UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

“ IULIU HAŢIEGANU”
CATEDRA DE MICROBIOLOGIE

CRISTIAN HODÂRNĂU

CECILIA BOBOŞ PETRICĂ CIOBANCA

LAURA SIMON

MICROBIOLOGIE

CAIET DE LUCRĂRI PRACTICE

PENTRU UZUL
STUDENŢILOR FACULTĂŢII DE MEDICINA DENTARA

EDITURA RISOPRINT
2010

1
LUCRAREA NUMĂRUL 1. MĂSURI DE PROTECŢIE ÎN LABORATORUL
DE MICROBIOLOGIE. STERILIZAREA ŞI DEZINFECŢIA

MĂSURI DE PROTECŢIE ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

1. În laboratorul de microbiologie este obligatorie purtarea echipamentului de protecţie: halate

albe, dar în anumite situaţii şi mănuşi, măşti, ochelari, pantaloni şi pantofi, destinaţi utilizării
doar în boxa de lucru.
2. În laboratorul de microbiologie nu se mănâncă,nu se bea şi nu se fumează.
3. Nu se duc la faţă nici mâinile şi nici diferite obiecte (manipularea batistei se
va face doar după spălarea mâinilor cu apă şi săpun).
4. Materialele contaminate şi cele sterile se manipulează cu multă atenţie în condiţii aseptice
pentru a evita contaminarea suprafeţelor de lucru,a mediilor de cultură, sau infectarea
persoanelor care lucrează în laborator. Se lucrează în apropierea becului de gaz, flacăra acestuia
fiind necesară pentru sterilizarea ansei bacteriologice sau a orificiului de deschidere al diferiţilor
recipienţi.
5. Ansa bacteriologică, instrument indispensabil în laboratorul de microbiologie se sterilizează
înainte şi după întrebuinţare prin încălzire până la incandescenţă.
6. Pipetele gradate şi pipetele Pasteur vor fi sterilizate prin flambare numai înainte de
întrebuinţare, după utilizare acestea vor fi puse în vase cilindrice care conţin soluţie
sulfocromică.
7. Baloanele, eprubetele şi plăcile Petri cu produse patologice sau culturi bacteriene care nu mai
sunt utilizate, vor fi puse în recipiente speciale pentru infecte în vederea sterilizării.
8. În cazul în care masa de lucru este contaminată cu bacterii, aceasta va fi acoperită cu o soluţie
dezinfectantă, care va fi lăsată 24 de ore.
9. Mâinile se spală frecvent cu apă şi săpun, această operaţiune fiind obligatorie şi la terminarea
lucrului.
10. Înainte de părăsirea laboratorului se vor închide toate sursele de apă, gaz şi curent electric.

2
 STERILIZAREA ŞI DEZINFECŢIA

Sterilizarea constă în distrugerea şi/sau îndepărtarea tuturor microorganismelor de pe

suprafaţa şi din interiorul unor obiecte.
Dezinfecţia constă în distrugerea şi/ sau îndepărtarea anumitor microorganisme (în special
patogene) de pe suprafaţa şi din interiorul unor obiecte.
Asepsia reprezintă ansamblul de măsuri şi mijloace prin care este prevenită contaminarea
cu microorganisme a materialelor dar şi a organismelor vii.
Sterilizarea se poate face - prin căldură
- cu substanţe chimice
- cu radiaţii ionizante
- prin filtrare

1. Sterilizarea prin căldură foloseşte ● căldura uscată

● căldura umedă
Materialele (reutilizabile) ce urmează să fie sterilizate prin căldură vor fi supuse unui
procedeu de pregătire în vederea sterilizării. După curăţare, spălare şi uscare, obiectele sunt
împachetate în hârtie. Obiectele cu deschidere mică, înainte de a fi împachetate vor fi îndopate cu
dop de vată (baloane, eprubete, cilindri). Pipetele (atât cele gradate, cât şi pipetele Pasteur) vor fi
prevăzute la capăt cu dop de vată. Dacă obiectele au conţinut material infecţios, înainte de
prelucrarea preliminară, vor fi sterilizate prin autoclavare pentru distrugerea microorganismelor.

Sterilizarea prin căldură uscată ● încălzirea la incandescenţă

● sterilizarea cu aer supraîncălzit
Încălzirea la incandescenţă – se aplică ansei bacteriologice, înainte şi după fiecare
utilizare; prin menţinerea ansei în flacără până la incandescenţă microorganismele sunt carbonizate.
Sterilizarea cu aer supraîncălzit (în cuptorul Pasteur) se aplică obiectelor din sticlă sau
porţelan, după ce au fost pregătite corespunzător.
Cuptorul Pasteur sau Poupinelul este un dulăpior metalic cu pereţi dubli între care circulă aerul
cald), iar în interior este prevăzut cu rafturi pe care sunt aşezate obiectele ce urmează să fie
sterilizate. Este încălzit electric şi este prevăzut cu un termoreglator, termometru şi ceas.
Condiţiile de sterilizare la Poupinel sunt:
● temperatura 180°C
● timp 1 oră
Temperatura de 180 °C este necesară deoarece puterea de pătrundere a căldurii uscate este mai
mică, iar la temperaturi inferioare, sterilizarea este incompletă.
! Nu se pot steriliza prin acest procedeu: obiecte metalice, obiecte din cauciuc sau care au garnituri
din cauciuc şi nici lichidele.
Controlul sterilizarii se face prin :
- urmărirea temperaturii şi a timpului;
- procedeu suplimentar- urmărirea aspectului ambalajelor de hârtie şi a
dopurilor de vată (la 170°C hârtia şi vata rămân albe, sterilizarea fiind
incompletă iar la 200°C hârtia şi vata se carbonizează şi nu mai oferă
protecţie).

3
 Obiectele sterilizate sunt păstrate până la utilizare în dulapuri pentru sticlărie sterilă.
Dacă nu au fost utilizate în timp de o săptămână, trebuie sterilizate din nou înainte de
utilizare.
Sterilizarea prin căldură umedă
●sterilizarea cu vapori de apă sub presiune
(autoclavarea)
- este cea mai sigură metodă de sterilizare şi este practicată ori de câte
ori o permite materialul.
- în autoclave se sterilizează medii de cultură, material infecţios,
obiecte metalice, obiecte de cauciuc, aparatele pentru filtrare,
materiale textile etc.
- ! NU se pot steriliza medii de cultură care au în compoziţia lor
ingrediente denaturabile termic.

Condiţiile de sterilizare la autoclav sunt:

● presiune 1 atm echivalează cu temperatura de
120°C, timp de 30 de minute.
● la 2 atm temperatura vaporilor de apă atinge
134°C (se indică pentru materialul infecţios ).
Autoclavul este un cazan încălzit electric (cu gaz la modelele vechi) cu pereţi dublii, grei şi
rezistenţi, prevăzut cu un capac care se închide ermetic. În interior se găseşte un grătar pe care sunt
aşezate obiectele ce urmează să fie sterilizate. Cazanul este prevăzut cu manometru, robinet de
admisie a apei, robinet de evacuare a apei din cazan, robinet de vapori pentru evacuarea aerului şi a
vaporilor şi supapă de siguranţă care se deschide automat dacă presiunea din cazan creşte peste un
nivel critic.
Controlul sterilizării la autoclave se face prin:
- procedee fizice;
- procedee chimice;
- procedee biologice.
Procedee fizice – se urmăreşte timpul şi presiunea din autoclav.
Procedee chimice –se folosesc substanţe cu punct de topire apropiat de 120° C, substanţa se
introduce în cazan odată cu obiectele şi se sterilizează la terminarea autoclavării. Dacă sterilizarea a
fost corectă, substanţa se regăseşte topită şi solidificată.
Procedeele biologice- folosesc fiole de Stearotest 120’’ (suspensie sporulată de Bacillus
stearotermophylus în mediu nutritiv şi cu indicator de pH – culoare violet şi apect limpede) care se
introduc în autoclav cu obiectele pentru sterilizat şi se recuperează la terminarea autoclavării, se
pun la 37°C şi apoi se citesc rezultatele (controlul): menţinerea aspectului nemodificat denotă o
sterilizare corectă în timp ce virajul în galben ( acidifiere ) şi o uşoară opalescenţă indică sterilizare
incompletă (au rămas spori viabili).
2. Sterilizarea cu substanţe chimice:
Substanţele folosite pot fi
●glutaraldehidă 2%
● peroxid de hidrogen stabilizat (6%)
● acidul peracetic (concentraţii diferite )

4
 Timpul de contact al substanţei cu substratul tratat diferă în funcţie de produs; vor trebui
respectate recomandările producătorului privitoare la condiţiile de lucru, atât pentru o sterilizare
corectă, cât şi pentru evitarea accidentelor.
Sterilizarea cu oxid de etilenă
- se foloseşte numai atunci când nu există un alt mijloc de sterilizare
adecvat;
- metoda este delicată, iar erorile de procedură pot să conducă fie la o
sterilizare ineficientă, fie la accidente (toxice ), la personalul care
realizează sterilizarea sau la bolnavii la care se utilizează materialul
astfel sterilizat;
- după sterilizare materialul trebuie supus tratamentului de desorbţie;
- oxidul de etilenă este toxic prin: inhalare, contact, pe cale
parenterală, prin reacţia cu diferiţi compuşi chimici (cu policlorura de
vinil eliberează etilenclorhidrină);
- !oxidul de etilenă este inflamabil şi exploziv!
Parametrii pentru sterilizare sunt:
● temperatură-37°C, presiune subatmosferică,-
timp de 180 minute sau
● temperatură-55°C, presiune subatmosferică
timp de 60 de minute

3. Sterilizarea prin radiaţii ionizante:

● razele gama sunt cele mai penetrante;
● ionizarea compuşilor celulari prin expulzarea electronilor conduce la moartea
microorganismelor;
● razele gama pot fi obţinute dintr-o sursă de: cobalt 60,cesiu 137;
● este o metodă de sterilizare la rece folosită pentru: medicamente,instrumentar
confecţionat din material degradabil termic;
 radiaţiile ultraviolete sunt utilizate pentru sterilizarea aerului din încăperi şi a
suprafeţelor de lucru.

4. Filtrarea:
● metodă de sterilizare la rece;
● microorganismele sunt reţinute de o substanţă poroasă;
● este aplicată soluţiilor denaturabile termic;
● se poate face prin creşterea presiunii sau prin aspirare realizată de
pompa de vid sau trompa de apă.
Pentru a fi evitată colmatarea porilor filtrului, filtrarea se va face în maxim 20 de minute,
forţa de aspirare fiind mai mică la început şi crescând treptat pe măsură ce decurge filtrarea;
lichidele vâscoase sunt diluate cu ser fiziologic; după filtrare este obligatoriu controlul sterilităţii
soluţiei (filtratul este însămânţat pe medii de cultură adecvate, este termostatat şi poate fi considerat
steril dacă în 48-72 de ore nu se dezvoltă nici o colonie).

Tipuri de filtre folosite

● Filtre Chamberland (bujii/ lumânări) confecţionate din
porţelan poros ars

5
 - se notează (în funcţie de dimensiunile porilor) de la L1- L13. Filtrele
L3- L13 reţin bacteriile.
- se folosesc adaptate la baloane Kitasato.
● Filtre de sticlă
- sunt discuri de sticlă neutră şi poroasă turnate într-o pâlnie (suport de
sticlă),
- se notează G0- G5,
- filtrele G5 (cu pori de cca 1μ) reţin bacteriile.
● Filtre Seitz
- sunt confecţionate din azbest şi celuloză,
- se montează într-o pâlnie metalică,
- se folosesc adaptate la baloane Kitasato,
- pot modifica pH-ul lichidului filtrat şi pot adsorbi principii activi.
● Membranele filtrante
- sunt confecţionate din nitrat sau acetat de celuloză, policlorură de
vinil,
- sunt montate în suporturi din plastic,
- se adaptează la seringi de construcţie specială,
- creşterea presiunii se obţine prin acţionarea seringii,
- diametrul porilor variază între 10- 4000 nm.

Dezinfecţia se poate face prin - căldură

- radiaţii
- substanţe chimice
1. Dezinfecţia prin căldură foloseşte ● căldură uscată,
● căldură umedă

Dezinfecţia prin căldură uscată ● flambarea – este utilizată în laborator în timpul

lucrului şi constă în trecerea rapidă şi repetată a obiectelor (din sticlă sau porţelan) prin flacăra
becului de gaz înainte şi după întrebuinţare.
Dezinfecţia prin căldură umedă ● fierberea
● pasteurizarea
● tindalizarea

Fierberea se realizează în fierbătoare încălzite electric sau la flacără:

- se face la 100°C (adausul de carbonat de sodiu poate conduce la
creşterea temperaturii spre 110° C) timp de 30 de minut,

6
 - sunt distruse formele vegetative. Sporii bacterieni rezistă însă
la fierbere,
- în laboratorul de microbiologie se foloseşte pentru
instrumentarul de utilizare imediată (foarfece, pense, etc.).
Pasteurizarea:
- folosită mai mult în industrie (pasteurizarea laptelui, a berii),
- distruge formele vegetative prin distrugerea proteinelor
(începe de la 56°C),
- produsul este încălzit în baia de apă.
● 30 de minute la 60- 65°C
sau
● 15 minute la 70- 75°C
sau
● câteva secunde la 85- 90°C
- după încălzire se răceşte brusc la 4°C
Tindalizarea este un procedeu de dezinfecţie fracţionată:
- se adresează soluţiilor care se denaturează la fierbere,
- temperatura folosită este inferioară celei de 100°C (60- 80°C),
- soluţia se încălzeşte în baia de apă 1-3 ore pe zi, 3-8 zile
consecutive iar între încălziri se păstrează la temperatura
laboratorului (21°C); după ultima încălzire se răceşte brusc
la 4°C,
- la temperatura laboratorului, sporii (eventual prezenţi)
germinează, iar formele vegetative vor fi distruse de o nouă
încălzire,
- controlul se realizează prin inoculare pe medii de cultură şi
termostatare în condiţii adecvate.
Dezinfecţia prin vapori curenţi de apă se face în oala lui Koch sau autoclav cu
robinetul de vapori deschis şi distruge numai formele vegetative; se aplică soluţiilor
denaturabile la temperaturi mai mari de 100°C.

2. Dezinfecţia cu radiaţii ultraviolete este indicată pentru:

● suprafeţele de lucru,
● aerul din boxele de lucru (laboratoare).
- este o metodă complementară măsurilor de curăţenie şi
dezinfecţie chimică
- condiţiile generale de eficacitate:
● sunt folosite lămpi fixe sau mobile cu tuburi de UV între 15-
30W prevăzute să funcţioneze în prezenţa omului (radiaţie indirectă- fără
emisie de ozon ),
● tuburile de raze UV trebuie să fie permeabile selectiv
pentru radiaţia cu putere bactericidă maximă (2537 Å),
 ● spaţiul trebuie supus prealabil unei curăţenii maxime,
temperatura mediului să fie între 15-30° C, cu umiditate de maximum 60%.

- condiţiile speciale :
● pentru suprafeţe
- sunt utilizate aparate cu radiaţie directă,
- dezinfecţia se face în absenţa omului,
- durata de expunere trebuie să fie corectă (3-4 doze letale pe
suprafaţa tratată).
● pentru aer
- numărul lămpilor se calculează în funcţie de aerul dezinfectat
de către fiecare lampă (debitul de aer, volumul încăperii, viteza
de schimb a aerului),
- nu este admisă expunerea directă a persoanelor la radiaţia
lămpii de dezinfecţie (pentru radiaţia directă este obligatoriu
echipamentul de protecţie- ochelari, mască, mănuşi de
cauciuc),
- ! aparatele achiziţionate vor fi însoţite de documentaţia
tehnică !

3. Dezinfecţia chimică poate fi clasificată în:

- dezinfecţie de nivel înalt
- dezinfecţie de nivel mediu
- dezinfecţie de nivel scăzut
Dezinfecţia de nivel înalt:
- distruge toate microorganismele, cu excepţia unui număr redus
de spori bacterieni,
- timpul de contact trebuie să fie de cel puţin 20 de minute,
- substanţele utilizate:
● glutaraldehida (2%),
● peroxidul de hidrogen stabilizat
(6%),
● acidul peracetic ( concentraţii
diferite),
● hipocloritul de sodiu( 5,25%).
Dezinfecţia de nivel mediu:
- distruge Mycobacterium tuberculosis, forme vegetative ale
bacteriilor, fungi, virusuri,
- ! nu distruge sporii bacterieni,
- timpul de contact necesar este de 10 minute,
- substanţe utilizate:
● fenoli
● iodofori
● alcooli
● compuşi pe bază de clor

3
Dezinfecţia de nivel scăzut:
- distruge majoritatea bacteriilor în formă vegetativă unele
virusuri şi unii fungi,
- ! nu distruge sporii bacterieni,
- ! nu distruge Mycobacterium tuberculosis,
- timpul de contact necesar este de 10 minute,
- substanţe utilizabile ● fenoli
● iodofori
● săruri cuaternare de amoniu
● alcooli 70-90°
● hipoclorit de sodiu (5, 25%)
Substanţe dezinfectante:
 fenolii
- au acţiune bactericidă şi fungicidă,
- ! nu acţionează asupra sporilor,
- acţiunea antivirală este foarte scăzută,
- se folosesc doar la dezinfecţia suprafeţelor şi a
aerului.
 halogenii
- eliberează clor, brom, iod
- substanţe care eliberează clor
● dicloroizocianuratul de sodiu
● hipocloriţii
Se folosesc pentru tratarea apei şi dezinfecţia zonelor de preparare a alimentelor.
Stabilizarea soluţiilor se face cu substanţe alcaline.
- substanţe care eliberează iod
● iod- acţiune neselectivă cu instalare rapidă-vizează
bacterii şi virusuri (Lugol-soluţie apoasă; tinctură de iod-soluţie
hidroalcoolică),
● iodoforii-distrug bacterii (inclusiv M.
tuberculosis) şi virusuri; acţiunea antifungică virusuri; acţiunea
antifungică este variabilă, iar asupra sporului bacterian au acţiune
slabă.

 compuşii cuaternari de amoniu:

- sunt detergenţi şi emulsionanţi,
- solubili în apă şi alcool,
- stabili,
- fără miros şi nu pătează,
- acţiune bactericidă (nu şi sporicidă),
- ! nu distrug M. tuberculosis!
- acţiune selectivă fungicidă,
- acţiunea asupra virusurilor este realizată numai la concentraţii de
peste 1% şi este selectivă.

 clorhexidina

4
 - biguanid care se prezintă sub formă de săruri
(acetat sau gluconat de clorhexidină),
- acţiune bactericidă ( minus M. tuberculosis),
- nu au acţiune sporicidă,
- acţiune antivirală variabilă.
 alcoolul etilic şi izopropilic
- se folosesc în soluţie apoasă ( pentru adsorbţia pe bacterii),
- concentraţii biocide 30-50 % pentru alcoolul izopropilic 50-70%
pentru alcoolul etilic,
- distrug bacteriile (inclusiv BK), fungii,
- acţiunea antivirală vizează predilect virusurile
învelite,
- nu prezintă acţiune sporicidă.
 aldehidele - formaldehida, glutaraldehida, succinaldehida
- pot fi folosite pentru dezinfecţie înaltă sau
sterilizare
- formaldehida ( soluţie apoasă 37% sau soluţie alcoolică
4,5%)
- are acţiune –bactericidă ( inclusiv BK),
sporicidă, fungicidă, virulicidă.
- glutaraldehida
- este un dezinfectant înalt şi sterilizant chimic
- soluţiile apoase sunt acide (activitate sporocidă redusă) şi pot fi
activate la forma alcalină (pH 7,5- 8,5), dar stabilitatea este doar de
14- 28 de zile (datorită polimerizării moleculelor de
glutaraldehidă),
- are spectru larg,
- activitatea nu este influenţată de prezenţa
materialului organic.
 peroxidul de hidrogen şi compuşii înrudiţi
- concentraţia 3% se foloseşte pentru dezinfecţia de rutină şi ca
antiseptic,
- peroxidul de hidrogen stabilizat (conc. 6%) este un
dezinfectant de nivel înalt,
- are un spectru larg - bactericid (inclusiv BK),
sporicid, fungicid, virulicid.

5
1. Încălzirea la incandescenţă 2. Cuptorul Pasteur (Poupinel)

3. Autoclavul

6
NOTE PERSONALE

7
LUCRAREA NUMĂRUL 2. PREPARATE MICROSCOPICE

PREPARATUL NATIV
COLORAŢIA SIMPLĂ
COLORAŢIA GRAM

Bacteriile au dimensiuni mici, de ordinul micrometrilor. Datorită acestui fapt,

aprecierea proprietăţilor lor morfologice (dar şi de colorabilitate) necesită realizarea de
preparate microscopice.
Un preparat microscopic se poate face - direct din produsul patologic
- din cultură bacteriană
Examenul microscopic direct din produsul patologic, de obicei are o valoare pur
orientativă, dar există şi excepţii de exemplu:
- un frotiu dintr-o secreţie uretrală care evidenţiază diplococi
reniformi Gram negativi în interiorul polimorfonuclearelor, ne oferă practic
diagnosticul de uretrită gonococică.
sau
- un preparat nativ examinat pe fond întunecat care a fost efectuat
din serozitatea prelevată de la nivelul unei leziuni (şancru dur) situată pe
mucoasa genitală şi care pune în evidenţă bacterii spiralate, foarte mobile
(executând mişcări caracteristice de rotaţie, translaţie, flectare şi înşurubare)
ne oferă în mod cert diagnosticul de sifilis primar.
Mult mai multe informaţii ne oferă însă un preparat microscopic care a fost făcut
dintr-o cultură bacteriană. Un astfel de preparat ne oferă informaţii privitoare la proprietăţile
morfo-tinctoriale ale bacteriilor. Examinarea acestor proprietăţi constituie una din etapele
care trebuie parcurse pentru identificarea unei bacterii izolată dintr-un produs patologic.
Proprietăţile morfo-tinctoriale sunt:
- mobilitatea (prezentă numai la bacteriile ciliate şi poate fi
apreciată numai în preparatul nativ care foloseşte bacterii
viabile),
- dimensiunile bacteriilor,
- forma bacteriilor,
- aşezarea în frotiu (frotiul sau preparatul colorat foloseşte
bacterii omorâte în cursul procesului de fixare),
- prezenţa (eventuală) a unor structuri neobligatorii ( cum ar fi
capsula sau sporii),
- tinctoriabilitatea sau colorabilitatea bacteriilor- care poate fi
apreciată strict în coloraţiile combinate (Gram şi Ziehl-
Neelsen).

TIPURI DE PREPARATE MICROSCOPICE

1. preparatul nativ.
2. frotiul (preparatul colorat).

8
 1. Preparatul nativ - se poate face- din produsul patologic
sau
- din cultura bacteriană
● preparatul nativ este singurul care ne oferă informaţii privitoare la
mobilitatea bacteriilor, deoarece foloseşte bacterii viabile; pentru alte
elemente însă frotiul este mult mai util.
● pentru realizarea unui preparat nativ se va depune cu ajutorul pipetei
Pasteur pe mijlocul unei lame de microscop o picătură dintr-o cultură
bacteriană într-un mediu lichid (sau din produsul patologic lichid) după care
se acoperă cu lamela şi se examinează la microscop folosind obiective uscate
(pot fi folosite obiective cu puterea de mărire de 10, 20 sau 40).
În cazul culturilor bacteriene de pe medii solide, pe lama de microscop
se depune o picătură de ser fiziologic în care se emulsionează cu ansa
bacteriologică o colonie bacteriană; în continuare se procedează la fel ca şi la
preparatul din cultura bacteriană pe mediul lichid; pentru examenul
microscopic pe fond întunecat se foloseşte un condensator paraboloid.
2. Frotiul ( preparatul colorat)- se poate face: - din produsul patologic,
- din cultura bacteriană.
● frotiul foloseşte bacterii omorâte în cursul procesului de fixare, deci
pot fi urmărite toate celelalte aspecte exceptând mobilitatea.
● pentru realizarea unui frotiu dintr-o cultură bacteriană pe mediu lichid
sau din produsul patologic lichid, pe mijlocul lamei de microscop se depune
cu pipeta Pasteur o picătură.
● pentru frotiurile din produse patologice semisolide sau din culturi
bacteriene pe medii solide, pe mijlocul lamei de microscop se depune o
picătură de ser fiziologic în care se descarcă (cu emulsionare) ansa
bacteriologică pe care s-a încărcat o colonie bacteriană (sau respectiv un mic
fragment din produsul patologic semisolid).
Timpii de execuţie ai frotiului sunt: - etalarea
- uscarea
- fixarea
- colorarea
- prin etalare se înţelege întinderea frotiului de-a lungul lamei
lamei de microscop (se face cu ajutorul ansei bacteriologice).
- uscarea se realizează la temperatura laboratorului sau, pentru o uscare
rapidă, preparatul se poate trece prin flacăra becului de gaz, evitând însă încălzirea exagerată
a acestuia.
- fixarea se poate face prin metode fizice care constau în trecerea frotiul
tangent la flacără sau chimice utilizate pentru anumite coloraţii speciale. Prin fixare:
- bacteriile sunt omorâte (preparatul devenind astfel neinfecţios),
- bacteriile aderă de lama de microscop şi nu se vor desprinde în
cursul operaţiunilor de colorare şi spălare,
- colorarea.

TIPURI DE COLORAŢII FOLOSITE:

9
 1. coloraţii simple,
2. coloraţii combinate,
3. coloraţii speciale.
1. Coloraţia simplă are valoare limitată, de obicei strict orientativă.
- frotiul fixat se acoperă cu un singur colorant (oricare ar fi el- albastru
de metilen sau safranină) care se lasă să acţioneze timp de 2 minute,
- colorantul este îndepărtat cu jet de apă,
- preparatul se usucă (se preferă uscarea rapidă la flacără),
- se pune pe preparat o picătură de ulei de imersie (ulei de cedru),
- se examinează la microscop cu obiectivul de imersie după aducerea
condensatorului în poziţia cea mai în înaltă.
Toate frotiurile sau preparatele colorate se examinează cu obiectivul de imersie, folosind ulei
de cedru
2. Coloraţiile combinate: Gram,Ziehl-Neelsen, permit referiri la colorabilitatea
(tinctorialitatea) bacteriilor.

COLORAŢIA GRAM- permite diferenţierea bacteriilor în:

- Gram pozitive,
- Gram negative.
Timpii coloraţiei Gram (se porneşte ca la oricare altă coloraţie de la preparatul
fixat):
● violet de genţiană 2min,
● soluţie Lugol 2 min (pentru mordansare),
● alcool- acetonă 20 sec. (pentru decolorare sau diferenţiere),
● safranină sau fuxină diluată-2 min.
Între toţi aceşti timpi, preparatul se spală la jet de apă. După ce a fost îndepărtată şi
safranina, preparatul se usucă şi apoi se examinează la microscopul optic cu obiectivul de
imersie.
Mecanismul coloraţiei Gram – are la bază o reacţie care se desfăşoară între colorant
şi componentele peretelui celular bacterian.
La bacteriile Gram negative, lipidele din peretele celular se extrag în timpul
decolorării cu alcool- acetonă. În felul acesta permeabilitatea peretelui bacterian creşte, iar
complexul cristal violet-iod, părăseşte celula care se va putea recolora în roşu cu safranină.
La bacteriile Gram pozitive (la care peretele diferă ca şi structura şi compoziţie
chimică de cel al bacteriilor Gram negative), în timpul decolorării cu alcool- acetonă,
peretele se deshidratează, permeabilitatea sa scade, iar complexul cristal violet-iod rămâne în
celulă care păstrează culoarea violet.

10
 Microscopul optic

Secreţie uretrală-col.simplă-albastru de metilen Streptococi-cultură-col.Gram

Bacillus-cultură-col.Gram Clostridium tetani-col.Gram

11
Col.Gram-bacili Gram negativi Pneumococi-prod.patol. Col.Gram-Sarcina

Col.Gram-amprentă de splină-Bacillus anthracis Stafilococi-cultură-col.Gram

NOTE PERSONALE

12
LUCRAREA NUMĂRUL 3. PREPARATE MICROSCOPICE
COLORAŢIA ZIEHL-NEELSEN. COLORAŢII SPECIALE

COLORAŢIA ZIEHL-NEELSEN- permite diferenţierea direct în produsul

patologic a mycobacteriilor de alte bacterii (se bazează pe proprietatea de acido-alcoolo
rezistenţă care este caracteristică mycobacteriilor).
Timpii coloraţiei Ziehl- Neelsen sunt :
 fucsină concentrată 5 minute (se acoperă lama în întregime),
- se încălzeşte la flacăra becului de gaz până la emisia de vapori,
evitându-se însă fierberea colorantului !
 acid sulfuric 20%- 30 secunde,
 alcool etilic 96%- 30 secunde,
 albastru de metilen- 2 minute.
Între aceşti timpi preparatul se spală la jet de apă. După ce se îndepărtează albastrul
de metilen se usucă rapid şi se examinează la microscop folosind obiectivul de imersie.
Pe un frotiu din spută astfel colorat, mycobacteriile apar ca şi bacili acido-alcoolo
rezistenţi (roşii!) în timp ce toate celelalte bacterii, celulele epiteliale, celulele inflamatorii
sau detritusurile celulare apar colorate în albastru (pentru interpretare se va vedea capitolul
Diagnosticul de laborator al tuberculozei).
Mecanismul coloraţiei Ziehl- Neelsen:
Are la bază realizarea între fucsina concentrată şi acizii micolici din peretele celular
al Mycobacteriilor a unor legături prin paritate molară, foarte stabile şi rezistente la acţiunea
de decolorare a acidului şi alcoolului.
Coloraţiile combinate nu sunt utilizate pentru toate bacteriile. Pentru bacterii cum ar
fi Chlamydia, Rickettsia, Treponema, Leptospira şi altele sunt utilizate coloraţii speciale.

COLORAŢIILE SPECIALE sunt utilizate pentru evidenţierea structurilor

neobligatorii ale bacteriilor sau/şi în cazul bacteriilor pentru care nu se utilizează o coloraţie
combinată
COLORAŢII PENTRU SPORI

● Coloraţia Schaeffer- Fulton (cu verde malahit 5% şi safranină)

- se porneşte de la frotiul fixat.
Timpii coloraţiei
- verde malahit- 5 min. (preparatul se încălzeşte deasupra băii
de apă sau la flacără, dar numai până la emisia de vapori),
- spălarea la jet de apă- 30 sec.,
- safranină- 20 sec.,
- spălare, uscare şi examinare cu obiectivul de imersie.
Sporii (atât endosporii, cât şi sporii liberi) se colorează în verde, în timp ce
formele vegetative (sporangiile) apar colorate în roşu.
● Coloraţia Dorner (cu fucsină şi nigrosină)

13
 - se încarcă cultura bacteriană pe ansă şi apoi se suspendă cât
mai omogen în câteva picături de apă distilată sterilă (într-o
eprubetă sterilă),
- se adaugă 4-5 picături de fucsină concentrată (Ziehl),
- amestecul se încălzeşte în baia de apă 10 minute,
- cu ansa bacteriologică se preia din amestec şi se suspendă într-
o picătură de nigrosină depusă în prealabil pe o lamă de microscop,
- etalarea frotiului se face cu ajutorul unei alte lame de microscop
într-un strat cât mai subţire,
- preparatul se lasă să se usuce la temperatura camerei,
- se pune ulei de cedru,
- se examinează la microscop cu obiectivul de
imersie.

COLORAŢII PENTRU CAPSULĂ

● Coloraţia Burri (modificată Giens) este o coloraţie negativă,întrucât capsula

în sine nu se colorează.
- cultura bacteriană se omogenizează într-o picătură de tuş de
China,
- frotiul se etalează într-un strat subţire şi omogen,
- se usucă şi se fixează,
- se colorează cu safranină 2 minute,
- colorantul se scurge de pe preparat,
- se usucă, se pune o picătură de ulei de cedru şi se examinează la
microscop cu obiectivul de imersie.
Bacteriile apar colorate în roşu, înconjurate de un halou necolorat (capsula) pe fondul
negru al preparatului, dat de tuşul de China.
 Coloraţia cu albastru de toluidină este o coloraţie pozitivă care permite
colorarea efectivă a capsulei.

COLORAŢIA PENTRU CILI

● Coloraţia Zettnov
- frotiul se fixează cu formol 1%- 10 minute,
- se mordansează cu tanin 5% la care se adaugă
tartrat de stibiu (picătură cu picătură până
când se tulbură soluţia de tanin),
- se încălzeşte la 60°C timp de 2 ore,
- se spală cu apă distilată caldă,
- se colorează la cald cu sulfat de argint
amoniacal până la culoarea cenuşiu- negru,
- examinarea microscopică se face cu obiectivul
de imersie. Cilii apar coloraţi în negru.

14
 ALTE COLORAŢII SPECIALE

● Coloraţia Neisser se foloseşte pentru evidenţierea corpusculilor

metacromatici Babeş- Ernst (caracteristici bacilului difteric).
- frotiul se face din cultura dezvoltată pe mediul Löffler, se
etalează, se usucă şi se fixează.
Timpii coloraţiei:
- soluţie alcoolică de albastru de metilen 2 părţi
+ soluţie alcoolică de cristal violet 1 parte- 5
minute,
- spălare cu apă distilată,
- soluţie de Lugol- lactat- 1 minut,
- spălare cu apă distilată,
- soluţie de crisoidină- 30 secunde,
- colorantul se scurge! iar uscarea preparatului se face prin
tamponare cu hârtie de filtru.
Se examinează la microscop cu obiectivul de imersie. Corpusculii metacromatici
Babeş- Ernst se colorează în albastru- violet , iar corpul bacterian în galben- brun.

 Coloraţia Fontana-Tribondeau (impregnarea argentică)- folosită

pentru spirochete.
- se folosesc frotiuri uscate, dar nefixate !
- preparatul se acoperă cu soluţie Rugge de trei
ori câte 30 de secunde- se scurge,
- acid tanic 5%- 30 secunde- se încălzeşte uşor,
fără să se ajungă la emisie de vapori,
- spălare cu apă distilată,
- azotat de argint amoniacal- 1 minut- se
încălzeşte tot fără emisie de vapori,
- spălare cu apă distilată, uscare,examinare la microscop cu
obiectivul de imersie.
Spirochetele apar colorate în brun- negru pe un fond galben.

● coloraţia Giemsa (pentru spriochete, chlamydii, rickettsii),

● coloraţia Machiavello ( rickettsii),
● coloraţia Gimenez ( rickettsii, chlamydii).

15
 Produs patologic-col. Ziehl-Nelsen

Leptospira, col. Fontana Tribondeau Bacili, col. Giemsa

B.subtilis-col.safranină şi verde malahit pt. spori Klebsiella-col.Burri pt. capsulă

Rickettsia-amprentă de sac vitelin col.Gimenez Chlamidia col.Machiavello

16
NOTE PERSONALE

17
LUCRAREA NUMĂRUL 4. MEDII DE CULTURĂ. INOCULAREA
PROBELOR PATOLOGICE. CARACTERELE CULTURILOR
BACTERIENE

MEDII DE CULTURĂ. INOCULAREA PROBELOR PATOLOGICE

Multiplicarea în laborator a bacteriilor din ambiental,se numeşte cultivare bacteriană.

Bacteriile sunt cultivate în scopuri diferite:
-izolarea unei specii,dintr-un amestec de specii bacteriene,
-identificarea bacteriei izolate şi pe baza caracterelor de cultură,
-obţinerea de produse biologice in scop diagnostic,profilactic sau terapeutic.
Un mediu de cultură poate fi definit ca fiind substratul care oferă bacteriei sub o
formă direct asimilabilă, toate substanţele indispensabile nutriţiei şi creşterii sale, în condiţii
fizico-chimice optime de pH, umiditate, presiune osmotică şi temperatură.
Totalitatea bacteriilor care se dezvoltă pe mediul de cultură constituie o cultură
bacteriană.
Pornind de la diversitatea de scopuri pentru care sunt cultivate bacteriile,este evident
că şi mediile de cultură sunt foarte diferite,dar pentru ca un mediu de cultură să poată fi
utilizat,este obligatoriu ca el să îndeplinească următoarele condiţii :
- să asigure substanţele nutritive necesare creşterii şi multiplicării
- să asigure condiţiile de pH,presiune osmotică,aerare sau anaerobioză.
- să fie sterile.

 INGREDIENTELE folosite la prepararea unui MEDIU DE CULTURĂ:

 apă
 săruri minerale
 substanţe nutritive
o Peptone-obţinute din proteine prin hidroliza acidă, alcalină sau
enzimatică,
o Infuzii sau extracte de carne-bulionul nutritiv,
o Amestecurile de proteine native-oul, serul sanguin, sângele
defibrinat.
 agenţii de solidificare
o Agar-agar (extract de alge) se prezintă sub formă de fâşii sau pulbere
de culoare gălbuie-încălzit în apă la 90ºC, se dizolvă, iar soluţia astfel
obţinută, prin răcire sub 45ºC se solidifică; agarul are proprietatea de
reţine un volum foarte mare de apă, de 50 de ori volumul său. Pentru
prepararea mediilor solide se utilizează agar 2%. Pentru mediile
semimoi agar 0,5-1%, iar în cazul anumitor medii pentru anaerobi agar
4%.

