biologic. Structura membranei citoplasmatice
explic comportamentul i funciile sale n celul. Aceasta prezint o
asimetrie funcional, datorit faptului c suprafaa intern funcioneaz
diferit de cea extern cu importan esenial pentru viaa celulei. Faza
lipidic asigur o barier de neptruns pentru multe substane, ceea ce
explic capacitatea membranei:
de a controla transportul de molecule n interiorul i n afara
55
celulei;
de a prezenta permeabilitate selectiv;
de a separa reaciile n interiorul celulei.
Proteinele membranare ndeplinesc multe funcii, i anume acelea
de a primi semnale moleculare, de a lega molecule (funcia de receptor),
de a aciona ca enzime i de a servi drept canale de transport.
Aceast structur explic multe caracteristici ale membranelor,
respectiv flexibilitatea, solubilitatea, permeabilitatea i capacitatea de
transport.
Datorit structurii sale fluide componenii se pot deplasa n stratul
bidimensional n aa fel nct activitile funcionale ale membranei pot
implica modificri att n conformaia sa ct i n aranjamentul
componenilor.
Deoarece bacteriile nu posed organite (organe) membrana
celular ndeplinete numeroase funcii legate de transport, de fosforilare,
de prelucrare a substanelor nutritive i de sintez.
Poate s-i mreasc suprafaa prin invaginare, formnd sisteme de
membrane care uneori se ramific n citoplasm. Funcioneaz ca o
barier osmotic dotat cu impermeabilitate cvasitotal fa de unele
tipuri de molecule, permind trecerea nestnjenit a altora. Unele
substane care sunt uor solubile n solvenii lipidelor precum i unii
anioni (ex: Cl-) traverseaz uor biomembranele, pe cnd ali ioni (Na+,
K+, glucidele, proteinele) nu o pot traversa tot att de uor, celula
recurgnd la mecanisme speciale de transport. Membrana este implicat n
mobilitatea bacteriei datorit faptului c una din structurile corpului bazal
al flagelilor intr n compoziia sa.
Particip la formarea i eliminarea unor proteine cum ar fi
enzimele i exotoxinele care pot fi sintetizate n membrana citoplasmatic
sau pe suprafaa sa extern.
Membrana procariotelor constituie un sediu important pentru o
serie de activiti metabolice.
Reprezint sediul unor enzime respiratorii (citocromoxidaze,
dehidrogenaze, catalaze, ale reaciilor de oxidoreducere).
Sistemele enzimatice situate n membrana celular sintetizeaz de
asemenea majoritatea precursorilor constituenilor peretelui bacterian,
fiind dirijat de polimeraze.
Structura membranei celulare reprezint inta aciunii unor
antibiotice. De exemplu, polimixina acioneaz asupra membranei celulare
asigurnd transferul precursorilor i totodat o important modificare a
permeabilitii acesteia, ceea ce explic toxicitatea acestui antibiotic.
56
3.2.4.1. Mezozomii
57
transversal care separ celulele dup diviziune.
Se presupune c mezozomii mresc suprafaa intern disponibil
pentru funciile membranei, ns funciile lor reale constituie n continuare o
problem controversat.
Cretere i reglare
Zarnea G.
(reacii de biosintez i catabolism)
Diviziune celular
3.3.1. Protoplasma
58
nucleului cu citoplasma, avnd n vedere absena unor membrane
intracelulare.
La celulele tinere citoplasma ader la peretele celular ca o mas
dens, omogen i intens colorabil. La cele btrne, se retract, i pierde
afinitatea tinctorial i capt o structur granular cu vacuole din ce n ce
mai evidente prin microscopie electronic.
O caracteristic a citoplasmei bacteriene este prezena unei mari
cantiti de ARN, ceea ce explic bazofilia ei intens. Aceast calitate este
mai evident la celulele tinere.
59
culturile tinere apar cu 2-4 cromozomi genetic identici deoarece provin din
replicarea cromozomului parental. Cnd celula este n stare de repaus,
viteza de replicare a materialului nuclear este proporional cu viteza de
cretere a celulei.
Examinat la microscopul electronic sau expus unor colorani
speciali, corpusculul cromatinic prezint aspect granular sau fibros.
Dei genomul reprezint condiia minim necesar pentru
supravieuirea bacterian, multe specii conin alte fragmente de ADN,
numite plasmide. Plasmidele sunt molecule mai mici de ADN
dublucatenar, independente de cromozom, caracteristice celulei procariote.
Totalitatea materialului genetic plasmidic din celula bacterian constituie
plasmonul.
Pot fi considerai cromozomi miniaturali (minicromozomi). Mai
pot fi desemnai i cu denumirile de material genetic suplimentar, auxiliar
sau extracromozomal. Reprezint aproximativ 1% din mrimea
cromozomului.
Aceste fragmente extracromozomale circulare minuscule confer
deseori bacteriilor caracteristici protectoare, cum ar fi rezistena la
medicamente i la radiaii sau producerea de toxine i enzime.
Deoarece plasmidele pot fi uor manipulate n laborator i
transferate de la o celul bacterian la alta, reprezint un element important
n tehnicile moderne de inginerie genetic.
Funcia biologic a materialului genetic const n determinarea
caracterelor care definesc fiecare specie bacterian, reprezentate de
ereditate, arhitectur precum i de capacitatea de evoluie a celulei
bacteriene.
Ribozomii (Granulele lui Palade) sunt structuri granulare cu rol
major n fiziologia celulei. Sunt particule nucleoproteinice
intracitoplasmatice de form aproximativ sferic cu diametrul de 20 nm.
O celul bacterian conine mii de ribozomi (15.000-100.000/celul) cu
constanta de sedimentare 70S i greutatea molecular 3000 kDa, ce
prezint tendina de a disocia rapid n dou subuniti mai mici inegale, cu
constantele de sedimentare 30S i 50S. Ei sunt ataai de membrana
celular i de mezozomi.
Din punct de vedere chimic, un ribozom este o combinaie de tip
special de ARN, numit ARN ribozomal sau ARNr (aproximativ 60%) i
proteine (40%).
O metod de caracterizare a ribozomilor este metoda de evaluare
prin uniti S a dimensiunilor moleculare ale diferitelor pri celulare care
au fost separate pe baza greutii ntr-o centrifug. Prin asocierea acestei
metode cu o micografie electronic de nalt rezoluie s-a demonstrat c
ribozomul procariot, evaluat n general ca msurnd 70S, este n realitate
60
alctuit din dou subuniti mai mici. Aa numita subunitate 30 S are un
aspect asemntor unei inimi, iar unitatea 50 S seamn cu o coroan. Ele
se unesc pentru a forma o platform n miniatur pe care se efectueaz
sinteza proteinelor.
Vom examina n continuare mai n amnunt aceste dou subuniti
din care sunt alctuii ribozomii.
Subunitatea mic 30 S (g.m. 900.000 dal) este alctuit din 21
molecule de proteine diferite, notate de la S1 la S21 (small = mic) i o
molecul de ARNr notat 16 S format din aproximativ 16.000 nucleotide.
Este format din trei regiuni:
cap (o treime din subunitatea mic);
baz (restul de dou treimi);
platform separat de cap printr-o scobitur numit fisur
(despictur, cleft).
Subunitatea mare 50S (g.m. 1.600.000 dal) este alctuit din 34
proteine diferite, notate convenional de la L1 la L34 (large = mare).
Modelul de structur al subunitii mari include o protuberan
central, flancat de cte o prelungire de fiecare parte, cea mai extins
fiind numit, peduncul, iar cealalt, creast (ridge), ntre ele
gsindu-se o vale.
Cnd cele dou subuniti sunt asociate, pedunculul subunitii
mari are baza aproape de constricia de pe o subunitate mic, iar capul
unei subuniti mici i protuberana subunitii mari sunt aproximativ
aliniate.
S-a demonstrat c att proteinele ct i moleculele de ARN, ocup
poziii bine definite la suprafaa ribozomilor, conferind n ansamblu
subunitii 50 S, o form ce ar putea fi asemnat dup unii autori cu o
coroan, iar dup alii cu un fotoliu.
Subunitatea 30 S a fost asemnat fie cu o inim, fie cu o
halter asimetric rezemat orizontal pe braele i sptarul fotoliului.
ntre cele dou subuniti (ntre scobitura fotoliului i gtul halterei)
rmne un canal lung i ngust, prin care trece ARNm, purttor al
informaiei genetice necesare pentru sinteza proteinelor.
Unii ribozomi se gsesc liberi n citoplasm, n timp ce alii apar
legai de faa intern a membranei citoplasmatice. O celul de E. coli n
plin cretere sintetizeaz circa 500 ribozomi/minut, acest proces implicnd
att sinteza, ct i asamblarea moleculelor.
Ribozomii sunt componente eseniale ale sistemului de traducere a
informaiei genetice reprezentnd adevrate fabrici de proteine. n
cursul procesului de biosintez a proteinelor, ribozomii individuali au
tendina de a se grupa n iruri lineare.
61
3.3.1.2. Granule, incluzii
62
mai puin refringente dect citoplasma, care apar n celula bacterian n
perioada ei de cretere activ.
Conin diferite substane dizolvate n ap fiind nconjurate la
periferie de un nveli lipoproteic unistratificat numit tonoplast.
ndeplinesc rolul de reglatori ai presiunii osmotice n raport cu mediul
extern sau de depozitare a substanelor de rezerv, n perioada
premergtoare formrii incluziilor.
Bacteriile care conin vacuole umflate cu gaze au o densitate
global mai mic dect apa i de aceea plutesc la suprafaa acesteia.
Permit bacteriilor acvatice mobile s-i modifice poziia ntr-o coloan
vertical de ap, mai ales n lacurile stagnante.
Rhapidosomii (gr. rhapidos = bastona, soma = corp) sunt
particule ribonucleoproteice, de form tubular, identificate att la
bacteriile nepatogene ct i la cele patogene (Pseudomonas, Proteus) cu
semnificaie biologic nc necunoscut.
Magnetosomii sunt incluziuni care conin fier sub form de
magnetit, ntlnite la unele bacterii acvatice. Prezena lor orienteaz
deplasarea dirijat pe cmpuri magnetice a bacteriilor respective. Aceste
incluzii acioneaz ca o busol (biomagnetic), asigurnd orientarea
pozitiv i deplasarea bacteriilor n cmpuri magnetice.
63
factorilor de mediu. Evidenierea sporilor n laborator se realizeaz prin
metode directe, cum ar fi coloraia cu verde de malachit sau indirecte prin
coloraia Gram.
Tabel 3.2.
Fenomene fizice i chimice majore ale procesului de formare a endosporilor
Stadiu/Starea celulei Proces/fenomen
Reprezint stadiul 0, ce corespunde strii de celul vegetativ la
sfritul perioadei de cretere exponenial, care conine n mod normal
Celula vegetativ
doi nucleoizi complet separai spaial. Materialul nuclear devine mult
mai dens
Celul vegetativ n stadiu Celul n stadiu precoce de formare al filamentului de cromatin (durata
precoce 0-1,5 h)
Filamentul de cromatin se separ din nou n doi cromozomi dintre care
unul migreaz la o extremitate a celulei unde este nchis ntr-un
compartiment corespunztor viitorului spor prin invaginarea membranei
plasmatice (ca un diafragm). Rezult doi protoplati inegali (celula
mam i presporul) care sunt acoperii de acelai perete celular. n
Celula vegetativ devine spo-
compartimentul corespunztor celu-lei vegetative continu sinteza de
rangiu n pregtire pentru pro-
ADN i de substane specifice acesteia n timp ce n cel al viitorului spor
cesul de sporulare
nu mai are loc replicarea ADN-ului formndu-se substane specifice
sporului. Acest protoplast sau miez al sporului conine structurile i
substanele chimice necesare pentru dirijarea proceselor vitale. n acest
timp sporangele sintetizeaz activ compuii necesari pentru formarea
sporilor. Acest stadiu dureaz 1,5-2,5 ore
Protoplastul este ingerat de sporangiu pentru a facilita formarea
straturilor protectoare n jurul su. Are loc formarea presporului liber n
Sporangiu celula mam, acoperit de o membran dubl rezultat din creterea
membranei citoplasmatice a sporangiului. Dureaz de la 2,5 pn la 4-5
ore
Un strat de peptidoglican special formeaz un cortex n jurul
Sporangiu cu prespor. Formarea protoplastului sporal, denumit acum prespor. Se depune calciul i acidul
cortexului. dipicolinic; miezul devine deshidratat i metabolic inactiv. Dureaz 4,5-
6 ore
Se adaug 3 nveliuri consistente i impermeabile de proteine multiple
Sporangiu cu prespor. Formarea
prin depozitarea pe suprafaa cortexului i ncorporarea de cistein.
nveliurilor sporale.
Dureaz 6-7 ore
Sporul se ngroa iar rezistena la cldur este total; sporangiul nu mai
este funcional i ncepe s se deterioreze. Are loc maturarea sporului
Spor matur
cu apariia refringenei i a rezistenei. Citoplasma devine mult mai
omogen i electronodens. Dureaz 7-8 ore
Pierderea complet a sporangiului cu eliberarea sporului din celula
Spor liber mam prin enzimele litice activate de maturarea sporului. Acesta poate
rmne inactiv (dormant) ns viabil mii de ani
64
produs n interiorul unei celule. Are rol n supravieuirea celulei, dar nu i
n reproducerea acesteia, deoarece nici diviziunea celular i nici creterea
numrului de celule nu sunt implicate n formarea sa.
n schimb, fungii produc multe tipuri diferite de spori, cu rol att n
supravieuire ct i n reproducere.
Lipsa unor surse nutritive, n special carbon i azot, reprezint un
stimul pentru ca o celul vegetativ s sporuleze. Odat ce acest stimul a
fost primit de ctre celula vegetativ aceasta se va transforma ntr-o celul
formatoare de spor numit sporangiu. Transformarea complet a unei
celule vegetative ntr-un sporangiu i apoi ntr-un spor necesit 6-8 ore la
majoritatea speciilor sporogene.
Condiii de mediu
favorabile:
ap (agent de GERMINARE Condiii de mediu
germinare); nefavorabile:
stimuli specifici temperatur;
(pH 6-8; uscciune;
substane chimice prezena O2 (CO2);
reprezentate de densitatea
glucoz, acizi germenilor pe
aminai, unitatea de volum.
nucleozide); SPOROGENEZ
oc termic.
Cele dou stadii difer prin
constante morfologice;
structur; afinitate tinctorial.
65
Fazele germinrii:
1. Faza de activare (iniierea germinrii).
Odat cu schimbarea condiiilor de mediu, se produc modificri n
structura sporului care i permit acestuia s rspund la stimulii de
germinare. n aceast faz se produce modificarea cortexului, umflarea i
alungirea sporului, pierderea refringenei i eliberarea unor substane de
origine sporal n mediu (peptide, dipicolinat de calciu, peptidoglican).
2. Germinarea propriu-zis este declanat de expunerea sporilor
activai la stimuleni specifici (glucoz, acizi aminai, nucleozide etc.). n
cursul germinrii stadiul de laten nceteaz, activitatea metabolic crete,
iar rezistena la agenii fizici i chimici (cldur, refringen,
impermeabilitate fa de colorani) dispare. nveliul sporal (B. cereus, B.
mycoides) se lizeaz sau se dezintegreaz mecanic (B. subtilis).
3. Creterea are loc prin distrugerea nveliurilor sporale i ieirea
unei noi bacterii, proces ce se realizeaz prin sinteza de novo a proteinelor
i a constituenilor structurali ai celulei vegetative.
Germinarea se consider ncheiat n momentul relurii
multiplicrii.
Att procesul de sporogenez ct i cel de germinare se gsesc sub
controlul a aproximativ 50 de gene situate n loci diferii pe cromozom.
Controlul sporulrii se realizeaz la nivelul transcrierii informaiei
genetice i la nivelul traducerii acesteia.
Factorii de mediu exercit un rol activant sau inhibant asupra
procesului de sporogenez i a celui de germinare. De exemplu, sporularea
are loc numai n anumite limite de temperatur (18-40oC). De asemenea,
este influenat de uscciune, prezena oxigenului sau a bioxidului de
carbon precum i o anumit densitate a germenilor pe unitatea de volum.
Germinarea este influenat n sens pozitiv de temperatur,
umiditate, oc termic (nclzire brusc la 60-80oC), pH 6-8, substane
chimice (glucoz, aminoacizi, ioni de sodiu, potasiu, calciu).
Factorii care inhib germinarea sunt reprezentai de: ap distilat,
glicerin, unele antibiotice (de exemplu: laterosporinele).
- temperatur
- umiditate
- oc termic - ap
- pH + - distilat
- substane chimice GERMINARE - glicerin
- antibiotice
67
celulei vegetative.
Raporturile anatomice ntre spor i sporangiu.
n frotiurile efectuate din culturi bacteriene, sporii apar fie liberi,
fie ataai sau integrai n celula vegetativ n interiorul creia s-au format.
n funcie de raportul dintre diametrul transversal al sporului fa
de cel al sporangiului, pot aprea dou situaii:
Diametrul sporului poate depi diametrul celulei vegetative,
aceasta din urm aprnd deformat;
Diametrul sporului apare mai mic dect cel al celulei vegetative
care apare nedeformat.
Dup poziia sporului n raport cu axul longitudinal al sporangiului
pot exista patru situaii:
Spor dispus central, la mijlocul axului longitudinal al celulei
vegetative;
Spor dispus subterminal, situat ctre una dintre extremiti;
Spor terminal, aflat la una din extremiti;
Spor lateral, situat central sau asimetric n raport cu grosimea
bacteriei.
68
vegetative.
Supravieuirea lor n condiii att de aspre se datoreaz mai multor
factori:
Spre deosebire de celula vegetativ sporii nu conin incluzii de
poli--hidroxibutirat, enzimele ciclului Krebs, unii transportori de electroni
din membran, n schimb, conin proteine structurale i enzime litice
proprii.
n plus, deoarece sporul are un coninut redus n ap liber, sruri
de fosfor, potasiu, acizi nucleici, el este i metabolic inactiv fiind foarte
rezistent la uscciune. Din acest motiv ei pot rmne viabili o perioad
ndelungat n diferite materii aflate n stare uscat.
Rezistena mare a sporilor la diferite substane chimice i la
radiaii, se datoreaz ntr-o oarecare msur i scoarei groase i
impermeabile a nveliurilor sporale. Dintre acestea putem meniona
urmtoarele: diferite antibiotice (puin active), alcoolul i cloroformul
(total inactive fa de spori), iar glicerina prezint chiar o aciune
conservant asupra sporilor. Acest fapt prezint importan n practica
preparrii unor vaccinuri (de exemplu: stabilizarea suspensiilor de spori n
cazul vaccinului anticrbunos).
Longevitatea sporilor este bine dovedit. ntr-un raport, este
descris izolarea unor spori viabili dintr-un specimen arheologic vechi de
3000 ani.
Condiiile de mediu sunt foarte importante n rezistena sporilor.
De exemplu, sporii formai n prezena ionilor de calciu sunt mai rezisteni
dect cei formai n absena acestora.
Rezistena la cldur a endosporilor a fost pus n legtur cu
coninutul lor mare de calciu i acid dipicolinic, dei rolul exact al acestor
substane chimice nu este nc pe deplin elucidat. S-a demonstrat c exist
un raport direct ntre cantitatea de acid dipicolinic i gradul de
termorezisten al endosporilor. tim c, de exemplu, cldura distruge
celulele prin inactivarea proteinelor i a ADN-ului i c acest proces cere
un anumit coninut de ap n protoplasm. Deoarece depunerea de
dipicolinat de calciu n spor ndeprteaz apa i las sporul foarte
deshidratat, acesta va fi mai puin vulnerabil la efectul cldurii.
Sporii rezist cteva ore la 180oC, cldur umed, iar la 115-
o
120 C, cldur uscat, cteva minute.
Gradul de termorezisten al sporilor depinde de urmtorii factori:
Specia bacterian. Sporii unor specii sunt mai rezisteni la
cldur dect cei ai altor specii bacteriene. De exemplu, sporii de B.
subtilis sunt mai rezisteni dect cei de B. anthracis;
Biotipul. n cadrul aceleiai specii exist diferene de rezisten
ntre biotipuri. De exemplu, sporii de C. perfringens, tipul E, sunt mai
69
rezisteni dect cei din tipurile C i D.
70
unele cu altele formnd colonii, fiecare n parte este pe deplin capabil s
execute toate activitile vitale necesare ca, reproducerea, procesele
metabolice i prelucrarea substanelor nutritive (spre deosebire de celulele
mai specializate ale organismelor pluricelulare).
71
- form cocobacilar, cu aspect de bacil scurt, cu capetele rotunjite.
Sunt bacterii de talie mic (1-1,5 lungime i 0,4-0,8 n
diametru), care n mod obinuit nu formeaz agregate, dar uneori pot s
apar grupate cte dou sau n lanuri scurte (de exemplu: familia
Enterobacteriaceae).
Alte forme de bacterii (n afara celor principale i a celor
intermediare) sunt reprezentate de:
- Vibrionul, bastona ncurbat, n form de virgul (cornioare),
caracteristic unor genuri cum ar fi: Vibrio cholerae, numit i Vibrio
comma (comma = virgul), de dimensiuni mici (2-4/0,3-0,5), de obicei
izolai, rareori cte 2-3 dispui cap la cap, precum i, genul Campylobacter
(campylo = curb).
- Spirilul, filament cu mai multe ture de spiral rigide. Sunt lungi
de 5-10 m i groi de 0,2-0,7m. Sunt bacterii mobile, de obicei
flagelate, lofotrich sau amfitrich (de exemplu: Spirillum volutans i alte
specii saprofite).
- Spirochetul este o bacterie filamentoas lung de 10-20, foarte
subire (0,1-0,3), cu spire strnse i regulate, flexibile care se pot strnge
sau relaxa (de exemplu: bacteriile din genurile Borrelia, Treponema i
Leptospira). Peretele celular, dei conine glicopeptide, prezint un anumit
grad de flexibilitate, spre deosebire de bacteriile tipice, rigide.
Aparatul locomotor este reprezentat de un fascicul de fibrile
contractile, fixate la cele dou capete ale protoplastului. Protoplastul
filamentos este nfurat n jurul fasciculului de fibrile, totul fiind acoperit
de peretele bacterian. Fibrilele au aceleai proprieti contractile ca i
flagelii bacteriilor tipice, dar prin poziia lor intern, ele asigur nu numai
mobilitate, ci i flexibilitate bacteriei.
- Filamentul are ca prototip actinomicetul, microorganism foarte
asemntor cu fungii, avnd particularitatea de a forma hife, cu tendin de
ramificare perpendicular, bacterii miceliene.
ntr-un stadiu mai avansat, filamentele se fragmenteaz n forme
bacilare de lungimi diferite.
Este destul de obinuit, ca celulele aceleiai specii, s difere n
oarecare msur ca form i dimensiune. Acest fenomen, numit
pleomorfism (Gr. pleon, mai multe; Gr. morph, form), se datoreaz
variaiilor individuale ale peretelui celular, provocate de diferene
nutriionale sau de unele mici diferene ereditare (de exemplu: celulele din
genul Corynebacterium sunt n general considerate ca avnd form de
bastona, ele prezint ns n cultur variaii, cum ar fi formele de
mciuc, umflat, curbat, filamentoas sau cocoid). Pleomorfismul
atinge maximul la bacteriile din genul Mycoplasma, care sunt complet
lipsite de perei celulari i ca atare prezint variaii extreme de form.
72
Pe de alt parte, pleomorfismul, trebuie acceptat ca o nsuire care
se manifest cu diferite grade de intensitate, n funcie de tulpin i de
condiiile de mediu, la toate speciile bacteriene.
Gama tipurilor bacteriene prea n trecut mult mai simpl dect se
dovedete a fi astzi. De la mijlocul, pn spre sfritul secolului al XIX-
lea, majoritatea bacteriilor cunoscute puteau fi uor reunite sub cteva
denumiri generice. Bacteriile sferice erau incluse n genurile Micrococcus,
Streptococcus, sau Staphylococcus, iar bacteriile n form de bastonae
erau ncadrate fie n genul Bacterium, fie n genul Bacillus. Dac acestea
aveau forme de bastonae curbate erau ncadrate n genul Vibrio, iar atunci
cnd aveau forme spiralate erau clasificate fie n genul Spirillum, fie n
genul Spirochaeta. Deoarece se cunotea foarte puin despre
caracteristicile biochimice ale acestor bacterii, iar coloraia Gram nu era
nc folosit ca un mijloc general de clasificare, studiul morfologiei lor
constituia metoda principal de identificare. Ca urmare, bacterii despre
care tim astzi, c sunt foarte diferite, erau ncadrate deseori n acelai
gen (de exemplu: Escherichia coli era n trecut denumit Bacterium coli,
Pseudomonas aeruginosa era denumit Bacterium aeruginosa, iar pentru
Streptococcus lactis se folosea termenul de Bacterium lactis, dei primele
dou bacterii sunt bacili, iar a treia este coc.
Schemele actuale de clasificare cuprind peste 1000 de genuri, iar
identificarea bacteriilor se bazeaz pe sute de caracteristici. Dei n
prezent se cunosc peste 5000 de specii, n fiecare an se descoper altele
noi. Creterea recent a numrului de specii noi se datoreaz n parte
perfecionrii tehnicilor de identificare. Unii bacteriologi consider c noi
nu am fcut dect s zgriem suprafaa i c mai rmn s fie
descoperite miliarde de bacterii.
Unele nume generice de bacterii apar tiprite i cu majuscule i cu
litere mici (obinuite). De exemplu, termenul Staphylococcus, dup cum
arat aici, se refer la un gen deosebit de bacterii n form de coci, cu un
set special de caracteristici. Cnd denumirea nu apare nici cu majuscule i
nici cu litere mici (cursive), germenii fiind prezentai la plural, acesta
reprezint un mod general de a desemna membrii genului respectiv sau de
a descrie un aranjament (dispoziie; mod de grupare) sau un tip celular. De
exemplu, streptococi, micrococi, micobacterii sau pseudomonade. Tot
astfel de exemple se pot da i n cazul lui Bacillus i Spirillum ce se refer
la gen iar dac acestea apar scrise cu litere mici (bacili; spirili) se refer la
forme. Gruprile specifice cocilor sunt reprezentate de:
- coci neagregai;
- tetrad;
- sarcin;
- stafilococ.
73
Cocii neagregai sunt coci izolai ce se ntlnesc la toate
bacteriile sferice indiferent de aezarea caracteristic speciei.
Tetrada este o grupare format din patru coci aezai simetric,
datorit diviziunii n dou planuri perpendiculare i persistenei alipirii
timp de dou generaii. Acest aspect este rar ntlnit (de exemplu:
Micrococcus tetragenes).
Sarcina este o grupare mai complex, constituit din pachete
cubice de 8, 16 sau mai multe celule. Aceste grupri diverse de coci
reprezint rezultatul diviziunii n trei sau mai multe planuri perpendiculare
care se intersecteaz. Dup diviziune celulele fiice rezultate rmn ataate.
Este caracteristic genului Sarcina (S. flava, S. aurantiaca) sau
Sporosarcina ureae.
Stafilococul este constituit din grmezi neregulate de coci dispui
asemntor ciorchinilor de struguri (staphylos = strugure), datorit
diviziunii n planuri neregulate i a persistenei alipirii timp de mai multe
generaii. Acest tip de grupare este caracteristic genului Staphylococcus.
Gruprile comune att cocilor ct i bacililor sunt reprezentate de:
- gruparea diplo
- gruparea strepto
Gruparea diplo, la care diviziunea se face dup planuri succesive
paralele, celulele rezultate rmnnd cte dou.
Gruparea diplo n cazul cocilor este caracteristic pentru
Streptococcus pneumoniae.
Acesta are o form lanceolat, grupndu-se specific cu prile
ascuite spre interior i cele rotunjite spre exterior, astfel nct diametrele
mari ale celor doi coci sunt n continuare, suprapunndu-se axului mare al
diplococului. n cazul bacteriilor din genul Neisseria (N. gonorrhaeae, N.
meningitidis) diametrele lungi ale celor doi coci sunt paralele, agregatul
lund aspectul a dou boabe de cafea care se privesc prin feele plane.
Bacilii se pot grupa fie cte doi, fie n linie dreapt (de exemplu:
Klebsiella), fie asemntor literei V (de exemplu: bacilul rujetului).
Gruparea strepto (streptos = lan) apare cnd diviziunea se
realizeaz dup planuri succesive paralele, rezultnd lanuri de celule de
lungimi variabile.
Lanurile formate de coci se aseamn cu un irag de mrgele,
purtnd denumirea de streptococi (formai din patru pn la sute de
celule), iar cele formate de bacili, se numesc streptobacili fiind
caracteristice speciilor din genul Bacillus (B. anthracis).
Gruprile specifice bacililor sunt reprezentate de:
- palisad
- litere chinezeti
- filament
74
- forme ramificate
Gruparea n palisad (grilaj) asemntoare cu scndurile unui
gard, dinii unui pieptene sau degetele de la mn, apare datorit faptului
c celulele rmn apropiate i paralele n sensul axului lor lung, aezarea
lor rezultnd dintr-o micare de basculare a celulei fiice, avnd ca punct de
sprijin peretele transvers recent separat.
Aranjamentul n palisad se constituie cnd celulele unui lan
rmn ataate, dar numai printr-o mic regiune tip balama la capete.
Celulele tind s se plieze una pe cealalt formnd un ir i fiind orientate
latero-lateral. Reacia poate fi comparat cu comportarea unor vagoane de
marf ale unui tren intrat n derapare rezultnd o grupare care se aseamn
ntructva cu o palisad (gard alctuit din rui) (de exemplu: bacteriile
din genul Corynebacterium sau cele din genul Mycobacterium, cum ar fi
Myb. leprae).
Gruparea n litere chinezeti sau litere de tipar (X, Y, V, N) este
reprezentat de grmezi mici, compuse din 2-4 bacili aezai neregulat,
alturai sau suprapui formnd ntre ei unghiuri suprapuse, ca beele de
chibrit mprtiate ntmpltor pe o mas. De exemplu, bacteriile din genul
Corynebacterium (Cor. diphteriae) sau cele din genul Mycobacterium
(Myb. tuberculosis).
Filamentul reprezint, de fapt, un plasmodiu, avnd loc
multiplicarea citoplasmei i a materialului nuclear fr constituirea peretelui
celular i a membranei citoplasmatice separatoare ntre celule.
De exemplu, unele bacterii din genul Bacillus cum ar fi B.
anthracis.
Formele ramificate reprezint tot plasmodii fiind caracteristice
actinomicetelor.
Marea majoritate a bacililor nu formeaz ns agregate i dup
fiecare diviziune celulele fiice se dezlipesc i apar dispersate n cmpul
microscopic (de exemplu: marele grup al enterobacteriaceelor).
n ceea ce privesc cauzele gruprii bacteriilor dup diviziune exist
cteva ipoteze:
Diviziunea se realizeaz prin intermediul unui sept
transversal care crete centripet de pe suprafaa intern a peretelui celular.
La bacteriile care se separ dup diviziune se presupune existena unui
mecanism de scindare a septului n dou foie, n timp ce la altele acesta
rmne nedivizat, realiznd unirea celulelor n grmezi sau lanuri;
n unele cazuri, septul transversal s-ar forma incomplet,
astfel nct celulele rezultate din diviziune ar rmne legate printr-o uvi
de citoplasm care ar reprezenta o punte de legtur ntre cele dou celule
echivalent plasmodesmei, pus n eviden ntre celulele multor esuturi
vegetale i animale;
75
Dup Prvot, la unele specii de bacterii sferice, gruparea
s-ar datora unei substane vscoase, gomoase, sintetizat de celula
bacterian i depus pericelular, difuz pe toat suprafaa celulei sau din
contr localizat n anumite regiuni, determinnd diferite tipuri de
polarizare a celulelor: radiar simpl (diplococ), diametral simpl
(streptococ), biradiar (tetracoc), bidiametral (sarcin), circumfereniar
(stafilococ).
n alte cazuri, gruparea dup diviziune depinde de existena
unor teci comune sau de existena unor substane de continuitate
intercelular a peretelui celular (Streptococcus faecalis). Bacteriile din
genul Sarcina formeaz pachete (opt-cteva sute de celule) datorit
existenei unui strat gros de 150-200 nm, format n totalitate sau n mare
parte dintr-un material similar celulozei prezent pe suprafaa extern a
peretelui celular.
Dimensiunile bacteriilor. Dimensiunile bacteriilor sunt foarte
mici, de ordinul micronilor fiind vizibile numai la microscop. Cocii au un
diametru care variaz ntre 0,5-3,0; bacilii au diametrul ntre 0,2-2,0 i o
lungime ntre 0,5-20. Vibrionii i spirilii au diametrul ntre 0,2-2,0 i o
lungime ntre 0,5-100. Spirochetele au un diametru care se situeaz ntre
0,1-2,0 i o lungime ntre 0,5-250.
Cele mai mici bacterii sunt micoplasmele care au n diametru de
125-200 nm i rickettsiile care prezint nsuiri intermediare. Sub raportul
dimensiunilor cele mai mici bacterii se suprapun virusurilor mari
(Poxvirus), fiind vizibile la microscopul fotonic, iar cele mai mari
depesc mrimea celor mai mici protiste eucariote.
Dintre bacteriile clasice, germenii din genurile Brucella i
Pasteurella au cele mai mici dimensiuni. Se pot considera bacterii mici,
cele ale cror dimensiuni variaz ntre 0,1 i 2-3.
Bacteriile cele mai mari au o lungime ce variaz ntre 10-15.
Dintre acestea menionm germenii din familia Bacillaceae.
Marea majoritate a bacteriilor au dimensiuni cuprinse ntre 2-10
lungime, iar diametrul transversal variaz ntre 0,2 i 2-3.
n general, exist o corelaie ntre lungime i diametrul transversal.
De exemplu, germenii din genurile Bacillus i Clostridium sunt cei mai
lungi, dar i cei mai groi bacili. Exist i excepii, ca de exemplu, bacilul
rujetului care dei poate ajunge la 3-4 lungime este n schimb cel mai fin
bacil avnd o grosime de 0,2-0,4.
76
Capitolul 4
Microbiologia crnurilor proaspete
77
abator, exist tendina ca biota de pe carcasele externe s se rspndeasc
n cteva zile de la o carcas la alta. Efectul practic al acestui fapt l
reprezint posibilitatea de contaminarea a unor astfel de produse la nivel
de comercializare cu amnuntul.
Produsele biochimice ce conduc la instalarea rigiditii
cadaverice. La sacrificarea unei vite, carcasa acesteia sufer o serie de
modificri. Lawrie a discutat despre aceste procese n amnunt i vor fi
prezentate aici n form schematic. Stadiile sacrificrii unui animal sunt
urmtoarele:
1. nceteaz circulaia: se pierde capacitatea de resintetizare a ATP-
ului; datorit acestui fapt are loc combinarea actinei cu miozina, formnd
actomiozina, care duce la o rigiditate a muchilor.
2. Aportul de oxigen este suprimat, avnd drept rezultat o diminuare
a potenialului redox.
3. Aportul de vitamine i antioxidani nceteaz, avnd drept rezultat
o dezvoltare lent a rncezirii (putrezirii).
4. nceteaz reglarea nervoas i hormonal, provocnd scderea
temperaturii animalelor i solidificarea grsimii.
5. nceteaz respiraia, avnd loc oprirea sintezei de ATP.
6. ncepe glicoliza, avnd ca rezultat transformarea a glicogenului n
acid lactic, ceea ce scade pH-ul, de la aproximativ 7,4 la un nivel ultim de
aproximativ 5,6. Aceast scdere a pH-ului iniiaz denaturarea
proteinelor, elibernd activitatea catepsinelor i finalizeaz rigiditatea
cadaveric. Denaturarea proteinelor este nsoit de un schimb de cationi
bivaleni i monovaleni pe proteinele din muchi.
7. Sistemul reticuloendotelial nceteaz s-i desfoare activitatea
de curire, ceea ce permite microorganismelor s se nmuleasc
necontrolat.
8. Are loc acumularea diverilor metabolii, ceea ce contribuie, de
asemenea, la denaturarea proteinelor.
Aceste procese se desfoar ntre 24 i 36 de ore, la temperaturile
obinuite la care se pstreaz carnea de vit proaspt tiat (2-5C). O
parte din biota normal provine din limfonodurile proprii ale animalului,
de pe cuitul de exsangvinizare, de pe piele, din tractul intestinal, din praf,
de pe minile manipulatorilor, de pe cuitele de tranare etc. Dup o
depozitare prelungit la temperatura de refrigerare, ncepe alterarea de
ctre microbi. n eventualitatea c temperaturile interne nu sunt reduse la
4C, alterarea va fi provocat de bacterii din surse interne. Dintre acestea,
principalele sunt Clostridium perfringens i genurile din familia
Enterobacteriaceae. Pe de alt parte, alterarea bacterian a crnii
refrigerate are loc la suprafa, ceea ce reflect surse externe ale biotei de
alterare.
78
Biota din carne. Termenul de biot este folosit n acest text, n loc
de flor, ca referire general la bacterii. Flora se refer la viaa plantelor.
Termenul de flor bacterian dateaz din perioada cnd se considera c
bacteriile ar fi plante primitive. Deoarece, bacteriile nu sunt plante se
prefer n locul florei, termenul de biot sau de microbiot
bacterian. n general, biota reflect mediile de tiere i de procesare
menionate mai sus, bacteriile Gram negative fiind predominante. Dintre
bacteriile Gram pozitive, cel mai frecvent se gsesc enterococii i
lactobacilii. Din cauza prezenei lor n toate mediile de procesare a crnii
este de ateptat ca numrul mucegaiurilor s fie foarte mare, incluznd
Penicillium, Mucor i Cladosporium. Levurile care se gsesc frecvent n
carnea de vit i de pasre sunt membrii ai genurilor Candida i
Rhodotorula.
Incidena/prevalena microorganismelor n crnurile roii
proaspete. Plcile de numrare aerobe (APCS = aerobic plate counts), din
carnea proaspt tocat sunt considerate mai mari dect cele raportate n
majoritatea statelor. ntr-un studiu efectuat n SUA, privitor la 563 de
probe de carne de vit crud tocat, numrul mediu log10 pentru APC a
fost de numai 3,90, iar pentru bacteriile coliforme, Clostridium
perfringens i Staphylococcus aureus, numerele respective au fost de 1,98,
1,83 i 1,49. Nu este elucidat n ce msur, aceste numere mai mici
reflect o tendin de scdere a bacteriilor din carnea proaspt tocat sau a
metodologiei de laborator. Timp de mai multe decenii carnea tocat s-a
dovedit a conine un numr mai mare de microorganisme dect cea
netocat (costie, antricoate, cotlete), cauzele fiind urmtoarele:
1. carnea tocat din comer este compus din diferite pri secionate,
care sunt manipulate excesiv, coninnd n general niveluri ridicate de
contaminare microbian. Carnea mrunit, sub form de buci mari
conine n general un numr mai mic de microbi.
2. Carnea tocat prezint o suprafaa mai mare de expunere, ceea ce
explic biota crescut a acesteia. Trebuie amintit c, dimensiunea
poriunilor fiind redus, suprafaa total crete, avnd loc o mrire
consecutiv a energiei de suprafa.
3. Aceast suprafaa fiind mai mare favorizeaz creterea bacteriilor
aerobe, care reprezint biota obinuit de alterare la temperaturi joase.
4. n unele uniti comerciale, dispozitivele de mcinare a crnii,
cuitele de secionare i ustensilele de depozitare sunt rareori curite, att
de temeinic i frecvent pe ct este necesar, pentru a preveni creterea
numrului de microbi. Aceasta poate fi ilustrat de datele obinute ntr-un
studiu de bacteriologie dintr-o bcnie mare. Lama fierstrului de tiat
carne i masa de secionare erau terse imediat dup ce erau curate n trei
ocazii diferite, cu urmtoarele rezultate medii: pe lama fierstrului exist
79
un numr total de log10/in2, un numr de 5,28 cu 2,3 coliformi, 3,64
enterococi, 1,60 stafilococi i 3,69 micrococi; masa de secionare a
prezentat un numr mediu log10/in2, un numr de 5,69 cu 2,04 coliformi,
3,77 enterococi, < 1,00 stafilococi i 3,79 micrococi.
5. O bucat de carne contaminat masiv este suficient pentru a
contamina alte buci, precum i ntregul lot, pe msur ce trec prin
dispozitivele de mcinare. Aceast poriune de carne contaminat conine,
deseori ganglioni limfatici nglobai n grsime. S-a dovedit c aceste
organe conin un numr mare de microorganisme, explicndu-se astfel,
faptul c n carnea de hamburger exist un numr mai mare de
microorganisme dect n carnea de vit tocat. n unele state, carnea de
hamburger, poate conine pn la 30% grsime, n timp ce carnea tocat
nu conine mai mult de 20% grsime.
4.1. Bacteriile
80
Erysipelothrix pentru infeciile umane.
Incidena lui Clostridium perfringens n diverse alimente n SUA a
fost studiat de Strang i colaboratorii. Ei au izolat acest microorganism
din 16,4% de probe de carne crud de vit, de pasre i de pete; din
condimente, 5%; din fructe i legume 3,8%; din alimente congelate
preparate n comer 2,7%; din alimente preparate n gospodrii 1,8%. n
carnea de vit tocat, C. perfringens n cantitate de 100 sau mai puin per
gram a fost gsit n 87% din 95 de probe, n timp ce 45 din cele 95 (47%)
de probe au coninut acest microorganism n niveluri < 1000/g. ntr-un
studiu efectuat n SUA, n perioada 2001-2002 pe 445 de probe de muchi
integral tocat i emulsifiat din carne de porc, de vit i de pasre crude, s-a
constatat c sporii de C. perfringens nu au depit 2,0 log10 fiind n medie
de 1,56 log10 ufc/g.
Unii membrii ai familiei Enterobacteriaceae au fost gsii n carnea
proaspt i congelat de vit, porc etc.
Din 442 de probe de carne examinate de ctre Stiles, 86% au
coninut bacterii enterice, toate cele 127 de probe de carne de vit
mcinat fiind pozitive. Cel mai frecvent au fost implicate Escherichia
coli biotipul I (29%), Serratia liquefaciens (17%) i Pantoea agglomerans
(12%). Un total de 721 de izolate (32%) au fost reprezentate de
Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae i E.
hafniae. La examinarea a 702 alimente pentru coliformii fecali, numrul
cel mai probabil de germeni (MPN = most probable numbers)
reprezentnd 10 categorii de alimente a fost gsit n 119 probe de carne de
vit tocat, media geometric obinndu-se prin procedura AOAC
(Association of Official Analytical Chemists) a fost de 59/g.
81
a subliniat importana aparaturii ca surs a acestor microorganisme pentru
poriunile de carne tiat.
82
Izolatele au reprezentat 14 tipuri diferite de PFGE (pulsed field gel
electrophoresis = electroforez n cmp pulsatil).
Carnea crud de porc i de pui au fost examinate pentru prezena
speciilor de Yersinia i n Mexic, iar 27% din probe au fost pozitive. Din
706 de izolate suspecte de Yersinia, 24 au fost confirmate ca fiind Y.
enterocolitica, Y. kristensenii, Y. intermedia i Y. frederiksenii. ntr-un
studiu de 43 de probe de carne de porc obinute la un abator, 8 au coninut
urmtoarele specii de yersinii: Y. enterocolitica, Y. intermedia, Y.
kristensenii, Y. frederiksenii. n Finlanda, 92% din 51 de probe de limb i
25% de probe de carne tocat au coninut Y. enterocolitica. Prin folosirea
PCR-ului i a unor metode de cultur, < 98% din limbile de porc au fost
pozitive, cel mai comun fiind biotipul IV. Din 31 de limbi de porc obinute
de la animalele sacrificate recent au fost izolate 21 de tulpini cu biotipul
0:8 i 30 cu biotipul 0:6.
ntr-un studiu efectuat pe crnai turceti uscai (sucuk) numarul de
bacterii Y. enterocolitica a sczut de la 5,0 la 1,8 log10 UFC/g, dup 4 zile
de fermentaie i la 0,5 log10 UFC/g, dup 12 zile de uscare, fr
adugarea direct a bacteriilor lactice acide. Prin adugarea lui
Lactobacillus sakei i Pediococcus acidilactici 7,0 log10 UFC/g, agentul
patogen a fost redus la 0,5 log10 UFC/g, dup 3 zile de fermentaie, iar
dup 4 zile nu a mai fost detectat nici unul.
83
industria fast-food-ului. Studiul cel mai vechi si cel mai detaliat n acest
sens este acela al lui Craven i Mercuri, care au constatat c atunci cnd la
carnea de vit sau de pui tocat s-a adugat soia n proporie de 10-30%
APCS al acestor produse a crescut comparativ cu martorii la care nu s-a
adugat aceasta, cnd ambele crnuri au fost pstrate la 4C, timp de 8-10
zile.
n timp ce bacteriile coliforme au crescut n amestecul de soia cu
carne de vit, acest lucru nu s-a ntmplat i n cazul amestecului de soia
cu pasre. n general APCS este mai mare n cazul concentraiei de soia
30%, dect n cazul celei de 10%. ntr-un studiu, n care s-a folosit soia
25% cu carne de vit tocat, durata medie de alterare la 4C pentru
amestecul carne de vit soia a fost de 5,3 zile, fa de 7,5 zile pentru
carnea de vit tocat fr adaos de soia. ntr-un alt studiu n care s-au
folosit proporii de soia 10%, 20% i 30%, APC-ul a crescut semnificativ
n toate cele trei cazuri.
n ceea ce privete cantitatea microbiologic a produselor de soia,
media geometric a APC din 1226 de eantioane de prob a unor produse
cu adaos a fost de 1.500/g, cu numrul fungilor, coliformilor, E. coli i
Staphylococcus aureus de 25/g, 3/g, 3/g i respectiv 10/g.
