Cuvnt nainte

Imunologia este unul dintre domeniile cele mai dinamice ale tiinelor biologice. Funcia imunitar este esenial pentru organismul uman i animal i de aceea, disfunciile imunitare severe sunt incompatibile cu supravieuirea. Pe de alt parte, activarea neadecvat a funciei imunitare are drept consecin iniierea sau progresia strilor patologice de hipersensibilitate i a maladiilor autoimune, ceea ce a amplificat interesul pentru studiul Imunologiei. Aceast lucrare este intitulat Imunologie i Imunochimie, pentru c accentueaz n mod deosebit, studiul reactanilor fundamentali ai imunitii: antigene i anticorpi. Lucrarea prezint ntr-o form didactic, foarte accesibil, mecanismele moleculare ale reactivitii imunitare n diferitele sale ipostaze: rspunsul imun fa de antigene moleculare, antigene de natur infecioas, autoantigene, antigene tumorale sau antigene de transplantare. Coninutul acestei lucrri este rezultatul cutrilor de-a lungul mai multor ani i a ncercrii de a prezenta ntr-o form concis, coerent i unitar, problematica major a Imunologiei, n contextul dovezilor tot mai numeroase i mai convingtoare, c funcia imunitar are nu numai rolul clasic de aprare antiinfecioas, ci este ntr-o continu expansiune a implicrii sale, att n meninerea homeostaziei chimice a organismului, ct i n numeroase stri patologice. Imunologie i Imunochimie este titlul unei lucrri care i-a propus ca deziderat, s consolideze un mod de gndire i de nelegere a funciei de aprare ca o funcie biologic esenial, a crei activare are nu numai efecte benefice, dar uneori genereaz manifestri patologice, aa cum sunt reaciile de hipersensibilitate i conflictele imunitare care stau la baza progresiei maladiilor autoimune. n construcia lucrrii Imunologie i Imunochimie am pornit de la volumul Imunobiologie i de la captivantele cursuri inute, la nceputurile Imunologiei n Facultatea de Biologie a Universitii Bucureti, de Domnul Academician Profesor Doctor Docent G. ZARNEA, cruia i aduc un respectuos omagiu pentru generozitatea efortului constructiv al Domniei Sale, investit n dezvoltarea disciplinelor microbiologice. Lucrarea Imunologie i Imunochimie este materializarea eforturilor de actualizare i conectare ct mai trainic a domeniului, la realitile tiinifice ale momentului. Lucrarea se adreseaz tuturor studenilor i absolvenilor mai noi, dar mai ales celor vechi, ai facultilor de Biologie, Medicin uman i Medicin veterinar, precum i specialitilor ale cror preocupri profesionale, practice sau teoretice, interfer cu domeniul Imunologiei. in s mulumesc anticipat tuturor acelora care vor studia lucrarea Imunologie i Imunochimie i vor face observaii critice ntemeiate, de care voi ine seama ntr-o viitoare ediie a acestei cri.

Autorul

INTRODUCERE Imunologia studiaz, n primul rnd, funcia de aprare a organismului uman i animal, care face parte din categoria funciilor de relaie i este esenial pentru supravieuire. Sistemul imunitar este esenial pentru supravieuirea organismelor multicelulare, datorit agresiunii permanente a agenilor infecioi (microorganisme i virusuri). Omul adult poart pe suprafaa mucoaselor i a tegumentului, un numr uria de celule bacteriene (circa 1014), mai multe dect propriile celule, unele avnd potenialul de a iniia procese infecioase. Disfuncia sever congenital sau dobndit a funciei imunitare este incompatibil cu viaa. Termenul de imunitate are o provenien social: n Roma antic, persoanele scutite de impozite ctre stat, erau considerate imune. Sensul termenului s-a extins, ulterior desemnnd persoanele scutite de a suferi efectele infeciei cu ageni patogeni. Imunologia s-a nscut i s-a dezvoltat ca un domeniu al Microbiologiei, bazndu-se pe cunotiinele i conceptele Patologiei i Biochimiei. n sensul clasic, restrns al noiunii, Imunologia studiaz reactivitatea organismului animal i uman, consecutiv contactului cu agenii patogeni, mecanismele elaborrii rspunsului imun, precum i particularitile esuturilor, celulelor i moleculelor care condiioneaz starea de imunitate. In sens clasic, noiunea de imunitate definete starea de nereceptivitate sau de rezisten a organismului fa de un agent patogen infecios, n situaia n care sunt ndeplinite condiiile pentru apariia unei maladii infecioase. Din acest motiv, Imunologia s-a dezvoltat ca un domeniu al Microbiologiei. n concepia clasic, s-a considerat c activarea funciei imunitare are un efect exclusiv benefic, protector pentru organism. n concepia modern, funcia imunitar se definete ca o proprietate biologic esenial a organismului uman i animal, care const n capacitatea de a diferenia rapid i specific, substanele proprii de cele strine.

Sistemul imunitar este tolerant fa de substanele proprii, deoarece a nvat s le recunoasc n timpul vieii embrionare, dar este dotat cu proprietatea de a recunoate i de a diferenia prompt substanele strine, fa de care se activeaz i le ndeprteaz din organism. Tolerana imunitar este rezultatul unui proces de selecie a clonelor de limfocite, selecie ce are loc n perioada dezvoltrii embrionare a limfocitelor, ele fiind celulele efectoare ale rspunsului imun. Selecia const n eliminarea clonelor de limfocite potenial autoreactive (potenial reactive fa de moleculele proprii) Componentele chimice proprii organismului, pe care sistemul imunitar le tolereaz, sunt incluse n noiunea de self (self, englez = propriu), iar cele strine, care se abat de la structura chimic programat genetic a organismului, poart denumirea de substane nonself sau antigene. Astfel, funcia imunitar este o funcie biologic esenial, prin intermediul creia organismele difereniaz prompt i cu mare sensibilitate, componentele self de substanele nonself. Funcia imunitar are un rol determinant pentru pstrarea homeostaziei mediului intern i a individualitii chimice a fiecrui organism, prin faptul c sistemul imunitar recunoate i tolereaz moleculele proprii, dar se activeaz la contactul cu substanele strine care se abat de la programul biochimic tolerat. Dup ce nva s tolereze self-ul, chiar din perioada dezvoltrii embrionare, funcia imunitar realizeaz un permanent control de calitate a moleculelor self.

Aa cum aparatul genetic asigur stabilitatea i integritatea unei specii ca sistem biologic, sistemul imunitar asigur pstrarea homeostaziei biochimice a organismului. Funcia imunitar este mediat de molecule cu rol de receptori de pe suprafaa limfocitelor i de molecule solubile n umorile organismelor. Obiectul de studiu al Imunologiei s-a diversificat odat cu progresul general al tiinelor biologice i n special, odat cu aprofundarea cunoaterii funciei de aprare. ncepnd din anii 60, interesul tiinific pentru Imunologie a crescut considerabil din dou motive: 1) n primul rnd s-a demonstrat c funcia imunitar este esenial pentru organism, insuficiena sa mrind riscul infeciilor cu microorganisme patogene sau potenial patogene, iar disfuncia imunitar sever este incompatibil cu viaa. 2) S-a demonstrat c activarea funciei imunitare nu este totdeauna benefic pentru organism, ci uneori, stimularea ei determin leziuni tisulare severe, chiar ireversibile, asociate cu strile de hipersensibilitate sau iniiaz evoluia unor stri patologice grave, ca de exemplu, maladiile autoimune. Exemplul clasic este oferit de infecia cu Mycobacterium tuberculosis sau cu M. leprae. Leziunile tisulare, materializate n existena granuloamelor, se datoreaz chiar rspunsului imun, care este aa de amplu nct produce manifestrile patologice. Strile de hipersensibilitate definesc o stare de reactivitate imunitar crescut i se caracterizeaz prin aceea c, la primul contact cu o substan nonself, nu se produce un rspuns imun detectabil, ci organismul dobndete o stare special de sensibilizare imunitar fa de un antigen. La contactul secundar ulterior, chiar cu cantiti foarte mici ale antigenului sensibilizant, organismul

rspunde cu manifestri patologice de intensiti variabile, al cror rezultat final poate fi fatal. Aa se ntmpl n strile de hipersensibilitate (alergii) la polen, la diferite medicamente (de exemplu, penicilina), la veninul insectelor sau la diferite substane alimentare. Modificrile patologice consecutive alergiilor pot fi locale sau generalizate. Un domeniu vast, n continu expansiune, dar relativ recent al Imunologiei l constituie maladiile autoimune. In esen, maladiile autoimune semnific ntreruperea strii de toleran perfect pe care sistemul imunitar o manifest fa de componentele self. Datorit unor stri fiziologice legate de procese de mbtrnire, unor procese infecioase, datorit unor procese patologice degenerative sau ca urmare a utilizrii substanelor medicamentoase, n organism se produc modificri chimice tisulare care sunt detectate de celulele sistemului imunitar. Consecina este declanarea unui rspuns imun fa de componentele self modificate chimic. Astfel se iniiaz un conflict autoimun, n cursul cruia sistemul imunitar genereaz efectorii si celule activate i molecule care recunosc specific moleculele self modificate. Respingerea grefelor de esuturi i organe este consecina activrii funciei imunitare. Antigenele esutului grefat, solubile sau fixate pe suprafaa celulelor din gref, activeaz limfocitele (celulele efectoare ale rspunsului imun). Autogrefele sunt totdeauna tolerate. n condiiile unei reactiviti imunitare normale, alogrefele i xenogrefele sfresc prin a fi respinse. Cu ct diferenele genetice i implicit biochimice ntre organismul donor i cel receptor de gref sunt mai accentuate, cu att grefa este respins mai repede.

Etapele dezvoltrii Imunologiei ca tiin Imunologia este o tiin relativ tnr, care a aprut iniial ca un domeniu a Microbiologiei, care la nceputurile sale a studiat mecanismele reaciilor de aprare a organismului uman i animal fa de agresiunea infecioas. Imunologia a fost fundamentat de descoperirile lui Pasteur i Metchnikoff i pstreaz nc legturi de esen cu disciplina mam - Microbiologia, dei astzi ea este una dintre ramurile cele mai importante i mai dinamice ale tiinelor biologice. Apariia Imunologiei ca tiin a fost precedat cu milenii, de observaii empirice referitoare la faptul c vindecarea unor maladii infecioase era urmat de o stare de rezisten permanent la reinfecie sau cel mult de forme uoare de mbolnvire. Cu 2-3 secole .C., n China i India s-a observat c unele maladii foarte grave (variola, pesta, ciuma), las n urm o stare de rezisten permanent la reinfecie sau cel mult, persoanele fceau forme foarte uoare de mbolnvire.

n infecia variolic, apar leziuni caracteristice mai ales pe tegumentul feei. Mai nti apar vezicule mici, pline cu lichid clar, al cror coninut se tulbur datorit infiltratului celular i fac crust, iar dup vindecare, las o cicatrice ce se pstreaz toat viaa (vrsat de vnt). S-a trecut la infectarea artificial a persoanelor sntoase n scopul declanrii unei mbolnviri uoare, care s instaleze starea de imunitate. Practica variolizrii prin prizarea pe nas a mojaratului de cruste uscate, recoltate de la cei trecui prin boal, era nsoit de infecii grave, datorit cantitii mari de virus inhalat. n 1418, procedeul variolizrii a fost introdus n Anglia de Mary Wortley Montagu i s-a practicat o perioad, cu toate riscurile mbolnvirii cu severitate necontrolat. Vaccinarea antivariolic a fost introdus de E. Jenner (1796). Ca vaccin, el a utilizat un virus de la bovine (cowpox). Metoda s-a bazat pe observaia empiric a rezistenei n cursul marilor epidemii de variol, a mulgtorilor care fuseser infectai cu virusul cowpox. Acesta, produce o infecie pustular i fiind nrudit antigenic cu virusul variolei, confer protecie antivariolic. Vaccinarea persoanelor sntoase s-a fcut cu lichidul recoltat din pustulele de pe ugerul vacilor. Perioada tiinific a Imunologiei a fost inaugurat de L. Pasteur, prin descoperirea unor vaccinuri cu o larg aplicaie practic. Denumirea de vaccin a fost dat de Pasteur, n amintirea produsului recoltat de Jenner din leziunile de pe ugerul vacii. Denumirea s-a pstrat pentru toate produsele folosite n practic, pentru a crea o stare de rezisten preventiv fa de eventualul contact cu agentul patogen. Pasteur a fundamentat tiinific practica producerii i utilizrii vaccinurilor. El a demonstrat c proprietile biologice (patogenitatea i virulena) bacteriilor i virusurilor patogene nu sunt fixe. In anumite condiii, aceste proprieti se pot diminua prin anumite artificii de tehnic, aa nct un agent virulent care de regul determin o infecie mortal, poate fi transformat ntr-un agent care produce o infecie uoar, fr semne clinice, dar creeaz o rezisten foarte solid. Vaccinurile atenuate ndeplinesc aceste deziderate. Pasteur a atenuat virulena agenilor patogeni prin dou metode: prin nvechirea culturilor i prin cultivarea la temperaturi ridicate. Pasteur a descoperit trei vaccinuri: al holerei ginilor, al antraxului la ovine i al rabiei. Agentul patogen al holerei ginilor Yersinia pestis este o bacterie foarte virulent. Un inocul de cteva celule este suficient pentru a produce mbolnvirea i moartea organismelor sensibile. Cultura virulent de Yersinia, prin meninere la temperatura camerei (nvechire) se atenueaz i dup inoculare la ginile normale, nu mai produce mbolnvirea. Psrile inoculate cu cultura bacterian atenuat, devin rezistente la reinfecia cu o cultur virulent, spre deosebire de psrile lotului martor, care se mbolnvesc i mor. Cultura bacterian veche a creat o stare de imunitate, adic a avut rolul unui vaccin. Atenuarea virulenei prin nvechirea culturii este un proces necontrolat i probabil se datoreaz modificrilor biochimice sau genetice ale celulelor, sub influena produselor de catabolism acumulate n mediul de cultur sau se datoreaz epuizrii mediului n substanele eseniale pentru cretere.

Agentul patogen al infeciei crbunoase (anthrax) este Bacillus anthracis, o bacterie sporulat. Sporul se formeaz la 37o. Cultura bacterian crescut la 42o, i modific proprietile biologice, pierde capacitatea de sporulare (devine asporogen). Aceste modificri se nsoesc de

pierderea progresiv a virulenei. Incubarea la 42o este o modalitate a obinerii dintr-o cultur virulent, a unei culturi cu virulen progresiv atenuat pentru organismul gazd(oaie, iepure, cobai, oarece).

Crbunele este o boal grav a oilor, ce se transmite i la om. Pasteur a imaginat o schem de vaccinare a ovinelor, ncepnd cu un inocul bacterian virulent pentru oarece i continund cu inocul bacterian cu virulen mai mare. A creat o stare de imunitate a ovinelor, crora le-a conferit rezisten la bacteriile foarte virulente.

Agentul infecios al rabiei nu a fost evideniat de Pasteur. Autorul a utilizat esut nervos medular sau creier de la iepurele infectat experimental, pe care l-a modificat prin uscare n prezena potasei caustice. A obinut un vaccin care, administrat ct mai repede dup muctura animalului rabid, creeaz o stare de rezisten, n absena creia infecia rabic evolueaz invariabil spre moarte.

Cercetrile lui Pasteur au pus bazele Imunologiei medicale i ale obinerii i utilizrii pe baze tiinifice a vaccinurilor. A urmat o perioad n cursul creia s-au nregistrat progrese importante n obinerea i administrarea vaccinurilor.

Bazele conceptului imunitii humorale au fost puse de Behring i Kitasato (1890), care au evideniat anticorpii serici, dup imunizarea animalelor de laborator. Serurile imune pot fi folosite n scop terapeutic pentru a stopa sau a atenua evoluia unei boli infecioase, cu condiia ca administrarea acestor seruri s fie foarte precoce. In 1923, Behring a organizat producia de seruri imune, preluat de Institutul Pasteur din Paris (nfiinat n 1894) i apoi de Institutul Babe i de Institutul Cantacuzino.

n 1894, Pfeiffer a descris fenomenul de bacterioliz, demonstrnd c serul sanguin al animalelor imunizate are proprietatea de a provoca liza celulelor bacteriene. El a demonstrat c bacterioliza necesit dou componente: serul sanguin al animalului imunizat i o pictur de ser proaspt de cobai. Procesul este foarte specific: serul produce numai liza celulelor bacteriene care au specificitate fa de anticorpii serici.

J. Bordet a evideniat c fenomenul lizei se produce i n cazul hematiilor, dac sunt puse n contact cu serul sanguin de la iepurele imunizat cu hematii, la care se adaug ser proaspt de cobai, n care se gsete complementul (alexina).

Conceptul imunitii mediate celular a fost formulat de Metchnikoff (1891). El a evidniat c n organism exist o serie de celule specializate, cu capacitatea de a recunoate celulele strine i de a le ngloba prin procesul de fagocitoz, care sunt digerate i eliminate din celula fagocitar. Metchnikoff a fcut observaii pe crustaceul Daphnia magna, ale crui celule fagocitare nglobeaz i diger sporii fungici (Monospora bicuspidata). Cnd infecia cu spori este masiv, capacitatea de aprare a organismului este depit i gazda moare.

Cele dou doctrine ale fenomenului imunitar, care s-au confruntat prin reprezentanii lor, au fost unificate de Wright (1903). El a demonstrat existena n ser a unor anticorpi naturali denumii opsonine, care acioneaz n cooperare cu fagocitele.

n 1930, K. Landsteiner a evideniat o structur antigenic pe suprafaa hematiilor umane i a stabilit existena sistemului antigenic ABO, precum i a normelor ce trebuie respectate n practica transfuziei de snge.

Ramon (1925) a demonstrat c unii ageni patogeni (ca de exemplu, al difteriei, al tetanosului) produc toxine foarte puternice. Aceste toxine au un potenial foarte ridicat: cantiti foarte mici de toxine sunt suficiente pentru a provoca moartea animalelor de experien. Tratarea preparatului de toxin cu formol 4%o i meninerea amestecului la 39o pentru o perioad de timp, este urmat de pierderea complet a proprietilor toxice. Preparatul atoxic este inofensiv i poate fi administrat n cantiti relativ mari, fr s determine efecte patologice. Preparatul atoxic i pstreaz proprietile imunogene i induce o stare de rezisten a organismelor imunizate. Sub aciunea combinat a formolului i temperaturii, toxinele difteric i tetanic au fost transformate n anatoxine.

Cercetrile de biochimie(1930-1950) au permis elucidarea structurii moleculare a antigenelor, a imunoglobulinelor i a haptenelor.

Studiul mecanismelor celulare ale proceselor imunitare (1950-1980) este marcat de progresele biologiei moleculare i de interferena cu Virologia, Microbiologia, Biologia celular, Biofizica, Biochimia, Genetica. S-a evideniat rolul esenial al limfocitului n fenomenele imunitare, precum i rolul plasmocitelor n sinteza i secreia anticorpilor.

Mc Farlane Burnet (1959) a elaborat teoria seleciei clonale a rspunsului imun, iar J.F.A.P.Miller (1960) a stabilit rolul esenial al timusului n dobndirea competenei funcionale a limfocitelor T.

R. Good (1960) a evideniat rolul bursei lui Fabricius n geneza sistemului imunitar la psri.

J. Dausset (1954) a demonstrat c pe suprafaa celulelor oricrui organism se gsete o serie de molecule (antigene), care confer fiecrui organism o individualitate antigenic unic. Datorit acestor antigene, reaciile care sunt determinate de o gref de esut sau de organ, pot evolua n mod diferit: ntre organismele foarte nrudite, grefa prinde foarte bine, iar o gref ntre organisme cu diferene majore de ordin genetic, produce o reacie de respingere, care este cu att mai rapid cu ct diferenele antigenice sunt mai mari. Antigenele suprafeei celulare care confer individualitate biochimic unic fiecrui organism, se numesc antigene de histocompatibilitate. Evaluarea diferenelor celor doi parteneri (donor i receptor) n ceea ce privete moleculele de histocompatibilitate, este esenial nainte de grefarea organului.

Dup 1970, studiul sistemului imunitar corespunde unei abordri integratoare. Dup opinia lui N. K. Jerne (1985), imunologia i-a pierdut statutul de disciplin izolat, fiind pe cale de a fi absorbit de biologia clasic.

Dup 1980, Imunologia s-a diversificat i s-a aprofundat, dar n acelai timp este mai unificat ca oricnd, sub imperativul numitorului comun al nelegerii funciei imunitare la nivel molecular. Abordrile moleculare vor sta la baza tuturor cercetrilor viitoare, legate de funcia imunitar.

n perspectiv, orizontul de evoluie a Imunologiei se extinde asupra nelegerii genelor codificatoare ale moleculelor efectoare i reglatoare ale rspunsului imun i ale mecanismelor aciunii lor. Astfel vom nelege diferenierea limfocitelor, activarea lor, mecanismele sintezei, secreiei, recirculrii limfocitelor i mecanismele aciunii moleculelor efectoare. Ar urma utilizarea cunotiinelor imunologice pentru prevenirea maladiilor cu substrat imunitar (alergii, maladii autoimune), pentru prevenirea respingerii grefelor de esuturi i organe i pentru imunoterapia neoplaziilor. Va fi o perioad a rentoarcerii aplicrii Imunologiei moleculare, la nivelul ntregului organism.

Diviziunile Imunologiei

Imunologia s-a nscut ca un domeniu al Microbiologiei i s-a dezvoltat ca un domeniu al Bacteriologiei medicale, cu care a rmas n raporturi de dependen pn ctre anul 1960. Treptat ns, prin acumularea unui volum mare de date tiinifice care au demonstrat intervenia funciei imunitare i a reaciilor imune n numeroase fenomene normale i patologice, Imunologia a devenit o tiin de sine stttoare. Consecina fireasc a implicrii funciei imunitare ntr-o multitudine de procese normale i patologice, a fost aceea c din domeniul Imunologiei s-au desprins ramuri care, la rndul lor, tind s aib o existen autonom.

Imunobiologia este cea mai cuprinztoare dintre ramuri. Ea studiaz fenomenele imunitare ca manifestri ale unei funcii biologice eseniale funcia de aprare. Studiaz substratul biologic al rspunsului imun (celulele imunitare, originea i mecanismele diferenierii lor, factorii celulari i humorali care asigur diferenierea lor), mecanismele celulare i moleculare ale biosintezei anticorpilor, explic implantarea celulelor tumorale i geneza cancerului clinic n condiiile aciunii efectorilor sistemului imunitar. Studiaz mecanismele imunitare ale respingerii grefelor de esuturi i organe, mecanismele reactivitii imunitare n filogenie i ontogenie, precum i bazele celulare i moleculare ale strilor de hipersensibilitate i ale maladiilor autoimune.

Imunochimia este o disciplin de grani ce aparine Imunologiei i Biochimiei, care studiaz funcia imunitar sub aspect biochimic. Preocuparea esenial a constat n studiul chimiei antigenelor i anticorpilor i al mecanismului lor de interaciune n reacia antigen-anticorp. Datele referitoare la structura chimic a antigenelor i anticorpilor au pus bazele Imunochimiei, dar ulterior, domeniul i-a lrgit sfera de activitate i studiaz urmtoarele aspecte:

- factorii moleculari ai rspunsului imun i n special ai imunitii mediate celular;

- moleculele de histocompatibilitate;

- markerii antigenici specifici diferitelor populaii de celule limfoide;

- moleculele cu funcie de receptor de antigen, pe suprafaa celulelor limfoide;

- factorii de cooperare celular n cursul elaborrii rspunsului imun (interleuchine);

- componentele complementului etc.

Termenul de Imunochimie a fost introdus de chimistul suedez Arrhenius (1907). El i-a intitulat astfel studiul cu privire la reaciile chimice care se produc n organismul uman i animal, dup imunizare. Fondatorul Imunochimiei este P. Ehrlich. El a introdus metode cantitative n studiul reaciilor antigen-anticorp i a elaborat o teorie general asupra recunoaterii imune (teoria catenelor laterale sau a receptorilor). Dup 1950, Imunochimia s-a dezvoltat spectaculos, datorit descoperirilor din domeniul biochimiei, datorit utilizrii unor metode fizico-chimice de analiz a macromoleculelor i prin aplicarea acestora la domeniul Imunologiei. S-a nscut un set de metode, n esen biochimice, puse n slujba analizei moleculelor implicate n funcia imunitar. Domeniul s-a numit analiz imunochimic i utilizeaz metode care deriv din mbinarea tehnicilor fizico-chimice cu cele imunologice. Imunochimia este deservit de metoda imunodifuziei, imunofluorescenei, RIA, ELISA, dializa la echilibru etc. Efectul utilizrii acestor metode de investigare a fost cunoaterea mecanismelor moleculare care stau la baza rspunsului imun, ndeosebi humoral i aplicarea n laboratorul clinic, a unor noi metode de diagnostic.

n clinic, studiile de Imunochimie au propus noi metode de tratament, bazate pe interaciunea unor molecule cu rol de vehicul pentru anticorpi, cu receptorii unor celule int (imunotoxine).

Imunogenetica studiaz determinismul genetic al rspunsului imun: mecanismele genetice care asigur diversitatea anticorpilor i a antigenelor de histocompatibilitate.

Imunohematologia s-a nscut odat cu stabilirea diferenelor antigenice ale eritrocitelor umane i cu precizarea grupelor sanguine (K. Landsteiner, 1901) i s-a dezvoltat dup ce s-a stabilit existena unor diferene fine ntre diferite tipuri de eritrocite i, n special, dup descoperirea factorului Rh i a rolului su n patologia sarcinii.

Imunologia medical uman i veterinar s-a dezvoltat n trei direcii:

- direcia profilactic, orientat spre descoperirea i producerea unor noi vaccinuri, capabile s creeze o stare de rezisten. Ea se preocup, de asemenea, de schemele de vaccinare, de posibilitatea asocierii diferitelor vaccinuri i de posibilitatea stimulrii rspunsului imun cu ajutorul adjuvanilor;

- direcia terapeutic studiaz posibilitatea obinerii serurilor imune. Ele conin anticorpi i se administreaz organismelor care prezint riscul mbolnvirii prin infecii;

- direcia diagnosticului studiaz posibilitatea identificrii agenilor etiologici ai diverselor maladii infecioase, cu ajutorul reactanilor imunologici (seruri imune i antigene).

Imunopatologia studiaz fenomenele imunitare n relaie cu diferite maladii. In multe situaii patologice, rspunsul imun (activarea funciei imunitare) are efecte defavorabile, prejudiciante asupra organismului. Rspunsul imun se instituie drept cauz, dar n special ca mecanism, pentru producerea unor manifestri patologice. Afeciunile generate de activarea sistemului imunitar (imunopatii) se grupeaz n dou categorii:

- strile de hipersensibilitate(alergiile);

- maladiile autoimune.

Imunopatologia studiaz, de asemenea, imunodeficienele (nscute i dobndite), imunitatea de transplant i imunitatea antitumoral, rspunsul imun n maladiile infecioase virale i bacteriene, precum i n maladiile parazitare.

Serologia (Imunoserologia) s-a dezvoltat ca o ramur practic, dedicat studiului tehnicilor de explorare a reaciilor imune in vitro.

CARACTERIZAREA GENERAL A ANTIGENELOR

GR. MIHESCU, CAMELIA MIHESCU

Convenional, antigenele se definesc ca substane strine, care, consecutiv introducerii n organismul uman sau animal pe o cale parenteral (alta dect cea digestiv), declaneaz sinteza anticorpilor cu care se combin specific. Definiia este incomplet din cteva motive.

1. Calea digestiv de administrare a antigenelor nu exclude totdeauna posibilitatea declanrii rspunsului imun. Pentru agenii infecioi care se multiplic n tractul digestiv, administrarea oral asigur o bun imunizare (de exemplu, vaccinul polio se administreaz oral, dei calea parenteral este mai eficient).

2. Unele substane nonself sunt n mod eronat considerate ca neantigenice, deoarece, dei in vivo stimuleaz reactivitatea imunitar i induc sinteza unei cantiti mici de anticorpi, in vitro nu produc reacii vizibile antigen-anticorp.

3. Fa de unele antigene, organismele nu declaneaz rspunsul imun, ci manifest o stare de toleran.

4. Unele molecule n stare nativ nu induc un rspuns imun, ci numai dup cuplarea covalent cu o molecul purttor. Molecula nativ i pstreaz proprietatea de a se combina specific cu anticorpii sintetizai. Astfel de molecule se numesc haptene.

J. F. Bach (1976) definete antigenele ca fiind molecule care, consecutiv introducerii n organism pe o cale adecvat, induc un rspuns imun materializat prin proliferarea celulelor limfoide i sinteza moleculelor de recunoatere (anticorpi i receptori celulari), cu care se combin in vivo i in vitro.

Modelul general de structur a unui antigen

O molecul antigenic este alctuit din dou componente;

- componenta purttor (carrier), care corespunde celei mai mari pri a moleculei:

- gruprile determinante de specificitate sau epitopi, localizate pe suprafaa componentei purttor i formate din secvene specifice de monomeri. Epitopii, prin secvena proprie a monomerilor i prin configuraia spaial specific, confer individualitate chimic i specificitate antigenic moleculei nonself. Gruprile determinante de specificitate sunt echivalenii moleculari i funcionali ai haptenei.

Gruprile determinante de specificitate se gsesc n numr variabil pe suprafaa purttorului i pot fi identice att n ceea ce privete compoziia chimic, ct i configuraia spaial (ca n cazul antigenelor polizaharidice cu epitopi repetitivi) sau sunt diferite, att ca secven a monomerilor ct i n privina configuraiei spaiale. Fig. 1. Modelul general de structur a unui antigen. Cea mai mare parte a oricrei molecule antigenice este reprezentat de gruparea carrier, pe care sunt localizai epitopii cu diferite configuraii spaiale, stimulatori ai reactivitii imunitare. Unii epitopi pot fi unici, iar alii sunt multipli. Uneori, epitopii stimuleaz sinteza anticorpilor cu afiniti diferite.

Proprietile definitorii ale antigenelor

n studiile experimentale asupra imunogenitii unor molecule sintetice, M. Sela (1969) a descris dou proprieti eseniale ale antigenelor:

1. Imunogenitatea sau antigenitatea este proprietatea unui antigen complet, format din gruparea carrier i epitopi, de a declana un rspuns imun, humoral sau celular, ori de cte ori ptrunde n organism pe o cale adecvat. Proprietatea de imunogenitate este asociat cu gruparea carrier a moleculei de antigen, grupare care ntr-o oarecare msur influeneaz i specificitatea anticorpilor.

2. Specificitatea definete capacitatea antigenului ntreg sau numai a epitopilor si de a se combina specific cu anticorpii sau cu receptorii celulari a cror sintez a fost indus. Proprietatea de specificitate este dependent, n primul rnd de epitopi, dar este influenat ntr-o msur mai mare sau mai mic i de gruparea carrier.

Noiunea de imunogen, uneori, este distinct de aceea de antigen. Noiunea de imunogen este mai restrictiv i semnific proprietatea unei substane, n stare nativ, de a stimula rspunsul imun, fr s necesite conjugarea cu o alt molecul.

Noiunea de antigen este mai larg, deoarece desemneaz molecule nonself care sunt imunogene n stare nativ sau devin imunogene dup conjugarea cu o molecul purttor. Antigenul poate fi uneori inacapabil, n forma sa nativ, s stimuleze rspunsul imun.

CLASIFICAREA I IMUNOGENITATEA ANTIGENELOR

Dup originea lor, antigenele sunt exogene i endogene.

Antigenele exogene sunt cele mai numeroase i pot fi mprite n trei categorii: 1) naturale; 2) artificiale; 3) sintetice.

Antigene naturale

Antigenele naturale formeaz categoria cea mai cuprinztoare. Aici sunt incluse toate macromoleculele naturale din virusuri, microorganisme, fungi, plante i animale.

Dup dimensiuni se disting antigene moleculare (solubile) i antigene corpusculare.

Antigenele moleculare (solubile) constituie gruparea cea mai numeroas, care include toate tipurile de macromolecule: proteine, polizaharide, lipide, acizi nucleici.

Antigenele corpusculare (insolubile) sunt reprezentate de virusuri i de celule (procariote i eucariote).

Antigenele moleculare

Cele mai studiate antigene sunt proteinele i polizaharidele, la care se adaug conjugatele: glicoproteine, nucleoproteine, lipoproteine, peptidoglicani, glicolipide.

Proteinele sunt cele mai numeroase i mai importante antigene moleculare. Diversitatea lor chimic, generat de variaia secvenei de aminoacizi este uria. Practic, fiecare tip de molecul proteic nonself din lumea vie este un antigen pentru organismul animal i uman, deoarece are o secven unic de aminoacizi, care determin o structur secundar i tridimensional proprie i implicit, existena unor epitopi proprii ca secven a aminoacizilor i conformaie spaial.

Imunogenitatea este o proprietate general a proteinelor, a celor cu rol structural (colagenul, cheratina, elastina, fibroina viermelui de mtase, proteinele capsidei virale), a celor cu rol funcional (miozin, actin, albumin, hemoglobin, mioglobin, enzime, hormoni, imunoglobuline), a celor cu rol de depozit de aminoacizi(ovalbumina, cazeina, gliadina din seminele de gru). Toate proteinele i polipeptidele cu o greutate molecular mai mare de 1000 D sunt imunogene, ntr-o msur mai mare sau mai mic.

De cele mai multe ori, pentru antigenele proteice, nu se face distincia dintre epitopii inductori ai rspunsului imun i gruparea carrier, deoarece proteinele posed un spectru continuum de determinani antigenici, ce corespund unor secvene discrete ale suprafeei moleculare localizate n zonele cele mai expuse contactului cu receptorii sistemului imunitar. Antigenitatea moleculelor globulare este determinat adeseori, de configuraia lor spaial, rezultat din plierea tridimensional. Pentru cele mai multe proteine globulare (mioglobina, hemoglobina, lizozimul,

ribonucleaza etc.), aproape toi determinanii antigenici sunt conformaionali, adic sunt rezultatul plierii spaiale a moleculei, iar alii sunt secveniali, adic sunt reprezentai de o secven particular de aminoacizi. Moleculele proteice fibrilare (cheratina, colagenul, fibroina) au configuraii mai simple dect cele globulare, catenele lor fiind aranjate sau rsucite pe o singur dimensiune. Determinanii antigenici ai acestor proteine sunt secveniali, formai din 3-6 aminoacizi.

Sistemul imunitar al unui organism recunoate un numr limitat de determinani antigenici ai unei molecule proteice. Epitopii, conformaionali sau secveniali, care stimuleaz rspunsul imun in vivo, iar in vitro induc proliferarea limfocitelor, se numesc epitopi dominani. O parte a determinanilor antigenici ai unei molecule native, cel mai adesea, sunt neimunogeni (imunosilenioi), nefiind accesibili sistemului imunitar al organismului, dar se pot exprima ntrun anumit set de condiii de imunizare (gazd, adjuvant etc.). Acetia sunt epitopi interni ai proteinelor globulare. Un determinant intern poate fi silenios n molecula nativ, dar devine imunostimulator dup clivarea enzimatic a moleculei, in vivo sau in vitro. De aceea, M. Sela a recomandat utilizarea termenului de grupare imunodominant, pentru epitopul sau epitopii care se exprim n anumite condiii(gazd, adjuvant, cale de administrare) i determin specificitatea rspunsului imun. Fig.2. Epitopii dominani sunt localizai la suprafaa moleculei globulare. Epitopii subdominani devin accesibili dup clivarea moleculei n etapa prelucrrii n macrofag, iar epitopii criptici sunt inaccesibili fenomenului de recunoatere imunitar.

Imunogenitatea antigenelor proteice se modific n diferite condiii.

Denaturarea moleculelor native sub aciunea agenilor chimici i a cldurii, modificarea configuraiei moleculei sub aciunea agenilor reductori sau hidroliza enzimatic, modific imunogenitatea. Anticorpii specifici fa de proteina nativ precipit slab sau de loc proteina denaturat termic sau chimic.

Formaldehida i glutaraldehida sunt ageni de legare ncruciat a moleculelor proteice, constituind reele multimoleculare stabile. Aceti ageni produc denaturarea proteinelor i modific funciile celor cu activitate biologic (toxine, enzime). Astfel, exotoxinele tratate cu formaldehid, i pierd proprietile toxice, dar rmn imunogene. Formaldehida i glutaraldehida se folosesc pentru conservarea antigenelor cu greutate molecular mic (peptide), dar sunt mai puin utilizate pentru conservarea proprietilor antigenice ale moleculelor mari. Agenii chimici de legare ncruciat modific imunogenitatea moleculelor proteice prin schimbarea conformaiei moleculei i mascarea epitopilor sau prin modificarea chimic a aminoacizilor epitopului.

Denaturarea semnific deplierea structurii rsucite a moleculelor proteice i are loc prin modificarea pH, prin nclzire, prin reducerea legturilor S-S sub aciunea ureii i a betamercaptoetanolului sau a acidului performic. Prin denaturare, proteina i pierde nu numai funcia biologic, dar i modific specificitatea antigenic. De exemplu, cele 4 puni S-S ale RN-azei, ntre resturile de cistin, sunt reduse de -mercaptoetanol i transformate n 8 resturi de cistein, cu pierderea total a activitii enzimatice. Anticorpii fa de RN-aza pancreatic bovin nativ nu precipit moleculele de RN-az denaturat prin reducerea legturilor S-S. Invers, anticorpii fa de RN-aza denaturat, nu precipit RN-aza nativ. Modificarea specificitii anticorpilor sugereaz c reducerea legturilor S-S determin pierderea epitopilor conformaionali.

Proteinele denaturate reverseaz greu la forma nativ, chiar prin restabilirea condiiilor de mediu.

Hidroliza enzimatic modific configuraia spaial a moleculelor proteice native i diminu imunogenitatea lor, cu att mai mult cu ct fragmentele rezultate au dimensiuni mai mici. Prin clivare enzimatic se anuleaz imunogenitatea epitopilor conformaionali i se relev epitopi care n molecula nativ au statutul de epitopi criptici.

O atenie special s-a acordat studiului imunogenitii unor proteine ale cror proprieti biologic-active sunt uor de evaluat: enzime, inhibitori enzimatici, hormoni proteici, toxine, imunoglobuline (n calitatea lor de antigene), proteine ale capsidei sau ale nveliului viral.

Enzimele sunt antigenice, indiferent de originea lor. Reacia moleculelor de enzim cu anticorpii specifici a constituit o modalitate de determinare a poziiei epitopilor. Anticorpii fa de diferii epitopi ai moleculei de enzim modific n grade foarte diferite activitatea ei catalitic. Dac anticorpii sunt specifici fa de epitopi localizai la nivelul situsului activ al enzimei, molecula i pierde activitatea fa de substrat, deoarece legarea anticorpilor la situsul activ inhib competitiv legarea moleculelor de substrat. Gradul de inhibiie a activitii enzimatice este cu att mai accentuat, cu ct molecula este mai mare. Efectul inhibitor al anticorpilor nu se produce dac enzima a legat deja substratul specific. Dac gruprile determinante de specificitate ale moleculei de enzim sunt situate n afara situsului catalitic, activitatea enzimei este parial inhibat, datorit modificrilor conformaionale care survin dup reacia antigen-anticorp, sau rmne intact. Foarte rar, complexul enzim-anticorp are un efect catalitic superior, comparativ cu enzima nativ.

Hormonii sunt molecule slabimunogene, datorit uniformitii relative a structurii lor chimice n regnul animal. Anticorpii specifici fa de majoritatea hormonilor proteici se obin prin asocierea lor prealabil cu adjuvantul Freund. Imunogenitatea hormonilor este ntr-o relaie direct cu

gradul deosebirilor chimice existente ntre hormonul exogen i hormonul produs de organismul receptor. Consecina este sinteza anticorpilor antihormon.

Proprietile antigenice ale insulinei sunt bine cunoscute, datorit utilizrii clinice a hormonului. Molecula de insulin este alctuit din dou catene polipeptidice, cu un numr total de 51 de aminoacizi: 21 ai catenei A i 30 ai catenei B. Cele dou catene sunt reunite prin puni S-S. Structura moleculelor de insulin de la diferite specii este foarte asemntoare, 47 din cei 51 de aminoacizi fiind identici. Deosebirile se gsesc n catena A pentru aminoacizii 8, 9 i 10 (la bovine Ala, Ser, Val, la om sunt Thr, Ser, Ile, iar la ovine Ala, Gly, Val). In catena B, diferena este limitat la aminoacidul C-terminal. Aceste mici diferene ale secvenei de aminoacizi nu modific funcia hormonului. De aceea, insulina, indiferent de provenien, este la fel de eficient pentru tratamentul diabetului uman. Micile diferene de secven, n general, nu sunt sesizate de organismul receptor. Totui, dup administrare prelungit, organismele receptoare cu reactivitate imunitar mai nalt, sintetizeaz anticorpi anti-insulin.

Polizaharidele, dei au complexitate structural relativ mare, condiionat de multitudinea posibilitilor de legare a atomilor de carbon, sunt molecule slabimunogene n stare nativ, comparativ cu proteinele. Antigenitatea lor este conferit de succesiunea unitilor componente, de configuraia spaial a moleculei i de greutatea molecular. Cele cu greuti mai mici de 50 kD nu sunt imunogene. Polizaharidele sunt antigene cu epitopi secveniali repetitivi i cel puin uneori, n funcie de originea polizaharidului i de specia imunizat, sunt imunogeni.

Din punctul de vedere al structurii moleculare, se disting dou tipuri de polizaharide: a) cele care au o caten central pe care se inser ramificaiile laterale; b) polizaharide lipsite de o caten central, iar ramificaiile sunt dispuse aleatoriu, fr nici o simetrie. Rolul catenelor centrale n conferirea imunogenitii este controversat, dar ramificaiile laterale au o importan deosebit pentru determinarea specificitii antigenice a polizaharidelor. Din punctul de vedere al compoziiei chimice pot fi homo- sau heteroplizaharide, iar n ceea ce privete sarcina, pot fi neutre sau ncrcate. Oligo- i polizaharidele pot dobndi o structur teriar (globular). Uneori, configuraia spaial a polimerului glucidic este determinant pentru specificitatea sa antigenic. Schimbrile conformaionale ale polizaharidelor se produc mai uor dect ale proteinelor, pentru c au bariere energetice sczute. Pentru polizaharide, denaturarea este practic necunoscut, ceea ce le confer stabilitate. Dac imunogenitatea polizaharidelor native este slab, adeseori ele se comport ca haptene, adic devin antigenice dup cuplarea cu un purttor proteic, rezultnd lectine, cu o foarte larg distribuie n lumea vie. In calitate de haptene, polizaharidele au proprietatea de specificitate, adic se combin cu anticorpii complementari fa de complexul glicoproteic.

Din motive de ordin practic, cele mai studiate polizaharide din punct de vedere antigenic sunt cele de origine bacterian: dextranul i polizaharidele capsulare.

Dextranii sunt polimeri ramificai de glucoz, resturile glucozil fiind unite mai ales prin legturi de tip 1-6, dar n funcie de specia productoare, punctele de ramificaie ale catenelor polimere pot fi 1-2, 1-3 sau 1-4.

Dextranii sunt sintetizai n special de unele bacterii lactice, din zaharoz, dup reacia:Dextranaz N(zaharoz) --------------- (Glucoz)n + (Fructoz)n

Dextranii au greuti moleculare foarte diferite (pn la 106 D), n funcie de gradul de polimerizare. Nu sunt imunogeni i de aceea se folosesc ca nlocuitori ai plasmei. Prin transfuzii repetate cu soluii de dextran la om i prin injectare repetat la oarece, s-au sintetizat anticorpi antidextran. Specificitatea anticorpilor antidextran este foarte nalt. In serul animalelor imunizate cu dextrani s-au detectat dou tipuri de anticorpi: unii specifici fa de resturile de glucozil legate 1-2 i alii specifici fa de resturile de glucozil legate 1-3, ce nu dau reacii ncruciate, dei deosebirea dintre cele dou categorii de molecule de dextran const numai n modul diferit de legare a resturilor de glucozil ntre ele.

Polizaharidele capsulare se pot gsi fie subforma moleculelor libere (solubile), fie subform corpuscular (ataate celulelor bacteriene capsulate).

Variaiile biochimice ale polizaharidelor capsulare, determinate de compoziia glucidic a catenei, de secvena monomerilor sau de modul de legare a lor n caten, confer tulpinilor bacteriene, specificitate antigenic de tip. La Str. pneumoniae s-au identificat peste 80 de tipuri antigenice ale polizaharidelor capsulare. In compoziia lor intr hexoze, pentoze, derivaii lor aminai, metilai etc. Specificitatea antigenic a polizaharidelor capsulare depinde att de compoziia chimic, ct i de succesiunea monomerilor n catena polizaharidic. Ca vaccinuri, polizaharidele induc starea de toleran.

n stare purificat sunt molecule neimunogene, datorit uniformitii lor structurale n lumea vie. Injectarea lor la animale nu induce sinteza anticorpilor. Acizii nucleici nativi sunt conjugate nucleoproteice, n care acizii nucleici au rolul de hapten. Majoritatea epitopilor conjugatului sunt conformaionali. O fracie din anticorpii anti-conjugat se combin cu acizii nucleici. Anticorpii anti-acizi nucleici se combin cu acizii nucleici n stare pur, indiferent de provenien. Proteinele asociate acizilor nucleici confer o nou specificitate antigenic i determin sinteza anticorpilor care se combin cu proteina puttor.

Experimental, anticorpii anti-acizi nucleici se obin pe una din urmtoarele ci:

1. Imunizarea cu bacteriofagi din seria T par (T2, T4, T6), supui ocului osmotic. ADN al acestor fagi se deosebete de ADN din celulele eucariote, prin prezena 5-hidroxi-metilcitozinei glicozilate, n locul citozinei. Anticorpii au specificitate fa de bazele glicozilate, ceea ce explic lipsa reaciilor ncruciate cu ali acizi nucleici.

2. Imunizarea cu ribosomi din celulele vegetale sau animale. Anticorpii sintetizai reacioneaz cu ARN de origine bacterian, vegetal sau animal, precum i cu polinucleotidele sintetice(poliA, poli-C, poli-U), dar nu reacioneaz cu ADN nativ i nici cu ADN denaturat.

3. Imunizarea cu conjugate hapten-protein, n care haptena este reprezentat de baze azotate, ribonucleozide, dezoxiribonucleozide, nucleotide, dinucleotide i trinucleotide. Anticorpii sintetizai reacioneaz att cu haptena ct i cu ADN nativ sau denaturat.

4. Imunizarea cu complexe formate din acizi nucleici i albumin metilat. Cele dou molecule formeaz un complex necovalent, datorit interaciei dintre gruprile negative ale acizilor nucleici i cele pozitive ale proteinei. Anticorpii sintetizai reacioneaz cu complexul molecular, cu proteina, cu acidul nucleic nativ i denaturat de diferite origini.

5. Anticorpii anti-acizi nucleici se gsesc n sngele pacienilor cu lupus eritematos diseminat (LED).

Anticorpii sintetizai fa de acizii nucleici cu rol de haptene n conjugatele cu proteine nu au specificitate, deoarece precipit ADN monocatenar, ARN de diferite origini, poliribonucleotide i acizii nucleici dublu catenari.

Lipidele sunt molecule neimunogene n stare nativ, dar se pot cupla cu proteinele i n conjugatul format au rolul de haptene. Din punct de vedere imunologic, cele mai importante lipide sunt fosfatidele (sfingomielina i cefalina) i glicosfingolipidele(galactocerebrozida).

O hapten lipidic cu o importan practic deosebit este cardiolipina, din cordul mamiferelor. In sngele indivizilor infectai cu T. pallidum se gsesc anticorpi care reacioneaz cu cardiolipina nalt purificat (reacie ncruciat), extras din cordul bovin.

Un alt antigen lipidic este antigenul Forssman, inductor al sintezei anticorpilor hemaglutinani i n prezena complementului, hemolitici.

Studiul imunogenitii lipidelor a fost ngreunat de insolubilitatea lor n ap. Problema reactivitii anticorpilor cu antigenele lipidice a fost depit parial, prin utilizarea lipidelor auxiliare (lecitina i colesterolul) n suspensia antigenic. Disponibilitatea liposomilor a permis studiul imunogenitii lipidelor asociate cu membranele.

Haptene

Haptenele(haptein, grec = a apuca) sunt substane chimice naturale sau de sintez, cu molecul mic, a cror imunogenitate este condiionat de cuplarea cu o molecul purttor, dar i pstreaz proprietatea de specificitate, adic reacioneaz cu anticorpii specifici a cror sintez a fost indus de haptena conjugat cu o molecul cu rol de purttor.

Denumirea de hapten a fost introdus de Landsteiner pentru a caracteriza din punct de vedere funcional un extract alcoolic de rinichi de cal, neimunogen ca atare pentru iepure, dar capabil s se combine cu anticorpii sintetizai dup imunizarea iepurelui cu extractul alcoolic de rinichi de cal, cuplat cu o molecul purttor. El a propus ca n categoria haptenelor s fie cuprins orice substan natural sau sintetic, cu greutate molecular mic sau mare, care n form nativ nu poate s induc un rspuns imun detectabil, dar dobndete capacitatea imunogen, dup cuplarea sa in vivo sau in vitro, cu o molecul purttor cu greutate molecular mare. Conjugatul este imunogen nu numai n raport cu epitopii moleculei purttor, ci i cu epitopul haptenei.

Din punct de vedere funcional, haptenele s-au numit jumti de antigene, deoarece au numai una din cele dou proprieti eseniale ale antigenelor: nu sunt imunogene, dar i pstreaz proprietatea de specificitate. De aceea, termenul antigenic nu este sinonim cu cel de imunogenic. Haptena este un antigen, dar n forma sa nativ, nu este imunogen.

n general, haptenele sunt molecule mici, dei uneori, macromoleculele pot funciona ca haptene. Extractul alcoolic de rinichi de cal este o hapten complex. Haptenele simple sunt reprezentate de polinucleotide, alcooli, formaldehida, unele medicamente etc.

Utiliznd haptenele simple, prin reacii de cuplare cu o molecul purttor s-au obinut antigene artificiale. Haptena din complexul molecular are rolul gruprii determinante de specificitate.

Studiul imunogenitii conjugatelor hapten-molecul purttor a permis determinarea mrimii gruprilor determinante de specificitate ale antigenelor i indirect, determinarea situsului de combinare a anticorpilor. Pe aceiai cale s-a evaluat specificitatea, afinitatea i heterogenitatea anticorpilor. Haptenele au fost folosite pentru studiile de cristalografie cu raze X a unui complex antigen-anticorp.

Haptene autocuplante sunt molecule cu greutate molecular mic, a cror particularitate const n aceea c, dup injectare, n organism se combin spontan cu proteinele tisulare i formeaz conjugate hapten-protein, in vivo. Conjugatele hapten-protein induc sinteza anticorpilor i determin procese de hipersensibilitate sau iniiaz maladii autoimune. Astfel se comport derivaii dinitrofenolului substituii cu clor sau fluor, unii produi de degradare a penicilinei.

Antigenele corpusculare

Antigenele corpusculare sunt, n esen, antigene moleculare asociate virusurilor i celulelor. Proteinele capsidale i glicoproteinele nveliului viral sau proteinele prezentate pe suprafaa celulelor infectate cu virusuri, sunt foarte imunogene i stimuleaz rspunsul imun al gazdei. De aceea, imunitatea consecutiv infeciei virale este, de obicei, de lung durat.

Antigenele bacteriene sunt fie solubile (eliminate n mediul extracelular), fie corpusculare (legate de celul). Din prima categorie fac parte exotoxinele i polizaharidele capsulare libere, iar din cea de a II-a, antigenul somatic O (endotoxina bacteriilor Gram negative), antigenele polizaharidice din glicocalix, flagelina, pilina, acizii teichoici, mureina etc.

Antigenele eritrocitare sunt glicoproteine ale suprafeei eritrocitare, cu determinism biochimic cunoscut, n sistemul A, B, 0. Glicoproteinele eritrocitare de grup sanguin se gsesc i pe suprafaa celulelor tisulare, dar i n secreiile exocrine (saliv, suc gastric etc.), la circa 75% dintre indivizi, denumii secretori. Glicoproteinele din secreii sunt hidrosolubile i studiul lor a fost mai uor dect al moleculelor eritrocitare.

Gruprile glucidice ale glicoproteinelor membranei eritrocitare au rol dominant n determinarea specificitii de grup sanguin, aa cum au evideniat studiile de digestie enzimatic controlat. Eritrocitele tuturor grupelor sanguine au un precursor antigenic comun antigenul H (codificat de gena H), bine exprimat pe suprafaa antigenelor de grup 0 i n cantiti progresiv descrescnde pe hematiile de grup A, Bi Ab.

Specificitatea antigenic de grup 0 este conferit de L-fucoz. Grupul A are o gen ce codific sinteza glicozil-transferazei, enzim ce adaug N-acetil-D-galactozamina, la galactoza preterminal a moleculei H. De aceea, specificitatea antigenic a eritrocitelor de grup A este conferit de trizaharidul N-acetil-galactozamin, galactoz i L-fucoz:

N-acetil galactozamin ( 1-3) Gal R (R = restul catenei polizaharidice)

1-2

Fuc

Indivizii de grup Bau o gen ce adaug D-galactoza (n loc de N-acetil galactozamin) la galactoza preterminal a moleculei H, avnd un determinant antigenic format din dou resturi terminale de D-galactoza i L-fucoza. Fig. 3. Oligozaharidele cu rol de epitopi determinani ai grupelor sanguine ABO. Oligozaharidul este ancorat n membrana eritrocitului prin intermediul sfingomielinei, denumit ceramid. 85% din indivizii umani secret substanele de grup sanguin n saliv. La indivizii secretori, oligozaharidele sunt prezente sub forma conjugatelor cu polipeptidele codificate de genele secretoare (dup Roitt, 1997).

Prezena restului de fucoz (adic antigenul H) este esenial pentru expresia epitopilor A i B. Gena H i antigenul su lipsesc la fenotipul Bombay. De aceea, transferazele A i B nu pot aduga glucidele specifice la restul Gal al polizaharidului i antigenele de grup A i B nu sunt exprimate.

Exprimarea antigenelor ABO pe hematii poate fi modificat prin tratamentul in vitro cu glicozidaze: o -glicozidaz (extras din bobul de cafea verde) poate cliva restul de Gal de pe hematiile de grup B i le convertete n hematii de grup 0, ce pot rmne funcionale dup transfuzia la subiecii de grup 0.

Antigenele de histocompatibilitate (descrise de J. Dausset, 1958) sunt molecule de suprafa ale majoritii esuturilor. Din punct de vedere biochimic, ele sunt strict specifice fiecrui organism uman i animal i confer individualitate biochimic proprie fiecrui organism. Se numesc i antigene de transplantare, deoarece, dup grefarea unui esut sau a unui organ, moleculele de histocompatibilitate se comport ca antigene i declaneaz rspunsul imun al organismului receptor, care determin respingerea grefei.

Antigenele individuale de histocompatibilitate se evideniaz prin reacia de respingere a grefei. n funcie de raportul genetic dintre donor i receptor, antigenele de histocompatibilitate aparin urmtoarelor categorii:

1) autoantigenele includ antigenele proprii de histocompatibilitate, care, n condiii normale sunt tolerate de sistemul imunitar. Sub aciunea unor factori fizici, chimici sau biologici, antigenele de histocompatibilitate se modific devenind autoantigene, generatoare ale conflictelor autoimune;

2) izoantigenele cuprind antigenele de transplantare comune orga-nismelor identice din punct de vedere genetic, care aparin unei linii genetic pure (inbred). Verificarea puritii genetice a unei populaii de organisme se face prin transplantul de piele. Dac grefa este acceptat, organismele respective aparin aceleiai linii inbred. Termenii izoantigen i inbred nu au coresponden pentru populaia uman;

3) aloantigenele (alos = altul) includ molecule care, dup injectare declaneaz rspunsul imun la organisme ale aceleiai specii, dar diferite genetic, de organismul donor. Aloantigenele sunt inegal rspndite la indivizii unei specii i induc rspunsul imun la organismele care nu posed antigenul respectiv. Aloantigenele se evideniaz dup imunizarea unui organism, cu o suspensie celular provenit de la organisme ale aceleiai specii, dar aparinnd unui alotip diferit;

4) heteroantigenele (xenoantigene, xenos = strin) includ molecule care se gsesc n/pe celulele tuturor indivizilor unei specii i care se comport ca antigene fa de organismele altei specii. Heteroantigenele se evideniaz prin sinteza anticorpilor fa de antigenele celulelor provenite de la un organism al unei specii diferite.

Celulele unei specii diferite aduc n organismul receptor nu numai heteroantigene, ci i aloantigene i chiar autoantigene. De aceea injectarea unui heteroantigen este una dintre cele mai utilizate metode pentru a induce sinteza autoanticorpilor.

Antigenele de organ sunt molecule specifice care confer particularitile biochimice i funcionale ale celulelor unui organ. De exemplu, proteinele hepatice sau ale glandei mamare difer de proteinele esutului renal al aceluiai organism.

Antigene artificiale

La origine, antigenele artificiale sunt antigene naturale, modificate chimic prin cuplarea, cel mai adesea covalent, cu una sau mai multe molecule mici, care le confer o nou individualitate antigenic i o nou specificitate de combinare cu anticorpii, n raport cu molecula de origine.

Antigenele artificiale s-au obinut, n principal, pornind de la moleculele proteice. Prin legarea moleculelor proteice cu diferite haptene s-au obinut trei tipuri de antigene artificiale:

a) conjugate hapten-protein, prin reacia de diazotare, iodurare i respectiv substituie nucleofil;

b) conjugate protein-protein, prin intermediul unor ageni bifunc-ionali de legare (diizocianaii i carbodiimidele);

c) proteine legate de suporturi insolubile, prin reacia de diazotare sau prin intermediul carbodiimidelor.

a) Conjugatele hapten-protein au fost utilizate de Landsteiner, n studiile cu privire la mecanismele rspunsului imun. In conjugate, haptenele ndeplinesc rolul de epitopi (grupri determinate de specificitate), iar mole-culele proteice au rolul de carrier. Rspunsul imun nu este orientat strict fa de epitopii haptenici, ci i fa de determinani antigenici ai gruprii carrier.

Cuplarea hapten-purttor necesit existena unei grupri reactive a haptenei, care s se lege covalent cu gruprile funcionale ale purttorului, cu condiia pstrrii integritii funcionale a celor doi reactani. Haptenele se pot cupla cu purttori foarte diveri, dar proteinele naturale (albumina, globulinele) furnizeaz conjugate foarte imunogene.

Landsteiner a cuplat amino-benzen-sulfonatul cu molecule proteice, prin reacia de diazotare i a obinut azoproteine:

Dup cuplarea haptenei cu Tir, His sau Lys din structura unei proteine, rezult un antigen artificial care induce formarea a dou categorii de anticorpi cu specificiti diferite, dup cum reacioneaz cu haptena, sau cu molecula purttor.

Conjugatele azoproteice au permis studiul influenei configuraiei spaiale a haptenei, asupra specificitii antigenice. Gruparea sulfonat a fost legat n poziia orto, meta sau para a haptenei aminobenzen. Antiserurile obinute au specificitate fa de fiecare izomer. Izomerul meta al aminobenzen-sulfonatului, cuplat cu proteina, pstreaz capacitatea de a precipita cu anticorpii specifici fa de proteina nativ, n timp ce conjugatele cu izomerii orto- i para- dau reacie foarte slab de precipitare. Concluzia este c izomerii de poziie induc modificri sterice (conformaionale) ale haptenei.

Conjugatele hapten-protein se pot obine prin reacia de iodurare. Proteinele puternic iodurate i modific specificitatea antigenic. Ele induc sinteza anticorpilor care dau reacii ncruciate de precipitare cu proteinele iodurate heterologe. Semnificaia este c prin iodurare, proteinele i pierd specificitatea antigenic. Toate proteinele iodurate induc sinteza anticorpilor fa de o grupare iodurat, n special fa de tirozina iodurat, indiferent de specificitatea gruprii purttor.

O alt reacie de obinere a conjugatului hapten-protein este cea de substituie nucleofil. Cele mai folosite haptene sunt 2,4-dinitrofenolul(DNP) i 2,4,6-trinitrofenolul(TNP).

Mecanismul molecular al cuplrii este urmtorul: un atom de H din gruparea OH- , NH2+ sau SSH a proteinei, este nlocuit de gruparea haptenic prin eliminarea apei. Proteina pierde electroni, iar nucleul benzenic i accept. Gruprile donoare de electroni sunt OH- , NH2+, S-SH.

Gruprile DNP i TNP sunt cuplate cu proteina purttor sub forma 2,4-dinitrobenzen-sulfonatului de Na, a 2,4,6-trinitrobenzen-sulfonatului de Na sau subforma derivailor halogenai.

Reacia dintre o protein i 2,4-dinitrobenzen-sulfonatul de sodiu ilustreaz mecanismul atacului nucleofilic, reacie n care proteina cedeaz electroni, iar nucleul benzenic i accept.

b) Conjugatele protein-protein se obin prin intermediul agenilor bifuncionali de legare: diizocianaii i carbodiimidele. Deoarece gruprile ciano au reactivitate diferit, reacia de cuplare se realizeaz n trepte. De exemplu, gruparea din poziia 4 a toluilen-diizocianatului este mai reactiv dect gruparea ciano din poziia 2. Aceasta permite ca una dintre proteine s se cupleze n poziia 4, iar ulterior, ntr-o nou etap a reaciei, cea de a II-a protein se va cupla la gruparea ciano din poziia 2:

Carbodiimidele, utilizate ca ageni bifuncionali pentru cuplarea proteinelor, sunt considerate anhidride simetrice ale ureii:

H2N C NH2 HOH

HN = C =NH H2N C 4 N Cianamida asimetric

Uree Carbodiimida simetric

Carbodiimidele pot fi substituite simetric sau asimetric cu molecule proteice:

R1N = C = NR1 sau R1N = C = NR2.

Agenii bifuncionali de cuplare permit obinerea conjugatelor proteice (conjugate anticorpiferitin, insulin-albumin), dar se folosesc i ca mediatori ai legrii diferitelor molecule proteice pe suprafaa eritrocitelor.

Marcajul cu feritin este deosebit de important din punct de vedere practic, deoarece se folosete pentru evidenierea electrono-optic, la nivelul membranei, a diferitelor molecule proteice.

c) Conjugatele protein-suport insolubil se obin prin cuplarea proteinelor cu un suport insolubil, prin reacia de diazotare, prin intermediul carbodiimidelor sau al BrCN. Ca suporturi insolubile se folosesc derivai celulozici: sephadex, sepharoza, agaroza etc. Legarea proteinei de suport, prin reacia de diazotare, se face prin intermediul tirozinei, lizinei, histidinei, triptofanului sau argininei.

Conjugatele anticorpi-suport insolubil se numesc imunosorbeni i sunt folosii cu o eficien deosebit pentru purificarea proteinelor dintr-un amestec, datorit specificitii lor de combinare cu anticorpii corespunztori, fixai ntr-o coloan de material inert. Antigenul complementar specificitii de legare a anticorpului fixat n coloan, se leag necovalent de imunosorbent, dup care poate fi eluat cu un agent chimic.

Anticorpii pot fi imobilizai pe un suport insolubil, prin tratamentul cu un agent de legare ncruciat (glutaraldehid), dar multe din situsurile reactive pt fi denaturate sau rmn ascunse. Fig. 4. Principiul funcional al imunosorbenilor utilizai n cromatografia de afinitate. Coloana conine sefaroz, pe care sunt fixate moleculele de anticorp. Amestecul de antigene este trecut prin coloan, unde va fi reinut numai antigenul care recunoate specific anticorpul fixat.

Cel mai bun suport de imobilizare este agaroza, un polizaharid obinut prin fracionarea agarului. Agaroza este rezistent la aciunea degradativ a enzimelor bacteriene i a agenilor chimici i poate fi regenerat. Este disponibil subforma sferelor poroase hidratate, cu diametrul de 40-300 m i conine 2-8% agaroz n soluie apoas.

In coloana de imunosorbent se pot fixa nu numai anticorpii, ci i antigenele sau chiar celule intacte.

Imunosorbenii se folosesc n activitatea de cercetare i n clinic, pentru prepararea unor produse biologice i a medicamentelor.

Antigene sintetice

Antigenele sintetice sunt polimeri de aminoacizi, cu secven cunoscut, obinui in vitro. Proprietile imunogenice ale homopolimerilor (poli-Lys, poli-Glu, poli-Pro) i ale heteropolimerilor au fost studiate de M. Sela. Studiul imunogenitii heteropolimerilor are avantajul c ofer posibilitatea studiului influenei compoziiei chimice, a greutii moleculare i a conformaiei moleculare, uurnd studiul imunochimic al gruprilor determinante de specificitate antigenic.

Catenele polipeptidice sintetice pot fi lineare sau ramificate. Cele ramificate rezult prin ataarea polimerilor lineari, la o caten polifuncional. Ramificarea se obine mai uor cu aminoacizi aromatici.

Homopolimerii nu sunt imunogeni, cu excepia poli-L-Pro, poli-L-Glu, poli-L-Arg, poli-L-Lys. Copolimerii formai din doi aminoacizi nu sunt totdeauna imunogeni, dar cei rezultai prin polimerizarea a trei aminoacizi diferii sunt totdeauna imunogeni. Cu ct compoziia lor este mai heterogen, imunogenitatea este mai accentuat. Prezena aminoacizilor aromatici confer o anumit rigiditate a epitopilor i implicit, o imunogenitate superioar.

Pentru a fi imunogeni, copolimerii trebuie s fie catabolizai de aparatul enzimatic al celulelor care prelucreaz i prezint antigenul. Polipeptidele formate din D-aminoacizi sunt slab

imunogene, datorit incapacitii organismului de a cataboliza polimerul. Polipeptidele sintetice s-au dovedit a fi foarte utile n studiile de imunochimie, cu privire la:

- determinarea mrimii gruprii determinante de specificitate i indirect, a situsului de combinare a anticorpilor specifici;

- rolul dimensiunilor moleculei asupra proprietilor de imunogenitate;

- rolul configuraiei spaiale a moleculei n conferirea proprietii de imunogenitate;

- identificarea epitopilor secveniali i conformaionali.

Determinanii antigenici

De cele mai multe ori, antigenele sunt macromolecule complexe sau chiar celule ntregi, dar rspunsul imun, dup injectarea lor n organism, este orientat predominant fa de situsuri discrete, strict limitate ale antigenului, denumite grupri determinante de specificitate (gds), situsuri antigenice, determinani antigenici sau epitopi.

Epitopul este regiunea limitat a antigenului care induce un rspuns imun specific, se combin cu situsul activ al moleculei de anticorp i determin specificitatea reaciei antigen-anticorp.

Antigenele proteice prezint cea mai mare diversitate de epitopi, att n privina compoziiei chimice, ct i a configuraiei spaiale. Studiile de cristalografie cu raze X permit identificarea atomilor individuali ai unei molecule i determinarea mobilitii lor, exprimat n factori de temperatur atomic. Factorii de temperatur ridicat corespund regiunilor moleculare cu mobilitate nalt (regiuni calde). In molecula proteic, epitopii corespund zonelor moleculare cu o mobilitate nalt a atomilor. La temperatura biologic, aceste secvene necesit cantiti mici de energie, pentru a trece dintr-o conformaie n alta. Invers, regiunile moleculare cu mobilitate atomic redus au factori termici de valoare sczut (regiuni reci) i necesit o cantitate mai mare de energie pentru schimbarea conformaiei. Adeseori, epitopii antigenici sunt localizai n regiunile calde ale moleculei.

Capacitatea unei regiuni a moleculei de antigen de a funciona ca epitop (adic de a stimula rspunsul imun) se numete imunopoten.

Mrimea gruprii determinante de specificitate s-a apreciat indirect prin determinarea mrimii haptenei capabil s umpl complet situsul de combinare al anticorpului. n acest scop s-a utilizat sistemul dextran-antidextran, ntr-o reacie de precipitare. Dextranul cu greutate molecular de 50 kD este imunogen i prin injectare repetat la iepure, se obine serul imun antidextran. Artificial se prepar oligozaharide cu dimensiuni controlabile. Reacia de precipitare dextran-anticorpi specifici este inhibat progresiv de oligozaharidul de glucoz i este complet n prezena hexazaharidului. Oligomerul cu 6 resturi de glucoz corespunde celui mai bun ligand care se cupleaz cu anticorpii anti-dextran (ligandul este orice molecul capabil s formeze un complex cu o alt molecul). Heptazaharidul, ca i oligozaharidele cu mai puin de 6 resturi de glucoz inhib mai puin eficient reacia de precipitare a sistemului dextran-antidextran. Fig. 5. Oligozaharidul format din 6-7 resturi de glucoz, blochez cu cea mai mare eficien, reacia de precipitare dintre dextran i anticorpii specifici antidextran. Oligozaharidele mai mari sau mici nu se combin eficient cu anticorpii i inhib ntr-o msur progresiv mai mic reacia de precipitare cu dextranul.

Cercetri similare s-au fcut cu homopolimeri de aminoacizi (poli-Lys, poli-Ala), legai de proteine purttor. Serul imun obinut pe iepure, fa de aceste conjugate, conine predominant anticorpi specifici fa de haptena homopolimeric. Reacia de precipitare dintre serul specific i conjugatul hapten-protein, este inhibat de pentamerul de alanin, ceea ce denot c acesta se leag cu cea mai mare afinitate de situsul de combinare al anticorpului. Pentamerul corespunde mrimii epitopului antigenic al conjugatului i reflect, indirect, mrimea situsului de combinare al anticorpilor specifici.

n concluzie, mrimea unui epitop polizaharidic corespunde la 6-8 uniti monomerice, iar pentru antigenele proteice, epitopul are 4-6 aminoacizi.

Valena antigenului s-a definit convenional prin numrul de epitopi ai unui antigen. Numrul de epitopi ai unei molecule antigenice variaz n raport cu mrimea i complexitatea sa structural.

Valena se evalueaz prin numrul moleculelor de anticorp care reacioneaz cu o molecul de antigen. Pentru evaluarea numrului de epitopi ai unui antigen, trebuie avut n vedere c molecula de anticorp este bivalent (leag doi epitopi), dar i faptul c un antiser nu conine anticorpi fa de toi epitopii unui antigen.

Studiile privind reacia antigen-anticorp in vitro, au condus la concluzia existenei a trei tipuri de valene antigenice (epitopi):

- valenele funcionale conformaionale sunt conferite de epitopii conformaionali, situai la suprafaa moleculei native de antigen i sunt accesibili sistemelor imunitare de recunoatere specific a moleculei. Numrul lor este proporional cu greutatea molecular a antigenului i este dependent de complexitatea conformaional a moleculei. Un situs antigenic, teoretic, s-ar gsi la fiecare cteva mii de daltoni;

- valenele funcionale interne sunt reprezentate de epitopi interni, care, n molecula nativ sunt inaccesibile sistemului imunitar. Ele devin funcionale, in vivo, dup degradarea parial a moleculei, n celulele care prelucreaz antigenul;

- valene nefuncionale, reprezentate de epitopi criptici care nu devin funcionale dup prelucrarea antigenului in vivo, dar se pot releva dup clivarea enzimatic in vitro a moleculei.

Numrul total al epitopilor unui antigen nu se cunoate, dar se poate evalua cu aproximaie, dup degradarea parial a moleculei de antigen. De exemplu, albumina seric bovin nativ are 6 situsuri funcionale conformaionale. Dup scindarea enzimatic menajat in vitro, rezult 9 fragmente peptidice, fiecare dintre ele dnd reacie de precipitare cu serul anti-albumin nativ. Pentru ca reacia de precipitare s aib loc, sunt necesari cel puin doi epitopi, ceea ce nseamn c molecula de albumin seric bovin are cel puin 18 epitopi, care devin funcionali dup scindarea enzimatic a moleculei i induc sinteza anticorpilor specifici.

Efectul de carrier

Antigenele prezint o dualitate funcional evident, conferit de faptul c specificitatea rspunsului imun este orientat predominant, dar nu exclusiv, fa de gruprile determinante de specificitate. La rndul su, suportul macromolecular (carrier) are proprietatea de imunogenitate, dar confer i un grad de specificitate a rspunsului imun. Rezultatele experimentale cu conjugate hapten-protein (dinitrofenol-albumin seric) au evideniat c n cazul n care suportul carrier este nonself, rspunsul imun este mai intens. Antigenul artificial s-a obinut prin cuplarea DNP cu albumina de oarece. Injectarea conjugatului la oarece induce un rspuns imun slab, cu un titru sczut al anticorpilor anti-DNP(anti-hapten). Conjugatul DNP-albumin seric bovin, injectat la oarece, stimuleaz intens rspunsul imun primar anti-hapten, ceea ce demonstreaz c gruparea carrier are rol modulator asupra rspunsului imun.

Rolul gruprii carrier n reactivitatea imunitar a fost evideniat prin evaluarea titrului anticorpilor dup stimularea secundar. Animalele stimulate repetat cu haptena A, cuplat cu purttorul B, produc un rspuns imun secundar intens, cu anticorpi anti-hapten i anti-carrier. ns, n rspunsul imun secundar, dac stimularea s-a fcut cu haptena A, cuplat cu un carrier diferit (C) titrul anticorpilor anti-hapten nu crete. Acest fenomen curios s-a denumit efect de carrier.

Un purttor eficient pentru stimularea rspunsului imun trebuie s fie imunogenic, adic s stimuleze rspunsul celulelor T. Moleculele neimunogene sunt purttori ineficieni ai haptenelor, pentru stimularea rspunsului imun. Aceasta arat c mecanismele de recunoatere pentru hapten i pentru gruparea purttor sunt diferite.

Imunizarea cu conjugate hapten-carrier, a indus numai sinteza anticorpilor specifici antihapten, dac purttorul a fost un antigen T-dependent. Moleculele neimunogene nu au caliti de carrier pentru haptene.

Efectul de carrier denot c haptena i epitopii purttorului sunt recunoscui separat, de limfocitele B i respectiv T. Cele dou subpopulaii de celule coopereaz pentru a induce sinteza anticorpilor cu specificitate de hapten.

Factorii care condioneaz imunogenitatea

Antigenul este o substan nonself, care, la contactul cu celulele sistemului imunitar, declaneaz sinteza anticorpilor specifici i a receptorilor celulari cu care se combin in vitro i in vivo. Definiia este nesatisfctoare, pentru c se refer la ce face antigenul, fr s-l defineasc n termeni proprii. Definirea complet a antigenului este rezultatul nsumrii unei serii de proprieti, fiecare dintre ele fiind o condiie necesar a imunogenitii, dar nu i suficient.

Condiiile imunogenitii au fost deduse prin studii experimentale, utiliznd antigene artificiale i sintetice.

1. Caracterul strin al moleculei este condiia major a imunogenitii. O molecul nonself este cu att mai imunogen, cu ct este mai diferit de moleculele organismului receptor. In esen, caracterul nonself al unei molecule nu este strict dependent de raporturile taxonomice ale organismului donor cu cel receptor de antigen, ci este consecina deosebirilor de structur molecular.

Cele mai multe proteine ale unei specii sunt nonself pentru alte specii, dar uneori, proteinele omologe ale unor specii sunt lipsite reciproc de imunogenitate. De exemplu, hemoglobina de cal nu este imunogen pentru iepure, dei celelalte proteine de cal sunt imunogene. Caracterul nonself nu implic n mod obligatoriu existena unor molecule cu totul noi, nentlnite la organismul receptor, ci numai modificri minime ale moleculei, conferite de existena ctorva aminoacizi diferii n anumite poziii ale catenei proteice. Pentru restul secvenei, molecula nonself poate fi asemntoare proteinelor proprii organismului receptor de antigen. Micile diferene de secven a aminoacizilor, au rolul de epitopi. De regul, proteinele aprute timpuriu

n evoluie au un grad superior de asemnare chimic interspecific i sunt slab imunogene pentru speciile nrudite (de exemplu, albumina seric), iar cele aprute mai trziu (de exemplu, globulinele serice) sunt mai heterogene i mai imunogene.

