MINISTERUL SĂNĂTĂŢII AL REPUBLICII MOLDOVA

UNIVERSITATEA DE STAT DE MEDICINĂ ŞI

FARMACIE “NICOLAE TESTEMIŢANU”
FACULTATEA FARMACIE
CATEDRA TEHNOLOGIA MEDICAMENTELOR

TEZĂ DE DIPLOMĂ

TEMA:
„ANALIZA ŞI STUDIUL FORMELOR
MEDICAMENTOASE SUPOZITOARE CU LIDAZA
FOLOSITE ÎN PRACTICA GINECOLOGICĂ.”

PEREŢ ECATERINA
ANUL V GR.F 1101

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC :
DOCTOR ÎN FARMACIE

CONFERENŢIAR UNIVERSITAR

DIANA GURANDA

CHIŞINĂU 2016
 CUPRINS:
Introducere………………………………………………..
Capitolul I. Referinţa bibliografică asupra tezei.
1.1 Utilizarea lidazei în medicină............................................................
1.2 Aspectul biofarmaceutic al administrarii vaginale a
medicamentelor................................................................................

1.3 Principiile de selectare a excipienţilor pentru supozitoare..............

1.4 Caracteristica excipienţilor pentru supozitoare ..............................

Capitolul II. Obiecte şi metode de cercetare .

2.1 Proprietaţi fizico-chimice ale lidazei...........................................................

2.2 Controlul calităţii supozitorilor..................................................................

2.3 Controlul disponibilităţii farmaceutice........................................................

Capitolul III. Obţinerea şi cercetarea suppozitoarelor vaginale cu lidaza

(partea experimentală).

3.1 Tehnologia de obţinere a supozitorilor vaginale cu lidaza pe diferiţi

excipienţi...........................................................................................................

3.2 Determinarea timpului de deformare şi topire completă a supozitorilor cu

lidaza...................................................................................................................

3.3 Studiul disponibilităţii farmaceutice a lidazei din supozitorile vaginale.

Concluzii.

Bibliografie.
Introducere:
 CAPITOLUL I.
1.1 Utilizarea lidazei în medicină.
Tratamentul modern al multor boli nu are hotare, și de foarte multe ori medicina
ofera o mulțime modalități alternative de a depăși acest lucru .

Lidaza - este un preparat enzimatic derivat din testicule de bovine.Descompune

componenta principală a țesutului conjunctiv substanță interstițială - acidul
hialuronic (mucopolizaharid, care constă din acetil glucozamina si acid glucuronic,
este o substanță de cimentare a țesutului conjunctiv), reduce viscozitatea, mărește
permeabilitatea vasculară a ţesutului, facilitează circulația fluidelor în spațiile
interstițiale; reduce umflarea țesuturilor, catifeleaza si aplatizeaza cicatricii, crește
gama de miscare la nivelul articulatiilor, reduce contractura si previne formarea
lor. Hialuronidază provoacă descompunerea acidului hialuronic la glucozamina si
acid glucuronic, reducând astfel vâscozitatea.

Istoria descoperirii
Pentru prima dată capacitatea unui extras din testicule de taur a crește
permeabilitatea tesuturilor a spus F. Durand-Raynal (F. Duran-Reynals) în 1928.
Agentul activ a fost numit factor de răspândire (Ing. spreading factor), datorită
capacității sale de a crește rata de raspandire a vaccinurilor virale de la locuri de
injectare subcutanată. În 1931, același factor a fost izolat din spermatoizi.În 1936-
1937 Carl Meyer a dovedit capacitatea factorului de răspîndire din testicule
taurului a degrada polizaharide acide izolat din vitros, cordonul ombilical și
bacterii din genul Streptococcus și a indicat că el are acelaş efect al enzimelor
autolitice ale bacterii de pneumococ. Aceasta enzima a avut diferite denumiri duşa
diferite autori : factorul de difuzie (eng. diffusing factor),enzima mucolitică,
mucinaza. În 1940, Karl Meyer a introdus termenul hialuronidaza pentru a se referi
la un grup de enzime de diferite origine, pentru posibilitatea lor de descompune
mucopolizaharide acide. Din acel moment, termenul de "hialuronidază" a început
să fie utilizat de către diferiți autori ca sinonim pentru "factorul de răspândire".
Tratamentul cu lidaza.

Lidaza se prescrie pentru tratamentul multor boli, precum şi pentru simptome

specifice. Lista de indicatii pentru utilizarea acestui medicament include:
- cicatrii de origine diferită (post-chirurgicale , traumatismale sau după arsuri );
- rigiditate articulară;
- ulcer perioadă de vindecare care a durat;
- contracturi articulare care rezultă din leziuni sau inflamatii;
- osteoartrita;
- tenosinovite cronice;
- spondilită anchilozantă;
- boli care afecteaza nivelul coloanei vertebrale lombare;
- boli ale pielii, inclusiv sclerodermia;
- hidrocefalie;
- infarct miocardic;
- retinopatie;
- hematome ale ţesuturilor moi localizate pe suprafaţa ;
- inflamarea tractului respirator superior, însoțită de obstrucția;
- nevrita.

Lidaza in ginecologie.

Tratamentul modern al multor boli nu are granițe, și de foarte multe ori medicina
ofera modalități alternative de a depăși acest necazuri .
Acest lucru este valabil mai ales pentru sanatatea femeei, în special problema de
planificare a sarcinii și incapacitatea de a rămâne insărcinata.
Când este imposibil de a rămîne însărcinată ceva timp, iar femeia a avut o
interventie chirurgicala la organe interne, sexuale, avort, boli infectioase
insuficient tratate, de foarte multe ori există adeziuni. Rezultatul formării lor -
impermibilitatea, ceea ce duce la infertilitate. Astăzi această problemă este
rezolvată prin interveţie chirurgicală - laparoscopie. La efectuarea ei piroane sunt
eliminate și conductele obţin permeabilitatea precedentă. În mod evident, nu
fiecare femeie este gata pentru o intervenție chirurgicală, așa se încerc auto-
tratamente bolii adezive prin metodele tradiționale. Dar medicina nu stă pe loc.
Pentru a combate piroane femeilor sînt sugerate să utilizeze lumânări vaginale cu
lidaza. Lidaza în alte forme farmaceutice, este utilizată pe scară largă în aproape
toate domeniile de medicina. În ceea ce privește ginecologie, lumânările sunt
utilizate nu numai pentru resorbția de adeziuni, dar, de asemenea, pentru
tratamentul cistitei interstitiale cronice şi infertilitate .
Acidul hialuronic este materialul de construcție de bază a adeziunilor. Lidaza,
distrugând-o, face piroanele mai moi.Prin scoaterea edemurilor, medicamentul
îmbunătățeşte permeabilitatea vaselor sanguine. Acest lucru este important mai
ales din punctul de vedere ginecologic, deoarece aceasta poate fi unul dintre
motivele pentru care femeia sufera de infertilitate.
Lumănări cu lidaza sunt larg răspândite în pneumologie, urologie, ortopedie,
cosmetică, chirurgie, dermatologie, și sunt de asemenea folosite pentru a crește
biodisponibilitatea medicamentelor.
In ginecologie lidaza se utilizează în calitate de supozitoare sau pulberi uscate
care se dizolvă și soluția rezultată se foloseşte pentru injectare. Cea mai eficienta
metoda cu acest medicament este electroforeză. Procedura se bazează pe acțiunea
unui curent electric constant care trece prin aplicația cu substanța
medicamentoasă.

Substanţa activă a lidazei cu anumite porțiuni se furnizează la ţesuturi. În

scopul de a scăpa de adeziuni și alte probleme ginecologice, de obicei, sunt
suficiente 10 proceduri. Există cazuri mai severe, în care medicul prescrie cîteva
cursuri de electroforeză.

