Limfocitele B și imunitatea

mediată umoral
Curs 5
 2

Cuprins

1. Receptorii limfocitelor B (BCR)

2. Semnalizarea BCR
3. Activarea limfocitelor B
4. Clasele de anticorpii și funcțiile acestora
 3

Studiu de caz
- Bărbat 23 ani se prezintă cu dureri de gât, febră, oboseală, care au debutat în urmă cu
3 săptămâni și s-au accentuat progresiv;
Examen clinic obiectiv:
- Amigdale inflamate, dimensiuni crescute, exudat; un g/l
anterior cervical mărit

Tratament:
- Penicilina → îmbunătățirea simptomelor clinice, dar
persistă febra și oboseala
Investigații paraclinice:
- HGB = 15 g/dl
- WBC = 23.000/mm3: Ne = 23%, Ly = 57%, > 20% Faringoamigdalită cu amigdale
inflamate și exudat la nivelul
limfocite anormale
amigdalei drepte
- Mononucleoză spot test +
Tratament:
• Repaus la pat, tratament suportiv
Evoluție:
• Recuperare completă în 6 săptămâni
 4

Sistmul imun dobîndit (adaptiv)

• A III-ea linie de apărare a organismului.

• Primele date despre existenţa SIA vin din 1790, cînd
Edward Jenner a inceput vaccinarea englezilor impotriva
variolei.
• A inoculat unui băiat de opt ani - James Phipps - puroi din leziunile
mulgătoarelor de vaci, care erau infectate cu variola taurinelor,
asemănătoare cu variola şi a observat că acesta nu s-a infectat de
variolă.
• Jenner a dat numele de "vaccin" (de la
cuvântul vacca din latină, însemnând vacă)
• În omagiul lui Jenner, Louis Pasteur a propus ca numele
de vaccinare să fie dat întregii proceduri de protejare a
subiecţilor de maladii prin inocularea unei substanţe
externe.
5
 6

Limfopoieza
 7

Limfocitele = populaţie heterogenă de celule, ce diferă

d.p.d.v al:
- căii de maturare
- duratei de viaţă
- teritoriilor preferenţiale de populare în organele limfoide
- markerilor de suprafaţă
- funcţiei
• Morfologic – greu de diferenţiat
• Cea mai importantă metodă de diferenţiere a subpopulaţiilor limfocitare
(imunofenotiparea)
• Markeri celulari de suprafaţă – antigene “cluster of differentiation” (CD), clasificaţi în
3 tipuri:
 markeri de diferenţiere B sau T – cu specificitate pentru linia respectivă
 markeri de maturaţie – specifici unei anumite etape evolutive, pot dispare la etapele
următoare
 markeri de activare – Ag care apar în cursul ciclului celular indicând o proliferare limfocitară
 8

Limfocitele B
• O populaţie minoritară de limfocite - 20% din totalul limfocitelor peiferice
• Denumirea după asemănarea funcţională cu populaţia limfocitară care se
maturează la păsări într-un organ specializat “bursa lui Fabricius”
• Durată de viaţă scurtă de ordinul lunilor şi sunt puţin recirculate, fiind
distribuite cu predominanţă în ariile B-dependente din organele limfoide
secundare, la nivelul corticalei g/l sau în pulpa albă a splinei
• Dispuse în aglomerări – foliculi limfoizi – staţionează t îndelungat în
aşteptarea Ag specific
• Difenţierea celulelor B - 2 etape:
Antigen – independentă – are loc în m.o.
Antigen - dependentă - În organele limfoide secundare
 9