Nu este nc clar elucidat problema de ce bateriile se dezvolt mai
rapid n amestecuri de carne cu soia, dect n cele fr soia. Soia nsi nu
altereaz biota iniial, iar tipul general de alterare al amestecurilor de
carne cu soia nu difer de acela al martorilor cu carne integral. Totui, o
diferen care trebuie menionat este valoarea uor mai ridicat a pH-ului
(0,3-0,4 uniti) n produsele cu adaos de soia, iar acest fapt ar putea s
explice rata de cretere mai rapid. Aceast constatare a fost evaluat de
ctre Harrison i col. prin folosirea unor acizi organici, pentru scderea
pH-ului n amestecurile de soia i carne de vit integral. Prin adugarea
unor mici cantiti dintr-o soluie de acid acetic 5% la amestecul de 20%,
alterarea a fost ntrziat cu aproximativ 2 zile, fa de cea a martorilor,
dar nu toat activitatea inhibitoare a fost datorat numai scderii pH-ului.
n cazul unei proporii de grsime de 25% n carnea tocat, numrul
bacteriilor nu a crescut proporional cu acela din carnea de vit, la care s-a
adugat soia.
Este posibil ca proteina de soia s mreasc suprafaa amestecului de
soia-carne, astfel nct s fie favorizat aciunea bacteriilor aerobe de tipul
celor care predomin n crnuri la temperatura frigiderului.
84
maini speciale. n cursul procesului de dezosare cantiti mici de pulbere
de oase devin o parte din produsul finit, iar n 1978, USDA
(Departamentul de Agricultur al SUA) limiteaz cantitatea de os (pe baza
coninutului de calciu) la nu mai mult de 0,75% (coninutul de calciu al
crnii fiind 0,01%).
MDM trebuie s conin minimum 14% proteine i nu mai mult de
30% grsime. Diferena parametrilor dintre carnea dezosat mecanic i cea
procesat convenional, n ceea ce privete creterea microbian este pH-ul
mai ridicat al primei categorii n mod tipic de 6,0-7,0. pH-ul crescut se
datoreaz ncorporrii de mduv n carnea dezosat mecanic.
Dei, majoritatea studiilor privind MDM-ul au artat c aceste
produse nu difer de cele obinute prin metodele convenionale, n unele
cercetri, ns, s-au gsit cifre mai mari. Numrul coliformilor din
produsele MDM comerciale s-a situat ntre 460-1100/g. Din 54 de probe
examinate, ase au coninut salmonele, patru C. perfringens dar nici una
nu a coninut S. aureus. APC-ul din pieptul de miel dezosat normal a fost
de 680.000, n timp ce, n cazul pieptului de miel dezosat mecanic, APC-ul
a fost de 650.000/g.
S-a constatat c probele comerciale de pete dezosat mecanic conin
un numr de 10 ori mai mare de microorganisme dect petele procesat
prin metode convenionale. ntr-un alt studiu efectuat n SUA s-a constatat
c s-a produs o cretere mai rapid a bacteriilor psihrofile, n carnea de
vit dezosat mecanic, dect n cea slab tocat.
Majoritatea studiilor au evideniat absena speciei S. aureus n carnea
dezosat mecanic. n general, numrul microorganismelor mezofile este
puin mai ridicat dect acela al microorganismelor psihrofile, existnd
tendina de a fi mai reduse organismele Gram negative.
Field a tras concluzia c, dac se folosesc practici corecte de
procesare, carnea dezosat mecanic nu trebuie s prezinte probleme
microbiologice. La o concluzie asemntoare a ajuns i Froning, privind
carnea dezosat de pasre i pete.
85
procesate la rece. Numrul mezofililor la 35C a fost mai mare n bucile
de carne procesate la cald, fa de cele procesate la rece, att nainte, ct i
dup depozitarea n pachete sub vid, la 2C, timp de 20 de zile. Coliformii
se pare c nu au fost afectai de procesarea la cald. Barbe a evaluat 19
perechi de jamboane (procesate la cald i la rece), constatnd c cele
procesate la cald au coninut 200 bacterii per gram n timp ce cele
procesate la rece au coninut 220 de bacterii per gram.
ntr-un studiu pe carcase de bovine, procesate la cald, inute la 16C
i pe carcase procesate la rece, inute la 2C, pn la 16 ore, dup moarte,
nu s-au constatat diferene semnificative n ceea ce privete numrul
microorganismelor mezofile i psihotrofe. Att carnea de vit procesat la
cald, ct i cea procesat la rece au coninut un numr mic de bacterii, dar
dup 14 zile, carnea procesat la cald a coninut un numr mai mare dect
cea procesat la rece.
Aceti cercettori au constatat c reglarea termic a crnii procesate
la cald n primele ore dup refrigerare este critic, iar ntr-un studiu
efectuat mai trziu s-a constatat c refrigerarea pn la -21C, n decurs de
3-9 ore a fost satisfctoare.
S-a constatat un numr semnificativ mai mare de microorganisme
mezofile i lipolitice n produsele de carne procesate la cald, dect n cele
procesate la rece, dar nu s-au nregistrat diferene semnificative la
microorganismele psihotrofe.
Efectul pe care refrigerarea prelungit ar putea s-l aib asupra biotei
crnii de vit, procesate la cald, la aproximativ 1 or dup sacrificare a
fost studiat de ctre McMillin. Au fost refrigerate poriuni de carne, timp
de 1, 2, 4 i 8 ore, dup sacrificare, fiind apoi tocate sub form de pateuri
congelate i examinate. Nu s-a observat o diferen semnificativ ntre
acest produs produsul procesat la rece, n ceea ce privete numrul de
coliformi, stafilococi i mezofili. Un studiu asupra taxonomiei numerice a
biotei din carnea de vit procesat la cald i cea procesat la rece, att n
momentul procesrii, ct i dup 14 zile de pstrare n vid la 2C, nu a
evideniat diferene statistice semnificative ntre numrul de
microorganisme. Microorganismele frecvent ntlnite dup depozitare
pentru ambele produse au fost streptococii (cu cea mai mare probabilitate
enterococii) i lactobacilii, n timp ce n produsul procesat la cald (nainte
de depozitare) au fost gsii mai muli stafilococi i bacili. n general, ns,
cele dou produse au fost asemntoare.
Friptura de miel restructurat, fcut din 10-30% MDM i carnea de
vit procesat la cald au fost examinate pentru ncrctura microbiologic
i s-a observat c, n general cele dou produse nefierte au fost de calitate
bun. Produsele nefierte au coninut sub 3,0x104/g, cu un numr n general
mai crescut n produsele cu cantiti mari de MDM. n produsele cu
86
coninut peste 30% de MDM a fost prezent un numr mai mare de
coliformi totali i coliformi fecali, considerndu-se c aceasta se datoreaz
contaminrii picioarelor i regiunilor pelvine, n cursul sacrificrii i al
eviscerrii. n produsul nefiert (0,1 g) nu s-au detectat S. aureus i C.
perfringens. n probele de 25 grame nu s-au detectat nici Yersinia
enterocolitica, nici Campylobacter jejuni. Prepararea a redus numrul de
celule n toate produsele la sub 30/g.
O examinare sintetic a lucrrilor a 10 grupe de cercettori a fost
efectuat de ctre Kotula, cu privire la efectul procesrii la cald asupra
microbiologiei crnurilor, constatndu-se c ase grupe nu au constatat
nici un efect, trei au observat efecte limitate i numai o grup a gsit un
numr mai mare. Kotula a tras concluzia c procesarea la cald n sine nu
are nici un efect asupra microbilor. Procesarea la cald este deseori nsoit
de o presurizare prerigor, constnd n aplicarea a aproximativ 15.000 psi
pentru 2 minute. Acest procedeu amelioreaz culoarea muchiului i
aspectul general, mrind frgezimea. Se pare c nu are nici un efect asupra
microbiotei.
87
fost bacteriile Gram pozitive, urmate de cele Gram negative i sporogene.
Cnd au fost expuse unui tratament de 30 V, timp de 5 minute, n ser
fiziologic sau n ser fiziologic tamponat cu fosfat, s-a produs o reducere de
5 cicluri logaritmice, n cazul bacteriilor E. coli, Shewanella putrefaciens
i Pseudomonas fragi, n timp ce n soluie peptonat 0,1% sau de sucroz
2,5 M, nu s-a produs n esen nici o modificare. Deci, stimularea electric
n sine, nu pare s exercite efecte msurabile asupra biotei microbiene a
crnurilor procesate la cald.
Carnea pre rigor poate fi frgezit prin tratarea la presiune mare, ca
aplicarea de aproximativ 15.000 lb**/in2, pentru cteva minute sau printr-
un proces numit Hidrodine**. Acesta frgezete carnea de vit prin
utilizarea unei mici cantiti de exploziv, care genereaz o und de oc
hidrodinamic n ap. Nu este clar dac aceast operaie afecteaz biota
bacterian, dar cnd este aplicat la 55-60 mega Pascal (M Pa) nu distruge
infeciozitatea lui Trichinella spiralis din carnea de porc.
88
alimentele principale, deoarece crnurile conin din abunden toi
nutrienii necesari pentru creterea bacteriilor, levurilor i mucegaiurilor.
n aproape toate cazurile se remarc alterarea produs de unul sau
mai multe genuri caracteristice acesteia, pentru un anumit tip de produs de
carne. De aceea, prezena microorganismelor mai variate, de pe crnurile
nealterate poate fi reprezentat de mediul iniial al produsului respectiv
sau de contaminanii captai n cursul procesrii, manipulrii, mpachetrii
i pstrrii acestuia. De aici, ntrebarea, de ce numai cteva tipuri
predomin n crnurile alterate. Crnurile proaspete (vit, miel, porc,
pasre, carnea marin, carnea procesat) prezint valori ale pH-ului n
limitele de cretere ale majoritii microorganismelor.
Coninutul n nutrieni i umiditatea sunt adecvate pentru a susine
creterea tuturor microorganismelor enumerate. Dei PO/R (potenialul
redox) al crnurilor integrale este redus, valorile de oxidoreducere tind s
fie mai ridicate, astfel nct microorganismele strict aerobe, facultativ
anaerobe i cele strict anaerobe, gsesc n general condiii adecvate pentru
cretere.
Dintre parametrii extrinseci, temperatura de depozitare prezint cel
mai important n controlul tipurilor de microorganisme ce se dezvolt pe
crnuri, deoarece aceste produse sunt pstrate n mod normal la
temperatura de refrigerare. n esen, toate studiile privind alterarea
crnurilor, care au fost efectuate n ultimii 50 de ani, au fost axate pe
produse pstrate la temperaturi joase.
Din carnea de vit alterat, integral au fost izolate urmtoarele
tipuri de mucegaiuri: Thamnidium, Mucor, Rhizopus, care produc aspectul
de whiskers (musti, fire de pr); Cladosporium, cauza obinuit a
petelor negre; Penicillium, care produce petele verzi; Sporotrichum i
Chrysosporium, rspunztoare de petele albe. n general, mucegaiurile,
nu cresc pe crnuri, dac temperatura este sub 5C.
Printre genurile de levuri gsite pe carnea de vit alterat, n frigider,
mai frecvente sunt Candida i Rhodotorula, iar n carnea de vit tocat,
predomin C. lipolytica i C. zeilanoides.
Carnea de vit tocat sau hamburgerii sunt alterate exclusiv de ctre
bacterii, genurile cele mai importante fiind: Pseudomonas, Alcaligenes,
Acinetobacter, Moraxella i Aeromonas. Cauza principal a alterrii, o
constituie n primul rnd Pseudomonas, dar i speciile din genurile
Acinetobacter-Moraxella. Genul Pseudomonas a suferit n ultimii 70 de
ani modificri serioase de taxonomie. Conform clasificrii actuale genul
Pseudomonas face parte din subclasa gamma a Proteobacteriilor,
incluznd speciile: Ps. fluorescens, Ps. fragi, specia tip Ps. aeruginosa i
altele. Unele din speciile ncadrate n trecut n acest gen au fost transferate
n subclasa alfa a proteobacteriilor (Brevundimonas, Devosia,
89
Sphingomonas), n timp ce altele (Acidovorax, Comamonas i Telluria)
sunt azi incluse n subclasa beta. Rmne s se stabileasc unde este locul
acestor genuri, printre microorganismele clasificate n trecut ca
pseudomonade.
Un studiu al bacteriilor Gram negative din carnea de vit, miel, porc
i crnai proaspei arat c majoritatea erau reprezentate de
pseudomonade (231), urmate de cele din genul Moraxella (61) i
Acinetobacter (49). Pseudomonadele care altereaz carnea la temperaturi
joase, n general nu corespund speciilor menionate n Manualul lui
Bergey.
Studiile taxonomice numerice, efectuate de Shaw i Latty, au dus la
gruparea majoritii izolatelor investigate, n 4 clase, pe baza testelor de
utilizare a sursei de carbon. Din 787 de tulpini de Pseudomonas izolate din
carne au fost identificate 89,7%; 49,6% fiind incluse n clasa 2, 24,9% n
clasa 1 i 11,1% n clasa 3. Microorganismele din clasele 1 i 2 au fost
nefluorescente, lecitinaz negative, fiind asemntoare speciei Ps. fragi,
iar cele din clasa 3 au fost fluorescente i gelatinoliz pozitive. Proporia
tulpinilor de Ps. fluorescens, biotipul I a fost reprezentat de 3,9%;
biotipul III de 0,9%, iar specia Ps. putida a fost reprezentat de o singur
tulpin.
Se tie c bucile mari de carne (sferturi) de vit se altereaz n
profunzime, de obicei lng os, n special lng sacrum. Acest tip de
alterare este deseori desemnat prin termenul de degradare osoas sau
acrire. Principalele bacterii implicate n acest tip de alterare sunt
Clostridium i Enterococcus.
Temperatura de incubare reprezint principala cauz a faptului c, n
crnurile alterate se gsesc mai puine genuri de bacterii, dect n carnea
proaspt.
ntr-un studiu efectuat de ctre Ayres, n carnea de vit proaspt
tocat, s-au gsit 9 genuri bacteriene, n timp ce dup alterare s-au izolat
numai 4. Peste 80% din populaia microbian din carnea proaspt a fost
reprezentat de bacteriile cromogene, sporogene, levuri, mucegaiuri, n
timp ce dup alterare, s-au gsit numai bacterii necromogene i bacili
Gram negativi.
Dei, s-a dovedit c unele bacterii pot crete la temperaturi de
refrigerare pe mediile de cultur, se pare c ele nu au capacitatea de a intra
n competiie cu succes, cu tipurile bacteriene care produc alterarea:
Pseudomonas i Acinetobacter-Moraxella.
Antricoatele sau cotletele se altereaz de obicei la suprafa; dac
microorganismele de alterare sunt reprezentate de bacterii sau de
mucegaiuri, acest lucru depinde de umiditatea existent. Carnea tiat
recent i pstrat la frigider n condiiile unei umiditi ridicate sufer
90
ntotdeauna o alterare bacterian. Principala caracteristic a acesteia o
constituie mucilagiul, format pe suprafaa alimentelor respective, n care
se gsesc aproape ntotdeauna microorganisme.
O valoare redox (O/R) relativ crescut, prezena umiditii i o
temperatur sczut favorizeaz dezvoltarea bacteriilor din genul
Pseudomonas. Uneori, cnd nivelul de contaminare este redus pe suprafaa
bucilor de carne de vit, pot fi observate coloniile bacteriene. Stratul de
mucilagiu confer coalescena coloniilor de suprafa, fiind n mare
msur rspunztor de consistena vscoas a crnurilor alterate. Ayres a
demonstrat c detectarea mirosurilor se face atunci cnd numrul
bacteriilor de suprafa este ntre log 7,0 i log 7,5/cm2, urmate de un
mucilagiu detectabil, cnd numrul acestor bacterii se situeaz ntre log10
7,5 i log 8,0/cm2.
Atunci cnd suprafaa crnii este prea uscat sau aceasta a fost tratat
cu antibiotice (tetracicline) se vor dezvolta, n special, mucegaiurile.
Odat cu dezvoltarea bacteriilor pe crnuri, mucegaiurile nu mai pot
aprea. Acest lucru se explic prin faptul c bacteriile cresc mai repede
dect mucegaiurile, consumnd oxigenul de pe suprafa, fr de care,
mucegaiurile nu se pot dezvolta. Creterea vizibil a mucegaiurilor pe
carnea tocat de vit este inexistent, cu excepia cazurilor n care agenii
antibacterieni au fost folosii drept conservani sau carnea a fost congelat
mult timp.
Dintre semnele incipiente ale alterrii crnii de vit se remarc
mirosurile neplcute, urmate de viscozitate, care se manifest prin
formarea mucilagiului bacterian. Slimele bacteriene, care se formeaz
pe carnea proaspt, n cursul alterrii acesteia n frigider sunt reprezentate
de biofilme (pelicul biologic).
Acelai tip de alterare se produce i n crnurile tocate cu soia, ns
rata de alterare este mai rapid.
91
perioada de incubare au fost de 10 ori mai ridicate, dect cele iniiale,
numrul total de microorganisme viabile, fiind de 106/cm2, n timp ce
putresceina nu a prezentat dect o modificare redus la acest nivel. n
ansamblu, constatrile au sugerat c aceste diamine ar putea fi preioase
pentru carnea mpachetat sub vid. n carnea proaspt de vit, de porc i
de miel, putresceina era prezent la niveluri de la 0,4 la 2,3 ppm, iar
cadaverina la niveluri de la 0,1 la 1,3 ppm. Putresceina reprezint
principala diamin produs de pseudomonade, n timp ce cadaverina este
produs mai mult de Enterobacteriaceae.
Modificri importante ale cadaverinei i putresceinei au loc n carnea
de vit, atunci cnd APC depete aproximativ 4x107, ceea ce ridic
unele semne de ntrebare, n ceea ce privete utilizarea lor ca indicatori ai
alterrii crnii. Aceasta reprezint o problem a majoritii metaboliilor,
deoarece producerea i concentraia lor tind s fie legate de
microorganismele specifice. ntr-un studiu, modificrile histaminei i
tiraminei din carnea de porc i de vit au fost prea mici pentru a constitui
factori de previziune a alterrii, dar putresceina din carnea de vit i
cadaverina din carnea de porc au prezentat modificri din ce n ce mai
mari pe msura alterrii.
Tehnica ERV (extract-release volume = tehnica volumului de
eliberare a extractului), prima dat descris n 1964, s-a dovedit a fi
valoroas n determinarea alterrii incipiente a crnii, precum i ca factor
de previziune a valabilitii crnii congelate. Tehnica se bazeaz pe
volumul de extract apos eliberat de un omogenat de vit, cnd este lsat s
treac prin hrtie de filtru, n decursul unei perioade date de timp.
Astfel, carnea de vit, de calitate organoleptic i microbiologic
bune, elibereaz valori mari de extract, n timp ce, carnea de vit de
calitate microbiologic redus elibereaz cantiti mai mici sau deloc.
Unul dintre cele mai importante aspecte ale metodei este informaia pe
care a oferit-o cu privire la mecanismul alterrii crnii de vit la
temperaturi joase.
Metoda ERV evideniaz dou aspecte ale mecanismului de alterare.
Primul aspect l constituie faptul c alterarea crnii la temperaturi joase are
loc fr descompunerea complet a proteinelor primare. Pe msur ce
crnurile sufer o alterare microbiologic, ERV este mai degrab
diminuat, dect crescut, cum se ntmpl n cazul cnd are loc degradarea
complet a proteinelor. Al doilea aspect evideniat de ERV l constituie
creterea capacitii de hidratare a proteinelor din carne, printr-un
mecanism necunoscut, dei s-a dovedit c aminoacizii produi de ctre
biota de alterare joac un rol important n acest sens. Se pune ntrebarea,
cum i satisfac bacteriile de alterare nevoile nutriionale n absena unei
descompuneri complete a proteinelor.
92
Crnurile proaspete pstrate la frigider sunt atacate de ctre
microorganismele psihrofile. n cazul crnurilor cu un pH de aproximativ
5,6 sunt prezeni suficieni hidrai de carbon simpli, pentru ca s susin
aproximativ 108 microorganisme/cm2. Biota heterogen din carnea
proaspt, care se dezvolt rapid i utilizeaz glucoza la temperatura de
refrigerare este reprezentat de pseudomonade. O oxigenare bun a
suprafeei va avea un efect benefic asupra creterii finale a acestor bacterii.
Brochothrix thermosphacta este i el capabil s utilizeze glucoza i
glutamatul, dar din cauza ratei de cretere mai lente, acesta pierde
competiia cu pseudomonadele. Cnd populaia de pe suprafa ajunge la
aproximativ 108/cm2, aportul de carbohidrai simpli este epuizat, iar n
acest moment se pot evidenia mirosurile neplcute, n funcie de msura
n care a avut loc utilizarea aminoacizilor liberi. Odat ce carbohidraii
simpli au fost epuizai pseudomonadele mpreun cu alte psihotrofe Gram
negative (Moraxella, Alcaligenes, Aeromonas, Serratia, Pantoea)
utilizeaz aminoacizii liberi i compuii azotai ca surs de energie.
Speciile de Acinetobacter utilizeaz mai nti aminoacizii, iar apoi
lactatul, iar creterea lor este redus la un pH de sub 5,7. n ceea ce
privete carnea de pasre, conversia glucozei n gluconat pare s confere
pseudomonadelor avantajul competitiv.
Un grup de cercettori au sugerat c predominarea speciei P. fragi n
sucul de miel la un pH 6,0 i la o temperatur de 4C, s-a datorat
capacitii acesteia de a utiliza creatina i creatinina. S-a observat c P.
fluorescens este mai abundent n crnurile proaspete dect P. fragi, dar c
acesta din urm devine cu timpul predominant.
Mirosurile fetide, asociate, n general cu crnurile n curs de alterare
i datoreaz originea aminoacizilor liberi i compuilor nrudii (H2S din
aminoacizii cu sulf; NH3 din muli aminoacizi; indol din triptofan).
Mirosurile neplcute apar atunci cnd aminoacizii ncep s fie utilizai. n
cazul crnurilor de culoare nchis, tari i uscate (DFD), cu un pH final
peste 6,0 i un raport mai redus de carbohidrai simpli, alterarea are loc
mai rapid, iar mirosurile neplcute pot fi detectate n cadrul unui numr de
celule de aproximativ 106/cm2. n cazul crnurilor normale sau DFD (dark,
firm and dry) proteinele nu sunt atacate, pn cnd aportul de constitueni
mai simpli nu este epuizat. S-a demonstrat, de exemplu, c antigenicitatea
proteinelor solubile n sare, din carnea de vit, nu este distrus n condiiile
obinuite de alterare la temperatur joas.
n cazul alterrii petelui, s-a demonstrat c sucul din petele crud
presat, prezint toate aspectele evidente ale alterrii, dup cum se poate
determina i prin utilizarea petelui integral. Acest lucru indic absena
general a unui atac microbiologic asupra proteinelor solubile, deoarece
acestea au fost absente n sucul filtrat. Acelai aspect este valabil i pentru
93
alte tipuri de crnuri. Alterarea incipient este nsoit de o cretere a pH-
ului, a numrului de bacterii i a capacitii de hidratare a proteinelor din
carne, mpreun cu alte modificri. n carnea de vit tocat, pH-ul poate
crete la un grad nalt de 8,6 (n crnurile n putrefacie), dei n momentul
alterrii incipiente s-au nregistrat i valori medii de pH de aproximativ
6,5.
Prin reprezentarea curbei de cretere a biotei de alterare pot fi
observate fazele obinuite de cretere, faza de declin, putnd fi atribuit
epuizrii nutrienilor i acumulrii produselor secundare, toxice, de
metabolism. Mecanismul exact prin care sunt distruse proteinele primare
din carne nu este, nc, complet elucidat.
Dainty i colaboratorii au inoculat slime (mucilagiu) de vit n
buci de carne proaspt i le-au incubat la 5C. Mirosul neplcut i
mucilagiul au aprut dup 7 zile cu un numr de microorganisme de
2x109/cm2. Proteoliza nu a fost detectat n fraciunile miofibrilare sau
sarcoplasmice, nici dup 2 zile, cnd numrul bacteriilor a atins 1010/cm2.
n cazul crnii de vit contaminat natural, mirosurile i mucilagiul au fost
observate dup 12 zile, cnd numrul bacteriilor a ajuns la 4x108/cm2.
Modificrile proteinelor miofibrilare au aprut dup a 18-a zi de pstrare.
Cu ajutorul unor studii pe culturi pure, Dainty a demonstrat c
pseudomonadele sunt active mpotriva proteinelor miofibrilare, n timp ce
alte bacterii acioneaz asupra proteinelor sarcoplasmice. Speciile de
Aeromonas s-au dovedit a fi active att asupra proteinelor miofibrilare, ct
i asupra celor sarcoplasmice. n cazul culturilor pure, modificrile
proteinelor nu au fost detectate, dect cnd numrul bacteriilor a ajuns la
peste 3,2x109/cm2.
94
streptococii lactici i B. thermosphacta. n 5 ficai de vit inui la 2C, 14
zile, Pseudomonas a constituit 7% biota de alterare de 100%, n timp ce
pH-ul iniial a fost 6,49 i a sczut la 5,93.
ntr-un alt studiu, pe ficai de vit, porc i miel, biota predominant
dup 5 zile la 2C, a diferit n cele 3 produse, astfel: n ficaii de vit au
predominat streptococii, levurile, bacteriile corineforme i
pseudomonadele; n ficatul de miel: bacteriile corineforme, micrococii i
streptococii i n ficatul de porc: stafilococii, Moraxella-Acinetobacter i
streptococii. ntr-un studiu efectuat de Gill i De Lacy, privind alterarea
ficailor de miel n biota de suprafa alterat au predominat:
Pseudomonas, Acinetobacter i Enterobacter; n pictura din ficaii ntregi
au fost dominante Pseudomonas i Enterobacter, n timp ce Enterobacter
i lactobacilii au dominat n esuturile profunde. n acest studiu s-a artat
c pH-ul a fost n jur de 6,4 i a sczut n jur de 5,7 n probele tratate cu
antibiotice, ceea ce arat c procesele glicolitice din ficat pot duce la o
scdere a pH-ului, dei aceste probe au coninut mai puin de 104
microorganisme/cm2. Nivelul ridicat al glucozei a fost suficient pentru a
permite o cretere vizibil a coloniilor de suprafa, nainte de dezvoltarea
mirosurilor neplcute. Aceasta ar putea constitui explicaia predominrii
biotei de alterare a ficailor de ctre tipurile non lactice.
Tabelul 4.1.
pH-ul i concentraia de glicogen, glucoz, acid lactic i amoniac din 10 ficai
proaspei
95
Capitolul 5
Indicatori de calitate i siguran microbiologic
alimentar
Tabelul 5.1
Microorganisme implicate n alterarea produselor alimentare
Microorganisme Produse alimentare
Acetobacter spp. Cidru proaspt
Bacillus spp. Pine dospit
Byssochlamys spp. Fructe zaharisite
Clostridium spp. Hard cheese (sortiment de brnz canadian)
Geotrichum spp. Fructe conservate
Bacterii acide lactice Bere
Lactococcus lactic Lapte crud
Leuconostoc mesenteroides Zahr
96
Microorganisme Produse alimentare
Pectinatus cerevisiiphilus Bere
Pseudomonas putrefaciens Unt
Levuri Sucuri concentrate de fructe
Zygosaccharomyces bailii Maionez, dressing-uri de salate
Tabelul 5.2.
Produi metabolici microbieni implicai n alterarea produselor alimentare
conservate
Metabolii Produse alimentare conservate
Cadaverin i putrescein Carne de vac n vacuum
Diacetil Concentrat de suc ngheat
Etanol Suc de mere, produse din pete
Histamin Conserve de ton
Acid lactic Conserve de legume
Trimetilamin (TMA) Pete
Baze volatile totale (TVB), Fructe de mare
nitrogen volatil total (TVN)
Acizi grai volatili Unt, smntn
97
S-a constat c etanolul reprezint cel mai bun indicator de prognostic
a mai multor alcooli, n extracte de pete conservate la 5C, n care 227
din 241 de izolate de pete alterat au produs acest alcool.
Acidul lactic a fost acidul organic cel mai frecvent din legumele
conservate, iar pentru determinarea sa a fost elaborat o metod rapid (2
ore) pe plac de gel de siliciu.
Producerea de trimetilamin (TMA) din oxid de N-TMA, din
alterarea petelui a fost utilizat de un numr mare de cercettori ca
indicator de calitate sau alterare.
Pentru msurarea substanelor volatile totale folosite ca indicatori de
calitate la pete s-au folosit mai multe proceduri, incluznd bazele volatile
totale i ali compui ai azotului eliberai prin distilarea cu vapori de aburi
a produselor de pete.
Metodele de numrare a microorganismelor viabile totale au fost
utilizate pentru evaluarea calitii produselor. Ele sunt, mai degrab,
indicatori ai strii existente a produselor respective, dect indicatori de
valabilitate.
n ansamblu, indicatorii de calitate microbieni pot fi folosii pentru
produsele alimentare care au o biot limitat. n cazurile n care calitatea
alimentului este afectat nesemnificativ de acumularea anumitor produi
metabolici, ele pot fi folosite ca indicatori de calitate.
Stabilirea numrului total de germeni viabili este o metod mult mai
sigur dect numrtorile microscopice directe, dar nu reprezint cea mai
eficient metod de determinare.
98
Aceste criterii se aplic la majoritatea produselor care pot fi vehicule
de transport ai agenilor patogeni din alimente.
De-a lungul timpului s-a considerat c agenii patogeni care produc
intoxicaii alimentare, fiind de origine intestinal, rezult direct sau
indirect din contaminarea alimentelor cu fecale. Ca atare, astfel de
indicatori sanitari au fost utilizai n decursul timpului pentru determinarea
contaminrii cu fecale a apelor.
Primul indicator pentru contaminarea fecal a fost Escherichia coli.
Cnd acest indice coli a fost aplicat la sigurana alimentar au fost
evideniate mai multe criterii suplimentare, dintre care cele sugerate de
Bauttiaux i Mossel (1961), care mai sunt nc valabile:
(1) n mod ideal, bacteriile selecionate trebuie s-i demonstreze
specificitatea pentru mediile intestinale;
(2) (ele) trebuie s fie n numr foarte mare n fecale, astfel nct s
fie gsite, chiar i n diluii mari;
(3) s opun rezisten mare mediului extraintestinal, a crui poluare
trebuie evaluat;
(4) s permit detectarea relativ uoar i perfect exact, chiar i
cnd microorganismele respective sunt prezente n numr foarte mic.
5.1.1. Coliformii
99
genuri i specii menionate (n special, E. aerogenes) este de dorit ca
incidena sa s fie determinat ntr-o populaie coliform.
Formula IMViC este metoda clasic, n care I reprezint producia de
indol, M = rou metil, V = Voges-Proskauer (producia de acetoin), C =
utilizarea citratului.
Dup aceast metod, cele dou microorganisme au urmtoarea
formul:
Tabelul 5.3.
I M V C
E. coli + + - -
E. aerogenes - - + +
100
Rou Voges
Specia Lactoz Sorbitol Indol Decarboxilaz
metil Proskauer
E. hermannii -/+ - + + - -
E. coli + + + + - +
101
Una dintre proprietile importante a lui E. coli ca indicator fecal
pentru ap este perioada sa de supravieuire. n general aceasta este
identic cu cea a majoritii bacteriilor patogene intestinale, dei unele
rapoarte arat c unii ageni patogeni bacterieni sunt mai rezisteni n ap.
E. coli nu este, ns, la fel de rezistent la virusurile intestinale. Buttiaux i
Mossel au ajuns la concluzia c diferii ageni patogeni pot rezista dup ce
E. coli este distrus n alimentele refrigerate, congelate sau iradiate. De
asemenea, patogenii pot persista n ape tratate, dup distrugerea lui E. coli.
Numai n alimentele acide, E. coli are o valoare deosebit ca
microorganism indicator, datorit rezistenei sale relative la un nivel redus
de pH.
Ecologie.
Habitatul principal al lui E. coli este reprezentat de tractul intestinal
al majoritii homeotermelor, dei uneori este absent n intestinul porcilor.
Habitatul principal al lui E. aerogenes este vegetaia i uneori tractul
intestinal.
Nu este greu s se demonstreze prezena bacililor coliformi n aer,
praf, pe mini, precum i pe suprafaa multor alimente. Problema nu
const n prezena bacteriilor coliforme, ci n numrul lor relativ.
Majoritatea legumelor sau zarzavaturilor din pia conin un numr mic de
bacili coliformi, Gram negativi, care fermenteaz lactoza, dar dac aceste
produse sunt recoltate i manipulate corect, numrul tinde s fie prea mic
i fr semnificaie real din punct de vedere al sntii publice.
102
2. Maxim 10/ml pentru lapte brut certificat i nu peste 1/ml pentru
laptele pasteurizat certificat.
3. Maxim 100/ml pentru alimentele congelate nainte de fierbere i
parial fierte.
4. Maxim 100/ml pentru produse umplute cu ou i lapte (budinci).
n alimentele uor perisabile este admis un numr redus de bacili
coliformi i anume: ntre 1 i 100 per gram (mililitru). Aceste criterii
reflect parametrii de flexibilitate i siguran alimentar.
Unele produse pentru care s-au recomandat limitele admise pentru
coliformi, de ctre Comisia Internaional pentru Specificri
Microbiologice pentru Alimente (ICMSF) sunt enumerate n tabelul de
mai jos.
Tabelul 5.5.
Criterii recomandate pentru limitele admise n alimente pentru E.coli/coliformi
Class
Indicator/produs n c m M
Plan
Coliformi Lapte praf 3 5 1 10 102
Coliformi Praf de ou 3 5 2 10 103
Alimente dietetice pentru sugari i
Coliformi 3 5 2 10 102
copii; diferite sortimente de biscuii
Produse instant pentru torturi, prajituri, 3 5 1 10 102
Coliformi
etc.
Produse uscate ce necesit fierbere 3 5 3 10 102
Coliformi
pentru consum
5.00
3 5 2 500
Coliformi Produse din crab gtite (ready-to-eat) 0
3 5 2 100 103
Coliformi Crevei ready-to-eat
103
Class
Indicator/produs n c m M
Plan
E. coli Ap mbuteliat 2 5 0 0 -
n = nr. de probe examinate dintr-un lot pentru satisfacerea cerinelor unui sampling plan (un grup
de criterii pentru acceptarea unui lot, bazat pe examinarea unui numr stabilit de probe prin metode
analitice)
c = nr. maxim admis de probe dubioase (2-class plan) sau la limita de aceptabilitate (3-class plan).
Cnd numrul este mai mare dect aceast limit lotul este respins.
m = o limit microbiologic, care pentru 2-class plan, separ alimentele de calitate bun de cele de
calitate dubioas sau pentru 3-class plan, separ alimentele de calitate bun de cele acceptate la
limit.
M = o limit microbiologic, pentru 3-class plan, care separ probele acceptate la limit de cele de
calitate dubioas. Valorile mai mari sunt neacceptate.
104
Pentru igienizarea suprafeelor din fabricile de mpachetare a
crnurilor K. pneumoniae (i posibil, Raoultella spp.) ar putea constitui o
alegere mai bun, dect E. coli generic.
n ciuda limitrilor menionate, valoarea bacililor coliformi, ca
indicatori de siguran este conform, cel puin pentru unele alimente. Ei
sunt cel mai bine folosii ca o component a unui program de evaluare a
siguranei, cum ar fi sistemul HACCP.
5.1.2. Enterococii
Istoric.
Escherich a fost primul care l-a descris pe E. faecalis, i l-a denumit
Micrococcus ovalis, n 1886. E. faecium a fost recunoscut, pentru prima
dat n 1899 i caracterizat n amnunime de ctre Orlo-Jensen n 1919.
Datorit existenei lor n fecale, aceti enterococi clasici au fost
folosii ca indicatori ai calitii apei, nc din jurul anului 1900.
Ostrolenk i Burton au fost primii care au comparat enterococii
clasici cu bacteriile coliforme, ca indicatori ai siguranei. Caracteristicile
semnificative ale enterococilor clasici, care au dus la utilizarea lor ca
indicatori de poluare a apei, sunt:
(1) nu se multiplic n ap, n special dac coninutul n substane
organice este redus;
(2) n general sunt mai puin numeroi n fecalele umane, dect E.
coli.
Tabelul 5.6
Clasificare i condiii de cultivare. Proprietile biochimice ale celor mai
importante specii de enterococi
E. sacharolyticus
E. pseudoavium
E. malodoratus
E.casseliflavus
E. gallinarum
E. soriolicida
E. flavescens
E. raffinosus
E. columbae
E. solitarius
E. sulfureus
E. cecorum
metabolice
Proprieti
E. faecalis
E. mundtii
E.faecium
E. durans
E. dispar
E. fallox
E.avium
E. hirae
E. asini
Crete la:
10C + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + +/-
105
E. sacharolyticus
E. pseudoavium
E. malodoratus
E.casseliflavus
E. gallinarum
E. soriolicida
E. flavescens
E. raffinosus
E. columbae
E. solitarius
E. sulfureus
E. cecorum
metabolice
Proprieti
E. faecalis
E. mundtii
E.faecium
E. durans
E. dispar
E. fallox
E.avium
E. hirae
E. asini
45C + + + + + - + + + + + + + + + - + + - + +/-
pH 9,6 + + + + + + + + + + + + + + + + + +
NaCl 6.5% + + + + + + + + + + - - + - + + + + + -
+/
-
Bil 40% + + + + + + + + + + + + +
Albastru de + - + + - +
metilen 0,1%
Telurit de K + - - + - - - - - +
0,04%
Tetrazolium + - + - +
0,01%
Rezistent la + + + + +/ - - - - -
-
60C/30 min.
Grup + + + + + + + + + + + - - - - + - -
serologic D
Motilitate
- - - - - - + - - - - - - - - + - -
/+ /+
Pigmentare - - - G - - - G - - - - - G - G -
Hidroliza +/ + + + + + + + + + + + + + + + + +
-
esculinei
Hidroliza +/ + v +/ v v + - - - + + - - v - - - +
- -
hipuratului
Hidroliza + + - + + - + + + + - + + + - -
Argininei
Producerea - - + - - + - - - - - - - - - - -
de H2S
Acid din:
Glicerol + + + - - v - v v + - - - - + - - - -
/+
Manitol + + + + - + + - + + + - - + + - + + - -
/+
Sucroz + v + + - + + + + + + - + + + + + - + -
106
E. sacharolyticus
E. pseudoavium
E. malodoratus
E.casseliflavus
E. gallinarum
E. soriolicida
E. flavescens
E. raffinosus
E. columbae
E. solitarius
E. sulfureus
E. cecorum
metabolice
Proprieti
E. faecalis
E. mundtii
E.faecium
E. durans
E. dispar
E. fallox
E.avium
E. hirae
E. asini
Salicin + + +/ + + + + + + + + + + +
-
Lactoz + + + + + + + + + - + + + v + + - + +
Arabinoz - + + + - - + - - + - - - - + - + - -
+ + - - - + + + + + + + + + + - + -
Rafinoz
/-
Legend: + = potitiv; - = negative; +/-, -/+, v = reacii variabile
Habitat.
E. faecalis i E. faecium sunt cunoscute ca specii fecale, iar speciile
noi necesit, n continuare studiul aspectelor lor naturale, n special n ceea
ce privete apariia lor n fecale. E. hirae i E. durans au fost izolate
frecvent de la psri i bovine, E. gallinarum de la psrile de curte. E.
durans i E. faecium sunt asociate cu tractul intestinal al suinelor, iar E.
faecalis pare s fie mai specific pentru tractul intestinal uman. E. cecarum
a fost izolat din cecum de la pui, E. columbae din intestinul de porumbel,
iar E. saccharolyticum de la vaci. E. avium se gsete n fecalele de
mamifere i pui; E. casseliflavus n grne nsilozate, n soluri i plante. E.
107
mundtii de la vaci, minile mulgtorilor, sol i plante; E. hirae de la pui i
intestinele de porc; E. dispar de la om i E. gallinarum din intestinele
psrilor.
Este bine stabilit pn n prezent faptul c enterococii clasici se
gsesc n plante, insecte i sol. Speciile pigmentate n galben sunt asociate
cu plantele, iar E. cecarum cu cecumul puilor de gin. Enterococii izolai
de pe insecte i plante pot proveni din fecalele animale. Astfel, enterococii
pot fi considerai ca rezideni temporari fiind diseminai n vegetaie de
ctre insecte cand ajung la nivelul solului prin ploaie i gravitaie.
Dei, E. faecalis este considerat ca fiind de origine fecal, unele
tulpini se gsesc pe vegetaie i ca atare nu au o semnificaie sanitar,
atunci cnd se gsesc n alimente. Mundt a studiat E. faecalis de la
oameni, plante i alte surse i a constatat c indicatorii nefecali pot fi
difereniai de cei fecali prin reacia lor n laptele turnesolat i prin
fermentarea melizitozei i melibiozei. ntr-un alt studiu pe 2.334 izolate de
E. faecalis din alimente uscate i congelate, o proporie mare de tulpini a
prezentat o asemnare strns cu tipurile rezidente pe vegetaie i de aceea
nu au avut o semnificaie sanitar. Cnd sunt folosii ca indicatori sanitari
de calitate n alimente este necesar s se stabileasc dac izolatele sunt de
tip vegetal sau sunt de origine uman. Enterococii se pot gsi i n
particulele de praf. Sunt larg distribuii, n special n abatoare i
afumtoare, n care sunt procesate produse de porc. n ceea ce privete
utilitatea enterococilor clasici, ca indicatori ai polurii apei, unii
cercettori care au studiat persistena lor n ap au constatat c ei dispar
ntr-un ritm mai rapid dect bacteriile coliforme, n timp ce ali cercettori
au fcut constatarea invers.
Leininger i McCleskey au observat c enterococii nu se multiplic
n ap, n timp ce coliformii dimpotriv.
Cerinele lor mai dificile de cretere pot fi considerate ca indicnd un
rol mai puin competitiv n mediile hidrice. n apele menajere, coliformii
i enterococii clasici au fost gsii n numr mare, dar s-au gsit
aproximativ de 13 ori mai multe bacterii coliforme dect enterococii.
ntr-un studiu efectuat cnd genul Enterococcus era format din
numai 8 specii, Devriese i alii au studiat 264 de izolate de enterococi,
obinui din intestinele unor animale de ferm. Tulpinile au fost selectate
pe baza creterii lor n bil 40% i NaCl 6,5%. Din cele 264 de izolate,
225 au fost conforme uneia din cele 8 specii: E. faecalis, E. faecium, E.
hirae reprezentnd 37,6%, 29,8% i 23% din izolate. Alte specii
identificate au fost E. durans (5,1%), E. gallinarum (1,6%), E. avium
(1,2%), E. mundtii (1,2%) i E. casseliflavus (< 1%).
Aceste 255 de izolate au fost obinute de la 8 specii de animale,
numrul cel mai mare provenind de la psrile de cas, vite i porci.
108
ntr-un studiu ulterior al enterococilor din alimentele de origine
animal, din Belgia, au fost izolate 161 de tulpini din urmtoarele
alimente: crnuri, brnzeturi, pete, crustacee i combinaii brnz-carne.
E. faecium a reprezentat 58,4% (94 din 161) i E. faecalis 26,1% (42
din 161) fiind reprezentate de E. hirae/E. durans.
Tabelul 5.7
Nr. zile depozitare la 6F Coliformi Enterococi
0 5.600.000 15.000.000
7 6.000.000 20.000.000
14 1.400.000 13.000.000
20 760.000 11.300.000
35 440.000 11.200.000
49 600.000 20.000.000
63 88.000 11.000.000
77 395.000 15.000.000
91 125.000 41.000.000
109
Nr. zile depozitare la 6F Coliformi Enterococi
207 55.000 3.500.000
481 66 5.000.000
Tabelul 5.8.
Caracteristici Coliformi Enterococi
Morfologie bacili coci
prezent n majoritatea
Incidena n materii fecale n unele probe absent
probelor
Specificitatea in tractul intestinal n general specific puin specific
110
Caracteristici Coliformi Enterococi
Supravieuirea n alimente congelate sczut ridicat
5.1.3. Bifidobacteriile
111
B. adolescentis i B. longum au fost cel mai frecvent izolate n numr
mare peste 106/100 ml din reziduuri umede. Ele au fost sugerate ca
indicatori de contaminare fecal recent n apele dulci tropicale, deoarece
dispar mai rapid dect coliformii i enterococi.
n ansamblu, strnsa asociere a bifidobacteriilor cu fecalele, faptul c
nu apar n ap i asocierea unor specii numai cu fecalele umane fac din
aceste bacterii buni indicatori ai polurii. Pentru c sunt strict anaerobi,
tind s creasc mai ncet i sunt necesare mai multe zile pentru obinerea
rezultatelor. Cresc cu mai mult probabilitate n carne i produse marine,
dect n legume (din cauza Eh-ului natural mai mare, n acestea din urm).
Este posibil ca ele s serveasc ca indicatori pentru crnuri i alimentele
marine.
112
Deoarece, bacteriile i virusurile posed proprieti diferite n ceea
ce privete persistena n mediul nconjurtor, colifagii au atras interesul
celor ce se ocup de indicatorii de enterovirusuri, n special din ap.