Există alte metode de tratament cu hialuronidază. Injecțiile cu lidaza se introduc

în ovar. Preparatul actioneaza timp de două zile. În unele cazuri, femeilor este
recomandat sa facă tampoane cu Lidaza. Procedura se repetă timp de 10 zile pe
noapte. Un bun efect antiinflamator au tampoane cu lidaza combinate cu dimexid.

Contraindicaţi:

Contraindicații la utilizarea acestui medicament sunt: sarcina, alăptarea, și

idiosincrasie la componentele medicamentului. Aplicarea lor ar putea fi în legătură
cu alte medicamente, inclusiv antibiotice, antifungice, antivirale și antihistaminice.
Pentru a evita reacții alergice sau alte efecte secundare, medicul dumneavoastră vă
poate prescrie procedura de testare specială. Astfel de procedură este scrisă în
instrucțiunile pentru fiecare medicament. Utilizarea acestor lumânări nu este
recomandată în formele acute de boli infecțioase, prezența proceselor inflamatorii
puternice, precum medicamentele hormonale cu estrogeni în compoziție.
Prezența a tumorii maligne se referă de asemenea la contraindicații utilizării a
medicamentului. Lumanari Lidaza, la fel ca orice alt medicament ar trebui să fie
utilizaţi numai cu prescripţia de către medicul dumneavoastră.

1.2 Aspectul biofarmaceutic al administrarii

vaginale a medicamentelor.
Administrarea unor medicamente pe cale vaginală este de asemenea cunoscută din
cele mai vechi timpuri. În Evul mediu substanţele active,aglomerate sub formă de
bastonaşe,se întroduceau într-un săculeţ de material taxtil şi astfel erau întroduse în
vagin. Aceste preparate denumite „pessarii”,descrise de Hippocrate,aveauîn
partea inferioară un fir care uşura scoatrea lor după tratament.

Folosirea amestecurilor de ceara cu untura de porc a condus la obţinerea unor

preparate asemănătoare ovulelor,iar introducerea masei gelatinoase, ca bază de
ovule , a marcat un progres în realizarea acestei forme ,fiind cu succes utilizată
pînă în prezent alături de alţi excipienţi.

Preocuparea pentru tratamentul local al afecţiunilor vulvo-vaginale este citată

încă din timpul lui Herodot (484 î.e.n.), la greci cu 1200 ani î.e.n., în scrierile lui
Hippocrat, Celsus, şi Galenus. Pentru tratarea locală a vaginitelor se prescriau
diferite topice locale cu efect astringent , sub formă de irigaţii, pudre inerte sau
astringente,badijonări,irigaţii.

Supozitoarele vaginale reprezintă o formă farmaceutică prescrisă pentru

administrarea medicamentelor pe cale vaginală. După F.R. IX, „supozitoarele sînt
preparate farmaceutice obţinute din una sau mai multe substanţe active încorporate
într-un excipient, destinate a fi administrate pe cale vaginală”.

Supozitoarele vaginale dupa forma se difera de cele rectale;

ovoidală,conică,hexagonală,de torpedo,în forma de migdală,cilindrică sau alte
forme. Masa variază între 2 şi 16 g, în funcţie de vărsta pacientei,natura bazei de
supozitor,sau forma lor.Greutatea ovulelor sferice este între 3 şi 5 g, cele ovoidale
între 8-10g.

Calea intravaginală a reţinut atenţia, încă din secolul trecut ca făcînd posibilă o
absorbţie prin mucoasa sa.
În 1905 Fauconnet compară absorbţia iodurii de potasiu ,dispersată în vaselină pe
mucoasa vaginală şi pe piele intactă sau lezată. Macht constată că derivaţii
arsenului sau ai mercurului sînt absorbiţi, la cîini sau pisică, pe această cale. O
creştere momentală a glicemiei se înregistrează după absorbţia vaginală a unei
doze de insulină. Aceste date sînt utile pentru a evita manifestările toxice a unor
substanţe sau pentru instruirea unui tratament hormonal sau cu prostaglandine.

Administrarea intravaginală a medicamentelor cu efect sistemic a început în

1947 odată cu cercetările efectuate de Rock şi colaboratorii care au demonstrat că
aplicarea vaginală a unor supozitoare cu penicilină au permis menţinerea unui nivel
sanguin a antibioticului în doză terapeutică timp de 4 ore la 6 ore. Absorbţia este
slabă sau lipseşte.
 După alţi autori calea vaginlă este defovorabilă acestei antibioticoterapii
datorită penicilinazei şi altor bacterii prezente în vagin. Eastman şi Scott arată că
acetatul fenilmercuric introdus intravaginal a fost regăsit în urină după 24 ore.
Lang şi Kunze au evidenţiat chiar o retenţie renală acestei substanţe substanţe care
se elimină prelungit timp de o săptămîna.

Biodisponibilitatea substanţelor active pe această cale este variabilă datorită

particularităţilor mucoasei,influenţată de schimbările ciclice ,de pH, de prezenţa
microorganismelor şi de prezenţa hormonilor oestrogeni. De aceste variaţii se ţine
cont la realizarea noilor sisteme terapeutice.

Absorbţia vaginală este condiţionată de următorile factori: variaţiile ciclice ale

stării mucoase,realizarea unui pH coborît,modificările morfologice şi dimensionale
şi o secreţie intermidiată vaginală. Reţeaua sanguină bogată ,porii şi constituenţii
lipidici ai epiteliului constituie de asemenea căile de pasaj.

Terapia pe cale vaginală prezintă următoarele avantaje: poate fi aplicată de

pacientă, asigură o concentraţie continuă eficace, riguros controlabilă, fără riscul
toxicităţii căii orale.

În timp ce pe cale orală medicamentul este decelat după 30 minute, atinge o

concentraţie maximă între 1-4 ore , apoi scade la 0,3-0,6 ng/ml pe cale vaginală,
absorbţia este rapidă, se menţine aproape constantă după 3 zile , timp îndelungat.

Fig. 1. Model fizic de eliberare a unui principiu activv pe cale sistemica aplicat –
intravaginal.
Un alt avantaj constă în evitarea primului pasaj hepatic , deoarece venele perineale
care drenează ţesutul vaginal se varsă în venă ruşinoasă şi care apoi intră în vena
cavă. Acest fapt este pozitiv pentru unii hormoni (progesteron,estradiol) inactivaţi
de metabolismul hepatic sau pentru prostaglandine care produc tulburări gastro-
intestinale.

Absorbţia medicamentelor prin calea endovaginală.

Tratamentul aplicat endo- şi exovaginal urmăreşte un efect de obicei local.
Absorbţia prin vagin se face prin difuziune pasivă. Pentru o absorbţie minimă, cît
mai limitată şi un efect preponderent local se va avea în vedere următoarele:

1) Medicamentele aplicate vaginal , endovaginal trebuie să aibă o liposolubilitate

redusă sau coeficientul de repartiţie ulei/apă să determine o difuziune pasivă
minimă.

2) Alegerea formei farmaceutice se va face în raport cu natura afecţiunii: în

cazul afecţiunilor cu hipersecreţie nu se vor utiliza baze cu gelatină glicerintă. De
asemenea bazele cu polioxietilenglicoli nu sînt indicate deoarece provoacă o
iritaţie locală şi stimulează activitatea secretorie. Sînt indicate baze lipofile sau,
dacă substanţa activă este în cantitatea mare, se apelează la aplicarea
comprimatelor ginecologice care necesită cantităţi reduse de substanţe auxiliare.

3) Se urmăresc încompatibilităţile care ar putea surveni între substanţa

medicamentoasă şi substanţele auxiliare, conservanţi, excipienţi. Se vor asocia cu
prudenţa substanţele tensioactive care favorează difuziunea şi împraştierea
principiilor active dar pot reduce efectul microbiologic, în cazul existenţei
substanţelor antiseptice, prin complexarea acestora sau endocitoza micelelor.