2. Mrimea moleculei influeneaz imunogenitatea moleculelor nonself. Pentru a fi imunogen, o molecul trebuie s aib dimensiuni care s depeasc un prag limit. Moleculele cu o bun imunogenitate sunt mai mari de 10 kD. Cu ct o molecul este mai mare, cu att numrul epitopilor si este mai mare. Secvenele de aminoacizi cu rol de epitopi au ansa repetrii de mai multe ori ntr-o molecul mai mare. Proteinele mari (de exemplu, ovalbumina 40 kD, albumina seric - 70 kD, hemocianina 6000 kD) sunt foarte imunogene, iar cele cu molecul mic (insulina 5,7 kD, histonele 6 kd, glucagonul 3,5 kD) sunt puin imunogene. Glucagonul este cea mai mic molecul natural fa de care s-au obinut anticorpi, iar cea mai mic molecul sintetic imunogen este un polipeptid de 1,4 kD.

Pentru polizaharide, limitele minime pentru imunogenitate sunt mai mari. Dextranii sunt antigenici dac au peste 50 kD, cu variaii mari de rspuns imun de la o specie la alta (omul i oarecele rspund bine, cobaiul foarte puin).

Moleculele mici neimunogene sau slab imunogene pot dobndi o imunogenitate optim, dup adsorbia pe particule inerte de colodiu, caolin sau de crbune. Acestea au rol de purttori i asigur creterea taliei moleculare.

3. Complexitatea molecular. Dimensiunile mari ale unei molecule nonself nu sunt totdeauna suficiente pentru a-i conferi imunogenitate. De exemplu, moleculele de polimeri sintetici (poliacrilamida, nylonul) sunt foarte mari, fiind formate dintr-un numr mare de monomeri repetitivi, dar nu sunt imunogene pentru c nu au complexitatea molecular minim necesar.

Moleculele naturale, n special proteinele au un grad nalt de complexitate, datorit diversitii monomerilor componeni. Fiecare tip de molecul proteic are o configuraie tridimensional unic, determinat de secvena specific de aminoacizi.

Proteinele globulare au cea mai mare complexitate antigenic, derivat din configuraia lor teriar. Ele posed epitopi exprimai pe suprafaa moleculei native, accesibili fenomenului de recunoatere de ctre celulele sistemului imunitar i epitopi interni, care pot stimula rspunsul imun, dup clivarea enzimatic a moleculei n celulele specializate pentru prelucrarea antigenelor. De exemplu, serul imun anti- albumin seric bovin precipit cu fiecare din cele 9 fragmente peptidice rezultate prin clivajul enzimatic al moleculei native, ceea ce sugereaz c in

vivo, molecula este scindat i astfel se relev epitopi interni, fa de care se sintetizeaz anticorpi specifici.

Complexitatea unei molecule nu depinde numai de diversitatea monomerilor, ci i de secvena lor i de efectul secvenei asupra structurii secundare, teriare i eventual quaternare a moleculei.

4. Starea fizic a antigenului. Imunogenitatea unei molecule este condiionat de o anumit rigiditate a epitopilor si. Lipsa rigiditii ar explica imunogenitatea redus a gelatinei, o protein denaturat, derivat din hidroliza colagenului, foarte bogat n glicocol (21-35%).

n mod obinuit, rotaia liber a unei molecule are loc numai ntre C i legtura peptidic. Glicocolul nu realizeaz ramificaii ale catenei polipeptidice n poziia C , ceea ce face ca molecula de gelatin s prezinte rotaii libere n jurul axului longitudinal. Gelatina are o proporie foarte mic de aminoacizi aromatici (Tir, His), iar cisteina i triptofanul lipsesc. Legarea L-Tir, n proporie de 2% mrete gradul de imunogenitate a gelatinei. Complexul induce sinteza anticorpilor care precipit gelatina nativ.

5. Solubilitatea. Condiia solubilitii unui antigen pentru a fi imunogen este sugerat de urmtarele observaii:

- polimerii macromoleculari sintetici care nu sunt solubilizai, adic nu sunt hidrolizai, sunt lipsii de imunogenitate;

- organismele cu echipamente enzimatice hidrolitice mai active (oarece) elaboreaz un rspuns imun mai amplu fa de un antigen greu solubil(de exemplu, polizaharidul de pneumococ), n raport cu organismele care hidrolizeaz mai greu (de exemplu, iepurele);

- antigenele corpusculare (celule, virioni) devin imunogene dup solubilizarea i eliberarea componentelor imunogene n macrofag, unde are loc degradarea menajat a antigenelor.

Hidroliza enzimatic a antigenului nu este totdeauna o condiie prealabil obligatorie a imunogenitii. Studiile cu antigene sintetice au artat c, n momentul recunoaterii de ctre celulele sistemului imunitar, o parte a epitopilor sunt intaci, identici cu aceia ai moleculei native.

6. Accesibilitatea determinanilor antigenici. Pentru ca un epitop s fie imunogen, trebuie s fie expus la suprafaa moleculei, pentru a fi accesibil mecanismelor de recunoatere imunitar. De exemplu, un polimer de L-Lys, cu rol de purttor pentru tripeptidul Tir-Ala-Glu este imunogen. Dup mascarea epitopilor tripeptidici cu catene de poli-Ala, molecula i pierde imunogenitatea. Fig. 6. Rolul accesibilitii determinanilor antigenici n imunogenitate. Copolimerul multicatenar format din acidul L-glutamic (G) i tirozina (T), legat prin intermediul poli Lalaninei (A-A), de purttorul polilizin este imunogen. Acelai copolimer, legat direct de purttorul polilizin, dar mascat de polialanin, este neimunogen.

7. Configuraia spaial a moleculei este un factor decisiv pentru imunogenez. Studiile privind imunogenitatea antigenelor sintetice, au evideniat c cel mai adesea, anticorpii se formeaz fa de o anumit secven de aminoacizi, care are rol de epitop. Dar, uneori, anticorpii sunt specifici fa de configuraia spaial a unui determinant antigenic. Concluzia a reieit din specificitatea distinct a anticorpilor fa de dou polipeptide sintetice cu aceiai compoziie chimic, dar cu configuraii spaiale diferite. In primul caz, determinantul antigenic este tripeptidul Tir-Ala-Glu, legat de un polimer sintetic, cu rol de purttor. La iepure, se sintetizeaz anticorpi specifici fa de tripeptidul Tir-Ala-Glu.

n al II-lea caz, prin polimerizarea tripeptidului se obine o molecul cu structura periodic a secvenei Tir-Ala-Glu, care dobndete configuraie -helical. Dup imunizarea iepurelui, se sintetizeaz anticorpi care precipit moleculele cu structur spaial -helical, dar nu precipit tripeptidul simplu. Pe baza acestor observaii, M. Sela recunoate existena a dou tipuri de determinani antigenici:

- determinani secveniali, a cror specificitate este dat de secvena subunitilor componente (aminoacizi, monozaharide), indiferent de structura spaial a moleculei. Epitopii secveniali sunt comuni pentru toate polipeptidele care au secvene de aminoacizi identice sau asemntoare i existena lor este o surs a reaciilor imune ncruciate; Fig. 7. Tipuri de epitopi. Epitopi secveniali i conformaionali, continui i discontinui.

- determinani antigenici conformaionali, a cror specificitate deriv din configuraia spaial a moleculei. Epitopii conformaionali sunt de dou feluri: continui i discontinui. Cei discontinui sunt formai din regiuni distincte ale moleculei, care ajung n juxtapoziie cnd molecula se pliaz n configuraia sa nativ.

Meninerea integritii determinanilor conforma-ionali este condiionat de integritatea legturilor S-S. Dup fragmentarea enzima-tic a moleculei, epitopii conformaionali discontinui i pierd integritatea i semnificaia funcional, iar cei continui au o soart variabil: i pierd sau i pstreaz configuraia avut n molecula nativ.

Importana epitopilor conformaionali a fost evi-deniat pentru molecula de lizozim din albuul de ou de gin. Bucla format de aminacizii 64-80 este nchis de o legtur S-S ntre dou resturi de cistein. Secvena buclei a fost sintetizat artificial i legat de polimerul Ala-Lys, cu rol de carrier. Complexul format induce sinteza anticorpilor la iepure, specifici fa de aceast secven, dar dau reacie de precipitare i cu molecula nativ de lizozim. Fig. 8. Bucla format din aminoacizii 64-80 ai secvenei moleculei de lizozim din albuul de ou, formeaz un determinant conformaional.

n general, anticorpii care se sintetizeaz fa de antigenele proteice naturale au specificitate, n primul rnd, fa de epitopii conformaionali i mai rar fa de cei secveniali, ceea ce denot c sistemul imunitar recunoate molecula nativ sau regiuni ale ei, cu configuraia spaial iniial.

n concluzie, studiul antigenelor sintetice a avut un rol decisiv pentru definirea condiiilor de imunogenitate. Polizaharidele sunt molecule cu o slab imunogenitate, corespunztoare unei complexiti moleculare limitate. Acizii nucleici i lipidele sunt molecule neimunogene n stare nativ, dar dup cuplarea cu un suport proteic, ndeplinesc rolul de haptene i devin foarte imunogene. Din aceast cauz, nucleoproteinele i lipoproteinele sunt antigene foarte eficiente. Proteinele native sunt imunogene, dar pentru exprimarea la un nivel superior a acestei proprieti, trebuie s ndeplineasc condiiile enumerate. Acestea, luate n parte, sunt necesare, dar nu suficiente. O bun imunogenitate este rezultatul cumulrii unui numr ct mai mare de condiii.

Un antigen ideal trebuie s fie greu degradabil (pentru o persisten ct mai lung n organism), s fie timodependent i s aib un numr ct mai mare de semnale imunogene (epitopi), conectate ntr-un ansamblu funcional, denumit imunon.

Antigene endogene

Antigenele endogene sunt componente celulare i tisulare proprii (self), fa de care, n condiii normale, sistemul imunitar nu manifest reactivitate. Totui, unele componente tisulare, n

anumite condiii, pot s stimuleze reactivitatea imunitar. Se disting dou categorii de antigene endogene: 1) antigene sechestrate (mascate) i 2) antigene alterate.

Antigenele sechestrate sunt substane cu localizare intracelular i de aceea nu sunt accesibile sistemului imunitar pentru a fi recunoscute n cursul dezvoltrii ontogenetice. Sub aciunea unor factori (fizici, chimici, biologici), inductori ai unor procese de liz celular, moleculele cu localizare intracelular se pot elibera i sunt recunoscute ca nonself de sistemul imunitar. De exemplu, anticorpii antimitocondriali care caracterizeaz ciroza biliar primitiv, se sintetizeaz dup liza unor celule i eliberarea acestor organite.

Alteori, unele componente tisulare sunt separate de sistemul imunitar, prin bariere anatomice:

- proteinele cristalinului, delimitate de cristaloid, se elibereaz n cursul interveniilor chirurgicale, dup traumatisme care sparg capsula sau dup afeciuni care permeabilizeaz cristaloida. Ele sunt recunoscute ca molecule nonself i stimuleaz rspunsul imun anti-cristalin, ce poate afecta irisul, procesele ciliare i coroida;

- proteinele spermatice, n strile de spermostaz, induc sinteza local a autoanticorpilor n structurile epididimului. Anticorpii recunosc specific un antigen al spermatozoizilor i rezultatul este imobilizarea sau chiar aglutinarea, cu consecina sa, sterilitatea imunitar;

- caseina din lapte poate stimula reactivitatea autoimunitar.

Antigenele alterate sunt molecule normale ale suprafeei celulare, legate de membran, care, din diferite cauze(uzur fiziologic sau sub aciunea diferiilor factori fizici, chimici, biologici) i modific structura chimic i sunt recunoscute ca molecule nonself. De exemplu, unele medicamente, dup legarea cu diferite molecule din plasm sau de pe suprafaa eritrocitelor, le modific conformaia nativ i acestea sunt recunoscute ca nonself. Virusurile induc sinteza n celula infectat, a antigenelor proprii, dar adeseori moleculele specific virale determin modificarea unor molecule self, care sunt recunoscute ca molecule strine i iniiaz conflictul autoimun.

n condiii normale, antigenele sechestrate i alterate sunt neutralizate i eliminate, fr consecine patologice. n 1900, Ehrlich a formulat conceptul horror autotoxicus, care semnific preponderena aciunii mecanismelor homeostatice. In condiiile unei reactiviti imunitare crescute, activarea rspunsului imun fa de aceste componente chimice are drept consecine, declanarea maladiilor autoimune, considerate ca fiind expresia patologic a funciei imunitare.

Antigene heterofile

Antigenele heterofile sunt substane neidentice, dar nrudite chimic, prezente la numeroase specii de organisme: om, animale, plante, microorganisme. Particularitatea dominant const n faptul c ele induc sinteza anticorpilor care dau reacii ncruciate: anticorpii specifici fa de un antigen al grupului heterofil, reacioneaz (ntr-o reacie de precipitare sau de aglutinare) cu oricare dintre antigenele grupului.

Prototipul antigenelor heterofile este antigenul de tip Forssman, descoperit n 1911 n esuturile de cobai. J. Forssman a descoperit c serul imun obinut prin imunizarea iepurelui cu omogenat tisular de cobai, aglutineaz eritrocitele de berbec. Este o reacie ncruciat, pe care autorul a denumit-o reacie heterolog. Termenul heterolog s-a pstrat pentru reaciile ncruciate previzibile, pe care le manifest diferite antigene nrudite (de exemplu, albumina seric de om i de primate). Denumirea heterofil s-a atribuit reaciilor ncruciate pe care le produc antigene nenrudite.

Regnul animal poate fi mprit n specii Forssman pozitive (cobai, hamster, oarece, oaie, capr, cal, pisic, cine, pui de gin etc.) i specii Forssman negative (om, iepure, obolan, maimue, bou, gsc). Nici unele nici altele nu au vreun grad de nrudire genetic.

Absena antigenului Forssman pe suprafaa celulelor tisulare la iepure, este foarte important din punct de vedere practic. Serul imun anti-antigen Forssman se obine prin imunizarea iepurelui cu o suspensie de hematii de berbec. In contact cu hematiile de berbec, serul imun obinut pe iepure, produce aglutinarea lor, iar n prezena complementului se produce liza. Anticorpii specifici fa de antigenele hematiei de berbec dau reacie ncruciat cu antigenele tisulare ale grupului Forssman, dar i cu antigene de origine bacterian. Antigene de tip Forssman s-au identificat ulterior, prin reacii serologice, n celulele unor bacterii patogene (Str. pneumoniae, Shigella, Salmonella) i chiar n celulele microbiotei din tractul digestiv, ceea ce explic prezena anticorpilor naturali anti-hematie de berbec, n serul uman.

Reaciile imune ncruciate pe care antigenele de tip Forssman le dau cu serul imun obinut fa de unul din antigenele grupului se explic prin asemnarea structurii chimice a acestor molecule. Cele mai multe antigene heterofile sunt glicoproteine sau glicolipide, n care gruprile glucidice au rolul de haptene. Componentele glucidice ale antigenelor heterofile sunt foarte asemntoare din punct de vedere chimic, chiar dac aparin unor organisme cu poziie sistematic foarte diferit. Antigenul Forssman este un glico-sfingolipid, la care determinantul antigenic este format din dou resturi de N-acetil-galactozamin.

Polizaharidele antigenelor de tip Forssman, n stare purificat, nu sunt imunogene, sunt rezistente la fierbere i chiar la autoclavare.

Cele mai importante sisteme heterofile sunt cele cu semnificaie biologic sau importan medical: sistemul Forssman, sistemul Paul-Bunnell (P-B) i sistemul Hanganutziu-Deicher(HD).

Anticorpii caracteristici mononucleozei infecioase (Paul i Bunnell, 1932) apar la 90% dintre pacienii infectai cu virusul Epstein-Barr i sunt IgM care se evideniaz ntr-o reacie de aglutinare cu eritrocite de ovine sau bovine. Anticorpii serici recunosc dou antigene distincte: un antigen prezent numai pe eritrocitele bovine (B) i un al II-lea antigen, existent att pe eritrocitele de bovine ct i pe cele de ovine (BS). Majoritatea pacienilor cu mononucleoz infecioas sintetizeaz anticorpi anti-B i anti-BS, dar o mic proporie conin numai anticorpi anti-B. Anticorpii P-B se sintetizeaz fa de un antigen, ce pare a fi o glicoprotein codificat de virus.

Anticorpii H-D, descrii de Hanganutziu (1924) i Deicher (1926) sunt declanatori ai maladiei serului, la pacienii care au primit injecii de ser heterolog. Sinteza lor este indus de antigenul H-D, care se gsete n esuturile mamiferelor, dar lipsete din esuturile normale umane, ns reapare n unele esuturi umane patologice (limfoame i mieloame). Din punct de vedere chimic, antigenul H-D este acid N-glicolil-neuraminic.

Alte antigene heterofile. Antigenele grupului Rh se gsesc pe eritrocitele maimuei Macaccus rhesus i pe eritrocitele a circa 85% dintre indivizii umani.

Antigenul H de pe eritrocitele umane de grup 0 este foarte asemntor cu un polizaharid al celulelor de Yersinia pestis (agentul ciumei), iar antigenul eritrocitar uman de grup A este asemntor cu un antigen al virusului variolei (smallpox). Dezavantajul asemnrii chimice dintre antigenele unor ageni patogeni i antigenele de grup sanguin este evident: indivizii umani de grup sanguin 0 i A reacioneaz mai slab la contactul cu antigenele asemntoare, iar procesul infecios se instaleaz mai rapid.

O importan practic deosebit au antigenele heterofile de T. pallidum i cele de Proteus ox19. Fracia major a anticorpilor specifici fa de T. pallidum aglutineaz o suspensie de celule bacteriene de Proteus ox19. Aceiai fracie a anticorpilor se combin cu cardiolipina, ceea ce permite ca n reacia de fixare a complementului pentru determinarea infeciei cu T. pallidum s se utilizeze antigenul cardiolipinic, mult mai uor de obinut.

Adjuvanii Substanele sau amestecurile de substane, care n asociaie cu un antigen sau injectate simultan cu acesta, intensific rspunsul imun specific fa de antigenul respectiv sunt denumite adjuvani (adjuvere, latin = a ajuta).

Punctul de plecare al introducerii adjuvanilor n practica imunologic a fost un fapt de observaie: dup asocierea unui vaccin bacterian celular, cu un vaccin macromolecular (anatoxin), rspunsul imun antitoxin este mult mai intens dect n cazul n care cele dou vaccinuri se administreaz separat. Dup injectarea vaccinului celular anti-tifoparatific A i B, mpreun cu anatoxina tetanic (TAB), titrul anticorpilor fa de anatoxina tetanic este de 20-30 de ori mai mare dect n cazul injectrii separate a anatoxinei tetanice. Explicaia acestui fenomen a fost dat ulterior: la locul injectrii vaccinului, corpii celulari bacterieni determin un proces inflamator, adic un aflux local de celule efectoare ale rspunsului imun (limfocite, macrofage). Macrofagele capteaz i fixeaz anatoxina ntr-un stoc, de unde este eliberat treptat i astfel se prelungete durata de stimulare a sistemului imunitar.

Cel mai cunoscut i folosit pentru studiul experimental al imunogenitii antigenelor este adjuvantul Freund, o emulsie1 de ap n ulei mineral de parafin. Antigenul se suspend n ap. Emulsia de ap n ulei se realizeaz cu un emulgator care conine grupri lipofile i hidrofile (lanolina, arlacel A). Acesta este adjuvantul Freund incomplet. Dup adugarea celulelor omorte de M. tuberculosis, rezult adjuvantul Freund complet. Principiul imunostimulator al celulelor de M. tuberculosis este reprezentat de glicolipidele i glicolipopeptidele(denumite ceruri) din structura peretelui celular. Glicolipopeptidele sunt formate din acizi micolici esterificai cu un polizaharid (arabinogalactan) ce conine arabinoz, galactoz, manoz, la care se leag un fragment peptidic ce conine D i L-alanin, acid D-glutamic, acid diaminopimelic. Fig. 9. Reprezentarea schematic a interaciunii moleculelor componente ale adjuvantului Freund.

Adjuvantul Freund determin urmtoarele efecte: a) persistena antigenului n organism prin ntrzierea degradrii sale i eliberarea treptat n circulaie; b) picturile de emulsie vehiculeaz antigenul pe cale limfatic, n tot organismul, inclusiv spre ganglionii limfatici, unde se va declana rspunsul imun; c) adjuvantul Freund complet i incomplet fac imunogene doze mici de antigene, care altfel nu ar fi imunogene i mresc semnificativ titrul anticorpilor fa de oricare antigen.

Amestecul de adjuvant i antigen se administreaz subcutan sau intradermic. Administrarea intravenoas anuleaz efectul adjuvantului. Este posibil administrarea decalat la interval de cteva zile (mai nti a adjuvantului), dac cele dou injectri se fac n acelai loc.

Efectul stimulator al adjuvantului Freund este foarte intens pentru dozele mici de antigen. Este foarte eficient n asociaie cu antigenele proteice, stimulnd sinteza IgG. Utilizarea sa la om este limitat de efectele secundare pe care le produce (artrita de adjuvant).

Endotoxinele bacteriilor Gram negative (Salmonella, Brucella, Bordetella etc.) au efect adjuvant. Ele sunt n acelai timp adjuvani, antigene, toxine i factori pirogeni. Efectul maxim se obine numai dac endotoxina se administreaz simultan sau la mai puin de 6 ore dup injectarea antigenului. Nu se adaug vaccinurilor umane pentru c produce febr.

Srurile de aluminiu (Al(OH)3, Al(SO4)2. 12 H2O), fosfatul de aluminiu) i cele de calciu au efect adjuvant, deoarece se combin cu imunogenul i formeaz un complex insolubil la situsul subcutan sau intramuscular al injectrii, mrind intervalul de timp n care celulele imunitare pot fi activate. Se stimuleaz afluxul de fagocite i funcia de fagocitoz.

Compuii aluminiului sunt singurii adjuvani acceptai n clinica uman i veterinar, dei prezint unele dezavantaje: stimuleaz rspunsul imun mediat humoral, dar nu i imunitatea mediat celular; vaccinurile care conin compui ai Al nu pot fi conservate prin nghe i nici liofilizate i de aceea necesit transport refrigerat.

Ali adjuvani acioneaz prin stimularea activitii enzimelor lizosomale. Vitamina A i srurile de beriliu, de siliciu, srurile quaternare de amoniu mobilizeaz macrofagele la locul injectrii i stimuleaz activitatea lor fagocitar i degradativ.

1Emulsia este o suspensie de picturi mici ale unui lichid n alt lichid, cu care nu este miscibil.

IMUNOGLOBULINELE (ANTICORPII)

Existena anticorpilor a fost demonstrat de Behring i Kitasato (1890), n serul animalelor imunizate experimental cu toxina tetanic. Serul lor neutralizeaz toxina in vitro i o face inofensiv pentru animalele de experien. Autorii au folosit denumirea de anticorp pentru a desemna substanele protectoare ce apar n ser, cu specificitate fa de un antigen corpuscular (bacterii).

Heidelberger (1930) a purificat anticorpii din ser i a evideniat c aparin fraciei proteice. Tiselius i Kabat (1938) au demonstrat experimental c, de cele mai multe ori, funcia de anticorp este asociat cu fracia gama a proteinelor serice i le-au dat denumirea de gamaglobuline.

n 1970, prin consens ntre specialiti, OMS a stabilit ca substanele cu proprieti de anticorp, s fie grupate n categoria imunoglobulinelor, pornind de la faptul c toate substanele din acest grup au funcie imunitar i sunt cuprinse n fracia globulinic a serului. Anticorpii nu sunt numai gamaglobuline. Exist i alte globuline cu funcie de anticorp, dup cum exist i gamaglobuline care nu au activitate de anticorp (de exemplu, proteinele patologice Bence-Jones).

Fig.10. Mobilitatea electroforetic a imunoglobulinelor serice. IgG are cea mai heterogen sarcin electric i migreaz n regiunile gama i beta. IgE are are mobilitate similar cu a IgD, dar nu poate fi identificat pe electroforegram datorit nivelului seric sczut.

Anticorpii sunt imunoglobuline care se sintetizeaz n organism dup ptrunderea unui antigen i au proprietatea de a se cupla specific cu antigenul inductor i de a-i anihila aciunea nociv. Termenul de anticorp n accepiunea sa actual, a fost folosit de Ehrlich (1891) n lucrarea Studii experimentale asupra imunitii.

Anticorpii formeaz 20% din totalul proteinelor plasmatice, dar se gsesc i n lichidele extravasculare, n secreiile exocrine (saliv, lapte, lacrimi) i ca molecule receptor de anti-gen pe suprafaa limfo-citelor B.

Moleculele de anticorpi au cea mai mic mobilitate electroforetic. Dei sunt asemntoare ca structur, moleculele de imunoglobuline formeaz o familie de o diversitate imens, nentlnit la nici o alt protein. Diversitatea lor uria este ordonat n clase i subclase, n primul rnd pe baza compoziiei n aminoacizi. Heterogenitatea compoziiei n aminoacizi se reflect n sarcina lor electric, foarte diferit. La electroforez, celelalte proteine serice migreaz ca o band compact, cu o mobilitate caracteristic, deoarece moleculele lor sunt omogene n ceea ce privete sarcina electric, la un pH dat. Imunoglobulinele migreaz ca o band larg, fiind heterogene, nu numai prin secvena aminoacizilor, ci i prin sarcina electric.

Structura moleculei de imunoglobulin

Structura moleculei de imunoglobulin (Ig) s-a stabilit prin analiza proteinelor omogene secretate de plasmocitoame, cu metodologii complexe: biochimice, analitice, cristalografia prin difracie cu raze X.

Unitatea structural de baz a moleculei de Ig este monomerul. Acesta este o unitate tetrapeptidic, format prin asocierea a dou lanuri grele (H, Heavy = greu), fiecare avnd circa 450 de aminoacizi i o greutate molecular cuprins ntre 50-76 kD i dou lanuri uoare (L, Light = uor), fiecare avnd circa 216 aminoacizi i o greutate molecular de 25 kD. Cele 4 catene polipeptidice sunt legate ntre ele prin puni S-S i se rsucesc n spiral - att unul fa de altul, dar i fiecare separat fa de propria-i ax, rezultnd o configuraie tridimensional, stabilizat prin 16-24 legturi S-S i prin alte interaciuni necovalente. Monomerul tetrapeptidic tridimensional are form de T sau de Y.

n funcie de secvena aminoacizilor, fiecare lan polipeptidic este alctuit din dou regiuni distincte:

a) regiunea constant (C ) corespunde jumtii C-terminale a celor 4 catene polipeptidice. Are o secven relativ uniform a aminoacizilor i asigur unitatea structural i funcional a moleculei de Ig;

b) regiunea variabil (V) cuprinde o secven de circa 110 aminoacizi n jumtatea N-terminal a celor 4 catene polipeptidice. Mrimea sa nu este fix, deoarece intervin inserii sau deleii de 3-6 aminoacizi. Regiunile variabile ale fiecrei perechi de catene formeaz situsul de combinare al moleculei de Ig, care confer specificitate de legare cu antigenul.

Variabilitatea maxim a secvenei de aminoacizi a catenei L se concentreaz n poziiile 24-34, 50-55, 89-97, iar a catenei H, la secvenele 30-36, 50-56, 86-91 i 95-100. Aceste secvene formeaz regiunile hipervariabile sau regiunile determinante de complementaritate (RDC), fa de configuraia spaial a epitopului. Aminoacizii acestor secvene intr n alctuirea situsului de combinare al moleculei de Ig.

Secvenele relativ invariante se numesc regiuni cadru (RC) i formeaz 80-85% din regiunea variabil a moleculei de Ig. Variaia secvenei aminoacizilor la nivelul regiunilor cadru este limitat la 5%. Secvena regiunilor cadru i a celor determinante de complementaritate alterneaz astfel: RC1, RDC1, RC2, RDC2, RC3, RDC3, RC4, RDC4.

Aproape de jumtatea catenelor H se gsete o secven de circa 15 aminoacizi, n care sunt grupate toate resturile de cistein ce formeaz puni S-S intercatenare. Aceast secven se numete regiunea balama. Este sensibil la aciunea proteazelor fiind clivat de papain, pepsin etc. La IgM i IgE, regiunea balama lipsete, dar cea omolog balamalei este clivat de proteaze. Regiunea balama asigur flexibilitatea moleculei de Ig, permind mobilitatea fragmentelor Fab, care, teoretic, pot forma unghiuri variabile, ntre 0-180o, conferind moleculei o geometrie variabil. Cele 16-24 legturi S-S ale monomerului tetrapeptidic sunt constante ca numr i localizare pentru diferitele clase de Ig. Se disting 3 categorii de puni S-S:

- legturi intercatenare H-H sau L-H, ale unui monomer. Legturile L-L s-au descris la IgA2 i la proteinele Bence-Jones, care sunt dimeri de lanuri L;

- legturi intracatenare, care determin structura teriar a fiecrui lan polipeptidic.

- legturi intercatenare, ntre lanurile H ce aparin unor monomeri diferii, la IgA2 i IgM, care formeaz complexe moleculare polimerice:

moleculei de Ig se formeaz prin plierea fiecreia din cele 4 catene polipeptidice i prin rsucirea lor n spiral. Domeniile sunt regiuni globulare ale moleculei, legate ntre ele prin secvene lineare scurte. Domeniile se pliaz ntr-o conformaie stabil, conferit de secvena proprie de aminoacizi. Comparativ cu secvenele lineare, domeniile pliate sunt mai rezistente la proteoliz.

Catena L are dou domenii: unul corespunztor regiunii variabile (VL) i altul corespunztor regiunii constante (CL).

Catena H are 4 domenii: unul corespunztor regiunii variabile (VH) i trei domenii ale regiunii constante: CH1, CH2, CH3. Fig. 11. a. Reprezentarea schematic a structurii primare a moleculei de imunoglobulin.

Fig. 11. b. Localizarea diferitelor funcii ale moleculei de anticorp.

Fiecare caten H a moleculelor de IgM i IgE are 5 domenii: unul n regiunea variabil (VH) i 4 n regiunea constant (CH1 CH4).

Secvena de legtur ntre regiunea constant (CH1) i cea variabil a fiecrei catene se numete zon de comutare (s = switch).

Fiecare domeniu are o form cilindric sau globular, cuprinde o secven de circa 60 de aminoacizi i este stabilizat prin interaciuni necovalente de tip trans, cu domeniul omolog din lanul opus i de tip cis, cu domeniul vecin al aceleiai catene.

Domeniile fiecrui lan, mpreun cu cele omologe ale lanului opus, formeaz uniti funcionale denumite module. Cooperarea lor funcional este ilustrat de faptul c domeniile VL i VH separate, au o capacitate foarte limitat de legare a antigenului, n timp ce forma lor asociat (care constituie situsul de legare al moleculei) este foarte eficient n legarea antigenului. Fig. 12. Reprezentarea schematic a domeniilor pliate i stabilizate ale moleculei de IgG.

Moleculele de imunoglobuline exist sub dou forme: secretate, ca anticorpi n umorile organismului i legate de membrana limfocitelor B, ndeplinind funcia de receptori de antigen. Forma legat prezint o secven hidrofob la captul C-terminal, de circa 30 de aminoacizi, care strbate membrana i se ancoreaz n structura ei.

Metodele de clivare i de denaturare chimic a moleculei de imunoglobulin au contribuit la nelegerea structurii i funciei sale. Clivarea s-a realizat cu enzime proteolitice (papain, pepsin, tripsin) sau prin cianoliz cu BrCN.

Fig. 13. Clivajul enzimatic al moleculei de IgG1 umane. Pepsina cliveaz catena H i elibereaz fragmentele F(ab)2 i regiunea Fc (segmentul cristalizabil). Hidroliza prelungit taie fragmentul Fc n peptide scurte. Papaina cliveaz molecula n regiunea balama (la restul 224) i elibereaz dou fragmente Fab i un fragment Fc (dup Roitt, 1984).

Papaina scindeaz mo-lecula de imunoglobulin la nivelul regiunii balama (aminoacidul 224) i elibe-reaz dou fragmente Fab (Fragment antigen binding) i fragmentul Fc (cristalizabil). Fiecare fragment Fab (50 kD) conine un lan L ntreg i jumtatea N-terminal a lanului H, notat cu Fd (difficult), care cuprinde domeniile VH i CH1. Frag-mentul Fab poate fi scindat transversal i rezult frag-mentul Fv (variabil) format din domeniile VL i VH, se-parat de domeniile CL i CH1.

Fragmentul Fc (50 kD) este format din jumtile C-terminale ale celor dou catene H, unite printr-o legtur S-S i prin legturi necovalente.

Pepsina cliveaz lan-urile H sub regiunea balama i elibereaz fragmentul Fc, mai mic dect fragmentul Fc papainic i dou fragmente Fab legate ntre ele (Fab)2, prin puni S-S intercatenare.

BrCN scindeaz lanurile polipeptidice la nivelul secvenelor cu Met, pe care o transform n homoserin. Fragmentele rezultate sunt heterogene ca mrime, n funcie de frecvena metioninei. Polipeptidele rezultate prin clivare enzimatic, ct i prin cianoliz, se separ prin tehnici cromatografice.

Denaturarea moleculei de imunoglobulin prin reducerea legturilor S-S. Agenii reductori (mercaptoetanolul, mercaptoetanolamina, ditiotreitolul) au o grupare SH liber i reduc legturile S-S intercatenare i intracatenare.

HO CH2 CH2 SH (Mercaptoetanolul)

Legturile intercatenare (H-H sau H-L) sunt reduse mai uor, iar cele intracatenare, care stabilizeaz buclele domeniilor moleculei de imunoglobulin, sunt disociate mai greu.

Reducerea legturilor S-S este reversibil. Dup ndeprtarea agentului denaturant, renaturarea este rapid i complet. Din acest motiv, agenii denaturani se ncorporeaz n sistemul supus denaturrii. Denaturarea se poate stabiliza prin diferite metode chimice.

Funciile moleculei de imunoglobulin

n ansamblul efectorilor sistemului imunitar, moleculele de imunoglo-bulin ndeplinesc dou categorii de funcii:

- funcii de specificitate

- funcii grupate sub denumirea de activiti biologice efectoare

Specificitatea imunoglobulinei fa de un antigen este exprimat prin capacitatea de recunoatere fin a epitopului complementar al antigenului i de combinare cu acesta. Specificitatea moleculei de imunogobulin este conferit de situsul su de combinare. Marea diversitate a moleculelor de anticorpi, asigur o diversitate uria a situsurilor de combinare, de ordinul a 108 109 specificiti de legare.

Specificitatea de legare este dat de structura spaial a situsului de combinare cu antigenul, conferit de resturile de aminoacizi ale regiunilor hipervariabile ale catenelor H i L.

Aminoacizii care formeaz situsul de combinare al moleculei de imunoglobulin, prin plierea regiunilor hipervariabile, delimiteaz o cavitate molecular ce difer ca form i mrime.

Cavitatea prezint substructuri (proeminene i depresiuni), pe care le formeaz secvenele hipervariabile, n timp ce restul regiunilor variabile ale celor dou catene confer structura tridimensional a cavitii moleculare.

Potrivirea spaial dintre situsul de combinare al moleculei de anticorp i epitopul specific, din punctul de vedere al configuraiei spaiale, este perfect. Eventualele imperfeciuni geometrice pot fi ocupate de moleculele de ap. Potrivirea perfect a celor dou uniti combinante este sugerat de metafora cheie-broasc.

Dup combinarea cu antigenul, modificrile spaiale ale situsului de combinare a anticorpului sunt minime, nedectabile. Epitopul antigenic are un rol important n potrivirea conformaional perfect cu situsul de combinare a anticorpului, deoarece corespunde unei regiuni moleculare cu factor de temperatur mai ridicat, ceea ce sugereaz o flexibilitate mai accentuat a secvenei moleculare respective.

Flexibilitatea unui determinant antigenic i permite s se adapteze mai uor ntr-un situs de legare preexistent al moleculei de anticorp, chiar dac epitopul nu se potrivete exact geometriei situsului de combinare a anticorpului. Datorit flexibilitii epitopului, legarea antigenului cu anticorpul se aseamn cu ntlnirea a doi nori i nu cu aceea a dou pietre.

Anticorpii specifici fa de secvenele peptidice mobile (calde) ale antigenului proteic, se leag cu afinitate mai mare de proteina nativ. Aceste rezultate sunt foarte importante din punct de vedere practic, pentru selectarea segmentelor peptidice n vederea obinerii vaccinurilor sintetice subunitare.

Dimensiunile situsului de combinare s-au dedus indirect, prin determinarea mrimii haptenei care blocheaz reacia de combinare a anticorpilor cu antigenul nativ: oligozaharidul format din 6-8 uniti monomerice ocup complet situsul de combinare al moleculei de anticorp. Oligozaharidele mai mici inhib parial reacia specific de precipitare. Pentru anticorpii specifici fa de antigene proteice, tetrapeptidele au blocat cu maxim eficien reacia de precipitare dintre anticorpi i antigenul nativ.

Funciile biologice efectoare sunt amorsate de reacia antigen-anticorp. Numrul funciilor biologice efectoare este mai mic i sunt dependente de regiunile constante ale moleculei de imunoglobulin.

Fiecare domeniu al regiunii constante a moleculei de imunoglobulin ndeplinete anumite funcii:

- legarea antigenului pe imunoglobulinele de suprafa care funcioneaz ca receptori pe limfocitele B, declaneaz proliferarea i diferenierea lor, iar legarea antigenului cu imunoglobulinele citotrope pentru mastocite, declaneaz degranularea acestor celule;

- dup cuplarea cu antigenul, moleculele de imunoglobulin expun fragmentul Fc, recunoscut ulterior de receptorii specifici pentru Fc de pe suprafaa monocitelor, macrofagelor, PMNN. Astfel se stimuleaz procesul de fagocitoz a celulelor nonself tapetate cu imunoglobuline, denumit imunofagocitoz;

- celulele K, prin intermediul receptorilor pentru Fc, interacioneaz cu celulele nonself tapetate cu IgG i realizeaz liza de contact prin fenomenul de citotoxicitate;

- interaciunea antigen-anticorp genereaz un semnal care se transmite regiunii Fc. Aceasta i modific configuraia spaial i expune un situs de recunoatere (pentru IgG situat ntre Glu 318 i Lys 322), de care se leag C1q;

- regiunea balama este transductoare de semnale i are un rol important n flexibilitatea moleculei de imunoglobulin, permind variaia unghiului dintre fragmentele Fab: ele trec reversibil de la forma T la Y. Geometria variabil a moleculei de imunoglobulin mrete eficiena de legare a antigenului, deoarece ajusteaz poziia celor dou situsuri de combinare ale anticorpului, n funcie de distana la care se gsesc determinanii antigenici pe suprafaa unui antigen particulat (virus sau celul);

- regiunea balama a moleculelor de IgG i IgD este sensibil la aciunea enzimelor proteolitice, iar a moleculei de IgA este rezistent.

Componenta glucidic a imunoglobulinei ndeplinete urmtoarele funcii;

- realizeaz i menine o conformaie a moleculei de imunoglobulin, esenial pentru secreie;

- mrete solubilitatea moleculelor de imunoglobulin;

- are rol de spaiator ntre domeniile unui lan i ntre catenele moleculei;

- particip la funciile citotrope ale moleculei de imunoglobulin;

- are rol n legarea C1q, component a sistemului complement.

Heterogenitatea anticorpilor

Moleculele de imunoglobuline din plasma oricrui organism sunt foarte heterogene, att datorit diversitii epitopilor fa de care s-au sintetizat ceea ce induce variaii ale secvenelor hipervariabile ale moleculei, ct i datorit variaiilor secvenei de aminoacizi n regiunile constante ale moleculei.

Heterogenitatea anticorpilor este ordonat n clase, subclase, tipuri, alotipuri i idiotipuri, pe baza variaiei secvenei de aminoacizi. Moleculele de imunoglobuline au caliti duble: ele se comport nu numai ca molecule de recunoatere, care recunosc specific antigenul, dar la rndul lor sunt recunoscute ca antigene. Pentru sporirea gradului de imunogenitate, moleculele de imunoglobuline se asociaz cu adjuvantul Freund i se injecteaz la animale de experien. Variaiile de structur chimic a imunoglobulinelor se comport ca determinani antigenici i induc sinteza anticorpilor anti-imunoglobulin. Variaiile de ordin chimic ale imunoglobulinelor se evideniaz prin metode imunochimice de precipitare ntre moleculele de imunoglobulin cu rol de antigen i anticorpii anti-imunoglobulin din serul imun.

Din punctul de vedere al manifestrii imunopotenei determinanilor antigenici ai imunoglobulinelor, s-au definit trei nivele de heterogenitate: izotipic, alotipic i idiotipic.

Heterogenitatea izotipic

Heterogenitatea izotipic (izos = acelai) definete variantele biochimice ale imunoglobulinelor, comune pentru toi indivizii unei specii. Variantele biochimice se datoreaz variaiilor secvenei de aminoacizi n regiunea constant a catenei H. Ele se comport ca determinani antigenici dup injectarea n organismul altei specii. Pentru identificarea epitopilor izotipici ai moleculelor de imunoglobulin uman, acestea, n asociaie cu adjuvantul Freund, se injecteaz la iepure.

Fiecare individ al unei specii exprim toate variantele antigenice izotipice caracteristice speciei.

Variantele antigenice izotipice ale imunoglobulinelor umane s-au identificat iniial, n regiunea constant a catenei H.

Exist 5 variante antigenice distincte ale catenelor H n regiunea constant, notate cu g, m, a, d, e, corespunztoare celor 5 clase de imunoglobuline: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Serul imun fa de un determinant antigenic de clas nu d reacii ncruciate cu celelalte tipuri de determinani, deoarece catenele H ale diferitelor clase de imunoglobuline prezint diferene mari de ordin chimic ntre domeniile echivalente, care merg pn la circa 60% din totalul aminoacizilor.

Determinanii antigenici ai unei clase de imunoglobuline sunt comuni tuturor indivizilor unei specii i se evideniaz n serul imun heterolog, obinut prin imunizarea organismelor altei specii. De exemplu, un antiser fa de lanul uman , obinut pe iepure, va precipita numai anticorpii clasei IgG din orice ser uman.

Ulterior, determinanii antigenici s-au identificat i n regiunile constante ale catenelor L. Determinanii antigenici ai catenelor L determin tipurile de imunoglobuline.

Catena L are dou variante antigenice, notate cu k i l, care se gsesc la toate cele 5 clase de imunoglobuline. Cele dou tipuri structurale de lanuri L (k i l) prezint deosebiri de secven a aminoacizilor n regiunea constant i nu au determinani antigenici comuni. De aceea, nu dau reacii imune ncruciate. Serul imun heterolog anti-molecule de imunoglobuline umane cu caten Lk, obinut pe iepure, precipit toate moleculele de imunoglobuline umane care conin catena Lk, indiferent de clas. Serul imun anti-Lk nu precipit moleculele de imunoglobuline care conin catena L l.

O molecul de imunoglobulin are dou catene de tip k sau l. Formula general a diferitelor clase de imunoglobuline este g2k2 (sau g 2 l 2), m2k2 (m2 l 2), a2k2 (a2 l 2).

Catenele L de tip k i l determin tipurile moleculare de imunoglobuline. La om, raportul Ig k/ l este 7/3, iar la oarece este 19/1, valori care probabil reflect raportul numeric al genelor codificatoare pentru cele dou tipuri de catene.

Izotipurile catenelor H nu influeneaz funcia de specificitate a moleculelor de imunoglobuline: acelai antigen poate fi legat de oricare din cele 5 clase de imunoglobuline.

Pe lng variantele antigenice menionate clase i tipuri s-au identificat diferene mai subtile ale moleculelor de IgG i IgA, n ceea ce privete proprietile fizice, chimice i biologice, diferene care corespund subclaselor antigenice. Aceasta nseamn c, pe lng determinanii antigenici de clas, exist i alte variante antigenice ale regiunii constante ale catenei H, corespunztoare subclaselor. Ele se noteaz cu litera clasei, urmat de o cifr: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, respectiv IgA1, IgA2.

Moleculele de imunoglobuline ale subclaselor au n comun determinanii antigenici proprii fiecrei subclase, aducnd un nivel superior de heterogenitate a catenelor H.

Diferenele secvenei de aminoacizi ai catenei H, ntre diferite subclase sunt mici: 24 de aminoacizi ntre IgG1 i IgG4. Cea mai important deosebire const n numrul legturilor S-S intercatenare.

Moleculele diferitelor subclase sunt sintetizate de celule diferite.

Variantele alotipice

Descoperirea alotipiei (alos = altul) a pornit de la urmtorul fapt de observaie: n serul pacienilor cu artrit cronic reumatoid se gsesc molecule de tip special, ncadrate n categoria factorilor reumatoizi (FR). Factorii reumatoizi sunt molecule de auto-anticorpi, adic IgM antiIgG.

Factorii reumatoizi se evideniaz in vitro, prin capacitatea lor de a determina aglutinarea eritrocitelor tapetate cu o doz subaglutinant de anticorpi specifici antieritrocitari (IgG).

Grubb (1956) a observat c FR seric, uneori, aglutineaz hematiile tapetate cu auto-anticorpi specifici (care se sintetizeaz n anemia hemolitic autoimun) ale unor pacieni, iar alteori, reacia de hemaglutinare nu se produce, testul evidenierii FR in vitro fiind fals negativ. Concluzia reaciei de hemaglutinare pe care, uneori, FR din serul pacienilor de artrit reumatoid o produce asupra hematiilor tapetate cu o doz subaglutinant de anticorpi specifici, a fost urmtoarea: autoanticorpii de pe suprafaa eritrocitelor unor indivizi cu anemie hemolitic autoimun, posed determinani antigenici diferii, pe care FR poate s-i recunoasc. Astfel s-a dedus c moleculele de imunoglobulin de la indivizi diferii, sunt diferite din punct de vedere antigenic. n consecin, imunizarea unui individ cu imunoglobulinele provenite de la alt individ

al aceleiai specii, determin sinteza anticorpilor fa de determinanii antigenici ai moleculelor imunoglobulinice ale donorului.

Imunoglobulinele sunt aloantigene ineficiente dac sunt injectate ca proteine solubile n organismul uman. De aceea, transfuziile de snge total, de plasm sau injectarea imunoglobulinelor solubile, de cele mai multe ori, nu induc sinteza anticorpilor antiimunoglobuline ale donorului. Moleculele de imunoglobuline devin antigenice dup asocierea lor cu adjuvantul Freund.

Semnificaia variantelor antigenice alotipice ale moleculelor de imunoglobuline este analog celei a antigenelor de grup sanguin. Fenomenul este general, adic i alte molecule provenite de la un organism pot fi imunogene pentru alte organisme ale aceleiai specii, la care se comport ca aloantigene.

Variantele alotipice ale imunoglobulinelor se detecteaz n reacia de precipitare cu aloantiseruri obinute pe organisme ale aceleiai specii, dar cu alotip diferit de acela al organismului donor al antigenului imunoglobulinic.

Variantele moleculare alotipice sunt consecina existenei genelor alele perechi (aa), o caracteristic general a organismelor diploide. Prin mutaii succesive, n acelai locus, apar mai multe alele care formeaz o serie polialelic - a1, a2, a3 an. Genele alele ocup acelai locus pe cromosomii omologi, ca i gena de tip slbatic a. Fiecare individ va avea o combinaie de gene alele: aa1, aa2 .. aan sau a1a2, a1a3 a1an, cu variante antigenice distincte.

Alotipurile imunoglobulinelor sunt rezultatul variaiilor secvenei aminoacizilor n regiunile constante ale catenelor H i L, ceea ce le confer un grad superior de heterogenitate, consecin a alelelor codominante la acelai locus.

Pentru moleculele imunoglobulinice umane s-au descris trei categorii de markeri alotipici:

- factorii Gm (gama marker), numerotai de la 1 la 25, pe catena H a subclaselor de IgG. De exemplu, markerul G1m(a) pe moleculele de IgG1 are secvena Asp-Glu-Leu-Thr-Lys, iar moleculele altor indivizi au secvena Glu-Glu-Met-Thr-Lys, adic doi aminoacizi diferii. Pentru IgG3 sau descris 14 alele;

- factorii A2m(1) i A2m(2), identificai pe catenele H ale subclasei IgA2;

- factorii Km(Inv), pe catenele Lk, n numr de trei;

- dou variante alelice pentru IgE.

Foarte rar, determinanii antigenici alotipici sunt localizai n domeniile variabile ale moleculei.

Ca i n alte sisteme alelice, indivizii pot fi homozigoi sau heterozigoi pentru genele care codific markerii. Genele se exprim codominant i se transmit n descenden dup mecanismul mendelian. De exemplu, alotipurile b4b5 pe catenele L ale imunoglobulinelor de iepure se exprim astfel: un organism homozigot b4b4 sau b5b5 exprim alotipul b4, respectiv b5. Dar genotipul b4b5 rezultat n descendena lor exprim markerul b4 pe o fracie a moleculelor i markerul b5, pe restul moleculelor de imunoglobuline.

Variantele idiotipice

Idiotipul (idios = individual) este reprezentat de o populaie omogen de molecule de anticorpi, sintetizate de descendenii unei clone celulare, care recunosc i se combin cu un singur determinant antigenic (epitop).

Specificitatea idiotipic a unei populaii de anticorpi s-a dedus pe cale experimental:

- antigenul (celule de S. typhi) s-a injectat la organismele A i B (iepuri), identice din punct de vedere genetic. Se sintetizeaz anticorpi aglutinani anti S. typhi;

- anticorpii aglutinani 1(produi de organismul A) s-au injectat la organismul C (iepure din aceiai linie genetic). Se sintetizeaz anticorpi anti-anticorpi 1, evideniai n reacia de precipitare.

Surprinztor, anticorpii anti-anticorpi 1 nu precipit anticorpii 2, dei anticorpii 1 i anticorpii 2 au aceiai specificitate fa de antigenele S. typhi, iar organismele A, B, C aparin aceluiai alotip.

Concluzia este c anticorpii 1 i anticorpii 2, dei au aceiai specificitate fa de antigenul de S. typhi, la rndul lor, au determinani antigenici proprii. De aceea, anticorpii anti-anticorpi 1 nu precipit anticorpii 2, sintetizai de un alt organism. Moleculele de anticorpi cu aceiai specificitate de combinare fa de un antigen, sintetizate de organisme identice genetic, au o individualitate antigenic distinct, denumit specificitate idiotipic.

Heterogenitatea idiotipic este consecina determinanilor idiotipici, localizai n regiunile hipervariabile ale catenelor H i L. Specificitatea idiotipic a moleculelor de anticorpi sintetizai de o clon de celule este conferit de unicitatea secvenei de aminoacizi de la nivelul secvenelor hipervariabile ce particip la formarea situsurilor de combinare, care determin epitopi cu caracter strict individual denumii idiotopi. Unii idiotopi sunt localizai chiar n interiorul situsului de combinare sau n imediata sa vecintate. Dovada o constituie faptul c legarea epitopului specific de situsul de combinare a anticorpului, blocheaz ntr-o msur mai mare sau mai mic, legarea anticorpilor anti-idiotipici. Fig. 14. Ilustrarea diagramatic a heterogenitii anticorpilor.

Colecia de idiotopi ai situsului de combinare a unei molecule de imunoglobuline formeaz idiotipul ei. Idiotipul este rezultatul configuraiei spaiale unice a regiunilor hipervariabile ale catenelor H i L, conferit de o secven unic a aminoacizilor.

Repertoriul idiotipurilor este de acelai ordin de mrime cu acela al specificitii situsurilor de com-binare. Pentru situsul de combinare al moleculei de imunoglobulin s-a pro-pus denumirea de paratop.

La alctuirea idiotipului particip ambele catene. Cele dou catene disociate nu pot s lege antiidiotipul sau l leag cu o eficien foarte sczut.

IgG

Imunoglobulinele reprezint circa 20% din totalul proteinelor serice. IgG este dominant cantitativ n serul uman normal, reprezentnd 70-75% din cantitatea total de imunoglobuline. Concentraia sa medie n ser este de 1250 mg/100 ml, cu variaii individuale normale ntre 800 2000 mg/100 ml.

IgG este cea mai heterogen dintre imunoglobuline n ceea ce privete sarcina electric. Din aceast cauz, n cmpul electroforetic se distribuie n fraciile g 1 i g 2 ale serului.

Din punct de vedere structural, IgG este un monomer cu greutatea molecular de 150 kD i cu constanta de sedimentare 7S. Componenta glucidic reprezint circa 3% din greutatea molecular a IgG. Fig. 15. Modelul structural al IgG1. Domeniile variabile ale celor dou catene (VH i VL) formeaz situsul de legare a antigenului. Cercurile negre indic poziia gruprilor glucidice. HR = regiunea balama.

gG se sintetizeaz tardiv n rspunsul imun pri-mar, dar este imunoglobulina predominant a rspunsului imun secundar i se distribuie uniform n compartimentele intra- i extravasculare.

IgG se prezint sub forma a 4 variante antigenice, conferite de compoziia n aminoacizi a catenei g: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Proporia normal a celor 4 subclase este de 66% pentru IgG1, 23% pentru IgG2, 7% pentru IgG3 i 4% pentru IgG4.

IgG3 este mai grea, datorit catenei g 3 i are o regiune balama extins, codificat de civa exoni, iar IgG4 are o regiune balama scurt i rigid, ceea ce produce o nepotrivire steric pentru fixarea complementului.

IgG este singura imunoglobulin care traverseaz placenta, asigurnd astfel protecia ftului i nou-nscutului n primele luni de via. Pe membrana sinciio-trofoblastului se gsesc receptori pentru regiunea Fc a IgG, care mediaz transferul placentar al moleculei.

In vivo, funcia esenial a IgG este neutralizarea toxinelor bacteriene. IgG activeaz sistemul complement i produce liza celulelor bacteriene i a particulelor virale, dar are i rol opsonizant. In vitro, IgG particip la reaciile de aglutinare i precipitare.

Termenul de njumtire al IgG este de 21 de zile.

n toate serurile imune, o proporie de 5-15% din moleculele de IgG, pare s conste din molecule asimetrice, cu un singur situs funcional de legare (molecule monovalente). Aceste molecule nu particip la reaciile secundare in vitro (aglutinare, precipitare). Cellalt situs este blocat stereochimic de un polizaharid bogat n manoz, legat de primul domeniu constant (CH1). IgA

Unitatea de baz a structurii IgA este monomerul, alctuit din dou catene grele (H) cu specificitate de clas (izotipic) a i dou catene uoare (L) de tip l sau k.

Unitatea monomeric (l)2 sau (a-k)2 are o tendin constant de a produce structuri moleculare polimerice, formate din 2, 3, 4 sau 5 monomeri (10S, 13S, 15S, respectiv 17-18S), care n ser se gsesc n concentraii descrescnde.

La microscopul electronic, molecula de IgA monomer are aspectul literei Y. Complexele dimerice au forma a dou litere Y, aezate una n prelungirea celeilalte. Cele dou fragmente Fc formeaz un lan lung i rigid.

IgA se gsete att n plasma sanguin, ct i n secreiile externe: salivar, lacrimal, gastric vaginal, intestinal, biliar, pancreatic, lactat.

Pe baza unor diferene de structur molecular (numrul punilor S-S, secvena aminoacizilor n regiunea balama) au fost descrise dou subclase de IgA: IgA1 i IgA2. Ele difer prin 22 de aminoacizi, n primul rnd datorit deleiei a 13 aminoacizi din regiunea balama a IgA2, dar care se gsesc la IgA1. Aceast diferen structural confer rezisten moleculei de IgA2 la aciunea unor proteaze bacteriene, care cliveaz specific IgA1 n regiunea balama.

n funcie de localizare se disting IgA seric i IgA din secreii. Fig. 16. Structura IgA1 uman. Sunt indicate poziiile punilor disulfurice inter- i intracatenare, precum i poziia ipotetic a catenelor polizaharidice. O punte disulfuric suplimentar stabilizeaz domeniul C a 2 i o alta leag lanul J n polimerul de IgA.

IgA seric este reprezentat n primul rnd de IgA1 (90%) i este monomer n proporie de 80%. Catenele L i H sunt reunite prin dou puni S-S. Subclasa IgA2 reprezint numai 10% din IgA seric. Pe baza markerilor alotipici ai catenei H, IgA2 se subdivide n dou variante alotipice: A2m1 (la populaiile caucaziene) i A2m2 (la populaiile mongoloide-negroide)

Funciile IgA seric nu sunt bine precizate, datorit dificultilor de purificare. Rolul su cel mai important ar fi acela de a ndeprta cantitile mici de antigene, provenite din alimente sau antigenele solubile ale microorganismelor, absorbite n circulaia general. Eliminarea timpurie mpiedic accesul acestor antigene la celulele sistemului imunitar i stopeaz declanarea unui rspuns imun de amploare, care ar devia forele de aprare a organismului, de la funcia sa esenial, aceea a proteciei antiinfecioase.

In vivo, IgA nu activeaz complementul pe calea clasic i nu produce liza antigenelor celulare, dar moleculele agregate in vitro de IgA1 i IgA2 activeaz calea altern. Funcia opsonizant a IgA este controversat. IgA nu produce reacii de precipitare cu antigenele moleculare.

IgA din secreii(sau IgA secretor) se gsete n secreia mucoaselor (digestiv, respiratorie, urinar), n secreia biliar i pancreatic. De aici deriv i denumirea sa improprie, IgA secretoare (sIgA), dei mai corect ar fi denumirea de IgA din secreii. Fig.17.Stuctura sIgA1 uman. Piesa secretoare, probabil este rsucit n jurul dimerului de IgA i se leag prin puni disulfurice de domeniul C a 2 al fiecrui monomer. Piesa J este amplasat la jonciunea celor doi monomeri. Puntea disulfuric ce leag domeniul C a 2 de regiunea balama nu este figurat (dup Roitt, 1984).

sIgA se gsete n special n form dimeric (80%), iar restul ca monomer sau alt tip de polimer. Compartimentul seric al IgA nu influeneaz semnificativ concentraia IgA din secreii i invers, IgA din secreii nu este absorbit n circulaie.

sIgA se sintetizeaz local, n structurile limfoide asociate mucoaselor: n mucoasa tractului respirator, dar mai ales cea nazal, a tractului digestiv (n special n mucoasa antrului piloric i a intestinului subire), n lamina propria a acinilor secretori ai glandelor salivare i mamare, n glandele lacrimale. In toate aceste structuri se gsesc numeroase plasmocite i precursorii lor. Imunizarea oral stimuleaz n primul rnd, sinteza IgA.

Structura moleculei de sIgA

Molecula de sIgA este alctuit din doi monomeri de IgA, legai prin catena J (joining) i o caten suplimentar, denumit component secretoare (CS). Formula general a sIgA dimer este (IgA)2 J CS i are greutatea molecular de 385 kD i constanta de sedimentare 10S.

Complexul molecular (IgA)2 J CS este foarte rezistent la proteoliz datorit conformaiei speciale dobndit dup legarea catenei J i a catenei CS, precum i datorit capacitii sale de a se lega de mucinele din secreii.

Catena J este un glicopeptid de 15-16 kD (136 aminoacizi) i se sintetizeaz n plasmocitele productoare de IgA. Este bogat n acizi glutamic i aspartic i conine un oligozaharid legat de Asp din poziia 43. Conine 7-8 resturi de cistein. Lanul J se leag prin puni S-S de regiunea Fc a IgM polimeric i de sIgA. Prezena catenei J s-a stabilit la imunoglobulinele polimerice de la toate clasele de vertebrate, iar ARNm pentru catena J s-a detectat la numeroase nevertebrate. In complexele moleculare cu un grad superior de polimerizare, numai dou molecule de IgA sau IgM se leag prin intermediul catenei J, celelalte fiind legate una de alta prin puni S-S. Polimerizarea moleculelor de IgA n citoplasma celulei productoare este esenial pentru transportul lor la suprafaa mucoasei. Lanul J se gsete n citoplasma limfocitelor B, n cursul diferenierii spre plasmocit. Aproape toate limfocitele din structurile limfoide asociate mucoaselor (digestiv, respiratorie), din esutul interstiial mamar, salivar i lacrimal, exprim lanul J intracelular. Catena J este sintetizat i de unele celule care produc IgG sau IgD din aceste structuri, dar este degradat n citoplasm. Plasmocitele din mduva osoas care produc IgA sau IgG sunt negative pentru lanul J.

Componenta secretoare a sIgA este o glicoprotein din categoria betaglobulinelor, nenrudit cu imunoglobulinele, bogat n glucide (8,7%). Secvena catenei cuprinde 750 de aminoacizi, distribuii n trei domenii: domeniul citoplasmatic (103 aminoacizi), transmembranar (23 aminoacizi) i extracelular (circa 625 aminoacizi), la care se adaug o secven semnal de 18 aminoacizi, care este clivat dup sintez.

Componenta secretoare se sintetizeaz n celulele epiteliale ale mucoaselor. Dup prelucrarea n complexul Golgi (unde are loc glicozilarea), CS migreaz pentru a fi integrat n plasmalema bazal i lateral a celulelor. Sinteza CS este independent de IgA. La noul nscut, CS se sintetizeaz n sptmna a 8-a (nainte de apariia plasmocitelor). Este prezent chiar la persoanele n ale cror secreii IgA lipsete.

Funciile componentei secretoare. Componenta secretoare are rol de receptor pentru moleculele dimere i polimere de IgA i IgM, care au legat lanul J (receptor poli-Ig). Legarea lanului J pare

s determine o schimbare conformaional a acestor molecule. Moleculele de IgA secretate ca monomeri, ca i polimerii care nu au legat lanul J nu se pot complexa cu CS i trec n circulaie.

IgA dimeric trebuie s ajung n contact cu celulele epiteliale, pentru a fi transportat la suprafaa mucoasei. Teoretic, IgA polimeric poate veni n contact cu celulele epiteliale care au lanul CS inserat n membran, pe una din urmtoarele dou ci:

- difuzia liber prin esutul conjunctiv adiacent plasmocitelor din lamina propria a mucoasei, unde are loc sinteza;

- translocaia din circulaie la nivelul capilarelor mucoasei.

Componenta secretoare este inserat n membrana laterobazal a celulei epiteliale. Din aceast poziie, prin domeniul su extracelular, CS leag dimerii de IgA care conin lanul J, printr-un mecanism necunoscut. Una din ipotezele privind mecanismul legrii presupune c CS s-ar nfura n jurul dimerului de IgA, extinzndu-se de la o regiune balama la cealalt, mrind astfel rezistena dimerului la proteoliz. Complexul format este endocitat n vezicule de pinocitoz i este eliberat pe faa luminal a celulelor epiteliale, n secreia lor extern. Un astfel de transport are loc n celulele epiteliale ale mucoasei tubului digestiv, ale mucoasei bronice, la nivelul epiteliului vezicii biliare i al tractului biliar, al acinilor glandelor mamare, al acinilor pancreatici i salivari. CS leag chiar complexele imune care conin IgA polimeric, formate n lamina propria a mucoasei. Acestea sunt transferate la suprafaa luminal a epiteliului prin acelai mecanism ca i IgA polimeric. Anihilarea pe aceast cale a antigenelor este foarte important n tractul intestinal, unde componentele antigenice alimentare i ale microbiotei pot dobndi acces la lamina propria.

Fig.18. Reprezentarea schematic a diferitelor trepte care se succed n generarea sIgA i IgM umane, pe calea transportului epitelial mediat de receptorul de poli-Ig (pIgR). IgA polimeric care conine lanul J (IgA-J) i IgM pentameric (IgM-J) sunt secretate de plasmocitele locale. Componenta secretorie (CS) este sintetizat n reticulul endoplasmic granular (REG) al celulelor epiteliale i se matureaz prin glicozilare n complexul Golgi. In reeaua transgolgian (TG), este fosforilat i este expus ca receptor de poli-Ig, pe membrana plasmatic bazolateral. Endocitoza ligandului complexat cu receptorul de poli-Ig, ca i a receptorului poli-Ig liber, este urmat de transcitoza la endosomii apicali i n final are loc clivarea receptorului poli-Ig i eliberarea moleculei Ig n secreii (dup Brandtzaeg i col., 1998).

Rolul CS n transportul IgA la suprafaa mucoaselor este argumentat de faptul c bolnavii cu deficit al sintezei sale, nu au IgA n secreii, dei nivelul IgA seric este normal.

Transportul transepitelial al sIgA este asociat cu o pierdere continu de receptori, care, spre deosebire de ali receptori, dup exocitoz la suprafaa celulei epiteliale nu sunt recirculai i nici nu se refac prin sintez de novo.

Funciile efectoare ale sIgA Fig. 19. Reprezentarea schematic a fenomenului de excludere imun, pe care-l produc anticorpii din secreia mucoasei intestinale. Inainte de imunizare, o mic parte a antigenului proteic ingerat, scap digestiei intraluminale, este preluat de enterocit i transportat n spaiile intercelulare. Dup imunizare, anticorpii din secreia intestinal, leag antigenul formnd complexe Ag-Ac. Legarea antigenului la suprafaa celulelor epiteliale este blocat. Antigenele complexate cu anticorpii n nveliul mucos, pot fi degradate de enzimele pancreatice adsorbite la supra-faa intestinului. Astfel, scade cantitatea de antigen disponibil pentru absorbia de ctre celulele intestinale.

Studiul funciilor efectoare ale IgA este ngreunat de dificultile obinerii sIgA n stare pur.

Funcia biologic esenial a sIgA este aprarea organismului fa de antigenele moleculare care ar putea fi nglobate (prin endocitoz) la nivelul mucoaselor (n special cea digestiv) i de a asigura protecia fa de agenii patogeni care tind s ptrund de la exterior pe calea mucoaselor digestiv, respiratorie, genito-urinar. sIgA formeaz complexe cu urmtoarele tipuri de antigene;

- cu antigenele mole-culare adsorbite la suprafaa mucoaselor, avnd rol n excluderea imun a acestora. Excluderea imun este o funcie major a sIgA, ce const n limitarea penetrrii materialelor antigenice prin epiteliul mu-coasei. Deoarece IgA este ine-ficient n activarea comple-mentului i nici nu stimuleaz fagocitoza, excluderea imun este un mecanism, n primul rnd, neinflamator.

- cu antigenele celulare bacteriene, realiznd imobi-lizarea i aglutinarea acestora. Astfel, este prevenit ptrunderea lor n organism;

- blocheaz legarea virusurilor de receptorii celulelor epiteliului respirator i ale mucoasei digestive;

- neutralizeaz efectul toxinelor (botulinic, tetanic, holeric);

- este imunoglobulina predominant n saliv i constituie principalul mecanism de aprare n cavitatea oral, prin aciune sinergic cu ali factori antibacterieni (lizozim, lactoferin, peroxidaz salivar i mucine).

Prezena sIgA n colostru i n lichidul amniotic sugereaz rolul su foarte important n conferirea imunitii pasive a noului nscut, att la om ct i la animale. Rezistena noilor nscui, hrnii natural este net superioar comparativ cu a celor hrnii artificial.

Concentraia sIgA n colostrul uman este foarte mare n primele 24-48 de ore de lactaie (6-88 mg/ml) i diminu brusc datorit diluiei ntr-un volum secretor mult sporit. Concentraia foarte mare a sIgA n colostru se datoreaz eliberrii unor cantiti mari ntr-un volum mic de secreie. Glanda mamar are un numr relativ mic de celule productoare de anticorpi, deoarece nu este stimulat antigenic. Originea sIgA n glanda mamar are dou surse:

- o sintez local foarte intens n plasmocitele din esutul conjunctiv subiacent epiteliului acinilor glandulari;

- transportul IgA din snge.

sIgA din secreia mamar, la nivelul mucoasei digestive a noului nscut, nu este transportat n circulaia acestuia dect ntr-o mic msur, n primele ore de via (la om) sau zeci de ore la alte mamifere. La unele mamifere (ovine, bovine), sIgA din secreia lactat matern este transportat foarte activ n circulaia noului nscut. Efectul protector antiinfecios al sIgA de origine matern se exercit prin faptul c moleculele rmn legate de celulele epiteliale ale mucoasei digestive i blocheaz astfel aderena microorganismelor i a virusurilor.

Moleculele de IgA nu sunt transferate prin placent. Sngele noului nscut nu conine IgA. Nivelul seric al IgA caracteristic adultului, este atins la 9-10 luni.

n condiii naturale, n tractul intestinal se sintetizeaz IgA fa de multe antigene exogene. IgA din secreia intestinal poate s treac intact prin tubul digestiv i s-i pstreze activitatea.

Persoanele cu deficit congenital al IgA (1/500-700) au sensibilitate mare la infeciile mucoaselor, dei celulele epiteliale sintetizeaz CS. Aceleai persoane sunt predispuse la maladii autoimune, deoarece, n absena sIgA, mucoasa digestiv este traversat de o mare diversitate de antigene, care induc sinteza unor anticorpi ce interacioneaz nu numai cu antigenul exogen inductor, ci i cu componente moleculare proprii.

In vivo, sIgA nu activeaz cascada complementului, dar moleculele agregate artificial, in vitro, activeaz calea altern.

Fig. 20.Structura IgM pentameric. Catenele grele de IgM uman au 5 domenii. Monomerii sunt legai prin puni disulfurice ntre domeniile Cm3 i Cm4. Sunt reprezentate catenele oligozaharidice, ca i poziia ipotetic a catenei J (dup Roitt, 1984).

IgM

Caracteristica struc-tural a IgM este prezena unui lan greu al izotipului m, alctuit din 576 aminoacizi. IgM conine 5 grupri prostetice oligozaharidice, care constituie 12% din greutatea molecular total. Secvena de aminoacizi a lanului H cu specificitate antigenic m este organizat n 5 domenii: unul variabil i 4 constante (Cm1, 105 amino-acizi Cm4, 111 aminoacizi), codificai de exoni diferii. Lipsete regiunea balama, fiind nlocuit cu domeniul CH2, sensibil la aciunea proteazelor.

IgM se gsete sub dou forme:

- monomer, legat de membrane

- polimer, liber n ser.

IgM legat de membrana unor limfocite, are n plus o secven COOH-terminal, hidrofob, format din 41 de aminoacizi, care ntrerupe transportul lanurilor m prin membran i ancoreaz

molecula n structura sa. IgM este molecula major cu rol de receptor de antigen, pe suprafaa limfocitelor B.

IgM seric are structura unui pentamer (L2 m 2), cu greutatea molecular de 950 kD. Fiecare pentamer conine un lan polipeptidic J, bogat n cistein, foarte acid, cu rol n polimerizarea monomerilor. Cele 5 uniti monomere sunt aezate radiar, cu regiunile Fc orientate spre centru, unite prin puni S-S, formate ntre domeniile CH3 i prin lanul J. Braele (Fab)10 sunt orientate spre exterior, chiar n unghi drept fa de discul (Fc)5

La microscopul electronic, pentamerul IgM are aspect de stea cu 5 brae, dispuse n jurul discului central. Fiecare bra are forma literei Y. Braele pot lua poziii diferite, ceea ce denot existena unei zone mobile pentru fiecare subunitate. Fiecare unitate monomeric este mobil la nivelul articulaiei n discul central, astfel c dup legarea cu epitopii de pe o suprafa membranar, IgM poate adopta configuraia asemntoare unui crab, iar regiunile multiple Fc devin accesibile lui C1q.

IgM poate s existe n form hexameric, de 10-20 de ori mai eficient n liza mediat de activarea C, dect n varianta pentameric.

Valena pentamerului este teoretic 10, dar aceasta s-a determinat numai n reacia cu haptenele mici. In reacia cu antigenele complexe, valena scade la 5 sau chiar mai puin, datorit probabil insuficientei flexibiliti a moleculei. Valena IgM este dependent de natura ligandului.

Funciile IgM. IgM este receptorul major de antigen pe suprafaa limfocitelor B mature.

IgM seric are funcii aglutinante, fiind de 1000 de ori mai eficient dect IgG n legarea antigenelor particulate. IgM reprezint 5-10% din cantitatea total de anticorpi serici, cu valori normale ntre 84-170 mg la 100 ml de snge.

IgM activeaz complementul(C), producnd liza antigenului celular i ingestia rapid a complexelor solubile. De aceea, IgM este foarte eficient n reacia de aprare fa de bacteriemii i fa de toxine(difteric, tetanic, botulinic, toxina din veninul de arpe).

IgM este principala opsonin imunoglobulinic a serului.

Afinitatea IgM (care semnific fora de legare dintre un epitop i un paratop) poate s fie slab, dar aviditatea global (energia medie a interaciunii IgM cu epitopii multipli ai unui antigen) este foarte mare fa de antigenele complexe i fa de celule, ambele avnd epitopi repetitivi.

Cea mai mare parte a anticorpilor IgM se sintetizeaz n stadiul timpuriu al rspunsului imun primar fa de un antigen. IgM se sintetizeaz ca rezultat al activrii policlonale, nespecifice, a limfocitelor B, produs de virusul Epstein-Barr la om sau de LPS la oarece. Anticorpii sintetizai dup stimularea policlonal a limfocitelor, leag o varietate de antigene: virusuri, bacterii, protozoare, parazii i fungi.

n plasm se gsesc anticorpi naturali sau spontani a cror sintez are loc n afara stimulrilor antigenice. Termenul natural se folosete pentru a distinge aceste imunoglobuline, de cele care se sintetizeaz dup imunizare. Majoritatea anticorpilor naturali aparin izotipului IgM. Ei reacioneaz nu numai cu o diversitate de antigene nonself, ci i cu molecule self: cu hormoni (insulina, tiroglobulina), cu constituieni celulari (ADN, miozina, actina, tubulina etc.), cu fragmentul Fc al IgG autolog (FR = factorul reumatoid).

IgM reprezint forma sub care se gsesc anticorpii naturali ai grupelor sanguine (aglutininele a i b), precum i anticorpii fa de antigenul somatic O (endotoxina) al bacteriilor Gram negative sau cei detectabili prin reacia Wassermann, dup infecia cu T. pallidum.

IgM trece greu sau nu trece n lichidele interstiiale i nici prin bariera placentar.

Nivelul seric al IgM de la adult este atins la 10 luni. IgM este izotipul cel mai bine conservat n evoluie, fapt evideniat prin relativa constan a secvenei de aminoacizi. Fig. 21. Structura IgE uman. Molecula este format din 4 domenii constante i un domeniu variabil. Este indicat poziia punilor disulfurice inter- i intracatenare, precum i poziia catenelor oligozaharidice. Clivajul enzimatic al IgE poate elibera fragmentele F(ab)2, fragmentele Fc i Fc.

IgE

Denumirea de IgE vine de la eritem, deoarece aceast clas de anticorpi este unul din mediatorii reaciilor vasculare eritematoase.

IgE a fost izolat i caracterizat de Ishizaka (1966), dintr-un mielom productor al acestui izotip. Molecula de IgE are dou catene L identice cu catenele L ale celorlalte clase de imunoglobuline i dou catene grele H cu specificitate antigenic e, fiecare cu cte 550 de aminoacizi, distribuii n 5 domenii: 4 domenii n regiunea constant i unul n regiunea variabil. Catenele H sunt reunite prin dou legturi S-S, localizate n domeniul C2.

Coninutul glucidic este de pn la 11,7%.

IgE este sintetizat n celule din mucoasa respiratorie, gastrointestinal i n ganglionii regionali.

n snge, IgE se gsete n concentraii foarte mici (250 ng/ml). Nivelul su caracteristic adultului este atins la 10-15 ani. IgE nu strbate bariera placentar.

Concentraia seric a IgE crete n parazitoze i n strile alergice. In cazurile de astm alergic, concentraia IgE ajunge la 1550 ng/ml.

IgE este o molecul citotrop: interacioneaz in vivo prin regiunea Fc, cu receptorii specifici de pe suprafaa mastocitelor i bazofilelor, dar i in vitro cu celulele aceleiai specii sau ale speciilor nrudite. Inclzirea serului la 56o anuleaz activitatea citotrop a IgE.

Rolul fiziologic principal al IgE pare a fi acela de protecie a situsurilor anatomice expuse traumatismelor i ptrunderii agenilor patogeni. IgE recruteaz factorii plasmatici i celulele efectoare, stimulnd reacia inflamatorie acut.

IgE ar fi unul din efectorii mecanismelor de ndeprtare a paraziilor intestinali. Aciunea sa s-ar exercita prin efectul chimiotactic pozitiv fa de eozinofile, n focarul de parazitoz i prin stimularea contraciilor rapide i prelungite a musculaturii netede. IgE mrete permeabilitatea vascular i permite anticorpilor serici i celulelor eozinofile s penetreze mucoasa i s participe la reaciile de aprare. Eozinofilele elibereaz coninutul enzimatic al lizosomilor i produc liza parazitului.

