UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE GR.T.

POPA IAI FACULTATEA DE FARMACIE

SIMONA ALEXANDRINA PINTEA (ARDELEAN)

TEZ DE DOCTORAT
Conductor tiinific Prof. Univ. Dr. NSTASE VICTOR

2011

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE GR.T.POPA IAI FACULTATEA DE FARMACIE

SIMONA ALEXANDRINA PINTEA (ARDELEAN)

STUDII EXPERIMENTALE ALE UNOR NOI SUBSTANE TENSIOACTIVE UTILIZATE N UNELE PREPARATE FARMACEUTICE
TEZ DE DOCTORAT

Conductor tiinific Prof. Univ. Dr. NSTASE VICTOR

IAI 2011

CUPRINS
I. DATE DE LITERATUR REFERITOARE LA 1. GENERALITI SUBSTANELE TENSIOACTIVE .. 6 1.1. Introducere i definiii ......................... .. 6 1.2. Proprietile agenilor de suprafa n funcie de structura lor .............................................. .. 8 I 2. MECANISME DE ACIUNE CLASIFICAREA TENSIOACTIVILOR ............... 12 2.1. Aspecte generale ...................................... 12 2.2. Tensioactivi din produsele farmaceutice 14 2.3. Clasificarea tensioactivilor ....................... 15 3. DETERMINAREA CALITATIV I CANTITATIV A SUBSTANELOR TENSIOACTIVE ............................................... 18 3.1. Metode analitice calitative ....................... 18 3.2. Metode analitice cantitativ 19 ........................ 4. METODE DE EVALUARE A TOXICITII TENSIOACTIVILOR. LEGISLAIE 22 ...................... 4.1. Aspecte generale ...................................... 22 privind legislaia 4.2. Consideraii referitoare la produse cosmetice i tensioactivi / 28 surfactani ....................................................................

II. CERCETRI PERSONALE Motivarea i obiectivele cercetrii ............................ 5. METODE MODERNE FOLOSITE PENTRU STUDIUL TENSIOACTIVILOR ............................. 5.1. Principalele protocoale INVITTOX folosite ca metode alternative pentru testarea nocivitii tensioactivilor ........................................... 5.2. Metode non-invazive folosite pentru testarea aciunii tensioactivilor la nivel cutanat ...... 5.3. Baze de date ............................................ 6. FOLOSIREA TENSIOACTIVILOR PENTRU UNOR FORMULRI OBINEREA FARMACEUTICE I TESTAREA ACESTORA ... 6.1. Difuzia prin membran i folosirea celulelor Franz ............................................................ 6.2. Evaluarea practic a cedrii unui principiu activ prin celule Franz echipate cu membrane de celuloz i piele de obolan ............... 6.3. Analiza reologic i de nocivitate a unor formulri semisolide cu diferite tipuri de tensioactivi ............................................................. 7. EVALUAREA NOCIVITII TENSIOACTIVILOR PRIN FOLOSIREA DE METODE NON-INVAZIVE ..................................... 7.1. Aspecte generale ..................................... 7.2. Materiale i metode ................................. 7.3. Rezultate i discuii ................................ 7.4. Concluzii .......................................

33 38 38 50 59

67 67 75 77

94 94 96 00 09

8. APLICAREA TESTELOR INVITTOX PENTRU EVALUAREA UNOR TENSIOACTIVI CLASICI I MODERNI ............................... 8.1. Aspecte introductive ................................ 8.2. Materiale i metode ................................. 8.3. Rezultate .............................................. 8.4. Concluzii ............................................. N 9. FOLOSIREA SURFACTANILOR SINTEZA DE NANOCAPSULE POLIETERURETANICE UTILIZATE N TRANSPORTUL TRANSDERMIC ....................................................... 9.1. Aspecte introductive ................................ 9.2. Microscopia electronic de scanare (SEM) ........................................................................... 9.3. Calorimentria de scanare diferenial (DSC) ............................................................................ 9.4. Materiale i metod ................................. 9.5. Rezultate i discuii ................................ 10. TESTAREA UNOR NANOCAPSULE CU TENSIOACTIVI PRIN METODE NONINVAZIVE PE MODEL ANIMAL ..................... 10.1. Condiii de determinare ........................ 10.2. Determinri tewametrice ....................... 10.3. Determinri pH-metrice ........................ 10.4. Determinri sebumetrice ...................... 10.5. Determinri mexametrice ..................... 10.6. Determinri corneometrice ................... 10.7. Concluzii ................................................

10 10 13 17 42

43 43 45 49 53 56

68 68 69 72 75 78 84 87

CONCLUZII GENERALE .................................. 88 BIBLIOGRAFIE ........................................................ 92

CERCETRI PERSONALE Motivarea i obiectivele cercetrii

Tensioactivii sau surfactanii sunt cunoscui pentru influena asupra multor membrane biologice, incluisv asupra pielii. Acest aspect va duce la modificarea calitilor pielii, a integritii acesteia i implicit la modificarea activitii terapeutice locale sau/i sistemice. Din grupul de tensioctivi lauril sulfatul de sodiu (LSS) prezint o importan deosebit prin faptul c modific foarte mult calitile membranelor biologice i n special ale pielii. Folosirea surfactanilor pentru facilitarea absorbiei cutanate este util mai ales n cazul soluiilor, loiunilor i gelurilor pentru care rezistena la suprafaa pielii este redus i tensioactivul grbete penetrarea cutanat. n aceste cazuri se ine seama i de faptul c tensioactivii modific sau interacioneaz cu unele componente ale stratului cutanat. Dup un timp scurt se stabilete starea de echilibru. Pielea este un organ intens studiat datorit expunerii frecevente la factori de mediu, produse cosmetice etc. Creterea aspectelor patologice ce se pot produce la nivelul pielii a accelerat nevoia de studiu pe modele experimentale [Franz, T.J., 1978; Wester, R., 6

1992; Michaels, A., 1975]. LSS difuzeaz ntre straturile lipidice ale pielii i fluidizeaz acest dublu strat. Pe lng aceast tulburare a echilibrului i integritii pielii este cunoscut faptul c acesta produce i fenomene nocive de tip iritare cutanat, pierdere de ap transdermic mai ales ca rezultat al legrii de keratina intracelular. LSS este considerat modelul de aur al iritrii cutanate i un compus de referin pentru studiul nocivitii cutanate. Nu n toate cazurile folosirea tensioactivilor ionici (anionici i cationici) determin penetrarea cutanat cea mai intens. Studii recente aplicate pentru Metotrexat au artat c acetia sunt avansai de un al tensioactiv, Transcutolul. Un aspect important este acela c pe lng tensioactivi, ca ageni de penetrare se folosesc i acizi grai, alcooli grai i solveni organici. Surfactanii reprezint o categorie de substane auxiliare, care pot fi folosite att n produsele farmaceutice i ct i n cele cosmetice, impunandu-se clar necesitatea unor analize de calitate i siguran, inclusiv compuii tensioactivi non-ionici [Franz, T.J., 1975]. Dei tensioactivii sunt componente auxiliare, acestea au rol important, contribuind la obinerea mai multe forme

farmaceutice (emulsii, baze de unguent, emulsie etc.) [Franz, T.J., 1975; Franz, T.J., 1978]. n categoria compuilor tensioactivi intr i grupul celor non-ionici ei fiind foarte importani pentru persoanele cu pielea sensibil ncadrabile n tipul 1 sau 4 de hipersensibilitate. Din acest grup de compui sunt foarte utilizai polisorbaii sau tweens i mai exact polisorbaii 20 i 80. Este bine cunoscut capacitatea lor iritativ foarte sczut, dar pentru o mai bun nelegere este necesar observarea lor detaliat. Diverse forme cu amestecuri de ageni tensioactivi au fost, de asemenea, foarte dezvoltate pentru efectele lor anti-iritante [Wester, R., 1992; Franz, T.J., 1975]. Polisorbaii 20 i 80 sunt utilizai n formularea unor produse bioterapice pentru dou caracteristici: prevenirea adsorbiei de suprafa i ca stabilizatori fa de agregarea proteic. Analiza modern a formelor cu ageni tensioactivi este justificat pe de-o parte prin utilizarea lor extins n produsele cosmetice i pe de alt parte prin includerea unei mulimi de msurtori uor realizabile [Michaels, A., 1975; Franz, T.J., 1975]. O comparaie ntre compui poate fi, de asemenea, util n privina aplicaiilor pe care le realizeaz. Deoarece acestea nu intr n categoria 8

substanelor periculoase testele pe animale nu sunt justificate din punct de vedere etic n timp ce testarea uman este chiar dezirabil. Folosirea metodelor noninvazive pentru analiza tensioactivilor i produselor cu coninut de tensioactivi face posibil detectarea rapid a nocivitii acestora. Unele dintre cele mai cunoscute aparate sunt cele care determin pierderea de ap transdermic, iritarea cutanat sau cantitatea de hemoglobin local, pigmentul melanic, pH-ul, hidratarea general a pielii etc. Cele mai cunoscute aparate n acest sens sunt: TEWA-metrul, Dermaspectrometrul, Cromametrul, Mexametrul, SkinpH metrul, Corneometrul, Sebumetrul etc. Informaiile furnizate de astfel de msurtori definesc calitatea organului cutanat prin prezentarea calitii stratului cornos (corneometrie), a pierderii de ap transdermic (TEWA-metrie) i a modificrii pigmentrii i a eritemului local (mexametria). Mexametrul este un spectrofotometru de reflexie de band ngust proiectat s msoare i s cuantifice eritemul (hemoglobina) i melanina ca zone pigmentate. Aplicabilitatea sa pe teren cosmetic se extinde n studiile recente la tulburri la hiperpigmentare i este considerat suficient de sensibil 9

