Seria {tiin\e reale [i ale naturii

Biologie ISSN 1814-3237

CAPACITATEA ANTIOXIDANT A PREPARATELOR DE FICOCIANIN

OBINUTE N BAZA BIOMASEI DE SPIRULIN MBOGITE CU GERMANIU

Valentina BULIMAGA, Svetlana DJUR, Maria PISOV, Liudmila RUDI*, Valeriu RUDIC*
LC Ficobiotehnologie
*
Institutul de Microbiologie i Biotehnologie al AM

The optimal time to harvest spirulina biomass for phycocyanin extraction was established. The phycocyanin yield
and purity depend on used extracting solution, recording the maximum values for 1% CaCl2 solution in 10% alcohol.
The testing for antioxidant activity of phycocyanin preparations by ABTS+ was carried out for both: preparations obtained
from spirulina biomass grown on Zarrouk medium, as well as those obtained from biomass cultivated on medium
enriched with germanium. The antioxidant activity of containing germanium phycocyanin preparations was the highest.

Introducere
Studiile privind nutriia uman au scos n eviden c un coninut redus de antioxidani n alimente duce la
stresul oxidativ, n cazul cruia are loc producerea necontrolat de radicali liberi, care cauzeaz denaturarea
proteinelor, lipidelor i acizilor nucleici. Stresul oxidativ este semnificativ n geneza multor patologii [1-2]
de la cancer i pn la maladii cardiovasculare i degenerative. n ultimii ani, pentru contracararea efectului
nefast al radicalilor liberi asupra organismului este propus utilizarea bioditivelor alimentare cu efect anti-
oxidant. Antioxidanii au capacitatea de a neutraliza radicalii liberi. Activitatea antioxidant a nceput s fie
subiectul unor cercetri intensive datorit necesitilor mereu crescnde ale industriei alimentare i farmace-
utice n utilizarea unor compui bioactivi naturali anticancerigeni i anti-aging, ceea ce demonstreaz bene-
ficiile apreciabile ale antioxidanilor pentru sntate [3]. Substanele antioxidative obinute din astfel de surse
naturale, ca seminele oleagenoase, grne, boboase, legume, fructe i al., au fost studiate mai profund.
n ultimii ani atenia cercettorilor este orientat tot mai frecvent spre explorarea antioxidanilor din ciano-
bacterii i microalge. Unele studii au demonstrat c att spirulina, ct i extractele obinute din spirulin pot
inhiba unele maladii de cancer la oameni i animale i contribuie la fortificarea sistemului imun. Un compo-
nent valoros al extractelor apoase obinute din spirulin sunt ficobiliproteinele.
Ficobiliproteinele sunt proteine-pigmeni bine solubile n ap, intens colorate n albastru, care au n com-
ponena lor catene pirolice deschise, legate covalent cu resturile de cistein ale catenelor polipeptidice i care
sunt pigmeni fotosintetici suplimentari la cianobacterii. Conform datelor din liteartur, ficocianina obinut
din cianobacterii, inclusiv din Spirulina spp., posed proprieti antioxidante datorit prezenei n compo-
nena sa a gruprilor tetrapirolice, similare cu bilirubina, bine cunoscut ca un anihilator eficient de diverse
specii reactive [4-7]. Potenialul antioxidant al ficocianinei a fost evaluat i de ali cercettori, utiliznd ca
surse de ficocianin unele specii de cianobacterii marine, astfel ca Lyngbya i Phormidium spp., precum i
Spirulina sp. Autorii propun i mecanismul posibil al aciunii antioxidante a ficocianinei asupra radicalilor de
hidroxil i peroxil, care se datoreaz prezenei n cromoforul numit ficocianobilin a legturilor conjugate [5].
n scopul de a proteja organismul de consecinele stresului oxidativ, o cale eficient poate fi mbuntirea
nutriiei antioxidante. Cercetrile tiinifice efectuate n aceast direcie au demonstrat c aciunea sinergetic
a unui spectru larg de antioxidani este mai semnificativ, comparativ cu aciunea unui singur antioxidant.
Antioxidanii din sursele naturale au o bioaccesibilitate mai nalt i au o eficien protectiv mai majorat
comparativ cu antioxidanii sintetici, inclusiv un efect anticancer pronunat [8].
Conform datelor obinute la studiul in vitro, efectuat de cercettorii chinezi, Se-ficocianina obinut din
biomasa de spirulin mbogit cu seleniu manifest o aciune antioxidativ nalt i ea s-a dovedit a fi un
agent puternic antiproliferativ asupra celulelor de melanom uman A375 i adenocarcinom MCF-7 la ficat
uman [9].
S-a stabilit, de asemenea, c i compuii organici ai germaniului au manifestat o capacitate anticancerigen
nalt la tratarea unor tumori, ns aceti compui n unele cazuri pot avea i efecte adverse asupra organismului.
Substituirea compuilor organici ai germaniului sintetizai pe cale chimic cu preparate naturale, obinute n
baza biomasei de spirulin, ce conine germaniu organic legat cu componenii bioactivi, inclusiv cu ficocianina,
prezint interes att din punct de vedere teoretic, ct i aplicativ.

