Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Cuprins
4. Microoganisme psichrofile…………………………………………………………………. 11
5. Microoganisme alcalofile…………………………………………………………………….12
6. Microoganisme acidofile……………………………………………………………………..13
7. Microoganisme halofile............................................................................................................14
8. Microoganisme barofile...........................................................................................................15
În lumea vie, există o serie de microorganisme care pot popula medii extreme. Aceste
microorganisme au dezvoltat de-a lungul timpului o serie de adaptări, de ordin structural şi chimic,
ce le permit dezvoltarea şi supravieţuirea în medii extreme.
Mediile extreme includ mediile cu temperaturi, pH, presiuni, concentraţii de sare ridicate şi
pe cele cu temperaturi, pH, concentraţii de nutrienţi şi disponibilitatea apei scăzute. Deasemenea, în
categoria mediilor extreme sunt incluse şi cele cu nivele ridicate de radiaţii, metale grele şi compuşi
toxici.
În ultima perioadă, biotehnologia a demarat o intensă cercetare asupra microorganismelor
extremofile, datorită numeroaselor aplicabilităţi din industrie. Unul dintre cele mai bune exemple îl
constituie extremoenzimele, care sunt deja folosite pe piaţă. Cele mai cunoscute extremoenzime sunt
proteazele alcaline din detergenţi. Acestea au o piaţă de desfacere foarte mare, luând în considerare
piaţa mondială de detergenţi. O altă aplicabilitate importantă o constituie obţinerea de AND
polimeraze, cu aplicabilitate în tehnica PCR (obţinute de la tulpini de Thermococcus littoralis,
Thermus aquaticus, Thermotoga maritime, Pyrococcus woesii şi P. furiosus ). O inovaţie importantă
o constituie deasemenea enzimele termostabile, care conduc hidroliza amidonului, precum α-
amilaze care nu necesită ionul de Ca2+, amilopululanaze, glucoamilaze şi glucozo-izomeraze, care
sunt active la pH-ul la care are loc hidroliza amidonului. Xilanazele termostabile şi alcaline sunt
folosite în tratamentul de preînalbire a cojilor, pentru a reduce cantitatea de clor necesară etapei de
înalbire. Bergquist et al au reuşit să introducă şi să exprime două xilanaze din Dictyoglomus
thermophilum, în Kluyveromyces lactis şi Trichoderma reesei. Dunaliella bardawii, o alga verde
extremofilă, este folosită la obţinerea de beta-caroten; Marinobacter hydrocarbonoclasticus, o
halotolerantă, este capabilă să degradeze o varietate de hidrocarburi alifatice şi aromatice. Nicholson
si Fathepure au pus la punct o cultură halofilică capabilă să degradeze în 1-2 săptămâni un amestec
de benzen, toluen, etilbenzen și xileni. În acest fel se poate pune la punct o metodă cu cost redus cu
aplicabilitate în amelioarea solurilor şi protejarea acviferelor.
În tabelul 1 sunt prezentate potenţialele aplicabilităţi ale extremofilelor.
Sursa Utilizarea
Termofile
ADN-polimeraze PCR
AND-ligaze LCR
Fosfataza-alcalină Diagnostic
Proteaze şi lipaze Produse lactate
Lipaze, pululanaze, amilopululanaze şi proteaze Panificaţie, producerea berii
α-amilaze, glucoamilaze, α-glucozidaze, Procesarea amidonului, folosirea
amilopululanaze, izomeraze glucozei şi fructozei ca îndulcitori
Alcool dehidrogenază Sinteze chimice
Xilanaze Înălbirea hârtiei
Antibiotice Farmaceutic
Microorganisme ce degradează petrolul Surfactanţi
2
Microorganisme sulf-oxidante Desulfurizări
Psichrofile
Fosfataza alcalină Biologie moleculară
Proteaze, lipaze, celulaze şi amilaze Detergenţi
Lipaze şi proteaze Producerea brânzeturilor
Proteaze Soluţii pentru curăţarea lentilelor de
contact
Acizi graşi polinesaturaţi Aditivi şi suplimente alimentare
β-galactozidază Hidroliza lactozei din produse lactate
Dehidrogenaze Biotransformări
Oxidaze Bioremedieri, biosenzori
Microorganisme “ice minus” Protectia plantelor sensibile împotriva
înghețului
Halofile
Bacteriorhodopsina Generatori de curent în bioelectronică
Polihidoxialcanoați Plastic de uz medical
Polimeri reologici Recuperarea petrolului
Lipide Lipozomi pentru medicamente și
cosmetice
Lipide Încălzirea uleiului