4) Tehnologia de preparere a supozitoarelor vaginale, comprimatelor şi altor

forme farmaceutice va fi conformă cu normele impuse, iar dozele maxime se vor
verifica după procedura de la medicamentele administrate per oral.

5) Examinarea cedării in vitro va stabili viteza de dizolvare a substanţei active

din forma respectivă cu o metodă asemănătoare cu a preparatelor per orale, sau pe
cale microbiologică pentru principii bacteriostatici.

6) Se va urmări clinic, eficienţa preparatelor ginecologice pentru estimarea

eficienţei tratamentului, a următorilor efectelor negative ale substanţelor auxiliare.
Se prelevează probe de sînge pentru constatarea efectelor secundare nedorite. De
asemenea se urmăreşte dacă nu apare o iritaţie locală.
1.3 Principiile de selectare a excipienţilor pentru
supozitoare.
Supozitoarele sînt constituite din substanţe active, excipienţi,baze sau mase
pentru supozitoare şi eventual alte substanţe ajutătoare sau adjuvanţi.

Ca excipienţi pentru prepararea supozitoarelor se întrebuinţează excipienţi

liposolubili ca unt de cacao , grăsimi semisintetice sau sintetice neutre sau
excipienţi hidrosolubili. În cazul în care pe prescripţie nu este indicat excipientul,se
va folosi unt de cacao , masă gelatinoasă sau alt excipient , menţinîndu-se
excipientul folosit pe prescripţia medicală.

Excipienţi pentru supozitoare trebuie să îndeplinească următoarele condiţii

generale :

 să fie inerţi din punct de vedere fiziologic, să nu provoace iritaţii la

nivelul mucoasei intestinale prin duritatea prea mare sau prin produşi
de rîncezire;

 să se topească la temperatura corpului în cazul celor care cedeză

prin fuziune principiile active încorporate, sau să se dizolve în
contactcu mucoasele;

 să prezinte un interval redus între punctul de topire şi punctul de

solidificare, aceasta permite o solidificare rapidă în formele de
turnare, bună capacitate de contracţie şi evitarea răcirii formelor;

 să fie indiferenţi din punct de vedere chimic (să nu producă

incompatibilităţi cu substanţe active);

 să nu prezinte modificări alotrope instabile;

 să aibă o vîscozitate corespunzătoare şă o consistenţă potrivită,

pentru reducerea sedimentării substanţelor active suspendate şi
asigurarea unei bune exatităţi de dozare;

 să permită încorporarea de fluide hidrofile şi lipofile;

 să permită o cedare şi o absorbţie corespunzătoare a substanţelor
active încorporate prin topire sau dizolvare într-un timp scurt ;

 să fie stabili, să nu se altereze prin conservare, să nu se coloreze, să

nu se întărească ulterior, să-şi păastreze forma şi rezistenţa
mecanică, să nu rîncezească şi să asigure stabilitatea principiilor
active încorporate.
1.4 Caracteristica excipienţilor pentru supozitoare.
Acţiunea dorită, locală sau mai îndepărtată este asiguratp de alegerea unui
excipient adecvat care să permită o dispersare uniformă a substanţei active pe toată
mucoasa vaginală şi să asigure o bună aderenţă pe mucoasa umedă. Pentru acest
scop sînt eficienţi expicienţii hidrofili, cum este masa de gelatină glicerinată, care
se caracterizează printr-un timp foarte scurt de dizolvare în secreţiile vaginale.

Excipienţii pentru supozitoare vaginale se clasifică în :

 excipienţi hidrosolubili : masa de gelatină glicerinată, gelul de agar,

polietilenglicolii.

 excipienţii liposolubili : untul de cacao, grăsimi hidrogenate solidificate,

ftalatul de cetil, gliceride sintetice ale acizilor graşi saturaţi, grăsimi
hidrogenate, trigliceride ale acizilor graşi saturaţi.

Excipienţi hidrosolubili
Masa de gelatină glicerinată este excipientul hidrosolubil cel mai folosit la
prepararea supozitorilor. Se bazează pe asocierea în cantităţi diferite a gelatinei,
glicerinei şi a apei, în porţii diferite.

Pentru încluderea diferitor substanţe active proporţiile componentelor pot fi

modificate după caz în viderea realizării unei consistenţe potrivite, avînd intervalul
de topire cerut. În ţările cu climă tropicală se va mări cantitatea de gelatină.
Proporţia de 12,5% gelatină determină consistenţa formei. La nevoie poate fi
modificată între limitele 7-22%.

Prepararea masei gelatinoase după formula menţionată în F.R.IX se face astfel:

gelatin se mărunţeşte (ca pulbere groscioară), se lasă cu apă prescrisă pentru
îmbibare 15-20 minute într-o capsulă tarată. Se adaugă glicerina şi se încălzeşte pe
baia apă la o temperatură de 50-60º C amestecînd continuu pentru evitarea
includerii aerului, pînă la dizolvare completă. Se completează apa evaporată şi se
încorporează substanţele active.

După tenica de preparare dată de U.S.P. pentru prepararea generală a

supozitoarelor vaginale, avînd ca excipient masa gelatinoasă, se prevede:
substanţele active se cîntaresc într-un vas tarat, se completează cu apă la 10g (în
care se dizolvă sau se suspendă), se adaugă apoi 10 g glicerină şi se amestecă, apoi
20 g gelatin în granule mari, amestecînd cu atenţie evitînd încluderea aerului. Se
încalzeşte pe baia de apă pîna la dizolvarea gelatinei. Masa topită se toarnă în
forme. Se recomandă următoarea tehnologie : se îmbibă gelatina în apă, apoi se
adaugă glicerina şi se îcălzeşte be baia de apă. După dizolvarea amestecului se
completează apa evaporată şi amestecă bine.Medicamentele prescrise se întroduc
uniform în această masă sub formă suspendată ca pulberi, sub formă de soluţie, sau
amestecînd omogen cu o substanţă potrivită. Amestecul se toarnă în forme.

Masa gelatinoasă cu conţinut mare de glicerină este higroscopică şi produce un

aflux mare de apă în lumenul intestinal prin fenomene de osmoză, ca în ovulele cu
conţinut în glicerina de 60-70%.

Dacă se ridică conţinutul în gelatină la 65-70% se obţine, după uscare un xerogel

care serveşte pentru prepararea capsulelor rectale. Se poate substitui glicerina cu
propilenglicol, cu 2-3 butilenglicol, sorbitol sau manitol.

Se vor avea în vedere unele incompatibilităţi dintre masa gelatinoasă şi diferite

substanţe ciclice ca : tanin, săruri solubile, ioduri, săruri solubile ale metalelor
grele, acizi şi baze tari ,săruri solubile,ioduri, săruri solubile ale metalelor
grele,acizi şi baze tari, săruri de amoniu, urotropina,clohidrat,formaldehidă, apă şi
soluţii apoase.

În masa gelatinoasă se pot include numeroase substanţe active.Conservarea masei

gelatinoase se face introducănd în formula de preparere 0,10% nipagin şi se
păstrează în borcanele ermetic închise la rece,timp de 30 de zile.

Ca excipient hidrofil este propus , de unii autori,colagenul inclus în masa glicero-

gelatinoasă. Se poate utiliza hidrolizatul de colagen obţinut din colagen supus
acţiunii enzimelor proteolitice, purificat şi liofilizat. Este biodegradabil şi păstrează
proprietăţile colagenului nativ.Sorturile de colagen cu greutatea moleculară mică
prezintă un timp mai scurt de dezagregare al masei gelatinoase (30 minute). În
tabel sînt redate cîteva formule.
Excipienți hidrofili pe bază de colagen pentru supozitoare vaginale.

