3.

REALIZAREA DE BIOPRODUSE PE BAZĂ DE

COLAGEN

Bioprodusele pe bază de colagen se pot realiza într-o varietate mare de

structuri moleculare (micro şi nanostructuri) sub formă de pulbere (pudră),
hidrogeluri şi soluţii injectabile, filme, membrane şi matrici etc.
Din punct de vedere al compoziţiei bioproduselor, paleta de combinaţii
este foarte largă, fiind legată de diversitatea aplicaţiilor. Din acest motiv,
majoritatea tehnologiilor sunt Know-How, iar bioprodusele sunt brevetate.
Prin tehnologiile de extracţie a colagenului în stare nedenaturată (TECN)
se obţin geluri cu un conţinut de 70-80% molecule de colagen nedenaturate, în
timp ce gelatina şi hidrolizatele se obţin prin tehnologii de extracţie în stare
denaturată (TECD), extractele conţinând cca. 90% molecule de colagen
denaturate sub formă de lanţuri polipeptidice.
Pentru realizarea de bioproduse se pot utiliza toate tipurile de extracte
colagenice: paste fibroase, geluri şi soluţii de colagen, gelatină şi hidrolizate
parţiale sau totale.
Pastele fibroase şi gelurile/soluţiile de colagen pot fi condiţionate ca
hidrogeluri sau prin uscare liberă şi liofilizare, procese care nu permit încălzirea
colagenului mai mult de 300C, care ce ar conduce la denaturarea conformaţiei
de triplu helix. În acest fel se obţin bioproduse finite sub formă de :
- hidrogeluri pentru cedare controlată a diferitelor componente
înglobate;
- membrane utilizate pentru dializă, imobilizare de enzime, proteze,
depozit pentru medicamente etc.
- bureţi spongioşi (matrici) folosiţi drept pansamente pentru arsuri şi
ulcere varicoase, hemostatice, substituenţi de ţesut, implanturi, suport
scaffold etc.;
- fibre utilizate pentru ranforsarea matricilor şi membranelor,
compozite fibroase hemostatice etc.;
- fire pentru suturi chirurgicale;
- unguente / creme.
Hidrolizatele de colagen obţinute la temperaturi ridicate, având o
conformaţie de ghem mai strâns (sferic) faţă de conformaţia de ghem lărgit,
specifică gelatinei, pot fi uscate şi prin atomizare. În timpul procesului de

153
atomizare, temperatura pe care o pot avea particulele fin pulverizate ajunge la
40°C, ceea ce nu influenţează conformaţia structurală a hidrolizatelor.
În schimb, atomizarea unei soluţii de colagen sau de gelatină, conduce la
scăderea drastică a greutăţii moleculare, ca urmare a procesului de denaturare
termică. Hidrolizatele de colagen sunt utilizate şi sub formă de unguente /
creme, în farmacie şi cosmetică.
Gelatina poate fi procesată prin diverse procedee sub formă de
membrane, matrici, hidrogeluri, capsule, microsfere, granule. Deşi are o
conformaţie structurală denaturată, greutatea moleculară de cca. 250.000 Da şi
capacitatea de a forma geluri cu tărie ridicată, gelatina poate fi uscată la
temperaturi mai ridicate 40-70°C, în instalaţii speciale.
Toate preparatele din colagen menţionate pot fi condiţionate şi în formă
iniţială de : paste, geluri, hidrolizate lichide, cu ajutorul conservanţilor chimici
de uz alimentar şi farmaceutic sau prin îmbuteliere sterilă în cazul hidrolizatelor.
Stabilirea metodelor de condiţionare şi sterilizare a preparatelor şi
produselor finite a prezentat o realizare importantă, deoarece preparatele
colagenice sunt un mediu propice pentru dezvoltarea microorganismelor, iar
utilizarea produselor finite în medicină ca biomateriale, necesită asigurarea
sterilităţii produselor. Astfel, sterilizarea produselor uscate (membrane, fire,
bureţi şi hidrolizate pulvis) se face cu oxid de etilenă şi cu radiaţii gamma,
metode eficace şi folosite industrial. Stabilitatea în timp a produselor uscate prin
liofilizare şi atomizare şi depozitate în condiţii adecvate, este practic nelimitată.

3.1. Procedee de obţinere a bioproduselor pe bază de colagen

Extractele colagenice sunt sisteme apoase, astfel încât, orice prelucrare

ulterioară necesită menţinerea solubilităţii în apă, în special în cazul extractelor
din colagen nedenaturat, utilizate ca biomateriale. Relaţia între colagen şi apă
este mai specială şi este legată de activitatea biologică a colagenului ca matrice
extracelulară. De acest fapt se ţine seama în procedeele tehnologice de
prelucrare a pastelor şi gelurilor care, chiar dacă conduc la forme de bioproduse
insolubile în apă, acestea au proprietăţi de hidrofilie remarcabile (absorbţie de
apă şi vapori de apă, permeabilitatea la vapori de apă).
În procedeele de prelucrare prin extrudere (filare, turnare în diverse
forme de membrane), un parametru important este vâscozitatea extractelor ca
atare sau reticulate, precum şi a compozitelor formate cu alţi polimeri sau
compuşi anorganici.
154
 Procedeele de uscare a extractelor colagenice sunt selectate în funcţie de
natura extractului (nedenaturat sau denaturat) şi de structura morfologică a
bioprodusului, respectiv burete spongios, fibre sau membrane. Cele mai utilizate
procedee de uscare sunt liofilizarea şi uscarea liberă la temperaturi de cca. 25°C.
Ambele procedee nu produc denaturarea extractelor.
Liofilizarea este un procedeu de uscare prin congelarea rapidă a
soluţiilor de colagen de la – 25°C la – 70°C, şi de sublimare a gheţii direct în
faza de vapori de apă în vid înaintat (2 x 10-3 torri).
În locul cristalelor de gheaţă se formeze pori, iar moleculele de colagen
se restructurează în fibrile şi fibre. Bioprodusele din colagen liofilizat se
prezintă sub formă de burete spongios, denumit matrice, cu proprietăţi similare
matricei extracelulare.
Uscarea liberă a extractelor colagenice se face în uscătoare cu rafturi, în
curent de aer cald de 25°C şi cu un control riguros al umidităţii din incinta
uscătorului, pentru ca uscarea să se producă lent în decurs de 48-72 de ore. În
aceste condiţii, între moleculele de colagen din extracte se formează legături
intermoleculare, fără intervenţia unui agent chimic de reticulare.
Uscarea prin atomizare se foloseşte pentru extractele colagenice
denaturate, în special pentru hidrolizate, aşa cum s-a arătat în subcapitolul 2.4.2.
Procedeele de obţinere a bioproduselor sub formă de gel sau soluţii
coloidale necesită operaţii tehnologice de filtrare şi condiţionare în mediu steril,
pentru ca bioprodusele să nu fie contaminate microbiologic.
În procedeele elaborate pentru realizarea de bioproduse pe bază de
colagen nedenaturat (paste şi geluri / soluţii de colagen), operaţiile cheie sunt
considerate: restructurarea, modificarea chimică şi compatibilizarea cu diverşi
compuşi bioactivi şi uscarea sau condiţionarea, ca formă finală de produs.
În general, prin procedeele aplicate, se încearcă păstrarea proprietăţilor
biologice specifice colagenului, în special conformaţia structurală nativă şi
hidrofilia. Aceste caracteristici sunt importante pentru asigurarea unui grad
ridicat de biocompatibilitate a bioproduselor utilizate ca biomateriale.
Pastele şi gelurile de colagen pot fi modificate fizic sau chimic în scopul
asigurării unei mai bune stabilităţi termice sau mecanice.
În schema nr. 3.1 este prezentat un flux tehnologic general, prin care se
pot obţine diverse forme de bioproduse din colagen nedenaturat şi aplicaţiile lor.

155
 Extracte de colagen nedenaturat

Pastă fibroasă Geluri şi soluţii coloidale

- Extrudere - Restructurare
- Coagulare - Modificare chimică sau fizică
- Uscare - Formare compozite
- Imobilizare de compuşi bioactivi

Membrane
tubulare pentru Condiţionare Filare Depunere de Uscare prin
industria în stare Extrudere straturi pentru liofilizare
alimentară lichidă Coagulare diverse suporturi:

Fibre Uscare textile, metalice,
ceramice
Matrici
Hidrogeluri colagenice
Fire şi Matrici

Carrier pentru Fibre Uscare liberă compozite
medicamente

Înlocuitor de
Fire

Suport
corp vitros chirurgicale

Tuburi Membrană scaffold

Component pentru
bioactiv în subţiri cu/fără
inginerie
produse (înlocuitori inserţie textilă
de vase tisulară şi
dermato- organogeneză
cosmetice sanguine)
Membrane

Văl fibros
Pansamente
transdermice bioactive
inserţii în drug delivery
diverse pentru

Substituenţi tratarea
forme de de ţesut
bioproduse arsurilor şi

Membrane ulcerelor
pentru varicoase
regenerarea
Pansamente
tisulară hemostatice
ghidată
Măşti
cosmetice

Fibre de
colagen
(colagen
fibros)

Schema 3.1. Procedee de obţinere a bioproduselor din extracte de colagen nedenaturate

156
 Tehnici de formare a bioproduselor scaffold

Bioprodusele utilizate ca biomateriale scaffold în ingineria tisulară

necesită o anumită microarhitectură internă de structuri microporoase. Aceste
structuri se obţin din polimeri naturali şi sintetici. Procedeele prin care se obţin
astfel de structuri sunt bazate pe tehnici convenţionale [1-6] sau neconvenţionale
de fabricaţie computerizată prin formare strat cu strat a formei solide dorite [7].
• Tehnicile convenţionale se referă la :
- formarea de matrice prin spălarea solventului care a servit la
dizolvarea polimerilor sintetici biodegradabili ;
- spume obţinute din soluţii de polimeri cu CO2 la presiuni ridicate,
ce prezintă dimensiuni de particule de 100-500µm;
- meşe fibroase/fibre legate, obţinute prin tehnologii textile care
permit realizarea de neţesute din fibre poliglicolice şi poliacrilice;
- separare de faze într-o soluţie de polimer, prin sublimarea
solventului, care conduce la biomaterialele scaffold ce au
încorporate în structură molecule bioactive;
- turnarea în matriţe a topiturilor de polimeri aduse la temperatura
tranziţiei sticloase; se obţin biomateriale scaffold, cu forme bine
definite, care pot conţine şi fibre pentru obţinerea de compozite cu
proprietăţi biologice specifice;
- liofilizarea soluţiilor sau emulsiilor de polimeri, prin care rezultă
matrici poroase, atât din polimeri naturali (colagen, chitină), cât şi
din polimeri sintetici sau compozite ale acestora.
Matricile compozite pe bază de colagen, obţinute prin diverse tehnici,
dintre care cea mai utilizată este liofilizarea, sunt cele mai adecvate structuri
scaffold utilizate pentru culturi de celule conjunctive, implanturi sau substituenţi
de ţesut.
Controlul structurii microporoase a matricei colagenice, se face prin
determinarea dimensiunii cristalelor de gheaţă, formate printr-un proces de
îngheţare a soluţiilor coloidale apoase de colagen. Alţi parametri care
influenţează dimensiunea porilor, precum şi menţinerea microstructurii în mediu
hidratat in vitro sau in vivo sunt: pH-ul soluţiei, natura substanţelor bioactive
încorporate şi gradul de reticulare, care defineşte şi rata de resorbţie in vivo a
matricei colagenice scaffold.
În procesul de liofilizare, prin sublimarea apei din gheaţă direct în faza
de vapori, se formează microstructura poroasă, care conţine macro, micro şi
nanopori, capabili să se rehidrateze cu cca. 120% apă, fără modificarea structurii
157
solide; ea devine de fapt o structură cvasisolidă schelet, recunoscută de celulele
fibroblaste.
• Tehnicile neconvenţionale de fabricaţie direct din modele generate de
computer, SFF, permit îmbunătăţirea designului biomaterialelor scaffold
prin controlul unor parametri: dimensiunea porilor şi distribuţia lor,
încorporarea unui sistem vascular artificial care creşte transportul de oxigen
şi nutrienţi în interiorul scaffold-ului, menţinând astfel dezvoltarea celulelor
în toată masa acestuia, în condiţii de maximă hidratare.
Tehnicile SFF permit, aşadar, obţinerea de biomateriale scaffold cu
dimensiuni externe dorite şi morfologie internă predefinită şi reproductibilă
care, nu numai că poate controla dimensiunea şi distribuţia porilor, dar pot
realiza structuri care conduc la creşterea transferului de masă, a oxigenului şi
nutrienţilor în interiorul biomaterialului. S-au construit astfel de biomateriale,
utilizând tehnici de fabricaţie în straturi, pe baza unui model generat de
computer utilizând software CAD exprimat ca serii de straturi în secţiune
transversală. Datele se introduc în maşina de SFF care produce modelul fizic,
plecând de la bază şi până la stratul de sus, iar fiecare nou strat aderă la cel
anterior [8].
Datele obţinute din tomografia computerizată sau prin rezonanţă
magnetică nucleară a ţesutului de înlocuit, sunt utilizate pentru a crea un model
CAD la dimensiunile necesare.
Tehnicile SFF utilizate pe plan mondial pentru obţinerea de biomateriale
scaffold cu structuri 3D, sunt: imprimare tridimensională (3DP); stereolitografie
(SLA); 3D Ploter; imprimare cu jet; modelare prin depunere strat cu strat
(FDM) [9].
În procedeele elaborate pentru prelucrarea extractelor de colagen
denaturat sub formă de bioproduse, principalele operaţii tehnologice sunt:
modificarea chimică (reticularea), formarea de compozite în stare solidă sau în
soluţii şi uscarea sau condiţionarea produsului final (Schema 3.2.)
Aplicaţiile gelatinei sunt strâns legate de capacitatea acesteia de a forma
pelicule, în care se pot îngloba şi imobiliza diverse substanţe active sau
bioactive. Produsele din gelatină, pot fi sub formă de: folii (gelatină fotografică
şi alimentară), capsule şi microcapsule pentru medicamente, membrane
transdermice.
Hidrolizatele de colagen sub formă de pulberi submicronice au multe
aplicaţii, fie ca atare, fie solubilizate şi utilizate la fabricarea unguentelor
farmaceutice şi a cremelor cosmetice.

158
 Extracte de colagen denaturat

Gelatină Hidrolizate

Modificare
Modificare chimică

chimică şi
Formare compozite
fizică

Formare
composite Uscare prin
Condiţionare în

Imobilizare stare lichidă atomizare
de compuşi
bioactivi

Produse sub Produse sub formă

formă de soluţii de pulberi

Gelatină alimentară şi coloidale
farmaceutică
Biostimulatori

Produse de uz medical
Bioproduse pentru animale şi
(pansamente pentru plante
hemostatice, membrane medicina
Adjuvant la
drug delivery, veterinară tabletarea
hidrogeluri, granule, (suport medicamentelor
capsule, micro capsule) pentru
Componente
vaccinuri, bioactive în
carrier produse dermato-
pentru cosmetice
(creme/unguente,
loţiuni)

Schema 3.2 Procedee de obţinere a bioproduselor pe bază de colagen denaturat

3.1.1. Restructurarea colagenului nedenaturat

Procesul de separare a fibrilelor şi fibrelor din geluri / soluţii, se

aseamănă cu procesul de cristalizare a sărurilor greu solubile şi se produce în
două stadii:
- formarea fibrilelor (izolarea nucleului);
- creşterea în continuare a fibrilelor şi formarea fibrelor.
Comparativ cu procesul de autoasamblare in vivo a moleculelor de
colagen în fibrile, anumite etape pot fi considerate similare.
159
 In vivo procesul se petrece etapizat, astfel:
- formarea interfazelor de structuri anizotrope de „cristale lichide”
(tactoide) în care moleculele de colagen se orientează paralel una
lângă alta, dar separate prin spaţii;
- limitarea distribuţiei prin difuziune a moleculelor de colagen unite în
mezofaze de cristale lichide sau tactoide în tot volumul intercelular,
datorită complecşilor hiperhidrataţi formaţi din moleculele de
colagen şi glicozaminoglicani;
- apropierea moleculelor de colagen învecinate din mezofaze şi
formarea protofibrilelor „monotipice” ;
- unirea a cinci protofibrile într-o microfibrilă în care capetele
moleculelor de colagen sunt decalate ordonat unele faţă de altele,
ceea ce conduce la succesiunea sectoarelor de cuplare a moleculelor,
ce se deosebesc printr-un potenţial de sorbţie mai ridicat;
- sorbţia preferenţiată în aceste zone a moleculelor de
glicozaminoglicani;
- formarea fibrilelor pe sectoarele analoge ale protofibrilelor învecinate
şi pe matricile din hidraţi de carbon sau alte tipuri de matrici;
- formarea membranelor semipermeabile pe suprafaţa fibrilelor;
- formarea legăturilor transversale covalente intra şi intermoleculare.
In desfăşurarea etapelor procesului de restructurare in vitro a moleculelor
de colagen în fibrile, un rol important îl are şi forma moleculei. Predominarea
forţelor de respingere electrostatică împiedică agregarea moleculelor şi conduce
la mărirea suprafeţei lor (a bastonaşului semiflexibil asimetric). La o greutate
moleculară identică, moleculele de formă globulară au o suprafaţă minimă.
Mărirea asimetriei moleculei favorizează stabilizarea sistemului, în special prin
formarea cristalelor lichide (tactoide) prin agregarea paralelă a moleculelor.
Deşi sunt separate prin spaţii de zeci şi sute de nanometri, moleculele dintr-un
cristal lichid interacţionează la distanţă. Criteriul de acţiune la distanţă poate fi
mărimea inversă a vâscozităţii intrinseci.
Vâscozitatea soluţiilor de tropocolagen la 20°C este mult mai mare decât
a altor compuşi macromoleculari, dar mai mică faţă de cea a
glicozaminoglicanilor. Datorită vâscozităţii mari, volumul total al sferelor de
acţiune a „cristalelor lichide” formate din moleculele de colagen este foarte
mare, astfel încât, la concentraţie de cca. 1%, tot volumul soluţiei intră în sfera
de acţiune la distanţă a tactoidelor de colagen, dispersate în mediu apos. În acest
fel se explică şi faptul că solubilizarea totală a colagenului insolubil, cu
păstrarea conformaţiei native helicoidale, conduce la soluţii coloidale a căror
160
concentraţie maximă nu depăşeşte 3-4%, concentraţie la care soluţia este un gel
transparent şi stabil în timp, la temperaturi cuprinse între 4-20°C. Pe măsură ce
temperatura se apropie de 35-37°C, din gel încep să se separe fibrile, iar gelurile
se opacizează.
Din cele expuse reiese de asemenea rolul foarte important pe care îl are
apa în procesul de fibrilogeneză in vivo, alături de alţi compuşi organici cu care
formează complecşi hidrataţi.
Stabilitatea agregatelor tactoide formate din molecule de colagen nu este
prea ridicată. Asupra ei influenţează orice factor care produce coagularea
coloizilor: săruri, solvenţi apolari (alcooli), variaţii de pH, temperatură şi diverşi
agenţi chimici care modifică încărcarea electrostatică a moleculelor. Tratarea
soluţiilor de colagen cu clorură de sodiu sau sulfat de sodiu precipită fibrilele de
colagen şi constituie o metodă de purificare a acestuia de alte substanţe
însoţitoare, rezultate prin procesul de solubilizare. Precipitatul fibrilar format
este uşor reversibil prin introducerea lui în soluţie acidă. Prin această operaţie,
conformaţia nativă helicoidală a moleculelor nu este afectată.

Restructurarea colagenului sub influenţa temperaturii

Macromoleculele de colagen cu conformaţie helicoidală nativă şi cu

formă asimetrică extrase în soluţie din colagen insolubil, pot fi precipitate sub
formă de fibre fine, constituite din fibrile, prin ridicarea temperaturii la 26 –
360C. Capacitatea de redizolvare, prin dezasamblare, dispare dacă fibrilele au
stat un timp mai îndelungat în această stare.
Acest fapt demonstrează tendinţa moleculelor de colagen de a realiza o
stare stabilă, prin consolidarea fibrilelor şi fibrelor precipitate. Cinetica acestor
schimbări dintr-o soluţie izotropă diluată, la o fază densă, a fost studiată, pentru
un domeniu mare de temperatură, concentraţie şi pH [10]. Rezultatele obţinute
susţin concepţia că tranziţia de fază ce are loc nu implică schimbări în
conformaţia moleculei, la temperaturile folosite (16-30°C). Studiile asupra
vitezei de precipitare termică arată schimbări de fază, ce presupun procese de
nucleaţie şi de creştere. Actul nucleaţiei pare să determine proporţia şi modelul
morfologic al structurii fibrilare şi fibroase formate.
Izoterma de precipitare prezintă un caracter sigmoidal şi indică un proces
autocatalitic, accelerat, la care spre sfârşit se produce o echilibrare. Restructu-
rarea colagenului din soluţii în funcţie de temperaturi nu reprezintă însă un

161
procedeu de sine stătător. Pentru a fi eficient, procedeul trebuie asociat cu
variaţia convenabilă şi a altor parametri.
Forma, grosimea şi alte caracteristici ale fibrilelor precipitate, depind de
pH-ul, tăria ionică şi de concentraţia soluţiei de colagen, precum şi de durata de
formare a fibrilelor şi ulterior a fibrelor (Tabelul 3.1) [11].

Tabelul 3.1. Restructurarea fibrilelor de colagen

Condiţii de precipitare Lăţimea tipică Limitele de variaţie a

pH Tărie Temperatura, oC a fibrilei (Å) lăţimii (Å)
ionică
0.13 900 200-1700
7 0.23 26 1600 700-2800
0.31 2500 800-4100
6 1100 500-2000
7 0.23 26 900 200-1800
8 800 100-1400
20 2500 1800-4800
7 0.23 25 1000 400-2000
36 500 200-1200

Micşorarea vitezei de precipitare, prin scăderea temperaturii, are o

influenţă favorabilă asupra creşterii grosimii fibrilelor. O influenţă similară o are
şi micşorarea pH-ului, precum şi creşterea tăriei ionice.

