Pre-fermentarea mustului de whisky de malț folosind Lactobacillus

plantarum și influența acestuia asupra caracterului distilatului nou

Plămăzile de distilerie sunt nesterile, ceea ce permite comunităților bacteriene să

înflorească, de obicei spre sfârșitul fermentației. A fost investigat efectul începerii fermentației
bacteriene la începutul fermentației. Mustul a fost tratat timp de 48 de ore folosind o tulpină
comercială de Lactobacillus plantarum urmată de fermentare utilizând o tulpină de distilare de
Saccharomyces cerevisiae.

Spălarea tratată a arătat o creștere substanțială a acizilor lactici, acetici și succinici.

Analiza senzorială a determinat faptul că distilatul produs cu tratament bacterian a fost
semnificativ diferit (p <0,05), iar analiza chimică a demonstrat o creștere a producției de acetat
de etil.

Aceste rezultate arată că tratarea prealabilă folosind specii de Lactobacillus ar putea fi

utilizată pentru a modifica calitatea distilatului nou-fabricat într-o distilerie. Prin utilizarea
culturilor bacteriene prezente în împrejurimi sau materii prime, distilatoarele ar putea permite
adăugarea microflorei naturale sau disponibile în comerț, îmbunătățind astfel dezvoltarea
aromelor în timpul fermentării și producând diferite caractere spirtoase.

1. Introducere

În timpul producției de whisky de malț, nu există o etapă de fierbere în timpul producției

de must, rezultând condiții „nesterile” pentru fermentare. Prin urmare, bacteriile și alte
microflore, derivate din mediul local (praf, mash tun, spălături (vas de fermentare)) sau din
materiile prime (malț, cereale, drojdie), se poate dezvolta pe parcursul. Aceste microorganisme,
împreună cu tulpina dorită de drojdie Saccharomyces, influențează aroma mustului fermentat -
cunoscut sub numele de “spălare”odată ce fermentația este completă. Într-o distilerie tipică de
whisky de malț, această spălare va fi distilată de două ori în albiuri de oțel de cupru pentru a
produce distilat nou.

În ciuda culturilor bacteriene și a drojdiilor sălbatice, de obicei asociate cu alterarea berii,

creșterea bacteriilor și fermentarea lor în fermentațiile whisky scoțian este adesea legată
anecdotic de calitatea sporită a distilatului nou-creat și taxonomia diferitelor culturi bacteriene
prezente a fost bine studiată în industrie. Nu este comun ca distileriile scoțiene să încurajeze
prezența unor astfel de culturi, deoarece acestea sunt permise prin absența fierberii mustului. De
asemenea, folosirea spălătorilor din lemn care adăpostesc niveluri mai ridicate de bacterii sunt
obișnuite. Mai mult, distilatoarele vor crește adesea timpul de fermentare pentru a încuraja o
fermentație secundară, lactică. În altă parte a lumii, mai tipic în Statele Unite, o porție de piure
uzat (cereale procesate, cu conținut scăzut de carbohidrați) din fermentația anterioară poate fi
inclusă în fermentator, reducând pH-ul mustului, ceea ce va încuraja creșterea acidului lactic
bacterii în timpul fermentării. Deși creșterea bacteriilor poate să nu fie complet eradicată, ea este
în general menținută la niveluri scăzute, astfel încât să nu afecteze randamentul spiritului dintr-o
anumită fermentație, fie prin concurență pentru zahăr fermentabil, fie prin inițierea floculării
drojdiei.

Au fost efectuate studii detaliate ale comunităților bacteriene prezente în mediul

distileriei, cu specii de Lactobacillus, considerate a fi genul dominant, datorită capacității sale de
a supraviețui alcoolului ridicat. conținut de fermentații tardive de whisky (7,5-8,5% v / v etanol),
pH scăzut (de obicei 3,5-4,0) și condiții anaerobe. În ciuda faptului că acest domeniu a fost bine
studiat, impactul specific pe care aceste culturi îl au asupra distilatului nou creat este puțin
înțeles. Acest lucru se poate datora mai multor factori diferiți. Este dificil să se determine
diferențele dintre calitatea distilatelor de la distilerie la distilerie, întrucât o multitudine de alți
factori influențează, de asemenea, calitatea percepută a distilatului nou creat. Aceasta include,
dar nu se limitează la, regimul de piure, viteza și tulpina de adâncire (adăugare) a drojdiei,
volumul fermentației, timpul și temperatura, precum și punctele de proiectare și tăiere în timpul
distilării. Mai mult, cercetătorii au stabilit că culturile bacteriene prosperă de obicei până la
sfârșitul fermentației, când greutatea specifică (SG) este mică (sub 1.000. La sfârșitul
fermentației există substanțe nutritive limitate care trebuie metabolizate, acestea fiind de obicei
derivate din autoliza celulelor moarte de drojdie. În mod tradițional, a fost înțeles de distilatori și
confirmat de cercetări că, dacă faza de creștere bacteriană ar avea loc prea devreme în
fermentație, aceasta ar fi în detrimentul producției de etanol și, prin urmare, a randamentului
final al distilatului. Durata fermentațiilor efectuate de mai mulți distilatori este adesea legată, în
special în materialele de comercializare, cu caracterul fructat, ester și ceros în spiritul nou-creat.
Acest concept este susținut în mod vag de literatură și susține că bacteriile pot crește conținutul
de esteri ai distilatului. Influența specifică a speciilor bacteriene este dificil de dovedit atât în
laborator (din cauza lipsei microflorei indigene), cât și la scară industrială (datorită diferențelor
dintre producători). Prin deplasarea fermentației bacteriene înainte de lansarea S. cerevisiae se
poate determina impactul Lactobacillus asupra caracterului distilatului nou-creat.