9
 STUDIA UNIVERSITATIS
Revist= [tiin\ific= a Universit=\ii de Stat din Moldova, 2012, nr.1(51)

Reieind din cele expuse, prezint interes lrgirea spectrului de preparate antioxidante cu aciune anti-
cancerigen i antibacterian, ce au n componena lor ficocianin cu coninut de alte elemente, cum ar fi
germaniul. Scopul lucrrii a constituit n obinerea preparatelor de ficocianin din biomasa mbogit cu
germaniu i n determinarea activitii lor antioxidante.

Material i metode
Obinerea biomasei de spirulin. Pentru a obine biomasa de spirulin utilizat ca surs de ficocianin a
fost efectuat cultivarea cianobacteriei CNMN-CB-11 pe mediul modificat Zarrouk [10] n decurs de 10 zile,
la iluminarea de 2500-3500 lx, la temperatura de 30oC. Biomasa de spirulin mbogit cu germaniu i,
respectiv, cu germaniu i seleniu a fost obinut la cultivarea spirulinei n aceleai condiii, dar cu suplimen-
tarea la mediul de nutriie n a 3-a zi de cultivare a GeS2 n concentraie de 10-15 mg/l. La a 10-a zi de
cultivare biomasa a fost filtrat i splat cu 2-3 volume de sol., 1,5% acetat de amoniu, suspendat n ap
(20 mg/ml) i supus congelrii-decongelrii repetate pentru distrugerea pereilor celulari.
Determinarea germaniului a fost efectuat prin reacia spectrofotometric cu fenilfluoron [11] n proba
de biomas supus mineralizrii prealabile.
Determinarea cantitii de ficocianin a fost efectuat dup A.Bennett i L.Bogorad [12], utiliznd for-
mula de calcul: Phyc (mg/ml)= (E620-0,434E650)/5,34
Metoda de determinare a activitii antioxidante cu radicalul cationic ABTS+ Activitatea antioxidant
a extractelor a fost determinat prin metoda de decolorare a radicalului cationic ABTS+ (2,2 azinobis
3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) elaborat de Re i al. [13]. ABTS+ a fost generat prin oxidarea
ABTS cu persulfat de potasiu. ABTS n concentraie de 7 mM i persulfatul de potasiu (2,45 mM) au fost
dizolvai n ap deionizat. Amestecul reactant se las la temperatura camerei pentru 12-16 ore la ntuneric
pn la utilizare. Din soluia de ABTS+ stoc se dilueaz cu etanol pn la absorbana 0,700 0,020 la 734 nm.
Apoi 1ml soluie diluat de ABTS+ se amestec cu 10 mcl de prob testat (1,0 mg/ml) i dup 6 min. se
msoar absorbana la 734 nm. Procentul de inhibiie a absorbanei se calculeaz conform ecuaiei:
% Inhibiie = (Abst=0 - Abst=60 min)/Abst=0 100,
unde: Abst=0min este valoarea extinciei soluiei de ABTS+ i Abst=6 min este valoarea extinciei soluiei ABTS+
dup 6 min. incubare cu probele.
Toate determinrile au fost efectuate n 3 repetiii.