Restructurarea colagenului la pH-ul izoelectric

Valoarea pH-ului izoelectric (pHi) al soluţiei de colagen, obţinute din

colagen insolubil, este cuprinsă între 4,5 – 5,2. Spre deosebire de soluţia de
tropocolagen, din această soluţie se separă la pH-ul izoelectric, un precipitat
dens de fibre destul de uniforme ca grosime, ce formează aglomerări.
Studiile efectuate prin microscopie electronică au evidenţiat tendinţa de
înfăşurare elicoidală a fibrilelor în fibre (vezi subcapitolul 3.2.4).
Precipitarea fibrelor la pH-ul izoelectric se explică prin compensarea
internă a sarcinilor electrice de pe suprafaţa moleculelor de colagen. Această
precipitare este reversibilă. Prin mărirea pH-ului sub sau peste valoarea pHi se
modifică din nou raportul sarcinilor electrice, iar moleculele de colagen trec în
soluţie prin desfăşurarea agregatelor fibrilare ca urmare a forţelor de repulsie
electrostatică. Din această cauză, stabilitatea fibrelor reconstituite la pHi, trebuie
162
îmbunătăţită prin intervenţia unor agenţi chimici, capabili să formeze reticulări
mai stabile.

Restructurarea colagenului sub influenţa electroliţilor

Prezenţa ionilor anorganici într-o soluţie de colagen produce mai multe

efecte. Unul dintre ele este efectul de protecţie, prin faptul că modifică
interacţiunea electrostatică dintre grupele ionizabile apropiate de pe aceeaşi
moleculă. De exemplu, ionii fosfat sunt legaţi puternic de moleculele de colagen
din soluţie, iar fibrilele precipitate au o formă caracteristică (Figura 3.1).

Figura 3.1. Fibrile formate cu fosfat de sodiu (mărire 500x)

Electrolitul anorganic crează legături de hidrogen intramoleculare pe

seama legăturilor intermoleculare de hidrogen. Din acest motiv, electrolitul
anorganic protejează colagenul din soluţie contra denaturării. Al doilea efect al
ionilor anorganici este interacţiunea electrostatică cauzată de încărcarea
fluctuantă a moleculelor de colagen.
Precipitarea fibrilelor de colagen din soluţie este un proces reversibil, cu
condiţia ca precipitarea şi redizolvarea să se efectueze la concentraţii mici de
electroliţi. La concentraţii mari de electroliţi apar legături transversale
permanente şi în acest caz fibrilele nu se mai dizolvă. Nu poate fi vorba de
denaturare, deoarece, la microscopul electronic, fibrilele prezintă paternul
caracteristic colagenului nativ. Insolubilitatea progresivă a colagenului ce
rezultă atunci când este dizolvat repetat şi reconstituit, şi în plus lipsa
îndepărtării complete a electrolitului prin dializă, indică o anumită legătură a
ionilor cu colagenul.
Pentru fiecare electrolit există un prag de precipitare, adică cea mai mică
concentraţie de sare în soluţie la care începe precipitarea fibrilelor de colagen.

163
Valoarea acestor concentraţii este de 0,45 – 0,5 M pentru NaCl, 0,3 – 0,4 M
pentru (NH4)2SO4 şi 0,12 – 0,13 M pentru Na2SO4 (Figurile 3.2 şi 3.3).

Figura 3.2. Fibrile formate cu sulfat de Figura 3.3. Fibrile formate cu NaCl
amoniu (mărire 500x) (mărire 500x)

Adăugarea sărurilor neutre amintite, nu conduce la modificări ale pH-

ului soluţiei şi din această cauză, capacitatea de a precipita colagenul din soluţii
se explică prin faptul că acţiunea de îndepărtare a apei se intensifică cu creşterea
puterii ionice a soluţiei. Ionii din spaţiul interfibrilar pot fi prezenţi fie sub formă
legată, fie sub formă de contraioni liberi, la resturile încărcate electrostatic.

Restructurarea colagenului în prezenţa substanţelor necolagenice

Formarea de fibrile bine dezvoltate necesită coacţiunea substanţelor

necolagenice. Colagenul solubilizat nepurificat formează repede fibrile de tip
nativ la precipitare, pe când colagenul purificat formează fibrile cu striaţii
anormal reticulate.
Influenţa pozitivă a componentelor necolagenice la precipitarea cola-
genului din soluţii, a fost evidenţiată mai mult prin studiile efectuate asupra
formării fibrilelor din colagenul solubil, tratat cu enzime. În comparaţie cu
colagenul netratat, colagenul tratat cu pepsină prezintă un timp de latenţă mai
mare pentru precipitarea fibrilelor din soluţie, prin ridicarea temperaturii.
Timpul de latenţă se măreşte pe măsură ce concentraţia în enzimă creşte. De
asemenea, colagenul solubil netratat cu enzimă nu se mai redizolvă complet prin
răcire, în timp ce colagenul solubil tratat trece total în soluţie. Deci, fibrilele de
colagen netratate cu pepsină sunt supuse unui proces de îmbătrânire, spre
deosebire de colagenul tratat care formează un sistem reversibil.

164
 Aceste modificări sunt justificate, deoarece pepsina degradează compo-
nentele necolagenice care însoţesc colagenul. Pe de altă parte, se produc
modificări ale moleculei de colagen însăşi, în domeniul telopeptidelor, unde se
găsesc legăturile transversale intramoleculare.
Aminoacizii şi peptidele au o influenţă favorabilă asupra formării
structurii fibrilelor de colagen. S-a observat, la microscopul electronic, că soluţia
de colagen purificată separă fibrilele mai bine dezvoltate, în prezenţa
aminoacizilor. Concentraţia optimă pentru obţinerea acestui efect este de minim
1,6 x 10-2 M amino acizi. Peste această concentraţie şi la temperaturi de
33-36°C, se obţine o formare cantitativă de fibrile de colagen. Acţiunea mai
puternică a argininei la formarea fibrilelor de colagen, în comparaţie cu alţi
derivaţi de guadinină, de exemplu ureea, se datoreşte prezenţei unei grupe amino
liberă în moleculă. Grupa carboxilică liberă nu are o influenţă deosebită.
Restructurarea colagenului din geluri / soluţii poate fi provocată de o
serie de agenţi chimici şi fizici. Studiul acestor procese este foarte util pentru
condiţiile de restructurare a colagenului din geluri în prezenţa medicamentelor
sau a altor substanţe bioactive, componente ce influenţează specific noile
structuri fibrilare formate. Restructurarea în prezenţa diverselor substanţe
polifuncţionale conduce la structuri fibrilare stabile şi rezistente, chiar dacă
acestea nu sunt identice cu structura colagenului nativ.
Restructurarea gelurilor este un procedeu important pentru formarea de
biomateriale colagenice cu structuri morfologice diverse, destinate unui număr
mare de utilizări în special în bioingineria medicală.

3.1.2. Modificarea chimică şi fizică a colagenului

Modificarea chimică a extractelor colagenice se realizează prin procedee

chimice şi fizice în funcţie de aplicaţiile bioproduselor [12, 13]
Procedeele chimice conduc la schimbări structurale, prin următoarele
categorii de modificări: reticulări intermoleculare, grefări de oligomeri pe
moleculele de colagen, fibrile sau piele şi transformări ale grupelor funcţionale
(NH2, OH, COOH) aparţinând resturilor de amino acizi.

165
 3.1.2.1. Reticularea colagenului

Modificarea colagenului se referă în primul rând la procesul de

reticulare, prin care grupele polare libere sunt implicate în formarea de noi
legături intermoleculare.
În ţesuturile conjunctive vii, reticulările conferă rezistenţă mecanică şi
termică mare şi rezistenţă la acţiunea enzimelor. Datorită distrugerii acestor
reticulări în cursul procesului de extracţie, formele reconstituite ale colagenului,
ca filme, fibre sau bureţi, necesită suficientă rezistenţă mecanică pentru a nu se
dezintegra la manipulare sau sub presiunea ţesuturilor înconjurătoare, după
aplicaţia in vivo. În afară de aceasta, viteza de biodegradare trebuie personalizată
pentru fiecare aplicaţie a bioprodusului [14, 15]. Astfel, este necesar să se
confere fermitate mecanică şi rezistenţă la acţiunea enzimei (colagenază) prin
introducerea reticulărilor intermoleculare. Reticularea este aplicată pentru a
controla viteza de resorbţie in vivo a biomaterialelor colagenice [12, 16].

A. Reticularea prin metode chimice se realizează cu ajutorul

următoarelor clase de compuşi:
- mono şi dialdehide (formaldehida, care se leagă prin punţi -CH2-),
malonaldehida şi glutaraldehida reticulează prin punţi ionice şi
aldolice;
- azide şi derivate azidice;
- compuşi dicarboxilici (prin grupări amidice şi esterice);
- diamine (hexametilendiamina) care crează legături amidice;
- diizocianaţi (hexametilen diizocianat), cu crearea de legături
amidice;
- compuşi cu sulf, ce pot crea legături disulfidice.
Dintre agenţii de reticulare ai colagenului cei mai utilizaţi sunt
formaldehida şi glutaraldehida.

Reticularea colagenului cu formaldehidă

Reticulările covalente în colagen pot fi create pe numeroase căi [17]. Cei

mai utilizaţi agenţi sunt aldehidele, cea formică şi cea glutatrică fiind cele mai
evidente exemple. Formaldehida reacţionează cu grupele ε-amino ale resturilor
de lizină şi hidroxilizină, formând o imină intermediară care formează o
legătură, fie cu tirozina sau cu o grupare amidică din asparagină sau glutamină
(conform schemei 3.3).
166
 Col − CO− NH 2
Col − NH2 + O = CH2 ←
→ Col − NH = CH2 ← → Col − NH − CH2 − NH3 − CO − Col
Col = colagen

Schema 3.3. Reticularea colagenului cu formaldehidă

Gradul de reticulare poate fi dedus din numărul de grupări ε-amino

modificate [18, 19]. Tratamentul cu formaldehidă prelungeşte absorbţia in vivo a
produselor pe bază de colagen, în timp ce scade tensiunea la întindere [20].
Avantajul major al formaldehidei este posibilitatea de reticulare a materialelor
colagenice uscate cu agenţi în stare de vapori în locul tratamentului lichid, în
special în mediu apos [19, 20]. Datorită fragilităţii reticulărilor produse cu
formaldehidă, a toxicităţii şi reacţiilor adverse ce apar din resturile fixate,
formaldehida nu este favorită, cu toate că este acceptată pentru dispozitive
medicale [21].

Reticularea colagenului cu glutaraldehidă

Cea mai obişnuită aldehidă ca agent de reticulare utilizată este

glutaraldehida bifuncţională (GTA) [22]. Tratamentul cu GTA este un proces
industrial viabil, eficienţa sa fiind optimizată, fiind ieftin şi cu durabilitate mult
mai mare ca cel cu formaldehidă [17-23]. Reacţia complexă depinde de pH,
solvent, concentraţie şi puritatea GTA [24-27]. Reticularea este optimă la pH
neutru şi necesită grupări libere ε-amino neprotonate, pentru a forma imine [28].
GTA nu reacţionează doar cu grupele imino, ci şi cu cele carboxilice, amidice
precum şi alte grupări ale proteinelor (Schema 3.4) [25].

Schema 3.4. Reticularea colagenului cu glutaraldehidă

167
 Polimerizarea suplimentară prin condensare aldolică, rezultă între
reticulările intermoleculare covalente, conectând moleculele de colagen
distanţate [24, 25]. În consecinţă, reticulările pot deveni mai puţin eficiente cu
creşterea concentraţiei de GTA. Lanţurile de aldehide polimerice pot creşte pe
suprafaţa fibrelor de colagen, care conduc predominant la reticulări
intermoleculare şi previn în plus penetrarea agenţilor în structura fibrelor şi
fibrilelor [22]. Gradul de reticulare poate fi măsurat prin analizarea grupărilor
amino libere, scăderea temperaturii, rezistenţa la digestie enzimatică şi
temperatura de topire a colagenului [27, 29, 30]. Variaţiile procedeelor de
reticulare cu GTA pot fi utilizate la optimizarea biomaterialelor colagenice.
Compuşii diaminici ca lizina pot fi adăugaţi pentru a intensifica reticularea
intermoleculară, comparativ cu GTA singură [31]. Tratamentul cu
glutaraldehidă reduce imunogenicitatea materialelor colagenice şi măreşte
rezistenţa la degradare enzimatică [32] .
Aldehida glutarică, faţă de formaldehidă şi de celelalte dialdehide
cunoscute (succinică, malonică, adipică), este unul din cei mai buni agenţi de
reticulare ai colagenului din pielea animală. Calităţile tanante deosebite se
datorează posibilităţii formării de polimeri prin condensare aldolică, care se
interpun între lanţurile polipeptidice ale colagenului şi care formează reticulări
chimice transversale. Acestea menţin supleţea ţesutului fibros colagenic şi în
acelaşi timp îi conferă stabilitate fizico-chimică şi fizico-mecanică.
Extractele colagenice mai pot fi reticulate cu compuşi poliepoxidici şi
devin mai hidrofile, comparativ cu cele tratate cu glutaraldehidă, datorită
structurii hidrofile a compuşilor poliepoxidici [33].

B. Reticularea prin metode fizice

In această categorie se înscriu în principal iradierile cu diverse radiaţii şi

deshidratarea.
Iradierea cu raze UV, γ, X produce dezaminări oxidative, care conduc la
reticulări prin legături iminice sau aldolice. Radicalii liberi formaţi, cu o
reactivitate foarte mare, pot crea punţi covalente între moleculele de colagen.
Inconvenientul metodei constă în faptul că reticularea se produce cu energii
scăzute numai într-o anumită zonă, îngustă, pe când energiile superioare pot crea
hidroliza sau denaturarea produsului.
În soluţiile acide de colagen nedenaturat cu concentraţii de 1-2%,
iradierea cu 104 rad nu produce efecte semnificative, doar apariţia de mici bule
de gaze; pe măsură ce doza creşte, atât numărul cât şi mărimea bulelor cresc.
168
Mărirea dozei de iradiere duce la mărirea vâscozităţii şi, în final, la pierderea
fluidităţii şi apariţia proprietăţilor elastice.
După iradierea soluţiei la doze de aproximativ 2x105 rad, începe
separarea de faze cu apariţia unui lichid sineretic, care se separă din gelul format
prin iradiere. Continuarea iradierii până la doze de aproximativ 107 rad duce la
corectarea apreciabilă a gelului cu expulzarea lichidului înglobat, colagenul
reticulat rămânând sub forma unui schelet foarte fragil. Pe de altă parte, soluţia
de colagen iradiată la doze mari, odată cu separarea fazelor, îşi pierde
capacitatea de a forma pelicule iar solubilitatea colagenului iradiat scade.
Separarea celor două faze prin iradiere (sinereza) este dependentă şi de
concentraţia soluţiei de colagen. Astfel, soluţiile mai concentrate de colagen
încep să separe cele două faze la doze mai mari de 106 rad. Viteza de formare a
gelului în soluţia de colagen este de asemenea dependentă de prezenţa
oxigenului: în soluţiile dezaerate, gelul se formează cu o viteză mai mare.
Prezenţa diferiţilor captatori de radicali, cum ar fi alcoolii, micşorează viteza de
formare a gelului; în cazul soluţiilor foarte diluate (0,25%), formarea gelului nu
a fost observată nici la doze foarte mari.
Faptul că procesul este parţial inhibat de prezenţa oxigenului sau aproape
total de prezenţa unor captori de radicali, indică un mecanism de reticulare a
apei, ceea ce concordă şi cu rezultatele obţinute la iradierea colagenului în stare
de fibrile [34]. Separarea de lichid prin iradiere (sinereza) la doze mari şi
contracţia gelului, care în final devine insolubil, se datoreşte creşterii numărului
de legături reticulate, având ca rezultat contracţia reţelei şi, în consecinţă,
eliminarea solventului din reţea.
Se consideră că radiaţiile γ acţionează asupra moleculelor de apă din
soluţia colagenică. Prin radioliză se formează speciile radicalice ⋅ H şi ⋅ OH şi
−
electronul hidratat eaq care transformă rapid ionii de hidrogen în atomi de
hidrogen. Atomul de hidrogen poate ataca molecula de colagen, extrăgând un
atom de hidrogen, astfel luând naştere H2, care apare sub formă de bule de gaz
în timpul gelifierii. Radicalul ⋅ OH extrage un atom de hidrogen de la colagen şi
se reface o moleculă de apă. În felul acesta, apar o serie de radicali pe molecula
colagenului, care prin recombinare formează legături de reticulare
intermoleculare. În soluţii diluate, radicalii formaţi datorită distanţelor mari nu
pot interacţiona intermolecular, ci intramolecular (scindarea catenelor
polimerice), având drept consecinţă micşorarea vâscozităţii soluţiei de colagen
iradiat [35] .

169
 În funcţie de efectul radiaţiilor γ asupra soluţiilor de colagen, intervalul
de doze poate fi împărţit în două domenii : < 105 rad şi >105 rad.
La doze de până la 105 rad se constată o creştere a vâscozităţii în soluţiile
degazate iradiate, cât şi a modulului de elasticitate, ceea ce arată că are loc un
proces de reticulare intermoleculară a colagenului. Doza de 1,2 x 105 rad, pentru
soluţia de colagen de 2% în prezenţa aerului, s-a dovedit a fi critică. La această
doză începe separarea solventului din gel (sinereza), iar produşii de iradiere ai
colagenului îşi pierd din capacitatea de dizolvare şi de formare a peliculelor.
Doze de peste 106 rad provoacă schimbări profunde în sistem: are loc o separare
continuă a solventului, ceea ce arată că o mare parte din grupele ionogene din
colagen, în jurul cărora sunt asociate molecule de apă, îşi pierd din sarcină,
probabil datorită fenomenelor de degradare şi recombinare cu electronul
hidratat. Contracţia gelului, cu apariţia sinerezei, poate fi atribuită creşterii
densităţii legăturilor reticulate, însoţită de expulzarea mecanică a solventului.
Radiaţiile gamma şi UV sunt mai eficiente pentru introducerea reticulării
[36]. Vâscozitatea soluţiei de colagen creşte cu timpul de iradiere a luminii
ultraviolete şi soluţia formează un gel în atmosferă de azot. În aer, vâscozitatea
creşte, dar degradarea colagenului are loc fără formarea gelului. Colagenul
solubil în acid, care posedă telopeptide la ambele capete terminale ale moleculei,
este afectat prin iradiere mai mult decât atelocolagenul, datorită conţinutului
mare de tirozină, care este responsabilă de reacţia fotochimică prin lumină
ultravioletă. Atmosfera de azot pentru iradiere este mai eficientă pentru reacţiile
de reticulare, dar colagenul este degradat prin iradiere prelungită. Capacitatea de
formare a fibrilelor este uşor deteriorată, chiar pentru perioade scurte de iradiere
ultravioletă.
Iradierea cu UV modifică proprietăţile biologice ale colagenului utilizat
ca biomaterial, în interacţiile colagen-celulă. Gelurile colagenice restructurate
din soluţii de colagen sunt utilizate în general ca substraturi pentru culturi de
celule, de fibroblaste, epidermice, hepatocite etc. Iradierea UV a gelurilor
conduce la o creştere accelerată a celulelor. De asemenea, a fost observat un
efect similar pe membrana colagenică iradiată, indicând proliferarea mai rapidă
a fibroblastelor, hepatocitelor şi celulelor epidermice [33].
Celulele epidermice cultivate pe membrane menţin un fenotip diferenţiat
pentru o perioadă mai lungă de timp şi formează multistraturi celulare [37, 38].
După cum s-a menţionat, iradierea gamma este o metodă eficientă pentru
a prepara lentile de contact colagenice cu un conţinut mare de apă, datorită
uşurinţei penetrării radiaţiilor gamma prin materialul turnat.