Datorită intensificării procesului, înlocuirea spălătorilor din lemn cu vase din oțel
inoxidabil și a practicilor de curățare mai robuste în multe distilerii de whisky în scopul
controlului produsului, creșterea bacteriană și impactul ulterior asupra calității băuturilor
spirtoase noi pot fi limitate. Legăturile dintre materialul de spălare și calitatea distilatului sunt
adesea făcute, deși lipsesc dovezi științifice, s-au postulat legături între spălările din lemn și
conținutul mai ridicat de esteri fructiferi datorită prevalenței bacteriilor în spălăturile din lemn
mai poroase.

Tulpinile microflorei de distilerie, care supraviețuiesc condițiilor de fermentare, pot fi

clasificate ca homofermentare (Lactococcus, Pediococcus și Streptococcus), heterofermentare
(Leuconostoc și Lactobacillus).Speciile homofermentative utilizează calea glicolitică (sau
Embden – Meyerhof – Parnas) și produc 2 mol acid lactic din 1 mol glucoză. Tulpinile de
heterofermentare facultative pot metaboliza glucoza prin calea 6- fosfogluconat / fosfocetolază
(6-PG / PK) care produc fie 2 moli de acid lactic, fie 1 moli etanol și dioxid de carbon per moli
de glucoză, în funcție de condițiile predominante.

S-a demonstrat că alte căi metabolice ale Lactobacillus formează acid succinic din acidul
lactic sau citric și joacă, de asemenea, un rol în decarboxilarea acizilor cinamici, toate acestea
putând influența caracterul distiatului nou.

Producerea subproduselor metabolice, în special a acizilor organici, ar putea avea un

impact substanțial asupra aromelor și caracteristicilor aromelor spălării distilate. Datorită
prezenței alcoolilor precum etanolul și a alcoolilor superiori (butanol, alcool izoamilic) și a
condițiilor de pH scăzut, reacțiile de condensare dintre acești alcooli și acizi pot duce la
esterificare (ecuația (1)). Acest efect a fost demonstrat în experimente de laborator.

ROH + ROOH ROOR + H2O

Ecuația 1 - Reacție de condensare generalizată pentru producția de esteri în condiții acide.

Mai mult, s-a demonstrat că volatilitatea esterilor se aliniază bine cu profilul de distilare
al etanolului, atât în sistemele experimentale, cât și în cele modelate, crescând probabilitatea ca
acești compuși să aibă un impact asupra aromelor în tăierea spirtoasă a unei distilări.

Esterii au de obicei o presiune de vapori mai mică decât alcoolii și acizii lor
corespunzători și, prin urmare, aceste produse vor fi mai ușor distilate, conducând astfel
echilibrul acestei reacții spre dreapta prin principiul lui Le Chatelier. Esterii au un impact mare
asupra calității distilatelor noi fabricate datorită volatilității lor scăzute și a pragurilor de aromă
scăzute care contribuie la arome fructate, uneori florale, pentru distilatul nou creat. Astfel, o
înțelegere a producției unor astfel de congeneri ar putea duce la o mai bună înțelegere a modului
în care comportamentul speciilor de bacterii dintr-o distilerie de whisky de malț afectează
caracterul distilatului nou-creat.

Acizii organici pot fi, de asemenea, produși din ciclul acidului tricarboxilic (TCA). De
obicei, acest lucru apare devreme prin acțiunea drojdiei în timpul fazei de întârziere a
fermentației. S-au studiat modificările conținutului organic al orezului și al berii pe bază de orz
malțiat, arătând că acizii acetic, lactic și succinic cresc în mare măsură în timpul fermentației. În
general, eliberarea acizilor organici are loc numai atunci când ciclul TCA nu este finalizat și,
prin urmare, ar putea servi și ca indicator al creșterii slabe a celulelor sau a stresului crescut de
drojdie. Conținutul de acid organic al berilor a fost studiat și a arătat că nivelurile de acizi acetic,
lactic și succinic cresc în timpul fermentației cu acizi malici și fumarici rămânând stabili, totuși,
există informații limitate cu privire la acizii organici formați în timpul fermentațiilor de whisky
de malț.
 După cum este detaliat în următoarea secțiune a acestei lucrări, a fost dezvoltată o metodă
de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) pentru a investiga concentrația de acizi
organici în mustul de fermentare. Inițial, o tulpină comercială de Lactobacillus plantarum a fost
inoculată în sunătoare. După trei tratamente bacteriene, un control (CP), în care nu a avut loc
niciun tratament bacterian, un tratament „steril” (SS) în care bac teria a fost aruncată în must fiert
și un tratament „nesteril” (US) unde bacteriile au fost aruncate în must nefiert. O tulpină de
distilare disponibilă din punct de vedere comercial a Saccharomyces cerevisiae a fost apoi
aruncată în must. Datele de fermentație au fost colectate și modelate folosind o ecuație logistică
cu 4 parametri pentru a determina orice diferențe în profilurile de fermentație. Spălarea
fermentată a fost apoi distilată mai întâi pentru a produce vinuri scăzute și apoi pentru a produce
un distilat nou, care a fost supus analizei chimice și senzoriale.