IgE este declanatoare a reaciilor de hipersensibilitate imediat de tip anafilactic. In reaciile de hipersensibilitate imediat, mastocitele i bazofilele care leag IgE se activeaz. Activarea ar fi rezultatul formrii unor puni antigenice ntre moleculele de IgE adiacente, care leag un

antigen(alergen) multivalent. Moleculele de IgE conectate prin puntea antigenic genereaz semnalul activrii celulare, a crei consecin este eliberarea moleculelor vasoactive (histamina, serotonina, ECF, SRSA). Fig.22. Structura IgD uman. Schema ilustreaz poziia punilor disulfurice inter- i intracatenare, precum i poziia ipotetic a catenelor oligozaharidice.

IgD

IgD s-a descoperit n 1965 ca o protein de mielom, cu proprieti speciale, care nu are specificitate antigenic a IgG, IgA sau IgM, dar precipit cu anticorpii specifici fa de catenele L ale imunoglobulinelor i este alctuit din cele 4 catene. Ulterior IgD s-a identificat n serul uman normal, dar i la toate speciile de mamifere i psri.

IgD se gsete n snge, n cantitate foarte mic (0,2% din cantitatea total de imunoglobuline).

Molecula de IgD este monomer. Lanurile L sunt n special de tip l, iar catenele H au specificitate antigenic d. Lanul H are 4 domenii: 3 n regiunea constant i unul n regiunea variabil. Regiunea balama este foarte extins i este sensibil la aciunea proteazelor.

Funcii. Aproape toat cantitatea de IgD are rol de receptor de antigen, mpreun cu IgM, pe suprafaa majoritii limfocitelor B mature. Moleculele membranare au un domeniu transmembranar i o scurt extensie citoplasmatic, analog formei membranare a catenei m. Cele dou izotipuri membranare (d i m) au acelai tip de caten L, iar situsul lor de legare este identic, adic recunosc acelai epitop. Nu exist molecule hibride m/d, deoarece cele dou catene H nu se mperecheaz. Raportul dintre cele dou izotipuri de pe suprafaa limfocitelor B este variabil i semnificaia funcional a acestui raport nu se cunoate.

IgD scade pe suprafaa limfocitelor B de memorie i dispare complet pe msur ce celulele se difereniaz spre plasmocit.

IgD seric are o concentraie de 3-40 mg/ml, fiind produs de un numr mic de plasmocite splenice i tonsilare. Sinteza ntr-un numr mic de celule i timpul de njumtire scurt (de 2,8 zile) explic nivelul seric sczut al IgD. Numrul mic de plasmocite productoare de IgD explic raritatea mieloamelor productoare de IgD. Dup stimularea antigenic repetat nu se

sintetizeaz anticorpi ai izotipului IgD. IgD nu are funcie de anticorp efector. Dup stimularea limfocitelor B care au ca receptor de suprafa molecule de IgD, diferenierea nu urmeaz o cale din care s rezulte celule angajate n secreia de IgD. La pacienii cu deficit al sintezei de IgA, n glandele lacrimale, n parotide i n glandele nazale, plasmocitele productoare de IgA sunt nlocuite cu cele productoare de IgD, iar n mucoasa intestinal, cu cele care sintetizeaz IgG i IgM. Totui, IgD nu este o imunoglobulin caracteristic secreiilor, deoarece n secreii nu este mai concentrat dect n ser. Fig. 23. Reprezentarea grafic a distribuiei cantitative a diferitelor clase de imunoglobuline n umorile interne i externe.

INTERACIUNI ANTIGEN-ANTICORP

Reaciile Ag-Ac sunt consecina proprietii eseniale a imunoglobulinelor, aceea a specificitii de legare cu determinantul antigenic care a indus sinteza lor.

Cele mai multe date referitoare la natura interaciunii s-au obinut n reacia dintre anticorpii specifici fa de haptene i epitopul haptenei. Haptenele au avantajul c, teoretic, prezint un singur epitop.

Reacia Ag-Ac poate fi considerat ca prototip al interaciunilor macromoleculare, dar se deosebete de interacia enzim-substrat prin dou caracteristici:

- reaciile Ag-Ac, in vivo, sunt totdeauna reversibile, deoarece anticorpii nu altereaz ireversibil antigenul, aa cum o enzim modific substratul ei;

- heterogenitatea anticorpilor nu are echivalen la alte categorii de proteine.

Reaciile Ag-Ac pot fi clasificate, dup efectele pe care le produc: reacii primare, secundare i teriare.

Reaciile primare semnific recunoaterea specific i legarea celor doi reactani. Reaciile primare se studiaz prin metoda dializei la echilibru, a imunofluorescenei, RIA.

Reaciile secundare pot s apar in vitro, ca o consecin direct, dar nu obligatorie, a interaciunii primare. Ele se evideniaz n timp prin fenomene de aglutinare sau de precipitare, n funcie de natura antigenului.

Reaciile teriare exteriorizeaz consecinele biologice ale reaciilor primare in vivo. Ele au un caracter complex, deoarece sunt influenate de factorii organismului: de concentraia complementului, de mediatorii eliberai de alte celule (mastocite), de afinitatea receptorilor de antigen. Reaciile teriare pot fi protectoare, dac au ca efect imobilizarea bacteriilor, neutralizarea toxinelor i a virusurilor sau pot avea efecte nocive: oc anafilactic, anafilaxie local, hemoliz intravascular.

Bazele moleculare ale interaciunii Ag-Ac

Interaciunile Ag-Ac, in vivo sunt totdeauna reversibile. Factorii care condiioneaz interaciunea Ag-Ac sunt:

- complementaritatea structural dintre determinantul antigenic i situsul de combinare al anticorpului. Acesta este factorul exclusiv al specificitii reaciei. Complementaritatea structural presupune adaptarea conformaional a celor dou grupri reactante i a fost gndit n termeni structurali, pe principiul cheie-broasc;

- complementaritatea electrochimic a gruprilor reactante este consecina complementaritii structurale i semnific intrarea n aciune a unor fore intermoleculare care stabilizeaz i consolideaz interaciunea celor dou grupri. Formarea legturilor intermoleculare necesit existena unor grupri atomice suficient de apropiate pe cele dou molecule. Distana dintre ele este invers proporional gradului de complementaritate.

Dei complementaritatea structural strict nu este obligatorie, o potrivire spaial ct mai nalt este mai favorabil interaciunii. Ea se exprim prin congruena suprafeelor de contact care furnizeaz fore de atracie intermolecular ce stabilizeaz complexul.

La interaciunea Ag-Ac particip urmtoarele tipuri de legturi necovalente: legturile de H, forele electrostatice, legturi van der Waals i legturi hidrofobe. Toate sunt fore nespecifice cu valoare mic i natura lor face ca reacia s fie reversibil.

Legturile de H se formeaz cnd doi atomi au n comun un nucleu atomic de H (un proton). Protonul comun se gsete ntre doi atomi de N sau de O sau ntre unul de N i unul de O. Nucleul de H este legat covalent de unul dintre cei doi atomi (de N sau de O). Legtura de H are energia de legare de 3-7 kcal/mol.

Fig. 24. Forele intermoleculare implicate n formarea complexului Ag-Ac. Aciunea acestor fore necesit un contact strns ntre cele dou grupri reactante. Legturile de H rezult prin formarea unei puni de H ntre doi atomi apropiai. Forele electrostatice se datoreaz atraciei grupelor ionice cu sarcini opuse situate la periferia celor dou lanuri proteice. Forele Van der Waals rezult prin interaciunea ntre diferii nori electronici, reprezentai sub forma dipolilor oscilani. Legturile hidrofobe, care pot contribui cu jumtate din fora de legare Ag-Ac, sunt produse prin asociaia gruprilor nepolare i hidrofobe, de unde moleculele de ap sunt excluse. Distana optim ntre gruprile reactive variaz cu tipul de legtur.

Forele electrostatice (coulombiene sau ionice) sunt rezultatul atraciei dintre atomi sau dintre grupe de atomi cu sarcin electric opus, situate pe cele dou grupri reactante: de exemplu, ntre un cation (Na+) i un anion (Cl-) sau ntre COO- i NH3+. Energia de legare a acestor fore este semnificativ la distane foarte mici (sub 100 Ao) dintre gruprile reactante. Juxtapunerea exact a ionilor favorizeaz ac-iunea acestor fore. Energia de legare este de 5 kcal/mol i variaz invers proporional cu ptratul distanei dintre cele dou grupri reactante (1/d2).

Legturile van der Waals, cele mai slabe fore de interaciune, sunt active pe distane foarte mici dintre gruprile reactante. Energia de legare este de 1-2 kcal/mol. Legturile van der Waals nu se bazeaz pe o separare permanent a sarcinilor electrice, ci pe fluctuaii ale acestora, induse de apropierea moleculelor. La o distan intermolecular limit se formeaz cmpuri electrice instantanee, cu efect polarizant asupra moleculelor nvecinate. Intre atomii suficient de apropiai, apare o for de atracie reciproc indus de sarcina dipol fluctuant, pe care un dipol o induce n dipolul nvecinat. Aceste fore se mai numesc i fore de dispersie. Intensitatea lor depinde de distana dintre gruprile implicate i este invers proporional cu puterea a 7-a a distanei. Valoarea lor este optim la 1-2 .

Legturile hidrofobe (sau apolare) apar ntre grupri nepolare (neionizate) n soluii apoase i sunt consecina tendinei de excludere a reelei ordonate de molecule de ap, dintre molecula de antigen i cea de anticorp. Aceste legturi sunt favorizate de aminoacizii cu grupri apolare, care

au tendina de asociere, diminund numrul moleculelor de ap din vecintatea lor. Prin eliminarea moleculelor de ap dintre gruprile reactante, distana dintre situsurile active scade foarte mult i crete valoarea forelor stabilizatoare.

Complementaritatea spaial sau forele intermoleculare nu sunt, fiecare n parte, suficiente pentru a forma legturi stabile. Pentru stabilitatea interaciunii Ag-Ac sunt necesare ambele condiii. Cu ct energia de legare a reactanilor este mai mare, cu att complexele Ag-Ac sunt mai stabile.

Interaciunea gruprilor reactante ale antigenului i anticorpului este definit de doi parametri: afinitatea i aviditatea anticorpilor.

Fig.25. Msurarea afinitii anticorpilor prin dializa la echilibru. Interaciunea Ag-Ac este reversibil. In interiorul sacului de dializ, haptena este parial sub form liber i parial legat cu anticorpii, n funcie de afinitatea anticorpilor. Prin membrana sacului de dializ poate difuza numai haptena liber i con-centraia sa extern va egala concentraia haptenei libere din interiorul sacului. Msu-rarea concentraiei haptenei n sacul de dializ permite calculul cantitii de hapten legat de anticorpi. Renoirea constant a tamponului duce la disocierea total i la pierderea haptenei din sacul de dializ, ceea ce denot natura reversibil a legturii Ag-Ac (dup Roitt, 1997).

Afinitatea anticorpilor msoar fora de legare dintre un determinant antigenic i situsul complementar de legare al unui anticorp specific. Afinitatea este rezultanta forelor de atracie i de respingere, care mediaz interaciunea celor doi reactani. Fora acestor interaciuni se msoar n reacia dintre un antigen monovalent (a unei haptene) cu anticorpii specifici. O interaciune cu afinitate nalt presupune structuri complementare perfecte, n timp ce complementaritatea imperfect a gruprilor reactante determin o afinitate sczut, deoarece forele de atracie sunt active numai pe distane foarte mici i sunt diminuate de forele de respingere.

Metoda de msurare a afinitii anticorpilor este dializa la echilibru. Metoda se bazeaz pe proprietatea haptenelor mici, monovalente (care nu dau reacii de precipitare cu anticorpii specifici), de a traversa membrana de dializ, impermeabil pentru anticorpi, ca i pentru complexele hapten-anticorpi.

Soluia concentrat de anticorpi se repartizeaz ntr-un sac de dializ i se imerseaz ntr-un volum cunoscut de soluie tampon, la pH 7,4, ce conine o concentraie cunoscut a haptenei. Haptena liber difuzeaz prin membran, n compartimentul cu anticorpi i se combin parial cu acetia. La echilibru, se msoar concentraia haptenei libere la exterior, egal cu concentraia haptenei libere din interior. Concentraia total a haptenei n sacul de dializ este mai mare, deoarece o proporie a moleculelor sale este legat de anticorpi.

Diferena dintre concentraia iniial i cea final a haptenei, n compartimentul exterior, msoar afinitatea ei de legare cu anticorpii specifici, n condiiile unui exces de molecule haptenice, care favorizeaz disocierea complexelor antigen-anticorp.

Aviditatea este un parametru al interaciunii Ag-Ac, care rezult din multivalena antigenului. Cele mai multe antigene posed mai mult dect un determinant antigenic. De exemplu, celulele bacteriene sau virionii, dar i polizaharidele, au pe suprafa un numr mare de determinani antigenici repetitivi. Antigenele proteice au totdeauna determinani antigenici multipli, dar diferii.

Antigenele multivalente leag un numr echivalent de molecule de anticorpi. Energia total de legare a epitopilor multipli ai unui antigen, cu situsurile anticorpilor specifici este mult superioar comparativ cu energia separat a fiecrei interaciuni dintre situsul de combinare i epitop. Aviditatea caracterizeaz energia medie de legare a unui antigen multivalent cu anticorpii specifici i msoar fora rezultant a afinitii dintre epitopii multipli ai unui antigen i paratopii complementari. Complexele Ag-Ac formate de antigenele multivalente sunt stabile, disocierea lor fiind dificil, deoarece este necesar ruperea tuturor legturilor existente.

Afinitatea furnizeaz date cu privire la natura fizico-chimic a reaciei Ag-Ac, iar aviditatea este semnificativ pentru antigenele naturale multivalente.

Afinitatea i aviditatea condiioneaz proprietile fiziologice ale anticorpilor. Cei cu afinitate mare sunt mai eficieni n reaciile biologice: n protecia antibacterian i antiviral, n reacia de precipitare in vitro.

Complexele Ag-Ac formate de anticorpi cu afinitate mic, persist n circulaie i se depun pe membrana bazal a glomerulilor renali. Complexele formate de anticorpii cu afinitate mare se elimin rapid din circulaie, fr efecte defavorabile asupra funciei renale.

Interaciunea Ag-Ac este caracterizat permanent prin formarea i anularea diferitelor tipuri de legturi intermoleculare. In vivo, probabil toate reaciile Ag-Ac sunt reversibile, dar reaciile secundare, in vitro (aglutinarea, precipitarea), n condiiile echilibrului reactanilor, sunt ireversibile.

BAZELE MOLECULARE ALE RECTIILOR IMUNE NCRUCIATE

Trstura dominant a reaciilor Ag-Ac este specificitatea, derivat din nsi caracterul rspunsului imun. In general, anticorpii reacioneaz numai cu antigenul homolog, adic antigenul inductor al sintezei lor, dar exist i excepii, cnd anticorpii unui ser imun reacioneaz i cu antigene heterologe, adic altele dect cel folosit la imunizare, dar nrudite chimic cu acesta.

Molecula de imunoglobulin, cu o structur tridimensional unic, poate s lege un numr de determinani antigenici diferii, similari ca structur chimic cu antigenul inductor sau cu o structur chimic distinct, dac epitopul su se potrivete spaial, cel puin cu o zon limitat a situsului de combinare al anticorpului.

Energia interaciunii anticorpului cu antigenele heterologe este totdeauna mai mic. Posibilitatea ca o molecul de anticorp s interacioneze cu antigene heterologe st la baza multispecificitii imunoglobulinelor sub aspect molecular i a reaciilor ncruciate sub aspect serologic.

Din punct de vedere molecular, posibilitatea legrii unor epitopi diferii, cu un anticorp unic n ceea ce privete situsul su de combinare, se explic prin faptul c la nivelul subunitilor sale structurale, se leag epitopi diferii, cu dimensiuni mai mici i configuraie complementar acestora.

Capacitatea unui situs de combinare al unei molecule de anticorp, de a lega dou antigene diferite, corespunde reactivitii serologice ncruciate adevrate. Legarea epitopilor heterologi se face totdeauna cu afinitate mai mic. Pentru antigenele proteice, reactivitatea ncruciat este determinat de existena unor epitopi asemntori din punct de vedere spaial, cu mici diferene

ale secvenei de aminoacizi, care induc uoare modificri ale epitopilor. Esena reactivitii ncruciate adevrate este c situsul moleculei de anticorp leag epitopi diferii.

O alt cauz de ordin molecular a reaciilor ncruciate o constituie heterogenitatea configuraiei spaiale a situsului de combinare al moleculelor de anticorpi ale unui ser imun. Heterogenitatea anticorpilor este consecina faptului c nu exist nici un antigen care s aib un singur epitop. Cea mai simpl hapten poate induce sinteza ctorva specificiti de combinare a anticorpilor. Heterogenitatea specificitii de combinare a anticorpilor unui ser imun, mrete ansa unei reacii cu antigene heterologe.

Din punct de vedere serologic, capacitatea anticorpilor unui ser imun, cu diferite specificiti de legare, de a reaciona imunologic cu antigene heterologe se numete reactivitate ncruciat de tip II i reflect capacitatea unei subpopulaii a anticorpilor serici de a lega un antigen heterolog.

Exemple de reacii imune ncruciate

Reaciile imune ncruciate au fost iniial detectate pentru serurile imune fa de celulele bacteriene, datorit complexitii antigenice a acestora. Orice celul bacterian conine un numr mare de antigene distincte (flagelare, somatice, capsulare, piliare, fimbriale, etc.). Serul imun specific conine anticorpi (n diferite proporii) fa de toate categoriile de antigene celulare, unele fiind comune mai multor linii bacteriene.

La rndul lor, moleculele mari conin numeroi determinani antigenici, unii dintre ei putnd fi comuni moleculelor omologe ale diferitelor specii.

Reaciile ncruciate sunt mai frecvente pentru antigenele care au epitopi de natur glucidic, deoarece glucidele realizeaz polimeri cu configuraii spaiale limitate ca diversitate.

Antigenele heterofile de tip Forssman, de natur polizaharidic, cu o larg distribuie n lumea vie (om, animale, plante, microorganisme), se caracterizeaz prin capacitatea lor de a reaciona cu un ser imun specific fa de unul din antigenele grupului.

Antigenele proteice din surse taxonomice nrudite, dau frecvent reacii ncruciate. De exemplu, antiserul fa de albumina de ou de gin, precipit albumina din oul de ra; albumina seric

bovin i cea equin sau fibrinogenul uman i cel bovin reacioneaz ncruciat cu serul imun obinut fa de una din aceste proteine. Anticorpii anti-Hbg de cal, sintetizai de iepure, reacioneaz nu numai cu antigenul specific, dar i cu Hbg a unor specii nrudite: zebra, vaca, porcul, ns reacioneaz foarte puin cu Hbg de roztoare, de psri, de amfibieni.

Reacia Ag-Ac a fost un instrument util pentru determinarea diferenelor structurale dintre proteinele omologe, care constau n secvena aminoacizilor. Cu ct dou specii de organisme sunt mai apropiate filogenetic, cu att proteinele lor omologe sunt mai asemntoare i dau reacii ncruciate mai intense.

Capacitatea antigenelor distincte, dar nrudite chimic, de a induce sinteza anticorpilor care reacioneaz ncruciat, a creat complicaii n tratamentul bolnavilor cu diabet insulinodependent. Insulina de origine animal (porcin, bovin, ovin), asemntoare cu cea uman, a determinat la unii pacieni aflai sub tratament de lung durat, sinteza anticorpilor anti-insulin, datorit micilor deosebiri ale secvenei aminoacizilor din poziiile 8, 9, 10. Anticorpii specifici fa de insulina unei specii, reacioneaz cu insulina celorlalte specii. 8 9 10 bovin Ala Insulina cal porc oaie Thr Thr Ser Ala Gly Ser Val Gly Ileu Ileu Val

Alt complicaie a derivat din utilizarea preparatelor de insulin, contaminate cu proinsulin. Insulina este sintetizat n celulele B ale insulelor Langerhans, ca preproinsulin, care se deosebete de proinsulin printr-o secven de 20 de aminoacizi la captul N. Dup scindarea acestei secvene rmne proinsulina, la care aminoacidul 1 din catena A i aminoacidul 30 din catena B, sunt legai prin catena C (33 aminoacizi). Peptidul C are rol n formarea punilor S-S ntre catenele A (21 aminoacizi) i B (30 aminoacizi).

Injectarea preparatelor de proinsulin determin formarea autoanticorpilor anti-insulin. Eliberarea proinsulinei n organism prin liza celulelor insulare B are acelai efect.

Reaciile imune ncruciate reciproce sunt frecvente, dar nu obligatorii. De exemplu, serul imun de iepure anti-albumin seric bovin precipit ovalbumina, dar reacia reciproc nu are loc.

Reacii ncruciate ntre antigene microbiene i tisulare. Serul imun anti-polizaharid capsular de Str. pneumoniae aglutineaz eritrocitele umane de grup A (a cror specificitate antigenic este conferit de N-acetil-galactozamin), iar serul imun anti E. coli aglutineaz eritrocitele umane de grup B (a cror specificitate antigenic este conferit de galactoz).

Serurile imune de la pacienii cu maladii infecioase reacioneaz cu antigenul microbian omolog, dar uneori, i cu antigene ale gazdei. O astfel de reacie este foarte interesant, deoarece poate sta la originea intoleranei fa de self, dup un proces infecios. Un exemplu este cazul anticorpilor ce apar la pacienii infectai cu T. pallidum, care se combin cu cardiolipina. Anticorpi reactivi fa de cardiolipin se gsesc de asemenea, n serul pacienilor infectai cu M. leprae i la cei cu lupus eritematos sistemic. Cardiolipina liber n circulaie nu este imunogen, dar devine imunogen dup asocierea cu nveliul extern de T. pallidum, ceea ce explic sinteza anticorpilor la cei infectai, dar lipsete n celulele de M. leprae.

Reactivitatea ncruciat a stat la baza explicaiei reaciilor autoimune care se produc ntre antigene ale muchiului cardiac sau antigene valvulare i anticorpii anti-protein M de Str. haemoliticus.

SISTEMUL IMUNITAR

Existena tuturor organismelor vii este condiionat de activitatea unor mecanisme de rezisten i de imunitate, capabile s protejeze individualitatea lor chimic, prin mecanisme de recunoatere i difereniere a substanelor proprii (self) de cele strine (nonself). In mod normal, aceste mecanisme sunt perfect tolerante fa de moleculele self, dar se activeaz i reacioneaz mai mult sau mai puin viguros pentru a ndeprta, a neutraliza sau a distruge substanele nonself.

Mecanismele de rezisten i imunitate sunt prezente pe toat scara evolutiv a organismelor, ncepnd cu bacteriile i se complexeaz n evoluie.

Celulele bacteriene posed mecanisme de protecie a individualitii genetice, reprezentate de:

- fenomenele de restricie mediate de prezena unor sisteme enzimatice specifice (enzime de restricie), care recunosc moleculele strine de ADN, le cliveaz la nivelul unor situsuri specifice, rezultnd fragmente mai mici, sensibile la aciunea exo- i endonucleazelor;

- fenomenele de reparaie genetic dependente de activitatea unor sisteme enzimatice care recunosc modificrile ADN induse de mutaii sau de lipsa de fidelitate a mecanismelor de replicare, transcriere i traducere genetic, corectndu-le fie complet (sistemele error free) sau minimaliznd erorile n cazul sistemelor reparatorii predispuse la erori (error prone systems).

La plantele superioare, mijloacele de aprare specific, aparent sunt absente, dar exist o gam larg de modaliti de aprare nespecific:

- continuitatea i integritatea esuturilor epidermice, acoperite sau impregnate cu substane impermeabile pentru virusuri i microorganisme;

- rezistena fiziologic conferit de coninutul nalt de zaharuri reductoare, prezena taninurilor, a diferiilor acizi organici, a pseudoanticorpilor cu activitate hemaglutinant n sucurile vegetale.

La protozoare, procesele de recunoatere asigur selecia hranei, identificarea partenerilor pentru conjugare la parameci, iar la cele parazite, procesele de recunoatere mediaz interaciunea cu gazda.

MECANISME DE APRARE LA NEVERTEBRATE

Dei nu au sistem limfoid, nevertebratele recunosc i rspund la substanele nonself, la fel de eficient ca i vertebratele. La ele funcioneaz o diversitate de mecanisme, unele fiind inductibile. Rspunsul este de scurt durat i nu are specificitate fa de agentul infecios patogen. Rspunsul imun al nevertebratelor se aseamn calitativ cu cel nscut al vertebratelor mediat de celulele fagocitare i de moleculele neimunoglobulinice.

La nevertebrate, aprarea organismului este asigurat de bariere fizico-chimice complexe: secreia mucoas care acoper corpul celenteratelor, anelidelor, molutelor i protocordatelor, omoar potenialii patogeni. Exoscheletul dur al celenteratelor, molutelor, artropodelor, echinodermelor i protocordatelor, formeaz o barier protectoare eficace fa de agenii infecioi. Majoritatea nevertebratelor superioare au sistem circulator cu celule albe, denumite hemocite sau celomocite, n funcie de natura cavitii corpului. Lipsesc hematiile.

n mediul intern al nevertebratelor se gsesc fagocite, factori antimicrobieni constitutivi i inductibili cu efect neutralizant i litic, factori de coagulare a macromoleculelor strine. Toate nevertebratele, chiar cele care nu au caviti ale corpului (spongieri, anemone, viermi lai), au fagocite, uneori de mai multe tipuri. Ca i la vertebrate, fagocitele sunt efectorii rspunsului inflamator, sintetizeaz enzime lizosomale i posed mecanisme citocide dependente de superoxid.

Reaciile de aprare (repararea tisular, fagocitoza, reacia de ncapsulare)sunt mediate de fagocite i de celulele hemostatice. Ingestia microorganismelor invadatoare este rezultatul aciunii fagocitelor, iar un numr mare de microorganisme i de metazoare parazite este ncapsulat de celulele hemostatice i de tip fagocitar. Endoparazitul care ptrunde n organismul nevertebratelor este fagocitat, sau dac are dimensiuni prea mari, este ncapsulat. Incapsularea este rezultatul unei fagocitoze fruste. Adeseori, endoparazitul ncapsulat, este omort sub aciunea intermediarilor toxici ai unei cascade enzimatice.

La nevertebrate lipsesc limfocitele i moleculele de imunoglobuline, dar acestea sunt compensate de o varietate de factori umorali de aprare: aglutinine, lizozim, bactericidine, enzime lizosomale, factori de imobilizare. La insecte s-au detectat peste 15 tipuri de proteine antibacteriene inductibile n cteva ore dup injectarea unui antigen.

Nevertebratele nu au proteinele cascadei complementare, dar viermii, insectele, crustaceii conin sistemul profenoloxidazei. Componentele acestui sistem sunt activate de o serie de enzime. La captul cascadei de activare se formeaz enzima activ fenoloxidaza, cu rol esenial n ndeprtarea substanelor nonself. Fig.26. Un mecanism posibil de activare a profenoloxidazei la fenoloxidaz, la artropode. Activarea este stimulat de leziunile tisulare, de infecia cu microorganisme, de schimbri ale concentraiei ionilor de Ca2+ i ale valorii pH, care pot duce la coagularea plasmei i generarea factorilor care mediaz evenimentele ulterioare ale imunitii (dup Roitt, 1997).

Fagocitoza este foarte activ i este stimulat de aglutininele i bactericidinele cu rol de opsonine. Din punct de vedere funcional, aglutininele i bactericidinele sunt similare anticorpilor. Acestea sunt lectine, cu rolul de a lega componenta glucidic a glicoproteinelor de pe suprafaa celulelor nonself, rezultatul fiind aglutinarea.

Lectinele sunt molecule care au aprut timpuriu n evoluie i sunt ubicvitare: se gsesc la bacterii, plante, nevertebrate i vertebrate. Ele tapeteaz microorganismele invadatoare i au rolul de a le imobiliza, dar au i rol opsonizant, uurnd fagocitoza. In funcie de specificitatea lor de legare cu glucidele, lectinele sunt foarte diferite.

n corpul gras al insectelor superioare s-au caracterizat circa 100 de peptide antimicrobiene, a cror sintez rapid este indus de infecie. Din punct de vedere structural sunt de dou tipuri:

- peptide ciclice, care conin puni S-S (de exemplu, drosmycina), active fa de bacteriile Gram pozitive i fa de fungi;

- peptide lineare (cecropine bogate n Gly i Pro), active fa de bacteriile Gram negative.

Componentele celulare i humorale cu funcii protectoare mediaz reacii de aprare nespecifice (nscute), fr rspuns accelerat la stimularea antigenic secundar.

ORGANIZAREA SISTEMULUI IMUNITAR LA VERTEBRATE

La vertebrate, aprarea este asigurat de mecanisme complicate celulare i humorale, de rezisten i imunitate. Funcia esenial a sistemelor de aprare este protecia fa de agenii patogeni invadatori. Interaciunea permanent cu microorganismele are un rol hotrtor n dobndirea complexitii structurale i funcionale a sistemului imunitar. Dovada o constituie faptul c la animalele germ-free (axenice), numrul limfocitelor B i titrul anticorpilor serici naturali sunt de 5-10 ori mai mici dect la organismele convenionale. Evoluia a generat tipuri celulare specializate, tot mai eficiente funcional, care neutralizeaz, sechestreaz, omoar sau ndeprteaz agenii infecioi.

La vertebrate, reaciile de aprare sunt rezultatul aciunii unor factori humorali nespecifici (complement, substane bactericide) i specifici (anticorpi) i a unor populaii de celule specializate, cu aciune nespecific (fagocite) sau specific (limfocite).

Din punct de vedere structural, n concepia modern, sistemul imunitar al organismelor superioare este considerat ca un organ difuz sui-generis, alctuit dintr-un numr foarte mare de molecule i celule, reunite ntr-o reea de interaciuni complexe, a crei funcie este asigurarea integritii i individualitii structurale a organismului.

n concepia restrictiv a lui N.K. Jerne, sistemul imunitar este reprezentat n exclusivitate de limfocite, iar ntr-o accepiune mai larg, pe lng limfocite, n alctuirea sistemului imunitar intr o serie de celule accesorii cu rol esenial n declanarea rspunsului imun: macrofagele i o serie de celule nrudite(celulele Lagerhans din tegument, celulele dendritice i cele interdigitate).

Se apreciaz c numrul limfocitelor, la adultul normal, este de 1012, iar al moleculelor de imunoglobuline, de ordinul a 1020. Impreun, aceste componente formeaz organul difuz, cu greutatea de circa 910 g (1-2% din greutatea corpului), a crui existen este adeseori ignorat, datorit caracterului sau difuz, n tot organismul. Celulele i moleculele sistemului imunitar sunt prezente n toate esuturile, dar n unele organe (splin, ganglioni limfatici, plci Peyer, amigdale, timus), componentele celulare au o densitate maxim.

Sistemul imunitar este unul din cele mai complexe ale organismului. Complexitatea lui deriv din structura de reea complicat de comunicaii intercelulare, din ubicvitatea sa n organism i din efectele multiple pe care le determin un numr mic de categorii celulare. Sistemul imunitar este considerat un adevrat creier mobil.

Din punct de vedere structural i funcional, sistemul de aprare al organismelor superioare prezint numeroase dualiti:

- existena unui compartiment al rezistenei nespecifice i neadaptative (nscut) i a unui compartiment cu aciune specific i adaptativ (sistemul imunitar);

- prezena a dou populaii nclinate de limfocite (T i B), care mediaz imunitatea celular i respectiv humoral;

- activitatea limfocitelor este modulat fie stimulator, fie inhibitor, sub aciunea unor celule i a unor factori humorali;

- existena organelor limfoide centrale (primare) i periferice (secundare);

- existena unui rspuns imun primar i a unui rspuns imun secundar;

- dualitatea structural (dou perechi de catene polipeptidice) i funcional (bivalena) a moleculei de anticorp;

- comportamentul dublu al moleculei de anticorp: molecula de anticorp recunoate epitopul specific i la rndul ei este recunoscut de molecule cu rol receptor.

Numrul celulelor sistemului imunitar (cu un ordin de mrime superior neuronilor) i al moleculelor sale nu reflect fidel potenialul de aprare a organismului, deoarece n cursul rspunsului imun are loc proliferarea i amplificarea numeric a limfocitelor, precum i a potenialului de biosintez. La aceasta se adaug o rat nalt de renoire i refacere a rezervelor sale celulare.

La om se produc zilnic un miliard de limfocite ce trec n circulaie. Circulnd i recirculnd prin reeaua vaselor sanguine i limfatice, celulele i moleculele sistemului imunitar asigur supravegherea organismului, recunoaterea moleculelor i a celulelor nonself, pentru a le elimina.

Limfocitele

Sistemul imunitar este reprezentat de esuturi derivate din mezoderm, a cror principal component celular este limfocitul. De aici deriv denumirea de sistem limfoid. In ultimul timp se folosete denumirea de limfon, care semnific totalitatea organelor limfoide primare i secundare, precum i celulele componente cu funcia de a recunoate antigenul.

Limfocitele sunt celule care n cursul elaborrii rspunsului imun, recunosc specific antigenul i de aceea se mai numesc imunocite. De aici deriv denumirea de sistem imunocitar, echivalent celei de sistem limfoid. Toate celulele acestui sistem poart pe suprafaa lor, molecule cu rol receptor, capabile s recunoasc specific determinanii antigenici strini.

Sistemul imunitar funcioneaz pe baza interaciunii dintre semnal (antigen) i receptorul specific limfocitar preformat.

n concepia modern, limfocitul este celula central a sistemului imunitar. Ea nu este celula cap de serie aa cum o considerau vechii histologi, ci prezint o extraordinar capacitate de reactivitate i difereniere.

Numrul limfocitelor.

Copiii au un numr mai mare de limfocite i de aceea vrsta trebuie considerat ca un parametru fiziologic de variaie, n evaluarea numeric a acestor celule. Ele reprezint 25-33% din totalul leucocitelor, adic circa 2100 celule/mm3 de snge. Valori mai mici de 1500 limfocite/mm3 semnific starea de limfocitopenie i cel mai adesea semnific un deficit numeric al limfocitelor T.

Pn n anii 50, limfocitele erau distinse numai dup dimensiuni: mari, mijlocii i mici. Cele mai multe limfocite circulante au dimensiuni mici: 7-10 m diametru. La microscopul optic, pe frotiul colorat May Grunwald Giemsa, limfocitele se disting de celelalte dup dimensiuni, sunt agranulare i au cel mai mare raport nucleocitoplasmatic. Limfocitele mari au un raport nucleocitoplasmatic mai mic i n citoplasm se gsesc granulaii azurofile. Se numesc limfocite granulare mari (LGL). In vitro, limfocitele sunt neaderente i nu fagociteaz.

Astzi, Imunologia are la baz conceptul unei heterogeniti funcionale nelimitate a limfocitelor, care deriv din diversitatea specificitii receptorilor suprafeei lor.

Populaia de limfocite care are receptori identici de antigen i recunoate un singur epitop (sau civa nrudii) formeaz o clon. Toate celulele unei clone sunt descendente ale unei singure celule-mam. In consecin, n organism sunt tot attea clone de limfocite, cte tipuri de determinani antigenici exist (teoretic) n natur. Corespondena complementaritii spaiale dintre receptorii limfocitari de antigene i epitopii antigenici asigur posibilitatea elaborrii unui rspuns imun specific, dup contactul limfocitelor cu oricare dintre epitopi.

Caracterizarea funcional a limfocitelor este rezultatul cercetrilor ntreprinse dup anul 1960. n raport cu organul limfoid primar n care se produce diferenierea i maturarea, Roitt i col. (1966) au mprit limfocitele n dou categorii distincte;

- limfocite T, care se difereniaz i se matureaz n timus;

- limfocite B, care se difereniaz i se matureaz n bursa lui Fabricius la psri i n echivalenii ei funcionali, la mamifere.

n funcie de capacitatea lor de a interaciona cu antigenul specific, limfocitele sunt:

- incompetente (imature), cele care nu recunosc antigenul;

- competente (mature), cele care recunosc antigenul specific.

Starea de competen este condiionat de prezena receptorilor prin intermediul crora antigenele sunt recunoscute. Pe suprafaa unei celule pot fi pn la 100 000 de molecule receptoare identice, care ateapt ntlnirea cu substanele nonself corespunztoare.

Dup ce limfocitul i-a dobndit competena n unul din organele limfoide primare, poate s rmn n repaus, dac organismul nu a recepionat mesajul antigenic corespunztor. Aceste limfocite sunt neangajate (neinformate sau naive). Cele care au venit n contact cu antigenul specific sunt limfocite angajate (informate). Ele constituie substratul material al memoriei imunologice i ori de cte ori se vor rentlni cu antigenul, vor produce un rspuns imun rapid i amplu.

Dup durata vieii, limfocitele sunt:

- cu via scurt (efectoare ale rspunsului imun);

- cu via lung (de memorie). Ele recircul n organism perioade ndelungate (de ordinul anilor). La om, limfocitele de memorie ar supravieui circa 10 ani, fr s se divid.

n raport cu funcia pe care o ndeplinesc, se disting urmtoarele categorii de limfocite:

- efectoare, cele care direct sau indirect, prin molecule efectoare, neutralizeaz antigenul;

- reglatoare, cele care ralizeaz echilibrul optim al rspunsului imun.

Limfocitele B

Limfocitele B reprezint 5-15% din totalul limfocitelor circulante i constituie o diviziune funcional major a populaiei limfocitare. Impreun cu descendenii lor difereniai (limfoblastul, plasmocitul), limfocitele B sintetizeaz anticorpi, efectorii rspunsului imun mediat humoral (RIMH).

Limfocitul B imunocompetent (matur, neangajat) sintetizeaz cantiti mici de molecule ale unui izotip de imunoglobuline, care rmn legate de membrana limfocitului, avnd rol de receptori de antigen, adevrate antene de detectare a antigenului specific.

Sub aspectul specificitii de legare a antigenului, fiecare organism posed milioane de clone de limfocite B, adic mici populaii celulare identice, descendente din aceiai celul mam, care recunosc i leag acelai antigen i produc anticorpi cu aceiai configuraie spaial a situsului de combinare.

Dup activare, toi descendenii limfocitului B sintetizeaz imunoglobuline i le secret ca anticorpi, cu aceiai specificitate de legare pe care a avut-o receptorul.

Receptorul de antigen al limfocitelor B. Majoritatea limfocitelor B umane din sngele periferic exprim dou izotipuri de imunoglobuline pe suprafaa lor: IgM i IgD sau numai IgD. Situsurile de legare ale celor dou izotipuri sunt identice. Numai 10% dintre limfocitele B au pe suprafaa lor, ca receptor de antigen, molecule de IgG, IgA sau IgE. Cele care au ca receptor molecule de IgA, sunt localizate n esutul limfoid asociat mucoaselor.

Moleculele receptoare de imunoglobulin sunt inclavate cu captul C-terminal n membran. Intre IgM legat de membran (IgMm), cu funcia de receptor de antigen i IgM seric (IgMs), sunt dou deosebiri majore:

- IgMm conine o secven C-terminal hidrofob, prin care se ancoreaz n membrana limfocitelor mature neangajate, care nu au venit n contact cu antigenul;

- IgMm este monomer, iar IgM seric este pentamer.

Secvena C-terminal a IgMm cuprinde 25 de aminoacizi hidrofobi ce formeaz domeniul transmembranar, urmat de o secven cationic Lys-Val-Lys. Ca la toate proteinele ancorate n membran, acest domeniu formeaz un -helix, cu o lungime suficient pentru a strbate membrana. Fiind hidrofob, secvena de aminoacizi are interaciuni strnse cu lipidele membranei. Secvena cationic se extinde n citoplasm, mrind gradul de stabilitate a moleculei n membrana celular.

Dup stimularea antigenic, sinteza se comut la IgM seric. Trecerea de la IgMm la IgMs este rezultatul unor diferene ale modului de prelucrare a ARN premesager. Copia de ARN premesager pentru sinteza catenei (H) are dou situsuri poteniale de clivare i ataare a resturilor de poli-A, ce marcheaz captul ARNm. Dup stimularea antigenic, din ARN premesager sunt clivate secvenele codificatoare ale domeniului C-terminal hidrofob i se sintetizeaz molecule de IgM fr secvena C-terminal de aminoacizi hidrofobi.

Comutarea IgMm --- IgMs nu modific lanul L al moleculei. Cele dou forme ale IgM au domenii identice VH i VL, adic au aceiai specificitate de legare a antigenului (au acelai idiotip).

Limfocitul B are receptori membranari pentru substanele mitogene, pentru complement (C3b), pentru regiunea Fc a imunoglobulinelor, pentru insulin etc. Receptorul pentru C3b funcioneaz i ca receptor pentru virusul Epstein-Barr. Limfocitele B neactivate au receptori de mic afinitate pentru IL-2, dar dup stimularea antigenic, ele exprim rapid, receptori pentru IL-2 de nalt afinitate. Limfocitele B rspund la efectul stimulator al IL-2, prin proliferare rapid i secreia IgM. Pe suprafaa limfocitelor B se gsesc la densitate nalt, moleculele CMH II.

Limfocitele T

Limfocitele T reprezint pn la 80% din totalul limfocitelor circulante. Valorile normale n snge, pentru limfocitele T sunt cuprinse ntre 1620-4320/mm3, ntre una i 18 luni de via i ntre 590-3090/mm3, dup 18 luni.

Proporia limfocitelor T se poate determina prin metoda rozetelor cu hematii de berbec sau prin metoda imunofluorescenei cu anticorpi monoclonali fa de receptorul de antigen.

Limfocitele T mature exprim markerul* CD4** sau CD8. Aceste molecule aparin suprafamiliei imunoglobulinelor. Celulele CD4 au de obicei funcie helper, iar cele ce exprim markerul CD8 sunt citotoxice.

Limfocitele T ndeplinesc funcii complexe, att efectoare ale rspunsului imun mediat celular ct i reglatoare, prin intermediul unor factori humorali pe care-i secret, denumii limfochine. Limfocitele T realizeaz urmtoarele funcii:

lizeaz celulele care exprim molecule nonself pe suprafaa lor;

regleaz rspunsul imun;

mediaz reaciile de hipersensibilitate ntrziat.

Aceste funcii sunt rezultatul heterogenitii funcionale i se datoreaz activrii unor subpopulaii distincte de limfocite T:

- limfocite Tc (Tcl, citotoxice sau citolitice) exprim pe suprafaa lor markerul T8 (CD8);

- limfocite Th (helper) au pe suprafa markerul CD4. Acestea sunt cele mai numeroase, reprezentnd 60-65% din numrul total de limfocite T ale organismului uman;

- limfocite Ts (supresoare), purttoare ale markerului CD4;

- limfocite TD sau TDH (delayed hypersensitivity) exprim markerul CD8.

Funciile limfocitelor Th se realizeaz prin intermediul limfochinelor secretate. In funcie de limfochinele pe care le sintetizeaz, limfocitele Th se clasific n dou subseturi:Th-1 i Th-2.

Celulele Th-1 (Th-c) secret IFN gama, IL-2 i TNF beta (citochine de tip 1, stimulatoare ale imunitii mediate celular). Citochinele de tip 1 produc urmtoarele efecte: stimuleaz reacia de citotoxicitate i inflamatorie asociat cu reaciile de hipersensibilitate ntrziat. In esen, limfocitele Th-1 au rol n edificarea unui rspuns imun mediar celular (RIMC).

Celulele Th-2 (Th-b) secret citochine de tip 2: IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10 (dar nu secret Il-2) i stimuleaz activitatea limfocitelor B de memorie. Citochinele tip 2 (IL-4, IL-5) stimuleaz rspunsul imun humoral fa de paraziii extracelulari (stimuleaz diferenierea limfocitelor B spre plasmocit) i instalarea strilor alergice prin capacitatea lor de a induce sinteza IgE i de a stimula mastocitele. In esen, limfocitele Th-2 sunt implicate n edificarea rspunsului imun mediat humoral (RIMH). Prin toate aceste efecte, limfocitele Th sunt amplificatoare ale rspunsului imun

Limfocitele CD8 (T citototoxice) reprezint 25-35% dintre limfocitele T circulante. Funcia lor const n efectul litic prin contact celular direct asupra celulelor infectate cu virusuri, malignizate sau alogenice.

Limfocitele TD sunt mediatoare ale reaciilor de hipersensibilitate ntrziat (delayed) de tip tuberculinic. Ele secret limfochine cu efecte locale asupra macrofagelor i limfocitelor din focarul inflamator.

Limfocitele Ts sunt inhibitoare ale amplitudinii rspunsului imun, dup epuizarea antigenului. Ele au rolul de a diminua intensitatea RIMC i RIMH, meninnd n limite fiziologice intensitatea reaciilor imunitare. Se pare c i exercit rolul supresor asupra rspunsului imun, prin inhibarea activitii limfocitelor Th, dar au i efect supresor direct asupra limfocitelor T i B efectoare. Limfocitele Ts au rol important n inducerea strii de toleran fa de antigenele exogene, ca i fa de moleculele self. Deficienele funcionale ale limfocitelor Ts creeaz predispoziii pentru maladiile autoimune.

Distincia funcional ntre limfocitele TCD4 i TCD8 nu este totdeauna net. Unele clone de limfocite TCD4 au proprieti citotoxice, iar unele clone TCD8, dup contactul cu antigenul, prolifereaz i secret limfochine, ca i limfocitele TCD4.

Receptorul de antigen al limfocitelor T (RCT)

Dei moleculele de anticorpi au fost printre primele a cror structur chimic s-a identificat, caracterizarea biochimic a receptorului de antigen al celulelor T s-a fcut foarte greu, deoarece nu a existat un echivalent celular T al tumorilor de mielom. Molecula cu rol de receptor de antigen a limfocitelor T s-a identificat recent, dup ce a fost posibil cultivarea liniilor de hibridom de celule T.

Moleculele receptoare de antigen ale limfocitelor T au o larg variaie biochimic, corespunztoare specificitii de legare a spectrului foarte larg de antigene.

Ca i n cazul anticorpilor, pentru receptorul de antigen al celulelor T, se folosete termenul de idiotip (Ti), pentru a desemna o molecul a RCT cu un set unic de epitopi asociai, derivai din configuraia sa spaial unic, complementar pentru legarea specific a unui epitop antigenic.

Pentru izolarea i identificarea receptorului Ti s-au utilizat anticorpi monoclonali (AMC) anti- Ti, care precipit specific moleculele Ti dintr-un amestec complex de proteine membranare. Examinarea peptidelor n imunoprecipitatele diferitelor clone de celule T, prin metoda electroforezei n SDS-poliacrilamid, a evideniat c RCT este un heterodimer i const dintr-o glicoprotein de 80-90 kD, care n condiii reductoare se disociaz n dou peptide de 40 i respectiv 43 kD. Molecula ntreag const dintr-o pereche de lanuri peptidice, similare ca dimensiuni, legate prin puni S-S.

Lanul

Lanul

Fig. 27. Structura receptorului de antigen al limfocitului T. Molecula este un heterodimer format din lanurile i , care se extind prin membrana celular i au scurte poriuni citoplasmatice. Complexul T3 este alctuit din 4 subuniti proteice (, i 2 ), localizate i dublul strat lipidic i n citoplasm.

Cele dou peptide sunt distincte i s-au notat i . Lanul are 248 aminoacizi, cu punctul izoelectric la pH = 5,0-5,5. Lanul are 282 aminoacizi, iar punctul izoelectric este la pH 6,57,0.

Fiecare caten are 4 domenii: unul variabil (V , respectiv V ), unul constant (C , respectiv C ), unul transmembranar i unul intracitoplasmatic. Astfel alctuit, molecula RCT face parte din suprafamilia moleculelor imunoglobulinice. Prin dimensiuni se aseamn cu lanul L al imuno-globulinelor: domeniul variabil al fiecrui lan are 110 aminoacizi, dar pentru c se ancoreaz n membran, se aseamn cu lanul H.

Domeniile variabile ( i ) sunt extrem de variabile (ca i regiunile variabile ale celor dou catene ale imunoglobulinelor) i particip la formarea situsului de combinare al RCT.

Situsul de combinare al RCT este alctuit din regiunile hipervariabile sau regiunile determinante de complementaritate RDC (3 ale catenei i 4 ale catenei ) i este aplatizat, adaptat funciei sale de a lega suprafaa aplatizat a moleculelor CMH.

La om, RCT heterodimer este asociat cu molecula T3, o grupare de trei peptide asociate necovalent. Funcia probabil a lui T3 este aceea de transductor al semnalului de activare, de la Ti la citoplasm, constituind, prin modificri conformaionale, un canal de trecere a ionilor de Ca2+ prin membran, dup ce receptorul a legat epitopul specific.

S-au identificat dou tipuri de RCT:Fig.28.a. Subseturi majore de celule T

Fig. 28.b. Subseturi funcionale de celule T CD4+ Subseturi de limfocite T, n funcie de tipul de RCT (RCT-2, RCT-2). Limfocitele RCT-1 au un repertoriu restrns de interaciune cu antigenul, dar nu manifest fenomenul restriciei CMH. Limfocitele RCT-2 exprim CD4 sau CD8, care determin recunoaterea antigenului asociat cu moleculele CMH II sau CMH I. Limfocitele TCR-2+ CD4+ sunt divizate pe baza limfochinelor pe care le secret, n subseturi de celule Th1(stimulatoare ale IMC) i Th2 (stimulatoare ale IMH) (dup Roitt, 1997).

- RCT-2 este heterodimerul format din polipeptidele i , legate prin puni S-S, prezent pe suprafaa a circa 90% dintre limfocitele T;

- RCT-1 este asemntor structural cu RCT-2, dar const din polipeptidele i , cu o alt specificitate antigenic, identificat prin intermediul anticorpilor monoclonali. Se gsete pe suprafaa a 0,5-15% dintre limfocitele T circulante umane, dar este mai frecvent pe limfocitele intraepiteliale ale mucoasei intestinale.

Limfocitele T / exprim markerul CD3 i recunosc antigenul printr-un mecanism asemntor cu acela al limfocitelor T /, adic recunosc epitopii asociai cu moleculele CMH I i II, dar frecvent par s interacioneze cu molecule CMH neclasice, iar specificitatea interaciunii lor cu epitopii antigenici este limitat. Aceste limfocite pot s recunoasc antigene neconvenionale, ca de exemplu, proteinele de oc termic i antigenele nepeptidice (glucidice).

n general, limfocitele cu RCT-1 ( /) sunt negative pentru markerul CD4 i pentru CD8, dei unele exprim nivele sczute ale unuia dintre markeri.

Unele studii sugereaz c aceste celule contribuie la rspunsul iniial al gazdei, la diferii ageni infecioi: virusuri, bacterii(n special micobacterii), parazii, dar i la rspunsul anti-tumoral. Ele par s constituie prima linie de aprare. Ipoteza este n acord cu localizarea lor anatomic, la poarta de intrare n organism, n esuturile nelimfoide (tegument, intestin), dar i n situsurile inflamatorii. Limfocitele T / se aglomereaz n focarele inflamatoare cronice(membrana sinovial, leziunile asociate cu lupusul eritematos diseminat).

La rumegtoare, 30-80% din totalul limfocitelor T circulante au receptor /, valorile maxime nregistrndu-se la organismele nou-nscute. La alte specii, numrul acestor limfocite T este mic. Abundena lor numeric la rumegtoare este corelat, probabil, cu bacteriemia masiv care nsoete procesul digestiv.

n esen, markerii RCT i CD3 sunt definitorii pentru limfocitele T.

Limfocitele T au un marker distinctiv pe suprafaa lor, fa de limfocitele B: Thy 1 (CD90). Acest marker poate fi exprimat i pe alte tipuri celulare i lipsete la o mic proporie a limfocitelor T.

Celulele NK

Celulele NK (natural killer) reprezint circa 15% din totalul limfocitelor sanguine. Ele deriv din mduva osoas i au origine comun (acelai progenitor), ca i celulele T. In vitro, sunt neaderente i nefagocitare, ceea ce le aseamn cu limfocitele. Din punct de vedere morfologic, celulele NK sunt mari, granulare (LGL, large granular lymphocytes), avnd citoplasm mai bogat dect celelalte limfocite, cu granulaii azurofile.

Celulele NK nu au nici unul din receptorii de antigen caracteristici limfocitelor T sau B i de aceea au fost denumite celule nule.

Celulele NK au pe suprafaa lor unii markeri caracteristici limfocitelor: au receptor pentru Fc de mic afinitate, formeaz rozete E, au receptor de mic afinitate pentru IL-2, produc IL-2 i IFN . Au i receptori caracteristici seriei mieloide.

n dezvoltarea lor, celulele NK nu sunt dependente de timus.

Celulele NK au via scurt i reprezint o linie important, primordial n evoluie, cu rol esenial n mecanismele de aprare nscut a organismului: sunt active n respingerea grefelor i a celulelor modificate sub raport antigenic. Funcia celulelor NK este de a recunoate i de a liza anumite celule tumorale i celule infectate cu virusuri. Celulele NK au lizat celulele liniilor B limfoblastoide transformate de EBV, deficiente n molecule CMH I, dar nu au mai lizat aceste inte dup transfecia cu genele HLA-B sau HLA-C. Mecanismul recunoaterii celulelor

purttoare de molecule nonself nu este cunoscut. Se admite c celulele NK recunosc moleculele CMH i se activeaz cnd receptorii lor nu ntlnesc moleculele CMH pe suprafaa celulelor int sau cnd moleculele CMH au o densitate mai mic dect cea normal. Efectul interaciunii este liza celulei int.

Aciunea definitorie a celulelor NK este citotoxicitatea. Ele lizeaz fr restricie CMH, celulele tumorale sau pe cele infectate cu virusuri.

Activitatea celulelor NK este foarte nalt la oarecele nud (fr timus) sau la oarecii timectomizai neonatal. Dup activare, celulele NK elibereaz IFN .

Cel mai studiat receptor membranar al celulelor NK este receptorul de mic afinitate pentru Fc al IgG (CD16).

O subpopulaie distinct a celulelor NK o reprezint celulele K (killer). Ele sunt tot LGL, dar spre deosebire de celulele NK, exprim receptorul de mare afinitate pentru Fc . Aciunea lor principal este citotoxicitatea mediat de anticorpi (ADCC), fa de celulele modificate antigenic.

In vitro, limfocitele T din snge, sub aciunea stimulatoare a unor citochine (IL-2, IFN ) difereniaz o subpopulaie, care au fost denumite LAK (lymphokine activated killers). In vitro, prin adugarea IL-2 i a antigenului tumoral, devin citotoxice fa de celulele tumorale omologe.

* Markerii de suprafa ai limfocitelor T umane s-au identificat cu dificultate, datorit naturii outbred a populaiei. S-au notat cu literele TCD, urmate de o cifr, n ordinea descoperirii: TCD1, TCD2 etc. Anticorpii monoclonali au constituit instrumentul esenial de lucru. Cel mai cunoscut este markerul TCD4, deoarece funcioneaz ca receptor pentru HIV. Este un glicopeptid cu o regiune extracelular format din 4 domenii, un domeniu transmembranar i unul citoplasmatic, iar CD8 este dimeric i prezint un domediu asemntor cu domeniul variabil al moleculei de imunoglobulin.

** CD (cluster designation) se refer la grupele (cluster) de anticorpi monoclonali utilizai pentru identificarea subpopulaiilor de limfocite. Fiecare grup de AMC are specificitate fa de un anumit marker celular.

BAZELE GENETICE ALE DIVERSITII RECEPTORILOR DE ANTIGEN

Funcia imunitar se bazeaz pe interaciunea specific dintre receptorii limfocitari i epitopii nonself. Diversitatea specificitii de legare a receptorilor limfocitari este paradigma pe care se cldete ntregul edificiu al tiinei imunologice. Diversitatea receptorilor caracterizeaz ambele populaii de limfocite.

Limfocitele B ale vertebratelor sintetizeaz anticorpi cu o mare diversitate a specificitii situsului de combinare (108- 109 tipuri diferite, care leag un numr echivalent de epitopi antigenici diferii). Inelegerea determinismului genetic al acestei uriae diversiti a ntrziat mult fa de alte aspecte ale funcionalitii sistemului imunitar.

Prima teorie modern cu privire la specificitatea anticorpilor a fost teoria lanurilor laterale a lui Ehrlich (1900). Lanurile laterale sunt receptori preformai, inserai n membrana limfocitelor

Legarea antigenului pe receptorul membranar al limfocitului va stimula celula s sintetizeze molecule identice cu receptorul de antigen, care trec n ser ca anticorpi. Aceast teorie a anticipat teoria seleciei clonale, precum i ideea c sistemul imunitar poate genera receptori cu mult nainte de a veni n contact cu antigenul. Receptorii limfocitari sunt preformai, au o structur asemntoare cu aceea a anticorpilor serici i rmn n ateptarea ntlnirii cu antigenul specific. Ehrlich consider, ns, n mod eronat, c o celul posed receptori pentru mai multe antigene. Teoria a fost abandonat cnd Landsteiner a artat c sinteza anticorpilor este indus i de antigenele artificiale (conjugate hapten-protein), nentlnite niciodat n natur i astfel specificitatea anticorpilor a fost explicat prin teoriile instructive (Breinl i Haurovitz, 1930). Aceste teorii atribuiau un rol important gruprilor determinante de specificitate. Epitopii ar ptrunde n celula care sintetizeaz anticorpi i ar aciona ca matri, imprimnd polipeptidelor n curs de sintez, o configuraie spaial complementar.

Teoriile instructive au fost infirmate dup evidenierea diversitii enorme a moleculelor de anticorpi, care se sintetizeaz dup stimularea cu un antigen, precum i de faptul c o celul B i descendenii ei produc anticorpi cu o specificitate unic fa de un epitop.

n 1959, Mc Farlane Burnet a formulat teoria seleciei clonale, care postuleaz c sistemul imunitar este reprezentat de un numr uria de clone de limfocite, corespunztor unui numr echivalent de epitopi. Clona este o populaie de celule identice din punct de vedere genetic, descendente ale unei singure celule de origine. Diversitatea clonelor este reflectat n specificitatea fiecreia de a recunoate un anumit epitop i este generat n timpul diferenierii celulelor limfoide din celulele de origine. Toate celulele unei clone poart pe suprafaa lor, molecule identice de imunoglobulin, care funcioneaz ca receptori specifici de antigen. Dup interaciunea cu antigenul, molecula receptor va fi sintetizat i secretat, cu o rat foarte nalt, ca anticorp. Epitopii antigenici selecioneaz din aceast colecie imens, clonele de limfocite care au receptori complementari din punctul de vedere al configuraiei spaiale i determin proliferarea i diferenierea lor n celule productoare de anticorpi. Toate celulele clonei au aceiai specificitate pentru antigen. Fig. 29. Ilustrarea schematic a teoriei seleciei clonale. Fiecare clon de limfocite are pe suprafaa sa, un receptor de antigen, specific pentru un epitop antigenic complementar. La ptrunderea n organism, antigenul selecteaz acele clone care pot s lege specific epitopii complementari. Celulele selectate sunt stimulate s se divid i s se diferenieze n celule efectoare mature i celule de memorie.

Sistemul imunitar funcioneaz pe principiul gata fcut, adic receptorul de antigen preexist pe suprafaa limfocitelor, astfel nct problema diversitii anticorpilor trebuie explicat pe baze genetice.

Teoria seleciei clonale este argumentat de cteva dovezi experimentale:

- limfocitele imunocompetente au specificiti distincte pentru diverse antigene: de exemplu, numai 1-2% dintre limfocite leag albumina seric bovin. Numrul celulelor care leag un anumit antigen crete mult dup imunizarea cu antigenul respectiv;

- limfocitele unei clone au receptori i produc anticorpi cu o singur specificitate, fa de un singur epitop. Faptul c iniial se sintetizeaz IgM i ulterior IgG, nu este un contraargument, deoarece anticorpii celor dou clase au regiuni variabile identice i au aceiai specificitate de legare cu epitopul;

- clona de celule cu specificitate de legare a unui epitop se poate elimina selectiv prin pasajul celulelor pe o coloan de afinitate, cu bile de sticl tapetate cu antigenul specific. Celulele care au receptori pentru antigen ader de coloan, iar celelalte trec, ceea ce denot c limfocitele sunt

angajate s rspund la un antigen, nainte de a se ntlni cu el, prin receptorii lor specifici preformai;

- incubarea limfocitelor cu un antigen puternic radiomarcat, produce moartea numai a celulelor care l leag specific.

Mecanismele genetice ale diversitii imunoglobulinelor

Susinut de dovezi experimentale, teoria seleciei clonale este acceptat. Se pune problema modalitii de codificare genetic a sintezei unei mari diversiti moleculare de anticorpi. Potenialului imens al unui organism de a sintetiza milioane de tipuri de molecule diferite de anticorpi, ar trebui s-i corespund un numr egal de gene codificatoare. Generarea potenialului uria de diversitate genetic s-a explicat n diferite moduri:

- teoria liniei germinale consider c genele care codific sinteza domeniilor VL i VH se gsesc n celula germinal. In genomul fiecrui individ s-ar gsi un numr imens de cistroni care s-ar transmite ereditar. Pentru cele 108 109 specificiti de legare ale moleculelor de anticorpi, ar exista tot attea gene codificatoare. Teoria nu explic modalitile de pstrare n cursul evoluiei, a acestui numr uria de gene i nici posibilitatea sintezei anticorpilor specifici fa de antigenele sintetice;

- teoria recombinrilor somatice presupune existena unui numr limitat de cistroni codificatori ai domeniilor variabile ale moleculei de anticorp, n linia germinal. Diversificarea specificitii de combinare a anticorpilor s-ar realiza prin recombinri somatice ntre un numr limitat de cistroni, asociate cu diviziunile celulare n cursul diferenierii limfocitelor;

- teoria mutaiilor somatice consider c repertoriul genelor pentru sinteza imunoglobulinelor este construit de novo n cursul dezvoltrii sistemului imunitar, pornind de la un numr mic de gene ale liniei germinale, prin mutaii la nivelul celulelor somatice. Selecia pozitiv (pstrarea viabilitii clonelor limfoide cu receptori pentru antigenele exogene) s-ar face sub influena antigenelor care selecioneaz i stimuleaz proliferarea celulelor mutante, care sintetizeaz anticorpi cu situs de combinare complementar. Teoria presupune persistena n organism, pentru perioade lungi de timp, a unui numr mare de antigene, ceea ce este improbabil;

- teoriile mixte presupun existena unui numr limitat de cistroni codificatori ai domeniului variabil (V), n celulele liniei germinale. Diversificarea imens a potenialului de codificare i sintez s-ar face prin recombinri somatice ntre aceti cistroni, n timpul diviziunilor celulare, declanate de recunoaterea i stimularea antigenic.

Ipoteza lui Dreyer i Bennett (1965) explic diversitatea anticorpilor prin nsi particularitile lor de structur. Existena unei singure gene codificatoare pentru regiunile V i C ale moleculei de imunoglobulin este improbabil, deoarece nu este posibil ca o gen s sufere attea variaii corespunztoare captului NH2 al catenei polipeptidice i s rmn constant pentru secvena codificatoare a captului COOH. Nu se cunoate nici o situaie n care segmentul ADN corespunztor regiunii constante a unei proteine s fi rmas nemodificat, iar cel codificator al regiunii variabile s fie expus fenomenelor mutaionale cu o frecven att de mare.

Singura modalitate de a explica variabilitatea regiunii N-terminale i constana regiunii Cterminale este acceptarea ideii c molecula de imunoglobulin este codificat de mai multe gene distincte cel puin dou - una pentru regiunea variabil i una pentru regiunea constant.

n acord cu aceast ipotez, n celulele limfoide embrionare ar exista cteva sute de gene codificatoare ale regiunii variabile i o gen pentru regiunea constant, care s-ar asocia la ntmplare n cursul diferenierii limfocitelor B. O molecul funcional de imunoglobulin s-ar sintetiza ori de cte ori recombinarea genetic aduce n limfocitul precursor al plasmocitului, o gen V n apropierea genei C corespunztoare. Astfel s-ar forma cuplurile de gene funcionale VL-CL i VH-CH, codificatoare ale celor dou catene.

Ipoteza venea n contradicie cu cteva dogme ale biologiei celulare i moleculare:

- dogma conform creia, o gen codific un polipeptid;

- dogma constanei genomului pe toat perioada de dezvoltare a unui organism;

- dogma imposibilitii rearanjrii genelor ntr-o celul somatic;

- dogma continuitii informaiei genetice. Din aceste motive, ipoteza nu a fost acceptat.

Teoria genelor multiple codificatoare ale unei molecule de imunoglobulin a fost confirmat ulterior prin tehnica cineticii de hibridare (Leder i Swan, 1971). Autorii au artat c att n celulele limfoide embrionare ct i n celulele tumorii de mielom, regiunea constant a catenelor H i L ale moleculei de imunoglobulin este codificat de o singur gen, iar regiunea variabil este codificat de mai multe gene.

Prin tehnica hibridrii, s-a comparat distribuia genelor codificatoare n ADN din dou surse:

- dintr-o tumor de mielom de oarece, ce secret un lan k;

- din celulele limfoide embrionare (imature) de oarece, ce nu sintetizeaz imunoglobuline.

ADN din ambele surse a fost clivat cu enzime de restricie, n fragmente separate ulterior prin electroforez.

Fragmentele codificatoare ale lanului k au fost identificate prin hibridare cu ADNc, obinut prin transcrierea invers a ARNm al lanului k. S-au folosit dou tipuri de ARNm ale lanului k:

- un fragment pentru lanul Lk ntreg (cu domeniile Vk i Ck);

- un fragment corespunztor jumtii 3 a ARNm, codificator al domeniului Ck;

Pentru ambele categorii de molecule de ARNm s-au obinut fragmentele de ADNc corespunztoare.

n proba cu ADN obinut din limfocitele embrionare, ADNc al fragmentului Ck a hibridat cu un fragment de ADN ce conine gena Ck, iar ADNc pentru ntregul lan k a hibridat att cu fragmentul genei Ck, ct i cu un alt fragment de ADN rezultat prin clivarea cu enzimele de restricie, care probabil conine gena Vk.

n concluzie, n celulele limfoide embrionare, cele dou gene codificatoare ale catenei k se gsesc situate la distan, n fragmente de restricie diferite.

n proba cu ADN obinut din celulele limfoide de mielom, ambele probe de ADNc, corespunztoare domeniului Ck i lanului ntreg Vk au hibridat ntr-un singur fragment.

n concluzie, n limfocitele mature, cele dou fragmente codificatoare ale lanului k se gsesc n vecintate imediat, n acelai fragment de restricie.

n esen, genele funcionale pentru sinteza imunoglobulinelor n celulele mature sunt rezultatul rearanjrii prin procese de transpoziie, a unor segmente genice mici, motenite n ADN al liniei germinale. Rearanjrile au loc n limfocite, pe msur ce ele se difereniaz din celule imature precursoare, n limfocite B productoare de anticorpi.

Singurul mecanism care aduce cele dou gene ntr-un ansamblu funcional este reunirea prin transpoziie i recombinarea genetic a celor dou secvene de ADN pentru a forma o gen activ L i o gen activ H.

Polipeptidele L i H sunt codificate de trei grupuri de gene nelincate:

- grupul genelor H, pentru sinteza catenelor , , , , (situate pe cromosomul 14 la om i 12 la oarece);

- grupul genelor k, codificatoare ale lanului Lk (situate pe cromosomul 2 i respectiv 6);

- grupul genelor pentru sinteza catenei L (situate pe cromosomul 22 i respectiv 6).

Fiecare din aceste familii cuprinde un numr controversat de gene codificatoare ale regiunii variabile, situate separat, la distan, de gena codificatoare a regiunii constante a moleculei de imunoglobulin.

Genele pentru catena L a imunoglobulinei de oarece s-au studiat prin clonarea fragmentelor de ADN ntr-un fag ce se replic n celulele de E. coli. S-a obinut astfel o cantitate suficient de mare de ADN al genelor codificatoare pentru catenele Lk i L , att din limfocitele embrionare, ct i din celulele limfoide mature de mielom, productoare de imunoglobuline.

Gena codificatoare a lanului este format din 4 segmente separate, ordinea lor n direcia 5 --3 find L, V , J i C.

Segmentul genic L codific 15-20 de aminoacizi ai secvenei leader de la extremitatea Nterminal a catenei polipeptidice. Aceast secven este clivat pe msur ce lanul strbate membrana reticulului endoplasmic i lipsete din molecula de imunoglobulin matur

Segmentul genic V codific cea mai mare parte a regiunii variabile a lanului , specificnd legarea aminoacizilor de la poziia 1 la 97.

Segmentul genic J (J, joining = legare) codific restul regiunii variabile, adic aminoacizii ntre poziiile 98-110.

Segmentul genic C codific secvena constant a catenei L, ntre poziiile 111-214.

Familia de gene codificatoare ale catenei Lk este organizat asemntor cu a genelor L : secvene leader Lk, aezate n tandem cu cele circa 250 de segmente genice Vk, 5 segmente genice Jk strns legate ntre ele (din care unul este defectiv) i la o distan de 1000 pb se gsete un singur segment genic Ck.

Genele pentru catena H a imunoglobulinelor au o organizare asemntoare celei a genelor catenei L. Segmentele genice codificatoare ale catenei H sunt mai numeroase i au o organizare mai complex, deoarece conin n plus secvene codificatoare D (diversity), intercalate ntre secvenele VH i JH. Cele circa 12 secvene genice D codific fiecare 5-15 aminoacizi i amplific diversitatea biochimic a anticorpilor. Ele confer cea mai mare variaie biochimic a catenei H.

Secvenele genice VH par a fi n numr de cteva sute. Fiecare segment VH este asociat cu segmentul LH, codificator al secvenei leader. La oarece sunt 200-300 de segmente genice VH, 10-20 segmente D, 4 gene JH i 10 gene CH, iar la om sunt circa 100 segmente genice VH(din care circa jumtate sunt funcionale), circa 30 de gene D i 9 gene J, din care 6 sunt funcionale. Genele VH sunt diseminate n 4 aglomerri.

Genele CH, codificatoare ale regiunii constante ale claselor i subclaselor de catene H, se gsesc n ordinea: , , 3, 1, , (nefuncional), 1, 2, 4, , 4

Fiecare segment genic CH conine mai muli exoni. Fiecare exon codific un domeniu structural al moleculei de imunoglobulin.

Asamblarea genei active pentru catena L. Pentru a rezulta o gen funcional Lk, unul din cele circa 250 segmente genice Vk se unete cu unul din cele 4 segmente genice funcionale Jk, printr-un proces de recombinare probabilistic. Impreun cu gena Ck, se formeaz ansamblul VJC, codificator al catenei Lk, transcris ulterior n ARN premesager. Prin procesul de clivare i ndire, intronii sunt eliminai i rezult ARNm pentru catena Lk. Se sintetizeaz lanul polipeptidic, iar secvena leader este clivat n cursul transferului prin membrana reticulului endoplasmic. Rearanjarea funcional a genei pentru catena L, stopeaz rearanjarea genelor ce codific acelai izotip (fenomenul excluderii alelice). Fig. 30. Recombinarea genelor umane codificatoare ale catenei Lk a imunoglobulinelor. Gena funcional n limfocitul B matur, rezult prin recombinarea uneia din numeroasele gene V, cu una din cele 4 gene J funcionale i gena Ck. Recombinarea poate avea loc ntre oricare din gene lilustreaz aranjarea genic ntre V2 J4 Ck.

Asamblarea genei active pentru catena H este similar asamblrii genei active pentru catena L, dar mai complex, deoarece implic recombinarea a trei regiuni genice distincte ale domeniului variabil: VH, D i JH. Iniial s-ar realiza legarea segmentelor genice D i JH, urmat de transpoziia uneia din genele VH n vecintatea complexului D-JH, pe unul din cromosomii celulei pre-B. Rearanjrile sunt posibile datorit secvenelor de recunoatere ale genelor V, D, J.

De cele mai multe ori, rearanjrile genice au loc intracromosomal i foarte rar intercromosomal. Dac rearanjarea este nefuncional, are loc rearanjarea genelor n cellalt cromosom pereche. In general, rearanjarea are loc la situsul k, iar dac rearanjarea n cei doi cromosomi este neproductiv, este iniiat rearanjarea la situsul .

La complexul VH-D-JH este translocat una din genele CH, care codific clasa i subclasa catenei H. Fig. 31. Modelul organizrii genei umane codificatoare a catenei H. Genele regiunii VH sunt multiple (50-300), fiecare cu secvena leader. Reunirea segmentului genic D cu gena JH precede legarea genei V de perechea DJH. Intronul genei leader (L) este ndeprtat prin clivarea i reunirea exonilor ARN. Reunirea alternativ poate genera imunoglobulina de membran (m) sau secretat (s). Cifrele indic numrul aproximativ de gene de segmente genice. Eu = regiune activatoare; Su = regiunea de comutare (switch) (dup Potter, 1998).

Imensa diversitate a specificitii de legare a anticorpilor este generat prin cteva mecanisme:

1) Diversitatea combinaiilor posibile prin asamblarea ntmpltoare a segmentelor genice. De exemplu, cele circa 250 segmente genice Vk i cele 4 segmente funcionale Jk produc circa 1000 (250 x 4) combinaii Vk-Jk. Pentru gena H exist posibilitatea unui numr superior de combinaii VH D JH: circa 250 segmente VH, 12 segmente D i 4 segmente JH (250 x 12 x 4 = 12000).

2) Flexibilitatea joncional a segmentelor genice. n momentul asamblrii complexelor VH D JH sau VL JL se produc deleii, adiii, substituii de baze, care modific circa 3 aminoacizi la fiecare jonciune. Numrul variantelor biochimice ale moleculelor de imunoglobulin crete de 3 ori pentru lanul L (1000 x 3) i de 9 ori pentru catena H (12 000 x 9 = 100000).

Adiiile i deleiile care nsoesc legarea segmentelor genice VL-JL trebuie s se fac astfel nct s se pstreze unicul cadru de citire al tripletelor pentru fiecare segment genic V i J. Dac legarea segmentelor genice introduce sau pierde 1 sau 2 nucleotide (sau alt numr nedivizibil cu 3), secvena n aval nu va fi citit. Aceasta este o rearanjare genic neproductiv.

Segmentele genice D pot fi citite n toate cele 3 cadre de citire, n diferite recombinri V-D-J, ceea ce contribuie semnificativ la diversitatea anticorpilor.

3) Diversitatea combinatorial prin mperecherea ntmpltoare a catenelor H i L. Dac oricare lan L poate fi mperecheat cu oricare lan H, vor rezulta peste 108 variante de imunoglobuline (100000 H x 3000 L).

4) Adiii de nucleotide n regiunea N. Cea mai variabil regiune a moleculei de anticorp este cea de a III-a secven determinant de complementaritate a catenei H (aminoacizii 86-91), locul de unire a segmentelor genice VH-D i D-JH. Aici se gsesc scurte secvene de aminoacizi, foarte variabile, denumite regiuni N. Ele sunt codificate de secvene de nucleotide adugate de enzima terminal-deoxinucleotidil-transferaz (TdT), activ n celulele limfoide imature, capabil s adauge nucleotide la captul 3 al catenei de ADN n curs de sintez, fr s necesite matri. Activitatea TdT este minim la ft i la noul-nscut, dar este stimulat postnatal. Enzima acioneaz preponderent pe genele catenei H, dar regiunile N s-au identificat i la jonciunile V-J ale catenei L.

5) Mutaiile somatice. Un numr de ordinul milioanelor de variante ale regiunii V pot s apar prin substituii unice de nucleotide n segmentul genic V. Acesta este fenomenul hipermutaiei somatice a domeniilor variabile, care este activat mai ales n condiiile imunizrii intense, ceea ce explic creterea afinitii anticorpilor pentru epitopul stimulator.

Hipermutaia somatic este mecanismul esenial pentru generarea diversitii anticorpilor. La om, hipermutaia somatic se produce n prezena antigenului i are loc n centrii germinativi din esutul limfoid periferic.