Soluți compatibili Protectori ai proteinelor și celulelor în
diferite procese (încălzire, înghețare)
Diferite enzime Diferite utilizări (agenți de aromă)
Acid γ-linoleic, β-caroten și extracte
celulare Suplimente alimentare, hrană dietetică,
coloranți
Microorganisme Modificatori ai aromei și texturii
produselor alimentare și fermentarea
sosurilor de pește
Microorganisme Degradarea și transformarea deșeurilor
Membrane Surfactanți pentru produse farmaceutice
Alcalofile
Proteaze, celulaze, xilanaze, lipaze
și pululanaze Detergenți
Elastaze, keratinize Îndepărtarea pielii/părului
Ciclodextrine Utilizări în farmaceutică, industria
chimică și alimetară
Xilanaze și proteaze Înălbire
Pectinaze Industria hârtiei, degomare și tratarea
deșeurilor
Microorganisme alcalofile Producere de antibiotice
Acidofile
Microorganisme sulf-oxidante Recuperare de metale și desulfurarea
cărbunelui
Microorganisme acidofile Acizi organici și solvenți
3
Microorganisme tolerante la solvenți organici Bioconversia compușilor insolubili în
apă (exemplu steroli), bioremediere,
biosurfactanți
5
2. Clasificarea microorganismelor extremofile
6
În funcţie de temperatura optimă de dezvoltare, bacteriile şi arhebacteriile au fost clasificate
în termofile moderate (Bacillus caldolyticus, Geobacillus stearothermophilus, Thermoactinomyces
vulgaris, Clostridium thermohydrosulfuricum, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoplasma
acidophilum), extreme (Thermus aquaticus, T. thermophilus, Thermodesulfobacterium commune,
Sulfolobus acidocaldarius, Thermomicrobium roseum, Dictyoglomus thermophilum,
Methanococcus vulcanicus, Sulfurococcus mirabilis, Thermotoga mritima) şi hipertermofile
(Methanoccus jannaschii, Acidianus infernos, Archaeoglobus profundus, Methanopyrus kandleri,
Pyrobaculum islandicum, Pyrococcus furiosus, Pyrodictium occultum, Pyrolobus fumarii,
Thermococcus littoralis, Ignicoccus islandicum, Nannoarchaeum equitans). Acestea au fost izolate
din surse ca: composturi, soluri expuse la radiaţii solare, izvoare termale terestre, crăpături
submarine hidrotermale sau rezerve geotermale de petrol. Tulpini extremotermofile de Geobacillus
thermooleovorans au fost izolate din izvoare fierbinti; deasemenea, Kasheri și Lovely au izolat o
tulpină ce reduce Fe(III) la Fe(II) din crăpătura izotermală Mothra (Pacificul de Nord), care poate
rezista la 121OC, aceasta fiind temepratura cea mai ridicată la care poate supravieţui un
microorganism (Satyanarayana, 2005).
În mod normal proteinele, acizii nucleici sau lipidele din structura microorganismelor se
deteriorează la temperaturi înalte; dar nu este şi cazul termofilelor. Lipidele membranare ale
termofilelor conţin o cantitate mai mare de acizi graşi nesaturaţi şi cu catena neramificată decât cele
ale mezofilelor. Acest lucru permite termofilelor să se dezvolte la temperaturi ridicate, asigurând
gradul de fluiditate necesar bunei funcţionări a membranei. Multe specii de termofile prezintă un
strat paracristalin la suprafaţă, alcătuit din proteine sau glicoproteine şi care functionează ca o
barieră protectivă.
Dintre hipertermofile, cel mai intens au fost studiate speciile de termoacidofile aparținând
ordinului Sulfolobales, metanogenele și câteva specii aparținând ordinului Thermococcales.
Principala limitare în studiul acestor microorganisme o constituie cantitatea mică de biomasă care
poate fi obținută. Thermococcalele au fost izolate din ecosisteme marine, excepție făcând
Thermococcus sibiricus, izolat dint-un zăcământ de petrol cu temperatură ridicată și Thermococcus
zilligii și Thermococcus waiotapuensis, ambele izolate din izvoare geotermale continentale. Ordinul
cuprinde trei genuri: Thermococcus, Pyrococcus și Palaeococcus, care sunt anaerobe, utilizează
peptidele ca sursă de carbon și majoritatea lor se dezvoltă foarte bine în prezența sulfului, producând
o cantitate mare de hidrogen sulfurat. Pentru cultivarea acestor microorganisme se preferă utilizarea
bioreactoarelor din sticlă, cu bule de gaz. În figura 1 este prezentat un bioreactor utilizant pentru
cultura termofilelor.