S-a demonstrat c, supravieuirea coliformilor din ap este paralel
cu aceea a enterovirusurilor umane. ntr-un studiu al apelor aprobate
pentru recoltarea de stridii, de-a lungul Coastei Golfului nici nivelul de E.
coli i nici nivelul bacteriilor coliforme nu au fost predictive pentru
prezena enterovirusurilor n stridii. n apele de recreaie, considerate
sigure, prin standardele pentru coliformi, enterovirusurile au fost detectate
n 43% din probe.
ntr-un studiu al apelor deschise de-a lungul coastei Carolinei de
Nord, virusurile enterice au fost izolate din 3 din 13 probe de 100 grame
de molute, din albii deschise, iar, 6 din 15 probe au fost pozitive cnd s-
au recoltat din albii nchise. O epidemie bine documentat de hepatit A
uman a fost atribuit consumului de stridii, recoltate din apele deschise.
ntr-un studiu care a comparat numrul de colifagi totali, fecali,
enterococi pe plci standard de numrare a acestora din ap, dup diferite
procese de tratare, colifagii s-au corelat mai bine cu enterovirusurile, dect
cu oricare din celelalte grupe menionate. Cnd produii reziduali
secundari au fost testai pentru colifagii masculini au fost gsite 8.200 de
uniti formatoare de colonii (UFC). Deoarece, unii colifagi au fost
raportai ca avnd habitatul natural n apele din mediul nconjurtor este
posibil ca numrul lor s nu se coreleze direct cu poluarea fecal.
Colifagii de gen masculin sunt indicatori mai buni ai polurii fecale a
apelor, dect colifagii totali, deoarece ei nu formeaz pili F la temperaturi
sub 30C i, deci, nu pot infecta celulele lor gazd F*. Asemntor
colifagilor, fagii lui Bacteroides fragilis au fost gsii n ape, cu niveluri
mari de reziduuri fecale umane (dejecii). Dei, numrul lor este mai redus
dect cel al colifagilor sunt mult mai specifici fecalelor umane. ntr-un
studiu au fost gsii n numr semnificativ, n apele reziduale din abatoare
sau n apele ce conin materii fecale de la animalele slbatice. Aceti
cercettori au artat c fagii B. fragilis se multiplic numai n condiii
anaerobe.
Fagii DNA dublu-catenari (DNA d.c.) de Vibrio vulnificus, mpreun
cu celulele gazd au fost gsii n diverse esuturi i fluide de stridii, fiind
mai abundeni i mai variai n molute, ceea ce sugereaz posibila lor
utilizare ca indicatori ai prezenei speciei V. vulnificus. ntr-un alt studiu s-
a constatat c numrul cel mai redus al acestor microorganisme a fost n
lunile ianuarie-martie i cel mai mare n timpul verii i al toamnei, cnd
numrul lor, per gram, a fost de 103-106, iar fagii de V. vulnificus au fost
de asemenea prezeni n numr maxim n acea perioad.
Unele enterovirusuri umane supravieuiesc mai bine n ap dect
113
coliformii, fiind mai rezistente la clor. Clorul a distrus 99,999% din
coliformii fecali, coliformii totali i streptococii fecali produii reziduali
primari, n timp ce virusurile au fost distruse n proporie de 85-99%.
Au fost comparai 4 fagi din punct de vedere al rezistenei la
nclzire, uscare, expunere la ClO2. Virusul hepatitei A a fost mai rezistent
dect poliovirusul I i dect colifagii RNA (MS2) i DNA (X174),
Enterovirusurile bovine produc la aceast specie infecii
asimptomatice i au fost gsii n fecalele a 76% din 139 de vite, 38% din
50 de cerbi cu coada alb i la una din 3 gte de Canada. n acest studiu
toate animalele menionate au folosit aceeai pune i acelai ru, iar
enterovirusurile bovine au fost gsite n stridiile din apele de ru din avalul
fermei.
Teschovirusurile, care sunt specifice speciei porcine (PTV), au fost
depistate la 92 de porci dintr-o ferm, folosind tehnica (PTV-RNA). Acest
grup de virusuri permite determinarea originii polurii (i anume de ce
specie anume este provocat).
Utilitatea pentru alimente. Utilitatea folosirii colifagilor pentru
determinarea coliformilor din alimente a fost pentru prima dat raportat
de ctre Kennedy et. al. n 1984. Acetia au folosit o incubare de la 16 ore,
pn la 18 ore, la 35C i au izolat colifagi din toate cele 18 probe de pui
proaspei i de crnai de porc. Numrul cel mai mare de colifagi a fost
gsit la puii proaspei (3,3-4,4 log10 UFC/100 g). n general, coliformii se
coreleaz mai bine cu E. coli i bacilii coliformi fecali, dect cu coliformii
totali. pH-ul cuprins ntre 6,0-9,0 nu a afectat colifagii din alimente.
Rezultatele pot fi obinute n 4-6 ore, dar aceti cercettori au preferat
incubarea timp de 16-18 ore. Pe de alt parte, colifagii de gen masculin
specifici, de S. Typhimurium nu au fost corelai cu coliformii fecali, totali
sau cu determinarea numrului n plci aerobe la 472 de probe de stridii
din Chesapeake Bay.
A fost investigat posibila utilizare a colifagilor de gen masculin
specifici (F+), ca indicatori pentru morcovii proaspei i din 25 de morcovi
testai, 25% au fost pozitivi pentru fagii F+, 8% pentru E. coli, 4% pentru
Salmonella.
Din carnea tocat de vit i pui au fost izolai 3 grupe de fagi diferii,
100% 5 colifagi F+, 69% colifagi somatici i 65% 3 fagi de Salmonella.
Sensibilitatea testului fagic pentru carnea de vit sau pui a fost de 38
UFC/100 g.
n ansamblu, datele obinute sugereaz c testele pentru colifagi pot
fi adecvate, fie ca o alternativ pentru determinarea lui E. coli sau a
coliformilor, fie ca indicatori direci pentru enterovirusuri. Datorit
faptului c rezultatele se obin n 4-6 ore, iar colifagii se coreleaz mai
bine cu enterovirusurile dect coliformii, este util efectuarea de cercetri
114
n continuare.
Posibila utilizare a indicatorilor fecali. Utilizarea cu succes a
coliformilor/coliformi fecali la evaluarea potabilitii apei a dus la
folosirea sa pe scar larg pentru determinarea siguranei microbiologice a
alimentelor, iar utilitatea sa a fost extins nu numai la o mare diversitate
de produse alimentare, dar i la suprafeele i ustensilele de manipulare a
alimentelor.
ntr-un studiu de 2 ani, efectuat n Italia pe probe de lptuci i
chimen, pentru determinarea numrului de coliformi, coliformi fecali i
enterococi s-a artat c aceste vegetale, care se folosesc ca atare, conin
ntre 3-4 log10/100 g, pentru fiecare grup.
Tabelul 5.9
Alimente APC Coliformi Coliformi fecali Enterococi
Lptuci 7.82 4.77 3.79 3.34
Chimen 6.37 4.89 3.89 3.49
Tabelul 5.10
Fagi RNA, F Colifagi Coliformi Streptococi Spori de
Sursa
specifici somatici termotolerani fecali Clostridium
Porc 2.8x<103 3.4x106 3.0x106 7.3x105 6.4x102
116
Tabel. 6.1.
Definirea zonelor termice de confort microbian
Intervalul termic Influena temperaturii
Reducerea vitezei proceselor metabolice pn la oprire:
Valori termice subminimale
efect microbiostatic
Temperatura minim Influeneaz uor favorabil
Procese metabolice derulate la parametrii de maxim
Temperatur optim
performan
Temperatur maxim Influeneaz uor favorabil
Temperaturi subminimale Coagularea proteinelor celulare:efect microbiocid
117
pentru majoritatea mezofililor se situeaz ntre 20 i 40oC. Acest tip de
bacterii traiete n animale i plante precum i n sol i ap, n clime
temperate, subtropicale sau tropicale. Temperaturile optime de cretere a
majoritii agenilor patogeni se sintetizeaz ntre 30 i 40oC (n funcie de
temperatura organismului respectiv, n general n apropierea temperaturii
de 37 oC).
Microorganisme termofile (t>45oC): bacterii butirice, bacterii
lactice din genul Thermobacterium, drojdii din genul
Schizosaccharomyces, bacterii din gunoiul fermentat, bacterii din furaje
nsilozate, virusuri. Sunt importante n procesele de alterare, la fabricarea
unor produse lactate, acidulri industriale, fabricarea unor buturi n
regiunile cuu clim cald, sterilizarea biotermic a gunoiului de grajd,
nsilozarea furajelor, obinerea enzimelor termostabile, purificarea apelor
reziduale, bioindicatori ai tratamentelor termice, pot produce o serie de
boli. Sistemele enzimatice ale microorganismelor termofile sunt active i
stabile la temperaturi ridicate. Unele bacteriile termostabile pot supravieui
o scurt perioad de timp la temperaturi nalte, n mod normal fiind
mezofile, acestea sunt contaminantele obinuite ale alimentelor nclzite
sau pasteurizate, fiind deseori sporogene. Bacteriile termofile se dezvolt
optim la temperaturi de peste 45oC, temperatura optim fiind cea de 60oC.
Bacteriile termofile au de regul ca ni ecologic soluri i ape cu
activitate vulcanic, precum i habitate expuse direct soarelui (platforme
de blegar). Majoritatea speciilor se dezvolt ntre 45 i 80oC, iar unele pot
supravieui chiar la aproximativ 250oC (aceast cifr este considerat
temperatura limit tolerat de protoplasm). Temperatura influeneaz
unele activiti vitale ale bacteriilor, cum ar fi: multiplicarea, elaborarea
unor toxine i enzime, sporogeneza etc. Multe dintre speciile termofile
sunt sporogene i mai puine dintre ele sunt patogene. Rezistena acestor
bacterii se bazeaz pe tolerana la temperaturi ridicate a constituenilor
celulari eseniali precum i a capacitaii deosebite de resintetizare rapid a
constituenilor celulari alterai prin caldur. Unele dintre habitatele cu cele
mai extreme sunt izvoarele fierbini, gheizerele, canalele i gurile de
aerisire ale oceanelor. Temperaturile din aceste locuri variaz de la 50 oC
pn la temperaturi situate cu mult deasupra punctului de fierbere al apei,
apropiindu-se de 350oC n unele canale de aerisire ale oceanelor.
Majoritatea bacteriilor adaptate la cldur sunt organisme extrem de
primitive (arhebacterii). Un ecosistem absolut unic, bazat pe bacterii care
oxideaz hidrogenul sulfurat exist n gurile de ventilaie hidrotermale din
adncurile oceanelor. Bacteriile adaptate termic colonizeaz chiar i
sistemele de nclzire a apei din gospodrii (boilere) sau turnurile de
nclzire i instalaiile de rcire cu ap din centralele electrice i uzinele
industriale.
118
Indicatorii convenionali, folosii pentru aprecierea
termorezistenei n cazul bacteriilor patogene sunt reprezentai de: punctul
termic mortal i timpul termic mortal. Punctul termic mortal se exprim
prin temperatura la care sunt omorte n zece minute toate celulele dintr-o
populaie ce aparine unei specii bacteriene date. Timpul termic mortal
reprezint timpul de expunere n care sunt omorte toate celulele unei
populaii dintr-o specie bacterian la o temperatur constant dat.
Sporii bacterieni rezist la temperaturi supramaximale, mult mai
ridicate dect celulele vegetative, fiind distrui la 120oC, cldur umed i
180oC, cldur uscat.
Temperatura minim reprezinta limita cea mai joas care permite
unei bacterii s-i continue creterea i activitatea metabolic; sub aceste
limite activitile sale sunt n general inhibate. Temperatura sczut
produce n majoritatea cazurilor o aciune pozitiv asupra bacteriilor. S-a
constatat c unele specii pot supravieui chiar la temperatura de nghe a
aerului (-190 oC) sau a heliului (-250 oC).
Gradul de nocivitate al temperaturilor sczute este cu att mai
redus cu ct nghetul se produce mai brusc. Cauza morii celulelor supuse
temperaturilor subminimale const n efectul deshidratant al ngheului
care atrage dup sine concentrarea electroliilor din celul precum i
aciunea mecanic a cristalelor de ghea. Efectul conservant a1 frigului
asupra bacteriilor i-a gsit aplicaii practice n metodologia pstrrii
acestora n colecii prin congelare (-70; -30 oC) sau prin liofilizare
(nghearea brusc a materialului microbian la temperatura zpezii
carbonice urmat de uscarea acestuia n vid).
Temperatura maxim reprezint temperatura cea mai ridicat la
care poate avea loc creterea i multiplicarea bacteriilor. Dac,
temperatura continu, ns, s creasc peste aceast limit, activitatea
metabolic se va opri, iar celula va muri.
Temperatura optim cuprinde o gam redus intermediar ntre
nivelul minim i cel maxim, cu rata cea mai rapid de cretere i
metabolizare. n funcie de habitatele lor naturale unii microbi se dezvolt
ntre limite destul de largi ale temperaturii cardinale n timp ce n cazul
altora aceste limite sunt mai nguste. De exemplu, bacteriile strict parazite
sau obligatorii nu se dezvolt dac temperatura variaz mai mult dect cu
cteva grade sub sau peste temperatura corpului gazdei. Rickettsiile se
multiplic numai ntre 32 i 38 oC.
Unii ageni patogeni sunt extrem de strici sub raportul nevoilor lor
de temperatur (ex.: gonococul se dezvolt ntre 30 i 40oC, iar bacilul
tuberculozei ntre 30 i 42oC). Alte bacterii patogene nu se pot dezvolta
dincolo de un interval de zece grade. Exist i bacterii care se pot dezvolta
n limite mai largi de temperatur. De exemplu, unele tulpini de stafilococ
119
care cresc ntre 6 i 46oC sau Enterococcus faecalis ntre 5 i 50oC.
Cunoscndu-se modul cum temperatura influeneaz metabolismul
microbian, pot fi dezvoltate aplicaii utiliznd cldura n cultivarea
industrial a microorganismelor utile la prepararea unor produse
farmaceutice, alimentare, biopreparate i produse de biosintez sau
utiliznd frigul (temperatura de refrigerare i congelare) n conservarea
materiilor prime, produselor alimentare, vacinurilor etc. La congelare, apa
liber i o parte din cea legat celular se transform n cristale de ghea,
crete concentraia n enzime, cu declanarea fenomenelor caracteristice
ocului osmotic i instalarea modificrilor ireversibile n conformaia
macromolecular i perneabilitatea membranei celulare. Procesul
determin distrugerea unor microorganisme, crend un mediu propice
dezvoltrii celor care au supravieuit. La congelarea rapid se produc
cristale mici intra- i extracelulare, ce creaz distrugeri mai mari ale
celulelor microbiene, dect congelarea lent. La congelarea lent (3-72
ore), apa migreaz din celula microbian n exterior, se formeaz cristale
mari de ghea, care rup membranele celulare, distrugnd celulele.
S-a observat c forma bacteriilor influeneaz rezistena acestora la
temperaturile minime, astfel cocii sunt mai rezisteni la congelare dect
bacilii. De asemenea sporii bacteriilor, toxinele si bacterile responsabile de
toxiinfecti alimetare rezist la congelare.
Denaturarea ireversibil prin cldur a proteinelor celulare,
acumularea produilor de metabolism toxici i inactivarea enzimelor sunt
mecanismele prin care cldur distruge microorganismele. Uciderea
microorganismelor prin cldur este una din principalele ci de conservare
a produselor alimentare i farmaceutice, de sterilizare a vaselor i
instrumentelor utilizate n laborator sau n slile de operaii, la pregtirea
mediilor de cultur microbian etc.
Inactivarea microorganismelor prin utilizarea temperaturilor
supramaximale este depent de timpul de expunere al acestora i este
influenat de prezena sau nu a vaporilor de ap.
Conservarea cu ajutorul temperaturii supramaximale: face referire
la fierbere, pasteurizare (t<100oC), sterilizare (t>100C) sau tindalizare (2-
3 pasteurizri repetate, alternante cu perioade de termostatare).
Tabelul 6.2.
Valorile minime de cretere ale unor bacterii
Microorganismul Temperatura minim de cretere
Vibrio -5
Yersinia enterocolitica -2
Enterococcus 0
Listeria monocytogenes 1
120
Microorganismul Temperatura minim de cretere
Clostridium botulinum 3,3
Salmonella 4
Staphylococcus 6,7
121
lipsete i comutnd pe respiraia aerob (un proces mult mai eficient)
cnd oxigenul devine disponibil. Desigur, multe procariote sunt strict
aerobe i solicit oxigen tot timpul.
122
preferenial n condiii de pH acid, precum i palD ce codific fosfataza
alcalin, prtA ce codific proteaza alcalin i xlnA ce codific xilanaza,
toate expresate preferenial n condiii de cretere cu pH alcalin. Din
categoria genelor reglate de pH care codific permeaze este i gabA ce
codific un transportor GABA ce are un pH acid optim i se expreseaz
preferenial ntr-un mediu acid. Dovezi indirecte susin c molibdat
permeaza este sintetizat preferenial n condiii de pH acid. Genele
reglate de pH implicate n sinteza metaboliilor exportai includ acvA o
gen expresat preferenial n mediu alcalin care codific -(L-{alpha}-
aminoadipil)-L-cisteinil-D-valinsintetaza i ipnA tot o gen expresat
preferenial n mediu alcalin care codific isopenicilin N sintaza, acestea
sunt primele dou enzime ale biosintezei penicilinei. Iar genele expresate
preferenial n pH acid implicate n sinteza metaboliilor exportai sunt
stcU care codific ketoreductaza cataliznd reducerea versicolorinului A i
participnd la sinteza sterigmatocistinei toxice, care, la o serie de specii
Aspergillus, este precursor al aflatoxinei. n plus, una sau mai multe
activiti implicate n toxicitatea aminoglicozidelor cum sunt neomicina i
kanamicina par a fi sub controlul pH-ului ambiental, respectiv tocicitatea
crete n condiii de cretere alcaline.
Din punt de vedere medical, cunoaterea comportamentului
fungilor funcie de pH permite elaborarea unor sisteme de reglare a pH-
ului care vor putea preveni efectul patogen al acestora asupra animalelor
i/sau plantelor.
123
Tabelul 6.3.
Efectul osmotic
Presiunea osmotic a mediul
Descrierea efectului osmotic
exterior celulei
Isotonic = 0,9% sruri Intr i ies cantiti egale de ap.
Apa are tendina de a intra, compresiunea
Hipotonic < 0,9% sruri peretelui. Nu sunt probleme dac peretele este
intact (poate suporta 20 de atmosfere).
Apa are tendina s ias afar, secarea celulelor
Hipertonic > 0,9% sruri
pn la plasmoliz. Se oprete metabolismul
124
6.5. Influena presiunii hidrostatice asupra microorganismelor
125
nefotosintetizante tind s fie lezate de ctre produsele toxice de oxigen
rezultate din contactul cu lumina. Unele specii bacteriene, cum ar fi
stafilococul auriu (Staphylococcus aureus) produc un pigment carotenoid
galben care protejeaz bacteria mpotriva efectelor lezante ale luminii prin
absorbia i distrugerea oxigenului toxic. Alte tipuri de radiaii toxice
pentru bacterii sunt cele ultraviolete i ionizante (raze X i radiaii
cosmice).
Cele dou forme principale de radiaii folosite n controlul
microbian sunt radiaiile electromagnetice i cele corpusculare
(particulare).
Radiaiile electromagnetice se comport ca nite unde, spectrul lor
variind de la radiaiile gama de mare energie, cu lungime de und scurt,
la o extremitate, pn la radiaii de mic energie, cu lungime de und
foarte mare, la cealalt extremitate.
n general, numai radiaiile electromagnetice de nivelul radiaiilor
gama, razelor X (numite i Roentgen) i radiaiile ultraviolete (UV) sunt
adecvate pentru controlul microbian.
Pentru a ntelege efectele fizice reale ale radiaiilor asupra
bacteriilor va fi util vizualizarea procesului de iradiere sau bombardarea
cu radiaii la nivel celular. Cnd o celul este bombardat de anumite unde
sau particule, moleculele sale absorb o parte din energia liber, ceea ce
poate avea urmtoarele consecine:
dac radiaia dezintegreaz structura atomic a moleculelor prin
dislocarea i ejecia de electroni orbitali rezultatul const ntr-un
dezechilibru electronic i n formarea de ioni. Aceasta este radiaia
ionizant. Una dintre intele cele mai sensibile pentru radiaia ionizant
este molecula de ADN, care poate suferi mutaii pe scar larg. Efectele
secundare letale se dovedesc a fi modificri chimice ale organitelor i
producerea de substane toxice. Efecte ionizante au radiaiile gama, razele
X i electronii de mare vitez.
Radiaiile neionizante sunt cel mai bine exemplificate de
radiaiile UV, excit atomii ridicndu-i la un nivel energetic superior, ns
nu-i ionizeaz.
Aceast excitaie atomic, la rndul sau, duce la legturi anormale
n interiorul unor molecule cum ar fi cele de ADN, producnd mutaii.
n ultimii ani, utilizarea radiaiilor ionizante a devenit mai sigur i
mai economic, iar aplicaiile lor s-au nmulit foarte mult. Acestea
reprezint o alternativ foarte eficient pentru sterilizarea materialelor
sensibile la caldur sau la substane chimice. Deoarece radiaiile
acioneaz n absena cldurii, sterilizarea produs de ele este uneori
denumit sterilizare la rece.
Dispozitivele care emit radiaii ionizante includ aparate de radiaii
126
gama ce conin cobalt radioactiv, aparate de raze X similare celor folosite
pentru diagnosticul medical i aparate de raze catodice care funcioneaz
cu un tub electronic cu vid (vacuum) al unui televizor. Obiectele sunt
plasate n aceste aparate i iradiate un timp scurt, doza fiind aleas cu
grij. Doza se msoar n razi (radiation absorbed dose = doza de radiaie
absorbit). n funcie de aplicaie expunerea variaz ntre 0,5 i 5 megarazi
(Mrazi; 1 megarad = 1.000.000 razi).
Toate radiaiile ionizante pot ptrunde prin lichide i solide, ns
radiaiile gama sunt cele mai penetrante, razele X sunt intermediare, iar
razele catodice cel mai puin penetrante. Bacteriile cele mai rezistente la
radiaii sunt anumii coci Gram pozitivi (Deinococcus) i sporii bacterieni.
Celulele bacteriene vegetative sunt extrem de sensibile la radiaii.
Deinococcus radiodurans a fost descoperit n 1956 de Arthur W.
Andersdon la Staia de Experimente Agricole Oregon, i este considerat
cea mai rezistent celul bacterian vegetativ la aciunea radiaiilor.
Abilitatea bacteriei de a supravieui n condiii extreme (radiaii i
substane chimice genotoxice, distruciilor oxidative i deshidratrii) este
atribuit abilitii acesteia de a-i reface cromozomii. Este cunoscut c
prin nclzire, deshidratare sau iradiere este posibil ruperea celor dou
lanuri oligonucleotidice ale moleculei de ADN cromozomial. D.
radiodurans va repara aceste fragmente cromozomiale, uzual n 12-24 ore,
utiliznd dou procese, cel din urm fiind de o importan crucial. Iniial,
D. radiodurans utilizeaz un proces denumit aliniere monostrat pentru a
reconecta unele fragmente de cromozom. Apoi, D. radiodurans utilizeaz
un proces cunoscut ca recombinare omolog, unde o proteina Reca repar
cele dou straturi. Proteina Reca taie fragmente de ADN utilizate ntr-o
alt molecul i le inser n stratul lezionat (acest lucru este posibil
ntruct genele sunt mpachetate n patru cromozomi circulari distinci). n
plus fa de acest mecanism D. radiodurans mai posed pigmeni
carotenoizi, sistem enzimatic de anihilare a aciunii toxice a oxigenului i
o membran extern distinct. Dintre acestea, prezena peretelui celular
multistratificat (trei sau mai multe straturi) cu o membran lipidic extern
i un strat peptidoglicanic gros, ce conine aminoacidul omitidin, de
asemenea servete la protecia celulei bacteriene fa de dozele letale de
radiaii.
De-a lungul anilor diferite agenii au experimentat folosirea
radiaiilor ionizante n dezinfecii i sterilizarea alimentelor. Problemele
care apar n mod inevitabil n cazul alimentelor iradiate sunt modificrile
de arom i valoare nutritiv ct i posibilitatea introducerii unor produse
secundare nocive rezultate din reaciile chimice. Aceste dezavantaje au
fost diminuate prin utilizarea unor doze minime i prin efectuarea
procesului n camere foarte reci i fr oxigen. Alimentele care se
127
sterilizeaz prin aceast metod sunt carnea afumat, precum i unele
mirodenii i condimente. Mai frecvent iradierea este folosit pentru
diminuarea ncrcturii microbiene. De exemplu, pot fi iradiate: carnea
proaspt de porc, carcasele de pui pentru controlul speciilor din genul
Salmonella, fructe i legume proaspete.
Sterilizarea produselor medicale cu radiaii ionizante constituie un
domeniu care se extinde rapid. Astfel, diverse medicamente, vaccinuri,
pulberi, instrumente medicale (n special din materiale plastice), seringi,
materiale de sutur, burei, mnui chirurgicale i esuturi (oase, cartilaje,
piele i valvele cardiace pentru grefe) se preteaz la acest mod de
sterilizare. Avantajele principale ale acestei metode constau n rapiditate,
putere de penetrare mare (poate steriliza materiale prin pachete i
ambalaje). Dezavantajele principale sunt pericolele poteniale pe care
expunerea la radiaii le prezint pentru operatori i posibila deteriorare a
unor materiale. Contrar convingerii populare, prin radiaiile folosite n
acest mod alimentele i alte materiale nu devin radioactive.
128
Fotosensibilizarea const n intensificarea aciunii antibacteriene a
unor substane inactive la ntuneric, avnd un efect invers n raport cu
fotoprotecia i fotoreactivarea.
Lumina vizibil exercit unele efecte antimicrobiene, ns nu este
suficient de previzibil n ceea ce privesc efectele sale de control asupra
tuturor microbilor.
Radiaiile infraroii pot fi distructive prin caldura pe care o produc,
ns au mai puine aplicaii dect alte metode termice.
Microundele, de asemenea, par s omoare microorganismele prin
producerea cldurii, dar efectele antimicrobiene ale undelor radio lungi
sunt minime.
Un laser este o surs de lumin, dar total diferit fa de un bec
normal. Cuvntul LASER provine din limba englez, el fiind ancronimul
pentru Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation.
Diferena dintre lumina emis de un bec normal i un laser este ca i aceea
dintre zgomotul alb i un ton curat. Principiile de funcionare ale laserului
au fost enunate n 1916 de Albert Einstein, printr-o evaluare a
consecinelor legii radiaiei a lui Max Planck i introducerea conceptelor
de emisie spontan i emisie stimulat, dar primul laser funcional a fost
construit de Theodore Maiman abia n 1960. Laserul este un dispozitiv
optic care genereaz un fascicul coerent de lumin. Fasciculele laser au
mai multe proprieti care le difereniaz de lumina incoerent produs de
exemplu de Soare sau de becul cu incandescen: monocromaticitate
(spectru foarte ngust de lungimi de und); direcionalitate (propagare pe
distane mari cu o divergen foarte mic i capacitatea de a fi focalizate
pe o arie foarte mic); intensitate (unii laseri sunt suficient de puternici
pentru a fi folosii la tierea metalelor).
Lasere cu elemente solide (materiale cristaline sau amorfe, de
obicei amorsate cu ajutorul lmpilor cu xenon sau a laserelor
semiconductoare) au lungimea de und n spectrul de la infrarou (1064,0
nm - Nd tratat) pn n spectrul vizibil (694,1nm rubin). Puterea acestor
lasere ajung n domeniul pentawatilor (cele care lucreaz n impulsuri),
dar n medie au n jur de 1000W, motiv pentru care principala lor
destinaie este prelucrarea materialelor (gurit, tiat, sudur, ajustare),
studierea fuziunii nucleare, spectroscopie i exercit un efect bactericid
instantaneu asupra populaiilor bacteriene.
129
atmosfer mpiedic resimirea ntregii sale intensiti i ca atare limiteaz
utilizarea sa practic. Lungimile de und ale radiaiilor UV se situeaz
ntre aproximativ 100 i 400 nm. Efectele sunt letale n special ntre 240 i
280 (cu un vrf de 260 nm). n practica de fiecare zi, sursa de radiaii UV
o constituie lampa germicid, care genereaz radiaii de 254 nm.
Din cauza strii lor energetice inferioare, radiaiile UV nu sunt att
de penetrante ca radiaiile ionizante.
Deoarece radiaiile UV trec uor prin aer, n mic masur prin
lichide i extrem de puin prin solide, obiectul ce urmeaza s fie
dezinfectat trebuie s fie expus direct acestui tip de radiaie.
Cnd radiaia UV trece printr-o celul, ea este iniial absorbit de
ADN, ceea ce are drept urmare stoparea reproducerii. O leziune
molecular specific se produce asupra bazelor pirimidinice (timin i
citozin), ce sunt att de afectate de radiaiile UV, nct formeaz legturi
anormale numite dimeri pirimidinici.
Faptul ca acetia se produc ntre baze adiacente pe acelai lan de
ADN mpiedicnd replicarea i transcrierea normal a ADN-ului, explic
inhibarea creterii i moartea celular. Pe lng alterarea ADN-ului
radiaiile UV dezintegreaz celulele prin producerea unor substane
fotochimice toxice (radicali liberi). Datorit pericolului lezrii universale
produs de radiaiile UV, ele reprezint un mijloc puternic de distrugere a
celulelor i a sporilor. Sporii bacterieni sunt de aproximativ zece ori mai
rezisteni la radiaii dect celulele vegetative, ns pot fi omori prin
creterea timpului de expunere.
Metodele de control care folosesc radiaii UV au ca obiectiv
principal dezinfecia, mai degrab dect sterilizarea. Ele sunt utilizate
pentru reducerea contaminanilor transmii prin aer n saloanele
spitaliceti, sli de operatie, coli, spaii de preparare a hranei, camine de
spital i barci militare.
Dezinfecia aerului cu UV s-a dovedit eficient n reducerea
infeciilor postoperatorii i n limitarea creterii microbilor n instalaiile
de prelucrare a alimentelor i n abatoare. n cursul acestor proceduri
lmpile germicide sunt plasate pe perei sau pe tavan pentru a mpiedica o
expunere excesiv a persoanelor din camer. Lampile cu UV pot fi de
asemenea plasate n evile de nclzire i de condiionare a aerului. Prin
utilizarea acestei metode concentraia microbilor transmii prin aer este
diminuat ntr-o proporie de pn la 99%.
Iradierea cu UV necesit o aparatur special pentru a rspndi
lichidul ntr-o pelicul subire, fluid care este expus direct unei lmpi.
Aceast metod poate fi utilizat pentru tratarea apei potabile (n locul
clorinrii) ct i pentru purificarea altor lichide (lapte, suc de fructe, vin i
bere) ca o alternativ pentru caldur.
130
Tratamentul cu UV s-a dovedit eficient n ndeprtarea
contaminanilor din antigene vaccinale i plasm. Suprafeele unor
materiale solide neporoase ca: perei, podele, contoare, cristale chimice,
carne, mici, esuturi pentru transplantare i medicamente, au fost de
asemenea dezinfectate eficient cu UV.
Un dezavantaj major al radiaiilor UV const n puterea lor foarte
redus de penetrare. Ele nu ptrund satisfctor n materiale opace ca:
sticl, metale, esturi, materiale plastice i chiar hrtie.
Un alt dezavantaj al radiaiilor UV este efectul nociv asupra
esuturilor umane expuse excesiv la care provoac arsuri solare, leziuni
retiniene, cancer i riduri cutanate.
131
umiditate, drojdiile i mucegaiurile, de minimum 10%; spori bacterieni
sunt mai rezisteni la scderea umiditii. Cunoscnd aceste cerine ele pot
fi exploatate la conservarea prin deshidratare a materiilor prime animale i
vegetale, a furajelor, alimentelor, produselor farmateutice, industriale etc.
prin zvntare sau deshidratare cu ajutorul cldurii asociat cu ambalarea
ermetic n materiale impermeabile, care asigur conservabilitatea n timp
a acestora.
Bacteriile reacioneaz fa de substanele chimice prin
urmtoarele mecanisme:
indiferena fa de substana respectiv;
utilizarea acesteia ca surs nutritiv;
intensificarea unor activiti biologice datorit efectului ei
biostimulator;
migrarea bacteriilor spre substana atractant datorit unui
chimiotactism pozitiv;
ndeprtarea bacteriilor de repelent datorit unui chimiotactism
negativ;
dereglarea unor activiti vitale pn la moartea celulei (efect
antibacterian).
Dup natura efectului antibacterian substanele chimice se pot
clasifica astfel:
bacteriostatice, cnd produc dereglari reversibile ce duc la
ncetarea diviziunilor celulare;
bactericide, care au un efect ireversibil, producnd moartea
bacteriilor.
Efectul antibacterian este dependent de urmtorii factori:
substana ca atare: exist substane chimice care au efect
bacteriostatic (ex.: acidul boric) i substante cu efect bactericid, chiar n
concentraii foarte mici (biclorura de mercur);
concentraia (doza): majoritatea substanelor chimice au efect
bacteriostatic n doze mici i bactericid n doze mari;
forma biologic: celula vegetativ este mai sensibil la aciunea
acestor substane dect endosporul. De exemplu, substane ca glicerina sau
cloroformul sunt active fa de celula vegetativ dar sunt inactive fa de
spor.
specia bacterian: de exemplu, pencilina este activ fa de
bacteriile Gram pozitive, dar nu i fa de majoritatea celor Gram
negative; substanele ca hidrazida acidului izonicotinic, acidul
paraaminosalicilic sunt active fa de bacilii tuberculozei.
Dup specificitatea aciunii, substanele antibacteriene se clasific
n:
132
substane cu aciune specific, ce se utilizeaz in vivo n
tratament, ce sunt reprezentate de produse chimice de sintez
(chimioterapeutice) sau de produse de secreie obinute din materiale
biologice de natur bacterian, fungic, vegetal sau animal (antibiotice).
n infeciile n care este posibil izolarea agentului etiologic se recomand
testarea sensibilitii acestuia fa de mai multe antibiotice consecutiv
(antibiograma). Tratamentul cu astfel de substane poart denumirea de
antibioterapie.
substane cu aciune specific utilizate numai in vitro al cror
efect nociv se exercit n mod egal att fa de celula bacterian ct i fa
de cea animal. Acestea sunt reprezentate de dezinfectante (principalii
ageni sterilizani chimici) i de ctre antiseptice cu aciune mai slab,
avnd un efect predominant bacteriostatic (utilizate n tratamente externe
pentru antisepsia pielii sau mucoaselor).
Pe baza indicelui sau coeficientului fenolic se apreciaz activitatea
antimicrobian a antisepticelor i dezinfectantelor. Acesta exprim cifric,
de cte ori o substan este mai activ sau din contr, mai puin activ
dect fenolul (etalonul convenional) faa de o specie bacterian dat.
Dup mecanismul de aciune, substanele antibacteriene se clasific
n patru grupe:
Substane care modific permeabilitatea nveliului, reprezentate
de spunuri, detergeni i fenol. Aceste substane produc modificri fizico-
chimice care determin pierderea permeabilitii selective a nveliului.
Spunurile diminu tensiunea superficial, detergenii dizolv lipidele, iar
fenolul acioneaz i prin alterarea proteinelor avnd un efect antibacterian
mult mai puternic.
Substane care produc alterarea proteinelor, din care fac parte
acizii (acioneaz prin ionii de hidrogen: H+), bazele (acioneaz prin ionii
OH- disociai, care determin gradul de alcalinitate al mediului) i alcoolii
care au o aciune antibacterian slab, direct proporional cu greutatea
molecular a acestora.
Substane care acioneaz prin interferare cu gruprile active ale
enzimelor, reprezentate de srurile metalelor grele (mercur, cupru, argint)
cu efect intens bactericid; ageni oxidani (clorul, iodul, peroxizii);
formaldehida (formol sau formalina; reacioneaz cu radicalii NH2 i OH).
Substane cu structur asemntoare stereochimic, care
acioneaz prin inhibiie competitiv, reprezentate de sulfamide. Acestea
produc blocarea sintezei acidului folic (factor de cretere pe care bacteriile
i-1 sintetizeaz singure). De exemplu, nucleul diparaaminobenzen-
sulfamid se aseaman i poate fi confundat de bacterii cu acidul
paraaminobenzoic care intr n compoziia acidului folic.
133
Agenii chimici antimicrobieni cei mai importani sunt reprezentai
de: halogeni, metale grele, alcooli, compui fenolici, oxidani, aldehide,
detergeni i unele gaze.
134
tratarea bazinelor de not; izvoarelor de ap mineral, a apei de but i
chiar a alimentelor proaspete.
Hipocloriii se mai pot utiliza chiar i n domenii sanitare conexe la
tratarea plgilor, dezinfecia aparaturii, lenjeriei i instrumentarului.
Decoloranii (nlbitorii) obinuii sunt soluii slabe (5%) de hipoclorit de
sodiu care servesc ca dezinfectante, deodorante sau la ndepartarea petelor.
Cloraminele (dicloramina, halozona) sunt folosite mai frecvent ca
substitueni ai clorului pur la tratarea conductelor de dezinfectare a apei.
Clorurarea standard a apei poate produce niveluri periculoase de substane
cancerigene (ex.: trihalometanii) putndu-se recurge la adaptarea tratrii
conductelor de ap cu cloramin. Dac substan este absorbit n snge n
timpul manoperelor de dializ sau la consumatorii de pete tropical aceast
msur poate crea probleme prin efectele sale toxice.
Cloraminele servesc, de asemenea, ca ageni de igienizare sau la
dezinfectani precum i n tratarea plgilor sau a suprafeelor cutanate.
Iodul i compuii sai. Iodul este o substan caustic, de culoare
neagr, care formeaz soluii de culoare cafenie cnd este dizolvat n ap
sau alcool. La scurt timp dup descoperirea sa n 1812, a fost rapid adoptat
n domeniile medicale ca antiseptic, iar ulterior ca dezinfectant.
Principalele preparate pe baz de iod sunt iodul liber n soluie (I2) i
iodoforii (de obicei combinaii ale iodului cu polivinilpiralidonul).
Iodul ptrunde rapid n celulele microbiene, unde se pare c
perturb diverse funcii metabolice prin mpiedicarea legrii proteinelor cu
hidrogen i disulfide (ca i n cazul clorului). Distruge aproape orice fel de
microorganisme dac se folosete n concentraii i timpi de expunere
adecvai. Activitatea iodului nu este tot att de puternic influenat de
substanele organice i de pH ca n cazul clorului.
Soluiile de iod liber exist sub trei forme: iodul apos care conine
2% iod i 2,4% iodur de sodiu; se utilizeaz ca antiseptic local nainte de
interveniile chirurgicale i uneori ca tratament al infeciilor cutanate i al
arsurilor. Soluia concentrat de iod (5% iod i 10% iodur de potasiu)
este utilizat n special ca dezinfectant datorit puterii sale. Este folosit n
dezinfecia obiectelor din material plastic, cauciuc precum i al lamelor,
cateterelor i termometrelor.
Tinctura de iod este o soluie de iod 2% n iodur de sodiu i alcool
diluat. Este un germicid cutanat puternic, n special cnd este necesar un
grad nalt de asepsie. Deoarece iodul poate fi extrem de iritant pentru piele
i toxic cnd este absorbit, soluiile i tincturile apoase puternice (57%) nu
mai sunt folosite n asepsiile de rutin. Alte dezavantaje constau n
caracteristicile de decolorare, corozive i olfactive (ru mirositoare).
Apa de but i apa rezidual pot fi tratate uneori cu compui ai
iodului ns aceas procedur este prea costisitoare pentru a putea fi
135
practicat pe scar larg. Exist tablete de iod pentru dezinfectarea apei n
caz de urgen sau pentru distrugerea agenilor patogeni din conductele de
ap impur.
Iodoforii sunt complexe de iod i un polimer neutru cum ar fi
alcoolul polivinilic. Aceast combinaie permite eliberarea lent a iodului
liber mrind gradul de penetraie. Aceti compui au nlocuit n mare
msur soluiile de iod liber n antisepsia medical deoarece sunt colorani
mai slabi i mai puin iritani. Produsele iodofore obinuite conin 2-10%
iod liber i se folosesc ca antiseptice medicale i dentare, ca ageni de
degerminare i ca dezinfectante.
Aplicaiile constau n pregtirea pielii pentru intervenii
chirurgicale, injecii, tratarea arsurilor, infecii vaginale, splarea minilor,
a aparaturii, a suprafeelor i chiar la prepararea apei de gur.
Fenolul i derivaii si. Fenolul (acidul carbolic) este un compus
caustic i toxic derivat din distilarea gudronului de carbune. Acesta a fost
folosit pentru prima dat de Joseph Lister n 1867 ca germicid chirurgical:
Fenolul a reprezentat principala substan chimic antimicrobian pn
cnd (aproximativ 50 de ani mai tarziu) s-au obinut alte substane fenolice
cu efecte mai puin toxice i iritante. Soluiile de fenol nu se mai folosesc
astzi, ns rmn un indicator standard fa de care se evalueaz alte
dezinfectante fenolice. Substanele nrudite chimic cu fenolul sunt deseori
denumite substane fenolice. Acestea conin unul sau mai multe inele de
carbon aromatic cu grupe funcionale adugate.
Cei mai importani sunt fenolii alchilai (crezoli), fenolii clorurai
i bifenolii. n concentraii mari ei sunt toxici celulari, care rup rapid
pereii i membranele precipitnd proteinele, n timp ce n concentraii mai
slabe inactiveaz unele sisteme enzimatice importante.
Fenolii sunt substane germicide puternice ce distrug formele
vegetative ale bacteriilor (inclusiv bacilul tuberculozei), dar nu i
endosporii acestora. Din cauza toxicitii lor sunt prea periculoi pentru a
putea fi folosii ca antiseptice. Pentru obinerea unui efect maxim fiind
slab solubili n ap, multe dintre aceste preparate trebuie amestecate cu
spun.
Hexaclorofenul este un bifenol special cu aciune puternic
germicid, n special mpotriva agenilor Gram pozitivi din genurile
Staphylococcus i Streptococcus. Pn la descoperirea faptului c acesta se
absoarbe prin piele producnd tulburri neurologice (1972), acest compus
se aduga la numeroase spunuri folosite n spitale la splatul minilor
naintea interveniilor chirurgicale i la mbieri (nou nscui) pentru
prevenirea infeciilor stafilococice.
Clorhexidina (Hibitan) este o baz organic complex ce conine
clor i dou inele fenolice. Mecanismul de aciune se aseamn cu cel al
136
detergenilor cationici, datorit faptului c produce denaturarea
proteinelor. n funcie de concentraie, poate avea efect bactericid att
pentru Gram pozitivi ct i pentru Gram negativi, ns este inactiv fa de
endospori. Prezint avantaje nete fa de alte antiseptice prin faptul c are
o aciune blnd, toxicitate redus i efecte rapide. Dei se leag de
suprafaa pielii avnd un efect antimicrobian rezidual timp de cteva ore,
clorhexidina nu este absorbit n esuturile mai profunde. Soluiile
alcoolice sau apoase de clorhexidin sunt azi folosite n mod curent la
splatul minilor, prepararea zonelor cutanate pentru incizii chirurgicale
sau injecii.
137
n ap i oxigen.
Soluiile de peroxid sunt folosite de aproximativ 50 de ani, dar
formulele iniiale erau instabile i inhibate de substanele organice. Azi,
ns, metodele de fabricare permit sintetizarea unui compus att de stabil,
nct chiar i n soluiile diluate i menine activitatea de-a lungul mai
multor luni de conservare.
Dei majoritatea celulelor microbiene produc catalaz pentru
inactivarea cantitilor mici de peroxid de hidrogen produse n mod
normal n cursul propriului lor metabolism, acestea nu pot neutraliza
cantitatea de peroxid de hidrogen, care intr n celul n cursul dezinfeciei
i antisepsiei. Peroxidul de hidrogen are efect bactericid, iar n concentraii
mari sporicid. El este util n special n tratamentul infeciilor cu bacterii
anaerobe datorit efectelor letale ale oxigenului asupra acestor forme.
Soluiile de peroxid de hidrogen 6-25% sunt suficient de puternice pentru
sterilizarea instalaiilor de mpachetat alimente i chiar a interiorului
navelor cosmice. Ali compui cu efecte asemntoare peroxidului de
hidrogen sunt: ozonul (O3), folosit uneori pentru dezinfectarea aerului i a
apei; acidul paracetic, oxidant extrem de puternic folosit pentru sterilizarea
stimulatoarelor cardiace i a camerelor de izolare pentru animale;
permanganatul de potasiu (KMnO4) soluie roz deschis, puternic
germicid, chiar i atunci cnd este foarte diluat. Datorit coninutului
su extrem de toxic este folosit n special ca algicid.
138
bacteriilor Gram pozitive, fiind ns ineficieni n cazul bacililor tuberculozei,
pseudomonadelor i sporilor.
Compuii cuaternari de amoniu includ clorura de benzalcaniu, i
clorura de cetilpiridiniu. n diluii variind de la 1:100 la 1:1000 sunt
amestecai cu ageni de curire pentru ca n acelai timp s dezinfecteze i
s curee suprafeele sau aparatura din clinici ori spitale. Datorit
proprietilor lor detergente i a toxicitii reduse, compuii cuaternari de
amoniu se situeaz printre cei mai buni ageni igienizani.