Rearanjrile genice se produc, iniial, la nivelul genei pentru sinteza catenei H. Catena H apare prima n citoplasma limfocitelor. Ulterior are loc rearanjarea genelor ce codific sinteza catenei L.

Rearanjarea genelor se desfoar continuu n limfocitele B din mduva osoas hematogen. Limfocitele care nu genereaz o rearanjare genic productiv sunt eliminate, nefiind utile sistemului imunitar. Probabil c pentru o rearanjare productiv sunt necesare, statistic, multe altele neproductive, ceea ce presupune c pentru fiecare limfocit funcional se pierde un numr mare de celule. Teleonomic ns, risipa este justificat de importana esenial a funciei imunitare pentru organism.

Mecanismele de recombinare genic permit ca n contextul existenei a mai puin de 1000 de gene n linia germinal, organismul s produc o mare diversitate de anticorpi (cteva miliarde), ceea ce constituie repertoriul imunoglobulinelor.

Descoperirea mecanismelor genetice de transpoziie, generatoare a uriaei diversiti a specificitii de combinare a anticorpilor, a deschis o nou cale a nelegerii asupra modului n care informaia genetic poate s fie diversificat.

Mecanismele de transpoziie sunt active n limfocitele B, dar i n celulele liniei T, n care codific o diversitate asemntoare a receptorului de antigen al acestor celule, dar nu au fost identificate pentru alte gene.

Mecanismele genetice ale generrii diversitii RCTi

Mecanismele genetice generatoare ale diversitii specificitii de legare a RCTi sunt asemntoare cu cele care genereaz diversitatea imunoglobulinelor. Calculele teoretice sugereaz c exist posibilitatea a cel puin 1014 combinaii TCR 2.

Genele codificatoare pentru Ti s-au studiat dup clonarea ADNc, obinut prin metoda hibridrii substractive*** . S-a studiat distribuia genelor att n celulele T embrionare, ct i n limfocitele T mature. Se cunosc mai bine genele care codific lanul . Ele sunt plasate n 4 regiuni distincte, care corespund segmentelor V, D, J, C. Nu se cunoate numrul genelor n fiecare regiune.

Prima treapt este sinteza ADNc din ARNm al limfocitelor T. ADNc este hibridat cu ARNm n mare exces, din limfocitele B. Secvenele de ADNc care nu hibrideaz cu ARNm, probabil vor reprezenta secvenele de ARNm specifice numai limfocitelor T.

Regiunea C are dou segmente genice distincte: C 1 i C 2. Regiunea J are dou grupuri de minigene: J 1 i J 2, fiecare cu cte 7 segmente genice (unul este nefuncional). Regiunea D are un numr nedefinit de gene (D1 - Dy), iar regiunea V are circa 30 de gene.

Formarea unei gene funcionale implic rearanjarea celor 4 segmente genice, dar rearanjrile sunt mai versatile dect ale genelor codificare pentru moleculele de imunoglobuline i rezult mai multe variante: Vb - Jb ; Db Db; Db Jb; Vb Db Jb. Tipul dominant de recombinare pare a fi V - D - J - C.

Diversitatea RCT se realizeaz prin mai multe mecanisme:

- numrul mare de gene V, D, J;

- asocierile combinatoriale diverse ale segmentelor V D- J. Ele sunt mai diversificate dect ale genelor pentru imunoglobuline, fiind posibile rearanjri D D i V J;

- diversitatea joncional prin deleie sau adiie de baze, la legarea segmentelor V, D, J.

Rearanjrile genice pentru RCTi se produc n timocitele imature, n zona cortical a timusului, nainte de a ajunge n zona medular. Fig. 32. Genele codificatoare ale receptorului limfocitar de

antigen. Catenele , i , sunt codificate de gene V (ale regiunii variabile), gene D, J i o regiune genic constant (C).

Rearanjarea genelor V pe unul din cromosomi, supreseaz rearanjarea genelor pe cromosomul pereche (excludere alelic), astfel c fiecare celul exprim un singur tip de caten RCT . Rearanjarea genelor alele nu este supus fenomenului excluderii alelice i de aceea fiecare celul are dou tipuri de receptori de antigen (RCT), fiecare avnd propriul su lan , dar lanul este comun. Surprinztor, celulele CD8 din epiteliul intestinal, care sunt generate extratimic, au RCT format din homodimeri -.

***Metoda hibridrii substractive (prin scdere) este o cale de a mbogi o anumit secven de nucleotide nainte de clonarea ADNc. Metoda se folosete n cazurile n care sunt disponibile dou tipuri celulare foarte asemntoare ale unui organism, dar proteina de interes este sintetizat de un singur tip. Aceast metod a fost folosit pentru a identifica proteina receptor de antigen a limfocitelor T, absent pe suprafaa limfocitelor B.

DEZVOLTAREA ONTOGENIC A SISTEMULUI IMUNOCITAR

Limfocitele T i B se difereniaz dintr-o celul stem (celul mam, tulpin, de origine), care nu a fost identificat, fiind doar ipotetic, deoarece nu are caractere structurale distinctive.

Celula stem este de origine mezenhimal. La psri i mamifere, celula stem apare n mezenhimul paraaortic al embrionului, avnd un potenial foarte nalt de multiplicare i difereniere.

Celula stem este pluripotent, chiar totipotent, deoarece prin multiplicare i difereniere, genereaz toate categoriile de celule sanguine: granulocite, monocite, limfocite, mastocite, megacariocite, eritrocite. Diferenierea iniial a celulei stem este pe linie eritrocitar i mieloid, iar diferenierea pe linie limfoid este ulterioar i simultan cu procesul de maturare.

Maturarea limfocitelor semnific dobndirea imunocompetenei, adic a capacitii de a recunoate specific antigenul i de a se activa.

Din mezenhimul paraaortic, celula stem migreaz n sacul vitelin, unde, pentru un interval de timp se desfoar hematopoeza.

Sacul vitelin este sediul esenial al diferenierii celulelor stem pe cale limfoid, la psri i mamifere, nainte de migrarea lor n ficat i splin. Dup cultivarea embrionului total de oarece, fr sacul vitelin, nainte de migrarea i colonizarea sa cu celule stem limfoide, nu s-a evideniat difereniere celular pe cale limfoid. Ulterior n viaa embrionar, funcia hematopoetic este preluat de ficat i splin. In aceste organe, celulele stem se divid cu o rat nalt i se difereniaz pe linie eritrocitar, mieloid (granulocitar), monocitar, limfoid.

n ultima parte a vieii embrionare, funcia hematopoetic este preluat de mduva osoas, chiar dac ficatul i splina pstreaz o activitate hematopoetic foarte limitat i un scurt interval dup natere.

Celulele limfoide difereniate n mduva osoas, la psri, migreaz iniial n splin i ficat, iar de aici migreaz n organele limfoide centrale (timus i bursa lui Fabricius).

La mamifere, din mduva osoas, limfocitele migreaz n ficat i splin. Unele i dobndesc competena imunitar chiar n mduva osoas, n ficat sau n splin, organe care ndeplinesc funciile bursei la psri, iar altele migreaz n timus. Acesta este circuitul primar al limfocitelor, n care se produce diferenierea independent de antigen, n cursul creia limfocitele devin imunocompetente. Aceast etap se desfoar n organele limfoide primare (timus, bursa lui Fabricius i echivalenii bursali ai mamiferelor). In cursul ei, limfocitele dobndesc receptori specifici de antigen. Fig. 33. Diferenierea celulelor stem n limfocite T i B are loc n timus i respectiv, n mduva osoas. Limfocitele mature migreaz n esuturile limfoide (dup Black, 1996).

Fig. 34. Un model al cilor de difereniere a celulelor sanguine din celulele stem hematopoetice, n raport cu condiiile de mediu. Celulele stem i cele imature sunt delimitate de linii ntrerupte (dup Ikuta, 1992).

A II-a faz a diferenierii limfocitelor este dependent de antigen i se produce n circuitul secundar. Limfocitele imunocompetente trec n circuitul sanguin i de aici migreaz n esuturile limfoide secundare, de unde, pe cale limfatic se rentorc n snge. In circuitul secundar, limfocitele au ansa ntlnirii cu antigenul specific receptorului lor, se activeaz, prolifereaz i se difereniaz spre stadiile de celule efectoare i celule cu memorie. Fig. 35. Diferenierea limfocitelor are loc n dou etape: 1) diferenierea independent de antigen n mduva osoas i n organele limfoide primare; 2) diferenierea dependent de antigen n organele limfoide secundare.

Mecanismele moleculare care condiioneaz migrarea limfocitelor din splin i ficat, n organele limfoide primare, nu se cunosc. Este un proces aleatoriu sau este programat de receptori celulari, eventual dobndii n aceste organe. Dac este un proces condiionat, nseamn c n ficat, celulele limfoide sunt deja pre-B (prebursocite) i vor migra n bursa lui Fabricius i respectiv pre-T (pretimocite), care vor migra n timus.

Rolul bursei lui Fabricius n diferenierea limfocitelor B

Bursa lui Fabricius este un organ limfoepitelial i se dezvolt ca un diverticul dorsal al intestinului terminal, situat lng cloac. Primordiul bursal se observ la embrionul de 4 zile de incubaie, ca un mugure epitelial n regiunea cloacal. Pe msur ce crete, mugurele se vacuolizeaz i vacuolele prin coalescen, formeaz lumenul bursal. Pe suprafaa intern a cavitii bursale, epiteliul formeaz pliuri longitudinale, prolifereaz i constituie aglomerri celulare (muguri epiteliali) n lamina propria. Formarea mugurilor epiteliali este dependent de interaciunea celulelor epiteliale cu esutul mezenhimal. Celulele stem limfoide din sacul vitelin colonizeaz mugurele epitelial n zilele 8-11 de dezvoltare embrionar. Fiecare mugure epitelial este colonizat de 1-3 celule stem limfoide prebursale. Celulele limfoide prolifereaz intens i formeaz medula foliculilor bursali.

Att celulele epiteliale ale bursei ct i celulele stem ale liniei limfoide prolifereaz intens n cursul vieii embrionare, dar i 2-4 sptmni dup ecloziune. La 4 sptmni dup ecloziune, bursa conine circa 10 000 de foliculi, fiecare avnd circa 105 limfocite.

Celulele stem limfoide prebursale sunt originare n mezenhimul embrionar. nainte de a ajunge n burs, genele pentru sinteza imunoglobulinelor s-au rearanjat, fiind angajate n dezvoltarea pe

linia B. La 12 zile de incubare, n interiorul bursei apar celule care exprim IgM membranar, iar la ecloziune, circa 90% din celulele bursale au IgM pe suprafaa lor i sub 1% exprim IgG sau IgA.

Celulele epiteliale din zona medular formeaz o reea lax, avnd o structur intern de tip secretor. In zona medular, pe lng celulele epiteliale se gsesc limfocite, plasmocite, fagocite. Regiunea medular i cea cortical sunt separate prin membrana bazal. La suprafaa lumenului bursal, celulele epiteliale se difereniaz n epiteliul asociat foliculului, cu funcia de a fagocita i de a transporta materialul antigenic, din lumenul bursal, n regiunea medular. Celulele epiteliale din epiteliul asociat foliculilor i cele din medula bursal sunt diferite n privina capacitii de a fagocita i a activitii enzimatice.

La ecloziune, bursa are 30-40 mg, atinge dezvoltarea maxim (3-4 g) la 2-4 luni i se menine pn la 4-6 luni, cnd ncepe s involueze i se atrofiaz la maturitatea sexual, cnd dispar complet structurile limfoide i epiteliale.

Bursectomia la ecloziune nu mpiedic migrarea limfocitelor B la periferie, pentru c procesul ncepe timpuriu n dezvoltarea embrionar. ndeprtarea chirurgical a primordiului sau ablaia chimic a epiteliului bursal prin tratament cu testosteron, se poate face la 2-5 zile de incubare, nainte ca foliculii bursali s fie populai de celulele stem limfoide. La pasrea adult timectomizat, numrul de limfocite B n organele limfoide periferice nu este influenat. Se gsesc plasmocite i anticorpi, dar cu un repertoriu foarte limitat al specificitii de legare, ceea ce denot o maturare extrabursal foarte limitat a limfocitelor B. Concluzia este c bursa lui Fabricius nu este strict necesar pentru asamblarea genelor codificatoare ale sintezei imunoglobulinelor i nici pentru diferenierea limfocitelor B, dar are un rol esenial pentru diversificarea clonal a limfocitelor B, adic pentru diversificarea repertoriului lor antigenic.

Bursa lui Fabricius este un organ limfoid specializat n care se produce diversificarea somatic extensiv a genelor rearanjate pentru sinteza anticorpilor, ct i expansiunea clonal a limfocitelor.

Spre deosebire de mamifere, la care generarea diversitii celor circa 109 specificiti de legare a anticorpilor se face prin legarea combinatorial a segmentelor genice V-D-J (pentru catena H) i a segmentelor genice V-J (pentru catena L), linia avian de evoluie a vertebratelor a exploatat o alt strategie pentru generarea diversitii specificitii de legare a moleculelor de anticorpi. In timpul dezvoltrii embrionare a puiului de gin, potenialul generrii diversitii genetice prin procese de recombinare genic este limitat, deoarece regiunea variabil a catenei H i a catenei L este codificat de secvene genice funcionale unice V i J. Conversia genic are loc cu o rat mare ntre singura gen funcional V (VH1 sau VL1) i un grup de pseudogene V. De aceea,

rearanjarea genelor n celulele embrionare ale liniei limfoide, nainte de migrarea n burs, va produce o diversitate foarte limitat a specificitii de legare a anticorpilor. Micromediul bursal selecteaz i favorizeaz diferenierea celulelor stem bursale care sufer o conversie genic productiv, iar celelalte (circa 90%), probabil cu conversie neproductiv, mor prin apoptoz n interiorul bursei.

ntre celulele epiteliale ale bursei i celulele liniei limfoide se stabilesc interaciuni foarte strnse, eseniale pentru diversificarea specificitii antigenice a limfocitelor B. Efectul bursei este mediat de factori humorali, ca de exemplu, bursopoetina, un polipeptid mic, capabil s induc diferenierea limfocitelor B in vitro.

Diferenierea limfocitelor B la mamifere

Diferenierea liniei celulare B este ulterioar diferenierii liniilor eritrocitar i mieloid.

La mamifere, primul organ n care are loc diferenierea celulelor B, este ficatul fetal. Iniial, ficatul primete celule precursoare ale liniei limfoide generate n sacul vitelin, dar ulterior el nsui devine sediul funciei hematopoetice. Aceiai funcie de stimulare a diferenierii limfocitelor B ar avea-o splina fetal i chiar sngele circulant, care strbtnd diferite organe dobndete capacitatea de a induce maturarea limfocitelor B.

Studiul diferenierii limfocitelor B n ficatul fetal este ngreunat, deoarece ficatul nu se poate extirpa (aa cum se pot extirpa timusul i bursa lui Fabricius), iar numrul limfocitelor este mic comparativ cu al celulelor liniei eritrocitare.

Celulele precursoare ale liniei B generate n ficatul embrionar i ulterior n mduva osoas, nu exprim markeri imunoglobulinici de suprafa. Ele i dobndesc competena imunitar n mduv, n ficat sau n splin. Maturarea (dobndirea competenei) const n exprimarea receptorului imunoglobulinic membranar. In genomul lor are loc rearanjarea genelor V, D, J ale catenei H. Odat cu rearanjarea genic, limfocitele sufer o tranziie rapid i devin limfoblaste mari, care se divid. Prin diviziune rezult celule pre-B mici, care exprim catena n citoplasm, dar nu exprim Ig de membran ( cit+, L-, Igm-). Ulterior se rearanjeaz genele k ale catenei L i numai dac genele k nu se rearanjeaz cu succes, se recombin genele . Dup sinteza catenei L, moleculele de imunoglobulin se exprim pe suprafaa limfocitului.

Rearanjarea ntr-o combinaie funcional a genelor unuia din cei doi cromosomi, mpiedic recombinarea genelor n cromosomul pereche, sugernd o explicaie pentru fenomenul excluderii alelice.

Prima imunoglobulin de suprafa a limfocitelor B este IgM, ca protein integrat, cu o densitate de peste 200 000 de molecule/celul. Limfocitele B care exprim pe suprafaa lor numai molecule IgM sunt considerate imature. Alturi de IgM pot s coexiste IgA sau IgG. Pe msur ce diferenierea limfocitelor B progreseaz, alturi de IgM apare IgD, care treptat devine dominant cantitativ. Limfocitele B mature, n repaus (neangajate) au pe suprafaa lor, nivele mai nalte de IgD dect IgM. Acestea sunt celule imunocompetente.

Limfocitele B care nu reuesc s genereze o rearanjare funcional a genelor pentru sinteza catenelor H i L, sunt eliminate ntr-un stadiu timpuriu al diferenierii lor.

Dup stimularea antigenic, limfocitele B mature secret IgM, IgG (una din subclase), IgA sau IgE. Nu se difereniaz o linie celular care s sintetizeze izotipul IgD.

Timusul la mamifere i rolul lui n diferenierea limfocitelor T

Timusul este un organ limfoid voluminos, aezat n partea superioar a mediastinului anterior. Are origine epitelial dubl: deriv din ectodermul perechii a III-a de pungi branhiale i din endodermul celei de III-a pungi faringiene. Primordiile epiteliale fuzioneaz i formeaz primordiul timic epitelial, care pierde legtura cu faringele i lumenul dispare.

Timusul este primul organ limfoid care apare la psri i mamifere. Primordiul timic este strpuns de celulele stem limfoide (la oarece, n ziua a 11-a de dezvoltare embrionar), cu originea n sacul vitelin. Ulterior n cursul dezvoltrii fetale, celulele limfoide vin din ficat, iar dup natere, din mduva osoas. La ftul uman, la 20 de sptmni de sarcin, timusul este dezvoltat complet.

Arhitectura timusului

Timusul este alctuit din doi lobi. Fiecare lob este mprit incomplet, prin septuri conjunctive, n lobuli. Lobulii conin o reea de celule epiteliale, printre care sunt diseminate numeroase celule limfoide (timocite).

Epiteliul timic este difereniat zonal: zona cortical i zona medular. Fig. 36. Componentele stromale ale micromediului timic.

La animalele tinere, zona cortical formeaz 80% din esutul timic. Celulele epiteliale sunt de form stelat, cu numeroase prelungiri fine care se interconecteaz, formnd un citoreticulum. Numrul limfocitelor este mai mare dect al celulelor epiteliale. Limfocitele sunt mici i pe seciunile colorate cu hematoxilin, zona cortical este ntunecat, datorit raportului nucleocitoplasmatic nalt al limfocitelor imature. Majoritatea limfocitelor(80-85%) sunt imature, dublu pozitive (exprim nivele nalte ale moleculelor CD4 i CD8) i au un nivel sczut de molecule RCT. Ele stau n ochiurile unei reele de celule epiteliale i celule dendritice care exprim molecule CMH. Moleculele CMH au rol esenial n selecia pozitiv a limfocitelor, adic maturarea lor n celule T mature. O mic proporie a limfocitelor sunt blaste.

Zona medular este format dintr-o reea dens de celule epiteliale mai mari, de form ovoid, cu prelungiri citoplasmatice scurte, bogate n organite secretoare. n ochiurile reelei se gsete un amestec de limfocite cu un singur marker, CD4+ sau CD8+, dar exprim RCT -, cu o densitate net superioar. Raportul celulelor CD4+/CD8+ este 2/1. Limfocitele sunt situate printre celulele prezentatoare de antigen (celule dendritice, interdigitate i macrofage). Un numr mic (sub 1%) de limfocite timice exprim RCT -, diseminate n cortex i medula.

n zona medular apar dou tipuri de structuri, derivate din celule epiteliale: corpusculii Hassal formai din celule epiteliale dispuse concentric, cu aspect general de degenerescen i cavitile chistice, cptuite de celule epiteliale columnare prevzute cu microvili. Fig. 37. Reprezentare schematic a arhitecturii generale a timusului. Subregiunile timusului sunt prezentate n dreapta figurii, iar constituienii lor celulari, n stnga (dup Hood i colab., 1984).

Timusul este bogat inervat, cu fibre adrenergice i colinergice, iar neurotransmitorii oxitocina, vasopresina i neurofizina sunt sintetizai endogen de celulele perivasculare medulare i de celulele nurse(celule epiteliale mari, asociate cu un numr mare de limfocite), ceea ce sugereaz raporturile strnse ale timusului cu sistemul nervos.

n raport cu distribuia limfocitelor, timusul are 4 regiuni funcionale:

- regiunea subcapsular, bogat n limfocite imature (pre-T), abia intrate n timus;

- cortexul timic, n care limfocitele se divid cu o rat nalt;

- jonciunea cortico-medular, format dintr-un cordon de macrofage santinel, cu rolul unei site celulare;

- regiunea medular, cu relativ puine limfocite, care poart markerii de suprafa proprii limfocitelor mature.

Timusul evolueaz, atingnd adeseori o dezvoltare maxim odat cu maturitatea sexual, dup care ncepe involuia, asociat cu sensibilitatea sa la hormonii steroizi. La oarece, involuia ncepe la 6 sptmni. La om, involuia timic ncepe dup pubertate, esutul reducndu-se cu circa 3% pe an, pn la 35-40 de ani i cu 1% pe an dup aceea. Dimensiunile nu se reduc, deoarece esutul timic este nlocuit de esut gras.

Atrofia glandei timice poate fi accelerat de corticosteroizi. Producerea unor cantiti crescute de corticosteroizi sau terapia cu corticosteroizi accelereaz atrofia timic. Fenomenul se numete involuie de stress, pentru c nivelul de corticosteroizi crete n strile de stress i n cele clinice. Steroizii au aciune citolitic asupra timocitelor corticale. Limfocitele medulare sunt relativ rezistente, datorit enzimei 20 -hidroxil steroid-dehidrogenazei.

Maturarea limfocitelor T n timus

Dezvoltarea repertoriului limfocitelor T, este un proces complex de evenimente de selecie pozitiv i negativ, ce implic interaciunea moleculelor de suprafa i necesit influena micromediului timic. Limfocitele T au raporturi spaiale strnse cu celulele stromale epiteliale. Acestea furnizeaz "semnale educaionale" care orienteaz maturarea limfocitelor n dou direcii:

- dobndirea RCT i a capacitii de a recunoate antigenele exogene;

- dobndirea toleranei fa de self;

- eliminarea celulelor T self-reactive, precum i a celor care nu genereaz combinaia genic a unui receptor funcional.

Celulele pre-T se difereniaz n ficatul fetal i n mduva osoas. Ele conin o enzim specific terminal deoxynucleotidil-transferaza (TdT) - cu localizare nuclear. In cortexul timic, limfocitele pre-T exprim markerii CD2 i CD3 pe membrana citoplasmatic. Pe msur ce maturarea progreseaz, limfocitele fiind nc n cortexul timic, exprim markerii CD4 i CD8. Dup expresia la mic densitate a moleculelor CD4 i CD8, se rearanjeaz genele care codific RCT i celulele devin triplu pozitive(RCT+, CD4+, CD8+). Acestea sufer procesele de selecie, prin care se elimin celulele T autoreactive i se selecteaz celulele care recunosc moleculele CMH I i CMH II. Cnd limfocitul T imatur migreaz n zona medular, se pierde fie markerul CD4, fie CD8. n acest stadiu dispare markerul TdT.

Celulele CD4 + i CD8+ se dezvolt din celule progenitoare dublu pozitive pentru cei doi markeri, iar acestea i au originea n celule dublu negative.

Dobndirea toleranei fa de self. n zona cortical a timusului, limfocitele nva s tolereze selful, fenomen ce const n selecia celulelor care recunosc moleculele CMH exprimate pe suprafaa celulelor epiteliale. Aproximativ 90% dintre celulele pre-T care ajung n zona cortical, nu reuesc s traverseze jonciunea cortico-medular. Ele sunt supuse unui proces de selecie pozitiv ce const n supravieuirea limfocitelor care recunosc moleculele CMH ale celulelor epiteliale. Selecia pozitiv const n supravieuirea limfocitelor care recunosc i interacioneaz cu afinitate medie, cu moleculele CMH. Limfocitele care nu genereaz un receptor care s recunoasc moleculele CMH, ca i cele care leag cu mare afinitate moleculele CMH, potenial inductoare ale conflictelor autoimune (selecie negativ), sunt eliminate prin apoptoz.

n zona medular, selecia limfocitelor continu, prin eliminarea clonelor reactive fa de self. Medula timic are particulariti funcionale proprii, care favorizeaz inducerea toleranei fa de self. In contrast cu cortexul, medula este deschis circulaiei libere a proteinelor de origine sanguin i n structura ei se gsesc CPA (celule prezentatoare de antigen) originare n mduva osoas (macrofage, celule dendritice, i interdigitate). Aceasta semnific faptul c moleculele self din snge ajung n timus i induc tolerana celulelor T imature. Moleculele self care nu intr n snge (de exemplu, moleculele tisulare), nu ajung n timus i nu induc selecia negativ. Fa de aceste molecule este posibil ntreruperea strii de toleran. Fig.38. Diferenierea celulelor T n timus. Celulele autoreactive cu specificitate pentru antigenele self neexprimate n timus, pot s devin tolerante prin contactul extratimic cu antigenele. TCR1 = receptor , ; pre-TCR2 = receptor pre-T , ; TCR2 = receptor matur , ; TdT = terminal deoxinucleotidil transferaza (dup Roitt, 1997, modificat).

Prin selecie negativ, n zona medular, sunt eliminate limfocitele T self-reactive, adic cele cu potenialul de a se activa fa de antigenele self asociate moleculelor CMH. Eliminarea acestor celule este esenial pentru inducerea toleranei fa de self. Sunt de asemenea eliminate celulele T care nu genereaz o combinaie genic pentru codificarea unui receptor funcional de antigen. Se matureaz limfocitele care genereaz receptori specifici fa de epitopii nonself.

Selecia negativ este dependent de cantitatea de antigen ce ajunge n timus. De exemplu, un antigen abundent (albumina) realizeaz o concentraie mare n timus i determin o selecie negativ complet, adic elimin ntregul spectru de limfocite T cu receptori de nalt i joas afinitate. De aceea, tolerana fa de albumin nu va fi niciodat ntrerupt i nu se cunosc maladii autoimune cu reactivitate limfocitar fa de albumin. Alte molecule ptrund n timus, n cantiti mici, pe cale sanguin(de exemplu, insulina) i selecia negativ este incomplet, adic sunt eliminate numai celulele T cu receptor de mare afinitate pentru antigen. In condiii experimentale, prin injectarea antigenului la concentraii mari, tolerana fa de aceste molecule poate fi ntrerupt i se poate stimula reactivitatea autoimun.

Se consider c exprimarea RCT i a moleculei CD4, ce interacioneaz cu moleculele CMH II, inhib exprimarea moleculelor CD8, sau diferenierea celulelor cu un singur marker(CD4 ori CD8) este un proces stochastic.

Rezultatul final al diferenierii limfocitelor T n timus, const n generarea receptorilor celulelor T, cu capacitatea de a tolera selful, asociat cu moleculele CMH, i de a reaciona la moleculele nonself, ceea ce este esenial pentru interaciunile celulare n cursul elaborrii rspunsului imun.

Numrul celulelor T mature n organele limfoide secundare rmne constant, la o valoare ridicat, n condiiile n care timusul involueaz treptat. Constana numeric a celulelor T este atribuit duratei lungi de via a acestor limfocite, dar nu este exclus producerea de novo n alte esuturi (intestin, ficat, mduv osoas).

Factorii celulari i humorali ai diferenierii limfocitelor

Pe baza datelor experimentale acumulate se poate deduce existena a cel puin dou mecanisme active asupra diferenierii limfocitelor n organele limfoide centrale. Mecanismele propuse nu se exclud. Coexistena i sinergismul lor demonstreaz importana organelor limfoide centrale n controlul procesului de difereniere i complexitatea acestuia. Majoritatea cercetrilor au vizat

factorii de difereniere ai timusului, dar rezultatele pot fi extrapolate asupra factorilor bursali ai diferenierii limfocitelor B la psri.

S-au conturat dou ipoteze referitoare la factorii de difereniere ai limfocitelor: ipoteza celular i ipoteza hormonal (humoral).

n acord cu ipoteza celular a micromediului epitelial al timusului, diferenierea limfocitelor T sar realiza prin contactul direct al pretimocitelor cu epiteliul timic. Experienele de extirpare a timusului la animalele nou nscute, cu sistem imunitar imatur au evideniat c prezena timusului funcional este o condiie esenial pentru funcia optim a imunitii mediate celular. Extirparea timusului la animalele nou-nscute este urmat de instalarea sindromului de epuizare(Miller, 1961), ale crui simptome se manifest progresiv mai intens i n esen reflect incapacitatea organismului de a se apra fa de infeciile virale i fungice (disfuncia imunitii mediate celular). Grefa timusului (de la organisme singenice) le restabilete treptat starea normal.

Extirparea timusului la organisme mature a evideniat c absena timusului este compatibil cu viaa, fr manifestarea unor deficiene notabile. S-a dedus astfel, c mecanismele celulare de contact al limfocitelor cu celulele epiteliului timic ar fi active numai n primele faze ale maturrii limfocitelor T, dar absolut necesare pentru diferenierea lor.

Dup datele actuale, mecanismul celular al influenei timice nu este suficient pentru diferenierea celulelor T. S-a emis ipoteza hormonal, care consider c procesul de difereniere i maturare imunitar ar continua dup ce timocitele prsesc timusul. Hormonul secretat de celulele epiteliului timic ar exercita o aciune stimulatoare asupra diferenierii limfocitelor, att intratimic ct i la distan, dup trecerea sa n circulaie, asupra celulelor limfoide circulante sau localizate n organele limfoide secundare, continund astfel influena direct a epiteliului timic.

n favoarea existenei unui factor hormonal timic s-au adus argumente experimentale, care pot fi grupate n dou categorii:

a) Experiene de restabilire a funciei imunitare sub aciunea factorilor timici: de exemplu, ndeprtarea timusului la oarecele nou-nscut este urmat de pierderea imunitii mediate celular. Implantarea subtegumentar a unei grefe de timus, plasat ntr-o camer special cu perei poroi, permeabil pentru molecule, dar impermeabil pentru celule, restabilete imunocompetena, ceea ce demonstreaz c nu este strict necesar contactul limfocitelor cu celulele epiteliului timic. Este suficient ca mediatorul (mediatorii) chimic secretat de timus s fie prezent n organism pentru a se produce maturarea limfocitelor T. Pe de alt parte, oarecii-

femele timectomizate la natere, i recapt competena imunitar n timpul sarcinii, sub influena hormonilor timici fetali, care trec n circulaia matern.

b) Evidenierea factorilor timici prin metode biochimice: unii hormoni au fost izolai din timus, iar alii din snge. Nu sunt ntru-totul asemntori hormonilor convenionali, pentru c nu se pot substitui complet esutului timic i pentru faptul c unele molecule din categoria hormonilor timici pot fi generate i n alte esuturi. Factorii serici de origine timic dispar dup timectomie i reapar dup grefa de timus. Existena factorilor serici de origine timic argumenteaz n favoarea ipotezei c imunocompetena se dobndete att n faza timic a limfocitelor, ct i la distan, dup ce limfocitele au prsit timusul.

Denumirea factorilor de imunocompeten variaz mult, n funcie de origine, proprieti biochimice, efecte biologice.

Din timusul de viel s-au extras cteva polipeptide, iar unele s-au preparat pe cale sintetic. O serie de componente manifest activitate imunobiologic: timulina, timopoetina, timozinele.

Timozinele (evideniate de Goldstein) din cea de 5-a fracie proteic de extract timic de viel, reprezint un grup de polipeptide cu greutatea molecular cuprins ntre 1000 i 15 000 D, stabile la 80o. Prin combinarea metodelor analitice de cromatografie analitic i gel-filtrare, din aceast fracie s-au izolat 16 polipeptide. Ele induc, in vitro, sinteza MIF de ctre limfocite, precum i diferenierea celulelor formatoare de anticorpi. De asemenea, timozinele restabilesc funciile imunitare la animalele timectomizate neonatal i la persoanele vrstnice, la care competena imunitar diminu datorit involuiei timusului. Din acest amestec de polipeptide, cel mai activ este un polipeptid de 108 aminoacizi (12 kD), a crui secven a fost determinat.

Timopoetina este un hormon polipeptidic al timusului de viel, izolat de Goldstein, format din 49 de aminoacizi, evideniat n primul rnd datorit efectelor sale asupra transmiterii neuromusculare i mai puin prin efectele sale asupra sistemului imunitar. Bolnavii atini de myasthenia gravis prezint, de regul, o hiperplazie timic (timom). S-a creat sistemul experimental al acestei maladii, ceea ce a permis izolarea unui polipeptid care modific transmiterea neuromuscular, iar la indivizii bolnavi provoac oboseala muscular. S-au identificat dou variante de timopoetin, care difer prin doi aminoacizi i stimuleaz activitatea limfocitelor T.

Timulina (Factorul timic seric, FTS) s-a izolat din serul uman, din serul de porc i din timusul de viel. In acord cu criteriile clasice ale endocrinologiei i fiziologiei, timulina este singurul polipeptid de origine timic recunoscut ca hormon, adic este secretat i reglat de timus.

Timulina lipsete n serul oarecelui nud, iar la animalele convenionale, dispare dup timectomie, dar reapare dup grefa timic. Este un peptid cu greutatea molecular de 900 D, cu urmtoarea secven a celor 9 aminoacizi: Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn. Concentraia FTS depinde de vrst i scade odat cu scderea greutii timusului. Timulina are activitate biologic numai cnd este cuplat equimolar cu Zn. Echilibrul Zn este alterat la vrstnici.

Se pare c hormonii timici acioneaz asupra limfocitelor T, dup ce acestea au prsit timusul. Efectul lor stimulator se exercit asupra tuturor categoriilor funcionale de limfocite T: helper, citotoxice, supresoare.

Ubiquitina este un polipeptid ce conine 74 de aminoacizi (8,4 kD) care se gsete n timus i n majoritatea esuturilor la animale i chiar la plante. In vitro, stimuleaz diferenierea limfocitelor precursoare ale liniei T i B, ceea ce explic pstrarea funciei imunitare dup timectomizarea animalelor mature.

ORGANELE LIMFOIDE SECUNDARE (PERIFERICE)

Sistemul limfatic, alctuit din vasele limfatice, limf i organele limfoide secundare, este parte integrant a sistemului vascular sanguin al veretebratelor, dar la mamifere are rol esenial n transportul i distribuia antigenelor, anticorpilor i a celulelor imunocompetente. Celulele tumorale se disemineaz (metastazeaz) frecvent pe cale limfatic.

Funcia primar a sistemului limfatic este de a colecta lichidul proteic interstiial, care rezult prin extravazarea continu la nivelul capilarelor sanguine i de a-l readuce n sistemul vascular sanguin, meninnd astfel constana volumului plasmei sanguine circulante.

La originea sistemului limfatic se gsesc capilarele limfatice, delimitate de o membran bazal subire, de care sunt ataate lax celulele endoteliale. Prin aezarea lor, aceste celule au rolul unor valve, care favorizeaz intrarea limfei n capilar i limiteaz ieirea. Membrana bazal este continu i este nconjurat de fibre musculare netede. Inveliul muscular al vaselor limfatice manifest contracii ritmice intrinsece, care genereaz o presiune de civa mm Hg, favoriznd

circulaia limfei. Fig.39. Principiul formrii limfei. Presiunea hidrostatic la captul arterial al capilarului determin ieirea fluidului proteic prin peretele capilar. La captul venos, presiunea hidrostatic este mic i presiunea coloid-osmotic a proteinelor plasmatice determin reintrarea apei, electroliilor i cristaloizilor n circulaie. Proteinele nu pot fi reabsorbite i mpreun cu o parte a apei i srurilor, sunt drenate prin limf. Diametrul capilarului permite trecerea hematiilor, iar leucocitele, fiind mai mari, trebuie s se deformeze. Aceasta creeaz o rezisten la curgere, ceea ce determin o cdere a presiunii ntre captul arterial i cel venos al capilarului (dup Hall,1998).

Confluena capilarelor limfatice formeaz vase mai mari, prevzute cu numeroase valve bicuspide ce mpiedic curgerea gravitaional a limfei.

Limfa mamiferelor poate fi compartimentat n limf periferic, intermediar i central.

Limfa periferic (cea care nu a trecut printr-un ganglion limfatic) are un coninut sczut de celule albe (sub 1000/mm3), de dimensiuni mici, din care circa 85% sunt celule T i circa 10% sunt celule cu voal.

Limfa intermediar (din segmentul vascular n care se gsesc ganglionii limfatici) conine un numr mare de limfocite mici (20 000/mm3), dintre care 75% sunt limfocite T care au extravazat la nivelul venulelor postcapilare din ganglioni.

Limfa central se gsete n vasele limfatice n aval de ganglioni, ce se unesc pentru a forma trunchiurile limfatice mari (intestinal, toracic, ductul limfatic drept, ductul cervical).

La mamifere, pe traseul vaselor limfatice care transport limfa de la periferie spre marile vene de la baza gtului, se gsesc ganglionii limfatici.

Sistemul limfoid este alctuit din limfocite, ca element celular esenial i din organele limfoide primare i secundare.

Organele limfoide secundare reprezint suportul anatomic al rspunsului imun i sunt reprezentate de urmtoarele tipuri de structuri:

- ganglionii limfatici, splin, esuturi limfoide organizate asociate cu suprafeele mucoase (tonsile, plci Peyer, esutul limfoid asociat mucoasei gastrointestinale(GALT), respiratorii (BALT);

- altele sunt formaiuni limfoide difuze, reprezentate de aglomerri de diferite categorii de celule n care predomin limfocitele, asociate cu tractul gastrointestinal, respirator i urogenital.

esuturile limfoide au localizri strategice, la porile de intrare a antigenelor n organism: tegumentul sau mucoasele. Aici se gsesc aglomerri de limfocite i celule care transport i prezint antigenele. Ele interacioneaz funcional, pentru a capta i neutraliza materialele nonself.

Organele limfoide secundare au urmtoarele particulariti funcionale:

- sunt populate tardiv cu limfocite care i-au dobndit competena funcional n organele limfoide primare;

- la nivelul lor, limfopoeza este diminuat sau inexistent;

- la nivelul capilarelor care le irig, limfocitele prsesc fluxul sanguin;

- extirparea lor total este imposibil, datorit caracterului difuz;

- conin proporia covritoare a limfocitelor, segregate n arii distincte: aria celulelor T conine un numr mic de limfocite B, dar are un numr mare de celule dendritice, cu rolul de a prezenta antigenele pentru activarea limfocitelor T i B; aria celulelor B conine n principal foliculi primari, ce reprezint situsurile n care limfocitele B activate, prolifereaz i formeaz centrii germinali, nainte de a se diferenia n celule productoare de anticorpi i celule de memorie; Fig. 40. Reeaua ganglionilor limfatici.

Aglomerarea celulelor cu funcie imun n esuturi limfoide secundare mrete eficiena reactivitii imunitare prin distribuia limfocitelor T i B n arii ce favorizeaz interaciunea lor cu celulele care prezint anti-genul i prin caracterul de reea, care permite circulaia limfocitelor n ariile n care antigenele sunt concentrate.

Ganglionii limfatici

Ganglionii lim-fatici sunt organe lim-foide secundare, situate n grupuri pe traseul vaselor limfatice care dreneaz ariile super-ficiale ale pielii sau viscerele, cu dimensiuni de la civa mm pn la 1cm. Suprafaa lor este acoperit cu o capsul conjunctiv din care pornesc numeroase trabecule ce strbat parenchimul ganglionar. Capsula este format din esut colagenic dens. In structura ganglionului limfatic se distinge stroma, format din fibre i celule reticulare. Celulele reticulare sunt fibroblaste mari, ramificate, care produc fibre reticulare. In ochiurile reelei se gsesc celule limfoide, macrofage, vase limfatice i sanguine, care formeaz parenchimul ganglionar.

Ganglionii limfatici au o vascularizaie dubl: limfatic i sanguin. Limfa este adus n ganglion prin cele 5-8 vase limfatice aferente, care se vars n sinusul subcapsular. De aici, printre trabeculele conjunctive, pornesc radiar sinusurile corticale, care ulterior devin sinusuri medulare. Acestea se continu cu vasele limfatice eferente.

Parenchimul ganglionar are o structur difereniat zonal. Se disting zona cortical i cea medular.

Zona cortical este divizat n dou subzone:

- corticala extern foarte bogat n limfocite B;

- corticala profund (paracortical), populat de limfocite T (la oarecele nud atimic- corticala profund este atrofiat).

n subzona cortical extern se gsesc numeroase aglomerri de limfocite, denumite foliculi limfoizi primari, formai n special din limfocite mici. Au diametrul de circa 1 mm i sunt distribuii printre limfocitele dispersate uniform. Foliculii primari sunt formai din limfocite B mici, mature, neangajate, mpachetate strns. O component nelimfoid important a foliculilor

primari o constituie aglomerrile de celule foliculare dendritice(CFD). Prin receptorii lor pentru complement i pentru Fc, CFD concentreaz complexele imune n aria limfocitelor B.

Dup stimularea antigenic, n timpul elaborrii rspunsului imun, foliculii primari devin foliculi limfoizi secundari, datorit proliferrii celulare intense, cu o zon central format din celule limfoide mai mari (celule B de memorie), macrofage i celule foliculare dendritice, denumit centru germinativ. Centrul germinativ este sediul proliferrii celulare intense dup stimularea antigenic.

Subzona cortical profund (paracortex) este o arie limfoid situat sub cortex, ntre foliculi i zona medular. Limfocitele i limfoblastele sunt dense, iar celulele prezentatoare de antigen (n special celule interdigitate, celule cu voal) sunt diseminate printre limfocite. Paracortexul este o arie T-dependent, limfociteleT n repaus i activate fiind majoritare. Intern fa de paracortex sunt cordoanele medulare, populate cu macrofage i plasmocite, care duc spre sinsul medular. Unitatea funcional a paracortexului este cordonul paracortical, care se ntinde de la baza foliculului, pn la cordonul medular subiacent. Cordonul paracortical are un diametru de 1001000 m i este spaiul n care celulele dendritice prezint antigenul, rarelor clone de limfocite T specifice i favorizeaz activarea lor.

Zona medular conine esut limfoid dens, sub forma unor cordoane aezate printre sinusurile medulare. In cordoane predomin limfocitele B productoare de anticorpi (plasmablaste i plasmocite mature), asociate cu macrofage, celule T. Sinusurile limfatice sunt cptuite cu celule, a cror suprafa apical prezint denivelri care ncetinesc percolarea limfei prin ganglion.

Antigenele care au penetrat barierele protectoare de suprafa ajung n ganglionii limfatici prin vasele limfatice aferente. Macrofagele care cptuesc sinusurile limfatice, preiau antigenele i le transfer zonelor T-dependent i T-independent, unde sunt recunoscute de limfocitele care au receptori specifici. Stimularea limfocitelor din foliculii primari, de ctre antigenele Tindependente, induce dezvoltarea foliculilor secundari, cu formarea centrilor germinali n care se gsesc i sunt reinute limfocitele B de memorie. Celulele B activate de antigen, migreaz n cordoanele medulare i se difereniaz n plasmocite productoare de anticorpi. Anticorpii prsesc ganglionul limfatic prin vasul limfatic eferent. Fig. 41. Structura unui ganglion limfatic. Sub capsula conjunctiv se gsete sinusul subcapsular, tapetat cu celule fagocitare. Limfocitele i antigenele ptrund n ganglion prin vasele limfatice aferente. Cortexul conine aglomerri de limfocite B (foliculi limfoizi). Majoritatea foliculilor posed un focar de celule proliferante, denumit centru germinativ. Zona paracortical conine, n esen, limfocite T, majoritatea fiind n contact cu celule interdigitate, prezentatoare de antigen. Fiecare ganglion are o vascularizaie arterial i venoas proprie. Limfocitele circulante intr n ganglion la nivelul endoteliului specializat al venulelor post-capilare ale zonei paracorticale. Medula conine limfocite T i B i majoritatea plasmocitelor organizate n cordoane. Limfocitele prsesc ganglionul numai prin vasul limfatic eferent.

Antigenele T-dependente ajung n ganglioni odat cu limfa aferent, fiind transportate de celulele cu voal n zona paracortical. Activarea i proliferarea celulelor T produc creterea n volum a ariei T-dependente.

Sngele circul n direcie opus limfei. Artera aferent ptrunde n ganglion la nivelul hilului i se continu cu arteriolele, care formeaz un bogat plex capilar. La nivelul cortexului profund, din plexul capilar se formeaz venulele postcapilare cu endoteliu nalt. La acest nivel, limfocitele prsesc circulaia sanguin prin celulele endoteliale i se distribuie n zonele caracteristice: limfocitele B n cortexul extern, iar limfocitele T n cortexul profund (paracortex). Dup ce strbat lent teritoriile ganglionare specifice, limfocitele trec n zona medular. Aici se colecteaz sinusurile limfatice medulare, care dreneaz limfa spre vasele limfatice eferente. Limfocitele prsesc ganglionul prin vasele limfatice eferente.

Circulaia lent a sngelui n vasele din ganglionul limfatic, permite unui numr mare de limfocite s treac din snge n limf, unde pot ntlni antigenul corespunztor. Se mrete astfel ansa ca un numr mic de limfocite imunocompetente s ntlneasc antigenul specific i s reacioneze proliferativ.

Organizarea ganglionului limfatic trebuie s favorizeze interaciunile dintre antigene i limfocite. Ganglionii conin numeroase celule capabile s prelucreze i s prezinte antigenele: macrofage, celule dendritice, celule interdigitate i celule cu voal. In ganglioni, populaia celular se renoiete continuu, prin traficul celulelor limfoide i al celulelor accesorii

Funciile ganglionului limfatic sunt urmtoarele:

- filtrarea limfei i epurarea componentelor nonself (celule bacteriene, toxine etc.) de ctre fagocitele ganglionare;

- este suportul material al proliferrii limfocitelor i al sintezei anticorpilor, dup stimularea antigenic. Limfa eferent este filtrat i mbogit n anticorpi i n limfocite. Fig. 42. Structura splinei. Splina este alctuit din pulp roie i pulp alb. Pulpa roie nconjur ariile pulpei albe. Pulpa alb conine foliculi primari i centrii germinativi, ca i n ganglionul limfatic.

Dup stimularea antigenic inductoare a rspunsului imun mediat humoral, n subzona cortical extern (a celulelor B) se produc ample modificri citologice, iar dup administrarea unui antigen timodependent, modificrile citologice apar i n subzona cortical profund (a celulelor T).

Splina

Splina este cel mai mare organ limfoid, cu rol important n funcia imunitar. Splina este acoperit de o capsul conjunctiv, cu puine fibre musculare i incapabil de contracii ample, de la care pornete o reea de trabecule conjunctive, ce mpart esutul splenic n com-partimente comunicante. n fiecare compartiment se gsesc pulpa alb i pulpa roie, sprijinit pe esutul conjunctiv reticular .

n trabeculele conjunctive se gsesc arterele trabeculare (ramificaii ale arterei splenice). Cnd ating diametrul de circa 200 m, arterele prsesc trabeculele conjunctive i ptrund n parenchimul splenic. Ele dau ramificaii laterale (arteriole), fiecare arteriol fiind acoperit de un manon dens de esut limfoid. In jurul arteriolei se gsesc limfocite, distribuite ntr-o strom conjunctiv, ce formeaz teci limfoide periarteriolare (PALS = periarteriolar lymphoid sheats) sau manoane coaxiale de limfocite, n jurul arteriolelor. Arteriola are o poziie central n manonul limfoid. Fig. 43. Structura pulpei albe a splinei. Pulpa alb este mprit ntr-o zon central bogat n celule T teaca limfoid periarteriolar (PALS) nconjurat de foliculi primari care conin celule B. In fiecare folicul primar se gsete o aglomerare de celule foliculare dendritice (FDC). Pulpa alb este separat de pulpa roie (RP) prin sinusul marginal (MS). Sinusul marginal este inclus ntr-un strat de limfocite ale zonei marginale (MZ). Adiacente sinusului marginal sunt macrofagele metalofile, care se crede c au rol important n reglarea traficului n spaiile pulpei roii i albe. Canalele colapsate (CC) par a fi ariile prin care limfocitele intr i ies din pulpa alb. CA = arteriola central.

Totalitatea tecilor periarteriolare (manoane limfoide coaxiale) formeaz pulpa alb a splinei. Manoanele au o zon intern, bogat n limfocite T i o zon extern bogat n limfocite B, grupate n aglomerri denumite foliculi. Limfocitele pulpei albe se vd pe seciunea esutului ca zone alb-cenuii, nconjurate de pulpa roie. Fig. 44. Topografia regiunilor timo-dependente (TD) i timo-independente (TI) n splin. Teaca limfocitar periarteriolar constituie regiunea TD, n timp ce foliculii limfoizi i esutul limfoid adiacent reprezint zona TI.

Unele arteriole, dup ieirea din manonul limfoid (pulpa alb) dau numeroase ramificaii n perie, denumite arteriole penicilate, care ptrund n pulpa roie.

Pulpa roie nconjur pulpa alb i este format din cordoane de esut splenic (cordoane Bilroth) situate printre sinusurile venoase. Unele capilare arteriale se pot conecta cu sinusurile venoase, dar majoritatea arteriolelor penicilate se deschid n cordoanele Bilroth (circulaie deschis). Sinusurile venoase sunt canale vasculare, delimitate de endoteliu i o membran bazal. Endoteliul este perforat de spaii poligonale mari, aezate ordonat.

Cordoanele Bilroth sunt formate dintr-o reea tridimensional de celule reticulare i fibre reticulare, care formeaz o unitate funcional cu adventicea sinusurilor. In aceast reea se deplaseaz celulele splenice libere cu funcie fagocitar (macrofage). Cordoanele Bilroth comunic cu sistemul venos al splinei.

Splina este un filtru al sngelui, legat pe o derivaie a marii circulaii.

La nivelul cordoanelor Bilroth, circulaia are caracter deschis, deoarece sngele vine n contact direct cu celulele splenice. In ochiurile cordoanelor Bilroth se gsesc sinusurile. Ele sunt capilare cu diametrul neuniform, tapetate cu celule din seria macrofagelor, care au rolul de a fagocita antigenele particulate. In sinusuri se deschide o parte din arteriolele penicilate (circulaie nchis).

Macrofagele din peretele sinusurilor i din cordoanele de esut splenic rein i capteaz hematiile mbtrnite i plachetele. Macrofagele exprim receptori pentru Fc al IgG, astfel c elementele figurate tapetate cu IgG (autoanticorpi) sunt fagocitate. Prin mbtrnire, eritrocitele i pierd acidul sialic de pe suprafa, expunnd manoza i galactoza, care sunt recunoscute de celulele splenice.

Alte arteriole, dup ieirea din manonul limfoid se termin n sinusul zonei marginale, care se deschide ntr-un sinus venos al pulpei roii. Zona marginal const dintr-o reea fin de fibre reticulare, n ochiurile creia se gsesc limfocite B. Sinusul marginal este adiacent foliculilor limfatici i const din spaii vasculare aplatizate, ce se continu cu sinusurile pulpei roii. Peretele su este foarte permeabil i permite trecerea limfocitelor din snge n pulpa alb (n teaca periarteriolar). Sinusul zonei marginale formeaz grania dintre pulpa alb i pulpa roie i reprezint zona de schimb celular dintre cele dou compartimente. Din pulpa alb, limfocitele trec n sinusurile marginale, apoi n sinusurile pulpei roii i de aici n sistemul venos al splinei.

n pulpa alb se gsesc foliculii limfoizi primari. Ei sunt localizai la periferia tecii limfoide periarteriolare sau n imediata ei vecintate. In manoanele limfoide periarteriolare, limfocitele au o distribuie selectiv: celulele T segreg predominant n tecile periarteriolare, iar celulele B, n foliculii limfoizi.

Antigenele din snge sunt preluate de macrofagele zonei marginale i ajung n pulpa alb. Sinteza anticorpilor fa de antigenele circulante este una din funciile majore ale splinei. Celulele B activate n pulpa alb, migreaz n pulpa roie, unde se gsete majoritatea plasmocitelor. In zona marginal se gsete majoritatea celulelor NK.

Splina nu are circulaie limfatic. La nivelul splinei, limfocitele ies din snge prin peretele capilarelor zonei marginale, care este foarte permeabil i se distribuie n pulpa alb, iar de aici strbat drumul invers i ajung n pulpa roie, n sinusurile venoase. Acestea comunic att cu capilarele zonei marginale, ct i cu sistemul venos al splinei.

Limfocitele prsesc splina prin vena splenic.

Sistemul imunitar al mucoaselor

Mucoasele (digestiv, respiratorie, genital, urinar), din punctul de vedere al contactului cu antigenele, constituie structurile cele mai vulnerabile ale organismului uman i animal. In special la nivelul intestinului, contactul permanent cu microorganismele creeaz condiiile ptrunderii acestora n mediul intern. Mucoasele reprezint nu numai o entitate anatomic, ci i una funcional imunologic. Particularitile lor structurale i funcionale tind s le delimiteze tot mai mult de aparatul imunitar sistemic.

Sistemul imunitar al mucoaselor, la mamifere, este o reea integrat de esuturi, formate din celule specifice, celule limfoide i molecule cu funcie imunitar, protectoare fa de infeciile pe calea membranelor mucoase. La nivelul structurilor de contact cu antigenele, sistemul imunitar al mucoaselor este divizat anatomic i funcional: structurile BALT(bronchus associated lymphoid tissue) i GALT(gut associated lymphoid tissue). La roztoare, structurile BALT sunt bine dezvoltate, avnd rolul de a rspunde la antigenele inhalate. La om, structurile BALT propriu-zise nu se dezvolt, iar esuturile limfoide majore echivalente sunt tonsilele palatine i formaiunile adenoide (tonsilele nazofaringiene). Impreun, ele formeaz o barier fizic de esuturi limfoide, care constituie inelul Waldeyer. Tonsilele i adenoidele se descriu ca NALT (nasal associated lymphoid tissue). Structurile limfoide asociate mucoaselor (MALT) includ

cteva categorii de celule antigen-reactive: celule B, pozitive pentru moleculele CMH II, macrofage, celule Langerhans, celule dendritice, celule foliculare dendritice, plasmocite. Aceste celule sunt fie distribuite difuz, fie organizate n structuri anatomice distincte: foliculi limfoizi, plcile Peyer, amigdalele.

Amigdalele (tonsilele palatine) sunt aezate n unghiurile mandibulare. Dimensiunile unei amigdale msoar 2,5 cm lungime, 1,5 cm lime i 1 cm grosime. Tonsilele i adenoidele sunt singurele structuri limfoide asociate tractului digestiv, acoperite de o capsul care ader intim de esutul limfoid subiacent. Pe faa intern (care privete spre vestibulul faringian) se gsesc deschiderile criptelor tonsilare. Criptele ptrund adnc n masa limfoid a tonsilei, uurnd contactul celulelor reactive (macrofage i limfocite), cu antigenele care ptrund pe care digestiv i respiratorie. Circa 50% dintre celulele tonsilare sunt limfocite B, constituite n foliculi care conin centrii germinali. Majoritatea limfocitelor B au ca receptor de antigen IgG, iar restul sunt IgM+ i IgA+. Circa 40% din celulele tonsilare sunt limfocite T. Fig.45. Rolul potenial al NALT pentru dezvoltarea imunitii mucoaselor. Tonsila palatin prezint cripte adnci. Schema ilustreaz categoriile majore de celulele prezentatoare de antigen, (LC = celule Langerhans, Mf = macrofage; FDC = celule foliculare dendritice), centrul germinativ al celulelor B i ariile parafoliculare cu celule T (TDA). Limfocitele efectoare i cele de memorie recircul pe calea sistemului imunitar comun al mucoaselor (dup McGhee, 1998).

Apendicele este o structur limfoid asociat intestinului, prezent numai la iepure, maimue antropoide i la om. Prezint structuri limfoide cu organizare similar plcilor Peyer, cu un dom bine definit, aglomerri de celule B organizate n foliculi i arii interfoliculare bogate n celule T. Epiteliul domului este permeabil, permind trecerea liber a antigenelor solubile i a celor particulate, ca i a bacteriilor.

Foliculii limfoizi sunt structuri asociate, caracteristice mucoasei intestinale, care se gsesc fie ca foliculi solitari de 0,5-2,0 mm, foarte numeroi n partea terminal a ileonului, fie ca foliculi agregai ce formeaz plcile Peyer. Foliculii (solitari sau agregai) sunt localizai n corionul mucoasei, dar ptrund i n submucoas. Fig. 46. Structura schematic a unei plci Peyer i a unui ganglion mezenteric. HEV = venule cu endoteliu nalt; CG = centru germinativ.

O plac Peyer conine 20-30 de foliculi agregai. Are form circular sau alungit (eliptic), cu axul mare orientat n lungul intestinului. Sunt mai numeroase n ileonul terminal. Lungimea este variabil, ntre 1-12 cm, iar limea, ntre 0,8-1cm. Plcile Peyer ocup marginea liber a intestinului(niciodat marginea mezenteric). Ele se formeaz n cursul dezvoltrii fetale, ating

nu-mrul maxim la pubertate (peste 200) i scad ncet cu vrsta. Se estimeaz c 10% din celulele limfoide umane sunt asociate cu structurile limfoide ale tractului gastro-intestinal

Fiecare folicul al plcii Peyer este format dintr-o aglomerare de macrofage, limfocite, plasmocite. Ariile interfo-liculare sunt bogate n limfocite T. Structura foli-cular individualizat este separat de lumenul intes-tinal prin structuri speci-alizate, denumite domuri: domul epitelial, alctuit din celule epiteliale dife-reniate, de aspect cubo-idal, ale mucoasei intes-tinale i domul conjunctiv subepitelial.

La nivelul domului, epiteliul intestinal prezint puine celule mucoase i puini microvili, dar exist n schimb, o categorie de celule specializate funcional, denumite celule M (membraneous), ataate de enterocite prin complexe joncionale. Prezena vimentinei i cheratinei n celulele M este dovada originii lor epiteliale. La nivel microscopic, celulele M se recunosc prin asocierea lor strns cu limfocitele intraepiteliale. Ele au pliuri membranare mari, bazolaterale, n care stau limfocitele intraepiteliale. Celulele M formeaz o umbrel deasupra unui spaiu n care se gsesc limfocite intraepiteliale, macrofage, celule dendritice.

Celulele M au rolul de a pinocita antigenele solubile din lumenul intestinal, dar preiau i antigene particulate(virusuri, bacterii, protozoare). Inglobarea antigenului nu este urmat de degradare lizosomal, ci antigenul intact este transportat n vezicule spre membrana laterobazal. Prin fuziune, antigenul este eliberat n spaiul laterobazal, unde este transferat celulelor subiacente, unele specializate n prelucrarea i prezentarea antigenelor, fenomen denumit translocaie. Antigenele sunt prelucrate n celulele dendritice i n macrofagele subepiteliale i sunt prezentate limfocitelor locale sau sunt transferate celulelor interdigitate i prezentate celulelor T interfoliculare. Celulele interdigitate care prezint antigenul, deriv din celulele dendritice care au nglobat antigenul. Fig. 47. a. O plac Peyer. b. Reprezentarea schematic a mecanismului funcional al plcii Peyer. Detaliu al celulei M. Dup nglobarea i transportul de ctre celula M, antigenul este prelucrat de macrofage sau de celulele dendritice, care se transform n celule interdigitate (IDC) i apoi este prezentat limfocitelor n ariile celulelor T ale plcii Peyer i ale ganglionilor limfatici mezenterici (MLN). E = enterocit; L= limfocit; m= macrofag/celul dendritic (dup Sminia, 1998).

O plac Peyer are 3 regiuni structurale: domul, foliculii cu centrii germinali (zona celulelor B) i aria parafolicular(populat de celulele T, n special celule Th). Plcile Peyer sunt populate iniial de limfocite T. Dezvoltarea centrilor germinali(ai limfocitelor B) este dependent de antigenele microbiotei intestinale, pentru c la animalele germ-free, plcile Peyer sunt slab dezvoltate i lipsesc centrii germinali. La organismele timectomizate neonatal i la cele congenital atimice,

ariile interfoliculare sunt srace n limfocite T. Pentru completa dezvoltare a plcilor Peyer, sunt necesare att influenele stimulatoare ale timusului, ct i contactul cu microbiota intestinal.

Structurile limfoide asociate tractului digestiv sunt lipsite de nveliul capsular i de vasele limfatice aferente. In lipsa vaselor limfatice, lichidul interstiial care scald structurile limfoide ndeplinete funcia limfei aferente.

Limfocitele foliculare au raporturi de vecintate cu epiteliul i de aceea se numesc foliculi asociai epiteliului. Foliculul limfoid, ca unitate structural a plcii Peyer, este strpuns de o arteriol ascendent, ce se termin ntr-o reea capilar situat sub epiteliul folicular. Aceste capilare se continu cu venulele postcapilare din ariile interfoliculare T-dependente.

Limfocitele libere, diseminate n mucoasa tractului digestiv au distribuie difuz. Ele se gsesc n lamina propria i n stratul epitelial al mucoasei, printre enterocite. Este o populaie heterogen de limfocite: cele din lamina propria sunt n proporii egale limfocite T i B, dar i un numr mare de plasmocite. In mucoasa intestinal se gsesc limfocite B, cu markerul IgE+ , numrul lor fiind crescut la persoanele cu alergii alimentare. In submucoasa gastrointestinal, n special n vecintatea vaselor de snge, se gsesc mastocite cu receptori de mare afinitate pentru IgE.

Limfocitele intraepiteliale sunt n special limfocite T citotoxice(75%) i limfocite B, cu markerul IgA+. Majoritatea limfocitelor B sunt n curs de difereniere spre plasmocite. Ele sunt primele care recunosc antigenele luminale ce traverseaz mucoasa pe o cale independent de celulele M. Limfocitele T intraepiteliale mediaz hipersensibilitatea ntrziat cu specificitate de antigen i au funcie citotoxic.

Celulele limfoide din structurile organizate(plcile Peyer) sunt neangajate. Ele au rolul de a iniia rspunsul imun, dup interaciunea cu antigenele care traverseaz celulele M. Limfocitele difuze din lamina propria sunt n mare parte activate, avnd funcia de a produce IgA.

Funciile MALT. Sistemul imunitar al mucoaselor are o funcionalitate precis: s exclud antigenele exogene, nainte ca ele s ptrund n mediul intern i s evite sau s minimalizeze expunerea aparatului imunitar sistemic, la antigenele moleculare sau celulare care tind s ptrund n mediul intern. In acelai timp, esutul limfoid asociat mucoaselor trebuie s rmn insensibil la microbiota normal a mucoaselor. MALT are calitatea de zon de control a organismului, la contactul cu antigenele, dar are i rol reglator asupra funcionalitii aparatului imunitar sistemic. Aa se explic faptul c administrarea oral a unui antigen la om sau animale, n esen, nu produce un rspuns imun sistemic, ci de obicei, un rspuns imun al mucoasei. Mecanismul nu este cunoscut, dar sistemul imunitar al mucoaselor mpiedic rspunsul imun

amplu al aparatului imunitar sistemic, la un numr foarte mare de antigene intestinale, n special de origine alimentar. Antigenele complexe bacteriene sau virale pot iniia un rspuns imun complex, prin intermediul aparatului imunitar al mucoaselor. Deficienele funcionale ale MALT expun organismul i aparatul imunitar sistemic, unei permanente stri de activare, care depete limitele fiziologice, consecina fiind instalarea maladiilor autoimune.

Prin epiteliul folicular, microorganismele dobndesc acces la structurile limfoide ale foliculului. Consecina este benefic, deoarece, astfel se iniiaz rspunsul imun protector fa de microorganismele luminale. Din acest punct de vedere, celulele M formeaz un sistem de avertizare timpurie. Ptrunderea microorganismelor la nivelul epiteliului folicular are i consecine nefavorabile, deoarece acesta poate fi o cale de acces a microorganismelor patogene (S.typhi), la structurile submucoase.

Limfocitele B din foliculii limfoizi ai plcilor Peyer se gsesc ntr-o stare de proliferare activ. Totui, numrul plasmocitelor este mic, ceea ce reflect posibilitatea ca limfocitele B din structurile GALT, s migreze n alte mucoase, nainte de a se diferenia n plasmocite.

Tabel comparativ privind principalele caracteriatici ale organelor limfoide primare i secundareCaracteristici

Organe limfoide primare

Organe limfoide secundare

Originea La zona de trecere ntre ectoderm i endoderm. Conin celule derivate din ectoderm din mezoderm (limfocite) .In mezoderm Momentul dezvol-trii sau dup natere cursul vieii fetale Foarte timpuriu n viaa embrionar Tardiv n

Rolul Sunt populate timpuriu cu celule precursoare ale limfocitelor i au rol n dobndirea competenei imunitare a acestora. Sunt populate tardiv numai de limfocite mature. Durata funciei lor La adult sufer o involuie progresiv, care la vrstele naintate este nsoit de o deficien a funciilor imunitare. Persist toat durata vieii Activitatea mitotic a limfocitelor Este intens i independent de stimularea antigenic Intens numai dup stimularea antigenic

Formarea centrilor germinativi de reacie

Absent

Foarte intens

Efectele extirprii precoce Reducerea numrului de limfocite i diminuarea rapid a reactivitii imunitare Nu este posibil. Dup blocarea imunitar diminu, dar totdeauna rmn celule imunocompetente. Efectele extirprii tardive Imposibil Reducerea numrului de limfocite i limitarea reactivitii imunitare Focare

Funcia esenial Centre de proliferare, maturare i diseminare a limfocitelor. ale rspunsului imun.

Fig. 48. Reprezentarea schematic a circuitului global al limfocitelor. (1) Limfoblastele din mduv ajung pe cale sanguin n splin i timus. Dup maturare, limfocitele sunt eliberate n snge. (2) Limfocitele mature intr n splin i o prsesc. (3) Limfocitele mature pot intra n structurile MALT i n esuturile periferice. (4) Limfocitele prsesc MALT i esutul periferic pe calea limfaticelor. (5) Limfocitele intr n ganglionul limfatic, trecnd prin celulele specializate care cptuesc venulele postcapilare. (6) Limfocitele prsesc ganglionul limfatic pe cale limfatic i reintr n snge prin ductul toracic.

RECIRCULAREA LIMFOCITELOR

Organele limfoide primare (mduva oaselor, timusul, bursa lui Fabricius) au rolul de a produce limfocite mature neangajate (virgine). Dup ce prsesc organele limfoide primare, limfocitele au proprietatea constitutiv de a recircula n organele limfoide secundare i n compartimentul teriar nelimfoid, n absena stimulului inflamator.

Organele limfoide secundare sunt reprezen-tate de ganglionii lim-fatici, de splin i de structurile MALT. Funcia lor este de a acumula i prezenta antigenele, att limfocitelor neangajate ct i celor de memorie.

esuturile nelimfoide ale compartimentului teriar sunt reprezentate de restul esuturilor organismului. In mod obinuit, ele conin puine celule limfoide, dar n focarele de inflamaie se acumuleaz populaii limfocitare numeroase, n special limfocite de memorie.

esutul limfoid secundar este suportul structural al reaciilor celulare ale rspunsului imun. La acest nivel se produce contactul limfocitelor cu antigenul specific. Faptul impune, ca o condiie funcional esenial, recircularea continu a limfocitelor pentru a ntlni i a recunoate antigenul. Din acest punct de vedere, limfocitele au o particularitate funcional unic: prsesc sngele ca i celulele mieloide (neutrofile, monocite), trec n organele limfoide secundare i n compartimentul teriar, dar, spre deosebire de cele mieloide, se rentorc n fluxul sanguin. Recircularea snge-esuturi limfoide secundare-snge se repet tot restul vieii limfocitelor i este independent de stimularea antigenic. Milioane de limfocite trec zilnic prin fiecare organ limfoid secundar, astfel nct fiecare antigen ptruns n organism pe o cale sau alta, va fi expus ntregului repertoriu de receptori de antigen ai limfocitelor.

Capacitatea limfocitelor de a recunoate i de a coloniza anumite esuturi limfoide a fost denumit ecotaxis sau homing. Fig. 49. Recircularea limfocitelor i a celulelor prezentatoare de antigen. Limfocitele neangajate prsesc timusul i migreaz n organele limfoide secundare (splin, ganglioni limfatici). Celulele prezentatoare de antigen (celulele dendritice i fagocitele mononucleare), dup ce prsesc mduva, trec n snge, apoi intr n esuturi, nglobeaz antigenul i l transport n esuturile limfoide pentru a fi prezentat celulelor T i B. Limfocitele activate migreaz din esuturile limfoide i se acumuleaz preferenial la situsurile infeciei sau ale inflamaiei.

Mecanismele homing au un rol esenial n meninerea diviziunilor funcionale ale organelor limfoide i n orientarea limfocitelor mature neangajate i a celor de memorie. Recircularea realizeaz dispersia populaiilor de limfocite efectoare i de memorie, spre ariile cele mai expuse invaziei antigenice, dar realizeaz i supravegherea esuturilor n raport cu prezena antigenelor.

Soluia natural pentru aceast funcie a fost compartimentarea sistemului limfoid n organe individualizate i esuturi care sunt conectate i unificate printr-un trafic limfocitar orientat i prin recirculare.

Recircularea limfocitelor este impus de modul de organizare a sistemului limfoid: fiecare organ limfoid dreneaz un teritoriu definit al organismului. Astfel, antigenul injectat subcutan sau intradermic este transportat la ganglionii limfatici regionali. Antigenul injectat intravenos ajunge n splin, iar cele care ptrund la nivelul mucoaselor (digestiv, respiratorie, genito-urinar) ajung la structurile limfoide MALT (GALT i BALT).

Limfocitele care recunosc antigenul la nivelul esuturilor limfoide secundare, se activeaz i iniiaz rspunsul imun, iar cele care nu au ntlnit antigenul specific, trec prin esuturile limfoide n cteva ore, se rentorc n snge pentru cteva minute i i reiau un nou circuit.

Celulele limfoide mature (competente) se gsesc concentrate n organele limfoide secundare. Cele din snge constituie numai o proporie mic din totalul limfocitelor.

Din totalul limfocitelor, numai o proporie foarte mic, (2%) recircul n unitatea de timp, pe traseul snge ganglioni limfatici limf canal toracic snge, iar restul rmn n organele limfoide secundare.

Limfocitele cu cea mai nalt rat a rcirculrii sunt celulele T de memorie. Limfocitele T i B neangajate (naive), recircul cu o rat mult mai sczut ntre organele limfoide secundare, pn ntlnesc antigenul sau mor. Cele care au ntlnit antigenul specific, se activeaz. Una din primele consecine ale activrii este exprimarea intens a unor molecule de suprafa, din categoria integrinelor, care mediaz aderena ferm a limfocitului de componentele matricei extracelulare. Limfocitele care recunosc antigenul sunt reinute selectiv n organul limfoid secundar.

Efectul pe termen mai lung al stimulrii antigenice este expansiunea clonal a limfocitelor i diferenierea lor n celule efectoare ale rspunsului imun i celule de memorie. Aceste categorii au proprieti de migrare (homing) net diferite fa de limfocitele neangajate.

Limfocitele efectoare i cele de memorie dobndesc capacitatea de a migra n compartimentul teriar (adic n organele nelimfoide). Pe de alt parte, ele manifest o selectivitate pronunat a compartimentului de homing, adic dup activare, recircul preferenial n formaiuni limfoide de aceiai categorie cu cele care au fost activate la contactul primar cu antigenul.

Limfocitele T /recircul preferenial n esuturile epiteliale neinflamate.

Importana fenomenului de homing. Fenomenul de homing este foarte important n procesul genezei embrionare a organelor limfoide primare, deoarece asigur migrarea n timus, respectiv n bursa lui Fabricius i echivalenii ei, a precursorilor limfocitelor T i B (pre-T i pre-B). Procesul recirculrii permite ca limfocitele mature neangajate s dobndeasc acces la structurile care concentreaz antigenele ce au ptruns pe cale tegumentar sau pe calea mucoaselor i s ntlneasc epitopul specific. Limfocitele T activate, prolifereaz i se difereniaz. Att cele activate, ct i cele de memorie manifest selectivitate de organ, adic recircul n acelai tip de organ limfoid secundar. Migrarea cu specificitate de organ, a celulelor T de memorie, mrete eficiena rspunsului imun, deoarece rentlnesc antigene asemntoare celor care le-au indus activarea primar. Mecanismul migrrii selective este puin neles. Probabil implic mecanisme de trafic selectiv, controlat de molecule membranare. La organismul adult, limfocitele recoltate din ductul toracic migreaz preferenial n MALT, iar cele din ganglionii limfatici se rentorc n ganglioni, n ariile timo-dependente. Limfocitele T i B recoltate din splin, dup transferul n organismul receptor, se distribuie n compartimentele T i B ale organelor limfoide secundare. Majoritatea limfocitelor din mduva osoas, migreaz n ariile timo-independente.

Ariile timo-independente (populate de limfocite B) ale organelor limfoide secundare sunt: foliculii cortexului extern din ganglionii limfatici, foliculii din plcile Peyer i foliculii zonei periferice din pulpa alb a splinei.

Ariile timo-dependente (populate de limfocite T) sunt: cortexul profund al ganglionilor (paracortex), manonul limfoid periarteriolar al pulpei albe a splinei i zonele interfoliculare ale plcilor Peyer.

Bazele moleculare ale fenomenului de homing

Fig. 50. Secvena de evenimente ce regleaz migrarea limfocitelor din snge prin pereii venulelor cu endoteliu nalt (HEV), n organele limfoide. Micarea de rostogolire a limfocitelor pe suprafaa celulelor endoteliale este convertit repede n aderen stabil dependent de integrine, n 1-3 s. Migrarea transendotelial a limfocitului aderent este reglat de un stimul de migrare exprimat de celulele endoteliale nalte. Bazele moleculare ale stadiului final al migrrii prin membrana bazal nu se cunosc, dar probabil este reglat de chimioatractanii eliberai de ganglionul limfatic (dup Ager, 1998).

Fiziologia recirculrii limfocitelor se bazeaz, n esen, pe reglarea proprietii lor de aderen i mobilizare. Limfocitele au proprietatea rar, de a-i regla proprietile adezive, toat durata vieii. Dac n snge limfocitele nu trebuie s adere ntre ele sau de alte celule circulante i nici de endotelii, trecerea lor n spaiul extravascular necesit aderena ferm de celulele endoteliale.

Traficul limfocitar implic evenimente complexe, care duc la recrutarea celulelor din fluxul sanguin. Procesul implic ncetinirea deplasrii limfoci-telor, la contactul cu endoteliul vascular, apoi aderena strns de celulele endoteliale, urmat de migrarea transendotelial.

Fenomenul migrrii prefereniale a limfocitelor din snge, n esuturile limfoide specifice (homing), este explicat prin existena moleculelor cu rol de aderen, denumite generic adezine, att pe suprafaa limfocitelor ct i pe suprafaa venulelor cu endoteliu nalt (HEV).

Adezinele suprafeei limfocitelor sunt receptori specifici de homing, iar cele de pe suprafaa celulelor endoteliale ale venulelor au rol de antireceptori. Att unele ct i altele aparin familiei integrinelor. Ambele categorii de molecule mediaz interaciunea selectiv a celulelor sanguine cu endoteliul vascular, ca o precondiie a migrrii n esuturi i se numesc selectine.

Selectina L se gsete pe suprafaa celor mai multe leucocite circulante: limfocite, neutrofile, monocite. Spre deosebire de celelalte dou tipuri (E,P), selectina L este exprimat constitutiv pe suprafaa celulelor. Rolul ei este medierea tranzitului leucocitelor n situsul inflamator, dar i n orientarea specific a recirculrii constitutive spre ganglionii limfatici periferici.

Deoarece fenomenul recirculrii limfocitelor este permanent, selectinele corespunztoare sunt exprimate de asemenea permanent, att pe celulele endoteliale ale venulelor ct i pe limfocite.

Interaciunea limfocitelor cu selectinele endoteliale s-a studiat in vitro, prin incubarea limfocitelor cu seciuni subiri de esut limfoid. Limfocitele se leag specific de venulele cu endoteliu nalt (HEV) i n proporie nesemnificativ, de endoteliul altor vase sanguine.

Limfocitele B ader preponderent de HEV din plcile Peyer, iar limfocitele T ader preferenial de HEV din ganglionii limfatici.