7
Figura1. Bioreactor cu bule de gaz utilizat pentru cultura hipertermofilelor. A-schema
bioreactorului, B-imagine laterală, C-imagine a părții superioare
(Godfroy, A., 2006).
Recoltarea probelor pentru termofilele marine se face în general folosind sonde care sunt
acționate de la suprafață, procedeul fiind destul de anevoios. Pentru colectarea diferitelor probe din
izvoare termale de adâncime sunt necesare aparate speciale pentru colectare- DSV (“Deep
Submergence Vehicles”) și ROV („Remotely Operative Vehicles”). Probele conțin fie lichide, fie
porțiuni solide (structuri ale coșurilor vulcanice, roci, sedimente, viețuitoare, etc.). Probele lichide
sunt colectate in floacoane Niskin, seringi de titan sau tuburi ORI. Probele solide sunt colectate cu
echipamentele DSV sau ROV, care au in componență un compartiment steril de colectare a
probelor. După colectare, probele trebuiesc procesate imediat, datorită faptului că majoritatea
termofilelor sunt anaerobe sau facultativ anaerobe (excepție făcând Marinithermus hydrothermalis,
Aeropyrum Camini și câteva tulpini de Thermus ) . În mod normal probele sunt păstrate în sticle cu
dop de cauciuc impermeabil la gaze, în atmosferă de azot. Mediile de cultură folosite diferă în
funcție de necesitățile nutritive ale microorganismului. Termofilele marine pot fi clasificate în:
microorganisme fermentative, metanogene, heterotrofe aerobe, reducătoare autotrofice sau
heterotrofice de nitat, sulfat, sulf sau fier. În tabelul 4 sunt prezentate principalele tipuri de termofile
marine, în funcție de metabolism.
8
Tabel 4. Microorganismele termofile în funcție de metabolism.
Facultativ
chemolitoautotrofe Archaeoglobales (Archaeoglobus H2 , Materie organică
SO42-, FeIII
şi Geoglobus) S2O32- ,SO32-
SO32-
Thiotrichales (Thiomicrospira) S , S2O3 , S
0 2- 2-
O2
Heterotrofe obligat Desulfurococcales (Pyrodictium) H2, Materie organică S0, S2O32-
9
anaerobe Desulfuromonadales (Geothermobacter) Materie organică
NO3-,FeIII
(Nakagawa,S., 2006)
• NaCl 25 g
• MgCl2 x 6H2O 4.2g
• MgSO4 x 7H2O 3.4g
• KCl 0.5 g
• NH4Cl 0.25 g
• K2HPO4 0.14 g
• CaCl2 x 2H2O 0.7g
• FeSO4 x 7H2O 0.02g
• Soluție minerală 10 ml.
Soluția minerală are următoarea compoziție (per litru de apă distilată și deionozată):
• Acid nitrilotriacetic (NTA) 1.5g
• MgSO4 x 7H2O 3g
• MnSO4 x 5H2O 0.5 g
• NaCl 1.0 g
• FeSO4 x 7H2O 0.1 g
• CoSO4 x 7H2O 0.18 g
• CaCl2 x 2H2O 0.1 g
• ZnSO4 x 7H2O 0.18 g
• CuSO4 x 5H2O 0.01 g
• KAl (SO4)2 x12H2O 0.02 g
• H3BO3 0.01 g
• Na2MoO4 x 2H2O 0.01 g
• NiCl2 x 6H2O 0.075 g
• Na2SeO3 x 5H2O 0.05 g
Acest mediu este adaptat în funcție de necesitățile speciale ale microorganismului de interes.
Incubarea se face fie în incubatoare, fie în baie de ulei, care pot atinge temperaturi de peste 130 oC și
presiune de 400kPa. Izolarea în culturi pure se face folosind tehnica diluțiilor repetate. Primul pas îl
reprezintă determinarea densității celulare din cultura ce va urma să fie supusă diluțiilor. În
continuare se realizează diluții seriale 1:10 până când densitatea celulară ajunge la aproximativ 102-
103 celule/ml. Din ultima diluție se fac diluții de 1:2 până când factorul total de diluție depășește
densitatea celulară inițială cu cel puțin două ordine de mărime. Întreaga operație de diluție este
necesar să fie repetată de 3-5 ori (Nakagawa, S., 2006).