18
 o alţi agenţi de solidificare –gelatina, care este însă solidă doar la
temperaturi mai mici de 25ºC; gelul de siliciu; oul coagulat-pentru
mediul Löwenstein-Yensen sau serul coagulat pentru mediul Löffler.
 alte ingrediente:
o indicatorii colorimetrici de pH-albastru de bromtimol,roşu fenol.
o agenţii selectivi-chimioterapice sau alte substanţe,colorante sau nu-
cristalul violet,verdele briliant,azida de sodiu.
o agenţii reducători-la prepararea mediilor pentru bacterii anaerobe,ca
de exemplu tioglicolatul de sodiu.
o substrate pentru teste biochimice- amino-acizi,zaharuri.

 CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURĂ:

 După starea fizică:
o Solide
o Lichide
 După compoziţie:
o Medii uzuale-lichide-apa peptonată şi bulionul nutritiv,
-solide-agarul nutritiv.
o Medii cu proteine native-lichide-bulion ser,bulion sânge,
-solide-agar ser, agar sânge, agar şocolatiu.
o Medii de îmbogăţire-sunt medii în fază lichidă
-mediul Chapman lichid, cu 15% Nacl,pentru stafilococi,
-mediul OCST, pentru Corynebacterium diphteriae,
-mediul cu selenit acid de sodium,pentru salmonelle ,
-apa peptonată cu pH bazic,8,5,pentru vibrioni.
o Medii selective-conţin agenţi selectivi,care inhibă multiplicarea
anumitor grupe de bacterii.
-mediul Chapman solid, cu7,5% Nacl,pentru stafilococi,
-mediul Tinsdale, pentru Corynebacterium diphteriae,
-mediul Löwenstein Yensen,pentru Mycobacterium
tuberculosis,
-mediul Sabouiraud,pentru fungi,
-medii selective cu lactoză pentru Enterobacteriaceae –
Drigalski,Levin,Leiffson,Mac Conkey,Istrate Meitert,CLED.
o Medii pentru bacterii anaerobe
-lichide –bulion thioglicolat de sodium,Brewer,Tarozzi,
-semisolide –Veillon,
-solide –cultivarea se face după tehnjca Ott –Nagler,Willis
Hobbs.
o Medii pentru teste biochimice- conţin un singur substrat-zahar sau
amino-acid, la care se adaugă sau nu, indicator colorimetric de pH.

 ÎNSĂMÂNŢAREA MEDIILOR DE CULTURĂ

19
 Însămânţarea se poate face în medii de cultură lichide,pe suprafaţa mediilor solide sau
în profunzimea mediilor semisolide.
Produsele patologice pot frecvent să conţină mai multe specii bacteriene, care trebuie
izolate în cultură pură. Acest deziderat poate fi atins prin utilizarea tehnicii de inoculare prin
epuizarea inoculului pe suprafaţa mediului din placa Petri. Inoculul se descarcă pe un sector
limitat al mediului, apoi cu ansa bacteriologică se trasează 4-5 striuri paralele, se sterilizează
ansa şi se repetă operaţiunea, până când sunt inoculate toate sectoarele din placa Petri. Pe
ultimele sectoare,după incubare se vor dezvolta colonii izolate a căror morfologie va putea fi
analizată.
Pentru realizarea antibiogramei prin metoda difuzimetrică, dar şi în alte situaţii cum
ar fi de exemplu urocultura cantitativă,se inoculează în pânză suprafaţa mediului, fie prin
inundare cu ajutorul pipetei Pasteur,fie cu ajutorul unui tampon îmbibat cu cultură bacteriană
cu care se şterge suprafaţa mediului pe cel puţin două direcţii perpendiculare.
Pentru inoculare în profunzimea mediilor semisolide se foloseşte ansa dreaptă, cu
care se înţeapă toată coloana mediului.
Pentru inoculări în mediile lichide se poate folosii fie ansa bacteriologică,fie pipeta
Pasteur- în cazul culturilor sau a produselor patologice lichide.

CARACTERELE CULTURILOR BACTERIENE

 ÎN MEDII LICHIDE
Se vor urmării elementele:
 Turbiditatea- marea majoritate a bacteriilor tulbură uniform mediile
lichide.
 Sedimentul- prezent sau absent,grunjos,de exemplu la culturile de
streptococi realizate în bulion glucozat, sau floconos, la enterobacterii.
 Pelicula- prezentă sau absentă, complectă sau incomplectă ca şi un
inel aderent de peretele eprubetei –exemple de bacterii care formează
peliculă completă: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, .Pseudomonas
aeruginosa.
 Culoarea–bacteriile care sintetizează pigmenţi cu eliberare
extracelulară: Pseudomonas aeruginosa modifică culoarea mediului de
cultură.
 Mirosul –este caracteristic pentru culturile anumitor specii bacteriene-
Pseudomonas aeruginosa degajă un miros aromatic, Citrobacter degajă
un miros de varză alterată, anaerobii un miros fetid.

 ASPECTUL COLONIILOR PE MEDII SOLIDE

 Relieful –bombat-colonii S- sau aplatizat –colonii R.

 Suprafaţa-netedă şi lucioasă-colonii S,sau rugoasă-colonii R.
 Conturul-bine delimitat-colonii S,festonat-colonii R.
 Mărimea-de la colonii punctiforme pentru streptococi, haemophili, la
colonii mari pentru Klebsiella.
 Pigmentarea- pigmenti nedifuzibili, cu pigmentarea strict a coloniilor-
auriu la Staphylococcus aureus, galben citrin la Sarcina, roşu la

20
 Serratia marcescens; pigmenţi difuzibili la Pseudomonas aeruginosa-
galbenverzui (fluoresceina) şi albastru(piocianina).
 Consistenţa-cremoasă- colonii S; uscată friabilă-colonii R; mucoidă,
gelatinoasă.
 Aderenţa- uşor detaşabile-colonii S, aderente şi greu detaşabile –
colonii R.
 Hemoliza- se urmăreşte pe mediile cu sânge şi depinde de tipurile de
hemolizine sintetizate de către bacterii.

 Majoritatea bacteriilor implicate în producerea infecţiilor umane la

izolarea lor din produsul patologic pe mediile de cultură, formează colonii
de tip S, excepţie fac Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium
diphteriae, Bacillus anthracis.

NOTE PERSONALE

21
1.Inocularea în medii lichide cu pipeta Pasteur 2. Inocularea cu ansa dreaptă în medii semisolide
şi cu ansa bacteriologică

1 2

3.Epuizarea inoculului pe suprafaţa mediilor 4. Inocularea în pânză

în plăci Petri

22
 PROPRIETĂŢILE BIOCHIMICE ALE BACTERIILOR

Studierea proprietăţilor biochimice (sau metabolice) ale bacteriilor izolate din

produsele patologice reprezintă o etapă esenţială pentru diagnosticul etiologic.
Se consideră că sunt necesare, cel puţin pentru anumite bacterii, baterii complete de
teste biochimice, pentru a putea încadra tulpina izolată în gen şi specie (de exemplu, în cazul
Enterobacteriaceaelor sunt necesare 24-28 de teste pentru un diagnostic precis de specie).
Aprecierea proprietăţilor metabolice necesită utilizarea unor medii de cultură speciale,
preparate cu un anumit substrat. După inocularea tulpinii bacteriene pe mediu şi o incubare
corespunzătoare, se apreciază dacă bacteria are sau nu capacitatea de a metaboliza substratul
respectiv. După analiza testelor utilizate pot fi făcute aprecieri diagnostice.
În funcţie de dotarea tehnică a laboratorului pot fi folosite medii preparate artizanal
sau kituri performante pentru astfel de teste. Chiar dacă utilizarea kiturilor reduce mult
timpul necesar diagnosticului , mediile preparate artizanal (în bucătăria de medii) urmăresc în
fapt acelaşi aspect- este sau nu metabolizat un substrat dat.
Testele metabolice folosite pentru identificarea bacteriilor pot fi grupate în:
● teste rezultate din metabolismul energetic bacterian:
- precizarea tipului de respiraţie,
- proba oxidării şi fermentării,
- cercetarea catalazei,
- reducerea nitraţilor la nitriţi,
- testul oxidazelor.
● testele rezultate din tipurile de fermentaţie:
- testul roşu metil,
- testul Voges- Proskauer,
- testul beta-galactozidazei,
- testul fermentării carbohidraţilor.
● testele rezultate din metabolizarea compuşilor azotaţi:
- testul indol,
- studierea decarboxilazelor amino- acizilor,
- evidenţierea producerii de hidrogen sulfurat,
- evidenţierea fenilalanindesaminazei,
- testul ureazei.
● teste rezultate din necesităţile nutritive minimale:
- utilizarea citratului de sodiu pe mediul Simmons,
- utilizarea acetatului de sodiu.

PRECIZAREA TIPULUI DE RESPIRAŢIE

Tulpina bacteriană se însămânţează în geloza Veillon prin incorporare. Se incubează
(24 de ore la 37°C).

23
 - Bacteriile - strict aerobe (ex: B. subtilis) se dezvoltă strict la
suprafaţa mediului,
- strict anaerobe (ex: Clostridiile) se dezvoltă strict în
profunzimea mediului,
- aerob- anaerob facultative se dezvoltă în toată
coloana mediului (ex: enterobacteriile).

PROBA OXIDĂRII ŞI FERMENTĂRII

● Se prepară o geloză dreaptă cu substratul (glucoză) şi cu un indicator colorimetric de pH
(albastru de bromtimol).
● Tulpina bacteriană se însămânţează prin înţepare cu ansa dreaptă în toată coloana mediului
● Se incubează (18 ore la 37°C).
● Pentru citirea reacţiei se urmăreşte culoarea mediului. Degradarea substratului conduce la
formarea de acizi, care virează indicatorul colorimetric.
Bacteriile - care degradează glucoza pe cale oxidativă
(ex: Pseudomonas aeruginosa) virează culoarea mediului în
galben numai la suprafaţă.
- care degradează glucoza pe cale fermentativă
(ex: Clostridiile) virează culoarea mediului în galben numai în
profunzime.
- care degradează glucoza pe cale oxidativă şi
fermentativă (ex: enterobacteriile) virează
culoarea în galben în toată coloana mediului.

REDUCEREA NITRAŢILOR LA NITRIŢI

● Tulpina bacteriană se însămânţează în apă peptonată suplimentată cu nitrat de potasiu
0,1%.
● Se incubează (24ore la 37°C).
● Acumularea nitriţilor în mediu se pune în evidenţă cu ajutorul unei substanţe indicatoare
(amestec de acid sulfanilic în acid acetic- 0,8 g la 100 ml acid acetic 30%- alfanaftilamina în
acid acetic- 0,5 g la 100 ml acid acetic 30%). Testul pozitiv (ex: enterobacterii) duce la un
viraj spre roşu a indicatorului.

TESTUL CATALAZEI
● Tulpina bacteriană testată (1colonie) se emulsionează într-o picătură de apă oxigenată.
Apariţia efervescenţei demonstrează prezenţa enzimei, care scindează apa oxigenată
(ex:stafilococii).

TESTUL OXIDAZELOR
● Citocromoxidaza (prezentă de ex. la Pseudomonas aeruginosa)se poate pune în evidenţă
folosind benzi indicatoare (soluţie alcoolică de alfanaftol şi soluţie apoasă 1% de clorhidrat
de dimetilparafenilendiamină).
● Se umectează banda indicatoare cu apă distilată, după care o colonie din tulpina testată se
descarcă cu ansa bacteriologică.Testul pozitiv se traduce prin apariţia unei culori albastre.

TESTUL ROŞU METIL

24
● Urmăreşte fermentarea substratului (cu scăderea pH-ului sub 5).
● Tulpina bacteriană testată se însămânţează în apă peptonată glucozată.
● Se incubează 18 ore la 37°C.
● Developarea reacţiei se face cu câteva picături de reactiv (soluţie alcoolică de roşu fenol-
0,1g în 300ml alcool).
- testul pozitiv (ex. enterobacterii cu excepţia Klebsiella, Enterobacter, Serratia,
Hafnia, Pantoea) se traduce prin apariţia culorii roşii= pH sub 5.
- testul negativ – culoare galbenă= pH peste 5.

TESTUL VOGES-PROSKAUER
● Urmăreşte fermentaţia acetoinică a glucozei.
● Tulpina bacteriană se însămânţează în apă peptonată glucozată.
● Se incubează 18 ore la 37°C.
● Se alcalinizează cu hidroxid de potasiu 40%.
● Se adaugă o soluţie alcoolică 5% de alfanaftol (fără să se amestece cu cultura).
● Se interpretează după câteva minute.
- testul pozitiv (ex. Klebsiella, Pantoea, Enterobacter, Serratia, Hafnia) este marcat
prin apariţia unui inel roşu- violaceu la interfaţa de contact.

TESTUL BETAGALACTOZIDAZEI
● Betagalactozidaza este o enzimă care participă la metabolizarea lactozei. Alături de ea la
scindarea substratului participă însă şi permeaza.
● Pentru a evita erorile de interpretare, în loc de lactoză se foloseşte un alt substrat-ortho-
nitrophenilgalactozidul (enzimă se produce numai în prezenţa substratului, fiind o enzimă
inductivă).
● Tulpina bacteriană se cultivă pe agar lactozat.
● Se prelevează cu ansa bacteriologică o colonie care se suspendă în 1-2 ml de ser fiziologic
● Se adaugă substratul (rondelă impregnată cu ortho- nitro phenilgalactozid).
● Citirea rezultatului se face după încălzire în palmă.
- testul pozitiv (ex E. coli) este semnificat de apariţia unei culori galbene.

FERMENTAREA ZAHARURILOR
● Mediul de cultură folosit este apa peptonată la care s-a adăugat substratul.
(un anumit zahar)- fie glucoza, fie zaharoza, fie lactoza, fie manitol) în proporţie de 1%,
precum şi un indicator colorimetric de pH.
● Tulpina bacteriană testată se însămânţează în mediu.
● Se termostatează 18 ore la 37°C.
- testul pozitiv (acidifierea mediului ) se traduce prin apariţia virajului de culoare.

TESTUL INDOL
● Urmăreşte evidenţierea triptofanazei (scindează triptofanul în indol, acid piruvic şi
amoniac).
● Se face o cultură de 24 ore la 37°C în apă peptonată.
● Reactivul indol (impregnat în benzi indicatoare sau soluţie picurată în cultură/ conţine 5g
paradimetilaminobenzaldehida în 75 ml alcool etilic 96% suplimentat cu 25ml acid
clorhidric concentrat.

25
 - testul pozitiv (ex. E. coli) este indicat de apariţia culorii roşu- violaceu.

DECARBOXILAZELE AMINO-ACIZILOR (lizina, arginina, ornitina)

● Tulpina bacteriană testată se însămânţează în apă peptonată suplimentată cu aminoacid (un
singur substrat) şi indicator colorimetric de pH.
● Se incubează 24 ore la 37°C.
- testul pozitiv (prezenţa decarboxilazei) este relevat de virajul indicatorului
corespunzător zonei bazice (prin decarboxilarea amino- acizilor rezultând compuşi alcalini).

PRODUCEREA DE HIDROGEN SULFURAT

● Cisteindesulfhidraza descompune aminoacizii cu sulf prezenţi în peptonele folosite la
prepararea mediului de cultură.
● Mediul de cultură este un agar drept, suplimentat cu acetat de plumb, tulpina bacteriană
testată se însămânţează prin înţepare cu ansa dreaptă în toată coloana mediului.
● Se incubează 18 ore la 37°C.
- testul pozitiv (ex Salmonella, Proteus) este relevat de culoarea neagră a mediului,
datorată formării sulfurii de plumb.

EVIDENŢIEREA FENILALANINDESAMINAZEI

● Enzima scindează fenilalanina cu formare de acid fenilpiruvic.

● Mediul de cultură este un agar înclinat preparat cu substratul (fenil-alanina).
● Tulpina bacteriană testată se însămânţează pe panta agarului.
● Se incubează 18 ore la 37°C.
● Developarea reacţiei se face cu clorură ferică.
- testul pozitiv (ex. Proteus, Providencia, Morganella)- se traduce prin înverzirea
mediului şi a coloniilor (acidul fenilpiruvic dă reacţia de culoare cu clorură ferică).

TESTUL UREAZEI
● Enzima scindează ureea cu formare de amoniac (compus bazic) şi dioxid de carbon.
● Mediul de cultură conţine substratul (urea) şi un indicator colorimetric de pH.
● Tulpina bacteriană testată se inoculează în mediu.
● Se incubă 18 ore la 37°C.
- testul pozitiv (ex. Proteus, Yersinia) este indicat de virajul corespunzător zonei
bazice.

UTILIZAREA CITRATULUI DE SODIU PE MEDIUL SIMMONS

● Se prepară un mediu minimal cu citrat de sodiu care se solidifică în eprubetă în poziţie
înclinată (mediul conţine şi indicator colorimetric).
● Se inoculează pe panta agarului.
● Se incubează 18 ore la 37°C.
- testul pozitiv (ex. Salmonella, Providencia) este indicat de dezvoltarea coloniilor
bacteriene şi de virajul culorii mediului.

UTILIZAREA ACETATULUI DE SODIU

● Mediul minimal preparat va conţine acetat de sodiu şi indicatorul colorimetric.

26
● Se procedează ca şi la testul anterior.
- testul pozitiv (ex. E. coli) este indicat de acelaşi aspect ca şi în cazul utilizării
citratului.

Bacillus-agar nutritiv-col.R Pseudomonas aeruginosa-agar nutritiv-pigmenţi

difuzibili

Staphylococcus aureus-agar sânge Streptococcus pyogenes-agar sânge

hemoliză beta şi alfa

Drigalsky-col.lactozo pozitive-E.coli Drigalsky-col.lactozo negative-Salmonella

Drigalsky-Klebsiella-cameleonaj Drigalsky-Proteus-invazie

27
Levin-col.lactozo pozitive-E.coli Levin –col.lactozo negative-Salmonella

Löwenstein-Yensen mediul Tarozzi agar sânge-tehnica Ot

Staphylococcus aureus-Chapman Sarcina pe agar nutritiv

28
teste biochimice în eprubete-medii artizanale API-kit de teste biochimice

NOTE PERSONALE

29
LUCRAREA NUMĂRUL 5. ANTIBIOGRAMA

ANTIBIOGRAMA

Definiţie

Prin antibiogramă, se înţelege determinarea sensibilităţii unei tulpini bacteriene, care a

fost izolată dintr-un produs patologic, faţă de diferitele chimioterapice.
Instituirea terapiei cu antibiotice rămâne, pentru medicul practician, o problemă de
mare responsabilitate medicală, fiind necesară cunoaşterea câtorva reguli, care să asigure
succesul terapiei cu antibiotice:
- antibiograma se face după stabilirea diagnosticului etiologic,
- tratamentul se realizează în funcţie de rezultatele antibiogramei, alegând
chimioterapicele faţă de care bacteria izolată are cea mai mare sensibilitate,
- dintre două sau mai multe chimioterapice cu eficacitate asemănătoare, se va
alege cel mai puţin toxic pentru conturarea schemei terapeutice,
- dacă se impune asocierea a două sau mai multe chimioterapice,se va ţine
obligatoriu seama de efectul sumării lor şi se vor asocia numai cele care
acţionează sinergic,
- se va ţine seama obligatoriu de stările fiziologice şi patologice preexistente
episodului infecţios, evitându-se chimioterapicele cu toxicitate crescută la
gravide şi lăuze, precum şi cele hepato sau nefrotoxice la bolnavi cu
afecţiuni cronice hepatice sau respectiv renale.
Există mai multe metode de efectuare a antibiogramei:
 Metoda diluţiilor în medii lichide:
Are ca scop determinarea concentraţiei minime inhibitorii (CMI) a fiecărui antibiotic,
care se exprimă în μg/ml. CMI este concentraţia cea mai mică de antibiotic care inhibă
multiplicarea bacteriană. Se fac diluţii succesive de antibiotic în mediu lichid şi se adaugă
câte o picătură din inoculul bacterian. Se incubează la 37°C şi se citeşte concentraţia cea mai
mică de antibiotic la care nu s-a dezvoltat bacteria (ultima eprubetă limpede indică limita de
sensibilitate a microorganismului faţă de chimioterapic). Adăugând la mediu un indicator de
pH (roşu fenol) se poate reduce timpul de citire a rezultatelor la 3-6 ore deoarece virarea
culorii mediului în urma modificării pH-ului datorită dezvoltării microbiene (pH acid) apare
mai rapid decât tulburarea mediului.

30
 Tuburi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
Mediu în ml 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Sol. Streptomicină 1 1 1 1 1 1 1 1 1
200/ml
Cultura de testat Câte o picătură în fiecare tub
diluată
Diluţiile finale de 100 50 25 12,5 6,25 3,1 1,56 0,78 0,39 ……..
streptomicină

 Metoda difuzimetrică în plăci Petri

Este o metodă de lucru comodă,în condiţiile unui rulaj mare de probe,dar prezintă
dezavantajul de a nu putea să stabilească concentraţia minimă inhibitorie.
Tehnica:
Cultura bacteriană de 24 de ore se diluează, apoi se însămânţează în pânză pe
suprafaţa unei geloze Mueller-Hinton, conţinută într-o placă Petri. Se lasă să se usuce
suprafaţa mediului lângă flacără cu capacul cutiei întredeschis şi, pe mediul uscat, se depun
cu o pensă microcomprimate conţinând diferite chimioterapice. Antibioticul difuzează în
geloză conform unui gradient de concentraţie . După o incubare de 18-24 de ore la 37°C se
interpretează antibiograma, măsurând- în mm- diametrul zonelor de inhibiţie din jurul
microcomprimatelor de chimioterapice. Valorile obţinute se compară cu valori din tabele
pentru tulpini standard. O tulpină poate fi sensibilă, intermediar sensibilă sau rezistentă.
Sensibilitatea sau rezistenţa unei bacterii faţă de antibiotice este o proprietate de
tulpină şi nu de specie.

 Metoda E-test

Este o metoda care îmbină avantajul metodei difuzimetrice- comoditatea (uşor de

utilizat în condiţiile unui rulaj mare de probe), cu avantajul pe care-l oferă metoda diluţiilor
(capacitatea de a stabili concentraţia minimă inhibitorie- CMI).
Se lucrează pe medii de cultură în plăci Petri (la fel ca şi metoda difuzimetrică), însă
în locul microcomprimatelor de chimioterapice, foloseşte benzi impregnate cu
chimioterapice. Concentraţia de chimioterapice (notată pe bandă) descreşte de la extremitatea
ce prezintă simbolul chimioterapicului spre extremitatea opusă.
Se incubează tot 18 ore la 37 ˚C, iar la citirea rezultatelor se urmăreşte locul în care
zona de inhibiţie întâlneşte banda. În punctul respectiv se citeşte CMI.
Pentru interpretarea rezultatelor se iau în considerare strict zonele de inhibiţie pe care
nu s-a dezvoltat nici măcar o singură colonie bacteriană.
 Alte metode
Pentru bacteriile anaerobe,se foloseşte metoda difuzimetrică în dublu strat de agar.
Pentru Mycobacterium tuberculosis,antibiograma se lucrează direct pe mediul
Löwenstein Yensen.

31
Metoda difuzimetrică în plăci Petri
1. Pseudomonas aeruginosa 2. Pseudomonas aeruginosa

3. Klebsiella pneumoniae 4. Escherichia coli

5. Escherichia coli – BLSE 6. Serratia marcescens

E-test : Streptococcus pneumoniae

32
NOTE PERSONALE

33
LUCRAREA NUMĂRUL 6. REACŢII ANTIGEN-ANTICORP

ANTIGENUL = orice substanţă care este capabilă să declanşeze în organism un

răspuns imun, sau in vitro să neutralizeze anticorpii specifici.
 Răspunsul imun poate fi de natură umorală (cu formarea de anticorpi specifici) sau
celulară. Răspunsul imun celular se poate manifesta şi în sens negativ, ca şi toleranţă
imunologică.
 O substanţă poate fi recunoscută drept proprie (self) de un organism sau drept străină
(non-self) de un lat organism; în consecinţă, antigenul (in vivo) există numai în raport
cu organismul receptor.
 Atributele antigenului sunt :
Antigenicitatea = capacitatea substanţei de a se combina cu anticorpii
respectivi, indiferent dacă are sau nu capacitatea de a stimula formarea lor.
Imunogenicitatea = capacitatea antigenului de a stimula formarea anticorpilor.
 Aglutinogenele – sunt antigene particulate care participă la reacţiile de aglutinare.
 Precipitogenele – sunt macromolecule (în soluţie) şi participă la reacţiile de
precipitare.

ANTICORPII (Imunoglobulinele) = glicoproteine sintetizate ca şi răspuns la un

stimul antigenic. Limfocitul B activat de stimulul antigenic trece printr-o serie de etape până
la stadiul de plasmocit, principala celulă care secretă imunoglobulinele-anticorpi.
 Aglutininele aparţin clasei de imunoglobuline M şi participă la reacţiile de aglutinare.
 Precipitinele aparţin clasei de imunoglobuline G şi participă la reacţiile de precipitare.
 Ca atare pentru obţinerea de aglutinine se practică imunizări de scurtă durată, iar
pentru precipitine imunizări de lungă durată.

REACŢIILE ANTIGEN-ANTICORP
Când un antigen şi anticorpul său specific se apropie de latul în mediul apos, cei doi
reactanţi intră sub influenţa unor forţe de atracţie. Legătura care se formează este o legătură
de tip van der Waals.
Pentru formarea complexului antigen-anticorp este necesar ca cei doi reactanţi să se
apropie la o distanţă de 0,1-0,2 nm.

Reacţia de aglutinare bacteriană

Aglutinarea bacteriană este o reacţie antigen-anticorp de agregare, în care antigenul

este reprezentat de celule bacteriene sau fragmente de celule bacteriene în suspensie (antigen
particulat). Sub acţiunea anticorpilor specifici, complexele imune antigen-anticorp, formează
reţele tridimensionale în prezenţa unor electroliţi din mediu şi în anumite condiţii de
temperatură şi pH, constituind agregate vizibile. Reacţia de aglutinare se foloseşte atât în
identificarea unor bacterii pe baza proprietăţilor antigenice, cât şi pentru evidenţierea
anticorpilor aglutinanţi din serul de bolnav.
Tehnici de efectuare a reacţiei de aglutinare

34
 Aglutinarea pe lamă. Se foloseşte preponderent în diagnosticul bacteriologic, pentru
identificarea rapidă pe baza proprietăţilor antigenice a unor tulpini izolate din produsul
patologic şi mai puţin în diagnosticul serologic.
Se depune pe o lamă curată şi degresată o picătură de ser imun şi alături o picătură de
soluţie salină fiziologică. Din cultura bacteriană de 18-24 de ore pe geloză nutritivă, obţinută
pornind de la o colonie izolată, se ia cu ansa o cantitate mică care se suspendă omogen în
picătura de ser imun, apoi se repetă operaţia în picătura de soluţie salină fiziologică. În cazul
unei corespondenţe antigen-anticorp, în picătura de ser imun, bacteriile vor fi aglutinate sub
formă de grunji fini, albi, vizibili cu ochiul liber. În picătura de soluţie salină fiziologică
(aglutinare martor) bacteriile rămân în suspensie omogenă; în cazul în care apare aglutinare,
aceasta este nespecifică, spontană, dată de obicei de culturi în faza R.
Aglutinarea pe lamă se poate folosi şi în diagnosticul serologic, în scop de triaj. Dacă
o astfel de reacţie se pozitivează, se va continua obligatoriu cu reacţia de aglutinare în tuburi
(cantitativă).
Aglutinarea în tuburi este o reacţie cantitativă, care se foloseşte predilect pentru
diagnosticul serologic; se efectuează în 6 epubete în care se realizează diluţii crescătoare (în
ser fiziologic) din serul de cercetat, la care se adaugă aceeaşi cantitate de antigen standard.
Titrul reacţiei este reprezentat de diluţia cea mai mare de ser la care se mai observă
aglutinarea, cu caracteristicile sale, de aglutinare somatică, sau respectiv flagelară.

Schema reacţiei de aglutinare în tuburi.

Eprubeta 1 2 3 4 5 6( martor)
nr.
Sol.salină 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
fiziologică
Ser de 0,5 diluţii succesive
cercetat
dil.1/10
Antigen 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Diluţii 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 -
finale ale
serului

În aglutinarea bacteriană, după natura şi localizarea antigenului care participă la

reacţie, există două tipuri principale de aglutinare: somatică sau aglutinare “O” şi ciliară sau
aglutinare “H”.
Aglutinarea ”O” sau somatică este data de antigenul “O”, somatic, care intră în
constituţia peretelui celular. Antigenul “O” este de natură glucido-lipido-polipeptidică,
termostabil, alcoolo-rezistent şi distrus de formol.
Aglutinarea “O” apare sub forma unor grunji fini, care nu disociază la o agitare
brutală: apare mai lent, necesitând incubare de 2 ore la 52° C în baia-marină, urmată de 20 de
ore la temperatura camerei. În aglutinarea “O” bacteriile se unesc între ele prin alipirea cap la
cap (aglutinare polară).
Aglutinarea “H”, flagelară este dată de antigenul “H”, prezent la bacteriile mobile,
antigen de natură proteică, termolabil, distrus de alcool, rezistent la formol. Aglutinarea “H”
apare sub forma unor flocoane care formează un sediment abundent lax, care dispare la

35
agitare brutală; aglutinarea “H” apare mai rapid, fiind suficientă o incubare de 2 ore la 52° C
în baia-marină. În aglutinarea “H” bacteriile se unesc prin flageli.
Cele mai importante reacţii de aglutinare folosite în diagnosticul serologic al bolilor
infecţioase sunt: reacţia Widal în febra tifoidă şi febrele paratifoide, reacţia Wright în
bruceloză şi reacţia Weil-Felix în tifosul exantematic şi alte rickettsioze. În reacţia Widal se
folosesc atât antigenele “O” cât şi “H” de la Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A şi
Salmonella paratyphi B pentru a evidenţia anticorpii corespunzători din serul de bolnav.
Reacţia de aglutinare pasivă sau aglutinarea pe suport se utilizează atunci când
antigenul este o soluţie moleculară. În urma fixării pe un suport particulat acesta devine
aglutinabil în prezenţa serului imun. Astfel de reacţii se pot executa dupa tehnici variate, care
sunt în funcţie de natura particulelor utilizate ca suport şi de modul în care se face legătura
antigenului de particulele respective. Reacţiile se pot folosi atât la identificarea unui antigen,
cât şi la cercetarea anticorpilor corespunzători folosind un antigen cunoscut.
Particulele folosite sunt fie inerte ca: latex, polistiren, bentonită, colodiu, fie se
folosesc hematii umane de grup ”O” sau hematii de animal- în acest caz vorbim de
hemaglutinare pasivă. Dacă antigenul este polizaharidic, el poate fi uşor adsorbit pe hematii
native. Dacă antigenul este de natură proteică, adsorbţia lui pe hematii se face numai după ce
în prealabil acestea au fost tratate cu acid tanic (hematii tanate) sau cu alţi fixatori
(glutaraldehida).
Exemple de reacţii de aglutinare pasivă în care antigenul este adsorbit de particule
inerte de latex polistiren.
- în evidenţierea factorului reumatoid (FR= imunoglobuline anticorp care
apare faţă de Ig G proprii, constituite majoritar din Ig M.)
Testul latex mai poate fi utilizat:
- pentru a detecta antigene de Haemophylus, pneumococ sau antigen de
meningococ în LCR, ser, secreţie faringiană.
- pentru cercetarea anticorpilor anti-ADN în diagnosticul de lupus eritematos
diseminat, atunci când particulele de latex sunt acoperite de ADN.
Exemple de aglutinare pasivă în care antigenul este adsorbit pe hematii:
- pentru testarea anticorpilor antitoxici şi a anticorpilor ce apar faţă de
diferite antigene bacteriene ( antigene “O”, antigene polizaharidice, etc.)
- în diagnosticul tiroiditei Hashimoto (boală autoimună) folosind hematii
tanate sensibilizate cu extract tiroidian.
- în diagnosticul poliartritei reumatoide, reacţia de hemaglutinare pasivă
Waaler-Rose. Principiul acestui test constă în proprietatea (capacitatea) pe
care o au eritrocitele de berbec sensibilizate cu hemolizină (anticorpi
antihematii de berbec) de a fi aglutinate de seruri care conţin factor
reumatoid.
Ca o reacţie derivată din hemaglutinarea pasivă, se foloseşte astăzi tot mai mult
reacţia de inhibare a hemaglutinării pasive. O astfel de reacţie se foloseşte în diagnosticul
imunologic al sarcinii pentru cercetarea gonadotrofinei corionice. Într-un prim timp urina
femeii este pusă în contact cu un ser imun antigonadotrofină. În caz de sarcină, gonadotrofina
corionică este prezentă în urină şi în consecinţă va avea loc reacţia cu anticorpii
corespunzători din serul imun. Într-un al doilea timp, amestecul este adăugat unei suspensii
de hematii tanate, sensibilizate la gonadotrofină. Dacă anticorpii antigonadotrofină din serul
imun utilizat în primul timp au rămas liberi, vor aglutina hematiile şi reacţia va demonstra

36
absenţa gonadotrofinei în urină- deci diagnostic negativ de sarcină. Dacă, din contră,
anticorpii antigonadotrofină din serul imun au fost saturaţi de gonadotrofina prezentă în urina
femeii însărcinate, aglutinarea hematiilor sensibilizate cu gonadotrofină nu va mai avea loc
(inhibarea hemaglutinării), diagnosticul de sarcină fiind în acest caz pozitiv.
În imunologia bacteriană reacţia se foloseşte mai ales pentru a preciza punctul
dominant dintr-o grupare determinată de un antigen.

Reacţia de precipitare

Este o reacţie antigen-anticorp de agregare, în care antigenul este reprezentat de

macromolecule în soluţie coloidală. Punerea în contact a antigenului cu anticorpul
corespunzător duce la formarea unor coplexe antigen-anticorp care precipită atunci când
elementele ce participă în reacţie se găsesc în proporţie optimă. Are mai multe variante în
funcţie de mediul în care se desfăşoară reacţia. Ţinând cont de faptul că în reacţia de
precipitare, antigenul, ca soluţie coloidală, poate fi bine caracterizat chimic (polizaharizi
bacterieni purificaţi, proteine bacteriene, antigene sintetice şi semisintetice), aceasta conferă
reacţiei un mare grad de specificitate şi sensibilitate, pretându-se foarte bine şi la analize
imunochimice de fineţe.
Tehnici de efectuare a reacţiei de precipitare:
1. Precipitarea inelară-antigenul şi serul imun sunt puse în contact în tuburi cu
diametrul mic, tuburi capilare, în aşa fel încât să nu se amestece, ci să formeze o interfaţă de
contact la nivelul căreia, prin creerea unei zone de concentraţie optimă de antigen-anticorp,
să pară un inel de precipitare (are caracter istoric, nu se mai foloseşte în prezent).
În diagnosticul bolilor infecţioase, pot fi menţionate:
- reacţia Ascoli- se utilizează în diagnosticul retrospectiv al anthraxului.
- reacţia Vincent-Bellot- în diagnosticul meningitei cerebro-spinale epidemice.
- identificarea de grup a streptococilor.

2. Reacţia de floculare este o reacţie în care precipitarea apare prin amestecul

antigenului cu serul imun (în toată masa amestecului) sub formă de flocoane. Această reacţie
se utilizează în principal pentru titrarea toxinelor bacteriene şi a serurilor antitoxice pornindu-
se de la observaţia că flocularea apare prima dată în eprubeta în care există o proporţie
optimă de antigen şi anticorp (reacţia de floculare Ramon). În felul acesta, cunoscând titrul
serului se determină cu uşurinţă valoarea antigenică a toxinei şi invers.
Tehnica de lucru constă în repartizarea într-o serie de eprubete a unor cantităţi crescânde de
ser antitoxic (Ac) peste care se adaugă o cantitate constantă de toxină (Ag).