2.Materiale și metode

Toate citirile de greutate specifică au fost măsurate prin filtrarea și degazarea probei
urmată de măsurare utilizând un Anton-Paar DMA 35 (Anton-Paar, St Albans, GBR). PH-ul a
fost înregistrat folosind un contor VWR pH110 (VWR, Lutterworth, GBR) și toate probele de
fermentație (alicote de pre-distilare) au fost înghețate înainte de analiză.

2.1.Plan experimental

O schiță a procedurii experimentale este prezentată în Fig. 1.

Figura 1. Schiță experimentală, care arată cele trei regimuri de producere a spiritelor folosite.
Toate tratamentele de spălare au fost supuse acelorași procedee experimentale pentru a produce
vinuri cu conținut scăzut și un nou distilat. (NMS).

2.2.Producția de must

Mustul (200 L) cu greutate specifică 1.066 a fost făcut piure folosind distilatoare de 55 kg
malțite orz Concerto (Simpsons Malt, Berwick-upon-Tweed, GBR) în fabrica pilot International
Center for Brewing and Distilling (ICBD) folosind o moară cu două role ( Fraser Agricultural,
Inverurie, GBR). Boabele s-au măcinat și apoi s-au amestecat cu 150 L de apă la 64 ° C timp de
1 oră înainte de separare folosind un tun lauter. Stratul de cereale a fost apoi stropit continuu cu
81 ° C apă pentru a obține volumul și gravitația dorite. Mustul produs a fost congelat în alicote
de 20 L pentru utilizare ulterioară. Tot mustul a fost decongelat înainte de utilizare.

2.3.Tratamentul mustului

Două tipuri de must tratat au fost produse în triplicat - un must „acru steril” (SS), produs
prin fierberea amestecului timp de 45 de minute și sifonat într-un vas de fermentare pentru a
elimina orice pauză fierbinte formată. Un must „acru nesteril” (US) care nu a fost fiert înainte de
a arunca bacteriile. Cultura bacteriană a fost o tulpină congelată uscată comercială de
Lactobacillus plantarum (Lallemand Inc., Felixstowe, GBR). Bacteriile au fost aruncate conform
instrucțiunilor producătorului la o rată de 1 g hL-1 și mustul a fost acidulat timp de 48 de ore la
35 ° C. Mustul de control utilizat (CP) a fost tratat fără bacterii și nu a fost fiert înainte de
utilizare.

2.4.Fermentaţia

O tulpină disponibilă comercial din drojdia uscată Saccharomyces cerevisiae a fost

introdusă direct în controlul netratat („control pitch”, CP) și în două musturi tratate (adică un
steril (US) și sterile (SS). Toate fermentațiile au fost înclinate cu drojdie la o rată de 1 g L-1
(aproximativ 2 x 107 celule mL − 1). Drojdia a fost înclinată direct în must la 20 ° C și a fost
lăsată să fermenteze 96 ore Această temperatură a inhibat fermentația bacteriană suplimentară și
a încurajat dominarea S. cerevisiae. Spălarea fermentată a fost filtrată și analizată folosind un
Anton-Paar DMA 4500 cuplat la un modul Alcolyzer ME (Anton-Paar, St Albans, GBR) pentru
a determina gravitația finală. și alcool în volum (% v / v etanol).

2.5.Distilarea

Spălarea fermentată a fost distilată pe distileria pilot ICBD. Pe parcursul tuturor

perioadelor de distilare, s-a înregistrat% v / v etanol al distilatului pentru a se asigura realizarea
unor profile consistente pentru a evita alterarea aromelor. Fertilele au fost încărcate cu 20 L (sau
18 L cu must fiert SS). Spălarea a fost încălzită folosind o bobină de abur și s-a obținut o
scurgere constantă de vinuri scăzute. Distilarea la spălare a fost oprită când nivelul de etanol al
distilatului a atins 1% v / v (un punct de reducere economic).

Distilarea spirtoasă a fost efectuată în albi al-Ambiq de cupru de 5 litri (AlAmbiq,

Gandra, PRT) folosind un condensator în formă de cadă cu vierme și încălzită cu un izomant de
5 litri (electrotermic, Staffordshire, GBR) la o temperatură constantă. La începutul acestei a doua
distilări s-au colectat previzualizări (50 ml) și apoi s-a colectat tăierea spirtoasă, permițând ca% v
/ v etanol al distilatului să scadă cu 12% înainte de a opri colectarea noului distilat.

2.6.Produse chimice

Toate substanțele chimice au fost furnizate la puritate ≥98% (Sigma-Aldrich, Dorset,

GBR). Eluantul HPLC a fost produs folosind apă distilată care a fost în continuare purificată și
degazată prin filtrare sub vid (0,45 um).