Ingediente Cantități Timp de

I II III dezagregare
Gelatină 1,00 1,00 1,00 Formula I, 33min.
Hidrolizat de colagen 0,50 0,50 0,50 Formula II,32 min.
Glicerina 10,00 9,00 9,00 Formula III,30 min.
Ulei de ricin - 1,00 -
Soluție 4,00 4,00 4,00
conseravantă(F.R.IX)
Lecitină - - 0,50

Gelul de agar-agar, în concentraţie de 3,3%, se prepară prin dispersarea agarului

în apă distilată fiartă şă în preyenţa esterului metilic al acidului p-hidroxibenzoic
0,10%.

Polietilenglicolii cu grad mai mic de polimerizare se ascociează cu

polietilenglicolii cu grad ridicat de polimerizare. Prezintă avantajul solubilităţii în
apă, se înmoaie la temperaturi cuprinse între 31,5-36,5 ºC facilitînd cedarea
substanţelor active. Se pot utiliza unele amestecuri de polietilenglicoli cu calităţi
optimizate prin adaos de polisorbaţi, ulei de ricin, 3-5% ulei de parafină sau 2-3%
apă.

Pentru reglarea consistenţei se adaugă P.E.G. 1000 şi P.E.G. 4000 în proporţie

de 9:1. Masa va avea un punct de topire la 40 ºC. Masa cu macrogoli dă o senzaţie
de jenă la aplicare datorită activităţii osmotice exagerate a P.E.G.-urilor. Se vor
avea în vedere şi unele incompatibilităţi ale acestor macromolecule cu diferite
medicamente.

Se prelucrează prin tehnica de preparare prin topire şi turnare în forme.

Încorporarea substanţelor active se face în funcţie de solubilitatea lor în aceste
baze.

Excipienţi liposolubili utilizaţi la obţinerea supozitoarelor vaginale

Dintre excipienţi liposolubili frecvent utilizaţi sînt: untul de cacao, grăsimile
hidrogenate solidificate, ftalatul de cetil, masele Estarium şi Witepsol.

Untul de cacao se utilizează în cantităţi de 2-3 g pentru un globul. Prezintă

dezavantajul că, prin caracterul sau hidrofob nu permite incorporarea soluţiilor
apoase,conduce la o eliberare parţială a substanţelor active. Este foarte util pentru
o acţiune locală.

Se pelucrează doar pulberi fin pulverizate şi distribuite uniform în masa de

supozitor. Se amestecă continuu iar masa se menţine la o temperatură cît mai
apropiată de cea a punctului de solidificare , cînd se procedează la turnarea în
forme.Este necesară o solidificare rapidă pentru evitarea sedimentării substanţelor
active . Se poate recurge în aceste scop la mărirea vîscozităţii masei prin adaos de
stearat de aluminiu, monostearat de gliceril, bentonită în cantităţi cuprinse între 2-
5%. Fructuaţia vîscozităţii excipienţilor este ilustrată de valorile medii ale
vîscozităţii.

Prezintă modifiări ale consistenței , manifestate prin scăderea punctului

topire,difeciența care se corectează prin adăugarea unor substanțe care se
corectează prin adăugarea unor substanțe care ridică punctul de fuziune ca : ceara
3-5%, cetaceul,alcoolul etilic 1-3%.

Uleiurile și grăsimile hidrogenate și cele solidificate se pot folosi datorită

rezistenței la autooxidare.

Adeps solidus sau Adeps neutralis (Masa Estarium) sînt excipienți recomandați și
pentru supozitoare vaginale de Ph. Belg., B.P.,U.S.P. În ei se pot înclude soluții
apoase sub formă de emulsie A/U, se dispersează ușor pe mucoasa vaginală,sînt
ușor conservabili. Masa Estarium se indică pentru prelucrarea substanțelor care
ridică punctul de topire. Asigură o cedare rapidă a ubstanțelor liposolubile.
Prezintă o bună stabilitate și o inerție chimică față de substanțe active, o slabă
contrație de volum fapt care permite prepararea supozitoarelor prin turnare în
condiții optime. Se pretează și la prelucrarea manuală sau prin presare în forme.

În cazul prelucrării cu Masa Estarium, anestezina și acetatul de hidrocortizon se

suspendă în excipientul topit. Acetatul de hidrocortizon din fiole se emulsionează
în Masa Estarium prin triturare energică în masa topită la care se adaugă 1g tween
80.

Ihtiolul se dispersează prin triturare cu excipientul gras. Dacă amestecul se

înmoaie, se răcește masa timp de 5-10 minute, apoi se continuă prepararea.
Formele metalice se vor gresa cu ulei de parafină.

În cazul prescrierii unor hormoni în cantități mici, aceștia vor fi încorporați sub
formă de pulberi titrate (pulbere titrată cu 1% hexestroldiacetat, cu lactoză), fie se
adaugă cantitatea corespunzătoare din comprimate sau fiole (sintofolin). Amestecul
de pulberi se adaugă în excipientul în stare semisolidă cînd prelucrarea se face prin
topire-turnare sau în excipientul ras în prezența uleiului de ricin sau lanolinei în
cazul prelucrării manuale.

Pulberile termostabile, pulberile vegetale și extractele uscate se pot prepara prin

suspendare în Masa Estarium ușor încălzită. Dacă acestei mase i se adaugă 2%
aerosil sau 5% monostearat de gliceril se asigură o vîscozitate potrivită. În acest
amestec se pot încorpora antibiotice ca: penicilina, tetraciclină, cloramfenicol și
bacitracina.

La preparatele prelucrate manual se folosește ca agent conspergant amidonul.

Pentru corectarea friabilității produselor li se adaugă ulei de ricin sau lanolina
anhidra.

Masa Estarium este incompatibilă cu mediul alcalin. Proprietățile mai

importante și sorturile selecționate pentru ovule sînt prezentate în tabel.

Natura bazei Punctul de topire Punctul de solidificare Indice de

hidroxil
Masa Estarium A 33-35º 29-31º 40
Masa Estarium B 33,5-35,5º 31,5-33,5º 20
Witepsol S 52 32-33,5º 27-30º -
Witepsol S 58 32-35,5º 27-29º -
Witepsol S - - 50-75

Witepsolul (Masa Imhausen) se utilizează sub formă de Witepsol G 58 special

pentru ovule, ele putînd fi preparate atît prin turnare cît și prin modelare.

Încorporarea substanțelor active mai frecvent prescrise în terapia locală

ginecologică, se face astfel: glicerina se emulsionează în concentații diferite în
Witepsol. Ihtiolul ,balsamul de Peru se triturează , cu 2/5 din greutatea lor , cu
uleiul de ricin sau cu Myglyol 812 și apoi se încorporează în Witepsol topit.
Testosteronul se încorporează prin dizolvare în Witepsol H la 90ºC în proporție de
1,1%, iar la răcire excesul cristalizează în cristale foarte fine care se resorb.

Chinina se încorporează fără dificultăți pînă la 50% din greutatea suzitorului

vaginal. Mentolul,eucaliptolul, camforul, guaiacolul,cloralul hidrat se pot
încorpora, dependent de cantitate, în amestec de Witepsol E 75, E 85 cu E 79.

Uleiurile volatile se fixează pe carbonat de magneziu «ușor» sau pe lactoză și se

încorporează în masa pentru evitarea volatilizării lor. Tincturile sau extractele
fluide pot fi încorporate prin amestec cu Mygliol 912, care solubilizează soluțiile
alcoolice și apoi se amestecă cu masa topită de Witepsol. Sulfamidele se triturează
cu 5-10% Mygliol 812, apoi se încorporează în Witepsol. Penicilina se prelucrează
convenabil în Witepsol H 15, fiind stabilă 2 ani. Se menționează o întîrziere în
resorbția subatanțelor active datorită punctului de topire al masei. Este
incompatibil cu mediul alcalin.

Lassupolul se poate asocia cu substanțe active și se pretează la prepararea prin

topire și turnare în forme.

Ферментативная активность: реакции и условия[править | править вики-

текст]

Тип I[править | править вики-текст]

Гидролизуют β-N-ацетилгексозаминидные связи субстрата. Конечными

продуктами гидролиза являются тетрасахариды, имеющие аминосахар на
восстанавливающем конце молекулы.