Eprubeta 1 2 3 4 5
nr.
Ser 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
antidifteric
100
U.A/ml
Sol.sal.fiz. 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
Toxina de 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
cercetat

37
 Eprubetele se pun în baia marină la 52º C şi se urmăreşte (la intervale de 5 minute) care
este prima eprubetă în care apare flocularea. Aceasta va reprezenta practic unirea unor
cantităţi echivalente de antigen şi anticorp.
Să luăm ca exemplu titrarea valorii antigenice a toxinei difterice: se lucrează după schema de
mai sus cu un ser antidifteric care are un titru cunoscut de 100/ UA/ml.
Dacă reacţia apare iniţial în tubul 3 care conţine 0,3 ml ser antitoxic, deci 30 unităţi
antitoxice, ţinând cont de faptul că o limită floculantă este neutralizată de o unitate antitoxică,
înseamnă că 30 unităţi antitoxice au neutralizat 30 de limite floculante; toxina titrată are
valoare de 30 de limite floculante (limita floculantă este unitatea de măsură in vitro pentru
toxina difterică).
3. Precipitarea în gel utilizează gel de agar sau agaroză (agar hidrolizat şi purificat)
ca mediu în care unul sau ambele elemente care întră în reacţie (antigen - anticorp) difuzează,
diametrul moleculelor de antigen şi anticorp fiind mai mic decât diametrul porilor gelului.
Întâlnirea celor două elemente în proporţie optimă duce la apariţia unei linii sau zone opace
de precipitare, vizibile în gelul transparent.
Se poate realiza după următoarele tehnici:
a) difuzia simplă ( difuzează numai unul dintre reactanţi, celălalt găsindu-se înglobat
în mediul de difuzie).
- metoda Oudin: într-o eprubetă se pune o coloană de gel în a cărei masă este
inclus serul precipitant: la suprafaţă se toarnă soluţie de antigen care
difuzează în mediu şi în raport cu capacitatea de difuziune a fiecărei
fracţiuni antigenice se formează la întâlnirea cu anticorpii benzi de
precipitare.
- metoda difuziei radiale Mancini: se utilizează, de exemplu, pentru
determinarea cantitativă din serul de bolnav a unor fracţiuni proteice, cum ar
fi IgG, IgM, IgA (imunograma) sau a C3, transferinei, etc. Imunograma
reprezintă cea mai frecventă utilizare a difuziei radiale în laboratorul clinic.
Reacţia este realizată prin înglobarea anticorpilor în mediul de difuzie.
b) dubla difuzie (difuzează ambii reactanţi)
- metoda Ouchterlony: pe o placă de sticlă se toarnă agaroză 1% în soluţie
tampon, în care după solidificare, se fac godeuri. În godeul central, se
pune serul imun (Ac), iar în celelalte godeuri, se pun diferite Ag. Se
incubează în camera umedă câteva zile. Dacă există corespondenţă între
Ag şi Ac se formează linii de precipitare, numărul lor fiind în funcţie de
complexitatea antigenului. Metoda poate fi aplicată pentru identificarea
unor antigene bacteriene, virale, proteine patologice care apar în serul
bolnavilor (proteina C reactivă, α-fetoproteina) şi alte proteine de diverse
provenienţe. Un tip particular de dublă difuzie îl reprezintă metoda Elek
pentru evidenţierea tulpinilor toxigene de bacil difteric.
c) difuzia în câmp electric
● imunoelectroforeza (IEF) este o metodă care asociază principiul
electroforezei (EF) cu principiul difuziunii în gel. Astfel, într-un prim timp, se
efectuează o EF în gel de agaroză prin care, datorită mobilităţilor electroforetice
diferite, componentele unui amestec antigenic complex (aşa cum sunt în mod
obişnuit antigenele naturale) se separă foarte bine. În al doilea timp, se adaugă un ser

38
 imun corespunzător şi se lasă să reacţioneze, în dublă difuzie, cu antigenele separate.
Când are loc întâlnirea antigenului cu anticorpul corespunzător în proporţii
convenabile, apare un arc de precipitare. Fiecare fracţiune proteică are un arc
carcteristic ca poziţie şi morfologie. IEF poate fi asociată cu coloraţii speciale pentru
a identifica mai bine fracţiunile antigenice. Această metodă, permiţând o analiză
amănunţită a constituienţilor antigenici, este foarte utilă în:
- determinarea numărului de fracţiuni prezente într-un antigen complex;
- determinarea clasei de Ig şi a altor proteine din plasma sangvină, cu ajutorul
unui ser imun anti ser de om.
- controlul purificării unor preparate antigenice:
● contraimunelectroforeza (CIEF): datorită încărcării electrice diferite,
antigenul şi anticorpul migrează în sens contrar într-un câmp electric, şi la locul de
întâlnire cu anticorpul corespunzător (care se deplasează prin electroendosmoză), se
produce în gel o linie de precipitare. Metoda se foloseşte pentru determinarea unor
antigene a căror migrare în câmp electric se face spre anod (antigenele virusului
hepatitei B-HBs, α-fetoproteina, polizaharide şi alte antigene polimicrobiene). Pe o
lamă pe care s-a turnat gel de agaroză, se taie 3-4 şiruri de perechi de godeuri egale la
distanţă de 0,3-0,5 cm între ele. Lama este pusă în cuva de electroforeză şi în
godeurile fiecărui şir plasate spre catod se introduc probele de cercetat (Ag), în timp
ce, în godeurile plasate către anod se introduce serul imun corespunzător. La
întâlnirea celor 2 elemente se formează o linie sau un arc de precipitare. Durata
migrării este de aproximativ o oră.

Reacţii antigen-anticorp cu participarea complementului

Participarea complementului (C’) în reacţiile imune a fost iniţial detectată prin

capacitatea de a induce liza bacteriilor sensibilizate de anticorpi (bacterioliza respectiv
imunohemoliza).
Reacţia de bacterioliză
În cazul în care antigenul care intră în reacţie este o celulă bacteriană, sub acţiunea
anticorpului specific şi a C’, bacteria suferă o serie de modificări, care în final duc la liza
celulei. Prima observaţie de acest fel a fost făcută pentru vibrionul holeric şi i s-a dat
denumirea de fenomenul de bacterioliză sau de vibrioliză a lui Pfeiffer, putând fi evidenţiat
in vivo sau in vitro.
Fenomenul de bacterioliză a mai fost demonstrat şi pentru alţi bacili Gram negativi:
bacil piocianic, bacil dizenteric, etc.
Bacterioliza, ca orice fenomen de citoliză, necesită participarea tuturor
componentelor complementului.

Efectul bactericid al complementului

În prezenţa anticorpilor specifici, complementul poate exercita un efect bactericid asupra
unor bacterii Gram negative. În vivo acest efect, care poate fi declanşat şi pe cale alternativă,
se pare că rezultă din acţiunea combinată a complementului şi lizozimului asupra peretelui
celular bacterian.

Fenomenul de imunhemoliză

39
 În prezenţa anticorpilor specifici antihematie (hemolizina sau ser hemolitic) şi a C’,
hematiile sunt lizate. Acest fenomen de hemoliză imună stă la baza determinării activităţii C’
prezent în ser, plasmă, lichide extravasculare.
În titrarea activităţii hemolitice a C’ se ia în consideraţie diluţia cea mai mare de C’,
care lizează 50% din hematii în prezenţa unei cantităţi optime de anticorpi antihematie,
notându-se DH50 ( doza hemolitică pentru 50% dintre hematii).
Fenomenul de imunhemoliză este utilizat, cu rol de indicator, în RFC.

Reacţia de fixare a complementului (RFC)

În cazul în care reacţiile antigen anticorp au loc în prezenţa C’, acesta se fixează
numai pe complexul imun format. Fixarea C’ pe complexul antigen-anticorp poate fi indirect
evidenţiată, prin fenomenul de imunhemoliză, utilizând sistemul hemolitic drept indicator.
La RFC participă două sisteme antigen-anticorp:
a) primul sistem Ag-Ac (sistemul de cercetat) este format din serul de cercetat care conţine
anticorpii (diagnostic serologic) şi antigenul standard.
b) al doilea sistem Ag-Ac (sistemul de referinţă sau sistemul hemolitic) are rolul de a
evidenţia fixarea complementului pe primul sistem Ag-Ac. Este format din eritrocite de
oaie şi hemolizină (anticorpi antieritrocite).
Între cele două sisteme oscilează C’.
În prezenţa anticorpilor în serul de cercetat, se formează complexe antigen-anticorp pe
care se fixează complementul, care se consumă din mediul de reacţie. Pentru partea a duoa a
reacţiei (când se adaugă sistemul hemolitic) nu mai rămâne complement liber, astfel încât
hematiile rămân intacte (nelizate), reacţia fiind interpretată ca şi pozitivă.
Dacă în serul de cercetat nu se găsesc anticorpi specifici pentru antigenul standard,
complementul nu are unde să se fixeze şi rămâne liber în mediul de reacţie, astfel încât în
partea a doua a reacţiei se poate fixa pe sistemul hemolitic, şi determină liza eritrocitelor;
reacţia este interpretată ca şi negativă.
RFC se execută în doi timpi:
1. Se pun în reacţie serul de cercetat, antigenul şi C’, incubându-se la 37˚C timp de
o oră, sau la +4˚C timp de 20 de ore, conform procedeului utilizat.
2. Se adaugă apoi sistemul indicator ( sistemul hemolitic) cu o nouă incubare la
37˚C, după care reacţia se citeşte apreciind prezenţa sau absenţa hemolizei
( reacţie negativă, sau respectiv pozitivă).
RFC se poate utiliza pentru identificarea unui antigen necunoscut, cu ajutorul
serurilor standard cunoscute, dar mai ales în scopul testării anticorpilor necunoscuţi (ser de
bolnav) folosind antigene standard cunoscute.
Materialele necesare reacţiei sunt:
1. Ser de bolnav inactivat 30 de minute la 56˚C înainte de reacţie pentru distrugerea
complementului propriu.
Serurile standard utilizate pentru identificări de antigene se tratează la fel.
2. Antigene cunoscute sau de cercetat, pot fi reprezentate de suspensii bacteriene,
extracte bacteriene, suspensii virale, extracte de ţesuturi, etc.
Antigenele trebuie titrate pentru a stabili valoarea antigenică sau titrul (cantitatea
minimă de antigen, care în prezenţa anticorpilor specifici fixează complementul).

40
 3. Complementul: în mod obişnuit se foloseşte serul de cobai (care conţine cantităţi mari
şi în general uniforme de complement), fie proaspăt recoltat, fie conservat prin
diverse procedee. Pentru a alege cantitatea optimă care trebuie pusă în reacţie,
complementul se titrează în prealabil, ori de câte ori se execută RFC.
Există mai multe procedee de titrare a complementului, din care exemplificăm o
tehnică folosită în serologia sifilisului.
Într-o serie de tuburi se pun cantităţi crescânde de complement diluat 1/10, începând
de la 0,1 până la 0,5. Se adaugă soluţie salină fiziologică până la cantitatea de 1,5 ml
pe tub şi apoi câte 1 ml sistem hemolitic. Se agită şi se incubează 30 de minute la
termostat, după care se citeşte. Cantitatea minimă de complement care produce liza
completă a hematiilor reprezintă titrul complementului, sau 1 unitate complement. În
reacţia de fixare se foloseşte cantitatea din tubul imediat următor; de exemplu dacă
liza totală a hematiilor a avut loc în tubul 4, titrul complementului este 0,25, iar în
reacţie se lucrează cu 0,3ml.
4. Hematii de oaie: se recoltează steril în balon cu perle de sticlă şi se defibrinează
mecanic prin agitare. Se spală cu soluţie salină fiziologică prin 3-4 centrifugări
repetate, după care se face o suspensie în soluţie salină fiziologică, la concentraţia
necesară.
5. Serul hemolitic anti-oaie (hemolizina) se prepară prin injectare repetată la iepure a
unei suspensii de hematii de oaie. El este titrat de institutul producător, titrul fiind
indicat pe eticheta fiolelor.
Pentru a prepara sistemul hemolitic necesar reacţiei se amestecă cantităţi egale de
suspensie de hematii în concentraţia necesară, conform procedeului utilizat şi
hemolizina diluată conform titrului. Amestecul se ţine 30 de minute la 37˚C înainte de
repartizare în reacţie.

Tehnici RFC:
1.Tehnica Wassermann: utilizată în diagnosticul serologic al sifilisului (reacţia Bordet-
Wassermann), în bruceloză, tuse convulsivă, etc.
2.Tehnica Ida Bengston: folosită în diagnosticul leptospirozelor, rickettsiozelor, a
infecţiilor cu chlamydii, etc, are avantajul că stabileşte cantitatea anticorpilor (titrul serului)
lucrându-se cu diluţii succesive de ser de bolnav.
Se lucrează pe probe perechi de seruri (prima recoltată la debutul bolii, a doua în
convalescenţă), urmărindu-se creşterea titrului de anticorpi de cel puţin 4 ori în proba a
doua. Titrul reacţiei este dat de diluţia cea mai mare de ser de bolnav care mai fixează
complementul, în prezenţa antigenului specific.
3.Tehnica Breadstreet şi Taylor care se foloseşte în infecţiile virale, infecţii cu
mycoplasme, febra Q, etc. Utilizează o titrare specială a complementului în prezenţa
diluţiilor de hemolizină, procedeu numit “ în tablă de şah”. RFC este efectuată pe plăci sau
microplăci cu godeuri, incubarea făcându-se după tehnica “ la rece”.

41
Reactii Antigen Anticorp cu reactanti marcati

Sensibilitatea reacţiilor antigen-anticorp poate fi mărită legând de anticorp ( mai rar

de antigen) un marker uşor de identificat, care să nu interfereze cu proprietăţile imunologice
ale reactanţilor. Acest marker poate fi:
a) o substanţă fluorescentă (izocianat de fluoresceină), în tehnica imunofluorescenţei;
b) izotopi radioactivi (de obicei I 125), în metoda radioimunotestării;
c) o enzimă (peroxidaza, β-galactozidaza, fosfataza alcalină) în testele imunoenzimatice.

Reacţia de imunofluorescenţă (IF)

Prin cuplarea unei substanţe fluorescente cu anticorpii se obţin anticorpi fluorescenţi,

care, fixându-se pe antigenul omolog, conduc la formarea de complexe antigen-anticorp
fluorescente, observabile prin examinarea la microscop în lumină ultravioletă.
a) metoda directă: anticorpii monospecifici sunt conjugaţi cu substanţa fluorescentă.
Materialul testat pentru prezenţa antigenului se etalează pe lamă, după care se
incubează cu anticorpii marcaţi. Excesul de anticorpi se îndepărtează prin
spălare, preparatul uscat fiind apoi examinat în lumină ultravioletă. Complexele
antigen-anticorp marcat, apar ca zone fluorescente, uşor vizibile.
IF directă este o metodă rapidă de diagnostic în unele infecţii bacteriene şi mai
ales virale, permiţând evidenţierea diverselor antigene în ţesuturi.
Dezavantajul procedeului direct constă în necesitatea unui număr mare de seruri
marcate, fiecare ser cu o singură specificitate.
b) metoda indirectă: comportă doi timpi:
- preparatul care conţine antigen se incubează cu anticorpii specifici,
nemarcaţi;
- vizualizarea complexului imun format se face prin prin adăugarea unui
indicator fluorescent, care este serul antiimunglobulină marcat.
Rezultă că în IF indirectă anticorpul specific nemarcat, pe lângă funcţia de anticorp
faţă de antigenul căutat, îndeplineşte totodată rolul de antigen faţă de anticorpul marcat cu
substanta fluorescenta (serul antiimunglobulinic).
IF indirectă are avantajul că un singur ser imun antiglobulinic marcat, serul
antiimunglobulină umană, serveşte la detectarea diverselor sisteme antigen-anticorp.
IF indirectă are o largă aplicare permiţând:
- evidenţierea antigenelor .
- detectarea anticorpilor .
IF este o metodă foarte sensibilă, cu condiţia ca reactivii utilizaţi să fie purificaţi şi
riguros controlaţi, pentru a se exclude erorile cauzate de fluorescenţa nespecifică.
IF se aplică în bacteriologie pentru identificarea streptococilor de grup A, în
diagnosticul infecţiilor cauzate de neiseerii, mycoplasme, hemofili, bordetelle, în sifilis, etc.
IF în diagnosticul rapid al infecţiilor virale - pentru diagnosticul rabiei, IF este
metoda de elecţie.
Radioimunotestarea (RIA)

42
 Iniţial aplicată pentru testări de hormoni şi enzime, RIA s-a extins şi în diagnosticul
bolilor infecţioase, fiind una din cele mai sensibile şi precise metode de detectare şi dozare a
antigenelor şi anticorpilor.
Se practică fie marcarea cu I125 (mai rar C14, H3) a unuia din reactanţi (antigen sau
anticorp), fie radiomarcarea unui indicator (serul antiglobulinic), care reacţionează cu
complexul imun primar, după care se măsoară radioactivitatea complexului format. RIA
combină specificitatea imunologică cu sensibilitatea radiochimiei.
Reacţiile se pot lucra fie în faza lichidă, fie în faza solidă, când unul din reactanţi este
fixat pe un suport solid inert (tuburi, discuri sau plăci din polistiren).
RIA se foloseşte pentru detectarea enterotoxinei stafilococice, a toxinei botulinice tip
A, pentru evidenţierea polizaharidului capsular la pneumococi, a P. aeruginosa în
infecţii urinare, etc.
În infecţiile virale : diagnosticul gripei, a infecţiilor herpetice, sau cu poxvirusuri şi
în deosebi în diagnosticul hepatitelor cu virus B.
Teste imunenzimatice
Antigenul sau anticorpul se cuplează cu enzime cu o mare activitate: peroxidaza din
hrean (frecvent folosită), fosfataza alcalină, etc., rezultând complexe care reţin atât activitatea
imunologică, cât şi cea enzimatică. Complexul imun va fi detectat prin aprecierea activităţii
enzimei faţă de un substrat specific.
Se cunosc diverse tehnici, în diagnosticul bolilor infecţioase aplicându-se preferenţial
ELISA (enzyme-linked-immunosorbant-assay) cu diferite variante.
a) tehnica indirectă, des folosită pentru detectarea anticorpilor, executată pe un suport
solid inert de obicei tuburi sau plăci din polistiren.
- antigenul cunoscut este adsorbit pe suport. După incubare antigenul nelegat
e îndepărtat prin spălare.
- adăugarea serului de cercetat ,incubare, spălare.
- adăugarea serului antiglobulină, marcat enzimatic, incubare, spălare.
- adăugarea substratului pentru enzimă.
Reacţia se citeşte după apariţia reacţiei de culoare ce poate fi măsurată
spectrofotometric, sau citită cu ochiul liber.
b) tehnica “ sandwich” pentru detectarea antigenelor, se practică tot pe suport solid:
- anticorpii cunoscuţi se adsorb pe un suport, incubare, spălare;
- adăugarea probei cu antigen de cercetat, incubare, spălare;
- adăugarea anticorpilor specifici marcaţi, incubare, spălare;
- adăugarea substratului pentru enzimă.
Citirea reacţiei de culoare ce apare se face cu ochiul liber, sau spectrofotometric.

Tehnica ELISA este folosită pentru:

- detectări de antigene, bacteriene, sau virale (toxina difterică, toxinele E.coli,
toxinele stafilococice, brucelle, yersinii, treponeme, rickettsii,
herpesvirusuri, virusuri hepatice, etc),
- mai ales pentru detectări de anticorpi antibacterieni (în salmoneloze,
bruceloza, rickettsioze, etc.) sau antivirali (în hepatitele B, C, şi în infecţia
cu virusul HIV).

43
Principiul reacţiei de aglutinare pe lamă Reacţie de aglutinare pe lamă - pozitivă

Principiul reacţiei de fixare a complementului

44
Testul Elek

Reacţia de imunelectroforeză

Reacţia de contraimunelectroforeză

45
 Principiul reacţiei de imunofluorescenţă
Reacţia directă Reacţia indirectă

Tehnica ELISA
ELISA indirectă ELISA sandwich

46
 Imagini de imunofluorescenţă

Candida Chlamydia trachomatis

Boala Lyme Treponema

47
NOTE PERSONALE

48
LUCRAREA NUMĂRUL 7. SCHEMA DIAGNOSTICULUI ETIOLOGIC
ÎN INFECŢIILE BACTERIENE. RECOLTAREA PROBELOR
PATOLOGICE

Schema diagnosticului de laborator in infectiile bacteriene

I. Diagnosticul direct (bacteriologic)

1. Recoltarea probelor patologice

2. Examenul microscopic direct

- preparat nativ
- frotiu

3. Izolarea pe medii de cultura

4. Identificarea :

a. Cercetarea proprietăţilor morfotinctoriale (preparate microscopice)

b. Cercetarea caracterelor de cultură (în medii lichide şi pe medii
solide)
c. Cercetarea proprietăţilor biochimice
d. Cercetarea proprietăţilor antigenice
e. Cercetarea proprietăţilor de patogenitate
f. Lizotipia fagică – în cazul în care este necesară

5. Antibiograma

II. Diagnosticul indirect

- serologic
- biologic

49
Recoltarea probelor patologice

Probele patologice pot fi produse biologice prezente în mod normal în organism şi care
prezintă modificări în cursul îmbolnăvirilor (sânge, lcr, urină, materii fecale) sau produse ce
apar numai în cursul îmbolnăvirilor (puroi, lichid pleural, spută, lichid articular).
Se mai pot recolta: apa potabilă, apa de canal, apă de îmbăiere, alimente, tampoane de
încărcătură bacteriană de pe suprafeţe, aeromicrofloră.

Reguli de bază pentru recoltarea probelor patologice:

- prelevarea probei se face steril,
- se va evita contaminarea probelor patologice cu agenţi infecţioşi din mediul extern,
- pentru recoltarea probelor patologice trebuie cunoscut:
1. De unde se pot recolta probele patologice. Selectarea probei se face în raport cu
patogenia infecţiei (poarta de intrare, căile de dieminare, căile de eliminare).
2. Când este momentul potrivit pentru recoltare, în raport cu evoluţia bolii. Se va
recolta înaintea tratamentului chimioterapic.
3. Cum trebuie recoltat, adică care este tehnica corectă pentru prelevare.
4. Cât trebuie recoltat, deci care este cantitatea minimă necesară pentru a putea face
diagnosticul de laborator.
Conservarea prelevatelor:
- se preferă însămânţarea pe medii de cultură cât mai repede posibil,
- dacă condiţiile nu permit însămânţarea:
 se utilizează medii de conservare şi transport
 se va respecta temperatura de conservare
 4 ºC, această temperatură nu permite multiplicarea bacteriilor - pentru
urina, materii fecale, sputa, puroi
 37 ºC- pentru unele bacterii (Neisseria meningithidis)- LCR, sânge
Etichetarea probei este obligatorie. Se vor menţiona:
 numele, prenumele, vârsta, sexul,
 natura prelevatului, data şi ora recoltării,
 tipul de analiză cerut (bacteriologic, virusologic, biochimic, parazitologic),
 diagnosticul clinic de prezumţie,
 numele si prenumele medicului care solicită analiza respectivă.

Recoltarea probelor patologice din tractul respirator

Secreţiile respiratorii vor fi recoltate în raport cu localizarea infecţiei.

1. Secreţia faringiană : se recoltează cu ajutorul tamponului faringian, dimineaţa
înainte de toaleta cavităţii bucale, cu ajutorul tamponului faringian.
Indicaţii: faringite, angine, scarlatină, difterie.
2. Secreţia nazală se recoltează cu tamponul; se indică în rinite şi sinuzite.
3. Secreţia conjunctivală se recoltează cu tamponul; se indică în conjunctivite.
4. Secreţia otică se recoltează cu tamponul; se indică în cursul otitelor.
5. Secreţiile traheobronşice se recoltează prin aspirare; se indică în infecţiile tracului
respirator inferior.

50
 6. Sputa se recoltează în: bronşite, bronhopenumonii, suspiciunea de tuberculoză. Se
procedează la recoltarea matinală după clătirea cavităţii bucale cu ser fiziologic
steril.

Recoltarea probelor patologice de la nivelul tractului digestiv

1. Lichidul de vărsătură se recoltează în cursul gastroenteritelor, toxiinfecţiilor

alimentare.
2. Materiile fecale pot fi recoltate pentru examenul bacteriologic (coprocultură),
parazitologic (coproparazitologic), virusologic, biochimic.
Pentru coprocultură se recoltează materiile fecale din scaunul de emisie spontană, cu ajutorul
coprocoltorului sau direct din rect cu ajutorul sondei Nelaton.
Indicaţiile coproculturii vizează dizenteria, holera, salmonelozele şi diferite alte
gastroenterite.
3. Bila se recoltează pentru bilicultură, dar şi pentru examinări biochimice şi
parazitologice. Pentru recoltare se foloseşte sonda Einhorn. Bilicultura este
indicată în cursul colecistopatiilor.

Recoltarea probelor patologice de la nivelul tractului urogenital

1. Urina se recoltează prin metoda jetului întrerupt (după toaleta locală şi eliminarea
primei porţiuni), într-un recipient steril.
Indicaţii: cistite, cistopielite, leptospiroze, suspiciune de TBC urogenitală, în prima
săptămână de evoluţie a febrei tifoide.
2. Secreţia uretrală se recoltează de la bărbaţi în cursul uretritelor.
3. Secreţia vaginală se recoltează pe masa ginecologică, cu ajutorul tampoanelor, în
cursul colpitelor şi cervicitelor.

Recoltarea sângelui

Necesită utilizarea sistemelor de unică folosinţă şi se indică în: scop bacteriologic-

hemocultură, pentru examen serologic, pentru examen virusologic, pentru examinări
parazitologice.

Recoltarea lichidului cefalorahidian

Recoltarea se face prin puncţie lombară (însămânţându-se cât mai repede posibil pe
medii preîncălzite la 37ºC – sau dacă însămânţarea imediată nu este posibilă se va asigura
menţinerea temperaturii de 37ºC până în momentul inoculării pe medii).
Indicaţii: meningite

Recoltarea exudatelor din seroase

Lichidul pleural, peritoneal, sinovial, se recoltează în cursul pleureziilor,

peritonitelor, sinovitelor, prin puncţionarea părţii declive a regiunii.

51
Recoltarea puroiului

Se face fie prin puncţie utilizând fie o seringă cu ac gros (din infecţii profunde), fie
cu ajutorul pipetei Pasteur din infecţii superficiale.

Recoltarea fragmentelor de ţesuturi

Se realizează prin biopsie, indicându-se examinare bacteriologică şi histologică.

Recoltarea produselor de necropsie

Se face cât mai rapid după deces. Pentru fiecare produs se foloseşte un alt set de
instrumente şi un alt set de instrumente steril.

Însămânţarea probelor patologice

Izolarea agentului patogen este esenţială pentru stabilirea diagnosticului.

Pentru izolarea bacteriilor din probele patologice se însămânţează pe medii de cultură
sau în medii de cultură (lichide sau semisolide).
Tehnicile folosite sunt următoarele:
1. epuizarea inoculului pe suprafaţa mediului de cultură din placa Petri – este
metode de elecţie pentru obţinerea coloniilor izolate. Inoculul se depune pe un
sector limitat al plăcii cu ajutorul ansei bacteriologice sau cu ajutorul
tamponului. Ansa bacteriologică sterilizată şi răcită permite dispersarea
inoculului pe un alt sector al mediului, prin trasarea a 4-5 striuri paralele între
ele. După sterilizarea ansei pornind de la striurile anterioare şi perpendicular
pe ele vor fi trasate alte câteva striuri paralele. Operaţia va fi repetată până la
epuizarea suprafeţei mediului.
2. Însămânţarea în profunzimea mediilor solide se realizează prin înţeparea cu
ansa bacteriologică dreaptă.
3. Însămânţarea în medii lichide se poate face cu ajutorul ansei bacteriologice
sau a pipetei Pasteur.
4. Însămânţarea în pânză – se poate face cu ajutorul tamponului sau a ansei
Drigalski şi este utilă pentru realizarea antibiogramelor, dar şi pentru lizotipia
fagică.

52
Însămânţarea în medii lichide cu ajutorul pipetei Pasteur Însămânţarea în profunzimea mediilor
şi a ansei bacteriologice solide cu ajutorul ansei bacteriologice drepte

Însămânţarea pe suprafaţa mediilor solide din plăci Petri Însămânţarea în pânză pe suprafaţa mediilor de
prin metoda epuizării inoculului cultură solide din plăci Petri

53
NOTE PERSONALE

54
LUCRAREA NUMĂRUL 8. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL
INFECŢIILOR PRODUSE DE BACILII GRAM POZITIVI

BACILI GRAM POZITIVI AEROBI NESPORULAŢI

GENUL CORYNEBACTERIUM

Genul Corynebacterium reuneşte un grup de bacterii care prezintă următoarele

caracteristici: sunt bacili Gram pozitivi, uşor încurbaţi, cu una sau ambele extremităţi
măciucate, aşezaţi în palisade, imobili, nesporulaţi, necapsulaţi, aerobi, uneori microaerofili
sau facultativ anaerobi.
Corynebacterium diphteriae, agentul cauzal al difteriei, a fost acceptat ca şi specie tip,
nu numai datorită importanţei sale ca şi agent patogen ala difteriei, dar şi pentru
caracteristicile sale bine definite, care-i conturează biologia.
Difteria este o boală infecţioasă gravă, care în forma ei tipică, se manifestă printr-o
leziune la poarta de intrare, cel mai frecvent la nivelul amigdalelor, unde produce un exsudat
fibrinos aderent, falsa membrană. Acesta se asociază cu fenomene toxice generale, datorate
difuzării în organism a unei toxine puternice pe care o produce bacilul. Producerea toxinei
este corelată cu starea de conversie lizogenă (dacă bacilul difteric este lizogenizat cu
bacteriofagul ß tox).
Dacă bacteriofagul care infectează celula bacteriană poartă gena tox+, fenomenul de
replicare al ADN-lui viral în interiorul bacteriei se însoţeşte de producerea unei proteine, care
se eliberează extracelular, şi care este toxina difterică.
Speciile genului Corynebacterium sunt :
 Corynebacterium diphteriae cu tipurile: gravis, mittis, intermedius (agentul
etiologic al difteriei),
 Corynebacterium hoffmani, Corynebacterium xerosis, difteromorfi, bacterii
comensale la nivelul mucoaselor şi tegumentelor.

Diagnosticul bacteriologic:
7. Recoltarea probelor patologice.
Se face cu ajutorul a trei tampoane (se recoltează exsudatul faringian).
2. Examenul microscopic direct
Din primul tampon faringian se fac două frotiuri, unul fiind colorat Gram, iar celălalt
în coloraţia specială Neisser. Frotiul colorat Gram evidenţiază bacili Gram pozitivi, aşezaţi în
palisade. Frotiul colorat Neisser serveşte la evidenţierea corpusculilor metacromatici Babeş-
Ernst.
3. Izolarea
Produsul patologic se însămânţează pe mediul Löffler, pe mediu cu telurit de potasiu
(Tinsdale) pe care bacilul difteric se dezvoltă sub formă de colonii mici, brune, înconjurate
de un halou negru. Pe mediul Löffler coloniile sunt de tip R cu contur neregulat şi au aspect
de floare de margaretă (pentru tipul gravis).
4. Identificarea
4.1. Caracterele morfotinctoriale : sunt reprezentative în frotiul efectuat de pe mediul
Löffler – bacili Gram pozitivi, drepţi sau uşor încurbaţi, cu una sau ambele extremităţi

55
măciucate. În coloraţia Neisser se evidenţiază corpusculii metacromatici Babeş-Ernst
(corpusculii se colorează în albastru violet iar corpul bacterian în galben brun).
4.2. Caractere de cultură
În medii lichide tipul gravis lasă mediul limpede şi formează peliculă, tipul mittis
tulbură uniform mediul, iar tipul intermedius formează un inel aderent şi sediment granular.
Pe mediul Gundel-Tietz : tipul gravis formează colonii de 1-2 mm cu marginea
crenelată cu suprafaţa neregulată şi de consistenţă friabilă, care dau aspectul de floare de
margaretă;tipul mittis formează colonii de mărimi variabile cu suprafaţă convexă şi lucioasă,
conturul regulat şi de consistenţă cremoasă; tipul intermedius formează colonii de talie
variabilă, ce prezintă o suprafaţă uşor acuminată, marginile circulare şi de consistenţă
semicremoasă. Pe mediul Tinsdale, diftericii formează colonii negre, înconjurate de un halou
brun, în timp ce pseudodiftericii formează tot colonii negre dar fără halou.
4.3. Caractere biochimice
Sunt utile pentru diferenţierea diftericului de pseudodifterici dar şi pentru
identificarea tipurilor de difterici (se urmăreşte fermentarea amidonului, glicogenului şi a
dextrinei).
Bacilul difteric (toate tipurile) produce hidrogen sulfurat şi nu scindează ureea.
Pseudodiftericii scindează ureea, în schimb nu produc hidrogen sulfurat.
4.4. Proprietăţi de patogenitate.
Factorul de patogenitate este reprezentat de toxina difterică, sintetizată de către
tulpinile lizogene. Toxina difterică acţionează prin blocarea sintezei proteice.
Testele de patogenitate pot fi realizate in vitro (testul Eleck), sau in vivo prin
inocularea la cobai. Inocularea la cobai se realizează prin administrarea subcutanată a unei
culturi de 48h de bacil difteric. Se folosesc animale protejate şi neprotejate. Cobaiul
neprotejat (prin ser antidifteric) moare în 1-4 zile de la inoculare prezentând ca şi leziuni
caracteristice : edem gelatinos la locul inoculării, revărsate sanguinolente în seroase şi
congestia suprarenalelor (cu aspect de cireaşă).
Inocularea toxinei la cobai a permis stabilirea unităţii de măsură in vivo pentru toxina
difterică, care este reprezentată de doza limită mortală (DLM).Un DLM de toxină difterică
reprezintă acea cantitate de toxină care omoară un cobai în greutate de 250g în timp de 4 zile
cu leziunile caracteristice descrise anterior.
Diagnosticul indirect-
Serologic- se realizează prin reacţia de hemaglutinare pasivă
Biologic- este utilizat pentru testarea stării de imunitate în colectivităţi. Constă în IDR Shick:
se inoculează intradermic toxina şi se citeşte reacţia după 24 de ore. Apariţia unui eritem la
locul inoculării este o reacţie pozitivă care dovedeşte lipsa anticorpilor antitoxici şi deci
susceptibilitatea persoanei respective la infecţie; aceste persoane se vaccinează cu anatoxină
difterică. Lipsa eritemului (reacţie negativă) este datorată neutralizării toxinei de către
anticorpi specifici, fapt ce indică prezenţa imunităţii.
Profilaxia în difterie se bazează pe administrarea vaccinului antidifteric (anatoxina difterică
– în trivaccinul DTP, sau în bivaccinul DT).

BACILI GRAM POZITIVI AEROBI SPORULAŢI

56
GENUL BACILLUS

Bacteriile din genul Bacillus sunt bacterii Gram pozitive, cu capetele tăiate drept,
dispuse în lanţuri, aerobe, în general mobile (Bacillus anthracis este întotdeauna imobil),
sporulate (diametrul sporului, care are o localizare centrală, este mai mic decât diametrul
bacteriei, astfel că celula bacteriană nu este deformată).
Genul cuprinde specii nepatogene (Bacillus subtilis, Bacillus stearotermophilus,
Bacillus polimixa, Bacillus megaterium ,etc) iar singura specie patogenă este Bacillus
anthracis.
Toţi reprezentanţii acestui gen sunt foarte răspândiţi în natură datorită sporului care le
conferă rezistenţă în mediul exterior; sunt germeni telurici găsindu-se în special în sol, dar
numeroase specii de Bacillus pot fi găsite în apă, aer sau pe materiale de origine animală şi
vegetală.
Bacillus subtilis – de regulă este o specie saprofită, însă a fost izolat în cursul
conjunctivitelor, iridociclitelor, sinuzitelor cronice şi al infecţiilor urinare.
Bacillus cereus – în cazul în care se înmulţeşte excesiv în alimente se poate constitui
în agent etiologic al unor toxiinfecţii alimentare (fosfolipaza C hidrolizează lecitina din
alimente şi produce fosforilcolină activă). Specia a mai fost izolată în cursul bacteriemiilor cu
localizări meningeale şi pulmonare.
Bacillus anthracis este agentul etiologic al antraxului- o antropozoonoză, care poate
îmbrăca diferite forme clinice:
- antrax cutanat se poate prezenta ca şi :
o pustula malignă (96% din cazuri), cu localizare predilectă la nivelul feţei şi a
membrelor; la locul de inoculare apare o veziculă cu conţinut serosanguinolent,
urmată de o ulceraţie mică care se usucă şi dă naştere unei cruste de culoare neagră,
de unde şi denumirea de cărbune cutanat. Regiunea subiacentă leziunii prezintă un
edem gelatinos, nedureros.
o edemul malign este forma cea mai gravă de manifestare a cărbunelui cutanat şi se
caracterizează printr-un edem extins, febră ridicată şi stare toxică.
- antrax visceral
o forma pulmonară, datorată inhalării sporilor, apare la persoane ce se ocupă cu
prelucrarea pieilor şi evoluează ca o bronhopneumonie cu spută sanguinolentă.
o forma gastro-intestinală este datorată ingestiei de carene sau de alte produse
contaminate cu Bacillus anthracis.
o meningita cărbunoasă, deşi este rară, conduce la o mortalitate de practic 100%.
Diagnosticul este bacteriologic
1. Recoltarea: în formele cutanate se recoltează serozitate din vezicule; în infecţia
pulmonară se recoltează spută; în infecţiile digestive se recoltează materii fecale şi în
meningită- LCR. De la animalele moarte, suspecte de infecţie cărbunoasă, se recoltează
ţesuturi.
2. Examenul microscopic direct: evidenţiază bacili Gram pozitivi, mari, capsulaţi,
izolaţi sau dispuşi sub formă de lanţuri scurte.
3. Izolarea. Bacteria este puţin pretenţioasă, dezvoltându-se uşor pe medii uzuale.
Probele patologice se însămânţează pe geloză nutritivă şi geloză sânge pe care Bacillus
anthracis se dezvoltă sub formă de colonii rugoase (de tip R) cu margini neregulate, care au
aspect de cap de meduză sau coamă de leu (pe mediile cu sânge coloniile sunt nehemolitice).