2.7.Analiza acizilor organici

Metodele au fost adaptate pentru analiza mustului și a spălării din cele găsite în literatură.
Acizii organici au fost analizați utilizând o cromatogramă Shimadzu LC-20AD echipată cu
autosamplator SIL-20A HT și un cuptor CTO-10AS pe coloană cuplat la un detector de matrice
de diode SPD-M20A. Două coloane Phenomenex Kinetex® (Phenomenx, Macclesfield, GBR)
150 × 4,6 mm coloane C18 au fost utilizate ca fază staționară și o soluție H3PO4 (5 mM, pH 2,1)
a fost utilizată ca fază mobilă. Un debit de 0,65 ml min-1 a fost atins cu o temperatură a
cuptorului pe coloană de 60 ° C. S-a injectat o probă de 10 μL și timpul de rulare a fost de 30
min. Toți compușii au fost detectați la o lungime de undă de 210 nm.

S-au folosit ca standarde externe acidul formic, malic, lactic, acetic, fumaric și succinic.
Acidul galic (10 g L − 1) a fost utilizat ca standard intern prin adăugarea a 10 μL la 1 ml de
probă, dând o concentrație de lucru de 100 mg L − 1 și a fost nedetectabil în probe reprezentative
de must și spălare. Cu toate acestea, compusul poate fi găsit în cantități mici (mult sub limita de
detectare a instrumentelor) în bere, posibil datorită adăugării de stabilizatori care ajută la
precipitarea polifenolilor și proteinelor. Standardele au fost realizate în intervale specifice
concentrației lor tipice găsite în must și spălare și au reflectat cantitatea găsită în probele de bere
pe baza rapoartelor de evaluare inter pares. Toate curbele standard au avut un coeficient de
determinare (r2) ≥ 0,999 și repetabilitate în must, spălare și bere cu abatere standard relativă
<10%.

Probele au fost centrifugate la 4500 rpm timp de 15 min și 1 ml de mediu centrifugat a

fost transferat într-un flacon de probă conținând 100 μL de acid intern galic standard.

2.8.Analiza GC-FID

Alcoolii superiori au fost analizați folosind un Agilent 7820 A care funcționează în

modul de injectare a lichidului (Agilent, California, SUA). Separarea a fost realizată folosind o
coloană Agilent DB-WAX 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm. Cuptorul a început la 35 ° C cu o
reținere de 6 minute, temperatura a fost crescută până la 60 ° C cu o rată de 5 ° C min-1 cu o
reținere de 2 minute urmată de o rampă la 210 ° C cu o viteză de 20 ° C min − 1 și o rampă finală
la 250 ° C la o rată de 70 ° C min − 1 cu o reținere de 1 min. Compușii au fost detectați folosind
un detector FID la 270 ° C.

O alicotă de probă de 1 ml a fost adăugată într-un flacon, urmată de 100 pl de pentan-1-ol

pentru a da o concentrație finală în flacon de 500 mg L-1. Din acest flacon, 1 uL a fost injectat pe
coloana GC. Congenenții analizați au fost acetaldehidă, acetat de etil, acetal, metanol, n-
propanol, izobutanol, acetat de isoamil, n-butanol, alcool izoamilic și furfural. Intervalele de
calibrare au fost cuprinse între 5 - 1250 mg L-1, cu excepția alcoolului izoamilic care a fost
măsurat într-un interval de 10-2500 mg L-1. Toate calibrările au avut r2> 0,99.

2.9.Analiza GC – MS

Analiza esterului a fost efectuată pe un Shimdadzu QP2010 Ultra GC / MS cu

autosampler AOC 5000 (Shimdazu, Tokyo, JPN) utilizând o fibră de microextracție în fază
solidă (SPME) PDMS / DVB de 65 μm. O probă (1 ml) a fost adăugată într-un balon de spațiu și
amestecat cu apă distilată (5 ml). Heptanoat de metil (10 μL, 25 mg L-1) a fost utilizat ca
standard intern. Proba a fost incubată timp de 5 minute, urmată de 5 minute de adsorbție a
analitului prin expunerea fibrei la spațiul principal al flaconului probei. Proba a fost apoi
desorbită pe o coloană GC timp de 1 min la 200 ° C.

Separarea a fost realizată pe o coloană DB-WAX 30 m × 0,25 mm × 0,25 μm programul

cuptorului a funcționat 40 ° C timp de 3 minute, urmat de o rampă inițială la 100 ° C la 10 ° C
min− 1 și a doua rampă la 160 ° C la 4 ° C min - 1. Rampa finală a ridicat temperatura cuptorului
la 220 ° C la o rată de 10 ° C min-1 și a fost menținută timp de 10 min. Spectrometrul de masă a
fost operat atât în modul SIM, cât și în modul SCAN. Ionii SIM utilizează au fost m / z 45, 55,
74, 88, 101, 104, 129. Modul SCAN a variat de la m / z 42 – 400.
Figura 2. A. (stânga) Tendința greutății specifice în timpul fermentației modelată de funcția
logistică cu 4 parametri (coeficienți în 2 suplimentar). B (Dreapta) Tendința pH-ului în timpul
fermentației.

2.10.Analiza senzorială

Un panou neantrenat (n = 12) a fost folosit pentru a evalua aspectele olfactive ale
probelor spirtoase produse. Toate probele au fost prezentate oarb în fața grupurilor de comisie
după diluarea la 20% v / v etanol.