pentru a detecta mici diferene de culoare a pielii. Un alt aspect important este faptul c ofer posibilitatea de reproductibilitate [Shah, V, 1993; Smith, E.W., 1992]. Metodele de testarea la nivel cutanat sunt diverse cum ar fi testarea in vitro pe diverse linii celulare, testarea in vivo pe animale de experien i testarea pe om. Aceste metode la rndul lor trec printr-o permanent analiz i modernizare. Testarea pe animale pentru produsele cosmetice este limitat. Aceste metode trebuie s fie fidele i reproductibile. Expunerea excesiv la ageni fizici i de mediu a pielii favorizeaz implicit apariia fenomenelor de fotombtrnire. Intervenia asupra organului cutanat prin intermediul unor factori agresivi de mediu cum ar fi formulrile cu tensioactivi, expunerea excesiv la radiaii UV etc sunt aspecte care preocup cercetrile actuale. Multe evaluri se pot face pe model uman [Corbo, M., 1993]. Toxicitatea compuilor tensioactivi poate genera un rspuns fiziologic, pot stimula iritaia i implic schimbri obiective (roea local i edem) ori senzaii subiective (prurit i durere). Chiar i date recente mai ales referitoare la studii preclinice finale arat c determinri variate de siguran a produselor apeleaz la testele pe 10

animalul de experien datorit similitudinii evalurii. Cu toate acestea sunt susinute intens metodele alternative dintre care utimele teste INVITTOX dezvolt metode pe celule sanguine, ou embrionat etc. [Vinardell, M.P., 2008]. Un numr mare de persoane folosesc o serie de creme i unguente mai ales cu scop cosmetic. Cu toate acestea nu s-a testat impactul folosirii lor dup sau n timpul expunerii la UV cunoscut fiind faptul c n compoziie au o serie de factori cu potenial nociv (tensioactivi etc). Acest aspect este corelat cu procentul de cancere cutanate care apar chiar dac expunerea intensiv la UV a fost redus cu un anumit timp nainte. Cercetarea dorete s scoat n eviden modificarea calitii pielii n prezena unui compus antioxidant prin metode de studiu non invazive de tipul: corneometrie, TEWA-metrie i mexametrie [Shah, V., 1993; Smith, E.W., 1992; Gallagher, S.J., 2003]. n acest context modele in vivo pe animale de tipul oarecilor sau obolanilor sunt uor de obinut cu observaii profunde pn la nivel molecular i pot genera rezultate bine corelate cu studiul pe om.

11

Prezentul studiu i propune s analizeze tocitatea unor surfactani comuni i utilizarea lor pe modele experimentale n special de tip non-invaziv. Acestea se refer la studii de evaluare toxicologic. Datele prezentate doresc s sublinieze posibilitatea de evaluare a tensioactivilor n formule aplicate pe piele uman. Metodele de studiu se refer la tehnici non-invazive ce se aplic la nivel cutanat i la noi metode acceptate pentru studiul nocivitii ca teste INVITTOX: studiul pe celulele sanguine (red blood cell test RBC) INVITTOX protocol nr. 37 i cel pe ou embrionat (membrana corioalantoidian) testul INVITTOX protocol nr. 96. Datele prezentate doresc s sublinieze posibilitatea de evaluare a tensioctivilor n formule aplicate pe piele uman. Pentru conturarea mai detaliat a datelor legate de aplicaiile tensioctivilor s-a folosit utilizarea acestora pentru formularea unor nanocapsule observnd i diferenierea aspectului lor datorit tipului de surfactant.

12

Principalele obiective fixate n cadrul tezei de doctorat

1. Analiza unor formulri farmaceutice semisolide cu tensioactivi. Compararea unor formulri cu tensioactivi diferii. 2. Studiul nocivitii tensioctivilor la nivelul organului cutanat prin metode non-invazive. Teste aplicate pe piele uman i de animal de experien. 3. Interpretarea nocivitii unor tensioactivi cu ajutorul ultimelor teste alternative INVITTOX. Aplicaii pe hematii i ou embrionat. 4. Studiul influenei cedrii unui principiu activ n funcie de tipul de tensioaciv. Aplicaii prin folosirea cedrii prin celule Franz i membran sintetic i obinut din piele de obolan. 5. Aplicaiile tensioactivilor n formularea unor

nanocapsule. Diferenierea n funcie de tipul de tensioactiv.

13

6.3. Analiza reologic i de nocivitate a unor formulri semisolide cu diferite tipuri de tensioactivi 6.3.2. Material i metod Citirile reologice s-au fcut cu Rheotestul RVMLV la 25 C. Indicele de saponificare s-a determinat conform F.R.X, urmat de o validare statistic a valorilor (6). Formulele produsului semisolid care s-a folosit pentru testarea tensioactivilor 2 % au fost preluate i adaptate dintr-un formular cosmetic (7). Procedeul de preparare a formulrilor semisolide a fost prin nclzirea celor dou faze (apoas i uleioas-faza gras) la o temperatur de aproximativ 70 C i mixarea acestora. Tensioactivul se solubilizeaz n faza apoas. Cele dou faze se amestec pn la rcire i solidificare. Pentru determinarea capacitii de ntindere s-au folosit aceleai 3 formule conform tabelului. Capacitatea de ntindere s-a determinat cu ajutorul extensometrului Pozo Ojeda i Sune Arbusa. Se ia n calcul diametrul cercului ocupat de 1 g unguent n urma presrii cu o plac de sticl (diametrul de 11 cm) care cntrete 54,5 grame (G0). La intervale de 1 minut se aeaz pe placa 14

superioar

extensometrului

greuti

ordine

crescnd: 50 g (G1), 100 g (G2), 150 g (G3) i 200 g (G4). Se citete apoi diametrul cercurilor formate prin ntinderea unguentului. Se calculeaz apoi suprafeele (.r2) care se noteaz cu S0, S1, S2, S3 i S4. Pe baza acestor tipuri de rezultate se traseaz curbele extensometrice. Tabelul 13. Formulele cosmetice analizate - pentru 100 g baz
Ingredient Laurilsulfat de sodiu Tween 20 Laurat D1216 Alcool cetilic Unt de cacao Vaselin Soluie conservant 8 7 20 65 8 7 20 65 8 7 20 65 de Formula 1 sucroz 0,5; 1; 1,5; 2 Formula 2 0,5; 1; 1,5; 2 Formula 3 0,5; 1; 1,5; 2 -

Pentru testarea curbelor de curgere se folosete formula:

15

unde este tensiunea tangenial (Pa), z este contanta cilindrului i ete valoarea citit pe cadran (fora pe care semisolidul o opune rotaiei). Pentru aprecierea vscozitii se folosete formula:

unde este vscozitatea dinamic (Pa .s), este tensiunea tangenial (Pa), iar D reprezint gradientul de vitez (1/s sau s-1). Curbele de curgere i reogramele in cont de aceti parametrii. Pentru testarea nocivitii s-a apelat la 3 grupuri de voluntare a cte 5 persoane cu vrsta cuprins ntre 20-30 de ani care au fost instruite n ceea ce privete testul i nu au prezentat alte patologii care s interfere cu rezultatul final. De asemenea nu s-a constatat nici hipersensibilitate cutanat. 6.3.3. Rezultate i discuii Analize reologice ale formule studiate au relevat urmtoarele aspecte prezentate n figurile 25-31.

16

17

18

19

20

21

Aspectul pielii la trei loturi de voluntari dup aplicare patch-ului cu formulele de analizat i concentraia de tensioactiv maxim de 2 % timp de 24 ore.

22

Tensioactivii sau surfactanii, sunt compui amfifili care formeaz monostraturi orientat pe interfee i prezint concentraii mai mari de echilibru la interfee dect cele existente ntr-o soluie vrac. Ele prezint mai multe caracteristici, inclusiv cele detergente, de spumare, de udare, de emulsifiere, de solubilizare i de dispersare. Aceti ageni sunt o parte integrant a sistemelor de formulare disperse pentru medicamente i produse cosmetice i pot ntegra caracteristicile de stabilitate fizic pentru aceste sisteme. n general, acetia sunt responsabili pentru proprietile reologice ale unei noi formule de uz dermatocosmetologic [Rieger, M.M., 1988; Garg, A., 2002]. Caracterizrile reologice pentru produsele semisolide farmaceutice i cosmetice furnizeaz informaii importante pentru a facilita producia i prelucrarea acestora. Astzi, cei mai muli productori, pot conta pe rezultatele reologice pentru a dezvolta produse favorizate pentru client. Prin urmare, o aparatur avnd un reometru fiabil i i date reologice pertinente i bine interpretate, devin absolut necesare pentru productorii actuali din domeniul farmaceutic i cosmetic. Rezultatele obinute indic faptul c formulrile semisolide ofer avantaje poteniale i reale, 23

reprezentnd un vehicul performant pentru dezvoltarea i pregtirea preparatelor dermofarmaceutice i cosmetice meritnd investigaii suplimentare i n perioadele viitoare. ntr-un alt studiu care trebuie amintit primele observaii cu privire la potenialul iritativ al unor formulri semisolide au fost evaluri vizuale. Acestea sunt prezentate n figura 40. Primele imagini au artat rezultatele patch testelor principale, iar al doilea analiza Proderm. Aa cum este prezentat n figurile 39 i 40, agentul cel mai nociv este Tween 80, dar textura pielii i aspectul vizual nu sunt foarte importante ca i efectele secundare negative observabile. Probele au fost aplicate concentraiile maxime de tensioactiv (respectiv 10 %).