57
 4. Identificarea:
4.1. Proprietăţi morfotinctoriale: în frotiu colorat Gram se evidenţiază bacili Gram pozitivi cu
capetele tăiate drept, prezentând aspectul beţelor de bambus. Dispoziţia sporului este
centrală, iar diametrul mai mic decât al celulei vegetative face ca aceasta să nu fie deformată.
În frotiul colorat cu safranină şi verde malahit se pot pune în evidenţă sporangiile
(formele vegetative) colorate în roşu precum şi sporii coloraţi în verde.
4.2. Caractere de cultură – creşte bine pe medii uzuale în condiţii de aerobioză.
o agar nutritiv – colonii mari, alb-cenuşii, cu suprafaţă rugoasă, margini neregulate şi
prezentând prelungiri laterale ca nişte şuviţe de păr care conferă coloniilor un aspect
caracteristic; sunt coloniile de tip R; în culturile atenuate la 42,5ºC pot să apară
colonii de tip S (tulpini atenuate).
o agar sânge – acelaşi aspect al coloniilor, nehemolitice.
o bulion nutritiv – tulpinile de tip R lasă mediul de cultură limpede şi formează un
depozit floconos
4.3. Caractere biochimice – zaharolitic, slab proteolitic, lichefiază gelatina.
4.4. Proprietăţi antigenice – prezintă un antigen capsular de natură polipeptidică şi două
antigene de perete celular, unul de natură polipeptidică şi celălalt de natură polizaharidică.
4.5. Caractere de patogenitate
Toxina este formată din antigenul protectiv (PA) şi din : fie factorul letal (LF) fie
factorul edemaţiant (EF); antigenul protectiv se leagă de receptori şi translocă în citosol LF
sau EF.
In vitro demonstrarea patogenităţii unei suşe de Bacillus anthracis se poate realiza prin
teste imunocromatografice.
Inocularea subcutanată la şoarece determină septicemie mortală în 24-48 h, iar la
necropsie se constată prezenţa unui edem gelatinos la locul inoculării precum şi congestia
organelor interne. Splina este hipertrofică, iar amprentele din splină în coloraţia Gram pun în
evidenţă bacili Gram pozitivi capsulaţi
5. Profilaxia foloseşte vaccinarea anticărbunoasă cu vaccinul de tip rPA (un
recombinant al antigenului protectiv) exprimat într-o suşă de Bacillus subtilis WB600.
6. Tratamentul chimioterapic foloseşte betalactamine şi quinolone.

BACILI GRAM POZITIVI ANAEROBI SPORULAŢI ŞI ALTE BACTERII

ANAEROBE

Bacteriile anaerobe aparţin la numeroase familii şi genuri. Anaerobii nesporulaţi

domină speciile aerobe la nivelul căilor aeriene şi digestive superioare, a colonului, vaginului
şi a unităţilor pilosebacee. Anaerobii nesporulaţi sunt atât coci cât şi bacili, Gram pozitivi şi
Gram negativi:
- bacili Gram pozitivi nesporulaţi din genurile Actinomyces, Bifidobacterium,
Eubacterium, Propionibacterium,
- bacili Gram negativi nesporulaţi din genurile Bacteroides, Megamonas,
Porphyromonas, Prevotella, Tissierella, Fusobacterium, Leptitrichia,
- coci Gram pozitivi nesporulaţi din genurile Peptococcus, Peptostreptococcus,
Ruminococcus, Coprococcus, Sarcina,
- coci gram negativi nesporulaţi din genurile Veillonella, Acidaminococcus,
Megasphaera.

58
 Astfel de anaerobi nesporulaţi sunt implicaţi în general în producerea infecţiilor de
vecinătate (corelate cu localizarea acestora la nivelul diferitelor cavităţi ale organismului).

BACILI GRAM POZITIVI ANAEROBI SPORULAŢI

GENUL CLOSTRIDIUM

Bacteriile din genul Clostridium sunt bacili Gram pozitivi, sporulaţi având spori ovali
sau sferici, terminali sau subterminali, care deformează bacteria; sunt anaerobi stricţi, mobili
sau imobili.
Bacteriile strict anaerobe sunt bacterii sensibile la acţiunea oxigenului, acesta fiind
toxic pentru ele. În genul Clostridium sunt clasificate specii patogene care sintetizează
exotoxine care reprezintă principalii factori de patogenitate: Clostridium tetani, Clostridium
botulinum şi Clostridiile gangrenei gazoase: Clostridium perfringens, Clostridium
sporogenes, Clostridium novy (oedematiens), Clostridium hystoliticum şi Clostridium
septicum.

Clostridium tetani
Clostridium tetani este un bacil Gram pozitiv, sporulat, cu sporul dispus terminal,
ceea ce-i conferă un aspect de băţ de chibrit. Există mai multe tipuri antigenice, însă toate
sintetizează acelaşi tip de toxină. Acţiunea toxinei tetanice se manifestă la nivelul sistemului
nervos central, unde blochează sinapsele inhibitorii şi determină contractura musculară
(tetanosul complet).
Bacilii rămân cantonaţi la poarta de intrare, reprezentată prin plaga împunsă,
sintetizează şi eliberează exotoxina, care difuzează în organism. La 3-10 zile de la
pătrunderea în organism a bacililor, se declanşează sindromul tetanic. Debutul se face prin
trismus (contractura muşchilor maseteri), apoi apar contracţiile musculare tonico-clonice, iar
în final se instalează tetanosul complet. Decesul se datoreşte spasmului laringian care duce la
asfixie.
Profilaxia tetanosului se face prin vaccinare cu anatoxină tetanică (trivaccinul DTP
sau divaccinul DT, intră în schema de vaccinări obligatorii). În prezenţa plăgilor cu potenţial
tetanigen se procedează la toaleta chirurgicală şi la rapel cu ATPA (anatoxina tetanică
purificată şi adsorbită).
Pentru diagnosticul de laborator se recoltează puroi din plagă, care se însămânţează
pe medii pentru anaerobi (agar sânge în tehnica Ott). Frotiul colorat Gram evidenţiază bacili
Gram pozitivi cu sporul dispus terminal. Formează colonii gălbui-cenuşii care au tendinţa de
confluare dacă concentraţia de agar a mediului este mai mică de 4%. În mediile lichide
formează sediment (datorat sporilor), iar culturile degajă un miros caracteristic de corn ars.
Este hemolitic şi slab proteolitic şi zaharolitic.
Antibiograma, efectuată prin metoda difuzimetrică în dublu strat de agar, finalizează
diagnosticul.

Clostridium botulinum
Clostridium botulinum este un bacil Gram pozitiv mobil datorită cililor peritrichi, cu
sporul dispus subterminal.

59
 Este o bacterie răspândită în solul tuturor regiunilor geografice. Are mai multe tipuri
antigenice, fiecare dintre tipurile antigenice sintetizând şi eliberând o toxină proprie. Tipurile
antigenice A, B, E şi F produc botulismul la om. Toxina botulinică are neurotropism, iar
mecanismul său de acţiune constă în blocarea transmiterii nervoase, prin inhibarea secreţiei
de acetilcolină.
Botulismul se datoreşte ingestiei de alimente conservate care au fost contaminate cu
spori de Clostridium botulinum. În condiţiile de anaerobioză oferite de conservă, sporii
germinează, iar formele vegetative se multiplică, secretând şi eliberând exotoxina care se
acumulează în alimentul conservat. Datorită producţiei abundente de gaze, astfel de conserve
sunt puternic bombate. Ingestia accidentală a unui astfel de aliment conduce la consumul
unei cantităţi de toxină preformată şi de bacili care ajunşi în tubul digestiv vor continua să
elibereze toxina. În câteva ore apar primele manifestări ale botulismului, cu tulburări de
vedere, datorate paraliziei muşchilor globilor oculari. Se instalează tulburări de deglutiţie.
Deşi botulismul este o toxiinfecţie alimentară, manifestările digestive sunt minore sau
absente. În lipsa serului antibotulinic specific de tip antigenic se ajunge la exitus în 24-36
ore, prin paralizia centrilor bulbari.
Clostridium botulinum se prezintă ca şi bacili Gram pozitivi cu spori dispuşi
subterminal. Pe mediile solide (pentru anaerobi) formează colonii neregulate cu suprafaţa
granulară şi cu o margine în extensie continuă. Exercită hemoliză pe mediile cu sânge. De
regulă, însă diagnosticul intoxicaţiei botulinice se face prin evidenţierea toxinei şi
determinarea tipului acesteia. Toxina se caută în lichidul de spălătură gastrică sau de
vărsătură, în conţinutul intestinal sau în lichidul din conserva incriminată. Pentru aceasta se
procedează la o reacţie de neutralizare in vivo, prin inocularea la şoareci de laborator. Se
folosesc 10 şoareci, din care 2 rămân ca şi martori şi nu se protejează cu ser antibotulinic.
Ceilalţi vor forma 4 perechi, fiecare dintre aceste perechi urmând a se proteja cu un alt ser
antibotulinic specific de tip ( A, B, E şi F). Fiecare animal se inoculează cu filtratul
alimentului incriminat. Animalele protejate prin serul antibotulinic specific de tip antigenic
supravieţuiesc, în timp ce celelalte animale, inclusiv martorii, mor. Dacă mor toate animalele
se poate exclude botulismul.

Clostridiile gangrenei gazoase

Gangrena gazoasă apare ca o complicaţie a plăgilor contaminate cu pământ unde se
realizează condiţii de anaerobioză necesare germinării sporilor şi se caracterizează prin
necroza şi putrefacţia ţesuturilor afectate, la aceste semne locale adăugându-se şi semne
generale. Infecţia este, de fapt, polimicrobiană, la producerea ei participând specii anaerobe,
aerob-anaerob facultative şi chiar aerobe. Bacteria prezentă întotdeauna este Clostridium
perfringens, dar genul Clostridium cuprinde şi alte specii carepot să se asocieze cu specia
amintită în declanşarea gangrenei gazoase: Clostridium septicum, Clostridium novy,
Clostridium sporogenes, Clostridium hystoliticum. Clostridium perfringens poate fi agentul
etiologic şi al unor toxiinfecţii alimentare sau enterite necrozante.
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic şi de urgenţă.
Recoltarea interesează exudatele din plagă, fragmente de ţesuturi necrozate, sânge,
puroi.
Examenul microscopic direct din produsul patologic are o mare valoare diagnostică.
Pe frotiul colorat Gram se remarcă un polimorfism bacterian accentuat, evidenţiindu-se bacili
mari Gram pozitivi, izolaţi, în perechi sau lanţuri scurte, cu spor central, subterminal sau fără

60
spori (Clostridium perfringens sporulează numai în culturi vechi), unii dintre ei capsulaţi
(Clostridium perfringens).
Izolarea se face pe medii pentru anaerobi şi este necesar ca fiecare specie să fie
izolată în cultură pură pentru a se putea trece la etapa următoare. Pentru izolare se folosesc
medii pentru anaerobi (Nagler, Willis-Hobbs în tehnica Ott).
Identificarea necesită parcurgerea tuturor etapelor (pe geloză glucozată cu gălbenuş
de ou – mediul Nagler, Clostridium perfringens produce reacţia Nagler, datorită alfatoxinei,
o lecitinază, care difuzează în jurul coloniilor şi descompune lecitino-vitelina din ou
producând un precipitat care opacifică mediul). Unele specii sunt zaharolitice (Clostridium
perfringens, Clostridium novy, Clostridium sporogenes), în timp ce altele sunt proteolitice
(Clostridium hystoliticum, Clostridium septicum).
Antibiograma se execută prin tehnica difuzimetrică în condiţii de anaerobioză (în
dublu strat).
Tratamentul gangrenei gazoase trebuie instituit de urgenţă şi constă în administrarea
de ser antigangrenos polivalent, antibiotice şi desigur, îngrijirea chirurgicală a plăgii
(eliminarea ţesuturilor necrozate, drenarea colecţiilor închise etc).

NOTE PERSONALE

61
LUCRAREA NUMĂRUL 9. COCII

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR PRODUSE DE COCII GRAM

POZITIVI

GENUL STAPHYLOCOCCUS

Genul Staphylococcus aparţine familiei Staphylococcaceae.

Stafilococii sunt coci Gram pozitivi, aşezaţi în ciorchine, imobili şi nesporulaţi. Genul
Staphylococcus este compus din circa 38 de specii, dintre care 18 specii se izolează de la om.
Stafilococii sunt agenţi etiologici în peste 80% din infecţiile supurative întâlnite în
practica medicală. Manifestă afinitate pentru ţesutul dermic şi pentru anexele pielii, fapt care
explică de ce stafilococii provoacă mai ales infecţii la nivelul tegumentelor şi anexelor pielii,
însă ei pot invada practic orice ţesut sau organ.
Principalele specii ale genului sunt Staphylococcus aureus, S. epidermidis şi S.
saprophiticus.
În specia Staphylococcus aureus sunt clasificaţi stafilococii coagulazo-pozitivi, frecvent
hemolitici, care determină majoritatea infecţiilor stafilococice umane.
Numărul şi virulenţa stafilococilor, care constituie inoculul bacterian pătruns în ţesuturi
şi capacitatea intactă a mecanismelor de apărare ale gazdei invadate, sunt factorii care
determină evoluţia procesului infecţios incipient. Dacă inoculul este moderat cantitativ şi
calitativ, atunci mecanismele de apărare reuşesc să elimine în câteva zile inoculul, iar ţesutul
îşi va restabili funcţiile fiziologice. Orice condiţie patologică, care modifică echilibrul
natural, se constituie în cauză favorizantă a unei infecţii stafilococice.
Localizările şi manifestările infecţiei stafilococice:
1. Tegumente şi ţesut celular subcutanat: foliculite, furuncule, hidrosadenite, abcese,
flegmoane.
2. Ţesut osos şi articular: osteomielite şi artrite.
3. Rinofaringe şi cavităţi pneumatice adiacente: faringite, angine, sinuzite, otite supurate,
mastoidite.
4. Tub digestiv: enterocolita infantilă şi toxiinfecţii alimentare.
5. Aparat genital: mastite, metrite, anexite, septicemii postabortum.
6. Aparat urinar: prostatite, cistite, pielonefrite, abcese renale.
7. Aparat cardiovascular: flebite, pericardite, endocardite.
8. Sistem nervos central: meningite şi abcese cerebrale.
9. Fanere: panariţii şi abcese.
10. Sindromul de şoc toxicoseptic (TSST), cauzat de o toxină stafilococică particulară
numită Toxic Shock Syndrome Toxin.
Deşi majoritatea localizărilor infecţiei stafilococice sunt reprezentate prin cazuri
individuale de boală, sunt şi situaţii când infecţia evoluează epidemic:
1. Infecţia nosocomială care este condiţionată de existenţa purtătorului de stafilococ
coagulozo-pozitiv (la nivelul rinofaringelui) într-o colectivitate de receptivi (mediu de
spital).
Infecţiile cu Staphylococcus aureus meticilino-rezistent, cu rezistenţă multiplă la
antibiotice (betalactamine, macrolide, aminoglicozide, cotrimoxazol), sunt greu de
controlat în condiţiile evoluţiei în mediul spitalicesc.

62
 2. Toxiinfecţia alimentară apărută în unităţile de alimentaţie colectivă când un aliment
contaminat cu o tulpină enterotoxigenă este păstrat în condiţii termice
necorespunzătoare. Stafilococii încep să se multiplice la temperatura de +5ºC,
sintetizează şi eliberează enterotoxina, care se acumulează în aliment şi care rezistă la
prelucrările termice culinare, fără a schimba însă caracteristicile organoleptice ale
alimentului.
Toxiinfecţia debutează în 2-6 ore cu greţuri, vărsături, cefalee şi scaune diareice apoase.
Evoluţia este de scurtă durată (24-48 ore), restabilirea stării de sănătate făcându-se odată
cu eliminarea enterotoxinei din organism.
Unii stafilococi coagulazonegativi se încadrează în categoria oportuniştilor. Acest
aspect s-a conturat în relaţie directă cu utilizarea pe scară largă a procedurilor medicale
invazive (sonde, catetere) şi a inserţiilor protetice (şunturi, valve cardiace, proteze vasculare
şi articulare). Staphylococcus epidermidis se constituie în cauză majoră de infecţii
nosocomiale în secţiile de nou-născuţi şi oncologie dar şi în serviciile cardiologice (infecţii
de pace-maker, endocardita asociată cu valve protetice). Staphylococcus saprophiticus
constituie un agent etiologic implicat în infecţii urinare la femei tinere, iar la bărbaţi în
uretrite nespecifice şi prostatite.
Diagnosticul de laborator foloseşte metodele diagnosticului direct bacteriologic.
Recoltarea probelor patologice se face în funcţie de localizarea infecţiei.
Examenul direct din produsul patologic are valoare orientativă în anumite situaţii şi
poate evidenţia în coloraţia Gram coci Gram pozitivi, aşezaţi mai frecvent izolat şi mai rar
sub aspectul caracteristic în ciorchine (este utilă din puroi, urină, lcr, sânge).
Izolarea: se efectuează pe geloză-sânge iar în cazul probelor patologice
polimicrobiene sau pentru alimente se utilizează mediul Chapman (mediu hiperclorurat cu
manitol).
Identificarea :
 proprietăţi morfotinctoriale: în frotiul colorat Gram se pun în evidenţă coci
Gram pozitivi aşezaţi în ciorchine.
 proprietăţi de cultură: pe mediul Chapman, S. aureus degradează manitolul şi
provoacă virarea culorii mediului din roz-roşu în galben; pe geloză sânge S.
aureus se dezvoltă sub formă de colonii S înconjurate de un halou de liză α
(incompletă), de tip cald sau β (dublu conturată – la temperatura laboratorului
apărând un al doilea halou de liză cu clarificarea totală a mediului)de tip cald-
rece; pe geloză nutritivă se pot observa colonii de tip S, frecvent pigmentate în
galben-auriu.
 proprietăţi biochimice: stafilococii produc catalază, degradează glucoza pe
cale oxidativă şi fermentativă; Staphylococcus aureus degradează manitolul pe
mediul Chapman, în timp ce S. epidermidis nu utilizează substratul amintit.
 proprietăţi antigenice: antigene polizaharidice şi polipeptidice (proteina A – cu
acţiune anticomplementară, antifagocitară şi alergizantă).
 proprietăţile de patogenitate ale S. aureus se bazează pe capacitatea acestora de a
elibera enzime şi toxine, a căror activitate poate fi evidenţiată prin teste de patogenitate “
in vivo” sau “ in vitro”.
Determinanţii de patogenitate sunt enzime extracelulare şi toxine stafilococice.
1. Enzime extracelulare:

63
 - hialuronidaza descompune acidul hialuronic din ţesuturi şi favorizează
extinderea stafilococilor în ţesuturile învecinate.
- coagulaza, principalul factor de patogenitate la S. aureus, determină formarea
din plasmă a unui coagul împiedicând acţiunea în focarul infecţios a factorilor
de apărare; la S. aureus este prezentă coagulaza liberă evidenţiabilă prin reacţia
în tuburi şi coagulaza legată evidenţiabilă prin reacţia pe lamă.
- fibrinolizina sau stafilochinaza lizează reţeaua de fibrină, permiţând progresia
stafilococilor în ţesuturile învecinate; se poate pune în evidenţă folosind un
mediu de cultură preparat cu plasmă umană oxalatată (mediul opac se va
clarifica în jurul coloniei.
- lipazele active pe lipide plasmatice şi tegumentare sunt esenţiale pentru
metabolismul stafilococilor, explicând colonizarea predilectă a tegumentelor,
unde glandele sebacee sunt mai bine reprezentate.
- nucleazele scindează acizii nucleici.
2. Toxine stafilococice:
- hemolizinele cu acţiune hemolitică şi dermonecrotică se pun în evidenţă în culturi
pe medii cu sânge.
- leucocidinele cu acţiune exclusivă şi selectivă asupra neutrofilelor.
- enterotoxinele, elaborate în mai multe variante antigenice, sunt identificabile prin
reacţie de imunodifuzie în gel (A şi D implicate în toxiinfecţiile alimentare, B
incriminată în enterocolite postantibiotice).
- toxina epidermolitică şi exfoliativă este produsă de stafilococi aparţinând grupului
2 fagic şi acţionează prin distrugerea cementului intercelular, aflux lichidian şi
ruperea desmozomilor cu desprinderea straturilor superficiale ale epidermului.
 lizogenie şi lizotipie fagică. Susceptibilitatea tulpinilor de stafilococ la acţiunea litică a
bacteriofagilor este importantă pentru caracterizarea anumitor particularităţi ale
diferitelor suşe (bacteriile din grupul 2 fagic au afinitate pentru ţesutul dermic, cele din
grupul 3 fagic sunt penicilino şi meticilino rezistente, etc.). Lizotipia fagică se urmăreşte
pe agar nutritiv pe care s-a însămânţat în pânză tulpina de identificat, care a fost apoi
supusă acţiunii diferiţilor fagi.
Antibiograma – finalizează diagnosticul şi este esenţială pentru conturarea unei
scheme terapeutice eficiente. Administrarea la întâmplare a antibioticelor poate conduce la
selectarea unor tulpini multirezistente.
În cazul infecţiilor tegumentare recidivante se poate indica prepararea şi
administrarea autovaccinului.

GENUL STREPTOCOCCUS

Genul Streptococcus cuprinde coci Gram pozitivi grupaţi în perechi sau lanţuri de
dimensiuni variabile, catalazo-negativi, imobili, nesporulaţi. Streptococii sunt prezenţi în apă,
aer, sol sau ca şi comensali la nivelul tegumentelor sau mucoaselor la om şi la animale.
Clasificarea streptococilor se poate face după mai multe criterii, cele mai importante
fiind: producerea sau nu a hemolizei pe geloză sânge şi structura antigenică determinată de
antigenele din peretele bacterian.
● după aspectul hemolizei pe geloză-sânge, se disting:

64
 - streptococi α hemolitici , pe geloza sânge în jurul coloniilor apare un halou
îngust de hemoliză incompletă, cu înverzirea mediului şi a coloniilor; acest
aspect fiind datorat unui reductant al hemoglobinei. Streptococi α hemolitici
sunt streptococii viridans (comensali la nivelul faringelui) şi pneumococii
(Streptococcus pneumoniae).
- streptococi α' hemolitici, care pe geloza sânge exercită o hemoliză clară, însă la
examinarea microscopică a zonei de hemoliză pot fi puse în evidenţă şi hematii
intacte (aspect întâlnit la streptococii de grup B).
- streptococi β hemolitici, pe geloza sânge coloniile sunt înconjurate de o zonă de
hemoliză totală, clară, aspect caracteristic pentru streptococii de grup A şi G.
- streptococi γ hemolitici, care nu exercită hemoliză pe geloza sânge
(Streptococcus faecium, Streptococcus fecalis).
● după proprietăţile antigenice (criteriul Lancefield) streptococii pot fi
clasificaţi în grupe antigenice, notate prin litere majuscule de la A la W (cu excepţia literelor
I şi J). Sunt cunoscuţi şi streptococi care nu prezintă antigenul de grup şi care nu pot fi
grupaţi după acest criteriu. Acest criteriu are la bază antigenele polizaharidice din peretele
celular.
Reprezentanţii grupei A pot fi la rândul lor împărţiţi în peste 60 de tipuri antigenice, pe baza
proteinei M, care conţine 2 determinanţi, unul cu specificitate de tip (se conturează tipurile
antigenice), iar celălalt nontip specific, strâns asociat proteinei M, şi denumit MAP. Acest
determinant este răspunzător de reacţiile imunologice cu ţesuturile gazdei.
Infecţii streptococice
 Infecţii cu streptococi de grup A (Streptococcus pyogenes):
 infecţii acute: respiratorii şi cutanate.
o infecţiile respiratorii: acute neeruptive = faringita şi anginele
acute eruptive = scarlatina
o infecţii cutanate: intertrigo (infecţia unui pliu), impetigo (dermatită
buloasă), ectima (un impetigo al adultului cu localizare la membrele
inferioare), erizipelul (o dermo-hipodermită acută localizată mai frecventă
la membrele inferioare şi caracterizată prin febră-39ºC, frison, placarde
cutanate eritematoase şi adenopatie regională).
 complicaţii precoce supurative:
o după infecţii respiratorii pot să apară limfadenita cervicală, pleurezii,
pneumonii, mastoidite, otite, sinuzite.
o după infecţii cutanate – celulite, miozite, fasceite necrozante (sindromul
Meleney).
 complicaţii tardive nesupurative:
o după infecţii respiratorii: cardita reumatismală, reumatismul articular acut,
purpura reumatoidă, eritem nodos, coreea Sydenham.
 Infecţii cu streptococi de grup B (Streptococcus agalactiae):
 infecţii neonatale, la nou-născuţii din mame infectate sau urmare a contaminării
nosocomiale.
 bacteriemii urmare a endometritei sau a supuraţiei plăgii cezariene.
 pneumonii, endocardite, artrite, celulite la indivizii imunosupresaţi.
 septicemia se asociază frecvent cu avortul septic.
 alte infecţii: otite, traheobronşite, infecţii urinare, etc.

65
  Infecţii cu streptococi de grup D (Streptococcus faecalis) şi cu Enterococcus:
 infecţii urinare, genitale şi perineale, endocardite, supuraţii ale plăgilor chirurgicale,
otite şi sinuzite, apendicite şi peritonite, infecţii biliare.
 Infecţii cu streptococi de grup C şi G (comensali ai faringelui):
 infecţii ale tractului respirator superior, infecţii cutanate, infecţii genitale, artrite
purulente, meningite.
 Infecţii cu Streptococcus pneumoniae:
 pneumonia lobară acută,
 alte infecţii: meningite purulente, bronşite, pleurezie, pericardite, sinovite, faringite,
infecţii oculare, artrite, endocardite, peritonite.
 Infecţii cu streptococi orali:
 endocardite, pneumopatii, valvulopatii (specificul infecţiilor orale este tratat separat
la capitolul Microbiologia cavităţii orale).
Diagnosticul de laborator al infecţiilor streptococice

Diagnosticul bacteriologic:
Recoltarea probelor patologice se face în funcţie de localizarea infecţiei.
Examenul microscopic direct se face în frotiul colorat Gram. Uneori nu are utilitate,
alteori poate da informaţii orientative, în timp ce în unele situaţii poate avea o mare valoare
diagnostică (de exemplu – în cursul unei pneumonii, un frotiu din spută care pune în evidenţă
diplococi Gram pozitivi capsulaţi având formă de vârf de lance, ne orientează spre
diagnosticul unei pneumonii pneumococice).
Izolarea
 pe agar sânge – pentru majoritatea streptococilor.
 pe agar nutritiv pentru enterococi.
 pe agar şocolatiu (sau agar sânge), cu incubare în atmosferă cu 10% CO 2, pentru
pneumococi.
Identificarea
 proprietăţi morfotinctoriale: coci Gram pozitivi, în lanţuri de lungimi
variabile;pentru Streptococcus pyogenes aspectul frotiului este caracteristic din
culturile dezvoltate în bulion glucozat.
 proprietăţi de cultură:Streptococcus pyogenes formează pe agar sânge colonii de tip
S, punctiforme, înconjurate de o zonă de hemoliză completă (betahemoliză);în bulion
glucozat lasă mediul limpede şi formează un sediment grunjos.
Streptococcus pneumoniae formează colonii de tip S
(tulpinile capsulate), înconjurate de o zonă de hemoliză α de culoare verzuie pe geloza
sânge şi respectiv galben-verzuie pe geloza şocolatie.
Enterococii formează colonii de tip S nehemolitice pe geloza
sânge, în timp ce pe mediul bilă-esculină apar negre ca urmare a hidrolizei esculinei.
 proprietăţi biochimice:sunt lipsite de importanţă pentru identificarea streptococilor
piogeni; sunt utile pentru identificarea enterococilor şi pneumococilor.
 enterococii (şi streptococii fecali) se dezvoltă la temperaturi între 10-40ºC, în timp ce
pneumococii necesită temperatura de 37ºC (cu incubare în atmosfera cu 10% CO2).
 enterococii se dezvoltă pe medii cu: 6,5% NaCl, 40% bilă şi 0,1% albastru de
metilen; pneumococii nu se dezvoltă pe astfel de medii şi în plus se lizează în
prezenţa bilei.

66
  pneumococii sunt extrem de sensibili la acţiunea optochinului.
 proprietăţi antigenice:
 grupele antigenice importante pentru patologia umană sunt: A, B, C, D, F, G.
 apartenenţa la grupul antigenic se poate face prin:
- testul la Bacitracină care permite încadrarea în grupul antigenic A.
- testul CAMP pentru încadrarea în grupul antigenic B (tulpinile streptococice din
acest grup produc factorul CAMP şi măresc zona de hemoliză produsă de o
tulpină de stafilococ utilizată la realizarea testului).
- coaglutinarea
- latex-aglutinarea foloseşte anticorpi antigrup streptococic fixaţi pe particule de
latex.
 pneumococii au peste 80 de tipuri antigenice identificabile prin reacţii de aglutinare
sau prin testul de umflare a capsulei a lui Neufeld.
 proprietăţi de patogenitate:
 pentru Streptococcus pyogenes: toxina eritrogenă, streptolizinele O şi S (oxigen-labilă
şi respectiv oxigen-stabilă), hialuronidaza, streptochinaza (fibrinolizina),
nucleazele,proteinazele (proteinaza C cu acţiune toxică pe cord).
 la pneumococi: capsula şi pneumolizina (o hemolizină)
Antibiograma este obligatorie pentru toţi streptococii, în pofida faptului că
streptococii de grup A sunt întotdeauna sensibili la penicilina de grup G.
Diagnosticul indirect:
Se face prin reacţia ASLO care pune în evidenţă prezenţa anticorpilor antistreptolizină O. Un
titru care depăşeşte 200 unităţi ASLO se va interpreta ca şi infecţie streptococică recentă şi
va impune profilaxia complicaţiilor.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR PRODUSE

DE COCII GRAM NEGATIVI

GENUL NEISSERIA

Genul Neisseria cuprinde diplococi Gram negativi, imobili, de aspect reniform,

aşezaţi în diplo. Sunt bacterii care produc catalază şi oxidază.
Genul reuneşte atât specii patogene cât şi specii comensale. Neisseriile patogene sunt
reprezentate prin Neisseria gonorhoeae (gonococul) şi Neisseria meningithidis
(meningococul).
Neisseria gonorhoeae determină infecţii cu transmitere sexuală, care la bărbat se
manifestă ca şi uretrită acută, care greşit tratată sau netratată devine subacută, şi în evoluţie
se complică cu prostatită, epididimită şi orhită. Pe termen lung, urmare a diseminării
hematogene se poate instala artrita. La femeie cel mai frecvent apare cervicita şi colpita fără
manifestări clinice evidente. În timp, infecţia se complică cu salpingită, ovarită şi sterilitate.
Şi la femeie se poate instala artrita ca şi complicaţie tardivă.
La nou-născut există posibilitatea instalării infecţiei consecutiv străbaterii filierei pelvi-
genitale materne, fapt care conduce la instalarea unei oftalmii purulente, care are ca şi
consecinţă cecitatea.
Diagnosticul de laborator

67
 Recoltarea probelor patologice:
 la bărbat se recoltează secreţie uretrală dimineaţa, înainte de micţiune, folosind fie
ansa bacteriologică, fie tamponul uretral.
 la femeie recoltarea se face la nivelul colului uterin, din fundul de sac vaginal
posterior şi de la nivelul orificiului de deschidere al glandelor Bartholin.
Examenul microscopic direct este util numai din secreţia uretrală. Se poate face fie
în coloraţia simplă cu albastru de metilen, fie în coloraţia Gram. Se pun în evidenţă diplococi
reniformi, Gram negativi (în coloraţia Gram) şi numeroase polimorfonucleare. În infecţiile
subacute diplococii apar fagocitaţi, iar în infecţiile cronice lipsesc polinuclearele, şi cu
destulă dificultate se pot pune în evidenţă diplococii care colonizează celule sau fragmente de
celule epiteliale.
Izolarea se realizează pe geloză şocolatie, sau pe geloză Muller-Hinton suplimentate
cu hidrolizat de lactalbumină; se incubează 48 h la 36ºC în atmosferă cu 10% CO2.
Identificarea se bazează pe proprietăţile morfotinctoriale (diplococi reniformi Gram
negativi), caracterele de cultură (colonii mici, de tip S, gri, transparente), proprietăţile
biochimice (produce oxidază, catalază, degradează glucoza dar nu şi maltoza), proprietăţile
de patogenitate (cu prezenţa endotoxinei, a pililor care asigură colonizarea mucoaselor, a
capsulei polizaharidice).
Antibiograma este obligatorie pentru conturarea schemei terapeutice.

Neisseria meningithidis este un agent etiologic specific uman, izolabil din

rinofaringele purtătorilor sănătoşi, iar în cazul bolii clinic manifeste de la nivelul lichidului
cefalorahidian.
Meningococii pătrund în organismul uman pe cale aerogenă şi determină iniţial o
rinofaringită subclinică sau clinic manifestă. Dacă depăşesc bariera mucoasă pătrund în sânge
şi determină bacteriemie. Sub acţiunea factorilor de apărare nespecifică – interferoniii, sau
specifică – anticorpii antimeningocici infecţia se poate opri în acest stadiu. În condiţii de
scădere a rezistenţei generale organismului, meningococii depăşesc bariera hemato-
encefalică şi se localizează la nivelul învelişurilor meningeale, determinând meningita
meningococică.
Diagnosticul de laborator se face pe baza examenului direct bacteriologic.
Recoltarea probelor patologice:
 se recoltează LCR prin puncţia coloanei lombare (înainte de instituirea tratamentului
chimioterapic),
 în meningitele bacteriene, în general, şi în cea meningococică în special, LCR este
purulent (spre deosebire de meningitele virale în care LCR este clar şi doar uşor
hipertensiv – în meningita bacilară aspectul LCR este asemănător cu cel din
meningitele virale).
Examenul microscopic direct:
 citologic preliminar realizează numărătoarea celulelor şi foloseşte camere de
numărare care se folosesc şi pentru leucocite (se face pe LCR necentrifugat).
 pe LCR centrifugat se completează examenul citologic în frotiuri colorate Giemsa sau
în coloraţie simplă cu albastru de metilen (în meningitele bacteriene predomină
polimorfonuclearele, în timp ce în meningitele virale, dar şi în meningita bacilară,
predomină limfocitele). Pentru excluderea definitivă a etiologiei bacilare se face
frotiu în coloraţia Ziehl-Neelsen. Informaţii esenţiale se obţin în frotiul colorat Gram:

68
 în cazul infecţiei meningococice frotiul pune în evidenţă diplococi reniformi Gram
negativi predominent fagocitaţi.
Izolarea se face pe geloză Muller-Hinton sau geloză şocolatie (medii preîncălzite la
37ºC), incubându-se în atmosferă cu 10%CO2.
Identificarea se bazează pe cercetarea proprietăţilor morfotinctoriale (frotiul colorat
Gram evidenţiază diplococii Gram negativi), cercetarea caracterelor de cultură
(colonii de tip S, nepigmentate şi nehemolitice, de dimensiuni foarte mici care se
prezintă sub aspectul picăturilor de rouă), pe proprietăţile biochimice (cu producerea
catalazei şi a oxidazelor, metabolizarea glucozei şi maltozei) şi a proprietăţilor
antigenice identificabile prin latex aglutinare şi imunofluorescenţă (serogrupele fiind
notate cu litere majuscule – A, B, C, 29E, X, Y, Z, W135), şi a proprietăţilor de
patogenitate (endotoxina, capsula, proteinele de membrană externă şi pilii).
Antibiograma se realizează prin metoda difuzimetrică pe geloză şocolatie.

NOTE PERSONALE

69
LUCRAREA NUMĂRUL 10. BACILII GRAM NEGATIVI

Bacilii Gram negativi se grupează în funcţie de capacitatea de a metaboliza glucoza în:

- bacili Gram negativi fermentativi- degradează glucoza pe cale oxidativă şi
fermentativă.
- bacili Gram negativi nefermentativi- degradează glucoza pe cale strict
oxidativă.