A fost utilizat un test triunghiular pentru a determina dacă a existat o diferență statistică
semnificativă între spiritele produse. Trei seturi diferite constând din diverse combinații de probe
de spirit nou-fabricate au fost prezentate membrilor comisiei. Fiecare set conținea două spirite -
două din același eșantion de marcă nouă și unul diferit. Candidaților li sa cerut să aleagă
eșantionul pe care îl consideră diferit. Testul a fost efectuat conform indicațiilor din BS EN ISO
4120 (British Standard, 2004). Din rezultate, intervalul de încredere statistică a fost determinat
pentru a demonstra că o diferență între probe ar putea fi determinată de către panou.

Testarea panoului consumatorului a fost apoi efectuată folosind aceiași analiști senzoriali.
Zece caracteristici senzoriale au fost selectate folosind roata de aromă a whisky-ului scotch
revizuit care a fost considerată adecvată pentru spiritul noului brand și a fost recunoscută de
Scotch Whisky Research Institute atât pentru testarea instruită a panoului, cât și pentru testele
consumatorilor (Lee și colab., 2001). Doadilor li s-a cerut să clasifice fiecare componentă
aromatică pe o scară de la 0 la 5, unde 0 nu a fost detectat și 5 a fost puternic detectabil. În cele
din urmă, candidaților li s-au prezentat trei mostre anonime și li s-a cerut să își clasifice
preferința.
 2.11.Analiza datelor

Pentru a îmbunătăți înțelegerea fermentațiilor produse, greutatea specifică (SG) a fost

modelată în RStudio (RStudio, Boston, SUA) folosind ecuația logistică cu 4 parametri (ecuația
(2)), deoarece s-a demonstrat că modelează eficient fermentațiile în bere pentru a preveni
flocularea prematură a drojdiei (ASBC, 2012; MacIntosh, 2015; MacIntosh, Adler, Eck și
Speers, 2012; MacIntosh, Josey și Speers, 2016; Speers, Rogers și Smith, 2003).

Pi−P e
P( t )=P e +
1+ exp ⁡(−B ( t−M ))

Ecuația 2 - Ecuațiile logistice cu 4 parametri folosite pentru modelarea declinului de

greutate specifică în timpul fermentării

Unde: P (t) este greutatea specifică la un moment dat t,

Pi este gravitația asimptotică inițială,

Pe este gravitația asimptotică finală (FG),

B este o funcție a gradientului la punctul de inflexiune,

M este punctul de inflexiune în raport cu timpul.

Analiza datelor a fost efectuată în Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, SUA) și
OriginPro (Originlab, MA, SUA). Toate semnificațiile testate au fost efectuate în RStudio
(RStudio, Boston, MA, SUA, 2019) cu semnificația determinată la intervalul de încredere de
95%.

3.Rezultate si discutii

3.1.Date de fermentare

Profilurile de fermentație sunt prezentate în Fig. 2, iar coeficienții funcțiilor logistice

aplicate (suplimentar 2) demonstrează că fiecare fermentație a urmat un model sigmoidal
consistent. Fermentarea mustului nesteril pare să aibă o fază de întârziere scurtată, cu un efect
foarte mic observat în ceea ce privește modificarea greutății specifice la înclinarea S. cerevisiae,
cu toate acestea, rata generală a fazei exponențiale a fost cea mai mică (B = 0,049 ± 0,005 ).
Ambele musturi tratate nu s-au atenuat complet (Fig. 2a), spălarea tratată steril fermentând 84,4
± 2,0% din greutate (carbohidrați), comparativ cu mustul controlat și fermentarea tratată nesterilă
la 94,4 ± 2,3% din martor must. O parte din această pierdere va fi prin formarea de biomasă și
consumul de carbohidrați de către populația bacteriană care era de așteptat.
 Utilizarea limitată a tuturor nutrienților din must este probabil ca urmare a condițiilor
predominante la sfârșitul fermentației. PH-ul final mediu măsurat în SS și US a fost de 3,35 ±
0,22 și respectiv 3,34 ± 0,13. Este obișnuit ca tulpinile de drojdie de distilerie să aibă o toleranță
a pH-ului până la cca. 3.5 și astfel este probabil ca limita de pH a drojdiei să fi fost atinsă. Deși
tratamentul a adus pH-ul sub această valoare pentru o mare parte din fermentație, este probabil
ca o pierdere a viabilității celulare, cauzată de combinația de niveluri crescute de alcool și pH
scăzut, să facă drojdia să înceteze activitatea. Concentrații mai mari de etanol vor crește
reintrarea protonilor în membrana celulară, reducând pH-ul din citoplasmă și inhibând funcția
membranei. S-a raportat că S. cerevisiae are diverse mecanisme de adaptare la stresul acid acid,
cu toate acestea, este probabil ca acumularea unor astfel de acizi să depășească toleranța acestei
tulpini. O scădere a viabilității drojdiei este frecvent observată și se poate datora, de asemenea,
creșterii numărului de bacterii spre sfârșitul fermentației, cum ar fi Lactobacillus delbreuckii și
Lactobacillus paracasei.
Figura 3. Concentrațiile măsurate de acizi organici înainte de tratament (pre acru), în must
(începe fermentarea) și se spală. Acizii organici analizați au fost A) malic, B) lactic, C) acetic, D)
succinic și E) fumaric. Barele de eroare indică abaterea standard pe n = 3 eșantioane.