Кроме того, тестикулярная (Ia) и лизосомальная (Ib) Гиалуронидазы

способны к трансгликозилазной активности, проявляющейся в
перенесении дисахаридных фрагментов между молекулами субстрата.
Тестикулярная гиалуронидаза проявляет ферментативную активность в
диапазоне рН 4,0 — 7,0. Для лизозомальной и субмандибулярной (Ic)
гиалуронидаз такой диапазон более узок (3,5 — 4,5).

Собственно тестикулярная гиалуронидаза, в отличие от всех остальных

гиалуронидаз, обладает высокой термической стабильностью и сохраняет
ферментативную активность до 50 °C.

Тип II[править | править вики-текст]

Гидролизует β-глюкуронидные связи исключительно в гиалуроновой

кислоте. Конечными продуктами гидролиза являются тетрасахариды,
имеющие глюкуроновую кислоту на восстанавливающем конце молекулы.

Оптимальное значение рН для гиалуронидаз данного типа равно 6,0.

Тип III[править | править вики-текст]

Гидролизуют β-N-ацетилгексозаминидные связи субстрата, одновременно с

этим дегидратируя по 4-й связи остаток уроновой кислоты на
невосстанавливающем конце молекулы.

Конечными продуктами ферментативной реакции в случае гиалуронидазы

типа IIIa являются дисахариды с аминосахаром на восстанавливающем конце
молекулы.

В случае гиалуронидазы типа IIIb субстратом является исключительно

гиалуроновая кислота, а конечными продуктами являются тетра- и
гексасахариды с N-ацетилглюкозамином на восстанавливающем конце
молекулы.

Оптимальные для проявления ферментативной активности микробных

гиалуронидаз значения рН различаются в зависимости от природы субстрата:
для сернокислых эфиров (хондроитин сульфаты, дерматан-сульфат)
оптимальными являются значения рН 8,0 — 9,0, в то время как для
гиалуроновой кислоты и хондроитина — значения в районе 6,8.

Биологические функции[править | править вики-текст]

Большинство функций, которые выполняют гиалуронидазы в живой природе, связаны с их
способностью увеличивать проницаемость тканей за счёт
снижения вязкости мукополисахаридов, входящих в их состав.
Тестикулярная гиалуронидаза, содержащаяся в акросомах сперматозоидов млекопитающих,
способствует процессу оплодотворения яйцеклетки. Гиалуронидазы ядов змей и насекомых, а
также слюны пиявок увеличивают проницаемость капилляров в месте укуса.

Также гиалуронидазы выступают в качестве пищеварительного фермента (гиалуронидазы

бактерий, слюны млекопитающих).

Повышенная активность гиалуронидазы характерна для многих клеточных

линий метастазирующих злокачественных опухолей; делаются попытки использовать
препараты, подавляющие эту активность, в качестве противоопухолевых средств[2].

Применение[править | править вики-текст]

В медицине[править | править вики-текст]
В качестве лекарственного средства в медицине используются главным образом препараты
тестикулярной гиалуронидазы, выделенной из семенников крупного рогатого скота. Основное
применение — при заболеваниях, сопровождающихся ростомсоединительной ткани,
в косметологии, а также для увеличения биодоступности лекарств и вакцин. Принятый ранее
в фармакологической практике термин «лидаза» («lydase») в настоящее время не
рекомендован к использованию в качествесинонима гиалуронидазы [источник не указан 1209 дней].

В процедурах экстракорпорального оплодотворения раствор тестикулярной гиалуронидазы

применяют для удаления слоя фолликулярных клеток, окружающих яйцеклетку. Удаление
слоя фолликулярных клеток необходимо для проведения микрохирургического
оплодотворения - ИКСИ [источник не указан 1209 дней].

Стрептококковая гиалуронидаза используется при диагностике стрептококковых инфекций.

В последнее время разработаны препараты, в которых пролонгирование ферментативной

активности гиалуронидазы достигается путём иммобилизации фермента
на высокомолекулярных носителях.

Повышенное содержание гиалуронидазы в моче используется как один из биохимических

маркеров рака мочевого пузыр

Хроматографическое выделение и изучение свойств фермента

гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Авторефератдиссертации по теме "Хроматографическое выделение и

изучение свойств фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого
скота"

РГ8 Ой 1 1 11011 1386

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ

ПРОМЫШЛЕННОСТИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ
ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ
АКАДЕМИЯ

ИГОНИНА ЛЮДМИЛА МИХАЙЛОВНА

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ

ФЕРМЕНТА ГИАЛУРОНИДАЗЫ ИЗ СЕМЕННИКОВ КРУПНОГО
РОГАТОГО СКОТА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Санкт-Петербургской

Государственной Химико-фармацевтической Академии (ректор - д.ф.н.,
профессор Г.ГГЯковлев)

Научные руководители:

Л.В. Дмитренко

доктор химических наук, профессор

кандидат химических наук, доцент Н.В. Глазова

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор кафедры биофизики Санкт-

Петербургского Государственного Технического Университета В.М.
КОЛИКОВ

кандидат биологических наук, главный научный сотрудник Российского

НИИ гематологии и трансфузиолопш Н. Д. СИДОРОВА

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский Государственный

Технологический Университет

Защита состоится 1996 г. в /3 часов на заседании

специализированного совета К 084.63.01 при СПХФА (197376, Санкт-

Петербург, ул. Проф. Попова, 14)

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке СПХФА.

Автореферат разослан 3 " СЪти^и^-1996 г. Ученый секретарь
специализирован нр!^ сов кандидат биологических наук / ^Л.Н В. Кириллова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: В последние годы интерес к ферментам, выделяемым из

животного сырья, возрастает, особенно в связи с их применением в медицине
при лечении различных заболеваний. Однако проблема повышения качества
инъекционных ферментных препаратов требует новых подходов к методам
их выделения, очистки и анализа. Наибольший интерес для промышленного
получения высокочистых биопрепаратов представляют технически простые,
масштабируемые методы, основанные на использовании сорбционно-хро
мало графических процессов, которые позволяют улучшить качество
получаемого препарата за счет избирательной сорбции целевого компонента
и обратимой десорбции с него. С другой стороны применение хроматографии
в промышленности создает чрезвычайно широкие перспективы для более
рациональной организации технологячесхих процессов выделения и очистки
биологически активных веществ. Хроматографии ее кие методы еще
недостаточно используются в медицинской промышленности, и только в
последнее время была показана перспективность и целесообразность
использования макропористых носителей для выделения и получения
высокочистых ферментных препаратов (Рудометова, 1994).

Объектом данного исследования был выбран фермент гиалуроаадаза (КФ

3.2.1.35), являющийся основным компонентом препарата "Ладаза" и
выделяемый из семенников крупного рогатого скота. Фермент уменьшает
вязкость межклеточного вещества, способствует увеличению проницаемости
тканей и облегчает движение жидкостей в межтканевых пространствах.
Препарат "Дидаза" применяется в медицине для ускорения всасывания
лекарственных веществ, рассасывания рубцов, вводится подкожно,
внутримышечно или путем ингаляций. До настоящего времени препарат

получали по технологии, основанной на фракционировании фермента от

балластных примесей из осветленного экстракта семенников крупного
рогатого скота органическим растворителем - ацетоном. Данная технология
имеет ряд существенных недостатков: шрывоопасность производства,
токсичность производства, большие энергозатраты на регенерацию
органического растворителя. Получаемый ферментный препарат обладает
низкой удельной активностью.
В связи с вышеизложенным разработка сорбционно-хромато графического
процесса выделения и очистки фермента гиалуронидазы представляется
перспеетивной и актуальной. С другой стороны, до сих пор ни один из
ферментов, катализирующих синтез или гидролиз гиалуроновых кислот не
был изучен в деталях (Kreil, 1995), поэтому изучение физико-химических
свойств высокоочшцеиного фермента гиалуронидазы из семенников
крупного рогатого скота является также актуальным.