BACILI GRAM NEGATIVI FERMENTATIVI

FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE cuprinde numeroase genuri şi specii (uneori

tipuri şi subtipuri antigenice). În familia Enterobacteriaceae sunt clasificate atât bacterii cu
patogenitate certă (Salmonella, Shigella, Yersinia pestis), cât şi bacterii comensale la nivelul
tubului digestiv al omului şi al animalelor, care însă, în anumite condiţii favorizante pot să
manifeste evidente caractere de patogenitate (E. coli, Proteus, Klebsiella, etc.).
Toate Enterobacteriaceaele sunt bacili Gram negativi care la izolarea din
produsul patologic pe medii de cultură formează de obicei colonii de tip S, pentru ca, după un
număr variabil de pasaje să poată forma şi colonii R. În medii lichide, de obicei, dau o
turbiditate uniformă, posibil peliculă incompletă ca şi un inel aderent de peretele eprubetei
(culturi vechi) şi sediment. Faţă de aceste caracteristici comune, uneori sunt întâlnite
particularităţi utile diagnosticului. Ex: Proteus- prezintă proprietatea de a migra pe mediile
gelozate (invazie la culturile în plăci Petri, căţărarea la cultivarea pe agar înclinat); Klebsiella
pneumoniae şi Klebsiella oxytoca formează colonii mucoide şi prezintă frecvent fenomenul
cameleonajului (în aceeaşi placă- se întâlnesc şi colonii lactozo-pozitive şi colonii lactozo-
negative); Serratia marcescens formează în anumite condiţii colonii pigmentate în roşu.
Pentru că există şi alţi bacili Gram negativi care nu fac parte din familia
Enterobacteriaceae, dar care au proprietăţi de cultură asemănătoare, pentru ca o tulpină
bacteriană care a fost izolată dintr-un produs patologic să poată fi încadrată în familia
Enterobacteriaceae, trebuie să îndeplinească şi următoarele caracteristici de metabolism.
- să degradeze oxidativ şi fermentativ glucoza
- să reducă nitraţii la nitriţi
- testul citocromoxidazei să fie negativ
Încadrarea ulterioară în gen şi mai apoi în specie se bazează şi pe alte proprietăţi
biochimice (stabilirea apartenenţei la o anumită specie necesită studierea a 24-28 de
proprietăţi biochimice diferite).
Principalele genuri ale familiei sunt: Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter,
Proteus, Providencia, Morganella, Klebsiella, Pantoea, Enterobacter, Serratia, Hafnia,
Yersinia, Edwardsiella, Tatumella, Cedecea, Erwinia, etc.
Chiar şi după utilizarea unor baterii complete de teste biochimice, în cazul unor
bacterii, stabilirea apartenenţei la o anumită specie se poate face numai pe baza structurii
antigenice (ex: Salmonella), prin practicarea de reacţii de aglutinare pe lamă.
La Enterobacteriaceae sunt prezente:
- antigenul somatic (“O”) prezent la nivelul peretelui celular ( parte din el
constituind endotoxina)

70
 - antigenul flagelar (“H”) prezent în cilii bacteriilor mobile ( deci absent la cele
neciliate)
- antigenul de înveliş (“K”) prezent ca şi antigen capsular la Klebsiella,
antigenul Vi la unele serotipuri de Salmonella sau alte antigene de suprafaţă.

GENUL SHIGELLA

Dizenteria bacilară (scaune diareice muco-sangvinolente care pot fi însoţite de febră

38°C, colici abdominale şi tenesme) este produsă de specii ale genului Shigella.
Shigelele pătrund în organism pe cale digestivă, iar la nivel intestinal se ataşează
nespecific de enterocite şi produc modificarea citoscheletului, apoi două proteine codificate
plasmidic determină endocitoza bacteriană, iar liza fagozomului permite shigelelor să
invadeze şi să se multiplice în citoplasmă; alte două proteine tot cu codificare plasmidică
favorizează răspândirea intercelulară; moartea celulei survine prin inhibiţia sintezei proteice,
consecinţa fiind ulceraţiile mucoasei apărute pe fond inflamator.
● Shigella dizenteriae cu tipurile:
- S. Shiga (1)
- S. Schmitzii (2)
- Grupa Large- Sachs (3-10)
● Shigella flexneri - 6 tipuri, mai multe subtipuri, 2 variante
● Shigella boydi- 18 tipuri antigenice
● Shigella sonnei- 1 tip antigenic dar în două variante S şi R (la această specie
variaţia de fază se produce după 1-2 pasaje)
În dizenterie se folosesc metodele diagnosticului bacteriologic:
1. Recoltarea probelor patologice: materii fecale din scaunul de emisie spontană.
Transportul probei la laborator trebuie făcut cât mai repede.
!NU se face examen microscopic direct din materiile fecale! (în scop de diagnostic
bacteriologic)
2. Izolarea se face prin însămânţare pe medii selective cu lactoză (McConkey, Levin,
Leiffson, Drigalski, CLED etc) pe care bacilii dizenterici se dezvoltă sub formă de colonii
lactozo negative.
3. Identificarea
- proprietăţile morfotinctoriale: bacili Gram negativi
imobili
- proprietăţile de cultură : colonii S lactozo negative
- proprietăţile biochimice : pozitivează testul roşu metil, nu produc
hidrogen sulfurat, testul indol este negativ (diferenţiere de tulpini de Escherichia coli), testul
Voges-Proskauer este negativ, nu produce urează, nu utilizează citratul de sodiu, nu
utilizează acetatul de sodiu (diferenţiere de Escherichia coli), nu produce
fenilalanindezaminază.
- proprietăţile antigenice se urmăresc prin reacţia de aglutinare pe
lamă folosind seruri polivalente şi ulterior monovalente pentru stabilirea apartenenţei la tip
şi eventual subtip- (S.flexneri).
- proprietăţi de patogenitate- toate Shigelele acţionează
enteroinvaziv, aşa încât este inutil să fie efectuat testul keratoconjunctivitei la cobai (testul
Serreny).

71
 4. Antibiograma- finalizează diagnosticul etiologic.

GENUL SALMONELLA

Genul Salmonella cuprinde bacterii mobile, care fermentează glucoza cu producere

de gaz, producere de acid din manitol şi sorbitol, hidrogen sulfurat, lizindecarboxilază şi
folosesc citratul ca şi unică sursă de carbon.
În accepţiunea actuală genul Salmonella reuneşte două specii: Salmonella enterica
care include 6 subspecii – enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, indica şi
Salmonella bongori. Pentru a evita confuziile care ar putea porni de la taxonomia veche,
pentru serovaruri s-a păstrat numele anterior atribuit speciilor în schema Kauffmann-White.
De exemplu: Salmonella serovar Typhimurium sau Salmonella serovar Enteritidis.
Bolile produse se numesc salmoneloze care pot fi clasificate în:
– Salmoneloze majore
- Salmoneloze minore

● Salmoneloze majore
- Febra tifoidă- produsă de S.typhi
- Febra paratifoidă A- S.paratyphi A
- Febra paratifoidă B- S.paratyphi B

● Salmoneloze minore
- Toxiinfecţii alimentare-produse de serovarurile enterotoxigene de Salmonella
serovar Typhimurium,serovar Enteritidis.
- Gastroenterite - pot fi produse de toate celelalte salmonele cu excepţia celor
incriminate în etiologia salmonelozelor majore.
- Stările septicopiemice- produse de salmonelele din grupa C (predilect
Salmonella cholerae suis)

Diagnosticul de laborator foloseşte în toate salmonelozele metodele

diagnosticului direct (bacteriologic) şi strict pentru febrele tifo-paratifoide şi metodele
diagnosticului serologic (Reacţia Widal).
Diagnosticul bacteriologic
1. Recoltarea probelor patologice– în toate salmonelozele se recoltează materii fecale
iar în febrele tifoparatifoide în prima săptamână de boală se recoltează sânge (pentru
hemocultură) şi urină (pentru urocultură), din săptămâna a II-a- materii fecale (pentru
coprocultură) în timp ce pentru depistarea purtătorilor de bacil tific se recoltează bilă (pentru
bilicultură).
2. Examenul microscopic direct al probelor patologice este inutil în cazul materiilor
fecale; din alte produse patologice- are valoare orientativă.
3. Izolarea:se inoculează produsul patologic pe medii de îmbogăţire şi pe medii
selective cu lactoză. Din mediile de îmbogăţire (ex- mediul cu selenit acid de sodiu) se
execută pasaje tot pe medii selective cu lactoză pe care salmonelele formează colonii lactozo
negative; acestea se izolează în cultură pură pentru identificare.
4. Identificarea utilizează:
- proprietăţi morfotinctoriale - bacili Gram negativi (mobili)

72
 - proprietăţi de cultură - colonii S lactozo- negative
- proprietăţi biochimice - fermentează glucoza cu producere de gaz, producere
de acid din manitol şi sorbitol, hidrogen sulfurat, lizindecarboxilază şi
folosesc citratul ca şi unică sursă de carbon
- proprietăţi antigenice
● antigenul somatic “O”- s-au descris peste 67 de factori “O” (factori
majori de specificitate). Ag “O” este caracteristic de grup.
- grupele serologice (antigenice) au fost notate cu
litere majuscule din alfabetul latin, de la A- Z şi apoi prin simbolul O al antigenului somatic
şi numărul factorului respectiv (O51, O52….).
- unele serogrupe au un singur factor major, altele
(mai complexe) au mai mulţi factori majori de specificitate.
● antigenele de înveliş (“K”) – sub această denumire sunt grupate
antigenele dispuse la suprafaţa peretelui celular. În schema Kauffman-White este specificat
doar antigenul Vi prezent în mod constant la S. typhi şi care conferă inaglutinabilitate
somatică.
● antigenele flagelare (“H”) – sunt caracteristice de tip. Variaţia
antigenelor H este cunoscută sub denumirea de variaţie de fază. La culturile
de Salmonella se disting antigene H proprii (de fază
1) şi antigen H comune (de fază 2).
- o celulă are antigen H numai de fază 1 sau
numai de fază 2.
- o cultură de Salmonella poate fi formată
din celule numai de fază 1 sau numai de fază 2 (culturi monofazice) sau din celule cu
antigene H de ambele faze (culturile difazice).
- antigenele H de fază 1 au fost notate cu
litere mici din alfabetul latin de la a-z şi apoi cu z şi un indice z 1, z2…).Antigenele H de fază
2 au fost notate prin complexe de cifre sau litere ( 1,2; 1,5; 1,7; 1,9;enx).
Identificarea antigenelor se bazează pe practicarea reacţiilor de aglutinare pe lamă (se
folosesc în ordine - ser polivalent anti O, serul Vi -dacă nu a aglutinat cu serul anti O-, seruri
anti“O” de grup, seruri anti H de fază 1 şi apoi seruri anti H de fază 2.) Enumerarea
antigenelor “O” şi “H” de fază 1 şi de fază 2 dă formula antigenică.
5. Antibiograma - finalizează diagnosticul bacteriologic.

Diagnosticul indirect ( R. Widal)- se practică în febrele tifoparatifoide

Reacţia urmăreşte evidenţierea în serul bolnavilor a aglutininelor antitifoparatifice (în
paralel pentru antigenul somatic şi cel flagelar). R. Widal completă însumează 3 reacţii de
aglutinare somatică şi alte trei de aglutinare flagelară (deci 6 reacţii de aglutinare în tuburi)
Pentru interpretarea rezultatelor se va ţine seama de faptul că
- aglutininele ating în ser titrul maxim în săptămâna III, IV
de boală,
- tratamentul chimioterapic asociat cu cortizonice, aplicat în primele
zile de boală, împiedică creşterea titrului aglutininelor (deci nu se mai justifică practicarea R.
Widal).

73
OPORTUNIŞTII FAMILIEI ENTEROBACTERIACEAE

GENUL ESCHERICHIA - cuprinde bacterii comensale, constituenţi obişnuiţi ai

microbiocenozei colonului la om şi animale, dar care în anumite condiţii pot manifesta
evidente caractere de patogenitate
Populaţiile de E. coli echipate cu factori de patogenitate, se pot constitui în agenţi
etiologici ai unor infecţii enterale şi extraenterale.
Infecţii extraenterale: infecţii ale căilor respiratorii superioare, infecţii ale căilor
biliare, meningite şi septicemii.
Sindroame diareice produse de tulpini de:
 E. coli enteroinvaziv (EIEC), pozitivează testul Sereny şi
determină o simptomatologie asemănătoare cu cea produsă de
Shigella.
 E. coli enterotoxigen (ETEC) elaborează enterotoxine şi
determină o simptomatologie asemănătoare cu cea din holeră.
 E. coli enteropatogen (EPEC), a fost incriminată în etiologia
unor pusee epidemice de diaree malignă la copii sub 1 an.
EPEC aderă de enterocit, citoscheletul celular se modifică, iar
membrana enterocitului îmbracă bacteriile aderente într-un
suport caracteristic ca o cupă; aderarea la membrană facilitează
formarea de microcolonii. În final, adeziunea celulară este
amplificată de participarea diferitelor proteine şi se ajunge la
ştergerea microvililor; sindromul diareic se explică prin
dispariţia microvililor cu reducerea capacităţii de retroresorbţie
a mucoasei.
 E. coli enterohemoragic (EHEC) produce, ca urmare a
conversiei lizogene, toxine a căror acţiune conduce la colite
hemoragice şi sindrom hemolitic uremic (anemie hemolitică,
insuficienţă renală).
 E. coli enteroagregativ (EAggEC) invadează ţesuturile,
produce o enterotoxină termolabilă fără activitate hemolitică şi
determină sindroame diareice acute şi cronice.
 E.coli difuz aderent (DAEC) cu acţiune difuz aderentă şi
invazivă celulară, care stă la originea sindromului diareic
produs de patotipul menţionat.
Escherichia coli
- Sunt bacili Gram negativi mobili
- Formează pe mediile selective cu lactoză colonii lactozo-pozitive (există şi excepţii)
- Se remarcă un fenomen de disjuncţie colonială marcat (poate forma colonii S dar şi R,
mucoide, gelatinoase sau uleioase)
- Pozitivează testul indol, se dezvoltă pe mediu minimal cu acetat de sodiu, pozitivează
testul roşu metil, glucoza este fermentată cu producere de gaze
- Are antigene somatice, de înveliş şi flagelare
- Prezintă factori de patogenitate: factori de virulenţă, factori de aderenţă (atg K88,
K89), factori de colonizare (CFA I, CFA II, P987, E 8775, CFA III), antigene de suprafaţă,

74
factori de toxicitate (endotoxina, hemolizinele, enterotoxinele) care pot fi evidenţiaţi prin
teste de laborator.
- Antibiograma este esenţială pentru conturarea schemei terapeutice.

GENUL KLEBSIELLA

Este o grupare constituită din enterobacterii imobile, capsulate, cu activitate intensă

asupra zaharurilor pe care le metabolizează cu producere de acizi şi gaze; produşii finali de
fermentaţie a glucozei fiind acetoina şi 2,3 butandiolul, deci pozitivează testul Voges
Proskauer (nu toate speciile).
Speciile întâlnite frecvent în patologia umană se dezvoltă pe mediile cu citrat de sodiu,
produc lizindecarboxilază şi urează.
Genul reuneşte 10 specii, specia tip fiind Klebsiella pneumoniae, implicată în
producerea de infecţii nosocomiale (intraspitaliceşti) – la adulţi se izolează din infecţii
urinare şi respiratorii, iar la copii mai frecvent din enterite. Pentru Klebsiella pneumoniae şi
Klebsiella oxytoca sunt caracteristice coloniile mucoide precum şi fenomenul cameleonajului
( colonii lactozo-pozitive alături de altele lactozo-negative).

GENURILE ENTEROBACTER ŞI PANTOEA

Cuprind bacterii mobile, care fermentează glucoza (cu producerea de gaze), lactoza,
ramnoza şi sorbitolul. Produce acetilmetilcarbinol şi pozitivează astfel reacţia Voges-
Proskauer.
Pe mediile gelozate formează colonii de tip S; pe mediile slab selective (Mc Conkey)
formează colonii lactozo-pozitive; Enterobacter sakazakii şi Pantoea agglomerans produc în
48-96 ore un pigment galben caracteristic.
Pantoea agglomerans şi Enterobacter sakazaki sunt izolate din infecţii nosocomiale
(E. sakazaki- meningite şi septicemii neonatale).

GENUL SERRATIA

Genul Serratia reuneşte multe specii implicate în producerea de infecţii ce interesează

căile urinare, căile respiratorii şi sistemul nervos central; specia Serratia marcescens
declanşează infecţii nosocomiale, ce vizează tractul urinar, căile respiratorii, uneori apariţia
septicemiilor. Sunt caracteristice coloniile pigmentate în roşu.
Sunt enterobacterii mobile, care degradează glucoza cu producere de gaze, produce
decarboxilaze, proteaze şi lipaze. Testul Voges-Proskauer este pozitivat în mod constant.

GENURILE PROTEUS, PROVIDENCIA ŞI MORGANELLA

Cuprind bacili Gram negativi care au ca şi caracteristică definitorie producerea de

fenilalanindezaminază.
● Proteus produce hidrogen sulfurat, produce urează şi nu utilizează citratul de sodiu,
are proprietatea de a migra pe mediile gelozate, manifestată ca şi invazie pe mediile de
cultură în plăci Petri şi respectiv căţărare când se însămânţează în apa de condensie a unui
agar înclinat (formează colonii lactozo-negative).Este agent etiologic al infecţiilor tractului

75
urinar (după E. coli se izolează cel mai frecvent din astfel de infecţii). Este una dintre
bacteriile ce se izolează frecvent din infecţiile nosocomiale.
● Providencia, care se izolează, de asemenea, din infecţiile urinare, diferă de Proteus
prin faptul că nu migrează pe mediile gelozate, nu produce hidrogen sulfurat, dar utilizează
citratul de sodiu.
● Morganella se izolează din infecţii localizate la părţile moi.

GENUL YERSINIA

Are ca şi specie tip Yersinia pestis (agentul etiologic al pestei), bacterie cu

patogenitate certă.
Dintre celelalte specii oportuniste ale genului, specia Yersinia enterocolitica este
implicată în producerea de sindroame diareice, prin mecanism mixt enteroinvaziv şi
enterotoxigen;este implicată în producerea infecţiilor nosocomiale.

FAMILIA VIBRIONACEAE

GENUL VIBRIO

Cuprinde bacili Gram negativi, încurbaţi în formă de virgulă, nesporulaţi, necapsulaţi,

mobili. Mai multe specii sunt patogene pentru om şi pentru animalele marine. Specia tip este
Vibrio cholerae- agentul etiologic al holerei. Infecţia apare mai frecvent în urma consumului
de apă contaminată şi evoluează ca un sindrom diareic cu scaune apoase datorat acţiunii
enterotoxinei.
Vibrionii pătrund în organism pe cale digestivă şi dacă reuşesc să depăşească bariera
acidităţii gastrice, colonizează mucoasa intestinală, secretând şi eliberând enterotoxina.
Această este formată din două fragmente notate A şi B; prin fragmentul B toxina se fixează la
receptorii enterocitului, după care este mobilizat fragmentul A care străbate membrana
citoplasmatică a enterocitului; trecând prin dublul strat lipidic membranar, prin reducerea
unor legături de sulf se formează peptidul activ A1, care pe faţa internă a membranei
citoplasmatice activează adenilatciclaza, rezultatul fiind o creştere marcată a nivelului
intracelular al cAMP, fapt în urma căruia enterocitul este comutat din celulă cu rol major
absorbant în celulă secretorie de apă şi electroliţi. Se declanşează o diaree apoasă, însoţită de
vărsături ce sunt datorate iritaţiei produse pe centrul vomei. Pierderile hidrice în 24 ore sunt
de 15-20 litri, producându-se hemoconcentraţie care conduce la prăbuşirea valorilor tensiunii
arteriale. Simptomatologia clinică este completată cu alte manifestări care sunt datorate
pierderilor electrolitice. Pentru bolnav este esenţial tratamentul patogenetic care se referă la
reechilibrarea hidroelectrolitică, completat cu tratamentul etiologic (administrarea de
chimioterapice – tetracicline).
Diagnosticul de laborator este bacteriologic:
1. Recoltarea probelor patologice: materii fecale, lichid de vărsătură probe din apa “
potabilă”, apele de canal şi materialele contaminate
2. Examenul microscopic direct din produsul patologic: în preparatul nativ se
evidenţiază bacili mobile, iar în frotiul colorat Gram - bacili Gram negativi cu formă
caracteristică de virgulă.

76
 3. Izolarea: Produsul patologic este inoculat în apă peptonată cu pH bazic (9,2). Din
pelicula dezvoltată la suprafaţa mediului la 6 şi 12 ore se execută pasaje pe mediul selectiv
BSA, pe care v. holeric formează colonii S translucide.
4. Identificarea parcurge toate etapele iar elementele utile pentru diagnostic sunt:
bacili Gram negativi în formă de virgulă, colonii transparente de tip S pe mediul BSA (pe
agar nutritiv la 18h coloniile sunt opace), pozitivează testul indofenoloxidazei, reduce nitraţii
la nitriţi, fermentează glucoza, zaharoza şi manoza, produce lizin şi ornitindecarboxilază,
produce gelatinază, pozitivează testul striului.
Este important antigenul somatic “O” pe baza căruia au fost conturate serogrupe.
Vibrionii holerici aparţin grupului O1, în cadrul căruia (cu ajutorul unor factori
specifici) s-au conturat trei serotipuri (Ogawa, Inaba, Hykojima) şi două biotipuri (holeric
clasic şi El-Tor) diferenţiabile prin teste de laborator.
Principalul factor de patogenitate este enterotoxina.
5. Antibiograma finalizează diagnosticul (sensibilitate la tetracicline).

NOTE PERSONALE

77
LUCRAREA NUMĂRUL 11. BACILI GRAM NEGATIVI
NEFERMENTATIVI. COCOBACILI GRAM NEGATIVI. BACTERII
ACIDO-ALCOOLO REZISTENTE.

Bacilii Gram negativi glucozo-nefermentativi reprezintă o grupare constituită

artificial pornind de la necesităţile identificării în laboratorul de microbiologie clinică.
Se conturează 4 grupe principale de identificare fenotipică:

 Bacili nefermentativi zaharolitici, oxidazo-pozitivi şi indol-negativi:

Pseudomonas, Burkholderia, Brevundimonas, Ralstonia, Rhizobium radiobacter,
Alcaligenes xylosoxidans supsp. Xylosoxidans, Ochrobactrum anthropi,
Flavobacterium spp., Pseudomonas-similari Grup 2, Shewanella spp., Sphingomonas
paucimobilis.

 Bacili nefermentativi azaharolitici, oxidazo-pozitivi şi indol-negativi:

Pseudomonas alcaligenes, P. pseudoalcaligenes, Alcaligenes spp., Alcaligenes
faecalis tip II, etc.

 Bacili nefermentativi zaharolitici sau azaharolitici, oxidazo-pozitivi şi

indol-pozitivi : Chryseobacterium meningosepticum, Flavobacterium grup IIb,
Empedobacter brevis, etc.

 Bacili nefermentativi oxidazo-negativi : Chryseomonas, Flavimonas,

Stenotrophomonas.

GENUL PSEUDOMONAS

Are ca şi specie tip Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic) foarte răspândită în

natură: sol, ape naturale stătătoare sau de scurgere, vegetale. În condiţii de igienă deficitară
poate fi izolată şi din spitale (cauză frecventă de infecţii nosocomiale). Se mai poate izola din
alimente, instalaţii sanitare, instrumentar medical, soluţii medicamentoase şi chiar antiseptice
slabe. Infecţiile produse de Pseudomonas aeruginosa sunt: infecţii urinare, infecţii
respiratorii, sindroame diareice, otite, osteomielite, suprainfecţia arsurilor.
Diagnostic de laborator – direct bacteriologic
1. Recoltarea probelor patologice- se face în funcţie de localizarea infecţiei
2. Examenul microscopic direct evidenţiază bacili Gram negativi. Preparatul nativ
arată mobilitatea lor.
3. Izolarea- pe medii uzuale (geloză nutritivă)
4. Identificarea parcurge toate etapele:
- proprietăţile morfotinctoriale: sunt bacili Gram negativi scurţi aşezaţi
izolat sau in diplo, uneori formând lanţuri scurte.
- proprietăţi de cultură: pe geloză nutritivă formează colonii S, R sau
gelatinoase, uneori mucoide. Sintetizează o serie de pigmenţi (piocianina

78
 cu specificitate de specie, fluoresceină), care difuzează în mediu de
cultură schimbând culoarea acestuia).
- proprietăţi biochimice: glucoza este degradată pe cale oxidativă,
utilizează citratul de sodiu ca şi unică sursă de carbon, creşte pe medii cu
NaCl 6,5%, produce catalază şi citocromoxidază, lichefiază gelatina şi
coagulează laptele.
- proprietăţi antigenice: prezintă antigene somatice şi flagelare.
- proprietăţi de patogenitate: are endotoxină, o exotoxină A care inhibă
sinteza proteică, enterotoxina termostabilă, enzime proteolitice (elastază,
protează, colagenază, lecitinaza C), hemolizine.

5. Antibiograma este obligatorie! Administrarea incorectă a chimioterapicelor,

permite apariţia tulpinilor multiplu rezistente la acţiunea lor!

ALŢI BACILI GRAM NEGATIVI NEFERMENTATIVI

Alcaligenes - infecţii urinare, infecţii respiratorii, meningite, septicemii.

Burkholderiae – izolat din septicemii, endocardite, infecţii urinare, meningite,

bronhopenumonii, plăgi infectate.

Brevundimonas – implicat în infecţii ale căilor urinare, infecţii vaginale, infecţii de cateter.

Capnocytophaga – implicat în boala parodontală juvenilă.

Cryseobacterium – izolat în cursul meningitelor şi a infecţiilor apărute după utilizarea

sistemelor de hemodializă.

Empedobacter - infecţii urmare a utilizării sistemelor de hemodializă!

Stenotrophomonas – endocardite, meningite, conjunctivite, pneumonii şi septicemii.

Sphingomonas – infecţii urinare, celulite cronice, meningite, septicemii, infecţii

postoperatorii, contaminează apele din piscine.

COCOBACILII GRAM NEGATIVI

GENUL HAEMOPHILUS

Genul Haemophilus cuprinde cocobacili Gram negativi imobili şi nesporulaţi, uneori

capsulaţi, care necesită pentru creştere factorii X (hemina) şi V (NAD sau NADP).
Specia tip este Haemophilus influenzae, un oportunist cantonat la nivelul faringelui, a
cărui putere invazivă poate fi declanşată fie de un factor exterior infecţios (gripa, rujeola), fie
de un traumatism local, fie prin prezenţa unor adezine bacteriene (capsula şi pilii).

79
 Specia prezintă mai multe tipuri antigenice, notate prin literele mici din alfabetul
latin; tipul antigenic b este implicat în producerea de meningite, apărute mai frecvent după
infecţii ale căilor respiratorii, dar şi epiglotite la copii cu vârste între 2-7 ani, bronşite,
pneumonii, uneori otite şi sinuzite.
Haemophilus parainfluenzae este un comensal al tractului respirator superior care
foarte rar poate fi izolat din infecţii ale acestui tract.
Haemophilus ducreyi este agentul etiologic al şancrului moale, o boală cu
transmitere sexuală.
Haemophilus aegyptius produce conjunctivite în sezonul cald.
Diagnosticul de laborator se bazează pe evidenţierea din produsul patologic a
cocobacililor Gram negativi, frecvent capsulaţi (pentru H. ducreyi aşezarea în lanţuri este
caracteristică).
Se dezvoltă pe medii de cultură ce conţin sânge (agar sânge, agar şocolatiu)
suplimentate cu factori de creştere, incubându-se în atmosferă cu 10% CO 2. Dacă se
însămânţează în spoturi de stafilococ pe geloză sânge, se poate evidenţia fenomenul de
satelitism (coloniile de Haemophilus se dezvoltă în jurul coloniilor de stafilococ).
Stabilirea apartenenţei la unul din cele 6 serotipuri se poate face prin latex aglutinare
sau tehnici imunoenzimatice de tip ELISA.
Antibiograma finalizează obligatoriu diagnosticul.

GENUL BORDETELLA

Genul Bordetella cuprinde cocobacili Gram negativi, uneori capsulaţi, care necesită
pentru cultivare medii de cultură speciale (mediul Bordet-Gengou).
Speciile genului sunt Bordetella pertusis, Bordetella parapertusis care produc tusea
convulsivă şi Bordetella bronhiseptica care se izolează în cursul formelor atipice de tuse
convulsivă.
După recoltarea probelor patologice (secreţie traheală şi bronşică), şi izolarea pe
mediul Bordet-Gengou, stabilirea diagnosticului bacteriologic se bazează pe parcurgerea
etapelor identificării.
Diagnosticul serologic foloseşte reacţia de aglutinare în tuburi.
Prevenţia se bazează pe vaccinare, utilizându-se trivaccinul diftero-tetano-pertusis.

BACILI ACIDO–ALCOOLO REZISTENŢI

GENUL MYCOBACTERIUM

Bacteriile clasificate în acest gen sunt bacili de dimensiuni mici, imobili, aerobi,
necapsulaţi şi nesporulaţi.
Sunt bacterii acido alcoolo-rezistente, proprietate care le este conferită de prezenţa la
nivelul peretelui lor celular a acizilor micolici.

Genul cuprinde numeroase specii care pot fi clasificate după cum urmează:
1. Mycobacterii care nu se dezvoltă pe medii de cultură acelulare:

80
 o Mycobacterium leprae (bacilul lui Hansen), agentul etiologic al leprei umane.
o Mycobacterium leprae murium care este agentul etiologic al leprei
şobolanilor.
2. Mycobacterii care se dezvoltă lent (în săptămâni) pe medii de cultură şi care sunt
patogene pentru om şi unele animale:
o Mycobacterium tuberculosis (bacilul lui Koch), agentul etiologic al
tuberculozei umane.
o Mycobacterium bovis, agentul etiologic al tuberculozei bovideelor, dar care
accidental poate să producă şi îmbolnăviri umane.
o Mycobacterium africanum , tot un patogen uman.
o Alte specii: M. muris, M.microtti.
3. Mycobacterii care se dezvoltă lent (în săptămâni) sau rapid (în câteva zile) pe medii
de cultură şi care pot fi saprofite, patogene sau condiţionat patogene.
 Grupa I-a : Mycobacteriile fotocromogene. Coloniile se dezvoltă în 6
săptămâni pe mediile de cultură, şi se pigmentează în galben portocaliu după
fotoinducţie (expunere la lumină). Exemplu: Mycobacterium kansasi (infecţii
cutanate şi meningite).
 Grupa a II-a : Mycobacteriile scotocromogene. Coloniile se dezvoltă în 6
săptămâni pe mediile de cultură şi se pigmentează în galben portocaliu la
întuneric. Exemple: Mycobacterium scrofulaceum, M. xenopi (adenopatii
submaxilare purulente).
 Grupa a III-a : Mycobacteriile necromogene. Coloniile se dezvoltă în 6
săptămâni pe mediile de cultură şi nu se pigmentează. Exemplu: M. avium-
intracellulare (izolat frecvent de la bolnavii de SIDA).
 Grupa a IV-a : Mycobacterii cu creştere rapidă. Coloniile se dezvoltă în câteva
zile pe mediile de cultură. Exemple: M. fortuitum, M. phlei (determină
abcese).

Diagnosticul de laborator în tuberculoză:

Diagnosticul bacteriologic:
1. Recoltarea probelor patologice se face în funcţie de localizarea infecţiei, cel mai
frecvent recoltându-se sputa (pentru că localizarea pulmonară este cea mai
frecventă; alte localizări sunt urogenitală, cutanată, osteoarticulară, pleurală,
meningeală).
2. Examenul microscopic direct foloseşte frotiul colorat Ziehl-Neelsen (a se vedea
preparatele microscopice). Mycobacteriile apar în frotiu ca şi bacili acido-alcoolo
rezistenţi, dispuşi izolat, în grămezi sau în litere majuscule (V, Y, W), pe fondul
albastru dat de toate celelalte elemente prezente în frotiu (alte bacterii, celule
inflamatorii, celule epiteliale sau detritusuri celulare, fibrină). În afara acestei
coloraţii, mai poate fi folosită şi coloraţia fluorescentă auramină-rodamină.
3. Izolarea se face pe mediul selectiv Löwenstein-Yensen (culturi la 37ºC timp de 6
săptămâni).
4. Identificarea:
- proprietăţi morfotinctoriale : bacili acido-alcoolo rezistenţi.
- caractere de cultură : colonii R (rugoase), conopidiforme pentru
M.tuberculosis şi respectiv aplatizate la M. bovis.

81
 - proprietăţi biochimice: produce catalază, testul la niacină este pozitiv
pentru M.tuberculosis şi negativ la M.bovis.
- proprietăţi de patogenitate :se demonstrează prin fenomenul lui Koch
(consecutiv inoculării la cobai).

5. Antibiograma – se lucrează pe mediul Löwenstein-Yensen.

Diagnosticul indirect – biologic:
Se face prin intradermoreacţia (IDR) la tuberculină (PPD). PPD = proteina purificată
şi adsorbită.
IDR testează hipersensibilitatea de tip tardiv la tuberculină şi presupune inocularea
strict intradermică pe faţa anterioară a antebraţului stâng a 0,1 ml PPD ce conţine 2 unităţi de
tuberculină.
Reacţia se citeşte preliminar la 24 h şi definitiv la 72 h prin măsurarea diametrului
papulei dermice (roşeaţă cu denivelare) apărute la locul inoculării. Un diametru mai mare de
10 mm se interpretează ca IDR pozitiv (prezenţa limfocitelor T angajate în răspunsul imun),
în timp ce diametrul sub 10 mm impune interpretarea IDR ca şi negativ şi consecutiv acestui
fapt vaccinare BCG.
Este absolut contraindicat să se facă testarea IDR în cazul în care există cea mai mică
suspiciune de infecţie bacilară în evoluţie.

NOTE PERSONALE

82
LUCRAREA NUMĂRUL 12. SPIROCHETE ŞI ALTE BACTERII
NECOLORABILE GRAM (RICKETTSIA, CHLAMYDIA,
MYCOPLASMA). ELEMENTE DE PARAZITOLOGIE

Spirochetele sunt bacterii subţiri cu o formă helicoidală foarte mobile datorită

prezenţei unui aparat mobil intracelular,reprezentat prin filamentele axiale.

GENUL TREPONEMA- cuprinde numeroase specii care pot fi comensale sau patogene
pentru om. Specia tip este Treponema pallidum, agentul etiologic al unei boli cu transmitere
sexuală, strict umană- sifilisul, care evoluează în 3 faze:
- sifilisul primar- caracterizat prin apariţia şancrului dur la locul de inoculare, leziune
însoţită de adenopatie inghinală. Netratat şancrul se vindecă spontan în 4-6
săptămâni.
- sifilisul secundar- caracterizat prin rozeole cutanate şi plăci mucoase, leziuni datorate
unei diseminări a treponemelor pe cale sangvină şi limfatică.
- sifilisul terţiar (tardiv) cu leziuni grave cardio-vasculare, cutanate (gome),
neurologice ( paralizie generală), osoase.
Sifilisul congenital este datorat transmiterii transplacentare a infecţiei treponemice de la
mamă la făt. Rezultatul fiind avortul fetal în trimestrul al doilea de sarcină. Dacă totuşi
sarcina este dusă până la termen,se instalează sifilisul congenital,cu leziuni incompatibile de
obicei cu supravieţuirea,iar dacă totuşi noul născut supravieţuieşte,va prezenta leziuni foarte
grave la nivelul creierului,leziuni oculare şi hepatice.
Diagnosticul este diferenţiat în funcţie de faza bolii. Dacă în perioada primară este
posibil şi foarte util diagnosticul direct, în perioada secundară şi mai ales terţiară se utilizează
predilect metodele serologice.

Diagnosticul bacteriologic
Recoltarea interesează serozitatea din şancrul dur. Este recomandabil ca recoltarea
să se facă la laborator pentru a facilita examinarea microscopică directă.
Examenul microscopic direct din produsul patologic este de mare valoare şi
reprezintă practic singura metodă de diagnostic,având în vedere faptul că treponemele nu se
pot cultiva pe medii de cultură acelulare.
● preparatul nativ - între lamă şi lamelă, examinat la microscopul cu
fond întunecat evidenţiază bacterii fine, helicoidale cu 10-12 ture de spiră regulate şi
egale, strălucitoare, deosebit de mobile şi care prezintă mişcările caracteristice de
flectare,rotaţie,inşurubare şi translaţie, executând mişcări de rotaţie, translaţie şi flexiune.
●coloraţia Burri se realizează prin amestecarea pe
lamă a unei picături din serozitate cu o picătură de tuş de China. Se întinde frotiul, se usucă şi
se examinează la microscop cu obiectivul de imersie: treponemele apar
albe, strălucitoare şi refringente pe fondul întunecat al preparatului.
● coloraţia Giemsa evidenţiază treponemele prezentând morfologia
caracteristică şi colorate în albastru violaceu.

83
  coloraţia Fontana-Tribondeau evidenţiază bacterii spiralate, cu ture
de spiră fine şi dese, colorate în brun-negru pe fondul galben al
preparatului.
 tehnica Levaditi-Manuelian, reprezintă o impregnare argentică
aţesuturilor, care în preparat se colorează în galben, în timp ce
spirochetele apar colorate în brun-negru.
Izolarea. Cultivarea pe medii a T. pallidum nu este posibilă, dar bacteriile pot fi
menţinute viabile, în laborator, pe mediul Nelson-Meier timp de 72 ore.
Diagnosticul indirect- serologic - constă în reacţii antigen-anticorp folosite pentru
evidenţierea anticorpilor antitreponemici:
Reacţiile cu antigene netreponemice au o specificitate mai redusă şi din acest motiv se
folosesc din ce în ce mai puţin:
 RFC – Bordet-Wasserman este o reacţie care nu se mai foloseşte.
 testul VDRL ( Venelar Disease Research Laboratory), este o reacţie de floculare care
foloseşte antigenul cardiolipinic. Microcristalele de colesterol încărcate cu
cardiolipină întră în reacţie cu anticorpii din serul bolnavilor, iar pozitivarea reacţiei
se traduce prin apariţia unor flocoane, concomitent cu limpezirea mediului de reacţie.
Reacţii cu antigene treponemice: sunt sensibile şi specifice:
 testul de imobilizare a treponemelor,
 reacţia de hemaglutinare pasivă a T. pallidum,
 reacţia de imunoaderenţă,
 reacţia de imunofluorescenţă indirectă,
 reacţia de fixare a complementului cu antigene treponemice.