139
Din pcate, utilizarea metalelor n controlul microbian prezint mai
multe dezavantaje:
sunt foarte toxice dac sunt ingerate, inhalate sau absorbite prin
piele, fie chiar i n cantiti infime;
provoac de obicei reacii alergice;
cantitile mari de lichide biologice i deeuri neutralizeaz sau
diminueaz aciunile lor;
microbii pot deveni n timp rezisteni la aciunea metalelor.
Tincturile organice de mercur (0,001-1,2%) cu turnesol (Mertiolat) i
nitromersol (Metafen) sunt antiseptice destul de eficiente i previn
infeciile, dar nu trebuiesc aplicate pe o piele fisurat, deoarece n acest
caz, devin nocive i pot ntrzia vindecarea.
Mercurocromul, n trecut produs de baz n cabinetele medicale, este
azi considerat unul dintre cele mai slabe antiseptice.
Un compus al argintului, care rmne n continuare n uz curent este
nitratul de argint (AgNO3). A fost introdus la sfritul secolului al XIX-lea
de ctre Crede pentru prevenirea unor infecii bacteriene (de exemplu:
infeciile gonococice). La noii nscui, tehnica lui Crede consta n instilarea
unei picturi dintr-o soluie 1% n ochi pe suprafaa conjunctival pentru
un interval scurt de timp, urmat de cltirea cu ser fiziologic pentru
reducerea iritaiei. Acest preparat nu se mai folosete astzi n tratamentul
noilor nscui deoarece s-a demonstrat c unii ageni infecioi, cum ar fi
chlamidiile, sunt rezisteni la nitratul de argint. Soluiile pe baz de nitrat
de argint se folosesc n prezent ca germicid local i dezinfectant al
suprafeelor dentare. Un compus al argintului cnd este adugat n
pansamente, cum ar fi de exemplu unguentul cu sulfadiazin, previne
eficient infecia cu bacterii n arsurile de gradul 2 i 3.
Preparatele de argint coloidal conin sruri de argint n complex cu
proteine. Deoarece elibereaz progresiv ionii de argint, sunt mult mai
blnde i mai puin toxice dect srurile anorganice.
140
celulei prin alchilarea aminoacizilor, un proces n care un atom de
hidrogen de pe un aminoacid este nlocuit de nsi glutaraldehid.
Ea poate, de asemenea, s perturbe ireversibil activitatea enzimelor
n interiorul celulei. Are un spectru larg i acioneaz rapid, fiind una
dintre puinele substane chimice acceptat oficial ca sterilizant i
dezinfectant de nivel nalt. Distruge n trei ore endosporii i n cteva
minute formele vegetative (chiar i bacilii tuberculozei sau
pseudomonadele). Glutaraldehidele, mai prezint i alte avantaje cum ar
fi:
puterea lor se menine chiar i n prezena unei materii organice;
sunt necorozive; nu deterioreaz materialele plastice;
sunt mai puin toxice i iritante dect formaldehidele.
Principalul lor dezavantaj, const n faptul c sunt ntructva instabile,
n special la un pH i o temperatur crescut.
Formaldehida este un gaz iritant ptrunztor care se dizolv rapid n
ap i formeaz o soluie apoas numit formol. Saturaia complet a
formaldehidei (37%) produce o soluie de formol 100%. Substana chimic
devine germicid n urma legrii sale cu acizii nucleici i grupele
funcionale de aminoacizi. Formolul este un dezinfectant de nivel mediu
spre nalt, dei acioneaz mai lent dect glutaraldehida. Toxicitatea
extrem a formolului (intr n clasificarea substanelor cancerigene), ct i
efectele sale iritante asupra pielii i mucoaselor limiteaz n mare msur
utilizarea sa clinic.
Glutaraldehida, a fost introdus n sterilizarea chimic a materialelor
care se deterioreaz prin cldur, n 1963, ca un substitut al formolului. Se
folosete n sterilizarea aparaturii i n dezinfecia practic a instrumentelor,
atunci cnd sterilizarea prin cldur nu este posibil. Este un dezinfectant
alternativ eficient, ns costisitor, folosit n medicin i industrie.
Glutaraldehida poate fi utilizat i n alte scopuri cum ar fi: conservarea
vaccinurilor, igienizarea carcaselor de pui etc.
Formolul poate fi diluat n alcool (8%) sau n ap (2-8%) avnd
diverse aplicaii. Tinctura de formol are o utilizare limitat, ca dezinfectant
al instrumentelor chirurgicale. Pentru ndeprtarea reziduurilor de formol,
orice obiect care vine n contact direct cu pielea trebuie cltit minuios cu
ap steril.
141
efectului lor colorant precum i spectrului ngust de activitate.
142
sterilizarea i dezinfectarea materialelor plastice i a instrumentelor
delicate din spitale i industrie. n concentraie de 450-800 mg/l, ETO
poate steriliza instrumente chirurgicale, plci Petri, seringi, stimulatoare
cardiace preambalate etc.
Este folosit, de asemenea, n continuare la sterilizarea condimentelor
i alimentelor uscate.
Oxidul de propilen este ndeaproape nrudit cu ETO, deoarece are
proprieti fizice i un mecanism de aciune similar cu acesta, fiind ns
mai puin toxic.
Se folosete pentru sterilizarea alimentelor (pulberi, amidon,
condimente, nuci) i ca dezinfectant.
Betapropiolacton (BPL) este un lichid neexploziv care, de
asemenea, alchileaz ADN-ul. Dei este mai germicid dect oxizii, nu este
tot att de penetrant. Aceste caracteristici precum i toxicitatea sa nalt i
limiteaz utilizarea folosindu-se la dezinfecia cldirilor, camerelor sterile,
instrumentelor etc.
143
Diagrama de mai jos, ofer o privire de ansamblu asupra principalelor
tipuri de interrelaii microbiene:
Schema 6.1.
INTERRELAII ECOLOGICE ALE MICROBILOR
influenat benefic
influenat benefic
Interdependen
interdependen
Nici un membru
prejudiciat; unul
prejudiciat; unul
Un membru
Non
144
craterele vulcanice termale profunde de pe fundul mrilor, unde forele
geologice disperseaz plcile crustei terestre, elibernd cldur i gaze.
Aceste cratere reprezint un focar de activitate biologic i geologic
tumultoas.
Descoperirile fcute pentru prima dat la sfritul anilor aptezeci au
demonstrat c baza lanului energetic din aceast colectivitate nu este
soarele, deoarece craterele sunt prea adnci pentru ca lumina solar s
poat ptrunde la acest nivel (2600 metri). n schimb, acest ecosistem se
bazeaz pe populaia bacterian autotrof masiv, care oxideaz cantitatea
abundent de hidrogen sulfurat eliberat prin activitatea vulcanic.
Sinergismul reprezint o relaie de cooperare ntre dou organisme,
benefic ambilor membrii, dar nu n mod obligatoriu. Este un fel de
mezalian ntre dou organisme pentru a realiza un factor util
metabolismului lor, pe care nici unul dintre cei doi nu ar putea s-l
realizeze singur. Uneori relaia este nutriional (ca n hrnirea
ncruciat), iar produsele metabolice stimuleaz creterea ambilor
membri. Un exemplu de sinergism l reprezint relaia dintre plante i
bacteriile din sol sau dintre unele bacterii care i stimuleaz reciproc
creterea. Astfel, arginina este descompus pn la stadiul de putrescein
prin aciunea sinergic a bacteriilor Escherichia coli i Streptococcus
faecalis. Exist de asemenea cazuri cnd dou tulpini apigmentogene de
Serratia marcescens, dac sunt cultivate mpreun au posibilitatea s
stimuleze pigmentul prodigiozin, produs n mod normal numai de tulpinile
pigmentogene.
n infeciile sinergice, asocierea unor organisme (uneori chiar pn la
zece specii) poate provoca o lezare tisular pe care separat nici una dintre
speciile respective nu o pot iniia. De exemplu, gangrenele gazoase i
infeciile gingivale au o etiologie multifactorial. Pododermatita
infecioas a bovinelor i ovinelor este determinat de asocierea a trei
bacterii, care se implic una pe cealalt n declanarea procesului patologic.
Multe interrelaii implic un dezechilibru ntre contribuiile participanilor.
n comensalism, ntre doi membri notai cu A i B se creeaz o astfel
de relaie, nct A nu este nici prejudiciat, nici avantajat de B, ns acesta
din urm beneficiaz de prezena lui A. n aceast situaie rezult c B este
comensalul lui A. Un exemplu clasic de comensalism, l reprezint
satelitismul, fenomen bazat pe factori nutriionali sau protectori.
n satelitismul nutriional, microbul A ofer un factor de cretere
necesar microbului B. ntr-o alt form microbul A distruge o substan
toxic sau inhibitoare pentru B. De exemplu, coloniile de Haemophilus se
dezvolt cu precdere limitrof coloniilor doicii. Doici bune sunt
stafilococii albi sau unele specii de Bacillus; doica este cea care
sintetizeaz factorul V prin cultivarea ei pe acelai mediu cu specia ce
145
necesit acest factor (n cazul de fa cu Haemophilus), datorit
concentraiei mari de factor V din aceast zon.
Un alt tip de comensalism se poate realiza ntre diverse bacterii,
unele specii procurnd substratul necesar celorlalte. De exemplu, pe acest
tip de relaie se bazeaz circulaia principalelor elemente biogene n natur
(azot, carbon, sulf).
O relaie interesant, de acest gen, este aceea n care beneficiul
rezult din degradarea sau neutralizarea unei substane cu efect nociv
pentru partener. De exemplu, Escherichia coli produce penicilinaza,
enzim care degradeaz penicilina, crend astfel condiii de multiplicare
bacteriilor penicilinosensibile. Un alt exemplu l constituie unele tulpini de
Pseudomonas care produc N-heptil-4-hidroxichinolein-N-oxid, care este o
substan ce mpiedic efectul antibacterian al streptomicinei.
Conceptul de parazitism reprezint un tip de relaie n care
microbul A se multiplic pe baza unui alt microb B ntr-o relaie parazit-
gazd (A-B). De exemplu, bacteriofagii sunt virusurile bacteriene ce
paraziteaz celula vegetativ. O dat cu multiplicarea acestora are loc
ruperea celulei gazd, fenomen ce se manifest pe mediile solide prin
formarea de plaje (zone circulare de liz).
Acest fenomen a fost valorificat n scopul identificrii bacteriilor
prin testul fagic (de exemplu la: Salmonella, Brucella abortus, Bacillus
anthracis), precum i la crearea n cadrul unor specii a unor diviziuni
(fagovar, fagotip, lizotip). n laborator aceast metod este folosit n
tratamentul unor infecii, cum ar fi cele produse de enterobacteriaceae i
poart denumirea de fagoterapie.
Parazitismul unei bacterii fa de alt bacterie se datoreaz speciei
Bdellovibrio bacteriovorus. Aceasta este capabil s paraziteze bacterii
cum ar fi cele din genurile Escherichia, Salmonella, Serratia, Proteus,
Pseudomonas, Streptococcus.
O alt asociere nociv o formeaz antagonismul care apare atunci
cnd membrii unei colectiviti A i B sunt n competiie.
n aceast interaciune inegal microbul A secret substane chimice
care inhib sau omoar microbul B din acelai habitat.
Acest tip de relaie confer primului venit (microbul A) un avantaj
competitiv. Se datoreaz mai ales diferenelor de vitez de multiplicare,
manifestndu-se att n cadrul aceleai specii ct i ntre specii diferite. n
acest proces mai intervin i ali factori cum ar fi compoziia mediului sau
gradul de mobilitate al bacteriilor. De exemplu, bacteriile ce aparin
genului Proteus posed un aparat flagelar extrem de activ, formnd o
cultur n pnz (gazon) i inhibnd totodat dezvoltarea altor bacterii.
Competiia intraspecific se ntlnete ntre tulpini cu nsuiri biologice
diferite, cum ar fi cea dintre tulpinile patogene i cele nepatogene.
146
Interaciunile de acest tip se petrec de obicei n sol unde colectiviti
mixte de microbi se gsesc deseori n competiie pentru spaiu i hran.
Exemplele cele mai ilustrative sunt cele din antibioze (producerea de
antibiotice) precum i producerea de bacteriocine. Tendina natural a
microorganismelor de a produce antibiotice a fost valorificat cu succes n
controlul i tratamentul infeciilor. Primul antibiotic a fost descoperit de
ctre Alexander Fleming n 1929, datorit competiiei exercitate de o
ciuperc din genul Penicillium fa de un stafilococ. n 1940, Chain i
Florey au reuit s extrag din aceast ciuperc penicilina n stare pur,
revoluionnd practica medical.
Cele mai multe dintre antibiotice se obin din bacterii ce aparin
genului Streptomyces (streptomicina, cloramfenicolul, tetraciclina, eritro-
micina etc.) sau Bacillus (polimixina, bacitracina).
n majoritatea cazurilor antibioticele au un efect bacteriostatic i
acioneaz selectiv asupra celulelor bacteriene. Bacteriocinele sunt proteine
produse de bacteriile Gram negative, inhibitoare pentru alte bacterii aflate
n competiie cu acestea. Au fost descoperite de ctre Andr Gratia, n
1925 la Escherichia coli.
Mai trziu s-au identificat substane asemntoare i la alte specii
bacteriene, crendu-se termenul mai general de bacteriocine. Capacitatea
de a produce bacteriocine poart denumirea de bacteriocinogenie, fiind
deseori corelat cu patogenitatea bacteriilor. Bacteriocinele reprezint o
categorie aparte de antibiotice, cu spectru ngust de activitate, efect
bactericid i un mecanism de aciune diferit fa de cel al antibioticelor
tipice.
Organismul animal constituie un habitat bogat pentru bacterii.
Microbii, care n mod normal se gsesc pe piele, tractul gastrointestinal sau
n alte sedii, poart denumirea de flor normal. Aceasta particip la
relaiile simbiotice sinergice, comensale i parazitare cu organismele gazd.
De exemplu, anumite bacterii comensale din intestin produc unele
vitamine.
Unele specii ajut la meninerea unui mediu ce protejeaz organismul
de infeciile produse de ali microbi. De exemplu, Lactobacillus, care
protejeaz vaginul este comensal, dar se poate transforma n agent patogen
n anumite condiii, invadnd esuturile corpului i producnd o infecie.
Sute de specii bacteriene comensale i duc traiul n sau pe suprafaa
organismelor animale, fie n scop prejudiciativ fie protectiv. S considerm,
de exemplu, pe Staphylococcus epidermidis ce triete n regiunile moarte
ale pielii, sau microbii orali care i procur hrana din fluxul constant de
nutrieni din cavitatea bucal, ori miliardele de bacterii care populeaz
intestinul gros. Deoarece flora normal a organismului se afl ntr-o
continu schimbare, aceste relaii nu sunt absolute, iar un simbiot sau un
147
comensal se poate transforma ntr-un agent patogen.
Infecia bacterian constituie un tip de relaie antagonic ntre bacterii
i organismele animale.
Patogenitatea, este o nsuire a unui microb de a produce un efect
nociv asupra organismului gazd. Numrul speciilor patogene nu depete
10% din totalul speciilor bacteriene cunoscute.
Bacteriile patogene se mpart n bacterii parazite obligatoriu, cu grad
ridicat de patogenitate i care nu pot supravieui un timp ndelungat n
afara organismului gazd; bacterii comensale potenial sau condiionat
patogene, care fac parte din flora autohton a organismului i care nu-i
exprim patogenitatea dect n anumite condiii; bacterii saprofite, accidental
patogene, prezente n mediile naturale.
Principalele nsuiri care asigur patogenitatea bacteriilor sunt:
virulena, care reprezint capacitatea unei bacterii de a se multiplica n
organism la nivelul esuturilor; infeciozitatea, capacitatea acestora de a
ptrunde n organism i de a se multiplica n diferite esuturi i organe;
invazivitatea, capacitatea de a difuza n diverse compartimente ale
organismului, agresivitatea, capacitatea unei bacterii de a neutraliza sau
anihila prin unele elemente structurale (de exemplu, capsula bacterian)
sau secreii (de exemplu, stafilocoagulaza) diverse mecanisme de aprare a
organismului (fagocitoz); toxicitatea, proprietatea unei bacterii de a
exercita un efect alternativ sau dereglator prin intermediul endo i
exotoxinelor.
n funcie de esutul sau organismul asupra cruia acioneaz se
cunosc foarte multe feluri de toxine.
Tabel 6.4
Caracterele difereniale dintre exo i endotoxine
(adaptare dup H. Rducnescu i Bica Popii)
148
6.10. Influena parametrilor intrinseci i extrinseci ai alimentelor
asupra microorganismelor
149
Tabel 6.5.
Sensibilitatea la pH a unor microorganisme
pH
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Mucegaiuri
Drojdii
Alicyclobacillus spp
Salmonella spp.
Acetobarter spp.
Lysteria monocytogenes
Yersinia enterocolitica
Escherichia coli
Clostridium botulinum
Bacillus cereus
Campylobacter spp.
Shigella spp
Vibrio parahaemolyticus
Vibrio cholerae
Clostridium perfringens
150
Tabel 6.6.
Valorile aproximative ale pH-ului la unele produse alimentare
Aliment pH Aliment pH
Legume Produse de origine
Asparagus (muguri i animal
tulpini) 5,7-6,1 Unt 6,1-6,4
Fasole 4,6-6,5 Babeurre 4,5
Sfecl de zahr 4,2-4,4 Lapte 6,3-6,5
Broccoli 6,5 Smntn 6,5
Varz verde 5,4-6,0 Brnz Cheddar 5,9
Morcovi 4,9-5,2; 6,0 Carne tocat de vit 5,1-6,2
Conopid 5,6 Jambon 5,9-6,1
elin 5,7-6,0 Carne 6,0
Porumb dulce 7,3 Pasre 6,2-6,4
Castravei 3,8 Peste (majoritatea speciilor
Vnt 4,5 imediat dup moarte) 6,6-6,8
Lptuci 6,0 Scoici 6,5
Mzline 3,6-3,8 Crabi 7,0
Ceap roie 5,3-5,8 Stridii 4,8-6,3
Ptrunjel 5,7-6,0 Crevei 6,8-7,0
Pstrnac 5,3 Ton 5,2-6,1
Cartofi 5,3-5,6 Somon 6,1-6,3
Dovleac 4,8-5,2
Spanac 5,5-6,0
Tomate 4,2-4,3
Napi 5,2-5,5
Fructe Suc de portocale 3.6-4.3
Mere 2.9-3.3 Prune 2.8-4.6
Cidru de mere 3.6-3.8 Pepene rou 5.2-5.6
Suc de mere 3.3-4.1 Suc de grefe 3.0
Banane 4.5-4.7 Struguri 3.4-4.5
Smochine 4.6 Lami 1.8-2.0
Pepene galben 6.3-6.7
Tabel 6.7.
Valorile aproximative ale pH-ului la unele microorganisme
Microorganism pH Microorganism pH
Aeromonas hydrophila cca. 6,0 Listeria monocytogenes 4,1
Alicyclobacillus acidocaldarius 2,0 Penicillium roqueforti 3,0
Bacillus cereus 4,9 Plesiomonas shigelloides 4,5
Botrytis cinerea 2,0 Pseudomonas fragi cca. 5,0
Clostridium botulinum, Group I 4,6 Salmonella spp. 4,05
C. botulinum, Group Il 5,0 Shewanella putrefaciens cca. 5,4
C. perfringens 5,0 Shigella flexneri cca. 5,5
Escherichia coli 0157:H7 4,5 S. sonnei 5,0
Gluconobacter spp. 3,6 Staphylococcus aureus 4,0
Lactobacillus brevis 3,16 Vibrio parahaemolyticus 4,8
L. plantarum 3,34 Yersinia enterocolitica 4,18
Lactococcus lactis 4,3 Zygosaccharomyces bailii 1,8
151
Pentru carnea de miel i de porc valorile de pH minime i maxime
gsite de ctre Callow au fost 5,4 i 6,7 i respectiv 5,3 i 6,9. Briskey a
raportat c pH-ul ultim al crnii de porc poate scdea, n anumite condiii,
pn la aproximativ 5,0. Efectul pH-ului asupra microorganismelor la
aceste valori, n special asupra bacteriilor este evident. n ceea ce privete
carnea de pete, se tie c petii halibut (din care se face untura de pete,
bogat n vitaminele A i E) a cror carne atinge un pH final de 5,6
prezint caliti mai bune de pstrare dect carnea majoritii celorlali
peti, a cror valoare de pH se situeaz ntre 6,2 i 6,6.
Unele alimente se caracterizeaz printr-o aciditate inerent; altele
ns, i datoreaz aciditatea sau pH-ul aciunii anumitor microorganisme,
aa cum este cazul laptelui fermentat, verzei acre i murturilor. Indiferent
de sursa de aciditate, efectul asupra calitii pstrrii apare ca fiind acelai.
Unele alimente rezist mai bine modificrilor de pH dect altele.
Cele care tind s reziste acestor modificri se numesc tamponate. n
general, produsele din carne sunt mai bine tamponate dect legumele. La
capacitatea de tamponare a produselor de carne contribuie diferitele lor
proteine. Legumele au n general un coninut redus de proteine i, ca
urmare, capacitatea de tamponare pentru a rezista modificrilor de pH, n
timpul creterii microorganismelor este absent.
Aciditatea natural sau inerent a alimentelor, n special a fructelor
este posibil s fi evoluat ca o modalitate de protecie a esuturilor
mpotriva distrugerii de ctre microorganisme. Fructele ar trebui s aib
valori de pH sub cele necesare multor microorganisme implicate n
alterarea alimentelor. Funcia biologic a fructului este protejarea
componentei reproductive a plantei: seminele, iar acest fapt a fost
important n procesul evolutiv al plantelor cu fructe.
Dei valorile acide de pH sunt mai utile n inhibarea
microorganismelor, valorile alcaline (12-13) sunt cunoscute ca fiind
distructive, cel puin pentru unele bacterii. De exemplu, utilizarea de
Ca(OH)2 pentru producerea valorilor de pH n aceste limite s-a dovedit
distructiv pentru Listeria monocytogenes i ali ageni patogeni din
alimentele proaspete.
Efectele pH-ului. Un pH advers afecteaz cel puin dou aspecte
ale respiraiei celulelor microbiene: funcia enzimelor i transportul
nutrienilor n interiorul celulei. Membrana citoplasmatic a
microorganismelor este relativ impermeabil la ioni H+ i OH-. De aceea,
concentraia lor n citoplasm rmne constant n ciuda variaiilor mari,
ce se pot produce n pH-ul mediului nconjurtor. Conway and Downey au
observat c pH-ul intracelular al celulelor levurice din drojdia de pine
este de 5,8. Dei, n cursul fermentrii glucozei regiunea extern a
celulelor este mai acid iar regiunea intern este mai alcalin. Pe de alt
152
parte, Peno i alii, nu au susinut afirmaia c pH-ul celulelor levurice
rmne constant n timpul variaiilor de pH ale mediului. La majoritatea
celulelor s-a constatat c pH-ul intern este aproape neutru, dar pot fi i
excepii (Sulfolobus i Methanococcus). Atunci cnd microorganismele
sunt plasate n medii cu pH mai mic sau mai mare dect cel neutru,
capacitatea de proliferare a acestora depinde de abilitatea lor de a aduce
pH-ul mediului nconjurtor la o valoare optim. Cnd se afl n medii
acide, celulele trebuie fie s mpiedice ptrunderea H+, fie s elimine ioni
H+ la fel de rapid cum au intrat. Cnd majoritatea microorganismelor cresc
n medii acide, activitatea lor metabolic are ca rezultat, faptul c, mediul
sau substratul devine mai puin acid, n timp ce microorganismele care
cresc ntr-un mediu cu pH ridicat, tind s provoace o scdere a pH-ului.
Decarboxilazele aminoacide, ce prezint o activitate optim la un pH n jur
de 4,0 i nici un fel de activitate la un pH de 5,5 produc o reglare spontan
a pH-ului spre neutru atunci cnd celulele se dezvolt n medii acide.
Clostridium acetobutylicum provoac creterea pH-ului
substratului prin reducerea acidului butiric la butanol, n timp ce
Enterobacter aerogenes produce acetoin din acid piruvic, pentru a crete
pH-ul mediului. Cnd aminoacizii sunt decarboxilai, creterea pH-ului are
loc datorit aminelor rezultate. Cnd creterea are loc n limite alcaline, un
grup de deaminaze aminoacide cu activitate optim la un pH 8,0 provoac
reglarea spontan a pH-ului spre neutralitate, ca rezultat al acizilor
organici care se acumuleaz.
n ceea ce privete transportul nutrienilor, celule tind s aib o
ncrctur rezidual negativ. De aceea, compuii neionizai pot intra n
celul, n timp ce compuii ionizai nu au aceast posibilitate. n cazul pH-
ului neutru sau alcalin, acizii organici nu intr n celule, n timp ce, n
cazul unor valori de pH acide, aceti compui sunt neionizai i pot intra n
celulele ncrcate negativ.
Un alt efect advers al pH necorespunztor asupra
microorganismelor este i interaciunea dintre H+ i enzimele din
membrana citoplasmatic. Morfologia unor microorganisme poate fi
afectat de pH. S-a raportat c lungimea hifelor de Penicillium
chrysogenum scade cnd aceast ciuperc crete ntr-o cultur continu, n
care valorile de pH au depit 6,0.
Miceliul se formeaz la un pH de aproximativ 6,7. Ionii de H+ i
K+ din spaiul extracelular se pot afla n competiie, atunci cnd ultimul
timuleaz fermentarea, primul o reprim. Spre exemplu, metabolizarea
glucozei de ctre celulele levurice ntr-un mediu acid a fost considerabil
stimulat de K+. n condiii anaerobe, glucoza a fost consumat n
proporie de 83%, n prezena ionilor K+, iar n condiii aerobe, n
proporie de 69%.
153
Exist i ali factori de mediu care interacioneaz cu pH-ul. n
ceea ce privete temperatura, cu ct aceasta crete mai mult, cu att pH-ul
substratului devine mai acid. Concentraia de sare are un efect net asupra
curbelor ratei de cretere a pH-ului.
Cnd microorganismele se dezvolt la ambele pri ale limitelor lor
optime de pH, rezult o faz de laten crescut, fiind de ateptat s aib o
durat mai lung, dac substratul este foarte tamponat. Cu alte cuvinte,
este de ateptat ca durata fazei de lag s reflecte timpul necesar
microorganismelor pentru a aduce mediul extern n limitele creterii
optime a pH-ului lor. Analiza substanelor rspunztoare de pH-ul advers
este important nu numai pentru determinarea vitezei de cretere n
continuare, dar i pentru determinarea pH-ului minim la care salmonelele
ar iniia creterea.
Chung i Goepfert au constatat c pH-ul minim a fost de 4,05, cnd
s-a folosit acid clorhidric i citric i de 5,4 i 5,5, cnd s-a folosit acid
acetic, respectiv propionic. Aceasta este, fr ndoial, o reflectare a
capacitii microorganismelor de a aduce mediul lor extern n limite mai
favorabile n cazul acidului clorhidric i acidului citric, spre deosebire de
ali acizi testai. Este, de asemenea, posibil, ca i ali factori dect pH-ul s
intervin n efectele variate ale acizilor organici ca inhibitori ai creterii.
Umiditatea produselor alimentare (valoarea aw). Dei nu se tie
cu precizie cum a intrat n practic metoda uscrii sau a desicaiei, ea este
una dintre cele mai vechi modaliti de de conservare a alimentelor.
Conservarea alimentelor prin uscare reprezint o metod de
ndeprtare a apei, fr de care microorganismele nu au cum s
supravieuiasc. Umiditatea produselor alimentare se exprim n ap%. n
microbiologie, intereseaz mai mult forma sub care apa se gsete n
produs i dac aceasta poate constitui un mediu bun pentru nmulirea
microbilor.
Activitatea apei (aw) reprezint procentul de ap liber, coninut
de aliment. Ea influeneaz creterea i activitatea metabolic a
microorganismelor din aliment, ca i rezistena lor fa de diferii factori,
cum ar fi cldura, pH-ul sau radiaiile. Aceast tensiune relativ de vapori
se noteaz cu simbolul aw = water activity (activitatea apei). Acest
parametru este definit prin raportul ntre presiunea vaporilor de ap din
substratul alimentar (p) i presiunea vaporilor de ap pur (po) la aceeai
temperatur:
aw = p/po
154
Acest concept este legat de RH (umiditatea realativ) n urmtorul
fel: RH = 100 x aw. Apa pur are un aw de 1,00, o soluie 22% NaCl are aw
de 0,86 i o soluie saturat de NaCl aw 0.75.
La majoritatea alimentelor proaspete aw este de aproximativ 0,99.
Valoarea minim raportat a fi necesar pentru creterea
microorganismelor n alimente este prezentat n tabelul de mai jos. n
general bacteriile solicit valori mari ale aw dect cele ale fungilor, iar
bacteriile Gram negative au cerinei mai mari dect cele Gram pozitive.
Bacteriile cele mai alterative nu cresc sub valoarea aw = 0,91, n timp ce
mucegaiurile pot crete pn la 0,80. Unele bacterii implicate n
toxiinfecii alimentare, cum este Staphylococcus aureus pot s se dezvolte
pn la 0,86, iar Clostridium botulinum nu se poate dezvolta sub 0,94.
Tabel 6.8.
Relaia aw - %NaCl
Concentraia NaCl
aw
Molar %
0,995 0,15 0,9
0,99 0,30 1,7
0,98 0,61 3,5
0,96 1,20 7
0,94 1,77 10
0,92 2,31 13
0,88 3,33 19
0,86 3,81 22
Tabel 6.9.
Valoarea aw minim a unor microorganisme
Microorganismul aw min Microorganismul aw min
Grupe Grupe
Bacteriile cele mai alterante 0,90 Bacterii halofile 0,75
Mucegaiurile cele mai alterante 0,88 Mucegaiuri xerofile 0,61
Drojdiile cele mai alterante 0,80 Drojdii osmofile 0,61
Organisme specifice Organisme specifice
Clostridium botulinum, tip E 0,97 Candida scottii 0,92
Pseudomonas spp. 0,97 Trichosporon pullulans 0,91
Acinetobacter spp. 0,96 Candida zeylanoides 0,90
Escherichia coli 0,96 Geotrichum candidum cca. 0,90
155
Enterobacter aerogenes 0,95 Trichothecium spp. cca. 0,90
Bacillus subtilis 0,95 Byssochlamys nivea cca. 0,87
Clostridium botulinum, tip A i 0,94 Staphylococcus aureus 0,86
B 0,94 Alternaria citri 0,84
Candida utilis 0,94 Penicillium patulum 0,81
Vibrio parahaemolyticus 0,93 Eurotium repens 0,72
Botrytis cinerea 0,93 Aspergillus glaucus* 0,70
Rhizopus stolonifer 0,93 Aspergillus conicus 0,70
Mucor spinosus Aspergillus echinulatus 0,64
Zygosaccharomyces rouxii 0,62
Xeromyces bisporus 0,61
157
nontolerant a rspuns la scderea aw-ului prin sintetizarea unei cantiti
mai mari de glicerol, dar prin reinerea unei mici cantiti. Rspunsul lui Z.
rouxii la un aw redus s-a produs la nivelul de penetraie/transport al
glicerolului, n timp ce rspunsul pentru S. cerevisiae a fost metabolic. Din
acest studiu rezult c un aw sczut foreaz pe S. cerevisiae s devieze o
producie mai mare din activitatea sa metabolic spre o producie de
glicerol, nsoit de o mrire a cantitii de glucoz consumat n timpul
creterii. ntr-un studiu ulterior s-a consemnat c pn la 95% din
presiunea osmotic extern exercitat asupra lui S. cerevisiae, Z. rouxii i
Debaryomyces hansenii poate fi echilibrat printr-o cretere a glicerolului.
Z. rouxii acumuleaz mai mult glicerol sub stres, n timp ce ribitolul
rmne constant.
Unele celule se pot nmuli (n numr mare) la valori de aw reduse,
n timp ce anumite produse extracelulare lipsesc. De exemplu, un aw redus
poate avea ca rezultat oprirea produciei de enterotoxin B de ctre S.
aureus, chiar dac n acelai timp se produce un numr mare de celule. n
cazul speciei Neurospora crassa, o valoare de aw redus a avut ca rezultat
alterri non-letale ale permeabilitii membranei celulare, care au dus la
pierderea mai multor molecule eseniale.
Rezultate similare s-au obinut cu electroliii sau nonelectroliii. n
ansamblu, efectul unui aw redus asupra nutriiei microorganismelor apare
ca fiind de o natur general, acolo unde nevoile celulare ce trebuie
mediate printr-un mediu apos sunt excluse (ntrerupte) progresiv. Pe lng
efectul asupra nutrienilor, un aw redus are efecte adverse asupra
funcionrii membranei celulare, care trebuie meninut ntr-o stare fluid.
Este de ateptat, tot ca o uscare a prilor interne ale celulelor, s aib loc
la plasarea acestora ntr-un mediu cu aw redus, pn la un punct n care se
produce echilibrul apei ntre celule i substrat. Dei, mecanismele nu sunt
pe deplin elucidate, toate celulele microbiene pot necesita acelai aw intern
efectiv. Cele care pot crete n condiiile externe ale unui aw redus pot s
creasc n virtutea capacitii lor de a concentra srurile, poliolii i
aminoacizii (i poate i alte tipuri de compui) pn la niveluri interne
suficiente, nu numai pentru a mpiedica pierderea apei de ctre celule, dar
le pot permite acestora chiar s extrag apa din mediul extern srcit (n
ap).
Potenialul oxidoreductor (POR) i oxigenul molecular. Se tie
de cteva decenii c microorganismele prezint grade diferite de
sensibilitate la potenialul redox (O/R, Eh) al mediului lor de cretere.
Potenialul O/R al unui substrat poate fi definit, n general, ca uurina cu
care substratul pierde sau ctig electroni. Un aliment este oxidant cnd
capteaz electroni i este reductor cnd cedeaz electroni.
158
oxidare
Cu Cu + e-
reducere
2 Cu + O2 2 CuO
159
Nu este surprinztor s constatm c bacteriile i mucegaiurile aerobe sunt
o cauz obinuit de alterare a produselor de acest tip. Crnurile solide au
valoarea Eh-ului n jur de 200 mV, iar valoarea Eh-ului crnurilor tocate
se situeaz, n general, n jur de 200 mV. Pentru brnzeturile de diferite
tipuri s-au raportat valori Eh negative de la -20 mV la aproximativ -200
mV.
n ceea ce privesc valorile de Eh ale muchilor pre rigor n opoziie
cu cele post rigor, Barnes i Ingram au efectuat un studiu pentru
msurarea valorii Eh n muchi, n decursul unor intervale de timp, pn la
30 de ore, post mortem i efectul asupra creterii bacteriene anaerobe.
Aceti autori au constatat c Eh-ul muchiului sternocefalic al calului
imediat dup moarte a fost de +250 mV, moment n care clostridiile nu s-
au mai nmulit. La 30 de ore postmortem, valoarea Eh-ului a sczut la
aproximativ 30 mV, n absena unei creteri bacteriene. Cnd creterea
bacterian a fost permis, valoarea Eh-ului a sczut la aproximativ 250
mV. Creterea clostridiilor a fost observat la valori Eh de 36 mV i mai
sczute. Aceti autori au confirmat pentru carnea de cal constatarea fcut
pentru carnea de balen, i anume c bacteriile anaerobe nu se nmulesc
pn la apariia rigiditii cadaverice, din cauza unei valori ridicate a Eh-
ului n carnea pre-rigor. Acelai lucru este valabil i pentru carnea de
bovine, porc i alte crnuri de acest tip.
Efectele Eh-ului. Microorganismele afecteaz Eh-ul mediului
nconjurtor n cursul creterii, la fel cum influeneaz i pH-ul. Acest
lucru este valabil, n special pentru aerobi, care pot micora Eh-ul
mediului nconjurtor, spre deosebire de anaerobi, care nu pot efectua
aceasta. Pe msur ce cresc aerobii, are loc depleia oxigenului din mediu,
avnd ca rezultat diminuarea Eh-ului. Creterea, ns, nu e ncetinit n
msura n care ar fi de ateptat, din cauza capacitii celulelor de a utiliza
substane donatoare de oxigen sau cele acceptoare de hidrogen din mediu.
Rezultatul este c mediul devine mai srac n substane oxidante i mai
bogat n substane reductoare. Valoarea Eh-ului unui mediu poate fi
redus de microorganisme prin producerea anumitor produse metabolice
secundare, cum ar fi H2S, care au capacitatea de a scdea Eh-ul pn la -
300 mV. Deoarece, H2S reacioneaz rapid cu oxigenul se va acumula
numai n mediile anaerobe. Eh-ul este dependent de pH-ul substratului, iar
relaia direct dintre aceti doi factori este valoarea rH, definit n modul
urmtor:
RT
Eh 2,303 (rH 2 pH)
F
160
unde: R = 8,315 joules, F = 96,500 coulomb i T este temperatura
absolut. De aceea, pH-ul unui substrat trebuie stabilit cnd este
determinat Eh-ul. n mod normal, Eh-ul este msurat la un pH de 7,0,
exprimat ca Eh 1,0 M = Eh0 (ecuaia simplificat a lui Hernst). n natur,
Eh-ul tinde s fie mai negativ, n condiii progresive alcaline.
Dintre nutrienii care se gsesc n natur, acidul ascorbic i
zaharurile reductoare din plante i fructe, precum i grupele SH din
crnuri prezint o importan primordial. Prezena sau absena unor
cantiti adecvate de ageni oxidoreductori ntr-un mediu are o valoare
evident pentru creterea i activitatea tuturor microorganismelor.
n timp ce creterea anaerobilor este considerat ca avnd loc n
mod normal la valori reduse de Eh, excluderea oxigenului poate fi
necesar pentru unii anaerobi. Cnd Clostridium perfringens, Bacteroides
fragilis i Peptococcus magnus au fost cultivate n prezena oxigenului,
inhibarea creterii s-a produs chiar cnd mediul are o valoare Eh neagativ
de -50 mV. Aceti cercettori au constatat c s-a produs creterea n medii
cu Eh ridicat pn la 325 mV, cnd nu era prezent oxigenul.
n ceea ce privete, efectul Eh-ului asupra produciei de lipide de
ctre Saccharomyces cerevisiae, s-a observat c celulele crescute n
condiii anaerobe produc un nivel total mai redus, o traciune variabil de
gliceride i cantiti diminuate de componente fosfolipidice sau sterolice,
comparativ cu celulele care cresc n condiii aerobe. Lipidele produse de
celulele care au crescut n condiii anaerobe s-au caracterizat printr-un
coninut mare de acizi (pn la 50% de acizi n total) de la 8:0 pn la
14:0 i printr-un nivel sczut de acizi grai nesaturai n fraciunea
fosfolipidic. n celulele crescute n condiii aerobe 80-90% din
componenta de acizi grai a fost asociat cu un glicerid, iar fosfolipidele
au fost gsite ca fiind acizi 16:1 i 18:1. Spre deosebire de celulele aerobe,
celulele anaerobe de S. cerevisiae au fost gsite ca avnd nevoi de lipide i
steroli.
Coninutul n nutrieni. Compoziia chimic a alimentelor.
Pentru o cretere i funcionare normal microorganismele importante din
alimente au urmtoarele nevoi: 1. ap; 2. surs de energie; 3. surs de azot;
4. vitamine i factori de cretere nrudii; 5. minerale.
Importana apei pentru creterea i dezvoltarea microorganismelor
a fost prezentat mai nainte. n ceea ce privesc celelalte 4 grupe de
substane, mucegaiurile au nevoile cele mai reduse, fiind urmate de
bacteriile Gram negative, levuri i de bacteriile Gram pozitive.
Ca surse de energie, microorganismele din alimente pot utiliza
zaharuri, alcooli i aminoacizi. Un mare numr de ali compui de azot pot
ndeplini aceast funcie pentru diferite tipuri de microorganisme. De
exemplu, unii microbi sunt capabili de a utiliza nucleotide i aminoacizi
161
liberi, n timp ce ali microbi pot utiliza peptide i proteine. n general
compuii simpli, cum sunt aminoacizii vor fi utilizai de aproape toate
microorganismele nainte de a avea loc un atac asupra compuilor mai
compleci, cum ar fi proteinele, cu greutate molecular mare. Acelai
lucru este valabil pentru polizaharide i grsimi.
Microorganismele pot necesita vitaminele B n cantiti reduse i
aproape toate alimentele naturale ce conin o cantitate abundent pentru
acele microorganisme, care sunt incapabile de a sintetiza factorii eseniali
de cretere. Bacteriile Gram negative i ciupercile sunt capabile de a
sintetiza majoritatea sau totalitatea factorilor necesari pentru cretere.
Drept consecin, aceste dou grupe de organisme pot crete pe
alimentele srace n vitamina B.
Fructele tind s aib un coninut mai redus n vitamina B dect
crnurile, iar acest fapt, mpreun cu pH-ul de obicei redus i cu Eh-ul
pozitiv al fructelor, contribuie la explicarea alterrii obinuite a acestor
produse de ctre mucegaiuri, mai degrab dect de ctre bacterii.
Constituenii antimicrobieni. Stabilirea unor alimente fa de
atacul unor microorganisme se datoreaz prezenei anumitor substane
existente n natur, care posed i manifest o activitate antimicrobian. Se
cunosc unele specii de plante care conin uleiuri eseniale ce posed o
activitate antimicrobian. Dintre acestea sunt eugenolul din cuioare,
alicina din usturoi, aldehida cinnamic i eugenolul din scorioar, alil-
izotiocianatul din mutar, eugenalul i timolul din salvie i carvacrolul
(izotimolul), timolul din oregano, capsicidina din ardei, acidul salicilic din
zmeur, etc.
Laptele de vac conine mai multe substane antimicrobiene, i
anume: lactoferina, conglutinina i sistemul lactoperoxidazic. Laptele crud
conine un retrovirus inhibitor ce poate inhiba pn la 106 UFC (uniti
formatoare de colonii)/ml. Acesta este distrus prin pasteurizare. Cazeina
din lapte, precum i unii acizi apoi liberi s-au dovedit a fi antimicrobieni
nainte de conservare.
Oule, ca i laptele conin lizozim, iar aceast enzim, mpreun cu
albumina confer oulor proaspete un sistem antimicrobian destul de
eficient. Derivaii acidului hidroxicinnamic (p-cumoric, feluric, caffeic i
acizii clorogenici) gsii n fructe, legume, ceai melas i alte surse
vegetale prezint toi o activitate antimicrobian i o oarecare activitate
antifungic. Lactoferina este o glicoprotein care fixeaz fierul i este
inhibitorie pentru o serie de bacterii din alimente. Ovotransferina este o
substan inhibitoare din albuul de ou crud pentru Salmonella enteritidis.
Vacuolele celulare ale plantelor crucifere (varz, varz de
Bruxelles, broccoli, guliile) conin glucosinolai, care n caz de lezare sau
ruptur mecanic elibereaz izotiocianai. Unele din acestea din urm
162
posed activiti antifungice i antimicrobiene.
Sistemul lactoperoxidazic. Sistemul inhibitor ce se gsete n
mod natural n laptele de bovine, fiind alctuit din trei compui:
lactoperoxidaza, tiocianatul i H2O2. Toate cele trei componente sunt
necesare pentru obinerea de efecte antimicrobiene, iar psihotrofele Gram
negative, ca pseudomonadele sunt foarte sensibile. Cantitatea de
lactoperoxidaz necesar este de 0,5-1,0 ppm, n timp ce laptele de bovine
conine n mod normal aproximativ 30 ppm. Dei, att tiocianatul, ct i
H2O2 se gsesc n mod normal n lapte, cantitatea lor variaz. n ceea ce
privete H2O2, aproximativ 100 uniti/mililitru sunt necesare n sistemul
inhibitor, n timp ce n lapte se gsesc n mod normal numai 1-2
uniti/mililitru. Un nivel eficient de tiocianat este n jur de 0,25 mM, n
timp ce n lapte, cantitatea sa variaz ntre 0,02 i 0,25 mM.
Cnd sistemul lactoperoxidazei din laptele crud a fost activat prin
adugarea de tiocianat la 0,25 mM, mpreun cu o cantitate echimolar de
H2O2, durata valabilitii produsului a fost prelungit cu 5 zile, fa de 48
de ore la martori. Sistemul a fost mai eficient la 30C, dect la 4C.
Efectul antibacterian crete cu aciditatea, iar membrana citoplasmatic se
dovedete a fi inta celular. Pe lng adugarea direct de H2O2, poate fi
utilizat o surs exogen prin adugarea de glucoz i glucoz oxidaz.
Pentru a se evita adugarea direct a glucozo-oxidazei, aceast enzim a
fost imobilizat pe perle de sticl, astfel nct glucoza e generat numai n
cantiti necesare prin utilizarea -galactozidazei imobilizat. Acest sistem
a fost eficient n laptele de capr mpotriva speciei P. fluorescens i E.
coli, a cror cretere a fost controlat timp de 3 zile pentru prima specie i
de 2 zile pentru a doua, la 8C.