Prezența bacteriilor va reduce, de asemenea, oportunitatea creșterii celulelor de drojdie la

începutul fermentării prin consumul atât de O2 dizolvat, cât și de substanțe nutritive din must
înainte de adăugarea drojdiei. Pe măsură ce drojdia uscată a fost utilizată, impactul epuizării
nutrienților va fi mai mic, totuși, deoarece drojdia va avea viabilitate redusă în forma sa uscată,
aceasta poate avea o creștere a celulei redusă după aruncare. S-a arătat anterior că formatul
drojdiei are un impact asupra capacității drojdiilor de a face față condițiilor stresante. Acest lucru
va crește probabilitatea de fermentații blocate care nu se atenuează complet. S-a dovedit că
bacteriile (în special L. plantarum) măresc cantitatea de floculare care apare în primele etape ale
fermentației, când atât bacteriile cât și drojdia sunt asezate împreună în condiții de laborator.

Tabelul 1

Nivelurile de acid lactic, acetic și succinic în must și post tratament cu Lactobacillus și

diferențele în probele SS și, respectiv, din US.

Tratament Acid Concentrație medie mg/L-1 % Diferența în

Must Sfarșitul concentrație
tratamentului
SS Lactic 4039 10,031 248
Acetic 425 2150 505
Succinic 1050 4621 440
US Lactic 3507 10,163 290
Acetic 434 2325 536
Succinic 1127 5033 446
 Fermentările cu un pH scăzut pot fi limitate în continuare din cauza scăderii activității
enzimatice. S-a demonstrat că enzimele continuă să descompună zaharurile complexe din must
pe parcursul fermentării în fermentațiile de whisky.În eșantionul steril (SS), enzimele de piure
vor fi fost complet denaturate în etapa de fierbere. În timp ce, din fermentația aceră nesterilă
(US), modificarea pH-ului în timpul fermentației (Fig. 2b) poate avea ca rezultat inactivarea
enzimelor de degradare a dextrinei, încetând zahărul din mustul descompus, rezultând greutatea
finală observată.

3.2.Date analitice – fermentare

Profilul acidului organic atât în timpul tratamentului cât și al fermentației este consecvent
între loturile similare de must (suplimentar 3). Diferențe mari, în special în timpul tratamentului,
arată că nivelurile de acizi lactici, acetici și succinici cresc în concentrație de până la cinci ori
(Fig. 3, Tabelul 1). Acidul acetic a avut cea mai mare creștere procentuală atât în mustul steril,
cât și în cel nesteril, dar acidul lactic a avut cea mai mare concentrație finală a acizilor măsurați
(Fig. 3). Aceste concentrații de acizi organici sunt apoi transportate mai departe în fermentația
ulterioară cu S. cerevisiae, cu toate acestea, nivelurile de acetic s-au dovedit a fi reduse la
începutul fermentației cu drojdie, în special cele din eșantionul US - unde o picătură de
aproximativ 1000 S-a observat mg L-1 în primele 24 de ore de fermentare (suplimentar 3). S.
cerevisiae are capacitatea de a metaboliza acidul acetic și s-a demonstrat că face acest lucru în
vinul de litchi, în special la 20 ° C. Acidul acetic poate fi preluat de celulă, reacționând cu acetil-
CoA unde ar putea forma metaboliți secundari, contribuind la caracterul distilatului, cum ar fi
alcooli superiori, esteri, acizi grași și alte lipide. Tendința acizilor organici pe parcursul
tratamentului și fermentației a arătat că acidul acetic scade rapid în primele 40 de ore de
fermentație, când drojdia produce etanol și alți alcooli superiori care ar putea reacționa cu acidul
acetic, susținând în continuare această postulare. S-a observat că nivelurile de acid acetic cresc
până la sfârșitul fermentației SS (după 30 de ore), totuși, se sugerează că acest lucru se datorează
autolizei drojdiei și secreției de compuși celulari și acizi organici în must.

Nivelul atât al acidului lactic, cât și al acidului succinic este în mod constant mai ridicat
în fermentația SS datorită unei faze de întârziere reduse în fermentația bacteriană, rezultat al
fierberii mustului. Mustul fiert va avea, de asemenea, o reducere semnificativă a bacteriilor
concurente (cu siguranță majoritatea, dacă nu toate bacteriile vegetative vor fi eliminate) și, prin
urmare, L. plantarum înclinat poate fi de așteptat să domine această fază de fermentare.

3.3.Date despre distilare

 Spălarea fermentată a fost apoi distilată de două ori, prima distilare într-un hibrid (cupru
și sticlă) încă pentru a produce vinuri scăzute și apoi distilată într-o oală de cupru încă pentru a
produce un nou distilat.

Vinurile scăzute au demonstrat o scădere semnificativă (p <0,05) a litrilor de alcool pur

(LPA) între probele martor și cele tratate, variind de la 1,79 LPA (martor) la 1,46 LPA în mustul
US. Acest lucru demonstrează că, în timpul fermentației, a fost produs mai puțin alcool din toate
probele de must de teanc cu bacterii, în principal din cauza lipsei de zaharuri fermentabile. Acest
lucru sugerează că s-a realizat o rectificare adecvată la toate probele de distilare, cu toate acestea,
s-a observat o reducere a randamentului spirtoase (LPA per kg de malț) din fermentațiile folosind
tratate (SS și US). Acest rezultat nu a fost neașteptat, deoarece consumul de zahăr de către
bacterii va duce la o reducere a alcoolului pe moleculă de zahăr consumat.