10
4. Microoganisme psichrofile
Până la ora actuală, s-au raportat numeroase specii de microorganisme psichrofile (peste
100), atât Gram pozitive, cât şi Gram negative. Acestea au fost identificate în sol, nisip, ape dulci,
ape marine sau în gheţarele mărilor şi oceanelor. Psichrofilele aparţin genurilor Alcaligenes,
Alteromonas, Aquaspirillum, Arthobacter, Bacillus, Bacteroides, Brevibacterium, Gelidibacter,
Methanococcoides, Methanogenium, Methanosarcina, Microbacterium, Micrococcus, Moritella,
Octandecabacter, Phormidium, Photobacterium, Polaribacter, Polaromonas, Psychroserpens,
Shewanella şi Vibrio. Genul Morritella este compus în totalitate din psichrofile. Primele psichrofile
identificate în Antarctica au fost Leifsonia aurea, Sporosarcina macmurdoensis şi Kocuria polaris.
Astfel în orice mediu cu temperaturi scăzute, cea mai mare parte a microorganismelor izolate sunt
psichrofile. Deasemenea, au fost identificate numeroase psichrofile în peşterile reci din Pirinei, Alpi,
Carpaţi, Lapland sau Arctic. Cea mai mare parte a lor aparţine genurilor Arthrobacter,
Pseudomonas si Flavobacterium, predominând genul Arthrobacter. Cele mai multe microorganisme
izolate din solurile acestor peşteri sunt similare Arthrobacter glacialis. În locurile unde zăpada se
topeşte sau unde suprafaţa zăpezii este colorată în roşu, verde sau galben, se găsesc alge. Majoritatea
acestora sunt psichrofile; speciile reprezentative sunt: Chloromonas brevispina, C. pichinchae, C.
rubroleosa, C. polyptera şi Chlamydomonas nivali (Satyanarayana, 2005).
Dintre toate componentele celulare ale psichrofilelor, cele mai importante sunt proteinele.
În tabelul 5 sunt prezentate principalele proteine obținute folosind psichrofilele.
11
diluate 1 la 2 sau 1 la 10, precum triptonă- soia- agar sau Luria-Bertani agar, la care se adaugă
cantăţi mici de extract de drojdii (0.01-0.001%). Însămânţarea se face pe mediul răcit în prealabil la
temperatura optimă fiecarui microorganism. Pentru izolarea psichrofilelor marine, cel mai frecvent
se utilizează mediul comercial Marine 2219 agar, dar se poate folosi şi mediu pe bază de apă de
mare sterilizată (preferabil prin filtrare) (Russell , N., 2006).
5. Microoganisme alcalofile
Descoperirea alcalofilelor s-a făcut relativ recent. Ulilizarea acestor microorganisme are o
istorie lungă in Japonia, fiind folosite încă din antichitate în industria indigoului; astfel, indigoul,
provenit din frunzele de indigo este redus în procesul de fermentaţie al indigoului, care are loc în
condiţii puternic alcaline (http://mmbr.asm.org).
Alcalofilele se împart în două mari grupuri fiziologice: alcalofile si haloalcalofile.
Alcalofilele necesită un pH mai mare de 9 pentru creştere, optimul fiind de 10; haloalcalofilele
necesită în afara pH-ului peste 9 şi o salinitate crescută (33% NaCl). Prima grupă are cerinţe minime
de NaCl în mediu de creştere. Acestea se găsesc în sol, sedimente marine sau în apele cu conţinut
ridicat de Ca2+ . Haloalcalofilele sunt prezente în mod frecvent în lacurile bazice sau în deşerturile
bazice. Majoritatea haloalcalofilelor izolate din aceste medii aparţin grupului Archaea.
Dintre genurile care cuprind alcalobacterii pot fi amintite: Pseudomonas, Paracoccus,
Micrococcus, Aeromonas, Corynebacterium, Actinopolyspora , Bacillus, Vibrio, Flavobacterium,
Cyanospira, Chlorococcum, Pleurocapsa, Spirulina, Ectothiorhodospira si Methanohalophilus.