Limfocitele B
 10

Markeri fenotipici ai limfocitelor B

• CD19 – în toate stadiile cu excepţia pre-plasmocit, plasmocit
• CD20 – mai târziu decât CD19, dispare înainte de transformarea în plasmocit. Reglează
concentraţia Ca2+intracelular – reglează progresia LB în ciclul celular
• CD21 – LB mature şi celulele dendritice foliculare. Receptor pentru C3 şi virusul Ebstein-Barr
• CD22 – iniţial intracitoplasmatic de către pro-B şi pre-B, membranar în fazele tardive de
maturare intramedulară. Exprimat de majoritatea celulelor din LAL. Este o moleculă de
adeziune şi în acelaşi timp acţionează ca traductor de semnal fiind asociat receptorului pentru
antigene
• CD23 – în izoforma sa CD23a este exprimat exclusiv pe celulele B. Are rol în prezentarea
antigenului către LT
• CD24 – în toate stadiile dar predominant pre-B
• CD5 – considerat iniţial ca marker T exclusiv. Exprimat pe o mică subpopulaţie B bormală şi
pe 90-95% din cazurile de LLC.
 11

Generarea unei diversificări de anticorpi prin

design-ul modular
• Enigma:
• cum celulele B pot produce 100mln diferiţi Ac pentru protecţie?
• a fost soluţionată în 1977 de Susumu Tonegawa, pentru care a primit
Premiul Nobel în 1987.

descoperirea genelor Ig C, V, J şi D
regiunilor şi rearanjametul lor
 12

Generarea unei diversificări de anticorpi prin

design-ul modular
• Ideea lui: toate celulele B iniţial au acelaşi ADN, dar la cele mature,
ADN-ul ce ce se transmte genelor Ac se poate schimba – şi această
schimbare este suficientă pentru generarea 100mln Ac diferiţi, de care
avem nevoie.

• El a comparat secvenţe de ADN ale Lc ale Ig la LB mature şi imature,

descoperind că sunt diferite.
• În aşa fel s-a descoperit că genele Ac maturi sunt efectuate prin
design-ul modular.
 13

Design-ul modular
• În fiecare celulă B, pe cromosomul ce codifică lanţurile grele ale Ac,
sunt multiple copii ale 4 tipuri de segmente de gene a ADN, numite V,
D, J şi C.
• Avem ≈ 40 segmente V, ≈ 25 segmente D, ≈ 6 segmente J.
• Pentru asamblarea unei gene a lanţului H matur, fiecare celulă B
caută unul din aceste segmente, plasîndu-le împreună, aşa ca în
figură:
 14

1. Receptorii limfocitelor B
- Sunt formați din două tipuri de proteine:
• lanțul greu (Hc, heavy chain)
• lanțul ușor (Lc, light chain), care sunt codificate de genele,
asamblate din segmente genice.
- Segmentele genice pentru generarea proteinelor sunt
localizate pe cromozomul 14 (fiecare dintre cei 2 cromozomi
contribuie cu segmente genice)
- Segmenele genice: V, D, J și C
 15

1. Receptorii limfocitelor B

- Rearanjament genic (gene rearrangement) – rezultatul este de a

găsi V, D J segmente potrivite şi segmente de regiuni constante pe
același cromosom → testarea segmentelor de gene

- Rearanjament productiv (productive rearrangement) – 1 din 9

șanse de a asambla combinația potrivită de gene, ce va produce
Hc proteină intreagă. Această proteină va fi transportată la S, ce
va semnaliza finisarea rearanjamentului.

- Dacă limfocitul B nu reușește să producă Hc și Lc care să fie

corect asamblate → moarte celulară (”sinucidere”), deoarece LB ce
nu poate exprima BCR, este inutil.
 16

1. Receptorii limfocitelor B

Fiecare limfocit B matur produce doar un singur tip de BCR sau

anticorp

Fiecare BCR este format dintr-un singur tip de Hc și Lc

Mare diversitate a limfocitelor B de a recunoaște teoretic orice tip de

moleculă organică (3 x 1011 anticorpi)
 17

2. Semnalizarea BCR
 BCR se leagă de antigenul corespunzător ”cognate” – epitop (6-12 AA)
 Cînd are loc recunoaștrea Ag, semnalul este transmis spre nucleul BC pentru a
recurge la activarea BC
Dar cum are loc această semnalizare?
Hc este scurt, nu ajunge pînă la nucleu, deacea BCR are niște proteine accesorii Igα și
Igβ, caree se asociază cu Hc
→ Semnalizarea recunoașterii antigenului prin Igβ și Igα, localizate intracitoplasmatic