GENUL BORRELIA

Genul Borrelia cuprinde bacterii de formă spiralată, cu ture de spiră largi şi cu

extremitatea terminată în L. Se transmit prin artropode. Genul reuneşte mai multe specii
printre care:
- Borrelia recurentis, transmisă prin păduche, agent etiologic al febrei recurente,
boală care se caracterizează prin numeroase accese febrile urmate de remisiuni.
- Borrelia burgdorferi, transmisă prin căpuşa, agentul etiologic al boreliozei Lyme.
Boala evoluează tristadial:
a) În faza primară se instalează eritemul migrator, caracterizat prin placarde
maculo-papuloase care apar la 3-30 zile de la contaminare şi care evoluează
centrifug; frecvenţa mai mare a leziunilor vizează zona toracelui.
b) În faza secundară, care se instalează după câteva săptămâni sau luni,
bacteriile pot fi izolate din sânge şi LCR; manifestările clinice sunt
tegumentare, neuromeningeale (meningită cu lichid clar), radiculare
(afectarea nervilor cranieni provoacă paralizie facială la frig), articulare (cu
interesarea unei singure articulaţii mari – cot, genunchi), cardiace (cu bloc
atrio-ventricular), oculare.
c) În faza terţiară, care apare după luni sau ani de la debut, sunt caracteristice
manifestări articulare, cardio-vasculare şi nervoase, cu posibilitatea
instalării tumorilor cerebrale.
Transmiterea materno-fetală este posibilă pe parcursul evoluţiei bolii.

84
 Diagnosticul de laborator foloseşte metodele diagnosticului bacteriologic şi
serologic.
Din probele patologice (sânge, LCR, lichid articular) se face examenul microscopic
(preparat nativ pe fond întunecat şi preparate colorate Giemsa, Burri, Fontana-Tribondeau –
care evidenţiază bacterii cu morfologie caracteristică).
Izolarea este dificilă şi necesită medii speciale.
Punerea în evidenţă la B. burgdorferi se face prin PCR.
Diagnosticul serologic se bazează pe tehnici ELISA, imunoblot, imunofluorescenţă
indirectă.

GENUL LEPTOSPIRA

Leptospirozele sunt larg răspândite în natură, fiind atât saprofite cât şi patogene.
Leptospirele patogene produc îmbolnăviri la animale,dar accidental şi la om.
Leptospirele sunt grupate in speciile:
 L.interogans, care cuprinde tulpinile patogene.
 L.biflexa ,cu tulpinile saprofite.
Leptospirele patogene aparţin la mai multe serogrupe, printre care L.
icterohaemorragie cu rezervor şobolanul şi care produce boala Weil; L.gryppo-typhosa cu
rezervor şoarecele de apă şi produce febra de nămol; L.pomona cu rezervor porcul şi care
produce boala tinerilor porcari; L.hebdomadis cu rezervor rozătoare sălbatice şi care
produce febra de 7 zile; L.canicola cu rezervor câinele, produce tifosul canin.
Leptospirele pătrund în organism prin leziuni dar chiar şi prin tegumente şi mucoase
intacte, produc bacteriemie şi apoi se localizează în rinichi, ficat şi meninge. Pe plan clinic
apare un sindrom febril, asociat cu icter, manifestări renale, meningeale şi hemoragii de
intensităţi variabile.

Diagnosticul direct

În primele zile de boală se recoltează sânge iar mai târziu urină şi eventual LCR.
Examenul microscopic direct este inutil, datorită eliminării foarte reduse a
bacteriilor.
Izolarea se face pe medii speciale care conţin ser de iepure cu un pH uşor alcalin 7,2-
7,6 (Uhlenhut, Kortoff), incubarea se face la o temperatură de 28-30° C.
Identificarea ţine cont de:caracterele morfologice evidenţiate pe frotiuri colorate
Giemsa şi Fontana-Tribondeau, dar sunt utile şi preparatele native examinate la microscopul
pe fond întunecat.
Diagnosticul serologic:
reacţia de fixare a complementului cu un antigen de grup comun leptospirelor,
stabileşte numai diagnosticul de leptospiroză fără precizarea serotipului.
 reacţia de aglutinare-liză permite identificarea serotipului.
Pe o lamă se amestecă o picătură din diluţiile binare ale serului de bolnav cu o
picătură din serotipul de leptospira şi se acoperă cu o lamelă. După câteva minute preparatul
este examinat la microscop pe fond întunecat. În cazul prezenţei anticorpilor specifici (reacţie
pozitivă), leptospirele devin imobile apoi se aglomerează formând ghemuri ce dau aspectul
de păianjen, iar în final sunt lizate.

85
MYCOPLASME

Familia Mycoplasmataceae reuneşte genurile Mycoplasma şi Ureaplasma.

Mycoplasmataceele sunt bacterii lipsite de perete celular şi ca atare caracterizate printr-un
polimorfism accentuat. Sunt cele mai mici bacterii capabile să se dezvolte autonom, pe medii
de cultură acelulare.
În genul Mycoplasma sunt clasificate cca. 60 de specii, unele dintre ele fiind patogene
pentru om şi animale.
Mycoplasma pneumoniae este agentul etiologic al pneumoniei atipice primare. Dintre
condiţionat patogeni, trebuie menţionată specia Mycoplasma hominis implicată în uretrite
nespecifice la bărbaţi, respectiv colpite şi cervicite la femei.
În genul Ureaplasma sunt clasificate bacteriile dotate cu capacitatea de a scinda ureea.
Capacitatea lor patogenă este controversată, dar este cert faptul că specia Ureaplasma
urealyticum este implicată în infecţii cantonate în sfera uro-genitală (idem M. hominis).
Izolarea acestor bacterii se face pe medii de cultură speciale, iar produsele patologice
trebuie în prealabil tratate pentru distrugerea microorganismelor asociate. Se dezvoltă lent (6-
9 zile) pe medii care conţin colesterol, fosfolipide şi extract de drojdie de bere. Formează
colonii de dimensiuni mici, implantate în mediu, cu centrul înfundat şi zona periferică clară.
Examenul microscopic în coloraţia Giemsa sau cu acridin-orange, evidenţiază
formaţiuni polimorfe.
Diagnosticul serologic se bazează pe imunofluorescenţă şi tehnici imunoenzimatice.

CHLAMYDII

Chlamydiile sunt bacterii imobile de formă cocoidală, paraziţi obligatoriu

intracelulari, care se multiplică în celula gazdă printr-un ciclu unic de dezvoltare, care le
deosebeşte de toate celelalte bacterii. Peretele lor celular este asemănător cu al bacteriilor
Gram negative; au un metabolism propriu care însă nu produce ATP, energia fiindu-le
furnizată de către celula gazdă.
La genul Chlamydia se întâlnesc două tipuri de celule:
1. celule mici, sferice, cu nucleoid compact, perete celular dens şi activitate metabolică
redusă. Acestea sunt formele puternic infecţioase, stabile extracelular, numite corpusculii
elementari.
2. celule mari, ovoidale, fără nucleoid dens, cu peretele celular lax, foarte active metabolic,
dispuse intracelular şi care poartă numele de corpusculii reticulaţi (sunt formele de
replicare ala chlamydiilor).
Ciclul de dezvoltare al chlamydiilor:
Corpusculii elementari se ataşează la celula gazdă, faptul necesitând existenţa la
nivelul chlamydiilor a unor situsuri termosensibile, iar la nivelul celulei gazdă a unor situsuri
la neuraminidază (pentru C. trachomatis).
După ataşare chlamydiile sunt fagocitate printr-un proces preferenţial (sunt
internalizate mai rapid decât orice altă bacterie, sau particulă inertă).
Ciclul de dezvoltare durează aproximativ 48 ore.

86
 În fagozom, corpusculii elementari rămân iniţial intacţi, însă în cca. 8 ore se
transformă în corpusculi reticulaţi; aceştia reprezintă forma metabolic activă, adaptată
existenţei intracelulare şi care se multiplică prin diviziune binară.
La cca. 20 ore de la infectarea celulei, corpusculii reticulaţi se reorganizează printr-un
proces de condensare, transformându-se treptat în corpusculi elementari; după cca. 48 ore
vacuola este plică de corpusculii elementari nou formaţi.
Celula se rupe, iar corpusculii elementari sunt puşi în libertate, putând să reia un nou
ciclu infecţios.
Infecţii produse de Chlamydii:
1. C. trachomatis (patogenă umană):
o trahom = keratoconjunctivită cronică cu hipertrofie foliculară şi ulceraţii
corneene - (serotipurile A, B, Ba, C),
o uretrită la bărbaţi, respectiv cervicită şi salpingită la femei, şi prin
autoinoculare conjunctivită (serotipurile D-K),
o limfogranulomatoză inghinală benignă = leziuni ale mucoasei genitale
asociate cu adenopatie regională şi cu simptomatologie generală constând
în: febră, artrită, conjunctivită, meningo-encefalită - (serotipurile L1, L2, L3).
2. C. pneumoniae – este implicată în producerea infecţiilor respiratorii (faringite,
traheo-bronşite, pneumonii).
3. C. psitacii – infectează păsările producând psitacoză-ornitoză.

Diagnosticul foloseşte atât metodele diagnosticului direct cât şi al celui serologic.

Examenul microscopic direct în frotiuri colorate Giemsa sau Machiavello evidenţiază
incluzii intracitoplasmatice dispuse în bonete polare. Fiind un parazit obligatoriu intracelular,
izolarea se poate face numai pe culturi de celule sau în oul embrionat.
Diagnosticul serologic se bazează pe imunofluorescenţă şi RFC.

RICKETTSII

Rickettsiile sunt bacterii de formă cocoidală sau cocobacilară, imobile, paraziţi

obligatoriu intracelulari, care se colorează prin coloraţiile speciale Giemsa, Machiavello şi
Giemenez. Pot fi izolate prin inocularea în culturi de ţesuturi neproliferative sau în sacul
vitelin al oului de găină embrionat. Marea majoritate a speciilor se transmit prin vectori
(păduche, purece, căpuşă), excepţie febra Q (produsă de Coxiella burneti) care se transmite
prin pulberi contaminate şi prin alimente.
Bolile produse poartă numele rickettsioze (fiind în general zoonoze – excepţie tifosul
exantematic care este specific umană), şi evoluează de regulă ca şi febre exantematice
(excepţie face febra Q care este o pneumonie interstiţială).
Tifosul exantematic este produs de Rickettsia prowazeki, transmisă prin păduche;
tifosul endemic este produs de R. mooseri, transmisă prin purece; febra butunoasă datorată
speciei R. conorri, transmisă prin căpuşă; febra Tsutsugamushi (tifosul de lăstăriş) transmisă
prin căpuşă; febra Q, agent etiologic Coxiella burneti care se transmite prin pulberi
contaminate; etc. Bolile menţionate produse de către speciile amintite sunt doar câteva dintre
rickettsiozele întâlnite în practică.

87
 NOŢIUNI DE PARAZITOLOGIE

Paraziţii sunt organisme care trăiesc fie toată viaţa, fie doar o parte din ea în
dependenţă de un alt organism viu, care poartă denumirea de gazdă.
Gazda poate fi definitivă sau intermediară.
Gazda definitivă este organismul care găzduieşte forma adultă a parazitului capabilă
de multiplicare (poate fi omul sau diferite animale). Gazda intermediară este organismul
care găzduieşte forme asexuate ale unor paraziţi, asigurând maturarea şi multiplicarea lor,
până când acestea dobândesc capacitatea de a parazita gazda definitivă (gazde intermediare
pot fi omul, diferite animale sau artropode).
Ciclul parazitar poate fi: simplu- cu trecerea directă a parazitului la o gazdă
definitivă sau complex- care presupune trecerea parazitului prin una sau mai multe gazde
intermediare, până când devine capabil să paraziteze gazda definitivă.
Acţiunea paraziţilor asupra gazdei se manifestă prin:
- Spolierea organismului de substanţe nutritive,
- Acţiune traumatică (mecanică),
- Acţiune bacteriferă (oferă porţi de intrare pentru bacterii şi condiţii pentru multiplicarea
acestora),
- Acţiune toxică (toxinele parazitare putând să determine fenomene alergice cutanate,
respiratorii sau chiar instalarea şocului anafilactic),
- Acţiune iritativ reflexă (ex: creşterea peristaltismului intestinal),
- Acţiune iritativ tisulară (cu formare de granuloame sau apariţia de fibroscleroză).
La acţiunea parazitului, gazda poate reacţiona prin:
- Reacţii celulare- anemie, hipereozinofilie (semnificativă în cazul helminţilor),
- Reacţii tisulare:- splenomegalia (mărire de volum a splinei), formare de perichiste.
- Reacţii imunitare- cu formare de anticorpi specifici care conferă rareori o imunitate
definitivă sau cu apariţia de complexe imune circulante ce pot conduce la diferite complicaţii
(ex: precipitarea la nivelul glomerulilor renali cu apariţia unei glomerulonefrite).

Clasificarea paraziţilor
1. Fungi (ciuperci, micete)- Ex: Candida spp., Aspergillus niger etc.
2. Protozoare:
Clasa Rhizopode - Ex: Entamoeba histolytica
Clasa Flagelate - Ex: Giardia (Lamblia) intestinalis
- Trichomonas vaginalis
Clasa Sporozoare: Ex: Plasmodium - vivax
- ovale
- falciparium
- malariae
Toxoplasma gondi
Clasa Ciliate: Ex: Balantidium coli
3. Helminţi (viermi paraziţi):
Nemathelminţi:
Clasa nematode - Ascaris lumbricoides
- Enterobius vermicularis

88
 - Trichiuris trichiura
- Trichinella spiralis
Plathelminţi:
Clasa Trematode- Ex: Fasciola hepatica
Clasa Cestode- Taenia - saginata
- solium
- Diphilobotrium latum
- Echinococcus granulossus

4. Artropode

NOŢIUNI DE DIAGNOSTIC ÎN BOLILE PARAZITARE

În multe parazitoze diagnosticul se bazează pe evidenţierea directă a parazitului din

probele patologice prelevate de la bolnav. În alte situaţii, răspunsul organismului gazdă la
agresiunea parazitului (modificări biochimice, hematologice sau imunologice), poate orienta
diagnosticul spre un anumit grup de afecţiuni parazitare. Există şi situaţii în care diagnosticul
de certitudine al unei parazitoze poate fi pus pe baza specificităţii de reacţie a gazdei
(detectarea de anticorpi specifici).
Diagnosticul parazitologic: - Examenul parazitologic al sângelui,
- Examenul coproparazitologic,
- Examenul parazitologic al sputei,
- Examenul parazitologic al urinii,
- Culturi de protozoare.
Diagnosticul indirect: - Reacţii antigen- anticorp,
- Investigaţia răspunsului imun celular,
- Alte metode (ex: examinări biochimice şi
hematologice) - cu valoare orientativă.

Examenul parazitologic al sângelui

Este indicat în suspiciunea de : malarie, leishmanioză viscerală, tripasonomiază,
filarioză.
Examenul direc t- permite vizualizarea paraziţilor mobili extraglobulari
(trypanosome şi filari).
Frotiul sangvin ● în strat subţire- permite examinarea bună a morfologiei
paraziţilor, dar există riscul de a da rezultate fals negative pentru că se examinează un
volum foarte mic de sânge.
- se aseptizează pulpa degetului (indexul), se puncţionează, se
îndepărtează prima picătură de sânge.
- picătura următoare se depune pe lama de microscop şi se etalează
cu o altă lamă înclinată la 45 de grade.
● picătura groasă- examinează un volum mai mare de sânge (cresc
astfel şansele de decelare a paraziţilor) dar, din cauza faptului că paraziţii sunt mai
retractaţi, este foarte greu de stabilit diagnosticul de specie.

89
 - 2-3 picături de sânge, recoltate din pulpa degetului în
condiţii de maximă sterilitate, sunt depuse pe o lamă de microscop. Se amestecă circular cu
colţul unei alte lame. Se usucă lent în circa 30 de minute.
● colorarea frotiului
- fixare cu metanol ( câteva secunde),
- acoperire cu soluţie Giemsa 3% ( ph 7,2) –
45 de minute,
- spălare,
- uscare în poziţie verticală,
- se examinează la microscop cu obiectivul
de imersie.

Examenul coproparazitologic
Este indicat în parazitoze produse de către protozoare (amibiaza, giardioza) sau
helminţi (ascaridoza, strongiloidoza, trichineloza, trichocefaloza, teniaza). Rezultatul va
menţiona specia parazitară, abundenţa lui şi stadiul evolutiv.
Examenul coproparazitologic se repetă după trei săptămâni în scop de control
posterapeutic.
Probele sunt recoltate într-un recipient curat şi care se poate închide etanş. Pentru
examinările de rutină se recoltează 3 probe (două din scaunul de emisie spontană şi una
după administrarea unui laxativ) iar în suspiciunea de amibiază se recoltează 6 probe (trei
din scaunul de emisie spontană şi alte 3 după administrare de laxative). Pentru transportul
probei se folosesc conservanţi (ex: metiolat- iod- formol sau formol 10%)
Examenul macroscopic urmăreşte:
- consistenţa (format, semiformat, moale, lichid),
- eventuala prezenţă a proglotelor de tenie sau a viermelui adult (Ascaris lumbricoides),
- eventuala prezenţă a sângelui (dacă este sânge proaspăt pe suprafaţa unui scaun format
aceasta indică prezenţa unor hemoroizi care sângerează; prezenţa de sânge şi mucus într-un
scaun semimoale poate sugera o infecţie amibiazică).
Examinarea proglotelor de tenie se face în ser fiziologic plasate între două lame de
microscop) şi permite identificarea speciei.
Nematodele sunt examinate după fixare în alcool 70% timp de 3 ore (se clarifică în
glicerină 10%- în alcool, se montează în glicerină şi se acoperă cu lamela de sticlă pentru
examinare).
Examenul microscopic se poate practica în:
- Preparat nativ ( în ser fiziologic sau soluţie Lugol)
- Preparat în strat gros
- Preparat după concentrarea elementelor parazitare
(tehnici diferite)
- Preparat colorat (permanent)
Preparatul nativ detectează: - trofozoiţi mobili (protozoare),
- larve mobile ( strongiloide),
- chiste de protozoare,
- ouă de helminţi,
- prezenţa sângelui şi a mucusului.

90
(pe lama de microscop se depune o picătură de ser fiziologic- eventual şi o picătură de
soluţie Lugol, se adaugă un mic fragment de materii fecale, se omogenizează, se acoperă cu
lamela şi se examinează la microscop cu un obiectiv uscat de 10, 20 sau 40).
Preparatul în strat gros (metoda Kato- Miura) - detectează ouăle de helminţi se
folosesc benzi de celofan ţinute în soluţie de glicerol- verde malahit timp de 24 de ore. Pe
lama de microscop se aşează un mic fragment de materii fecale, peste care se dispune cu
pensa celofanul ţinut în soluţia menţionată. Dispersia (sub celofan) se face cu o altă lamă.
Adausul de glicerol permite îndepărtarea bulelor de aer. Se lasă 30 de minute la
temperatura camerei şi se examinează la microscop cu un obiectiv uscat).
Metodele de concentrare sunt folosite pentru evidenţierea ouălelor de paraziţi aflate
în număr foarte mic în probă sedimentare în formol- eter, flotări în soluţie de zaharoză).
Preparatul colorat - detectează trofozoiţii şi chiste de protozoare
Pot fi folosite: - coloraţia tricrom
- hematoxilină ferică
- coloraţia Ziehl- Neelsen modificată
Coloraţia Ziehl- Neelsen modificată:
1. fucsină fenicată- 30 de minute (la rece), spălare.
2. decolorare cu acid sulfuric concentrat 20 de secunde, spălare.
3. colorare cu soluţie de verde malahit 5%, 3 minute, spălare, uscare
(se examineză cu obiectivul de imersie).
Reacţii antigen- anticorp
Pot fi practicate:
- imunelectroforeza,
- contraimunelectroforeza,
- reacţia de aglutinare (inclusiv hemaglutinarea),
- reacţia de fixare a complementului,
- reacţia de imunofluorescenţă,
- reacţii imunoenzimatice ( ELISA).
Investigarea răspunsului imuncelular
Se poate face prin:
- intradermoreacţie,
- testul de inhibare al migrării macrofagelor,
- testul de transformare blastică,
- testul de degradare al bazofilelor.

Alte metode: urmărirea hipereozinofiliei- care este mai pronunţată în parazitozele

datorate helminţilor, însă poate fi întâlnită în diverse alte stări patologice (hemopatii,
alergii).

CANDIDOZELE

91
 Morfologie

În genul Candida sunt clasificate aproximativ 150 de specii. Dintre acestea patogene
umane sunt doar 10. Specia tip este Candida albicans, comensală la nivelul cavităţii bucale,
a intestinului şi a vaginului care îşi manifestă patogenitatea numai în prezenţa unor factori
favorizanţi. În momentul actual sunt admise 4 condiţii predispozante pentru declanşarea
infecţiei cu Candida albicans:- vârsta: se remarcă o incidenţă crescută la sugar şi la copilul
mic;- scăderea rezistenţei organismului prin: sarcină, disfuncţii endocrine (cu predilecţie la
diabetici), imunosupresie (tratamente cu corticoizi şi citostatice, deficit imun congenital,
infecţie cu virusul HIV);- chimioterapia antibacteriană (prin producerea dezechilibrelor în
diferitele microbiocenoze în special la administrarea timp îndelungat pe cale orală) -
distrugerea barierelor anatomice prin: intervenţii chirurgicale, protezări, cateterisme,
tratamente injectabile.
Alte specii de Candida, mai frecvent izolate sunt: Candida tropicalis, Candida
glabrata, Candida parapsilosis şi Candida krusei. Speciile menţionate sunt cauză de infecţii
nosocomiale. După câte se presupune, creşterea incidenţei altor specii de Candida s-ar putea
datora utilizării pe scară largă a Fluconazolului, care a redus incidenţa infecţiilor cu specia
Candida albicans.
Candida albicans poate să producă:
-Candidoze mucoase: digestive, bronhopulmonare, urogenitale,
-Candidoze cutanate şi unghiale: intertrigo, perles (zăbăluţă),
onix, perionix,
-Candidoze osteo-articulare: artrită, osteomielită,
-Candidoze viscerale: pneumonii, pericardite, miocardite,
endocardite, meningite, microabcese renale, endoftalmii,
-Septicemie,
-Candidoze alergice: prin produşi de metabolism.

Candidoza bucală
Se manifestă mai frecvent sub formă de stomatită (muguet).

92
 Stomatita candidozică debutează printr-o congestie intensă a mucoasei bucale şi a
limbii. Se însoţeşte de senzaţia de arsură şi de uscăciune a gurií. În câteva zile pe fondul
eritematos, apar depozite albicioase, iniţial izolate şi ulterior confluente. Se instalează şi o
discreta disfagie.
Lipsa tratamentului conduce la apariţia complicaţiilor: cronicizarea sau extinderea
descendentă pe tubul digestiv (esofag, intestin).
Alte manifestări ale candidozei bucale pot fi:
- glosita mediană (limba este hipertrofiată, depapilată cu depozite albicioase
pe un fond intens eritematos)- Leziunile sunt prezente pe faţa dorsală, înaintea V-ului
lingual.
- uranita (granulaţii albicioase pe un fond intens eritematos al bolţii palatine).
- cheilite angulare- fisuri ale mucoasei comisurii labiale acoperite de cruste şi
cu durere intensă.
Diagnosticul de laborator:
Probele patologice: sunt recoltate în funcţie de localizarea procesului infecţios, în
condiţii similare cu cele pentru diagnosticul direct al infecţiilor bacteriene (trebuie menţionat
că pentru depozitele cutaneo- mucoase sau unghiale este preferabil raclajul).
Examenul microscopic direct: se poate face pe preparatul nativ sau pe frotiuri
colorate (Gram, Giemsa, Gomori, Mac Manus). Frotiurile permit punerea în evidenţă a:
ciupercii levuriforme, filamentelor sau a pseudomiceliilor.
După examenul microscopic în laboratoarele dotate se poate practica diagnosticul de
boală invazivă: a) amplificarea genică (PCR) pentru probele de sânge, salivă, urină sau plăgi
arse sau b) se caută antigenele proteice de Candida albicans prin utilizarea de anticorpi
monoclonali.
Cultivarea şi identificarea:
Pe mediul Sabouraud după 24-48 de ore la 23°C, Candida albicans formează colonii
de tip S (din care în preparatele microscopice se poate pune în evidenţă ciuperca
levuriformă).
Pe mediul EMB (eozină-metilen blue) Candida albicans formează colonii cu aspect
de păianjen.
Pe agar cu extract de porumb se pot pune în evidenţă chlamidosporii.
Pe mediul Albicans ID- specia Candida albicans formează colonii de culoare albastră.
Pe fluoro-agar- specia Candida albicans formează colonii de tip S, fluorescente.
Mediul CHROM-agar- se foloseşte ca şi mediu de diferenţiere între speciile:
- Candida albicans - care formează colonii de tip S de culoare verde.
- Candida tropicalis- care formează colonii de culoare gri—albăstrui,
înconjurate de un halou maro-purpuriu.
- Candida krusei- formează colonii de tip R cu centrul roz şi marginile de
culoare albă.
Testul de filamentaţie este absolut specific pentru specia Candida albicans.
O colonie se descarcă în 0,5 ml de plasmă de iepure şi se incubează la 35°C, timp de
două ore.
Din amestec se examinează la microscop o picătură.
* Există tulpini de Candida stellatoidea şi tulpini de Candida tropicales care
pot să pozitiveze testul filamentaţiei.
* Anumite tulpini de Candida albicans sunt capabile să-şi schimbe fenotipul ,
iar această capacitate poate fi asociată cu virulenţa şi invazia tisulară.

93
 * Candida albicans exprimă cel puţin trei tipuri de adezine care facilitează
ataşarea de suprafeţele epiteliale, urmată de penetrarea în epiteliu, prin
producerea de aspartil proteinază şi formarea de hife.
Pentru identificarea altor specii de Candida sunt importante proprietăţile de
metabolism. Interesează în special metabolizarea zaharurilor. În acest sens, în momentul
actual, sunt utilizate kiturile de diagnostic.
Diagnosticul immunologic:
- pentru anticorpi este inutil,
- pentru evidenţierea antigenelor nu este încă suficient de standardizat.

PARAZITOZE PRODUSE DE PROTOZOARE

GIARDIOZA ( LAMBLIAZA)

Lambliaza este produsă de protozoarul Giardia intestinalis (Lamblia intestinalis).

Interesează toate grupele de vârstă, însă este mai frecventă la copiii mici.
Morfologia parazitului
Giardia intestinalis este un protozoar flagelat care poate exista sub două
forme: trofozoit şi chist.

Trofozoitul (forma vegetativă) are un corp cu simetrie bilaterală, faţa dorsală este
bombată, iar faţa ventrală jumătate plană şi jumătate concavă. Privit din faţă parazitul are
formă de pară, iar din lateral formă de lingură. Prezintă doi nuclei şi patru perechi de
flageli (fiecare pornind dintr-o pereche de blefaroplaşti). Detaliile morfologice sunt
vizualizate în preparate microscopice colorate: citoplasma este fin granulată şi nu prezintă
vacuole digestive; nucleii sunt ovalari şi sunt dispuşi în dreptul unei depresiuni;
blefaroplaştii sunt dispuşi pe linia mediană între nuclei.
Chistul, reprezintă forma de rezistenţă a parazitului putând supravieţui timp
îndelungat în mediul extern. Este ovalar, are o membrană externă dublă, bogată în chitină,
prezintă patru nuclei şi un mănunchi de flageli. Pe axul chistului se pot evidenţia resturi de
flageli dispuse în forma literei S (se colorează în brun în preparatele microscopice realizate
în soluţie Lugol).
Ciclul biologic
Giardia trăieşte sub formă vegetativă la suprafaţa mucoasei duodeno-jejunale.
Formele vegetative (trofozoiţii) au două posibilităţi evolutive: diviziune binară, dând naştere
la noi forme vegetative şi transformarea în chiste (care în momentul emisiei prin materiile
fecale sunt puternic infecţioase), constituind forma de diseminare a infecţiei.

94
Contaminarea umană, se realizează prin ingestia chistelor de Giardia. Contaminarea
hidrică: este principala modalitate de contaminare şi conduce la apariţia epidemiilor.
Transmiterea directă este posibilă în condiţiile de igienă deficitară şi se realizează prin
contact direct (mâini murdare) sau indirect prin obiecte contaminate de mâinile murdare.
Transmiterea prin alimente (zarzavaturi, legume contaminate de dejecte umane ce conţin
chiste) este rară.
Diagnostic
Examenul coproparazitologic permite punerea în evidenţă a chistelor. Preparatul
nativ în ser fiziologic: este dificil de pus în evidenţă chistele. În soluţie Lugol chistele se
colorează în brun închis şi sunt evidenţiate detalii de structuri. Frotiul se face din materii
fecale suspendate în ser fiziologic, se colorează Wheatley-Gomori (cu tricrom) sau
Heidenhein (cu hematoxilină ferică) şi evidenţiază atât formele chistice cât şi cele
vegetative.
În eliminarea chistelor există şi perioade negative de 7-10 zile, aşa încât se impune
repetarea examenului coproparazitologic de 4-5 ori la 7- 10 zile interval.
Examenul lichidului duodenal şi al bilei, permite evidenţierea trofozoiţilor .Se face
preparat nativ în care trofozoiţii prezintă mişcări caracteristice (sacadate de rostogolire)
sau frotiu colorat May Grünwald Giemsa pentru obţinerea detaliilor structurale.
Tratamentul: Metronidazol, Tinidazol (Fasygine).

TRICHOMONIAZA UROGENITALĂ

Este produsă de protozoarul flagelat Trichomonas vaginalis şi se transmite pe cale

sexuală. Are predilecţie pentru mediul urban şi este mai frecventă la femei cu parteneri
sexuali multipli (risc crescut de asociere şi al altor boli cu transmitere sexuală).
Morfologia
Trichomonas vaginalis este un parazit de formă ovalară, mobil şi care există numai sub
formă vegetativă de trofozoit. Are un nucleu voluminos şi situat în partea anterioară, o masă
de blefaroplaşti de la care pornesc patru flageli liberi (situaţi anterior), un flagel recurent
care este legat de membrana ondulantă (situat dorsal). În axul corpului prezintă o structură
rigidă cu rol de susţinere denumită axostil.

95
Ciclul biologic
Este un parazit specific uman care se întâlneşte la femei şi la bărbaţi. La femei se
localizează în vagin, dar poate interesa şi glandele Bartholin, cervixul şi aparatul urinar. La
bărbaţi se localizează la nivelul şanţului balano-prepuţial şi uneori la nivelul prostatei şi a
veziculelor seminale.
Contaminarea umană se face pe cale sexuală.
Aspecte clinice
La femei se manifestă ca şi vulvovaginită acută cu leucoree spumoasă galben-verzuie
cu miros de mucegai şi care pătează lenjeria. Se însoţeşte de prurit vulvar intens. Evoluţia
este de lungă durată incluzând şi perioade de remisie. Conduce la dispareunie.
Frecvent în evoluţie se asociază şi cistita. La bărbaţi evoluează cel mai frecvent fără
manifestări clinice. Foarte rar pot să apară manifestări de uretrită.
Diagnosticul parazitologic:
Produsele patologice: La femeie se recoltează secreţia vaginală pe masa
ginecologică. La bărbat secreţia uretrală matinală (secreţia vaginală se recoltează în
primele zile postmenstruale la cel puţin 48 de ore după contact sexual sau spălătură
vaginală).
Examenul microscopic:
Preparatul nativ- se face în ser fiziologic, examinându-se cu obiectivul uscat de 10
pentru detectarea paraziţilor şi apoi cu obiectivul de 40 pentru identificare (examinarea se
face imediat după recoltare).
Frotiul poate fi colorat May- Grünwald- Giemsa, Gram, eozină + albastru de
metilen, Poppenhein (în coloraţie May- Grünwald- Giemsa- citoplasma parazitului apare
albastru violet, iar nucleii şi flagelii se colorează roşu- violaceu).
Izolarea (se foloseşte când examenul microscopic dă rezultate negative). Sunt
utilizate culturi pe mediile Löffler sau Simici ( incubare 24-72 de ore).
Diagnosticul indirect:
Diagnosticul serologic (cu specificitate destul de scăzută) se poate face prin:
imunofluorescenţă indirectă, latex aglutinere sau teste ELISA. Se poate face IDR (cu antigen
din paraziţi inactivaţi) dar este foarte rar folosit!
Tratamentul - Metronidazol,
- Tinidazol ( Fasygine),
- Secnidazol ( Flagentyl).
Tratamentul se aplică ambilor parteneri, iar la femei se impune şi asocierea
tratamentului local.
PARAZITOZE PRODUSE DE HELMINŢI

NEMATHELMINŢI

ASCARIS LUMBRICOIDES
Este agentul etiologic al parazitozei numită ascaridoză.
Morfologia parazitului:
Viermii adulţi au o culoare roz albicioasă şi dimensiuni mari. Sunt de sexe diferite.
Femelele sunt mai lungi (cca. 20-30 cm), iar masculii mai mici (15-20 cm) şi au extremitatea
posterioară încurbată. În urma acuplării, femelele elimină ouă neembrionate. Oul este

96
ovalar şi are o culoare brună. Prezintă un înveliş dublu: extern mai gros şi de aspect
mamelonat şi intern neted şi stratificat (de natură chitinoasă). În interior se găseşte celula
ou înconjurată de masa vitelină. Embrionarea se realizează pe sol în 10- 40 zile. Oul
embrionat prezintă în interior o larva cilindrică.

Ciclul biologic
Ascaris lumbricoides este un parazit specific uman. Viermii adulţi se localizează la
nivelul intestinului subţire şi au o longevitate de 10-24 de luni. Femelele depun zilnic cca.
250000 de ouă fecundate care se emit odată cu materiile fecale contaminând mediul ambiant
( igienă deficitară).
Contaminarea umană se produce prin ingestia de ouă embrionate existente pe legumele
nespălate şi pe mâinile murdare de pământ. Larva eliberată din ou la nivelul tubului
digestiv, traversează peretele intestinal şi desfăşoară iniţial un ciclu perienteric necesar
adaptării la condiţiile de anaerobioză. Ciclul perienteric presupune o etapă hepatică (de 4-5
zile) după care larvele ajung în circulaţia sangvină şi în septele interalveolare pulmonare.
Urmează etapa pulmonară (de 5-7 zile) în care larvele progresează în căile respiratorii până
la faringe. Pot fi expulzate sau înghiţite, situaţie în care ajung în tubul digestiv şi se
transformă în viermi adulţi reluând un nou ciclu.
Diagnostic. În fazele iniţiale se poate doar suspiciona parazitoza pe baza unei
hipereozinofilii (relevată de tabloul sangvin). Diagnosticul de certitudine se poate face în
etapa intestinală. Macroscopic- pot fi evidenţiaţi viermii adulţi eliminaţi prin materiile fecale
(excepţional de rar pe cale bucală). Examenul coproparazitologic: preparatul nativ realizat
din materiile fecale pune în evidenţă ouă cu morfologie caracteristică.

ENTEROBIUS VERMICULARIS ( OXIURUL)

Parazitoza produsă se numeşte oxiuroză şi este specific umană.

Morfologie
Viermele adult are o talie mică (femelele, maximum 1 cm, iar masculii maximum 0,5
cm- cu extremitatea posterioară încurbată) şi culoare albă. La partea anterioară viermii
adulţi prezintă două proeminenţe transparente care formează butonul cefalic cu rol de
fixare. În urma fecundării, femelele emit ouă embrionate (contagioase). Oul este ovalar şi
are un înveliş dublu format din două membrane subţiri unite într-un punct lateral. În interior
este prezent embrionul giriniform născut (în câteva ore se transformă în larvă vermiformă).

97
Ciclul biologic
Viermii adulţi parazitează intestinul uman la nivelul regiunii ileo-cecale. După
acuplare femelele maturează ouă embrionate (în circa 30 de zile, timp în care rămân
cantonate la nivelul regiunii ileo-cecale, şi încep să migreze descendent spre anus, forţează
sfincterul anal şi depun în pliurile mucoasei (mai ales seara şi în cursul nopţii), câte 10000
de ouă (embrionate).
Contaminarea se poate realiza prin:
a) Infestaţie ecogenă- prin contact direct cu persoana parazitată sau
indirect prin obiecte contaminate.
b) Autoinfestaţie exogenă prin mecanism fecal-oral (în condiţii de
igienă deficitară).
c) Autoinfestaţie endogenă care se produce rar când femela de
oxiur depune ouă în grosimea mucoasei intestinale, care
eclozează şi se eliberează larvele care evoluează spre viermi
adulţi ( în 2-4 săptămâni).
d) Retrofecţiunea, apare în condiţii de igienă total deficitare. Ouăle
rămân mult timp în regiunea perianală, iar larvele eclozate se
reîntorc în intestin.