Dup legarea specific a receptorilor limfocitari de antireceptorii celulelor endoteliale, se iniiaz evenimentele al cror rezultat este extravazarea limfocitelor din esuturile limfoide secundare.

Trecerea limfocitelor din fluxul sanguin, prin peretele vascular, are loc n mai multe etape:

- deschiderea jonciunilor strnse dintre celulele endoteliale (n 5-10 minute);

- migrarea selectiv a limfocitelor T i B, n ariile caracteristice, n orele urmtoare.

Recircularea limfocitelor n structurile limfoide ale mucoaselor

Recircularea limfocitelor n structurile limfoide ale mucoaselor (GALT i MALT) are particulariti distincte fa de recircularea limfocitelor n celelalte organe limfoide secundare. Principala diferen const n aceea c, ntr-o msur important, sistemul imunitar al mucoaselor este separat din punct de vedere funcional, de aparatul imunitar sistemic. Separarea este rezultatul modului preferenial de recirculare a limfocitelor n GALT i BALT i anume, limfoblastele generate n structurile limfoide ale tractului gastrointestinal circul n ductul toracic i au tendina de a se rentoarce n aceleai structuri limfoide.

Limfocitele recircul n snge i reintr n esutul limfoid secundar. Celulele mature, neangajate, se distribuie aleatoriu n structurile MALT i asigur existena ntregului repertoriu de receptori de antigen.

Limfa ductului toracic este calea final comun a ntregii cantiti de limf generat sub nivelul diafragmei, majoritatea avnd originea n teritoriul intestinal. In ductul toracic se gsesc limfocite mari (blaste). Celulele efectoare i de memorie manifest un homing preferenial, care menine compartimentarea limfocitelor. Limfocitele stimulate i blastele generate n structurile MALT, dup ce sunt descrcate n snge, extravazeaz rapid n lamina propria i revin cu o mare probabilitate n aceleai structuri sau se distribuie n structuri limfoide omologe, asociate altor mucoase. Multe se transform n plasmocite care sintetizeaz IgA. Pentru c celulele stimulate la nivelul tractului gastrointestinal recircul spre alte situsuri mucoase(plmn, glande mamare, tractul urogenital) s-a propus conceptul de sistem imunitar comun al mucoaselor. Chiar dac proporia limfocitelor care recircul preferenial la nivelul diferitelor mucoase (tractul respirator i urogenital) este limitat, fenomenul este foarte important, deoarece sugereaz posibilitatea stimulrii imunitii protectoare generale, la toate situsurile mucoase, folosind un vaccin oral.

n plcile Peyer i n foliculii limfatici solitari ai mucoasei gastrointestinale se gsesc preponderent limfocite B cu izotip IgA, dar i limfocite B cu izotip IgG i IgM. Preponderena

lor numeric se explic prin aceea c se leag mai ferm de venulele cu endoteliu nalt, comparativ cu limfocitele T. Dup contactul cu antigenul, ele se activeaz, prolifereaz i se difereniaz. Totui, n plcile Peyer, practic nu exist celule productoare de anticorpi. Acest fapt denot c plcile Peyer sunt structuri limfoide specializate n medierea contactului dintre limfocite i antigenele tractului digestiv, dar celulele B dup stimulare migreaz din plcile Peyer nainte de a se diferenia n plasmocite. Blastele rezultate din celulele B stimulate, prsesc plcile Peyer pe cale limfatic i ajung n ganglionii limfatici mezenterici. De aici, blastele migreaz selectiv n mucoasa digestiv i respiratorie i constituie esutul limfoid difuz.

Limfocitele T au o modalitate mai puin restrictiv de a migra n mucoase. In structurile limfoide ale mucoasei, celulele T sunt minoritare. Rolul lor pare a fi limitat la efecte reglatoare asupra limfocitelor B.

n concluzie, recircularea limfocitelor B la nivelul mucoaselor este restrictiv, n sensul c celulele stimulate de antigene, n structurile limfoide ale mucoasei digestive au o tendin marcat de a recircula n structuri limfoide asociate mucoaselor. S-a avansat ipoteza unei specificiti de organ a recirculrii limfocitelor B. Cele activate n BALT vor recircula n mucoasa respiratorie, iar cele activate n GALT vor recircula la nivelul mucoasei digestive, asigurnd o eficien protectoare maxim.

Recircularea limfocitelor n compartimentul teriar nelimfoid

Dintre esuturile nelimfoide, cele mai cunoscute n privina raporturilor lor cu limfocitele sunt suprafeele epiteliale: epiteliul tegumentar i mucoasele tractului gastrointestinal, urogenital i respirator. Aceste structuri se caracterizeaz prin prezena a dou componente limfoide distincte. Prima, evideniat la oarece, populeaz epiteliile n cursul dezvoltrii embrionare. Acestea sunt limfocite cu localizare intraepitelial (IEL) i pentru a se diferenia sau pentru a se menine n aceast localizare, nu necesit contactul cu antigenul exogen. Se pare c limfocitele intraepiteliale i au originea direct n organele limfoide primare sau chiar n mduva osoas, fr s necesite un stadiu de tranzit prin organele limfoide secundare. Fig. 51. Rolul MALT n inducerea sintezei IgA n mucoase. Inglobarea antigenului de ctre celulele M, declaneaz rspunsul imun local. Limfocitele B IgA+ i Th CD4+, pe calea limfaticelor eferente, migreaz n ganglionii limfatici mezenterici i apoi n ductul toracic, pentru a ajunge n snge. Aceste celule migreaz n situsurile n care IgA este molecula efectoare, unde are loc diferenierea final, sinteza i transportul sIgA. Stimularea limfocitelor n MALT i exodul celulelor spre situsurile efectoare justific denumirea de sistem imunitar comun al mucoaselor.

A II-a categorie de limfocite din structurile nelimfoide sunt, n special, limfocite T de memorie i limfocite efectoare care s-au activat n organele limfoide secundare. Ele au localizare intraepitelial sau se gsesc n esutul conjunctiv subepitelial.

Celulele epiteliale regleaz direct activitatea celulelor limfoide, att prin proximitatea lor direct, ct i prin capacitatea de a sintetiza citochine, ce activeaz i/sau recruteaz celulele efectoare.

Limfocitele intraepiteliale sunt, n primul rnd celule T, cu receptor - sau -. Suprafaa foarte mare a epiteliilor, trebuie s fie corelat cu existena mai multor IEL, dect alte tipuri de celule T. Majoritatea sunt bogate n granule citotoxice, ceea ce a dus la presupunerea c IEL recunosc i lizeaz celulele epiteliale infectate, formnd prima linie de aprare. Este greu de explicat modul n care celulele T, cu o diversitate foarte larg a specificitii de legare a receptorilor de antigen, recunosc epitopii specifici expui pe suprafaa celulelor epiteliale fixe. De aceea, s-a presupus c IEL recunosc semnalele de stress imunitar, i nu epitopii specifici ai agenilor infecioi. Semnalele sunt transmise de proteinele nrudite (MICA, MICB), dar distincte de moleculele CMH I. Aceste molecule nu prezint antigenul, dup modelul clasic al moleculelor CMH, ci IEL recunosc diferenele nivelului de exprimare a moleculelor MICA i MICB, pe suprafaa celulelor normale i a celor stressate. Stimulii activrii MICA i MICB pot fi de natur infecioas sau evenimente de transformare care pun n pericol integritatea organismului.

IEL sunt pozitive numai pentru CD8 (CD8 +,-) sau sunt negative pentru ambii coreceptori (CD4- CD8 -, -). Se pare c epiteliile favorizeaz dezvoltarea extratimic a IEL, care vin direct din mduva osoas.

Limfocitele asociate epiteliilor recircul cu o rat sczut, care poate fi constitutiv, dar se amplific mult dup stimularea antigenic local.

n esuturile nelimfoide, limfocitele T realizeaz controlul de calitate a moleculelor expuse pe suprafaa celulelor tisulare. Dac este detectat prezena antigenelor nonself (virale, tumorale sau induse chimic), limfocitele T iniiaz rspunsul imun citotoxic.

ANTIGENELE COMPLEXULUI MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE (C M H)

Existena antigenelor de histocompatibilitate a fost dedus din faptul c alogrefele tegumentare sau de organe, nu sunt viabile n organismul receptor. Dup 7-10 zile, esutul transplantat se inflameaz i curnd dup aceea, grefa este respins.

Respingerea grefei este de natur imunitar: sistemul imunitar al receptorului de gref recunoate ca nonself, anumite molecule ale celulelor grefei i se activeaz. Moleculele de suprafa ale celulelor grefate, recunoscute ca nonself, sunt denumite antigene de histocompatibilitate. Ele confer individualitate biochimic fiecrui individ.

Antigenele de histocompatibilitate se definesc ca molecule ale suprafeei celulare i care, datorit diferenelor biochimice individuale sunt recunoscute de sistemul imunitar al unui organism cu un alotip diferit (cu o alt combinaie de gene alele la situsul codificator).

Diversitatea biochimic la nivel individual a acestor molecule, st la baza unicitii biochimice a fiecrui individ uman i este determinat de o diversitate genetic corespunztoare.

Deoarece se comport ca antigene majore n organismul receptor de gref, antigenele CMH se numesc i antigene de transplantare.

n funcie de capacitatea lor de a stimula rspunsul imun de respingere a grefei, antigenele CMH sunt tari i slabe.

Antigenele CMH tari reprezint principala barier n calea transplantului de esuturi i organe. La oarece, moleculele CMH tari aparin sistemului H-2. Grefele de esuturi i organe ntre organisme care difer prin antigenele complexului H-2 ale suprafeei celulare sunt invariabil respinse n 10-14 zile. Antigenele tari aparin claselor I i II.

Antigenele slabe (uoare) sunt codificate de sistemul minor de histo-compatibilitate i determin respingerea lent a grefei de piele, n circa 200 de zile.

La om, corespondentul sistemului molecular antigenic H-2 de la oarece este complexul antigenic al sistemului HLA (Human Leucocyte Antigen). Denumirea semnific faptul c moleculele sistemului au fost detectate iniial (J. Dausset, 1958), pe suprafaa leucocitelor.

Antigenele complexelor H-2 i HLA au o varietate antigenic individual i de aceea natura lor chimic se poate studia numai n populaii genetic pure (inbred) de oarece, obinute prin mperecheri multiple ntre indivizii aceleiai descendene.

Structura molecular a antigenelor CMH clasa I

Antigenele codificate de genele CMH clasa I sunt glicoproteine de membran, a cror regiune Cterminal se gsete n citoplasm, iar cea N-terminal este expus extracelular.

O molecul CMH clasa I este alctuit dintr-un lan H (Heavy) polipeptidic glicozilat (45 kD), n asociaie strns, necovalent, cu -2 microglobulina (12 kD), un polipeptid care se gsete i n ser.

Catena H este alctuit din 339 aminoacizi, distribuii n urmtoarele 5 domenii:

- trei domenii extracelulare, n regiunea N-terminal, notate cu -l, -2, -3, fiecare cu cte 90 de aminoacizi. Sub aciunea papainei, pot fi clivate de restul moleculei. Domeniile -2 i -3 prezint legturi S-S intracatenare i formeaz bucle de 63 i respectiv 86 aminoacizi;Fig.52. Reprezentare schematic a structurii moleculelor CMH clasa I, ancorate n membrana citoplasmatic. Catena codificat de gena CMH prezint 3 domenii globulare (-1, -2, -3). Domeniul -3 este asociat cu un peptid -2 microglobulina, un mic peptid globular de 12 kD cu o structur teriar asemntoare unui domeniu al Ig, stabilizat printr-o punte S-S.

- domeniul transmembranar conine 25 resturi de aminoacizi hidrofobi, care traverseaz membrana. Imediat deasupra acestui domeniu se gsesc 5 aminoacizi bazici (Arg, Leu), tipici pentru proteinele legate de membran, cu rolul de a ancora lanul polipeptidic n membran;

- domeniul hidrofil cito-plasmatic (30 de aminoacizi la om, 40 la oarece), conine n special serin, unele resturi fiind fosforilate, este implicat n transmiterea semnalului de la domeniile extracelulare, la mediatorii citoplasmatici. Acest domeniu conine resturi de cistein cu rol n legarea prin intermediul punilor S-S, de alte catene H sau de proteine citoplasmatice.

Componenta glucidic este alctuit din dou grupri, fiecare fiind format din 12-15 resturi de zaharuri, ataate de domeniile -1 i -2. Sunt oligozaharide care conin manoz, de care se leag catene laterale de glucozamin i acid sialic.

Catena H are o regiune variabil n jumtatea N-terminal, cu dou subzone hipervariabile, care difer prin mai mult de 60% din aminoacizi, de la un organism la altul, localizate n domeniile 1 i -2. Studiile prin difracie cu raze X ale domeniilor extracelulare, cristalizate dup clivarea cu papain arat c domeniile -1 i -2 sunt foarte asemntoare ca secven de amino-acizi i prin pliere formeaz mpreun o cavitate molecular, presupus a fi situsul de legare stabil a epitopului antigenic. Cavitatea, susinut de secvene -pliate ale acelorai domenii -1 i -2, este ocupat de o molecul linear, care este un peptid ce cristalizeaz concomitent cu catena H. Situsul cavitar, dup ce leag antigenul, formeaz un complex recunoscut de limfocitele TCD8. Restul catenei H corespunde regiunii constante. Fig.53.a. Reprezentarea schematic n ochi de pasre a suprafeei superioare a moleculei CMH clasa I umane, bazat pe structura obinut n cristalografie cu raze x. Secvenele -pliate care formeaz baza cavitii sunt marcate prin sgei groase, orientate n direcia amino-carboxil. Secvenele -helicale sunt reprezentate prin liniile groase spiralate. Suprafeele interne ale celor dou helice i faa superioar a secvenelor -pliate formeaz o cavitate. Cele dou sfere negre reprezint o legtur S-S ntracatenar. b. Vedere lateral a aceleiai molecule, care arat anatomia cavitii i plierea domeniilor -3 i -2 m (4 catene -pliate antiparalele pe o fa i 3 pe cealalt) (dup Roitt, 1997)

-2 microglobulina (-2 m) (o globulin mic, ce migreaz la electroforez n regiunea -2) a fost descoperit n 1968, n urina pacienilor cu disfuncie renal provocat de intoxicaia cronic cu cadmiu. Este sintetizat de majoritatea celulelor din organism. Conine circa 100 aminoacizi, cu uoare variaii numerice. Nu prezint variabilitate detectabil pe cale chimic sau imunologic i nu este glicozilat.

Ca i domeniul -3 al catenei H, -2 m prezint omologie a secvenei de aminoacizi cu domeniile constante ale moleculei de Ig. Secvena de aminoacizi a -2 m formeaz un singur domeniu stabilizat printr-o punte S-S, ntre dou resturi de cistein.

-2 m se asociaz necovalent cu lanul H al moleculei CMH clasa I, prin interaciunea cu domeniul -3, dar studiile recente de cristalografie cu raze X, sugereaz un contact extins cu toate cele trei domenii. Moleculele de -2 m legate, se afl n echilibru cantitativ cu cele din plasm.

Asocierea celor dou catene se face dup terminarea sintezei lor i este o condiie obligatorie pentru transportul moleculelor CMH I de la reticulul endoplasmic la membrana citoplasmatic i pentru ancorarea lor n membran. Celulele liniei Daudi (derivat din limfomul Burkitt), dei sintetizeaz catena H, nu exprim molecule CMH I, deoarece nu sintetizeaz -2 m.

Moleculele CMH I au un turnover constant. Cele vechi se elibereaz i trec n circulaie sau sunt endocitate i se sintetizeaz altele noi. Stabilitatea lor este condiionat de rata disocierii peptidului i -2 m. Catenele H libere se denatureaz i sunt degradate.

Moleculele CMH clasa I sunt adevrate certificate de identitate biochimic i genetic, pentru fiecare organism, datorit polimorfismului lor biochimic foarte accentuat. Ele vegheaz la pstrarea homeostaziei biochimice a organismului i devin inta sistemului imunitar n urmtoarele situaii:

dup grefarea esuturilor i organelor care poart molecule incompatibile;

dup ce se asociaz cu antigenele virale, tumorale sau cu cele induse de agenii chimici;

dup modificarea biochimic printr-un proces mutaional.

Structura molecular a antigenelor CMH clasa II

Antigenele CMH clasa II-a sunt glicoproteine heterodimere de membran, formate din dou catene diferite, notate cu i .

Prin solubilizare cu detergent, aceste molecule se elibereaz ntregi. Lanul are 30-34 kD, iar lanul are 26-29 kD.

Fiecare caten este format din 4 domenii:

- dou extracelulare, alctuite din circa 90 de aminoacizi fiecare, notate cu -1, -2, respectiv 1, -2;

un domeniu transmembranar (circa 30 de aminoacizi);

un domeniu citoplasmatic (10-15 aminoacizi).Fig. 54. Reprezentarea schematic a moleculelor CMH clasa II-a. Molecula este format din 2 catene diferite ( i ), legate necovalent, a cror extremitate C-terminal se inser n citoplasm. Cele dou catene au cte dou domenii globulare, asemntoare cu domeniile Ig. Cu excepia domeniului -1, toate celelalte sunt stabilizate printr-o punte S-S intracatenar. Cele dou catene sunt glicozilate (dup Roitt, 1997).

Domeniile -1 i -1 au o variabilitate accentuat a secvenei de aminoacizi. Ele se asociaz pentru a forma o structur ce delimiteaz o cavitate n care este legat peptidul antigenic.

Domeniile -2 i -2 pre-zint omologie a secvenei de aminoacizi, cu domeniile mole-culei de Ig.

Domeniile -2, -1 i -2 sunt stabilizate prin legturi S-S, iar domeniile -1, -2 i -2 sunt glicozilate. Gruparea glucidic conine manoz, galactoz, fucoz, glu-cozamin. Diferenele greutii mo-leculare a celor dou catene se dato-reaz nivelului diferit de glicozilare.

Determinismul genetic al moleculelor CMH

Moleculele CMH sunt codificate de genele complexului major de histocompatibilitate. Calificativul complex este justificat de numrul mare de gene componente, iar cel de major semnific importana deosebit a moleculelor codificate de aceste gene, n realizarea unor funcii imunitare importante:

-elaborarea rspunsului imun

-respingerea grefelor de esuturi i organe.

n raport cu tipul de proteine pe care le codific, genele CMH aparin clasei I i clasei a II-a.

La oarece, genele CMH codificatoare ale moleculelor complexului antigenic H-2 sunt localizate pe cromosomul 17, ntr-un fragment de 2000-4000 kb perechi, suficient de mare pentru a codifica circa 200 de proteine de dimensiuni medii. In acest complex se gsesc 3 tipuri de gene descoperite independent:

-primul grup de gene (descoperit n anii 40) codific antigenele tari de transplantare, care induc respingerea rapid a grefelor de tegument i de organe, ntre indivizi neidentici genetic (aparin unor alotipuri diferite). Acestea sunt genele CMH clasa I, care codific moleculele CMH clasa I;

-al II-lea grup, denumite genele rspunsului imun (IR) codific sinteza unor molecule care condiioneaz intensitatea rspunsului imun al organismului, slab sau puternic, fa de un antigen. Genele IR codific proteinele clasei a II-a de molecule CMH, denumite i molecule Ia (I associated);

-al III-lea set de gene ale complexului CMH codific sinteza unor componente ale complementului.

La oarece, moleculele CMH I sunt codificate de gene situate la extremitile complexului genic H-2, notate K i D. Gena K are circa 55 de variante alelice. Fiecare variant codific proteine distincte. Fig. 55. Reprezentare diagramatic a localizrii subregiunilor genice CMH la oarece i om i poziia genelor majore n aceste subregiuni. La om, locusurile genice clasa II-a sunt localizate ntre centromer i locusurile clasei I, ca i la alte specii de mamifere.

Complexul H-2 la oarece (pe cromosomul 17). Regiunea cromosomal Clasa I II III K K I A, E C4, C2, Bf, TNF D, L I S D

Locusuri genice

La om, moleculele CMH clasa I sunt codificate de genele HLA, iar moleculele CMH II, de regiunea cromosomal D, localizate pe cromosomul 6.

Moleculele CMH I sunt codificate de trei gene: HLA-A, HLA-B, HLA-C. S-au descris genele HLA-E, -F, -G, -H i -J, dar acestea sunt considerate gene neclasice pentru c produsele lor de sintez se deosebesc structural i funcional de ale genelor HLA-A, -B i C.

Moleculele CMH II sunt codificate de regiunea cromosomal HLA-D, ce aparine genelor clasei a II-a.

Genele clasei a III-a codific sinteza acelorai proteine plasmatice (C4, C2, Bf).

Complexul HLA (pe cromosomul 6). Regiunea cromosomal Clasa II III I D C4, C2, Bf B C A E, F, G, H, J

Gene neclasice B C A E, F, G, H, J

Locusuri genice

DP, DQ, DR C4, C2, Bf

Genele HLA clasa I i II au cel mai nalt grad de polimorfism genetic dintre toi determinanii genici cunoscui ai organismului uman:

HLA-A are 83 de alele

HLA-B, 185 de alele

HLA-C, 42 de alele.

Numrul alelelor este n continu cretere pe msur ce se identific noi variante. Polimorfismul genic este consecina existenei a cel puin dou alele pentru un locus. Pe fiecare din cei doi cromosomi pereche, un individ prezint 3 gene CMH diferite (HLA-A, HLA-B, HLA-C). Celulele umane prezint 6 variante diferite de gene clasa I, cte trei de la fiecare printe. Genele CMH I sunt codominante, astfel c pe suprafaa fiecrei celule se exprim produsele de sintez ale ambelor alele parentale. Se sintetizeaz astfel 6 variante biochimice de molecule CMH I.

ntr-o populaie uman, moleculele CMH I i CMH II sunt foarte diferite din punct de vedere biochimic, ca o expresie a polimorfismului genic al indivizilor umani.

Antigenele HLA-A, B i C sunt antigenele majore recunoscute de sistemul imunitar al gazdei, n reacia de respingere a grefei. Cantitativ, moleculele HLA-C sunt inferioare fa de HLA-A i HLA-B. Toate sunt capabile s prezinte antigenul. Moleculele CMH neclasice (E, F, G) nu prezint antigenul.

Polimorfismul biochimic al moleculelor CMH I este limitat la domeniile 1 i 2, la nivelul secvenelor ce formeaz cavitatea molecular.

Genele CMH II sunt localizate n regiunea HLA-D. Regiunea genic HLA-D controleaz rspunsul limfocitelor n amestec. Specificitile alelice ale genelor CMH II au fost definite prin tipizare limfocitar i aparin locusurilor Dw i HLA-DP sau prin tipizare serologic i aparin locusurilor HLA-DP, DQ, DR.

Regiunea D este divizat n trei subregiuni funcionale majore, care codific moleculele DR, DQ i DP. In subregiunile DQ i DP se gsete o pereche de gene funcionale DQA1 i DQB1, respectiv DPA1 i DPB1, care codific cele dou catene ( i ) ale moleculei CMH II.

Subregiunea DR este mai complex. Ea conine o singur gen pentru sinteza catenei , DRA1 i una sau dou gene pentru sinteza catenei (DRB1, DRB3, DRB4 sau DRB5).Nr. alelelor DRA1 2

DRB1 184 DRB3 11 DRB4 8 DRB5 12 DQA1 18 DQB1 31 DPA1 10 DPB1 77

Ca i genele codificatoare ale moleculelor CMH I, genele codificatoare ale moleculelor CMH II sunt codominante. Se sintetizeaz astfel 8 variante biochimice de molecule CMH II (deoarece sunt dou gene codificatoare ale genei pentru mlecula HLA-DR).

Combinarea aleatorie a numrului mare de alele explic polimorfismul extensiv al moleculelor CMH ntr-o populaie uman. Numrul combinaiilor genice posibile ntre aceste alele este evaluat la circa 1090, un numr cu mult mai mare dect al indivizilor umani care coexist la un moment dat. In contextul existenei unui numr mare de gene alele codificatoare, posibilitatea ca doi indivizi nenrudii s aib proteine identice ale moleculelor CMH clasele I i II este mic. Nu exist doi indivizi identici pentru toate cele 6 variante de molecule CMH I i pentru cele 8 variante de molecule CMH II.

Moleculele CMH I i II au rolul de a lega peptidele antigenice. O variant molecular poate s lege un numr limitat de peptide antigenice(de ordinul milioanelor), dar probabilitatea unei potriviri spaiale crete mult prin existena a 6 variante de molecule CMH I i a 8 variante de molecule CMH II.

Peptidul antigenic este legat deosebit de stabil n situsul cavitar al moleculelor CMH I i II.

Evaluarea diferenelor antigenice ale moleculelor CMH

Fiecare organism are o specificitate antigenic proprie conferit de moleculele CMH clasa I. Diferenele antigenice dintre indivizii alotipici ai unei specii, dependente de moleculele CMH I se evalueaz serologic. Serul imun specific anti-molecule CMH se obine prin injectarea unei suspensii de leucocite, la un organism al aceleiai specii, diferit din punct de vedere genetic, adic un organism cu o alt combinaie de gene alele codificatoare ale moleculelor CMH I. Organismul receptor sintetizeaz anticorpi fa de antigenele HLA ale leucocitelor donorului, care se deosebesc de propriile sale molecule.

Specificitatea antigenic a unui organism poate s conste n prezena unei molecule antigenice pe sau n celulele sale, care nu exist pe sau n celulele altor organisme sau se datoreaz unor diferene structurale fine ale moleculelor de histocompatibilitate, prezente la toate organismele speciei, n variante genetice distincte.

Anticorpii anti-HLA se gsesc n serul femeilor multipare i se sintetizeaz ca rezultat al stimulrilor antigenice HLA de origine patern, exprimate pe celulele ftului, dar absente pe suprafaa celulelor organismului matern. Leucocitele ftului care strbat bariera placentar trec n circulaia matern i induc sinteza IgG, cu persisten ndelungat n circulaie.

O alt surs de ser imun anti-HLA o constituie pacienii politransfuzai. Astfel ei se imunizeaz fa de antigenele HLA alotipice de pe suprafaa leucocitelor donorilor de snge.

Antiserurile HLA se pot obine prin imunizarea voluntarilor.

Diferenele antigenice dintre doi indivizi, determinate de moleculele CMH clasa II-a se evalueaz prin capacitatea lor de a iniia reacia limfocitar mixt (RLM). Limfocitele de la doi indivizi ce poart alele diferite la locusul HLA-D sunt co-cultivate in vitro. Condiia reactivitii limfocitare este diferena unei singure alele la locusul ce codific aceste molecule.

Indivizii care au molecule CMH I identice nu reacioneaz serologic, dar dac celulele lor difer prin moleculele CMH II, codificate de alele diferite ale locusului HLA-D produc un rspuns intens n RLM.

ntr-un amestec de celule limfoide homozigote aa i bb se activeaz ambele populaii de limfocite, deoarece limfocitele aa reacioneaz fa de antigenul b, iar limfocitele bb se activeaz fa de antigenul a. Intr-un amestec de limfocite homozigote aa, cu populaia de limfocite heterozigote ab, rspund numai limfocitele aa. Rspunsul bidirecional apare i n amestecul limfocitelor ac i ab.

De obicei se evalueaz capacitatea limfocitelor receptorului de gref de a se activa fa de antigenele donorului i pentru a induce un rspuns unidirecional, populaia de limfocite a donorului este tratat cu mitomicin C (un inhibitor al sintezei ADN) sau este iradiat. Tratamentul nu modific imunogenitatea celulelor. Funcia stimulatoare a celulelor limfoide este restrns la celulele specializate prezentatoare de antigen, radiorezistente i care nu se divid in vitro. Rspunsul celulelor n RLM este orientat exclusiv fa de moleculele CMH I i II. Moleculele CMH II constituie un stimul primar esenial pentru RLM.

Moleculele CMH clasa I i II au rol esenial n elaborarea rspunsului imun, iar din punct de vedere antigenic, determin respingerea alogrefelor (grefe ntre indivizi ai aceleiai specii, dar aparinnd unor alotipuri diferite).

Distribuia tisular a moleculelor CMH I i II i semnificaia lor evolutiv

Moleculele CMH I se gsesc pe suprafaa majoritii esuturilor, pe celulele endoteliale ale capilarelor, iar leucocitele exprim cea mai nalt densitate a moleculelor CMH I: 1% din moleculele de suprafa ale membranei leucocitare sunt molecule HLA.

Moleculele CMH I au o densitate mai mic pe suprafaa celulelor hepatice, din plmn, rinichi i sunt foarte diluate pe suprafaa celulelor musculare i a celor mai multe glande endocrine (cu excepia suprarenalelor).

Moleculele CMH II sunt exprimate predominant, pe suprafaa limfocitelor B i pe celulele specializate pentru prelucrarea i prezentarea antigenelor: celulele seriei monocit-macrofag, celulele endoteliale ale capilarelor sanguine i limfatice, celulele Kupffer, celulele dendritice, eozinofile, microglia SNC.

Moleculele CMH lipsesc pe eritrocite, pe celulele endoteliului corneean, pe componenta exocrin a pancreasului, pe celulele acinare ale glandelor parotide, pe neuronii SNC, pe celulele endoteliale ale capilarelor SNC, pe esutul placentar.

n condiii normale, o form solubil de molecule HLA se gsete n plasm. Nivelul ei crete marcat n timpul infeciei virale, probabil datorit creterii ratei sintezei moleculelor HLA, stimulat de interferon i de alte citochine.

Intensitatea exprimrii noleculelor CMH II este variabil, fiind controlat de diferii factori: interferonul i IL-2, sintetizai de limfocitele T, amplific nivelul de exprimare a moleculelor CMH II, iar PGE2, glucocorticoizii, -fetoproteina, LPS din bacteriile Gram negative, diminu densitatea acestor molecule, avnd astfel rol imunosupresor.

Limfocitele B i celulele tumorale secret molecule CMH II.

Privit n perspectiva evoluiei, existena moleculelor CMH nu semnific respingerea grefelor de esuturi i organe, deoarece acestea nu se realizeaz n mod natural, ci au fost introduse n practica medical a ultimelor decenii. In sens evolutiv, existena moleculelor CMH ar putea fi atribuit necesitii organismelor de a semnaliza rapid, celulele care prezint molecule antigenice pe suprafaa lor: celulele infectate cu virusuri sau cele transformate malign. In acest context, moleculele CMH au o semnificaie deosebit: pentru supravieuirea organismului, liza celulelor purttoare de molecule nonself trebuie s fie rapid, nainte ca virusul s se multiplice i respectiv, nainte ca celula malign s se divid i s formeze o microtumor.

Pentru ca intervenia limfocitelor Tc s fie eficient, este necesar ca moleculele CMH s fie prezente pe oricare celul ce poate fi infectat de un virus sau poate s fie transformat malign. Pe de alt parte, moleculele CMH, al cror rol esenial este acela de a prezenta epitopii nonself, trebuie s permit aciunea eficient i rapid a limfocitelor Tc.

Moleculele CMH ndeplinesc i funcii neimune. Moleculele CMH I sunt componente ale receptorilor de hormoni. De exemplu, linia celular stabilizat Daudi nu exprim moleculele CMH I i nu are nici receptor pentru insulin, deoarece nu sintetizeaz 2-microglobulina.

RSPUNSUL IMUN

Organismul, ca sistem funcional este echilibrat atta timp ct informaia antigenic pe care o primete, este identic cu cea proprie. Fa de moleculele strine, care se abat de la modelul informaional propriu, sistemul imunitar rspunde prin activarea mecanismelor de recunoatere pentru a ndeprta moleculele nonself.

Ansamblul fenomenelor complexe n cascad, declanate de interaciunea specific a sistemului imunitar cu antigenul, n cursul crora celulele imunocompetente se activeaz, prolifereaz i se difereniaz n celule efectoare i celule de memorie, constituie rspunsul imun.

Funcionalitatea sistemului imunitar se suprapune parial, modelului general al arcului reflex, deoarece presupune existena unui flux informaional care corespunde unui excitant specific (Ag) fa de un receptor (limfocitele), o cale aferent (celulele care nglobeaz i prelucreaz Ag), un organ central (celulele limfoide dintr-un organ limfoid secundar) i efectorii rspunsului imun (anticorpi, celule efectoare).

Asemnrile dintre sistemul imunitar i sistemul nervos se extind i asupra altor particulariti:

- sistemul imunitar este dotat, ca i sistemul nervos, cu inteligen (capacitatea de a recepiona un numr mare de stimuli (adic de a recunoate un numr mare de determinani antigenici diferii) i de a prelucra informaie chimic. Sistemul nervos prelucreaz informaie senzorial, iar sistemul imunitar recunoate i prelucreaz informaie molecular. Inteligena sistemului imunitar se manifest discontinuu, n funcie de agresiunile antigenice asupra organismului;

- educaia sistemului imunitar (adic stocarea informaiei antigenice primit prin stimulri repetate), ca i n cazul sistemului nervos, ncepe dup natere;

- ambele sisteme nva prin experien, pentru c ambele sunt dotate cu memorie, care poate fi consolidat prin repetarea stimulului. Memoria ambelor sisteme este nscris n modificri moleculare persistente ale reelei, dar nu poate fi transmis la descendeni;

- ambele sisteme sunt organizate dup modelul unei complexe reele celulare i moleculare.

ntre cele dou sisteme exist i deosebiri: sistemul nervos recepioneaz stimuli de orice natur, care acioneaz la nivelul ntregului organism, iar sistemul imunitar recunoate i reacioneaz numai la stimuli de natur molecular, care tind s perturbe echilibrul chimic al organismului.

PARTICULARITILE GENERALE ALE RSPUNSULUI IMUN

Elaborarea rspunsului imun fa de o substan nonself este un proces fiziologic care se caracterizeaz printr-o mare eficien i suplee i are urmtoarele particulariti generale:

- funcia imun are caracter adaptativ, care decurge din orientarea specific a reaciilor sale fa de o substan nonself. Caracterul adaptativ al rspunsului imun implic mobilizarea unor celule preprogramate care ateapt s fie activate de un anumit antigen, corespunztor specificitii lor;

- caracterul foarte economic al funciei imunitare deriv din specificitatea aciunii sale. In timpul rspunsului imun se selecioneaz i se activeaz numai clonele de limfocite care au recunoscut specific epitopii antigenului, toate celelalte clone rmnnd disponibile pentru alte interaciuni;

- eficiena funciei imune deriv din caracterul foarte economic al mijloacelor celulare i moleculare pe care le mobilizeaz i din capacitatea de a amplifica efectorii si, pe dou ci;

a) proliferarea masiv (circa 8 generaii celulare) a celulelor selecionate sub aciunea stimulatoare a substanei nonself. Dup activare se produc modificri funcionale calitative ale acestor celule, de difereniere proliferativ i maturare, rezultatul fiind generarea celulelor efectoare cu mare capacitate de aciune i a celulelor de memorie;

b) celulele efectoare produc cantiti mari de molecule de recunoatere, sub forma receptorilor specifici fa de substana nonself;

- caracterul de reea a celulelor activate n rspunsul imun, conectate prin mediatori moleculari (interleuchine) i care condiioneaz eficiena rspunsului imun;

- celulele sistemului imunitar coopereaz stimulator cu numeroase alte categorii de celule, capabile la rndul lor s confere rezisten organismului. Cooperarea are loc, inclusiv cu factorii nespecifici (nscui) ai rezistenei (fagocitele, proteinele sistemului complement, molecule bactericide sau bacteriolitice din plasm);

- rspunsul imun adaptativ necesit o perioad de timp pentru activarea i proliferarea limfocitelor care au recunoscut antigenul, n timp ce reaciile neadaptative sunt prompte;

- rspunsul imun adaptativ asigur protecia organismului i a descendenilor si, prin transferul placentar al anticorpilor i prin secreia lactat;

- rspunsul imun adaptativ are o proprietate fundamental unic - memoria imun - consecin a experienei antigenice individuale, netransmisibil la descendeni.

Rspunsul imun este rezultatul cooperrii unui numr restrns de tipuri celulare i moleculare.

In funcie de predominana componentei celulare sau moleculare n compartimentul efector al rspunsului imun, se disting dou tipuri de reactivitate imunitar.

1. Rspunsul imun mediat humoral (RIMH), care se caracterizeaz n esen, prin sinteza anticorpilor ca molecule efectoare. Efectele RIMH sunt urmtoarele:

- neutralizarea toxinelor i a infeciozitii particulelor virale

- opsonizarea antigenelor celulare(bacterii, celule eucariote)

- legarea antigenelor moleculare n complexe Ag-Ac i eliminarea lor.

Imunitatea mediat humoral este transferabil de la un organism la altul prin intermediul serului. RIMH este protector fa de infeciile bacteriene (n special piogene), fa de reinfeciile virale i fa de antigenele moleculare pe care le neutralizeaz.

2. Rspunsul imun mediat celular (RIMC) se caracterizeaz prin aceea c, dup ptrunderea antigenului, de regul celular, sistemul imunitar mobilizeaz celule specializate, care atac antigenul int. Atacul se realizeaz fie prin contact celular direct ntre limfocitele T efectoare i celula int, fie prin mediatori moleculari.

Rspunsul imun mediat celular este declanat de antigene care se exprim pe suprafaa celulelor:

- antigene virale exprimate pe suprafaa celulelor infectate, n special dup infecia viral primar;

- antigene fungice;

- antigene exprimate pe suprafaa celulelor infectate de bacteriile cu localizare intracelular obligat (Rickettsia, Coxiella, Chlamydia) sau facultativ intracelular (M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, Brucella sp., Listeria monocytogenes, Francisella tularensis), n special n macrofage;

- antigenele tumorale;

- antigenele celulare din grefele de esuturi i organe alogenice.

Existena celor dou compartimente ale rspunsului imun este argumentat de rezultatele experimentale, dar i de observaiile clinice, adevrate experiene ale naturii, asupra unor indivizi cu afeciuni determinate de incapacitatea RIMH sau RIMC.

Sindromul Di George se caracterizeaz prin aplazia congenital a timusului i paratiroidelor. Bolnavilor le lipsete reactivitatea fa de antigenele care mobilizeaz IMC i de aceea sunt sensibili la infeciile virale, fungice i la cele produse de bacterii cu localizare intracelular. Sinteza i titrul Ig serice sunt normale.

Hipo- i agamaglobulinemia congenital de tip Bruton este o afeciune congenital determinat de gena tirozin-kinazei, situat pe cromosomul X, care afecteaz diferenierea celulelor limfoide B i produce imunodeficiena X lincat (Xid). Celulele B n snge sunt rare, dei numrul limfocitelor pre-B n mduva osoas nu este semnificativ redus, ceea ce sugereaz o moarte celular crescut la tranziia pre-B-B. Deficiena clinic const n incapacitatea de a sintetiza anticorpi i din aceast cauz, copiii, dup 3-6 luni de via, fac infecii repetate i recurente cu bacterii Gram pozitive i prezint manifestri ale maladiilor autoimune. Reactivitatea IMC rmne nemodificat, pentru c organismul i pstreaz rezistena fa de infeciile virale i fa de bacteriile Gram negative. Separarea celor dou compartimente ale rspunsului imun, humoral i celular, este artificial, deoarece ntre ele este o condiionare reciproc i profund: anticorpii au funcie opsonizant, favoriznd astfel IMC, iar pe de alt parte, IMC este mediat de numeroi factori solubili. Cele dou compartimente interacioneaz sinergic pentru producerea unui rspuns imun eficient. Totui, separarea este meninut deoarece reflect diferenele fundamentale ale mecanismelor de aciune ale celor dou populaii de limfocite: limfocitele B pentru RIMH i limfocitele T pentru RIMC.

Nici un antigen nu induce un rspuns imun pur, humoral sau celular. Totdeauna rspunsul imun este mixt, cu predominana unuia sau a celuilalt dintre compartimente.

ETAPELE RSPUNSULUI IMUN

Rspunsul imun este rezultatul succesiunii urmtoarelor etape:

- ptrunderea antigenului n organism i nglobarea lui de ctre celulele accesorii;

- prelucrarea antigenului i prezentarea epitopilor pe suprafaa celulelor accesorii;

- recunoaterea specific a componentelor nonself i activarea celulelor efectoare;

- producerea efectorilor rspunsului imun.

Ptrunderea antigenului n organism se realizeaz pe diferite ci:

- pe cale cutanat

- pe calea circulaiei sanguine

- pe calea mucoaselor(respiratorie, gastro-intestinal i urogenital).

Epiteliul tegumentar i mucoasele reprezint o suprafa foarte mare, expus la o mare diversitate de substane antigenice. Tegumentul este o barier mecanic fa de cele mai multe antigene, iar mucoasele sunt protejate, n primul rnd, de IgA din secreii. Epiteliul tegumentar i

epiteliile mucoaselor au rol n fenomenul excluderii antigenice. Schimbul liber ntre mediul extern i cel intern are loc numai n situaii patologice.

Elaborarea rspunsului imun este, n esen, rezultatul cooperrii a dou categorii de celule: celulele accesorii ale rspunsului imun i celulele limfoide.

Antigenul este recunoscut de celule specializate funcional i nglobat, cel mai adesea prin aciunea unor mecanisme nespecifice, de celulele accesorii, cu rolul de a prelucra i de a prezenta antigenul.

Celulele prezentatoare de antigen (CPA)

Celulele accesorii au rol esenial n elaborarea rspunsului imun, datorit capacitii lor de a ngloba substanele strine, de a le prelucra i de a le prezenta limfocitelor, de a fagocita celulele opsonizate i de a sintetiza substane imunomodulatoare. Prezentarea antigenului este treapta obligatorie care precede recunoaterea antigenelor proteice de ctre celulele T.

Orice celul care poart pe suprafaa ei molecule CMH poate s participe la elaborarea rspunsului imun. Celulele prezentatoare de antigen au urmtoarele proprieti: preiau antigenele, le internalizeaz i le prelucreaz; exprim moleculele CMH I i II; exprim moleculele de aderen care favorizeaz interaciunea cu limfocitele; produc molecule stimulatoare ale creterii i diferenierii limfocitelor T; elibereaz citochine.

Cele mai importante celule accesorii pentru elaborarea rspunsului imun sunt macrofagele. In vivo, macrofagul particip decisiv la procesul de imunogenez. Indiferent de calea de ptrundere n organism, antigenele sunt captate de celule accesorii, cel mai adesea, de macrofag.

Cea mai mare parte a antigenelor circulante sunt eliminate nainte de a declana rspunsul imun, n primul rnd de celulele Kupffer, localizate pe faa luminal a capilarelor sinusoide din ficat. La nivelul ficatului se elimin circa 90% din totalul antigenelor circulante (bacteriile care strbat bariera mucoasei digestive, endotoxinele absorbite la nivelul colonului, antigenele de origine alimentar).

Alte celule specializate, cu rol major n prezentarea antigenului sunt celulele dendritice i limfocitele B.

Celulele dendritice fac parte dintr-o familie care cuprinde urmtoarele tipuri de celule:

- celulele Langerhans, localizate n epiderm, dar i n mucoase(oral, nazal, esofagian, bronic, n mucoasa traheii)

- celulele cu voal, din limfa aferent

- celulele dendritice, din epiderm, din epiteliile mucoaselor, din organele limfoide i din snge

- celulele interdigitate, din aria paracortical a ganglionilor limfatici.

Originea acestor celule nu este cert, dar se admite urmtoarea filiaie: monocitul sanguin, celula Langerhans din epiderm, celula cu voal din limfa aferent ganglionului limfatic, celula dendritic din derm, din organele limfoide i din snge.

Celulele dendritice s-au izolat din organele limfoide i din snge, pe baza capacitii lor de a adera de suport (ceea ce permite eliminarea limfocitelor din amestec) i de a-i pierde aderena dup 24 de ore de cultivare. Rolul lor n prezentarea antigenului este argumentat de faptul c stimuleaz intens reacia limfocitar mixt.

Celulele dendritice au rol foarte important pentru iniierea rspunsului imun. Sunt larg distribuite n esuturile limfoide i nelimfoide la toate speciile de mamifere studiate. Precursorii celulelor dendritice i ai macrofagelor sunt localizai n mduva osoas, iar monocitul este un stadiu comun, nainte de diferenierea pe cele dou linii. Monocitul trece n snge, de unde se disemineaz n esuturile nelimfoide (epiderm, epiteliul tractului respirator, gastrointestinal, urogenital) i se difereniaz n celul dendritic. n tegument, celulele dendritice i celulele Langerhans formeaz o reea ramificat n tot epidermul. Ele au capaciti optime de captare i prelucrare a antigenelor, care ptrund pe cale tegumentar. Dup maturare, favorizat de citochinele produse local, migreaz din esuturile nelimfoide, n esuturile limfoide secundare. Migrarea din epitelii are loc pe cale limfatic, pn n ganglionii limfatici regionali, iar cele din spaiile interstiiale migreaz pe cale sanguin n splin. In timus, celulele dendritice prezint

complexele CMH-peptide, timocitelor care i dobndesc competena imunitar, pentru inducerea toleranei imune.

Celulele acestei familii nu au receptori pentru Fc i nici pentru C3, dar exprim la un nivel ridicat, moleculele CMH I i II.

Celulele Langerhans reprezint 2-8% din totalul celulelor epidermice i formeaz o reea printre cheratinocitele straturilor profunde. Ele reprezint celulele dendritice imature i exprim nivele mai mari de molecule CMH II. Sunt capabile s preia antigenul exogen prin intermediul moleculelor de suprafa, fiind celule prezentatoare de antigen foarte eficiente. Celulele Langerhans pot s prezinte antigenul local, n epiderm, sau pot s se mobilizeze, s prseasc stratul bazal i s migreze pe cale limfatic, pn n ganglionii regionali. In timpul migrrii, celulele au prelungiri membranare i se numesc celule cu voal. In ganglionul limfatic, ele se distribuie n aria paracortical(cortexul profund) i devin celule dendritice i celule interdigitate (o variant morfologic cu prelungiri mai scurte), avnd rol esenial n prezentarea antigenelor i activarea limfocitelor T. Celulele Langerhans, celulele cu voal i celulele interdigitate sunt stadii diferite ale liniei celulelor dendritice.

Celulele acestei familii nu au proprieti fagocitare. Totui, li se atribuie un rol important n procesul prelucrrii antigenelor. Antigenele rmn legate la nivelul membranei celulare i sunt prelucrate prin intermediul ectoproteazelor pe care le secret. Iradierea tegumentului cu raze UV duce la dispariia celulelor Langerhans.

Limfocitul B este celula efectoare a RIMH, dar are i rolul de captare i prezentare a antigenului specific. Eficiena sa n captarea antigenului este maxim, deoarece receptorul imunoglobulinic leag specific epitopii corespunztori chiar la concentraii foarte mici, de 1000 de ori mai mici dect cele necesare prezentrii sale de ctre macrofag sau de ctre celula dendritic.

Limfocitul B recunoate i prezint numai antigenele moleculare mici (peptide). Probabil c proteinele mari nu le sunt accesibile. Exist dovezi c antigenul peptidic legat la suprafaa limfocitului B, prin intermediul receptorului imunoglobulinic specific, este endocitat, prelucrat n compartimentul acid i prezentat n asociaie cu moleculele CMH II, pentru a fi recunoscut de limfocitele T. Limfocitele B exprim nivele relativ nalte ale moleculelor CMH II. Rolul lor de captare i eventual, prelucrare a antigenului este semnificativ la contactul secundar cu antigenul.

Cele mai importante celule, cu funcia de captare i prelucrare a antigenului sunt macrofagele i celulele dendritice.

Prima treapt a interaciunii antigenului exogen cu CPA (macrofag, celula dendritic) este legarea nespecific, necovalent, cu structuri nedeterminate ale suprafeei celulare. Antigenele din complexele imune sunt recunoscute de CPA prin intermediul receptorilor pentru Fc i C3.

Dup ce a ptruns n organism, antigenul este repede nglobat i depozitat n interiorul macrofagului. Scoaterea antigenului din circulaie are o semnificaie funcional deosebit, deoarece constituie un depozit din care este eliberat treptat i stimuleaz imunogeneza. Antigenul liber n organism poate s induc una din cele dou stri defavorabile pentru reactivitatea imunitar:

- poate fi eliminat prea rapid din organism, nainte de stimularea rspunsului imun;

- dozele prea mari de antigen liber sunt defavorabile reactivitii imunitare, prin blocarea rspunsului limfocitelor.

Starea caracterizat prin incapacitatea de rspuns imun a organismului se numete paralizie imunologic. Este o stare de blocare complet a reactivitii imunitare prin inundaie antigenic.

Antigenele moleculare sau particulate cu o bun imunogenitate sunt reinute parial n macrofag sub o form rezistent la degradare, pentru perioade mai lungi de timp.

Macrofagele modific imunogenitatea antigenelor: dup legarea de macrofag, cele slab imunogene devin mai imunogene, iar cele cu imunogenitate ridicat, dup legarea de macrofag i pierd parial aceast calitate.

Prelucrarea antigenelor

Prelucrarea antigenelor exogene este o etap obligatorie deoarece limfocitele T (Th i Tc) nu recunosc i nu preiau direct informaia antigenic nativ. Limfocitele T recunosc numai informaia antigenic prezentat pe suprafaa CPA. Celulele accesorii ale rspunsului imun

prelucreaz antigenele moleculare mari i pe cele particulate. Din punct de vedere biochimic, prelucrarea semnific deplierea, clivarea proteinelor i generarea peptidelor, ca rezultat al unei proteolize pariale. Prelucrarea antigenului exogen de ctre celulele prezentatoare, parcurge urmtoarele etape: internalizarea antigenului n veziculele membranare acide; proteoliza parial; cuplarea cu moleculele CMH; transportul la nivelul membranei plasmatice.

Gradul prelucrrii antigenului este dependent de natura sa. Intervalul de prelucrare este de 45-60 minute. Durata s-a determinat prin inactivarea metabolic a macrofagelor cu paraformaldehid, la diferite intervale de timp dup contactul cu antigenul.

Experienele cu antigen marcat au evideniat c n CPA, materialul imunogen are dou destinaii: o parte este expus pe suprafaa celulei i este recunoscut de celulele T, iar o alt parte este sechestrat n celul, de unde este eliminat activ n mediul extracelular i este preluat de alte CPA.

Principalul mecanism degradativ care are loc n CPA este proteoliza lizosomal. Concluzia a fost dedus experimental: amoniacul i cloroquina (substane lizosomotrope) se acumuleaz n lizosomi i blocheaz activitatea enzimelor prin creterea pH lizosomal. Macrofagele astfel tratate sunt incapabile s prezinte antigenele proteice sau bacteriene. Cloroquina blocheaz numai etapa prelucrrii antigenului, dar nu i recunoaterea sa de ctre limfocitele T, deoarece administrarea ei dup o or de la contactul macrofagelor cu antigenul, a rmas fr efect. Cloroquina a blocat prezentarea antigenului de ctre celulele dendritice, dei ele nu sunt fagocitare in vitro i au un echipament lizosomal puin dezvoltat. S-a dedus c ele prelucreaz antigenul la suprafa, prin intermediul ectoproteazelor membranare, dei nu exist dovezi directe n acest sens.

Prezentarea antigenelor i asocierea cu moleculele CMH I nu este sensibil la aciunea substanelor lizosomotrope alcalinizante.

Proteinazele cisteinice (funcioneaz prin intermediari covaleni enzim-substrat) sunt importante pentru prelucrarea antigenelor proteice, aa cum s-a demonstrat cu antigene sintetice.

Proteoliza rapid i extensiv este cauza slabei imunogeniti a unor antigene (sau chiar a absenei imunogenitii). Unele antigene sintetice (copolimerul L-acid glutamic-L-alanin) sunt mult mai imunogene dup inhibarea aciunii proteinazelor cisteinice.

Mecanismele moleculare ale prelucrrii antigenelor sunt puin cunoscute. In macrofage se produce o digestie selectiv a antigenului, n urma creia o parte din epitopi se pstreaz, dar cea mai mare parte a antigenului este complet degradat.

Complexitatea antigenului condiioneaz numrul de peptide cu rol de epitopi, care deriv prin procesul de prelucrare i care pot fi legate de moleculele CMH. Dac antigenul este o bacterie, numrul de epitopi este nedeterminat i specificitatea lor antigenic este variabil, n funcie de complexitatea aparatului enzimatic hidrolitic al celulei care prelucreaz antigenul.

Nu toate antigenele necesit proteoliza (fragmentarea) prealabil recunoaterii de ctre celulele T. Uneori este suficient numai denaturarea (deplierea) proteinelor pentru ca antigenul s fie prezentat de CPA, chiar tratate cu cloroquin.

Forma sub care limfocitele T recunosc antigenele, depinde att de natura CPA, dar n special de natura antigenului.

Majoritatea proteinelor sunt rapid endocitate i prelucrate, dar unele sunt legate de membrana celulei i prezentate n stare nativ, fr o prelucrare prealabil. Antigenele peptidice mici (insulina, angiotensina) pot fi recunoscute n form nativ, de unele subpopulaii de limfocite T, n timp ce altele recunosc formele prelucrate ale acelorai antigene.

Dimensiunea i configuraia spaial a moleculei de antigen sunt hotrtoare n ceea ce privete gradul prelucrrii sale, nainte de a fi prezentat. De regul, moleculele mari necesit prelucrarea prealabil, iar cele mici sunt prezentate n form nativ.

Forma chimic a antigenului, dup prelucrare, nu este cunoscut cu certitudine. Foarte probabil, este un polipeptid de dimensiuni mici (9-20 aminoacizi).

Dup ali autori, prelucrarea nu este necesar pentru ca antigenul s fie prezentat limfocitelor T, dar totdeauna este necesar conversia sa la o form care s-i permit interaciunea cu moleculele CMH II ale CPA i cu receptorii limfocitelor T. Dovada este adus de faptul c liposomii cu molecule CMH II inserate n stratul lipidic, la care s-au ataat o varietate de antigene proteice native, stimuleaz clonele de limfocite T in vitro, n absena complet a CPA.

Epitopii antigenelor peptidice exogene sunt expui la suprafaa CPA, n asociaie cu moleculele CMH clasa II, iar epitopii antigenelor de origine endogen sunt prezentai n asociaie cu moleculele CMH clasa I.

Rolul moleculelor CMH n prezentarea antigenelor

Rspunsul imun este rezultatul interaciunilor complexe ntre celulele care prezint antigenele i limfocitele T i B.

Prezentarea antigenelor este o etap obligatorie a elaborrii rspunsului imun, ce deriv din faptul c limfocitele nu interacioneaz direct cu antigenele n stare nativ, ci numai dup ce acestea au fost prelucrate i prezentate pe suprafaa unei celule.

Moleculele CMH ndeplinesc funcia de prezentare a antigenelor i au un rol esenial n declanarea rspunsului imun.

Pentru a deveni disponibili interaciunii cu receptorii de antigen ai limfocitelor, epitopii sunt asociai intracelular, cu moleculele CMH I sau II i sunt transportai la suprafaa CPA ca fragmente peptidice sau ca proteine intacte, n funcie de natura i de mrimea antigenului. Fig. 56. Prelucrarea i prezentarea antigenului exogen, n asociaie cu moleculele CMH II. Moleculele CMH II, cu catena invariant, sunt asamblate n reticulul endoplasmic (RE) i transportate prin reeaua Golgi, de unde sunt orientate spre vezicula endosomal, care conine protein degradat parial, derivat din antigenul exogen. Degradarea catenei invariante, face posibil asocierea peptidului antigenic cu molecula dimeric (DM). Complexul este transportat la suprafaa celulei i este recunoscut de limfocitele Th.

Moleculele CMH I i II au capacitatea funcional de a lega i de a expune pe suprafaa celulei, un numr neli-mitat de peptide diferite. Complexul format de mo-leculele CMH I sau II i epitopul peptidic este recu-noscut de limfocitele T.

Nu se cunoate modalitatea interaciunii dintre moleculele CMH i epitopii antigenici. Ar putea fi o interaciune ferm sau moleculele CMH au numai rolul de suport pentru epitopii antigenici.

Se accept ideia unei ierarhii a epitopilor cu privire la ordinea legrii competitive de moleculele CMH, dato-rit sensibilitii diferen-iate la proteaze. Rezult peptide cu afinitate diferit fa de situsul de legare a moleculelor CMH. Astfel, exist epitopi dominani, care se asociaz cu mare probabilitate de molecu-lele CMH, epitopi subdominani, cu mai puine anse de asociere cu moleculele CMH i epitopi criptici, care se asociaz rareori n complexe cu moleculele CMH i care nu devin accesibili limfocitelor T potenial reactive.

Antigenele exogene sunt prezentate n asociaie cu moleculele CMH II

Moleculele CMH II leag peptide derivate din proteinele exogene endocitate de celule: proteine solubile, proteine ale capsidei virale, proteine bacteriene sau proteine ale protozoarelor endocitate de celul. In vitro, s-a demonstrat c moleculele CMH II purificate, leag suficient de stabil o molecul peptidic, pentru a fi izolate mpreun prin gel-filtrare.

Antigenele exogene sunt nglobate i prelucrate n fagolizosomii celulelor prezentatoare de antigen (CPA). Moleculele CMH II se sintetizeaz n reticulul endoplasmic granular i sunt modificate post-traducere, n cisternele Golgi. Cele dou catene ale moleculei sunt reunite prin catena invariant. Asocierea este meninut pn cnd moleculele CMH II ajung n sistemul endocitar al celulei. In drumul lor spre suprafaa celulei, moleculele CMH II ajung prin fuziunea veziculei transportoare, n compartimentul fagolizosomului ce conine antigenul parial degradat. La acest nivel este eliminat catena invariant ce reunete catenele i i care ocup situsul de legare a antigenului. Moleculele CMH II se asociaz cu peptidul antigenic de 13-25 aminoacizi. Complexul format este expus la nivelul membranei, unde este recunoscut de limfocitele TCD4. Situsul de legare al moleculei CMH II este o cavitate format prin -plierea domeniilor -1 i 1, delimitat de secvenele -helicale ale domeniilor -1 i -1. Complexul format este recunoscut de limfocitele TCD4. Fig. 57. Reprezentarea schematic a asocierii moleculelor CMH II cu peptidul antigenic (dup Cresswell, 1994).

Moleculele CMH II au funcia fundamental de a stimula elaborarea rspunsului imun specific fa de antigenele exogene, prin intermediul limfocitelor TCD4. Limfocitele TCD4 secret IL-2, IL-4, IL-5, IFN , cu efect stimulator fa de limfocitele Tc i B.

Asocierea unui peptid nonself cu moleculele CMH II semnific cererea de ajutor pentru eliminarea antigenului, materializat n activarea limfocitelor TCD4 i secreia de limfochine stimulatoare ale rspunsului imun.

Moleculele CMH II au rol esenial pentru stimularea rspunsului imun, dar i pentru reglarea intensitii sale. Interaciunea moleculelor CMH II cu epitopii antigenici nu este specific.

Deoarece moleculele CMH sunt polimorfe, exist diferene, uneori importante, ntre organismele outbred ale unei specii de a rspunde la un antigen. Astfel se explic diferenele individuale de sensibilitate fa de un agent infecios. Un rspuns imun mai amplu, este generat de un organism care expune mai muli epitopi antigenici diferii, asociai cu diferitele variante de molecule CMH II, comparativ cu un organism care expune mai puine fragmente antigenice asociate cu 1 sau 2 tipuri de molecule CMH II.

Antigenele endogene sunt prezentate n asociaie cu moleculele CMH I

Rolul moleculelor CMH n procesul recunoaterii antigenelor care se sintetizeaz n interiorul celulei (proteine endogene), a fost demonstrat de Zinckernagel i Doherty (1974), pentru antigenele virale, n experiene de genul urmtor:

- oarecii liniei inbred D au fost inoculai cu virusul coriomeningitei limfocitare (cu specificitate antigenic A), pentru a stimula proliferarea limfocitelor Tc fa de celulele infectate cu acest virus;

- culturile de fibroblaste de la embrionii liniei D se infecteaz cu varianta antigenic A i respectiv B, iar fibroblastele liniei K se infecteaz cu varianta antigenic A;

- limfocitele Tc ale organismelor liniei D, stimulate cu virusul A, recunosc i lizeaz, in vitro, fibroblastele liniei D, infectate cu varianta antigenic A, dar nu recunosc i nu lizeaz fibroblatele liniei D infectate cu varianta antigenic B i nici fibroblastele liniei K, infectate cu varianta antigenic A.

Concluzia a fost c nucleoproteinele citosolice virale, sintetizate n celul, pot deveni inta celulelor Tc, dup ce sunt expuse ca un peptid prelucrat, n asociaie cu moleculele CMH I ale celulei infectate. Pe baza acestei concluzii s-a stabilit principiul general c proteinele intracelulare (care nu sunt destinate membranei citoplasmatice), pot s-i semnaleze prezena n raport cu celulele T, prin expunerea asociat cu moleculele CMH I. Rezultatele au fost extrapolate i pentru categoria larg a antigenelor exogene. Fig. 58. Aciunea limfocitelor Tc este restrictiv n raport cu moleculele CMH I, deoarece celula Tc recunoate att antigenul specific, ct i molecula CMH I. Amnunte n text.

Recunoaterea asociat a antigenelor cu moleculele CMH I sau II are dou semnificaii majore:

- celulele sistemului imunitar interacioneaz cu proteinele proprii, numai dac acestea sunt asociate cu un determinant antigenic nonself, de origine viral, tumoral sau indus de ageni chimici;

- recunoaterea antigenului este condiionat de existena fenomenului de histocompatibilitate, adic celulele care prezint antigenul i cele care l recunosc (limfocitele Tc i Th) trebuie s poarte molecule CMH identice, adic celulele care interacioneaz trebuie s aparin aceluiai organism sau unor organisme genetic identice(ale aceleiai linii inbred). Acesta este fenomenul de restricie (limitare) a interaciunilor celulare prin moleculele CMH.

Moleculele CMH I au rolul de a lega i de a prezenta proteine self, peptide derivate din catabolismul proteinelor citosolice, antigene bacteriene sau ale paraziilor intracelulari, antigene virale sintetizate n celul prin traducerea unui ARNm viral, antigene tumorale sau antigene a cror sintez a fost indus de ageni chimici. Dup asocierea cu epitopi antigenici, moleculele CMH I devin inta atacului limfocitelor TCD8.

Limfocitele Tc sunt implicate, n primul rnd, n recunoaterea i eliminarea celulelor infectate cu virusuri sau a celor transformate malign. Ambele tipuri de antigene sunt sintetizate n celul i sunt considerate ca avnd origine endogen.

Evenimentele celulare al cror rezultat este prezentarea peptidelor, se succed n urmtoarele trepte:

- catabolismul antigenului proteic (n citoplasm)

- transportul peptidului din citosol, n cisternele reticulului endoplasmic

- asamblarea complexului format din peptid i molecule CMH I

- transportul complexului la suprafaa celulei.

Antigenele endogene se asociaz cu moleculele CMH I, chiar n cisternele reticulului endoplasmic granular. La acest nivel, moleculele CMH II sunt inaccesibile asocierii cu epitopii antigenici, deoarece catenele i sunt reunite prin catena invariant.

Prezentarea antigenelor endogene, asociate cu moleculele CMH I nu este sensibil la aciunea agenilor lizosomotropi alcalinizani (amoniac, cloroquin), dar este sensibil la derivaii peptidici(di- sau tripeptide aldehidice) care inhib proteasomul. Proteasomul este un complex proteic multicatalitic, compus din mai multe subuniti inelare suprapuse, asamblate ntr-o structur cilindric, n care se produce proteoliza moleculelor proteice citosolice conjugate cu ubicvitina. Proteasomul este o structur care controleaz turn-overul proteinelor citosolice, inclusiv al factorilor de transcriere i al ciclinelor. Ubicvitina este un polipeptid mic, care este asociat pe cale enzimatic dependent de ATP, de lizina proteinelor citosolice. Legarea ubicvitinei produce deplierea proteinei int i asigur recunoaterea de ctre elementele complexului proteasomic citosolic. Proteinele celulare modificate dup cuplarea cu ubiquitina, devin sensibile la proteoliz. Proteoliza are loc n mediul apos al structurii cilindrice i este independent de ATP. Astfel sunt protejai constituienii celulari de degradarea necontrolat. Peptidele rezultate n proteasom sunt foarte rapid degradate n citoplasm. De aceea s-a presupus c ele se asociaz cu proteinele chaperone, cu rol protector i de orientare a peptidelor n lumenul reticulului endoplasmic. Fig. 59. Prelucrarea i prezentarea antigenului endogen, de ctre moleculele CMH I. Proteinele citosolice sunt degradate de complexul proteosomic, n peptide care sunt transportate n reticulul endoplasmic (RE). La acest nivel, -2 m induce diso-cierea catenei H de proteina chaperone (calnexina). Se asambleaz molecula CMH I i se asociaz cu peptidul antigenic. Complexul peptid-CMH I se elibereaz din asocierea cu transportorul TAP, traverseaz cisternele Golgi i se exprim pe suprafaa celulei, gata s fie recunoscut de RCT. Celulele deficiente n TAP1/2 nu elibereaz peptidele pentru a se asocia cu moleculele clasa I i nu pot exercita efectul citotoxic asupra intei (dup Roitt, 1997).

Fig. 60. Formarea complexului CMH I-peptid n cisternele RE.

Peptidele rezultate din pre-lucrarea antigenelor endogene sunt transportate n reticulul endoplasmic, de o categorie de proteine transportoare, denumite TAP (pro-teine transportoare asociate cu prezentarea antigenului) care folo-sesc energia rezultat din hidroliza ATP, pentru a transporta prin membrane diferite proteine, ioni, antibiotice. Molecula TAP este un heterodimer, format din dou subuniti (TAP1 i TAP2). Fiecare subunitate are o regiune hidrofob N-terminal transmembranar i un domeniu C-terminal ce leag ATP. Moleculele TAP au capacitatea de a transloca peptidele prin membrana RE.

Catenele moleculei CMH I se sintetizeaz separat pe cisternele RE i odat cu traducerea sunt transportate n RE. Catena H, -2 m i peptidul se asambleaz ntr-un complex, chiar n cisternele RE sau n compartimentul pregolgian. n cisternele Golgi, catena H este glicozilat, iar complexul CMH I-peptid este ancorat n membran i expus la suprafaa celulei. Moleculele CMH I leag peptide mici, de 8-10 aminoacizi. Specificitatea de legare este larg. Molecule CMH I identice leag peptide diferite.

Liniile celulare care nu sintetizeaz -2 m, nu exprim molecule CMH I pe suprafaa lor. Acesta este un exemplu al funciei de control de calitate pe care l are RE. Moleculele CMH pliate incorect nu sunt transportate la nivelul membranei, ci rmn n cisternele RE i sunt degradate. Absena -2 m determin plierea greit i degradarea catenei mari. Controlul de calitate este mediat de un set de proteine chaperone, care se asociaz reversibil cu proteinele pliate incorect i astfel permit corectarea greelii de pliere.

La nivel membranar, complexul molecular este recunoscut de limfocitele Tc i rezultatul interaciunii este liza celulei int.

Moleculele CMH I nu disting ntre peptidele self i nonself. Peptidele asociate cu moleculele CMH I au fost izolate, fracionate prin HPLC (high-performance liquid chromatography) i secveniate. Fiecare celul expune pe suprafa , sute de peptide, cele mai multe fiind proteine citosolice autologe.

Asocierea moleculei CMH I cu un peptid nonself pe suprafaa celulei, semnific necesitatea distrugerii celulei int. Dovada n favoarea acestei ipoteze este adus de faptul c, in vivo, situsul de legare al moleculelor CMH I este ocupat de peptide self, adic fragmente ale proteinelor proprii, pe care celulele le capteaz din spaiul interstiial sau le produc n proteasom i le prezint ca i pe cele nonself.

Dup disocierea peptidului, molecula CMH I goal expus la suprafaa celulei, este instabil.

Faptul c situsul de legare al moleculelor CMH I este ocupat de peptide self, este n acord cu teoria supravegherii imune, conform creia, celulele killer i limfocitele Tc controleaz permanent suprafaa celulelor organismului, pentru a detecta eventuala apariie a antigenelor tumorale sau virale. Celulele care exprim pe suprafaa lor molecule nonself, sunt eliminate prompt.

Deoarece celulele prelucreaz i prezint continuu molecule proprii, celulele sistemului imunitar sunt stimulate permanent. Limfocitele controleaz calitatea moleculelor CMH I i detecteaz celulele ce prezint molecule alterate sau molecule nonself.

Indivizii umani deficieni ai moleculelor CMH I, nu par a avea o inciden crescut a infeciilor virale severe, ceea ce sugereaz existena i a altor mecanisme de recunoatere a moleculelor nonself, neasociate cu moleculele CMH I. Fig. 61. Reprezentarea schematic a moleculelor CD4 i CD8.

Modelul recunoaterii antigenuluide ctre limfocitele T

Recunoaterea antigenului de ctre limfocitele T este mediat n primul rnd, de receptorul de antigen (RCT). Secvenele hipervariabile ale lanurilor i formeaz regiunile determinante de comple-mentaritate (RDC 1 i RDC 2). Buclele RDC 1 i RDC 2 ale regiunilor variabile (V) i ale RCT, interacioneaz cu regiunea helical a moleculei CMH, iar cele dou secvene RDC 3, interacioneaz cu peptidul antigenic.

Interaciunea limfocitului cu celula prezentatoare de antigen este mediat i de alte molecule.

Limfocitele Tc prezint pe suprafaa lor, markerul CD8 i recunosc antigenele asociate cu moleculele CMH I, iar limfocitele Th prezint markerul CD4 i recunosc antigenele asociate cu moleculele CMH II. Moleculele CD4 i CD8 sunt proteine membranare, monomorfe, participante la recunoaterea complexelor CMH-peptide, de pe suprafaa celulelor int.

Domeniile lor extracelulare, prin secvena aminoacizilor, se aseamn cu domeniile imunoglobulinelor.

Molecula CD4 este monomeric i este pliat n 4 domenii extracelulare, omologe cu ale moleculei de Ig, stabilizate prin puni S-S.

CD8 este o protein dimeric, iar conformaia sa spaial prezint un domeniu asemntor domeniului variabil al moleculei de imunoglobulin.

n procesul recunoaterii antigenului, molecula CD8 se asociaz cu domeniul constant -3, al moleculei CMH clasa I, iar molecula CD4 se asociaz cu domeniile constante -2 sau -2 ale moleculei CMH clasa II-a.

Moleculele CD8 i CD4 sunt importante nu numai pentru orientarea limfocitelor spre intele adecvate, dar au i rol n transducerea semnalului, deoarece cozile lor citosolice leag o tirozinkinaz, cu rol esenial n transmiterea semnalului activator al limfocitului T.

Receptorul de antigen al limfocitelor T recunoate fragmentele peptidice complexate cu moleculele CMH I sau II. Pentru fiecare organism, diversitatea moleculelor CMH este limitat, dar ele leag o larg varietate de peptide scurte (8-9 aminoacizi, pentru moleculele CMH I i circa 14 aminoacizi, pentru moleculele CMH II). Dei nu este o legare pe baza specificitii, interaciunea peptidului antigenic cu moleculele CMH este caracterizat de o afinitate nalt, deoarece se stabilete cu gruprile NH2 i COOH de la extremitatea peptidului, restul secvenei de aminoacizi rmnnd disponibili pentru interaciunea cu RCT. Fig. 62. Diagrama domeniilor extracelulare ale moleculelor CMH clasa I (sus) i clasa II (jos). Situsurile de legare ale celor dou clase de molecule au configuraii tridimensionale asemntoare i sunt ocupate de peptidul rezident self sau nonself (dup Roitt, 1993).

Deoarece moleculele CMH I i II leag peptide scurte, epitopii celulelor T sunt alctuii din secvene peptidice lineare, adic configuraia epitopilor nu este dependent de conformaia proteinei native. Deoarece epitopii recunoscui de limfocitele T sunt peptide scurte, rezult c prelucrarea proteolitic a antigenelor este o etap obligatorie, care precede interaciunea lor cu limfocitele T.

Prezentarea antigenelor asociate cu moleculele CD1

Antigenele nepeptidice sunt prezentate celulelor T, prin alte mecanisme. Moleculele CD1 se aseamn structural cu moleculele CMH I. Ele prezint antigenele n asociaie cu domeniile hidrofobe, care formeaz caviti, capabile s lege antigenele lipidice i glico-peptidice. n aceast asociaie, antigenele sunt recunoscute de limfocitele T. Se cunosc 4 izo-forme distincte de molecule CD1 (CD1a, -b, -c, -d), codificate de 5 gene situate pe cromosomul 1. Prezentarea antigenelor lipidice n asociaie cu moleculele CD1 este sensibil la agenii de acidificare a endosomului (cloroquin, concana-micin A). Probabil, asocierea antigenelor lipidice cu cu CD1 se produce n compartimentul endo-somal acid.

Moleculele CD1 sunt impor-tante pentru reaciile de aprare anti-infecioas, pentru c ele prezint antigenele de micobacterii (acidul micolic, lipoarabinomananul), celulelor T.

Calea CD1 de prezentare a antigenelor se aseamn cu cile de prezentare a antigenelor peptidice n asociaie cu moleculele CMH I i II. CD1 este asemntoare din punct de vedere structural, cu moleculele CMH I, dar asocierea cu antigenul are loc n endosomul lipidic. Prezentarea antigenelor n asociaie cu moleculele CD1 este considerat ca o cale distinct.

Activarea limfocitelor T

Fig. 63. Moleculele CMH regleaz rspunsul imun. a. O celul T citotoxic (CD8) recunoate peptidul n asociaie cu o molecul CMH clasa I, pe suprafaa unei celule infectate cu un virus.

b. O celul T helper (CD4) recunoate peptidul antigenic asociat cu o molecul CMH clasa II, pe suprafaa unei celule prezentatoare de antigen (CPA). Epitopii antigenici sunt recunoscui de RCT, dar la procesul recunoaterii particip i moleculele CD8 i respectiv CD4. CD8 recunoate domeniul -3 al moleculei CMH I, iar CD4 se leag de domeniile -2--2 ale moleculei CMH II.

Cel puin trei molecule distincte sau complexe moleculare, fizic independente, ale membranei au rol n transducerea eficient a semnalului activator al celulei T, fiecare fiind asociat cu o activitate enzimatic relevant:

- RCT1 - i complexul CD3 (--). Partea invariant a RCT este asociat cu tirozin-chinaza p59fyn;

- coreceptorii CD4 sau CD8, asociai cu tirozin-chinaza p56lck;

- CD45, cu activitate fosfatazic tirozin-specific.

Limfocitele T mature cu RCT - sunt CD4 sau CD8. Celulele TCD4 recunosc fragmentele peptidice legate de moleculele CMH II, iar celulele TCD8 recunosc fragmentele peptidice legate de moleculele CMH I. Aceast specificitate a condus la sugestia c molecula CD4 poate s lege molecula CMH II, iar molecula CD8 leag molecula CMH I, ambele avnd rol de coreceptori de antigen. Fig. 64. a. Suprafamilia genelor care codific imunoglobulinele i diferite alte molecule cu rol n recunoaterea intercelular. Toate aceste molecule au o structur asemntoare. Familia moleculelor multigenice, cu rol n recunoaterea antigenului cuprinde imunoglobulinele, RCT, moleculele CMH I i II.

b. Familia moleculelor monogenice cuprinde molecula Thy (exprimat pe celulele T i pe neuroni), receptorii de poli-Ig (transport IgA prin epiteliul mucoaselor), N-CAM (o molecul de aderen a neuronilor), CD4, CD8, precum i alte proteine (o protein plasmatic uman, o protein neurocitoplasmatic) (dup Roitt, 1997).

Coreceptorii CD4 i CD8 sunt glicoproteine trans-membranare. Fiecare este aso-ciat cu o molecul de tirozin-kinaz specific celulei T, p56lck. In procesul activrii celulei T de ctre antigen, coreceptorul trebuie s se lege de aceiai molecul CMH ca i RCT, pentru transducerea optim a semnalului. Inter-aciunea faciliteaz transmi-terea semnalului activator cu o eficien de pn la 300 de ori mai mare.

CD4 i CD8 sunt mem-bre ale suprafamiliei imuno-globulinelor. Dei ambele au rol de coreceptori i se asociaz cu aceiai tirozin-kinaz (p56lck), nu au omologie structural.