BCR complet constă din 2 părți:

Extracelulară – Hc/Lc, ce recunoaște Ag, dar
nu poate transmite semnalul
Intracelulară - Igα și Igβ proteine, ce pot
semnaliza
 18

2. Semnalizarea BCR
 Pentru generarea unui semnal de activare, mai mulți BCR trebuie poziționați
unul lângă celălalt pe suprafața limfocitului B = clusterizare sau crosslinking
 Clusterizarea BCR are loc dacă există mai mulți epitopi de același fel pe un
singur antigen. S a mai multor Ag patogeni este compusă din mai multe copii de diferite
proteine. Atunci cînd BC recunoaște un epitop al acestor proteine, mai mulți BCR pot clusteriza,
pentru focusarea Ag.
 Igα și Igβ din interiorul celulei interacționează cu enzime- transmiterea
semnalului la nucleu, precum BCR este ocupat.

Fiecare limfocit B are aproximativ 100000 BCR

pe suprafață
 19

2. Semnalizarea BCR
Există o proteină pe S BC cu rol în
semnalizare – receptor, ce poate lega un
component al C
Receptorul pentru complement = co-
receptor
Ag opsonizat acţionează ca o “clamă” ce
strînge BCR şi co-R împreună pe S BC,
cea ce amplifică transmiterea
semnalului.

- Limfocitul B prezintă receptori pentru fragmentul C3b al complementului →

recunoaște antigene opsonizate
- Clusterizarea BCR împreună cu receptorii pentru complement amplifică
semnalizarea de aproximativ 100x
 20

2. Semnalizarea BCR
 21

3. Activarea limfocitelor B (pentru a produce Ac)

• BC care nu au întîlnit niciodată Ag – limfocite B naive

• BC ce s-au întîlnit cu Ag cunoscut – limfocite activate
“experimentate”

3.1. Activarea limfocitelor B dependentă de limfocitele Th

3.2. Activarea limfocitelor B independentă de limfocitele
Th (depenentă de antigen)
3.3. Activarea limfocitelor B de mitogen
 22

3. Activarea limfocitelor B
Activarea BC naive necesită 2 semnale:
1. Clusteruzarea BCR şi a moleculelor de semnalizare asociate
2. Semnal co-stimulator
• 3.1. Activarea limfocitelor B depenentă de Th
- Semnal co-stimulator, ce conferă contact direct
între BC şi ThC.
- Necesită activarea prealabilă a limfocitelor T, pe S
cărora proteina CD40L, care se leagă de CD40 de
pe S BC – transmiterea semnalului co-stimulator,
clusteruzarea BCR, activarea BC.
- Procesarea antigenului și prezentarea împreună
cu molecule MHC
- Eficient doar în activarea limfocitelor B și
producția de anticorpi doar împotriva antigenelor
proteice
- Deficiența de CD40L (CD154): sindrom hiper-IgM
 23

3. Activarea limfocitelor B

• 3.2. Activarea limfocitelor B dependetă de antigen (independentă

de limfocitele Th)
• Ag de pe S multor bacterii – posedă carbohidraţi (multiple unităţi –
epitopi, ce se repetă) ce pot clusteriza mulţi BCR → proliferarea BC;
dar pentru activarea deplina e necesar al II-lea semnal:
• recunoaşterea Semnal de pericol = danger signal (PAMP-PRR),
comun pentru bacterii, paraziţi;
• Avantajul – BC pot fi activate, formînd Ac rapid, fară participarea
ThC
 24

3. Activarea limfocitelor B
3.3. Activarea limfocitelor B de mitogen
Calea nenaturală
- Ag-Mitogen = agent care induce proliferarea
celulară (virusuri, bacterii, paraziți, substanțe
chimice)
- Se leagă de alți receptori decât BCR pe suprafața
limfocitelor B (receptori pentru mitogeni)
- Induce activarea policlonală a limfocitelor B
- Nu depinde de antigenul specific
- Este o modalitate de a distrage sistemul imun de
la producerea unui răspuns specific