Aspecte clinice
Principalul simptom este pruritul anal nocturn însoţit de iritaţie perianală sau chiar
eczemă şi manifestări nervoase. Localizările ectopice ale viermilor adulţi pot să conducă la
declanşarea de apendicite, enterite hemoragice sau chiar vulvovaginite (la fetiţe).
Diagnostic parazitologic:
a) macroscopic: vizualizarea femelelor de oxiur la nivelul pliurilor mucoasei
anale.
b) microscopic: se bazează pe efectuarea “scoth-testului” (testul Graham)
care constă în aplicarea pe mucoasa anală a unui fragment de scoth
(pentru prelevarea ouălor) şi transpunerea lui pe o lamă pentru
examinarea microscopică.

PARAZITOZE PRODUSE DE CESTODE

Plathelminţii sunt viermi paraziţi care au corpul turtit dorsoventral. Sunt grupaţi în
două clase: Trematode şi Cestode. În clasa Cestode sunt clasificaţi viermii plaţi care au
capul segmentat.

98
Caractere generale.
Viermii adulţi sunt formaţi din:
a) scolex (capul) prevăzut cu organe de fixare (ventuze, cârlige sau botridii)
dispuse în una sau mai multe coroane.
b) col (gât) reprezentat de un ţesut proliferativ care generează proglotele
(segmentele corpului).
c) strobila (cap) formată dintr-o înşiruire de proglote. Cele tinere (situate în
vecinătatea colului) au aparatul reproducător imatur. Urmează proglotele
mature (la care toate organele sunt bine dezvoltate) şi la capătul distal
(terminal) al viermelui, proglotele bătrâne la care organele interne sunt
involuate cu excepţia uterului ce ocupă proglotul în totalitate şi care practic
este un sac plin cu ouă.
La unele specii uterul este închis iar eliminarea ouălor se face prin ruperea
proglotului, în timp ce la alte specii se deschide la exterior printr-o structură
numită tacostom, fapt care permite eliminarea ouălor pe măsura formării lor
(exemplu: Botriocefalul).
La cestode hrănirea se face prin osmoză.
Sunt organisme hermafrodite caracterizate prin tipul de hermafroditism proterandric
(fecundarea se realizează între proglote învecinate).

TENIOZELE
Sunt parazitoze produse de : Taenia solium ( prin consum de carnea de porc) şi
Taenia saginata ( prin consum de carne de vită).

Taenia saginata

Morfologie
Viermele adult are o lungime de 6-8 m şi culoare alb opacă. Scolexul prezintă 4
ventuze şi nu are cârlige (tenie nearmată). Strobila este formată din 1200- 2000 de proglote
cu papila genitală dispusă pe părţile laterale, după o alternanţă neregulată. În proglotele
bătrâne, uterul este bine dezvoltat, are 20-30 de ramificaţii închise în deget de mănuşă.
Ouăle sunt embrionate, au un înveliş extern fragil, iar în interior se găseşte
embrionul format din embrionul hexacant şi un înveliş radial gros, de culoare brună.
Forma larvară se numeşte cisticerc ( Cysticercus bovis).

Ciclul biologic
Omul este gazda definitivă, fiind parazitat la nivel intestinal cu viermele adult.
Proglotele bătrâne se desprind din strobilă şi progresează activ, străbat sfincterul ileo-cecal,
apoi cel anal şi se elimină din organism în intervalul dintre defecaţii.
Pe sol proglota se sparge, ouăle se eliberează şi contaminează mediul ambiant.
Embrionii sunt ingeraţi de către gazda intermediară, reprezentată prin bovine.

99
 În intestinul animalului, prin dilacerarea învelişului radial se eliberează embrionii
hexacanţi, care străbat peretele intestinal şi care prin circulaţia sangvină ajung la nivelul
musculaturii active (miocard, muşchi masticatori, etc.) unde se veziculează, dând naştere
formei larvare- cisticercul.
Contaminarea umană se realizează prin consumul de carne de vită necontrolată
veterinar şi care conţine cisticerci.
În intestinul uman porţiunea veziculară a cisticercului se dilacerează, se eliberează
scolexul care se fixează pe mucoasa intestinală, iar ţesutul proliferativ al colului generează
proglotele strobilei. În 2-3 luni se formează viermele adult.
Aspecte clinice
În general parazitoza evoluează cu o simptomatologie digestivă (crampe abdominale,
diaree alternând cu constipaţie).
Diagnosticul teniazei
Anamneza- relevă consumul de carne de vită şi eliminarea de proglote în perioadele
dintre defecaţii.
Examenul macroscopic (cu lupa) al proglotelor permite orientarea diagnosticului pe
baza particularităţilor de structură.
Examenul coproparazitologic- neconcludent. Metoda cea mai bună este “ scoth
testul” care permite detectarea ouălor rămase pe pliurile mucoasei anale, după spargerea
accidentală a proglotei la străbaterea sfincterului anal.
Intradermoreacţia (IDR)- foloseşte antigenul extras din cisticerc şi se foloseşte
pentru depistarea focarelor epidemice.

Taenia solium
Morfologie
Viermele adult are 2-3 m lungime şi o culoare alb- lăptoasă transparentă.
Scolexul este prevăzut cu 4 ventuze şi un rostru care prezintă o coroană dublă de
cârlige, care permit fixarea pe mucoasa intestinală (tenie armată).
Strobila este formată din 700-1000 de proglote, care au papila genitală dispusă pe
părţile laterale ale proglotelor după o alternanţă regulată.
Uterul este bine dezvoltat, prezintă 7-10 ramificaţii închise în deget de mănuşă şi este
plin cu ouă.
Ouăle sunt embrionate şi conţin embrionul hexacant. Forma larvară se numeşte
Cysticercus cellulose.
Ciclul biologic
Gazda definitivă este omul, parazitat la nivel intestinal, cu viermele adult.
Proglotele bătrâne se detaşează din strobila viermelui şi se elimină cu materiile
fecale.
Gazda intermediară este porcul, care ingeră proglote întregi.
În tubul digestiv al animalului, sunt puşi în libertate numeroşi embrioni hexacanţi,
care străbat peretele intestinal şi prin circulaţia sangvină ajung la nivelul musculaturii şi
ţesutului subcutanat, unde prin veziculizare formează cisticercii. Cisticercoza porcină este
masivă (datorită ingestiei de proglote întregi).
Contaminarea umană se realizează prin consumul de carne de porc cu cisticerci. În
intestin se eliberează scolexul, iar ţesutul proliferativ al colului generează elementele
strobilei. În 2-3 luni se formează viermele adult.

100
Aspecte clinice.
Parazitozele evoluează cu o simptomatologie digestivă nespecifică, iar bolnavii sunt
deranjaţi de eliminarea periodică de fragmente de strobilă.
Pot însă să apară complicaţii, prin localizarea proglotelor în apendice
(apendicita) sau în căile biliare (angiocolita). Cea mai gravă complicaţie este însă
cisticercoza umană.
Diagnosticul teniozei se face la fel ca şi în cazul teniozei de carne de vită.

BOLI PRODUSE DE LARVE

CISTICERCOZA UMANĂ

Este o parazitoză produsă prin dezvoltarea în organismul uman a cisticercilor de

tenie.
Mecanismul de producere
Autoinfestaţia- se produce la persoanele parazitate cu viermi adulţi
a) endogenă- poate fi datorată abuzului de condimente sau băuturi alcoolice
Proglotele bătrâne desprinse din strobilă pot fi regurgitate în stomac. Sunt eliberate
mii de ouă, iar cisticercoza dezvoltată va fi masivă şi netratabilă.
b) exogenă- se produce pe cale fecal orală în condiţii de igienă defectuoasă (prin
mâini murdare se realizează un aport limitat de ouă în cavitatea bucală). Cisticercoza astfel
rezultată va fi moderată.
Infestaţia exogenă- se realizează prin ingestia unui număr mic de ouă, prezente pe legumele
nespălate. Cisticercoza rezultată va fi discretă.
Diagnostic
În fazele de debut hemograma relevă o hipereozinofilie cu valoare orientativă. Tot
valoare orientativă au şi alte examinări radiologice (cisticercoza musculară), oftalmoscopice
(cisticercoza oculară); diagnosticul de certitudine se bazează pe biopsia cisticercilor pentru
evidenţierea în preparate microscopice a structurii lor caracteristice.
Diagnosticul serologic (prin reacţia de fixare a complementului sau prin reacţia de
precipitare inelară) se foloseşte în fazele avansate ale bolii.
Diagnosticul biologic se face prin IDR cu antigen extras din cisticerc.

CHISTUL HIDATIC
Este o parazitoză datorată dezvoltării în organismul uman a formei larvare a unei
tenii de dimensiuni mici numită Echinococcus granulosus.
Morfologie
Viermele adult este format din scolex (cu 4 ventuze şi o coroană dublă de cârlige),
col şi strobilă formată din 3 proglote: tânără, matură şi bătrână (care conţine 400-800 de
ouă embrionate). Ouăle conţin embrioforul format din embrionul hexacant şi un înveliş
radiar gros. Forma larvară se numeşte hidatidă ( la om- chist hidatic) şi este o veziculă
polichistică şi policefalică.
Ciclul biologic. Viermii adulţi parazitează intestinul câinelui şi al altor canide sălbatice
(lup). Spargerea proglotei bătrâne conduce la eliberarea de ouă embrionate, care sunt emise
prin materiile fecale, contaminând blana animalului şi mediul ambiant. Gazda intermediară
este reprezentată, de obicei, de ovine. Accidental însă forma larvară se poate dezvolta şi în
organismul uman.

101
Contaminarea umană se realizează prin ingestia de ouă embrionate (în condiţii de igienă
deficitară). Ouăle ingerate, în tubul digestiv pierd învelişurile, se eliberează embrionii
hexacanţi, care străbat peretele intestinal, diseminează hematogen şi se localizează în ficat
(60%), plămâni (30%) sau alte organe (10%). La nivelul viscerelor, hidatida se dezvoltă
lent, induce formarea unei membrane reactive (membrană polichistică), împreună cu care
formează chistul hidatic. Ciclul biologic poate fi închis, atunci când gazda intermediară este
reprezentată prin animale ierbivore care devin pradă pentru canide.
Diagnostic:
Examenul radiologic oferă informaţii orientative evidenţiind prezenţa unei formaţiuni
pseudotumorale. Examenul parazitologic se poate face numai după excizia chirurgicală,
fiind interzisă puncţia chistului. Macroscopic, aspectul este caracteristic, iar microscopic (în
preparat nativ) se pun în evidenţă scolecşi liberi sau grupaţi în vezicule prolegere.
Diagnosticul serologic este foarte important (asigură diagnosticul în 90% din
cazuri). Pot fi practicate reacţii cu antigen solubil: reacţie de fixare a complementului,
reacţie de latex aglutinare, reacţie de hemaglutinare pasivă sau imunelectroforeză. Singura
reacţie cu antigen întreg este reacţia de imunoflurescenţă indirectă. Intradermoreacţia
Cassoni se foloseşte pentru diagnosticul biologic.

NOTE PERSONALE

102
LUCRAREA NUMĂRUL 13. VIRUSOLOGIE

Diagnosticul de laborator în infecţiile virale se bazează pe :

● examinarea microscopică a produselor patologice şi a ţesuturilor
infectate, pentru punerea în evidenţă a unor modificări caracteristice
virusurilor
● cultivarea şi identificarea agenţilor virali
● demonstrarea unei creşteri semnificative a titrului anticorpilor specifici,
prin compararea serului de fază acută şi a serului de convalescent.
Virusurile sunt caracterizate printr-un parazitism absolut. Pentru a se putea multiplica,
ele trebuie să infecteze celulele vii. Datorită acestui fapt sunt cultivabile numai prin inoculare
în sistemele celulare: a) animale de experienţă; b) ouă embrionate; c) culturi de celule.
Pentru diagnosticul direct virusologic, se recoltează, în general, aceleaşi probe
patologice ca şi pentru diagnosticul direct bacteriologic, însă este indicată utilizarea de
stabilizatori virali, iar recoltarea (care se face în primele 4-5 zile de la debutul
simptomatologiei clinice) se face în soluţia Hanks.

CULTIVAREA VIRUSURILOR

INOCULAREA LA ANIMALE DE EXPERIENŢĂ

Această metodă nu se mai foloseşte astăzi în scop diagnostic; inocularea la animale se

practică numai în scopuri de cercetare.
Pentru inoculări se utilizau animale mici: şoareci, hamsteri, cobai, iepuri.
Există diferenţe semnificative de sensibilitate faţă de acelaşi virus, nu numai în
funcţie de specie, dar şi după rasa şi vârsta animalului.
Căile de inoculare utilizate sunt: subcutanată, intravenoasă, intranazală,
intraperitoneală, scarificare cutanată sau corneeană, inoculare intracerebrală. Unele căi
reproduc modalitatea de pătrundere a virusului în organismul uman, altele (ex:
intracerebrală) pot fi considerate artificiale.
În organismul animalului inoculat, virusul replicat este prezent în sânge şi ţesuturi şi
animalul prezintă semne de boală. În lipsa acestor semne, pot fi executate “ pasaje oarbe”
(sânge, triturat de ţesuturi de la animalul inoculat, vor fi inoculate la un alt animal, sau în
alte sisteme celulare), care să asigure replicarea virusului până la un titru care să determine
apariţia unor leziuni evidente.

Criterii care demonstrează replicarea virală:

- prezenţa de leziuni macroscopice şi/ sau microscopice la nivelul ţesuturilor.
- reproductibilitatea leziunilor prin inocularea de sânge sau triturat de ţesuturi la alte
animale.
După ce s-a demonstrat replicarea virală, sângele şi trituratul de ţesuturi vor fi
utilizate drept antigene virale în reacţiile de identificare.
Exemple de inoculări:

103
 - virusurile Coxsackie pot fi izolate prin inoculare subcutanată la şoarecele sugar (cu
acelaşi produs patologic se inoculează toţi şoarecii dintr-un cuib). Şoarecii inoculaţi cu
virusul Coxsackie A dezvoltă o paralizie flască, iar microscopic se evidenţiază leziuni de
miozită generalizată, iar cei inoculaţi cu Coxsackie B dezvoltă o paralizie spastică,
microscopic fiind prezente leziuni de miozită localizată şi alte leziuni degenerative în SNC
şi viscere.
- virusurile gripale se izolau prin instilare intranazală la şoarecele adult. Animalul dezvoltă
o pneumonie interstiţială caracteristică.
- virusurile herpetice se izolau prin scarificare corneană la iepure. Animalul va dezvolta o
keratoconjunctivită.
- virusul rabic se izolează prin inoculare intracerebrală la şoarece. Animalul dezvoltă o
encefalită rabică, iar în preparatele microscopice (secţiuni prin substanţa nervoasă- colorate
cu hematoxilină- eozină se pun în evidenţă corpusculii Babeş- Negri (incluziuni acidofile în
neuroplasmă).

INOCULAREA ÎN OUL EMBRIONAT

Acest tip de inoculare a fost abandonat în ce priveşte diagnosticul de rutină, dar

metoda se practică încă, pentru replicarea virusurilor gripale în vederea preparării
vaccinurilor.
Metoda era folosită pentru:
● izolarea virusurilor gripale- inocularea în cavitatea alantoidiană sau amniotică.
● izolarea virusului urlian- inocularea în cavitatea amniotică sau în sacul vitelin.
● izolarea herpesvirusurilor- inocularea pe membrana corioalantoidiană.
Pentru inoculări sunt utilizate ouă fecundate şi care au cochilia albă. Acestea se spală,
degresează şi dezinfectează după care se usucă şi se incubează la 38°C în atmosferă cu
umiditate 60%.
După patru zile de incubare sunt examinate la ovoscop prin transiluminare,
verificându-se viabilitatea embrionului (pot fi inoculate numai ouă cu embrion viabil).
Pentru inoculare, oul se plasează pe ovoscop cu embrionul la partea superioară, se
aseptizează cochilia şi în dreptul camerei cu aer se practică, în cochilie, un orificiu care va
servi pentru introducerea acului unei seringi în care s-a aspirat produsul patologic. Orientarea

104
acului se va face în poziţie specifică pentru fiecare tip de inoculare. Volumul de produs
patologic inoculat va fi de 0,2 ml şi obligatoriu se inoculează 2-3 ouă cu acelaşi produs
patologic.
Pentru inocularea pe membrana corioalantoidiană este necesară obţinerea unei false
camere cu aer prin practicarea unui orificiu suplimentar pe una dintre părţile laterale ale
oului. Se aplică pe orificiul practicat în dreptul camerei cu aer o pară de cauciuc, se aspiră,
conţinutul oului se deplasează şi prin orificiul lateral pătrunde aer. Falsa cameră cu aer
conduce la îndepărtarea membranei corioalantoidiene de membrana proprie.
Cu pipeta se depun cca 0,2 ml de produs patologic direct pe membrana corioalantoidiană.
Orificiile din cochilie se închid şi ouăle sunt incubate un timp şi la o temperatură care să
permită replicarea virusului (presupus prezent în produsul patologic).
Criterii care demonstrează replicarea virală:
- imobilitatea embrionului, semn al morţii sale (se evidenţiază prin transluminare la
ovoscop).
- prezenţa la nivelul membranelor de hemoragii, îngroşări, opacifieri sau a unor noduli
pe membrana corioalantoidiană (se evidenţiază prin examinarea cu lupa a membranelor,
după ce s-au prelevat lichidele embrionare, iar oul a fost deschis şi conţinutul deversat
într-un recipient steril).
- dobândirea de către lichidele embrionare a unor proprietăţi caracteristice virusului
replicat, cum ar fi de exemplu capacitatea hemaglutinantă.
După demonstrarea replicării virale, lichidele embrionare vor fi utilizate drept
antigene virale în reacţiile de identificare.

Noduli pe membrana corioalantoidiană în oul embrionat după inoculare cu virusul variolic (A) şi cu virusul
vaccinal (B). Mici noduli secundari sunt vizibili pentru virusul vaccinal (după Courtesy I.J., Downie A.W.,
1971).

INOCULAREA ÎN CULTURI DE CELULE

Probele patologice pot fi inoculate pe:

a) culturi de celule diploide (primare sau secundare );
b) linii celulare stabilizate.
Culturi celulare primare: ţesutul de origine este dezintegrat cu o enzimă proteolitică
(ex: tripsina), iar celulele sunt reluate într-un mediu de creştere introdus într-un recipient
steril (au forme diferite şi pot fi confecţionaţi din sticlă neutră sau plastic). Celulele

105
sedimentează şi aderă de peretele recipientului care este acoperit de mediul de creştere. Se
multiplică prin diviziune binară până la formarea unui monostrat confluent. În acest stadiu
diviziunile celulare încetează datorită inhibiţiei de contact. Culturile primare pot fi utilizate
pentru inocularea produselor patologice sau în vederea multiplicării celulelor (nu toate
celulele se pretează însă la pasaje).
Culturi celulare secundare: cultura primară este desprinsă de pe peretele
recipientului prin tripsinizare blândă (după ce mediul de creştere a fost îndepărtat). Celulele
desprinse sunt reluate într-un mediu proaspăt unde sedimentează, aderă şi se multiplică până
la formarea monostratului confluent. După un număr variabil de pasaje, rata de creştere scade
şi celulele mor.
Linii celulare stabilizate: pentru acele celule care se pretează la multiple pasaje, la
al 60-70-lea pasaj se constituie arii de celule transformate, cu aberaţii morfologice şi
funcţionale care au pierdut inhibiţia de contact şi cresc anarhic. Astfel de celule pot fi pasate
practic la nesfârşit dacă sunt asigurate condiţiile necesare. Transformarea celulară, în afara
apariţiei spontane, poate fi şi indusă, prin virusuri oncogene sau prin substanţe chimice
mutagen-cancerigene.
Exemple de linii stabilizate:
- de provenienţă umană:
- Hela- din carcinom de col uterin;
- KB- din carcinom laringian;
- Hep-2- din carcinom hepatic;
- RD – din rabdomiosarcom;
- L132- din plămân embrionar.
- provenite de la animale:
- Vero- din rinichi de maimuţă;
- BHK-21- din rinichi de hamster;
- PK- din rinichi de porc;
- Ma 188- din testicul de cal;
- RK – din rinichi de iepure.
Culturile celulare sunt examinate pentru: activitatea metabolică (evidenţiabilă
macroscopic prin acidifierea mediului cu virajul spre galben al indicatorului roşu fenol);
monostratul celular confluent se evidenţiază prin examinarea la microscopul reversat.
Acelaşi produs patologic (sau suspensie virală) se inoculează pe minimum două
tuburi cu culturi de celule. Din recipient se îndepărtează mediul de creştere. Se inoculează
produsul patologic sau suspensia virală în volum de 0,2 ml/ tub. Se lasă o oră la temperatura
laboratorului (20-22ºC), pentru ca virusul să se adsoarbă pe receptorii celulari, apoi se
introduce mediul de întreţinere. Se incubează la 37°C. Mai frecvent incubarea se face
staţionar. Pentru unele virusuri este însă necesară incubarea cu rotaţie.
La intervale de timp culturile sunt examinate pentru punerea în evidenţă a
modificărilor care să ateste replicarea virală.
Criteriile care demonstrează replicarea virală sunt:
● Inhibiţia metabolismului celular:
- se pune în evidenţă prin examinarea macroscopică a culturilor
(indicatorul colorimetric virează spre violet- datorită
acumulării de compuşi alcalini rezultaţi din distrugerea
celulelor).

106
● Efectul citopatogen (ECP):
- poate fi de tip degenerativ (citocid) ca şi în cazul virusurilor
poliomielitice; celulele se rotunjesc, se micşorează, nucleul
devine picnotic distrucţia celulelor fiind totală în 24-72 de ore.
- unele virusuri produc ECP în focar (apar focare de celule
rotunjite care se desprind treptat de pe peretele recipientului).
Ex: adenovirusuri.
- există şi virusuri care produc ECP de tip sinciţial (celulele
fuzionează şi apar mase celulare multinucleate care se desprind
treptat de pe peretele recipientului). Ex: VRS.
● Hemadsorbţia:
- reprezintă capacitatea celulelor infectate cu unele virusuri de a
fixa pe suprafaţa lor hematii, urmare a unor modificări
specifice la nivelul membranelor celulare determinate de
prezenţa virusului replicat (se evidenţiază la microscop).
● Interferenţa virală:
- este o metodă indirectă care permite decelarea replicării unui
virus necitopatogen. Se procedează la suprainfectarea celulelor
cu un virus citopatogen cunoscut (virus indicator). Prezenţa în
celule a virusului necitopatogen împiedică suprainfecţia
celulelor cu virusul indicator.
● Incluziile celulare:
- celulele infectate viral sunt colorate şi examinate la microscop.
Se pot pune astfel în evidenţă incluzii fie intranucleare, fie
intracitoplasmatice, fie la ambele nivele.
- incluziile intranucleare sunt prezente în celulele infectate cu
adenovirusuri, Herpetoviridae, Papovaviridae.
- incluziile intracitoplasmatice sunt provocate de
Paramyxoviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae, Poxviridae.
- incluziile intranucleare şi intracitoplasmatice se dezvolta în
timpul multiplicării v. rujeolei, v. citomegalic.

HEp-2 monostrat celular confluent K.B monostrat celular confluent

107
 P.E.U-celule de plămân emrionar uman E.E.U-celule de embrion uman total
După Anderca I. et Ianconescu M., - 1962

HEp-2 infectat cu Herpesvirus simplex HEp-2 infectat cu Herpesvirus simplex

ECP în focar, incluzii intranucleare ECP de tip sinciţial

HEp-2 infectat cu VRS Celule diploide din rinichi uman infectate cu virus
ECP de tip sinciţial rujeolic, incluzii intranucleare şi intracitoplasmatice

108
 După Courtesy I.J. en Medical Virology (Fenner F., White D.O.) - 1971

REACŢII ANTIGEN-ANTICORP UTILIZATE ÎN VIRUSOLOGIE

În infecţiile virale aceleaşi reacţii antigen-anticorp pot fi folosite pentru:

- identificarea virusurilor cu ajutorul unor seruri antivirale standard – diagnostic
virusologic.
- evidenţierea anticorpilor din serul de cercetat cu ajutorul antigenelor virale cunoscute
- diagnostic serologic.
În reacţiile cantitative, diagnosticul serologic se stabileşte pe baza creşterii dinamice
(de cel puţin patru ori) a titrului anticorpilor, comparându-se titrul serului de convalescent cu
cel al serului de fază acută. Serul de fază acută se recoltează în primele 4-5 zile de la debutul
simptomatologiei clinice, atunci când se recoltează şi probele patologice pentru diagnosticul
direct, iar “serul de convalescent” după 10-14 zile de la prima recoltare.
● Reacţia de hemaglutino-inhibare (RHI) este utilizată pentru evidenţierea virusurilor
hemaglutinante (gripale, paragripale, rubeolic, rujeolic, urlian, coronavirusuri, adenovirusuri
etc).
● Reacţia de fixare a complementului (RFC) este utilizată în infecţii cu
adenovirusuri, enterovirusuri, herpesvirusuri, virusuri paragripale etc. În virusologie este
utilizată tehnica Bradstreat- Taylor (în plăci cu godeuri).
● Reacţia de seroneutralizare (RSN) poate fi folosită pentru diagnostic în infecţiile cu
enterovirusuri, paramyxovirusuri, adenovirusuri, herpesvirusuri.
● Reacţia de inhibare a hemadsorbţiei se utilizează pentru virusurile care au
capacitatea de a produce fenomenul de hemadsorbţie (virusurile gripale).
● Teste de imunodifuzie (nu se mai folosesc actualmente):
a) difuzia radială;
b) hemoliza radială
c) contraimunelectroforeza
● Reacţii antigen- anticorp cu reactanţi marcaţi:
a) imunofluorescenţa
b) radioimunoadsorbţia
c) teste imunoenzimatice
 Imunoelectrotransfer (western-blot).
● Imunoelectronomicroscopia: ex: infecţii cu rotavirusuri sau cu virusul hepatitei A
(HAV) etc.

Reacţia de hemaglutino-inhibare
Se poate folosi ca şi celelalte reacţii şi în diagnosticul direct şi în diagnosticul
serologic.
Pentru diagnosticul direct se începe cu titrarea antigenului printr-o reacţie de
hemaglutinare, iar în reacţia de hemaglutino-inhibare se va folosi antigenul la valoarea de 4
UHA (unităţi hemaglutinante).

109
 Reacţia de hemaglutinare (titrarea antigenului)
Godeu nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ser 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
fiziologic
(ml)
Antigen 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
viral (ml)
Suspensie 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
hematii
(ml)
Diluţii ½ ¼ 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024
obţinute

Reacţia de hemaglutino-inhibare se lucrează conform schemei:

Godeu nr. 1 2 3 4 5 6 7 8
Ser fiziologic 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
(ml)
Ser antiviral 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
(ml)
Se fac diluţii
binare în ser
fiziologic
Antigen viral 4 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
UHA ( ml)
Se incubează 60 de minute la 22 º C
Suspensie de 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
hematii 0,5 %
( ml)
Se incubează 60 de minute la 22 C. Se citeşte reacţia

Citirea reacţiei urmăreşte să stabilească care dintre serurile antivirale are capacitatea de a
inhiba fenomenul de hemaglutinare care este caracteristic virusului izolat, indicând astfel
diagnosticul.

110
Exemplu (identificarea virusurilor gripale):

RHA ½ ¼ 1/8 1/16 1 /32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024

RHI

Ser standard anti AH1N1

Se
r standard anti AH2N2
Se
r standard anti AH3N2

= absenţa hemaglutinării (la titrarea prin reacţia de hemaglutinare), respectiv inhibarea

hemaglutinării (în reacţia de hemaglutino-inhibare).

= hemaglutinare.

Diagnosticul serologic
Se lucrează pe probe perechi de seruri şi urmăreşte creşterea în dinamică a titrului de
anticorpi, de cel puţin 4 ori în proba a doua faţă de prima probă.

Reacţia de seroneutralizare (RSN)

Este o reacţie sensibilă şi specifică utilă în diagnosticul infecţiilor virale.
În RSN anticorpii se fixează pe virionii corespunzători şi neutralizează capacitatea lor
infectantă pentru celula gazdă.
Diluţiile de ser antiviral (standard în diagnosticul direct, de cercetat în diagnosticul
serologic) se pun în contact cu cantităţi egale de virus (de identificat în diagnosticul direct,
standard în diagnosticul serologic), pentru 30-60 minute la temperatura laboratorului (20-
22ºC) după care amestecul se inoculează într-un sistem celular susceptibil, urmărind
infectivitatea virală pentru acesta. În culturile de celule reacţia de seroneutralizare este
pozitivă când efectul citopatogen nu apare. În prezenţa efectului citopatogen caracteristici
virusului inoculat RSN se interpretează ca şi negativă.

Reacţia de inhibare a hemadsorbţiei

Este importantă pentru identificarea virusurilor care nu produc un ECP evident
(exemplu: virusurile gripale).
Prin hemadsorbţie se înţelege capacitatea unor virusuri de a induce modificări ale
suprafeţelor celulelor infectate care să antreneze după sine posibilitatea ca aceste celule să
fixeze pe suprafaţa lor eritrocite.
În reacţia de inhibare a hemadsorbţiei se urmăreşte neutralizarea prin anticorpi
specifici a capacităţii hemadsorbante produsă de virusul replicat (omologia reactanţilor
antigen-anticorp = diagnostic pozitiv, se traduce prin lipsa de instalare a fenomenului de
hemadsorbţie caracteristic virusului).

111
Imunoelectronotransfer (western-blot)
Proteinele virale sunt separate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă. Acestea
sunt ulterior transferate şi fixate pe un suport de nitroceluloză. Banda cu proteinele virale este
incubată cu serul de cercetat. Fixarea anticorpilor se evidenţiază cu ajutorul imunglobulinelor
(anti Ig umană) marcate enzimatic. Se adaugă substratul pentru enzimă şi se citeşte reacţia de
culoare.

DETECTAREA GENOMULUI VIRAL

1. Electroforeza în gel de poliacrilamidă, a ARN-ului (RNA-PAGE),

2. Hibridizarea genomică,
3. Amplificarea enzimatică a genomului.

Electroforeza în gel de poliacrilamidă a ARN , este o tehnică utilă pentru depistarea directă a
rotavirusurilor şi este realizabilă numai în condiţiile unei excreţii masive în materiile fecale
precum şi a structurii duble catenare a ARN-ului genomic.

Hibridizarea genomică
Această metodă se bazează pe capacitatea ARN sau ADN viral de a se lega în mod
specific (hibridizare) de catene complementare de ADN (sonde nucleotidice), generate
artificial sau pornind de la genomul viral clonat. Legarea poate fi detectată cu ajutorul
marcajului radioactiv sau enzimatic al sondei. Marcajul radioactiv este evidenţiat pe un film
sensibil la razele X în general prin «dot blot». Această modalitate de detecţie este deosebit de
sensibilă, însă necesită un timp de expunere lung şi condiţii de lucru (radioactivitate).
Utilizarea enzimelor, cum ar fi peroxidaza sau fosfataza alcalină, permite detectarea prin
reacţii de tip ELISA. Este în egală măsură posibil să se facă hibridizarea in situ a cupelor
histologice pentru depistarea infecţiei.
DOT BLOT = tehnică pentru detectarea, analizarea şi identificarea proteinelor similară cu
western-blot, dar diferită prin faptul că proba de proteină nu este separată electroforetic, ci
depusă punctiform pe un suport membranar sau pe hârtie.Concentraţia proteinelor poate fi
estimată semicantitativ, cu ajutorul anticorpilor specifici.

Amplificarea enzimatică a genomului

Au fost propuse mai multe metode, însă cel mai frecvent se foloseşte reacţia în lanţ a
polimerazei (PCR=polymerase chain reaction). Această metodă constă în separarea la cald a
celor două catene de ADN, ce conţin regiunea pentru amplificat. Eşantionul este apoi
amestecat cu amorse (în jur de 20 de nucleotide), complementare secvenţelor nucleotidice,
care flanchează regiunea pentru amplificat. Aceste amorse sunt alese în aşa fel încât să fie
situate la extremităţile unei secvenţe de 50-1000 baze. După răcirea ADN-ului, amorsele în
exces se fixează cu secvenţa complementară pe ADN-ul ţintă, iar apoi nucleotidele sunt
incorporate secvenţial de o ADN-polimerază termostabilă (Taq-polimeraza); se produc astfel,
două copii de ADN ţintă.

112
 Amestecul este din nou încălzit pentru separarea ADN-ului dublu catenar, după care
se răceşte pentru a permite fixarea amorselor şi incorporarea de nucleotide. Taq-polimeraza
(Thermus aquaticus) este utilizată datorită faptului că ea nu se denaturează prin încălziri şi
răciri repetate. După 30 până la 80 de cicluri efectuate în mod automat, ADN-ul amplificat
poate fi detectat prin electroforeză în gel de agaroză. Este foarte important de verificat ca
fragmentul amplificat să corespundă perfect secvenţei ţintă, fie cu ajutorul unei endonucleaze
de restricţie, fie prin hibridizare cu ajutorul unei sonde ADN. Metoda poate fi modificată
pentru detectarea virusurilor cu ARN, prin adăugarea unei etape de transcripţie inversă,
înainte de a începe PCR. Din punct de vedere teoretic, se poate detecta o singură copie a
genomului viral. În practică, însă, cantităţile necesare sunt mult mai mari. Eşantionul poate
de asemenea să conţină inhibitori din reacţie, ce vor determina rezultate fals negative.
Metoda este deosebit de sensibilă, iar reacţiile fals pozitive survin în urma contaminării
eşantionului printr-o ţintă exogenă. Din acest motiv, este indicat să se folosească locaţii
distincte pentru prepararea eşantioanelor, amplificare şi detectarea produselor amplificate.
Sensibilitatea şi specificitatea PCR poate fi ameliorată cu ajutorul unei a doua amplificări,
folosind amorse interne pentru primul fragment.

Titrarea antigenului prin RHA şi identificare prin RHI cu seruri antivirale standard.

113
Microscop reversat (folosit la examinarea monostratului celular)

Hemadsorbţia eritrocitelor de pui pe celule infectate cu virus gripal.

Incluzii intracitoplasmatice acidofile = corpusculii Babeş-Negri caracteristici în infecţia rabică.

114
După Hart T. şi Shears P., Médecine-Sciences/Flammarion, 1997.

ORTHOMYXOVIRIDAE

Familia Orthomyxoviridae, include virusurile gripale (Myxovirus influentzae) tip A,

B şi C.
Sunt virusuri cu ARN monocatenar, simetrie helicoidală, învelite. Virionul este
sferic. Genomul viral este format din 8 segmente de ARN, fiecare dintre ele constituind o
genă care codifică sinteza unei alte proteine. Sunt codificate 3 polimeraze (P1= ARN
polimeraza ARN dependentă care este implicată în replicarea genomului viral; P2 şi P3 cu
participare la organizarea şi asamblarea nucleoproteinei), nucleoproteina, proteina
matricei, proteina nestructurală, hemaglutinina şi neuraminidaza.
Ansamblul ARN- proteine formează complexul ribonucleoproteinic. Moleculele de
ribonucleoproteină sunt dublu spiralate, iar extremităţile rămân monocatenare. Acest
complex este acoperit de către proteina matricei peste care este dispus învelişul viral
Pe suprafaţă proemină două tipuri de spiculi: hemaglutinina şi neuraminidaza.
Virusurile gripale au atât antigene interne reprezentate de ribonucleoproteina, ARN-
polimeraza şi proteina matricei cât şi antigenele externe reprezentate de hemaglutinină şi
neuraminidază. Hemaglutinina intervine în adsorbţia virionilor pe receptorii celulei gazdă,
precum şi în procesul de înmugurire a membranei celulare în perioada de maturare a
virionului iar neuraminidaza participă atât la declanşarea infecţiei, cât şi la eliberarea din
celulă a virionului matur. Hemaglutinina intervine şi în producerea reacţiei de
hemaglutinare.
La antigenele externe se descriu două tipuri de variaţii:
a) minore: care constau în modificări mici în structura lor; se produc prin
mutaţie şi caracterizează mutantele epidemice.
b) majore: constau în modificări bruşte şi extinse în structura acestor
antigene; se produc prin recombinare genetică între virusuri care se
replică concomitent şi caracterizează mutantele pandemice.
Din punct de vedere clinic, infecţia gripală evoluează ca şi o pneumonie interstiţială
şi poate fi urmată de complicaţii (fie suprainfecţii bacteriene, fie complicaţii de altă natură;
ex: miocardita). Profilaxia se face prin vaccinare.
Diagnosticul virusologic
Recoltarea produsului patologic:
 exudat faringian şi nazal,
 lichid de spălătură rinofaringiană.
Examenul microscopic direct: folosind tehnica imunofluorescenţei pot fi detectate
antigenele virale în celulele epiteliale.
Cultivarea: produsul patologic se inoculează în cavitatea amniotică sau alantoidiană
a oului embrionat de 9-11 zile (metodă veche) sau se foloseşte inocularea în culturi de
celule.
Evidenţierea virusului se bazează pe capacitatea acestuia de a aglutina hematii de
cocoş, proprietate ce se evidenţiază prin reacţia de hemaglutinare conform schemei de mai
jos.
Pentru identificarea virusurilor se foloseşte reacţia de hemaglutinoinhibare (dacă s-
a izolat în oul embrionat) dar poate fi folosită şi reacţia de inhibare a hemadsorbţiei (dacă s-
a izolat în culturi celulare).