24

6.3.4. Concluzii Lauril sulfatul de sodiu este tensioactivul care determin cele mai bune proprieti reologice (curgere, vscozitate) comparativ cu ceilali doi ns i lauratul de sucroz duce la formulri calitative reologic. n schimb laurilsulfatul de sodiu va determina o nocivitate extrem de sever comparativ cu ceilali tensioactivi.

7. EVALUAREA NOCIVITII TENSIOACTIVILOR PRIN FOLOSIREA DE METODE NON-INVAZIVE

Tensioactivii sunt printre cele mai frecvente i versatile elemente constitutive care se regsesc n numeroase medicamente topice, produse cosmetice, 25

ageni pentru curat, spunuri i ampoane. Surfactanii sunt aplicai n diverse produse ca i aditivi din cauza suprafeei lor i a activitilor de interfa. Astfel, concentraiile utilizate n preparatele comerciale ar trebui s evite reaciile adverse cum ar fi iritarea tegumentar sau ocular precum i ale tipuri de patologii secundare uzului lor. Din acest motiv, cutarea de noi tensioactivi non-iritani este de mare interes i necesit dezvoltarea unor studiile de pre-formulare. Pentru a exista asigurarea c preparatele / formulrile sunt inofensive din punct de vedere dermic i ocular, este necesar s se studieze potenialul iritativ al tensioactivilor prin determinarea toxicitii lor. 7.2. Materiale i metode S-au utilizat bandaje ocluzive, materiale de fixare i siringi. Conform Declaraiei de la Helsinki studiile au pstrat toate datele de confidenialitate. De asemenea obiectivele studiului au intit aspecte eseniale de ordin tiinific. naintea nceperii studiului toi subiecii au fost detaliat informai despre ceea ce urmeaz s aib loc n cadrul studiului n cel mai mic detaliu. Pentru studiul de fa s-au selectat voluntari Caucazieni, care au acceptat n 26

mod liber s participe la cercetare, clinic sntoi. Criteriile de excludere s-au referit la boli dermatologice care pot interfera cu evaluarea final, starea de graviditate, participarea la alte studii simultan, tatuaje, arsuri i escare n zonele de studiu. Numrul total de voluntari a fost 25 de sex feminin subdivizate n grupuri de 5. De asemenea participanii vor fi exclui din grup dac: - nu urmeaz ndeaproape instruciunile; - se mbolnvesc sau sufer traumatisme pe parcursul studiului; - nu mai doresc s continue studiul n mod deliberat. Descrierea testului Metodologia de testare const n urmtoarele etape: o anumit cantitate de produs (2 ml) se aplic cu o sering de 2 ml pe un bandaj ocluziv; bandajul ocluziv impregnat cu produsul cosmetic este aplicat pe pielea uman (umr sau partea superioar a spatelui); simultan, patch-urile placebo (niciun fel de substane active) i cele ce realizeaz controlul pozitiv (lauril sulfat de sodiu), sunt aplicate pe piele; cele trei tipuri de probe sunt 27

codificate i aplicate aleatoriu de ctre investigator, ntrun trial tip single blind; bandajul ocluziv este meninut 24 de ore fr nici o umiditate, observndu-se orice eventuale efecte secundare; dup 24 de ore bandajul ocluziv este detaat de pe piele i produsul este splat fr nicio manevr de frecare; toate efectele adverse tegumentare (eritem, uscciune, edem), sunt evaluate cu ajutorul scorurilor COLIPA, menionate anterior; orice reacie este observat imediat i dup 30 de minute, o or, 24 i 48 de ore de la ndeprtarea bandajului ocluziv; evaluarea a fost realizat de ctre personal specializat i n aceleai condiii luminozitate. Pentru patch-uri au fost folosite: bandaje ocluzive, materiale adezive pentru fixarea bandajelor, seringi i hrtie. Studiile au fost realizate respectndu-se principiile etice ale Declaraiei de la Helsinki cu privire la testarea pe subieci umani, incluznd confidenialitatea cu privire la toate nregistrrile i documentele. Aspectul pielii a fost analizat cu ajutorul patchtestelor i confirmat de analiza 41 Proderm cu un dispozitiv Proderm (figura 5).

28

Evaluarea potenialului toxic / iritativ pentru produsele cosmetice testate este efectuat vizual - roeaa i / sau uscciunea a pielii este evaluat pe o scal n conformitate cu scorurile COLIPA (tabelul 14).

Transportul transepidermic const n traversarea stratului cornos intact (SC). Exist dou posibiliti de trecere: intracelular i intercelular (prin i printre 29

corneocite). Modul de trecere depinde coeficientul de partiie k al substanei active: substanele hidrofile prefer modul intracelular de traversare n timp ce substanele lipofile aleg calea intercelular, n acelai timp, existnd molecule care pot utiliza ambele ci. Aceast metod reprezint o evaluare indirect a integritii stratului hidrofilic responsabil pentru funcia de barier a pielii. Exist o difuzie continu a apei din corpul uman spre stratul cornos i de acolo la mediul inconjurator. Nivele mici de ap transepidermic evaporat nseamn o funcie mai bun a pielii ca barier i o pierdere mai mic a gradului de umezire natural. Funcia de barier este uor perturbat de probleme mecanice sau chimice. Msurtorile de tip TEWL vor fi efectuate numai dup utilizarea produselor cu ajutorul bandajelor ocluzive timp de 24 de ore. Acest tip de testare au reprezentat o metod neinvaziv de analiz a pielii, ntr-un trial single blind. Formula semisolid pregtit pentru testele TEWL a fost comparat cu una similar la care s-a ajuns folosindu-se un extract din scoara uscat de mesteacn, 1g / 100 g crem (vezi tabelul 15). Aceast formul s-a dovedit a avea o

30

activitate de protecie tegumentar [Urica, L., 2005; Morell, J.L.P., 1996].

7.3. Rezultate i discuii Primele observaii cu privire la potenialul iritativ al acestor formulri semisolide au fost evaluri vizuale. Principalele teste au fost: eritemulul, descuamarea i edemul. Rezultatele sunt prezentate n tabelul 17.

31

32

33

34

35

36

37

Observaia principal n acest studiu preliminar este c soluia tensioactivului anionic este formularea cea mai duntoare pentru piele. Aa cum este prezentat n literatura de specialitate tensioactivul laurilsulfat de sodiu este considerat modelul de aur pentru testele de iritare. Dei acest aspect este clar, ar putea fi important s se analizeze ce tip de formulare a produs tulburrile cele mai evidente i care este 38 importana diferitelor

concentraii asupra afeciunilor induse pielii. Datele referitoare la aceti compui sunt elementare deoarece ei se aplic cu o frecven considerabil pe piele. Aspectele legate de pirderea de ap transdermic subliniaz discuiile prezentate i arat c o perioad scurt i permanent de aplicare de laurilsufat de sodiu n doze mici determin o important nocivitate pe piele. Starea de hidratare a pielii este influenat de factori externi, cum ar fi creme, loiuni, soluii i evaluarea real arat diferenele n ceea ce privete tipul de agent tensioactiv i formularea utilizat Observaiile cele mai importante n aceast direcie sunt legate de nocivitatea laurilsulfatului de sodiu pentru ambele formulri dar mai uoar pentru crema neionic. Formulrile semisolide influeneaz starea de hidratare, dup o perioad scurt de timp de aplicare permanent. Parametrul cu o influen sczut se refer la valorile melaninei pentru toate tipurile de formulri. Chiar dac este detectabil prin acelai dispozitiv, Mexametrul, eritemul este intens influenat de agentul tensioactiv anionic. Acest comentariu poate fi corelat cu aspectul vizual al pielii (figura 43) pentru un test cu plasture pe o piele sensibil indic faptul c la o concentraie mai mic de agent tensioactiv anionic (5 %) se produc modificri 39

importante externe (scorul eritemului 2). Analizele privind agenii tensioactivi aplicai pe piele sunt justificate mai ales prin utilizarea lor frecventa. Acest lucru poate fi motivul pentru care tiina a dezvoltat noi tendine in analiza de toxicitate a tensioactivilor, cum ar fi membrana de ou embrionat-corioalantoidian (HETCAM) testul sau testele in vitro (fibroblati etc.). Aceste evaluri vor finaliza testele non-invazive de apariie a hemoragiei, a lizei i a coagulrii. 7.4. Concluzii Polisorbaii pot fi considerai ingrediente sigure mai evident n formulrile semisolide. Polisorbat 20 este un compus foarte protectiv care poate fi aplicat n produsele pentru o piele sensibil. Aplicaiile pe termen lung pentru polisorbai reprezint o procedur sigur. Concentraiile mai mari de tensioactivi cum ar fi compuii neionici sunt sigure pentru piele i aspectul nociv nu prezint semnificaie. Chiar i compuii nonionici introdui n formulrile cosmetice semisolide care nu sunt toxice necesit testri de siguran din cauza aplicrii lor pe termen lung i a utilizrii acestora n produse pentru pielea sensibil sau n diverse separri biologice.