A. Secreție normală policlonală de Ig la un adult

sănătos
B. Secreție normală policlonală de Ig ca urmare a
infecției
C. Secreție monoclonală în mielom multiplu
 25

3. Activarea limfocitelor B
Activarea limfocitelor B

proliferare

Maturarea limfocitelor B
1. Schimbarea clasei Ig (IgM)
2. Hipermutații somatice – pentru creşterea afinităţii BCR pentru recunoaşterea Ag
3. Orientarea spre plasmocite/limfocite B de memorie
 26

Anticorpii (Ig)
• O moleculă de IgG:
 2 perchi de diferite proteine:

▫ Lanţ uşor Lc
▫ Lanţ greu Hc
 2 regiuni identice – Fab, ce leagă
ag
 O regiune constanta Fc, ce poate
lega receptorii pe S celulelor
efectoare (macrofage) - structura
specială ce determină clasa Ig.
 27

4. Clasele de anticorpi și funcțiile acestora

 28

4. Clasele de anticorpi
și funcțiile acestora
 29

Ce fac Ac?
• Ac, fiind foarte importanţi în apărare, nu distrug direct “invadatorul” - Ag. Ei
marchează “sărutul morţii” pe Ag, care-l va duce la distrugere.
• Rolul lor este de a identifica Ag şi de a permite altora de a efectua distrugerea.
• Ac se pot cupla atît cu Ag bacterieni, cît şi cu cei virali, marcîndu-i pentru
distrucţie.
• Ac opsonizează invadatorii; din germ. “opsonize” – a pregăti pentru mîncare.
30
 31

4. Funcțiile anticorpilor

Anticorpii participă la apărarea

organismului prin 3 mecanisme:

- Inactivarea (neutralizarea) toxinelor

bacteriene; neutralizarea particulelor
virale și a celulelor bacteriene prin
legarea și inactivarea acestora
- Opsonizarea și fagocitoza celulelor
bacteriene
- Activarea sistemului complement de
către anticorpii legați de celulele
bacteriene
 32

Opsonizarea
Ac - legarea Fab de Ag, iar cozile Fc se leagă de receptorii Fcr de
suprafaţă a celulelor efectoare - macrofage.
• Ac formează o punte între Ag şi fagocit, pregătindu-l pentru
fagocitare.
• Ac fixează atenţia macrofagelor spre Ag, care alteori poate fi
ignorat.
 33

4. Clasele de anticorpi și funcțiile acestora

4.1. Anticorpii IgM

- Activarea limfocitelor B naive induce producția de IgM

- Sunt produși la debutul infecției
- Sunt capabili de activarea cascadei complementului:
fixeaza componenta C1 pe Fc, care nu mai este
inhibată și activează cascada complementului prin
calea clasică (dependentă de anticorp)
- Au mai mare avantaj în infecţia precoce ca IgG,
deoarece fixează eficient C. IgM sunt eficienţi pentru
neutralizarea virusurilor, prin legarea cu ei şi
prevenind infectarea celulelor
- Primii anticorpi în caz de infecție virală sau
bacteriană
 34

4. Clasele de anticorpi și funcțiile acestora

4.1. Anticorpii IgM

Activarea căii clasice a complementului

 35

4. Clasele de anticorpi și funcțiile acestora

4.2. Anticorpii IgG

- 4 subclase, cu Fc diferite
- IgG3 leagă complementul cel mai bine; NK prezintă receptori pentru porțiunea Fc a
IgG3 = citotoxicitate dependentă de anticorp, ADCC) NK omoară, Ac – identifică ţinta

- IgG1 se leagă de agenții patogeni în vederea opsonizării și ingestia de către fagocite

(macrofagele și neutrofilele prezintă receptori pentru porțiunea Fc a IgG1)
 36

4. Clasele de anticorpi și funcțiile acestora

4.2. Anticorpii IgG

-Eficienţi în neutralizarea virusurilor

-Pot străbate bariera materno-placentară, suplinind cu IgG pînă la cîteva luni după
naştere
-Au cea mai mare durată de viață – 23 zile (IgM – 1-5 zile)
-Au cea mai mare concentrație serică (1240 mg/dl)
 37