115
PARAMYXOVIRIDAE

Cuprinde virusuri cu ARN, simetrie helicoidală, înveliş lipidic bistratificat, care

prezintă proprietăţi de mixofilie şi capacitate hemaglutinantă, precum şi proprietăţi
hemolitice.
Familia include genurile:
● Paramyxovirus cu virusurile paragripale (4 tipuri antigenice) şi virusul urlian
(Paramyxovirus parothidis).
● Morbillivirus cu virusul rujeolic.
● Pneumovirus cu virusul respirator sinciţial (VRS).
Virusurile paragripale, produc la copiii mici bronşite, bronşiolite şi pneumonii (tipul
3), precum şi laringotraheite sufocante (tipul 2). La copiii mari şi la adulţi infecţia evoluează
frecvent ca şi o rinofaringită.
Virusul urlian este agentul etiologic al parotiditei epidemice caracterizată prin
tumefierea uni sau bilaterală a glandei /glandelor parotide. Virusul manifestă un tropism
deosebit şi pentru alte ţesuturi glandulare. Profilaxia se face prin vaccinare.
Virusul rujeolic este agentul etiologic al rujeolei, boală infecto-contagioasă a
copilăriei care evoluează cu erupţie tegumentară maculo-papuloasă asociată cu
simptomatologie respiratorie. Profilaxia se realizează prin vaccinare.
Virusul respirator sinciţial prezintă importanţă numai pentru patologia infecţioasă a
copilului mic la care produce bronşiolite şi bronhopneumonii grave, în special în primele 6
luni de viaţă. La adult şi la copilul mare infecţia evoluează ca o “banală” rinofaringită.
Paramyxoviridaele sunt cultivabile pe culturi de celule unde produc efect citopatogen
de tip sinciţial, iniţial discret dar care se accentuează prin pasaje repetate.

RHABDOVIRIDAE

Pentru patologia umană este important virusul rabic. Este un virus cu ARN
monocatenar liniar (nesegmentat), simetrie helicoidală, învelit.
Virusul rabic infectează atât animalele sălbatice cât şi domestice: transmiterea se
face prin muşcătură, virusul fiind prezent în saliva animalului bolnav.
Infecţia se poate transmite şi la om, tot prin muşcătură.
Incubaţia medie este de 30-40 de zile, după care se instalează hiperestezie şi prurit în
zona plăgii şi apar modificările de comportament şi anxietatea.
În perioada de stare, evoluează ca o encefalită rabică cu halucinaţii, agitaţie, spasme
dureroase ale musculaturii faringelui care determină hidrofobie. Paraliziile şi starea
comatoasă preced exitusul.
Rabia, odată instalată, nu se poate trata. Prevenirea rabiei se face prin
administrarea de ser antirabic asociat cu vaccin antirabic (obligatoriu în prezenţa unor
plăgi muşcate).

Diagnosticul de laborator
La om se face numai la necropsie.

116
 În cazul animalelor suspecte de rabie acestea sunt ţinute sub observaţie, prelevându-
se probe de salivă din care pot fi decelate antigenele virusului rabic prin metoda
imunofluorescenţei.
Dacă animalul prezintă semne de boală este sacrificat şi se practică secţiuni prin
substanţa nervoasă colorate cu hematoxilină eozină. În astfel de preparate microscopice pot
fi puse în evidenţă în neuroplasmă incluzii acidofile. Acestea sunt corpusculii Babeş- Negri şi
sunt patognomonici pentru rabie.
Virusul rabic este cultivabil prin inoculare intracerebrală la şoarecele sugar, precum
şi prin inoculare pe culturi de celule diploide umane.

PICORNAVIRIDAE

Familia cuprinde virusuri cu ARN monocatenar liniar, simetrie cubică, neînvelite.

Capsida este un icosaedru cu 60 de capsomere, iar diametrul virionului este foarte mic (22-
30 nanometri)
Genul Enterovirus cuprinde: virusurile poliomielitice (tip 1, 2, 3),virusurile
Coxsackie A (23 de tipuri), Coxsackie B (6 tipuri), virusurile ECHO (32 de tipuri) precum şi
virusurile enterice umane 68- 71.
Aceste virusuri manifestă afinitate pentru tractul digestiv şi formaţiunile limfatice
ataşate tubului digestiv (amigdale, ganglioni mezenterici, plăci Payer) nivele la care se
multiplică, după care prin viremie ating structurile ţintă.
Virusurile poliomielitice manifestă tropism pentru SNC, iar afectarea meningeală
poate să apară în toate infecţiile cu enterovirusuri (meningite aseptice).
Infecţia poliomielitică
Perioada de incubaţie are o durată de 7- 14 zile, după care poate evolua: - infecţie
subclinică; - boală minoră (cu febră, cefalee, mialgii, tulburări digestive); - boală paralitică
(apare numai la 1% din cei care fac infecţia poliomielitică) şi se caracterizează prin
instalarea unei paralizii (flască) ce interesează un singur grup muscular. Paralizia este
datorată localizării virusului la neuronii motorii din coarnele medulare anterioare, sau din
cortexul motor cerebral.
Imunitatea în poliomielită este specifică de tip.
Profilaxia se face prin vaccinare (vaccin cu virus viu atenuat tip Sabin).
Infecţia cu virusurile Coxsackie
Coxsackie A poate produce:
● herpangina, caracterizată prin hiperemia faringelui fond pe care apar vezicule de
aspect cenuşiu,
● boala mână-picior-gură, caracterizată prin leziuni ulcerative la nivelul faringelui
şi care asociază o erupţie veziculară palmo-plantară.
Coxsackie B poate produce:
● pleurodinia (mialgia epidemică), cu febră, cefalee şi dureri musculare
generalizate, dar mai intense la nivelul toracelui,
● encefalomiocardita nou-născutului.
Infecţia cu virusurile ECHO, evoluează ca şi meningită cu lichid clar (aseptică).
Genul Heparnavirus- cuprinde virusul hepatitei A (HAV).
Genul Rhinovirus are peste 150 de tipuri antigenice. Sunt agenţi etiologici majori ai
guturaiului, boală ce evoluează cu secreţie oculo-nazală abundentă, tuse, strănut şi cefalee.

117
Diagnosticul de laborator în infecţiile cu enterovirusuri

Toate Enterovirusurile pot fi izolate în culturi de celule în care induc un ECP de tip
degenerativ, iar identificarea şi diagnosticul serologic se bazează pe utilizarea reacţiei de
seroneutralizare (RSN).

Diagnosticul de laborator în poliomielită.

Diagnosticul virusologic
Produsul patologic (materiile fecale) este inoculat în culturi de celule (se pot utiliza
celule diploide din rinichi uman, amnios uman sau rinichi de iepure, precum şi linia
stabilizată Hela). Virusurile poliomielitice induc un ECP de tip degenerativ, cu rotunjirea şi
micşorarea celulelor, nucleu picnotic, iar liza celulară este totală în 24- 72 de ore.
Identificare se bazează pe practicarea reacţiei de seroneutralizare în culturi de
celule.
Pentru RSN, diluţiile de ser sunt puse în contact cu volume egale de antigene virale,
se lasă 30-60 de minute la temperatura laboratorului (22°C) după care se inoculează pe
sistemul celular (la culturile celulare se folosesc volume de 0,2 ml/ tub). Se utilizează şi
culturi de celule neinoculate martor.
La intervale de timp culturile de celule inoculate sunt examinate.
Rezultatele: ●RSN pozitivă- în sistemul celular (culturile de celule) în care a
existat omologie între anticorpii din ser şi antigenele virale, nu mai apar modificările
caracteristice virusului inoculat.
●RSN negativă- în sistemul celular (culturile de celule) în care
virusul nu a fost neutralizat prin anticorpi specifici, acesta produce modificările
caracteristice.

HERPETOVIRIDAE

Herpetoviridaele sunt virusuri cu AND dublu catenar, simetrie cubică, învelite,

virionul are o formă sferică şi diametrul de 130- 250 nanometri, iar capsida este un
icosaedru cu 162 de capsomere.
Se clasifică în subfamiliile :

1. Alfaherpesvirinae cu genurile:
 Simplex virus:
o virusurile herpes simplex tipul 1- oral
tipul 2- genital.
 Varicella virus:
o Virusul varicelă-zona zoster – 1 tip antigenic.
2. Betaherpesvirinae cu genurile:
 Citomegalovirus -virusul citomegalic- 1 tip antigenic
 Roseolovirus – virusul herpetic uman 6
- virusul herpetic uman 7
3. Gammaherpesvirinae cu genurile:
 Lymphocryptovirus - virusul Epstein-Barr- 1 tip antigenic

118
  Rhadinovirus – virusul herpetic uman 8.

Infecţii produse:

Virusul Herpes simplex:

Primoinfecţia, de obicei, este inaparentă clinic şi este urmată de cantonarea virusului
la nivelul ganglionilor rahidieni corespunzători ariei cutaneo-mucoase interesate. Recidivele
se traduc prin apariţia unui buchet de vezicule pe un fond eritematos, cu localizare repetata
în acelaşi teritoriu cutanat sau mucos. Factorii declanşatori ai recidivelor pot fi : a) termici (
frig sau căldură excesivă); b) hormonali; c) reacţii de hipersensibilitate; d) radiaţii
ultraviolete; e) boli febrile.
- Gingivo- stomatita (cu tipul 1)- apare la copii între 6 luni şi 6 ani şi se
caracterizează prin apariţia de leziuni la nivelul mucoasei bucale ( mai rar amigdale sau
orofaringe)
- Herpesul labial (cu tipul 1)- erupţie microveziculară pe fond eritematos la
joncţiunea cutaneo- mucoasă.
-Keratoconjunctivita (cu tipul 1)- prinderea straturilor profunde ale corneei
prezentând risc de opacifiere şi cecitate în cazul recidivelor.
-Eczema herpeticum erupţia variceliformă Kapoşi)- tipul 1. Erupţia herpetică se
produce pe un tegument eczematos preexistent.
-Meningoencefalita (tipul 1) şi herpesul generalizat sunt forme deosebit de grave de
boală cu mortalitate ridicată.
-Herpesul genital (cu tipul 2)- erupţia microveziculară interesează mucoasa genitală.
O situaţie particulară o reprezintă primoinfecţia cu herpes simplex, fie de tip 1, fie tip
2 la femeia gravidă, mai ales în primele 3 luni de sarcină, când, urmare a trecerii
transplacentare a virusului, pot sa apară malformaţii congenitale.
În cazul recidivei cu herpes simplex tip 2 la gravida la termen, în timpul travaliului
din leziunile cervicale şi/sau vaginale virusul ajunge să infecteze fătul, iar rezultatul va fi
apariţia la nou-născut a unui herpes perinatal.
Virusul varicelă-zona zoster are un singur tip antigenic dar produce două manifestări
clinice distincte.
Varicela, apare la primo infecţie şi este o boală infecto-contagioasă a copilăriei cu
incidenţă maximă între 2 şi 6 ani. Sunt caracteristice leziunile eruptive (mai frecvent la
nivelul tegumentelor capului şi trunchiului) care se găsesc în stadii evolutive diferite însă în
acelaşi teritoriu tegumentar (macule, papule, vezicule, pustule şi cruste).
Zona- zoster apare la adulţi, consecinţă a reactivării virusului într-o gazdă parţial
imună. Se caracterizează prin apariţia aceloraşi leziuni, ca şi în varicelă, dar care
interesează traiectul unui nerv senzitiv (fie el intercostal sau ramura oftalmică a nervului
trigemen).
Virusul citomegalic are un singur tip antigenic. Infecţia produsă evoluează diferit la grupe
de vârstă diferite.
La copilul mare evoluează ca şi infecţie subclinică, la adult determină o pneumonie
interstiţială, în timp ce la nou-născut şi sugar- se instalează o boală gravă, citomegalia cu
incluzii, virusul fiind localizat în ficat, rinichi şi plămân.
Virusul Epstein-Barr, are un tip antigenic şi produce mononucleoza infecţioasă. Celula ţintă
este limfocitul B, iar boala clinic manifestă (febră, eritem faringian, limfadenopatie

119
cervicală, splenomegalie, hepatomegalie, icter, astenie) apare la jumătate dintre persoanele
care fac infecţia după vârsta de 8 ani.

Diagnosticul de laborator
Diagnosticul virusologic
Pentru virusul herpes simplex şi varicela-zona zoster, cultivarea se face pe celule
diploide (rinichi de iepure, rinichi de maimuţă, embrion uman) sau pe linii celulare
stabilizate (Hep 2, BHK-21- numai pentru herpes simplex şi Hela), pe care produc un ECP
fie în focar, fie de tip sinciţial, iar în preparatele microscopice se pot pune în evidenţă
incluzii intranucleare (eozinofile).
Virusul Epstein-Barr este cultivabil pe culturi de limfocite pe care le transformă
limfoblastic, iar Virusul Citomegalic se poate cultiva pe culturi de limfoblaste sau pe linia
stabilizată Ma-188 (produce ECP de tip herpes, dar sunt caracteristice incluziile duble şi
intranucleare şi intracitoplasmatice).
Pentru identificarea virusurilor se folosesc reacţii antigen-anticorp cum sunt RSN,
RFC sau RIF.
Diagnosticul serologic
Pentru toate herpetoviridaele se poate urmări creşterea semnificativă a titrului de
anticorpi prin RFC, RSN sau RHAP (reacţie de hemaglutinare pasivă) sau pot fi utilizate
tehnici imuno- enzimatice.

NOTE PERSONALE

LUCRAREA NUMARUL 14. MICROBIOLOGIA CAVITĂŢII ORALE

120
 Cavitatea orală conţine numeroase microorganisme: bacterii (care sunt
predominante), levuri, protozoare şi virusuri.

BACTERIILE
 Există aproape 200 de grupe bacteriene, unele dintre ele permanente şi altele care sunt
ocazionale.
 Bacteriile sunt clasificate, după coloraţia Gram în două mari grupe: Gram pozitive şi Gram
negative.
1. Cocii Gram pozitivi
Printre aceştia, aproape 50% sunt:
 Streptococii orali (grupul viridans)
Au fost descrise 5 specii:
a. Streptoccus sanguis
 este localizat la nivelul dinţilor
 se întâlneşte în placa dentară
 poate fi agentul etiologic al endocarditelor bacteriene.
b. Streptococus mutans
 are acelaşi habitat ca şi S. sanguis
 este iniţiatorul cariei dentare
c. Streptococcus mittis
 se găseşte pe mucoasa bucală
 poate fi agentul etiologic al endocarditelor subacute.
d. Streptococcus salivarius
 se găseşte în salivă şi de asemenea în regiunea dorsală a limbii.
e. Streptococcus milleri
 foarte puţin implicat în patologia dentară.
 Streptococii anaerobi
 aparţin genului Peptostreptococcus
 sunt prezenţi în placa subgingivală
 ei pot fi izolaţi din boala paradontală şi din infecţii endodontice.
 Genul Micrococcus cu specia M. mucilagenosus (prezent pe limbă)
 Genre Staphylococcus (foarte puţin reprezentat în cavitatea bucală).
2. Cocii Gram negativi
 Genul Neisseria - numai specii comensale.
 GenulVeillonella
 sunt bacterii anaerobe
 sunt în număr mai mare în placa dentară.
3. Bacilii Gram pozitivi
 există tot timpul în cavitatea orală.
 numărul lor creşte în placa dentară.
 Actinomyces (bacterii filamentoase)
A. israeli (produce o afecţiune purulentă în regiunea cervicală)
A. viscosis şi A. naeslundi – care sunt prezenţi în calculusul dentar.
 Bifidobacterium
 bacterii anaerobe, care se găsesc în placa dentară

121
 Bacterionema – prezent în placa subgingivală.
 Lactobacillus
 prezent în placa dentară
 este una dintre bacteriile care sunt responsabile de evoluţia cariei dentare.
 Eubacterium (bacterii strict anaerobe)
 se întâlnesc în placa dentară
 participă la producerea bolii parodontale.
 Rhotia
 se găseşte în placa dentară
 Propionibacterium (bacterii anaerobe)
 se întâlneşte în placa dentară
4. Bacilii Gram negativi
 Bacteroides (bacterii strict anaerobe)
 se găsesc în placa dentară
 sunt izolaţi de asemenea în parodontopatii
 Prevotella (strict anaerobi)
 sunt izolaţi în bolile parodontale.
 Porphyromonas (strict anaerobi)
 predomină în parodontită la adult.
Fusobacterium
 responsabil de gingivite ulcero-necrotice acute.
 Leptotrichia (strict anaerobi)
 se găseşte în placa dentară
 Capnocytophaga (bacili Gram negativi nefermentativi)
 sunt implicaţi în boala parodontală juvenilă.
5. Cocobacili Gram negativi
 Eikenella (specia E. corrodens)
 se găseşte în placa dentară (în bolile parodontale)
 responsabil, de asemenea, de abcesele dento-alveolare.
 Actinobacillus (specia A. actinomycetemcomitans).
 prezent în boala parodontală juvenilă.
6. Bacterii neclasificate Gram
 Treponema (T. denticola, T. macrodentium, T.vincenti)
 izolată de la bolnavi, care prezintă gingivite ulcero-necrotice (ANUG)
 implicată, de asemenea, în parodontite.

Levurile
 sunt reprezentate de câteva specii ale genului Candida (C. albicans, C. tropicalis)
 în anumite cazuri pot fi responsabile de infecţii orale.

Protozoarele
 Entamoeba (specia E. gingivalis)
 se găseşte pe suprafaţa dinţilor, la nivelul gingiilor şi uneori în amigdale,
prezenţa ei putând fi asociată bolii parodontale şi gingivitelor.
 determină boala parodontală cauzând liza ţesuturilor parodontale.

122
  parazitul ingeră bacterii, leucocite şi eritrocite fără însă să manifeste caractere
invazive.
 această amibă este capabilă să ingere hemoglobina eritrocitelor, datorită
afinităţii pentru O2; secretă o substanţă leucotactică care antrenează
degenerescenţa şi absorbţia leucocitelor; se transmite exclusiv prin contact
oral – oral; acest parazit colonizează cavitatea bucală la majoritatea
persoanelor adulte însă, poate coloniza şi uterul (dacă se găsesc actinomicete,
nutrientul preferat de E. gingivalis).
 E. gingivalis poate să fie evidenţiată în frotiuri realizate din placa dentară şi
colorate fie trichrom sau în coloraţia cu hematoxilină ferică.
 se dezvoltă foarte bine pe mediul LES modificat sau pe mediul YES (yeast
extract-sucrose broth) la un pH de 6,4-6,7; mediile de cultură sunt incubate
timp de 120-168 ore, temperatura optimă de multiplicare este de 34,5-35 ºC.

 Trichomonas (T. tenax)

 strict anaerob, se găseşte în trevisa gingivală, lojele amigdaliene şi salivă, la
persoanele cu igienă dentară deficitară; mai poate fi izolat din secreţiile
bronşice.
 contaminarea se face prin salivă şi prin picăturile lui Pflügge
 este de dimensiuni mici, forma migdalată, incolor şi refringent.
 diagnosticul se bazează pe examenul microscopic între lamă şi lamelă, a
prelevatului suspendat într-o picătură de ser fiziologic.
 două prelevate de calcul dentar se cultivă într-un mediu introdus în tuburi
K.T.B. (Kupferberg Trichomonas Broth). Un mediu se incubează în condiţii
de aerobioză, iar altul în anaerobioză la 37ºC 72 ore. Protozoarele sunt
identificate prin examinare microscopică directă care relevă prezenţa
flagelatelor dezvoltate în mediul de cultură.

Virusurile
 foarte puţin reprezentate în cavitatea bucală.
 printre acestea: Herpes simplex, Adenovirus.

ECOSISTEMUL ORAL

 Cuprinde microorganismele şi diferite locuri din cavitatea orală, unde microorganismele se

dezvoltă.
 Habitatele cavităţii orale sunt
 dinţii (suprafaţa lor)
 mucoasa orală
 partea dorsală a limbii
 trevisa gingivală
 saliva.
 Dinţii: reprezintă habitatul pentru bacteriile aderente: Streptococcus mutans, Streptococcus
sanguis.
 Mucoasa orală

123
- Este habitatul pentru bacteriile puţin aderente: Streptococcus salivarius, Streptococcus
mittis.
 trevisa gingivală
- Bacteriile care se găsesc aici joacă un rol în iniţierea şi dezvoltarea bolii parodontale.
 Saliva
- Joacă un rol antibacterian prin spălarea mecanică, care antrenează bacteriile şi previn
aderenţa lor; la fel ea conţine diferiţi factori de apărare nespecifici (lizozim, lactoferine) şi de
asemenea specifici (Ig A, IgG, Ig M). Saliva reprezintă un sistem tampon de pH.

FACTORII FIZICO – CHIMICI CARE INFLUENŢEAZĂ DEZVOLTAREA

BACTERIILOR
 temperatura ( 35 - 36 0 C)
 pH-ul local - în condiţii normale est 6,75.
- în placa dentară pH-ul scade până la 5 şi permite dezvoltarea bacteriilor
acidofile (S. mutans, Lactobacillus).
 potenţialul de oxidoreducere
 în salivă, el este pozitiv (+200  + 500 milivolţi)
 când el scade până la - 150 mV, bacteriile anaerobe se dezvoltă foarte bine.
 în trevisa gingivală a unei gingii sănătoase, el este de + 73 mV.
 în bolile parodontale, el scade până la - 300 mV (se dezvoltă numai bacterii
anaerobe).
 substanţele antibacteriene (antibioticele şi antisepticele)
 pe cale generală sau aplicate local influenţează dezvoltarea bacteriilor.
 alimentaţia
 dacă este bogată în carbohidraţi, ea favorizează apariţia cariei dentare şi
favorizează creşterea levurilor.
 factori medicamentoşi
 obturaţiile, extracţiile, detartrajul - pot influenţa bacteriile orale.

FLORA BACTERIANĂ NORMALĂ

 la naştere, cavitatea bucală a nou născutului este sterilă.
 în primele 24 ore se vor stabili aici câteva bacterii, mai ales Streptococcus salivarius (de
la mamă sau din mediul înconjurător).
 apoi, ca urmare a activităţii metabolice a primelor specii apar celelalte bacterii: S.
mittis, S. milleri, Neisseria, Veillonella.
 la 6 luni (după apariţia dinţilor): Streptococcus mutans şi Streptococcus sanguis.
 între 6-9 luni - în trevisa gingivală apar bacilii Gram pozitivi (Actinomyces,
Bifidobacterium) şi Gram negativi (Bacteroides, Fusobacterium, Leptotrichia).
 lactobacilii se găsesc constant numai după 2 ani.
 la 6 ani se va instala Candida.
 Există bacterii care colonizează suprafeţele dure (dinţii): S. mutans, S. sanguis,
Actinomyces.
 Celelalte bacterii preferă mediile anaerobe: Prevotella, Porphyromonas, Treponema care
colonizează trevisa gingivală.
 La cei vârstnici (când işi pierd dentitia), bacteriile care colonizează cavitatea bucală sunt
foarte similare cu cele ale unui copil înainte de erupţia dentară.

124
 Protezele dentare modifică din nou compoziţia microbiană a cavităţii bucale.

CARIA DENTARĂ
 Caria dentară este definită ca o distrucţie localizată a ţesuturilor dentare prin acţiunea
bacteriană. Este o infecţie cronică endogenă produsă de bacterii comensale. Leziunea
cariogenă este rezultatul demineralizării emailului şi mai târziu a dentinei prin acizii produşi
de către bacteriile plăcii, care metabolizează carbohidraţii alimentari. Procesul iniţial de
demineralizare a emailului este reversibil, el fiind urmat de o remineralizare; când
remineralizarea nu se produce, în email vor apare cavităţi, care pot evolua spre dentină. Se
descriu cariile dentare ale emailului (de suprafaţă), ale dentinei şi ale suprafeţei radiculare
(profunde).
 Loeche, în 1976, a elaborat teoria infecţioasă specifică a cariei dentare, afirmând rolul
cariogen a unui număr limitat de bacterii. Astfel, Streptococcus mutans este responsabil de
apariţia cariilor de suprafaţă, de email, Lactobacillus şi Actinomyces de cariile suprafeţelor
radiculare.

Bacteriile cariogene
STREPTOCOCCUS MUTANS Streptococcus mutans este, inţiatorul cariei. Există o
corelaţie între numărul (cantitatea) de S. mutans din salivă şi din placă şi incidenţa cariei;
acest lucru este susţinut de experienţele pe animale (sterile) şi prin imunizarea animalelor cu
S. mutans, fapt care reduce incidenţa cariei.
 S. mutans are două mecanisme principale de producere a cariei dentare:  capacitatea de a
metaboliza rapid sursele mai ales zaharoza la acid lactic şi  prin proprietăţile de a produce
polizaharide extracelulare plecând de la zaharoză şi intracelulare (glicogen) care acţionează
ca depozite alimentare pentru momentul când carbohidraţii alimentari scad.

DIAGNOSTIC DE LABORATOR
 Identificarea S. mutans se face pe baza aspectului coloniilor, proprietăţilor biochimice şi
prin imunofluorescenţă.
 Mediul GSTB (un mediu cu glucoză, zaharoză, telurit şi Bacitracină) este utilizat pentru
izolarea S. mutans. Produsele patologice se recoltează din leziuni cariogene utilizând
tampoane foarte subţiri şi sterile, care sunt însămânţate pentru a obţine colonii izolate
(însâmanţarea în striu). Cutiile Petri cu medii însămânţate sunt incubate timp de 48 ore la 37
0
C în atmosferă de CO2.
 Citirea se face după 48 ore pe baza aspectului coloniilor dezvoltate. Coloniile sunt foarte
mici (dar vizibile cu ochiul liber), cu un diametru de 0,05-0,7 mm şi sunt examinate în
condiţii optime cu un microscop binocular. Coloniile de S. mutans au un aspect rugos cu o
suprafaţă netedă şi margini circulare, sunt bombate cu suprafaţa în general neregulată, care se
colorează alb-bej până la maro deschis sau gri deschis. Coloniile de S. sobrinus sunt de tip S
cu marginile circulare, bombate şi cenuşii.
 Tulpinile izolate sunt însămânţate, de asemenea, pe geloză sânge pentru a evidenţia
proprietăţile hemolitice, obsevându-se că majoritatea tulpinilor se dezvoltă sub formă de
colonii nehemolitice, foarte, foarte mici (0,02-0,1 mm) care sunt vizibile cu lupa; cultura se
dezvoltă în cantitate mai mică comparativ cu cultura de pe mediul GSTB. În acest caz, de
asemenea, este necesară incubarea în atmosferă de CO 2. Examinarea coloniilor trebuie

125
completată cu punerea în evidenţă a caracterelor morfo-tinctoriale pe frotiuri colorate Gram
unde se văd coci Gram pozitivi în lanţ.
 Alt criteriu de identificare este cel biochimic, plecând de la proprietăţile biochimice
caracteristice pentru S. mutans. Identificarea biochimică se face pe mediul Hiss la care se
adaugă manitol, sorbitol, glicerol, glucoză, în cantitate de 1%. Indicatorul Andradi (roşu
fenol şi NaOH n/10) este indicatorul de pH utilizat. Eprubetele însămânţate sunt incubate la
37 0C timp de 20 ore în atmosferă de CO 2. Virajul culorii indicatorului evidenţiază un test
pozitiv şi culoarea roşie apare când substratul a fost degradat.
 Alături de aceste metode, S. mutans se poate evidenţia prin metodele moderne:
imunofluorescenţa şi PCR.

LACTOBACILLUS
 Lactobacillus sunt bacterii responsabile mai degrabă de progresia leziunii cariogene şi
caracterizează cariile dentinei. Există o corelaţie între numărul de Lactobacillus în salivă şi în
placă şi activitatea cariogenă. Lactobacillus are posibilitatea de a se dezvolta la un pH scăzut
(acid) şi de a produce, de asemenea, acidul lactic pornind de la zaharoză.

DIAGNOSTIC DE LABORATOR
 Lactobacillus est o altă bacterie cariogenă. Se prezintă sub formă de bacili Gram pozitivi,
imobili, nesporulaţi care se găsesc într-un număr mic în placa dentară (ei reprezintă 1% din
flora plăcii) şi nu au mecanisme eficiente pentru a se ataşa şi a se acumula în placa dentară.
În schimb, lactobacilii, abundenţi în cariile dentinei, sunt implicaţi în etiologia cariei dentare,
nu atât în iniţierea sa cât în avansarea leziunii cariogene.
 Sunt bacterii acidurice cu un pH optim de creştere de 5,5-5,8 şi cu o capacitate de
fermentare a carbohidraţilor ceea ce explică rolul lor în producerea şi, de asemenea, în
progresia cariei dentare atunci când ea a a fost iniţiată de S. mutans şi S. sobrinus.
 După modul de fermentare a glucozei, lactobacilii sunt clasificaţi în specii
homofermentative care produc în principal acidul lactic (aproximativ 65%) şi specii
heterofermentative dintre care mai puţin de 65% produc acid lactic, alături de alţi produşi
finali, în principal acid acetic şi etanol, inclusiv gaz (CO 2). Cele mai frecvente specii de
Lactobacillus sunt: L. casei, L. acidophylus.
 Există teste care pot evalua numărul de lactobacili în saliva pacienţilor şi ei oferă informaţii
despre potenţialul cariogen a acelei cavităţi orale; există o corelaţie între numărul de
lactobacili prezenţi în salivă la pacienţii susceptibili la carie (cu un număr mare de carii
dentare) şi un număr redus la persoanele cario-rezistente.
 Lactobacilii sunt izolaţi pe mediul Rogosa care permite creşterea bacteriilor la un pH de
5,5. Cutiile Petri cu medii însămânţate cu salivă recoltată de la subiecţii studiaţi, sunt
incubate timp de 4 zile la 25 0C. Identificarea se face pe frotiuri din cultura dezvoltată şi prin
teste biochimice ale fermentării carbohidraţilor.

 ACTINOMYCES
 sunt asociaţi mai ales cariilor suprafeţei radiculare.
Diagnostic de laborator :
Se izolează pe agar sânge pe baza de infuzie cord-creier; se folosesc două plăci, una
cu incubare anaerobă la 37ºC timp de 21 de zile şi alta cu incubare aerobă 14 zile la 37ºC. Se

126
urmăreşte la fiecare 2 zile dezvoltarea culturilor. Formează colonii de culoare alb-gălbuie de
consistenţă fermă.
În preparatul microscopic apar ca şi bacterii filamentoase, ramificate, Gram pozitive,
cu aspecte de pseudohife. La efectuarea frotiului, prin mişcări brutale ale ansei, pseudohifele
se pot fragmenta în forme bacilare difteromorfe.

NOTE PERSONALE

BIBLIOGRAFIE

1. BENSON H.G., Microbiological Applications, Ed. Wm. C. Brown, Fifth-Edition, 44-172,

1990.

127
2. BERTON M.J., BRASSEUR F., CHOTARD S., DECLERCK C., DORARD PH.,
TRAVEAUX PRATIQUES DE BACTÉRIOLOGIE, Institut de formation de technicians en
analyses biomedicales, 2001.
3. BOSGIRAUD – AEMIP C., Microbiologie générale et santé, Ed. ESKA, 155-162, 209-
243, 257-265, 2003.
4. BUIUC D., NEGUŢ M., IONESCU G., Identificarea bacililor Gram negativi, aerobi,
glucozo-nefermentativi – în tartat de Microbiologie clinică, ed. II-a, Ed. Medicală, Bucureşti,
765-795, 2008.
5. CHEN J.F., LIU G.Y., WEN W.R., CHEN C., Studies on the continuos culture and
pathogenicity of Entamoeba gingivalis, Zhongguo Ji Sheng Chong Yu Ji Sheng Chong Bing
Za Zhi, 2000, 18(2):84-86.
6. CODIŢĂ I., BUIUC D., PÂNZARU C., UNGUREANU V., Identificarea cocilor Gram
pozitivi aerobi şi facultativi anaerobi – în Tratat de Microbiologie Clinică, ed. II-a, Ed.
Medicală, Bucureşti, 562-607, 2008.
7. DECOSTER A., LEMAHIEU J.C., DEHECQ E., DUHAMEL M., Cours de Bactériologie,
2004, http//anne.decoster.free.fr/bindex.html
8. DURIEZ T., DUJARDIN L., AFCHAIN D., Cours de Parasitologie, Faculté de Pharmacie,
Lille,France;http://pharmacie.univ-Lille2.fr/recherche/labos/Bacteriologie/ACCUEIL/
index.php
9. GANNON J.T., LINKE H.A., Growth studies on xenic culture of Entamoeba gingivalis
using established media, Int J Parasitol., 1989, 19(8) :835-838.
10. GANNON J.T., LINKE H.A., An antibiotic–free medium for the xenic cultivation of
Entamoeba gingivalis, Int J Parasitol., 1991, 21(4) :403-407.
11. HART T., SHEARS P., Bactéries et infections bactériennes dans Atlas de poche de
Microbiologie, Ed. Flamarion Médicine - Science, 1997, 71-227.
12. HODÂRNĂU C., BOBOŞ C., Microbiologie – Cahier de travaux pratiques à l'usage des
étudiants en Médicine dentaire, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, 2008.
13. IVANOF A. (sub red.), Caiet de lucrări practice de Microbiologie, Ed. Did. Ped.,
Bucureşti, 1983.
14. JUNIE M., SAŞCĂ C., Infecţii umane parazitare, Ed. Dacia., Cluj-Napoca, 1997.
15. MATINCA D., STĂNILĂ L., Cahier de travaux pratiques à l’usage des étudiants en
Médicine et Pharmacie, Ed. Med. Univ.”Iuliu Haţieganu”, Cluj-Napoca, 2002.
16. NEGUŢ M., BUIUC D., Identificarea bacililor Gram negativi, glucozo-fermentativi – în
Tratat de Microbiologie Clinică, ed. II-a, ed. Medicală, Bucureşti, 695-764, 2008.
17. PAYMENT P., TRUDEL M., Manuel de Techniques virologiques, Ed. Aupelf, 21-72,
121-153, 1989.
18. PERLEMUTER L., CENAC A., Dictionnaire pratique de Médicine clinique, Masson,
Paris, 1977.
19. PILLY E., Infections parasitaires et mycosiques, în Maladies infectieuses, 427-429, 437-
442, 1988.
20. RĂDULESCU S., MEYER E.A., Parazitologie Medicală, Ed. All, Bucureşti, 271-287,
1992.
21. SAMARANAYAKE L.P., Esential Microbiology for Dentistry, Churchill Livingstone,
1996.
22. STĂNILĂ L., La microbiology de la cavite orale, în Bacteriology generale et virologie,
Ed. Med. Univ. .”Iuliu Haţieganu”, Cluj-Napoca, 2003.

128
23. Implication des protozoaires oraux dans la maladie parodontale, 2004,
www.dreamdirectdesign.com/dentisfuturis/ modules/news/article.php ?storyid=366.

CUPRINS

LUCRAREA NUMĂRUL 1. MĂSURI DE PROTECŢIE ÎN LABORATORUL DE

MICROBIOLOGIE. STERILIZAREA ŞI DEZINFECŢIA..................................................2
LUCRAREA NUMĂRUL 2. PREPARATE MICROSCOPICE........................................13
LUCRAREA NUMĂRUL 3. PREPARATE MICROSCOPICE.......................................18

129
 COLORAŢIA ZIEHL-NEELSEN. COLORAŢII SPECIALE...........................................18
LUCRAREA NUMĂRUL 4. MEDII DE CULTURĂ. INOCULAREA PROBELOR
PATOLOGICE. CARACTERELE CULTURILOR BACTERIENE.................................23
MEDII DE CULTURĂ. INOCULAREA PROBELOR PATOLOGICE...........................23
PROPRIETĂŢILE BIOCHIMICE ALE BACTERIILOR..................................................28
LUCRAREA NUMĂRUL 5. ANTIBIOGRAMA..............................................................35
ANTIBIOGRAMA..............................................................................................................35
LUCRAREA NUMĂRUL 6. REACŢII ANTIGEN-ANTICORP......................................39
LUCRAREA NUMĂRUL 7. SCHEMA DIAGNOSTICULUI ETIOLOGIC ÎN
INFECŢIILE BACTERIENE. RECOLTAREA PROBELOR PATOLOGICE.................54
LUCRAREA NUMĂRUL 8. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR
PRODUSE DE BACILII GRAM POZITIVI......................................................................60
LUCRAREA NUMĂRUL 9. COCII...................................................................................67
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR PRODUSE.............................72
DE COCII GRAM NEGATIVI...........................................................................................72
LUCRAREA NUMĂRUL 10. BACILII GRAM NEGATIVI............................................75
LUCRAREA NUMĂRUL 11. BACILI GRAM NEGATIVI NEFERMENTATIVI.
COCOBACILI GRAM NEGATIVI. BACTERII ACIDO-ALCOOLO REZISTENTE.. . .83
LUCRAREA NUMĂRUL 12. SPIROCHETE ŞI ALTE BACTERII NECOLORABILE
GRAM (RICKETTSIA, CHLAMYDIA, MYCOPLASMA). ELEMENTE DE
PARAZITOLOGIE..............................................................................................................88
LUCRAREA NUMĂRUL 13. VIRUSOLOGIE...............................................................108
LUCRAREA NUMARUL 14. MICROBIOLOGIA CAVITĂŢII ORALE......................126
BIBLIOGRAFIE................................................................................................................133

130