Analiza chimică a spălării distilate (vinuri scăzute) a arătat o creștere a concentrației de

acetat de etil, semnificativ (p <0,05) în eșantionul US, comparativ cu martorul (103 ± 23 mg L −
1 și 63 ± 13 mg L − 1 ), cu o creștere a probei de SS observată, de asemenea (79 ± 22 mg L − 1).
Mai mult, alcoolii superiori propanol, izobutanol și alcool izoamilic au fost detectați la
concentrații mai scăzute în probele de vinuri cu conținut scăzut de aciditate decât în martor.
Analiza chimică de la a doua distilare (Fig. 4) a constatat că niveluri scăzute de butanol au fost
detectate numai în proba martor la concentrații medii de 35,8 mg L − 1 și 28,4 mg L − 1 în
previziuni și, respectiv, tăieturi spirtoase. Propanolul a fost detectat la o concentrație de 124,1 mg
L − 1 în proba de băuturi alcoolice din US (Fig. 4).

În ambele regimuri de fermentație acidulată, nivelurile de acetaldehidă și acetat de etil au

fost îmbunătățite substanțial în comparație cu cele ale probei martor. Acetaldehida, asociată cu o
aromă eterică nu este percepută, în general, ca un atribut pozitiv distilatului nou-creat. Nivelurile
crescute de acetat de etil în ambele probe acre sunt prezentate ar putea fi rezultatul acidului
acetic produs inițial (de Lactobacillus) care ulterior este metabolizat de drojdie sau se poate
forma prin esterificare în timpul uneia dintre etapele de distilare. De obicei, esterii acetatului
conferă note fructate în distilatul nou.

Reducerea observată la alcoolii superiori poate sugera că acizii organici produși în timpul
tratamentului de acidificare elimină acești alcooli superiori sub formă de esteri, îndepărtând
astfel de analiți din probele produse. Prin schimbarea condițiilor în timpul fermentației, se
sugerează că calea metabolică a drojdiei sa schimbat și acest lucru a condus la o reducere a
alcoolilor superiori formați în timpul fermentațiilor tratate. Mai mult, nivelurile reduse de
aminoacizi (în principal datorită metabolismului de către bacterii) prezente în must pot fi
influențat cantitatea de ceto-acizi produși în celula de drojdie. Acest lucru ar inhiba formarea
aldehidei, făcând astfel producerea mai mică a produsului redus corespunzător. Acest lucru ar fi
avut o influență pozitivă asupra aromei distilatului.
 Analiza esterului de urmărire a fracției tăiate principal a fost, de asemenea, efectuată
utilizând SPME-GC / MS. Din rezultatele GC / MS, nivelurile tuturor esterilor etilici - excluzând
lactatul de etil și dodecanoatul de etil - au fost mai mari la control în comparație cu ambele probe
acide (suplimentar 10).

Această discrepanță este oarecum în dezacord cu literatura de specialitate pe acest

subiect, cu toate acestea, există mai multe aspecte ale structurii experimentale care ar putea
explica diferența. Prin acțiunea de pre-acidificare a mustului înainte de fermentarea cu drojdie,
drojdia va produce ambii mai puțină biomasă din cauza lipsei de nutrienți disponibili și, de
asemenea, din cauza mediului stresant prezent de la niveluri ridicate de acizi organici. Astfel,
nivelurile de esteri ai acizilor grași precum octanoatul de etil și decanoatul de etil - derivați din
subprodusele sintezei lipidelor și alcoolilor vor fi reduse în distilatul final. Nivelurile de etanol
sunt, de asemenea, mai mari în eșantionul de control, deși este puțin probabil ca acest lucru să
aibă un impact atât de mare pe măsură ce etanolul este solventul cel mai abundent din toate
probele.

Nivelurile de lactat de etil au fost semnificativ mai mari (p <0,05) în probele tratate
datorită esterificării acidului lactic produs cu etanol cu niveluri în martor, probele SS și US fiind
de 3, 20 și respectiv 21 µg L − 1. În mod similar, sa demonstrat că acetat de feniletil prezintă
concentrații semnificativ mai mari (p <0,05), prin reacții similare cu alcoolul feniletilic, acest
ester conferă spiritului caracterul dulce, floral și fructat (Burdock, 2016). Lactatul de etil conferă
o aromă de ceară, cu toate acestea, nu s-a văzut că are un impact semnificativ asupra calității
distilatului nou-creat.

Figura 5. Diagrama păianjen care prezintă rezultatul mediu din QDA a eșantioanelor de distilate
produse noi, candidații au clasat fiecare componentă 0-5 pe o scară arbitrară, n = 12.
 Mustul fiert va avea un nivel redus de proteine și alți nutrienți ai mustului datorită
îndepărtării lor în timpul formării pauzei fierbinți (proteine precipitate și alte materiale). Studiile
au arătat că nivelurile reduse ale acestor constituenți de must cresc nivelul de esteri și
promovează calitatea spiritului ulterior. Mai mult, producția de esteri și alți metaboliți derivați
din drojdie va fi redusă în probele tratate datorită reducerii zahărului fermentabil în comparație
cu proba martor. Astfel, este de așteptat scăderea multor niveluri de esteri. Fierbând mustul,
zaharurile din must devin mai concentrate și gravitația (adică densitatea) crește. Măsurătorile
gravitaționale în eșantionul SS la sfârșitul tratamentului - t = 0 (Fig. 2a) - sunt mai asemănătoare
cu gravitatea inițială a fermentației de control. Ca rezultat, profilul ester al controlului și al
probei SS sunt distribuite în mod similar.