170
 3.1.2.2. Modificări chimice prin grefare

Obţinerea de produse cu caracter peliculogen, (necesare pentru formare

de membrane) prin grefarea colagenului cu polimeri sintetici, a constituit o
preocupare continuă a cercetătorilor, mai ales în găsirea de noi structuri de lianţi
necesari pentru finisarea pieilor, cu proprietăţi fizico - mecanice îmbunătăţite şi
efecte ecologice.
Cei mai utilizaţi monomeri în reacţiile de grefare a colagenului sunt:
monomerii vinilici şi acrilici, anhidridele alilice, N – carboxianhidridele,
lactamele [12].
Mecanismul reacţiei se bazează pe transferul de radicali, iniţiat de un
sistem redox. Reacţia se poate realiza în sistem omogen sau eterogen, în funcţie
de solubilitatea în apă a compusului macromolecular.
Perioada anilor 1975-1985 a fost denumită de către specialiştii din
industria pielăriei ca fiind perioada „grefării colagenului”, in vitro şi in situ (în
piele). Numeroase studii şi chiar aplicări tehnologice la nivel pilot s-au efectuat
în domeniul grefării sau copolimerizării polimerilor acrilici cu colagenul,
gelatina sau albumina [39-42]. S-a urmărit atât obţinerea de produse auxiliare
pentru retanare, cât şi lianţi pentru finisarea pielii. Cele mai valoroase studii de
grefare in situ le-au realizat cercetătorii din Madras – India [43-46]
Primele studii s-au efectuat cu gelatină, care a fost grefată cu monomeri
din seria vinilului. Rezultate optime s-au obţinut la temperaturi cât mai joase şi
cu concentraţii minime de iniţiatori, eficienţa grefării crescând cu creşterea
raportului dintre greutatea monomerului şi a proteinei [41].
Grefarea pe extracte sub formă de fibre sau soluţii de colagen se face în
sistem redox sau cu ion de Ce(IV) pentru a reduce la minimum degradările.
Monomerii polari ca acrilonitrilul, metilmetacrilatul se grefează rapid,
copolimerii grefaţi se extrag cu solvenţi pentru a îndepărta heteropolimerii
negrefaţi. Randamentul de reacţie depinde de: concentraţia iniţiatorului,
concentraţia monomerului, temperatura şi timpul de lucru. Factorii cei mai
importanţi care influenţează grefarea sunt concentraţia monomerului şi a
catalizatorului.
Numărul de catene laterale grefate şi greutatea moleculară medie a
ramurilor de polimer metilmetacrilat grefate, obţinute în diferite condiţii de
polimerizare, indică faptul că o lungime a catenelor laterale şi numărul de părţi
laterale grefate sunt considerabil influenţate de concentraţiile iniţiatorului şi
monomerului, de temperatură şi timpul de reacţie. Viteza de difuzie a

171
monomerului în colagen este un alt factor important care afectează gradul de
grefare, el depinzând de forma preparatului colagenic (solubil sau insolubil).
Amestecurile fizice de colagen solubil şi poliacrilamidă s-au comportat
la fel ca şi colagenul netratat. Dovezile că produsele sunt copolimeri grefaţi au
fost legate de comportarea lor la umflare cu diferiţi solvenţi, de vâscozitatea în
solvenţi micşti, precum şi prin analiză spectrală în IR (benzi de absorbţie
caracteristice amidei la 1550 şi 1660 cm-1). Observaţiile la microscopul
electronic a fibrelor de colagen grefat şi secţiunile ultra fine ale fibrelor nu au
prezentat striaţiuni transversale, ceea ce atestă că polimerul a pătruns în fibrele
colagenului.
În scopul de a introduce noi grupări funcţionale care să intre pe rând în
reacţia de polimerizare, s-a modificat colagenul prin tiolare, bromurare, vinilare,
cianoetilare. Numărul de părţi grefate creşte mult când colagenul este tiolat,
N-bromurat, vinilat şi cianoetilat. O creştere semnificativă a numărului de părţi
grefate s-a observat de asemenea când colagenul este metilat. Toate aceste studii
au arătat că grupele hidroxi şi scheletul peptidic al colagenului pot conferi situri
pentru iniţierea reacţiilor de grefare.
Determinarea cantităţii de substanţă colagenică din produsul grefat se
face prin: determinarea conţinutului de azot, a conţinutului total de aminoacizi şi
determinarea hidroxiprolinei [41].
Grefarea colagenului cu stiren s-a făcut pe cale radiochimică cu energii
diferite, iar cu acetatul de vinil, acrilamidă sau metilmetacrilat prin sistem redox
Fe2+ + H2O2. Există numeroase studii privind grefarea esterilor acrilici pe
colagen.
Pe plan naţional, cele mai multe studii s-au efectuat pe gelatină. Aceasta
se datoreşte şi aplicaţiilor acesteia în industria fotografică. S-au efectuat studii
prin care gelatina a fost tratată în proporţii de 1:1; 1:2; 1:4 cu metilmetacrilat
(MMA) sau acrilonitril (AN), sau cu amestecuri din cei doi copolimeri, în părţi
egale. S-au comparat rezistenţele la tracţiune şi a extensibilităţii filmelor acestor
copolimeri ai gelatinei cu filme de cazeină, obţinându-se rezultate pozitive. Prin
analize chimice şi spectrofotometrice s-a demonstrat posibilitatea de a grefa
gelatina cu până la 30% gelatină cu monomeri vinilici [46].
Pentru îmbunătăţirea extensibilităţii filmelor de gelatină se poate
interveni prin adaosuri de plastifianţi ca: sulforicinat, glicol, trietanolamină,
glicerină, în raport de 1:1; 1:2 şi 1:5 faţă de copolimeri. Astfel, filmul
copolimerului gelatină + poliacrilonitril (PAN), tratat cu sulforicinat în raport de
2:1, prezintă cea mai ridicată creştere a extensibilităţii, fără reducerea
semnificativă a rezistenţei la tracţiune. Valori ale extensibilităţii obţinute cu
172
sulforicinat au fost înregistrate la folosirea glicolului ca plastifiant. În acest caz,
copolimerul gelatină – polimetilmetacrilat (PMMA) 1:1 produce o scădere a
rezistenţei la tracţiune care este dependentă de cantitatea de plastifiant folosit
[47].
Studii de grefare cu monomeri acrilici (metilmetacrilat, etilacrilat şi acid
acrilic) au fost efectuate pe hidrolizate de colagen neutru (HO) cu greutăţi
moleculare diferite de cele ale gelatinei (40.000 – 75.000 Da).
Ca iniţiator de polimerizare s-a folosit K2S2O8, sintezele decurgând în
regim de agitare continuă la 70°C. În perioada finală a fiecărei sinteze s-a
procedat la ridicarea temperaturii pentru perioade scurte de timp la 80 – 85°C, în
vederea desăvârşirii reacţiei. Raportul mediu colagen: monomeri a variat între
1/4 ÷ 4/1. Aspectul masei de reacţie finală indică o structură coloidală cu
particule 0,1 – 0,2 µm.

3.1.2.3. Transformări chimice ale grupelor funcţionale

Modificarea catenei laterale este o metodă eficientă pentru schimbarea

caracteristicilor fizico-chimice şi biologice ale moleculelor de colagen.
Modificarea chimică se poate face la grupele funcţionale principale
caracteristice, aminice sau hidroxilice, în mediu apos sau neapos [13, 48]
Reacţiile de substituţie la grupele aminice şi hidroxilice se fac cu
compuşi din următoarele clase:
• cloruri acide (clorură de benzoil, cloruri ale acizilor graşi, sulfocloruri
aromatice sau alifatice) şi anhidride (succinică, ftalică, maleică). Se
modifică pH-ul izoelectric al colagenului precum şi proprietăţile
hidrofile în favoarea caracterului hidrofob [33];
• derivaţi halogenaţi (bromură şi clorură de benzil, diclorfenil metanul
etc.);
• epoxizi (epiclorhidrină, esteri glicidil) [49];
• izocianaţi aromatici şi alifatici.
Domeniul optim de pH pentru modificarea grupelor aminice este peste
cel izoelectric, iar pentru grupele OH, pH-ul optim este cuprins între 5,5 – 7,5.
Modificarea grupelor carboxilice se efectuează prin reacţii de esterificare, cu
clorură de tionil sau carbodiimide. Domeniul optim de pH este cuprins între 2 şi
pHi.

173
 Modificările chimice ale grupelor funcţionale în mediu apos au loc
simultan prin participarea atât a grupelor -NH2 şi -OH cât şi a celor -COOH.
Datorită structurii macromoleculare a extractelor colagenice, randamentul reacţiei
este dependent de greutatea moleculară şi implicit de gradul de libertate al
grupelor polare reactive. Astfel, în cazul hidrolizatelor de colagen reacţia este
mai eficientă.
Reacţiile de modificare chimică ce decurg în mediu neapos, conţinut din
alcoolul care participă la esterificare, se efectuează la temperaturi de 15 – 25°C
sau la fierbere [ 50, 51]. Şi în acest caz , randamentul reacţiei de esterificare este
influenţat de greutatea moleculară a extractului colagenic (hidrolizate, gelatină)
[52].
Modificarea catenelor laterale din colagen este un procedeu folosit
pentru obţinerea de geluri vâscoelastice (substituenţi de corp vitros) şi de fibre
cu canal (hallow fiber) cu proprietăţi anticoagulante [53].
Colagenul nativ are proprietăţi hemostatice, dar prin succinilare şi
metilare acestea sunt estompate, astfel încât nu se mai formează plachete
sanguine pe suprafaţa lumenului fibrelor [54, 55].
Modificarea catenelor laterale schimbă balanţa hidrofil / hidrofobă carac-
teristică colagenului, modifică solubilitatea şi interacţiunea cu sângele şi
celulele, proprietăţi necesare pentru anumite aplicaţii. De asemenea, pot fi
imobilizate substanţe biologic active cum ar fi factorii de creştere: heparina,
enzime, proteină morfogenetică osoasă etc.

3.1.3. Compozite pe bază de colagen

Compozitele sunt acele materiale care conţin două sau mai multe faze
constituente distincte, la o scară mai mare decât cea atomică. Prin termenul de
material compozit se înţelege un amestec constituit din mai multe substanţe, a
căror comportare la solicitări fizice, fizico-chimice sau chimice este similară
unei entităţi materiale unice .
Componentul major defineşte materialul compozit; deci materialele
compozite colagenice sunt constituite din colagen şi polimeri (naturali sau
sintetici) sau compuşi anorganici, adăugaţi în scopul de a conferi proprietăţi pe
care le posedă numai materialele necolagenice, obţinându-se astfel produse cu
proprietăţi noi, îmbunătăţite.
Din punct de vedere structural, compozitele sunt anizotrope în natură,
proprietăţile lor , în special cele mecanice, diferă în direcţii diferite. Multe dintre
174
ţesuturile vii cum ar fi oasele, cartilajele, dinţii, colagenul, pielea sunt
compozite naturale. Compozitele sintetice sunt în principal o combinaţie a două
faze distincte, de exemplu, o fază continua, matrixul şi una discontinuă, de
ranforsare, cum ar fi fibrele sau particulele (pulberi).
Motivul esenţial în dezvoltarea unui compozit cu aplicaţii medicale
(biocompozit) este acela că prin varierea tipului de distribuţie a fazei de
ranforsare în compozit, se poate obţine un domeniu larg de proprietăţi
mecanice şi biologice, şi prin urmare o optimizare a structurii şi performanţelor
medicale şi a interacţiunii cu ţesutul înconjurător.
Clasele de polimeri cei mai utilizaţi în obţinerea de materiale biocompo-
zite sunt: polietilenele, polipropilenele, policlorura de vinil, polistirenul şi
copolimerii săi, polimetilmetacrilatul, poliamidele, policaprolactama, polietilen
tereftalatul, policarbonatul, poliacetalii, poliuretanii, siliconii, polimerii cu fluor.
Una dintre cele mai frecvente utilizări ale biocompozitelor este ingineria
tisulară, care aplică metode din ingineria materialelor şi ştiinţelor vieţii pentru a
crea construcţii artificiale necesare regenerării ţesuturilor [56]. După cum se va
vedea (cap. 4.1.3.1.) faţă de complexitatea biologică şi sensibilitatea sistemului
organismului uman, cerinţele materialelor de reconstrucţie ale ingineriei tisulare
sunt variate şi extrem de schimbătoare. În primul rând, biocompatibilitatea faţă
de materialul substratului este imperativă, şi anume că materialul nu trebuie să
aibă un răspuns inflamatoriu, să nu fie imunogen sau citotoxic [57]. În plus,
proprietăţile mecanice trebuie să fie suficient de bune şi nu trebuie să cedeze în
timpul activităţii. Materialele utilizate pentru reconstrucţie sunt materiale
naturale sau sintetice, cum ar fi polizaharidele, poli α–hidroxieterii,
hidrogelurile sau elastomerii termoplastici [58].
În general, ţesuturile sunt grupate în ţesuturi moi (piele, vase de sânge,
cartilajii, ligamente) şi ţesuturi tari (oase, dinţi). Toate aceste ţesuturi sunt
materiale compozite, cu proprietăţi anizotropice, care depind de rolul şi de
structura aranjamentului diferitelor componente (colagen, elastină,
hidroxiapatită) în ţesut. Astfel, anizotropia proprietăţilor elastice ale ţesuturilor
biologice este considerată unul dintre cele mai importante criterii în designul
implantului format de materialul biocompozit. Din punct de vedere mecanic,
pentru implanturile de ţesuturi tari sunt adecvate biocompozitele pe bază de
metale, biovitroceramici, în timp ce polimerii sunt adecvaţi pentru implanturi de
ţesut moale. Polimerii se pot regăsi în cele două tipuri de structuri ale
ţesuturilor, atât ca matrice cât şi ca material de ranforsare.

175
 3.1.3.1. Compozite cu polimeri sintetici

Materialele compozite polimerice oferă câteva avantaje esenţiale

aplicării lor în ingineria tisulară, datorită combinării unor proprietăţi mecanice
ca modul de elasticitate, rezistenţă la tensiune, rezistenţă la oboseală, coroziune
scăzută, oferind un potenţial ridicat de biocompatibilitate structurală, mai mare
decât a materialului monolit.
Materialele compozite polimerice, mai mult, sunt compatibile cu
metodele moderne de diagnostic, cum ar fi tomografia computerizată (CT),
rezonanţa magnetică nucleară (RMN).
Clasificarea materialelor compozite se face în funcţie de forma lor de
ranforsare, existând trei tipuri mari de componente: fibre scurte, fibre lungi
continui şi pulberi [59].
O altă clasificare este bazată pe biodegradabilitatea lor: total resorbabile,
parţial resorbabile şi neresorbabile. Tabelul 3.2. redă principalele biocompozite
şi categoria lor de biodegradabilitate.

Tabelul 3.2. Biomateriale compozite polimerice

Compozit neresorbabil Compozit parţial resorbabil Compozit total

resorbabil
Alumina/PMMA CF/PGA PGA/PGA
Bioglass/PS CF/PLA PLA-PGA/PLA
Bioglass/PU CF/PLLA PLLA/PLDLLA
Os/PMMA HA/Alginat
CF/C;CF/Epoxi;CF/Nylon HA/PBT
CF/BBT;CF/PEEK;CF/PMMA HA/PEG-PHB
CF/PP; CF/PS;CF/PTFE HA/PLA
CF/UHMWPE; PET/Colagen
GF/GMA;GF/PMMA;GF/PP/PU PET/PHEMA
HA/HDPE;HA/UHMWPE PU/PU-PELA
KF/PC;KF/PMA; Alumina/PLLA
PE/PMMA; PET/PU
PMMA/PMA;PTFE/PU
Silica/GMA;Silica/SR
UHMWEPE/GMA
UHMWEPE/UHMWEPE

176
 Biocompozitele resorbabile sunt compuse din matrici şi fibre care sunt
resorbabile complet în organism, în special din acid polilactic (PLA) sau
copolimer acid polilactic-acid glutaric (PLA-PGA). Produsele de degradare nu
sunt toxice, sunt biocompatibile şi uşor de metabolizat.
Biocompozitele parţial resorbabile sunt compuse din materiale de
ranforsare neresorbabile şi matrici resorbabile. Cazurile particulare utilizează
polimetilmetacrilatul (PMMA), polibutilentereftalat (PBT) ca matrici resor-
babile în combinaţie cu hidroxiapatita (HA) sau PLA şi polialcanoaţi ca
polihidroxibutirat (PHB), combinat cu o fază de ranforsare neresorbabilă ca
alumina şi carbonatul de calciu. Pentru aplicaţii interne de fixatori, materialul de
ranforsare poate fi fibra de carbon, în timp ce matricea este formată din acid
polilactic sau acid polilactic-acid glutaric. Un biocompozit de interes clinic este
format din polietilenă şi hidroxiapatita, utilizat în grefarea şi refacerea oaselor.
Biocompozitele neresorbabile sunt utilizate în special pentru implanturi
de oase, proteze, dentiţie, fixatori externi.
Dezvoltarea materialelor compozite tip „scaffold” (suport schelet) este
atractivă ca realizare de proprietăţi avantajoase, din două sau mai multe
materiale ce se pot combina, conducând la proprietăţi mecanice şi fiziologice
mai bune şi adecvate cerinţelor ţesutului gazdă. Cea mai importantă forţă
motrice ce stă în spatele dezvoltării unui biocompozit polimeric cu diverse
materiale de ranforsare, pentru ingineria tisulară, este conferirea comportării
bioactive a matricei. Gradul de bioactivitate este ajustabil prin varierea
volumului fracţiei, dimensiunii, formei, aranjamentului incluziunii. Astfel,
creşterea volumului fracţiei şi a ariei suprafeţei/volumul fracţiei incluziunii
favorizează creşterea bioactivităţii. Complementar comportării bioactive a
acestor compozite mai trebuie luat în consideraţie şi comportamentul la
degradarea acestora şi metabolizarea lor.
Există numeroase tehnici şi procedee de preparare a acestor bioproduse
tip „scaffold”, în formă solidă, spume, bureţi, acoperiri etc. Tabelul 3.3 şi figura
3.4. prezintă aceste rute de fabricaţie în varianta 3D, cu avantajele şi
dezavantajele lor, precum şi structura lor morfologică [59].

177
 Tabelul 3.3. Procedee de preparare a bioproduselor scaffold

Ruta de fabricaţie Avantaje Dezavantaje

Separarea de fază - Porozitate mare(95%)
indusă termic - Structură poroasă
interconectată
- Pori tubulari şi anizotropici -
- Controlul dimensiunii şi
distribuţiei porilor prin
varierea condiţiilor
Distribuţie solvent - Porozitate controlată
Particule - Interconectivitate controlată
Forme solide - Structură poroasă
- Încapsulare proteine şi celule
- Interfaţă bună
Sinterizare microsfere - Structură poroasă gradată
- Porozitate controlată
- Fabricare în forme complexe
Acoperiri scaffold - Rapid şi uşor
- Timp mare de sublimare
(48 h)
- Producţie mică
- Utilizare solvenţi organici
- Structură izotropică
- Utilizare solvenţi organici
- Necesar îmbunătăţire
rezoluţie la microscală
- Solvenţi organici
- Interconexiunea este o
problemă
- Solvenţi organici
- Blocare pori, solvenţi
organici utilizaţi, acoperire
dificilă

Figura 3.4. Microfotografiile la microscopul electronic scanning (SEM) ale diferitelor

tipuri morfologice de biocompozite, preparate prin diverse tehnici:
a) separare de faze induse termic, b) distribuţie solvent şi de particule,
c) forma solidă, d) sinterizare microsfere, e) os de remediat

178
 În literatura de specialitate sunt raportate numeroase sisteme tipice
reprezentative pentru biocompozite utilizate în ingineria tisulară. Tabelul 3.4.
prezintă o selecţie a compozitelor utilizate pentru scaffold-uri în ingineria
tisulară (osoasă), comparativ cu un os cortical şi un os de înlocuit [59].

Tabelul 3.4. Compozite utilizate la obţinerea bioproduselor scaffold

Compozit Procent Porozit Dimensiune Rezistenţa la Modulul,

Ceramic Polimer ceramic, ate, % pori, µm compresiune MPa
% (C), tensiune
(T), flexiune
(F), MPa
1. Compozite dense
Fibre HA PDLLA 2-10,5 - - 45(F) 1.75-2.4x103
PLLA 10-70 50-60(F) 6.4 -12.8x103
HA PLGA 40-85 - - 22(F) 1.1x103
TCP OLLA- 75 - - 51(F) 5.18x103
PEH
PPF 25 7,5-7,7 (C) 191-134
A/W PE 10-50 - - 18-28 0.9-5.7x103
Os cortical 130-180
2. Compozite dense
CaP PLGA 28-75 75 >100 65
amorf
HA PLLA 50 85-95 100x300 0.39(C) 10-14
Bioglass PLGA 75 43 89 0.42(C) 51
PLLA 20-50 77-80 100 (macro) 1.5-3.9 137-250
PDLLA 5-29 94 100 (macro) 0.65-1.2
Sticlă PLA- 40 93-97
fosfatică PDLLA
Os de înlocuit 4 -12 (C) 100-500

Din perspectiva ştiinţei materialelor, provocarea ingineriei tisulare este

de a configura şi fabrica structuri reproductibile bioactive şi bioresorbabile 3D,
cu structuri compacte sau poroase, care sunt capabile să-şi menţină structura şi
integritatea un timp predictibil, chiar în condiţii de mare încărcare. Integritatea
mecanică a acestor structuri biocompozite este însă cu cca. un ordin de mărime
mai scăzut decât al osului cortical. Atingerea proprietăţilor mecanice ale osului
natural va permite înlocuirea unei părţi considerabile a ţesutului bolnav.
Incorporarea biomoleculelor ca un factor de creştere, cu scopul de a accelera
vindecarea ţesutului, este promiţătoare şi în plină acţiune de extindere a

179
cercetării. Această încorporare a biomoleculelor uneori este inadecvată, datorită
proceselor termice, dar devine promiţătoare prin abordarea tehnicii de
funcţionalizare a suprafeţei structurilor de încorporat.
O perspectivă de mare interes în utilizarea biomedicală a acestor
biocompozite este introducerea celulelor stem în structura lor. Scaffold-urile
însămânţate cu celule stem permit adaptarea funcţionării celulei locale prin
diferenţierea celulelor stem [60].
Acest nou concept permite suprafeţei scaffold-ului să mimeze funcţia
locală biologică şi să conducă în viitor la o creştere in vitro şi in vivo a ţesutului
sau a organului. Interfaţa celulelor stem şi a scaffold-ului este în prezent în
centrul atenţiei, constituind factorul de creştere şi de adeziune celulară. În acest
concept se anticipează că scaffold-ul compozit va fi constituit dintr-o matrice
polimerică biodegradabilă, cu o fază anorganică bioactivă, şi probabil va fi un
suport ideal, în combinaţie cu celulele stem.

3.1.3.2. Compozite cu compuşi anorganici

O altă categorie importantă de materiale sunt ceramicele bioactive,

sticlele bioactive sau ceramică – sticlă. S-au dezvoltat compozite polimer –
ceramice, în scopul creşterii stabilităţii mecanice a implantului şi îmbunătăţirii
interacţiei cu ţesutul şi cu capacitate controlată de eliberare a medicamentelor.
Ceramicele
Ceramicele sunt larg utilizate în aplicaţii dentare şi remedieri osoase.
Ceramicele cele mai utilizate în aceste domenii sunt: alumina (Al2O3), care are o
mare rezistenţă la coroziune, o bună compatibilitate şi rezistenţă mare la
tensiune.
Hidroxiapatita (HA) este o ceramică pe bază pe fosfat de calciu, ea
fiind componenta majoritară a oaselor, fiind biocompatibilă, cu o
biodegradabilidate şi contracţie aproape absente. Compania Interpore Cross
International, este cea care produce HA modificat, printr-o tehnică de
modificare hidrotermală: carbonatul de calciu din specii marine devin HA.
Structurile rezultate au o morfologie poroasă asemănătoare osului, iar la
implantare în defecţiunile osoase, ele suportă o creştere osoasă prin pori
(osteoconducţia – creşterea osoasă prin şi în structura poroasă). Degradarea HA
poate fi controlată prin modificarea structurii chimice.

180
 Fosfatul tricalcic(TCP) se degradează mult mai repede ca HA. TCP
medical se utilizează ca un autogrefant de expandare. Un alt produs ceramic,
sulfatul de calciu (CS) cunoscut ca Osteoset (Wright Medical Corporation),
este astăzi utilizat pentru aplicaţii ortopedice, iar tabletele de CS cu aspirină sunt
utilizate în scheletul craniofacial pentru umplerea golurilor osoase. O
combinaţie de sulfat de calciu cu fosfat tricalcic (Hapset) este utilizată în
stomatologie.
Biosticlele şi biovitroceramicele
Sticlele bioactive se leagă în general de oase şi ţesuturi moi. Acestea
conţin diferite proporţii de Na2O, CaO, P2O5, SiO2. Încă din 1971, Hench şi
colaboratorii au găsit câteva compoziţii vitroase, cu o biocompatibilitate
excelentă şi abilitate de legare la ţesutul osos. Prin reacţii interfaciale şi mediate
celular, sticlele bioactive prin stratul de carbonat fosfat (HCA) ce se formează
permit o legare chimică cu osul. Unele din cele mai utilizate biosticle sunt 45S5
Bioglass, Perioglas, Novabone, în domeniul defecţiunilor periodontale, osoase,
ca materiale de umplere sau acoperiri pe structuri polimerice naturale/sintetice
[61].
O caracteristică comună a biovitroceramicelor şi sticlelor este
dependenţa de timp a cineticii de modificare a suprafeţei, care apare după
implant. Suprafaţa formează un strat de hidroxicarbonatapatit biologic activ
(HCA), care crează legături la interfaţa cu ţesutul. Faza de HCA care se
formează pe implantul bioactiv este chimic şi structural echivalent cu faza
minerală a osului. Formarea in vivo a stratului de HCA la suprafaţa ceramicii
bioactive poate fi reprodusă în fluidul corporal simulat (SBF), liber de proteine
şi acelular, care se prepară la o concentraţie ionică apropiată de cea a fluidului
plasmatic. O morfologie de tip „cauliflower” (conopidă) a stratului de apatită
format pe implant este prezentată în microfotografia din figura 3.5 [59].