40

8. APLICAREA TESTELOR INVITTOX PENTRU EVALUAREA UNOR TENSIOACTIVI CLASICI I MODERNI

Evaluarea potentialului iritativ al unor surfactanti prin metode in vitro i in vivo Curenia / igiena este o veche necesitate iar surfactanii au fost folosii de ctre omenire n acest scop nc din vremuri strvechi. Tensioactivii sunt molecule amfotere i coninnd o jumtate hidrofil i una lipofil care s le permit s interacioneze cu att moleculele polare ct i cu cele nepolare. Tensioactivii sunt, n general, clasificate n funcie de aceste proprieti sau pe baza constituiei lor chimice. n funcie de ncrctura lor, ei sunt clasificai ca tensioactivi anionici, neionici, cationici sau amfoteri. Datorit proprietilor amfotere acetia pot fi folosii ca ageni de curaare, spumare, umectare, emulgatori etc. Atunci cnd sunt aplicai pe piele, ei pot interaciona cu structuri tegumentare, n special cu componentele lipidice i proteice. Dei tensioactivii utilizai n produsele care se ndeprteaz sunt n general bine tolerai, ei prezint un risc pentru dezvoltarea dermatitei iritative de contact. 41

Potenialul iritativ este extrem de dependent de concentraia de substan, precum i de pH-ul compoziiei realizat n cadrul formulrii [Rhein, L.D., 1986; Baranda, L., 2002]. Datorit capacitii de a emulsiona i de a reduce tensiunea superficial a apei, tensioactivii pot elimina lipidele din piele n timpul procesului de splare. Prin urmare, efectele dermice iritante majore se manifest n special n uscarea i asprirea pielii, iar n cazuri rare, pot fi induse chiar leziuni mai severe. Exist mai multe metode utilizate cu regularitate a diferenia detergenii, n ceea ce privete potenialul lor de iritaie i pentru ai clasifica din punct de vedere al riscurilor profesionale. Testul Draize de iritare ocular a fost standardul de aur muli ani pentru testarea iritrii ochilor. Avnd n vedere preocuparea pentru bunstarea animalelor i limitarea utilizrii lor n experimentele de laborator, au fost dezvoltate metode alternative cum ar fi testul pe celule roii din snge, testul pe membrana corioalantoidian de ou de gin (test HET-CAM) i teste ce folosesc modele de esut ocular, toate pentru a evalua potenialul iritativ al membranelor mucoase / oculare indus de tensioactivi i alte substane. Iritaia dermic 42

este adesea evaluat la om utiliznd testarea cu patch-uri epicutanate (ECT; testul one-time plasture ocluziv), n timp ce testele tip camera de spun (SCT) pot fi utilizate pentru a evalua iritarea secundar expunerii ocluzive repetate la surfactant. Scopul acestui studiu a fost de a evalua comparabilitatea rezultatelor testului prin diferite metode. Pentru a evita inconsecvenele dependente de lot, potenialul iritativ pentru 18 tensioactivi a fost evaluat folosind aceeai soluie stoc pentru agenii tensioactivi n cadrul fiecrui studiu. Cnd etichetarea se face n conformitate cu clasificarea riscului profesional, substanele sunt, n general, testate nediluate i la pH-ul pe care l dein materiile prime depozitate. Acest lucru nu reflect condiiile incluse n produsele de igien personal, cum ar fi amponul, n care nivelul pH-ului, de obicei, variaz de la pH 5-8. Prin urmare, n acest studiu de compatibilitate a soluiilor tensioactive evaluarea s-a fcut la un pH care este relevant pentru acest tip de produs de consum. Excepie au fost cazurile de limitare a metodei printr-un pH specific, cnd testarea a fost efectuat cu produse adaptate la un pH de 6,5. 43

Potenialul iritativ ocular al tensioactivilor a fost studiat cu ajutorul a trei sisteme de testare in vitro care n prezent sunt utilizate ca alternative la studiile pe animale i anume testul RBC i testul HET-CAM. 8.2. Materiale i metode Soluiile de Laurilsulfat de sodiu (SDS), Tween 20 i Tween 60 au fost n concentraie de 5 %. Ele au fost oferite de ctre departamentul de tehnologie farmaceutic al UMFT. O soluie tip vehicul control a fost pregtit pentru aplicarea pe CAM; reactivul pur a fost diluat cu ap distilat (1:10, v / v). SDS a fost administrat n CAM iar ca model de control pozitiv s-a folosit o soluie de 1 mg / ml n ap distilat. Testul HETCAM Aceast investigaie biologic este folosit pentru a evalua potenialul iritativ ocular pentru orice substan de testat, msurat prin abilitatea sa de a induce toxicitate la nivelul vascular pe membrana corioalantoidian de pui [Ribatti, D., 2008]. Biotestului HET-CAM a fost realizat ca urmare a recomandrilor ICCVAM publicate n noiembrie 2006 n apendicele G i adaptate la condiiile laboratorului nostrum [Kishore, A.S., 2008]. 44

Animale i tratament oareci tip CD1 Nu / Nu au fost achiziionai de la firma Charles River (Sulzfeld, Germania), 4 oareci / grup. Din sptmna 8 pe zona dorsal a fost aplicat soluia testat: grupul A. martorul-doar solvent (ap); grupul B. soluie SLS de 5 %; grupul C - Tween 20 5 % i grupul D soluia de Tween 60 5 %, de cte 2 ori / zi fiecare. Rezultatele finale au fost nregistrate i centralizate dup 30 de zile. Protocolul de munc a urmat toate normele de sntate animal preconizate NIAHNational Institute of Animal Health: animalele au fost meninute n timpul experimentului n condiii standard: 12 ore ciclul lumin-ntuneric, hran i ap libidum, temperatur de 24 C, umiditate peste 55 %. Msurtorile mexametrice au fost efectuate cu ajutorul unui dispozitiv de cercetare de la CourageKhazaka, un mexametru tip MX18 (Courage-Khazaka Electronic, Kln, Germania). Pentru msurtori, oarecii au fost anesteziai cu ketamin i xilazin. Timpul de msurare continu a fost de 20 de secunde. Protocolul a urmrit observaiile cu privire la statusul hemoglobinei (respectiv apariia eritemului). Dispozitivul a fost aplicat pe zonele afectate cel mai 45

evident i a fost meninut pe piele timp de 20 de secunde. Datele au fost nregistrate de softul specific al dispozitivului tip Mexametru MX18 i apoi exprimate n uniti. Toate datele au fost prelucrate ca valori msurate iniiale i finale pe aceeai zon

Compuii testai i reactivii Toate tensioactivii utilizai, cu excepia lauril sulfatului de sodiu (SDS), au fost obinui de la Cognis Deutschland GmbH & Co. KG (Germania). O descriere a acestor tensioactivi poate fi gsit n tabelul 19. Aceleai soluii stoc au fost utilizate pentru toate testele (12 % AS; pH 6,5).

46

47

8.3. Rezultate Soluii stoc identice (12 % AS; pH 6,5) au fost utilizate pentru toate testele n scopul evitrii variaiilor n rezultatele testelor din cauza diferenelor induse de proprietile intrinseci ale produsului testat. Att concentraia de substan activ (AS) ct i pH-ul joac un rol major n provocarea reaciilor iritante, pH-ul i AS % fiind ajustate n conformitate cu tabelul 20, n funcie de metoda utilizat nainte de testare. Cu excepia a ECT, toate testele au fost efectuate n aceeai lun.

48

Unele dintre probe au fost testate n ECT n aceeai lun n timp ce alte probe au fost testate dou luni mai trziu. Testele au fost effectuate dublu-orb i, dup caz randomizat. Testul RBC Testul celulelor sanguine roii este un test pe baz de celule fotometrice i a fost dezvoltat pentru a evalua reaciile iniiale celulare care au loc n procesele de iritaie ocular determinate de tensioactivi i de produse pe baz de surfactani. Principiul testului RBC este evaluarea tulburrilor membranare i a denaturrii proteinelor cauzate de agenii tensioactivi. n acest scop, deteriorarea membranei celulare este evaluat cu ajutorul cantitii de hemoglobin care se scurge n supernatant precum i de modificrile conformaiei proteinelor care sunt evaluate prin denaturarea hemoglobinei. Deoarece pH-ul fiziologic al sngelui este 7,4, toate soluiile au fost ajustate la acest pH pentru a evita modificri ale potenialului iritativ numai din cauza pH-ului. Coeficientul H50 / DI este utilizat ca o msur de clasificare a iritaiei oculare n analogie cu testul Draize de iritaie ocular.