Rezultate i discuii
Cercetarea aciunii antioxidante a ficocianinei din biomasa de spirulin este precedat de extragerea i
fracionarea ei de ali componeni. Conform unor date din literatur, s-a stabilit c randamentul ficocianinei
extrase dup dezintegrarea biomasei suspendate n lichid cultural este mai diminuat n comparaie cu extra-
gerea din biomasa suspendat n H2O [14]. Aceste rezultate indic la faptul c prezena srurilor ar putea
influena asupra randamentului i puritii ficocianinei extrase din biomas. n aceast ordine de idei, a pre-
zentat interes studiul influenei demineralizrii biomasei obinute asupra cantitii i calitii ficocianinei.
Demineralizarea a fost efectuat prin splarea biomasei cu soluie de 1,5% acetat de amoniu i H2O n raport
de 1:2.
Conform rezultatelor cercetrilor efectuate anterior, s-a stabilit c puritatea i randamentul ficocianinei
depinde de solventul utilizat pentru extragerea ei [15-16]. Pentru a stabili influena srurilor restante n
biomasa de spirulin asupra puritii i randamentului ficocianinei, au fost determinai aceti parametri
pentru ficocianina obinut din biomasa nedemineralizat i cea demineralizat la extragere cu ap, soluie
alcoolic de 10%, soluie apoas de 1% CaCl2 i soluie 1% CaCl2 n alcool de 10%. Rezultatele obinute
(Tab.1) demonstreaz c att randamentul ficocianinei, ct i puritatea ei sunt mai majorate la extragerea din
biomasa supus n prealabil demineralizrii. Un randament nalt (23,9-24,8%) se observ pentru toate extrac-
tele, indiferent de extragentul utilizat, ns cu nregistrarea unei valori maxime a puritii (A620/A280 =2,70)
la extragerea ficocianinei cu soluie de 1% CaCl2 n alcool de 10%.

10
 Seria {tiin\e reale [i ale naturii
Biologie ISSN 1814-3237

Tabelul 1
Influena demineralizrii biomasei spirulinei asupra puritii i randamentului ficocianinei
la extragerea ei din biomasa cultivat n condiii industriale
Proba de extract examinat Cantitatea de Randamentul Puritatea ficocianinei
ficocianin, mg/prob ficocianinei, % (A620/A280)
Din biomasa nedemineralizat:
a) apos 2,680,10 13,40,5 1,070,04
b) alcoolic (10%) 2,920,10 14,60,5 1,240,05
c) apos (1% CaCl2) 3,480,12 17,40,7 1,700,05
d) alcoolic (10%) cu 1% CaCl2 3,460,12 17,30,7 2,250,07
Din biomasa demineralizat:
a) apos 4,940,19 24,71,0 1,750,05
b) alcoolic (10%) 4,960,20 24,80,9 1,800,05
c) apos (1% CaCl2) 4,780,18 23,90,9 2,080,06
d) alcoolic (10%) cu 1% CaCl2 4,920,18 24,61,1 2,700,08

n scopul stabilirii termenului optim de colectare a biomasei, care asigur valori maxime ale randamen-
tului i puritii ficocianinei extrase din biomas, spirulina a fost supus cultivrii n decurs de 7, 10 i 15 zile.
Conform rezultatelor obinute (Tab.2), termenul optim de recoltare a spirulinei ca surs de ficocianin este la
a 10-a zi de cultivare. Totui, comparnd extractul de ficocianin apos i cel alcoolic cu 1% CaCl2, s-a
stabilit c randamentul i puritatea ficocianinei sunt mai majorate, respectiv, de cca 1,1 i 1,3 ori la extra-
gerea cu soluie de 1% CaCl2 n alcool de 10%, indiferent de termenul de recoltare a spirulinei.
Tabelul 2
Influena termenului de cultivare a spirulinei asupra puritii i randamentului ficocianinei
la extragerea ei din biomas cu H2O i soluie de 1% CaCl2 n alcool de 10%
Termenul Biomasa Caracteristica extractului de ficocianin
de de Cantitatea, mg/prob Randamentul, % Puritatea (A620/A280)
cultivare a spirulin, alcoolic alcoolic alcoolic
spirulinei mg/ml apos apos apos
cu CaCl2 cu CaCl2 cu CaCl2
7 zile 18,50,7 3,400,1 3,830,1 18,320,7 20,721,1 1,700,05 2,200,1
10 zile 20,00,8 3,910,1 4,330,1 19,50,8 21,601,2 1,960,06 2,460,1
15 zile 20,90,8 4,100,1 4,240,1 19,60,7 21,201,1 1,800,06 2,320,1