Figura 3.5. Microfotografia la microscopul electronic

scanning (SEM) a hidroxiapatitei formate
pe suprafaţa spongioasă a bioglass-ului.
Se relevă în detaliu formarea cristalelor
de hidroxiapatită de formă circulară.
181
 Un dezavantaj major al acestor bioceramici şi biosticle este rezistenţa
lor scăzută la fracturare şi rezistenţa mecanică scăzută, în special în forma
poroasă (tabel 3.5). Biovitroceramicele manifestă proprietăţi mecanice mai bune
decât cele ale sticlelor amorfe şi a ceramicelor calciu fosfat, iar
biovitroceramica apatita/ wollastonite (A/W) manifestă o rezistenţă la îndoire
foarte mare, datorită precipitării wollastonitei şi a fazei apatitice .

Tabelul 3.5. Proprietăţile mecanice ale HA, Bioglass 45S5, A/W vitroceramică
şi os uman

Ceramica Rezistenţa la Rezistenţa la Modul Rezistenţa la

compresiune, tensiune, Mpa elasticitate, GPa fracturare, MPa
Mpa
Hidroxiapatita > 400 ~ 40 ~ 100 >1.0
(HA)
45S5 Bioglass > 500 42 35 0.5-1
Vitroceramica 1080 215 118 2.0
A/W
Bioglas 70S30C 2.25 - - -
poroasa
Bioglass-derivat 0.2-0.4 - - -
glass-ceramic
>90%poros
HA poros 0.21-0.41 - 0.83-1.6x10-3 -
(82-86%)
Os cortical 130-180 50-151 12-18 -

Aceste ceramici şi biovitroceramici, Bioglass, glass-ceramica, conţin

HA sau componentele sale: CaO, P2O5 [62].. Formarea de HA nu este limitată
numai la ceramice; prin diverse tratamente chimico-termice în prezenţa unor
metale ca : titan, aliaje de titan, tantal, zirconiu tetragonal, se poate obţine şi pe
aceste suprafeţe formarea de HA, cu o foarte bună biocompatibilitate şi o
rezistenţă la fracturare de 4 ori mai mare. S-a demonstrat că formarea de grupe
funcţionale Ti-OH, Zr-OH, Nb-OH, Ta-OH pe suprafaţă, în structura
monoclinică tetragonală sau anatasă, se produc centre de nucleere pentru
cristalele de apatită , iar încărcarea negativă a suprafeţei creşte absorbţia ionilor
de Ca din soluţie.
În ultimii ani, au apărut nanocompozitele hibride organic/anorganic,
perfecţionându-se metodele de introducere a fazelor. S-au obţinut
nanocompozite polimer / silicat stratificat prin numeroase căi, datorită

182
uşurinţei de a combina diversele metode şi a diversităţii gazdelor stratificate
disponibile [63]. Astfel, componenta organică poate fi introdusă ca :
- precursor, ce poate fi un monomer sau oligomer;
- polimer liniar, obţinut anterior (în topitură, soluţie sau emulsie);
- reţea polimerică obţinută anterior, reticulată fizic (ex. polimer liniar
semicristalin) sau chimic (ex. elastomeri).
Componenta anorganică poate fi introdusă ca:
- monomer (ex. un alcoxid metalic);
- nanoparticule, mănunchi de fire sau lamele;
- structură nanoporoasă existentă (ex. aerogel).
Metodele curente utilizate pentru obţinerea nanocompozitelor hibride
polimer – silicat stratificat sunt: polimerizarea in situ, intercalarea polimerului
din soluţia polimerică, intercalarea directă din topitura polimerică sau prin
tehnica sol-gel. Această tehnică este o metodă relativ recentă de obţinere a
nanocompozitelor polimerice, constând în cristalizarea directă a silicatului
stratificat prin tratamentul hidrotermic al gelului, care conţine substanţe
organice, organometalice şi polimerul [64]. Dintre acestea, cea mai avantajoasă
este metoda de intercalare din topitură, datorită flexibilităţii, compatibilităţii cu
tehnicile curente de prelucrare a polimerilor şi a acţiunii blânde faţă de mediu,
datorită lipsei solventului.
Obţinerea nanocompozitelor prin intercalarea polimerului direct din topi-
tură implică încălzirea statică sau sub forfecare, a amestecului dintre polimer şi
silicatul stratificat, la o temperatură mai mare decât punctul de înmuiere al
polimerului. În timpul încălzirii, lanţurile polimerului difuzează din topitură în
galeriile dintre straturile de silicat. În funcţie de gradul de pătrundere, se obţin
hibrizi cu structuri ce variază de la intercalate la exfoliate (figura 3.6) [65].

Figura 3.6. Reprezentarea schematică a structurii compozitului

obţinut cu silicaţi stratificaţi. Barele reprezintă straturile de silicat

183
 În cazul în care polimerul şi silicatul sunt nemiscibile rezultă un hibrid la
macroscară, constând din aglomerate de silicat stratificat ( >1 mm diametru),
înconjurate de polimer. Formarea uneia sau alteia dintre structuri depinde, în
primul rând, de caracteristicile polimerului şi ale silicatului stratificat
organofilizat. Aceste caracteristici includ tipul, densitatea de împachetare,
dimensiunea modificatorului organic pe suprafaţa silicatului şi natura
polimerului [66].
Formarea unei legături la interfaţa organic/silicat stratificat este
rezultatul unor fenomene fizico-chimice ca: interacţiuni Van der Waals,
interacţiuni acid – bază, interacţiuni ion – dipol. Aceste interacţiuni pot fi
dezvoltate la interfaţa organic/anorganic prin modificarea suprafeţei silicatului
stratificat prin două procedee:
1. înlocuirea cationilor hidrataţi mobili, existenţi în galerii, cu cationi de
alchil amoniu, alchil fosfoniu, alchil sulfoniu sau amestecul acestora,
prin reacţii de schimb ionic;
2. înlocuirea moleculelor de apă cu molecule organice sau polimerice, care
conţin grupe funcţionale cu încărcare parţial negativă, ca de ex.:
carboxil, hidroxil, ester, eter, cetonă, aldehidă, prin metoda ion – dipol.

1. Înlocuirea cationilor anorganici mobili cu cationi de alchil amoniu, pe

suprafaţa galeriei silicatului, serveşte atât la „potrivirea” polarităţii suprafeţei
silicatului cu cea a polimerului, cât şi la creşterea înălţimii galeriei silicatului.
Astfel, se favorizează pătrunderea în spaţiul galeriei (intercalarea) atât a
precursorului polimeric, cât şi a polimerului, în funcţie de gradul de încărcare al
silicatului şi de surfactantul de tip alchil amoniu, fiind posibile diferite
aranjamente.
Ionii se pot orienta paralel cu suprafaţa silicatului ca un monostrat, un
bistrat lateral, un strat pseudo-trimolecular, sau poate rezulta o structură
înclinată parafinică [67, 68]. La un grad de încărcare foarte înalt, ionul mare de
surfactant poate adopta o orientare bistrat parafinică în galeriile silicatului [69,
70].
În cazul în care pentru schimbul cationic se utilizează surfactanţii cu
lungimi de lanţ < C8, se poate obţine un organosilicat în care cationii de sodiu
sunt parţial înlocuiţi, situaţie în care ei acţionează ca nişte puncte de fixare,
opunându-se expansiunii galeriei de către precursorul polimeric. În acest caz,
coocupantul suprafeţei galeriei adoptă o orientare de monostrat lateral. În cazul
în care se măreşte concentraţia de surfactant cu lanţ scurt, prin modificarea
suprafeţei silicatului, prin trei reacţii consecutive de schimb ionic, surfactantul
184
organic îşi păstrează orientarea de monostrat lateral în interiorul galeriei, dar toţi
cationii de sodiu sunt înlocuiţi. Dacă lungimea lanţului alchil creşte (> C8), ionul
de amoniu (sulfonic) trece din orientarea de monostrat lateral spre structura de
bistrat lateral şi structură parafinică.
Prezenţa unei concentraţii mici de ioni de sodiu are, în acest caz, un efect
redus asupra polarităţii galeriei, şi precursorul polimeric este capabil să pătrundă
în galeria silicatului stratificat [71].
Este necesară stabilirea concentraţiei optime de surfactant care se
intercalează între straturile de silicat, caz în care dispar proprietăţile hidrofile şi
se manifestă cele organofile. Trebuie evitată utilizarea unei concentraţii prea
mari de surfactant, deoarece produsul de reacţie se prelucrează greu, substanţa
organică împiedicând filtrarea, uscarea şi măcinarea [72].
2. Prin metoda ion-dipol se realizează modificarea suprafeţei silicatului
menţinându-se Na+ pe suprafaţa silicatului şi potenţializându-se dipolul indus pe
faţa opusă sodiului, care se disponibilizează pentru neutralizarea încărcării
deficitare din stratul octaedric. Încărcarea parţial pozitivă indusă de Na+ poate
interacţiona cu încărcarea parţial negativă de pe monomerul funcţional sau
grupele polimere. Grupele funcţionale cu moment dipol negativ cuprind
hidroxili, carboxili, esteri, eteri, aldehide şi cetone. Moleculele organice sau
polimerii care posedă astfel de grupe funcţionale dislocuiesc moleculele de apă
ataşate cationilor de schimb. În funcţie de molecula organică sau intercalantul
utilizat, se formează un complex unic cu suprafaţa silicatului. Cantitatea
intercalată în galerie va creşte spaţiul, atracţia dintre foiţele stratificate
individuale va scădea şi în consecinţă foiţele de silicat pot fi complet dispersate
sau exfoliate, prin forfecare mecanică suplimentară [73, 74].
Un exemplu de moleculă organică „unică” ce se intercalează între
straturile unui silicat este dodecilpirolidona, al cărui complex este foarte
hidrofob, deoarece gruparea carboxil a inelului pirolidonic se leagă de sodiu de
pe suprafaţa silicatului, în timp ce lanţul alchil pătrunde în galeria silicatului,
îndepărtând straturile. Acest material se comportă similar cu un silicat modificat
cu alchilamoniu, printr-o reacţie de schimb ionic [75].
Un exemplu de polimer intercalat îl constituie polivinilpirolidona (PVP),
care formează un complex prin legarea grupării carboxil a inelului pirolidonei cu
ionul de sodiu.
Molecule neutre, altele decât apa, pot fi de asemenea intercalate între
straturile de silicat. În procesul de intercalare pot acţiona mai multe mecanisme
de legătură [76]. Unul din mecanisme implică formarea unui complex între

185
cationul de schimb şi intercalat, un altul implică reacţia cationului hidratat, care
funcţionează ca un acid Brönsted şi intercalant care acţionează ca o bază.
Macromoleculele organice încărcate pozitiv sunt adsorbite la suprafaţa
silicatului printr-o reacţie de schimb cu cationii anorganici de compensare a
sarcinii, în timp ce compuşii organici neîncărcaţi (neionici) sunt adsorbiţi, în
principal, prin interacţiuni între grupele funcţionale şi cationii de schimb.
Absorbţia este exotermă şi creşte cu greutatea moleculară a compusului,
reflectând creşterea contribuţiei forţelor Van der Waals asupra întregii energii de
absorbţie [77].
Alături de bazicitate, mărimea şi forma moleculei organice vor influenţa
încorporarea, întrucât aceşti factori determină atât creşterea absorbţiei fizice cât
şi uşurinţa cu care aminoacidul poate pătrunde între straturile silicatului [78].
Apa legată de cationii de schimb joacă un rol important în interacţiunea
silicatului cu compuşii organici neîncărcaţi, întrucât grupele polare ale acestor
compuşi concurează cu apa pentru aceleaşi locuri „ligand” din jurul cationilor.
Interacţiunile cation – dipol sunt de aşteptat să existe şi în cazul fixării la
suprafaţa silicatului a polimerilor organici polifuncţionali neîncărcaţi. Entropia
ce se dezvoltă în sistem prin înlocuirea multor molecule de apă de pe suprafaţa
mineralului de un singur lanţ macromolecular, furnizează forţa motrice pentru
absorbţia polimerului [75].
Comparativ cu metoda de modificare a suprafeţei silicatului prin schimb
ionic, metoda ion – dipol prezintă avantajul că se poate utiliza o mare varietate
de molecule organice şi polimeri, în multe situaţii polimerul putând fi intercalat
direct şi ulterior exfoliat pentru a forma nanocompozitul.
Aerogelurile anorganice sunt materiale mezoporoase formate dintr-o
reţea continuă de nanocristale, având un volum al porilor ridicat. Proprietăţile
unice ale aerogelurilor se datoresc ariei mari a suprafeţei, densităţii joase şi
controlabile, accesibilităţii moleculelor reactante la nanocristalele aerogelului
printr-un transport de masă rapid în volumul continuu al mezoporilor.
Primele încercări de obţinere a aerogelurilor datează din 1931 când
S.S.Kistler de la Universitatea Stanford a inventat tehnica uscării la punctul
supercritic al solventului utilizat. După 30 ani, S. J. Teicher obţine aerogeluri
prin uscare la punctul critic cu CO2 lichid.
Aerogelurile de TiO2 îmbină proprietăţile şi caracteristicile aerogelurilor
cu proprietăţi fotocatalitice (de distrugere a bacteriilor etc.) şi de biocompati-
bilitate a TiO2.

186
 Proprietăţile aerogelurilor sunt strâns legate de morfologia lor (aria
suprafeţei, dimensiunea cristalitelor, dimensiunea şi volumul porilor), care este
dependentă de condiţiile de sinteză şi uscare a gelurilor corespunzătoare.
În general, aerogelurile de TiO2 se obţin prin metoda sol-gel urmată, fie
de uscarea la punct supercritic, fie de uscarea prin îngheţare şi sublimare a
solventului din gelul de TiO2, procese care au loc în timpul liofilizării
biogelurilor.
Metoda sol-gel constă în polimerizarea (hidroliza şi condensarea) unor
precursori, cei mai folosiţi fiind cei pe bază de alcoxizi ai titanului [Ti(OR)2].
Complexitatea moleculară a alcoxidului este determinată de tipul ligandului
(caracterul de donor sau acceptor de electroni), precum şi de solventul utilizat.
Datorită grupelor OR puternic electronegative, care stabilizează metalul în
gradul cel mai mare de oxidare, alcoxizii titanului sunt foarte reactivi, fiind
susceptibili atacului nucleofil rapid [79]. Tipul de ligand alcoxidic poate
modifica semnificativ comportarea la hidroliză a alcoxidului, ceea ce va
conduce la formarea unui sol stabil sau a unor polimeri liniari.
Cinetica reacţiilor de hidroliză şi condensare, precum şi structura
produsului condensat depind de tipul de catalizator utilizat, acid sau bazic. La
pH acid, condensarea are loc preferenţial la capetele lanţului, cu formarea unor
polimeri mai puţin ramificaţi. Cataliza acidă, coroborată cu un raport molar
apă/metal, conduce la formarea unor geluri monolitice. În condiţii bazice,
reacţiile de condensare şi hidroliză au loc prefernţial la mijlocul lanţurilor, cu
formarea unor produşi mai ramificaţi şi mai compacţi.
Etapele procesului de formare a aerogelurilor de TiO2 şi SiO2 prin
metoda sol-gel sunt: sinteza gelului anorganic, maturarea (2-8 săptămâni la
întuneric), spălarea gelului şi uscarea în condiţii supercritice sub formă de
pulberi.
Metoda de uscare în condiţii supercritice permite obţinerea aerogelului
prin eliminarea solventului din porii gelului, cu păstrarea structurii acestuia şi se
bazează pe faptul că la punctul critic apare o continuitate de stare (dispare
interfaţa gaz / lichid) ce determină dispariţia tensiunii superficiale şi ca urmare
evitarea colapsării. Modificarea parametrilor de uscare în condiţii supercritice
(debitul de alimentare cu CO2 lichid, perioada de încălzire şi de depresurizare a
autoclavei) permite obţinerea aerogelurilor cu suprafaţa mare (700 – 900 m2/g),
volum mare (1,5 – 2 cm3/g) şi un diametru al porilor de 10 – 15 nm.
Obţinerea gelurilor se realizează, în general, prin metoda sol-gel în
cataliză acidă sau bazică. Precursorii folosiţi pot fi de natură organică cum sunt:
acetaţii M(O2CMe), 2-etil-hexanoaţi M(O2CCHEtnBu)n, Al(O2CH)3(H2O),
187
[Al(O)x(OH)y(O2CR)z]m, carboxilaţii, β-dicetonele de forma
’
[M(RCOCHCOR )n]m unde M : Ca, Sr, Ba, iar R : Me, t-Bu. Cei mai utilizati
precursori organici sunt alcoxizii metalici de forma M(OR)n în care R este un
radical alcoxil sau radical halogenat de tipul -CH(CF3)2, -C6F5 [80]. Precursorii
anorganici cei mai utilizati sunt: halogenurile metalice (ex: TiCl3, TiCl4) şi
sulfurile metalice (ex: PbS, CdS, ZnS, NiS). Prin hidroliza acestor precursori,
necatalizată sau catalizată acid sau bazic, urmată de condensare se obţine solul
care, funcţie de condiţiile de sinteză (rapoarte molare precursor/ solvent,
precursor/catalizator, etc.) gelifică într-un timp mai scurt sau mai lung cu
formarea unui gel.
Gelurile oxidice ale metalelor tranziţionale (TiO2, SiO2, etc.) se obtin in
general din precursori anorganici prin reacţii de hidroliză şi condensare [81].
Hidroliza se realizează prin solvatarea cationilor metalici Mz+ (introduşi
în soluţie sub formă de sare) de către moleculele de apă.
Condensarea poate decurge prin două mecanisme nucleofile, în funcţie
de coordinarea metalului. Când are loc coordinarea completă, condensarea se
realizează prin substituţie nucleofilă.
Alcoxizii metalelor tranziţionale, în special ai metalelor cu configuraţia
0
d (Ti şi Zr) sunt des folosiţi ca precursori moleculari pentru obţinerea sticlelor
şi ceramicelor. Alcoxizii metalici sunt foarte reactivi, datorită prezenţei
grupărilor R-O- puternic electronegative (nucleofile) care stabilizează metalul în
starea cea mai ridicată de oxidare. Metalul este sensibil la atacul nucleofil [82].
Dintre alcoxizii metalici, cei ai Si şi Ti, [Si (OR1 )4 ] , respectiv [Ti (OR2 )4 ] sunt cei
mai utilizaţi în procesele sol-gel [82]. Acest fapt se datorează următoarelor
proprietăţi: electronegativitatea scăzută a metalelor tranziţionale care le măreşte
caracterul electrofil şi le labilizează faţă de hidroliză, condensare şi alte reacţii
nucleofile. Metalele tranziţionale manifestă mai multe stări stabile de oxidare.
Cinetica hidrolizei şi condensării este influenţată, de asemenea, de
lungimea catenei ligandului şi de conjugarea electronică din ligand. Pentru o
serie de alcoxizi ai titanului (Ti(n-OR)4), viteza hidrolizei scade odată cu
creşterea lungimii catenei alchil, datorită efectului steric ce afectează
mecanismul normal de substituţie nucleofilă.
Utilizarea gelurilor / aerogelurilor de TiO2 la obţinerea biocompozitelor
pe bază de colagen impune acestora existenţa unor caracteristici morfo-
structurale (porozitate, suprafaţă etc.) optime, astfel încât biocompozitul să
faciliteze dezvoltarea celulelor / ţesutului, transportul prin difuzie a agenţilor
nutritivi şi eliminarea deşeurilor biologice [83, 84]. Materialul biocompozit

188
rezultat trebuie să fie biodegradabil, să posede caracteristici de interfaţă care să
permită ataşarea, proliferarea şi diferenţierea celulelor. De asemenea, suportul
schelet biocompozit trebuie să aibă caracteristici mecanice apropiate de cele ale
ţesutului de înlocuit.

3.1.3.3. Compozite cu alţi compuşi bioactivi

Colagenul poate forma compozite cu o gamă foarte largă de compuşi

bioactivi naturali sau sintetici în funcţie de domeniul de aplicaţie [63, 85, 86].
Compozitele formate cu polizaharide naturale acid hialuronic, condroitin sulfat,
chitosan şi alginat sunt cele mai studiate şi aplicate ca hidrogeluri, membrane şi
matrici.
Diverşi alţi compuşi bioactivi pot fi înglobaţi sau imobilizaţi în gelurile
şi soluţiile de colagen: factori de creştere pentru diverse tipuri de celule, extracte
vegetale, medicamente, proteine etc.

3.2. Forme de bioproduse de bază de colagen

Dată fiind diversitatea formelor de bioproduse colagenice vor fi

prezentate în continuare formele morfostructurale de bază: hidrogeluri, fibre,
membrane, matrici, care provin din extracte de colagen nedenaturat.
Hidrolizatele de colagen sunt utilizate drept componente bioactive cu precădere
în produsele farmaceutice şi cosmetice.
Pentru caracterizarea bioproduselor colagenice se folosesc metodele de
analiză fizico-chimică şi morfostructurală descrise în subcapitolul 2.4.
În funcţie de compoziţia, structura şi domeniul de aplicare al
bioproduselor se pot utiliza şi alte metode specifice (analize fizico-mecanice,
porozimetrice, teste de biodegradare in vitro prin digestie enzimatică, testarea
biocompatibilităţii in vitro, în culturi de celule, etc.)