49

Surfactanii Dehyton MC, Gluadin WQ, Dehyton ML, Plantacare 2000, Plantacare 818, Gluadin WK, i Plantapon LC7 au fost clasificai ca nefiind iritani n timp ce tensioactivii Plantapon LC7, Gluadin WK i Plantapon 818 au fost ncadrai cel mai puin iritani. Tensioactivii PGFAC-S, Plantapon ACG 50, 138 Plantapon LGC, i Plantacare 1200 au fost clasificai ca fiind uor iritani, tensioactivii Plantapon SB3, Dehyton DC i Dehyton PK45 au fost clasificai ca fiind moderat iritani i tensioactivii Texapon S K14, Texapon ALS, Texapon K12 G i Texapon N70 au fost clasificai ca iritani. Testul HET-CAM Testul protocolului HET-CAM ICCVAM a fost aplicat anterior conform de ctre descris

Spielemann si Liebsch (INVITTOX 1992). Acesta se bazeaz pe observarea membranei corioalantoide dup aplicarea probelor de analizat i ine cont de avantajul esutului biologic folosit reeaua vascular sanguin, de a reaciona prompt n contact cu compuii analizai. Membrana corioalantoid a embrionului de pui de gin este observat continuu timp de 5 minute dup aplicarea soluiilor de analizat. Metoda a putut fi folosit 50

n cazul tuturor probelor, acestea fiind transparente. Momentul apariiei primului semn de hemoragie, liz vascular (vase fantom) sau coagulabilitate este notat n secunde i folosit pentru a calcula indicele de iritabilitate; severitatea reaciilor generate a fost de asemenea evaluat. Rezultatele sunt prezentate n figura 48 i n tabelul 20.

51

52

53

54

Analiznd rezultatele obinute se observ diferena existent ntre probele control i cele de analizat. Se remarc reacia sever produs de ctre lauril sulfatul de sodiu (SDS); toxicitatea acestuia este confirmat i de efectul produs la aplicarea a 0,3 ml de soluie 1 % la nivelul membranei corioalantoide; decesul embrionului a survenit n decurs de 20 de minute. n afara specimenului tratat cu SDS toate celelalte au supravieuit pn a doua zi. Din seria de compui analizai se remarc i Cremophor A6; n decursul celor 5 minute de observare a evoluiei plexului vascular n contact cu soluia aplicat au fost remarcate numeroase zone cu microhemoragii; de 55

asemenea n urma evalurii aspectului macroscopic al membranei la o zi dup aplicarea probelor, Cremophor A6 este singura prob care determin distrugerea n totalitate a membranei corioalantoide (figura 51).

Dintre moleculele analizate nici una nu a fost lipsit n totalitate de potenial iritativ. Urmtorii compui au fost evaluai ca ageni surfactani cu reacie iritativ foarte uoar: Cremophor A25, Abril EM 90, Isolan GI 34. Sucrose ester, Cremophor RH 40, Cremophor EL i Labrasol au indicat un potenial iritativ uor. Compusul cu cel mai ridicat potenial iritativ ncadrat n categoria efect moderat spre sever a fost Cremophor A6. Acest efect a fost confirmat i prin distrucia structurii membranei evocat n figura 51. Rezultatele arat o mare diferen ntre controlul pozitiv, SDS i cele dou substane tensioactive testate 56

Tween 20 i Tween 60. SDS induce tulburri majore la nivel vascular pe membrana corioalantoidin; dup aplicarea de 0,3 ml de soluie (1 mg / ml), o zon ntins a fost afectat de numrul mare de microhemoragii, moartea modelului fiind nregistrat dup 20 de minute de la contactul cu soluia de SDS. Celelalte exemplare au avut o viabilitate mai bun, rezistnd pn a doua zi. Cele dou soluii de tensioactivi evaluate nu au produs reacii iritative severe pe plexul capilar al CAM tratate. Ambele au prezentat semne de microcoagulare. Soluia de Tween 20 a indus o reacie generalizat i mai sever, care a aprut mai trziu, explicnd n acest fel existena celei mai mici valori a scorului iritativ. De asemenea, nu a existat nici un semn de liza, vasodilataia i hemoragia uoar au aprut doar la sfritul timpului de observare. n ceea ce privete soluia Tween 60, au existat cteva domenii de microcoagulare i de liz vascular, dar care au fost nregistrate mai devreme, inducnd un scor iritativ mai mare, chiar dac severitatea reaciei a fost clasificat ca fiind uoar. Experimentele in vivo susin teoria iritativ pentru aspectele observate pe imaginile macroscopice ale compuilor testai (figura 52). Cel mai iritativ compus 57

este unul de referin SLS, dar, de asemenea, cei nonionici (Tweens) au dezvoltat reacii iritante i de tegument uscat (figurile 52 i 53).

58

9. FOLOSIREA SURFACTANILOR N SINTEZA DE NANOCAPSULE POLIETERURETANICE UTILIZATE N TRANSPORTUL TRANSDERMIC

9.4. Materiale i metod n sinteza nanocapsulelor polieter-uretanice se utilizeaz o component hidroxilic (diol, poliol sau cel mai frecvent amestecul lor), o component izocianic (un semiprepolimer izocianic pe baz de lisin-diizocianat), solvent i surfactani. Componenta hidroxilic este format dintr-un amestec de dioli cu mase moleculare mici ca 1,2-etilenglicol, 1,4-butandiol, respectiv polietilenglicol cu masa molecular 200. Componenta izocianic este un semiprepolimer pe baz de lisindiizocianat; se utilizeaz varianta cu semiprepolimer pentru a evita problemele de omogenizare datorate diferenelor de vscozitate dintre cele doua componente. Se folosete acetona ca solvent i diferii surfactani.

59

60

61

62

9.5. Rezultate i discuii Complecii de incluziune sunt analizai prin calorimetria de scanare diferenial n scopul detectrii unei modificri ale proprietilor termice comparativ cu substanele pure. n cazul ncorporrii nanocapsulelor, are loc o deplasare a punctelor lor de topire, fierbere i sublimare sau chiar dispariia acestora. Analiza prin calorimetrie de scanare diferenial a fost realizat cu un aparat Mettler Toledo DSC 821 tip Star, versiunea 6.0 (Mettler Inc., Schwerzenbach, Elveia), cu o vitez de nclzire de 5 C / min i o vitez de curgere a argonului de 167 ml / min (10 l / h). Masa probei s-a situat ntre 2-5 mg iar intervalul de temperatur a fost ntre 25-300 C.

63

Curbele DSC nu prezint pic-uri, substana avnd caracter amorf, iar descompunerea substanei are loc n jurul temperaturii de 280 C. n cazul produilor testai cu 64

HPBCD se constat dispariia pic-ului endoterm (220 C) i apariia unor pic-uri puternic endoterme n jurul valorii de 260 C, care probabil atest topirea ntregii probe la aceast valoare de temperatur. Nu poate fi exclus i o descompunere a probei, nsoit de o eventual reacie ntre cei doi compui. Morfologia particulelor a fost examinat utiliznd microscopul de scanare electronic Hitachi 2400S (Hitachi Scientific Ltd, Japonia). S-a utilizat un aparat de acoperire n strat subire (Bio-Rad SC 502, VG Microtech, Anglia) pentru a induce o conductivitate electric a suprafeei eantionului. Presiunea aerului a fost de 1,3-13,0 mPa. Forma i morfologia de suprafa ale unor compui formai din nanocapsule i ale complecilor lor obinui prin tehnica uscrii prin pulverizare sunt prezentate n figurile urmatoare. Imaginile microscopice au fost nregistrate cu o mrire de 10.000 x a probei, astfel nct s fie vizibil att imaginea de ansamblu ct i o imagine ct mai detaliat a particulelor substanelor respective. n cazul produilor analizai se constat existena unor cristale prismatice, de dimensiuni diferite, cu suprafa neted; nanostructurile se prezint ca i cristale 65

de diferite dimensiuni, neregulate. n ceea ce privete cele dou formule implicate n obinerea complecilor de incluziune menionai, se constat o diferen semnificativ n morfologia particulelor: unele se prezint sub forma unor cristale tridimensionale, de dimensiuni neregulate iar RAMEB este format din particule sferice, fisurate, netede. n cazul complecilor obinui prin tehnica uscrii prin pulverizare se constat o modificare remarcabil a morfologiei substanelor. Produii SD au o natur amorf, cu particule sferice, unele parial fisurate, cu o suprafa neted. Se observ de asemenea agregarea acestor particule sferice. n consecin, morfologia i dimensiunea particulelor produilor SD sunt fundamental diferite de cele ale substanelor iniiale, fiind imposibil evidenierea cristalelor individuale (planurile de clivaj cristalografice) ale diureticelor sau -CD. Aceste observaii conduc la estimarea existenei unei singure faze n produii SD i deci la formarea unui complex de incluziune.