Preparatele de ficocianin obinute cu diveri solveni din biomasa cultivat n decurs de 10 zile n condiii
standard i cele obinute din biomasa mbogit cu germaniu au fost supuse testrii pentru a stabili capaci-
tatea lor antioxidant prin metoda ABTS+. Rezultatele sunt prezentate n Tabelul 3 .
Tabelul 3
Capacitatea antioxidant a preparatelor parial purificate de ficocianin, obinute din biomasa
de spirulin, determinat prin metoda ABTS+ (Abs 734 nm)
Coninutul Ge n A734(0) -
Proba analizat % inhibiie
preparat, mg/g A734(exp)
Preparate de ficocianin obinute din biomasa de spirulin cultivat pe mediul Zarrouk
1. Extract apos 0 0,1220,005 17,430,67
2. Extract cu sol. apoas 1% CaCl2 0 0,0950,005 13,570,38
3. Extract cu sol. 1% CaCl2 n 10% alcool 0 0,1010,005 14,430,52
Preparate de ficocianin obinute din biomasa de spirulin mbogit cu germaniu
1. Extract apos 0,800,02 0,1430,007 20,430,78
2. Extract cu sol. apoas 1% CaCl2 1,140,04 0,1450,007 20,710,81
3. Extract cu sol.1% CaCl2 n 10% alcool 1,140,04 0,1460,007 20,860,67

11
 STUDIA UNIVERSITATIS
Revist= [tiin\ific= a Universit=\ii de Stat din Moldova, 2012, nr.1(51)

Datele obinute demonstreaz c toate preparatele testate posed capacitate antioxidant fa de ABTS+.
Studiul comparativ al capacitii antioxidante a extractelor de ficocianin a scos n eviden valori mai nalte
ale gradului de inhibiie n cazul extractelor obinute din biomasa mbogit cu germaniu (20,43-20,86%),
comparativ cu valorile evaluate pentru ficocianina extras din biomasa cultivat n condiii standard (13,57-
17,43%). Coninutul de germaniu n preparatele de ficocianin este cuprins n limitele 0,8-1,11 mg/g de
ficocianin.
Conform unor autori, aciunea antioxidant a ficocianinei asupra radicalilor de hidroxil i peroxil se dato-
reaz prezenei n ficocianobilin (catena tetrapirolic) a legturilor conjugate [5]. Nu poate fi exclus i apor-
tul la acest proces a unor resturi aminoacide din catena polipeptidic [17]. A fost demonstrat c extractul
apos, bogat n ficocianin, obinut din alga albastr-verzuie Aphanizomenon flos-aquae, are abilitatea de a
proteja eritrocitele normale umane de deteriorarea oxidativ in vitro. Au loc schimbri spectrale ale ficocia-
ninei induse cu AAPH - (2,2'-azobis(2-amidino-propan) dihidroclorid) sau cu CaCl2. Incubarea extractului cu
ageni oxidani duce la o diminuare semnificativ a absorbanei la 620 nm i la dispariia rapid a coloraiei
albastre.
Valori mai nalte ale % de inhibiie, atestate n extractele de ficocianin obinute din biomasa mbogit
cu germaniu, se pot datora prezenei n componena lor a germaniului organic, care poate fi un antioxidant
potenial [18]. Efecte similare au fost observate i n studiul efectuat de cercettorii chinezi privind activitatea
antioxidant i antiproliferativ a ficocianinei purificate ce coninea seleniu (Se-PC), obinute din Spirulina
platensis mbogit cu seleniu [9]. Activitatea antioxidant a Se-PC a fost evaluat prin 4 metode: ABTS,
DPPH, de anihilare a anionului superoxid i de himoliz a eritrocitelor. Rezultatele au scos n eviden c
Se-PC manifest o activitate antioxidant mai puternic, comparativ cu ficocianina, n anihilarea radicalilor
liberi.
Putem concluziona c toate preparatele de ficocianin testate posed activitate antioxidant la determinare
prin metoda ABTS+, ns cu o prevalare a activitii antioxidante a preparatelor de ficocianin mbogite cu
germaniu (% de inhibiie 20,43-20,86). Biomasa de spirulin mbogit cu germaniu poate fi utilizat n
calitate de surs de Ge-ficocianin cu proprieti antioxidante i alte efecte curative. Termenul optim de recol-
tare a spirulinei pentru extragerea ficocianinei este de 10 zile. Extragentul care asigur un randament i o puri-
tate nalt este soluia de 1% CaCl2 n alcool de 10%.

Concluzii
1. A fost stabilit c etapa de demineralizare a biomasei de spirulin contribuie la majorarea puritii i a
randamentului ficocianinei extrase cu diveri solveni. Termenul optim de cultivare a spirulinei pentru extra-
gerea ficocianinei este de 10 zile. Extracia ficocianinei cu soluie de 1% CaCl2 n 10% alcool asigur un
randament (24,6%) i o puritate maxim a ficocianinei (A620/A280=2,6).
2. Preparatele de ficocianin manifest capacitate antioxidant semnificativ la determinare prin reacia
cu ABTS+, % de inhibiie prevalnd n probele de ficocianin obinut din biomasa mbogit cu germaniu
fa de ficocianina obinut din biomasa standard.