Studiile de cristalografie cu raze X au artat c domeniul extern al moleculei CD4 formeaz o protruzie pe faa lateral a moleculei, implicat n legarea moleculei CMH II.

Molecula CD8 este format din dou catene diferite ( i ) i are un singur domeniu de omologie cu molecula de Ig, la captul amino. Acesta este urmat de o secven cu configuraie nedefinit i cuprinde resturile de cistein care permit legarea moleculelor n dimeri funcionali. Molecula CD8 are rol de coreceptor, participnd la recunoaterea antigenului, prin asocierea cu domeniul -3 al moleculei CMH I. Fig. 65. Diferite aranjamente ale RCT i ale co-receptorilor si sunt determinate de izoformele lui CD45 exprimate pe celula T. Pe celulele neangajate, CD4, CD45 i RCT migreaz independent pe suprafaa celulei. Pe celulele T de memorie, cele trei molecule sunt asociate. Pe celulele Th2 clonate, o izoform de CD45 cu gr. mol mic, se leag de CD4, dar acest complex nu se asociaz cu RCT. Activarea optim a celulei are loc n cazul n care cele trei molecule sunt asociate strns pe suprafaa limfocitului (dup Janeway, 1997).

Coreceptorii se asociaz fizic cu RCT n timpul activrii celulei T.

Molecula CD45 este o fosfataz transmembranar tirozin-specific. Este un antigen leucocitar, prezent pe toate celulele de origine hematopoietic, alctuit dintr-un domeniu extern variabil i un domeniu citoplasmatic constant ce const din dou subdomenii cu activitate fosfatazic tirozin-specific.

CD45 prezint mai multe izoforme, care variaz cu tipul celular. Varia-bilitatea rezult din clivarea alternativ a ARNm. Celulele T i schimb izoforma de CD45 n timpul activrii i dup activare. Pe limfocitele T neangajate, izoformele de CD45 sunt toate cu greutate molecular mare, iar celulele T activate sau de memorie exprim o variant a CD45 cu greutate molecular mic.

Izoformele distincte se asociaz n mod diferit cu celelalte componente ale complexului la celulele neangajate i la cele de memorie, modificnd eficiena transmiterii semnalului de activare.

Limfocitele TCD4 recunosc com-plexul molecular CMH II-epitop, expus la suprafaa celulei prezentatoare de antigen (CPA) i se activeaz. Limfocitul activat secret IL-2, o interleuchin esenial pentru expansiunea clonal a limfocitelor TCD4 i amplificarea rspunsului imun. Amplificarea rspunsului imun parcurge mai multe etape: Fig. 66. Mecanismul activrii celulei T.

- dup legarea limfocitului TCD4 de CPA, ultima produce IL-1;

- stimuleaz limfocitul TCD4 s produc IL-2. IL-2 acioneaz stimulator asupra celulelor care o produc (bucl autocrin) i asupra limfocitelor nvecinate, care au aceiai specificitate a receptorului de antigen (aciune paracrin), efectul fiind exprimarea intens a receptorilor pentru IL-2 pe suprafaa limfocitelor stimulate;

- limfocitele TCD4 activate de IL-2 prolifereaz i genereaz o populaie de celule imunoreactive, Th1 i Th2, care la rndul lor, prin intermediul interleuchinelor pe care le secret, au efecte activatoare asupra compartimentului imunitii celulare sau stimuleaz activarea i proliferarea limfocitelor B specifice, n funcie de natura antigenului. Fig. 67. Amplificarea rspunsului imun.

Pentru ca epitopii s fie recunoscui, moleculele CMH trebuie s expun simultan pe suprafaa celulei, un numr mare de peptide nonself, pentru un interval suficient, astfel nct s permit limfocitelor T s controleze calitatea moleculelor CMH ale fiecrei celule.

Timpul de generaie al unei celule T, dup stimularea antigenic poate fi de 4,5 ore, adic ntr-o sptmn, dintr-o singur celul T pot s rezulte 1012 celule, ceea ce ar nsemna dublarea numrului de limfocite T n organism. O protein de dimensiuni medii, cu 2-10 epitopi, poate fi recunoscut de 10-1000 celule neangajate, n funcie de capacitatea moleculelor CMH de a prezenta epitopii peptidici. Consecutiv unei infecii virale, numrul celulelor CD8 cu specificitate fa de antigenele virale, la oarece poate s creasc de 10 ori.

Durata de via a limfocitelor T este greu de evaluat, dar moartea lor prin apoptoz este declanat de IL-2 i de antigen. Dup stimularea ciclului celular sub aciunea antigenului, limfocitele T devin foarte sensibile la apoptoz. Proliferarea celulelor T este stimulat dup ce IL-2 se fixeaz pe receptorul specific. Dup unul sau cteva cicluri, limfocitele T n faza G1 sau

S, devin foarte sensibile la apoptoz. Aa se explic moartea hibridoamelor T ca rspuns la legarea ncruciat a RCT.

Apoptoza celulelor T este declanat n dou situaii: sub aciunea stimulatoare a antigenului i n absena limfochinelor.

Rspunsul celulelor T la antigen se desfoar n dou faze, cu evenimente moleculare distincte: faza de activare i cea de proliferare.

Faza de activare const n inducerea genelor pentru sinteza IL-2 i a receptorului de mare afinitate pentru IL-2. In aceast faz, apoptoza este practic absent. Faza de proliferare a limfocitelor T este iniiat de fixarea IL-2 pe receptorul su. Dup ce celulele T au parcurs unul sau cteva cicluri celulare i intr n faza G1 sau S, devin foarte sensibile la apoptoz. Factorul esenial al apoptozei este IL-2.

Conceptul controlului feed-back al intensitii rspunsului imun prin fenomenul apoptozei (reglarea propriocid) s-a nscut din nevoia de a explica acest nou rol al IL-2, care contrasteaz cu proprietile sale proliferative. Teoria afirm c IL-2 confer celulelor T, sensibilitate la apoptoz. Gradul stimulrii antigenice determin inducerea apoptozei. Dup ncetarea stimulrii antigenice, sinteza IL-2 i a receptorului su scade. In absena IL-2, cu rol trofic pentru limfocitele T, se iniiaz apoptoza pasiv. Invers, dac celulele T intrate n ciclul diviziunii sunt intens stimulate de antigen, se produce apoptoza activ (indus de antigen).

Apoptoza pasiv diminu expansiunea populaiei celulelor T, i o adapteaz la intensitatea unui rspuns fiziologic. Apoptoza activ este indus numai de activarea RCT. Ca rezultat al acestor dou forme de apoptoz, rspunsul feed-back elimin celulele T dac antigenul i IL-2 sunt n exces sau n deficit.

O parte a celulelor T poate s scape morii apoptotice pasive sau active i s devin limfocite T de memorie, cu via lung.

1 Structura RCT a fost prezentat ntr-un capitol anterior.

Activarea limfocitelor B

Spre deosebire de limfocitele T care recunosc numai antigenul modificat, prelucrat i prezentat n asociaie cu moleculele CMH, limfocitele B recunosc att forma prelucrat ct i forma nativ, nemodificat a antigenului solubil.

Contactul limfocitelor B cu un antigen timo-dependent, declaneaz diferenierea limfocitelor B pe dou ci:

- calea extrafolicular, rezultatul fiind sinteza timpurie a anticorpilor

- calea centrilor germinativi, care duce la memorie imunologic i genereaz plasmocite.

n splin, n absena cooperrii cu limfocitele Th, consecina este lipsa de rspuns imun (anergia). Dac are loc cooperarea T-B, se formeaz focare proliferative oligoclonale. Din focare, unele limfocite B migreaz n centrul germinativ i dobndesc memoria imunitar.

Limfocitele B recunosc direct antigenele timo-independente i se activeaz fr s necesite cooperarea limfocitelor T.

Dup activare ntr-un centru germinativ, de ctre un antigen T-independent sau dup interaciuni cu celule Th, celulele B mici n repaus sunt convertite la limfoblaste mari i ulterior acestea evolueaz fie spre plasmocite productoare de anticorpi, fie se difereniaz n celule mici de memorie. Procesul de activare n centrul germinativ este nsoit de generarea mutaiilor n regiunea V i comutarea de la IgM, la IgG, IgA sau IgE. Mutaiile mresc diversitatea situsurilor de legare a antigenului. Dac mutaia produce un situs nefuncional, celula activeaz programul morii genetice (apoptoza). Aceste modaliti de difereniere sunt influenate de semnale costimulatoare i de citochine (IL-2, 4, 6, 10, TGFB).

Limfocitul B leag specific antigenul n configuraia nativ, prin intermediul receptorului imunoglobulinic de membran i probabil l ncorporeaz sub forma complexului antigenanticorp. Aa se explic faptul c anticorpii specifici fa de proteinele native recunosc epitopi conformaionali discontinui, alctuii din aminoacizi, care n secvena primar sunt localizai la distan, dar n molecula pliat ajung n proximitate. De aceea, limfocitele B sunt foarte eficiente n procesul captrii, prelucrrii i prezentrii unui antigen injectat n doz foarte mic (de 1 000

de ori mai mic dect doza necesar prezentrii aceluiai antigen de ctre macrofage sau de ctre celulele dendritice). Antigenele care stimuleaz receptorii celulelor B sunt diverse: proteine, polizaharide, lipide, molecule mici(arsenat, trinitrofenol).

Importana limfocitelor B ca prezentatoare de antigen este redus n cursul rspunsului imun primar, dar devin foarte importante n cursul rspunsului imun secundar, n special n cazul n care doza stimulant de antigen este foarte mic.

n cursul stimulrii antigenice secundare, limfocitele B de memorie, a cror populaie este numeroas, nglobeaz specific antigenul prin intermediul receptorilor imunoglobulinici (endocitoz mediat de receptori sau prin pinocitoz nespecific).

Soarta antigenului recunoscut specific de limfocitele B nu este cunoscut. Antigenul ar rmne n compartimentul vezicular i nu ar fi amestecat cu proteinele citoplasmatice. Proteinele internalizate, probabil sunt prelucrate de proteazele lizosomale i se elibereaz fragmentele peptidice care se asociaz cu moleculele CMH II. Complexele peptid-molecule CMH II sunt transportate la suprafaa celulelor B, unde interacioneaz cu RCT specific al celulelor Th. Interaciunea peptid-RCT, determin eliberarea citochinelor din limfocitul Th, la rndul lor, cu rol stimulator asupra proliferrii i maturrii celulelor B. Pe de alt parte, antigenul nativ, fr s fie internalizat i prelucrat, ar putea declana stimularea limfocitelor B de memorie. Din aceast cauz, rspunsul imun va fi specific fa de epitopii conformaionali ai moleculei native, n configuraia sa spaial.

Limfocitele B recunosc i leag specific, polipeptide mici i mijlocii. Moleculele proteice mari i antigenele corpusculare sunt nglobate i prelucrate de macrofage i de celulele dendritice, iar epitopii lor sunt expui n asociaie cu moleculele CMH II, fiind recunoscui de limfocitele T i B.

Mecanismul molecular al activrii limfocitelor B este greu de studiat, datorit faptului c proporia limfocitelor stimulate de antigenul specific este mic, chiar i dup stimularea secundar. Din acest motiv, activarea limfocitelor s-a explicat prin extrapolarea rezultatelor obinute dup activarea policlonal nespecific, in vitro, consecutiv legrii moleculelor de lectine, cu efect mitogen asupra limfocitelor B. Receptorii de lectine ai limfocitelor B nu s-au identificat.

A II-a metod de studiu a mecanismului activrii limfocitelor B a constat n utilizarea anticorpilor cu specificitate fa de Ig de membran, marcai cu fluorocromi. Astfel s-a evideniat c moleculele imunoglobulinice ale suprafeei limfocitului B, cu rol de receptor de antigen,

prezint un grad ridicat de mobilitate. Dup cuplarea cu anticorpii specifici (sau cu antigenul bivalent specific), moleculele imunoglobulinice membranare se grupeaz n zone discontinui ( petice) i ulterior conflueaz ntr-o zon delimitat a membranei, denumit bonet. Acesta este fenomenul de capping (bonetare). Moleculele receptoare de antigen astfel grupate, sunt eliberate n mediul extracelular sau sunt endocitate. Legarea ncruciat a moleculelor de suprafa, declaneaz activarea limfocitului B.

Receptorul limfocitelor B este evaluat la 108-109 specificiti de legare. Datorit numrului foarte mare de specificiti de legare antigenic a limfocitelor B, organismul prezint o mare diversitate de imunoglobuline serice (10000000 tipuri diferite), adic un numr de 1000 de ori mai mare dect numrul proteinelor structurale, enzimatice i hormonale din organism.

Antigenele timo-independente par s activeze limfocitul B, prin acelai mecanism. Ele au epitopi repetitivi care leag simultan mai muli receptori de antigen ai membranei limfocitului B. Punile moleculare ntre receptorii de antigen, declaneaz semnalul activator al limfocitului, materializat n proliferarea i diferenierea sa. Fig. 68. Activarea limfocitului B, dup legarea unui antigen cu epitopi repetitivi.

Stimularea nespecific a limfocitelor B

Proliferarea limfocitelor B este indus nu numai de antigenul specific i de superantigene, ci de orice ligand care leag ncruciat receptorii de antigen i formeaz puni intermoleculare. Legarea ncruciat a imunoglobulinelor de suprafa (probabil nu numai a lor, ci i a altor molecule membranare) declaneaz semnalul pentru proliferare, dar nu i pentru diferenierea lor n plasmocite.

Stimularea limfocitului B este, uneori, rezultatul activrii receptorilor membranari neimunoglobulinici, sub aciunea diferitelor mitogene. Mitogenele sunt antigene timoindependente. Cele mai cunoscute mitogene sunt lectinele2 din seminele plantelor. Din punct de vedere chimic, mitogenele sunt glicoproteine cu specificitate de legare pentru glucidele de pe suprafaa celulelor.

Lectinele sunt produse de toate organismele, dar unele tipuri de celule produc cantiti mari de lectine.

Avnd o distribuie ubicvitar, lectinele ndeplinesc funcii biologice importante, fiind molecule de recunoatere n diferite procese biologice:

- eliminarea glicoproteinelor din circulaie

- aderena agenilor infecioi de celulele gazd sensibile

- recrutarea leucocitelor la situsul inflamator

- medierea interaciunilor celulelor imunitare.

Lectinele cele mai studiate sunt cele din plantele leguminoase: Con A, PHA, lectinele de soia (SBA) i din arahide (PNA). Ca model de structur, toate lectinele leguminoaselor sunt formate din 2 sau 4 subuniti identice sau aproape identice de 25-30 kD fiecare, toate avnd aceiai specificitate de legare a glucidului.

Lectinele se clasific ntr-un numr mic de grupe de specificitate, n funcie de monozaharidul pentru care ele manifest cea mai nalt afinitate de legare (manoza, galactoza, N-acetilglucozamina, L-fucoza i acidul Nacetilneuraminic). Unele lectine leag slab monozaharidul, dar interacioneaz cu oligozaharidele(di-, tri- i tetrazaharidele). De exemplu, selectinele leag numai oligozaharidele.

Lectinele se combin cu glucidele printr-o reea de legturi de H i interaciuni hidrofobe.

Lectinele au constituit instrumentul major pentru studiul mecanismelor stimulrii mitogenice a limfocitelor.

n prezena unei lectine mitogene, in vitro, o larg varietate de celule int nenrudite antigenic, sunt lizate de celulele Tc, fenomen cunoscut sub denumirea de citotoxicitate dependent de lectin(prin analogie cu fenomenul ADCC).

Liza celulelor tumorale de ctre macrofage, dependednt de lectine, este o alt form de citotoxicitate. Unele lectine sunt toxice pentru celulele mamiferelor, in vivo i in vitro.

Funcia major a lectinelor este cea de recunoatere celular. De exemplu, hemaglutinina peplosului viral este lectina specific pentru acidul N-acetil neuraminic, iar lectinele suprafeei bacteriene mediaz legarea celor patogene de celulele gazd, o treapt esenial pentru iniierea procesului infecios. Haptenele inhibitoare ale lectinelor bacteriene protejeaz fa de infecia experimental cu bacteriile care exprim lectina, furniznd baza dezvoltrii terapiei anti-adezine a infeciilor bacteriene.

Unele lectine ale suprafeei celulei bacteriene mediaz legarea specific de fagocitele (PMN, macrofage) umane i de oarece, n absena opsoninelor, rezultatul fiind fagocitoza, ingestia i digestia bacteriilor. Procesul s-a denumit lectino-fagocitoz.

La nevertebrate, se crede c lectinele de pe suprafaa hemocitelor sunt molecule de recunoatere a moleculelor nonself.

Lectinele cu funcie endocitar sunt receptori legai de membran cu diferite specificiti i par a avea rol n clearance-ul glicoproteinelor i chiar al celulelor (eritrocite mbtrnite, bacterii) din circulaie.

Interaciunile adezive mediate de glucidele de suprafa i de selectine, controleaz traficul leucocitelor spre situsurile inflamatorii i migrarea (homing) a limfocitelor n organele limfoide specifice.

Rspunsul limfocitelor B la lectine este policlonal, deoarece sunt activate limfocitele cu specificiti multiple de legare a antigenului. In vitro, la concentraii mari, unele mitogene activeaz toate clonele de limfocite B, inclusiv pe cele de memorie, independent de specificitatea lor antigenic. La concentraii mici, mitogenele pot produce chiar activarea specific a limfocitelor B. Receptorii de mitogene nu se cunosc, dar sunt diferii de receptorii imunoglobulinici pentru antigene.

Limfocitele T sunt stimulate policlonal de PHA, Con A, iar PWM (pokeweed mitogen) stimuleaz celulele T i B.

Ali activatori policlonali ai limfocitelor B i ai diferenierii lor la plasmocite sunt virusul Epstein-Barr, concentraiile mari de endotoxine ale bacteriilor Gram negative, polizaharidul de Str. pneumoniae, ficolul, polimerii D-aminoacizilor, polivinil-pirolidona. Toate aceste antigene persist ndelung n organism, pe suprafaa macrofagelor din sinusul subcapsular al ganglionilor limfatici i n zona splenic marginal. Ele leag ncruciat receptorii imunoglobulinici ai limfocitelor B.

Celulele B ale noilor nscui nu rspund bine la antigenele timo-independente, ceea ce are consecine importante pentru eficiena vaccinurilor polizaharidice la copiii mici.

Semnificaia fiziologic a activrii policlonale nu este clar. Dup activarea nespecific policlonal, se sintetizeaz anticorpi a cror specificitate nu este totdeauna complementar antigenului inductor. De exemplu, limfocitele B stimulate de virusul Epstein-Barr sintetizeaz anticorpi care se combin cu fosforil-colina, o molecul absent n structura virionilor, dar prezent n peretele celular de Str. pneumoniae. Activarea policlonal a limfocitelor B este important n fazele timpurii ale infeciei, dar are i posibile consecine negative ce constau n inducerea variatelor fenomene autoimune.

Cooperri celulare n elaborarea rspunsului imun

De cele mai multe ori, sinteza anticorpilor dup stimularea antigenic, este rezultatul interaciunilor stimulatoare ale limfocitelor B convenionale (B2), cu limfocitele Th. Un antigen macromolecular poate fi considerat ca un complex format din carrier i determinani haptenici (epitopi), recunoscui de limfocitele Th i B.

Antigenele care pentru stimularea rspunsului imun necesit cooperarea celor dou populaii de limfocite, aparin grupului larg al antigenelor timo-dependente. Ele sunt reprezentate de proteinele heterologe, de polipeptidele sintetice, de hematiile heterologe, de flagelina monomer etc. Cele mai multe antigene moleculare, n special de natur proteic sunt timo-dependente.

Cooperri celulare T-B-macrofag. Pentru declanarea rspunsului imun, antigenele timodependente necesit cooperarea limfocitelor Th, cooperare supus restriciei moleculelor CMH. Aceste antigene se comport ca univalente, n raport cu specificitatea antigenic a fiecrui determinant i de aceea, n absena cooperrii celulare, ele sunt ineficiente n stimularea rspunsului imun. Pe de alt parte, antigenele timo-dependente pot fi prea repede degradate de

celulele fagocitare. Nu au activitate mitogenic, iar dac se leag de receptorii limfocitelor B, aceste antigene se comport ca haptene i nu declaneaz diferenierea celulelor B.

De cele mai multe ori, limfocitele cooperante Th i B recunosc epitopi diferii ai aceleiai molecule de antigen solubil nativ, neprelucrat, dar expus pe suprafaa limfocitului B. Limfocitele B recunosc epitopi conformaionali ai antigenelor proteice mici, iar limfocitele Th recunosc epitopi secveniali, de 10-20 aminoacizi. Cele dou celule cooperante ader una de alta. Dup ce recunoate antigenul, celula Th activat secret IL-2 n spaiul intercelular ngust, cu rol declanator al stimulrii limfocitului B. Clona de limfocite B, cu receptori specifici pentru epitopul antigenic, prolifereaz. Astfel, se produce fenomenul expansiunii clonale.

Limfocitele Th i B coopereaz i n cazul n care recunosc epitopi diferii ai unui antigen, asociai cu moleculele CMH II, pe suprafaa unei CPA.

Majoritatea antigenelor solubile i toate antigenele corpusculare sunt captate i prelucrate de macrofage i de celulele dendritice i sunt prezentate n asociaie cu moleculele CMH II. Epitopii acestor antigene, de cele mai multe ori cu specificitate diferit, sunt recunoscui de limfocitele B i Th. Limfocitele Th se activeaz i elibereaz IL-2 cu efect stimulator asupra limfocitului B, care prolifereaz i se difereniaz pn la celula cap de serie plasmocitul ce sintetizeaz i secret anticorpi specifici fa de epitopul stimulator al limfocitului B.

Activarea limfocitelor B, indus de antigenele timo-independente

Antigenele timo-independente se numesc astfel, deoarece declaneaz rspunsul imun prin activarea direct a limfocitelor B, fr s necesite cooperarea limfocitelor Th. Antigenele timoindependente sunt molecule mari, neproteice: polizaharidul capsular de Streptococcus, ficolul (polimer de sucroz), dextran-sulfatul, LPS ale bacteriilor Gram negative, levanii (polimeri de fructoz), polivinil-pirolidona.

Antigenele timo-independente au trei proprieti comune:

- au secvene repetitive n structura lor chimic. Aceast condiie nu este suficient i nici definitorie pentru calitatea de antigen timo-independednt, deoarece polimerii sintetici ai Laminoacizilor, au secvene repetitive, dar sunt antigene timo-dependente;

- au o structur tridimensional care favorizeaz interaciunea direct cu receptorii de antigen ai limfocitelor B;

- sunt molecule rezistente la aciunea enzimelor degradative i persist ndelung n organism.

Limfocitele T nu coopereaz la elaborarea rspunsului imun indus de antigenele polizaharidice, deoarece acestea sunt rezistente la procesele degradative i nu furnizeaz oligozaharide care s se poat asocia cu moleculele CMH II. Fragmentele moleculare eventual rezultate din procese degradative, se leag cu afinitate mic de proteine i nu se asociaz cu moleculele CMH II.

Cele dou categorii funcionale de antigene nu sunt strict delimitate n ceea ce privete mecanismul activrii rspunsului imun. Dup degradarea structurilor repetitive, antigenele timoindependente devin timo-dependente. De exemplu, glucagonul(antigen timo-dependent), dup clivare cu tripsin, elibereaz doi determinani antigenici: unul corespunztor captului Nterminal, timo-independent i cel corespunztor captului C-terminal, timo-dependent(stimulator al limfocitelor Th).

Activarea limfocitelor B1

Limfocitele B1 par s fie stimulate i s produc anticorpi dup un mecanism independent de celulele T. Aceste celule au nivele nalte de IgM pe suprafaa lor, apar timpuriu n ontogenie i migreaz predominant n cavitile peritoneal i pleural, au capacitate de renoire i manifest diferite specificiti de legare a epitopilor antigenici. Celulele B1 recunosc antigenele bacteriene comune (fosforil-colina), Ig, ADN, proteinele membranare eritrocitare.

Spectrul reactivitii nu este limitat la molecule nonself, ci se manifest i fa de molecule proprii: hormoni (insulin, tiroglobulin), constituieni celulari (ADN, miozin, tubulin, fosfolipide, fragmentul Fc al IgG autolog). Sinteza auto-anticorpilor de ctre celulele B1 este

argumentat de faptul c expansiunea neoplazic a acestor celule (ca n leucemia limfocitar cronic) este adeseori asociat cu simptomele autoimune.

Celulele B1 au un rol important n imunitatea nscut, deoarece secret cantiti mari de anticorpi naturali (IgM) fr expunerea la antigenele din mediu i fr imunizare.

Celulele B1 au o contribuie foarte important la rspunsul imun al mucoaselor. Multe plasmocite din structurile limfoide ale intestinului, productoare de IgA, deriv din celulele peritoneale B1, sugernd migrarea limfocitelor ntre cavitatea peritoneal i GALT. IgA sintetizat fa de antigenele peretelui bacteriilor din lumenul intestinal, este secretat n special de celulele B1. sIgA produs de celulele B1 are rol important n protecia suprafeei mucoaselor, mpiedicnd penetrarea sistemic a bacteriilor microbiotei intestinale. Sinteza sIgA nu necesit celulele Th i nici structuri foliculare organizate (plci Peyer i centri germinali).

Un alt situs strategic de aprare antimicrobian este zona marginal a splinei, localizat la jonciunea pulpei albe i roii. Ea conine macrofage, celule dendritice, celule B i este prima linie de aprare fa de agenii patogeni venii pe cale sanguin. Celulele B din zona marginal se deosebesc fenotipic de alte limfocite splenice prin prezena mai bine exprimat, a receptorilor pentru complement i pentru IgM. Ca i celulele B1 peritoneale, celulele zonei marginale sunt foarte sensibile la stimularea cu LPS, care induce diferenierea lor rapid n plasmocite. Stimularea lor este independent de celulele Th.

Efectele stimulrii antigenice asupra esutului limfoid secundar

Antigenul injectat intravenos este captat preferenial de macrofagele din zona marginal a splinei. Antigenele care strbat mucoasa intestinal sunt captate de celulele M ale domului plcii Peyer. Ele sunt transportate la limfocitele T i B din ariile plcii. Evenimente asemntoare au loc n esutul limfoid asociat bronhiilor.

Antigenul injectat subcutan sau intradermic este transportat n ganglionii limfatici locali, fie n stare liber cu fluxul limfatic, fie legat pe suprafaa celulelor specializate(celulele Langerhans prsesc epiderma prin vasele limfatice eferente, devin celule cu voal i dup ce ajung n ganglionul limfatic migreaz n aria celulelor T i devin celule interdigitate).

Limfocitele mature recirculante vin n contact cu CPA, se activeaz i formeaz centrii germinativi.

ntr-un ganglion limfatic se disting 4 faze ale reactivitii celulare.

1) In primele ore dup stimularea antigenic se produce o reacie inflamatorie local, cu o cretere a fluxului sanguin de circa 25 de ori. Se intensific traficul limfocitar spre ganglionii regionali. Concomitent se produce obturarea cii de ieire a limfocitelor din ganglion, dar rata curgerii limfei nu se modific. Sub aciunea unor factori locali (prostaglandine, factori de aderen) se mrete gradul de aderen limfocitelor i astfel n ganglioni se formeaz un dop limfocitar.

2) Dup 1-2 zile se intensific ieirea limfocitelor ganglionare n fluxul limfatic eferent. In ganglion sunt reinute limfocitele care au recunoscut specific antigenul.

3) n cea de a III-a i a IV-a zi dup stimularea antigenic se intensific proliferarea limfocitelor activate i n limfa eferent apar limfoblaste. Acestea au proprieti specifice de homing: vor migra n ali ganglioni i n noile sedii se difereniaz n celule care sintetizeaz anticorpi (plasmocite).

4) Dup cea de a IV-a zi diminu generarea blastelor. Din celulele stimulate rezult celule de memorie care trec n snge i devin circulante.

Stimularea cu antigene timo-dependente este nsoit de formarea centrilor germinativi. In centrii germinativi, limfocitele B proliferante se gsesc n asociaie cu limfocitele Th.

DINAMICA RSPUNSULUI IMUN MEDIAT HUMORAL

n serul normal, cantitatea total de imunoglobuline este de 10 mg/ml (circa 5 x 1016 molecule).

nainte de imunizare, anticorpii serici specifici fa de un antigen dat, sunt sub nivelul detectabil prin metodele clasice.

Rspusul imun generat dup contactul primar al organismului cu antigenul constituie rspunsul imun primar, n a crui dinamic se disting trei faze:

- faza de laten

- faza de cretere a titrului anticorpilor

- faza de scdere a titrului anticorpilor serici.

Faza de laten este intervalul cuprins ntre momentul stimulrii antigenice i nceputul creterii titrului anticorpilor serici. Durata sa este foarte variabil n funcie de natura antigenului (de exemplu, 2-3 zile pentru hematiile de berbec i 20 de zile pentru toxina difteric), de doza de antigen administrat, de calea de administrare (subcutan, intramuscular, intravenoas), de modul de administrare (cu sau fr adjuvant).

Latena este mai scurt pentru antigenele corpusculare. Perioada de laten este necesar expansiunii clonale. La contactul primar al sistemului imunitar cu antigenul, n organism se gsete o populaie numeric restrns de limfocite care recunosc specific antigenul. In perioada de laten, clona de limfocite activat specific, prolifereaz intens (cu o succesiune de circa 8 generaii celulare) i va produce o populaie de celule, corespunztoare numeric reaciei de aprare a organismului.

Faza de cretere a titrului anticorpilor serici ncepe la sfritul perioadei de laten. Titrul anticorpilor crete cu o rat exponenial. Durata sa este foarte variabil: fa de hematiile de berbec, titrul maxim al anticorpilor este atins la 4-5 zile, iar al anticorpilor anti-toxin difteric, la circa 90 de zile. Titrul rmne maxim (n platou), cteva zile, dup care ncepe s scad.

Faza de scdere a titrului anticorpilor ncepe curnd dup atingerea valorii maxime. Rata scderii depinde de rata sintezei, de rata degradrii anticorpilor, dar i de cantitatea de antigen disponibil, care leag anticorpii n complexe, determinnd scderea titrului lor. Titrul IgG scade cu 7%/ zi, IgA cu 25%/ zi, IgM cu 18%/zi. La 30-40 de zile, titrul anticorpilor poate deveni nedectabil. n fazele de cretere i de scdere a titrului, anticorpii sunt detectabili prin reacii secundare in vitro, de aglutinare i de precipitare. Fig. 69. Cele 4 faze caracteristice ale rspunsului: faza de lag, faza creterii logaritmice a titrului anticorpilor, faza de platou i faza de declin, n timpul creia anticorpii sunt catabolizai. Dinamica rspunsului imun depinde de natura antigenului i de specia gazd.

n perioada de debut a rspunsului imun primar se sintetizeaz IgM. Dup cteva zile se detecteaz IgG, care atinge un titru maxim mai nalt dect IgM. Titrul IgM ncepe s scad, nainte ca titrul IgG s ating valoarea maxim. La nivelul maxim al titrului anticorpilor, IgG este de circa 10 ori mai concentrat dect IgM, ceea ce denot c dup activare, dei majoritatea limfocitelor B (circa 90%) au ca receptor de antigen molecula de IgM, dup activare comut sinteza de la izotipul IgM la izotipul IgG.

Unele limfocite ale clonelor n expansiune, nu se difereniaz n plasmocite, ci sintetizeaz molecule de imunoglobulin care rmn asociate membranei citoplasmatice. n tehnica hemolizei localizate n gel, aceste celule nu produc plaje de liz. Ele constituie substratul celular al memoriei imunitare.

Rspunsul imun are caracter adaptativ i se caracterizeaz prin trei trsturi eseniale (care lipsesc reaciilor de aprare nespecifice, nscute):

- specificitatea (anticorpii se combin cu antigenul inductor)

- diversitatea izotipic i a situsului de combinare

- memoria (pstrarea memoriei experienei contactului cu antigenul).

Diversitatea. Moleculele de anticorpi sunt foarte heterogene n ceea ce privete izotipul (IgG, A, M, E). IgM dispare relativ repede, dar IgG i IgA persist la titruri sczute, nedectabile prin

metodele obinuite, pentru perioade variabile (sptmni, ani). Anticorpii sunt heterogeni din punctul de vedere al specificitii de legare cu diferii epitopi ai antigenului inductor.

Anticorpii rspunsului imun primar (IgM i IgG), n general, au afinitate sczut, dar aviditatea lor este mare.

Afinitatea anticorpilor msoar fora de legare dintre un epitop i situsul de combinare al anticorpului specific. Afinitatea este rezultanta forelor de atracie (legturi de H, fore electrostatice, fore van der Waals, legturi hidrofobe), dintre cele dou grupri reactante.

Aviditatea msoar fora rezultant a afinitii dintre epitopii multipli i paratopii complementari i este consecina faptului c cele mai multe antigene sunt mozaicuri de epitopi. Complexele antigen-anticorp cu IgM au aviditate mare, deoarece anticorpul este decavalent.

RSPUNSUL IMUN HUMORAL SECUNDAR

Rspunsul imun secundar este expresia memoriei imunitare. Memoria definete capacitatea unui organism de a elabora un rspuns imun mai eficient, adic mai rapid, dar n special mai intens, dup contactul secundar cu antigenul.

Rspunsul imun secundar fa de antigenele timo-independente este comparabil cu rspunsul imun primar:

- dup stimularea secundar, titrul anticorpilor nu crete semnificativ

- se sintetizeaz predominant IgM

- nu se produce comutarea sintezei la IgG

- memoria imunitar este slab exprimat.

Rspunsul imun secundar este indus de antigenele timo-dependente i se caracterizeaz printr-o laten mai scurt, creterea rapid a titrului anticorpilor, cu un maxim mult mai nalt dect n rspunsul imun primar.

Doza de antigen inductoare a rspunsului imun secundar este mult mai mic, iar timpul necesar dublrii titrului este de ordinul orelor. Iniial se sintetizeaz IgM, fr o perioad evident de laten. Sinteza IgG este de asemenea accelerat. Titrul maxim al IgG este de cteva ori mai mare dect n rspunsul imun primar i rmne ridicat o perioad mult mai lung de timp.

Din punctul de vedere al evenimentelor celulare, la cteva zile dup iniierea rspunsului imun secundar, limfocitele B de memorie, activate, migreaz n mduva osoas i se matureaz n plasmocite. Mduva osoas este un sediu major al rspunsului imun specific i o surs major de imunoglobuline. In rspunsul imun secundar, cea mai mare parte a imunoglobulinelor se sintetizeaz n mduva osoas. In timp ce esutul limfoid periferic rspunde rapid dup stimularea antigenic, dar numai pentru o perioad scurt, mduva osoas rspunde lent, dar sinteza de anticorpi este masiv i de lung durat, fa de un antigen care stimuleaz repetat. Fig. 70. Rspunsul imun primar i secundar fa de un antigen macromolecular. Este ilustrat corelarea titrului anticorpilor cu activitatea celulelor B. Citochinele regleaz comutarea sintezei de la IgM la IgG.

Trsturile distinctive ale rspunsului imun secundar sunt:

a) maturarea afinitii anticorpilor;

b) comutarea izotipului la sinteza IgG.

Maturarea afinitii anticorpilor se explic prin aceea c pe parcursul diferenierii proliferative a limfocitelor B, se produc mutaii somatice ale secvenei regiunii V, prin substituii de nucleotide i prin selecia mediat de antigen, a clonelor de limfocite cu afinitate mare de legare a epitopilor complementari. La om, hipermutaia are loc n prezena antigenului, n centrii germinativi, singurul situs n care antigenul este reinut pentru luni sau ani, asociat cu celulele. Antigenul este sechestrat pe suprafaa celulelor dendritice foliculare, care l pstreaz sub forma complexelor antigen-anticorp, n proximitatea limfocitelor B. Consecutiv mutaiei somatice, se sintetizeaz

anticorpi cu afinitate mai mare, deoarece, treptat, crete numrul limfocitelor B cu mutaii care confer afinitate mai mare de legare a anticorpilor cu antigenul. Celulele B care au suferit mutaii nefuncionale, mor prin apoptoz.

Mutaiile sunt mai ales punctiforme, cu foarte rare deleii sau inserii a nucleotidelor unice.

Sinteza anticorpilor cu afinitate nalt are dou consecine practice importante:

- complexele antigen-anticorp sunt greu disociabile i se elimin mai rapid din mediul intern;

- anticorpii dau reacii ncruciate cu antigenele nrudite.

Reaciile ncruciate ale anticorpilor cu afinitate crescut au o importan practic deosebit, pentru c imunizrile cu antigene nrudite, pot avea efecte neateptate. De exemplu, indivizii aduli vaccinai cu virusul influenza, pot s produc, surprinztor, anticorpi cu un titru mai mic fa de antigenul folosit n vaccinare, dect titrul anticorpilor fa de o tulpin de virus care a produs o infecie la vrsta copilriei. Acesta este fenomenul amintirii pcatului originar i st la baza studiilor epidemiologice retrospective, pentru precizarea serotipului unui agent infecios care a declanat epidemii trecute. Explicaia const n faptul c imunizarea primar genereaz celule cu memorie fa de mai multe antigene nrudite. La rentlnirea cu unul din antigenele nrudite, este stimulat o populaie de celule care recunoate determinani antigenici comuni. Se sintetizeaz anticorpi care se combin cu ambele variante antigenice, dei, uneori, anticorpii specifici fa de epitopii celui de al II-lea antigen pot s lipseasc.

Comutarea izotipului const n trecerea de la sinteza IgM n cursul rspunsului imun primar, la sinteza altor izotipuri, n special IgG, n rspunsul imun secundar.

La nivel molecular, comutarea izotipului este rezultatul deplasrii complexului genic VDJ, de la poziia sa original, adiacent captului 5 al genei C, ntr-o poziie nou, adiacent captului 5 al altei gene C, de exemplu C . Dup aceast aranjare genic, toat secvena genic dintre poziia iniial a complexului VDJ i localizarea final, este eliminat prin deleie. Procesul rearanjrii genelor se numete recombinare prin comutare (switch recombination).

Excepia de la acest mecanism este sinteza simultan a receptorilor de membran IgM i IgD (mIgM i mIgD), de ctre celulele B mature. Sinteza catenei nu implic recombinarea prin

comutare, ci este rezultatul ndirii alternative a exonilor unei copii de ARN premesager care conine genele VDJ, cu secvena genei C sau a genei Cd. Fig. 71. a. Mecanismul ndirii genice pentru comutarea de la IgM membranar, la IgM secretat. Pentru forma secretat, secvena hidrofob codificat de exonii M-M care ancoreaz IgM receptor de membran este eliminat. b. IgM i IgD cu funcia de receptori de antigen, coexist pe aceiai celul, prin ndirea difereniat a copiei primare de ARN.

Gena activ pentru sinteza imunoglobulinelor este transcris n ARN premesager, care conine secvene codificatoare pentru regiunile V i C (exoni), dar i secvene necodificatoare(introni). Intronii se gsesc ntre secvenele recombinate VJ sau VDJ i gena C. Pentru catena H, intronii se gsesc ntre exonii care codific domeniile individuale. Intronii sunt eliminai prin ndirea ARN i rezult ARNm unitar, care este tradus n polipeptidele moleculei de imunoglobulin.

Sinteza imunoglobulinei se face cu rate distincte n diferite celule B, n raport cu gradul ei de difereniere. O celul B nestimulat antigenic sintetizeaz circa 106 molecule de imunoglobulin pe zi, cu rol, n primul rnd, de receptori membranari de antigen, iar un plasmocit produce pn la 2000 molecule de imunoglobulin/secund, toate avnd rolul de anticorpi plasmatici.

Nevertebratele nu au memorie imunitar.

Anticorpii ndeplinesc urmtoarele funcii eseniale:

- se combin specific cu antigenele solubile i formeaz complexe antigen-anticorp, care sunt epurate de macrofage

- neutralizeaz toxinele

- se leag specific cu determinanii antigenici virali i neutralizeaz infeciozitatea virionilor

- opsonizeaz microorganismele dintr-un focar infecios

- fixeaz complementul pe suprafaa unui antigen celular i efectul este liza (bacterioliza, citoliza, hemoliza).

Factorii care condiioneaz intensitatea rspunsului imun

Titrul anticorpilor sintetizai n cursul rspunsului imun este dependent de mai muli factori: de calea de administrare a antigenului, de doz, de ritmul i modul de administrare (cu sau fr adjuvant) i de factorii genetici ai organismului imunizat.

Pentru producerea contactului rapid dintre antigen i celulele imunocompetente din ganglionii limfatici este avantajoas calea parenteral de administrare: intradermic, subcutan sau intramuscular. Injectarea intravenoas favorizeaz contactul antigenului cu limfocitele din splin, dar rspunsul imun are o intensitate mic, datorit eliminrii rapide a antigenului.

Cea mai eficient cale de administrare a antigenului este cea intradermic, pentru c persistena sa la locul injectrii este de lung durat i la situsul injectrii se acumuleaz celule implicate n elaborarea rspunsului imun. Exist chiar posibilitatea sintezei locale, in situ, a anticorpilor.

Doza de antigen influeneaz nivelul afinitii anticorpilor. Dozele mari de antigen, induc o maturare insuficient a afinitii anticorpilor, n raport cu dozele mici, deoarece acestea stimuleaz numai clonele de limfocite cu receptori de nalt afinitate fa de antigenul stimulant, n timp ce dozele mari ale aceluiai antigen stimuleaz clonele de limfocite de nalt i de mic afinitate i produc chiar stimularea nespecific a limfocitelor.

Intensitatea rspunsului imun este dependent de legea dozelor repetate i a intervalelor. Administrarea aceleiai doze de antigen, n mod fracionat i la intervale adecvate, este mai eficient dect administrarea dozei unice, deoarece fiecare doz mic pregtete organismul, fcndu-l mai reactiv fa de doza urmtoare.

Uneori, a II-a injectare, foarte apropiat n timp de prima, poate fi inoperant, deoarece antigenul este eliminat de anticorpii sintetizai dup stimularea primar. Cel mai bun protocol de

administrare pentru a obine un rspuns imun secundar optim, const n injectarea unei doze mici de antigen, urmat de doze progresiv crescnde.

O cantitate prea mare de antigen, produce inundarea organismului cu substane nonself i rspunsul este paradoxal. In loc de stimularea rspunsului imun se obine efectul invers, denumit paralizie imunologic.

Paralizia imunologic este o reacie de protecie a organismului, fa de dozele mari de antigen. Organismul i blocheaz toate mecanismele de rspuns imun. Fenomenul areactivitii imunitare poate surveni att dup injectarea unei cantiti prea mari de antigen uor metabolizabil, ct i dup injectarea unei cantiti moderate a unui antigen care se metabolizeaz greu. La fiecare specie de organisme, pentru fiecare antigen, pare s existe un echilibru controlat genetic, ntre doza stimulatoare a rspunsului imun i cea care produce paralizia imunologic.

Antigenele bune sunt hidrolizate parial i stimuleaz declanarea rspunsului imun, iar antigenele slabe, fie sunt degradate rapid, fie sunt rezistente la degradare i induc starea de paralizie imunitar. De aceea, doza optim necesar inducerii unui rspuns imun optim este diferit de la un antigen la altul i se determin experimental pentru fiecare caz. De asemenea, pentru fiecare antigen se stabilete numrul de fracii ale dozei, intervalul administrrii fraciilor, calea de administrare, adjuvantul.

Pentru antigenele corpusculare, injectrile se fac, n general, la 7 zile, iar pentru cele macromoleculare, la 14-21 de zile.

Raportul dintre cantitatea de antigen intact i cel parial degradat, care se gsete n organism la un moment dat dup adminisrare, este o reflectare direct a ratei cu care antigenul este metabolizat.

Imunogenitatea unui antigen este influenat de modul de administrare. Asocierea cu adjuvanii mrete gradul de imunogenitate a multor antigene, iar pentru altele, asocierea cu un adjuvant este o condiie obligatorie a imunogenitii. Administrarea n asociere cu un adjuvant este foarte important pentru imunogenitatea proteinelor uor degradabile i a celor slab imunogene (de exemplu, hormonii). Cele uor degradabile, dup administrare n stare nativ, dispar repede din organism, dar n asociaie cu un adjuvant sunt eliberate treptat, stimulnd organismul o perioad mai lung de timp.

Injectarea intravenoas anuleaz efectul favorabil al adjuvantului.

Maturitatea sistemului imunitarn (imunocompetena) influeneaz intensitatea rspunsului imun. Administrarea unui antigen la un organism al crui sistem imunitar este imatur, nu activeaz rspunsul imun, ci induce o stare de toleran.

Rspunsul imun al indivizilor umani, la cei doi poli ai vrstelor, este slab. La copii, sistemul imunitar este imatur, iar la vrstnici, treptat, funcia imunitar diminu, ceea ce se reflect n reducerea activitii limfocitelor T, creterea proporiei limfocitelor Ts, scderea activitii celulelor NK, toate avnd un efect imunodepresiv, asociat cu creterea incidenei neoplaziilor i cu scderea capacitii de aprare fa de agenii infecioi.

Factorii genetici sunt eseniali pentru capacitatea de rspuns imun a organismului. O substan nonself poate fi un bun antigen pentru unele specii, dar neantigenic pentru altele. De exemplu, albumina seric bovin este imunogen pentru iepure, dar este slab imunogen pentru om, iar polizaharidul capsular de Str. pneumoniae este imunogen pentru om i oarece, dar neimunogen pentru iepure i cobai.

Antigenele naturale sunt mozaicuri de epitopi. Sistemul imunitar al unei specii, recunoate unii epitopi, dar rspunde mai greu sau ignor ali epitopi. Diferitele specii de organisme, pot sintetiza anticorpi cu specificiti distincte fa de acelai antigen, deoarece recunosc epitopi diferii.

Uneori se nregistreaz diferene semnificative ale reactivitii imunitare, chiar ntre organisme ale aceleiai specii, corelate cu starea fiziologic, cu starea nutritiv, cu sexul, cu vrsta. Din aceast cauz, serurile imune nu sunt reactivi standardizai i rezultatele obinute n reaciile imune in vitro, nu sunt totdeauna reproductibile.

Anticorpi naturali

Imunoglobulinele serice sunt cele mai abundente proteine serice (10 mg/ml), care s-au sintetizat n afara oricrui proces de imunizare, dar au specificitate fa de antigene cunoscute. De exemplu, n serul de oarece se gsesc anticorpi anti-hematie de berbec. Denumirea de anticorpi naturali sau spontani s-a folosit pentru a-i distinge de anticorpii sintetizai dup imunizare.

Anticorpii naturali se sintetizeaz ca urmare a stimulrii imunitare continue, sub aciunea antigenelor microbiotei intestinale. Funciile anticorpilor naturali sunt controversate.

Anticorpii naturali sunt polireactivi, adic dau numeroase reacii ncruciate, cu o diversitate de antigene (polizaharide, proteine, acizi nucleici), de diferite origini: virale, bacteriene, fungice sau ale paraziilor multicelulari.

O importan deosebit au anticorpii naturali ce se leag cu determinantul -gal, cu levanul, cu LPS sau cu fosfatidil-colina. Funcia anticorpilor naturali anti--gal pare a fi legat direct de aprarea fa de agenii patogeni. Pierderea genei galactozil-transferaz n evoluie, a conferit un avantaj, prin sinteza anticorpilor anti-gal, cu rol protector fa de agenii patogeni.

Majoritatea anticorpilor naturali sunt sintetizai de un set special de limfocite B, denumite B1.

Sinteza anticorpilor naturali se datoreaz faptului c, postnatal, organismele sunt supuse stimulrilor antigenice multiple, cu antigene de diferite origini (virale, bacteriene, fungice, alimentare), care ptrund pe calea mucoaselor digestive i respiratorii. Antigenele stimuleaz policlonal, limfocitele B din formaiunile limfoide asociate mucoaselor. Dei se sintetizeaz dup stimulri repetate cu doze mici de antigene, afinitatea anticorpilor naturali este inferioar celei a anticorpilor sintetizai dup imunizare.

Anticorpii naturali aparin izotipului IgM. Din aceiai categorie fac parte aglutininele sanguine i . Sinteza lor are loc nainte de natere, n afara oricrei stimulri antigenice.

Anticorpii naturali, datorit spectrului larg de legare cu antigene majore comune diferiilor ageni patogeni, au rolul de molecule de recunoatere ale imunitii nscute.

Sistemul imunitar nscut cuprinde i molecule cu o structur diferit de aceea a anticorpilor, ca lectina care leag manoza (MBL = manose binding lectin). Este o opsonin din snge care fixeaz complementul i utilizeaz receptorul C1q al macrofagului.

Serul normal de bovine conine o protein denumit conglutinin, care determin agregarea (conglutinarea) eritrocitelor tapetate cu componente ale complementului. La alte specii, sinteza conglutininei este indus de imunizarea cu molecule tapetate cu componente ale complementului sau sinteza sa este declanat dup activarea complementului in vivo.

Imunoconglutininele sunt auto-anticorpi fa de epitopi exprimai de componentele activate ale complementului, care n moleculele native sunt criptice. Conglutininele sunt anticorpi anticomplement, echivaleni factorilor reumatoizi, specifici fa de IgG. Serul uman conine nivele sczute de imunoconglutinine, dar nivelul lor crete dup activarea complementului n infeciile acute i cronice i n maladiile inflamatorii cronice, produse de virusuri, de microorganisme i de parazii.

Biosinteza imunoglobulinelor

Sediul sintezei imunoglobulinelor este plasmocitul. Limfocitele sintetizeaz cantiti minime de imunoglobuline, care rmn ancorate n membrana citoplasmatic i au rolul de receptor de antigen. Dup activarea limfocitului, celulele descendente rezultate printr-un proces de proliferare i difereniere, sintetizeaz cantiti crescnde de imunoglobuline.

Plasmocitul este celula cap de serie, difereniat terminal, care nu se divide i triete cteva zile. Ea sintetizeaz molecule identice de imunoglobuline (monoclonale), cu o singur specificitate de legare fa de un epitop antigenic, cu o rat de circa 2000 molecule/secund.

Catenele polipeptidice L i H se sintetizeaz separat, pe polisomi de dimensiuni diferite, ataai pe cisternele reticulului endoplasmic. Mrimea polisomilor este proporional cu lungimea catenei polipeptidice, pe care o sintetizeaz i este dependent de lungimea moleculei de ARNm codificatoare. Catena L se sintetizeaz pe polisomi de 7-8 ribosomi, iar catena H, pe polisomi de 14-16 ribosomi. Polisomii lungi, purificai precipit in vitro, cu serul imun anti H.

Cele dou catene se sintetizeaz ca precursori mai mari, cu o secven N-terminal de circa 20 de aminoacizi (secvena leader), care este clivat n timpul transferului n lumenul cisternei de reticul endoplasmic. Cele dou tipuri de catene se sintetizeaz ca uniti de sine stttoare i

ulterior se asambleaz pentru a forma o structur tetracatenar. Moleculele de imunoglobulin sintetizate, se acumuleaz n cisternele reticulului endoplasmic granular i ulterior sunt transferate n cisternele Golgi. La acest nivel se formeaz legturile S-S i se ataeaz gruprile glucidice. Compoziia componentei glucidice este variabil, dar ca structur de baz este reprezentat de N-acetil-glucozamin, manoz, galactoz, fucoz, acid sialic. Legarea primelor dou monozaharide ncepe n momentul n care catena H este ataat de polisom. Catena polizaharidic se alungete progresiv, pe msur ce proteina se deplaseaz n cisternele Golgi. Moleculele de anticorpi prsesc aparatul Golgi, n vezicule secretorii, care fuzioneaz cu membrana citoplasmatic i elibereaz coninutul la exterior.

Glicozilarea este o condiie obligatorie pentru secreia moleculelor de imunoglobulin.

Moleculele de IgA i IgM prezint forme polimerizate. Asocierea polimerilor este catalizat de lanul J. Polimerizarea are loc concomitent cu secreia. In citoplasma plasmocitului nu se gsesc molecule polimerizate.

n celulele care sintetizeaz imunoglobuline destinate secreiei, catenele L se gsesc n mic exces fa de catenele H. Pentru fiecare din cele dou tipuri de catene, exist un numr egal de molecule de ARN, dar catena L se sintetizeaz de dou ori mai repede dect catena H, avnd dimensiuni de dou ori mai mici.

Catabolismul imunoglobulinelor

Catabolismul imunoglobulinelor s-a studiat utiliznd moleculele marcate cu I125 sau I131. Primul are timpul de njumtire de 57 de zile, iar al II-lea, de 8 zile. Iodul radioactiv se cupleaz cu nucleul aromatic al tirozinei, sub aciunea blnd a unor ageni oxidani (H2O2, cloramina T), care mresc ansa ca molecula de imunoglobulin marcat s rmn nemodificat din punct de vedere structural i funcional. Rata scderii radioactivitii, reflect rata catabolizrii proteinei native. Catabolizarea imunoglobulinei este o reacie de ordinul 1, adic din molecula nativ rezult produi finali de catabolism.

Cantitatea de imunoglobulin catabolizat(dIg) ntr-un interval de timp (dt) este direct proporional cu concentraia moleculelor n snge i este constant, conform relaiei: d Ig/dt = k

Ig (k reprezint rata catabolizrii imunoglobulinelor, adic fracia de molecule din cantitatea total, ce se catabolizeaz n unitatea de timp, de obicei n 24 de ore).

Rata de catabolizare este o reflectare direct a timpului de njumtire a imunoglobulinelor. Valorile celor doi parametri sunt cu att mai mari, cu ct concentraia imunoglobulinelor este mai mare. Pentru calculul ratei de catabolizare a imunoglobulinelor este suficient s se determine timpul de njumtire a radioactivitii, care la un individ normal este de 22 de zile.

Mecanismul catabolizrii imunoglobulinelor. Prima ipotez cu privire la mecanismul molecular al catabolizrii afirm c moleculele de imunoglobulin trec din spaiul vascular, ntr-un compartiment de catabolizare, n care se gsesc celule capabile s le recunoasc i s le capteze prin pinocitoz. Deoarece aceste celule au un numr limitat de receptori capabili s lege specific moleculele de imunoglobulin, n veziculele de micropinocitoz vor fi ncorporate nu numai moleculele fixate pe receptori, ci i molecule libere. In accepiunea ipotezei, moleculele fixate pe receptorii celulelor, sunt protejate de procesele degradative i prsesc celula, revenind n circulaie, n timp ce moleculele care au fost pinocitate nespecific (fr legarea prealabil de receptori) sunt degradate. Ipoteza explic logic dependena ratei de catabolizare a imunoglobulinelor, de concentraia lor. La concentraie sanguin sczut, majoritatea moleculelor de imunoglobuline sunt endocitate specific, prin intermediul receptorilor i astfel sunt protejate de degradare, ntorcndu-se intacte n circulaie. Aa se explic faptul c n cazurile de hipogamaglobulinemie, timpul de njumtire este mare. La concentraii mari de imunoglobuline, timpul de njumtire se scurteaz. n aceste cazuri, numai o proporie mic de molecule este protejat de degradare prin legarea de receptorii celulari, restul fiind endocitate nespecific i expuse degradrii.

A II-a ipotez consider c procesul catabolic este iniiat numai dup ce moleculele de imunoglobuline au suferit o modificare conformaional a regiunii Fc. Moleculele modificate (prin uzur metabolic) se fixeaz prin regiunea Fc, de membrana celulelor care au astfel de receptori: leucocitele, PMN, macrofagele (n special hepatice i splenice) i sunt nglobate prin micropinocitoz. In veziculele de pinocitoz, are loc reducerea legturilor S-S intercatenare i hidroliza sub aciunea enzimelor lizosomale. Aceast ipotez, contrar celei de mai sus, consider c moleculele de imunoglobulin, odat fixate pe receptorii celulari, sunt nglobate n celule i degradate parial sau total. Pentru procesul catabolizrii, n concepia ipotezei, hotrtoare este tranziia moleculei de imunoglobulin de la conformaia nativ, la cea modificat. Ipoteza este sprijinit de heterogenitatea receptorilor pentru Fc de pe suprafaa macrofagelor. O categorie de receptori pentru Fc fixeaz numai moleculele care au suferit modificri ale regiunii Fc. Ei se deosebesc de receptorii clasici pentru Fc, care leag moleculele native de imunoglobulin.

Utilizri ale serurilor imune

Cea mai larg utilizare (n perioada 1920-40) a serurilor imune a constituit-o domeniul seroterapiei (terapia de urgen a unor infecii septicemice, a infeciei difterice, scarlatinoase, tetanice, rabice). Dezavantajul major este c serurile imune conin nu numai anticorpii specifici, ci i toate celelalte proteine serice, care sunt imunogene pentru organismul receptor i induc rspunsul imun, adeseori cu manifestri patologice (boala serului).

Anticorpii se folosesc n tehnici i metodologii de diagnostic imunologic. Utilizarea lor depinde de posibilitatea de a-i produce pe iepure, capr, berbec sau cal. Principalele direcii de utilizare a anticorpilor sunt urmtoarele:

- n determinrile fine ale unor cantiti mici de antigene (tehnicile ELISA, RIA);

- pentru purificarea proteinelor n cromatografia de afinitate;

- pentru identificarea unor medicamente n ser i urin;

- pentru detoxifierea organismului de droguri (eliminarea digoxinei dup intoxicare prin administrarea ndelungat la pacienii cu insuficien cardiac);

- pentru identificarea unui agent infecios, prin reaciile serologice care utilizeaz seruri imune cu specificitate cunoscut (serotipizare).

2Lectinele sunt glicoproteine care se leag nespecific cu glucidele sau cu gruprile glucidice ale glicoproteinelor. Ele precipit polizaharidele i glicoproteinele sau aglutineaz celulele.

Activitatea lor aglutinant i precipitant poate fi inhibat de haptene(monozaharide i oligozaharide).

IMUNITATEA MEDIAT CELULAR

Rspunsul imun mediat celular s-a evideniat nainte de descoperirea diferenelor funcionale dintre limfocitele T i B, odat cu observaia c unele antigene induc reacii inflamatorii a cror intensitate nu este corelat cu titrul anticorpilor serici. La indivizii la care anticorpii serici nu sunt detectabili, pot fi produse reacii de hipersensibilitate ntrziat, ca manifestri directe ale rspunsului imun mediat celular.

n organism, imunitatea mediat celular ndeplinete urmtoarele funcii:

- protecia fa de infeciile bacteriene cu localizare intracelular, fa de infeciile fungice, virale i cele produse de protozoare;

- rezistena fa de multe tipuri de celule tumorale;

- mediator al proceselor inflamatorii asociate cu diferite procese infecioase;

- respingerea alogrefelor.

n toate aceste cazuri, reacia imun mediat celular se declaneaz nainte de sinteza anticorpilor.

Rspunsul imun mediat celular este consecutiv recunoaterii unei structuri antigenice pe suprafaa unei celule int, de ctre limfocitul citotoxic TCD4 sau TCD8, ori de ctre celulele NK sau K, cu potenial litic natural. n general, limfocitele TCD4 recunosc antigenele prelucrate, sub

forma fragmentelor peptidice, pe suprafaa celulelor specializate (macrofage), n asociaie cu moleculele CMH II. Fig. 72. Citotoxicitatea mediat celular. Celulele T (CD8 i unele celule CD4) recunosc antigenul asociat cu moleculele CMH. Celulele NK detecteaz absena moleculelor CMH I autologe pe celula int i a unor liganzi puin cunoscui pe celulele tumorale. Celulele K recunosc regiunea Fc a IgG legat pe antigenele de suprafa ale celulei int (dup Roitt, 1993).

Limfocitele TCD8 recunosc antigenele prezentate pe suprafaa celulelor int, n asociaie cu moleculele CMH I. Ele au dimensiuni mici i recunosc celulele proprii infectate cu virusuri sau malignizate, dar i transplantele alogenice sau xenogenice. Limfocitele TCD8 produc efecte citotoxice asupra celulei int, att in vivo ct i in vitro.

Procesul morii celulare sub aciunea limfocitelor Tc specifice, in vitro, se desfoar n trei stadii:

- stadiul de recunoatere

- programarea pentru liz

- dezintegrarea celulei int.

Limfocitul Tc recunoate antigenul de pe suprafaa celulei int, prin intermediul receptorului de antigen. Fig. 73. Interaciuni celulare n procesul litic al celulei int.

La contactul cu celula int, mobilitatea limfocitului Tc se accentueaz i ntreaga suprafa a celulei int este explorat n cteva minute. Stadiul de recunoatere dureaz circa un minut i necesit obligatoriu prezena cationilor bivaleni (Ca2+).

Programarea pentru liz const n eliberarea moleculelor cu efect citotoxic. In spaiul ngust al jonciunii cu celula int, limfocitul Tc elibereaz o protein citolitic (o limfotoxin) de 70 kD denumit perforin i granzimele (enzime asociate granulelor): serin-proteaza (denumit granzima B), o cistein-aspartic proteaz (caspaz). Caspazele sunt proteaze din categoria cistein-

proteazelor, care necesit pentru aciunea lor, intermediari covaleni cisteinil-aspartat. Ele cliveaz substraturi celulare specifice care produc modificri ale citoscheletului i cromatinei ce declaneaz moartea apoptotic a celulei int. Specificitatea strict a aciunii lor este neobinuit la proteaze.

Perforina i granzimele sunt principalele molecule ale granulelor celulelor TCD8 i NK. Aciunea lor este sinergic.

Proteazele determin liza rapid a celulei int, iar celelalte proteine cu efect citotoxic acioneaz lent. Perforina se polimerizeaz i formeaz pori transmembranari, cu diametrul de 10 nm. Din acest punct de vedere, modul su de aciune se aseamn cu C9 . Fig.74. Ilustrarea schematic a celor dou mecanisme ale citotoxicitii: exocitoza granulelor de perforin/granzim i citotoxicitatea mediat prin interaciunea FasL/Fas, produs de limfocitele Tc CD8+ i CD4+.

Dezintegrarea celulei int se caracterizeaz prin apariia leziunilor membranare i dureaz circa 100 minute. Este un proces dependent de temperatur i nu necesit prezena limfocitului Tc, dei n prezena sa procesul este accelerat.

Dup contactul cu o celul int, limfocitul Tc se deplaseaz pentru a explora alte celule. Procesul de recunoatere a antigenului este limitat (restrictiv) de identitatea moleculelor CMH I.

Limfocitul Tc este rezistent la aciunea litic a proteinelor proprii, deoarece granzimele sunt sintetizate ca prepropeptide. Dup clivajul peptidelor leader, moleculele sunt transportate prin cisternele golgiene pn la granulele omologe lizosomilor. Pentru liza unei celule int, limfocitul Tc elibereaz 10% din coninutul su toxic.

Al II-lea mecanism al citolizei, independent de Ca2+ i de perforin (descris n 1993) este mediat de interaciunea receptorului Fas cu ligandul Fas (FasL). Receptorul Fas (CD95) este exprimat pe celula int, iar ligandul Fas (Fas L = CD95L) este exprimat pe limfocitele T citotoxice. Fig.75. Reprezentare schematic a rolului perforinelor citolitice asupra celulei int (dup Male i colab., 1987).

n concluzie, limfocitele T citotoxice pot media liza celulei int, fie prin exocitoza granulelor citolitice, care conin complexul perforin-granzim, fie prin interaciuni ntre receptorul Fas i ligandul Fas. Fig.76. Dup eliberarea coninutului enzimatic, celula efectoare rmne viabil i funcional fa de alte celule int.

Aciunea limfocitelor Tc se evideniaz in vitro, n reacia limfocitar mixt(RLM) uni- sau bidirecional. n reacia unidirec-ional, limfocitele organismului A se cultiv n amestec cu limfocitele organismului B, blocate metabolic prin tratament cu mitomicin C sau prin iradiere X. Dup tratament, proprietile antigenice rmn nemodificate, dar limfocitele devin neproliferante. n 4-5 zile, limfocitele populaiei viabile sunt stimulate, pro-lifereaz i devin citotoxice.

n RLM bidirecional, se produce activarea concomitent a celor dou populaii de limfocite Tc cocultivate. Raportul numeric este decisiv pentru evoluia interaciunilor. Limfocitul Tc este supus atacului concertat al ctorva limfocite Tc agresoare i este lizat. Indeprtarea ionilor de Ca2+ din mediul de cultivare, cu EDTA, previne liza celulei int. Probabil, ionii de Ca au un rol esenial n exocitoza i n activarea perforinei.

Limfocitele granulare mari (LGL, Large granular lymphocytes) sunt celule non-T, non-B, efectoare ale citotoxicitii mediate celular i au receptori pentru regiunea Fc a imunoglobulinelor. Ra-portul nucleo-citoplasmatic este mic, cu multe granule azurofile n citoplasm. Datorit dimensiunilor mai mari i densitii mai mici, LGL pot fi uor separate de limfocitele mici, prin centrifugare. Efectul lor citotoxic s-a evideniat in vitro, pentru celulele umane i de oarece. Ele reprezint 5-10% din totalul limfocitelor circulante i recunosc celulele purttoare de antigene prin mecanisme distincte.

a) Celulele NK (Natural killer) se identific, datorit capacitii lor de a adera la suportul de plastic, dup 24 de ore de incubare a limfocitelor izolate din sngele periferic, cu IL-2 recombinant. Astfel, celulele NK pot fi captate pe suportul de plastic i separate de limfocitele T, a cror activare i exprimare a moleculelor membranare de aderen, necesit o perioad mai lung de timp. In vitro, celulele NK lizeaz spontan o varietate de celule maligne, celule infectate cu virusuri sau celule alogenice, ntr-o interaciune nespecific ce nu este restrictiv n raport cu identitatea moleculelor CMH. Imunizarea prealabil a organismului cu celule sensibile, nu ridic nivelul citotoxicitii nerestrictive n raport cu moleculele CMH i de aceea se numesc ucigae naturale.

Nu se cunoate receptorul prin care celula NK interacioneaz cu celula int i nici structura membranar a celulei int recunoscut de celula NK. Moleculele CMH I de pe suprafaa celulei int, cel puin uneori, inhib liza mediat de celulele NK, aa cum arat studiile in vitro. Aceste observaii au condus la ipoteza c celulele NK sunt specializate s recunoasc i s lizeze celulele cu nivele sczute ale moleculelor CMH I. Activitatea lor citotoxic este stimulat de interferon. Fig. 77. Celulele NK nu lizeaz celulele self normale (A), dar lizeaz celule alogenice (B) sau celulele self care nu exprim molecule CMH clasa I (C). Celula NK exprim cel puin un receptor specific cu rol inhibitor al interaciunii cu moleculele autologe CMH clasa I. Dup infecia viral sau ca o consecin a transformrii maligne, celulele autologe pierd o proporie important a moleculelor CMH I, fiind nlocuite de peptidele anormale. In ambele cazuri, aceste celule devin sensibile la liza mediat de celulele NK. Celulele alogenice care exprim molecule CMH I, nenrudite cu moleculele self, sunt lizate deoarece interaciunile dintre receptorii NK i moleculele CMH I nu sunt inhibate eficient.

Efectul litic este rezultatul aciunii unui factor pe care celula NK l transfer n celula int, prin contact intercelular direct. Granulele secretorii conin molecule citotoxice, ca i cele secretate de limfocitele Tc.

Celulele NK par a avea un rol foarte important n rezistena organismului fa de celulele tumorale i n liza celulelor infectate cu virusuri. Aciunea lor este detectabil la 2-3 zile dup infecia viral, precednd astfel aciunea efectorilor limfocitelor Tc specifice i a anticorpilor.

b) Celulele K sunt limfocite granulare mari (LGL), dar se deosebesc de celulele NK, prin prezena receptorilor membranari de nalt afinitate pentru Fc . Celulele K interacioneaz cu celulele int prin intermediul moleculelor de IgG. Celulele tumorale sau cele infectate cu virusuri leag moleculele de IgG pe suprafaa lor, la nivelul situsurilor antigenice i expun fragmentul fragmentul Fc. Acesta funcioneaz ca adaptor, permind celulei K, prin intermediul receptorului pentru Fc, s recunoasc i s lizeze celulele int tapetate cu anticorpi. Liza celulei int, mediat de receptorii pentru regiunea Fc, este cunoscut sub denumirea de citotoxicitate mediat de anticorpi (ADCC = antibody dependent cell cytotoxicity).

Fenomenul ADCC s-a demonstrat indirect, in vivo, la pacienii injectai cu AMC specifici fa de antigenele unor celule tumorale (melanom, limfom al celulelor B): se produce liza extensiv a celulelor tumorale, att prin fenomenul ADCC, ct i liza consecutiv fixrii complementului.

Alte celule LGL sunt limfocitele NK activate in vitro, sub aciunea IL-2, cunoscute sub denumirea de celule LAK (lymphokine activated killer).Fig. 78. Ilustrarea schematic a mecanismului citotoxicitii mediate de anticorpi (ADCC).

Dup activarea cu stimuli exogeni (de exemplu, IL-2), unele limfocite T i celulele NK se activeaz: cresc ca dimensiuni, crete numrul granulelor i dobndesc capacitatea de a lega i de a liza un spectru larg de celule tumorale, celule infectate cu virusuri sau chiar celule tisulare normale. Astfel de celule efectoare, activate de IL-2, s-au denumit LAK (lymphokine activated killer). Celulele LAK se definesc ca limfocite care mediaz citotoxicitatea nerestrictiv n raport cu moleculele CMH, fa de o varietate de inte, dup activarea in vivo sau in vitro numai cu IL2 sau n amestec cu alte citochine. Celulele LAK nu reprezint o categorie special de limfocite, ci deriv preponderent din celulele NK, dar i din limfocitele T. Mai puin de 1% din totalul celulelor T, care mediaz citotoxicitatea nerestrictiv n raport cu moleculele CMH, sunt precursorii celulelor LAK. Ce-lulele LAK secret citochine: TNF- i interferon.

Celulele purttoare de molecule nonself (malig-nizate sau infectate cu virusuri) sunt recunoscute de monocite i chiar de PMN eozinofile, care au activitate litic asupra celulelor int.

Macrofagele i monocitele activate sunt mai mari dect celulele n repaus, exprim mai intens moleculele CMH II i au coninut lizosomal mai bogat. Fig.79. Celulele Th au rol esenial n IMC. Celulele accesorii prelucreaz antigenul i l prezint limfocitelor Th. Prin intermediul IL pe care le secret, limfocitele Th selecteaz i activeaz mecanismele efectoare adecvate. Ele pot stimula celulele B s se diferenieze n celule productoare de anticorpi, s stimuleze sau s inhibe alte categorii de celule efectoare: Tc, NK, macrofage, granulocite i celule K mediatoare ale citotoxicitii mediate de anticorpi (dup Roitt, 1993).

Macrofagele se activeaz sub aciunea IFN , a endotoxinelor bac-teriene, dup infecia cu bacterii intracelulare (Mycobacterium, Listeria). Activarea const n amplificarea ratei metabolice. Macrofagul activat devine citotoxic pentru celula int. Interaciunea macrofagului cu celula int nu este mediat de structuri specifice, dar macrofagul activat face discriminare ntre celulele modificate (malignizate sau infectate cu virusuri) i cele normale. Macrofagele activate fagociteaz intens i realizeaz efectul ADCC. Ele produc IFN cu efect activator asupra celulelor NK, secret oxid nitric (NO), toxic pentru celula int, H2O2, produi de oxidare a glucozei cu efect toxic asupra intei, secret IL-1, TNF (tumour necrosis factor), colagenaz.

TNF este o pro-tein citotoxic cu efect lent (48-72 de ore) asupra celulei sensibile, foarte asemntoare limfotoxi-nei produs de limfoci-tele Tc activate. Ambele sunt proteine hidrofobe i se leag cu mare afini-tate de aceiai receptori ai celulei int.

Eozinofilele au rol important n aprarea fa de viermii parazii, prin efecte de citotoxi-citate de tip ADCC. Fo-carele de parazitoz sunt asociate cu eozinofilie.

Oricare ar fi celu-lele efectoare ale citoto-xicitii mediate celular, limfocitele Th (subsetul Th1) au rol esenial n stimularea reactivitii imunitare mediate celular, prin intermediul cito-chinelor, n special IL-2 i IFN.

MEDIATORII MOLECULARI AI REACTIVITII IMUNITARE

Rspunsul imun este controlat att prin interaciuni directe ale diferitelor tipuri de celule cooperante, ct i prin produsele de sintez pe care acestea le secret.

Factorii moleculari cu rol n reglarea rspunsului imun, iniial, au fost denumii citochine. Citochinele cunoscute sunt mprite n urmtoarele grupe funcionale: CSF (Colony Stimulating Factors), IL (Interleuchine), IFN (Interferoni) i TNF (Tumor necrosis factor), factori de cretere i chemochine.

Citochinele sunt proteine inductibile, care pot fi secretate de orice celul din organism, cu posibila excepie a eritrocitelor.

Citochinele sunt molecule cu activitate biologic, n concentraii foarte mici (femto-molar = 1015), care induc un rspuns specific al celulelor sensibile. Acestea posed receptori de mare afinitate pentru diferite citochine i rspund prin modificarea ratei sintezei ARN i a proteinelor. Citochinele sunt parte integrant a conceptului lui C. Bernard, privind homeostazia mediului intern.

Activitatea citochinelor se manifest in vivo i in vitro, la concentraii foarte sczute i din aceast cauz au fost denumite imunohormoni sau hormoni reglatori ai rspunsului imun. Spre deosebire de hormoni, care acioneaz la distan, citochinele acioneaz la nivel local, iar mecanismul aciunii lor este similar cu acela al hormonilor peptidici.

Spectrul de aciune al citochinelor este foarte larg, fiind implicate n toate aspectele patologice. Citochinele nu au activitate enzimatic, dar produc efectele numai dup ce se leag de receptorii specifici de mare afinitate, ai celulelor sensibile. Cele mai multe celule au un numr mic de receptori (sute, pn la cteva mii). Pentru a produce un rspuns maxim, numai un procent al receptorilor trebuie s lege citochina specific. Se activeaz cile de semnalizare intracelular i eventual se produce comutarea unui set de gene, care codific diferite proteine: molecule de aderen intercelular, proteaze, proteine de faz acut, enzime ale catabolismului lipidic, NOsintaza i citochine, inclusiv cea care a produs stimularea iniial a celulei.

n funcie de efectele pe care le produc, IL se grupeaz astfel:

- IL care stimuleaz mobilitatea orientat a celulelor (chemochine)

- IL care modific rata (stimulare sau inhibiie) diviziunii celulelor i diferenierea lor

- IL stimulatoare sau inhibitoare ale funciilor specifice ale unor celule

- IL care modific viabilitatea celulelor (induc apoptoza).

Caracteristicile generale ale citochinelor sunt urmtoarele:

- majoritatea citochinelor sunt polipeptide sau glicoproteine cu gr. mol. ntre 5- 30 kD;

- multe formeaz homodimeri sau homotrimeri (IL-12 este un heterotrimer);

- sinteza lor constitutiv este minim sau absent;

- aciunea lor este limitat, autocrin, paracrin sau chiar intracrin, dar nu endocrin, dei unele se gsesc n snge n timpul infeciilor generalizate. Aciunea lor este mediat de receptori de mare afinitate. Unele citochine au spectru larg de aciune, dar cel puin unele efecte ale lor se manifest asupra celulelor hematopoetice. Citochinele acioneaz adeseori prin stimularea sintezei sau inhibiiei altei citochine (cascada de citochine) sau prin modularea exprimrii receptorilor pentru alte citochine. Uneori, citochine cu structuri moleculare diferite au aciuni asemntoare (redundan). O singur citochin acioneaz asupra mai multor tipuri de celule i produce aciuni multiple (pleiotropism). De obicei, celulele n organism sunt supuse aciunii concomitente a mai multor citochine cu efect sinergic sau antagonic. Fig. 80.a. Aciunea citochinelor este, n general, local. Rareori, ele se gsesc n cantiti semnificative n snge. Aciunea local a citochinelor este intracrin (n interiorul celulei), autocrin (autostimularea celulei productoare) i paracrin (aciunea asupra celulelor din proximitatea situsului sintezei). Semnalele locale pe care le transmit diferitele citochine sunt eseniale pentru meninerea homeostaziei celulare, tisulare i a organismului. b. Reprezentare diagramatic a spectrului de activiti pe care le induc citochinele asupra celulei eucariote. Cele mai importante sunt activarea metabolismului i a sintezei diferitelor proteine (ciclooxigenaz, enzime proteolitice, NO-sintaz), diferii receptori de aderen. Citochinele pot s modifice ciclul celulei sensibile, producnd stimularea diviziunii, inhibiia ei sau apoptoza. Chemochinele sunt o clas de citochine mici, care determin migrarea orientat a leucocitelor.