66

67

68

69

70

71

72

73

74

10. TESTAREA UNOR NANOCAPSULE CU TENSIOACTIVI PRIN METODE NONINVAZIVE PE MODEL ANIMAL

cadrul

experimentului

de

determinare

modificrilor aprute la suprafaa pielii n tratamente cu medicamente nglobate n nanocapsule de tip polieteruretanic s-au avut n vedere urmtoarele: - au fost utilizai n experiment 30 oricei C57BL6j mprii n 10 loturi (3 oricei / lot); - oriceii au fost epilai cu o zi nainte de a ncepe aplicarea i determinrile, respectiv cu o zi naintea aplicrii i determinrilor din sptmnile 4 i 8; - a fost aplicat de fiecare dat o cantitate de 200 L emulsie de nanocapsule n aceton (conc = 0.01 % w/w); - pe martor s-au aplicat cte 200 L aceton; - valorile au fost determinate dup 30 minute de la aplicarea pe piele; - n tabele i grafice sunt prelucrate valorile medii ale fiecrui lot de 3 oricei; - loturile au fost notate conform tabelului I in funcie de surfactanii utilizai n sinteza nanocapsulelor poliuretanice. 75

76

77

78

79

80

81

82

10.7. Concluzii

n cazul valorilor determinate pe loturile de oareci supus acestui experiment, s-a observat c aplicarea de emulsii care conin nanocapsule nu modific parametrii studiai.

83

CONCLUZII GENERALE
1. Surfactanii sau compuii cu activitate tensioactiv pot genera schimbri importante la nivelul organului cutanat. Studiul lor necesit reevaluare mai ales datorit faptului c pot fi parte component a unor produse cu utilizarea frecvent i aceasta impune monitorizarea nocivitii lor. n plus noile concepte despre tensioctivi nu se refer la excluderea lor ci la reevaluarea lor. Calitatea produselor cu tensioctivi este incontestabil mai ales n ceea ce privete formulrile n care ei au rol de emulgator. 2. Metodele moderne de studiu ale surfactanilor permit o investigare direct pe pielea uman pentru a prevedea nocivitatea lor. Cu toate acestea pentru o detaliere a aciunii lor de ansamblu n produse dermatologice sau alte produse finite se impune studiul complex pe organisme in vivo (animale de experien, embrionii de pui etc). 3. Studiul tensioactivilor se efectueaz n cercetrile actuale prin metode non-invazive. TEWA-metria, corneometria, Mexametria sunt numai cteva din aceste metode aplicate pentru testarea organului cutanat. 84

4. Compuii anionici de tipul laurilsulfatului de sodiu par a fi extrem de nocivi pentru piele chiar i la doze reduse. Acest aspect este uor observabil mai ales dac sunt aplicai sub form de soluii. Nocivitatea compuilor anionici se manifest n primul rnd prin modificarea aspectului pielii prin iritaie i edem (patch test). Un alt aspect detectabil n urma aplicrii compuilor tensioactivi ndeosebi anionici este modifcarea statusului hidric al pielii. 5. Cu toate c despre compuii anionici se vehiculeaz n diverse moduri ideea de nocivitate ei nu pot fi nlocuii i ignorai n produsele i formulrile finite datorit calitii conferit acestor formulri. Demonstrarea detaliat n actualul material a posibilitilor detaliate, diferite i reproductibile de evaluare a produselor cu tensioactivi ajut la soluionarea problemei de testare i elucidare a nocivitii versus aplicabilitate. 6. Compuii neionici nu sunt lipsii complet de intervenii n ceea ce privete modificarea calitii pielii. Acest aspect demonstrat prin diversele formulri cu tensioactivi 85

(formulri semisolide, nanocapsule) conduce din nou la ideea testrii pe ct posibil prin tehnici non-invazive a formulrilor cu aceti compui. 7. Compuii de tipul surfactanilor nu modific sesizabil melanina, dar cu ajutorul Mexametrului se pote detecta modificarea hemoglobinei locale (eritemul). n plus influeneaz i pierderea de ap transdermic i statusul hidric al pielii. 8. Parametrii de tipul apei transdermice i hemoglobinei locale sunt importani n expresia nocivitii locale a unor compui aplicai topic, inclusiv n cazul emulgatorilor. 9. Studiul toxicitii surfactanilor prin metode moderne este de actualitate mai ales n ceea ce privete frecvena utilizrii lor, ndeosebi n produse cosmetice. Aplicarea tehnicilor INVITTOX poate fi o soluie important pentru aprecierea exact a nocivitii acestora. 10. Un numr mare de studii au fost efectuate pentru a gsi teste care s nlocuiasc nevoia de animale de experien n testele de siguran pentru ochi i piele. 86

Testul pe piele de oarece, care este un test fidel pentru corp n totalitatea lui, poate fi corelat cu testul CAM. O baterie de teste ar trebui s fie stabilite, pentru c nici un test unic nu poate ndeplini toate cerinele de evaluare a riscurilor; s-ar putea utiliza o metod in vitro i o parte din aceste teste ar putea fi teste simple pe ou embrionate sau pe pielea animalelor utilizate ca i tehnici noninvazive de msurare. 11. Tensioactivii pot servi la producerea unor formulri farmaceutice importante i moderne. Ei sunt indispensabili pentru unele formulri semisolide, mai ales cele de pe piaa dermocosmetic. 12. Aplicarea tensioactivilor moderni care prezint nocivitate sczut poate fi o soluie n ceea ce privete reducerea potenialului nociv ce poate fi exercitat de acest tip de compui. 13. Tensioactivii clasici utilizai n formulri individual sunt iritani i sensibilizani pentru piele chiar i la doze reduse de 1-2 %. Combinarea acestora cu principii care

87

s protejeze organul cutanat ajut la diminuarea efectelor nocive locale. 14. Tensioactivii pot influena cedarea in vitro a principiului activ, fie c este vorba de membran celulozic fie c membrana de cedare este pielea de obolan. 15. Nanocapsulele sunt formulri moderne care n unele variante de formulare apeleaz la tensioctivi. Tipul acestora poate influena structura lor i caracteristicile formei finite dar nu ntr-un mod accentuat. 16. Testarea nanocapsulelor cu tensioactivi pe pielea animalelor de experien prin metode rapide noninvazive arat nocivitatea redus a acestora. 17. Noile tendine n domeniul studiilor compuilor cu potenial nociv se refer la posibilitatea de a-i utiliza n continuare cu reglementri foarte clare.

88

PROPUNERI I RECOMANDRI
1. Folosirea tensioactivilor n formulri farmaceutice trebuie fcut echilibrat. Aceasta va avea n calcul ideea de folosire a acestora n doze reduse sau folosirea unor substane asociate care s reduc nocivitatea local. 2. Aplicaiile tensioactivilor pot fi extinse pe domenii variate, inclusiv n ceea ce privete formularea de nanocapsule. Aceste formulri se pot executa cu doze mici de surfactant i sunt lipsite de efecte nocive marcante. 3. Aplicarea testelor INVITTOX este o soluie facil i detaliat a prezentrii nocivitii unui tensioactiv. 4. Testele INVITTOX se pot corela ntre ele i apoi cu altele de alt natur pentru a aprecia detaliat toxicitatea tensioactivilor chiar i la doze reduse. 5. Se recomand testarea i monitorizarea atent a formulrilor cu tensioactivi mai ales dac sunt de tip anionic. 6. Pentru evaluarea tensioactivilor i formulrilor acestora este indicat folosirea de metode non-invazive

89

(Mexametrie, TEWAmetrie etc.) care vor reda rapid i exact degradarea cutanat. 7. Se recomand folosirea unor tipuri de tensioctivi care confer putere de penetrare similar atunci cnd se testeaz cedarea principiului activ prin membran celulozic sau piele de animal. 8. Tensioactivii moderni trebuie luai n calcul ca variante de compui cu rol de emulgator sau penetrant lipsii de o nocivitate remarcabil.

ELEMENTELE DE ORIGINALITATE
Prin prezentul material se reliefeaz elemente de originalitate care pot fi dup cum urmeaz: 1. Se prezint studii de toxicitate corelate pe pielea uman i studii implementate pe animale de experien care apeleaz la tehnici moderne de analiz i investigare. 2. Teza propune abordarea tehnicilor moderne de testare a compuilor nocivi i a tensioactivilor, testele INVITTOX dintre care s-a selectat testul pe ou embrionat i testul pe eritrocite care s-a aplicat pe un numr extins

90

de tensioactivi din categorii diferite. Muli dintre acetia sunt de ultim generaie. 3. Teza subliniaz implementarea tehnicilor non-invazive moderne ca metode de studiu al calitii organului cutanat. 4. Formularea de nanocapsule cu diferii tensioactivi, implicit de ultim generaie subliniaz elementul cel mai important i nou al materialului n lucru. 5. Nanocapsulele obinute prin metode de sintez actuale au fost investigate prin metode moderne de analiz pe animale de experien. 6. Studiul are un caracter concluziv n ceea ce privete analiza tensioactivilor ntre aplicabilitate i nocivitate.