189
 3.2.1. Hidrogeluri

Hidrogelurile au fost aplicate ca biomateriale atunci când polimerul

hidroxietilmetacrilat (HEMA) a fost reticulat şi stabilizat structural morfologic
şi biologic [87].
Domeniul hidrogelurilor a fost lărgit prin introducerea de polimeri
naturali sau compozite dintre polimerii naturali şi sintetici. Astfel, în 1980 au
fost realizate hidrogeluri din alginaţi de calciu, colagen, cartilaj, care au fost
aplicate la încapsularea celulelor [88-92]. În ultimul deceniu, cele mai multe
aplicaţii ale hidrogelurilor au fost orientate spre ingineria tisulară, ca matrici
suport pentru repararea şi regenerarea unei largi varietăţi de ţesuturi şi organe
[93-95].
Hidrogelurile sunt tipuri de reţele polimerice hidrofile, care pot absorbi
apa de la 10% la peste 100%, raportată la greutatea uscată. Ele pot fi chimic
stabile, diferenţiat în funcţie de utilizarea ca biomaterial.
Există două tipuri de hidrogeluri:
- fizice ( reversibile) şi
- chimice ( permanente).
Hidrogelurile fizice se obţin atunci când se formează o reţea
intermoleculară, prin intermediul forţelor ionice, de hidrogen, sau hidrofobe.
Hidrogelurile fizice nu sunt omogene, deoarece asociatele de tip cluster sau cele
ionice crează discontinuităţi.
Hidrogelurile chimice sau permanente, sunt reţele reticulate prin
legături covalente. Acestea pot fi obţinute prin reticularea polimerilor solubili în
apă, sau prin conversia polimerilor hidrofobi în polimeri hidrofili, care apoi sunt
reticulaţi. În stare reticulată, hidrogelurile ating o hidratare (gonflare) de
echilibru în soluţii apoase, care depinde în principal de densitatea reticulărilor,
estimată prin masa moleculară.
Ca şi hidrogelurile fizice, cele chimice nu sunt omogene, mai conţin
regiuni cu grad de hidratare mai redus şi cu densităţi mari de reticulare,
denumite clusteri. Aceste domenii sunt dispersate în porţiunile structurale
puternic hidratate şi cu densitate scăzută de reticulare. Faptul poate fi datorat
agregării hidrofobe a agenţilor de reticulare, ce conduc la clusteri cu densităţi
mari de reticulare. Astfel, în timpul formării pot apărea separări de faze sau pot
apărea goluri sau macropori, care depind de compoziţia hidrogelului, de
solventul folosit şi de temperatură.
În gelurile chimice, lanţurile terminale libere reprezintă defecte ale
reţelei semisolide din care se formează, deoarece ele nu contribuie la
190
proprietăţile elastice ale hidrogelului. În acelaşi sens acţionează şi alte defecte
reprezentate de noduri şi ghemuri ale lanţurilor terminale.
Din punct de vedere structural hidrogelurile fizice sau chimice pot avea
configuraţii macromoleculare foarte variate, cum ar fi:
- reţele reticulate sau încâlcite din nanopolimeri liniari, copolimeri
liniari, copolimeri bloc şi grefaţi;
- copolimeri legaţi prin legături de hidrogen etc;
Hidrogelurile pot avea şi forme fizice diferite:
- solide matriţate (lentile de contact);
- matrici din pulberi presate (tablete sau capsule pentru administrare
orală);
- microparticule (bioadezivi, transporturi de medicamente – carrier);
- membrane sau filme (depozite pentru eliberarea transdermică a
medicamentelor) sau geluri pentru electroforeză 2D;
- solide încapsulate (pompe osmotice);
- lichide ce formează geluri prin încălzire sau răcire.

3.2.1.1. Compoziţii polimerice pentru obţinerea hidrogelurilor

La fabricarea hidrogelurilor sunt utilizate o varietate foarte mare de

compoziţii polimerice hidrofile: polimeri naturali sau sintetici.
Polimerii naturali pot fi anionici (ex. acid hialuronic, alginic, pectină,
carrogen, chondroitin sulfat, dextran sulfat), cationici (chitosan, polinază),
amfoteri (colagen/gelatină, carboximetilchitină, fibrină) sau neutri (dextran,
agaroză, pullulan).
Din clasa polimerilor sintetici s-au utilizat poliesteri de tipul
polietilenglicol – acid polilactic (PEG – PLA) sau cu grupe finale acrilice (PEG
- PLA acrilat) precum şi amestecuri de polimeri sintetici (PVAc - PVA), sau
naturali şi sintetici (alginat – acrilat P (HEMA).
Tehnicile de obţinere a hidrogelurilor sunt foarte variate. Astfel, pentru
gelurile fizice se utilizează:
- încălzirea sau răcirea soluţiei de polimer;
- reticularea polimerului în soluţie apoasă prin utilizarea de cicluri de
îngheţ-dezgheţ, pentru a forma microcristale;
- scăderea pH-ului pentru a forma geluri reticulate, prin legături de
hidrogen între doi polimeri diferiţi;

191
 - amestec din soluţii de polianioni şi policationi pentru a forma un gel
coacervat;
- geluri formate din soluţii de polielectroliţi şi ioni multivalenţi cu
sarcini opuse.
Pentru gelurile chimice:
- reticularea polimerilor în stare solidă sau în soluţie prin: iradiere,
reticulare chimică, compounduri reactive multifuncţionale;
- copolimerizarea în soluţie a unui monomer şi a unui agent de
reticulare;
- copolimerizarea unui monomer şi a unui macromer multifuncţional;
- polimerizarea unui monomer în diferiţi polimeri solizi, pentru a
forma geluri (ex. acrilamidă şi amidon);
- conversia chimică a unui polimer hidrofob într-un hidrogel.
Există o gamă diversă de polimeri sintetici şi naturali pe baza cărora se
obţin hidrogeluri cu proprietăţi reologice stabile.
Gelurile pe bază de polihidroxietilmetacrilat (P-HEMA) reprezintă
cea mai studiată categorie de geluri cu proprietăţi reologice speciale. Dacă
monomerul HEMA este polimerizat în prezenţa unei substanţe care solubili-
zează atât monomerul cât şi polimerul (ex. etilenglicol, etilenglicol-apă), se
obţine un hidrogel omogen transparent. Dacă monomerul este polimerizat în
prezenţa unei substanţe care nu solubilizează polimerul format, se obţine un
polimer opac, poros, de culoare albă. Monomerul HEMA este un bun solvent
pentru P-HEMA, astfel încât dacă apa în amestecul apă-HEMA are o
concentraţie mai mică sau egală cu 43%, se obţine un gel omogen.
Hidrogelurile pe bază de P-HEMA au o stabilitate chimică, fiind
rezistente faţă de amine şi la hidroliză acidă. De asemenea, în soluţie neutră sunt
relativ stabile la temperatură, astfel încât pot fi sterilizate cu abur fără a suferi
modificări.
Hidrogelurile pe bază de poliacrilamidă (PAM) şi derivaţi sunt
transparente, au rezistenţă mecanică scăzută şi pot avea un conţinut ridicat de
apă (95%). Această concentraţie de apă depinde de concentraţia agentului de
reticulare din sistem. În general, hidrogelurile din poliacrilamidă sunt relativ
stabile în condiţiile fiziologice de pH şi temperatură.
Hidrogelurile pe bază de poli-N-vinil – pirolidonă (PVP). Acest
polimer este o poli-N-vinil-lactamă. Fiecare unitate structurală conţine un dipol
cu o sarcină parţial negativă a atomului de oxigen şi o sarcină parţial pozitivă la
atomul de azot. PVP are o structură asemănătoare cu cea a proteinelor şi poate

192
forma legături de tip ion-dipol, dipol-dipol, legături de hidrogen, legături
hidrofobe.
Prezenţa în apă a PVP-ului, alături de unii compuşi insolubili, conduce la
un efect de solubilizare a acestora, probabil datorită formării unor coacervate.
Poli-N-vinil-pirolidona prezintă o reactivitate chimică mică şi rezistenţă mare la
acţiunea enzimelor.
Absorbţia polimerului în tractul intestinal, membrane, mucoase sau piele,
este foarte redusă. Sub formă reticulată, PVP-ul este uşor solubil în apă, cât şi în
solvenţi polari şi nepolari (metanol, etanol, etilenglicol, butandiol, glicerină,
cloroform, acid acetic, formaldehidă, piridină, trietanolamină). Datorită
interacţiei sale puternice cu apa, este folosit la prepararea gelurilor, care pot
absorbi o cantitate mare de apă. Pentru a se obţine geluri cu o bună rezistenţă
mecanică, se utilizează ca agenţi de reticulare metilen-bis-4-fenil-izocianat sau
metilen-bis-acrilamida.
Pentru uz medical au fost realizate şi hidrogeluri pe bază de poli-N-vinil-
2-pirolidonă şi poliacrilamidă.
Complecşii polielectrolitici sunt polisăruri formate prin reacţia între un
polimer cationic (ex. clorură de polivinilbenzilmetilamoniu) şi un polimer
anionic (ex. polistirensulfonat de sodiu). Complexul format din aceşti doi
polielectroliţi are o rezistenţă relativ slabă, ceea ce face ca gelul să sufere
degradări la sterilizarea în autoclavă. Aceste geluri au însă avantajul că în
reţeaua lor poate fi integrată uşor o sarcină negativă sau pozitivă; acest lucru se
realizează prin creşterea concentraţiei unuia dintre polimeri.
Polivinilalcoolul (PVA) prezintă proprietăţi de coloid de asociere cu o
concentraţie critică micelară de 0,05%. Unele substanţe, ca acidul galic, rezor-
cina, β-naftolul, fluoroglicina, produc gelifierea polivinilalcoolului în soluţie.
Un gel foarte poros pe bază de PVA se poate obţine prin tratarea PVA cu
formaldehidă şi aerarea soluţiei înainte de polimerizare.
Pentru uz medical s-a realizat un hidrogel pe bază de PVA şi heparină,
utilizând ca agenţi de reticulare glutaraldehida şi formaldehida. Hidrogelurile pe
bază de PVA, obţinute prin reticularea cu radiaţii, au fost testate ca înlocuitori
de cartilaj.
Biopolimeri naturali
Există două tipuri de polimeri biodegradabili: materiale pe bază de
polimeri naturali ce includ polizaharide (amidon, alginaţi, chitină/chitosan, acid
hialuronic şi derivaţi) sau proteine (soia, colagen, gel de fibrină, mătase) precum
şi materiale de ranforsare (o varietate de biofibre ca fibrele naturale
lignocelulozice) [96-98].
193
 Chitosanul este un derivat al chitinei, un tip de polizaharid, prezent în
scheletul unor peşti. El are câteva proprietăţi bine definite care îl fac interesant
pentru aplicaţii în ingineria tisulară şi anume: o reacţie minimă a organismului
la implant, condiţii de procesare blândă (polimerii sintetici sunt dizolvaţi uşor în
chitosan), proprietăţi controlabile mecanice/biodegrdabile (porozitate, lungimea
catenei polimerice), prezenţa unor grupe reactive pentru ataşarea la compozit
[99].
Alginatul este un polizaharid, derivat dintr-o algă marină brună, se
prelucrează uşor din apă, este netoxică şi neinflamabilă. Alginaţii sunt
biodegradabili, au o porozitate controlată, se pot lega uşor de molecule biologic-
active, formând geluri solide, prelucrabile ca perle sau alte forme. Anumite
principii se pot încapsula în aceste perle de alginat, utilizabile în afecţiuni ale
ficatului, nervilor, cartilajelor [100].
Glicozaminoglicanii (GAG) sunt substanţe aparţinând categoriei
heteropolizaharidelor, alcătuite din două tipuri de unităţi monozaharidice
alternative, din care cel puţin una conţine o grupare acidă, fie o grupare carboxil,
fie sulfat. Mucopolizaharidele sunt substanţe gelatinoase şi au proprietăţi
adezive. Cel mai utilizat GAG pentru obţinerea de hidrogeluri este acidul
hialuronic, prezent în substanţa fundamentală a ţesutului conjunctiv al
vertebratelor, în lichidul sinovial şi în umoarea vitroasă a ochiului.
În soluţie apoasă, acidul hialuronic formează hidrogeluri vâscoelastice,
vâscozitatea acestora variind în funcţie de concentraţia şi masa moleculară a
polimerului, de pH, de sărurile neutre prezente în soluţie. Natura vâscoelastică a
soluţiilor depinde de timpul de relaxare moleculară a segmentelor de lanţ ale
polimerului. Creşterea concentraţiei polimerului în soluţie măreşte numărul de
interacţii inter şi intramoleculare între segmentele de lanţ şi determină creşterea
timpului de relaxare, crescând astfel şi rigiditatea reţelei macromoleculare.
Hidrogelurile din acid hialuronic sunt solubile în apă şi în ser fiziologic.
La concentraţii mai mari de 0,2% HA, soluţiile acestui polizaharid trec în
faza de gel datorită faptului că lanţurile polimerice formează reţele
tridimensionale care se înterpătrund. La concentraţii mai apropiate de 1%,
reţelele sunt net constituite şi ochiurile acestora sunt cu atât mai mici cu cât
concentraţia şi gradul de polimerizare sunt mai ridicate.
Un factor important în menţinerea rigidităţii tridimensionale îl reprezintă
gruparea carboxilică a acidului hialuronic care determină un anumit grad de
repulsie între unităţile dizaharidice adiacente. Dacă gruparea –COOH este
eliminată, sau sarcina negativă liberă este neutralizată, rigiditatea reţelelor

194
tridimensionale scade, lanţurile polimerului tind să devină semispiralate şi se
reduce vâscozitatea hidrogelului.
Studii efectuate pe plan mondial au evidenţiat că prezenţa
polizaharidelor măreşte, într-o bună măsură, rezistenţa hidrogelului de colagen.
Astfel, lucrul mecanic pentru ruperea reţelelor din hidrogel pentru acelaşi grad
de reticulare, este de 133 kg, în cazul hidrogelului de colagen şi de 497 kg/cm2
pentru hidrogelul de colagen modificat cu condroitin sulfat.
O categorie importantă de hidrogeluri o constituie hidrogelurile pe bază
de colagen. Biocompatibilitatea mult mai mare a colagenului comparativ cu cea
a polimerilor organici menţionaţi anterior, recomandă utilizarea hidrogelurilor
pe bază de colagen pe scară largă în medicină.
Tratarea gelului de colagen cu polimeri naturali (polizaharide) sau
reticularea acestuia cu substanţe tanante organice îmbunătăţesc proprietăţile
fizico-mecanice şi bioactive ale acestuia, ducând la obţinerea unor hidrogeluri
care răspund mai bine la cerinţele impuse unui material de uz medical.

3.2.1.2. Proprietăţile hidrogelurilor

Gelurile cu mediu de dispersie apos sau hidrogelurile sunt reţele

tridimensionale de polimeri hidrofili reticulaţi, în general covalent sau prin forţe
de natură ionică, care interacţionează cu soluţii apoase gonflându-se la o valoare
de echilibru. Acestea pot fi relativ rezistente, ca în cazul membranelor celulozice
utilizate în dializă, sau relativ puţin rezistente, devenind din ce în ce mai puţin
rezistente pe măsură ce creşte conţinutul de apă, deşi variabile ca natura
agentului de reticulare, reţeaua polimerică, tacticitatea şi cristalinitatea pot
influenţa semnificativ comportarea mecanică [101].
Hidrogelurile sunt sisteme destul de subtile care se echilibrează în
mediu, suferind astfel multe modificări. Proprietăţile unor asemenea geluri sunt
puternic dependente de densitatea de reticulare şi de conţinutul de impurităţi, iar
în cazul celor din polimeri sintetici de urmele de monomer, catalizator şi
stereospecificitatea polimerului.
Proprietăţile superficiale şi interfaciale ale hidrogelurilor sunt destul de
apropiate de ale gelurilor biologice naturale şi ale ţesuturilor. Adăugând şi
proprietăţile de volum, acestea sunt foarte convenabile pentru aplicaţii medicale
şi farmaceutice. Astfel, există multe similitudini între interfaţa gel/apă şi celule

195
vii/soluţii fiziologice. Cum ultimile sunt dificil de studiat şi interpretat, studiul
primelor poate conduce la elucidarea unor aspecte din natura vie.
Proprietăţi de volum ca gonflarea fac posibilă elucidarea mecanismelor
de gonflare şi osmotice din ţesuturile biologice, precum şi aplicarea acestora ca
implanturi care se gonflează, pe când permeabilitatea la substanţe cu masă
moleculară mică solubile în apă fac gelurile convenabile pentru eliberarea
controlată a medicamentelor sau pentru transportul unor substanţe dizolvate
imobilizate în gel, cum sunt enzimele.

Factorii care afectează gonflarea hidrogelurilor

Gradul de reticulare este unul dintre cei mai importanţi factori care
afectează gonflarea hidrogelurilor. Este definit ca raportul dintre numărul de
moli de agent de reticulare şi numărul de moli de unităţi repetate ale
polimerului. Gradul de reticulare este cu atât mai mare cu cât cantitatea de agent
de reticulare în structura hidrogelului este mai mare. Hidrogelurile mai reticulate
au o structură mai densă şi se umflă mai puţin, comparativ cu aceleaşi
hidrogeluri cu grad mai mic de reticulare. Reticularea împiedică mobilitatea
lanţului polimeric, micşorând gradul de gonflare.
De asemenea, structura chimică a polimerului poate afecta gradul de
gonflare al hidrogelului. Hidrogelurile cu conţinut de grupări hidrofile au un
grad mai mare de gonflare, comparativ cu cele care conţin grupări hidrofobe.
Grupările hidrofobe se rup în prezenţa apei, minimizând astfel expunerea lor la
moleculele de apă; ca rezultat, aceste hidrogeluri se vor umfla mai puţin decât
cele care conţin grupări hidrofile.
Gonflarea hidrogelurilor sensibile la temperatură poate fi afectată de
schimbări ale temperaturilor mediului de gonflare. Tăria ionică şi pH-ul
afectează gonflarea hidrogelurilor sensibile la tărie ionică şi pH. Există mulţi alţi
stimuli specifici care pot afecta gonflarea hidrogelurilor sensibile la alte
răspunsuri ale mediului.

196
 Dinamica gonflării

Cinetica de gonflare a hidrogelurilor poate fi clasificată ca gonflare prin

difuzie controlată, conform legii lui Fick şi relaxare controlată care nu respectă
această lege. Când difuzia apei în hidrogel are loc mai repede decât relaxarea
lanţului polimeric, cinetica de gonflare este controlată prin difuzie.

Proprietăţi mecanice

Proprietăţile mecanice ale hidrogelurilor sunt foarte importante pentru

aplicaţii farmaceutice. De exemplu, integritatea dispozitivelor de cedare a
medicamentelor în timpul de viaţă al aplicaţiei este importantă pentru obţinerea
avizului FDA - USA, în afara faptului că dispozitivul este desemnat ca sistem
biodegradabil. Un sistem de cedare a medicamentelor destinat să protejeze un
agent terapeutic sensibil ca proteina, trebuie să-şi menţină integritatea, pentru a
fi capabil să protejeze proteina până aceasta este eliberată în afara sistemului.
Schimbarea gradului de reticulare a dus la realizarea proprietăţilor
mecanice dorite ale hidrogelurilor. Creşterea gradului de reticulare al sistemului
va avea ca rezultat un gel mai tare. Totuşi, un grad mai mare de reticulare crează
o structură mai fragilă. Există un grad optim de reticulare care realizează un
hidrogel elastic şi relativ rezistent. De asemenea, a fost utilizată copolimerizarea
pentru a realiza proprietăţile mecanice dorite ale hidrogelurilor. Încorporarea
unui comonomer care va contribui la formarea legăturilor de hidrogen, va mări
rezistenţa hidrogelului.

3.2.2. Membrane colagenice

Gelurile şi soluţiile de colagen uscate liber la 25°C se transformă în

pelicule denumite curent membrane, din cauza asemănării lor cu membranele
naturale (placentară, bazală, dura mater, intestinală etc.). Durata procesului de
uscare, umiditatea relativă a aerului din uscător şi viteza de circulaţie a aerului,
influenţează structura morfologică a membranei de colagen.
Membranele pot fi reticulate în fază de gel sau după formarea lor, prin
imersie într-o soluţie de fixare / reticulare ce conţine aldehidă sau alt agent de
reticulare; mai rar se foloseşte reticularea cu vapori de formaldehidă.
Membranele colagenice sunt semitransparente, uniforme, elastice şi
destul de rezistente pentru a fi pliate sau rulate în tuburi (figura 3.7) .
197
Pot fi monostrat sau multistrat şi pot avea inserţii textile, care-i măresc rezistenţa
mecanică.

Figura 3.7. Membrana de colagen

Membranele colagenice compozite pot conţine aceleaşi clase de compuşi

care sunt utilizate şi pentru formarea matricilor compozite.
Există totuşi o restricţie în ceea ce priveşte procentul de component
adăugat. Acesta este dependent de natura compusului, solubilitatea şi
reactivitatea lui faţă de gelul colagenic. În membranele compozite formate cu
pulberi de ceramică, hidroxiapatită, aerogeluri de TiO2, SiO2, silicaţi naturali
modificaţi, nu se pot folosi cantităţi mai mari de 5-10% din aceste componente.
Formarea membranelor colagenice compozite cu polimeri naturali sau
extracte vegetale solubile în apă, este influenţată mai mult de interacţiile
intermoleculare care pot conduce la coprecipitarea componenţilor [102].
Dintre aplicaţiile bioproduselor pe bază de membrane colagenice cele
mai importante sunt legate de:
- capacitatea de cedare gradată (drug delivery) prin plasturi transdermici
[103-105];
- proprietăţile de difuzie, electrice şi piezoelectrice, care se manifestă la
bioprodusele implantabile (tuburi pentru regenerarea nervilor periferici,
substituenţi de ţesut abdominal şi membrane pentru regenerare tisulară
ghidată [106-108];
Pe plan naţional s-au realizat până în prezent următoarele tipuri de
membrane colagenice:
- simplă, mono şi tristratificată, utilizată ca substituent de mielină în
neurochirurgie (SMC);
- membrană cu inserţie textilă PLASCOL substituent de perete
abdominal;

198
 - proteze vasculare textile acoperite cu membrane de colagen
COLARTEX;
- compozite cu biovitroceramică sau aerogel de TiO2 pentru regenerare
tisulară ghidată, utilizate în chirurgia maxilo-facială (COREM şi
Membrana TC);
- „drug delivery” ce conţin medicamente pentru aplicaţii transdermice şi
transconjunctivale (membrane cu diclofenac, cisteină, gentamicină,
extracte vegetale).