INTERLEUCHINE (IL)

Denumirea veche de limfochine sugereaz c ele sunt sintetizate n primul rnd de limfocite. Pentru citochinele produse de celulele seriei monocit-macrofag se folosete denumirea de monochine. Denumirea de interleuchine este mai adecvat, deoarece reflect rolul lor esenial, acela de a media cooperarea celulelor sistemului imunitar.

Interleuchinele sunt peptide hidrosolubile, cu rol reglator, sintetizate n special de limfocite, dar i de alte celule. Efectul lor se exercit, n primul rnd asupra celulelor limfoide, dar i asupra altor celule.

Producerea interleuchinelor, in vitro, s-a evideniat n 1962, prin tehnica incubrii celulelor din exudatul peritoneal de oarece, n tuburi capilare plasate n ambiana materialului solubil eliberat de limfocitele sensibilizate dup stimularea cu antigen, in vitro. Factorul solubil produs de limfocitele stimulate, inhib migrarea macrofagelor din tubul capilar i s-a denumit factorul inhibitor al migrrii macrofagelor (MIF).

Producerea interleuchinelor in vivo s-a recunoscut n 1967, dup ce s-a remarcat c procesele inflamatorii sunt mult mai intense n raport cu titrul anticorpilor sintetizai i c ele sunt dependente de eliberarea unor factori din limfocitele T activate i din macrofage. Interleuchinele au rolul de a recruta alte celule, pe care le atrag n focarul inflamator.

Pn la descoperirea interleuchinelor rmseser neexplicate modalitile prin care, o multitudine de celule neconectate anatomic, i coordoneaz activitatea n sensul elaborrii rspunsului imun, dup stimularea antigenic.

Sinteza IL este dovedit de urmtoarele observaii:

- existena liniilor limfoide, a cror cretere in vitro este dependent de IL. Aceste linii celulare se folosesc pentru testarea prezenei IL ntr-un lichid biologic;

- unele clone de limfocite, dup stimularea in vitro cu lectine, produc cantiti mari de IL, utilizabile pentru analiza biochimic.

In vivo, IL sunt produse de limfocitele T (mai puin de limfocitele B), de celulele seriei monocitmacrofag, de celulele endoteliului vascular, de fibroblastele esutului conjunctiv, de cheratinocite etc.

IL-1

Sursa major de IL-1 o reprezint fagocitele mononucleare (celulele seriei monocit-macrofag). Dar orice tip de celul nucleat matur poate s sintetizeze IL-1: cheratinocitele, celulele dendritice, astrocitele, microglia, limfocitele B normale, unele clone de limfocite T in vitro, celulele NK, neutrofilele, fibroblastele, celulele endoteliale, celulele musculare netede.

Sinteza IL-1 este indus de aciunea unor stimuli biologici (endotoxinele bacteriilor Gram negative, exotoxinele, mureina bacteriilor Gram pozitive, zimosanul din peretele celular al levurilor, complexele imune, C3a, citochinele limfocitelor activate, lectinele mitogene) sau nebiologici (particule de Si, cristale de urai). Fig. 81. Agenii declanatori ai sintezei IL-1.

Sunt dou variante moleculare (IL-1 i IL-1), codificate de gene distincte. S-a identificat a IIIa variant molecular, IL-1ra (receptor antagonist), care se fixeaz pe receptorii pentru IL-1 i IL-1 , inhibnd efectele lor. IL-1 i IL-1 se sintetizeaz ca precursori de 31kD (271 i respectiv 269 aminoacizi), care sunt clivai proteolitic i rezult molecule de 17 kD. IL-1 este activ att n varianta nativ, ct i forma rezultat dup clivare. IL-1 este clivat de o cisteinproteaz intracelular (ICE = interleukin converting enzyme).

Efecte. Dup ce este produs local de celulele stimulate, IL-1 acioneaz autocrin sau paracrin, stimulnd rspunsul inflamator i rspunsul imun specific, fiind un mesager cu spectru larg de aciune. IL-1 este un mediator pleiotropic (cu efecte multiple) al rspunsului gazdei la infecii sau la leziuni:

-stimuleaz producerea altor citochine (G-CSF, TNF-, IL-6, IL-8, IL-11, PDGF);Fig.82. IL-1 este produs de multe tipuri celulare ca rspuns la leziuni, infecie sau dup stimularea antigenic i influeneaz multe categorii de celule i procese; stimuleaz activitatea citocid a celulelor NK; activeaz metabolismul PMN i chimiotaxia spre situsul producerii IL-1; induce expresia moleculelor de aderen n endoteliu i mrete permeabilitatea; stimuleaz chimiotaxia i funcia citocid a macrofagelor; stimuleaz proliferarea celulelor Th, exprimarea receptorului pentru IL-2 i pro-ducerea de citochine; stimuleaz proliferarea i dife-renierea limfocitelor B n celule productoare de anticorpi.

- stimuleaz prolife-rarea celulelor T, crescnd sinteza de IL-2 i exprimarea receptorilor pentru IL-2 pe celulele T;

- induce exprimarea moleculelor CMH II pe CPA;

- stimuleaz diferen-ierea limfocitelor pre-B i maturarea lor n celule B;

- stimuleaz monocitele s produc IL-1 (bucl autocrin);

- este chemoatractant pentru leucocite la situsul inflamaiei, prin inducerea sintezei moleculelor de aderen pe endoteliul vascular;

- induce sinteza pro-teinelor de faz acut (CRP) n ficat;

- este reglatoare a hema-topoezei, contracarnd efectele mielosupresoare ale radioterapiei i chimioterapiei prin inducerea sintezei SOD (enzim cu Mn) n mitocondrii;

- stimuleaz producerea de CRH din hipotalamus, cu eliberarea ACTH din hipofiz. IL-1 poate stimula direct eliberarea ACTH. Stimularea axei hipotalamo-corticosuprarenalei induce sinteza glucocorticoizilor. Acetia au efect reglator prin feed-back, inhibnd sinteza IL-1, dar stimulnd exprimarea receptorilor pentru IL-1;

- pare a avea rol n distrugerea cartilajului articular, sub aciunea unei metaloproteaze produs de condrocite, care caracterizeaz artrita reumatoid. In aceast maladie autoimun, IL-1 activeaz condroclastele i osteoclastele i de aici deriv denumirea ei de catabolin;

- stimuleaz proliferarea fibroblastelor;

- in vitro are efecte citostatice i citocide pentru unele linii de celule maligne;

- este factorul pirogen endogen, pentru c stimuleaz sinteza prostaglandinelor (PG3), active asupra centrului hipotalamic al termogenezei, producnd febr; Fig.83. Cile producerii compuilor icozanoidici din fosfolipidele membranare. Liniile groase reprezint conversia enzimatic, iar cele ntrerupte, transformri neenzimatice. PG = prostaglandin; Tx = tromboxan; Lt = leucotrien.

Fig.84. Reprezentare schematic a cascadelor enzimatice ce duc la formarea PG i LT, mediatori ai efectelor endotoxice i ai reaciilor inflamatorii.

- stimuleaz proliferarea celulelor B dup contactul lor cu Ag;

- este factor contrasupresor, deoarece inhib activitatea celulelor Ts;

- stimuleaz activitatea metabolic a macrofagelor i secreia enzimelor (colagenaz), uurnd mobilitatea lor n substana fundamental;

- activeaz limfocitele T i B;

- produce hipozincemie4 i hipoferemie i inhib creterea i diviziunea celulelor bacteriene;

- asupra cortexului cerebral, IL-1 produce inhibiie (somn), cu unde lente.

IL-2

IL-2 a fost descoperit n 1976 de Gallo, n mediul de cretere al limfocitelor normale, stimulate cu PHA. Denumirea veche a IL-2 este TCGF(T-cell growth factor). IL-2 este principalul hormon cu rol esenial n generarea unui rspuns eficient i este factorul esenial reglator al rspunsului imun. Este produs de limfocitele TCD4 activate. Limfocitele TCD4 n repaus nu produc IL-2, dar limfocitele Th1 se activeaz dup ce recunosc antigenul asociat cu moleculele CMH II i produc IL-2 i interferon , iar setul Th2 produce IL-4, IL-5 i IL-6. Unele clone de limfocite TCD8 pot produce cantiti mici de IL-2. Limfocitele B infectate cu VEB produc IL-2. In vitro, IL-2 este produs de linii celulare T, dup stimulare cu PHA sau Con A. Alte linii celulare sintetizeaz IL-2 constitutiv, fr stimularea prealabil cu lectine mitogene.

Conformaia tridimensional a moleculei de IL-2 este un -helix, alctuit din 4 catene.

Activiti biologice. IL-2 exercit efect stimulator asupra celulelor care au secretat-o (bucl autocrin), dar i asupra altor limfocite (bucl paracrin), deoarece receptorul de mare afinitate pentru IL-2 se gsete pe majoritatea celulelor limfoide.

Limfocitele stimulate prolifereaz i exprim, la densitate nalt, receptorii de IL-2 pe suprafaa lor. Astfel se produce expansiunea clonal a limfocitelor care au recunoscut specific un antigen. Interaciunea IL-2 cu receptorul su declaneaz activarea i proliferarea celular.

Rolul primar al IL-2 este expansiunea clonal a limfocitelor CD4 i CD8.

IL-2 stimuleaz diferenierea limfocitelor TCD4, n celule Th1 sau Th2. Asupra celulelor Th1, IL-2 acioneaz autocrin, iar asupra celulelor Th2 i CD8 acioneaz ca factor paracrin. Stimuleaz activitatea citotoxic a limfocitelor CD8. Fig.85. IL-2 este sintetizat de limfocitele Th. Rolul su esenial este stimularea celulelor T i eliberarea mediatorilor (IFN ), dar stimuleaz i creterea limfocitelor B. Activarea monocitelor i a celulelor NK este important pentru amplificarea rspunsului imun. La pacienii cu carcinom renal, precursorii autologi ai celulelor NK pot fi activai in vitro, de doze mari de IL-2 (1000 UI/ml) i genereaz celule LAK (lymphokine-activated killer), utilizate experimental n terapia cancerului.

Limfocitele B, dup stimularea sub aciunea IL-2, se activeaz, exprim receptori de mare afinitate pentru IL-2, prolifereaz intens i secret IgG, IgA, IgM. IL-2 stimuleaz comutarea izotipic din rspunsul imun secundar.

Celulele NK rspund la efectul stimulator al IL-2 prin creterea activitii citotoxice, fr activarea proliferrii.

IL-2 stimuleaz activitatea macrofagului, care devine citotoxic pentru celulele tumorale i pentru bacteriile parazite intracelular. Macrofagul stimulat produce H2O2, NO, PGE2 i TNF-. Activitatea antifungic a granulocitelor crete mult dup stimularea cu IL-2. Probabil se intensific producerea de lactoferin i TNF-.

Sinteza IL-2 este stimulat de IL-1. La rndul ei, IL-2 stimuleaz sinteza IL-4, 5, 6. IL-2 rmne principala citochin care controleaz rspunsul proliferativ al limfocitelor CD4.

Sinteza IL-2 este indus de orice stimul antigenic, dar aciunea ei este specific, deoarece determin numai expansiunea clonelor care au recunoscut determinanii antigenici.

Gena codificatoare a IL-2 a fost clonat, ceea ce a permis obinerea unei cantiti suficiente de IL-2 n stare cristalizat. Este o glicoprotein de 15,4 kD i conine resturi de sialil i glicozil.

S-a clonat gena codificatoare pentru receptorul IL-2. Receptorul este format din 3 catene polipeptidice: IL-2R (55kD), IL-2R (75 kd) i catena , al crei rol rmne incert. Catena este component a receptorilor celulari pentru alte citochine: IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 i de aceea a fost notat cu c (comun). S-au identificat trei clase de receptori pentru IL-2:

- receptorul de mare afinitate, format din toate cele trei catene;

- receptorul de afinitate medie, format din catenele i ;

- receptorul de mic afinitate, format numai din catena .

Limfocitele nestimulate antigenic au numai receptorul de mic afinitate. Dup stimularea antigenic primar, se exprim receptorul de afinitate intermediar, iar dup stimularea secundar se exprim, cu o densitate mare, receptorul de afinitate nalt. Aceasta sugereaz c intensitatea rspunsului imun este condiionat de disponibilitatea receptorilor de IL-2.

Receptorul de IL-2 funcioneaz ca un ntreruptor start-stop (on-off). IL-2 interacioneaz iniial, cu catena de 55 kD i ulterior, cu cea de 75 kD. Interaciunea este ferm i de aceea, disocierea este lent. Dup disocierea IL-2 de receptor, semnalul de activare a limfocitelor dispare.

IL-3 este un polipeptid de 140 aminoacizi la oarece i 133 la om. Este produs de limfocitele T i de celulele NK, iar mastocitele i eozinofilele stimulate produc cantiti mici de IL-3. In reaciile alergice, IL-3 modific funciile mastocitelor, eozinofilelor i macrofagelor. Efectele ei se exercit asupra celulelor din imediata vecintate a celor care au produs-o, dar cnd se produce o activare masiv a limfocitelor (de exemplu, n infecia gripal), IL-3 apare i n circulaie i efectele ei sunt sistemice. IL-3 stimuleaz activarea celulelor accesorii (granulocite, fagocite, plachete), cu funcii de aprare i reparare ntr-un focar inflamator. Stimuleaz diferenierea celulelor stem n mduva hematopoetic, efectul fiind recuperarea funcional a mduvei osoase consecutiv chimioterapiei citotoxice.

IL-4 este produs de cteva seturi de limfocite i are efecte multiple asupra celulelor limfoide. Sursa major de IL-4 sunt limfocitele Th2, o subpopulaie esenial pentru iniierea RIMH fa de agenii patogeni extracelulari. IL-4 acioneaz autocrin i determin stimularea celulelor productoare. Stimuleaz exprimarea moleculelor CMH II pe celulele B i secreia IgE i IgG1. De aceea s-a numit factorul stimulator al limfocitelor B. Induce diferenierea celulelelor TCD4 spre celule Th2, care la rndul lor secret IL (IL-5, IL-10) stimulatoare ale RIMH. Este o citochin anti-inflamatorie, producnd inhibiia citochinelor inflamatorii (IL-1, TNF) i a PG.

IL-5 este secretat de limfocitele Th2 i stimuleaz proliferarea i diferenierea limfocitelor B n rspunsul imun. Stimuleaz diferenierea celulelor stem medulare, n monocite i eozinofile. Sinteza crescut a IL-5 determin eozinofilie.

IL-6 este o citochin multifuncional, secretat de macrofage, de limfocitele T, de celulele endoteliale. Stimuleaz sinteza IgA n structurile limfoide asociate mucoaselor. Efectele IL-6 sunt sinergice cu ale IL-1. IL-6 este un mediator al rspunsului de faz acut. Rspunsul de faz acut este o reacie sistemic anti-inflamatoare, consecutiv infeciei sau leziunii tisulare i se caracterizeaz prin febr, leucocitoz, creterea permeabilitii vasculare, scderea nivelului metalelor (Zn, Fe) i a steroizilor plasmatici, dar crete nivelul proteinelor de faz acut. Proteinele de faz acut sunt sintetizate de hepatocite sub aciunea stimulatoare a unui factor specific, iar IL-6 are aciune similar cu aceea a factorului stimulator al hepatocitelor.

IL-7 este produs de fibroblaste. La oarece, rolul esenial al acestei citochine este de a stimula diferenierea celulelor limfoide imature, n limfocite T i B, n special intrarea i meninerea lor n faza S. Situsurile aciunii sale sunt mduva osoas i timusul.

IL-8 este produs de macrofage, fibroblaste, celule endoteliale. Face parte din categoria chemochinelor. Aciunea sa principal este cea chemotactic fa de neutrofile, eozinofile, limfocite T, n focarul inflamator. Sinteza ei rapid este indus de LPS, de infecia viral, n celulele mononucleare din snge, n fibroblaste, n cheratinocite. IL-8 stimuleaz activarea neutrofilelor (migrare transendotelial, eliberarea enzimelor lizosomale, intensificarea metabolismului oxidativ, generarea anionului superoxid n focarul inflamator). Are efecte asupra celulelor nelimfoide: este haptotactic(induce migrarea celulelor epiteliale spre suprafa).

IL-9 este sintetizat de limfocitele T i determin efecte multiple asupra celulelor stem hematopoetice, limfopoetice i neuronale. Aciunea sa este sinergic cu IL-4. In absena IL-4, IL9 stimuleaz activarea limfocitelor B i sinteza IgE i IgG.

IL-10 are rol reglator important asupra sintezei diferitelor citochine. Este produs de limfocitele T activate, de monocite, de celulele B, de cheratinocite(dar i de celulele carcinomului de colon, de melanoame). Celulele Th2 constituie sursa principal de IL-10, dar este produs de clone Th1 dup stimularea cu antigenul specific. Efectele sale multiple se exercit asupra limfocitelor, monocitelor, celulelor NK, celulelor dendritice. Inhib activarea macrofagelor i exprimarea moleculelor CMH II pe suprafaa lor. Inhib sinteza citochinelor proinflamatorii. Fig.86. IL-12 este produs de macrofage i are rol central n rspunsul imun. IL-12 stimuleaz celulele NK i T s elibereze interferon , iar celulele T neangajate sunt stimulate s se diferenieze spre fenotipul Th1.

IL-11 are ase-mnri funcionale cu IL-6, dar are un spectru mai restrns de aciune. Efectele sale se exercit asu-pra sistemului hema-topoetic, limfopoetic, hepatic, adipos i neuronal. Este proinflamatorie i induce sinteza proteinelor de faz acut.

IL-12 s-a identificat n supernatantul liniilor celulare B transformate, ns celulele B normale (de om i oarece) nu sintetizeaz cantiti semnificative de IL-12. Sursele principale sunt macrofagele i celulele dendritice. Macrofagele - primele celule care recunosc antigenul, ncep s produc IL-12. Celulele int ale IL-12 sunt limfocitele T (CD4, CD8) i NK. In vivo, IL-12 induce diferenierea limfocitelor TCD4, n celule Th1 care sintetizeaz interferon , inductor al anemiei, neutropeniei i limfopeniei. Este o citochin de iniiere a rspunsului imun, fiind puntea de unire ntre reaciile de aprare nespecific i rspunsul imun specific. Stimuleaz diferenierea celulelor Th neangajate, n celule Th1, mediatoare ale RIMC.

IL-13 este produs de celulele Th2, dar i de alte seturi de celule Th, de celulele TCD8, de alte celule activate (mastocite, eozinofile, bazofile). Induce proliferarea limfocitelor B care sintetizeaz IgE i IgG4, sugernd rolul su n patogeneza strilor alergice. Inhib activarea macrofagelor i sinteza citochinelor proinflamatorii, avnd astfel proprieti anti-inflamatorii.

IL-15 are multe activiti biologice comune cu ale IL-2. Catenele i ale receptorului pentru IL-15 sunt comune i pentru receptorul de IL-2, iar catena este specific. IL-15 are o distribuie tisular mai larg dect IL-2. Este factor de cretere pentru celulele T (umane i de oarece), pentru celulele B i NK. Are aciune sinergic cu IL-12. IL-15 se gsete n lichidul sinovial la pacienii cu artrit reumatoid, unde recruteaz limfocitele T i le stimuleaz pentru a produce IFN , TNF- i GM-CSF. Rolul reglator al IL-2 nu este compensat de IL-15 i nici de alte citochine.

Alte citochine

Celulele limfoide i macrofagele sintetizeaz factori proteici, denumii limfotoxine, cu efect litic asupra celulelor sensibile. Limfotoxina s-a evideniat iniial, ca un factor citotoxic n supernatantul limfocitelor activate.

Limfotoxinele sunt produse de limfocitele TCD8, de celulele NK i de macrofagele stimulate. Denumirea de limfotoxine deriv de la efectul lor citotoxic sau citostatic, fa de celulele malignizate sau fa de cele infectate cu virusuri.

Limfotoxina produs de limfocitele Tc se numete perforin i are rol major n liza celulei int.

Limfotoxina poate fi produs ca protein solubil sau ca protein asociat membranei citoplasmatice a unor celule. Forma solubil a limfotoxinei este alctuit din trei monomeri de limfotoxin (LT ) i este produs de celulele Tc (CD8) i de subsetul Th-1 al limfocitelor CD4.

Limfotoxina se exprim i pe suprafaa celulelor T, ntr-o alt variant biochimic: o subunitate proteic a LT-, asociat cu dou molecule de LT-.

Macrofagele stimulate cu endotoxine, sintetizeaz o monokin de 17 kD, denumit TNF- sau caectin.

TNF- este o glicoprotein de 156 aminoacizi, trimeric, produs n primul rnd de macrofage dar i de alte celule: adipocite, limfocite B, cheratinocite, fibroblaste, granulocite, mastocite, monocite, celule NK, celule musculare netede, celule T.

Factorii inductori ai sintezei TNF- sunt foarte numeroi: celulele alogenice i bacteriene, peptidoglicanul, complexele imune, LPS, intermediarii reactivi ai reducerii O2, celule malignizate, infecia viral, zimosanul din peretele levurilor, ionii de Zn etc.

Efecte. TNF- inhib ciclul de replicare viral i stimuleaz diferite activiti biologice: diferenierea monocitelor n macrofage, activitatea ADCC, sinteza moleculelor CMH I i II, activitatea fagocitar, creterea i proliferarea fibroblastelor, este un factor pirogen, hipotensiv, favorizeaz regenerarea ficatului, induce sinteza proteinelor de faz acut i apoptoza celulelor int, activeaz celulele endoteliale, stimuleaz distrugerea cartilajului, activeaz limfocitele T i B, stimuleaz sinteza Ig. Local, TNF- mrete aderena limfocitelor TCD8 la endoteliul vascular i le stimuleaz citotoxicitatea. Este o citochin proinflamatorie.

TNF- este implicat direct n distrugerea celulelor B insulare, n diabetus melitus insulinodependent.

Denumirea de caectin pentru TNF- deriv de la efectul ei stimulator asupra catabolismului, ceea ce explic apariia i manifestarea sindromului de epuizare (caexia), caracterizat prin pierderea n greutate, la pacienii neoplazici sau cu infecii cronice. Caectina inhib transcrierea genelor care codific sinteza enzimelor lipogene.

Receptorii de caectin se gsesc pe hepatocite, pe celulele musculare i adipoase i rspund prin intensificarea catabolismului. Ca urmare, trigliceridele sunt mobilizate din depozite i crete concentraia plasmatic a lipoproteinelor cu densitate foarte mic.

Factorul inhibitor al migrrii macrofagelor (MIF) este prima limfochin ale crei efecte au fost descrise. Inhibiia migrrii macrofagelor este produs de o varietate de factori: citochine, mitogene, toxine. Sub denumirea de MIF a fost caracterizat o protein de 12, 5 kD din umoarea apoas a camerei anterioare a globului ocular, care produce supresia rapid a citotoxicitii mediat de celulele NK, fa de endoteliul corneean. Camera anterioar a globului ocular este considerat ca situs privilegiat din punct de vedere imunologic. esuturile sale (endoteliul corneean i cristaloida) nu exprim molecule CMH I i astfel devin inta atacului litic al celulelelor NK infiltrate. Activitatea inhibitorie a MIF a fost anulat de anticorpii specifici antiMIF.

INTERFERONII I MECANISMELE ACIUNII LOR

Interferonii sunt o categorie special de citochine, a cror sintez este indus de diferii ageni chimici sau biologici. Funciile lor se caracterizeaz printr-un spectru larg de activiti nespecifice, cea mai important fiind inducia strii antivirale.

Interferonul a fost descoperit de Isaacs i Lindenmann (l957). Ei au observat c injectarea membranei corioalantoice a embrionului de gin, cu virus influenza inactivat (denumit virus inductor sau interferent), blocheaz replicarea ulterioar a virusului influenza infecios (virus revelator al interferenei). Autorii au artat c inhibiia replicrii virale (interferena) se datoreaz unui factor inhibitor, pe care l-au denumit interferon (IFN).

Elucidarea naturii chimice i a modului de aciune a interferonilor a constituit o problem de interes major a biologiei moleculare i a virologiei n ultimele decenii.

Inducerea strii antivirale este cea mai important funcie a interferonilor, dar ei au i alte activiti biologice majore:

- inhibiia multiplicrii celulelor normale i tumorale

- reglarea proceselor de difereniere celular

- reglarea funciei imunitare.

Natura interferonilor. Diferitele variante moleculare de interferoni au fost grupate n dou tipuri: interferoni de tip I i de tip II. Interferonul de tip I cuprinde variantele , i . Interferonul de tip II include varianta molecular . Interferonul este produs de leucocite i este reprezentat de o varietate larg de molecule, codificate de un numr mare de gene. Interferonul este sintetizat de variate celule nehematopoetice (de exemplu, fibroblaste), dup infecia cu virus sau dup ce sunt stimulate cu ARN dublu catenar. Sinteza sa este codificat de o singur gen. Interferonul , s-a identificat la bovine i la ovine i este sintetizat n cantiti mari n epiteliul uterin, n perioada care precede implantarea embrionului i de aceea s-a denumit interferon trofoblastic. Interferonul este produs de limfocitele activate sub aciunea antigenului specific sau a substanelor mitogene i reprezint interferonul de tip II. Deoarece, in vivo, este sintetizat de limfocitele T activate, de limfoblastele seriei B i de limfocitele granulare mari (celulele NK), interferonul este considerat a fi de tip imun.

Distribuia interferonilor n cele dou tipuri i subtipuri se bazeaz pe proprietile lor antigenice individuale. Antiserul specific fa de moleculele de interferon ale unui tip nu precipit i nu neutralizeaz aciunea interferonilor celuilalt tip.

n general, moleculele de interferoni sunt glicoproteine. Interferonii i au resturi glucidice legate la asparagina 80 i respectiv 25 i 97. Majoritatea interferonilor nu sunt glicozilai. Glicozilarea nu este esenial pentru exprimarea activitilor biologice, ceea ce explic faptul c interferonii sintetizai n celulele bacteriene, de genele codificatoare clonate, au activitate biologic.

Interferonii i sunt stabili chiar la pH 2 i i pstreaz activitatea n prezena SDS, ultima fiind o proprietate foarte important pentru purificare.

Sinteza interferonilor. In mod obinuit, celulele normale nu sintetizeaz cantiti detectabile de interferoni. Genele codificatoare ale sintezei lor nu sunt transcrise. Sinteza interferonilor este indus de diferii ageni: virusuri infecioase sau inactivate, moleculele de ARN dublu catenare helicale, endotoxinele bacteriilor Gram negative (Brucella sp., Listeria monocytogenes), infecia cu micoplasme, cu rickettsii i chlamidii, polimerii sintetici, mananii (polizaharide), diferii activatori metabolici etc. LPS este un bun inductor al IFN i .

Pentru virusurile cu genom ARN dublu catenar, inductorul sintezei de interferon este chiar genomul viral. Virusurile cu genom ADN, cu excepia celor din grupul pox, sunt slab inductoare, iar cele cu genom ARN monocatenar sunt inductoare ale sintezei interferonilor, deoarece ARN se replic printr-un intermediar dublu catenar.

ARN monocatenar, ADN mono- sau dublu catenar, ca i hibrizii ADN-ARN nu sunt inductori ai sintezei interferonilor.

Virusurile inactivate (din vaccinuri), ca i cele ce infecteaz un substrat nepermisiv sunt inductoare ale sintezei interferonilor. n leucocitele mononucleare, sinteza IFN este indus de glicoproteinele nveliului viral.

In vitro, la 37o, sinteza ncepe la 4 ore dup infecia viral i atinge rata maxim concomitent cu sinteza proteinelor virale.

Informaia genetic codificatoare a sintezei interferonilor este distribuit n trei familii de gene. Sinteza interferonului este codificat de l4 gene i 7 pseudogene, localizate pe braul scurt al cromosomilor perechii a 9-a. Interferonul este codificat de o gen (sau cteva), cu aceiai localizare, iar interferonul este codificat de o singur gen localizat pe perechea a l2-a de cromosomi. Ca o caracteristic, nici una din gene nu conine introni.

Cel mai bun inductor al sintezei de interferon este ARN dublu catenar natural sau sintetic. Mecanismul induciei nu este cunoscut. Probabil, ARN dublu catenar induce sinteza unui factor, care, la rndul su neutralizeaz represorul specific al transcrierii acestor gene. Factorul determinant al induciei este nsi natura bicatenar a moleculei de ARN i nu informaia genetic nscris n ea. Nu se cunoate nici mecanismul induciei sintezei interferonului (de tip imun), n limfocitele activate de antigenul specific sau stimulate de mitogene.

Inducia sintezei interferonilor necesit sinteza ARNm i traducerea sa n catena polipeptidic. Inhibitorii sintezei proteinelor (actinomocina D), administrai simultan cu inductorul, inhib sinteza interferonilor.

Interferonii secretai de diferite specii de organisme sau de diferite categorii de celule ale unui organism, prezint deosebiri legate de secvena aminoacizilor, de coninutul glucidic, care au stat la baza gruprii lor n cele trei clase.

Toi interferonii se sintetizeaz ca precursori de l66 aminoacizi, cu secvene semnal N-terminale de 20-23 aminoacizi, necesare secreiei. Dimensiunle reale ale catenei polipeptidice sunt de l43, l45 i respectiv de l46 resturi de aminoacizi.

Molecula de interferon are dou domenii cu secvene de aminoacizi relativ constante: unul n jumtatea N-terminal, care formeaz situsul de legare pe receptorul celular, iar cellalt, n jumtatea C-terminal, pare s moduleze legarea de receptor i probabil mediaz funciile biologice.

Studiul biochimic al moleculei de interferon a fost nlesnit de obinerea anticorpilor monoclonali specifici fa de diferite tipuri de interferon.

Interferonii se sintetizeaz, probabil, la toate clasele de vertebrate.

Activiti biologice efectoare ale interferonilor

Activitatea biologic principal a interferonilor este cea antiviral i a fost demonstrat experimental. Infeciile virale sunt mult mai severe la animalele de experien, crora, odat cu virusul infecios li s-a injectat ser imun specific anti-interferon.

Interferonii formeaz prima linie de aprare umoral fa de infeciile virale, nainte de mobilizarea rspunsului imun. Interferonii protejeaz celulele de efectele citopatice virale, dar nu elimin complet infecia. Starea de protecie antiviral, indus de interferoni dureaz cteva zile i apoi dispare. Dup cteva zile de absen, starea de protecie poate fi indus din nou.

Interferonii nu au aciune antiviral direct, ci induc o stare antiviral.

Interferonii au specificitate de specie, adic activitile biologice i n special efectul protector antiviral se manifest fa de orice virus, n raport cu celulele speciei care a produs interferonul. Baza specificitii de aciune, rezid n interaciunea dintre interferon i receptorul celular. Activitatea biologic a interferonilor este direct proporional cu afinitatea lor de legare cu substratul celular. Interferonul de oarece are, in vitro, efect protector fa de celulele de oarece, indiferent de virusul infectant. Acelai interferon are un efect protector minim (5%) pentru celulele de obolan, iar pentru celulele umane, efectul protector este nul.

Protecia antiviral este dependent de concentraia interferonilor. Dozele mari, administrate n sisteme experimentale, in vitro, sunt protectoare fa de nivelul sczut al multiplicitii de infecie, asemntor celui natural. Multiplicitatea nalt de infecie (cea experimental), depete efectul protector al interferonilor.

Descoperirea interferonilor a condus la revizuirea conceptului imunitii celulare i a rolului su n limitarea infeciilor virale. Sistemul interferonului este primul care i exercit efectul protector, dintre toate sistemele de aprare cunoscute. El este operativ n decurs de cteva ore de la infecie.

Cele mai multe virusuri sunt inductoare ale sintezei interferonului i sunt sensibile, n diferite grade, la aciunea lui.

Interferonul este produs de celulele infectate, concomitent cu desfurarea ciclului multiplicrii virale. Este eliberat din celule imediat dup sintez i difuzeaz spre celulele nvecinate, crora le induce starea antiviral. Astfel, virusul, n ciclul su replicativ, ntlnete o barier intracelular. Nivelul activitii antivirale, probabil, este dependent de concentraia extracelular a interferonului, astfel c celulele nvecinate celor productoare de interferon devin cele mai rezistente la infecia cu virus. Celulele mai ndeprtate sunt mai puin protejate.

Eficiena relativ a diferitelor mecanisme de aprare, inclusiv a celui mediat de interferon depinde de ruta pe care se rspndete virusul. De la poarta de intrare, virusul se disemineaz spre organele int, pe calea fluidelor organismului (snge, limf), prin leucocitele infectate sau pe cale axonal. Diseminarea pe cale sanguin i limfatic este limitat de macrofagele asociate capilarelor sanguine i limfatice. Viremia diminu i odat cu ea diminu severitatea infeciei. Experienele cu administrare de interferon evideniaz c interferonul circulant reduce viremia i protejeaz organele int. Interferonul este mai puin eficient fa de virusurile care se disemineaz pe cale axonal.

La pacienii hipogamaglobulinemici, limitarea i eliminarea infeciei virale este rezultatul aciunii interferonului, a reaciei febrile a organismului, a rspunsului inflamator i a imunitaii mediate celular.

Bazele moleculare ale activitii interferonilor

Interferonii nu au activitate biologic n celulele care i sintetizeaz. Principala lor activitate cea antiviral- nu este direct, deoarece interferonii nu sunt molecule efectoare, ci inductori ai strii antivirale. Interferonii acioneaz asupra celulelor neinfectate i le induc starea de rezisten fa de infecie, influennd multiplicarea virusurilor n diferite etape ale ciclului (de exemplu, transcrierea ARNm, traducerea etc.), n funcie de sistemul celular.

Dup secreia din celulele n care a fost sintetizat, interferonul se leag de receptorul membranar al altor celule, unde funcioneaz ca o citochin paracrin i activeaz un set de gene specifice. Corespunztor celor dou tipuri de interferoni, se cunosc dou tipuri de receptori. Ambele sunt glicoproteine de membran.

Complexele interferon-receptor sunt endocitate. Internalizarea lor declaneaz evenimentele nucleare, al cror rezultat este starea antiviral i apariia unor modificri ale metabolismului celular.

Interferonii induc sinteza unor proteine, care mediaz efectele lor multiple. Starea antiviral este produs pe mai multe ci. Pot fi inhibate diferite etape ale ciclului de replicare viral: penetrarea i dezvelirea, transcrierea ARNm viral, traducerea ARNm viral, replicarea genomului, asamblarea i eliberarea virusului progen. Decisiv este natura virusului, dar tipul celular poate avea un rol important. Starea antiviral este, n primul rnd, consecina sintezei n celul, a unei proteine inhibitoare a transcrierii i/sau a traducerii mesajului genetic viral (PIT), care interfer fie cu sinteza ARNm viral, fie cu traducerea sa, fie cu ambele procese. O a II-a cale major a inducerii strii antivirale este degradarea ARNm viral prin aciunea 2-5 oligo-adenilat-sintetazei i a riboendonucleazei.

n cele mai multe sisteme virus-celul, inhibiia multiplicrii virale este rezultatul interferenei cu etapa traducerii ARNm viral. In celulele liniei sensibile L (originar din fibroblaste de embrion de oarece), infectate cu virus vaccinal, se produce dezagregarea polisomilor celulari. ARNm viral se asociaz cu ribosomii eliberai i formeaz polisomi ce sintetizeaz proteine specific virale. In celulele tratate cu interferon, nainte de infecia viral, ARNm viral nu se asociaz cu ribosomii i nu se sintetizeaz proteine specifice. In absena proteinelor virale, infecia este abortiv. Efectul este acelai dup infecia cu reo-, picorna-, toga-, rhabdo-, paramixo-, herpessau cu papovavirusuri.

n celulele tratate cu actinomicina D (un inhibitor specific al sintezei proteice), efectul protector al interferonului nu se realizeaz.

Una din proteinele inhibitoare ale traducerii ARNm viral este protein-chinaza dependent de ARN dublu catenar (PKR), denumit i chinaza factorului de iniiere a sintezei proteinelor la eucariote (eIF-2). Fig.87. Aciunile antivirale ale interferonilor (IFN). Interferonii se leag specific de receptorii de IFN i produc numeroase efecte, dou dintre ele fiind ilustrate n schem. IFN induc sinteza proteinelor antivirale 2,5 adenozin-sintetaza i o protein-chinaz. Ambele sunt activate de ARN dublu catenar, intermediarul replicrii virale. Sintetaza induce formarea 25ppp-oligo A, care activeaz o endonucleaz capabil s produc degradarea ARNm. Protein-chinaza fosforileaz factorul de iniiere al traducerii proteinelor, elF2, pe care l inactiveaz (dup Male, 1987).

PKR este o chinaz serin/treonin, prezent n celule i n mod normal se sintetizeaz cu o rat foarte sczut. Enzima, n proporie de 20% se gsete n nucleu (mai ales n nucleol) i 80% are sediul citoplasmatic. In cea mai mare parte, protein-chinaza citoplasmatic este legat de ribosomi i este mai fosforilat dect cea nuclear. Protein-chinaza este inactiv (latent), dar poate fi activat de ARN dublu catenar. n celulele tratate cu interferon, nivelul protein-chinazei (o protein de 67 kD) crete de peste 20 de ori.

PKR se activeaz n prezena ARN dublu catenar, rezultatul fiind autofosforilarea ctorva resturi de serin i treonin. Autofosforilarea este cel mai probabil, intermolecular i se produce ntre dou molecule de PKR asociate cu aceiai molecul de ARN dublu catenar. In consecin, concentraiile mari de ARN-dublu catenar inhib procesul autofosforilrii. Heparina (un polianion) activeaz aceast enzim. Substratul fiziologic unic al PKR fosforilate este subunitatea a factorului de traducere eIF-2. eIF-2 fosforilat nu poate fi reciclat pentru iniierea traducerii i produce inhibiia sintezei proteinelor celulare.

n celula infectat cu un virus, protein-chinaza, se asociaz cu ARN-dublu catenar, se activeaz i se fosforileaz. Protein-chinaza activat, poate fosforila un numr de substraturi celulare, inclusiv factorul 2 , de iniiere a sintezei proteinelor la eucariote (eIF-2 ), la restul de serin 5l (Kumar, 1998). eIF-2 fosforilat, blocheaz iniierea sintezei catenei polipeptidice.

Alt cale activat de ARN dublu catenar i de interferon este calea 2,5-oligo-adenilatsintetazei/RN-aza. Interferonii induc sinteza unei familii de enzime denumite 2-5(A)sintetaze, care polimerizeaz ATP n oligo-adenilai de diferite lungimi, legai 2-5. Aceste enzime sunt inactive, dar se activeaz datorit unei schimbri conformaionale care se produce consecutiv legrii sale cu ARN dublu catenar. 2,5-AS activat este capabil s polimerizeze ATP i alte nucleotide n legturi 2-5. In molecula de 2,5-oligoadenozin, resturile de riboz sunt legate prin puni fosfo-diesterice 2-5. Acestea sunt legturi unice, deoarece toate polinucleotidele naturale conin legturi 3-5.

2,5-oligoadenozina activeaz RN-aza L. RN-aza L este detectabil n toate celulele animale. Majoritatea celulelor conin o fosfodiesteraz ce poate hidroliza 2-5(A). RN-aza L poate cliva ARN celular i viral monocatenar la secvene specifice UpA, UpG i UpU. RN-aza L poate manifesta efecte antivirale prin inducia apoptozei. Aceast cale este activ n inhibiia replicrii picornavirusurilor n celulele tratate cu IFN

Cei mai buni interferoni stimuleaz sinteza interferonilor, care la rndul lor activeaz ambele enzime (adenilat-sintetaza i protein-kinaza).

Interferonii au aciune direct, prin inducerea modificrilor n membrana plasmatic a celulei, mrind rigiditatea stratului lipidic. Acesta poate fi mecanismul efectului inhibitor al interferonului asupra transformrii maligne a celulelor, sub aciunea virusurilor oncogene.

Dac la nivel celular, efectele antivirale ale interferonilor sunt mediate n primul rnd prin aciunea proteinelor antivirale intracelulare, n organism interferonii acioneaz prin alte mecanisme. Interferonii stimuleaz funcia imunitar. Celulele infectate de virusuri sunt lizate de celulele imunitare. Recunoaterea lor este mediat de moleculele CMH I, a cror expresie este stimulat de interferoni. Interferonii sunt stimulatori ai enzimei nitric-oxid-sintetaz, care prin oxidul nitric(NO) inhib replicarea virusurilor n anumite celule.

Alte activiti biologice ale interferonilor. Interferonii exercit o gam larg de aciuni, cu efecte inhibitoare sau stimulatoare asupra celulelor sensibile

Efectele inhibitorii se exercit nu numai asupra multiplicrii virusurilor, ci i asupra creterii i multiplicrii microorganismelor parazite cu localizare intracelular, asupra unor activiti metabolice tisulare (de exemplu, prin inhibiia sintezei proteice, interferonul poate s induc procese de necroz celular), asupra multiplicrii celulelor tumorale, asupra creterii i diviziunii celulelor normale, asupra reaciilor de hipersensibilitate ntrziat.

Efectele stimulatoare ale interferonilor se exercit asupra nivelului de exprimare a unor molecule de suprafa a celulelor (de exemplu, moleculele CMH, receptorii de mare afinitate pentru regiunea Fc a IgG pe suprafaa macrofagului, cu consecine importante pentru rata eliminrii complexelor imune prin fagocitoz i asupra ADCC). Fig. 88. Funciile IFN sunt multiple: activitile antiviral i antiproliferativ sunt mai puin intense dect ale IFN i , dar este cel mai puternic inductor al activrii macrofagelor i al exprimrii moleculelor CMH clasa II pe celulele tisulare, fiind sinergic cu TNF i TNF .

Interferonii stimuleaz activitatea citotoxic a limfocitelor NK i activeaz metabolismul oxidativ al macrofagelor, precum i activitatea lor antitumoral. Pe suprafaa limfocitelor T, interferonii intensific exprimarea receptorilor pentru IL-2. Stimuleaz rspunsul imun, dac este administrat concomitent cu antigenul. Efectul imunostimulator se poate atribui unei mai bune exprimri a moleculelor CMH, ceea ce condiioneaz o prezentare mai eficient a antigenului.

Semnificaia biologic a interferonilor. Interferonii sunt componente ale reelei citochinelor. Citochinele sunt molecule active, produse de diferite categorii de celule, sub aciunea unor stimuli, inclusiv sub aciunea interferonilor.

Citochinele interacioneaz cu receptorii altor celule i regleaz procesele lor de proliferare i difereniere. Deoarece limfocitele stimulate produc interferon , aceast clas de molecule face parte din categoria limfochinelor.

Adeseori, efectele biologice ale diferitelor categorii de citochine sunt antagonice. Homeostazia celular este, probabil, rezultatul unui echilibru ntre efectele induse de o varietate de citochine.

ntre interferoni i hormoni, exist cteva asemnri, cu privire la mecanismul secreiei i eliminrii din celulele productoare, al interaciunii cu celulele sensibile, al mecanismului de aciune asupra celulelor (ca i hormonii, interferonii activeaz ciclazele GMP i AMP), precum i n ceea ce privete efectele reglatoare i modulatoare ale celor dou categorii de molecule asupra reaciilor imunitare.

Avnd n vedere aceste asemnri, s-a propus ca interferonii s fac parte din grupul hormonilor neclasici, alturi de EGF (Epidermal Growth Factor), PDGF (Platelet Derived Growth Factor), NGF (Nerv Growth Factor) etc.

Perspectivele producerii i utilizrii interferonilor

n unele celule, sinteza interferonilor este indus spontan, n absena unui inductor detectabil. Interferonii i sunt produi de liniile celulare limfoblastice originare n celulele T, n concentraii variabile, de la l la l000 U/ml.

Interferonii sunt produi prin biotehnologii moderne, n celule manipulate genetic. Genele codificatoare ale sintezei interferonilor au fost izolate, secveniate i inserate n vectori de clonare. Acetia au fost transferai n celula procariot (E. coli) sau eucariot. Genele

codificatoare ale interferonilor sunt transcrise att n celule bacteriene, ct i n celule eucariote. Pe aceast cale, in vitro sau obinut cantiti mari de interferoni (utilizabili n clinic), fiind sintetizai de celulele bacteriene, de levuri i de celulele de mamifere.

Interferonii se utilizeaz pe scara larg n tratamentul infeciilor cu virus rabic i cu virusuri encefalitogene. Efectul lor este ameliorarea sau chiar eliminarea infeciilor persistente, cu virusul hepatitei B, C, cu herpes-zoster sau cu citomegalovirus.

Interferonii au proprieti antiproliferative i se folosesc n tratamentul unor stri neoplazice umane. Tumorile originare n limfocitele B sau n celulele plasmocitare sunt cele mai sensibile. Cea mai eficient activitate antiproliferativ o are interferonul . Varietatea este activ n maladia Hodgkin (proliferarea malign a macrofagelor ganglionare).

Utilizarea interferonilor n clinic este limitat de manifestarea unor efecte secundare: febr, hipotensiune, mialgie, bradicardie

3Membranele biologice sunt depozite pentru precursorii mediatorilor derivai din lipide. Rspunsul celular este nsoit de remodelarea rapid a lipidelor membranare sub aciunea lipazelor activate. Lipazele includ fosfolipaza A2, D i C. Se genereaz rapid lipide bioactive, cu funcie de mediatori. PG formeaz o familie de acizi grai nesaturai cu caten de 20 atomi de C. Precursorul PG este acidul arachidonic (nesaturat), legat esteric de C2 al fosfolipidelor membranare de unde este eliberat sub aciunea fosfolipazei A2. Acidul arachidonic este precursorul sintezei compuilor icozanoidici (PG i leucotriene LT) i este convertit la endoperoxizi ciclici (PG) sub aciunea ciclooxigenazei. Sinteza acestei enzime este inhibat de aspirin i indometacin, substane cu efect antifebril. Efectul lor antifebril se exercit prin inhibiia sintezei PG. PG se sintetizeaz n monocite, macrofage, granulocite, dar i n majoritatea celorlalte esuturi ale organismului uman i animal. Dup sintez sunt eliberate n circulaie i sunt inactivate n ficat, rinichi i plmni. PG sunt inhibitori ai reactivitii imunitare, deoarece diminu reactivitatea limfocitelor i macrofagelor.

4Zincul este un element esenial pentru funcia imunitar. Se gsete n situsul activ a peste 200 metaloenzime, fiind foarte important pentru metabolism. Sinteza acizilor nucleici este dependent de metaloenzimele cu Zn (ARN- i ADN polimerazele). Deficiena Zn (datorat ingestiei sczute sau malabsorbiei) produce disfuncii ale limfocitelor T, atrofia timusului, diminuarea numrului de limfocite T n organele limfoide secundare. In rspunsul inflamator acut febril(consecutiv unei infecii), concentraia plasmatic a Zn scade la jumtate din valoarea normal, fiind sechestrat n hepatocite, timocite i n mduva osoas. Mecanismul sechestrrii nu se cunoate. Deficienele Zn sunt asociate cu malnutriia proteic sau cu malabsorbia.Unele

fibre dietetice mpiedic absorbia Zn. In reaciile de faz acut ale strilor febrile, balana metabolic a azotului este negativ i este nsoit de scderea Zn, datorit sechestrrii tisulare.

BAZELE CELULARE I MOLECULARE ALE MEMORIEI IMUNITARE

Rspunsul imun are trei particulariti generale: 1) specificitatea; 2) diversitatea (heterogenitatea anticorpilor); 3) memoria.

Memoria imunitar este caracterizat printr-un rspuns imun mai rapid i mai extins n timp. Argumentul direct este chiar timpul de laten mai scurt al rspunsului imun secundar, explicabil prin faptul c dup prima expunere la antigen, rezult o populaie mai numeroas de celule cu receptori specifici fa de epitopii imunostimulatori. Aceste celule au parcurs deja cteva trepte ale diferenierii spre celulele productoare de anticorpi.

Anticorpii rspunsului imun secundar au o afinitate mai mare de legare cu antigenul specific. In rspunsul imun secundar (de memorie), iniial se secret IgM, dar i alte izotipuri, n special IgG.

Memoria imunitar implic tipuri funcionale specializate de limfocite T i B, denumite celule de memorie.

Receptorii de antigen ai limfocitelor B de memorie sunt n special molecule de IgG, iar ai limfocitelor neangajate sunt molecule de IgM i IgD. Pe suprafaa altor celule de memorie s-au identificat i ali receptori: IgM i IgG, IgM i IgA, IgM i IgE. Aceti markeri asigur generarea izotipurilor corespunztoare de imunoglobuline n rspunsul imun secundar. Limfocitele B de memorie au localizri specifice i receptorii lor de antigen prefigureaz izotipul anticorpilor secretai: limfocitele care au ca receptor de antigen molecule de IgA i IgE sunt localizate n structurile limfoide asociate mucoaselor (digestiv, respiratorie). De aceea, calea de administrare a antigenului influeneaz profund izotipul anticorpilor care se sintetizeaz, fiecare izotip avnd o eficien optim ca mediatori ai funciilor efectoare particulare: IgA inhib aderena

microorganismelor la suprafaa mucoaselor; IgG i IgM sunt efectorii rspunsului imun humoral, iar IgE activeaz mastocitele.

Receptorii de antigen ai limfocitelor B de memorie au afinitate mai mare de legare a antigenelor i de aceea sunt mai eficieni n captarea cantitilor mici de antigene i n prezentarea mai rapid a acestora.

Mecanismul generrii limfocitelor B de memorie este ipotetic. Una din teorii consider c att plasmocitele (productoare de anticorpi) ct i celulele B de memorie deriv din acelai limfocit B precursor. Celulele rezultate din diviziunile succesive declanate de stimularea antigenic evolueaz diferit: unele se difereniaz n plasmocite, iar altele rmn limfocite mici care se rentorc la starea G0 i devin limfocite de memorie. Descendenii clonei stimulate evolueaz spre plasmocit sau spre celula de memorie, n raport cu influenele pe care le primete de la diferite limfochine, de la celulele accesorii sau de la celulele Th.

Dup alt teorie, celulele de memorie i plasmocitele provin din celule B diferite. Limfocitele B par fi preprogramate s devin plasmocite sau limfocite de memorie, nainte de expunerea la antigen.

Rspunsul imun secundar se caracterizeaz prin creterea afinitii anticorpilor.

Afinitatea receptorilor i a anticorpilor fa de antigene este conferit de regiunea variabil a moleculei. Creterea afinitii este explicabil prin dou mecanisme:

- stimularea selectiv a limfocitelor care au receptor VH/VL de mare afinitate, exprimat pe suprafaa limfocitelor B neangajate. Altfel spus, pe msur ce cantitatea de antigen scade, continu s se activeze numai celulele cu receptori de mare afinitate i s domine rspunsul imun;

- dup stimularea antigenic, n centrii germinativi ai organelor limfoide secundare are loc procesul hipermutaiei somatice, printr-un mecanism necunoscut ce introduce mutaii punctiforme n regiunile V.

Mecanismul memoriei imunologice pentru perioade lungi de timp (luni, ani sau tot restul vieii) nu este cunoscut. Populaia celulelor de memorie trebuie, prin definiie, s aib via lung i

aceasta, teoretic, se poate realiza fie prin generarea celulelor care nu se divid i nu mor sau prin generarea unei populaii care se renoiete prin diviziuni care nlocuiesc celulele moarte. Primul model are avantajul c nu necesit un component reglator, iar al II-lea impune aciunea unui mecanism reglator al ratei de renoire.

Existena unor limfocite cu via lung, dup unii autori, este cu totul improbabil, dar rezultatele analizei limfocitelor la om, dup expunerea sever la radiaii, sugereaz c celulele individuale pot s persiste fr s se divid, un interval de ordinul ctorva decade. Dup alte opinii, supravieuirea limfocitelor T i B este dependent de prezena antigenului. Experienele de transfer adoptiv al celulelor de memorie (T i B) au artat o scdere a rspunsului de memorie, n 30-40 de zile, ceea ce sugereaz c memoria imunitar nu este rezultatul diferenierii limfocitelor de memorie cu via lung. Pstrarea antigenului n organism pare s aib rol esenial n meninerea tuturor categoriilor de celule de memorie.

Antigenul se depoziteaz i se pstreaz n organism pentru perioade de ordinul lunilor sau chiar un an, n asociaie cu celulele foliculare dendritice, sub forma complexelor imune. Ele realizeaz stimularea continu a limfocitelor B, la un nivel sczut. Celulele foliculare dendritice sunt eseniale pentru memoria imunitar a celulelor B, a cror stimulare de durat o realizeaz cu antigenele pe care le poart pe suprafaa lor. Celulele foliculare dendritice nu prelucreaz i nu prezint antigenele, dar depoziteaz complexele antigen-anticorp pe suprafaa lor.

O alt modalitate a pstrrii ndelungate a memoriei imunitare este consecina expunerii periodice a limfocitelor B la antigene cu reacie ncruciat, la superantigene sau la mitogene, care prin intermediul interleuchinelor determin o expansiune limitat la cteva cicluri de diviziune.

Reeaua idiotipic a lui Jerne explic memoria imunitar: interaciunile idiotipice dintre diferiii constituieni moleculari i celulari ai reelei, iniiate de contactul cu antigenul, ar fi suficiente pentru pstrarea memoriei informaiei antigenice dobndit anterior.

Limfocitele B de memorie nu se activeaz sub aciunea mitogenilor sau a activatorilor policlonali, ci rspund numai la antigenul specific. Activarea lor necesit o cantitate mult mai mic de antigen i este mult mai puin T-dependent.

Celulele Th de memorie sunt probabil generate n cortexul ganglionilor limfatici, dar mecanismul nu este cunoscut. Mecanismul memoriei celulelor T a fost propus dup modelul inducerii dermatitei de contact, o reacie de hipersensibilitate ntrziat, mediat de celulele CD4.

Din punct de vedere funcional, n contrast cu celulele Th neangajate, celulele Th de memorie primesc informaie antigenic nu numai de la macrofag, ci i de la limfocitele B localizate la interfaa dintre foliculi i cortexul ganglionilor limfatici. Cele neangajate stimuleaz slab celulele B, iar celulele CD4 de memorie mediaz rspunsul viguros al limfocitelor B.

Receptorul de antigen al limfocitelor T (RCT) nu sufer fenomenul maturrii de afinitate. Aceasta nseamn c limfocitele T de memorie nu leag epitopii antigenici cu afinitate mai mare, dar dup stimularea secundar, ele se activeaz mai rapid. Coreceptorul CD45 este prezent ntr-o izoform cu greutate molecular mai mic dect al limfocitelor T CD4 neangajate.

Caracteristica funcional definitorie a celulelor Th de memorie este rspunsul lor mult mai amplu la stimulul antigenic, prin proliferare intens, comparativ cu celulele neangajate. Dup stimulare, celulele Th de memorie produc o gam mult mai larg de limfochine: IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IFN , spre deosebire de limfocitele Th neangajate, care la contactul cu antigenul sintetizeaz IL-2.

Mecanismul molecular al generrii limfocitelor Tc (CTL) de memorie nu este cunoscut. Rspunsul imun mediat celular fa de antigenele de transplantare i fa de antigenele celulare n general, are la baz aceleai caracteristici ale reactivitii imunitare: instalarea memoriei imunitare dup stimulul primar i o reactivitate intens i rapid dup reexpunerea la antigen. Reactivitatea imun secundar mediat celular se evideniaz n dinamica respingerii alo- i xenogrefelor: organismele liniei genetice A resping alogrefa primar de la linia inbred B dup dinamica rspunsului imun primar (10-14 zile). A II-a gref de esut de aceiai provenien este respins dup dinamica rspunsului imun secundar (5-6 zile), iar a II-a gref de la un organism al liniei inbred C este respins de organismele liniei A dup dinamica rspunsului imun primar.

Celulele T CD8 de memorie produc o gam larg de citochine, iar cele neangajate produc IFN .

Rspunsul imun secundar (de memorie) este rezultatul cooperrii variatelor tipuri de celule de memorie. De exemplu, celulele Th de memorie produc IL-2, cu efect stimulator asupra celulelor Tc i B de memorie. Cooperarea celular mrete eficiena rspunsului imun. O cooperare de tip special este aceea a limfocitelor B de memorie, care au capacitatea de a capta foarte eficient cantitile foarte mici de antigene specifice i de a le prezenta limfocitelor Th. Captarea antigenului prin intermediul receptorului imunoglobulinic specific de antigen este de circa 1000 de ori mai eficient dect prin pinocitoz nespecific.

Pe suprafaa limfocitelor T de memorie nu apar molecule noi, dar se exprim la un nivel superior, cele implicate n aderena la epiteliul venulelor. Moleculele de suprafa sunt implicate n recircularea limfocitelor la situsuri prefereniale (homing). Celulele T de memorie recircul n primul rnd n esuturile nelimfoide, ajung n esuturile limfoide prin limfaticele aferente i se rentorc n snge prin limfa eferent. Dovada este adus de faptul c in vivo, celulele care intr cu limfa n ganglionii limfatici, sunt exclusiv celule de memorie. Nu se tie dac aceste celule recircul sau rspund la o stimulare antigenic.

n concluzie, cele mai ample diferene ntre celulele neangajate i cele de memorie sunt de ordin funcional i constau n primul rnd n capacitatea celulelor de memorie de a secreta o gam foarte larg de citochine. Populaia celulelor de memorie are via lung, dar se pot divide cu o rat controlat de mecanisme homeostatice. Condiiile pentru generarea i meninerea memoriei nu sunt clare. Reexpunerea la antigenul specific nu pare a fi necesar pentru pstrarea memoriei.

REGLAREA RSPUNSULUI IMUN

Pentru eficiena aciunii nu este suficient s posezi efectori foarte buni, ci performanele efectorilor trebuie monitorizate.(N. Wiener, 1961).

Teoria seleciei clonale consider c organismul animal sau uman, n mod obinuit rspunde la stimularea cu orice substan antigenic natural sau artificial, deoarece sistemul imunitar este alctuit dintr-un numr imens de populaii de celule limfoide, fiecare avnd receptori specifici pentru un epitop antigenic.

Sistemul imunitar manifest o stare de toleran perfect fa de constituienii proprii organismului, dar exist situaii de excepie, n care anumite molecule self pot deveni imunogene.

Interaciunile reciproce ale reelei idiotipice, ca mecanism esenial al reglrii rspunsului imun, se bazeaz pe raionamentul c dup stimularea antigenic, rspunsul imun evolueaz pe dou direcii eseniale:

- sinteza anticorpilor complementari fa de antigenul inductor, efectul fiind legarea i neutralizarea antigenului;

- sinteza unor molecule care se combin specific cu moleculele de imunoglobuline libere, dar i cu receptorii limfocitelor T i B i i blocheaz, inhibnd funcia lor i stopnd rspunsul imun. Aceste molecule au rol esenial n reglarea rspunsului imun.

Sinteza moleculelor cu aciune specific fa de receptorii limfocitari se datoreaz faptului c moleculele de imunoglubuline, libere sau legate de celule, au determinani antigenici proprii care se comport ca imunogene chiar pentru organismul n care s-au sintetizat.

Determinani antigenici izotipici. Molecula de imunoglobulin poart n structura sa mai multe categorii de determinani antigenici, evideniai prin injectarea imunoglobulinei asociat cu adjuvantul Freund, la animalele de laborator. Anticorpii se comport ca antigene fa de organismele altor specii i se sintetizeaz anticorpi fa de determinanii antigenici care definesc variantele izotipice, caracteristici diferitelor clase de imunoglobuline. Determinanii antigenici izotipici se gsesc pe catena H (, , , , ) sau pe catena L ( sau ) i sunt invariani pe toate moleculele de imunoglobuline ale unei clase, la toi indivizii unei specii.

Determinanii alotipici se gsesc pe moleculele de imunoglobuline ale organismelor unei specii, care au acelai alotip, adic aceiai combinaie de gene alele codificatoare ale anticorpilor. Determinanii alotipici sunt localizai n regiunile constante ale catenelor H i L i semnificaia lor este analog celei a antigenelor de grup sanguin.

Determinanii idiotipici sunt localizai n regiunile variabile ale moleculei de imunoglobulin i reflect particularitile biochimice ale acestei regiuni. Aici se gsesc determinanii antigenici cu caracter individual ai moleculei de imunoglobulin, denumii idiotopi, consecin a hipervariabilitii aminoacizilor.

Fiecare determinant antigenic se numete idiotop, iar ansamblul lor formeaz idiotipul. Idiotopii sunt asociai cu secvenele hipervariabile ale moleculei: trei secvene ale catenei L i trei din cele patru secvene hipervariabile ale catenei H (secvena a 3-a nu intr n alctuirea paratopului).

Fenomenul idiotipiei semnific existena unor determinani proprii fiecrui organism, localizai pe moleculele de anticorpi. Prezena idiotopilor nu este limitat la moleculele libere de imunoglobuline, ci se gsesc i n structura receptorilor limfocitari de antigen, n special n

structura moleculelor de imunoglobuline cu rol de receptor de antigen de pe suprafaa limfocitelor B.

Teoria reelei idiotipice consider c idiotopii sunt imunogeni chiar pentru organismul n care sau sintetizat i induc sinteza anticorpilor specifici cu care se combin. Acetia se numesc anticorpi anti-idiotipici. La rndul lor, anticorpii anti-idiotipici induc sinteza anticorpilor antianti-idiotipici. Astfel, reeaua idiotipic nu este numai o reea de interaciuni moleculare ntre imunoglobulinele libere, ci este o reea mixt de interaciuni celulare i moleculare.

n contextul teoriei, distincia dintre idiotip i anti-idiotip este numai operaional. Orice idiotip de pe suprafaa unui receptor de antigen(molecul liber sau ancorat n membrana limfocitelor T i B) poate funciona simultan, ca imunogen(epitop) stimulator al rspunsului imun, dar funcioneaz i ca paratop, capabil s se lege cu idiotipul complementar.

Repertoriul idiotipurilor este egal cu acela al specificitilor de legare.

Teoria reelei idiotipice a lui Jerne se bazeaz pe faptul c ntr-un organism, fiecare molecul de anticorp este recunoscut de situsurile de combinare ale altor molecule de anticorpi cu configuraie spaial complementar. Astfel, idiotopii proprii anticorpilor sintetizai n faza iniial a rspunsului imun, se comport ca determinani antigenici i declaneaz un rspuns imun de faza II-a, n care se sintetizeaz anticorpi anti-anticorpi din faza I-a a rspunsului imun. Anticorpii din faza a II-a se numesc anticorpi anti-idiotip. La rndul lor, acetia au un set propriu de idiotopi, care se comport ca epitopi antigenici i induc sinteza anticorpilor de faza a III-a .a.m.d. Ca ntr-o sal a oglinzilor, acest proces se poate repeta continuu. Anticorpii sintetizai ntr-o astfel de cascad a rspunsului imun, sunt legai ntr-o reea de interaciuni specifice, care poate s implice ntregul sistem imunitar. Fig.89. Elementele reelei idiotipice, n care receptorii de antigen ai unui limfocit recunosc reciproc un idiotip pe receptorii altui limfocit. Limfocitele Th, Ts i B interacioneaz prin reacii idiotip-antiidiotip, producnd stimularea sau supresia. Interaciunile T-T pot avea loc prin recunoaterea direct a unui RCT de ctre altul sau mai frecvent, prin recunoaterea unui peptid RCT prelucrat i asociat cu moleculele CMH. Unul din seturile de anticorpi antiidiotipici, Ab2 poate purta un idiotip asemntor cu antigenul (adic este imaginea intern a acestuia). Acelai idiotip (O) poate fi prezent pe receptorii cu specificiti distincte, astfel c anti-(anti-Id1) nu se leag n mod necesar de antigenul original ( = anti; Id = Idiotip; Ab1 = Id; Ab2 = anti-Idiotip ce nu implic paratopul; Ab2 = anticorpi anti-Idiotip imaginea intern care implic paratopul; Ab3 = anti(anti-Id ).

Anticorpii anti-idiotipici constituie fora reglatoare a sistemului imunitar.

n mod asemntor, reeaua de interaciuni specifice se creeaz ntre idiotopii moleculelor receptoare de antigen din membrana limfocitelor T. Ei sunt recunoscui de situsurile de combinare ale receptorilor de pe un alt set de limfocite.

Teoria reelei idiotipice se bazeaz pe existena unei reele imense de interaciuni idiotipantiidiotip, att ntre anticorpi ct i ntre receptorii celulari, ce asigur controlul rspunsului imun.

Dup Jerne, interaciunile reelei se produc nu numai ca rspuns la un stimul antigenic, ci i n starea de echilibru a sistemului imunitar.

Caracterul de reea a sistemului imunitar decurge din faptul c fiecare molecul de anticorp sau de receptor, funcioneaz mai nti ca molecul efectoare a rspunsului imun, dar i ca molecul inductoare a sintezei altor efectori. Prin intermediul interaciunilor idiotip-antiidiotip, sistemul imunitar interacioneaz cu el nsui.

n absena stimulilor antigenici, sistemul imunitar este n stare de echilibru (steady state) i reeaua idiotipic funcioneaz unitar. Interaciunile reelei activeaz limfocitele B i ele sintetizeaz mici cantiti de anticorpi. Astfel, sistemul imunitar este concentrat asupra componentelor proprii i produce anticorpi-antiidiotipici fa de propriul su repertoriu de receptori. Toate componentele reelei imunitare(celule, molecule) sunt ntr-o stare de comunicare permanent i n stare de echilibru reciproc. Consecina interaciunilor reciproce inductoare idiotip-antiidiotip este starea normal (echilibrat), represat, a sistemului imunitar.

Ptrunderea unui antigen exogen n organism, stimuleaz cteva clone de limfocite i astfel sistemul imunitar iese din starea de represie obinuit. Se sintetizeaz Ac1, care au idiotipul 1(I1).

Ca rspuns la determinanii idiotipici ai idiotipului 1, limfocitele B sintetizeaz anticorpi de faza a II-a (anticorpi anti-idiotip I1). Efectele declanate de un antigen se propag n tot sistemul imunitar, aa cum pe suprafaa unei ape, sub impactul unui oc mecanic se induc unde succesive tot mai mici, pn se ajunge la starea de echilibru.

Teoria reelei idiotipice introduce un concept nou al imaginii interne a antigenului, foarte important din punct de vedere teoretic i practic. In acord cu aceast concepie, anticorpii (Ac1) fa de un epitop poart imaginea sa negativ. Idiotopii acestor molecule, asociai situsului de combinare, induc sinteza anticorpilor anti-idiotipici (Ac2). Acetia poart imaginea negativ a anticorpilor 1 i vor reproduce imaginea intern a epitopului iniial. Anticorpii 2, care sunt imaginea intern a antigenului, pot fi stimulatori ai rspunsului imun fa de antigenul iniial.

Numrul imaginilor interne crete odat cu sinteza unui nou idiotip, pe msura ce influena antigenului se propag n reeaua sistemului imunitar.Fig. 90. Ilustrarea grafic a reelei idiotipice. Anticorpii generai ca rspuns fa de un antigen constituie primul val al rspunsului. Al II-lea val este iniiat de idiotipul anticorpilor din primul val i se numesc anticorpi antiidiotipici. Ei exprim idiotipul care genereaz al III-lea val al rspunsului anticorpilor (anticorpi anti-anti-idiotipici). Teoria consider c rspunsul idiotip-anti-idiotip continu indefinit, ns circuitul se ncheie cnd unul din idiotipurile anticorpilor se aseamn cu unul din idiotipurile sintetizate ntr-un val anterior.

Concepia actual a funcionalitii sistemului imunitar presupune c acesta este format dintr-un numr mare de clone de limfocite, care poart receptori preformai fa de antigene. In acord cu reeaua idiotipic, imaginile interne ale diferiilor epitopi ai clonelor de limfocite, sunt prezente n reea, aa nct nici un epitop din mediul extern nu este cu adevrat strin pentru sistemul imunitar, deoarece toi epitopii capabili s induc un rspuns imun, sunt reprezentai n sistemul imunitar de receptori limfocitari, prin imaginea lor intern.

Unii idiotopi ai reelei sunt chiar imaginea intern a moleculelor antigenice din propriul organism. In acord cu aceast concepie, maladiile autoimune sunt consecina perturbrii reelei idiotipice.

Reeaua idiotipic se stimuleaz i sintetizeaz anticorpi anti-idiotipici, numai cnd idiotopii ating o concentraie limit.

Jerne compar cascada activrii idiotip-antiidiotip a sistemului imunitar, cu o sal a oglinzilor, n care iniial se formeaz imaginea negativ a structurii nonself (anti-nonself), apoi anti-antinonself, care la rndul lor reflect universul antigenelor exogene.

Teoria reelei idiotipice permite nelegerea sistemului imunitar ca un sistem global de interaciuni reciproce, n contradicie cu teoria clasic a clonelor de limfocite care ateapt pasiv ntlnirea cu antigenul.

Elementul fundamental al teoriei este c sistemul imunitar formeaz o reea funcional de interaciuni ntre molecule de anticorpi i receptorii limfocitari, continuu echilibrat nainte de ptrunderea antigenului exogen.

Interaciunile idiotipice sugereaz o legtur funcional permanent ntre limfocite, precum i ntre limfocite i alte categorii de celule din organism, stimulnd pe unele, represnd pe altele, printr-un ansamblu de semnale interne.

TOLERANA IMUNITAR

Tolerana este o stare fiziologic, caracterizat prin absena rspunsului imun fa de un antigen i prin pstrarea capacitii de rspuns imun fa de alte antigene.

Sistemul imunitar este tolerant, n primul rnd fa de componentele self, pe care a nvat s le recunoasc n timpul dezvoltrii embrionare.

Starea de toleran este specific pentru un antigen dat i pentru cele nrudite din punct de vedere chimic, dar este asociat cu pstrarea reactivitii imunitare fa de toate antigenele care nu dau reacie ncruciat cu antigenul tolerat.

Tolerana imunitar i reactivitatea imunitar prezint urmtoarele caracteristici comune:

- sunt specifice fa de un antigen dat

- se manifest dup contactul cu antigenul inductor

- sunt mediate de limfocite.

Tolerana se deosebete de starea de imunosupresie, ultima fiind consecina unei incapaciti congenitale sau dobndite de a rspunde la o varietate de antigene.

Importana fenomenului de toleran fa de componentele proprii organismului a fost recunoscut de Ehrlich i Morgenroth (1900), care au formulat conceptul horror autotoxicus, o consecin esenial a funciei normale a sistemului imunitar, ce semnific faptul c n mod normal, organismul i asigur protecia propriilor sale componente fa de autodistrugerea prin reactivitatea imunitar.

Starea de toleran poate fi indus natural sau experimental.

Dup 1920 s-a evideniat c tolerana poate fi indus experimental, fa de unele antigene administrate n doze mari: toxina difteric, polizaharidul de streptococ (la oarece), globulina de cal (la iepure). Aceleai antigene, n doze mici sunt stimulatoare ale rspunsului imun.

n 1938, Traub a indus tolerana specific, prin inocularea oarecilor in utero, cu virusul coriomeningitei limfocitare (LCMV).

n 1945, Owen a evideniat c gemenii dizigoi de bovide (aparinnd unor alotipuri diferite) i tolereaz reciproc antigenele tisulare, dac n cursul vieii embrionare, un proces de fuziune placentar a permis un schimb reciproc de elemente figurate. Cei doi gemeni resping grefele de esut de origine parental sau de la organisme cu aceiai ascenden. Aceti gemeni au elemente figurate sanguine proprii, dar i celule sanguine ale gemenului cu un alotip diferit i se numesc himere hematopoetice.

Concluzia a fost c, prin contactul timpuriu, n cursul vieii embrionare, al limfocitelor cu antigenele, se creeaz o stare de toleran specific fa de nonself i ulterior, antigenele inductoare ale toleranei vor fi recunoscute ca self i tolerate.

Himerele hematopoetice pot fi obinute artificial, la organismele adulte, prin iradiere sau prin imunosupresie sever medicamentoas, urmat de injectarea celulelor de mduv osoas strin. In clinic, pentru tratamentul unor maligniti ale sngelui se realizeaz eliminarea total a mduvei hematopoetice prin iradiere i imunosupresie, urmat de transplantul de mduv osoas uman.

n sens mai larg, himera biologic este un organism dotat n mod artificial cu componente celulare, cu esuturi sau organe, care provin de la alt organism.

n 1953, Billingham, Brent i Medawar au descoperit faptul c maturarea limfocitelor parcurge un stadiu, n cursul cruia contactul cu antigenul, perturb acest proces, consecina fiind pierderea funciei imunitare, adic limfocitele devin tolerante fa de antigenul respectiv.

Starea de toleran se induce experimental, la oarecii nou-nscui, fa de toate tipurile de antigene. Revelatoare n acest sens sunt strile de toleran, induse la animalele nou-nscute, fa de celulele provenite de la organisme genetic diferite. Animalele injectate la natere cu celule alogenice, la vrsta adult vor accepta grefele tisulare de la organismele donoare de celule.

Inducerea strii de toleran, prin contactul timpuriu cu antigenul, nainte de natere sau imediat dup aceea, se datoreaz faptului c, n stadiul embrionar i o perioad postnatal de durat variabil n funcie de specie, sistemul imunitar este imatur i n consecin, foarte sensibil la inducerea strii de toleran imunitar.

Starea de toleran este specific fa de determinantul antigenic. Tolerana poate fi ncruciat, adic se manifest concomitent fa de mai multe antigene diferite, nrudite chimic, dac au cel puin un determinant antigenic comun.

Limfocitele B imature sunt foarte sensibile la inducerea strii de toleran, datorit faptului c uneori, ele preiau informaia antigenic prin contactul direct cu epitopii specifici ai antigenului, dar dup maturare devin rezistente la acest proces. Sensibilitatea limfocitelor T fa de inducerea toleranei variaz n limite mai restrnse n cursul ontogeniei lor.

Mecanismele celulare i moleculare ale toleranei sunt ipotetice, dar probabil sunt dependente de momentul inducerii toleranei, n cursul ontogeniei lor.

Tolerana indus n cursul vieii fetale este rezultatul contactului limfocitelor antigen-reactive, cu antigenul. Capacitatea de rspuns imun la stimulul antigenic specific este pierdut definitiv i ireversibil (de exemplu, tolerana oarecelui fa de LCMV dup inocularea in utero).

n cursul vieii fetale, tolerana se instaleaz dup acelai mecanism al toleranei fa de componentele self, care este puin cunoscut.

Starea de toleran a limfocitelor B mature este mai greu inductibil. Mecanismul toleranei este ipotetic.

n cursul vieii adulte, dup stimularea repetat cu un Ag timo-dependent, tolerana se instaleaz ca rezultat al epuizrii limfocitelor B antigen-reactive. Toate limfocitele B mature, capabile s reacioneze specific fa de un antigen, sunt stimulate i se difereniaz n celule productoare de Ac, astfel nct o stimulare ulterioar cu acelai antigen rmne far rspuns.

Tolerana imunitar poate fi mediat de celulele Ts. Acest mecanism a fost demonstrat experimental la oarece, dup injectarea unei cantiti mari de hematii de berbec. Starea de toleran este transferabil la organisme izogenice, prin intermediul limfocitelor splenice Ts.

Tolerana poate fi indus de factori blocani din plasm, a cror natur nu este totdeauna cunoscut, dar uneori s-au identificat a fi anticorpi, care ndeplinesc funcia de specificitate, dar nu i funciile biologice efectoare.

Uneori, starea de toleran indus de antigenele greu degradabile este aparent, deoarece se sintetizeaz anticorpi specifici fa de antigenul injectat. Se formeaz complexe imune cu antigenul care persist n organism i de aceea, n ser nu se detecteaz anticorpi liberi prin metodele obinuite.

Factorii care condiioneaz inducerea strii de toleran

Inducerea strii de toleran este dependent de doza de antigen, de modul de administrare, de starea fizic a antigenului, de calea de administrare, de rata de catabolizare a antigenului, de vrst, de factori genetici.