Referine:
1. Lawler J.M. Exacerbation of pathology by oxidative stress in respiratory and locomotor muscles with Duchenne
muscular dystrophy // J.Physiol, 2011, vol.25(3), p.2161-70.
2. Bennett S., Grant M.M, Aldred S. Oxidative stress in vascular dementia and Alzheimer's disease: a common pathology //
J.Alzheimers Dis., 2009, vol.17(2), p.245-57.
3. Balsano C., Alisi A. Antioxidant effects of natural bioactive compounds // Curr. Pharm. Des., 2009, vol.15(26),
p.3063-73.
4. Bhat V.B., Madyastha K.M. C-phycocyanin: a potent peroxyl radical scavenger in vivo and in vitro // Biochem.
Biophys. Res. Commun., 2000, vol.275(1), p.20-25.
5. Patel A., Mishra S., Ghosh P. Antioxidant potential of C-phycocyanin isolated from cyanobacterial species. Lyngbya,
Phormidium and Spirulina spp. // Indian J. of Biochem. and Biophysics., 2006, vol.43, no.2, p.25-31.
6. Bertolin T.E., Farias D., Guarienti C.F. et al. Antioxidant effect of phycocyanin on oxidative stress induced with
monosodium glutamate in rats // Braz. arch. biol. technol., 2011, vol.54, no.4, p.733-738.
7. Bermejo P., Piero E., Villar .M. Iron-chelating ability and antioxidant properties of phycocyanin isolated from a
protean extract of Spirulina platensis // Food Chemistry, 2008, vol.110, no.2, p..436-445.

12
 Seria {tiin\e reale [i ale naturii
Biologie ISSN 1814-3237

8. Saxena A., Saxena A.K., Singh J., Bhushan S. Natural antioxidants synergistically enhance the anticancer potential of
AP9-cd, a novel lignan composition from Cedrus deodara in human leukemia HL-60 cells // Chem. Biol. Interact.,
2010, vol.188(3), p.580-90.
9. Tian Feng Chen, Yum-Shing Wong. In vitro antioxidant and antiproliferative activities of selenium-containing
phycocyanin from selenium-enriched Spirulina platensis // J. Agric. Food Romey, 2008, vol.2008, no.12, p.4352-4358.
10. Rudic V. Aspecte noi ale biotehnologiei moderne. - Chiinu: tiina, 1993.
11. Marczenko Z.; Balcerzak, M. Separation, preconcentration and spectrophotometry in inorganic analysis. - E-book
type: Imprint: Elsevier, 2000.
12. Bennett A., Bogorad L. Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga // Journal of cell biology,
1973, vol.58, p.419-435.
13. Re R. et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay // Free Radical
Biology & Medicine, 1999, vol.10, p.1231-1237.
14. Cisneros M., Rito-Palomares M. A simplified strategy for the release and primary recovery of C-phycocyanin
produced by Spirulina maxima. // Chemical and Biochemical Engineering Quaterly, 2004, vol.18, no.4, p.385-390.
15. Bulimaga V., Djur S., Pisov M. et al. Elaborarea tehnologiilor noi de obinere n baza biomasei de spirulin a pre-
paratelor de ficocianin // Conferina tiinific internaional Biotehnologia microbiologic domeniu sciento-
intensiv al tiinei contemporane, Chiinu 6-8 iulie 2011, p.9-10.
16. Bulimaga V., Pisov M. Exploararea biotehnologic a biomasei de spirulin n calitate de surs de ficocianin aditiv
alimentar i cosmetic // Conferina tiinific internaional Creterea impactului cercetrii i dezvoltarea capaci-
tii de inovare, USM, Chiinu, 21-22 septembrie 2011, p.38-41.
17. Romay Ch. et al. C-phycocyanin: A biliprotein with antioxidant, anti-inflamatory and neuroprotective effects //
Current protein and peptide science, 2003,vol.4, no.3, p.207-216.
18. Wakabayashi Y. Effect of germanium-132 on low-density lipoprotein oxidation and atherosclerosis in Kurosawa
and Kusanagi hypercholesterolemic rabbits. // Bioscience biotechnology and biochemistry, 2001,vol.65, no.8, p.1893-1896.

Prezentat la 03.04.2012

13