91

BIBLIOGRAFIE SELECTIV 1. Addicks, W.J.; Flynn, G.L.; Weiner, N. Validation of a flow-through diffusion cell for use in transdermal research. Pharm. Res. 1987, 4, 337341. 2. Ai R, Dahl JE, Morisbak E, Polyzois GL. Irritation and cytotoxic potential of denture adhesives. Gerondol 2005; 22:177183. 3. Al-Bawab, A.; Friberg, S.E., Some pertinent factors in skin care emulsions. Adv. Colloid Interf. Sci. 2006, 123126, 313322. 4. Baranda L. et al.: Correlation between pH and irritant effect of cleansers marketed for dry skin, Int. Journ of Dermatol., vol. 41 (8), Aug., p. 494, 2002; 5. Barany E, Lindberg M, Loden M. Biophysical characterization of skin damage and recovery after exposure to different surfactants. Contact Dermat 1999; 40:98103. 6. Barany, E., 2000. Human in vivo skin irritancy testing. In: Loden, M., Maibach, H.I. (Eds.), Dry Skin and Moisturizers. CRC Press LLC, Boca Raton, pp. 243250. 92

7. Barry, B.W.; Grace, A.J., Sensory Testing of Spreadability: Investigation of Rheological Conditions Operative During Application of Topical Preparations, J. Pharm. Sci. 1972,61 (3), 335341. 8. Bellomo, R.; Ronco, C. An Introduction to continuous renal replacement therapy. In Atlas of Hemodialysis; Bellomo, R., Baldwin, I., Ronco, C., Thomas, G., Eds.; Bailliere Tindall: London, UK, 2001; Volume 1, pp. 110. 9. Benassi L, Bertazzoni G, Magnoni C et al. Decrease in toxic potential of mixed tensides maintained below the critical micelle concentration: an in vitro study. Skin Pharmacol. Appl Skin Physiol 2003; 16: 156164. 10. Bonferoni, M.C.; Rossi, S.; Ferrari, F.; Caramella, C. A modified Franz diffusion cell for simultaneous assessment of drug release and washability of mucoadhesive gels. Pharm. Dev. Tech. 1999, 4, 4553. 11. Breton, P.J., 1999. From microns to nanometers: early landmarks in the science of scanning

93

electron microscope imaging. Scanning Microsc. 13-1, 16. 12. Budai P, Varnagy L, Fejes S et al. Irritative effects of some pesticides and a technical component on tissue structure of the chorioallantoic membrane. Commun Agric Appl Biol Sci 2004; 69: 807809. 13. Capitanul, A.; Luzy, A. P. ;Esdaile,D. ; et al., Comparison of the human skin grafted onto nude mouse model with in vivo and in vitro models in the prediction of percutaneous penetration of three lipophilic pesticides, Regul. Toxicol. Pharm. , 2007, 47: 274-287. 14. Caracciolo P.C., de Queiroz A.A.A., Higa O.Z., Buffa F., Abraham G.A., 2008, Acta Biomaterialia, 4, 976-988; 15. Chattaraj, S.C.; Kanfer, I. Release of acyclovir from semisolid dosage forms: a semi-automated procedure using a simple plexiglass flow-through cell. Int. J. Pharm. 1995, 125, 215222. 16. Chenoweth, D.E.; Cheung, A.K.; Henderson, L.W. Anaphylatoxin formation during

94

hemodialysis:

Effects

of

different

dialyzer

membranes. Kidney Int. 1983, 24, 764769. 17. Chilcott R, Barai N, Beezer A, Brain S, Brown M, Bunge A, et al. Inter- and intra-laboratory variation of in vitro diffusion cell measurements: an international multi-centre study using quasistandardised methods and materials. J Pharm Sci. 2005;94:6328. 18. Clement, P.; Laugel, C.; Marty, J.-P. Influence of three synthetic membranes on the release of caffeine from concentrated w/o emulsions. J. Controlled Release 2000, 66, 243254. 19. 1997, (123-124), 169-182. 20. Corbo, M.; Schultz, T.W.; Wong, G.K.; van Buskirk, G.A. Development and validation of in vitro release testing methods for semisolid formulations. Pharm. Tech. 1993, 9, 112128. 21. Crisante F., Francolini I., Bellusci M., Martinelli A., DIlario L., Piozzi A., 2009, European Journal of Pharmaceutical Sciences, 36, 555-564; 22. Cronin, M.T.D.; Dearden, J.C.; Moss, G.P.; Murray-Dickson, G. Investigation of the mechanism of flux across human skin in vitro by 95

quantitative structure-permeability relationship. Eur. J. Pharm. Sci. 1998, 7, 325330 23. De Fine Olivarius, F.; Agner, T.; Menne, T., Skin barrier function and dermal inflammation. An experimental study of transepidermal water loss after dermal tuberculin injection compared with SLS patch testing. Br. J. Dermatol. 1993, 129, 554557. 24. Debbasch C, Ebenhahn C, Dami N et al. Eye irritation of low-irritant cosmetic formulations: correlation of in vitro results with clinical data and product composition. Food Chem Toxicol 2005; 43: 155165. 25. Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, Dupuis J, Lovell W, et al. Test guidelines for in vitro assessment of dermal absorption and percutaneous penetration of cosmetic ingredients. Food Chem Toxicol. 1999;37:191205. 26. Djabari Z, Bauza E, Dal Farra C et al. The HETCAM test combined with histological studies for better evaluation of active ingredient innocuity. Int J Tissue React 2002; 24: 117121 96

27. Duggin, G., Softening Skin with Emollient Ingredients, Manufacturing Chemist 1996, 67 (6), 2731. 28. Eccleston, G.M., Functions of mixed emulsifiers and emulsifying waxes in dermatological lotions and creams, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 29. Edresi, S.; Baie, S., In-vitro and in-vivo evaluation of a photo-protective kojic dipalmitate loaded into nano-creams. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences 2010, 5 (6), 251-265. 30. Eun HC, Suh DH. Comprehensive outlook of in vitro tests for assessing skin irritancy as alternative to Draize tests. J Dermatol Sci 2000; 24: 7791. 31. FDA-SUPAC-SS. Guidance for Industry. SUPAC-SS Non-sterile Semisolid Dosage Forms. Scale-up and Postapproval Changes: Chemistry, Manufacturing and Controls. In vitro

ReleaseTesting and In Vivo Bioequivalence Documentation 1997; pp. 1924. 32. Fernandez A.M., Abraham G.A., Valentin J.L., San Roman J., 2006, Polymer, 47, 785-798; 97

33. Franz, T.J. Percutaneous absorption. On the relevance of In vitro data. J. Invest. Dermatol. 1975, 64, 190195. 34. Franz T. The finite dose technique as a valid in vitro model for the study of percutaneous absorption. Curr Probl Dermatol 1978;7:5868. 35. Friend, D.; Catz, P.; Heller, J.; Okagaki, M. Transdermal delivery of Levonorgestrel IV:Evaluation of membranes. J. Pharm. Sci. 1989, 78, 477481. 36. Fluhr, J.W.; Kuss, O.;Diepgen, T.; Lazzerini, S.; Pelosi, A.; Gloor,M.; Berardesca, E.,Testing for irritation with a multifactorial approach: comparison of eight noninvasive measuring techniques on five different irritation types, Br. J. Dermatol. 2001,145, 696703. 37. Frum Y, Eccleston GM, Meidan VM. Evidence that drug flux through synthetic membranes is assocated with normally distributed permeability coefficients. 2007;67:4349. 38. Gallagher, S.J.; Trottet, L.; Carter, T.P.; Heard, C.M. Effects of membrane type and liquid/liquid 98 Eur J Pharm Biopharm.

phase boundary on in vitro release of Ketoprofen from gel formulations. J. Drug target. 2003, 11, 373379. 39. Garg, A.; Aggarwal, D.; Garg, S.; Singla, A. K.Spreading of Semisolid Formulations An Update,Pharmaceutical Technology 2002, 9,84105. 40. Gettings SD, Lordo RA, Hintze KL et al. The CTFA Evaluation of Alternatives Program: An evaluation of in vitro alternatives to the Draize primary eye irritation test. (Phase III) surfactant based formulations. Food Chem Toxicol 1996; 34: 79117. 41. Gogolewski S., 1996, Biomedical polyurethanes. In: Arshady R., editor. Desk reference of functional polymers. Syntheses and applications, American Chemical Society, Washington DC, 657-698; 42. Goldstein, J., et al., 2003. Scanning Electron Microscopy and X-ray Microanalysis, 3rd ed. Plenum Press, New York. 43. Guan J., Sacks M.S., Beckman E.J., Wagner W.R., 2004, Biomaterials, 25, 85-96; 99

44. Hagino S, Itagaki H, Kato S et al. Quantitative evaluation to predict the eye irritancy of chemicals: Modification of chorioallantoic membrane test by using trypan blue. Toxicol In Vitro 1991; 5: 301304. 45. Hagino S, Itagaki H, Kato S, Kobayashi T. Further evaluation of the quantitative chorioallantoic membrane test using trypan blue stain to predict the eye irritancy of chemicals. Toxicol In Vitro 1993; 7: 3539. 46. Haguenau, F., Hawkes, P.W., Hutchison, J.L., Satiat-Jeunematre, B., Simon, G.T., Williams, D.B., 2003. Key events in the history of electron microscopy. Microsc. Microanal. 9, 96138. 47. Hawkes, P., 2004. Recent advances in electron optics and electron microscopy. Ann. Fondation Louis de Broglie 29-1 . 48. Henning A, Schaefer UF, Neumann D. Potential pitfalls in skin permeation experiments: influence of experimental factors and subsequent data evaluation. Eur J Pharm Biopharm. 2009;72:324 31.