Sistemul lactoperoxidazei poate fi utilizat pentru pstrarea laptelui
crud n rile n care nu se obinuiete refrigerarea. Adugarea de
aproximativ 12 ppm de SCN- i 8 ppm de H2O2 ar trebui s fie inofensive
pentru consumator. Un aspect interesant al acestui sistem este efectul pe
care l are asupra proprietilor termice. ntr-un studiu s-a artat c reduce
valorile termice D la 57,8C cu aproximativ 80% pentru Listeria
monocytogenes i aproximativ 86% pentru Stp. aureus la 55,2C. Dei,
mecanismul acestei distrucii termice crescute este neclar, pot fi luate n
considerare unele implicaii interesante.
Structura biologic a alimentelor. nveliul natural al unor
alimente confer o protecie excelent mpotriva ptrunderii i lezrii
consecutive de ctre microorganismele care altereaz alimentele. n
aceast categorie se ncadreaz structuri ca: nveliul seminelor, nveliul
fructelor, coaja nucilor, a oulor, pielea animalelor. n cazul unor nuci
cum sunt pecanele (Carya olivae formis) i nucile (Juglans regia),
nveliul lor este suficient pentru a mpiedica ptrunderea tuturor
163
microorganismelor. Odat ce acest nveli este fisurat, miezul nucilor este
expus alterrii de ctre mucegaiuri. nveliul extern i membranele oulor,
cnd sunt intacte, mpiedic ptrunderea aproape a tuturor
microorganismelor, dac acestea sunt pstrate n condiii adecvate de
umiditate i temperatur. Fructele i legumele cu nveli deteriorat se
altereaz mult mai rapid dect cele care nu au nveliul afectat. Pielea care
acoper petii i crnurile (vit, porc) mpiedic contaminarea i alterarea
acestor alimente n parte din cauz c aceasta tinde s se usuce mai rapid
dect suprafeele tiate proaspt. Adunai la un loc, aceti ase parametri
intrinseci reprezint calea natural de prezervare a esuturilor de plante i
animale mpotriva atacului microorganismelor. Prin determinarea msurii
n care fiecare din aceste microorganisme exist ntr-un aliment dat. Se pot
prevedea tipurile generale de microorganisme din alimentul respectiv,
determinndu-se astfel stabilitatea general a acestuia. Determinarea lor ar
putea, de asemenea, contribui la stabilirea vrstei i, probabil a istoricului
de manipulare a alimentelor.
164
Psychrobacter, Enterococcus i altele. Psihotrofele cele mai frecvente din
alimente sunt cele care fac parte din genurile Pseudomonas i
Enterococcus. Aceste microorganisme cresc bine la temperatura de
refrigerare i provoac, la 5-7C, alterarea crnurilor, petilor, crnii de
pasre (de curte), a oulor i a altor alimente pstrate n mod normal la
aceast temperatur. Numrul de plci standard al numrului de celule
viabile de pe aceste alimente este n general mai mare, cnd plcile sunt
incubate la aproximativ 7C, timp de cel puin 7 zile, dect cnd sunt
incubate la 30C i mai mult. Speciile i tulpinile mezofile fac parte din
numeroase genuri, putnd fi gsite pe alimentele pstrate la temperatura de
refrigerare, dac condiiile sunt favorabile. Se pare c ele nu cresc la
aceast temperatur ci la temperaturi ncadrate n limitele bacteriilor
mezofile. Trebuie semnalat faptul c unele microorganisme pot crete ntre
0C i peste 40C. Un astfel de exemplu l constituie Enterococcus
faecalis.
Majoritatea bacteriilor termofile importante din alimente aparin
genurilor Bacillus, Paenibacillus, Clostridium, Geobacillus,
Alicyclobacillus i Thermoanaerobacter. Dei, nu toate speciile din aceste
genuri sunt termofile, ele prezint un mare interes pentru microbiologii i
tehnologii alimentari din industria fabricrii conservelor.
Mucegaiurile sunt capabile de a crete n limite mari ale presiunii
osmotice, ale coninutului nutrienilor i ale temperaturii (ca i bacteriile).
Multe mucegaiuri sunt capabile de a se dezvolta la temperatura de
refrigerare, n special unele tulpini de Aspergillus, Cladosporium i
Thamnidium, care pot fi gsite pe ou, poriunile laterale ale crnii de vit
i pe fructe. Levurile cresc deasupra limitelor de temperatur ale
microorganismelor psihrofile i mezofile, dar n general nu i n limite
termofile.
Calitatea unui produs alimentar trebuie, de asemenea, luat n
considerare n alegerea temperaturii de pstrare. Dei, ar prea de dorit ca
toate alimentele s fie pstrate la 4C sau sub aceast temperatur, aceasta
nu reprezint msura cea mai bun n meninerea calitii alimentelor.
De exemplu, bananele se pstreaz mai bine la 13-17C dect la 5-
7C, iar unele legume, la aproximativ 10C, incluznd cartofii, elina,
varza i multe altele. n fiecare caz, succesul temperaturilor de pstrare
depinde n mare msur de umiditatea relativ a mediului de depozitare i
de prezena sau absena unor gaze ca CO2 i O3.
Temperatura de depozitare reprezint parametrul cel mai important
care produce alterarea alimentelor de nalt perisabilitate, acest fapt fiind
subliniat de ctre Olley i Ratkowsky. Conform acestor cercettori,
degradarea alimentelor poate fi prevzut de o curb a ratei de alterare.
Curba general de alterare a fost ncorporat n circuitul unui integrator al
165
funciei de temperatur pe care se citesc zilele echivalente de depozitare la
0C. S-a artat c rata de alterare a crnii proaspete de pasre la 10C este
de aproximativ dou ori mai mare dect la 5C i la 15C, de aproximativ
trei ori mai mare dect la 5C.
n locul utilizrii legii Arrhenius s-a stabilit urmtoarea formul
pentru a descrie relaia dintre temperatur i rata de cretere a
microorganismelor, ntre temperaturile minime i cele optime.
r B(T T0 )
unde r este rata de cretere, B reprezint panta liniei de regresie, iar T0 este
o temperatur conceptual, lipsit de semnificaie metabolic. S-a dovedit
c relaia liniar se aplic la bacteriile i la fungii de alterare, cnd se
dezvolt n alimente sau cnd utilizeaz aminoacizii.
Umiditatea relativ a mediului nconjurtor (atmosferei). RH-
ul mediului nconjurtor sau presiunea vaporilor de ap este important,
att din punct de vedere al aw-ului din alimente, ct i din punct de vedere
al creterii microorganismelor de pe suprafaa lor, deci a duratei de
conservare. Excesul de umiditate care se formeaz la suprafaa alimentelor
se datoreaz vaporilor din atmosfer i apei din produs. Cnd aw-ul unui
aliment este reglat la 0,60 este important ca alimentul s fie conservat n
condiii de umiditate relativ, care s nu permit ca alimentele s capteze
umiditatea din aer i s-i creasc aw-ul propriilor suprafee i
subsuprafee, pn la punctul la care se poate produce creterea
microbian.
Cnd alimentele cu valori ale aw-ului reduse sunt plasate n medii
cu umiditate relativ ridicat, acestea capteaz umiditatea, pn la
stabilizarea unui echilibru. De asemenea, alimentele cu un aw ridicat pierd
apa din produs cnd sunt plasate ntr-un mediu cu umiditate relativ redus.
n general, cu ct temperatura este mai ridicat, cu att e mai redus
umiditatea relativ i viceversa.
Alimentele care sufer alterarea suprafeelor de ctre mucegaiuri,
levuri i unele bacterii, trebuie pstrate n condiii de umiditate relativ
redus. Carnea incorect nvelit, cum ar fi cea de pui sau de vit, tind s
aib suprafaa serios alterat, nainte de alterarea n profunzime, din cauza
RH-ului, n general ridicat din frigider, ct i datorit faptului c biota de
alterare a crnii este, n esen, de natur aerob. Dei, n cazul anumitor
alimente este posibil reducerea anselor de alterare superficial a
suprafeelor, prin depozitarea n condiii de RH reduse, trebuie inut
seama i de faptul c alimentul nsui (n astfel de condiii) va pierde din
apa proprie.
166
n alegerea unor condiii de RH adecvate ale mediului nconjurtor
trebuie luat n considerare, att posibilitatea creterii microorganismelor
pe suprafaa alimentului respectiv, ct i posibilitatea degradrii calitii
acestuia. Prin modificarea atmosferei gazoase este posibil ntrzierea
alterrii de suprafa, fr scderea umiditii relative.
Prezena i concentraia gazelor n mediul nconjurtor.
Dioxidul de carbon este unul dintre cele mai importante gaze implicate n
creterea sau inhibarea creterii microorganismelor din alimente. Ozonul
(O3) este un gaz atmosferic cu proprieti antimicrobiene, ncercndu-se,
de-a lungul mai multor decenii folosirea sa ca agent pentru prelungirea
valabilitii anumitor alimente. S-a dovedit c este eficient mpotriva
diverselor microorganisme, ns datorit faptului c reprezint un oxidant
puternic, nu poate fi utilizat n cazul alimentelor cu coninut mare de
lipide, deoarece ar provoca o cretere a rncezirii. Ozonul a fost testat
mpotriva speciei E. coli O157:H7 n mediul de cultur i la 3 pn la 18
ppm bacterian a fost distrus n 20-50 minute. Cnd gazul a fost
administrat dintr-un generator de ozon i pe agar cu soia triptic (tripticaz
soia), valoarea D pentru 18 ppm a fost de 1,18 minute, dar n tampon
fosfat, valoarea D a fost de 3,18 minute. Pentru a obine o inactivare de
99% a aproximativ 10.000 de chiti de Giardia lamblia pe mililitru, timpul
mediu de concentrare a fost de 0,17 i 0,53 mg-min/L la 25C i respectiv
5C. Protozoarele a fost de 3 ori mai sensibil la ozon de 25C dect la 5C.
Este admis n alimente, n Australia, Frana i Japonia, iar n 1997 i
s-a acordat statusul GRAS (generally regarded as safe", n general
considerat ca inofensiv) n SUA, pentru utilizarea n alimente. n
ansamblu, nivelul de ozon din aer n limitele 0,15 - 5 ppm s-a dovedit a
inhiba creterea unor bacterii de alterare i a unor levuri.
167
Capitolul 7
Genuri bacteriene izolate frecvent din alimente
1
Abrevieri: adj.: adjectiv; adj. verb.: verb adjectival; adv.: adverb; dim.: diminutiv; fem.:
feminin; gen. : genitiv; Gr.: din greac (se transcriu cuvintele n alfabetul latin); L.: din
latina clasic; L.M.: din latina medieval; masc.: masculin; n.: nominativ; N.L. : neo-latin,
neologisme utilizate ca un cuvant latin; neut.: neutru; part.: participiu; pl.: plural; pref. :
prefix; prep: prepoziie; suf. : sufix; sup.; superlativ; v.: verb.
168
Alcaligenes (n. arab al kada, baza, alcalin; n. Francez alcali; v.
Gr. gennao, produce, genereaz; n. masc. N.L. Alcaligenes, (bacterii)
productoare de alcali) sunt bacterii Gram-negative, patogen-oportuniste,
ubicvitare, descompun substraturi din cele mai diverse i sunt izolate cel
mai frecvent din lapte crud, produse din pasre i fecale. De asemenea,
acestea se mai pot izola din arborele respirator al pacienilor cu fibroz
chistic.
Alteromonas (2n. Gr. alteros, alta, altul; n. Gr. monas -ados, o
unitate, o monad; N.L. Alteromonas alt monad) Bacterii care populeaz
apele mrilor n regiunile de coast putnd fi izolate din alimentele
recoltate de aici. Toate speciile acestui gen au nevoie pentru cretere de
salinitatea apei marine.
Arcobacter (2n. L. arcus -us, arc; n. Gr. bakteria, baston; n. N.L.
bacter, baston (n bacteriologie - bacil); n. masc. N.L. Arcobacter, un bacil
curb sau arcuit) se izoleaz de la psrile de curte, din molute, lapte crud,
ap i produse de vit i porc. Unele specii pot fi implicate n avorturi i
enterite att la animale ct i la om.
Bacillus (2n. masc. L. bacillus, bastona i n bacteriologie bacil;
n. masc. N.L. Bacillus, numele unui gen bacterian care reunete bacterii ce
au form de bacil) Genul conine dou specii patogene B. anthracis
(agentul etiologic al antraxului) i B. cereus. Dei majoritatea tulpinilor
celui din urm sunt nepatogene, unele cauzeaz gastroenterite de etiologie
alimentar.
Brevibacillus (2adj. L. brevis -is -e, scurt; n. dim. n. masc. L.
bacillus, bastona i n bacteriologie bacil N.L. Brevibacillus, bacil scurt)
reunete bacterii clasificate anterior n genul Bacillus, care se gsesc n sol
i ap, deobicei pe plante, n aer sau n praf.
Brochothrix (2adj. Gr. Brochos, ansa, n. Gr. trix, fir) aceti bacili
sunt nrudii cu genurile Listeria i Lactobacillus dar prezint i unele
caractere comune cu genul Micobacterium. Uzual se izoleaz din carnea
proaspt sau procesat care este conservat prin refrigerare n pachete
impermeabile pentru gaze.
Burkholderia (2n. fem. N.L. Burkholderia, n onoarea
bacteriologului W.H. Burkholder) cuprinde bacterii ce pot fi izolate de pe
plante, n special pe unele flori, n lapte crud i produc deteriorarea
legumelor. Bacterile sunt patogene importante n patogeneza fibrozei
chistice la om.
Camphylobacter (adj. Gr. campylo, curb, curbat; n. Gr. bakteria,
baston; n. N.L. bacter, baston (bacteriologic, bacil); n. masc. N.L.
Campylobacter, bacil curbat) prezint un interes crescut pentru sntatea
public prin dou specii care produc campylobacterioz att la om ct i la
animale: Campylobacter jejuni i Campylobacter coli. Omul se
169
contamineaz prin consum de carne i lapte crude, carne semipreparat
sau prin ap contaminat. Aceti germeni se afl la nivelul tractului
intestinal al psrilor slbatice i n cel al animalelor domestice. Carnea de
pasre vndut n magazine este mai des contaminat dect carnea roie i
subprodusele din carne.
Carnobacterium (n. L. caro carnis,carne; n. dim. Gr. bakterion,
beisor (bacteriologic, bacil mic); n. neut. N.L. Carnobacterium (sic), bacil
izolat din carne) acest gen reunete o serie de bacterii clasificate n trecut
ca lactobacili, dar care din punct de vedere filogenetic sunt mult mai
apropiate de enterococi i vagacoci dect lactobacilii. Se difereniaz de
lactobacili i prin faptul c nu se pot dezvolta pe medii cu acetat i prin
capacitatea de a sintetiza acid oleic. Sunt heterofermentative i
majoritatea cresc la 0C, dar nici unul la 45C. Au fost izolate de pe
suprafaa crnurilor ambalate n vid precum i de pe carnea de pasre.
Citrobacter (n. L. citrus -i, lmie; n. Gr. bakteria, baston; n. N.L.
bacter, baston (bacteriologic bacil); n. masc. N.L. Citrobacter, un bacil
care utilizeaz citratul de sodiu) reunete bacterii izolate din tubul digestiv
care fermenteaz lent lactoza i produc colonii galbene pe plcile cu agar.
Specia izolat cel mai frecvent din alimente este C. freundii. Speciile
acestui gen se dezvolt i pe zarzavaturi sau legume precum i pe carnea
proaspt.
Clostridium (n. Gr. closter, fus; n. dim. neut. N.L. Clostridium, un
fus mic) este un gen ce include att specii mezofile, ct i specii psihotrofe
i termofile. Sunt larg rspndii n natur, la fel ca i opuii lor bacilii
aerobi formatori de spori. Genul contine multe specii, dintre care unele
produc nbolnviri la om.
Corynebacterium (n. Gr. coryne -es,mciuc; n. dim. Gr.
bakterion, beior, bastona -bacteriologic, un bacil mic; n. neut. N.L.
Corynebacterium, un bacil mic n form de mciuc) sunt bacterii
implicate n deterioarea produselor vegetale i a celor din carne.
Majoritatea sunt mezotrofe dei se cunosc i specii psihotrofe, una dintre
acestea din urm, Corynebacterium diphtheriae fiind agentul etiologic al
difteriei umane.
Enterobacter (n. Gr. neut. Enteron -ou, intestin; n. masc. L.M.
bacter, echivalent cu bacterium, un bacil mic; n. masc. L.M. Enterobacter,
un bacil intestinal mic) bacili intestinali, Gram negativi, care solicit
condiii de cultivare similare cu cele ale enterobacteriaceelor, chiar dac,
n general, nu sunt adaptate tractului gastrointestinal.
Enterococcus (n. Gr. Enteron -ou, intestin; n. Gr. coccos -ou, bob;
n. masc. N.L. Enterococcus, un coc intestinal) acest gen cuprinde coci din
grupul serologic Lancefield D. Acest gen s-a extins la peste 16 specii de
celule oxoide, Gram pozitive ce apar n cmpul microscopic singure, n
170
perechi sau n lanuri scurte. n trecut erau incluse n genul Streptococcus.
Unele specii nu reacioneaz cu antiserurile de grup D.
Erwinia (n. fem. L.M. Erwinia, n onoarea primului
fitobacteriolog Erwin F. Smith) este un gen de Enterobacteriaceae format
n principal din specii bacteriene patogene pentru plante. De Erwinia
amylovora sunt atacate mai ales gutuiul, prul i unele soiuri de mr la
care produce focul bacterian al rosaceelor.
Escherichia (n. fem. N.L. Escherichia, n onoarea bacteriologului
care a descris specia tip T. Escherich, 1857-1911) este genul bacterian cu
cele mai studiate specii. Specie tip a genului, E. coli este o bacterie uzual
ntlnit n intestinul subire al animalelor cu snge cald, dar capacitatea
acesteia de a supravieui perioade scurte de timp n afara organismului
face din ea un organism indicator pentru testarea contaminrii fecale a
probelor de mediu i alimente. Bacteria poate fi izolat i cultivat uor,
are o genetic simpl, uor de manipulat, ce face ca aceast specie s fie
una din cele mai bine studiate modele procariote i cu important
deosebit n biotehnologie.
Flavobacterium (adj. L. flavus -a -um, glbui; n. dim. Gr.
bakterion, un beior (n bacteriologie, un bacil mic); n. neut. N.L.
Flavobacterium, un bacil glbui) bacili Gram negativi caracterizai prin
producerea n agar a unor pigmeni de la galben la rou i prin asocierea
lor cu plantele. Unele specii sunt mezotrofe, iar altele sunt psihotrofe,
participnd la alterarea crnii i a legumelor refrigerate. Flavobacteriile
sunt n general bacterii comensale care triesc n sol i ap i sunt patogeni
oportuniti.
Kocuria (n. fem. N.L. Kocuria n onoarea lui M. Kocus) gen nou
separat din genul Micrococcus, reunete specii uzual izolat de pe pielea
omului. K. rosea i K. kristinae sunt asociate mai des cu bacteriemia
asociat cateterelor sau post-investigaii laparoscopice. Organismele sunt
larg rspndite n natur i frecvent se izoleaz i din flora normal a pielii
altor mamifere. Sunt puine studii ce detaliaz infeciile cu Kocuria spp.
Hafnia grupeaz bacili Gram negativi prezint o importan
deosebit n alterarea crnurilor refrigerate i a produselor vegetale.
Hafnia alvei este singura specia a genului, este mobil, lizin i ornitin
pozitiv i are un coninut n G+C mol% ADN de 48-49.
Lactobacillus (n. L. lac lactis, lapte; n. L. bacillus (ou bacillum) -
i, beior, baston mic - n bacteriologie un bacil mic; n. masc. N.L.
Lactobacillus, bacil din lapte) include un grup important din bacteriile
acidolactice. Sunt bacterii Gram pozitive, catalaz negative care se
grupeaz n lanuri lungi. L. suebicus a fost izolat din mere i pere uscate
i crete la un pH de 2,8 n etanol 12-16%. Pe baza datelor de
secvenializare a ARN 16S, au fost identificate 3 grupe distincte
171
filogenetic i este posibil ca genul s sufere ct de curnd o reclasificare.
Dei speciile izolate din alimente sunt de tip microaerofil, exist i multe
tulpini anaerobe, izolate n special din rumenul erbivorelor i intestinul
gros la om. Marea majoritate a acestora se izoleaz de pe numeroase
leguminoase i prezena lor n produsele lactate este frecvent. Unele
specii de Lactobacillus sunt utilizate industrial la producerea iaurturilor,
brzeturilor, fermentarea verzei, murturilor, berii, vinului, cidrului,
kimchi-ului i a altor mncruri fermentate, precum i a silozurilor. Pinea
sourdough este fabricat utiliznd o cultur starter reprezentat de o
cultur simbiotic de drojdi i bacteri acidolactice crescute n mediu cu
ap i fin de gru. Lactobacilii, n special L. casei and L. brevis sunt
unele din cele mai comune organisme de degradare a berii.
Lactococcus (n. L. lac lactis, lapte; n. Gr. coccos -ou, bob; n.
masc. N.L. lactococcus, coc din lapte) cuprinde coci ce au aparinut
serogrupului N al genului Streptococcus. Sunt coci Gram pozitivi, imobili,
catalaz negativi, sferici sau ovali, ce se gsesc singuri sau se grupeaz n
perechi sau lanuri scurte. Cresc la 10oC, dar i la 45oC, iar majoritatea
tulpinilor reacioneaz cu antiserul de grup N. Acidul L-lactic reprezint
principalul produs final al fermentaiei. Specia tip a genului este
Lactococcus lactis, cu dou subspecii L. lactis lactis i L. lactis cremoris.
Lactococcus lactis este unul din cele mai importante microorganisme
implicate n industria laptelui. Este o bacterie nepatogen esenial n
prepararea unor produse din lapte cum este babeurre-ul, iaurtul sau brnza.
Cnd L. lactis ssp. lactis este adugat n lapte bacteria utilizeaz enzimele
pentru a produce molecule de energie, denumite ATP, din lactoz.
Bioprodusul energiei ATP este acidul L-lactic. Acidul lactic produs de
ctre bacterii coaguleaz laptele care apoi se separ, cu formarea brnzei i
zerului. Lactococcus lactis este utilizat i la prepararea legumelor murate,
berii, vinului, unor sortimente de pine i sausage i a altor alimente
fermentate. Cercettorii anticipeaz c prin descifrarea fiziologiei i
prelucrarea genetic a acestora, bacteriile vor cpta o valoare inestimabil
n industria alimentar i farmaceutic, ce exploreaz capacitatea lui L.
lactis de a fi un vehicul de furnizare a medicamentelor.
Leuconostoc (adj. Gr. leucus, clar, luminos; n. neut. L.M. Nostoc,
nume gen alge; n. neut. L.M. Leuconostoc, drojdie fr culoare - incolor)
clasific un alt gen de bacterii lactice, coci Gram pozitivi, catalaz
negativi (care-i difereniaz de stafilococi) i heterofermentativi. Uzual,
aceti coci se asociaz cu lactobacilii i sunt acuzai c stau la baza
mirosului neplcut de la prepararea culturii starter pentru pinea
sourdough. Unele specii sunt capabile s produc infecii umane, dar
fiinc acestea nu sunt uzuale n etiologia bolilor umane, kiturile de
diagnostic standard existente n comer nu sunt concepute s le identifice.
172
Listeria (n. fem. N.L. Listeria, n onoarea chirurgului Lord Joseph
Lister, 1827-1912) acest gen conine 6 specii de bacterii Gram pozitive,
neformatoare de spori, fiind strns nrudit cu Brachothrix. Cele 6 specii au
perei celulari, acizi grai i compoziia citocromilor identice. Specia tip a
geului este Listeria monocytogenes, o bacterie uzual izolat din sol, ap
curgtoare, canalizare, plante i mncare. Listeria reprezint agentul
etiologic al listeriozei, o toxiinfecie alimentar grav ce poate duce la
decesul a 25% din oamenii mbolnvii. Sunt deosebit de rezistente i
capabile s creasc n intervalul termic 4C - 37C.
Micrococcus (adj. Gr. micro, mic; Gr. coccos -ou, bob; n. masc.
N.L. Micrococcus, un coc mici) se izoleaz din cele mai variate habitate,
ap, gunoaie i sol. Sunt coci Gram pozitivi izolai i de le pielea
mamiferelor, dezvoltndu-se n prezena unor niveluri mari de NaCl. n
prezent M. luteus i M. lylae sunt singurele specii ale genului.
Moraxella (suff. dim. L. -ella; n. fem. N.L. Moraxella, n onoarea
oftalmologului V. Morax, 1866-1935) cuprinde bacterii comensale ale
suprafeelor mucoase i care uneori determin infecii oportuniste.
Organismele sunt bacili sau cocobacili Gram negativi, scuri, sau cum este
cazul speciei Moraxella catarrhalis, diplococi, catalaz i oxidaz
pozitivi. Moraxella catarrhalis este cea mai important specie a genului.
Au un metabolism oxidativ i nu formeaz acid din glucoz.
Paenibacillus (adv. L. paene, aproape; n. N.L. Bacillus, nume gen
bacterian; n. masc. N.L. Paenibacillus, aproape un Bacillus sp. -apropiai
de genul Bacillus) este un gen bacterian relativ recent ce cuprinde
microorganisme incluse n genul Bacillus sau Clostridium: P. alvei, P
amylolyticus, P azotofixans, P circulans, P durum, P larvae, P macerans,
P macquariensis, P pubuli, P pulvifaciens i P validus. Recent au fost
adugate dou specii noi (P. lautus i P. peoriae). Bacterii Gram-labile,
mobile, aerobe sau facultativ anaerobe, chemo-organotrofe, xilanolitice.
Paenibacilii sunt importani pentru degradarea unor serii de
macromolecule, pentru producerea de ageni antibacterieni i antifungici,
i capacitatea de a fixa azotul n asociaie cu plantele. O nou specie a fost
izolat din laptele crud i cel tratat UHT (termic). Speciile asociate cu
infecii umane (septicemii, meningite, pneumonii) sunt P. alvei, P.
macerans i P. polymyxa.
Pandoraea (suff. L. -ea; n. fem., Gr. Pandora, prima femeie n
mitologia greac) au fost izolate pentru prima dat din sputa unor bolnavi
cu fibroz chistic. Cu toate c nu s-a demonstrat a fi germeni obinuii ai
alimentelor, specia P. noriumbergenesis a fost izolat din laptele praf.
Datele clinice disponibile indic implicarea patologic a acestor bacterii n
o serie de infecii cronice i posibilitatea transmiteri de la pacienii cu
fibroz cistic.
173
Pantoea (suff. L. ea, Fr. panto-, . L., Gr. pant-, panto-, pant-,
peste tot, toate) este un gen bacterian care cuprinde bacili drepi, Gram
negativi, necapsulogeni, nesporogeni, majoritatea flagelai peritrich,
inclui n grupa coliformilor (parametru evaluat n analiza calitii apei sau
a sntii publice). Acetia se pot izola de pe suprafaa plantelor,
seminelor, n sol, ap i din intestinul oamenilor. Unii sunt patogeni
pentru plante. Cele 4 specii recunoscute au fost n trecut clasificate ca
enterobacterii sau erwinii. P. agglomerans include speciile Enterobacter
agglomerans, Erwinia herbicola i E. milletiae; P.ananas include speciile
Erwimia ananas i E. uredovora; P.stewartii a fost denumit n trecut E.
stewartii; P. dispersa este o specie nou descris. Un test API 20E poate fi
un ajutor n identificarea corect a speciei. Coninutul n G+C al ADN este
49,7 pn la 60,6 mol%
Pediococcus (adj. Gr., Fr. pedion, o suprafa plan, n. masc. Gr.
coccos -ou, bob; n. masc. N.L. Pediococcus, coci care cresc ntr-un plan)
conine lactococi homofermentativi, Gram-pozitivi, ce se nmulesc prin
diviziunea celulelor n unul sau dou planuri de simetrie formnd grupri
diploide sau terade. P acidilactici este specia tip i a fost citat ntr-un caz
de septicemie la un brbat de 53 de ani. Uzual pediococii sunt considerai
contaminani ai berii i vinului, dei prezena lor este uneori nedorit n
anumite tipuri de bere cum este Lambic (sortiment de bere fabricat numai
in regiunea Pajottenland din Belgia). Anumite izolate de Pediococcus
produc diacetil, compus ce confer o arom special anumitor sortimente
de vin (ex. Chardonnay) i bere. Pediococcus sp. sunt adesea utilizate ca
inoculani de nsilozare pentru obinerea furajelor fermentate destinate
hrnirii rumegtoarelor. Alturi de ali lactobacili, cum sunt Leuconostoc
i Lactobacillus, pediococii sunt implicai i n fermentarea verzei.
Proteus (n. masc. L. Proteus -ei (sau-eos), Proteus, zeu al mrii n
mitologia Greac, ce posed puterea divin a metamorfozei, numele de
Proteus a fost dat unui gen bacterian ale crui specii prezint un
polimorfism accentuat) este genul ce reunete un grup de bacterii ce au ca
ni ecologic tubul digestiv al omului i animalelor. Sunt unii din
principalii ageni ai proceselor de putrefacie din mediile naturale (sol i
ap) i particip ca efectori ai circuitelor biogeochimice din natur. Prin
supransmnri n alimente pot duce al toxiinfecii alimentare i sunt
rspndite n alimentele proaspete, n special legume, carnea provenind de
la psrile de curte i n produsele marine. Dei n trecut era genul cu cele
mai multe bacterii izolate din alimente, acum a fost redus numeric prin
transferul multor specii n alte genuri nou create: Acidovorax,
Aminobacter, Brevundimonas, Burkholderia, Comamonas, Delftia,
Devosia, Herbaspirillium, Hydrogenophaga, Marinobacter, Ralstonia,
Sphingomonas, Telluria i Wantersia. P. fluorescens i P. aeruginosa
174
rmn n genul initial.
Psychrobacter (n. Gr. psychros, psychein, a face la frig; n. masc.
L.M. bacter, echivalent cu bacterium, un bacil mic; n. masc. L.M.
Psychrobacter , bacil care se dezvolt la frig) este un gen creat n special
pentru a include unii din bacilii Gram negativi, imobili, clasificai anterior
n genurile Acinetobacter i Moraxella. Psychrobacteriile sunt cocobacili
ce se grupeaz n perechi, anaerobi, imobili, catalaz i oxidaz pozitivi i
care nu fermenteaz glucoza. Creterea acestora are loc n medii cu NaCl
60,5% i n general la 1C, dar nu i la 3,5 C sau 37 C. Se deosebesc de
acinetobacterii prin faptul c sunt oxidaz pozitivi i utilizeaz
aminovaleratul, iar spre deosebire de Pseudomonas spp. nu au capacitatea
de a utiliza glicerolul sau fructoza. Se izoleaz frecvent de pe carnea de
pui, pete i din ap.
Salmonella (suff. dim. L. -ella; n. fem. N.L. Salmonella, n
onoarea bacteriologului D.E. Salmon, 1850-1914). Specia tip este
reprezentat de Salmonella enterica. Exist peste 2500 de serovaruri
(serotipuri) care se noteaz, de exemplu, astfel: Salmonella enterica
serotipul Newport sau Salmonella Newport (de notat c serotipul nu este
italicizat). Coninutul moleculei de ADN n G+C este de 50-53mol%.
Sunt bacterii Gram negative considerate n ansamblul lor, indiferent de
serotip, virtual patogene pentru om i, n concluzie, obligatoriu absente din
alimente. Salmonella spp. populeaz tractul intestinal al oamenilor i altor
animale, inclusiv al psrilor. Acestea sunt uzual transmise la om prin
alimente contaminate cu fecale de animale. Salmonelele pot determina
toxiinfecii alimentare (salmoneloz) i prin contaminare ncruciat. De
exemplu, dac sucul ce provine din carnea proaspt infectat vine n
contact cu alimente neprelucrate termic sau deja preparate (aa cum sunt
salatele), acestea pot constitui surse de infecie. Alimentele se pot
contamina i prin minile nesplate ale unui buctar infectat. De
asemenea pot fi gsite i n fecalele unor animale de companie, n special
la cele cu diaree. Oamenii se pot contamina dac nu se spal pe mini
dup ce manipuleaz aceste fecale. n mod particular reptilele pot fi
purttoare de salmonele, de aceea oamenii care le manipuleaz trebuie s
se spele pe mini n timpul cel mai scurt, chiar dac acestea sunt aparent
sntoase. Orice produs alimentar proaspt de origine animal, cum sunt
carnea, laptele, produsele lactate, oule, fructele de mare i unele legume
i fructe pot fi purttoare de salmonele. Bacteria poate supravieui i
produce mbolnviri dac produsele din carne i ou nu sunt gtite
corespunztor, la o temperatur care garanteaz distrugerea lor, i dac
legumele i fructele nu sunt splate energic la jet de ap. Salmonelele pot
contamina i alte alimente ce vin n contact cu carnea proaspt. Bunele
practici de manipulare a alimentelor sunt absolut necesare n prevenirea
175
transmiterii bacteriei din carnea proaspt.
Serratia (n. fem. N.L. Serratia, n onoarea inginerului S. Serrati,
secolul XVIII). Bacili Gram negativi, inclui n familia
Enterobacteriaceae, aerobi, proteolitici i care n general produc
prodigiozin pe nucleele de cultur i pe alimente, dei tulpinile
nepigmentogene nu sunt o raritate. Serratia liquefaciens este specia cel
mai frecvent izolat din alimente. Aceasta produce alterarea produselor
vegetale i a crnii refrigerate.
Shewanella (suff. dim. L. -ella; n. fem. N.L. Shewanella, n
onoarea bacteriologului J.M. Shewan) este genul bacterian n care sunt
grupate unele bacterii incluse anterior n Pseudomonas putrefaciens i
ulterior n Alteromonas putrefaciens, iar la aceast dat formeaz specia S.
putrefaciens. Acetia sunt bacili drepi sau curbi, Gram negativi,
nepigmentogeni, oxideaz pozitivi cu un coninut n G+C de 44-47 mol%.
Alte trei specii ale genului sunt S. hanedai, S. benthica i S. colwelliana.
Toate sunt asociate cu habitatele acvatice sau marine, iar creterea speciei
S. benthica este stimulat prin presiune hidrostatic.
Shigella (v suff. dim. L. -ella; n. fem. L.M. Shigella, n onoarea
bacteriologului K. Shiga, 1871-1951). Toti membrii acestui gen sunt
prezumtiv enteropatogeni umani sau ai altor primate, dar nu i al altor
mamifere. Infecia se produce uzual prin contaminare fecalo-oral, iar n
funcie de vrst i starea general a gazdei numai cteva celule bacteriene
pot fi suficiente pentru a declana o infecie. Ca rezultat al distruciei
celulelor mucoasei intestinale de la nivelul cecumului i rectului Schigella
sp. determin dizenterie.
Sphingomonas (adj. Gr. sphingo-, sphingen, ataare rapid; n. Gr.
monas -ados, unitate, monad; n. fem. N.L. Sphingomonas, o monad care
ader repede) Exista 33 de specii Gram negative. Aceste bacterii produc
un pigment galben tipic i au fost incluse n genul Flavobacterium.
Sphingomonele sunt larg rspndite n natur, fiind izolate din numeroase
habitate terestre i acvatice, precum i din rdcinile plantelor, legumelor,
probe recoltate de la animale i din alte surse. Unele sphingomone (n
special Sphingomonas paucimobilis) pot juca i un rol n patologia uman,
n principal prin producerea unor infecii nosocomiale ce pot fi tratate uor
prin antibioterapie. Datorit capacitii lor biodegradative i biosintetice,
sphingomonele sunt deja utilizate ntr-o gam larg de aplicaii
biotehnologice, de la bioremedierea contaminanilor din mediu la
producerea de polimeri extracelulari cum sunt sfinganii (ex: gelan, welan
i rhamsan) utilizai pe scar larg n industria alimentar i n alte
industrii. O tulpin de Sphingomonas sp. 2MPII, poate degrada 2-
methylphenanthrene.
Staphylococcus (n. Gr. staphule -es, ciorchine de struguri; n. Gr.
176
coccos -ou, bob; n. masc. N.L. Staphylococcus, coci grupai n ciorchine
de strugure) cuprinde bacterii Gram pozitive incriminate n producerea
unei varieti mari de boli la om i animale, att prin producia de toxine
ct i prin capacitatea invaziv. Specia tip a genului este S. aureus care
provoac mai multe sindroame la om inclusiv gastroenterite alimentare.
Poate supravieui chiar i pe suprafeele uscate, ceea ce impune o abordare
tranant a strategiei de prevenire i combatere a transmiterii acesteia la
om. Toxinele stafilococice sunt principala cauz a otrvirii alimentelor
i nivelul acestora poate fi crescut n alimentele pstrate n condiii
improprii. Dei procesul de gtire le ucide, enterotoxinele sunt termo-
rezistente i pot supravieui fierberii timp de mai multe minute.
Stafilococii se pot dezvolta i n alimentele cu o cantitate de ap relativ
sczut (cum sunt salamurile uscate i unele sortimente de brnz).
Stenotrophomonas. (adj. Gr. stenos, strmt; n. Gr. trophos, acela
care hrnete; n. Gr. monas -ados, o unitate, o monad; n. fem. N.L.
Stenotrophomonas, o monad, o bacterie care utilizeaz un numr limitat
de substraturi nutritive). Bacili Gram negativi, aerobi i nefermentativi
care se izoleaz din plante (promotori ai creterii sau semibioni n
rizosfera mai multor plante agricole), sol, ap i lapte. Incadrat
taxonomic iniial n genul Pseudomonas i apoi n Xanthomonas,
Stenotrophomonas maltophila (specia tip) este considerat la aceast dat
ca a 2-a bacterie nasocomial, cea mai frecvent dup Pseudomonas
aeruginosa. Stenotrophomonas rhizophila a fost folosit pentru controlul
i combaterea infeciilor fungice la plante.
Vagococcus (n. masc., Fr. vagabond, Eng. vagrant, cltor, nomad,
n. Gr. coccos -ou, bob; n. masc. N.L. Vagococcus, coci migratori, nomazi)
ca gen a fost propus n 1989 pentru a grupa cocii mobili asemntori
lactobacililor, ce erau definii anterior ca lacto-streptococi mobili
(lactobacili serogrupul N), i la care secvenializarea ARNr 16S a
demonstrat c sunt diferii fa de toi lactobacilii cunoscui. Sunt bacili
flagelai peritrih, Gram pozitivi i catalaz negativi ce se dezvolt la 10oC
dar nu i la 45oC, n medii cu NaCl 4%, dar nu i la 6,5%; nu se dezvolt
la un pH de 9,6. Stratul de peptidoglican al peretelui celular este compus
din Lis-D-Asp, iar coninutul ADN-ului n G+C este de 33,6 mol%. Foarte
puine specii produc hidrogen sulfurat. Se gsesc n pete, fecale i ap.
Specia tip a genului este Vagococcus fluvialis, a crei caracterizare a dus
la formarea acestui gen. Investigaii taxonomice moleculare ulterioare au
dus la identificarea unei a doua specii, denumit Vagococcus
salmoninarum. Dei distinct, genul Vagococcus a are o strns legtur
filogenetic cu genurile Enterococcus i Lactococcus, iar unele specii sunt
foarte greu de difereniat pe baza caracterelor fenotipice. Exist o serie de
comunicri referitoare la izolarea de la petii (salmonide) bonavi a lui V.
177
salmoninarum i de la animalele domestice a lui V.fluvialis, dar
semnificaia lor pentru patologia uman rmne nc necunoscut. Posibila
implicare a vagococilor n infecii umane rmne valabil, dac se ia n
considerare dificultatea identificrii lor, care poate duce la identificarea
greit sau ignorarea acestora.
Vibrio, (v. L. vibro, a imprima o micare vibratorie, a agita, a
vibra; n. masc. N.L. Vibrio, cel care vibreaz, ce se mic rapid) sunt
bacili drepi sau curbi, Gram negativi, membrii ai familiei Vibrionaceae.
O serie de specii ce au aparinut acestui gen sunt acum incluse n genul
Listonella. Unele specii produc la om gastroenterite sau septicemii, n
principal prin consumul alimentelor neprelucrate termic ce conin crevei
sau crabi, dar i prin consumul de ap contaminat (Vibrio cholerae).
ADN-ul acestor bacterii conine 38-51 G+C mol . Specile patogene de
Vibrio sunt V. cholerae (agentul etiologic al holerei), V. parahaemolyticus
i V. vulnificus. Multe alte specii au i caracter zoonotic, ele producnd
boli, adesea mortale, la peti i molute.
Weissella (v suff. dim. L. -ella; n. fem. L.M. Weissela, n onoarea
bacteriologului N. Weiss). Acest gen de bacterii acidolactice a fost creat
1990 pentru a clarifica poziia taxonomic a ramurii leuconostoc a
lactobacililor. Utiliznd att datele secvenializrii ARNr 16S ct i 23S,
Martinez-Murcia i Collins (1990) and Martinez-Murcia et al. (1993) au
artat c Leuconostoc paramesenteroides este distinct filogenetic de
Leuconostoc mesenteroides i acesta se grupeaz cu ali cinci lactobacili
heterofermentativi Lactobacillus confusus, Lactobacillus halotolerans,
Lactobacillus kandleri, Lactobacillus minor i Lactobacillus viridescens.
n 1993 Collins et al. trec n revist organismele leuconostoc-like izolate
din mezelurile fermentate, ceea ce a dus la identificarea speciilor ce
formeaz genul Weissella: fostul Leuconostoc paramesenteroides, cei
cinci lactobacili prezentai anterior i o specie nou izolat Weissella
hellenica. La aceast dat sunt indexate n gen peste 50 de specii.
Tulpinile Weissella au fost izolate dintr-o varietate de surse. Weisella
paramesenteroides este una din cele mai frecvent izolate specii n
legumele proaspete i joac un rol important n prima faz a procesului de
fermentare a silozurilor. Weisella halotolerans, Weisella hellenica i
Weisella viridescens au fost uzual asociate cu carnea i produsele din
carne, n timp ce habitatul natural al Weisella kandleri nu este cunoscut.
Se consider c tulpina tip a speciei Weisella kandleri i are habitatul n
unele specii de plantele de deert. Weisella confusa a fost identificat n
zahrul din trestie, sucul de morcovi i ocazional n laptele crud i apa
menajer/uzat. Tulpinile Weisella minor utilizate la descrierea
taxonomic au fost izolate din sedimentul mainilor de lapte. Weisella
thailandensis a fost izolat din produse fermentate tailandeze din pete,
178
dar n Asia de Sud-Est weisellele au fost izolate i din alte produse
alimentare tradiionale cum sunt tapai (aliment fermentat i dulce pe baz
de orez) i chili bo (produs nefermentat cu cili i amidon din cereale i alte
ingrediente perisabile). Coninutul n G+C al ADN-ului este de 37-47
mol%.
Yersinia (n. fem. N.L. Yersinia, n onoarea bacteriologului elveian
A.J.E. Yersin, 1863-1943). n acest gen este inclus agentul pestei umane,
Y. pestis, specii care produc gastroenterite, Y. enterocolitica, i septicemii
cu limforeticulite, Y. pseudotuberculosis. Roztoarele sunt rezervorul
natural, iar alte mamifere pot fi gazde n mai mic msur. Infecia se
poate transmite transcutanat prin snge (Y. pestis) sau pe cale digestiv
prin consum de produse alimentare contaminate cu urin sau fecale (n
special prin legume, lactate i carne). Implicarea unui mecanism
protozoonotic n transmiterea yersiniilor nu este cert, dar se tie c acetia
sunt parazii facultativ intracelulari. Cercetarea posibilei propagri i
proliferri a yersiniilor prin vectori amoeba (prin stadiul de chist al
protozoarului) reprezint o tem de cercetare actual. Dintre
caracteristicile fiziologice ale Yersinia sp. de reinut este capacitatea de a
supravieui i prolifera la temperaturi de 1-4oC (ex. n produsele
alimentare pstrate la temperatura frigiderului). n plus, aceasta prezint o
rezisten semnificativ i la temperaturi ridicate, reuind s
supravieuiasc pn la 20-30 minute la 50-60oC i s nu fie distrus prin
procesul de pasteurizare standard a laptelui (15 secunde la 72 oC). Totui,
yersinile sunt inactivate rapid de ageni oxidani cum sunt ap oxigenat i
permanganatul de potasiu. Coninutul G+C mol al ADN-ului este 45,8-
46,8.
179
Capitolul 8
Ciuperci microscopice izolate
frecvent din alimente
8.1. Mucegaiuri izolate frecvent din alimente
180
Genul: Colletotrichum
Clasa: Hypomycetes (hife productoare de conidii)
Ordinul: Hyphomycetales
Familia: Moniliaceae
Genurile: Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium (Pullularia),
Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Helminthosporium,
Monilia/Sclerotinium, Penicillium, Stachybotrys, Trichothecium
Cele mai importante genuri ale micologiei alimentare vor fi n
continuare descrise succint.
Alternaria: fungi responsabili de
putregaiul fructelor cu smburi, al merelor i
smochinelor precum i de putregaiul negru al
citricelor. Alternariile sunt fungi de cmp care
cresc pe gru, dar se pot izola i de pe crnurile
roii. Acestea produc micelii septate cu
conidiofori i conidii cafenii mari. Unele specii
produc micotoxine, dar majoritatea efectelor
Fig.2.7. Alternaria produse asupra sntii animale i umane nu
sunt nc bine cunoscute. Nu toate specile de
Alternaria sunt combtute i considerate patogene, chiar mai mult, unele
promit a fi arme de lupt ecologice contra unor plante duntoare.
Aspergillus: produce lanuri de conidii.
Cnd se dezvolt cleistoteci2 cu ascospori
stadiul perfect al celor gsii n alimente este
Emericella, Eurotium sau Neosartorya.