Cele mai cunoscute haloalcalofile sunt: Natronobacterium pharaonis, N. gregoryi,
Natronococcus occultus, Methylobacter alcaliphilus, Methylomicrobium alcaliphilum, Spirochaeta
alcalica, S. asiatica, Desulfonatronovibrio hydrogenovorans, Clostridium, Thermoanerobacter sp.,
și Thermopallium natronophilum (Satyanarayana, 2005).
Izolarea alcalofilelor se face folosind metode convenționale, cea mai importantă problemă
luată în considerare fiind mediul de cultură. Cea mai folosită tehincă este cea a diluțiilor repetitive,
pe plăci cu mediu solid (Mesbah, N., 2006).
În mod normal, pentru cultivarea alcalofilelor se folosește mediu pe bază de NaHCO 3-
Na2CO3, ajustând pH-ul în jurul valorii de 10.5 prin adăugare de Na2CO3 1%.
Se folosesc în principal două medii: mediul Horikoshi (1971), dezvoltat inițial pentru
izolarea alcalofilelor din sol, și mediul Tindall et al. (1984).
Compoziția mediului Horikoshi (1971) este următoarea (grame per litru):
• Glucoză 10.0
• Peptonă 5.0
• Extract de drojdii 5.0
• KH2PO4 1.0
• MgSO4 x 7H2O 0.2
• Na2CO3 10.0.
Compoziția mediului Tindall et al. (1984), exprimat în grame per litru:
• Extract de drojdii 10.0
• Acizi casaminici 7.5
• Citrat trisodic 3.0
• KCl 2.0
• MgSO4 x 7H2O 1.0
• MnCl2 x 4H2O 0.00036
• FeSO4 x 7H2O 0.05
12
• NaCl 200
• Na2CO3 10.0
La preparare, mediul poate prezenta precipitați și are pH-ul cuprins între 10.5 și 11, dar după
turnarea în plăci, pH-ul scade la 9.5-10, datorită absorției de CO2 (Grant,W., 2006).
6.Microoganisme acidofile
7. Microoganisme halofile
8. Microoganisme barofile
14
10. Microoganisme oligotrofe
Bibliografie
1. Burns, D. & Dyall-Smith, M.. Cultivation of Haloarchaea. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.)
Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp.536-542;
2. Cavicchioli, R. & Thomas, T.. Extremophiles. In: J. Lederberg. (ed.) Encyclopedia of
Microbiology, Second Edition, Vol. 2, Academic Press, San Diego, 2000, pp. 317–337;
3. Cavicchioli, R., Curmi, P., Siddiqui, K.& Torsten, T.. Proteins from Psychrophiles
In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic
Press, 2006, pp. 406-407;
4. Godfroy, A., Postec, A. & Raven, N., Growth of Hyperthermophilic Microorganisms
for Physiological and Nutritional Studies. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in
Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 93-97;
5. Gonzalez-Toril, E., Gomez, F., Malki, M. & Amils, R.. The Isolation and Study of
Acidophilic Microorganisms, In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35,
Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 471;
6. Grant, W.. Cultivation of Aerobic Alkaliphiles. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods
in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 443-444;
7. Litchfield, C., Sikaroodi, M. & Gillevet, P.. Characterization of Natural Communities
of Halophilic Microorganisms, In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume
35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 513;
8. Mesbah, N. & Wiegel, J.. Isolation, Cultivation and
Characterization of Alkalithermophiles. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in
Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 452-461;
9. Nakagawa,S. & Takai, K.. The Isolation of Thermophiles from
Deep-sea Hydrothermal Environments, In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in
Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp.55-78
10. Rainey, F. & Oren, A.. Extremophile Microorganisms and the Methods to Handle
Them In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles,
Academic Press, 2006, pp. 5-10;
11. Russell , N. & Cowan, D.. Handling of psychrophilic
Microorganisms. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35,
Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 371-388;
15
12. Satyanarayana, T., Raghukumar, C. & Shivaji, S.. Extremophilic microbes: Diversity
and perspectives, Current Science, VOL. 89, NO. 1, 10 July 2005, pp.78-88;
13. Zimmerman, J. & Battista, J.. Measuring Survival in Microbial Populations Following
Exposure to Ionizing Radiation. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume
35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp.746-747;
14. http://mmbr.asm.org/cgi/content/full/63/4/735#SEC1;
15. http://en.wikipedia.org/wiki/Extremophile.
16