100

49. Herh, P.; Tkachuk, J.; Wu, S.; Bernzen, M.; Rudolph B.,The rheology of pharmaceutical and cosmetic semisolids,American Laboratory 1998, 1, 12-14. 50. Herzinger T, Korting HC, Maibach HI. Assessment of cutaneous and ocular irritancy: a decade of research on alternatives to animal experimentation. Fundam Appl Toxicol 1995; 24: 2941. 51. Hong J.H., Jeon H.J., Yoo J.H., Yu W.-R., Youk J.H., 2007, Polymer Degradation and Stability, 92, 1186-1192; 52. Imokawa, G., Surfactant-induced depletion of ceramides and other intercellular lipids: implication for the mechanism leading to dehydration of the stratum corneum, Exog. Dermatol. 2004,3, 8198. 53. Jiang X., Li J., Ding M., Tan H., Ling Q., Zhong Y., Fu Q., 2007, European Polymer Journal, 43, 1838-1846; 54. Jones, D.S.; Woolfson, A.D.; Brown, A.F., Texture, Viscoelastic, and Mucoadhesive Properties of Pharmaceutical Gels Composed of 101

Cellulose Polymers, Int. J. Pharm. 1997,151, 223233. 55. Joy, D.C., 1991. The theory and practice of highresolution scanning electron microscopy. Ultramicroscopy 37, 216233. 56. Kajs T. M. ,Gartstein V Review of the instrumental assessment of skin: Effects of cleansing products J. Soc.Cosmet. Chem. 1991,42, 249-271 57. Khan G, Frum Y, Sarheed O, Eccleston GM, Meidan VM. Assessment of drug permeability distribution in two different model skins. Int J Pharm. 2005;303:817. 58. Kishore A S, Surekha P A, Sekhar P V R et al. Chorioallantoic Membrane Bioassay: An In Vitro Alternative to Draize Eye Irritation Test for Pesticide Screening. International Journal of Toxicology 2008; 27: 449-453. 59. Kobayashi, Y.; Iwai,L.; Akutsu, N.; et al., Increased carbonyl protein levels in the stratum corneum of the face during winter, Int. J. Cosmetic. Sci., 2008, 30, 35-40.

102

60. Kogan,

A.;

Garti,N.,

Microemulsions

as

transdermal drug delivery vehicles. Adv. Colloid. Interfac., 2006, 123-126, 369-385. 61. Knya, M.; Sorrenti, M.; Ferrari F.; et al., Study of the microstructure of o/w creams with thermal and rheological methods, Journal of Thermal Analysis and Calorimetry 2003, 73, 623-632. 62. Michaels A, Chandrasekaran SK, Francis W, Meredith M. Drug permeation through human skin: theory and in vitro experimental measurement. A I Ch E J. 1975;21:98596. 63. Morell, J.L.P.; Claramonte, M.D.C.; Vialard, A.P. Validation of a release diffusion cell for topical dosage forms. Int. J. Pharm. 1996, 137, 4955. 64. Oatley, C.W., 1982. The early history of the scanning electron microscope. J. Appl. Phys. 53 (2). 65. *** OECD, 2008. Guideline for the Testing of Chemicals, Draft Proposal for a New Guideline: In vitro Skin Irritation: Human Skin Model Test. Available at: http://www.oecd.org/ searchResult / 0,3400,en-2649-201185-1-1-1-1-1,00.html.

103

66. Otto, A.; Plessis, J.; Wiechers, J.W., Formulation effects of topical emulsions on transdermal and dermal delivery. International Journal of Cosmetic Science, 2009, 31, 119. 67. Park J.-H., Allen M.G., Prausnitz M.R., 2005, Journal of Controlled Release, 104, 51-66; 68. Pellett, M.A.; Castellano, S.; Hadgraft, J.; Davis, A.F. The penetration of supersaturated solutions of piroxicam across silicone membranes and human skin in vitro. J. Control. Release 1997, 46, 205214. 69. Prausnitz M.R., Mitragotri S., Langer R., 2004, Nat. Rev. Drug. Discov., 3, 115-124; 70. Sanchez L, Mitjans M, Infante MR et al. Determination of interleukin-1_ in human NCTC 2544 keratinocyte cells as a predictor of skin irritation from lysine-based surfactants. Toxicol Lett 2006; 167: 4046. 71. Santerre J.P., Woodhouse K., Laroche G., Labow R.S., 2005, Biomaterials, 26, 7457-7470; 72. Santoyo, S.; Arrelano, A.; Ygartua, P.; Martin, C. In vitro percutaneous absorption of piroxicam

104

through synthetic membranes and abdominal rat skin. Pharm. Acta. Helv. 1996, 71, 141146. 73. Savic, S.; Weber, C.,; Savic, M.M.; MullerGoymann, C., Natural surfactant-based topical vehicles for two model drugs: Influence of different lipophilic excipients on in vitro/in vivo skin performance. International Journal of Pharmaceutics 2009, 38, 220230. 74. Sivak, W.N., Zhang J., Petoud S., Beckman E.J., 2010, Acta Biomaterialia, 6, 144-153; 75. Schaefer H., Redelmeier T.E., 1996, Skin Barrier: Principles of Percutaneous Absorption, Karger, Basel, 12-18; 76. Shah, V.P.; Elkins, J.S.; Lam, S.Y.; Skelly, J.P. Determination of in vitro drug release from hydrocortisone creams. Int. J. Pharm. 1989, 53, 5339. 77. Shah, V.; Elkins, J.; Hanus, J.; Noorizadeh, C.; Skelly, J. In vitro release of Hydrocortisone from topical preparations and automated procedure. Pharm. Res. 1991, 8, 5559.

105

78. Tatai L., Moore T.G., Adhikari R., Malherbe F., Jayasekara R., Griffiths I., Gunatillake A., 2007, Biomaterials, 28, 5407-5417; 79. Teichmann, A.;Heuschkel,S.;Jacobi,U.; et al., Comparison of stratum corneum penetration and localization of a lipophilic model drug applied in an O/W microemulsion and an amphiphilic cream, Eur. J. Pharm. Biopharm., 2007, 67, 699706. 80. Thakker, K.D.; Chern, H. Development and validation of in vitro release tests for semisolid dosage forms - case study. Disso. Tech. 2003, 10, 1015. 81. Twist, J.; Zatz, J. Membrane - solvent - solute interaction in a model permeation system. J. Pharm. Sci. 1988, 77, 538540. 82. Twist, J.N.; Zatz, J.L. Influence of solvents on paraben permeation through idealized skin model membranes. J. Soc. Cosmet. Chem. 1986, 37, 429444. 83. Uchiyama T., Watanabe J., Ishihara K., 2002, Journal of Membrane Science, 208, 39;

106

84. Ueda, C.T.; Shah, V.P.; Derdzinski, K.; Ewing, G.; Flynn, G.; Maibach, H.; Marques, M.; Rytting, H.; Shaw, S.; Thakker, K.; Yacobi, A. Topical 85. Urica and L, Transdermal C. Drug Peev, Products. V.Vlaia, Pharmacopeial Forum. 2009, 35, 750764. C.Dehelean, G.Coneac- Formulation and quality evaluation of some topical semisolid preparations containing dried extract of birch tree, Recent Developments in Pharmaceutical Analysis, Sept.2005 pp.207. 86. Van Ruissen, F.; Carroll, Le, M.; Van der Valk, J.M.; Schalkwijk, J., Differential effects of detergents on keratinocyte gene expression. J. Invest. Dermatol. 1998, 110, 358363. 87. Vinardell MP, Garca L. The quantitive chlorioallantoic membrane test using trypan blue stain to predict the eye irritancy of liquid scintillation cocktails. Toxicol In Vitro 2000; 14: 551555. 88. Vinardell MP., Mitjans M. Alternative Methods for Eye and Skin Irritation Tests: An Overview. J Pharm Sci 2008; 97:4659.

107

89. Vinardell MP, Rimbau V, Mitjans M. Potential eye irritation of some biodegradable liquid scintillation cocktails determined in vitro. Food Chem Toxicol 2004; 42:12871290. 90. Vinardell MP, Mitjans M. The chorioallantoic membrane test as a model to predict the potential human eye irritation induced by commonly used laboratory solvents. Toxicol In Vitro 2006; 20: 10661070. 91. Welin-Berger, Bergenstahl, B. K.; The Neelissen, effect of J.A.M.; rheological

behaviour of a topical anaesthetic formulations on the release and permeation rates of the active compound. Eur. J. Pharm. Sci. 2001, 13, 309 318. 92. Wester R, Maibach H. Review: percutaneous absorption 93. Williams, 618 94. Wu, S.T.; Shiu, G.K.; Simmons, J.E.; Bronaugh, R.L.; Skelly, J.P. In vitro release of nitroglycerin 108 of A.C.; drugs. Clin Pharmacokinet. Penetration 1992;23:25366. Barry, B.B., enhancers, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004,56, 603

from topical products by use of artificial membranes. J. Pharm. Sci. 1992, 81, 11531156. 95. Zorin, S.; Kuylenstierna, F.; Thulin, H. In vitro test of Nicotine's permeability through human skin. Risk evaluation and safety aspects. Am. Occup. Hyg. 1999, 43, 405413.

109

110