3.2.2.1. Membrane colagenice fără inserţie

Din punct de vedere al structurii morfologice membranele de colagen de

tip SMC prezintă o structură apropiată de cea a unui ţesut colagenic lax. Prin
analiza microscopică se observă o structură fibroasă microporoasă diferită de
cea existentă în matricea colagenică (figura 3.8).

a) b)
Figura 3.8. Secţiune transversală prin membrana: a) monostrat SMC,
b) tristrat SMC. Microscopie SEM, mărire 1000x

Mărimea porilor şi distribuţia lor influenţează proprietăţile de difuzie /

permeabilitate, precum şi pe cele electrice. Aceste caracteristici sunt importante
pentru biofuncţionalitatea substituenţilor de mielină, utilizaţi în reconstrucţia de
nervi periferici.
Microporozitatea specifică membranei colagenice este datorată porilor
cu diametru mediu de 0,08 µm, care se formează în timpul uscării libere în urma
evaporării lente a apei conţinute în gel. Prin acest procedeu de uscare, fibrilele şi
fibrele de colagen se apropie foarte mult eliminând spaţiile ocupate de apă.
Substituenţi de mielină SMC sunt structuri hidrofile, a căror proprietăţi de

199
permeaţie / transport ionic şi de potenţial electric sunt influenţate de apa
constituentă.
Studiile efectuate pe plan mondial în acest domeniu, au relevat
importanţa efectului de barieră pe care trebuie să-l aibă membrana colagenică
pentru proteinele cu mase moleculare mari. Acestea nu trebuie să pătrundă în
„camera închisă”, formată din membrana colagenică rulată sub formă de tub,
care protejează capetele nervului secţionat.
În acelaşi timp, membrana colagenică trebuie să fie permeabilă la
fluidele vitale necesare regenerării nervilor. Substituenţii de mielină sub această
formă sunt un mediu bun de protecţie şi de ghidare pentru creşterea axonilor în
zona de ruptură a nervilor.
Proprietăţile electrice şi hidrofile ale membranelor colagenice SMC,
influenţează procesul de difuziune care este important în mecanismele de
transport ale sărurilor şi nutrienţilor, necesari unei refaceri rapide a nervilor
periferici traumatizaţi. Se impune o singură restricţie majoră, aceea că macro-
moleculele proteice nu trebuie să treacă prin porii membranei SMC.
Proprietăţile hidrofile ale membranelor colagenice SMC sunt influenţate
de structura microporoasă, care se formează în timpul restructurării gelului şi
uscării libere a acestuia.
Membranele SMC prezintă foarte bune proprietăţi hidrofile; astfel,
absorbţia de apă este peste 150% şi variază în funcţie de gradul de reticulare şi
de numărul de straturi din care se formează membrana (tabelul 3.6).
De asemenea, gentamicina introdusă în compoziţia membranei influen-
ţează mult absorbţia de apă în sensul scăderii procentului. În schimb, permeabi-
litatea şi absorbţia la vapori de apă sunt mai mari, ceea ce demonstrează
complexitatea interacţiilor care se manifestă între proteine şi diverse tipuri de
medicamente [109].

Tabelul 3.6. Caracteristicile hidrofile ale membranelor colagenice SMC

Denumire probă Permeabilitate la Absorbţie de Absorbţie de apă(%) la

vapori de apă vapori de apă, %, 20°C
mg/24 h, 20°C 20°C
24 h 72 h 1h 2h 24 h
Membrană monostrat,
fără gentamicină 989 18,0 23,8 157,7 161,8 168,8
Membrană monostrat cu 924 13,3 21,5 148,0 148,0 157,6
gentamicină
Membrană tristrat, fără
gentamicină 904 12,8 20,2 143,0 150,7 152,6

200
 Depunerea de straturi succesive de gel colagenic, deşi micşorează
diametrul porilor interconectaţi, nu influenţează semnificativ permeabilitatea şi
absorbţia vaporilor de apă. Acest fapt poate fi explicat printr-o suprafaţă
specifică a porilor mai mare la membrana tristrat, faţă de cea monostrat (13 m2/g
şi respectiv 9 m2/g).
Din punct de vedere al rezistenţelor mecanice, membranele colagenice
SMC sunt suficient de rezistente la manipulare în timpul actului chirurgical
(rezistenţa la tracţiune este de cca. 4 kgf/mm2). Prin hidratare, membranele
devin şi mai rezistente, datorită efectului de plastifiere realizat de apa absorbită.

Proprietăţile electrice ale membranelor colagenice SMC

Majoritatea ţesuturilor şi celulelor folosesc transportul de curent electric

pentru a-şi îndeplini funcţiunile biologice. Folosirea electricităţii în funcţionarea
celulei este un proces natural din punct de vedere fizic, deoarece foarte multe
din substanţele transportate în organism sunt încărcate electric; de asemenea,
semnalele electrice sunt adecvate pentru transferul şi conversia de informaţie.
Piezoelectricitatea şi electricitatea sunt proprietăţi fundamentale ale
ţesuturilor conjunctive din oase, dinţi, tendoane, piele şi din structuri nervoase.
Polaritatea ţesuturilor este funcţională în condiţiile în care organismele au
receptori senzoriali care să detecteze stimulii mecanici şi termici din mediul
înconjurător. Este acceptată în general ipoteza că aceste proprietăţi dielectrice
din ţesuturile naturale se datorează fibrilelor de tip colagen aranjate paralel.
Pentru explicarea mecanismului de transport electric în proteine, nu
există încă o teorie unică a conducţiei electrice. Fenomenul este deosebit de
complex atât din cauza structurii complicate a proteinelor, cât şi a faptului că
fiind hidrofile, tipul de purtători de curent se schimbă cu conţinutul de apă.
Astfel, curentul poate fi electronic, protonic sau ionic şi în anumite condiţii de
hidratare şi temperatură pot coexista toate tipurile de purtători.
Permitivitatea electrică a membranelor de colagen SMC s-a măsurat
indirect prin folosirea acestora ca element dielectric pentru un condensator.
Caracteristicile electrice ale membranei de colagen SMC se situează între cele
ale materialelor semiconductoare şi cele izolatoare (tabelul 3.7).

201
 Tabelul 3.7 Caracteristicile electrice ale mebranei SMC

Membrana Rezistivitate, ρ Permitivitate, t 0C

tristratificată εr
uscată 5 x 1010 Ωm 3,15 25
hidratată 1010 Ωm 3,7 25

Testarea in vitro a gradului de resorbţie a

membranei colagenice SMC

Reticularea colagenului cu ajutorul aldehidelor, în special glutaraldehida,

este o metodă des utilizată pentru obţinerea de biomateriale implantabile, greu
resorbabile in vivo.
S-a stabilit o metodă de determinare in vitro a rezistenţei membranelor
colagenice, la digestia enzimatică, utilizând membrane monostrat şi tristrat
reticulate cu procente diferite de glutaraldehidă, 0,05 - 0,3%. Membranele sunt
supuse acţiunii enzimei (pepsină) în concentraţie de 0,5% şi 1%, la temperatură
de 37°C. Gradul de resorbţie se estimează prin timpul necesar pentru macerarea
completă a probei. Astfel, în cazul unei membrane martor, nereticulată şi care a
fost tratată cu o soluţie de pepsină 1%, resorbţia totală s-a produs după 20 de
ore, iar cu o concentraţie mai mică de pepsină, 0,5%, după 30 ore (tabelul 3.8).
În cazul membranelor reticulate cu glutaraldehidă în concentraţii diferite,
s-a constatat că acţiunea enzimei este diminuată, resorbţia membranei
făcându-se într-un timp mai îndelungat. Astfel, la o membrană ce conţine 0,05
% aldehidă şi care a fost tratată cu o soluţie de pepsină 1%, resorbţia s-a produs
după 108 ore, iar cu o soluţie de 0,5% pepsină după 140 ore.
De asemenea, s-a mai constatat că timpul de resorbţie al membranelor de
colagen variază şi în funcţie de grosimea lor (numărul de straturi), precum şi de
gradul de reticulare şi îmbătrânire al acestora.
În cazul membranelor reticulate cu glutaraldehidă în concentraţii diferite,
s-a constatat că acţiunea enzimei este diminuată, resorbţia membranei
făcându-se într-un timp mai îndelungat.

202
 Tabelul 3.8. Influenţa structurii membranelor SMC asupra gradului de
resorbţie in vitro

Denumire probă Număr straturi din Concentraţie Timp de

care s-au format pepsină, resorbţie
membranele (%) (ore)
Membrana martor 1 1 12
nereticulată 0,5 18
3 1 18
0,5 24
Membrana I 1 1 108
reticulată cu 0,05% 0,5 140
glutaraldehidă 3 1 195
0,5 208
Membrana II 1 1 210
reticulată cu 0,1% 0,5 230
glutaraldehidă 3 1 260
0,5 300
Membrana III 1 1 320
reticulată cu 0,2% 0,5 380
glutaraldehidă 3 1 435
0,5 560
Membrana IV 1 1 442
reticulată cu 0,3% 0,5 600
glutaraldehidă 2 1 780
0,5 804

Membranele monostrat mai subţiri, sub acţiunea pepsinei la temperatura

de 37°C, sunt resorbite într-un timp mult mai scurt faţă de membranele mai
groase tristratificate, tratate cu aceeaşi cantitate de glutaraldehidă şi concentraţie
de enzimă. Diferenţa între timpii de resorbţie la membranele formate dintr-un
strat sau trei straturi se accentuează la concentraţii mari de glutaraldehidă.
Prin urmare, gradul de resorbţie al membranelor de colagen poate fi
reglat şi prin grosimea acestora, limitând astfel concentraţia agentului de
reticulare. Membranele colagenice SMC sunt reticulate cu 0,1% glutaraldehidă.
Membranele de colagen sunt utilizate şi ca sisteme transdermice de
cedare de medicamente pentru tratarea ţesutului infectat. Astfel de sisteme de
administrare a medicamentelor sunt mai confortabile şi mai sigure decât alte
tratamente convenţionale ca picături, unguente şi injecţii subconjunctive zilnice.
Medicamentele pot fi înglobate în membrane colagenice prin legături de
hidrogen, legături covalente sau simplă înglobare. Membrana colagenică
acţionează ca un rezervor (depozit), în care medicamentele sunt înglobate în

203
interstiţii şi apoi absorbite gradat prin porii pielii în fluidele fiziologice şi în
sânge.

3.2.2.2. Membrane colagenice cu inserţie textilă

În chirurgia abdominală modernă, pentru repararea herniilor sunt

utilizate două modele de implant sub formă de plase textile din fibre sintetice: cu
pori mici, mai grele şi cu pori mari, mai uşoare.
La utilizarea plaselor textile fabricate din fibre sintetice, deşi sunt
considerate inerte din punct de vedere biologic, totuşi s-a constatat apariţia unor
complicaţii post operatorii legate de formarea aderenţelor.
Acoperirea plaselor cu polimeri naturali biocompatibili, în special cu gel
de colagen, este un procedeu în curs de definitivare, prin care plasele devin mai
biocompatibile, asigurând proprietăţile mecanice şi biologice specifice pentru
un implant de perete abdominal. Pelicula de colagen formată pe suprafaţa plasei
împiedică aderenţele de ţesut şi asigură o integrare mai rapidă a implantului în
ţesuturile adiacente.
Pe plan naţional s-a realizat plasa textilă colagenată, denumită
PLASCOL, în care membrana de colagen acoperă integral plasa textilă din
fibre poliesterice şi proteza vasculară textilă colagenată COLARTEX, unde
membrana de colagen este depusă pe suprafaţa exterioară a protezei textile
tubulare [110-112].
Pentru a asigura o permeabilitate redusă la fluidele fiziologice, în special
la sânge, acest tip de membrane colagenice sunt formate din 3 straturi. Testate in
vitro în condiţii dinamice ce simulează presiunea sângelui (120 mm Hg),
membranele sunt impermeabile (rezistă 24 h) (Tabelul 3.9).

Tabelul 3.9. Caracteristicile hidrofile ale membranelor

Denumirea probei Grosime Permeabilitate Absorbţie de Permeabilitate

mm la vapori de apă vapori de apă, la apă în
mg/24 h, 20°C % condiţii
24 h 72 h dinamice
Plasă PLASCOL 0,33 90 6,22 3,22 rezistă 24 h
Proteză vasculară 1,19 88 8,47 4,91 rezistă 24 h
COLARTEX

204
 Deşi sunt impermeabile la apă, totuşi aceste membrane multistratificate
sunt suficient de hidrofile pentru a se gonfla, formând un suport chemotactic
pentru celulele ţesutului înconjurător protezelor PLASCOL şi COLARTEX.
Rezultatele analizei porozimetrice pun în evidenţă schimbările care apar
după hidratarea acestor membrane în distribuţia şi dimensiunile porilor [109].
Astfel, în stare uscată predomină porii cu diametre de 0,2 – 0,01µm (41%).
După imersie în apă timp de 30 de minute, diametrul porilor predominanţi se
micşorează de aproape 10 ori, respectiv 0,01 - 0,009µm. De asemenea, suprafaţa
specifică de pori se micşorează de la 9,88 m2/g iniţial la 1,35 m2/g.
Aceste rezultate şi faptul că membrana colagenică depusă pe proteza
textilă nu se desprinde după gonflare, arată o structură compactă compozită.

3.2.3. Matrici colagenice

După cum s-a menţionat, aplicarea procedeului de uscare prin liofilizare

a gelurilor şi soluţiilor de colagen conduce la obţinerea de bureţi spongioşi cu
structură macro, micro şi nanoporoasă. În acest sens, materialele colagenice pot
fi considerate biospume, xerogeluri sau aerogeluri. Specific unei astfel de
structuri este greutatea specifică foarte mică cca. 0,02 g/cm3.
De asemenea, proprietăţile hidrofile reprezentate prin absorbţia de apă şi
vapori de apă sunt caracteristice pentru matricile de colagen, acestea putând
absorbi apa până la 3000%. Se pot obţine matrici cu diferite compoziţii şi
caracteristici adaptate domeniului de utilizare: biomateriale scaffold, implanturi
drug delivery şi substituenţi de ţesut ( piele, cartilaj, os) [113-122].
Varietatea mare de matrici se realizează prin formarea de compozite la
nivel micro şi nanostructural, atunci când componentele adăugate în gelul
colagenic nu depăşesc 30-40%; la un procent mai mare din componentele
polimerice sau anorganice, matricea compozită pierde din proprietăţile specifice
colagenului şi apar separări de faze în timpul liofilizării.
Solubilitatea matricilor colagenice in vitro sau in vivo se reglează prin
reticulare în special cu aldehide, prin grefare sau formare de complecşi
intermoleculari.
Printre primele matrici colagenice realizate este şi un produs românesc
denumit PANCOL, care se utilizează ca pansament bioactiv pentru tratarea
arsurilor pielii [123]. Această matrice colagenică este nereticulată, solubilă în

205
mediul fiziologic, în acest sens reprezentând şi un aport suplimentar de proteină
necesar refacerii ţesutului conjunctiv al pielii.
Biomaterialele pe bază de matrici colagenice s-au dezvoltat într-un ritm
accelerat, solicitat de domeniul medicinei regenerative, care are nevoie de o
gamă mai largă de implanturi, substituenţi de ţesut şi proteze. Consultarea
literaturii de specialitate evidenţiază amploarea cercetărilor şi aplicaţiile în acest
domeniu.
În continuare vor fi prezentate mai detaliat bioprodusele pe bază de
matrici colagenice realizate pe plan naţional, care se află în faza de expe-
rimentare clinică şi de avizare pentru fabricaţie [124-132]. Matricile colagenice
prezentate sunt realizate cu diferite grade de solubilitate şi de bioresorbţie,
necesare pentru aplicarea lor ca scaffold pentru culturi de celule sau substituenţi
de ţesut.

3.2.3.1. Caracteristicile matricii colagenice tip AMATCOL

Structura morfologică a matricei de colagen, deşi este asemănătoare unui

burete spongios, este diferită de aceasta prin multitudinea nivelelor structurale
care participă la formarea micro şi nanoporilor (molecule de colagen, fibrile,
fibre) [133].

a) b)
Figura 3.9. Structura morfologică a matricei de colagen analizată prin microscopie:
a) optică; b) electronică

În matricile colagenice compozite structura morfologică poate fi mai

densă sau compactă în funcţie de natura şi procentul componentei adăugate.
De asemenea, capacitatea de rehidratare a matricilor colagenice prin
imersie în apă sau prin expunere la vapori de apă este influenţată de parametrii
menţionaţi mai sus. S-au efectuat studii privind influenţa hidratării cu vapori de
206
apă asupra stabilităţii termice a matricilor colagenice, proprietate importantă
pentru aplicaţii in vivo.
Hidratarea matricei colagenice s-a efectuat cu vapori de apă saturaţi, la
20°C, variind timpul de hidratare de la 17 la 262 ore. Modificările umidităţii
absorbite de matricea colagenică au fost urmărite în timp, pentru a stabili
capacitatea maximă de hidratare şi timpul necesar atingerii echilibrului de
hidratare (figura 3.10).

180
160
140
Umiditate, %

120
100
80
60
40
20
0
0 40 80 120 160 200 240 280 320 360
Timp, ore

Figura 3.10. Capacitatea de hidratare cu vapori de apă

a matricei colagenice

Matricea cu umiditate de 116% a devenit uşor umedă, iar structura

microporoasă a pierdut din elasticitate: la umiditate de 126% matricea poate fi
considerată ca un cvasisolid. Utilizată in vivo ca implant scaffold sau ca suport
3D în mediu de cultură de celule, matricea se rehidratează ajungând la un
conţinut de apă apropiat de cel existent în ţesutul viu (70 – 80% în piele) [122].

Tabel 3.10. Dimensiunea porilor (diametrul – d) şi densitatea porilor (n) pentru

cele cinci tipuri de matrici

Probă Umiditatea Permeabilitatea dmin dmax dmediu Numărul

matricei fluxului de azot, (µm) (µm) (µm) mediu de
(%) Lp pori
(L.min-1. cm-2) nx109,
(pori.cm2)
P1 30 27 0.880 2,776 2,050 7,89
P2 50 29 0.859 2,226 2,029 4,45
P3 80 37 0,927 8,771 6,779 11,7
P4 116 28 0,150 0,546 0,532 58,2
P5 160 17 1,067 1,067 0,859 45

207
 Influenţa hidratării asupra structurii morfologice a matricei colagenice
s-a determinat şi prin analiză porozimetrică cu ajutorul porometrului de lichid.
S-a determinat dimensiunea şi numărul mediu de pori şi permeabilitatea
gazodinamică, prin flux de azot.
Se constată din rezultatele prezentate în tabelul 3.10, că matricea
colagenică cu umiditate 80% (P3) are permeabilitatea gazodinamică a azotului
cea mai mare, de 37 L / min.cm2 şi diametrul mediu al porilor de 6,7 µm. Pentru
valori ale umidităţi mai mici, (30 şi 50%), atât diametrul mediu al porilor cât şi
permeabilitatea azotului, au valori comparabile de 2,05 µm – 2,03 µm şi
respectiv 27 L / min.cm2 – 29 L / min.cm2. Cu creşterea umidităţii la valori de
peste 80% (150 – 160%), atat permeabilitatea cat şi mărimea porilor scade.
Cu excepţia probei P3 distribuţia mărimilor porilor are un caracter
gaussian, similare membranelor de microfiltrare (figurile 3.11 şi 3.12)

Figura 3.11. Distribuţia mărimii porilor Figura 3.12. Distribuţia densităţii

pentru proba P2 superficiale de pori pentru proba P1

În concluzie, atât permeabilitatea azotului cât şi diametrul mediu al

porilor prezintă un maxim pentru proba de matrice cu umiditatea de 80%.
După cum se ştie permeabilitatea fazelor printr-un polimer hidrofil este
influenţată pozitiv de absorbţia de apă, deoarece aceasta creşte volumul liber al
matrixului polimeric. Apa acţionează structural prin absorbţia ei la grupele
polare ale moleculei de colagen urmată de formarea clusterului şi creşterea
volumului liber intercatenar, cu atât mai mult cu cât umiditatea relativă este mai
mare.
Cu predilecţie moleculele de apă se structurează pe suprafaţa moleculelor
de colagen de-a lungul axei acestora, prin legare mai întâi la grupele polare
laterale şi apoi prin intermediul legăturilor dipol – dipol ale apei. Astfel, apa
structurată formează un înveliş electroconductiv, care transformă şi transportă
informaţiile schimburilor mecanice şi ionice şi influenţează prin acţiune

208
chemotactică celulele fibroblaste, în sensul aderării şi dezvoltării lor în matricea
AMATCOL.
Hidratarea matricei la cca. 80 – 100% umiditatea se poate realiza ad-hoc,
prin imersie în mediul de cultură sau în ser fiziologic, înainte de implantare in
vivo ca biomaterial; structura morfologică a matricei permite această comportare
de cvasisolid.

Comportarea reologică a matricelor colagenice la fluaj

Matricile colagenice au aspect buretos şi prezintă elasticitate, deformaţie

întârziată, precum şi deformaţie permanentă (curgere). Pentru a stabili
comportarea vâscoelastică, s-a determinat comportarea la fluaj la temperatura
22°C la o tensiune mică de numai 100 gf/cm2.
Pentru calculul comportării vâscoelastice se utilizează ecuaţia reologică
de stare dată de modelul Alfrey, constituit din legarea în serie a unui model
elementar elastic cu modulul de elasticitate E1 din modelul Voigt-Kelvin (model
constituit dintr-un model elementar elastic şi unul elementar vâscos legate în
paralel, caracterizat prin timpul de întârziere) şi cu un model elementar vâscos
cu coeficientul de vâscozitate η3 [134]:
τ τ   t  τ ’
ε= + 1 − exp −  + t (1)
E1 E2   θ  η3
unde:
ε = deformaţia totală;
τ = tensiunea aplicată (100 gj/cm3);
E1 = modulul de elasticitate (Young) pentru contribuţia modelului elementar elastic;
E2 = acelaşi modul pentru contribuţia modelului elastic la modelul Voigt – Kelvin;
θ = timpul de întârziere;
η3 = contribuţia deformaţiei permanente sau a curgerii la comportarea vâscoelastică.

Utilizând această ecuaţie, s-au determinat valorile E1, θ, η3 care

caracterizează comportarea vâscoelastică a matricei considerate. Din deformaţia
relativă instantanee, apreciată a avea valoarea 0,15, s-a determinat pentru
modulul de elasticitate valoarea 667 gf/cm3. Contribuţia deformaţiei întârziate
(deformaţie care se produce în timp), exprimată sub forma timpului de întârziere
(care reprezintă 68% din deformaţia relativă întârziată totală egală cu 0,0148), are
valoarea de 15s. Contribuţia deformaţiei permanente η3, calculată la 5 minute

209
după îndepărtarea tensiunii, este pentru matricea colagenică de 352940 gf.s/cm2.
Matricea este omogenă şi relativ moale, de aceea deformaţia instantanee nu s-a
putut determina, ci s-a apreciat din curba de fluaj (figura 3.13).