4. Clasele de anticorpi și funcțiile acestora

4.3. Anticorpii IgA
- Cea mai abundentă Ig în
organism
- Este principalul Ac al
mucoaselor (400m2)
- 80% BC din mucoase produc
IgA, protejînd mucoasele
 38

4. Clasele de anticorpi și funcțiile acestora

4.3. Anticorpii IgA

- Este secretată în laptele matern,

tapetînd mucoasa intestinală a copilului
- protecţie
- Concentrație plasmatică = 280 mg/dl
- Durată de viață = 6 zile
- Structura conferă capacitatea de migrare
prin pereții organelor (intestin),
rezistenţă la mediul acid, 4 Fab
- Opsonizează agenții patogeni și formează
aglomerări (clumps) care vor fi eliminate
prin materiile fecale
- Componenta C1 a complementului nu
leagă fragmentul Fc al IgA
 39

4. Clasele de anticorpi și funcțiile acestora

4.3. Anticorpii IgA

Generarea IgA secretor:

- Plasmocitele secretă IgA dimeric
(cu lanț J), care se leagă de poli-IgR
de la nivelul membranei
basolaterale a celulelor epiteliale
- Complexul este transportat prin
celula epitelială la nivelul
suprafeței apicale, unde are loc
digestia enzimatică parțială a
complexului IgA2-J poli-IgR
- Componenta secretorie (SC) este
legată de IgA și eliberată în
secrețiile mucoasei ca sIgA
 40

4. Clasele de anticorpi și funcțiile acestora

4.4. Anticorpii IgE
- Concentrație plasmatică = 0,03 mg/dl
- Durata de viață = 1,5 zile
- 1913, Charles Richet – premiul Nobel pentru anafilaxie
(șocul anafilactic este determinat de degranularea
mastocitelor)
- Mastocitele – durată de viață foarte mare (ani), prezintă
receptori pentru porțiunea Fc a IgE
- Rol în IÎ prin fagocitarea bacteriilor opsonizate şi
eliberarea de citokine
- Rol mai important - Protecţia împotriva invaziei
parazitare
- Conţin substanţe biologic active (His)
- Degranularea mastocitelor, avind ca scop omorîrea
parazitului, mai are şi consecinţe nefaste – RA, şoc
anafilactic
 41

4. Clasele de anticorpi și funcțiile acestora

4.5. Anticorpii IgD

- Funcție umorală neclară

- Concentrație plasmatică = 3 mg/ml
- Durată de viață = 2,8 zile
- Descoperiți în 1960 de Rowe și Fahey
- Participă la inițierea răspunsului imun dobândit
- Menționați în unele cazuri de hipersensibilitate la penicilină
- Hiperglobulinemia D asemănătoare febrei mediteraneene (febră recurentă,
dureri abdominale, artralgii/artrite, cefalee, leziuni cutanate, IgD crescut) –
mutație recesiv autozomală cr. 12
 42

4. Stadiile de dezvoltare ale limfocitelor B

– fazele antigen-independentă și antigen-dependentă: deletarea limfocitelor B autoreactive și

inducerea toleranței.
•În faza antigen-inependentă, rearanjamentele genice au loc înainte de întâlnirea cu antigenul.
•În faza antigen-dependentă, antigenele timus-indepedente (polizaharide) reacționează cu limfocitele B1, fără
ajutorul Th, pentru a forma mai ales anticorpi IgM. Limfocitele B2 interacționează cu antigenele timus-
dependente (proteine) și necesită schimbarea izotipului și mutații somatice a genelor VH/VL pentru a produce
IgMIgGIgAIgE
 43

4. Clasele de anticorpi și funcțiile acestora

 44

4. Clasele de anticorpi și funcțiile acestora

• Schimbarea claselor de Ac este controlată și de

citokinele, întîlnite de BC:
IL-4, IL-5 – schimbarea de la IgM la IgE
IFN-γ – producere de IgG3, efectiv împotriva bacterii,
virusuri
 TGFβ – schimbarea IgM în IgA – în gripă
 45