Eurotium (fostul grup A. glaucus) produce
chistoteci de culoare glbui deschis, toate
speciile fiind xerofile. E. herbariorum produce
deteriorarea gemurilor i jeleurilor de struguri.
Fig.2.8. Aspergillius Emericella produce cleistoteci albi, iar E.
nidulans este teleomorfa speciei Aspergillus
nidulans. Neosartorya produce cleistoteci albi i ascospori incolori. N.
fischeri este termorezistent, iar rezistena sporilor si este similar cu cea
a celor de Byssochlamys. Aspergilii apar pe un numr mare de alimente,
fiind pigmentai n galben-verde pn la negru. Putregaiul negru al
piersicilor, citricelor i smochinelor constituie una din condiiile alterrii
fructelor. Unele specii se gsesc i pe unca afumat la ar sau pe slnin,
iar altele produc alterarea uleiurilor de palmier, alune i porumb. A. oryzae
2
Cleistoteci = ascele se formeaz n periteci complet nchise, una cte una. Ascocarp =
ascofruct = corp de fructifica ie = structur fungic cu complexitate variabil ce poart
asce i ascospori.
181
i A. soyae sunt implicate n fermentaia shogu, iar ultimul n fermentaia
koji. A. glaucus produce katsuobushi, un produs oriental din pete
fermentat. Grupul A. glaucus-A. restrictus contine fungi de depozitare care
invadeaz semintele, boabele de soia si fasolea. A. niger produce -
galactozidaz, glucoamilaz, invertaz, lipaz i pectinaz, iar A. oryzae
produce -amilaz. Dou specii produc aflatoxine i altele produc
ocratoxin A i sterigmatocistin.
Aureobasidium (Pullularia): sunt fungi de culoare nchis, cu
larg rspndire n mediu, ce sunt uzual izolai din deeuri de plante, sol,
lemn, esturi i din aerul spaiilor nchise. A. pullulans (Pullularia
pullulans) este cel mai frecvent contaminant alimentar. Se pot izola i din
crevei, sunt responsabili de boala petelor negre ale crnii de vit
conservat pe termen lung i sunt frecvent ntlnite pe fructe i legume.
Patogenitatea Aureobasidium rmne ns limitat i neobinuit. La om
au fost raportate micoze cutanate, respiratorii, peritonite i o serie de
infecii aureobasidiale oportuniste.
Botrytis: au conidioforii lungi, subiri i
adesea pigmentai. Miceliul este septat, conidiile
sunt prezente pe celulele apicale, de culoare
cenuie sau neagr i uneori se produc sclerote3
neregulate. Botrytis cinerea este ce mai
frecvent specie gsit n alimente. Aceti fungi
sunt importani pentru c produc mucegaiul gri
al merelor, perelor, zmeurei, cpunilor,
Fig.2.11. Botrytis strugurilor, merelor, citricelor i al unor fructe
cu smburi.
Byssochlamys: acest gen este teleomorfa
unor specii de Paecilomyces, fungi neizolai din
alimente. Importana bisoclamidilor rezid din
termorezistena lor i capacitatea de a altera
unele alimente acide. n timpul creterii pot
tolera valori potential reduse de oxidoreducere.
Unele specii sunt productoare de pectinaze, iar
Fig.2.12. Byssochlamys fulva i Byssochlamys nivea
Byssochlamys altereaz fructele conservate i mbuteliate.
Aceti fungi sunt cel mai frecvent incriminai n
degradarea fructelor i sucurilor de fructe.
Cladosporium: este un gen fungic ce cuprinde unele din cele mai
3
sclerotium (Ag) = un corpuscul de dimensiuni variabile format dintr-o mas indurat de
hife cu sau fr esut gazd prezentnd o scoar de culoare nchis din care se pot
dezvolta conidiofori sau micelii.
182
ntlnite mucegaiuri. Acetia se caracterizeaz prin producerea de hife
septate cu conidii arborescente de culoare nchis, cu ramificaii diverse.
n culturi are o cretere catifelat, colorat n msliniu pn la negru.
Unele conidii au form de lmie. Cladosporium herbarum produce pete
negre pe carnea de vit i oaie congelat. Pot altera untul i margarina, iar
unele specii provoac putregaiul fructelor i strugurilor. Sunt fungi de
cmp care cresc pe grunele de orz i gru. Sunt rar patogene pentru
oameni, dar au fost raportate ca responsabile de unele infecii cutanate i
ale unghiilor precum i de infecii sinusale i pulmonare.
Colletotrichum: fac parte din clasa
Coelomycetes i formeaz conidii n interiorul
acervulilor. Formeaz conidiofori simpli
elongai i conidii hialine unicelulare ovoide sau
dolice. Au form de disc sau de pern, ceroase
i n general de culoare nchis. Colletotrichum
gloeosporioides se poate izola din alimente, ea
Fig.2.14. produce antracnoz n special pe fructe tropicale
Colletotrichum ca mango i papaya. Sunt foarte rar implicate n
patologia uman i a animalelor, fiind raportate
cteva cazuri de cheratite micotice, n principal dup leziuni oculare, i
infecii consecutive bolilor imunosupresive.
Fusarium: formeaz un miceliu nchis
cu aspect vtos cu nuane de roz, rou, purpuriu
sau cafeniu. Macroconidiile sunt septate, avnd
forma fusiform pn la falciform (n form de
secer). Produc putregaiul moale al
smochinelor. Ca fungi de cmp unele specii se
dezvolta pe grunele de orez sau gru. Unele
specii produc tricotecene, fumonizine i
Fig. 2.15. Fusarium zearalenone. Fusarium venenatum este produs
pe scar industrial pentru a fi utilizat ca
aliment uman (Quorn).
Geotrichum (denumit anterior Oidium lactis i Oospora lactis).
Aceti fungi drojdii-like au cel mai adesea culoarea alba, hifele septate, iar
reproducerea are loc prin formarea de artroconidii din hifele vegetative.
Geotrichum candidum, anamorfa lui Dipodascus geotrichum este cea mai
important specie din alimente. Ea este cunoscut i sub denumirea de
ciuperca lactic, deoarece confer arom specific multor tipuri de
brnz sau ciuperca de aparate pentru ca se dezvolt pe echipamentul ce
vine n contact cu alimentele, n fabricile de procesare a alimentelor, n
special n cele de conservare a tomatelor. Cauzeaz putregaiul acru al
citricelor i piersicilor, i alterez smntna. Au o rspndire destul de
183
larg, putnd fi gsite inclusiv pe carne i legume.
Monilia/Sclerotinium: produce conidii
roz, gri sau cafenii. M. sitophila este stadiul
conidial al speciei Neurospora intermedia.
Monilia este stadiul conidial al speciei
Monilinia fructicola. Ele produc putregaiul
cafeniu al fructelor cu samburi (piersici, caise).
Monilina sp. provoac mumificarea afinelor.
Mucor: hifele sunt neseptate i produc
Fig. 2.17. Monilia sporangiofori purttori de columela cu sporangii
la vrf. Numeroii membrii ai acestui gen nu
produc rizoizi sau stoloni. Produc colonii
vtoase, iar unele specii produc whiskers
(musti de pisic) la carnea de vit i puncte
negre ale crnii de oaie congelat. Cel puin o
specie, M. miehei, produce lipaz. Se gasete n
alimente fermentate, bacon i numeroase
legume. Unele specii fermenteaza zerul de soia.
Penicillium: conidioforii i conidiile
Fig. 2.18. Mucor sunt singurele structuri de reproducie prezente,
genul fiind plasat n clasa Deuteromycota. Sunt
plasate ntre ascomicete atunci cand se
formeaza cleistochecii4 cu ascospori, ca de
exemplu Talaromyces sau Eupenicillium.
Dintre cele dou genuri teleomorfe, genul
Talaromyces este cel mai important n
contaminarea alimentelor. T. flavus este
Fig. 2.19. Penicillium teleomorfa lui P. dangeardii i este implicat n
alterarea concentratului de suc de fructe.
Produce spori termorezisteni cnd se formeaz conidii n Penicillium
acestea cad din fialide. Culorile tipice pe care le au n alimente sunt
albastru sau albastru verzui. Unele specii produc putregaiul albastru i
verde al citricelor, strugurilor, perelor i fructelor cu smburi.
Rhizopus: hifele aseptate produc stoloni i rizoizi. Sporangioforii
se dezvolt tipic sub form de ciorchine n capul stolanilor la punctul de
origine al rizoizilor. R. stolonifer reprezint specia cea mai frecvent izolat
din alimente. Uneori sunt denumite mucegaiurile pinii i produc
putregaiuri moi, apoase ale merelor, perelor, fructelor cu smburi,
strugurilor, smochinelor si ale altor fructe. Unele produc petele negre ale
crnii de vit i de oaie congelate. Pot fi gsite pe slnin i pe alte
4
cleistocheci = ascosporic nchis n ascii dispersai aleator
184
produse de carne procesate. Unele produc pectinaze, iar R. oligosporus
este important in producerea de oncom, bongkrek si tempeh.
Thamnidium: aceste mucegaiuri produc
sporangii mici purtate de structuri extrem de
ramificate. T. elegans este specia cea mai
cunoscut datorit faptului c se dezvolt pe
membrele posterioare ale crnii de vit
refrigerate, creterea fiind cunoscut sub
denumirea whiskers. Acestea se pot izola i
Fig. 2.21. din ouale alterate.
Thamnidium Trichothecium: hifele sunt septate
purtnd conidiofori lungi, subiri i simpli. T.
roseum este singura specie de culoare roz i produce mucegaiul roz al
fructelor. De asemenea provoac mucegaiul moale al dovlecilor gsindu-
se frecvent pe orz, gru i porumb. Uneori produc micotoxine.
Alte mucegaiuri: Pe lng mucegaiurile prezentate anterior mai
sunt cunoscute i alte genuri cu importan n
microbiologia alimentar, care pot fi grupate n
dou categorii. Prima
categorie este
reprezentat de
mucegaiuri prezente
n unele alimente, dar
Fig. 2.23. care n general nu au
Trichothecium Fig. 2.22. o semnificaie
Neosartorya considerabil:
Cephalosporium, Diplodia i
Neurospora. Cephalosporium este un deuteromicet ce se gsete pe carnea
congelat. Microsporii acestui gen sunt asemntori cu cei ai unor specii
de Fusorium. Diplodia este un alt deuteromicet care provoac mucegaiul
cafeniu apos al piersicilor. Neurospora este un ascomicet, iar N.
intermedia este cunoscut sub denumirea de mucegaiul rou al pinii.
Monilia sitophila este anamorfa lui N. intermedia. Aceasta din urm este
important n fermentarea oncomului i a fost gsit pe diferite crnuri.
White spot petele albe ale crnii de vit este provocat de Sporotrichum
spp., iar mucegaiurile diverselor fructe sunt cauzate de Gloeosporium spp.
Unele speciile de Helminthosporium sunt patogene, iar altele saprofite
pentru foarte multe plante.
Neosartorya fischeri: (anamorfa lui Aspergillus fischerianus) a
fost recunoscut ca fiind cauza alterrii unor produse din fructe n anii
1960. Ascosporii si sunt extrem de termorezisteni, fiind capabili s
reziste la fierbere n apa distilat timp de 1 or, i este micotoxinogen,
185
producnd fumitremorgin A, B i C; terein, veruculogen i fischerin.
Cea de a doua categorie conine mucegaiuri xerofile, cu rol foarte
important n alterare. Pe lng Aspergillus i Eurotium, Pitt i Hocking
includ printre xerofile i genurile: Basipetospora, Chrysosporium,
Eremascus, Polypaecilum, Wallemia i Xeromyces. Aceste mucegaiuri se
caracterizeaz prin abilitatea lor de a crete sub valoarea a w (water
activity) = 0,85. Ele se gsesc n alimentele ce-i datoreaz
conservabilitatea unui aw redus. Dintre cele 6 genuri 2 merit a fi
prezentate: Wallemia i Xeromyces.
Wallemia: produce pe mediile de cultur i pe alimente colonii de
culoare cafenie. W. sebi este specia cea mai important i poate crete la
aw=0,69. Produce mucegaiul gri (dun) pe petele uscat i srat.
Xeromyces: are o singur specie, X. bisforus, produce cleistoteci
incolori cu ascii exanescente5 ce conin 2 ascospori. Acest microorganism
are creterea cea mai redus n aw dintre toate celelalte microorganisme
cunoscute. Cauzeaz probleme la lichioruri, prune, ciocolat, sirop i alte
produse similare.
5
exanescente = care dispar repede
186
n sistematica levurilor s-au produs multe modificri, datorit
folosirii unor metode mai noi, dar i datorit unei filozofii ce pare a fi
ndreptat mai mult spre gruparea taxonilor dect spre separarea lor. Una
din lucrrile de baz privind sistematica levurilor este aceea editat de
Kreger-van Rij, publicat n 1984. n acest volum, genul Torulopsis din
trecut a fost transferat n genul Candida, iar unele specii Saccharomyces
au fost transferate n genul Torulaspora i Zygosaccharomyces. Starea
teleomorf sau perfect a mai multor levuri face ca referirile din literatura
mai veche s fie dificile.
Deak i Beuchat, Beneke i Stevenson, Pitt i Hocking au prezentat
o cheie simplificat de identificare a levurilor din alimente. Taxonomia a
circa 15 genuri este prezentat rezumativ mai jos.
Diviziunea: Ascomycotina
Familia: Saccharomycetaceae (formeaz ascospori i artrospori;
reproducere vegetativ prin fisiune sau nmugurire)
Subfamilia: Nadsonioideae
Genul: Hanseniaspora
Subfamilia: Saccharomycotoideae
Genul: Debaryomyces
Issatchenkia
Kluyveromyces
Pichia
Saccharomyces
Torulaspora
Zygosaccharomyces
Subfamilia: Schizosaccharoycetoideae
Genul: Schizosaccharomyces
Diviziunea: Deuteromycotina
Familia: Cryptococcaceae (fungi imperfeci; reproducere prin nmugurire)
Genul: Brettanomyces
Candida
Cryptococcus
Rhodotorula
Trichosporon
Genurile de mai sus sunt enumerate n contiunare n ordine
alfabetic:
1. Brettanomyces (stadiul perfect este Dekkera). Aceast levur
este nesporogen, cu celule ogivale i nmugurire terminal, producnd
acid acetic din glucoz, numai n condiii aerobe. B. intermedius reprezint
specia tip i poate crete la un pH sczut de 1,8. Aceste levuri produc
alterarea berii, vinului i buturilor nealcoolice, a murturilor, iar unele
sunt implicate n postfermentarea unor beri blonde. B. bruxellensis
187
contribuie la formarea aminelor biogene din vinurile roii.
2. Candida. Acest gen a fost creat n 1923 de ctre Berkhout i a
suferit o serie de modificri n ceea ce privete definiia i clasificarea.
Este considerat ca fiind un taxon heterogen important ce poate fi divizat n
40 de segmente cu 3 grupe principale, bazat n principal pe compoziia de
acizi grai i cariotipizarea electroforetic. Numele generic nseamn alb
strlucitor, iar celulele nu conin pigmeni carotenoizi. Speciile
imperfecte de ascomicete sunt plasate aici, incluznd i fostul gen
Torulopsis, dup cum urmeaz:
Candida famata (Torulopsis candida, T. famata);
Candida kefyr (Candida pseudotropicalis, T. kefyr, Torula
cremoris);
Candida stellata (Torulopsis stellata);
Candida holmii (Torulopsis holmii).
Multe din formele anamorfe de Candida sunt azi incluse n genul
Kluyveromyces i Pichia. Candida lipolytica este anamorfa lui
Saccharomycopsis lipolytica.
Membrii acestui gen sunt levurile cele mai frecvente din carnea de
vit i pui tocate recent, iar C. tropicalis reprezint genul predominant din
alimente. Unii membrii sunt implicai n fermentarea boabelor de cacao, ca
o component a granulelor de kefir i n multe alte produse incluznd
unele tipuri de bere i sucuri de fructe.
3. Cryptococcus. Reprezint anamorfa genului Filobasidiella i a
altor basidiomicete. Sunt nesporogene, se reproduc prin nmugurire
multilateral i nu fermenteaz zaharurile. Sunt hialine, de culoare roie
sau portocalie i pot forma artrospori. Au fost gsite pe plante, soluri,
cpuni i alte fructe, pete marin, crevei i carne de vit proaspt,
tocat.
4. Debariomyces. Levuri ascosporogene ce produc uneori un
pseudomiceliu i se reproduc prin nmugurire multilateral. Ele sunt
reprezentate de 2 genuri ce se gsesc n produsele lactate.
D. hansenii reprezint ceea ce au fost n trecut D. subglobosus i
Torulaspora hansenii, fiind specia predominant din alimente. Poate
crete n NaCl 24% i la un aw de numai 0,65. Crete n saramur i pe
brnzeturi, provocnd alterarea concentratului de suc de portocale i a
iaurtului.
5. Hanseniaspora. Sunt levuri apiculate ale cror anamorfe sunt
speciile Kloeckera. Ele produc o nmugurire bipolar i drept urmare se
produc celule n form de lmie. Ascele conin 2-4 spori n form de
plrie. Fermenteaz zaharurile i se gsesc pe tomate, smochine, cpuni,
188
citrice i intervin n fermentarea boabelor de cacao.
6. Issatchenkia. Membrii acestui gen produc pseudomiceliu i se
multiplic prin nmugurire multilateral. Aici au fost incluse unele specii
ce fceau parte din genul Pichia. Teleomorfa speciei Candida krusei este
I. orientalis i se gsete n medii lichide unde formeaz pelicule
caracteristice. Conine coenzima Q7, fiind frecvent ntlnit ntr-o mare
diversitate n alimente.
7. Kluyveromyces (Fabospora). Sunt formatoare de ascospori, se
reproduc prin nmugurire multilateral, iar sporii sunt sferici. K.
marxianus include fostele specii K. fragilis, K. lactis, K. bulgaricus,
Saccharomyces lactis i S. fragilis.
K. marxianus este una din cele 2 levuri predominante din
produsele lactate. Aceasta conine coenzima Q6, fiind implicat n
fermentarea kumisului6. Este de asemenea folosit pentru producerea
lactozei din zer. Se gsete ntr-o larg diversitate de fructe i produce
alterarea brnzeturilor.
8. Pichia. Genul cel mai larg de levuri adevrate. Se reproduc prin
nmugurire multilateral, iar ascele au de obicei 4 spori sferoidali n form
de plrie sau saturnian. Pot forma pseudomicelii i artrospori. Unii
spori, n form de plrie aparin speciilor Williopsis, iar unele din speciile
mai vechi sunt acum clasificate n genul Debaryomyces.
P. guilliermondii este starea perfect a speciei Candida
guilliermondii. Anamorfa speciei P. membranaefaciens este Candida
valida. Speciile lui Pichia formeaz n mod caracteristic pelicule pe
mediile lichide i sunt importante n producerea unor alimente indigene n
diferite pri ale lumii.
Unele au fost gsite pe petele proaspt i pe crevei i cresc
frecvent n saramura de msline i altereaz murturile i varza murat.
9. Rhodotorula. Aceste levuri sunt anamorfe ale familiei
Basidiomycetes. Cele care produc teleospori sunt incluse n genul
Rhodosporidium. Se reproduc prin nmugurire multilateral i sunt
nefermentativi.
R. glutinis i R. mucilaginosa sunt speciile prevalente din alimente.
Ele produc pigmeni roz pn la rou, majoritatea fiind de culoare
portocalie sau roz. Se gsesc pe carnea proaspt de pui, crevete, pete i
vit i unele cresc pe suprafaa untului.
10. Saccharomyces. Aceste levuri ascosporogene se multiplic
prin nmugurire multilateral i produc spori sferici n asce. Sunt diploizi
i nu fermenteaz lactoza. Cele clasificate n trecut ca speciile S. bisporus
i S. rouxii sunt acum incluse n genul Zygosaccharomyces, iar specia S.
6
butur fermentat din lapte de iap
189
rosei este clasificat n prezent n genul Torulaspora. Toate levurile din
bere, pine, vin, ampanie sunt incluse n specia S. cerevisiae. Ele se
gsesc n granulele de kefir putnd fi izolate dintr-o gam larg de
alimente: salam uscat i fructe. S. cerevisiae produce rar alterri ale
alimentelor.
11. Schizosaccharomyces. Se divid prin fisiune lateral sau prin
formarea de perei transversali i pot produce hife adevrate i artrospori.
Ascele conin 4-8 spori n form de boabe i nu produc muguri. Sunt
considerate ca fiind rudele ndeprtate ale levurilor adevrate. S. pombe
este specia tip. Este osmofil i rezistent la unii conservani chimici.
12. Torulaspora. Se reproduc prin nmugurire multilateral, cu
formare de spori sferici cu asce. Trei specii haploide incluse n trecut n
genul Saccharomyces sunt azi incluse n acest gen. Ele sunt ageni
puternici de fermentare a zaharurilor i conin coenzima Q6. T. delbrueckii
este specia cea mai prevalent n alimente.
13. Trichosporon. Aceste levuri oxidative neformatoare de
ascospori se multiplic prin nmugurire i prin formarea de artroconidii.
Produc micelii adevrate, iar fermentarea zaharurilor este absent sau
slab. Sunt implicate n fermentaiile boabelor de cacao i idli i au fost
identificate n crevetele proaspt, carnea de vit, pui, miel congelat i alte
alimente.
14. Yarrowia. n trecut aparineau genului Saccharomycopsis. Fac
parte din ordinul Endomycetales i apar frecvent pe fructe, legume, carnea
de vit i pui. Candida lipolytica reprezint stadiul amamorf, iar Y.
lipolytica este stadiul teleomorf (perfect).
15. Zygosaccharomyces. Se reproduc prin nmugurire
multilateral, iar ascosporii n form de boabe sunt n general liberi n
asce. Majoritatea sunt haploide fiind ageni de fermentare puternici ai
zaharurilor.
Z. rouxii este specia tip i poate crete la un aw de 0,62, dup
Xeromyces bisporus cunoscut pentru abilitatea sa de a crete la un aw
sczut.
Unele specii sunt implicate n fermentarea shoyu i miso, iar altele
sunt ageni obinuii de alterare ai maionezei i garniturilor de salat, n
special Z. bailii, care poate crete la un pH de 1,8.
190
fungi dimorfi.
Levurile au celulele ovale sau sferice, nmugurite, i formeaz
colonii rotunde, bombate, lucioase, cremoase, fiind asemntoare cu
bacteriile.
Fungii filamentoi (mucegaiurile) formeaz hife (filamente
ramificate septate sau neseptate) ntreesute ntr-un miceliu care are dou
pri:
miceliul vegetativ, cu cretere submers n mediul de cultur de
unde absoarbe nutrienii;
miceliul aerian care crete erect la suprafaa mediului i formeaz
organele de fructificare care sunt formatoare de spori (conidii).
Fungii dimorfi cresc ca levuri n esuturile gazdei sau n culturi la
temperatura de 37C i au o cretere micelian n culturi la 22-30C sau n
sol.
Dup aspectul microscopic al hifelor, se deosebesc urmtoarele
forme de fungi:
fungi cu hife hialine, neseptate, groase, rsucite formate de
zigomicete;
fungi cu hife hialine septate i nepigmentate, cu variate i
numeroase organe de fructificare (uneori apar pigmentate);
fungi dematiacei, cu hife septate i pigmentate n brun.
191
segmente difereniate ale miceliului aerian.
conidiile sunt formate de levuri sau sunt purtate la extremitatea
unor conidiofori difereniai din miceliul aerian.
Conidiile formate de levuri sunt reprezentate de:
blastoconidii, care apar prin nmugurire la levuri sau la unii fungi
i poart cicatrice bazale la locul desprinderii de celula mam (de
exemplu: Cladosporium);
chlamidoconidiile apar prin creterea i rotunjirea unor celule de
la extremitatea hifelor (terminate) sau intercalare (sesile) (de exemplu:
Candida albicans);
artroconidiile se formeaz din celulele hifale care cresc i i
ngroa peretele (Geotrichum).
Conidioforii sunt segmente hifale specializate la extremitatea
crora se formeaz conidiile. Acestea pot fi mici i unicelulare
(microconidii) sau mari i multicelulare (macroconidii) purtate de
conidiofori bine difereniai.
La unii fungi extremitatea conidioforilor este ramificat n
segmente secundare numite fialide sau anelide.
Fialidele produc la apexul lor conidii acropetale (Penicillium).
Anelidele sunt celule conidiogene care prin cretere i strangulare,
formeaz un lan de conidii n secven baziseptal (Scopulariopsis).
192
relativ reduse (60-70%). Tot astfel unele specii de levuri se pot multiplica
n condiii de umiditate redus, n substraturi cu 50-60% glucoz.
pH-ul limitele pH-ului pentru iniierea creterii sunt cuprinse
ntre 2 pn la peste 9. n absena unui tampon puternic, majoritatea
acestor organisme pot modifica pH-ul ntr-unul care este mai favorabil
pentru creterea lor, de obicei la o valoare ntre 4 i 6,5.
oxigenul toate speciile de mucegaiuri sunt obligat aerobe, totui
unele specii au capacitatea s se dezvolte deasupra alimentelor din
conserve sau ntr-o atmosfer lipsit de oxigen prin procurarea acestuia de
la substratul nsui.
****
Fig. 8.1.
Reacia general a heterotrofelor i autotrofelor
193
alimentele netratate s conin un numr diferit de bacterii, mucegaiuri,
levuri i, deseori, se pune ntrebarea inocuitii unui anumit aliment pe
baza numrului total de germeni. ntrebrile care se pun intereseaz
numrul total de organsime prezente pe gram sau mililitru i respectiv
tipurile de microorganisme prezente n acest numr.
Este necesar cunoaterea microorganismelor asociate n mod
normal cu un anumit aliment ca produs neprelucrat i cea a
microorganismelor ce nu sunt normale pentru acel aliment. De aceea este
important cunoaterea distribuiei generale a microorganismelor n natur
i tipurile de organisme prezente n mod normal, n condiiile n care
alimentele se gsesc i sunt manipulate.
194
Capitolul 9
Virusuri cu importan n microbiologia alimentelor
Infeciile virale cu impact negativ asupra produselor alimentare de
origine animal sunt sistematizate n dou grupe mari:
- viroze transmisibile la om pe cale natural prin carne sau organe;
- viroze netransmisibile la om prin carne i organe, dar care pot
deprecia calitatea acestora.
Sistematizate sub cele mai variate forme, virusurile transmisibile
prin hran rmn o cauz obinuit, dar probabil nerecunoscut a
gastroenteritelor i pot sta, adesea, la originea unor episoade de
mbolnvire. Infecia uman poate fi rezultatul consumului de alimente
contaminate sau al transmiterii de la o persoan la alta prin contact direct
sau prin aerosoli. Alimentele pot fi contaminate de ctre persoanele ce o
manipuleaz, dac sunt infectate, sau n urma contactului cu apa sau alte
reziduuri contaminate. Cele mai frecvente focare de boal cu etiologie
viral declarate au fost asociate cu consumul de crustacee care au fost
colectate din vecintatea deversrilor de ape menajere contaminate. Dei
difuzarea bolilor virale prin alimente este greu de demonstrat, se pare c
cel mai mare risc al transmiterii lor se ntlnete n catering, unde
operaiunile de preparare a alimentelor neprelucrate termic sunt
numeroase.
Virusurile transmisibile prin alimente mai pot fi sistematizate i n
alte dou grupe principale:
- Virusuri Norwalk-like (NVL, cunoscute i sub denumirea de
virusuri mici rotunde sau SRSV) care determin gastroenterite;
- Virusul hepatitei A, care produce hepatit.
Alte tipuri de virusuri care pot fi ocazional implicate n mbolnviri
sunt astrovirusurile i rotavirusurile, dar transmiterea acestora prin
alimente este rar.
Pentru a se replica virusurile solicit o gazd, iar sursa de origine a
tuturor virusurilor transmisibile prin alimente este reprezentat de
intestinul uman. Ele nu se pot replica n alimente. Contaminarea
alimentelor poate avea loc pe parcursul preparrii i servirii lor de ctre
personalul contaminat sau prin contactul cu reziduurile menajere sau apa
contaminate. Cel mai adesea aceste infecii virale sunt asociate produselor
culinare preparate din diferite tipuri de molute bivalve (midii sau scoici
comestibile) recoltate de pe plaje contaminate cu gunoaie sau din
apropierea gurilor de evacuare a apelor menajere n mare sau ocean. Ariile
de colectare a crustaceelor sunt clasificate pe baza nivelului de
contaminare a crustaceelor cu bacterii prezente n fecale. Dac nivelul de
195
contaminare depete limitele legale pentru a fi consumate direct atunci,
pentru a putea fi comercializate, crustaceele trebuie reimersate n ap
curat, supuse unui tratament termic corespunztor sau supuse unui proces
de purificare (epurare). Aceste crustacee sunt adevrate filtre marine ce
pot concentra cantiti mari de virus din mediul acvatic nconjurtor.
Molutele sunt consumate fie n stare crud fie dup o prelucrare termic
uoar, ce nu poate inactiva n totalitate particulele virale prezente. n plus
purificarea nu poate garanta nlturarea virusurilor, iar episoade de
gastroenterite virale au fost atribuite crustaceelor supuse unui asemenea
tratament. Cultivarea molutelor bivalve n ap curat este deci cea mai
bun modalitate de control a infeciilor virale. Deci, dei molutele sunt n
mod evident considerate o surs de infecie n cazul bolilor virale
transmisibile prin alimente, ele nu sunt cea mai important cauz a
mbolnvirilor.
Legumele i fructele pot fi surse secundare de infecie, constituind
un suport de vehiculare a virusurilor patogene pentru om atunci cnd au
fost fertilizate sau irigate cu gunoaie menajere ori ap contaminate. De
altfel, n ghidurile publicate de WHO (Organizaia Mondial a Sntii)
se statueaz c acele fructe i legume care se consum crude nu trebuie
fertilizate cu gunoaie menajere sau irigate cu ap contaminat. O parte din
cazurile de hepatit A sunt rezultatul contaminrii prin fructe.
Consumul apei i gheii contaminate sau utilizarea acestora la
prepararea mncrii poate fi de asemenea o alt cauz a infeciilor virale.
Contaminarea mncrii de ctre operatori este probabil cea mai
comun cauz a bolilor virale transmise prin alimente. Anumite sortimente
de mncare, cum ar fi salatele sau platourile de desert, solicit o
manipulare manual considerabil n timpul pregtirii i nu sunt supuse
unor tratamente termice nainte de a fi consumate, motiv pentru care sunt
frecvent implicate n mbolnvirile virale transmise prin alimente.
n practica uzual de laborator nu este posibil detecia virusurilor
din hran deoarece acestea au nevoie de o gazd vie pentru a se replica. n
plus, nivelul particulelor virale n hrana contaminat este uzual foarte
redus. Exist laboratoare de specialitate capabile s utilizeze culturile
celulare i alte metode complexe de extragere i identificare a virusurilor,
dar aceste metode nu pot fi implementate n laboratoarele uzinale ce
apeleaz la metode uzuale i expeditive de diagnostic.
Utilizarea tehnicii PCR (Polymerase Chain Reaction) n detecia
NLV din alimentele implicate n focare de boal a fost deja dezvoltat, dar
este nc n faza de perfecionare ntruct nu este nc posibil detectarea
tuturor tulpinilor virale.
Metoda curent de detecie a NLV din fecale este microscopia
electronic (ME). Pentru a fi posibil identificarea este necesar o
196
concentraie de cel puin un milion particule virale per gram de fecale i
numai probele de fecale obinute n primele 48 de ore de la debutul bolii se
preteaz la examinarea pentru NLV. Tehnica PCR de identificare a NDV
din fecale i vom este mult mai sensibil dect ME, putndu-se utiliza
probe prelevate i la 7 zile de la debutul simptomatologiei.
Identificarea virusului hepatitei A din fecale prin ME uzual nu este
posibil deoarece apariia icterului este cu mult dup ce peak-ul excreiei
particulelor virale a trecut, motiv pentru care diagnosticul se bazeaz pe
identificarea restructurrilor imunologice ale organismului afectat
(identificare IgM, IgG) din serul sanguin sau saliv.
Virusurile transmisibile prin alimente sunt rezistente i pot
supravieui perioade lungi de timp n alimente sau n mediul unde se
manipuleaz alimentele. Acestea sunt foarte rezistente la congelare,
refrigerare, conservani i radiaii ionizante. Virusul hepatitei A este
distrus rapid prin nclzire la peste 85C i la fel ca NLV este inactivat la
aceast temperatur. Inactivarea virusurilor are loc la temperaturi de peste
60C la o rat proporional cu temperatura, dar i cu a compoziiei
mediului n care se gsesc aceste virusuri. Acestea supravieuiesc la pH-ul
acid (pH 3), gsindu-se n fructele acide cum sunt cpunile i zmeura i n
unele procese cum sunt murarea n oet sau obinerea iaurtului. Aceste
virusuri sunt rezistente i la alcool i concentraii ridicate de zahr.
Persoanele implicate n manipularea sau prepararea produselor
alimentare cu manifestri gastroenterice exprimate prin vom sau diaree
trebuie excluse obligatoriu de la aceste activiti. Ele nu trebuie s revin
la munc mai devreme de 2 zile de la data remiterii semnelor clinice.
Contaminarea alimentelor cu NLV de ctre aceste persoane se realizeaz
foarte uor datorit cantitii foarte mari de particule virale prezente n
fecalele i voma de la debutul simptomatologiei i a rezistenei crescute n
mediul nconjurtor. Infectarea personalului se poate realiza i prin
inhalarea de aerosoli, nu doar prin ingestie. O cale frecvent de
transmitere este aceea a minilor murdare, de aceea echipamentele de
igienizare a minilor nu trebuie s lipseasc din grupurile sanitare ale
unitilor din industria alimentar. Dac vomitarea s-a produs n buctrie
sau pe linia de producie a unei uniti alimentare trebuie implementat un
program strict de decontaminare viral a mediului. Cea mai bun metod
este utilizarea apei calde cu detergent urmat de o dezinfecie cu un produs
pe baz de clor la o concentraie de 500 ppm clor activ. Alimentele care au
fost expuse la contaminarea prin aerosoli sau care au fost manipulate de
persoana bolnav trebuie distruse n timpul cel mai scurt dac nu este
posibil tratarea lor la o temperatur medie de cel puin 85C dup
expunere.
Pentru a preveni transmiterea virusurilor gastroenterice prin
197
crustacee acestea se recomand a fi cultivate n ap curat deoarece
procesul de epurare nu constituie metoda cea mai sigur de eliminare a
virusurilor. Pentru a distruge virusurile din molute tratamentul termic al
acestora trebuie s garanteze atingerea unei valori de temperatur n
interiorul cochiliei de 85 90C pentru o perioad de cel puin 90 de
secunde, dar este necesar un control strict al procesului de manipulare pe
fluxul tehnologic (evitarea ncrucirii timpilor operatori) i evitarea
manipulrii crnii cu mna. Consumarea de molute crude cum ar fi
midiile rmne un risc, la fel ca i cel al contaminrii ncruciate n
buctrie de la crustacee la alte alimente.
Contaminarea alimentelor, altele dect crustaceele, se ntlnete de
obicei la suprafaa acestora, iar la acest nivel virusurile se distrug uor prin
tratament termic. Procesarea termic uzual practicat n industria
alimentar presupune nclzirea la o temperatur medie de 70C timp de 2
minute. Aceasta reduce substanial nivelul contaminrii virale, dar nu
distruge toate virusurile dac nivelul contaminrii a fost foarte ridicat.
Prevenirea mbolnvirilor virale prin intermediul alimentelor
depinde n mare msur de educarea personalului i de nivelul de
contientizare a acestui risc n industria alimentar.
198
Capitolul 10
Prionii i importana lor n microbiologia alimentelor
Prionii (En. Proteinaceus infectious particles = particule proteice
infecioase) sunt definite ca izoforma patologic a unei structuri proteice
normale codificate de organismele gazd. Noiunea de prion a fost folosit
prima oar de Prusiner, cel care a studiat pe larg aceast infecie la ovine
(scrapia). Aceste entiti infecioase au cunoscut de-a lungul timpului
numeroase denumiri, cum sunt viroze neconvenionale, viroze lente,
amiloidoze transmisibile sau encefalopatii spongiforme subacute. n
medicina actual bolile produse de aceste entiti infecioase
neconvenionale sunt cunoscute ca encefalopatii spongiforme transmisibile
(EST), iar conceptul de prion rmne o problem controversat, ntruct
acetia nu au acizi nucleici (entiti infecioase lipsite de ADN sau ARN).
Declanarea EST const n conversia unei proteine existent normal n
esutul nervos al mamiferelor - PrPc - ntr-o protein mutant - PrPSc -
responsabil de exprimarea clinico-lezional a bolii. n urma contactului
cu prionii exogeni, proteina PrPc se transform n copii infecioase ce vor
fi depozitate la suprafaa celulei, sub form de plci amiloide, sau
intracelular, sub form de fibrile prionice. PrPc i PrPSc au aceeai
secven de aminoacizi, dar structura spaial diferit, proteina normal
avnd mai multe regiuni -helix, iar cea infecioas mai multe regiuni -
helix pliate.
Teoria naturii proteice a
prionilor este susinut i de
efectul sau lipsa efectului unor
substane asupra acestora. Prionii
nu sunt distrui de o serie de
substane chimice sau metode
tratamente fizice cunoscute ca
degradante pentru acizii deoxiribo-
i ribonuceici.
a. b. Dei foarte rare, noua
Fig. 2.25. Structura spaial a form a bolii Creutzfeld-Jakob
proteinei prionice normale (NVCJD), sindromul Alpers, boala
PrPc (a.) i anormale PrPSc (b.) Kuru i alte EST umane rmn
boli incurabile. Numeroasele
necunoscute etiologice i patogenetice au ridicat mari semne de ntrebare
referitoare la transmiterea infeciilor prionice de la animale la om prin
alimente sau produse biotehnologice. Pentru microbiologia alimentar
prezint un interes special prionii rumegtoarelor. Cu toate c nu exist
199
dovezi ale transmiterii scrapiei (EST ovin) la om, n legislaia Uniunii
Europene se stipuleaz c splina rumegtoarelor mici (oi, capre) provenind
la indivizi de orice vrst i capul (inclusiv creierul, globii oculari,
amigdalele) i mduva spinrii provenind de la animalele mai mari de un
an constituie materiale cu risc EST, acestea fiind excluse din alimentaia
public i din furajarea animalelor, fiind distruse. Fa de encefalopatia
spongiform bovin msurile de prevenire a transmiterii prionilor de la
bovine la om au fost luate n Marea Britanie nc din 1988 i ulterior au
fost reglementate i de Uniunea European i Organizaia Mondial a
Sntii Animale. Interzicerea folosiri n alimentaia uman a unor organe
provenind de la bovine sntoase a fost instituit n Marea Britanie nainte
de a fi semnalate primele cazuri de NVCJD. La bovinele din Marea
Britanie i alte state cu inciden ridicat, aceste organe definite ca
materiale cu risc specific sunt, la fel ca i la ovine, reprezentate de capul
n totalitate, ce conine creierul, globii oculari, ganglionii trigemeni,
amigdalele, dar fr limb (considerat organ separat), mduva spinrii,
amigdale, timus, splin, masa intestinal, de la bovinele mai mari de 6
luni. La bovinelor cu vrsta mai mare de 30 luni se confisc i ganglionii
rdcinilor dorsale ale nervilor rahidieni. Se consider c NVCJD a fost
contactat prin consumul crnii i al produselor din carne provenite de la
vaci cu ESB.
200
Capitolul 11
Principalele caractere difereniale ntre bacterii,
virusuri i ciuperci microscopice
Tabelul 11.1
Ciuperci
Caracterul diferenial Virusuri Bacterii
microscopice
Numarul tipurilor de
1 2 3
acid nucleic
Tipul de organizare acelular procariot eucariot
un singur
Organizarea mai muli
genom viral cromozom i
materialului genetic cromozomi
plasmide
Echipament enzimatic
i activitatea absente prezente prezente
metabolica proprie
Capacitatea de cretere absent prezent prezent
independent, mai independent, prin
sunt sintetizate de
Mod de reproducere ales prin forme variate
celula gazd
sciziparitate asexuate i sexuate
Capacitatea de
nu este cazul absent prezent
difereniere celular
constant,
Parazitism absolut absent absent
obligatoriu
- virion infecios
(temporar
extracelular)
- celula vegetativ
- virus vegetativ - miceliu sau
(capabil de
Forme biologice de intracelular n pseudomiceliu (tal)
diviziune)
existen n natur curs de sintez - spor (forma de
- spor (forma
- virus integrat reproducere)
de conservare)
fixat n
cromozomul
celulei gazd)
organisme vii cu
organisme vii cu
Poziia pe scara la grania ntre diverse grade de
organizare simpl
filogenetic viu i neviu complexitate
(protiste)
morfofiziologic
201
Capitolul 12
Sursele principale de microorganisme prezente n
alimente i controlul lor
12.1. Solul i apa
202
pe suprafaa carcaselor nou obinute presupune curarea de cheaguri de
snge sau impuriti mecanice, fasonarea carcasei (nlturarea suprafeelor
anfractuoase unde se pot dezvolta microorganisme) i splarea cu jet de
ap sub presiune. Utilizarea echipamentelor corespunztoare (perii-du
speciale din cauciuc) i a procedurilor de curare optime (jet de ap sub
presiune aplicat oblic) asigur reducerea cu peste 90% a numrul total de
germeni de pe suprafaa carcasei. Utilizarea apei sub presiune asigur o
mbibare mai redus a carcasei cu ap dect la splarea cu furtunul,
pelicula uscat de la suprafaa acesteia realizndu-se mai repede. Este
interzis splarea carcasei sau a subproduselor comestibile n bazine din
care apa nu se scurge continuu. Dup 4-6 ore de zvntare la rece (10oC) la
suprafaa carcaselor se formeaz o pelicul uscat ce va preveni
contaminrile ulterioare.
Pentru aprovizionarea cu ap a obiectivelor din domeniul alimentar
trebuie s existe o surs de ap potabil, care se utilizeaz ori de cte ori se
impune evitarea contaminrii alimentelor. Apa curat poate fi utilizat
pentru produsele din pescuit ntregi sau pentru alte tipuri de splare
extern. Ap de mare curat poate fi utilizat pentru molute bivalve vii,
echinoderme, tunicate i gasteropode marine.
Atunci cnd n unitile alimentare este utilizat apa nepotabil,
pentru incendii, producerea de aburi, refrigerare sau alte scopuri similare,
aceasta trebuie circulat printr-un sistem separat, bine identificat. Apa
nepotabil nu trebuie s aib conexiuni cu sau s permit refluxul n
sistemele de ap potabil. Apa reciclat utilizat pentru prelucrare sau ca
ingredient nu trebuie s prezinte nici un risc de contaminare. Aceasta
trebuie s fie de acelai standard ca apa potabil. Gheaa ce vine n contact
cu alimentele sau care poate contamina alimentele trebuie s fie produs
din ap potabil sau, atunci cnd este utilizat pentru rcirea produselor
din pescuit ntregi, din ap curat. Aceasta trebuie s fie produs,
manipulat i depozitat n condiii care s o protejeze de contaminare.
Aburul utilizat n contact direct cu alimentele nu trebuie s conin nici o
substan ce reprezint un pericol pentru sntate sau care are potenialul
s contamineze alimentele.
Atunci cnd alimentelor le este aplicat un tratament termic n
containere sigilate ermetic, trebuie s se asigure ca apa utilizat pentru
rcirea containerelor dup tratamentul termic s nu constituie o surs de
contaminare pentru alimente.
203
mic gsesc aici mediul adecvat bunstrii lor generale. Cele care persist
pe produsele vegetale datoreaz aceasta capacitii lor de a adera la
suprafaa plantelor, astfel nct s nu se ndeparteze uor prin splare,
precum i faptului c sunt capabile s beneficieze de cerinele lor
nutriionale. Dintre acestea trebuie menionate bacteriile acidolactice i
unele levuri. Bacteriile patogene pentru plante fac parte din genurile
Corynebacterium, Curtobacterium, Pectobacterium, Pseudomonas i
Xanthomonas. Agenii patogeni fungici se gsesc printre diferite genuri de
mucegaiuri.
Invariabil microbii se asociaz benefic, uneori esenial, cu toate
formele de organisme superioare din care nu sunt excluse plantele. n
lumea plantelor, leguminoasele (mazrea, fasolea, lucerna) triesc n
strns asociere cu bacterii care extrag azotul din atmosfer i ajut
plantele s creasc.
Operatorii cu activitate n domeniul alimentar care produc sau
recolteaz produse vegetale trebuie s menin curate i s dezinfecteze
facilitile, echipamentul, containerele, lzile, vehiculele i vasele. Acetia
trebuie s asigure condiii igienice de producie, transport i depozitare a
produselor vegetale. Pentru a preveni contaminarea plantelor i produselor
vegetale trebuie utilizat numai ap potabil sau ap curat, trebuie evitat
contactul acestora cu animalele sau ali duntori, iar personalul care
manipuleaz asemenea produse alimentare s fie sntos i instruit cu
privire la riscurile pentru sntatea public. Depozitarea i manipularea
deeurilor i substanelor periculoase trebuie fcut de o manier care s
previn contaminarea produselor vegetale. De asemenea operatorii cu
activitate n dimeniul alimentar care produc sau recolteaz produse
vegetale trebuie s in cont de rezultatele oricror analize relevante
efectuate pe probe prelevate de la plante sau pe alte probe ce au
importan pentru sntatea public i s utilizeze corect produsele pentru
protecia plantelor i biocidele.