0.20

0.15
Deformatie relativa

0.10

0.05

0.00
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Timp, min

Figura 3.13. Curba de fluaj şi revenire pentru matricea

colagenică AMATCOL

Analiza reologică prin curbele de fluaj a matricei colagenice, demon-

strează o comportare vâscoelastică specifică, de cvasisolid caracterizată printr-un
model reologic compus tip Kelvin – Voigt [116].
S-a studiat influenţa hidratării asupra stabilităţii termice a matricilor
colagenice AMATCOL. În figura 3.14. sunt reprezentate curbele TG, DTG şi
DTA obţinute la analiza termică a matricei cu umiditate (U) = 21,74%. Curbe
similare au fost obţinute şi pentru celelalte probe de matrici cu umidităţi
cuprinse între 30 şi 80%; aceste termograme sunt similare cu cele raportate
anterior, pentru colagen sau probe de piele [122].
Analiza termogramelor arată că la degradarea termică a colagenului
hidratat, în domeniul 20°C – 400°C, au loc două procese succesive în care se
formează produşi volatili. Primul proces, notat cu I, este endoterm şi are loc în
domeniul de temperatură 25°C – 125°C. Acest prces a fost atribuit deshidratării
colagenului [122]. Al doilea proces, notat cu II, este exoterm şi constă în
descompunerea şi termo-oxidarea colagenului deshidratat, ce are ca rezultat
formarea de compuşi volatili cu masa moleculară mică.

210
 II

100
%∆m
EXO
DTA

80
ENDO
I
II
60

II
DTG
40

20 TG

0
50 100 150 200 250 300 350 400
T/0C

Fig. 3.14. Termograma (ansamblul curbelor TG, DTG si DTA) probei U=20,74

Figurile 3.15. şi 3.16. prezintă comparativ curbele DTG si DTA

caracteristice probelor analizate, iar tabelul 3.11 listează parametrii proceselor
I şi II.
d%∆m/dT
1.0 80.03%

0.9

0.8 60.30%

0.7

0.6

0.5
31.12% 21.74%
0.4

31.12%
0.3

0.2

60.30%
0.1 21.74%
80.03%
0.0

50 100 150 200 250 300 350

T/0C

Figura 3.15. Curbele DTG caracteristice probelor de colagen analizate

211
 ∆ T /m s 8 0 .0 3 %
0 .0 5 u n i t a t i r e la t iv e
II

II
0 .0 4 6 0 .3 0 %

0 .0 3 I II
3 1 .1 2 %
0 .0 2 II
I
I
0 .0 1 2 1 .7 4 %

I
0 .0 0

50 100 150 200 250 300 350 400

T /0 C

Fig. 3.16. Curbele DTA caracteristice probelor de colagen analizate

Tabelul 3.11. Parametrii degradarii neizoterme a probelor de colagen hidratat (seria II)

U, % ∆m125 ∆m125
u I
Tmax ( DTG ) Tmin
I
( DTA) II
Tmax ( DTG ) ∆m350
u
∆m400
u

% % °C °C °C % %
21,74 19,30 23,94 48 47 ≈ 277 49,37 58,22
31,12 18,52 22,73 50 50 ≈ 273 39,06 46,53
60,30 32,02 47,11 53 53 ≈ 266 44,21 53,30
80,03 38,05 61,42 56 56 ≈ 263 39,99 43,61

∆m125 = pierderea procentuală de masă în procesul I, până la 125°C, raportată la

masa probei
∆m125
u
= pierderea procentuală de masă în procesul I, până la 125°C, raportată
la masa probei deshitratate
I
Tmax ( DTG ) = temperatura maximului DTG, caracteristic procesului I
I
Tmin ( DTA) = temperatura minimului DTA, caracteristic procesului I
II
Tmax ( DTG ) = temperatura maximului DTG, caracteristic procesului II
∆m350 − ∆m125 ∆m400 − ∆m125
∆m350u
= × 100 ; ∆m400
u
= × 100 , unde ∆m350 si
100 − ∆m125 100 − ∆m125
∆m400 sunt pierderile de masa la 350°C şi respectiv 400°C.

Din tabelul 3.11 şi figurile 3.14 – 3.16 rezultă că parametrii proceselor

I şi II depind de gradul de hidratare al colagenului.

212
 Pentru procesul de deshidratare (procesul I), se constată urmatoarele:
- pentru probele U=21,74% si U= 31,12%, masele de apă desorbită până la
125°C sunt practic egale;
- pentru probele U= 31,12%, U = 60,30% şi U=80,03%, masa de apă
desorbită până la 125°C creşte progresiv cu gradul de hidratare;
- temperaturile caracteristice maximului DTG sunt practic egale cu cele
caracteristice minimului DTA şi cresc progresiv cu gradul de hidratare a
colagenului;
- viteza procesului de deshidratare creste cu gradul de hidratare iniţial.
Rezultă că, o dată cu creşterea gradului de hidratare, creşte şi cantitatea
de apă slab legată de colagen;
Pentru procesul de degradare termo-oxidativă (procesul II), se constată
următoarele:
- pierderea de masă, raportată la masa de „colagen uscat”, depinde de
gradul de hidratare iniţial;
- viteza de degradare termo-oxidativă maximă o prezintă proba
U=21,74%, iar pentru T ≥ 2700C, viteza de degradare scade cu gradul de
hidratare;
- curbele DTG şi DTA prezintă o serie de rugozităţi, ceea ce arată că prin
deshidratarea colagenului rezultă un material cu structura heterogenă;
- temperatura maximului principal DTG scade uşor cu gradul de hidratare
iniţial;
- pentru curbele DTA, atât aria care este proporţională cu căldura degajată,
cât şi amplitudinea care este proporţională cu viteza procesului de termo-
oxidare, depind de gradul de hidratare;
Dependenţa amplitudinii curbelor DTA de gradul de hidratare este
similară cu cea rezultată din analiza curbelor DTG.
Din cele aratate mai sus rezultă că, atât sistemul colagen-apă, cât şi
„colagenul uscat” rezultat prin deshidratare, prezintă structuri dependente de
gradul de hidratare iniţial. Modificări ale gradului de hidratare determină
modificări semnificative ale stabilităţii hidrotermice şi ale stabilităţii la termo-
oxidare a colagenului.
În figurile 3.17 – 3.19. sunt prezentate curbele DSC (flux termic funcţie
de temperatură) obţinute la analiza probelor de matrici colagenice, efectuată în
aer, imersate în apă şi în curent de azot.

213
 DSC /(mW/mg) Flow /(ml/min)
↑ exo
-0.1
300
-0.2

-0.3 250

-0.4
87.7 °C 200
-0.5
-23.11 J/g
-0.6 150
[1.3] Colagen-martor-25--50-120-Ar-creuzete inchise.sd3
DSC
-0.7 Flow (purge1)
Flow (protective) 100
[1.3]
-0.8 [1.3]

-0.9 50
[1.3]
-1.0
94.0 °C 0
-40 -20 0 20 40 60 80 100
Temperature /°C

Figura 3.17. Curba DSC a matricii de colagen, în aer

DSC /(mW/mg)
↑ exo
0.6 [1]

0.4
-36.24 J/g

0.2
41.3 °C

0.0

-0.2
[1] Colagen-martor-cr-Al-apa-10-25-110.dd3
DSC
-0.4

-0.6

-0.8 44.2 °C

40 45 50 55 60 65 70
Temperature /°C
Administrator 2007-05-21 07:43 Main
Instrument: NETZSCH DSC 204 F1 File: E:\DSC\Probe\Fisiere masuratori neprelucrate\colagen\Colagen-martor-cr-Al-apa-10-25-110.dd3 Remark: aer-static

Figura 3.18. Curba DSC a matricii de colagen, imersate în apă

214
 DSC /(mW/mg) Flow /(ml/min)
↑ exo
[1]
-0.5
-526.8 J/g -156.6 J/g
-11.36 J/g 300

-1.0 217.8 °C
250
294.7 °C 317.0 °C

-1.5
200

[1] Colagen-martor-cr-capac-gaurit-10-25-570-N2.dd3
-2.0 DSC 150
Flow (purge1)
Flow (protective)

-2.5 100
[1]

-3.0 50
[1]

62.7 °C
-3.5 0
100 200 300 400 500
Temperature /°C
Administrator 2007-05-21 09:51 Main PTM1-10-20-900-Ar.ngb

Figura 3.19. Curba DSC a matricii de colagen, în curent de azot

Prin integrarea fiecărei curbe DSC, s-a evaluat entalpia procesului de

denaturare, care a fost apoi raportată la masa probei analizate (Tabelul 3.12) .

Tabelul 3.12 Parametrii proceselor puse în evidenţă prin metoda DSC

DSC aer DSC apă DSC N2

Deshi- topire descompunere
dratare
Material Tinitial Tmin − ∆H Tinitial Tmin − ∆H Tmin Tmin − ∆H Tmin − ∆H
0
C 0
C J.g-1 0
C 0
C J.g-1 0
C 0
C J.g-1 0
C J.g-1
Colagen 87,7 94,0 23,11 41,3 44,2 36,24 62,7 217,8 11,36 294,7 156,6
martor 317,0
Tinitial = temperatura extrapolată la care începe procesul
Tmin = temperatura minimului endoterm DSC
∆H = entalpia procesului

Din datele obţinute se constată că, atât în aer, în apă cât şi în curent de
azot, procesul global de denaturare ce are loc la încălzirea progresivă a fiecărei
matrici colagenice este endoterm. Din curbele din figurile 3.17 – 3.19, apare că
denaturarea în apă are loc la temperaturi mai joase decât denaturarea în aer sau
azot. Temperatura Tiniţial pentru DSC în apă coincide cu temperatura de
contracţie.
Matricile colagenice sunt utilizate ca biomateriale scaffold pentru culturi
de celule fibroblaste şi substituenţi de piele. În tratarea diferitelor leziuni ale
pielii, intervin complicaţii datorate infectării rănilor. Pentru evitarea acestui
215
pericol, în matricile colagenice se introduc antibiotice şi alte medicamente, care
sunt cedate gradat în decurs de 48 de ore. Scopul cedării locale este menţinerea
unei concentraţii mari de medicament, fără efecte toxice. În acest caz, colagenul
are şi rolul de protector pentru ţesuturile lezate.
Încorporarea medicamentelor se face înainte de operaţia de liofilizare, în
concentraţii de 0,1 – 5%, în funcţie de compoziţia şi modul de acţiune al fiecărui
medicament sau alt compus bioactiv, de exemplu factori de creştere celulari.
Astfel, s-au realizat matrici colagenice cu 1-3% gentamicină, captopril,
estradiol, diclofenac [109]. S-a studiat profilul maselor de cedare in vitro, în ser
fiziologic, a medicamentelor conţinute în matricile colagenice preparate la
pH-uri diferite şi concentraţii variabile de medicament. S-au corelat rezultatele
obţinute cu proprietăţile morfostructurale ale matricilor, reprezentate de
porozitate şi proprietăţile hidrofile, pentru determinarea modelului de interacţie
a colagenului cu medicamentele şi pentru stabilirea concentraţiei optime pentru
imobilizarea acestora în matrici [126, 127]. Pentru a se asigura o cedare
constantă a medicamentelor din matricile de colagen, acestea trebuie să conţină
0,2% diclofenac, 0,1 – 0,2% gentamicină [109].

3.2.3.2. Caracteristicile matricilor colagenice compozite

Din gama largă de matrici colagenice compozite, se remarcă cele care

conţin componente anorganice, mai puţin utilizate pentru aplicaţii medicale.
Aceste componente sunt aerogelurile de TiO2 şi SiO2 şi silicaţi naturali
modificaţi.
Compozitele binare şi ternare realizate între aceşti compuşi şi colagen
sunt realizate pe plan naţional după procedee Know-How. Matricile compozite
binare cu aerogel de TiO2 (TIABIS) sau silicat natural (NANOCOLASIL),
precum şi compozitele ternare (COLTER) sunt în fază de testare biologică in
vitro şi experimentare clinică ca substituenţi de ţesut osos [63, 135-138].
Spectroscopia FT-IR a matricilor TIABIS relevă predominarea structurii
helicoidale specifică colagenului. Integritatea structurii colagenice de triplu
helix este dovedită prin raportul dintre benzile de absorbţie de la 1235 cm-1
(Amidă III) şi cea de la 1451 cm-1 (deformare CH3), I 1235/1451 > 1 [119].
Benzile Amida I, datorate concentraţiei mari de TiO2 şi SiO2 dispar prin
hidratarea aerogelului, de la 20 la 50% umiditate. Legăturile de hidrogen,
formate prin intermediul apei ordonează structura colagenului din aerogelurile
compozite (fig. 3.20) .
216
 A m id e II I A m id e I I A m i d e I A m id e III A m id e II A m id e I

3 2 .3 %

3 2 .3 %

Absorbance
Absorbance

1 3 .3 %

12 %
12 %

3 .5 %
1 1 .9 %
T I A B I S m a t r ic e
T I A B I S m a t r ic e

800 1000 1200 1400 1600 1800

800 1000 1200 1400 1600 1800

b)
-1
W avenum ber / cm
a)
-1
W avenum ber / cm

Figura 3.20. Spectrele FT-IR a aerogelului TIABIS ME1:

a) iniţial, b) hidratat 24 ore

Matricile TIABIS cu aerogel de SiO2 au o tendinţă mai mare de a reţine

apa, pe măsură ce creşte concentraţia de SiO2; se amplifică banda Amida A
(3.400 cm-1) corespunzătoare apei nelegate.
Analiza prin difracţie de raze X a demonstrat faptul că matricile TIABIS
sunt structuri amorfe care păstrează ordonări atomice locale specifice.
Difractograma matricei de colagen martor indică existenţa unei ordonări locale
bine conturate (1,74 - 2,12 Å şi 3,04 - 3,64 Å) (figura 3.21).
Introducerea componentei anorganice de TiO2 modifică ordonarea locală
în matricile TIABIS atunci când procentul de TiO2 depăşeşte 10%.

3 O -O 4.59
Ti - O 3 .0 8 ( a - rutil )
c o la g e n
2 1 .9 8 (m a rto r)

3 .6 4
1
functia RDF

T iO 2-am o rf

-1

-2 C o lag en + 10% TiO 2

-3
1 .5 2 .0 2 .5 3 .0 3 .5 4 .0 4 .5 5 .0
d is tan ta in s p a tiu l re a l R [ A ]

Figura 3.21. Funcţia de Distribuţie Atomicã Radialã (Radial Distribution Function),

G(R), pentru cele trei sisteme investigate,
funcţie de distanţa în spaţial real exprimatã în Å

217
 Proprietăţile hidrofile ale ME de aerogeluri de TIABIS sunt reprezentate
de permeabilitatea la vapori de apă şi de absorbţia de apă şi vapori de apă,
parametrii dependenţi de structura morfologică şi chimică a acestora (figura
3.22).

Figura 3.22. Proprietăţile hidrofile ale matricei TIABIS

în funcţie de concentraţia în TIO2

Matricea colagenică compozită NANOCOLASIL care conţine 20%

silicat natural modificat, prezintă cele mai bune proprietăţi hidrofile, comparativ
cu matricea TIABIS şi matricea colagenică: 18,80% absorbţie de vapori de apă
după 24 de ore, faţă de 13,20 - 17,80% pentru matricea TIABIS şi 18,55% în
cazul matricei colagenice.
Deşi matricea NANOCOLASIL are o structură cu pori mai mari,
hidrofilia accentuată se datoreşte absorbţiei suplimentare de apă de către
silicatul natural, care a fost modificat cu geluri sau hidrolizate de colagen [135].
Matricile colagenice compozite ternare au la rândul lor un domeniu
foarte vast de aplicaţii, datorită combinaţiilor care se pot face între componenţii
anorganici şi cei formaţi din polimeri naturali sau sintetici [136-138].

218
a) b)

Figura 3.23. Analiza termogravimetrică a matricilor colagenice compozite cu:

a) aerogel TiO2 şi b) silicat natural modificat

Prin introducerea de componente anorganice (ceramici, biovitroceramici,

aerogeluri de TiO2 şi SiO2, silicaţi naturali) sau polimeri sintetici creşte
stabilitatea termică a matricei colagenice, conform analizei termice prezentate
în figura 3.23 [136].

3.2.4. Fibre de colagen

Din gelurile / soluţiile de colagen se obţin fibre prin procedeul de

restructurare şi uscare prin liofilizare. De fapt se obţine un văl fibros (fibre
individuale şi aglomerării de fibre), care poate fi denumit şi colagen fibros, după
cum se reliefează în figura 3.24.

Figura 3.24. Fibre de colagen

219
 Datorită structurii tridimensionale specifice pielii, nu se pot obţine fibre
lungi, individuale, ci fibre scurte şi fascicole de fibre cu grosimi diferite (figura
3.25). Prin tanare cu formaldehidă fibrele sunt mai bine individualizate (figura
3.26).

Figura 3.25. Fibra din colagen netanat Figura 3.26. Fibre de colagen tanate cu
(mărire 40x) formaldehidă (mărire 40x)

La microscopul electronic se observă subunităţile fibrei, respectiv fibrile

de colagen. Fibrele de colagen precipitate dintr-o soluţie de colagen de
concentraţie 0,2% au fost studiate la microscopul electronic TEM prin
contrastare dublă cu acid fosfowolframic şi acetat de uranil.

Figura 3.27. Fibrile de colagen separate la pH izoelectric (mărire 45000 x)

După cum se observă din figura 3.27. fibrilele de colagen sunt lungi,
dense, destul de uniforme ca grosime şi formează aglomerări sub formă de
noduri. De asemenea, se observă pe unele porţiuni ale fotografiei, tendinţa de
înfăşurare helicoidală a fibrilelor. Fibrele sunt elastice, ceea ce permite
încovoieri sub diverse forme, cele mai frecvente fiind acelea sub formă de
semicerc.

220
 Fibrele colagenice sunt produse pure ce conţin 98% proteină colagenică
(tabelul 3.13).

Tabelul 3.13. Caracteristicile fizico-chimice ale fibrelor de colagen

Caracteristici Fibre de colagen Fibre de colagen tanat

netanat cu formaldehidă
Aspect fibros fibros
Culoare alb-gălbui alb-gălbui
Umiditate, % 15,0 15,0
Conţinut în azot total *, % 17,5 17,45
Substanţă proteică *, % 98,0 98,0
Substanţe minerale *, % 1,0 1,0
Capacitate de absorbţie
Apa la 37 oC Parţial solubil Gonflare parţială
Acid acetic 0,5M Parţial solubil Gonflare partial
*
Valori calculate la liber de umiditate.

Fibrele de colagen se utilizează ca semipreparat standard, pentru

realizarea de produse pe bază de colagen de uz medical, farmaceutic şi cosmetic.
Fibrele de colagen tanat cu formaldehidă sunt utilizate ca suport pentru analize
biochimice, culturi de celule şi inserţii fibroase în matrici colagenice [11].

3.2.5. Bioproduse pe bază de hidrolizate colagenice

Hidrolizatele de colagen nu constituie o formă finală de bioprodus

colagenic. Sunt semipreparate utilizate în principal ca substanţe biologic active
în produse farmaceutice şi cosmetice şi ca biostimulator pentru animale şi
plante, prin doparea hidrolizatelor cu microelemente. Soluţiile de hidrolizate de
colagen pot fi dopate cu oligoelemente într-o varietate mare de compoziţii.
Prin oligoelement se înţelege orice element din materia vie care se
găseşte în concentraţie mai mică de 0,01% greutate substanţă uscată în corpul
uman. Proporţia acestor elemente este mică în celula vie, deoarece au greutate
moleculară foarte mică, raportată la cea a proteinelor.
În prezent există numeroase publicaţii care abordează problema
elementelor constituente ale organismelor vii, prezente în cantităţi foarte mici şi
a căror rol este de catalizator (Cu, Zn, Co, Mn, Mo, Cd, Cr etc.) [139]. În
organism, oligoelementele se găsesc sub formă de complexe cu molecule mici
221
sau proteine (specifice sau nespecifice), mult mai rar sub formă de ioni liberi sau
integraţi prin legături covalente.
Pentru obţinerea de complecşi formaţi din polipeptide şi sărurile
anorganice ale oligoelementelor esenţiale se folosesc ambele tipuri de
hidrolizate acide (HA) sau neutre (HO) [140-143]. Efectele bioproduselor
colagenice cu efect biostimulator sunt prezentate în capitolul 4.