Задачи исследования. Целью работы являлось хроматографическое

выделение и изучение свойств высокоочшценной гиалуронидазы из
семенников крупного рогатого скота н разработка сорбционного метода
получения препарата "Лидаза". Для достижения этой цели были поставлены
следующие задачи:

1. Исследование физико-химических и биохимических свойств фермента

гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота.

2. Изучение закономерностей сорбции гиалуронидазы на ионитах различной

природы в статнчесхих условиях.

3. Выбор оптимального сорбента для выделения фермента.

4. Разработка на основе полученных данных процесса сорбциояно-хромато

графического выделения фермента;

5. Оптимизация и масштабирование сорбционного процесса выделения с

цепью использования технологии в промышленном масштабе.

Научная новизна. Впервые выделен протомер гиалуронидазы га семенников

крупного рогатого скота и изучены его биохимические свойства, получены
данные о наличии дисульфидных связей между протомерами.

Впервые изучены равновесные и термодинамические параметры сорбции

полимерных форм гиалуронидазы в статических условиях на различных
ионогенных и неионогенных сорбентах. Установлена взаимосвязь структуры
матрицы молекулярного сорбента на основе стирола (Полисорб) с
модифицированной поверхностью и макропористого ионогенного сорбента
(КУ-23), имеющего в основе ту же матрицу, с избирательностью сорбции
гиалуронидазы, определяемой ион-ионным и молекулярным
взаимодействиями.

Сформулированы факторы, определяющие взаимодействие фермента с

ионогеняыми и неионогенкыми сорбентами в динамических условиях.
Впервые осуществлено концентрирование фермента гиалуронидазы из
экстракта на макропористом сульфокатионнте в ионообменных колонках.
Показано, что выявленные закономерности полностью масштабируются и
оптимизируются с помощью критериального параметра к, что создает
возможность осуществления крупномасштабного процесса ионообменого
выделения фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота.

Практическое значение. На основе экспериментальных данных исследования

был разработай патент "Способ получения гиалуронидазы". Способ
апробирован в условиях цеха ферментных препаратов завода медицинских
препаратов АО "Самсон" (Санкт-Петербург). Предлагаемый способ позволил
сократить время технологического

процесса почти в 2 раза и улучшить качество ферментного препарата, а также

условий труда.

Основные положения, выносимые tía защиту.

1. Фермент гиалуронидаза из семенников крупного рогатого скота

представляет собой совокупность полимерных форм (серий) с различными
молекулярными массами (10 -200 кДа), обладающих одинаковой удельной
активностью.

2. Концентрирование полимерных форм фермента гиалуронидазы из экстракт

семенников крупного рогатого скота возможно в равновесных условиях в
процессе сорбции-десорбции вмйсто традиционного метода г
использованием органического растворителя.

3. Очистка фермента возможна с применением фронтально-

хроматорграфического процесса сорбции в неравновесных условиях на
макропористых неионогенных сорбентах.

Апробация работа. Основные положения диссертации доложены и

обсуждены

на:

Всероссийской научной конференции "Химия и технология лекарственных

веществ" (Санкт-Петербург, 1994);

Семинаре "Теория и практика ионного обмена, ионообменная

хроматография", Всероссийского химического общества им. Д.И.
Менделеева (Спб, 1994) 10-ом Интернациональном симпозиуме "Advances
and application of chromatography m industry" (Братислава, 1996) По теме
диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора

литературы, двух глав, содержащих материалы собственных исследований и

обсуждения результатов, приложения, заключения, выводов и списка

литературы. Приложение включает в себя акт апробации и технологии
получения фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота
с использованием экстракции ионообменного выделения гиалуронидазы из
экстракта с последующим осаждением сульфатом аммония. Часть
материалов и результатов исследовательской работы по проекту
"Фундаментальные и практические аспекты разделения биополимеров с
применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и
капиллярного электрофореза (КЭ)" выполнены в Институте Хроматографии
национального исследовательского центра Италии (Рим).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

С учетом цели и задач настоящей работы экспериментальные исследования

проводились по следующим направлениям:

- сравнительный анализ ферментного препарата "Лидаза" и стандартов

гиалуронидазы из семешшкоз крупного рогатого скота фирмы "Sigma" и
"Fluka";

- получение высокоочшценного протомера гиалуронидазы и изучение его

физико-химических и биохимических свойств;

- исследование сорбции полимерных форм гиалуронидазы из раствора

препарата "Лидаза" и нз экстракта семенников крупного рогатого скота в
статических условиях на различных ионогеиных и неионогенных сорбентах;

- изучение возможности выделения фермента в равновесных процессах

сорбции-десорбции в динамических условиях на макропористых ионитах и
очистки в процессе неравновесной сорбции на молекулярных сорбентах с
модифицированной поверхностью.

Тонкую очистку и сравнительный анализ препарата Лидаза и стандарта

гиалуронидазы m семенников крупного рогатого скота фирмы "Sigma" и
"Fiuka" проводили на установке HPLC фирмы "Весктап"(США) с
использованием следующих колонок для HPLC: SP-5PW LKB Ultropac
column (7,5x75 мм), основу которой составляет гидрофильный полимерный
гель G5000PW с функциональными группами -C.3H«-S03"Na'; HPLC
gdffltration column Bio-Sil SEC 125 (300x7,5 мм); и PENTAX column с
пористыми шарообразными гранулами гаяроксилапатита SH-0710F (7,5x100
мм).

Дегликозилирование фермента гиалуронидазы проводили с помощью

фермента peptide-N-glycosidase F (Е 5003), выделенного из Flavobacterium
meningosepticum, и полученного от фирмы Oxford GlycoSystem
(Великобритания). Ферментативное дегликозилирование проводилось в
течение 5 часов при температуре 37±1°С и pH = 6,5 (H.M.Baker,1994;
D.Laee,1990). Активность гиалуронидазы определяли Турбодиметрачсским
методом (Dorfiaan, 1995) и разработанным сотрудниками кафедры
биотехнологии СПХФА количественным методом, в основе которого лежит
полуколичествешшй Фармакопейный метод (ВФС - 42 -188 - 72).

В процессе работы использовали следующие ионогенные и неиокогснные

сорбенты: макропористый судьфокатионит КУ-23, карбоксильный катеонит
СГ-1М, имеющий макросетчатую структуру, шшонигы АМП и БАК,
гемосорбент СКН-4М, макропористый сополимер стирола и дивинилбензола
Полисорб. Модификацию поверхности молекулярных сорбентов проводили
поверхностно-активным веществом катонного типа - 2 % раствором
алкилбензилдиметил аммония хлорида. Перед началом работы сорбенты
подвергали кислотно-щелочной обработке. В статических условиях сорбцию
проводили при постоянном перемешивании на качалке.

Установление равновесия в системах определяли по предварительно

полученным кинетическим кривым. По результатам экспериментов
рассчитывали емкость сорбции по общему белку (метод Лоурн) и
равновесный коэффициент распределения Kd.

Гельхроматографический анализ раствора препарата "Лидаза", а также

экстракта и фракций до и после сорбции проводили на колонке (ДхН
=12x630 мм), заполненной сефадексом G-75-120 фирмы "Sigma". Фракции
анализировали на содержание белка, углеводов и ферментативную
активность.