3.4.Date senzoriale

Fig. 5 prezintă rezultatele medii ale analizei descriptive cantitative (QDA) efectuate de
același grup.

Rezultatele senzoriale au arătat că toate cele trei spirite au prezentat dovezi ușoare ale
diferențelor aparente între probe atunci când au fost evaluate de BS EN ISO 4120 (CI ≥ 90%,
suplimentar 11). Mai mult, s-au observat dovezi ale unei diferențe aparente moderate între proba
martor și SS. Se postulează că o echipă senzorială a distilatului antrenat este probabil să fi produs
rezultate cu un interval de încredere mai mare, deoarece panourile aleatorii și neinstruite s-au
dovedit a fi lipsite de consistență.

Alte dovezi ale diferențelor de spirit sunt prezentate de analiza descriptivă cantitativă
(Fig. 5). Panoul a detectat mai multe arome fructate, florale și dulci din ambele probe - atribute
asociate în general cu caracter pozitiv al spiritului - cu ambele probe acidulate.

De obicei, membrii grupului au clasat eșantionul SS mai mare în aceste categorii, comparativ cu
distilatul din US. Studiile care au implicat L. plantarum au arătat anterior că atât notele fructate,
cât și florale au fost îmbunătățite în distilatul nou-creat cu includerea acestei specii în timpul
fermentației.

În urma testării senzoriale, 67% dintre membrii comisiei au preferat proba sterilă, alți
25% alegând proba acră nesterilă și un comisar (8%) alegând proba de control. Deși testul de
preferință este subiectiv, deoarece nu s-a dat nicio instrucțiune pe ce să își bazeze opinia, acesta
demonstrează că preferința sa corelat cu atributele pozitive menționate.
4.Concluzie

Prin utilizarea unei etape de tratament pre-fermentare pentru a scădea pH-ul (acrarea),
utilizând o tulpină comercială de L. plantarum, a fost influențat profilul acidului organic al unei
spălături tipice de distilare de whisky scoțian. Specia bacteriană a produs acizi lactici, acetici și
succinici ale căror concentrații au rămas ridicate prin fermentarea ulterioară folosind o tulpină
cunoscută de S. cerevisiae. S-a redus semnificativ pH-ul mediilor de fermentare și astfel,
fermentabilitatea mustului a fost redusă. Deși randamentele de alcool sunt semnificativ mai mici
în probele acide, ar putea fi utilizată o perioadă mai scurtă de acriere sau un timp mai devreme de
lansare a drojdiei, care are potențialul de a reduce pH-ul final și de a permite drojdia să rămână
viabilă și activă până la finalizarea fermentației.

Distilatul probelor acidulate a prezentat niveluri mai ridicate de esteri de acetat, în special
acetat de etil și acetat de feniletil. Lactatul de etil - produs prin reacția etanolului și acidului lactic
- a fost, de asemenea, detectat la concentrații ridicate în distilatele tratate, prezentând că acizii
organici produși de speciile bacteriene pot crește concentrația esterului în distilat. Nivelurile de
alcooli superiori au fost, de asemenea, reduse comparativ cu un control fără acid.

Un grup senzorial a stabilit că cele trei regimuri utilizate au dat spirit care a fost statistic
diferit prin utilizarea unui test triunghiular. Probele acidulate au produs spiritul unei caracteristici
dulci, florale și fructate.

Acizii organici produși în timpul fermentării pot limita producția de astfel de esteri în
timpul distilării. Prin încorporarea tulpinilor de drojdie sau bacteriene sau a condițiilor de
fermentare care încurajează producerea unor astfel de acizi (cum ar fi aceticul) se poate produce
distilat de o calitate care este percepută ca având note fructate și dulci crescute. Este probabil că
contribuția senzorială pe care o are bacteriile asupra spiritului nou creat este unul dintre efectele
primare prin metabolism și, de asemenea, efecte secundare asupra fermentării drojdiei.

Deși fișierul tehnic al whisky-ului scotch (DEFRA, 2013) nu permite adăugarea specifică
a speciilor bacteriene să se amestece direct, acest proces poate fi utilizat pe alte piețe în care nu
se aplică astfel de restricții (CAN, IND, JPN sau SUA), oferind astfel o îmbunătățire control
asupra bacteriilor care le pot inocula producția de whisky de malț. Mai mult, drojdiile
producătoare de acid organic devin din ce în ce mai populare în rândul fabricanților de bere
artizanală, ca alternativă la bacteriile standard de fierbere a fierbătorului. Întrucât reglementările
referitoare la whisky-ul Scotch nu specifică ce tulpină de drojdie trebuie utilizată pentru a
produce whisky, această lucrare arată că tulpinile de drojdie cu capacitatea de a produce acizi
organici pot fi benefice pentru calitatea de whisky a noului distilat.