Compuşi tensioactivi pe bază de hidrolizate colagenice

Numeroase studii au vizat valorificarea proprietăţilor de coloid protector,

specifice colagenului, hidrolizatelor de colagen cu greutăţi moleculare sub
20000 Da. Au fost stabilite condiţiile de compatibilitate a diverselor tipuri de
surfactanţi, atât cu soluţiile de hidrolizate, cât şi cu gelurile de colagen, în scopul
utilizării acestor complecşi în şampoane şi emulsii cosmetice şi farmaceutice.
[144-146]. Hidrolizatele acide cu greutăţi moleculare sub 1000 Da au fost
folosite pentru obţinerea de detergenţi, prin cuplarea peptidelor cu acizi graşi cu
diferite structuri chimice [144, 145].
Printre ele se remarcă încercările pe bază de esteri ai aminoacizilor şi
peptidelor din proteine cu alcooli primari sau secundari, prin acilarea peptidelor
şi polipeptidelor sau prin cuplarea la azotul aminic al esterilor sau eterilor
halohidrinelor rezultate prin tratarea cu epiclorhidrină a acizilor graşi, în mediu
bazic. De asemenea, s-a studiat clorurarea acizilor graşi cu clorură de tionil,
reacţia de cuplare desfăşurându-se după un mecanism de substituţie nucleofilă,
la 50-55°C. Se obţin randamente bune în cazul în care concentraţia în hidrolizat
nu este mai mare de 25-30%. S-a constatat o influenţă puternică a gradului de
hidroliză a proteinelor asupra proprietăţilor produsului final. Pentru realizarea
unei reacţii avansate de cuplare, valoarea gradului mediu de polimerizare a
polipeptidelor trebuie să fie de 3-4 aminoacizi.
În funcţie de masa moleculară medie, frecvenţa grupelor amino reac-
ţionabile variază sensibil. Cu cât masa moleculară a peptidelor este mai mare,
numărul de grupări aminice care pot fi angajate în reacţie este mai mic, clorura
acidului gras participând într-o cantitate mai mică la cuplare şi proprietăţile
finale ale produsului sunt necorespunzătoare utilizării ca agent tensioactiv [147-
151].
Au fost realizate produse tensioactive biodegradabile obţinute prin
cuplarea peptidelor din hidrolizate acide cu fosfolipide. Aceşti complecşi
colagen – fosfolipide (FL-P) pot fi utilizaţi în:
222
 - industria farmaceutică şi de medicamente: ca adaos în diverse produse
farmaceutice; se recomandă în special lecitina din gălbenuşul de ou, ce conţine
şi alţi complecşi bioactivi valoroşi α, β, γ - lecitine, biotina. Prin conţinutul de
colină şi inozitol, lecitinele înlesnesc metabolizarea grăsimilor şi colesterolului
din ficat, ca şi metabolismul carbohidraţilor. Bioprodusele FL-P acţionează ca
agenţi emulsifianţi ai tuturor elementelor hranei în traiectul intestinal, înlesnind
absorbţia. Colina din lecitina complexului este o sursă de grupe metil labile şi
lecitina bine purificată de colesterol poate avea efect lipotropic în tratamentul
hipercolesteromiei, arterosclerozei şi psoriazisului. De asemenea, lecitina din
complex este un factor esenţial în prevenirea degenerării grase a ficatului;
asigură o mai bună utilizare a vitaminelor liposolubile (A, D) în corp, este bun
stimulator hepatic, al memoriei (sursă de acetilcolină), cardiovascular,
neurologic şi al pielii. Se utilizează ca stabilizator şi agent de uscare a
suspensiilor de antibiotice;
- în cosmetică aceşti complecşi FL-P acţionează ca emulgatori,
stabilizatori, agenţi de penetrare şi emoliere. Multe formule cosmetice pentru
creme, loţiuni, şampoane, briantine, uleiuri de păr, rujuri conţin complecşi FL-P.
În cremele de ras se adaugă cca. 1% lecitină din complex ca agent de înmuiere şi
stabilizator de spumă. Efectul emolient este evident în săpunurile solide şi
lichide. De asemenea, acţionează ca un tampon asupra alcalinităţii săpunurilor,
cu efect antispumă şi antioxidant;
- industria alimentară: adăugaţi în produsele de panificaţie 0,1 – 0,3%
contribuie la păstrarea umidităţii şi prospeţimii; în proporţie de 0,3 – 1% în
dulciuri realizează o distribuţie uniformă a grăsimilor în caramele, nuga,
ciocolată, îngheţată precum şi o reducere a vâscozităţii, îmbunătăţirea texturii,
un adaos de 1-3% (raportul de lecitină din complex) au rol de agent de umezire
şi dispersie, de sursă calorică, aducând aport de fosfor organic;
- industria chimică: se utilizează în industria de lacuri şi vopsele,
cerneluri, coloranţi; în industria petrolieră la accelerarea uscării produselor,
stabilizator al emulsiilor şi suspensiilor, prevenirea coroziunii. Caracterul
antioxidant se manifestă chiar la concentraţii mici 0,25 – 0,5%; se pot folosi
împreună cu antioxidanţi fenolici.
Proprietăţile cicatrizante ale colagenului sunt valorificate eficient prin
utilizarea hidrolizatelor de colagen cuplate cu vitamine şi antioxidanţi (din
extracte vegetale), în cremele şi unguentele cu efect de protecţie solară şi
radioprotecţie. Gama de produse este foarte diversă şi provine atât din
compoziţia produselor, cât şi din procedeele de fabricaţie a cremelor şi
emulsiilor [151-153].
223
 BIBLIOGRAFIE

1. Mikos, A.G., Sarakinos, G., Leite, S.M., Vacanti, J.P., Langer, R.,
Biomaterials, 1993, 14, 323.
2. Mooney, D.J., Baldwin, D.F., Suh, N.P., Vacanti, J.P., Langer, R,
Biomaterials, 1996, 17, 1417.
3. Cima, L.G., Vacanti, J.P., Vacanti, C., Inger, D., Mooney, D., Langer, R.,
J Biomech Eng-T ASME, 1991, 113, 143.
4. Lo, H., Ponticiello, M.S., Leong, K.W., Tissue Eng, 1995, 1, 15.
5. Thompson, R.C., Yaszemski, M.J., Powers, J.M., Mikos, A.G., J Biomater
Sci-Polym E, 1995, 7, 23.
6. Whang, K., Thomas, C.K., Nuber, G., Healy, K.E., Polymer, 1995, 36,
837.
7. Sachlos, E., Czernuszka, J.T., European Cells and Materials, 2003, 5, 29.
8. Brevet US 5807437, 1998.
9. Brevet US 5121329, 1991.
10. Cassel, J.M., Mandelkern, L., Roberts, D.E., J. Amer. Leather Chem.
Asoc., 1962, 11, 556.
11. Trandafir, V., Chiriţă, Gh., Industria Uşoară, 1974, 4, 165.
12. Colţ, M., Bucevschi, M.D., „Valorificarea neconvenţională a pieilor”, Ed.
Gh.Asachi, Iaşi, 1999.
13. Bucevschi, M.D., Chiriţă, Gh., Colţ, M., Chiriţă, M., JALCA, 1999, 94, 89.
14. Saito, H., Taguchi, T., Aoki, H., Murabayashi, S., Mitamura, Y., Tanaka,
J., Tateishi, T., Acta Biomaterialia, 2007, 3, 89.
15. Gao, T.J., Lindholm T.S., „Searching for a novel carrier for bioactive
delivery of bone morphogenetic protein”, in: Lindholm, T.S. (Ed), Bone
Morphogenetic Proteins: Biology, Biochemistry and Reconstructive
Surgery, Landes, R.G., Austin T.X., 1996.
16. Brevet FR 2645870, 1990.
17. Khor, E., Biomaterials, 1997, 18, 95.
18. Olde, D. L.H.H, Dijkstra P.J., et. al., J. Biomed. Mater. Res., 1995, 29,
139.
19. Friess W., Biron, R.J., Pharm. Res., 1997, 14, 154.
20. Ruderman, R.J., Wade, C.W.R., et. al., J. Biomed. Mater. Res., 1973, 7,
263.
21. Gorham S.D., Collagen in: D. Byrom (Ed.), Biomaterials, Stokton Press,
New York, 1991.
22. Jayakrishnan, A., Jameel, S.R., Biomaterials, 1996, 17, 471.
224
23. Oliver, R.F., Grant, R.A., et. al., Br.J. Exp. Path., 1980, 61, 544.
24. Gratzer, P.F., Pereira, C.A., et.al., J. Biomed. Mater. Res., 1996, 31, 533.
25. Rasmussen, K.E., Albrechtsen, J., Histochemistry, 1974, 38, 19.
26. Ruijgrok, J.M., J.R. de Wijn, J. Mater. Sci. Mater. Med., 1994, 5, 80.
27. Woodroof, E.A., J. Bioeng., 1978, 2, 1.
28. Friess, W., Lee, G., Biomaterials, 1996, 17, 2289.
29. McPherson J.M., Ledger, P.W., et. al., J. Biomed. Mater. Res.,1986, 20,
79.
30. Simionescu, A., Deac, R., J. Biomed. Mater. Res., 1991, 25, 1495.
31. Meade, K.R., Silver, F.H., Biomaterials, 1990, 11, 176.
32. Bajpai, „Immunological aspects of treated natural tissue prostheses”, in:
D.F. Williams (Ed.), Biocompatibility of Tissue Analogues, CRC Press,
Boca raton, FL, 1985, 5 – 25.
33. Friess, W., European J. Pharmaceutics Biopharmaceutics, 1998, 45, 113 –
136.
34. Bailey, A., J. Radiation Research, 1964, 22, 606.
35. Tulbure, R., Mândru, M., Industria Uşoară, 1979, 9, 385.
36. Miyata, T., Sohde, T., Rubin, A. L., Stenzel, K. H., Biochim. Biophys.
Acta, 1971, 229, 672.
37. Koganei, Y., Ishikawa, S., Yoshizato, K., Shioya ,N., Maekawa, K., Jpn. J.
Burn Injuries, 1987, 13(2), 28.
38. Yoshizato, K., Nishikawa, A., Taira, T., J. Cell Sci., 1988, 91, 491.
39. Reich, O., Z. Chemical, 1963, 11, 436.
40. Langmeir, F., Blazej, A., Kozarstvi, 1968, 11, 301.
41. Panduranga, R., K., Leather Science, 1970, 17, 328.
42. Reich, O., Revue Technique des Industries du Cuir, 1971, 4, 128.
43. Kudoba, J., Ciyninarte, E., Martînheina, A., Polym. Mater.R.J., 1969, 11,
15.
44. Trachenberg, S.I., V.U.Z. Him.Technol. (URSS), 1971, 20, 65.
45. Okamoto, K.I., Kagyo Kagoku Zossi, 1971, 74, 37.
46. Kudaba, C., Polim.Mater. Ich. Issled, 1970, 3, 7.
47. Mareş, E., Industria Uşoară, 1981, 28(11), 489.
48. Heidemann, C.J., Das Leder, 1991, 42, 204.
49. Xi, T., Lin, F.J., Biomat. Applic., 1992, 7, 61.
50. Brevet RO 75271, 1980.
51. Brevet RO 82037, 1983.
52. Bucevschi, M.D., Chiriţă, Gh., Industria Uşoară, 1983, 30(3), 103.

225
53. Tanaka, M. & Miyata, T., 26th Int. Congress of Ophthalmology,
Singapore, 18-24 March 1990. (Organised by Int. Soc. For
Ophthalmology).
54. Nakagawa, M. & Tanaka, M., 26th Int. Congress of Ophthalmology,
Singapore, 18-24 March 1990.
55. Miyata, T., Schwartz, A., Wang, C. L., Rubin, A. L. & Stenzel, K. H.,
Trans. Am. Soc. Artif. Int. Organs, 22, 1976, 261-7.
56. Williams, D., Mater Today, 2004, 7, 24.
57. Chaikof, E.L., Matthew, H., Kohn, J., Mikos, A.G., Prestwich, G.D, Yip,
C.M., Ann NY Acad.Sci., 2002, 961, 96.
58. Berger, S.A., Goldschmith, W., Lewis, E.R., „Introduction to
Biengineering”, Oxford University Press, Oxford, 1996.
59. Rezwan, K., Chen, Q.Z., Blaker, J.J., Boccaccini, A.R., Biomaterials,
2006, 27, 3413.
60. Levenberg, S., Langer, E., „Advanced in tissue engineering current topics
in development biology”, vol 61, New York, Academic Press, 2004.
61. Hench, L.L., Splinter, RJ, Allen WC, J. Biomed. Mater. Res. Symp., 1971,
2, 117.
62. Kokubo, T., Kim, H., Kawashita, M., Biomaterials, 2003, 24, 2161.
63. Vuluga, Z., Paven, H., Donescu, D., Materiale Plastice, 2004, 41(1), 3.
64. Zanetti, M., Lomakin, S., Camino, G., Macromol. Mater. And Eng., 2000,
279, 1.
65. Morgan, A.B., Gilman, J.W., Jackson, C.L., Polym. Mater. Sci. Eng.,
2000, 82, 270.
66. Okamoto, M., Morita, S., Taguchi, H., Y. Kim, H., Kotaka, T., Tateyama,
H., Polymer, 2000, 41, 3887.
67. Wu, Q., Liu, X., Berglund, L.A., Polymer, 2002, 43, 2445.
68. Loo, L., Gleason, K., Macromolecules, 2003, 36, 2587.
69. Hou, S.-S., Bonagamba, T.J., Beyer, F.L., Madison, P.H., Schmidt-Rohr,
K., Macromolecules, 2003, 36, 2769.
70. Davis, R. D., Jarrett, W. L., Mathias, L. J., Polym. Mater. Sci. Eng., 2000,
82, 272.
71. Hoffmann, B., Dietrich, C., Thomann, R., Friedrich, C., Mulhaupt, R.,
Macromol. Rapid. Commun., 21, 2000, 57.
72. Iliuţă, I, Rev. Chimie, 1979, 30, 342.
73. Kameno, K., „Nanocor Technical Data”, 1991, 1.
74. Brevet EP 741451, 1991.

226
75. Beall, G.W., Tsipursky, S.J., „Chemistry and Technology of Polymer
Additives”, S.Al. Malaika, A. Gdovay, Wilkic (eds.), Blockwell Science,
London, 1999.
76. Pinnavoia, T.J., Science, 1983, 220, 365.
77. Theng, B.K.G., „Formation and Properties of Clay Polymer Complexes”,
elsevier Scientific Publ. Co., Amsterdam Oxford, N.Y., 1979.
78. Theng, B.K.G., „The Chemistry of Clay-Organic Reactions”, elsevier
Scientific Publ. Co., Amsterdam Oxford, N.Y., 1979.
79. Sava, B.A,. Rev. Chim. Bucharest, 2004, 4, 200.
80. Hubert-Pfalzgraf, L.G., Toward molecular design of oxide precursors for
advanced materials, 2002, http://www.solgel.com/forum/.
81. Baia, L., Baia, M., Peter, A., Cosoveanu, V., Danciu, V., J. Optoelectron.
Adv. Mater., 2007, 9(3), 671.
82. Brinker, C.J., Scherrer, G.W., „Sol-Gel Science – The Physics and
Chemistry of Sol-Gel Processing”, Academic Press Inc., Harcourt Brace
Jovanovich, Publishers, Boston, San Diego, New York, London, Sydney,
Tokyo, Toronto, 1990.
83. Baia, L., Peter, A., Coşoveanu, E., Indrea, Baia, M., Popp, J., Danciu, V.,
Thin Solid Films, 2006, 511, 516.
84. Barau, A., Crişan, M., Gartner, M., Jitianu, A., Zaharescu, A., Ghiţă,
A., Danciu, V., Coşoveanu, V., Marin, I., J. Sol-Gel Sci. Technol., 2006,
37, 175.
85. Chiţanu, G.C., Creangă, D.M., Hirano, T., Badea, N., Rev. Roum. Chim.,
2002, 47(3-4), 343.
86. Chiţanu, G.C., Creangă, D.M., Anghelescu-Dogaru, A.G., Avram,
I., Hirano, T., Acta Univ. Cibin. Ser. F Chemia, 2002, 5(1), 63.
87. Hunter, C.J., Shieh, A.C., Nerem, R.M., Levenston, M.E., Trans. Soc.
Biomater., 2000, 306.
88. Chow, K.S., Khor, E., Biomacromolecules, 2000, 1, 61.
89. Marler, J.J., Guha, A., Rowley, J., Koka, R., Mooney, D., Vacanti, J.P.,
Plast. Reconstr. Surg., 2000, 105, 2049.
90. Jeong, B., Bae, Y.H., Kim, S.W., Trans. Soc. Biomater., 2000, 1491.
91. Ichi, T., Watanabe, J., Ooya, T., Yui, N., Trans. Soc. Biomater., 2000,
1438.
92. Marcolongo, M., Tsang, K., Thomas, J., Guy, D., Lowman, A., Trans. Soc.
Biomater., 2000, 191.
93. Lutolf, M., Pratt, A.B., Vernon, B., Elbert, D.L., Tirelli, N., Hubbell, J.A.,
Trans. Soc. Biomater., 2000, 651.
227
94. Campoccia, D., Doherty, P., Radice, M., Brun, P., Abatangelo, G.,
Williams, D.F., Biomaterials, 1998, 19, 2101.
95. Prestwich, G.D., Marecak, D.M., Marecak, J.F., Vercruysse, K.P., Ziebell,
M.R., J. Controlled Release, 1998, 53, 93.
96. Fatemeh P., „Biomaterials for application in medicine”: Chapter 1,
Elsevier Science, Amsterdam, 1997.
97. Niiranen, H., Pyhalto, T., Rokkanen, P., Kellomaki, M., Tormala, P.,
J.Biomed. Mater. Res.A, 2004, 69A, 699.
98. Han, B., Huang, L.L.H., Cheung, D., Cordoba, F., Nimni, M., „Polymer
growth factors with a collagen binding domain: Their potential tissue
reapair and organ regeneration”, In Zilla and Greisle Tissue Engineering of
Vascular Prothesis Grafts, Austinn:R, 1999.
99. Chandy, T., Sharma, C.P., Biomater.Artif.Org., 1990, 18, 1.
100. Glicklis, R., Shapiro, L., Agbaria, R., Merchuck, J.C., Cohen, S.I., Bioing.,
2000, 67, 344.
101. Albu, M.G., Leca, M., Europen Cells & Materials, 2005, 10(1), 8.
102. F.Radu, V. Trandafir, M. Godeanu, M. Radu, Rev. Soc. Rom. a Chimiştilor
Cosmetologi, 2003, 3(4), 25.
103. Guzun Stoica, A., Ghita, C., Trandafir, V., Journal of the Romanian
Colloid and Surface Chemistry Association, 1996, 1(1), 37.
104. Ionescu Bujor, I., Trandafir, V., Zgirian, G., European Cells & Materials,
2003, 5(1), 7.
105. Silva, C.C., Thomazini, D., Pinheiro, A.G., Aranha, N., Figueiró, S.D.,
Góes J.C., Sombra, A.S., Materials Science and Engineering B, 2001,
86(3), 210.
106. Sousa, N., et.al., Solid State Sciences, 2002, 4(1), 43.
107. Rafiuddin Ahmed, M., Venkateshwarlu, U., and Jayakumar, R.,
Biomaterials, 2004, 25, 2585.
108. Ber, S., Torun Köse, G., Hasırcı, V., Biomaterials, 2005, 26(14), 1977.
109. Albu, B., Simion, D., Trandafir, V., Radu, M., Radu, F., Journal of Colloid
and Surface Chemistry, 2005, 5(1-2), 13.
110. Brevet RO 115590, 2000.
111. Brevet RO 103994, 1989.
112. Brevet RO 107819, 1993.
113. Trandafir, V., Pop de Popa, I., Revue Roumaine de Chimie, 1973, 35, 10.
114. Trandafir, V., Ionescu, M., Acta Diabetologică, 1994, 20, 4.
115. Lee, S. J., Lim, J., Lee, J.W., Atala, A., Yoo, J.J., Biomaterials, 2006,
27(18), 346.
228
116. Trandafir, V., Albu, M., Leca, M., „Ovidius” Univerity Annals of Medical
Science – Pharmacy, 2003, 1(8), 42.
117. Barau, A., Crişan, M., Gartner, M., Danciu, V., Coşoveanu, V., Marian,
I., Anastasescu, M., Zaharescu, M., Materials Science Forum, 2005,
492, 311.
118. Siapi, E., Mavromoustakos, T., Trandafir, V., Albu, B., Budrugeac, P.,
Thermochimica Acta, 2005, 425, 165.
119. Baia, L., Trandafir, V., Danciu, V., Baia, M., Coşoveanu, V., J.Popp,
Asian J. of Physics, 2006, 15(2), 209.
120. Trandafir, V., Enescu, D.M., Iordache, N., Albu, M., BIOMaterialien,
2006, 7(3), 234.
121. Lungu, A., Albu, M., Trandafir, V., Materiale Plastice, 2007, 44(4), 273.
122. Budrugeac, P, Trandafir, V, Albu, MG, Journal of Thermal Analysis and
Calorimetry, 2003, 72(2), 581.
123. Brevet RO 52796, 1970.
124. Moldovan, L. Buzgariu, W., Craciunescu, O., Oprita, E.I., Zarnescu, O.,
Romanian Biological Sciences, 2004, 1(3-4), 3.
125. Oprita, E.I. Moldovan, L., Craciunescu, O., Buzgariu, W., Tardei, C.,
Zarnescu, O., Central European Journal of Biology, 2006, 1(1), 61.
126. Radu, G.L., Caloianu, M., Ciucu, A., St. Cerc. Biotechnol., 1987, 19, 35.
127. Radu, G.L., Ciucu, A., Caloianu, M., „Suport colagenic pentru imobi-
lizarea produselor biologic active” in Microbiologie Industrială şi
Biotehnologie (ed. N. Topala), vol. VI, 1988.
128. Brevet RO 98398, 1988.
129. Brevet RO 69198, 1978.
130. Brevet RO 83081, 1981.
131. Brevet RO 96692, 1989.
132. Brevet RO 103550, 1989.
133. Trandafir, V., Albulescu, M., Materialwissenschaft und Werkstottechnick,
2005, 36(12), 42.
134. Sheu, M.T., Huang, J.C., Yeh G.H., Ho, H.O., Biomaterials, 2001,
22, 1712.
135. Vuluga, Z., Donescu, D., Trandafir, V., Radovici, C., Serban, S., Revue
Roumaine de Chimie, 2007, 52(4), 395.
136. Trandafir, V., Vuluga, Z., Danciu, V., Albu, M.G., Trusca, R., Iancu, C.,
Conference Proceedings of BIOFOAMS 2007, Capri, Italia, 2007, 82.
137. Porter, A.E., Patel, N., Skepper, J.N., Best, S.M., Bonfield, W.,
Biomaterials, 2004, 25(16), 3303.
229
138. Vuluga, Z., Danciu, V., Trandafir, V., Radovici, C., Vuluga, D.M., Şerban,
S., Potarniche, C.G., Molecular Cristals & Liquid Cristals, sub tipar 2008.
139. Trandafir, V., Cioroianu, T., Bratulescu, V., Sarbu, C., Albu, M.G., Cuoio,
Pelli, Materie Concianti, 2003, 79(6), 289.
140. Trandafir, V., Chiriţă, Gh., Industria Uşoară, 1972, 3, 141.
141. Olteanu, M., Trandafir, V., Leca, M., Materiale Plastice, 1979, 3, 162.
142. Trandafir, V., Materiale Plastice, 1979, 4, 214.
143. Trandafir, V., Industria uşoară, 1977, 6, 249.
144. Micutz, M., Staicu, T., Leca, M., Proc. Romanian International Conference
on Chemistry and Chemical Engineering – RICCCE XIV, Bucharest,
22-24 Sept., 2005, vol. 2, 117.
145. Micutz, M., Staicu, T., Leca, M., Rev. Roumaine Chim., 2005, 50 (7-8),
547.
146. Micutz, M., Staicu T., Leca, M., J. Colloid Surface Chem., 2005, 5, 53.
147. Asandrei, N., Bulacovschi, J., Trandafir, V., Industria Uşoară, 1976,
7, 295.
148. Leca, M., Florescu, S., Trandafir, V., Jorn. Com. Esp. Deterg, 1999, 29,
309.
149. Leca, M., Trandafir, V., Journal of Colloid and Surface Chemistry, 1999,
3(2), 12.
150. Leca, M., Trandafir, V., Staicu, T., Micutz, M., Florescu, S., Jorn. Com.
Esp. Deterg., 2000, 30, 275.
151. Cremenescu, E., Giurginca, M., Meghea, A., Rev. Chim., 2006, 57(8), 808.
152. Cremenescu, E., Giurginca, M., Meghea, A., Rev. Chim., 2006, 57(10),
1003.
153. Cremenescu, E., Borlescu, C., Meghea, A., Demetrescu, I., RSCC
Magazine, 2006, 6(2), 38.

230