Фронтально-динамические процессы сорбции фермента из раствора

препарата "Лидаза" и промышленного экстракта семенников проводили на
колонках (ДхН = 5 х120 мм) и (ДхН = 10 х150 мм). Оптическая плотность
растворов на выходе из колонки регистрировалась автоматически с помощью
оборудования для быстрой хроматографии - установке FPLC Sistem фирмы
Pharmacia LKB (Швеция).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Данные сравнительного анализа препарата Лидаза и стандартов

гиалуронидазы фирмы "Sigma" и "Fluka" представлены на рисунке 1, in
которого видно, что фермент представляет собой совокупность серии
полимерных форм, соотношение которых меняется при длительном хранении
фермента в растворе, вероятно, из-за деполимеризации. Молекулярная масса
полимерных форм фермента представлена довольно широким диапазоном от
200 KDa до 10 jcDa, полимерные формы и протомер обладают одинаковой
удельной активностью. По нашему мнению, полимеризация фермента
связана как с наличием дисульфидных связей между протомерами, так и с
наличием в составе фермента приблизительно 5-7% углеводов
(C.L.Bcrders,1968; J-C.Micha!ski,1984). В доказательство этому
предположению было проведено

Рис. 1. Гелъхроматографический анализ гиалуронвдазы семенников крупного

рогатого скота а) стандарт фирмы "Sigma"; б) стандарт фирмы "Fiuka"; с)
препарат Лвдаза . Слева - свежеприготовленные растворы фермента 5 мг/мл,
справа -после хранения в течение 7 дней при +5 °С.

HPLC geffiltration column Bio-SU SEC 125 (300x7,5 мм), элюент - 0,2 М
буферный

Ш фосфорной кислоты, рН=б,0, скорость пропускания раствора 1 мл/мин. _ -

фракции с гиалуронидазной активностью

инкубирование фермента (стандарт тиалуронидазы из семенников крупного

рогатого скота фирмы "Sigma") при комнатной температуре с 2-
меркаптоэтанолом (рисунок 2) и проведена ферментативное
дегликозилировние с peptide-N-glycosidase F. Оба метода приводили к
деполимеризции фермента и увеличению пика протомерных форм. В
динамических условиях на колонке PENTAX с пористыми шарообразными
гранулами гидроксиапатита в режиме изократическон элюции ОД м
буферным раствором фосфорной кислоты (pH = 6,0) была выделена фракция
протомера гиалуронидазы с удельной активностью 2800 Ед/мг. Гельхромато
графический анализ фракции на колонке Bio-Sil SEC 125 позволил
определить молекулярную массу протомера, составляющую 10 700 Da.
Изучение физико-химических свойств полученного протомера
гиалуронидазы показало, что фермент наиболее стабилен в области pH 3,5 -
3,8. Оптимальными условиями реакции гидролиза гиалуроновой кислоты
протомером гиалуронидазы являются pH = 4,0 - 5,5 (рис. За) и температура
37 - 40°С (рис. 3 б). Повышение температуры до 50°С приводило к потере
активности фермента в течение 15 минут. В таблице 1 представлены
рассчитанные значения констант Михаэлиса-Ментен Km и максимальной
скорости ферментативной реакции Vmax для различных субстратов,
показывающих влияние их концентрации на активность протомера
гиалуронидазы. Наибольшую субстратную специфичность протомер
гиалуронидазы имел к гиалуроновой кислоте, наименьшую - к хоидроитин-4-
сульфату.

________Таблица 1

Субстрат Km, мг/мл Vmax, мкмоль/мин

Гиалуроновая кислота 0,176 0,00148

Хондроитин-4-сульфат 1,47 0,00249

Хондроитин-6-сульфат 0,83 0,00233

Б 280

0.02

ш О,

оИ

V) V-

nS

Рис. 2. Гельхро маю граф ичгсхий анализ раствора стандарт! пчлурокндази

фирмы "Sigma* в процессе кнкубироваяи* фермента с 2-ыериптоэтанолом в
концентрационном соотношении к ферменту 0,022 % 5 иг/мл. HPLC
gdffltr&don column Bio-Sil SEC 125 (300x7,5 мм), эюоснг - ОД М буферный
раствор фосфорной кислоты, рН=б,0, скорость пропускания раствора 1
мл/мин.

120 100 80 60 40 20

РН
Рис. 3 а. Влияние рН на активность протомера гиалуронидазы семенников
крупного рогатого скота.

я»

<3

1,0 0,8 0,6 0,4 0.2

10 20 30 40 50 60 °с Температура

Рис. 3 б. Влияние температуры на ход гидролиза гиалуроновой кислоты

протомером гиалуронидазы семенников крупного рогатого скота.

Изучение влияния неорганических и органических компонентов на

активность протоиера гиалуронидазы семенников крупного рогатого скота
показало, что протомер активируется ионами Са2+ (100 мМ), альбумином
(0,1 %), мочевиной (4 М) и ингнбируется ионами Мп2+, 2п2*, Си2', Ре3+ (1
мМ), цианидом калия {1 мМ), и цистеином (4 мМ).

В работе было показано, что полимерные формы гиалуронидазы, включая

протомер, обладают одинаковой удельной активностью, поэтому
разрабатывался метод сорбционного выделения из экстракта семенников
крупного рогатого скота фермента гиалуронидазы, представленной
различными полимерными формами.

На различных иояогенных и молекулярных макропористых сорбентах были

изучены рН-завношости емкости сорбции полимерных форм гиалуронидазы
из раствора препарата "Лмдаза" (модель экстракта семенников крупного
рогатого скота) и изотермический процесс сорбции. Как видно из
представленных данных на рисунке 4 (а, б), наибольшей сорбционной
емкостью обладают сульфокатиоиит КУ-23 и карбоксильный катеонит СГ-
1М. На анисните БАК и амфолите АМН емкость сорбции при рН экстракта,
то есть рН = 4,3-4,8, мала. Молекулярные сорбенты тоже отличаются
незначительной емкостью сорбции. Эффект повышения емкости сорбции
отмечается после обработки поверхности молекулярных сорбентов Полисорб
и СКН-4М поверхностно-активным веществом кахионного типа. Однако в
данном случае, как показало дальнейшее изучение, молекулярные сорбенты с
модифицированной поверхностью селективно сорбируют примесные
компоненты. Эти сорбенты предложены для очистки гиалуронидазы от
примесей с использованием фронталыю-хроматографнческого процесса.
Рис. 4 а). Изотермы сорбции белха из раствора препарата "Лидаза" на
различных ионогенных сорбентах: 1 - СГ-1М, 2 - КУ-23, 3 - АМП, 4 - БАК

Рис. 4 б). Изотермы сорбции белка из раствора препарата "Лидаза" на

различных молекулярных сорбентах: 1 - СКН (модифицированный), 2 -
Полисорб (модифицированный), 3 - Полисорб, 4 - СКН-4М.

Одним из факторов, определяющим возможность препаративного

сорбциониого выделения вещества является его избирательная и обратимая
десорбция с носителя. В динамических условиях на лабораторных колонках
(ДхН = 10x150 мм) были проведены опыты по изучению сорбции-десорбции
гиалуронидазы из раствора препарата "Лидаза" на выбранных сорбентах для
концентрирования фермента: катеонитах КУ-23 и СГ-1М. Из рисунка 5
видно, что обратимость сорбции на карбоксильном катиониге составляет не
более 60 %, тогда как на сульфокатионите она достигает 80-100 %. Учитывая
недостаточную степень десорбции фермента, представляется
целесообразным осуществить выбор оптимального сорбента для выделения
гиалуронидазы в пользу макропористого сульфокатионнга КУ-23.
Аналогичные опьпы были проведены с использованием промышленного
экстракта семенников крупного рогатого скота. Гельхроматографический
анализ экстракта до и пезае сорбции (рисунок 6) подтверждает возможность
выделения фермента на макропористом сульфокатионите с использованием
сорбциониого хромато графического процесса. На основе полученных
экспериментальных данных с учетом подбора условий проведения процесса
был разработан способ получения гиалуронидазы, подана заявка на патент №
94039657/039108 (дата приоритета -20.10.1994), получено положительное
решение о выдаче патента. Предлагаемый способ полностью исключает
использование ацетона, и тем самым, изменяются условия труда, категория
взрывоопасности помещения, уменьшается время технологического процесса
в два раза.