Tehnici de obținere a anticorpilor

monoclonali - hibridoame

- Celulele splenice ale unui șoarece care

a fost imunizat cu antigenul dorit sunt
sursa de celule B secretoare de
anticorpi
- Fuzionează cu celule mielomice ale
unui șoarece cu mielom
- După fuziune rezultă un număr mare
de clone hibride, fiind selectate doar
clonele de interes  expandate în
culturi celulare pentru a produce
cantități  de anticorpi monoclonali
 46

Răspunsul imun primar și secundar

 47

Răspunsul imun primar și secundar

Diferențe între răspunsul imun primar și cel secundar

Caracteristici Răspuns primar Răspuns secundar

Perioada de latență Lungă Scurtă

Titrul maxim de anticorpi Scăzut Crescut

Persistența titrului de anticorpi Durată scăzută Perioadă îndelungată

Afinitatea anticorpilor Scăzută Crescută

Prezența celulelor de memorie Puține celule (?) Nr.  de celule

Clasa predominantă de Ig IgM IgG

Doza de imunogen necesară Crescută Scăzută

pentru producerea anticorpilor
 48

Rolul imunității înnăscute

 49

Rolul
răspunsului
imun umoral
 50

Relevanța cazului clinic

Mononucleoza infecțioasă (boala sărutului, boala Pfeiffer, febra glandulară) = boală
infecțioasă cauzată de virusul Epstein-Barr (EBV), membru al familiei herpes

- Se întâlnește mai ales la adolescenți și adulți tineri

- Se caracterizează prin febră, dureri faringiene și musculare, oboseală și uneori
prin creșterea în dimensiune a splinei (splenomegalie  ruptură splenică)
- Relativ netransmisibilă (necesită contact intim și transmiterea virusului prin
salivă); se poate transmite și prin sânge
- Complicații: anemie hemolitică, trombocitopenie, anemie aplastică, miocardită,
hepatită, ulcerații genitale, ruptură splenică, erupții cutanate și complicații
neurologice (sindrom Guillain-Barre, encefalită, meningită)
- EBV este implicat în patogeneza bolilor autoimune (lupus eritematos); a fost
asociat cu numeroase procese neoplazice – tumori hematologice, epiteliale,
mezenchimale (carcinom nazofaringian, limfoame cu limfocite B – Burkitt,
Hodgkin, boli limfoproliferative)
- Diagnostic diferențial: infecție streptococică
 51

Relevanța cazului clinic

Mono spot test = mononucleoză spot test, test heterofil, test cu anticorpi heterofili
- Test de laborator care măsoară anticorpii heterofili (anticorpi umani care reacționează
cu proteinele altei specii)
- Se efectuează la pacienții cu simptomatologie caracteristică: faringoamigdalită
exudativă, febră, cefalee, ganglioni limfatici măriți, oboseală
- Test nespecific
- Poate fi pozitiv la pacienții cu alte infecții
- Rezultate fals-negative se întâlnesc în 10-15% dintre cazuri, mai ales la copii cu
vârsta mai mică de 10 ani

Frotiu sânge periferic la un pacient cu

mononucleoză infecțioasă, care arată
limfocite atipice, caracterizate prin vezicule
citoplasmatice și indentații membranare
 52

Relevanța cazului clinic

- Virsul Epstein-Barr infectează limfocitele B  proliferare  producere de
anticorpi policlonali (anticorpi heterofili, aglutinine la rece, crioglobuline,
anticorpi aninucleari, factor reumatoid)
-  semnificativă a nr. limfocite și monocite
- Limfocitele T (mai ales CD8+) împotriva limfocitelor B infectate cu EBV sunt
atipice = corpi Downey
- Majoritatea simptomelor se datorează proliferării și activării limfocitelor T ca
răspuns la infecție

Teste specifice de laborator:

- Anticorpi anti-antigene ale capsidei virale (VCA – viral capsid antigen)
- Antigene timpurii (EA – early antigen)
- Antigenul nuclear (EBNA – EBV nuclear antigen)

Combinația optimă de teste serologice:

IgM și IgG pentru VCA; IgM pentru EA și anticorpi pentru EBNA
53