204
Atunci cnd se recolteaz legumele cu ajutorul ustensilor de
recoltare, microorganismele de suprafa contamineaz suprafeele de
contact. De asemenea secionarea unui bloc de carne ntr-o pia mpreun
cu folosirea de cuite i maini de tocat provoac un nivel aproape constant
de contaminare cu microorganisme prin acumularea unui numr din ce n
ce mai mare de bacterii.
Prevenirea contaminrii alimentelor de ctre ustensilele cu care
sunt manipulate presupune instituirea unui program de igienizare a
spaiilor, cu identificarea punctelor critice de control unde contaminarea
sau dezvoltarea microorganismelor ar fi posibil.
Evitarea contaminrii carcaselor prin intermediul cuitelor,
masatelor sau fierstraielor utilizate de mcelari la tranare se realizeaz
cu ajutorul sterilizatoarelor cu ap nclzit la circa 85-90oC. Prezena
acestor sterilizatoare n punctele de lucru este obligatorie, iar utilizarea
acestora se face dup tranarea fiecrui animal sau ori de cte ori este
nevoie.
Pentru ca alimentele s fie protejate mpotriva contaminrii
mijloacele de transport i/sau containerele utilizate pentru transportul
acestora trebuie s fie meninute curate i n stare bun de ntreinere i
funcionare i, dup caz, s fie concepute i construite astfel nct
igienizarea i dezinfecia s fie posibil. Recipientele destinate produselor
alimentare nu ar trebui utilizate pentru transportul produselor non-
alimentare. Atunci cnd acestea sunt utilizate i pentru transportul altor
materiale dect produse alimentare sau pentru transportul simultan al unor
produse alimentare diferite, trebuie s existe o separare efectiv a
produselor.
Materialul utilizat pentru ambalare i mpachetare nu trebuie s
reprezinte o surs de contaminare, acestea depozitndu-se de aa manier
nct acestea s nu fie expuse la un risc de contaminare. Ambalarea i
mpachetarea trebuie efectuate ntr-o manier care evit contaminarea
produselor alimentare. Dup caz i n special n cazul recipientelor i al
vaselor de sticl, trebuie s fie asigurate integritatea containerului i igiena
acestuia. Materialul de ambalare i de mpachetare reutilizat pentru
produse alimentare trebuie s fie uor de igienizat i dezinfectat.
Produsele alimentare n stare lichid, granulate sau sub form de
pudr, n vrac, trebuie transportate n recipiente, containere sau tancuri
destinate exclusiv acestora. De aceea aceste containere se marcheaz n
mod vizibil cu litere ce nu pot fi terse, n una sau mai multe limbi de
circulaie internaional, pentru a se scoate n eviden c acestea sunt
utilizate exclusiv pentru transportul de produse alimentare, sau trebuie s
fie marcate cu inscripia numai pentru produse alimentare. Dac
mijloacele de transport (containerele) au fost utilizate la transportul
205
produselor non-alimentare sau al altor sortimente alimentare este
obligatorie igienizarea prealabil pentru a se evita contaminarea
ncruciat.
n vederea evitrii deprecierii produselor alimentare perisabile,
mijloacele de transport sau containerele de transport trebuie dotate cu
echipamente de meninere a alimentelor la temperaturi corespunztoare i
s permit monitorizarea acestei temperaturi.
206
igien a alimentelor, proporional cu activitatea desfurat, i c cei
responsabili pentru elaborarea i meninerea procedurii de lucru sau pentru
punerea n aplicare a ghidurilor aferente au primit instruirea
corespunztoare n aplicarea principiilor HACCP.
207
Indiferent de forma n care microorgansimele se gsesc n aer
acestea pot determina mbolnviri la animale i om consecutiv inhalrii
sau ingerrii dac au sedimentat pe produsele alimentare.
Evaluarea presiunii infecioase din atmosfer confer un indiciu
orientativ asupra riscului de transmitere a unor boli infecioase prin
contact sau prin inhalare. Cele mai frecvente metode utilizate pentru
aceasta sunt determinarea numrului total de germeni la 37oC, streptococii
hemolitici i viridans, stafilococii i colibacilii. Dei majoritatea
microorganismelor pot fi gsite la un moment dat n aer sau praf, n cursul
unui proces de prelucrare a alimentelor cele care persist sunt majoritar
bacterii Gram pozitive. Dintre fungi este de ateptat ca o serie de
mucegaiuri s apar n aer i praf mpreun cu unele levuri. Dominanta
microbian variaz funcie de sezon, constatndu-se preponderena
bacterian n sezoanele de primvar i var i dominana ciupercilor
toamna i iarna.
Cunoaterea detaliilor de formare i meninere n aer i praf a
microorganismelor permite elaborarea unor strategii de prevenire i
control eficiente. Astfel, ar fi de preferat ca unitile alimentare s
utilizeze sisteme de ventilaie cu filtre care s reduc numrul de germeni
prezeni n aerul din afara incintei de lucru la introducerea lui n halele de
producie, iar ventilaia natural s fie utilizat doar n spaiile care nu sunt
destinate preparrii produselor alimentare.
Tabel 12.1.
Genuri microbiene ce pot fi ntlnite n alimente
Bacterii
Acinetobacter Corynebacterium Leuconostoc Salmonella
Aeromonas Enterobacter Listeria Serratia
Alcaligenes Enterococcus Micrococcus Shewanella
Arcobacter Erwinia Moraxella Shigella
Bacillus Escherichia Paenibacillus Staphylococcus
Brochothrix Flavobacterium Pantoea Vagococcus
Campylobacter Hafnia Pediococcus Vibrio
Carnobacterium Kocuria Proteus Weissella
Citrobacter Lactobacillus Pseudomonas Yersinia
Clostridium Lactococcus Psychrobacter
Mucegaiuri
Alternaria Byssochlamys Geotrichum Rhizopus
Aspergillus Cladosporium Monilia Trichothecium
Aureobasidium Colletotrichum Mucor Wallemia
Botrytis Fusarium Penicillium Xeromyces
Drojdii
Brettanomyces Candida Cryptococcus Saccharomyces
Issatchenkia Kluyveromyces Pichia Rhodotorula
Schizosaccharo Torulaspora Debaryomyces Zygosaccharomyces
myces Hanseniaspora
208
Protozoare
Cryptosporidium Cyclospora Entamoeba
Toxoplasma gondii
parvum cayetanensis histolytica
Giardia lamblia
209
Capitolul 13
Tipuri de fermentaii utilizate n
industria alimentar
210
variatelor microorganisme implicate n procesul fermentativ.
Cu toate c oamenii au utilizat mii de ani fermentaiile, biochimia ce
guverneaz aceste procese metabolice a fost n mare parte lmurit abia n
ultima sut de ani. Bagajul informaional necesar controlrii i optimizrii
fermentaiilor a fost achiziionat prin cercetri experimentale ce au
presupus numeroase ncercri soldate destul de des cu eecuri. Prin
stpnirea proceselor fermentative a fost posibil obinerea unor
sortimente variate de pine, iaurt, brnzeturi, bere sau vin.
211
dup tratarea cu sulfit de sodiu. Pentru a se obine acidul lactic, lactatul de
calciu este tratat cu acid sulfuric i purificat. n urma fermentaiei lactice
se obine, teoretic, un gram de acid lactic dintr-un gram de zahar
fermentescibil.
n funcie de agentul de fermentaie, temperatur sau compoziia
mediului acidul lactic obinut poate fi dextrogir, levogir sau racemic.
Glicoliza prin calea Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP) este cea mai
uzual suit de reacii de oxidare a glucozei n piruvat i multe bacterii,
animale i plante utilizeaz aceast cale glicolitic n metabolismul lor.
EMP este o parte esenial a catabolismului multor organisme. Cu toate
acestea, nu este singura metod de fermentare a glucozei. Trebuie reinut
c bacteriile sunt deosebit de creative i este posibil existena unor ci
metabolice diferite la specii diferite. EMP poate fi mprit n trei etape
mari: activarea glucozei, clivarea hexozei i extragerea energiei.
Glucoza este o molecul relativ stabil i pentru degradare aceasta
trebuie mai nti destabilizat prin adugarea de compui fosfai cu
potenial energetic nalt. n prim faz o grupare fosfat este donat de ctre
ATP (sau de ctre fosfoenolpiruvat sursa de fosfat este dependent de
specia de microb) moleculei de glucoz pentru a forma glucozo-6-fosfatul.
Molecula este izomerizat la fructozo-6-fosfat (un alt zahar) i se adaug o
a doua grupare fosfat. Fructozo-1,6-bifosfatul este mai uor de atacat
dect glucoza i este pregtit pentru a fi clivat.
212
Fructozo-1,6-difosfat
Acid 1,3-difosfogliceric
213
Fig. 13.4. Obinerea lactatului de ctre bacterile homofermentative. Calea de producere
utilizat este identic cu a glicolizei, iar produsul final este lactatul.
214
Fig. 13.6. Ciclul EMP modificat de transformare a glucozei n alcid lactic cu ajutorul lui
Lactobacillus i Streptococcus n condiii de aerobioz sau anaerobioz
215
mai rapid a vinului de pe drojdie, sulfitarea mustului, diluarea mustului,
suplimentarea concentraiei de zaharuri etc.
Transformarea acidului malic n acid lactic i dioxid de carbon se
realizeaz printr-o succesiune de reacii prin care, sub aciunea enzimei
malat-dehidrogeneza, n prezena difosfopiridinnucleotidei (DPN) i a
ionilor de Mg2+, din acid maleic se obine acid oxal-acetic. Din acidul
oxal-acetic sub aciunea enzimei oxal-acetat decarboxilaza se obine acid
piruvic, iar acesta este redus de lactatdehidrogenaz n acid lactic i dioxid
de carbon.
216
suporte concentraiile mari de zahr i astfel s determine fermentarea
alcoolic a acestora, situaie ntlnit la fermentarea mierii sau a
siropurilor cu concentraii ridicate de zahr. De asemenea i alte
microorganisme cum sunt unele bacterii (Bacillus macerans, B. gracile, B.
etilicus) sau mucegaiuri (Amylomyces rouxii, Mucor eumycetes, Mucor
racemosus, Rhizopus orizae, Dematium pullulans, Aspergillus orizae,
Penicillium glaucum) sunt capabile s produc prin fermentaie alcool
etilic.
Mecanismul degradrii hidrailor de carbon cu transformarea lor n
alcool etilic reunete mai multe reacii enzimative derulate n prezena i
cu ajutorul adenozin i tiamin fosfailor, coenzimei A, vitaminelor B1, B2,
B5, B6, PP precum i a altor componente eseniale, la care se adaug
factorii implicai n metabolism, dintre care mai importani sunt:
temperatura (se impune cunoaterea valorii optime de cretere a fiecrei
drojdii n parte), pH-ul (3,5-4,7), presiunea osmotic (<60 kgf/cm2),
potenialul redox, concentraia de alcool rezultat (la 18% se inhib
dezvoltarea drojdiilor superioare, iar la 4-5% cea a drojdiilor inferioare),
inhibitorii i activatorii micoorganismelor care efectueaz fermentaia
alcoolic (oxigenul, dioxidul de carbon, antisepticele, microelementele
minerale).
Enzime de baz implicate n principalele reacii ale acestei
fermentaii sunt:
- n reaciile de fosforilare si formare a trizofosfatilor: hexokinaza,
fosfoglucoizomeraza, fosfofructokinaza, aldolaza;
- n reaciile de dehidrogenare a aldehidei fosfoglicerice:
glicerofosfatdehidrogenaza i fosfogliceratkinaza;
- n reaciile de formare a acidului piruvic: glicerofosfatmutaza,
enolaza;
- n reaciile de formare a alcoolului etilic: alcooldehidrogenaza.
Una din cele mai familiare fermentaii este conversia glucozei n
alcool etilic pentru obinerea buturilor alcoolice. Dup formarea
piruvatului, alcoolul etilic este obinut prin dou reacii simple. n prima
faz CO2 este extras din piruvat pentru a forma aldehida acetic, apoi
aldehida acetic este redus cu NADH pentru a forma alcoolul etilic.
Cile fermentative ale glicolizei EMP la piruvat sunt identice att
la bacteriile lactice (Lactobacillus) ct i la drojdii (Saccharomyces),
diferena ntre aceste dou ci fiind maniera n care are loc reducerea
acidului piruvic cu obinerea de produi diferii.
217
Acid piruvic Aldehida acetic Alcool etilic
Fig. 13.8. Oxidarea lui NADH. Aldehida acetic este redus la alcool etilic (substana
activ n fabricile de alcool). Aceasta este ultima etap a fermentaia cu drojdii a glucozei
n etanol.
218
13.5. Fermentaia butiric
219
pasteurianum) i vin (A. ascendens, A. teurianum), iar altele sunt folosite
ca bacterii acetice industriale (Bacterium acetigenum). Majoritatea
bacteriilor acetice sunt mezofile (19 36oC), iar producia de acid acetic
poate atinge i concentraia de 11% (Bacterium schutzenbachii).
Identificarea caracteristicilor bacteriilor acetice i a condiiilor
necesare derulrii fermentatiei acetice a determinat controlul acesteia i n
mod firesc stabilirea strategiilor de prevenire i combatere a oetirii
vinului. Totui, utilitatea fermentaiei acetice este dominat de obinerea
oetului, un produs alimentar destinat marinrii unor produse culinare sau
conservrii fructelor i legumelor. Tot unei fermentaii acetice sunt supuse
i boabele de cacao pentru a se obine aroma i alte caracteristici specifice.
Condiiile necesare derulrii fermentaiei acetice a vinului (oetirea
vinului) sunt: volum alcool <12%, aciditate volatil la vinurile albe >1,4
g/l i la vinurile roii >1,7 g/l, oxigenare, temperatura n limitele 19
38oC. Oetirea vinului trebuie prevenit prin tratamente antiseptice (acid
sulfuros liber) ntruct odat contaminat vinul, nu mai exista remediu
curativ. O alt msur profilactic este prevenirea dezvoltrii coloniilor de
Drosophyla melanogaster (musculia oetului), care este considerat
vector al bacteriilor acetice.
Producerea acidului lactic de ctre bacteriile lactice este o
consecin a creterii lor anaerobe. Electronii, absorbii de ctre NAD+ n
timpul glicolizei sunt pui la dispoziie prin reducerea piruvatului care
consecutiv este convertit n acid lactic. Dac n loc de piruvat este furnizat
un alt donator de electroni, piruvatul este liber s fie utilizat n alte scopuri
metabolice. O cale posibil este decarboxilarea, printr-una din cele cteva
ci posibile, pentru a forma acidul acetic cu producerea concomitent de
ATP. Acidul acetic poate fi de asemenea obinut prin oxidarea direct a
acidului lactic.
Una din cile posibile de producere ale acidului acetic este cu
ajutorul lui Lactobacillus plantarum. n condiii de limitare a glucozei
producia de celule bacteriene de L. plantarum este crescut prin condiii
aerobe, dar rata de cretere nu este modificat. La niveluri mari de
glucoz, imaginea este puin mai complicat, i numeroase studii au artat
c rata creterii este ntrziat de oxigen (Archibald & Fridovich, 1981,
Murphy & Condon, 1984b, Tseng & Montville, 1992). Aceast inhibare a
creterii se ntlnete naintea creterii produciei de H2O2, iar aceasta
reprezint probabil efectul direct al toxitii oxigenului. Totui, chiar la
concentraii mari de glucoz, creterea celulelor bacteriene este nc mare
n condiii aerobe, i o cretere mare a celulelor bacteriene n condiii
aerobe s-a observat c este asociat cu o cretere n producia de acetat
(Sedewitz et al., 1984b). Aceste observaii sunt n concordan cu ipoteza
c acetatul i ATP-ul sunt generate din piruvat. Acidul lactic poate servi
220
de asemenea ca o surs de energie n condiii de anaerobioz. Murphy et
al. (1985) au observat c la adugarea de acid lactic n culturile de
L. plantarum n absena altor surse de energie este posibil dezvoltarea
modest n condiii de aerobioz, dar nu i n condiii anaerobe. Aceast
imagine este ntructva confuz deoarece n cercetrile acestora se obin 4
moli de acetat din fiecare mol de lactat furnizat o discrepan ciudat ce
nu a mai fost comunicat (ntr-un alt experiment (Murphy & Condon,
1984b) utilizndu-se glucoz, s-au obinut 1,3 moli acetat din 1 mol
glucoz un rezultat mult mai apropiat de ateptri).
222
Reaciile chimice derulate n cadrul acestei fermentaii urmresc
oxidarea alcoolului etilic, cu formarea unor produi intermediari (aldehida
acetic activat i aldehida acetic hidratat) din care va rezulta n final
acidul acetic.
223
atinge 50% la utilizarea culturilor de Citromyces pfefferianicus.
n producerea acidului citric pot fi utilizate ca surs de carbohidrai
melasa de sfecl sau de trestie de zahr, sucroza, glucoza comercial,
hidrolizate de amidon etc. Dintre acestea sucroza i melasa pare a fi cele
mai bune surse. Pentru producerea acidului citric materia prim este
diluat pn se atinge o concentraie de 25% zahr i se amestec cu o
surs de azot i alte sruri. Dac se utilizeaz melas, pH-ul mediului
trebuie meninut n jurul valorii de 5, iar dac se utilizeaz sucroz nivelul
pH-ului trebuie s fie ceva mai mic, n jurul valorii de 3. Producerea
acidului citric cu A. niger este puternic influenat de concentraia
reziduurilor de metale cum ar fi fierul, magneziul, cuprul i zincul din
mediu. O concentraie corespunztoare a acestor elemente este esenial
pentru obinerea unei bune producii de acid citric, att absena ct i
excesul nefiind benefice. Pentru optimizarea nivelului acestor
microelemente materia prim este supus unor tratamente cu ferocianuri,
crbune, ageni de chelatare sau rezine. S-a observat c prin adugarea de
metanol la o concentraie de 3-4% se schimb randamentul produciei de
acid citric. Aceast fermentaie este o fermentaie aerob i, n consecin,
aerarea corespunztoare a mediului este esenial pentru succesul
produciei de acid citric.
n ultimii ani, producia de acid citric cu ajutorul drojdiilor a
crescut n importan prin descoperirea faptului c o varietate de drojdii
cum ar fi Candida i Hansenula produc acid citric din carbohidrai i
hidrocarbonai. Au fost semnalate tulpini de Candida lipolytica care par a
fi bune productoare de acid citric utiliznd materii prime din cele mai
variate. Mecanismul prin care fiecare din aceste drojdii produc acid citric
pare s fie uor diferit de mecanismul prin care acesta este produs de ctre
fungi. Dup ce este finalizat fermentaia se precipit citratul de calciu
existent n bulionul de fermentaie prin adugarea de hidroxid de calciu.
Este filtrat, splat i tratat cu acid sulfuric pentru a precipita sulfatul de
calciu. Soluia coninnd acid citric este apoi purificat prin tratarea cu
rezine sau crbune i n final cristalizat.
Acidul citric este utilizat n industria alimentar, textil i
farmaceutic. Este folosit de asemenea din ce n ce mai mult pentru
extragerea gazelor toxice i corozive din aer. Creterea posibilitilor de
utilizare ale acestui acid organic a dus implicit la creterea cererii lui.
Pe lng fungi i drojdii, posibilitile utilizrii bacteriilor n
producerea acidului citric sunt de asemenea exploatate.
224
sub aciunea diverselor ciuperci i bacterii, prin care este degradat
substratul (glucidele, glicerina, peptonele, acidul citric, acidul succinic,
acidul malic, acidul tartric, acidul acetic, alcooli etc.) pn la acid oxalic.
Totui, substratul preferat pentru obinerea acidului oxalic prin fermentaie
este zahrul, compus care sub aciunea mucegaiului Sterigmatocytis nigra
furnizeaz acid oxalic n cantitate mare, dac fermentaia are loc n
prezena srurilor de fier. Aceste sruri sunt indispensabile ntruct
absena fierului face ca fermentaia oxalic s devin citric. De asemenea,
cantitatea mare de acid oxalic poate fi produs numai dac aceasta este
neutralizat cu substane alcaline introduse n mediul de cultur al
microorganismelor utilizate.
225
lor n metan, hidorgen i alte hidrocarburi. Deoarece din acest proces se
obine o mare producie de energie, fermentaia anaerob metanic poate fi
folosit la nivelul fermelor i gospodriilor rurale prin realizarea unor
instalaii simple de fermentare i captare a biogazului rezultat. Biomasa
obinut n urma acestei fermentaii constituie un ngrmnt natural,
ecologic, cu coninut foarte ridicat de humus, compui azotai i carbon.
Principalele grupe de microorganisme capabile de fermentaie
anaerob metanic sunt:
- grupa bacterilor anaerobe din genurile Bacteroides, Clostridium,
Ruminococcus i Butyrivibrio i a bacterilor facultativ anaerobe
(Escherichia coli, Bacillus) ce degradeaz celuloza, proteinele sau ali
biopolimeri cu formare de H2, CO2, acid formic, acid butiric, acid
propionic, alcool etilic i alcool metilic;
- grupa microorganismelor care biodegradeaz produii n aldehid
acetic activat: Syntrophobacter, Syntrophomonas, Desulfovibrio;
- grupa bacterilor metanogene care biodegradeaz substratul
reprezentat de metaboliii din primele dou etape (H2, CO2, acizii, alcoolii
etc) n metan.
n continuare sunt prezentate cteva procese utilizate la fabricarea
produselor alimentare fermentate.
Tabelul 13.1
Alimente i Materia ara care l
Organismele de fermentare
produse prim produce uzual
Produse lactate
Streptococcus lactis,
Kefir Lapte Lactobacillus bulgaricus, Torula Asia de Sud.Vest
sp.
Peninsula
Taette Lapte S. lactis var. taette
Scandinav
Fin de gru
Tarhana Lactici Tucia
i iaurt
Produse din carne i pete
unca afumat unc de porc Aspergillus, Penicillium spp./ Sudul S.U.A.
Lebanon
Vit Pediococcus cerevisiae Europa, S.U.A.
bologna
Sos de pete Pete mic Bacillus spp. halofilic Sudul S.U.A.
Katsuobushi Ton Skipjack Aspergillus glaucus Japonia
Produse din plante altele dect cele alcolice
226
Alimente i Materia ara care l
Organismele de fermentare
produse prim produce uzual
Fructe de Africa, America de
Boabe de cacao Candida krusei, Geotrichum spp.
cacao Sud
Fructe de Erwinia dissolvens, Brazilia, Congo,
Boabe de cafea
cafea Saccharomyces spp. Hawaii, India
Varz i alte
Kimchi Bacterii acidolactice Koreea
legume
Leuconostoc mesenteroides,
Mzline Mzline verzi Pretutindeni
Lactobacillus plantarum
Pediococcus cerevisiae,
Murturi Castravei Pretutindeni
Lactobacillus plantarum
Buturi alcoolice
Whisky Porumb,
Saccharomyces cerevisiae S.U.A.
Bourbon secar
Cidru Mere, altele Saccharomyces spp. Pretutindeni
Planta
Mezcal Drojdii Mexic
Century
Sake Orez Saccharomyces saki Japonia
Oet Cidru, vin Acetobacter spp. Pretutindeni
Struguri, alte Tulpini de Saccharomyces Pretutindeni
Vin
fructe ellipsoideus
***
Energia furnizat este redus i microbii trebuie s fermenteze
cantiti mari de substrat pentru a produce suficient energie necesar
proceselor celulare.
227
Capitolul 14
Recoltarea probelor alimentare
228
minimum 8-10 cm i un os lung;
organele: se recolteaz ntregi sau poriuni din acestea n pungi sau
recipieni sterili n cantitate de minim 200 g;
carnea preambalat, carnea de pasre, specialiti de pasre: se
recolteaz 1 % din numrul pachetelor care alctuiesc lotul, ns nu mai
puin de 5 pachete;
carnea de lucru (din ntreprinderile productoare): se recolteaz o
prob de 500-1.000 g din fiecare lot dac acestea sunt uniforme n privina
caracterelor organoleptice; n caz contrar lotul se mparte n 3 subloturi:
cu caractere organoleptice normale;
cu uoare modificri organoleptice;
cu caractere organoleptice evident modificate.
Din fiecare sublot se recolteaz o prob de 500-1.000 g.
carnea tocat: se recolteaz 200-300 g din fiecare ambalaj n
proporie de 1% din numrul acestora (nu mai puin de 2 i nu mai mult de
5 ambalaje);
preparate din carne: batoanele sau calupurile recoltate se
secioneaz longitudinal realizndu-se examenul organoleptic; cele dou
jumti constituie proba i contraproba; dintr-una din jumti se
recolteaz (de la mijloc i de la capete) 300-800 g i se trimit la laborator;
Tabelul 14.1.
Mrimea lotului Numrul de recipieni recoltai
Pn la 1.000 2
1.001-5.000 5
5.001-10.000 10
10.001-50.000 20
50.001-150.000 30
229
14.4. Recoltarea probelor de lapte i produse din lapte
230
se formeaz o prob medie din care se recolteaz 200-300 g, care se trimit
la laborator; dac ambalajele sunt mici (pachete de 300 g) se recolteaz
2% din numrul unitilor de ambalaj.
231
Din materialul examinat se fac diluii zecimale astfel:
la o cantitate de 50 g de prob se adaug 450 ml de tampon
fosfat Butterfield i se amestec bine ntr-un blender 2 minute; astfel se
obine diluia 10-1;
se folosesc pipete sterile, care se schimb la fiecare diluie,
transfernd 10 ml din diluia 10-1 n diluia 10-2 i aa mai departe pn la
ultima diluie n 90 ml de diluant; numrul diluiilor se stabilete n funcia
de condiia microbiologic urmrit;
din diluiile executate se fac nsmnri n plci Petri
introducnd cte 1 ml din fiecare diluie ntr-o plac; rezultate mai exacte
se obin dac se nsmneaz cte 2 plci pentru fiecare diluie;
n fiecare plac se toarn apoi peste suspensie 20 ml de agar
topit i rcit la 44-46C;
se omogenizeaz bine astfel nct bacteriile s fie repartizate
uniform n mediul de agar, n vederea obinerii coloniilor izolate; se
consider c o colonie izolat reprezint rezultatul multiplicrii unei
singure celule bacteriene;
plcile nsmnate se pun la termostat la 35C, iar dup 48
2 ore se numr coloniile rezultate din fiecare diluie; se numr plcile cu
un coninut ntre 25 i 225 de colonii;
pentru a afla numrul de germeni se nmulete numrul
coloniilor existente ntr-o plac cu diluia respectiv; pentru obinerea unor
rezultate mai precise se numr coloniile din mai multe plci, se
nmulete fiecare cifr aflat cu diluia respectiv, iar apoi se face media
aritmetic; rezultatul se exprim prin UFC, care corespunde cu numrul
coloniilor gsit pe unitatea de volum sau greutate din materialul examinat.
232
Materiale necesare.
eprubete cu diametrul de 2 centrimetri;
baie de ap electric sau termostat;
soluie de albastru de metilen.
Tehnica de lucru: ntr-o eprubet steril se adaug 1 mililitru soluie
de albastru de metilen. Se adaug 10 ml lapte din proba de analizat
(nclzit n prealabil la 38-40C). Se omogenizeaz bine. Se introduce
eprubeta n baie de ap sau n termostat la o temperatur de 38C.
Se urmrete decolorarea: dup 20 minute; dup 2 ore i dup 5 ore
i jumtate.
Determinarea se consider ncheiat, cnd ntreaga prob de lapte s-a
decolorat. n funcie de intervalul de timp, n care are loc decolorarea,
laptele se poate mpri n patru clase de calitate:
2. Metoda cu resazurin
Principiul metodei: Resazurina este o oxazon, care introdus n
lapte determin o coloraie albastr.
Sub aciunea microorganismelor este redus n rezorufin de culoare
roz-roiatic i apoi n dehidrorezorufin, care este incolor.
Materiale necesare:
eprubete sterile cu dop de cauciuc;
pipete sterile de 1 ml i de 10 ml;
resozurin, soluie apoas 0,05% (proaspt pregtit cu ap
steril);
baie electric sau termostat reglabil la 37C.
Tehnica de lucru: Se depune 1 ml de soluie de resazurin ntr-o
eprubet steril. Se adaug 10 ml de lapte, din proba de analizat. Se
nchide eprubeta cu un dop de cauciuc, se omogenizeaz i se introduce n
baie de ap sau n termostat la 37C. Dup o or, proba se omogenizeaz
din nou i se apreciaz nuana de culoare, n funcie de care laptele se
ncadreaz, n 4 grupe.
3. Proba catalazei.
Cantitatea de catalaz din lapte variaz n funcie de ncrctura
microbian a acestuia i de coninutul n leucocite. Prin dozarea catalazei
se poate aprecia att starea de sntate a glandei mamare, ct i condiiile
de igien n care a fost recoltat, manipulat i pstrat laptele.
Principiul metodei: Se bazeaz pe proprietatea catalazei de a
descompune apa oxigenat, elibernd oxigenul sub forma bulelor de gaz.
Materiale necesare:
ap oxigenat, soluie 3%;
catalazometru (dispozitiv Lobek).
1. Laptele cu un coninut normal de germeni pune n libertate oxigen,
care este capabil s disloce mai puin de 1 ml ap.
233
2. Laptele cu un coninut mai mare de germeni (suspect) - elibereaz
oxigen, care disloc 1- 3 ml ap.
3. Laptele cu germeni peste limita admis (necorespunztor) -
elibereaz oxigen care disloc mai mul de 3 ml de ap.
234
235
Capitolul 15
Tehnici de diagnostic de laborator
236
numr, fie printr-un simbol.
Pentru a avea condiii ct mai riguroase de sterilizare, n cursul
diferitelor operaiuni n laboratoarele de bacteriologie, se recomand ca
lucrrile s se efectueze n ncperi speciale, denumite boxe, cu restricii
de circulaie i prevzute cu lmpi cu ultraviolete, utilizarea hotelor simple
sau a hotelor laminar/linear flow. n astfel de hote, aerul ptrunde linear
spre operator i este forat s treac printr-un prefiltru i apoi printr-un
sistem de filtre HEPA (high efficiency particulate air).
237
propipete pot fi reprezentate de o par de cauciuc adaptat la
extremitatea de seciune;
lame i lamele de microscop lame cu margini palisate sau
simple (mai ieftine).
Pentru colorarea preparatelor microscopice, folosim:
1. stative din srm anexate la tvi metalice emailate;
2. cutii pentru bi de colorat.
Stative i panere. Pentru tuburile i flacoanele cu medii de cultur
sunt indicate stative autoclavabile din propilen, care reduc riscul spargerii
eprubetelor, un dezavantaj al stativelor din metal.
Stativele din lemn sunt total neigenice i dificil de decontaminat.
Courile din srm se folosesc numai pentru recipienii cu material
neinfecios.
Firul de nsmnare este confecionat din srm inoxidabil, de
platin sau crom nichel, cu grosime n funcie de consistena materialului
microbian de manipulat. Este fixat ntr-un port fir din metal, care trebuie
inut perfect curat prin frecare periodic, uoar, cu mirghel fin, a
extremitii inferioare, pentru ndeprtarea materialului carbonizat. Port
firul din sticl este contraindicat.
Firul perfect drept. Este utilizat pentru nsmnri prin nepare.
Ansa (firul buclat la o extremitate) pentru nsmnarea n medii
lichide i pentru epuizarea inoculului n striuri.
Firul spatulat pentru manipularea coloniilor microbiene, cu
consisten ferm.
15.2. Sterilizarea
238
microbiologiei, precum i, a altor sectoare, ca medicina, industria, etc.
nc de timpuriu, microbiologii au nceput s suspecteze c nu
numai alterarea i descompunerea sunt provocate de microorganisme, dar
i bolile infecioase. Ei au mers pn acolo, nct s susin c nsui
corpul uman reprezint o surs de infecie.
Oliver Holmes (medic american) a observat c mamele care nteau
la domiciliu, prezentau mai puine infecii dect cele care nteau n
materniti, iar medicul ungur Ipraz Semmebicis a artat, clar, c unele
femei se infectau n saloanele maternitilor, dup ce erau examinate de
medici, care veneau direct din camerele unde se fceau autopsiile.
Chirurgul englez Joseph Lister, a fost primul care a introdus tehnicile
aseptice*, avnd ca obiectiv reducerea microbilor ntr-un mediu medical i
prevenirea infectrii plgilor. Aceast asepsie a constat n esen, n
dezinfectarea minilor i aerului, nainte de manoperele chirurgicale, cu
substane chimice antiseptice puternice, ca fenolul. Aceste tehnici i
aplicarea cldurii, pentru sterilizare au devenit bazele controlului microbian
prin metode fizice i chimice, care mai sunt i azi utilizate.
Reguli de asepsie n laborator:
Se ordoneaz pe masa de lucru echipamentul strict necesar;
Studentul se aeaz comod pe scaun cu antebraele complet pe
blatul mesei, executnd toate micrile sub controlul vederii;
Ansa se ine n mna dreapt, apucndu-se ca pe un creion, de
extremitatea opus firului;
n mna stng se ine recipientul n care se prelev sau se
introduce materialul manipulat, ct mai aproape de extremitatea inferioar;
Se scoate dopul recipientului cuprinzndu-l ntre auricular,
inelar i palma minii drepte;
Se sterilizeaz, prin flambare gura eprubetei;
Se introduce ansa n eprubet pentru prelevarea i depunerea
materialului microbian. Se evit atingerea cu ansa a pereilor recipientului;
Dup retragerea ansei, se flambeaz gura recipientului i se
introduce dopul sau se nurubeaz capacul;
Se resterilizeaz ansa.
cldura uscat:
nclzire la rou;
flambare;
aer cald;
incinerare.
239
cldura umed:
peste 100C: autoclavare;
la sau sub 100C: tindalizare.
filtrare;
radiaii ultraviolete;
sterilizare chimic prin oxid de etilen.
240
incubaie la 37C) n forme vegetative, care vor fi distruse prin nclzire, a
doua zi. nclzirea de a treia zi se face pentru distrugerea ultimelor forme
vegetative, rezultate din germinarea sporilor.
n intervalul dintre nclziri, recipienii cu substanele supuse
sterilizrii se menin la temperatura camerei, pentru germinarea sporilor.
Pasteurizarea ca i ultrapasteurizarea (uperizarea) distruge numai
formele vegetative, nefiind o sterilizare propriu-zis. Se folosesc n
industria alimentar (la sterilizarea laptelui, a berii, a sucurilor, etc).
Pasteurizarea const n nclzirea lichidelor la temperaturi ntre 55C
i 95C, un timp variabil (la 65C, 90 de minute, la 90C, cteva secunde),
iar ultrapasteurizarea n injectarea de vapori supranclzii (150C) n masa
lichidelor destinate sterilizrii.
Sterilizarea prin radiaii ultraviolete se realizeaz cu ajutorul
lmpilor germicide. Acestea reprezint tuburi de sticl special, n care
descrcrile electrice ntr-o atmosfer cu vapori de mercur la joas
presiune genereaz radiaii ultraviolete.
241
Sterilizarea prin ageni chimici se poate realiza cu ajutorul:
substanelor dezinfectante, pe care le putem aplica numai pe
suprafee inerte din cauza efectelor iritante ori toxice (de exemplu: sublimat
corosiv 1, formol 40%, sod caustic, clorur de var);
substanelor antiseptice, care pot fi aplicate pe tegument, unele
mucoase sau plgi, avnd o toxicitate mai redus (de exemplu: alcool
medicinal, etilic 70%, tinctur de iod, ap oxigenat, permanganat de
potasiu 0,1%, acid acetic 1%, cloramin, detergeni).
Niciodat aceast metod nu se va utiliza pentru sterilizarea
materialelor (instrumente, medii) destinate cultivrii sau manipulrii
microbilor.
242
Cnd, ns, n acelai prelevat urmrim i virusuri i bacterii, proba
va fi suspensionat n mediile de transport fr antibiotice, urmnd ca
acestea s fie adugate difereniat la prelucrarea probei n laborator.
O atenie aparte trebuie s acordm bacteriilor anaerobe, astfel:
dac transportul i examinarea se fac fr ntrziere, cea mai
accesibil metod este aspirarea probelor fluide n sering etan, cu
ndeprtarea imediat a bulelor de aer i obturarea acului prin nepare
ntr-un dop steril;
pentru probele biopsice i tampoane sau dac intervalul pn la
examinare se prelungete sunt indispensabile containere comerciale
speciale (tuburi, flaconae, pungi), care conin un sistem generator de
dioxid de carbon, un agent reductor i un indicator redox (resazurin
sau albastru de metilen) pentru monitorizarea vizual a anaerobiozei.
Containerele speciale cu atmosfer mbogit n dioxid de carbon i
mediu microaerofil sunt avantajoase pentru probele n care urmrim
Neisseria sau Campylobacter.
Cei interesai de expedierea produselor microbiene prin pot,
trebuie s respecte exigenele de conservare i securitate impuse de
standarde recunoscute internaional.
243
15.6. Conduita general a identificrii bacteriilor
de aglutinare;
de precipitare;
RFC;
ELISA
PCR
de imunofluorescen, i multe altele.
244
Caracterul de patogenitate a crui manifestare depinde n primul
rnd de virulen. Acest caracter este relativ i neunitar, deoarece virulena
variaz cu tulpina i se poate atenua sau chiar pierde n culturi de
laborator.
Pe de alt parte, eficacitatea aciunii patogene depinde i de
receptivitatea individual a gazdei, folosite pentru evidenierea ei.
Patogenitatea se testeaz prin inoculare experimental la organisme
sensibile, pe o cale adecvat.
Sunt luate n consideraie numai rezultatele pozitive, deoarece cele
negative pot fi datorate fie utilizrii unei gazde neadecvate, fie unor
condiii de inoculare nepotrivite.
Caracterele ecologice. Habitatul natural al microorganismelor i
relaiile lui n mediul natural cu alte forme de via pot varia n funcie i
de ali factori dect cei proprii speciei date, precum i pentru faptul c una
i aceeai specie bacterian poate tri n medii naturale foarte diferite.
Parametrii ecologici utili pentru caracterele unei specii sunt
reprezentai de: temperatura optim de cretere sau de patogenitate,
temperatura tolerant, intensitatea luminii, pH, simbioza cu unele
microorganisme, etc.
Sensibilitatea la fag. Se testeaz stabilind activitatea unui set
standard de fagi cunoscui. Permite stabilirea de subdiviziuni n cadrul
speciei (fagovar) cu importan n epidemiologie, pentru determinarea
sursei de infecie i a cilor de transmitere.
Deoarece multe tulpini sunt lizogene, ele pot fi caracterizate prin
tipizare fagic indirect (lizogenotipie), adic prin detectarea i
identificarea fagilor temperai prezeni ca profag n genomul lor.
Cheile de identificare. Cheile de identificare conin enumerarea
caracterelor constante (caractere-cheie) prezente sau absente totdeauna
la un taxon dat.
Cea mai cunoscut cheie de identificare este cea elaborat de
Skerman i publicat n determinatorul lui Bergey.
Caracterele cheie pozitive sunt considerate markeri sau caractere de
diagnostic.
Coleciile de culturi. Meninerea tulpinilor bacteriene n colecii se
poate realiza prin:
transfer activ (n subculturi efectuate la intervale fixe, n funcie
de particularitile biologice ale speciei respective);
prin uscare (pe diferite suporturi inerte ca: nisip, silicogel, etc.);
prin liofilizare (uscare n vid urmat de congelare la temperaturi
joase -30 - 80C);
prin crioprezervare la -70C - 90C, care asigur nivelul
maxim de supravieuire n timp.
245
Pentru fiecare specie microbian nou aprut se recomand pstrarea
unei culturi pure, a tulpinii tip originare, cu o descriere complet, care s
poat fi completat cu noi caractere, pe msur ce tehnicile de investigare
se perfecioneaz.
Dac tulpina este pierdut se recomand nlocuirea ei cu o tulpin
neotip, care i seamn foarte mult.
Pstrarea unui astfel de specimen tip practicabil este extrem de
dificil.
Din grupele de caractere enumerate se examineaz un numr variabil,
dar minimal pentru identificarea tulpinii, fiind foarte utile schemele de
diagnostic i cheile de identificare.
Pentru a definitiva identificarea unei tulpini, datele examenului
bacteriologic, trebuie selectate, asamblate i comparate. n acest scop se
impune confruntarea caracterelor evideniate cu datele prezentate n
determinatoare, manuale, ghiduri.
Determinatoarele cuprind descrierea complet a speciilor bacteriene
care prezint interes pentru ramurile aplicative ale bacteriologiei. Sistemele
de clasificare utilizate n determinatoare variaz uneori de la un autor la
altul, mai ales n ceea ce privete taxonii de rang superior (ncrengtur,
ordin).
Determinatorul cel mai folosit n lume, este lucrarea Bergeys
Manual of Determinative Bacteriology, a crei prim ediie a aprut n
1923. n 1984, a aprut primul volum al manualului reeditat sub titlul
Bergeys Manual of Systematic Bacteriology.
Indexurile conin liste alfabetice ale tuturor denumirilor utilizate n
prezent i n trecut pentru bacterii.
Cataloagele de colecii cuprind liste alfabetice cu laboratoarele i
bacteriologii posesori de colecii de tulpini, pe specii bacteriene i adresele
acestora. n fiecare colecie bacterian, tulpinile trebuie s posede o fi
individual cu simbolul tulpinii, locul, data i materialul din care a fost
izolat, proprietile ei morfologice, culturale, biochimice, antigenice, de
patogenitate, etc.
Tabelul 15.1
Taxonii de rang superior ai speciilor bacteriene importante
Clas/ Ordin/ Familie Gen
Subclas Subordin (nr. genuri) (nr. de specii)
Staphylococcaceae (5) Staphylococcus (41)
246
Lactobacillaceae (3) Lactobacillus (130)
Streptococcus (83)
Streptococcaceae (2)
Lactococcus (5)
Ord. Lactobacillales
Enterococcaceae (5) Enterococcus (35)
Corynebacteriaceae
Corynebacterium (89)
(1)
Cl. Ord.
Actinobacteria Actinomycetales
Scl. Srd. Nocardia (73)
Nocardiaceae (2)
Actinobacteridae Corynebacterineae Rhodococcus (37)
Ord.
Micrococcaceae (9) Micrococcus (10)
Actinomycetales
Srd. Micrococcineae
Tabelul 15.2.
Taxonii de rang superior ai speciilor bacteriene importante
Clas/ Ordin/ Familie Gen
Subclas Subordin (nr. genuri) (nr. de specii)
Escherichia (7)
Klebsiella (12)
Morganella (1)
Plesiomonas (1)
Ord. Entero-
Proteus (8)
Enterobacteriales bacteriaceae (44)
Providencia (6)
Salmonella (9)
Serratia (13)
Cl. Gammaproteobacteria
Shigella (4)
Yersinia (13)
Pasteurella (22)
Actinobacillus
Pasteurellaceae
Ord. Pasteurellales (18)
(7)
Haemophilus (23)
Lonepinella (1)
Mannheimia (5)
Ord. Thiotrichales Francisellaceae Francisella (3)
247
Clas/ Ordin/ Familie Gen
Subclas Subordin (nr. genuri) (nr. de specii)
(1)
Pseudomonas
Ord. Pseudomona-
(161)
Pseudomonadales daceae (10)
Cellvibrio (7)
Ord. Vibrionales Vibrionaceae (8) Vibrio (77)
Ord. Aeromonadaceae
Aeromonas (20)
Aeromonadales (4)
Ord. Cardio-
Dichelobacter (1)
Cardiobacteriale bacteriaceae (3)
Legionellaceae
Legionella (50)
Ord. Legionellales (1)
Coxiellaceae (3) Coxiella (1)
Burkholderiaceae
Burkholderia (42)
Ord. (10)
Cl. Betaproteobacteria
Burkholderiales Alcaligenaceae
Bordetella (8)
(11)
Ord. Rhizobiales Brucellaceae (3) Brucella (6)
Cl. Alphaproteobacteria Rickettsia (23)
Ord. Rickettsiales Rickettsiaceae (2)
Orientia (1)
Leptospiraceae Leptospira (13)
Cl. Spirochaetes Ord. Spirochaetales
(2) Leptonema (1)
Borrelia (32)
Spirochaetaceae Treponema (23)
Ord.
Cl. Spirochaetes (9) Cristispira (1)
Spirochaetales
Brevinema (1)
Serpulinaceae Brachyspira (5)
(2) Serpulina (6)
Campylo- Campylo-bacter
Ord. Campylo- bacteriaceae (4) (25)
Cl. Epsilonproteobacteria
bacterales Helicobacterace Helicobacter
ae (4) (23)
Ord. Desulfo- Desulfo-
Cl. Deltaproteobacteria Lawsonia (1)
vibrionales vibrionaceae (3)
Ord. Fusobacteriacea Fusobacterium
Cl. Fusobacteria
Fusobacteriales e (7) (20)
Mycoplasma
Ord. Mycoplasma- (121)
Cl. Mollicutes
Mycoplasmatales taceae (4) Eperythrozoon
(5)
Ureaplasma (7)
Chlamydiaceae Chlamydia (5)
Ord.
Cl. Chlamydiae (2) Chlamydophila
Chlamydiales
(6)
248
Capitolul 16
Medii de cultur, reactivi i diluani utilizai n
diagnosticul de laborator
249
infectate.
Dup preparare, mediile sterilizate se pstreaz n locuri ntunecoase
i rcoroase.