Успешность внедрения технологии в производство и эффективность её

использования зависит от того, насколько оптимальны выбранные режимы и
условия проведения процесса. Решечу задачи оптимизации как раз и состоит
V ййхожд<е((йи

Рис. 5. Выходные кривые сорбции и десорбции гиалуронидазы на сорбентах-

а) СГ-1М; б) КУ-23

Рис. 6. Гельхроматографический анализ: а) экстракта семенников крупного

рогатого скота; б) в проскоке; в) элюата
таких режимов и условий. В данной работе масштабирование и оптимизация
процесса проводилось с использованием критериального параметра А,
(формула 1.1), куда входят: Кб - объемный коэффициент распределения;

ИэФ+ - эффективный коэффициент внутренней диффузии;

\Vpo6 - рабочая скорость протекания раствора через колонку;

А, - диаметр частиц сорбента;

Но - высота колонки;

р - относительный радиус непоглощающего ядра сорбента;

&о - порозность слоя сорбента..

Я = Кй-^н. (1.1)

(1-р) ^р1бс1

Для расчета нам понадобилось определить истинные значения Кё и для

полимерных форм ферме/гга гиалуронядазы. Для этого на колонке с

сефадексом С-75 нарабатывалась фракция полимерных форм фермента (М =
40 - 80 кДа), которую затем использовали в дальнейших опытах.

Оценку скорости процесса сорбции полимерных форм гиалуронидазы из

семенников крупного рогатого скота производили по времени достижения
сорбциошюго равновесия вещества между раствором и сорбентом.
Равновесие при сорбции на сульфокатионате устанавливается быстрее, чем
при сорбции на карбоксильном катконите СГ-1М (десять часов против
тридцати), коэффициент внутренней диффузии увеличивается на порядок.

Используя полученные нами экспериментальные данные, проводили

кииэтико-динамический анализ сорбционно-хроматографического процесса
по программе,

разработанной сотрудниками кафедры биотехнологии СПХФА. Для

различных 4, сорбента были рассчитаны различные параметры процесса.

В качестве параметра оптимизации была выбрала производительность

колонны Б = п/Ыо&ц, где п - общий выход. Из рисунка 7 видно, что при
использовании колонн со стационарным споем число колонн минимально, а
производительность максимальна при с! =200-500 мкм. Это регулярный
режим сорбции и X >0,35. При диаметре зерен сорбента большем 500 мкм -
режим нерегулярный, сокращается время проскока, увеличивается число
колонн. При диаметре меньше 200 мкм замедляется рабочая скорость
процесса, ухудшаются его гидродинамические характеристики. Хорошими
данными характеризуется псевдоожиженный слой, но для ферментов он ещё
не применялся и требует дополнительных экономических затрат из-за
сложности конструкции оборудования. В результате оптимизации подобраны
условия сорбции и оптимальные размеры колонн, число колонн работающих
на сорбции, общее число колонн, предложен оптимальный диаметр частиц
для проведения процесса. Предложенная технология была апробирована в
условиях цеха ферментных препаратов на заводе Медицинских препаратов
акционерного общества "Самсон", получен акт об апробации.

^общ

<31 >с 10 , М

регулярный режим нерегулярный режим X > 0,35 Я. <0,35

Рис. 7 Оптимизация процесса сорбции гиалуронидазы на сульфокатиошгге

КУ-23 Р - производительность колонны, N„6«! - общее число колонн, <3ч -
диаметр зерен сорбента.

ВЫВОДЫ

1. Проведен сравнительный анализ препарата "Лидаза" со стандартами

гиалуронидазы фирмы "Sigma" и "Fluka". Показано, что как в препарате, так
и в стандарте гиалуронидазы семенников крупного рогатого скота фермент
представляет собой совокупность полимерных форм (10 ООО - 200 ООО Da),
соотношение которых изменяется при длительном хранении в водном
растворе.

2. Показано, что полимеризация фермента связана с образованием

дисульфидных связей между протомерами и наличием углеводов в составе
фермента. Получена фрахция протомгрной формы гиалуронидазы и
определена ее молекулярная масса - 10700 Da, изучены физико-химические
свойства.

3. Изучены особенности ионообменной сорбции полимерных форм

гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота (препарат "Лидаза") в
статических условиях - влияние рН растворов на сорбционную емкость
различных иошптш, рассчитаны равновесные и кинетические параметры
сорбции. Показано, что фермент избирательно сорбируется на
карбоксильном катиоките СГ-1М и сульфокатиошгге КУ-23.
4. Исследован равновесный процесс сорбции фермента на различных
сорбентах. Показана возможность концентрирования гиалуронидазы из
экстракта семенников крупного рогатого скота на макропористом
сульфокатионите за счет избирательной сорбции и обратимой десорбции.
Молекулярные сорбенты с модифицированной поверхностью предложено
использовать для очистки фермента от низкомолекулярных примесных
компонентов.

5. Проведена оптимизация и масштабирование сорбционно-

хроматографического процесса. Рассчитаны оптимальные параметры
процесса, проведена

апробация способа. Данный метод позволяет сократить время

технологического процесса почти в два раза и увеличить удельную
активность препарата в 2,0-2,5 раза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Н.В.Глазоза, Т.Б.Ефимова, Л.М.Игошша, Н.В.Рудометова, Л.ВДмнтренко

Использование хромэто графических методов для оценки эффективности

очистки ферментных препаратов, /кн. "Препаративная и масштабируемая
хроматография биологически активных веществ и другие альтернативные
методы", Ленинград: ЛДНТП, 199], с. 105-112

2. Л.М.Игоннн», Н.В.Глазова, Л.В-Дмитренко, Н.ВЛяникояа. Применение

сорбционко-хроматографических методов для очистки ферментного
препарата Лидаза. /кн. "Химия и технология лекарственных веществ, Санкт-
Петербург, 1994, с. 14.

3. Л-М.11пн;;ша, Н.В.Глйзовл, Н.Ч.Згияхопа. Использование сорбентов для

удаления примесей из инъекционного препарата Лидаза. Международный
симпозиум "Проблемы сорбцнонной детоксикации внутренней среды
организма". Н6воскб?!р«с, ноябрь 1995.

4. СГ.Юиышева, Л.М.Игсниия, П.В.Зяникоаа, Н.В. Глазова, Г.Э.Елькня

Равновесие и кинетика сорбции гиалуронидазы на сетчатых полимерных

нонитах СГ-1М и КУ-23. //ж. "Прикладная Х1!мия", 1996, т. 69, в. 5, с. 764 -
767.

5. N.V.GUzova, L.M.Igonina, G.E.Elkin. Chromatographic purification of enzyme

medicines from macromolecuiar impurities./ 10th Bratislava International
Conference on Macromolecules" Chromatography of polymers and related
substances", Bratislava, 1995.

6. N.V-Zjunkov*, UMJgoaina, N.V.Rndcmetov», G.E.Elkia, N.V.GUzova.

Chromatographic purification of enzyme medicines./ 10th International
Symposium "Advances and application of chromatography in industry" Bratislava,
1996, p. 175.

7. D.Corradini, L.MJgoniaa, G.Cannaru. Effect of the addition of metal ions in the

mobile phase on the chromatographic behaviour of protons in ion-exchange
HPLC./ там же, р.ЗОЗ.

8. D.Corradini, G.Canoarea, I-M.Igouina. Evaluation of interactions between

proteins and ionic species in solution by capillary electrophoresis./11th Convegno
Nationale "Proteine96", Siaia (Italia) 1996, p.91.

Работа представлялась на различные конкурсы и была удостоена следующих

наград:

- премии мэра Санкт-Петербурга за 1995 год

- стипендии Президента Российской Федерации для прохождения научной

стажировки зарубежом в 1995/96 уч.году,

-почетного диплома конкурса "Молодые дарования", 1996.

Информация о работе

 Игонина, Людмила Михайловна

 кандидата биологических наук

 Санкт-Петербург, 1996

 ВАК 03.00.04

Автореферат