Dei, acest capitol prezint formulele tuturor mediilor folosite n
metodele descrise n manual, se prefer utilizarea mediilor deshidratate din
comer, pentru uniformitatea metodei i a scurtrii timpului efectiv de
lucru al analizatorului.
n cazul n care nu exist un mediu comercial, acesta trebuie preparat
din componentele sale individuale. Climatul cu umiditate mare poate
provoca ntrirea rapid a mediilor deshidratate, putnd afecta astfel
performanele metodei. n plus mediile alcaline pot absorbi dioxidul de
carbon i pot modifica pH-ul. Ori de cte ori este posibil, mediile trebuie
furnizate cu data expirrii pe recipient. Dac aceasta nu este specificat,
mediile nu se folosesc mai mult de un an de la primirea lor n laborator.
Cele vizibil alterate prin formarea de cocoloae sau acumularea de
umezeal trebuie aruncate.
Compuii chimici sunt folosii pe scar larg n compoziia mediilor,
ca ageni selectivi, ca indicatori i colorani n diferite proceduri
microbiologice. Datorit faptului c impuritile chimice pot, fie s inhibe,
fie s stimuleze creterea microorganismelor sau pentru c pot produce o
reacie nedorit, trebuie folosite numai substane chimice care ndeplinesc
specificaiile unei organizaii de certificare.
Spre deosebire de majoritatea mediilor deshidratate, substanele
chimice prezint foarte rar marcat data de expirare.
250
Compoziia mediilor de cultur variaz de la civa compui organici
foarte simpli, pn la o list complex de compui organici i anorganici.
Manualul Difco (Digestive Ferments Company) fondat n 1895,
enumer aproximativ 500 de medii folosite n laboratoarele moderne de
microbiologie.
Datorit exigenei produselor comerciale gata pentru folosire, mediile
de cultur, n ziua de azi, se prepar foarte uor. Nu ns, aceeai era
situaia i n trecut.
O camer de preparare a mediilor avea aspectul unui hibrid ntre o
buctrie i laboratorul unui alchimist.
O carte de referin, care trece n revist mediile de cultur pn n
anul 1930, poart titlul de O compilare de medii de cultur pentru
cultivarea microorganismelor, de Levine i Shoenlein i conine 7000 de
reete.
O combinaie fantastic de materii prime se adugau (i uneori se
mai adaug) preparatelor, unele forme fiind extrem de complexe. Nu era
ceva neobinuit ca pentru un singur mediu s fie necesare 25 de faze de
preparare. Compoziiile mediilor par s nu fi fost limitate dect de
imaginaia buctarului. n reete apar numeroase produse animale
neconvenionale, cum ar fi: oase, cartilaje, placent, plmn, slnin, carne
tocat de vit, testicule, sperm, puroi, fecale, urin.
Materialele vegetale, care constituie de asemenea o surs foarte bun
de substane nutritive, erau mcinate, tiate, tocate, pasate, filtrate i gtite.
O list parial sugereaz o adevrat grdin: cartofi, morcovi, spanac,
ceap, mazre, fructe (banane, prune), ierburi (paie, fn) i zeci de diverse
semine.
Produse ca sucul de tomate, macaroane, cafea, condimente, unt i
bere i-au avut, de asemenea, locul n unele amestecuri.
Nici o surs imaginabil nu a fost omis, incluznd componente
ciudate ca: pmnt, blegar, crmizi, crbuni, rumegu, cenu de lemne,
scame, cuie ruginite, azbest, arsenic i cianur.
Pentru a putea fi folosite n cultivarea bacteriilor, mediile de cultur
trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
s conin substane nutritive necesare metabolismului bacterian;
s aib un pH necesar dezvoltrii bacteriei respective;
s corespund particularitilor fiziologice ale bacteriilor, mai
ales n funcie de tipul respirator;
s fie steril.
Mediile de cultur se prepar din ingrediente special destinate
acestui scop, cum ar fi:
ingrediente rezultate n urma hidrolizei acide a unor produse de
origine animal, vegetal sau microbian (extract de carne de bovine,
251
hidrolizat de cazein, extract de drojdie);
sruri minerale: n compoziia unui mediu intr aproape
ntotdeauna clorura de sodiu 0,5-0,7 %;
agarul este mediul solid i se gsete n comer sub form de agar
fibre sau pudr, fiind reprezentat de o alg marin (Gelidium corneum) din
mrile Japoniei.
Descoperirea agarului. Bacteriologii au realizat nc din timpurile
trecute, avantajul creterii bacteriilor n colonii separate, fa de creterea
lor n bulioane i infuzii. n acest scop ei au avut nevoie de un mediu care
s fie relativ solid pentru cultivarea bacteriilor i care, n acelai timp s
furnizeze nutrienii necesari acestora.
n trecut, se foloseau felii de cartof sau gelatin sterilizat, ns
acestea lsau mult de dorit, nefiind extrem de eficace n acest sens.
Cartofii aveau un coninut limitat de nutrieni, iar gelatina i pierdea
soliditatea la temperaturi mai calde, putnd fi digerat de multe categorii
de microorganisme.
Bacteriologul german Walther Hesse a studiat microbii din aer,
fiind dezamgit de rezultatul derutant al culturilor n gelatin. nelegnd
necesitatea gsirii unui substituent al gelatinei, soia sa Fanny, i-a sugerat
s foloseasc o substan numit agar. Agarul era folosit tradiional n
Malaezia pentru prepararea jeleurilor i ngroarea supelor, fiind un agent
de solidificare aproape perfect. Prin aceast descoperire important, Hesse
a reuit un salt imens n istoria preparrii mediilor de cultur, agarul fiind
folosit i n zilele noastre.
apa, reprezint sediul reaciilor chimice i intr n compoziia
tuturor mediilor de cultur sub diferite forme (distilat, bidistilat,
deionizat, de robinet, de izvor), n funcie de necesitile bacteriilor;
alte ingrediente care folosesc la prepararea unor medii speciale
sunt reprezentate, de exemplu, de: extractul de mal, extractul de larve de
albine, ser sangvin, snge, vitamine, antibiotice, indicatori de pH etc.
252
la lichidul obinut se adaug peptona (10), clorura de sodiu
(5);
se ajusteaz pH-ul prin adugarea de soluie normal de hidroxid
de sodiu;
se filtreaz din nou prin hrtie de filtru;
se repartizeaz n recipiente de sticl, care se astup cu dopuri de
vat;
se sterilizeaz 30 de minute la 115C.
Maceratul de carne poate fi substituit cu extractul de carne, sub
form de pulbere purificat i standardizat, produs de diferite firme
internaionale (Merck, Difco, Bacto) sau de institute de produse biologice
din ara noastr.
Prepararea unui mediu solid (agar) se realizeaz astfel:
la 1000 mililitri bulion se adaug 17-30 grame agar, de preferat
pulbere;
mediul se repartizeaz n eprubete i se sterilizeaz;
dac solidificarea se produce n poziie nclinat se obine agar
nclinat, iar n poziie vertical se obine agar drept.
Mediile cu ser se prepar din medii uzuale (bulion, agar), la care se
adaug ser normal (de obicei, de cal), n proporie de 1/10.
253
Tot n aceast categorie se ncadreaz i agarul cu cistin tripticaz
(CTA) i mediile de transport.
mediile solide prezint o suprafa tare, pe care celulele pot
forma colonii separate, fiind vitale n izolarea i subcultivarea bacteriilor
i fungilor. Ele se prezint sub dou forme:
lichefiabil;
nelichefiabil.
Mediile solide lichefiabile (medii solide reversibile) conin un agent
de solidificare care este termoplastic (modificat fizic n funcie de
temperatur). Cel mai folosit este agarul, un polizaharid complex, izolat
din alga roie Gelidium.
Agarul prezint numeroase avantaje. Este solid la temperatura
camerei i la temperatura de incubare (40-45C) i se lichefiaz la
temperatura de fierbere a apei (90-100C). O dat lichefiat nu se
resolidific, dect dup ce se rcete la 42C, ceea ce permite ca s fie
turnat n eprubete sau n plci Petri sub form lichid, la temperaturi care
nu vor duna microbilor sau manipulatorului (45-50C). Agarul este
flexibil i modelabil, reprezentnd un cadru de baz pentru meninerea
umiditii i a nutrienilor, dei, pentru marea majoritate a
microorganismelor, el nsui nu reprezint un nutrient utilizabil. Enzimele
bacteriene nu sunt capabile s-l digere (degradeze).
Exemple: Orice mediu, care conine de la 1% pn la 5% agar,
conine de obicei acest cuvnt n denumirea sa.
2. Dup compoziia chimic, se mpart n:
medii naturale;
medii sintetice;
medii semisintetice.
Mediile sintetice. Mediile a cror compoziie este determinat chimic,
se numesc medii sintetice. Conin compui organici i anorganici cu un
grad mare de puritate i un coninut molecular specificat printr-o formul
exact. Astfel de medii sunt foarte utile n cercetare i culturi celulare, n
care nevoile nutriionale ale organismelor testate sunt cunoscute.
Mediile naturale (empirice). Conin cel puin o component care nu
poate fi determinat chimic (un compus care nu este foarte pur, simplu i
nu poate fi determinat printr-o formul chimic).
Exemple: medii cu snge, ser i extracte de carne, lapte, extract de
levuri, boabe de soia digerate, glucide vegetale complexe, cartof
glicerinat, pepton.
Peptona este o protein parial digerat, bogat n aminoacizi,
folosit deseori ca surs de carbon i azot.
3. Dup frecvena i scopul utilizrii n laborator se mpart n
medii uzuale i medii speciale.
254
Mediile uzuale sunt folosite frecvent n laborator, fiind destinate
cultivrii unui spectru larg de microbi. De regul, sunt medii naturale i
conin un amestec de nutrieni care pot stimula n aceeai msur creterea
microbilor patogeni i nepatogeni.
Exemple: agarul i bulionul nutritiv, agarul cu snge, agarul cu
tripticaz soia (TSA).
255
culoarea natural galben.
medii de reducere conin o substan care absoarbe oxigenul sau
ncetinete ptrunderea acestuia ntr-un mediu inducnd astfel potenialul
de oxidoreducere. Exemple de ageni reductori sunt acidul thioglicolic,
acidul ascorbic, cisteina.
mediile de transport sunt folosite pentru transportul specimenelor
mai sensibile (care mor repede) sau care urmeaz s fie transportate pe o
distan mai mare, ce necesit un timp mai lung pn la analiza lor
chimic.
Exemple: Stuart, Amies conin sruri, tampoane i absorbani,
pentru prevenirea distrugerii celulelor de ctre enzime, de modificrile
pH-ului sau substane toxice i nu conin nutrieni pentru stimularea
creterii.
Medii de conservare geloz moale.
Medii de testare pentru testarea eficienei medicamentelor
antimicrobiene de ctre fabricanii de medicamente, pentru evaluarea
efectului dezinfectantelor, antisepticelor, cosmeticelor i conservanilor
asupra creterii microorganismelor.
Medii de urmrire. Sunt folosite pentru calcularea numrului de
microorganisme din lapte, ap, alimente, sol i alte eantioane.
Majoritatea reetelor de preparare prezentate mai jos sunt
recomandate de farmacopeea USA-1992.
256
4. Bulion VF (viande = carne; foie = ficat)
Ficat de viel 250 g
Carne de viel 250 g
Ap de la robinet 1000 ml
- ficatul i carnea se toac mrunt i se fierb 20 minute;
- se filtreaz prin tifon;
- fragmentele de carne i ficat rmase n tifon se spal de 4-5 ori cu
ap distilat, se usuc i se repartizeaz n tuburi, n cantitate de circa 1-3
grame.
- lichidul obinut dup filtrare se completeaz cu ap de la robinet la
volumul iniial;
- se adaug 5 g pepton i 5 g clorur de sodiu;
- se ajusteaz pH-ul la 8;
- se autoclaveaz 20 minute la 120C;
- se adaug 2% glucoz;
- se repartizeaz cte 6 ml n tuburi, n care s-au introdus n prealabil
cte 3 g de carne i ficat;
- se sterilizeaz prin autoclavare timp de 15 minute la 115C;
- nainte de utilizare mediul se regenereaz prin fierbere;
5. Geloz Veillon
Bulion nutritiv 1000 ml
Agar 3g
Glucoz 5-10 g
Azotat de potasiu 1-2 g
pH = 7,4
Se repartizeaz n eprubete nalte, cu diametrul ct mai mic, astfel
nct mediul s ocupe 3/4 din nlimea acestora. Se sterilizeaz.
258
Interpretare. Coloniile de bacterii proteolitice peptonizeaz cazeina
din lapte, iar mediul din jurul lor se clarific.
259
16. Ap peptonat
Pepton 10 g
Clorur de sodium 5g
Ap distilat 1000 ml
pH = 7,4
260
pH = 3,5
Se repartizeaz 100-200 ml n recipieni adecvai. Se sterilizeaz. n
momentul folosirii la mediul topit i rcit la 50C, se adaug acid tartric
10% sau acid lactic n cantitatea necesar obinerii pH-ului de 3,5.
261
Citrat ferric 0,5 g
Agar 15 g
Ap distilat 1000 ml
Se nclzete cu agitare pentru dizolvarea componentelor. Se
repartizeaz n tuburi, se autoclaveaz 15 minute, la 121C i se solidific
n eprubete, n poziie nlinat. pH final = 6,6 0,2.
262
26. Bulion i agar BHI (Brain Heart Infusion)
Infuzie de creier cu carne de viel 200 g
Infuzie de inim cu carne de vit 250 g
Pepton 10 g
Clorur de sodium 5g
Na2HPO4 12 H2O 2,5 g
Dextroz 2g
Ap distilat 1000 ml
Se dizolv ingredientele n ap distilat prin nclzire uoar. Se
repartizeaz bulionul n sticle sau tuburi pentru pstrare. Se autoclaveaz
15 minute la 121C. pH final = 7,4 0,2.
Pentru prepararea agarului cu infuzie de creier inim se adaug 15 g
de agar la 1 litru de bulion BHI. Se nclzete pentru dizolvarea agarului,
nainte de introducerea n sticle, pentru depozitare. Se autoclaveaz 15
minute la 121C.
263
29. Bulion dextroz cu bromcrezol purpuriu (BCP) (Bromcresol Purple
Dextrose Broth)
Dextroz 10 g
Extract de carne de vit 3g
Pepton 5g
Bromcrezol purpuriu (1,6% n etanol) 2 ml
Ap distilat 1000 ml
Se dizolv ingredientele n ap distilat. Se repartizeaz n tuburi 12-
15 ml. Se autoclaveaz 15 minute la 121C. pH final 7,0 0,2.
264
Substanele biochimice. Glicin 1%, NaCl 3,5%, Cistein 0,02%,
Nitrit 1%. Se adaug 2,5 g glicin la una din porile de 250 ml ale bazei cu
soluie rou-neutru, 0,75 g NaCl la a doua porie cu soluie de rou neutru
i 0,05 g cistein la a treia porie cu soluie rou neutru. Se adaug 2,5 g,
KNO3, la a patra porie, fr soluie de rou neutru. Se regleaz valoarea
de pH la 7,0 0,2 i se mparte n 7-10 ml per tub. Se autoclaveaz 15
minute la 121C.
265
34. Agar cu Novobiocin-Cefsulodin-Irgasan (CIN) sau Agar selectiv
Yersinia (YSA) (Yersinia Selective Agar)
A. Mediu de baz:
Pepton special 20 g
Extract de drojdie 2g
Manitol 20 g
Acid piruvic 2g
NaCl 1g
MgSO4 7H2O (10 mg/ml) 1 ml
Agar 12 g
Ap distilat 756 ml
B. Soluie de Irgasan 0,40% n 95% etanol
1 ml
Poate fi pstrat la -20C, o sptmn
C. Soluie de dezoxicolat
Dezoxicolat sodic 0,5 g
Ap distilat 200 ml
Se nclzete pn la fierbere; se rcete la 50-55C.
D. Hidroxid de sodiu 5N 1 ml
E. Rou neutru 3 mg/ml 10 ml
F. Cristal violet 0,1 mg/ml 10 ml
G. Cefsulodin 1,5 mg/ml
10 ml
Poate fi pstrat la -70C
Se scoate la temperatura camerei nainte de folosire.
H. Novobiocin 0,25 mg/ml 10 ml
I. Clorur de stroniu 10% sterilizat 10 ml
Preparare: Se dizolv ingredientele soluiei A (mediul bazal) n ap,
care se fierbe. Se rcete pn la 80C (prin meninerea n baie de ap de
50C, timp de 10 minute). Se adaug soluia B (Irgasan) i amestec bine.
Se rcete la 50-55C. Se adaug soluia C (dezoxicolat). Soluia trebuie
s fie limpede. Se adaug soluia D i H. Soluia I se adaug uor. Se
ajusteaz pH-ul la 7,4 cu 5N NaOH. Se repartizeaz n plci Petri n porii
de cte 15-20 ml. Agarul selectiv pentru Yersinia deshidratat preparat
comercial (Difco) cu suplimente poate fi substituit. Se urmeaz
instruciunile de preparare.
266
Se mrunete ficatul i se adaug n ap. Se fierbe la foc redus, o
or. Se rcete. Se ajusteaz pH-ul la 7,0 i se fierbe din nou 10 minute. Se
filtreaz prin tifon steril i se stoarce lichidul n exces. Se adaug celelalte
ingrediente i se ajusteaz pH-ul la 7,0. Se adaug ap pn la 1000 ml. Se
filtreaz prin hrtie de filtru groas. Se pstreaz bulionul i carnea separat
n congelator. Se adaug n eprubete ficatul mrunit. Se autoclaveaz 15
minute la 121C.
267
la nmuiat 30 minute; se dreneaz etanolul; oule se sparg aseptic i se
ndeprteaz albuurile; glbenuurile se extrag cu o sering steril sau cu
o pipet cu gura larg; se plaseaz ntr-un container steril i se amestec
aseptic cu un volum egal de soluie salin steril 0,85%; se pstreaz la
4C, pn la folosire.
268
Se nclzete uor pentru dizolvare; se toarn n tuburi de 16 x 150
ml, pn la o treime din nlimea lor; se autoclaveaz 15 minute la 121C.
nainte de solidificarea mediului tuburile se nclin pentru obinerea
pantelor de 45 cm i a bazelor de 2-3 cm. pH final 7,4 0,2.
Pepton 12 g
Extract de drojdie 3g
Sruri biliare 9g
Lactoz 12 g
Sucroz 12 g
Salicin 2g
Clorur de sodiu 5g
Tiosulfat de sodium 5g
Citrat de amoniu feric 1,5 g
Albastru de bromtimol 0,064 g
Fuxin acid 0,1 g
Agar 13,5 g
Ap distilat 1000 ml
Se nclzesc toate componentele, pn la temperatura de fierbere, cu
agitare continu pentru dizolvarea acestora. Nu se fierb mai mult de 1
minut. Se evit supranclzirea. Se rcete n baie de ap. Se repartizeaz
porii de cte 20 ml, n plci Petri sterile de 15 x 100 mm. Se las s se
usuce 2 ore cu capacul parial deschis. pH-ul final 7,6 0,2. Nu se
pstreaz mai mult de o zi.
269
Ap distilat 1000 ml
Pentru E. coli: se dizolv toate ingredientele i se repartizeaz n
porii de cte 10 ml n tuburi de 20 x 150 mm cu tubulee de fermentaie
de 10 x 75 mm inversate. Se autoclaveaz 15 minute la 121C. pH final
6,9 0,2.
Pentru Salmonella se toarn porii de 225 ml n baloane Erlenmeyer
de 500 ml. Dup autoclavare, timp de 15 minute la 121C i imediat
nainte de folosire volumul se ajusteaz aseptic la 225 ml; pH final 6,9
0,2.
270
NaCl 5g
Lauril sulfat de sodiu 0,1 g
4-metil umbeliferil beta-D-glucuronid (MUG) 50 mg
Ap distilat 1000 ml
Se prepar bulionul LT i se adaug MUG. Se dizolv prin nclzire
uoar dac este necesar. Se repartizeaz cte 10 ml n tuburi care conin
tubulee de fermentare inversate; se autoclaveaz 15 minute la 121C; pH
final 6,8 0,2.
271
Cristal violet 0,001 g
Agar 13,5 g
Ap distilat 1000 ml
Se dizolv ingredientele prin nclzire uoar, prin agitare continu.
Se fierb 1-2 minute. Se autoclaveaz 15 minute la 121C. Se rcete la 45-
50C i se mparte n porii de 20 ml, care se repartizeaz n plci Petri
sterile. Se usuc la temperatura camerei, cu capacul nchis. Nu se folosesc
dect plci perfect uscate. pH final 7,1 0,2.
272
Galactoz 5g
Glicerin 5 ml
Ap distilat 1000 ml
Se dizolv toate ingredientele cu excepia agarului. Se ajusteaz pH-
ul la 7,3 0,1. Se adaug agarul i se nclzete pentru dizolvare. Se
mparte n porii de 11 ml, care se repartizeaz n tuburi de 16 x 150 mm.
Se autoclaveaz 15 minute la 121C. Dac nu se folosete n 4 ore se
nclzete 10 minute n ap fiart, apoi se rcete brusc prin introducerea
n ap rece.
273
Se dizolv ingredientele i se autoclaveaz 15 minute la 121C.
Mediul se rcete i se refrigereaz la 5-8C. pH final 7,6 0,2. Se dizolv
0,5 g KCN n 100 ml de ap distilat steril rece (5-8C). Se folosete o
pipet cu bul i se adaug 15 ml soluie de KCN rece la 1 l de baz steril
rece. Nu se pipeteaz cu gura. Se amestec i se repartizeaz aseptic cte
1,0-1,5 ml n tuburi sterile.
274
autoclaveaz 15 minute la 121C. pH final 7,5 0,2.
275
45 cm i a bazei de 2-3 cm. pH final 6,9 0,2.
276
68. Mediul Voges-Proskauer modificat
Pepton proteazic 7g
NaCl 5g
Dextroz 5g
Ap distilat 1000 ml
Se dizolv ingredientele n ap i se ajusteaz pH-ul dac este
necesar. Se repartizeaz cte 5 ml n tuburi sterile. Se autoclaveaz 10
minute la 121C. pH final 6,5 0,2.
277
Irgasan 4 mg
Ap distilat 1000 ml
Se nclzete uor pn la dizolvarea complet a componentelor. Se
sterilizeaz 15 minute la 121C. Nu se depete temperatura de fierbere.
Se rcete la 45-50C i se adaug aseptic 10 ml de supliment
antimicrobian Yersinia, rehidratat (CN). Se amestec bine i se
repartizeaz n plci Petri sterile.
Suplimentul antimicrobian Yersinia (CN):
Cefsulodin 4 mg
Novobiocin 2,5 mg
Extract de drojdie 3g
Pepton 10 g
Clorur de sodiu 70 g
K2HPO4 5g
Manitol 10 g
Cristal violet 0,001 g
Agar 15 g
Ap distilat 1000 ml
Se nclzete cu agitare uoar pentru dizolvarea agarului. Se
ajusteaz pH-ul la 8,0 0,2. Nu se autoclaveaz. Se rcete la 50C. Se
spal globulele roii de om sau de iepure de 3 ori cu soluie fiziologic
salin. Se adaug 5% din volumul acestei suspensii la mediul rcit. Se
amestec i se repartizeaz n plci Petri (plcile trebuie s fie bine uscate
nainte de folosire).
278
NaCl 5g
Lactoz 10 g
Sucroz 10 g
Glucoz 1g
Fe (NH4)2(SO4)2 6H2O 0,2 g
Na2S2O3 0,2 g
Rou fenol 0,025 g
Agar 13 g
Ap distilat 1000 ml
Mediul 2
Extract din carne de vit 3g
Pepton 15 g
Pepton proteaz 5g
Glucoz 1g
Lactoz 10 g
Sucroz 10 g
FeSO4 0,2 g
NaCl 5g
Na2S2O3 0,3 g
Rou fenol 0,024 g
Agar 12 g
Ap distilat 1000 ml
Se suspend ingredientele din Mediul 1 n ap distilat, se amestec
bine i se nclzesc cu agitare uoar. Se fierb 1 minut pentru dizolvarea
complet a ingredientelor. Se autoclaveaz 15 minute la 118C. Mediul 2
se prepar la fel ca i Mediul 1, numai c autoclavarea se face 15 minute la
121C. Tuburile se solidific n poziie nclinat pentru a obine o pant de
4-5 centimetri i o baz de 2-3 centimetri. pH-ul final este de 7,3 0,2
pentru Mediul 1 i 7,4 0,2 pentru Mediul 2.
279
Extract de drojdie 0,1 g
KH2PO4 0,091 g
Na2HPO4 0,095 g
Rou fenol 0,01 g
Ap distilat 1000 ml
Se dizolv ingredientele n ap distilat. Nu se nclzete. Se
sterilizeaz prin filtrare, prin membrane de 0,45 m. Se repartizeaz
aseptic porii de 1,5-3 ml n tuburi sterile. pH final = 6,8 0,2.
280
ap distilat i se fierbe pn la dizolvarea total a ingredientelor. Se
autoclaveaz 15 minute la 121C. Se rcete la 55C. Se adaug n mod
aseptic soluia de sulfat de polimixin B (FD 003) sterilizat prin filtrare,
n aa fel ca antibioticul s reprezinte 100 U.I./ml de mediu i 100 ml
emulsie de glbenu de ou (FD 045) steril la 1000 ml mediu. Se amestec
bine i se toarn n plci Petri. Mediul are un aspect de gel clar sau uor
opalescent, rou-oranj.
281
Hidrolizat enzimatic de cazein 5g
Extract de drojdie 5g
Extract de carne de bovine 5g
Clorur de sodiu 20 g
Clorur de litiu 3g
Fosfat disodic 12 g
Fosfat monopotasic 1,35 g
Esculin 1g
Citrat feri-amoniacal 0,5 g
pH final = 7,2 0,2.
Mediul deshidratat n cantitate de 57,85 se suspend n 990 ml de
ap distilat i se fierbe pn la dizolvarea complet. Se autoclaveaz 15
minute la 121C. Se rcete la 50C. Se amestec bine i se repartizeaz n
recipieni adecvai.
282
Ap distilat 1000 ml
Se repartizeaz porii de 10 ml n tuburi de 20 x 150 mm. Se
autoclaveaz 15 minute la 121C. pH final 7,4 0,2.
283
Ap distilat 1000 ml
Se autoclaveaz 15 minute la 121C. pH final = 7,0 0,2.
Diluani
1. Ap distilat tamponat
a) Soluia stoc:
Fosfat monopotasic 34 g
Ap distilat 500 ml
Se ajusteaz pH-ul la 7,2 cu NaOH (aproximativ 175 ml) i se aduce
volumul la un litru cu ap distilat.
b) se iau 1,25 ml din soluia A i se completeaz la volumul de 1
litru cu ap distilat. Aceasta reprezint soluia de lucru care se
repartizeaz n recipieni i se sterilizeaz.
3. Ser fiziologic
Clorur de sodiu 8,5 g
Ap distilat 1000 ml
284
285
286
Norme de protecia muncii n laboratorul de microbiologie
287
prealabil pentru lucrrile practice, dect dup acceptul cadrului didactic
rspunztor;
11. Se vor respecta normele minime de asepsie i se va menine
distana corespunztoare fa de becul de gaz;
12. Nu se vor amesteca la ntmplare substanele, coloranii,
reactivii, care se gsesc n laborator;
13. Microscoapele se vor folosi cu mare atenie, iar la terminarea
lucrului se vor strnge corespunztor, se vor aranja la marginea mesei de
lucru i se va terge oleul de cedru cu pulpa degetului, dup care se vor
acoperi cu huse;
14. nainte de a prsi laboratorul, studentul respectiv va trece la
splarea i dezinfecia minilor;
Respectarea acestor norme minime n laboratorul de microbiologie
va permite desfurarea lucrrilor practice n condiii de siguran deplin.
288
Nivel Aplicat n: Mijloace de protecie Locul de munc
289
Bibliografie selectiv
1. *** Bureau of Community Environmental Health, Division of Environmental
Health, Florida Department of Health (2005). Annual Report, Florida. Food and
Waterborne Illness Surveillance and Investigation.
2. *** Codex Alimentarius Commision. Procedural Manual. Eleventh edition. Food
and United Nation World Health Organization, Rome, 2000;
3. *** Codex Alimentarius, Volume one B, General Requirements (Food Hygiene)
FAO- WHO, october 1997;
4. *** Codex Comitee of Food Hygiene, Thirtieth Session, Washington D.C. october
20-24, 1997;
5. *** Council Directive 91/492/EEC (1991). Health conditions for the production and
the placing on the market of live bivalve molluscs. Official Journal of the European
Communities L268: 1-14.
6. *** Evaluarea riscurilor in cadrul sistemelor de management al igienei,
http//www.dqsromania.ro; 2005
7. *** Food and Agriculture Organization Of The United Nations , Roma 1998, Food
Quality and Safety Systems A Training Manual on Food Hygiene and the Hazard
Analisis and Critical Control Point (HACCP) System http://www.fao.org, Roma
1998;
8. *** Foodborne Viral Infections U:\wpdocs\pac\info stats & nrs\Electronic
versions\Foodborne Viral Infections.doc. Feb.2008.
9. *** Guidebook for the preparation of Plans and the Generic HACCP Models
U.S.Department of Agriculture Food Safety and Inspection Service (FSIS) Office of
Policy, Program Development and Evluation (OPPDE)
http://www.fsis.usda.gov/index.htm,1999;
10. *** Hotrrea Guvernului nr. 924/2005 privind aprobarea Regulilor generale pentru
igiena produselor alimentare, publicat n Monitorul Oficial al Romniei, Partea I,
nr. 804 din 5 septembrie 2005, ce transpune Regulamentul Parlamentului European
i al Consiliului Uniunii Europene nr. 852/2004/CE.
11. *** Hotrrea Guvernului nr. 954/2005 privind aprobarea Regulilor specifice de
igien pentru alimente de origine animal, publicat n Monitorul Oficial al
Romniei, Partea I, nr. 805 din 5 septembrie 2005, ce transpune Regulamentul
Parlamentului European i al Consiliului Uniunii Europene nr. 853/2004/CE.
12. *** http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/salmonellosis_g.htm. Accesat la
data 11.02.2008
13. *** http://www.ebi.ac.uk/integr8/QuickSearch.do?action=doOrgSearch&
organismName=Lactococcus+lactis Accesat 20.02.2008
14. *** http://www.genoscope.cns.fr Accesat 20.02.2008
15. *** Manualul inginerului de industrie alimentara. Editura Tehnica, Bucuresti, vol 2,
1999 [1338-1410]
16. *** Recommended Internaional Code of Practice General Principles of Food
Hygiene (CAC/RCP 1 1969, Rev.3, 1997);
17. *** Siguranta alimentara HACCP ! HACCP !- Revista ANAMOB NEWS nr.127/15
feb.2004;
18. *** UK Statutory Instrument No. 1263 (1989). The Sludge (Use in Agriculture)
Regulations 1989. HMSO, London.
19. *** Viral Gastroenteritis Sub-Committee of the PHLS Virology Committee (1993).
Outbreaks of gastroenteritis associated with SRSVs. PHLS Microbiology Digest 10:
2-8.
290
20. *** Working Party of the PHLS Salmonella Committee (1995). The prevention of
human transmission of gastrointestinal infections, infestations, and bacterial
intoxications. Communicable Disease Report 5: Review No.11, R158 - R172.
21. ***Food and Drug Administration Center for food Safety and Applied Nutrition
Aprilie 1998- A HACCP Principles Guide for Operators of Food Establishments at
the Retail Level http://vm.cfsan.fda.gov ;
22. ***Metodologie din 30 octombrie 2001privind examenul medical la angajarea n
munc, examenul medical de adaptare, controlul medical periodic i examenul
medical la reluarea muncii Publicat n Monitorul Oficial, Partea I nr. 836 din 27
decembrie 2001
23. Ala'Aldeen, D. A. A. (2007). "Neisseria and moraxella". In Greenwood, David;
Slack, Richard; Peitherer, John; & Barer, Mike (Eds.), Medical Microbiology (17th
ed.), p. 258. Elsevier. ISBN 978-0-443-10209-7.
24. Andrews W.1. , Manual of food quality control, Rev. 1, Microbiological Analysis,
FAOUN, Roma, 1992
25. Apostu S.2. , Microbiologia produselor alimentare - Lucrri practice, vol. III, Editura
Risoprint, Cluj-Napoca, 2006
26. Banu Constantin, 2000, Tratat de stiinte si tehnologi maltului si a berii, Editura
Tehnica, Bucuresti, [177-179]
27. Banwart, G. J. 1989. Basic food microbiology, 2nd ed. Van Nostrand Reinhold,
New York.
28. Battista, J.R. Against All Odd: The Survival Strategies of Deinococcus radiodurans.,
1997, p. 203-224
29. Bauman, H.E. (1990), Concept, Development and Aplication, Food Tehnology;
30. Berzescu P., s.a., 1981, Tehnologia berii si a maltului, Editura Ceres, Bucuresti, [13,
108,109,126]
31. Bjrkroth, J., and W. Holzapfel. 2006. Genera Leuconostoc, Oenococcus and
Weissella, p.267 -319. In M. Dworkin (ed.), The prokaryotes: a handbook on the
biology of bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria, vol. 4, 3rd ed. Springer-Verlag, New
York, NY.
32. Brad Segal,1975, Tehnologia generala a industriei alimentare, Galati, [419-423]
33. Cmpeanu G.; IF Dumitru. Progrese n Biotehnologie. Bucureti, Ed. Ars Docendi,
2002.
34. Chan, V. L. Microbial genome, in Bacterial genomes and infectious diseases / edited
by Voon L. Chan, Philip M. Sherman, Billy Bourke. Humana Press, Totowa,
NewJersey 2006
35. Collins, M. D., C. Ash, J. A. E. Farrow, S. Wallbanks, and A. M. Williams. 1989.
16S ribosomal ribonucleic acid sequence analyses of lactococci and related taxa.
Description of Vagococcus fluvialis gen. nov., sp. nov. J. Appl. Bacteriol. 67:453
460
36. Collins, M. D., Samelis, J., Metaxopoulos, J. & Wallbanks, S. (1993). Taxonomic
studies on some leuconostoc-like organisms from fermented sausages: description of
a new genus Weissella for the Leuconostoc paramesenteroides group of species. J
Appl Bacteriol 75, 595603.
37. Corlett DA (1991) Regulatory verification of HACCP system;
38. Corlett DA (1991) Initiating HACCP in your food company by establishing
accountabilies, goals and a project plan;
39. Coundron, P.E., Payne, J.M., Markowitz, S.M. (1991). Pneumonia and empyema
infection associated with a Bacillus species that resembles B. alvei. J. clin.
Microbiol. 29, 1777-1779
291
40. Daniels RW, (1991)Apling HACCP to New Generation Refrigerated Foods at Retail
and Beyond
41. Dean KH, (1990),HACCP and Food Safety in Canada
42. Dellaglio, F. & Torriani, S. (1986). DNADNA homology, physiological
characteristics and distribution of lactic acid bacteria from maize silage. J Appl
Bacteriol 60, 8393.
43. Dellaglio, F., Vescovo, M., Morelli, L. & Torriani, S. (1984). Lactic acid bacteria in
ensiled high-moisture corn grain: physiological and genetic characterization. Syst
Appl Microbiol 5, 534544.
44. Diaconescu Andra, 3. Microbiologie special, Editura AgroTehnica, Bucureti, 2002
45. Escherichia. Taxonomy Browser. NCBI. Retrieved on 2007-11-30.
46. Euzby J. P., 4. LPSN, 2007.
47. Feng P, Weagant S, Grant, M (2002-09-01). Enumeration of Escherichia coli and the
Coliform Bacteria. Bacteriological Analytical Manual (8th ed.). FDA/Center for
Food Safety & Applied Nutrition. Retrieved on 2007-01-25.
48. Fleischmann, R. D., Adams, M. D., White, O., et al. (1995) Whole-genome random
sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 269, 496512.
49. G.M. Ni'matuzahroh, M. Gilewicz, M. Guiliano & J.C. Bertrand (May 1999). "In-
vitro study of interaction between photooxidation and biodegradation of 2-
methylphenanthrene by Sphingomonas sp 2MPII". Chemosphere 38 (11): 2501-
2507. PMID 10204235.
50. Gutnick D. Potential Application of Acinetobacter in Biotechnology in
Acinetobacter Molecular Biology. Gerischer U (editor), Caister Academic Press.
2008.
51. Hammes,W. P. & Vogel, R. F. (1995). The genus Lactobacillus. In The Genera of
Lactic Acid Bacteria, pp. 1954. Edited by B. J. B. Wood & W. Holzapfel. Glasgow:
Blackie Academic and Professional.
52. Hogg S. (2005) Essential Microbiology. John Wiley & Sons Ltd, The Atrium,
Southern Gate England
53. Hopulele Traian, 1979, Tehnologia maltului si a beri, [15-26, 50-53, 165-171, 173-
174, 224-228]
54. Ivana Simona Bacteriologie general, Editura tiinelor Medicale, Bucureti, 2005
55. Ivana Simona. Bacteriologie veterinar special, Editura Ceres, Bucureti, 2002
56. Ivana Simona. Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere n micologie,
Editura tiinelor Medicale, 2006
57. Jablecki J, Norton SA, Keller GR, DeGraw C, Ratard R, Straif-Bourgeois S,
Holcombe JM, Quilter S, Byers P, McNeill M, Schlossberg D, Dohony DP, Neville
J, Carlo J, Buhner D, Smith BR, Wallace C, Jernigan D, Sobel J, Reynolds M, Moore
M, Kuehnert M, Mott J, Jamieson D, Burns-Grant G, Misselbeck T, Cruise PE,
LoBue P, Holtz T, Haddad M, Clark TA, Cohen A, Sunenshine R, Jhung M,
Vranken P, Lewis FMT, Carpenter LR (2005). Infectious Disease and Dermatologic
Conditions in Evacuees and Rescue Workers After Hurricane Katrina - Multiple
States, August-September, 2005. Mortality and Morbidity Weekly Report 54: 1-4
58. James M. J., Martin J. L., David A. G.8. , Modern food microbiology 7th ed., Ed.
Springer, California, 2005
59. Jay, J. M., M. J. Loessner, and D. A. Golden. 2005. Modern food microbiology, 7th
ed. Springer, New York, NY.
60. John E. Rushing, P.A. Curtis, A.M. Fraser*, D.P. Green, D.H. Pilkington, D.R. Ward
and L.G. Turner Basic Food Microbiology,
www.ces.ncsu.edu/depts/foodsci/ext/pubs/ microbiologybasic.pdf, accesat
292
08.01.2008
61. Joseph S, Colwell R, Kaper J (1982). Vibrio parahaemolyticus and related halophilic
Vibrios. Crit Rev Microbiol 10 (1): 77-124. PMID 6756788
62. Kandler, O., Schillinger, U. & Weiss, N. (1983). Lactobacillus halotolerans sp. nov.,
nom. rev. and Lactobacillus minor sp. nov., nom. rev. Syst Appl Microbiol 4,
280285.
63. Kulwichit W, Nilgate S, Chatsuwan T, et al. (2007). "Accuracies of Leuconostoc
phenotypic identification: a comparison of API systems and conventional phenotypic
assays". BMC Infectious Diseases 7: 69.:10.1186/1471-2334-7-69.
64. Lane, DJ., B. Pace, GJ. Olsen, et al. 1985. Rapid determination of 16S ribosomal
RNA sequences for phylogenetic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 6955-6959.
65. Mara, D. and Cairncross, S. (1991). Guidelines for the safe use of wastewater and
excreta in agriculture and aquaculture. WHO: Geneva.
66. Martinez-Murcia, A. J. & Collins, M. D. (1990). A phylogenetic analysis of the
genus Leuconostoc based on reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. FEMS
Microbiol Lett 70, 7384.
67. Martinez-Murcia, A. J., Harland, N. M. & Collins, M. D. (1993). Phylogenetic
analysis of some leuconostocs and related organisms as determined from large-
subunit rRNA gene sequences: assessment of congruence of small- and large-subunit
rRNA derived trees. J Appl Bacteriol 74, 532541.
68. Maunder, D. T. 1969. Spoilage problems caused by molds of the Byssochlamys
Paecilomyces group, p. 12-16. In Byssochiamys seminar abstracts. Res. Circular no.
20, New York State Agric. Exp. Sta., Geneva.
69. Milbourne, K. (1983). Thermal tolerance of Lactobacillus viridescens in ham. Meat
Sci 9, 113119.
70. Nasima Ali, Paul R. Herron, Meirwyn C. Evans and Paul J. Dyson. Osmotic
regulation of the Streptomyces lividans thiostrepton-inducible promoter, ptipA.
Microbiology (2002), 148, 381-390
71. Nicoleta Croitor, 2002, Tehnologia generala a industriei alimentare, Editura fundatiei
universitatii, Dunarea de jos, Galati, [111-130]
72. Niven, C. F., Jr & Evans, J. B. (1957). Lactobacillus viridescens nov. spec., a
heterofermentative species that produces a green discolouration of cured meat
pigments. J Bacteriol 73, 758759.
73. Peri C, (1993), Hazard Analisis Model for Food Process; Food Science and
Tehnology Today;
74. Pot, B., L. A. Devriese, J. Hommez, C. Miry, K. Vandemeulebroecke, K. Kersters,
and F. Haesebrouck. 1994. Characterization and identification of Vagococcus
fluvialis strains isolated from domestic animals. J. Appl. Bacteriol. 77:362369
75. Put, H. M. C., and J. T. Kruiswijk. 1968. Microbiological changes in canned
pasteurized strawberries by Byssochiamys. Ann. Inst. Pasteur Lille 19:171-190.
76. Rpuntean Ghe., Rpuntean S.,9. Bacteriologie veterinar special, Editura
Academic Press, Cluj-Napoca, 2006
77. Ray, B. 2004. Fundamental food microbiology, 3rd Ed. CRC Press, Boca Ratan, FL.
78. Richardson, D. C. 1965. Incidence of Byssochlamys fulva in Queensland grown
canned strawberries. Queensl. J. Agric. Anim. Sci. 22:347-350.
79. Rotaru Gabriela, (1996), Asigurarea inocuitii alimentare cu ajutorul metodei
HACCP;
80. Rotaru Gabriela, (1997), HACCP n industria alimentar Editura Academic Galai;
81. Savu C (1999), Poluarea mediului i prezena substanelor toxice n alimente
Controlul calitii alimentelor Editura Semne Bucureti;
293
82. Savu C (2002) - Igiena i controlul produselor de origine animal, Editura Semne,
Bucureti;
83. Schliefer, K. H., J. Kraus, C. Dvorak, R. Kilpper-Balz, M. D. Collins, and W.
Fischer. 1985. Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the genus
Lactococcus gen. nov. Syst. Appl. Microbiol. 6:183195 Schliefer, K. H., and R.
Kilpper-Balz. 1987. Molecular and chemotaxonomic approaches to the classification
of streptococci, enterococci and lactococci: a review. Syst. Appl. Microbiol. 10:1
19.
84. Schmidtke, L. M., and J. Carson. 1994. Characteristics of Vagococcus salmoninarum
isolated from diseased salmonid fish. J. Appl. Bacteriol. 77:229236
85. Southwick, F.S.; D.L Purich. More About Listeria. University of Florida Medical
School. Retrieved on 7 March 2007.
86. Stanescu V., (1998), Igiena si controlul alimentelor , Editura Fundaiei ; Romania de
Maine Bucuresti;
87. Tanasupawat, S., Shida, O., Okada, S. & Komagata, K. (2000). Lactobacillus
acidipiscis sp. nov. and Weissella thailandensis sp. nov., isolated from fermented fish
in Thailand. Int J Syst Evol Microbiol 50, 1479-1485.
88. Teudea V. (1996) Igiena Alimentelor i Protecia Mediului. Vol. I, Ed. Lider,
Bucureti.
89. Thompson, Andrea. "E. coli Thrives in Beach Sands", Live Science, June 4, 2007.
Retrieved on 2007-12-03.
90. Tisler J.M. (1991), The Food and Drug Administrations perspective on HACCP,
Food Tehnology;
91. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Listeria monocytogenes and Listeriosis.
Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Biology (2003).
Retrieved on 2007-03-07.
92. Vagiakou-Voudris E, Mylona-Petropoulou D, Kalogeropoulou E, Chantzis A, Chini
S, Tsiodra P, Malamou-Lada E (2002). "Scand J Infect Dis" 34 (10): 7667. PMID
12477331.
93. Wallbanks, S., A. J. Martinez-Murcia, J. L. Fryer, B. A. Phillips, and M. D. Collins.
1990. 16S rRNA sequence determination for members of the genus Carnobacterium
and related lactic acid bacteria and description of Vagococcus salmoninarum sp. nov.
Int. J. Syst. Bacteriol. 40:224230
94. Wayne, L.G., DJ. Brenner, R.R. Colwell, et al. 1987. Report of the ad hoc committee
on reconciliation of approaches to bacterial systematics. Int. J. Syst. Bacteriol.
37:463-464.
95. Woese, CR. 1987. Bacterial evolution. Microbiol Rev. 51:221-271.
96. Yousef, A. E., and C. Carlstrom. 2003. Food microbiology: a laboratory manual.
Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ
97. Yutaka Yano,* Akihiko Nakayama, Kenji Ishihara, and Hiroaki Saito. Adaptive
Changes in Membrane Lipids of Barophilic Bacteria in Response to Changes in
Growth Pressure. Appl Environ Microbiol, February 1998, p. 479-485, Vol. 64, No.
2
294