Dozele inductoare ale rspunsului imun i ale toleranei variaz mult de la un organism la altul, dar adeseori, dozele foarte mici i foarte mari induc starea de toleran, iar dozele medii sunt inductoare ale rspunsului imun. De exemplu, albumina seric bovin, n doze mici (1 mg/kg corp, de 3 ori pe sptmn, timp de cteva sptmni) sau n doz mare (100 mg/kg corp) induce starea de toleran.

Administrarea antigenelor fr adjuvant favorizeaz instalarea toleranei imunitare.

Administrarea intravenoas i chiar oral favorizeaz inducerea toleranei, iar injectarea subcutan, intradermic sau intramuscular stimuleaz rspusul imun.

Starea fizic a antigenului influeneaz reactivitatea imunitar. Antigenele proteice n stare agregat sunt imunogene, iar forma monomeric (solubil) a acelorai antigene este, n funcie de doz, imunogen sau tolerogen. Dozele mari de antigene solubile favorizeaz tolerana, dar n asociaie cu adjuvanii sunt imunogene.

Pentru inducerea i meninerea strii de toleran este necesar persistena antigenului n organism. Antigenele care se catabolizeaz greu induc starea de toleran.

Cea mai cunoscut stare de toleran experimental este cea indus de dozele mari de polizaharide (antigene timo-independente, greu degradabile). Ele produc paralizia limfocitelor B, dup legarea n exces de receptorii lor. Corespondentul clinic al acestei situaii experimentale este starea de toleran indus de microorganismele capsulate, care produc infecii pulmonare la persoanele vrstnice. Pe fondul reactivitii imunitare sczute, esutul pulmonar este inundat cu polizaharide capsulare i sfritul este letal.

Durata strii de toleran este variabil, n funcie de mecanismul celular care a mediat instalarea ei.

Tolerana indus n timpul vieii embrionare, probabil ca rezultat al anulrii reactivitii clonei de limfocite specfifice, este ireversibil. Tolerana indus dup maturarea limfocitelor este o stare

reversibil i revenirea la starea imunoreactiv normal este dependent de timpul necesar regenerrii limfocitelor mature imunoreactive.

Durata toleranei indus prin fenomenul inundaiei antigenice este dependent de rata catabolizrii Ag.

Tolerana ftului

Pentru organismul matern, ftul este o alogref, deoarece jumtate din zestrea sa genetic este de origine patern.

Din punct de vedere imunologic, organismul matern nu este tolerant fa de antigenele fetale. Ca dovad, grefa de esut fetal este respins.

Pe toat durata sarcinii, organismul matern i pstreaz reactivitatea imunitar normal, dar prin intermediul placentei, ftul dispune de un sistem eficient de protecie.

Placenta, anex de origine embrionar, este o barier care neutralizeaz efectorii imunitari ai organismului matern. Trofoblastul este nveliul celular al placentei i al al membranelor extraembrionare ce acoper ftul i reprezint esutul fetal de interfa cu sngele matern i cu esutul endometrului. La om, stratul trofoblastic extern al vilozitilor corionului placentar este sinciiotrofoblastul, un strat celular continuu far jonciuni intercelulare. Prin sinciiotrofoblast, ftul se hrnete, respir i supravieuiete.

Pe faa intern (spre embrion), placenta nu exprim antigenele majore de histompatibilitate, iar pe faa extern predomin antigenele minore. Moleculele CMH de origine fetal au o densitate mic. Organismul matern recunoate antigenele fetale ale placentei i reacioneaz prin mecanisme imunitare. Aa se explic faptul c n circulaia matern se detecteaz anticorpi antifetali la circa 15% dintre gravide. Diferenele antigenice dintre mam i ft par a fi chiar benefice pentru dezvoltarea ftului. Aa se explic vigoarea hibrizilor, n contrast cu dificultile de propagare a liniilor inbred. Greutatea placentei i a embrionului este mai mare la femelele alogenice, fa de cele singenice n raport cu ftul lor.

Pe fondul unei reactiviti imunitare normale a organismului matern fa de stimulii antigenici, la nivelul placentei, ca zon de interfa feto-matern, se produce o modelare a reactivitii imunitare, care favorizeaz tolerana fa de antigenele fetale.

Tolerana fa de antigenele fetale se realizeaz prin urmtoarele mecanisme:

- n placent se secret i se concentreaz substane cu aciune imunosupresoare strict localizat, care inhib activarea limfocitelor Tc i NK;

- placenta secret factori care neutralizeaz local Ac antiplacent i i transform n anticorpi blocani, care la rndul lor au efect protector;

- n placent s-au detectat limfocite cu efect imunosupresor (Ts), iar numrul lor crete semnificativ n a II-a jumtate a sarcinii;

- placenta are o rezisten deosebit. Celulele sale rezist efectului litic al celulelor Tc iNK;

- placenta are o capacitate proprie de regenerare. Eventualele sale leziuni provocate de efectorii IMC i IMH sunt compensate prin proliferarea celulelor rezistente. Placenta supus atacului efectorilor imunitari este mai groas dect n mod obinuit;

- placenta are rolul de a minimaliza recunoaterea antigenelor fetale de ctre efectorii imunitari de origine matern, avnd rolul unui burete imunitar. Sinciiotrofoblastul uman, dar i al altor specii, prezint receptori pentru regiunea Fc , prin intermediul crora IgG matern este transportat selectiv n circulaia fetal i confer imunitate pasiv tranzitorie postnatal ntr-un mediu ostil din punct de vedere antigenic. Transferul maxim are loc n sptmnile 20-22 de sarcin. Concomitent pot fi transferai anticorpi materni specifici fa de antigenele fetale (n special anticorpi anti-HLA, care s-au sintetizat ntr-o sarcin anterioar) i care ar avea efect defavorabil asupra dezvoltrii fetale, dac ar penetra bariera placentar. Exist mecanisme care protejeaz ftul de IgG matern. Alo-anticorpii materni specifici anti-HLA fetale sunt legai pe celulele netrofoblastice (fibroblaste, endoteliale etc.) din mezenchimul intravilar al esutului placentar i nu ajung n circulaia fetal. IgG matern cu potenial lezional (IgG anti D sau antiplachetari), care scap efectului neutralizant al placentei ntlnesc inte antigenice foarte extinse (pe eritrocite, pe plachete);

- sub aspect imunitar, placenta este o zon neutr, datorit nivelului sczut al moleculelor CMH;

Dac toate aceste bariere de aprare sunt depite, se produce avortul imunitar.

SURSE DE GAMAGLOBULINE OMOGENE

Moleculele de anticorpi ale unui ser imun sunt foarte heterogene din punctul de vedere al specificitii lor de combinare cu epitopii antigenici inductori, deoarece, att antigenele moleculare, dar n special cele corpusculare (virusuri, celule), prezint o mare diversitate de epitopi. Chiar i antigenele moleculare cele mai simple sunt mozaicuri de epitopi. Specificitatea de combinare a moleculelor de anticorpi corespunde epitopilor fa de care s-au sintetizat.

Diversitatea uria a specificitii de combinare a anticorpilor (evaluat la 108-109) genereaz o heterogenitate biochimic de acelai nivel, materializat n variaia secvenei de aminoacizi, ceea ce a constituit un obstacol major n calea studiului lor prin metode analitice, dei anticorpii se gsesc totdeauna n snge, cu excepia cazurilor patologice de agamaglobulinemie.

Analiza biochimic a imunoglobulinelor a fost condiionat de existena unei surse omogene de molecule de anticorpi, cu o secven identic a aminoacizilor. Condiia identitii secvenei de aminoacizi este ndeplinit de anticorpii care au aceiai specificitate de legare, nu fa de un antigen, ci fa de un singur epitop.

Proteine de mielom

Sursa natural de molecule de imunoglobulin, omogene, identice din punct de vedere biochimic (monoclonale), este mielomul multiplu (plasmocitomul), o afeciune tumoral malign, iniiat n mduva osoas i rezultat prin proliferarea unui plasmablast.

Plasmocitomul produce molecule de imunoglobuline identice din punct de vedere biochimic i al sarcinii electrice, denumite proteine de mielom, deoarece toate celulele tumorii sunt descendente ale unei singure celule productoare de anticorpi. Moleculele secretate de o tumor de mielom se numesc proteine M (Mielom) sau paraproteine i pot s reprezinte pn la 95% din totalul gamaglobulinelor plasmatice.

Tumorile de mielom apar spontan cu o frecven mic la om, cine, cal, obolan, oarece sau se induc experimental la oarecii liniilor inbred NZB i BALB/c. Tumora este transplantabil n serie.

Uneori, proteinele M au aceiai secven de aminoacizi ca i imunoglobulinele normale, dar adeseori, sinteza catenelor patologice este incomplet: lipsesc diferite secvene de aminoacizi, de diferite lungimi.

Rareori, proteinele de mielom i pstreaz chiar proprietatea de a lega specific determinani antigenici cunoscui: de exemplu, 5% din proteinele M ale unei linii inbred de oarece, leag determinani antigenici ai suprafeei celulelor bacteriene enterice, ceea ce sugereaz c tumora i are originea n descendenii limfocitelor B, care prolifereaz ca rspuns la stimularea specific cu antigene ale microbiotei enterice.

Tumorile de mielom, de cele mai multe ori, secret molecule incomplete sau fragmente de molecule imunoglobulinice.

n celulele tumorilor de mielom, rata sintezei catenelor H i L este dezechilibrat. De exemplu, mielomul Bence-Jones, sintetizeaz catenele L n mare exces. Proteinele Bence-Jones sunt dimeri de lanuri L (k sau ). Una din cele dou catene L are rolul catenei H i particip la formarea situsului de legare. Molecula patologic are activitate de anticorp fa de unele componente tisulare sau fa de antigene mici.

Mielomul lanurilor grele sintetizeaz numai catenele H ale izotipurilor sau , iar mielomul macroglobulinemiei Waldenstrom sintetizeaz molecule de IgM. Majoritatea mieloamelor produc proteine Bence-Jones.

n laboratorul clinic, diagnosticul de mielom se pune dup detectarea n ser, prin electroforez, a unei cantiti mari de molecule ale unui izotip de imunoglobulin (circa 50 mg/ml).

Proteinele de mielom precipit la 50-60o, la pH 4-6, se redizolv prin nclzire la 80-90o i reprecipit prin rcire.

La pacienii cu mielom, n special la cei cu macroglobulinemie Waldenstrom, vscozitatea sngelui crete mult, datorit cantitii excesive de proteine produse de mielom. Eliminarea proteinelor patologice se face prin procedeul plasmaferezei. Plasmafereza este tehnica de recoltare a unor volume mari de snge, urmat de reintroducerea n organism, a celulelor sanguine suspendate ntr-un nlocuitor de plasm.

Surse artificiale de anticorpi monoclonali. Tehnologia hibridomului

Metoda clasic de obinere a anticorpilor necesari studiilor clinice i de diagnostic, const n stimularea repetat, prin injectarea antigenului ntr-un organism cu reactivitate imunitar optim. Cnd titrul anticorpilor specifici este maxim, animalul este sngerat i se obine serul imun (antiserul), care este folosit n stare nativ sau este utilizat pentru purificarea anticorpilor. Metoda are cteva dezavantaje:

- cantitatea i calitatea anticorpilor fa de un antigen variaz de la un organism la altul i chiar ntre sngerrile succesive ale aceluiai animal;

- serul imun este un amestec foarte heterogen de molecule de anticorpi, chiar i n cazul n care imunizarea se face cu un antigen cu grad nalt de puritate;

- orict de simplu ca structur molecular, un antigen are mai muli epitopi care stimuleaz mai multe clone de limfocite, ce produc anticorpi cu specificiti i afiniti diferite;

- antigenele nalt purificate conin impuriti antigenice care induc sinteza anticorpilor specifici n cantiti disproporionat de mari;

- chiar dup purificare proces costisitor antiserurile conin anticorpi cu afiniti diferite i cu reactivitate ncruciat.

Din aceste cauze, toate serurile imune sunt amestecuri de anticorpi policlonali, n cantiti variabile de la un organism la altul. Obinerea unor cantiti mari de anticorpi cu specificitate de legare fa de un epitop unic, prin metoda clasic este imposibil.

Tehnologia modern de obinere a anticorpilor omogeni, denumit hibridoma (hibrid + mieloma) a fost propus de Khler i Milstein (1975), se bazeaz pe urmtoarele principii metodologice i teoretice:

1) Antigenul purificat se injecteaz animalelor de experien.

2) La momentul adecvat, din splin sau din ganglionii limfatici, se separ limfocitele. Fiecare limfocit i plasmocitele derivate sintetizeaz molecule omogene de anticorpi, cu specificitate unic de combinare pentru un singur epitop, denumii anticorpi monoclonali (AMC).

3) Limfocitele B triesc puin n afara organismului, iar plasmocitele care sintetizeaz cea mai mare cantitate de anticorpi, nu supravieuiesc in vitro i de aceea cultivarea sau clonarea lor nu este posibil.

4) Celulele de mielom sunt nemuritoare, datorit capacitii lor de a se menine un timp nelimitat n cultur. Fuziunea lor cu limfocitele B in vitro, le confer celor din urm proprietatea de nemurire, rezultnd o celul hibrid(hibridom), care sintetizeaz i secret anticorpi monoclonali (AMC). AMC sunt considerai ca varianta in vitro a proteinelor de mielom, pentru c n ambele cazuri, o clon de limfocite prolifereaz i secret anticorpi cu o anumit specificitate

5) Hibridomul productor de anticorpi motenete caracteristici att de la limfocit adic secret anticorpi cu specificitate fa de un antigen, ct i de la celula de mielom, adic este nemuritor.

6) Celulele hibridoma pot fi clonate individual i fiecare clon produce anticorpi specifici fa de un singur determinant antigenic. Ele pot fi meninute indefinit prin pasaje in vivo sau prin cultivare in vitro. Fig.91. Biotehnologia hibridomului de producere a anticorpilor monoclonali se bazeaz pe fuziunea limfocitului, cu celula tumoral de mielom de oarece. Antigenele membranare specifice ale celor dou celule, se distribuie n mozaic pe suprafaa celulei fuzionate heterocarion.

Etapele obinerii hibridomului

Metodologia obinerii unei linii celulare hibride, nemuritoare, productoare de AMC, parcurge mai multe etape.

1. Obinerea celulelor de mielom. Baza tehnologiei hibridomului a fost obinerea unei linii celulare mutante de mielom, care nu secret anticorpi i este deficient pentru hipoxantinguanozin-fosfo-ribozil-transferaz (HGPRT).

Mielomul (plasmocitomul) este rezultatul diviziunilor necontrolate ale unui singur plasmablast sau ale unui precursor al su din linia limfocitar B. Proliferarea necontrolat este nsoit de sinteza unor cantiti mari de molecule omogene de imunoglobulin, cu proprieti biochimice uniforme. Moleculele sintetizate de tumorile de mielom se deosebesc de imunoglobulinele normale, prin aceea c nu prezint specificitate de legare cu antigenul.

Tumorile de mielom apar spontan la multe mamifere, iar la om, 1% din tumori sunt mieloame. Tumorile de mielom se induc experimental la mai multe linii de oarece (BALB/c i NZB), dup injectarea intraperitoneal a uleiurilor minerale, sau dup implantarea materialelor plastice, care produc o reacie inflamatorie cronic. Tumorile apar dup 120-130 de zile i se pot menine prin pasaje seriate la oareci din aceiai linie inbred sau prin cultivare in vitro i produc cantiti suficiente de imunoglobuline pentru analiza biochimic. Nu s-au obinut mieloame care s sintetizeze anticorpi cu specificitate de legare fa de un antigen.

Hibridoamele se obin din linii speciale de mielom, care au dou particulariti mutaionale:

- nu sintetizeaz propria molecul de imunoglobulin, astfel c celula hibrid va produce exclusiv molecule de imunoglobulin caracteristice limfocitului B normal;

- sunt deficiente pentru sinteza enzimei HGPRT, necesar sintezei acizilor nucleici.

- Pentru hibridare sunt disponibile linii celulare de mielom de oarece, de obolan, de om, dar cea mai folosit este linia P3-X63-Ag8, izolat de la linia BALB/c, cu urmtoarele caracteristici:

este HGPRT-;

- este tumorigen pentru oarece;

- are o frecven relativ nalt (1/105-106) de fuziune cu limfocitele de oarece;

- nu sintetizeaz imunoglobulina proprie i nu represeaz genele pentru sinteza imunoglobulinei n hibridom;

- are o eficien nalt de clonare in vitro.

Deoarece sunt deficiente pentru sinteza enzimei HGPRT, celulele sale nu detoxific efectul aminopterinei, care se adaug n mediul de cretere. Aminopterina, un antagonist al reductazei acidului folic, blocheaz calea sintezei ADN prin inhibiia sintezei purinelor (A, G) i a timidinei. In mediul cu aminopterin, celulele cu HGPRT- nu supravieuiesc.

2. Imunizarea. Obinerea unei populaii mari de limfocite B, prin fenomenul expansiunii clonale, angajate n sinteza anticorpilor specifici fa de un anumit epitop, se realizeaz prin imunizare. Antigenul stimuleaz mai multe clone de limfocite. Fiecare clon de limfocite activate, sintetizeaz anticorpi specifici fa de unul din epitopii antigenului. Procedura de imunizare (cantitatea de antigen, tipul de adjuvant, calea de administrare) este selectat empiric.

Cea mai bun surs de limfocite rmne splina de oarece i de obolan, dar n special oarecele BALB/c, pentru c mielomul are aceiai origine i prin hibridare se evit incompatibilitatea

CMH. Hibridoamele de obolan, obinute prin fuziunea limfocitelor splenice cu celule de mielom, sunt mai stabile i anticorpii pe care i sintetizeaz fixeaz complementul.

Cantitatea de antigen necesar pentru imunizare depinde de imunogenitatea acestuia. Antigenele celulare bacteriene sau ale celulei eucariote sunt foarte imunogene. Antigenele solubile (polipeptide, glucide, hormoni) sunt slab antigenice. Imunogenitatea lor crete dup cuplarea cu hemocianin de Limulus (KLH) sau cu albumina. Cea mai bun imunizare se obine prin injectare intravenoas sau intraperitoneal repetat, timp de cteva sptmni sau luni, a antigenului slab imunogen.

Splina se recolteaz nainte de atingerea titrului maxim al anticorpilor serici. Blastele fuzioneaz mai uor dect celulele n repaus.

O alternativ a imunizrii este stimularea limfocitelor in vitro, prin incubarea n prezena antigenului.

3. Fuziunea se realizeaz n scopul imortalizrii celulelor productoare de anticorpi i este esena biotehnologiei hibridomului. Scopul imortalizriieste pstrarea capacitii limfocitelor individuale de a secreta un singur tip de AMC, prin creterea nelimitat n timp, fr senescen, in vivo sau in vitro, ca o consecin a transformrii, indus cu celule de mielom.

Limfocitele sau imortalizat pe trei ci:

- prin fuziune cu celule tumorale de mielom

- prin infecie cu un virus transformant ADN

- prin transfecie cu ADN transformant din celulele maligne sau cu ADN al unui oncodnavirus.

Cea mai utilizat metod de imortalizare este aceea a fuziunii cu o celul de mielom. Fuziunea limfocitelor viabile din splin, obinute prin dezagregare mecanic, cu celulele de mielom HGPRT- se realizeaz prin amestecul lor n proporie de 2-5 celule splenice/o celul de mielom.

Procesul fuziunii este stimulat pe mai multe ci, dar cel mai adesea se folosete PEG cu gr. mol. de 4000 D. Amestecul de celule se menine 3 minute n 0,20-0,50 ml PEG 40%, la 370, pH 7,58,0. Frecvena fuziunii crete sub aciunea impulsurilor electrice scurte, de mare intensitate.

Numrul i varietatea hibridoamelor obinute este mare, ceea ce impune selecia celor productoare de anticorpi cu specificitatea dorit.

4. Selecia celulelor de hibridom. Amestecul de fuziune conine celule splenice i celule de mielom nefuzionate, celule splenice fuzionate ntre ele, celule de mielom fuzionate ntre ele i celule hibridom, rezultate prin fuziunea splenocitelor cu celule de mielom.

Selecia are ca scop, separarea celulelor de hibridom i eliminarea din amestec, a celorlalte tipuri celulare, nefuzionate sau fuzionate neutilizabile. In acest scop, amestecul de celule se cultiv pe mediul selectiv HAT (hipoxantin-aminopterin-timidin), n care splenocitele nefuzionate i fuzionaii splenocit x splenocit mor n 1-2 sptmni, copleite fiind numeric de celulele de hibridom, care se divid la fiecare 17-24 de ore.

Mediul selectiv HAT permite supravieuirea numai a fuzionailor mielom x splenocit i este inhibitor pentru celulele de mielom, ca i pentru fuzionaii mielom x mielom. Aciunea sa selectiv se bazeaz pe urmtoarele condiii experimentale:

a) Aminopterina din mediul HAT blocheaz sinteza purinelor (A, G) pe calea inozinmonofosfatului i astfel blocheaz sinteza acizilor nucleici. In acest mediu, celulele HGPRTdevin dependente de surse externe de purine (A, G) i de timidin. Hipoxantina din mediul HAT poate fi convertit la inozin-monofosfat, de ctre enzima HGPRT i se formeaz adenozin-monofosfat i guanozin-monofosfat. Timidina poate fi fosforilat la timidin-monofosfat i timidin-trifosfat, de ctre enzima TK. Ambele enzime (HGPRT i TK) se gsesc n splenocitele normale.

b) Celulele de mielom sunt HGPRT- i pe mediul selectiv HAT nu supravieuiesc nici celulele ca atare, nici fuzionaii mielom-mielom. Pe acest mediu supravieuiesc i se divid indefinit, celulele de hibridom, deoarece sunt HGPRT+ (codificat de genomul splenocitelor) i sunt nemuritoare, calitate conferit de celulele de mielom.

5. Clonarea. Clona este o populaie de celule identice, genetic stabile, derivate din diviziunea unei singure celule. Clonarea se face prin diseminarea suspensiei celulare diluate, pe medii

nutritive agarizate. Fiecare celul de hibridom, prin diviziuni succesive, produce o colonie, adic o clon celular. Operaia de clonare se repet pentru a garanta o descenden omogen. Dintre sutele de hibridoame clonate, este necesar selectarea celor cu capacitate de sintez a anticorpilor specifici fa de antigenul cu care s-a fcut imunizarea. Fig.92. Ilustrarea schematic a etapelor producerii anticorpilor monoclonali (AMC). Animalele, de obicei oareci, sunt imunizate cu un antigen (de exemplu, un microorganism care conine 4 antigene de suprafa - a, b, c, d). Fiecare antigen conine un numr de epitopi, de exemplu molecula b conine epitopii b, b, b. Serul animalelor imunizate este policlonal i conine anticorpi A, B, B, B, C, D. Prima treapt n producerea AMC este obinerea suspensiilor de celule B i celule de mielom. In etapa urmtoare, cele dou populaii de celule (m i s) sunt puse n amestec, n prezena PEG, ca agent de fuziune. Suspensia se repartizeaz n godeurile unei plci pentru cultivarea celulelor, la o diluie adecvat astfel nct, fiecare godeu s nu conin mai mult dect o celul hibrid. Celulele se cultiv n mediu HAT pentru a inhiba creterea celulelor de mieloma nefuzionate. Celulele splenice nefuzionate nu se divid i mor dup cteva zile. In procesul de selecie mor i fuzionaii s - s i m - m. Supravieuiesc i prolifereaz fuzionaii am, bm, bm, dm i xm. Clonarea se repet. Hibridoamele se cultiv i se determin specificitatea anticorpilor sintetizai. Cele care sintetizeaz anticorpi cu specificitatea necesar se propag n recipiente mai mari n care se obin 1-10 l/ml. Celulele pot fi injectate n cavitatea peritoneal de oarece, unde se multiplic sub forma ascitei i produc 1 mg/ml anticorpi specifici.

Hibridoamele productoare de anticorpi cu specificitatea dorit, se cultiv in vitro, n culturi cu perfuzie continu cu mediu proaspt sau n bioreactoare cu capacitate mare.

Cea mai simpl tehnic este a cultivrii in vivo i const n inocularea intraperitoneal a circa 2 x 106 celule hibridoma, la organisme ale aceleai linii genetice (pentru evitarea fenomenului de incompatibilitate CMH). Hibridomul se dezvolt intraabdominal i lichidul de ascit care o nsoete, conine anticorpi n proporie de 50% din totalul proteinelor sale.

Randamentul producerii AMC in vivo este de 100-1000 de ori mai mare dect in vitro. Anticorpii din lichidul ascitic se purific prin fracionare cu sulfat de amoniu sau prin metoda cromatografiei cu schimb de ioni.

Avantajele biotehnologiei hibridomului

Producerea AMC prin tehnologia hibridomului are un avantaj net fa de metoda convenional a obinerii serului imun, deoarece se pot obine anticorpi specifici produi de cte un hibridom, pentru fiecare epitop al unui antigen natural. Clonarea individual a fiecrui hibridom, creeaz condiii ca fiecare clon celular s secrete anticorpi cu specificitate unic fa de un singur epitop al unui antigen.

Celulele de hibridom prolifereaz rapid, ceea ce scurteaz timpul necesar obinerii AMC.

Hibridoamele produc cantiti foarte mari de anticorpi, ce depesc de cteva ori concentraia anticorpilor din serul animalelor imunizate.

Clonele de hibridom se menin indefinit prin cultivare in vitro sau in vivo.

Hibridomul ofer posibilitatea obinerii AMC marcai, prin adugarea precursorilor marcai radioactiv (marcare intern). Anticorpii marcai in situ (n timpul sintezei) ofer un avantaj net n raport cu anticorpii marcai dup purificare (marcare extern). Marcarea extern cu I125 implic purificarea imunoglobulinelor din antiserul convenional, dar presupune modificarea chimic i denaturarea parial, cu pierderea proporional a specificitii de legare.

Pentru marcarea intern se folosesc elemente radioactive cu perioada de njumtire mai lung dect a I125 : C14, S35, H3. Marcajul radioactiv intern este net superior celui cu peroxidaz i feritin, utilizat n tehnicile convenionale.

Tehnologia hibridomului este un model experimental care poate fi extins i la alte categorii de celule care sintetizeaz substane utile (interferon, insulin). Obinerea unor hibrizi dintre celula de mielom de oarece i un limfocit normal, de la aceiai specie, n scopul producerii AMC, a introdus un concept nou n biologia molecular - conceptul imortalizrii funciilor specifice difereniate.

Aplicaii practice ale AMC

AMC reprezint un reactiv imunochimic bine definit i de aceea, rezultatele obinute prin utilizarea lor sunt reproductibile.

AMC se folosesc ca reactivi de mare specificitate n cercetare, n diagnosticul clinic, n farmacologie pentru profilaxia i terapia unor infecii la om i animale, n tehnicile de biochimie analitic pentru purificarea unor molecule.

n domeniul cercetrii imunocitochimice*, AMC sunt reactivi cu nalt specificitate, utilizai pentru identificarea unor proteine care se gsesc n cantiti foarte mici. De exemplu, AMC marcai cu fluorescein permit evidenierea moleculelor membranare, inaccesibile investigaiei cu metodele clasice. AMC au fost markeri eficieni pentru identificarea diferitelor subpopulaii de limfocite T i B, a antigenelor membranare ale celulelor seriei mieloide i monocitare. Sistemul CD (cluster differentiation) este definit n ntregime pe baza utilizrii AMC i cuprinde acum peste 200 de markeri de suprafa. AMC cu specificitate CD se folosesc pentru a detecta apariia sau absena populaiilor celulare n timpul stimulrii antigenice. Fig. 93 Structura fluoresceinei.

Datorit specificitii lor de legare, AMC se folosesc pentru a evidenia diferenele antigenice minore ntre diferite variante moleculare. Astfel sau identificat variaiile compoziiei n aminoacizi ale spiculelor glicoproteice, consecutive driftului antigenic la virusul influenza A.

AMC se folosesc pentru identificarea moleculelor neurotransmitoare, a receptorilor sinaptici i a enzimelor de biosintez. S-au obinut AMC fa de receptorul de acetilcolin, dar dificultile sunt mari pentru c neurotransmitorii sunt antigene slabe.

n diagnosticul serologic, serurile imune obinute prin metoda clasic au avut adeseori inconvenientul major al lipsei reproductibilitii rezultatelor. AMC se folosesc ca reactivi de mare specificitate pentru diagnosticul rabiei pe seciunile de esut nervos al animalelor infectate,

Anticorpul este marcat cu o molecul generatoare de semnal (de exemplu, un fluorocrom, o enzim productoare de culoare prin aciunea sa asupra substratului specific, ori o particul metalic). Sensibilitatea metodei, adic puterea semnalului poate fi mrit prin creterea raportului dintre molecula indicator (anticorpul marcat) i antigen. Imunocitochimia necesit producerea anticorpilor specifici i tratamentul adecvat al esuturilor, adic fixarea i histoprepararea pentru a favoriza interaciunea optim ntre reactiv i molecula int a hepatitelor virale B, C, D, a infeciei cu HIV (prin determinarea prezenei antigenelor n ser) i a unor

infecii bacteriene. Pentru diagnostic se folosesc anticorpi marcai cu fluorescein sau metodele ELISA sau RIA.

AMC se folosesc pentru diagnosticul neoplaziilor, pe baza evidenierii antigenelor specifictumorale. n acest scop se utilizeaz AMC marcai cu izotopi radioactivi, cu specificitate fa de CEA, AFP etc.

AMC se folosesc pentru detectarea hormonilor polipeptidici: TSH, FSH, HCG. Hormonii sunt molecule cu un numr mic de epitopi. Subunitile ale diferiilor hormoni sunt foarte asemntoare, dar difer n special prin catenele . Exist AMC specifici pentru ambele subuniti i AMC care recunosc epitopii conformaionali ai moleculei native.

AMC se folosesc n farmacologie. In scop profilactic se fac imunizri pasive fa de infeciile bacteriene care nu beneficiaz de preparate vaccinale i sunt rezistente la antibiotice: Pseudomonas, Clostridium.

n scop terapeutic, AMC se folosesc pentru tratamentul rabiei, pentru neutralizarea endotoxinelor (LPS) produse de infeciile cu bacterii Gram negative, consecutive arsurilor. Septicemiile sunt cauzate de o larg varietate de bacterii Gram negative, toate avnd n comun lipidul A n structura chimic a LPS. Pentru tratamentul majoritii infeciilor bacteriene se utilizeaz antibiotice, la un pre de cost inferior n raport cu AMC.

AMC se folosesc n controlul fertilitii: AMC anti-HCG i anti-zona pelucida sunt folosii pentru imunizarea pasiv a femeilor fertile.

Sperana utilizrii AMC n tratamentul tumorilor s-a nruit. Una din cauze este c majoritatea tumorilor umane i au originea n celulele epiteliale ale colonului, snului, plmnului i prostatei, iar oncogenele activate codific proteine intracelulare, inaccesibile terapiei cu AMC. Frecvena acestor tumori nu crete la persoanele imunosupresate, ceea ce este un argument n favoarea codificrii antigenelor intracelulare, inaccesibile sistemului imunitar. Chimioterapia ofer mult mai multe anse de succes, la un pre de cost inferior.

n sistemul hematopoietic i imunitar, AMC se folosesc pentru a distruge toate populaiile celulare, cu excepia celulelor stem, cu scopul eliminrii celulelor malignizate i a precursorilor ei care poart oncogena activat.

AMC se folosesc pentru neutralizarea nivelelor toxice ale unor medicamente (digoxina).

AMC se folosesc ca ageni imunosupresori. Receptorilor de gref li se administreaz AMC specifici fa de complexul antigenic membranar CD3, n cazurile n care imunosupresia chimic (cu ciclosporin) nu reuete.

n maladiile autoimune, AMC se administreaz pentru a realiza o imunosupresie parial, care s permit aprarea fa de infeciile cu ageni oportuniti.

AMC se folosesc pentru producerea imunotoxinelor (conjugate AMC-medicamente). Medicamentele utilizate sunt ageni citotoxici, care, prin intermediul situsului de legare a AMC, sunt destinate s se lege specific de celulele int(de exemplu, celulele maligne). In acest scop sunt necesari AMC cu o afinitate nalt a specificitii de legare fa de antigene specific tumorale. AMC se cupleaz cu toxine (difteric, ricin, abrin), cu medicamente citostatice sau cu radionuclizi.

AMC se folosesc n tehnicile de biochimie analitic, n scopul purificrii proteinelor, sub forma coloanelor de afinitate imunoabsorbante. AMC sunt imobilizai pe suporturi n coloane solide (imunosorbeni), prin care este trecut amestecul de proteine. In coloan sunt reinute specific, moleculele care se leag cu AMC. Astfel se purific proteine care se gsesc n amestec, n concentraii foarte mici (IFN).

*Imunocitochimia este o tehnic de laborator care permite identificarea vizual a moleculelor int n esuturi i celule, prin interaciunea specific a anticorpilor marcai, cu antigenul.

MECANISME DE APRARE ANTIINFECIOAS

Sistemul imunitar a evoluat i s-a complexat structural i funcional, n condiiile presiunii selective permanente pe care o exercit agenii infecioi, ce tind s invadeze, s colonizeze i s se multiplice n esuturi. Structura sistemului imunitar este o reflectare direct a interaciunilor

sale cu diversitatea agenilor infecioi care-l stimuleaz. Cele dou fore opozante s-au modelat reciproc, ntr-un conflict constant. Gazdele care nu neutralizeaz agentul infecios sunt sortite morii, iar cele care supravieuiesc sunt mai bine adaptate s reziste infeciilor ulterioare.

Problema heterogenitii antigenice a virusurilor i bacteriilor patogene este important nu numai din punct de vedere teoretic, ci este esenial pentru aspectul practic al vaccinrii, deoarece exist riscul stimulrii rspunsului imun fr eficien protectoare. Consecina stimulrii unui rspuns imun ineficient poate fi agravarea maladiei infecioase sau chiar activarea mecanismelor patogenitii autoimune.

Evaluarea imunogenitii moleculelor structurilor suprafeei virusurilor i bacteriilor este dificil, deoarece o molecul n soluie poate avea o alt configuraie a epitopilor dect n ansamblul structural nativ. Diferena deriv din raporturile sale spaiale cu moleculele vecine, pe suprafaa agentului infecios. Din aceast cauz, rspunsul imun al organismului, la stimularea cu un agent patogen, rmne un domeniu de studiu practic nelimitat. O alt complicaie este consecina faptului c specificitatea antigenic a unor molecule este, uneori, variabil de la o tulpin la alta, att la virusuri ct i la bacterii. Rspunsul imun trebuie s contracareze nu numai diversitatea antigenelor la care este expus, ci trebuie s gseasc soluia de rspuns, pentru variaia biochimic a unei structuri, la diferite tulpini de microorganisme.

RSPUNSUL IMUN SPECIFIC ANTIINFECIOS

Rspunsul imun antibacterian i antiviral are att o component humoral ct i una celular. Prevalena unuia sau altuia dintre cele dou compartimente este diferit n funcie de natura agentului infecios. De cele mai multe ori, predomin rspunsul imun mediat humoral, iar n cazuri mai rare (de exemplu, infecia cu M. tuberculosis sau cu M. leprae) este preponderent rspunsul imun mediat celular.

Rspunsul imun fa de diferite antigene ale agenilor patogeni are grade variate de protecie antiinfecioas, n funcie de natura agentului, de gradul su de virulen i de natura rspunsului imun pe care-l iniiaz. Uneori, rspunsul imun antiinfecios este puin benefic pentru gazd sau este chiar detrimental, din diferite cauze:

- rspunsul imun este orientat fa de componente moleculare neeseniale ale agentului infecios. Stimularea antigenic activeaz un rspuns imun ineficient. Anticorpii nu au efect neutralizant al infeciozitii, pentru c structurile de care se leag specific nu constituie situsuri critice ale agentului patogen (de exemplu, anticorpii antiflagelari, care in vitro determin aglutinarea, in vivo au o eficien mai sczut, limitat la imobilizarea celulelor bacteriene);

- rspunsul imun poate produce leziuni mai puternice i mai extinse dect nsui agentul infecios. Infecia propriu-zis produce leziuni minime, dar activarea imunitii mediate celular amplific leziunile tisulare i grbete evoluia procesului infecios (de exemplu, leziunile consecutive infeciei cu virusul corio-meningitei limfocitare la oarece i liza hepatocitelor infectate cu virusul hepatiei B umane).

Componentele structurale antigenice ale unui agent infecios, care stimuleaz un rspuns imun protector se numesc situsuri critice sau structuri imunodominante.

Un rspuns imun eficient (protector) trebuie s aib ca rezultat final, lezarea structurii peretelui bacterian, fungic sau a nveliului viral, prin aciunea combinat a anticorpilor i a proteinelor complementului.

Structura antigenic a celulei bacteriene

Multe molecule bacteriene moduleaz activitatea sistemului imunitar, avnd ori un efect stimulator (adjuvant), ori diminu reactivitatea imunitar. Ele modific rspunsul celulelor imunitare competente, prin mecanisme de semnalizare. De aceea se numesc molecule imunomodulatoare. Efectele lor realizeaz un echilibru complex ntre mecanismele de recunoatere i neutralizare a antigenelor i virulena bacterian. Imunomodulatorii pot avea efecte asupra limfocitelor T, B i asupra macrofagelor, similare cu cele produse de citochine.

Imunomodulatorii cu activitate mitogenic, induc activarea policlonal a limfocitelor T i B, care se deosebete de activarea specific. Rezultatul este sinteza anticorpilor cu specificiti multiple, dintre care, o fracie sunt specifici fa de agentul infecios. Dei fr specificitate, sinteza rapid a anticorpilor poate fi suficient pentru stoparea infeciei.

Moleculele imunomodulatoare modific nu numai reactivitatea imunitar, ci i mobilitatea celulelor, n special a fagocitelor (de exemplu, pot inhiba migrarea macrofagelor din focarul inflamator). Dac moleculele imunomodulatoare persist n esuturi, stimuleaz cronic sistemul imunitar, cu efecte patologice autoimune, cea mai cunoscut fiind artrita de adjuvant.

Multe molecule imunomodulatoare de origine bacterian au efecte mai generale, care se extind asupra altor sisteme: ele produc febr, influeneaz sistemul de coagulare sanguin, concentraia ionilor, a Fe etc.

Moleculele bacteriene cu rol imunomodulator sunt localizate pe suprafaa celulei. Ele sunt polimeri ai nveliului, dar i molecule excretate, cu efect toxic. Pe de alt parte, eficiena rspunsului imun antibacterian, depinde de raportul dintre reactivitatea sistemului imunitar i mecanismele de autoprotecie ale bacteriei, menite s devieze rspunsul imun.

Din punct de vedere antigenic, bacteriile interacioneaz cu gazda prin modaliti diverse. La o extremitate sunt cele lipsite de atributul invazivitii, care produc cantiti mici de toxine, iar la cealalt, sunt bacteriile care cresc cu o rat nalt n esuturi sau n snge i produc septicemii. Unele bacterii prezint determinani antigenici asemntori ca structur chimic, moleculelor self ale organismului gazd. Rspunsul imun specific va fi absent ori nesemnificativ, sau efectorii imunitari dau reacii ncruciate cu moleculele self. Alteori, suprafaa bacterian posed determinani antigenici de natur proteic sau polizaharidic, inductori ai rspunsului imun.

Cele mai semnificative structuri bacteriene din punct de vedere antigenic sunt cele parietale: peptidoglicanul din peretele Gram pozitiv i Gram negativ, peptidoglicolipidele din peretele complex al micobacteriilor i structurile parietale ale spirochetelor. Toate tipurile structurale de perete conin murein (peptidoglican), dar se deosebesc prin alte numeroase componente chimice cu semnificaie antigenic.

Unitatea minim a peptidoglicanului care pstreaz activitatea imunostimulatoare este N-acetilmuramil-L-alanina-D-izoglutamina (muramil dipeptid- MDP). Att componenta glucidic ct i aminoacizii MDP au funcie imunomodulatoare.

A II-a clas de polimeri imunomodulatori sunt acizii teichoici i lipoteichoici ai bacteriilor Gram pozitive.

Proteinele de suprafa asociate peretelui celular au, uneori, semnificaie antigenic. Cea mai cunoscut este proteina M de la Str. pyogenes (grup A), care confer specificitate de tip. S-au identificat peste 80 de variante antigenice, cu rol de factor de virulen.

Componentele antigenice eseniale ale membranei externe a bacteriilor Gram negative sunt lipopolizaharidele (LPS), a cror specificitate este conferit de polizaharidul O, o structur imunodominant care cuprinde pn la 40 de uniti glucidice. Numeroasele variaii structurale ale catenei glucidice determin existena unui numr corespunztor de variante antigenice bacteriene. LPS este componentul principal al bacteriilor Gram negative, activator al rspunsului imun nscut, prin componentul su lipidic. Termenii LPS i endotoxin sunt frecvent utilizai cu acelai sens. LPS trebuie s desemneze moleculele purificate, iar termenul de endotoxin semnific LPS i proteinele asociate din membrana extern, eliberate din suprafaa celulei.

LPS sunt molecule amfifile, ceea ce condiioneaz interaciunea lor cu celulele organismului. Ele au o regiune hidrofob, capabil s stabileasc legturi cu lipidele membranare i o parte hidrofil, care poate rmne n faza apoas. O prim modalitate de interaciune este cea direct, dintre molecula amfifil i suprafaa celulei. Molecula LPS poate fi inserat n membrana celulei, prin jumtatea hidrofob sau se leag de receptorii membranari prin jumtatea hidrofil.

A II-a modalitate de interaciune a moleculei LPS cu celulele este indirect, mediat de proteina care leag (binding) LPS (LBP). Molecula de LPS este recunoscut i legat de o glicoprotein plasmatic de 60 kD, din categoria proteinelor de faz acut. Este sintetizat de hepatocite i are un situs de legare pentru lipidul A.

Polizaharidele capsulare ale unor bacterii patogene Gram pozitive i negative, libere n supernatant sau legate de perete, sunt foarte imunogene dac conin lipide sau proteine terminale. Variaia lor biochimic deriv nu numai din schimbarea ordinii unitilor glucidice componente, ci, n primul rnd, din posibilitatea legrii monozaharidelor de oricare din cei 6 atomi ai hexozei adiacente. Diferenele de secven a monozaharidelor genereaz determinani antigenici care nu reacioneaz ncruciat cu anticorpii specifici fa de un alt determinant cu aceiai compoziie.

Toxinele de natur proteic sunt imunogene i stimuleaz rspunsul imun cu efect protector.

Peretele celular al micobacteriilor este foarte rezistent la aciunea factorilor litici. In alctuirea sa intr glicolipide, formate din resturi de acid micolic, legai covalent de resturile de arabinogalactan (lipoarabinogalactan) i arabinomanan (lipoarabinomanan). Complexul glicolipidic se leag de peptidoglican, prin puni fosfat.

Membrana extern a spirochetelor este bogat n lipide i lipopeptide, stimulatoare ale rspunsului imun i ale reaciilor de hipersensibilitate.

Bacteriile toxigene, lipsite de invazivitate (C. diphteriae, C. tetani, clostridiile enterice) stimuleaz rspunsul imun humoral antitoxic.

Bacteriile invazive determin infecii regionale sau generalizate (sistemice). Majoritatea se multiplic n spaiile extracelulare, unele au localizare facultativ intracelular, iar altele sunt obligat intracelulare.

Bacterii cu localizare extracelular Bacterii facultativ intracelulare, Bacterii obligat intracelulare Streptococcus sp Mycobacterium tuberculosis Rickettsia Staphylococcus sp Neisseria sp M. leprae Chlamydia

Brucella sp. Listeria monocytogenes

Escherichia coli

Klebsiella sp. Yersinia sp. Proteus sp. Salmonella typhi S. paratyphi Treponema pallidum

Pseudomonas sp. Bacteroides fragilis

Haemophilus influenzae Actinomyces sp.

Bacteriile cu localizare extracelular induc un rspuns imun mediat humoral. Activarea limfocitelor B este rezultatul cooperrilor celulare macrofag-limfocit B-limfocit Th. In focarul de inflamaie, bacteriile cu localizare extracelular determin formarea abcesului, n care predomin polimorfonuclearele

Bacteriile cu localizare intracelular induc, preponderent, un rspuns imun mediat celular. Persistena lor n celulele fagocitare are ca rezultat final, formarea granulomului. Cele mai tipice pentru natura lor imunitar sunt granuloamele care se formeaz n infeciile cu M. tuberculosis i cu M. leprae.

Mecanisme prin care microorganismele evit aprarea gazdei

Infeciozitatea microorganismelor patogene este dependent de capacitatea lor de a coloniza esuturile gazdei i de a contracara mecanismele de aprare ale gazdei. Capacitatea de variaie rapid a moleculelor de suprafa este o trstur evolutiv comun n tot spectrul patogenilor. Se cunosc exemple de bacterii patogene care au elaborat mecanisme ce permit variaia antigenic rapid i eficient. Moleculele de suprafa prezint regiuni bine conservate, ancorate n membran, dar nu sunt niciodat expuse contactului cu sistemul imunitar al gazdei. Rata nalt de mutaie produce un numr mare de variante antigenice. Astfel, n patogeneza gonoreii i meningitei, cauzate de Neisseria sp, rolul fimbriilor este esenial pentru ataarea de celulele epiteliale. Moleculele de fimbrilin evideniaz secvene constante, semivariabile i hipervariabile. Regiunile hipervariabile determin antigenitatea acestor structuri i tropismul fa de celulele epiteliale ale tractului urogenital uman. N. meningitidis este capsulat i numai fimbriile proemin dincolo de limitele stratului polizaharidic. De aceea, pierderea fimbriilor inhib proprietatea de aderen.

Polizaharidul capsular este repelent pentru fagocite, deoarece celulele fagocitare nu au receptori pentru polizaharidele capsulare. Uneori, acestea sunt asemntoare oligozaharidelor din moleculele glicoproteice proprii organismului, ceea ce explic slaba lor imunogenitate. Tulpinile variante, necapsulate sunt mai puin virulente, dar au avantajul c nu sunt recunoscute de anticorpii specifici fa de antigenele capsulare. Absena capsulei, la Haemophilus influenzae, confer celulei o capacitate sporit de a se ataa i de a invada celulele epiteliale ale gazdei.

La Str. pyogenes s-au identificat peste 80 de serotipuri diferite, ce rezult din mutaiile punctiforme ale genei ce codific proteina M, component a peretelui celular.

LPS protejeaz fizic celula bacterian de aciunea complementului i a fagocitelor, constituind un strat protector, iar diversitatea glucidelor din oligozaharidul terminal, confer o variaie antigenic extrem de larg. La. S. typhimurium s-au identificat peste 2000 de variante antigenice, cu tot attea specificiti serologice.

La spirocheta Borrelia hermsii (agentul febrei recurente, caracterizat prin crize febrile, separate de intervale asimptomatice), episoadele febrile semnific apariia i multiplicarea unei noi variante antigenice. Antigenul variant este o protein abundent a membranei externe (VMP = variable

major protein).

Unul dintre cele mai bine studiate exemple de variaie antigenic i rolul ei n infecie, este al tripanosomelor africane care produc boala somnului. T. brucei produce o parazitemie, care crete i descrete, deoarece genereaz subpopulaii care sunt variante antigenice ale unei glicoproteine specifice (VSG variant-specific glycoprotein) a suprafeei celulei. Undele de parazitemie constituie trstura principal a infeciei cronice, care persist pn cnd individul tratat se vindec, ori netratat, moare. In stadiile terminale, agentul patogen invadeaz alte esuturi i capacitatea de aprare este depit.

n cursul infeciei, numrul mare de parazii, d natere la o subpopulaie care poart o VSG modificat biochimic i antigenic, ce scap controlului imediat al rspunsului imun. Ulterior, aceast variant nou este recunoscut de sistemul imunitar, dar generarea rapid a noilor VSG mpiedic eliminarea infeciei. Capacitatea parazitului de a se comuta la diferite VSG duce la epuizarea forelor de aprare ale gazdei n fazele terminale ale bolii.

Infecia cu Plasmodium falciparum este persistent, recurent i se caracterizeaz printr-un tablou foarte variabil al manifestrilor clinice. Imunitatea specific se dezvolt lent i numai dup infecii ample i repetate, se consolideaz un rspuns imun protector fa de infecia sever, dar este o imunitate incomplet i incapabil s sterilizeze organismul. In ariile geografice cu o rat nalt de transmitere a parazitului, apar complicaii severe, cu mortalitate crescut, la copiii sub 5 ani. Copiii care depesc 5 ani, au imunitate adecvat pentru a controla infecia. Starea de protecie persist tot restul vieii, n condiiile inoculrii continue a sporozoiilor de la narii infectai. Rspunsul imun fa de antigenele parazitului este mediat de anticorpi (IgG). La pacienii cu SIDA (care exacerbeaz dramatic evoluia tuberculozei sau infeciile oportuniste), malaria nu are o evoluie mai sever, ceea se nseamn c sinteza IgG este independent de celulele T. Eritrocitele infectate sunt ingerate de macrofage, independent de IFN.

Diversitatea antigenic a tulpinilor de Plasmodium este argumentat de miniepidemiile de malarie sever, care apar n zonele endemice mari. Tulpinile mai virulente au proprieti antigenice i de citoaderen modificate. Diferenele proprietilor de aderen produc manifestri severe, inclusiv malarie cerebral, iar modificrile de antigenitate permit parazitului s persiste i s produc infecii repetate.

Moleculele de suprafa ale eritrocitelor infectate cu P. falciparum prezint variaie antigenic, ceea ce condiioneaz citoaderena. Aderena eritrocitelor infectate, de esutul cerebral, renal sau hepatic, este cauza malariei severe. Generarea continu a diferitelor populaii variante antigenice de parazii, cu diferite specificiti de aderen, este cauza infeciilor persistente caracterizate prin unde de parazitemie i manifestri clinice specifice malariei.

Diversitatea fenotipic corespunztoare variaiei antigenice este o strategie foarte eficient pentru adaptarea la presiunea selectiv pe care o exercit efectorii rspunsului imun i la diversitatea de particulariti structurale i funcionale ale esuturilor gazdei. Mecanismele de variaie sunt deosebit de importante pentru succesul diseminrii unei infecii n populaia gazd.

RSPUNSUL IMUN N INFECIILE VIRALE

Infeciile virale constituie, nc, o cauz major a morbiditii i mortalitii, dei vaccinarea a redus incidena infeciilor severe (polio, oreion, rujeol, rubeol) i a eradicat variola. Cunoaterea mecanismelor rspunsului imun antiviral este important pentru evaluarea problemelor clinice de fond (de exemplu, dinamica rspunsului imun) i pentru cutarea unor noi metode de obinere a vaccinurilor.

Interaciunea virusurilor cu organismele, este modulat de sistemele de aprare nscute i dobndite. Pentru a se perpetua ntr-o populaie, virusul trebuie s fie virulent, dar suficient de flexibil n modularea virulenei, pentru a se pstra n populaia sensibil. In perspectiv evolutiv, interaciunea virusului cu organismul sensibil trebuie s confere superioritate virusului. Dac este prea virulent i nu poate fi controlat de imunitatea gazdei, rezultatul poate fi moartea i n final dispariia gazdei. Dac este lipsit de virulen, virusul va fi eliminat prea rapid de sistemul imunitar al gazdei i poate s dispar prin incapacitatea de a se perpetua.

Adeseori, virulena viral este diminuat prin mutaie i n acelai timp se selecteaz gazde mai bine adaptate imunitar, rezultnd un echilibru fluctuant, n care coexist att gazda ct i virusul.

Proteinele virale, componente ale capsidei i peplosului, sunt imunogene i induc un rspuns imun intens n organismul infectat. Rspunsul imun antiviral este orientat att fa de antigenele exprimate pe suprafaa virionilor, ct i fa de antigenele prezentate pe suprafaa celulei infectate.

Antigenele expuse pe suprafaa celulei infectate, difer n funcie de natura virusului (nud sau acoperit) i de mecanismul maturrii virionilor. Celulele infectate cu virusuri nude (adeno-, reo-,

enterovirusuri) expun pe suprafaa lor proteine virale asociate cu moleculele CMH I, iar cele infectate cu virusuri nvelite, n special cu virusuri care se matureaz prin nmugurire la nivelul membranei, expun glicoproteinele peplosului, inserate n arii limitate ale membranei. In ambele cazuri, celula infectat devine inta mecanismelor de recunoatere imunitar.

Antigenele expuse pe suprafaa virionului sau a celulei infectate, stimulatoare ale rspunsului imun, se numesc antigene protectoare. Antigenele intrinseci ale virionului, au rol protector nesemnificativ, deoarece nu vin n contact cu sistemul imunitar, dect n cazul n care se sintetizeaz n exces i se elimin din celula infectat.

Antigenele virale libere sau asociate virionului, stimuleaz rspunsul imun humoral, iar cele prezentate pe suprafaa celulelor infectate, stimuleaz rspunsul imun celular.

Activarea unuia sau altuia dintre compartimentele imunitii, depinde de mai muli factori: de tipul de infecie (primar sau secundar), de rezultatul interaciunii virus-celul (liz sau infecie persistent) etc.

Virusurile care produc infecii acute, determin o competiie ntre replicarea viral i efectorii rspunsului imun. Rezultatul este nsntoirea sau moartea gazdei.

Pentru virusurile care produc infecii cronice, scara de timp este mai lung. Virionii sau antigenele virale din snge sau din alte fluide, determin formarea complexelor Ag-Ac, cu manifestri patologice secundare. Alteori, anticorpii antivirali i celulele T activate, pot produce leziuni ale celulelor infectate. Majoritatea manifestrilor clinice care nsoesc infeciile virale cronice, sunt consecina rspunsului imun al gazdei, stimulat de antigenele virale.

Rspunsul imun primar

Mecanismele de aprare nespecific (interferonul, aciunea celulelor NK, rspunsul mucociliar) pot influena rezultatul infeciei.

Dup infecia viral primar sau dup administrarea vaccinului inactivat, se stimuleaz rspunsul imun mediat celular(citotoxic) i humoral. Rspunsul humoral, cu sinteza anticorpilor, are o dinamic lent. In stadiul acut al infeciei, titrul anticorpilor specifici este abia detectabil, dar atinge valoarea maxim la 2-4 sptmni i persist sptmni sau luni, n funcie de gazd, virus etc. Pentru virusul febrei galbene i cel rujeolic, nivelul detectabil al anticorpilor persist tot restul vieii.

Dup infecia primar sau dup vaccinarea cu preparatul viral atenuat sau inactivat, se sintetizeaz anticorpi din clasele IgM, IgA i IgG. Sinteza anticorpilor este indus de marea majoritate a virusurilor, dar rolul protector al imunoglobulinelor este variabil de la un virus la altul, n funcie de sediul multiplicrii, care la rndul su condiioneaz manifestrile patologice ale infeciei.

n funcie de mecanismul patogenezei, se disting trei tipuri de virusuri:

- virusurile care infecteaz mucoasele tractului respirator i digestiv i rmn la poarta de intrare: rinovirusuri, influenza, parainfluenza, virusul respirator sinciial, enterovirusuri;

- virusuri care infecteaz i se multiplic la nivelul mucoaselor, iar ulterior se disemineaz pe cale sanguin, limfatic sau axonal, pentru a infecta viscerele sau sistemul nervos central: virusul poliomielitei, rujeolic, al oreionului, herpes simplex, pox, virusul hepatitei A;

- virusuri inoculate direct n snge, prin muctur, neptur, prin traume, iar de aici se rspndesc la organele int: HIV, virusul hepatitei B, virusul rabic, virusurile encefalitogene(alfa- i flavivirusuri).

Rolul anticorpilor n imunitatea antiviral

Cei mai importani anticorpi cu rol protector antiviral sunt cei care au specificitate de combinare fa de epitopii critici ai suprafeei virionilor. Legarea anticorpilor cu virionul se face dup modelul complementaritii spaiale ntre epitopii antigenelor suprafeei virale i situsul de combinare al anticorpilor. Efectul principal al interaciunii anticorpilor cu particulele virale, n

faza fluid, este neutralizarea, adic pierderea infeciozitii virionilor. Pentru producerea efectului neutralizant, este necesar legarea mai multor molecule de anticorpi, care trebuie s recunoasc o structur esenial a virionului, denumit situs critic. De exemplu, fagii din seria Tpar au un singur situs critic i infeciozitatea lor este anulat de legarea anticorpilor specifici la nivelul fibrelor cozii. Virionul gripal are situsuri critice multiple: anticorpii anti-HA sunt neutralizani, cei specifici anti-NA au efect neutralizant minim, iar anticorpii anti-protein M sunt total ineficieni.

La adenovirusuri, situsurile critice sunt capsomerele hexonice i fibra pentonic. Anticorpii specifici fa de aceste structuri sunt neutralizani, iar anticorpii anti-penton nu diminu infeciozitatea. Pentru HIV, situsul critic este zona prin care virionul se ataeaz de moleculele CD4 ale limfocitului Th. Anticorpii specifici fa de situsul de legare al virusului Epstein-Barr de receptorul pentru C3b al limfocitului B, au efect neutralizant.

Moleculele de anticorpi legate pe suprafaa virionului nvelit formeaz complexe, care, in vivo sau in vitro, iniiaz fixarea complementului. Rezultatul final este liza virionilor nvelii.

Un alt efect al interaciunii anticorpilor cu virionii, in vitro, este agregarea. Fenomenul este dependent de un prag limit a densitii virionilor/unitate de volum. Agregarea virionilor este nsoit de diminuarea infeciozitii, deoarece chiar n cazul unui mare exces al moleculelor de anticorpi, unele particule virale din interiorul agregatului, rmn n afara contactului cu anticorpii neutralizani i i pstreaz infeciozitatea, denumit infeciozitate rezidual sau persistent. Agregarea viral fiind dependent de un prag al densitii virionilor, este un fenomen care se manifest numai in vitro. In vivo nu se realizeaz niciodat o densitate limit a virionilor care s produc acest efect.

Anticorpii antivirali ce se sintetizeaz n cursul rspunsului imun primar, au energie mic (afinitate) de legare cu situsurile antigenice ale virionilor i se disociaz uor, lsnd o infeciozitate rezidual. Alteori, moleculele de anticorpi nu acoper situsurile critice ale virionilor, care condiioneaz iniierea procesului infecios.

Efectul protector al anticorpilor circulani este demonstrat pentru infeciile cu faz viremic, avnd o contribuie esenial la ncheierea procesului infecios.

Anticorpii reduc ncrctura de virus i diminu infeciozitatea viral, consecina fiind scderea numrului de celule infectate, uurnd astfel sarcina celulelor Tc de a elimina celulele infectate.

n cursul infeciei secundare, anticorpii se sintetizeaz rapid, la titru nalt.

Anticorpii se folosesc pentru profilaxia i terapia infeciilor virale. Imunizarea pasiv cu ser imun, diminu riscul infeciei virale i se folosete n tratamentul infeciilor stabilizate.

Protecia mucoaselor. La nivelul mucoaselor, imunitatea antiviral este dependent, n primul rnd de IgA. Sinteza local de anticorpi (n special IgA) dup stimularea viral este relativ independent de rspunsul imun sistemic. Anticorpii sintetizai la nivelul mucoaselor au efect protector, n absena anticorpilor sistemici. Anticorpii din secreiile mucoaselor ndeplinesc dou funcii majore fa de agenii patogeni virali: excluderea imun i neutralizarea infeciozitii virale.

Excluderea imun este un mecanism protector foarte important la nivelul mucoasei respiratorii i pare a fi dependent nu numai de imunoglobuline, ci i de stratul de mucus care acoper epiteliul. Absena activitii ciliare este asociat cu infecii severe ale tractului superior, sugernd importana barierei mucoase. sIgA neutralizeaz infeciozitatea virionilor, iar secreia mucoas este n primul rnd o barier mecanic ce blocheaz adsorbia virionilor pe membrana celulelor epiteliale.

IgA din secreii are rol esenial n rezistena la reinfecia cu virusurile care se multiplic exclusiv n celulele epiteliale ale mucoaselor digestive i respiratorii. Vaccinarea oral cu virus polio inactivat are ca scop stimularea imunitii mucoasei. Dac au titru crescut, anticorpii serici (IgM) difuzeaz n mucoase. Nu se tie n ce msur anticorpii din secreii sau din snge protejeaz epiteliul tractului respirator inferior. Fig. 94. Mecanismele protectoare ale mucoasei tractului respirator, fa de infecia viral. Dup inoculare, particulele virale sunt neutralizate (1) de anticorpi, care ajung la suprafaa mucoasei prin transport transepitelial (IgA polimeric), prin difuzie (IgG) sau prin administrare artificial (pictur spray, aerosol). Alt mecanism este excluderea imun (2) i se produce cnd particulele virale sunt legate de anticorpi, incluse n mucus i ndeprtate prin activitate mucociliar. Anticorpii pot difuza prin mucus pentru a neutraliza virusul progen i particulele care trec prin stratul de mucus. Neutralizarea viral poate s se produc intracelular (3), n timpul transportului intracelular al IgA polimeric. La suprafaa bazolateral a celulelor epiteliale infectate, IgG se poate fixa specific de proteinele membranare codificate de virus i mediaz liza celulei (4) dup fixarea complementului sau prin fenomenul ADCC. Celulele infectate de virus pot fi lizate sub aciunea limfocitelor Tc specifice. Liza celulelor epiteliale uureaz trecerea efectorilor imunitari n ambele direcii (dup Weltzin, 1999).

n tractul respirator inferior, n secreia mucoas, se gsesc concentraii mari de IgA i IgG. Anticorpii ajung n secreii, n mare parte, prin difuzia printre celule sau prin ruperi ale epiteliului.

Dei vaccinurile gripale se administreaz parenteral, este clar c anticorpii din secreii (sIgA) au rol major n protecia antiinfecioas. sIgA confer o mai bun protecie ncruciat fa de variante antigenice rezultate prin drift antigenic, comparativ cu IgG circulant.

Pentru antigenele virale expuse pe suprafaa celulelor infectate, studiile in vitro au evideniat c anticorpii antivirali i complementul se leag specific i pot s produc citoliza.

Complementul poate acoperi complexul Ag-Ac, blocnd eventualii receptori disponibili. Complexele sunt fagocitate de celule care au receptori pentru C3.

Complementul poate liza virionii nvelii. Retravirusurile sunt lizate de complement, chiar n absena anticorpilor. Complementul pare s aib rol n faza timpurie a infeciei, cnd titrul anticorpilor este foarte sczut i au afinitate mic.

Proteinele complementului sunt importante ca mecanism efector humoral fa de infeciile bacteriene, dar rezistena celor cu deficit al complementului, fa de infeciile virale este normal.

Imunizarea pasiv a mucoasei respiratorii poate fi folosit n scop profilactic sau terapuetic. Are avantajul c efectul protector este imediat, iar efectele colaterale sunt rare. Anticorpii sunt mai eficieni fa de infeciile virale, cnd se administreaz profilactic. Anticorpii administrai prin imunizare pasiv, n secreiile tractului respirator, pot s previn, s diminueze sau s vindece infecile virale. Imunizrile s-au fcut n special cu IgG pentru c este mai uor de obinut. IgA are avantajul de a fi polimeric i teoretic, are activitate aglutinant superioar fa de IgG i pentru c nu fixeaz complementul, probabil nu stimuleaz reaciile inflamatorii. Are o perioad de activitate mai lung, deoarece componenta secretoare (CS) l protejeaz de aciunea proteazelor.

n concluzie, imunitatea mediat humoral reprezint modalitatea tactic, de neutralizare a virusurilor n faza extracelular.

Anticorpii se sintetizeaz n rspunsul imun primar i secundar antiviral, dar activitatea lor protectoare este neesenial pentru controlul multor infecii primare sau secundare. Copiii cu agamaglobulinemie nscut de tip Bruton, nu au sensibilitate crescut fa de infeciile virale, cu excepia meningitei enterovirale, produs de echovirusurile 9 sau 11. Anticorpii sunt activi fa de antigenele virale din umorile organismului, dar nu penetreaz n celulele infectate.

Imunitatea antiviral mediat celular

n ciclul infecios al multor virusuri, antigenele sunt expuse trziu pe suprafaa celulei. In aceste cazuri, rolul protector al anticorpilor este secundar.

Imunitatea mediat celular (IMC) constituie mecanismul major al aprrii specifice antivirale. Dup infecia primar sau dup administrarea vaccinului viral atenuat, se activeaz rspunsul celulelor Tc, care are activitate maxim la 7-10 zile i scade la 2-3 sptmni dup infecie.

Pentru controlul infeciei virale, celulele Tc sunt eseniale. La pacienii cu sindrom Di George (cu aplazie timic congenital), la pacienii SIDA, la cei leucemici sau la cei supui terapiei imunosupresoare prelungite, frecvena i severitatea infeciilor virale cresc semnificativ.

Rolul IMC n protecia antiviral este elocvent n cazul infeciei cu virusul rujeolic. La copiii normali, infecia produce erupia tegumentar caracteristic i ulterior virusul este eliminat. La copiii cu deficien a celulelor T, boala este adeseori fatal. Manifestrile eruptive sunt mediate de celulele T i la copiii imunosupresai nu se produc. Apariia erupiei este indicatorul evoluiei favorabile. La copiii agamaglobulinemici, erupia se produce i evoluia infeciei este nealterat de absena anticorpilor. Se instaleaz imunitatea de memorie.

IMC precede sinteza anticorpilor n toate infeciile virale, dar n special n cazul infeciilor citolitice n care virusul se multiplic rapid. IMC are rol important n aprarea fa de infeciile virale primare, deoarece se activeaz ntr-un timp scurt i rspunde nevoilor de aprare rapid fa de infeciile virale, nainte de edificarea rspunsului imun mediat humoral. In focarul inflamator indus de infecia viral se acumuleaz celule efectoare ale IMC, care ating valoarea maxim la dou zile de la nceputul replicrii virale. IMC se activeaz dup ce virusul a ptruns n celul i aceasta expune pe suprafaa ei, antigene virale. Efectul su este liza celulelor infectate i are rolul de a limita diseminarea virusului n mediul extracelular. Liza celulelelor infectate cu virusuri citocide este protectoare numai dac se produce rapid, nainte de asamblarea

virionilor progeni. Liza tardiv are efect opus, deoarece favorizeaz diseminarea virusului. Pentru virusurile care produc infecii persistente, citoliza timpurie sau tardiv are efect protector. Fig. 95. Controlul infeciilor virale citocide i necitocide de ctre celulele Tc. Liza celulei infectate poate s se produc n faza de eclips, nainte de asamblarea virionilor maturi sau n faza de mijloc, cnd numai o parte a virionilor s-a asamblat. In ambele cazuri, liza este protectoare fa de infecia cu virusuri citocide i necitocide. In contrast, liza relativ trzie n timpul ciclului de replicare viral este protectoare numai fa de virusurile necitocide. Dac celulele Tc nu produc liza, celulele infectate pot s supravieuiasc i s elibereze virioni infecioi perioade lungi de timp. In cazul infeciei citocide, liza tardiv nu diminu diseminarea virusului, deoarece asamblarea s-a ncheiat i virionii vor fi eliberai prin citoliza produs de efectorii imunitar (dup Kagi, 1996).

IMC constituie modalitatea strategic de protecie antiviral, al crei efect este liza celulei nainte de ncheierea ciclului de replicare viral.

Efectorii imunitii mediate celular detecteaz celulele a cror suprafa este modificat din punct de vedere antigenic (celule infectate cu virus, celule transformate malign, celule mbtrnite sau celule nonself).

Orice protein structural a virionului sau existent numai n celula infectat (protein nestructural) poate fi prelucrat de celulele infectate sau de celulele accesorii ale rspunsului imun. Moleculele nonself prelucrate sunt asociate cu moleculele CMH I (sau CMH II) i sunt expuse pe suprafaa celulei. Complexele moleculare devin inte pentru aciunea limfocitelor Tc. Celula infectat este lizat sub aciunea factorilor litici eliberai de limfocitul Tc. Celulele Tc recunosc orice protein viral, structural sau nestructural, asociat cu moleculele CMH.

Limfocitele Tc activate sunt specifice fa de virusul infectant. De exemplu, limfocitele Tc sensibilizate fa de virusul variolei, lizeaz numai celulele infectate cu acest virus. Nu lizeaz celulele normale i nici celule alogenice infectate cu virusul variolei.

Zinckernagel i Doherty (1974) au demonstrat experimental specificitatea aciunii limfocitelor fa de antigenele virale, dar i fenomenul de limitare (restricie) a interaciunilor celulei efectoare cu celula int, de identitatea moleculelor CMH. Celulele care prezint antigenul i cele care l recunosc trebuie s fie histocompatibile, adic s poarte pe suprafaa lor, molecule CMH I i II identice.

n infecia secundar, rspunsul celulelor Tc este rapid, mediat de celulele Tc de memorie. Celulele de memorie pot s persiste n absena antigenului specific, probabil datorit stimulrii sporadice nespecifice, de citochinele eliberate local n timpul reaciilor fa de antigenele nenrudite.

Celulele NK nu au specificitate fa de antigen i nu produc memorie imunitar. Celulele NK se activeaz rapid i la 2-3 zile dup infecie ating activitatea maxim, dup care diminu rapid. Deficienele pentru celulele NK sunt rare, dar sunt nsoite de infecii severe cu virusul varicela zoster, cu virusul citomegalic, herpes simplex virus 1.

Mecanismul interaciunii celulei NK cu celula infectat nu se cunoate. Celulele NK lizeaz celulele care au pierdut moleculele CMH i astfel au devenit anormale. Activitatea celulelor NK este stimulat de interferon.

Celulele infectate cu virusuri pot fi lizate prin fenomenul ADCC (antibody dependent cell citoxicity), prin aciunea limfocitelor Tc sau NK. Ele lizeaz celulele tapetate cu anticorpi.

Fagocitele mononucleare (monocitul sanguin, macrofagul tisular, celula dendritic) au rol important pentru eliminarea virusului dintr-un proces infecios. Fagocitele mononucleare fagociteaz virionii inoculai prin neptur. Macrofagele au i activitate ADCC.

Mecanisme prin care celulele infectate evit efectorii rspunsului imun

n mediul extern, virusurile sunt instabile, datorit sensibilitii la factorii de mediu. De aceea, pentru a se perpetua ntr-o populaie de organisme sensibile, virusul trebuie s rmn ct mai mult n gazda infectat, ori s se transmit ct mai eficient de la o gazd la alta. Pe de alt parte, efectorii rspunsului imun humoral i celular nu sunt totdeauna eficieni n recunoaterea i eliminarea celulelor infectate cu virus, iar virusul eliberat din celul, trebuie s evite contactul cu efectorii rspunsului imun.

n majoritatea infeciilor persistente, virusurile infecteaz celulele sistemului imunitar: virusul hepatitei B, papovavirus, herpes, virusul Epstein-Barr, virusul citomegalic, rubela, rujeola, oreion, influenza, parainfluenza, HTLV I, II, HIV, diminund potenialul reactiv al imunitii.

O celul infectat care expune pe suprafaa ei un numr mic de situsuri antigenice poate s scape lizei, deoarece situsurile antigenice distanate nu permit legarea celor dou situsuri de combinare ale moleculei de anticorp, necesar activrii complementului. Celulele infectate persistent exprim o cantitate limitat de antigene virale pe suprafaa lor, comparativ cu celulele n care ciclul de replicare viral este litic. Acesta pare a fi mecanismul de supravieuire a celulelor infectate cu virusul coriomeningitei limfocitare (LCM), cu virusul rujeolei sau cu virusul hepatitei B.

Antigenele virusului hepatitei B se sintetizeaz n mare exces i se elimin din hepatocite, sub forma unor particule fr genom. Se consider c excesul cantitativ de antigene virale determin fenomenul de toleran imunitar.

Celulele infectate persistent manifest fenomenul de fluctuaie cantitativ a antigenului viral, expus pe suprafaa lor. Celulele infectate cu virusul rujeolic trec succesiv prin cicluri de dispariie i reapariie a antigenelor virale, asociate membranei citoplasmatice, n timp ce moleculele normale ale celulei nu au variaii cantitative semnificative. Fenomenul se numete modulaie antigenic.

Anticorpii necitolitici pot masca antigenele virale expuse la suprafaa celulei, devenind astfel inaccesibile celulelor efectoare litice (limfocite Tc, NK).

Uneori, virusurile infecteaz celule care nu exprim molecule CMH I. Neuronii exprim puin sau de loc moleculele CMH I i reprezint un situs preferenial al persistenei virale. Herpesvirusurile infecteaz latent neuronii, iar virusul rujeolic, virusul LCM i alfavirusurile pot infecta aceste celule.

Adenovirusurile codific o protein de 19 kD, care se asociaz cu moleculele CMH I i blocheaz transportul lor spre suprafaa celulei i astfel celula infectat care nu exprim molecule CMH I nu este recunoscut de limfocitele T.

Virusul influenza evit efectul neutralizant al anticorpilor specifici, prin rata nalt de mutaie a ARN-polimerazei, genernd noi variante biochimice ale hemaglutininei (HA) i ntr-o msur limitat, ale neuraminidazei (NA). Noile variante antigenice ale HA i NA trebuie s-i pstreze funcia, adic virionul trebuie s fie infecios, dar scap detectrii de anticorpii preexisteni. Fenomenul variaiei antigenice limitate se numete drift antigenic.

Shiftul antigenic corespunde unei noi variante genetice a virusului influenza i este rezultatul unei reasortri a genomului, care are loc cel mai probabil la psri, unde se produce co-infecia cu un virus uman (ce infecteaz rareori psrile) i cu o linie de virus aviar.

Virusurile contracareaz aciunea citochinelor. Virusurile sunt att inductori ai sintezei interferonilor (IFN), ct i inta principal a aciunii lor. Un virus care induce sinteza IFN i este foarte sensibil la aciunea sa inhibitorie nu se poate propaga. Evoluia a favorizat virusurile care contracareaz efectele inhibitorii ale IFN asupra ciclului de replicare viral. Virusurile cu virulen nalt, inhib sinteza ARN celular i sinteza proteinelor (efect de ntrerupere), ceea ce interfer cu capacitatea celulei de a produce IFN i de a rspunde la aciunea lui.

Multe virusuri sunt rezistente la aciunea IFN. Unele dezoxiribovirusuri codific proteine ce inhib cile majore de transducere a semnalelor induse de IFN. De exemplu, proteina E1 a adenovirusurilor inhib semnalul indus de IFN sau . Poxvirusurile codific sinteza unor receptori solubili pentru citochine (pentru TNF i IL-1), denumii virochine.

TIPURILE DE IMUNITATE DOBNDIT

(ADAPTATIV)

Homeostazia organismului uman i animal este asigurat de sisteme complexe de aprare, ale cror particulariti funcionale au fost definite n primul rnd, n raport cu modul de aciune fa de agenii infecioi. Organismele dispun de dou categorii de mecanisme de aprare:

- mecanisme de aprare specific, reprezentate de sistemul imunitar;

- mecanisme de aprare nespecific sau nscut, adic cele care asigur rezistena sau imunitatea natural.

Prin imunitate natural sau nscut se nelege rezistena unui organism fa de un agent infecios sau fa de un parazit, n absena unui rspuns imun evident.

Cele dou sisteme de aprare, specific i nespecific, se condiioneaz reciproc. Nu se poate evalua gradul n care mecanismele de rezisten natural sunt influenate dup expunerea la contactul cu agenii infecioi, dar rspunsul imun detectabil sau chiar subliminal produce modificri ale strii de activitate a sistemului fagocitar mononuclear i a celulelor killer.

Mecanismele de aprare antiinfecioas sunt att specifice (adaptative, dobndite) ct i nespecifice (nscute).

Imunitatea dobndit are un caracter specific i se definete ca o stare de rezisten antiinfecioas, cu caracter individual, condiionat de contactul anterior al organismului, ntr-un proces infecios natural, cu agentul infecios virulent, cu toxinele sale native sau cu agentul atenuat i anatoxinele sale administrate ca vaccin. Imunitatea dobndit, denumit i inductibil, este relativ, n sensul c, dei n general este foarte solid, poate fi nvins prin agresiunea exercitat de o cantitate mare de ageni infecioi sau de infecia cu o tulpin deosebit de virulent.

n funcie de originea i modul de instalare, imunitatea dobndit este de dou tipuri: dobndit pe cale natural i pe cale artificial. In ambele cazuri, imunitatea poate fi dobndit att activ, prin rspunsul imun la stimulul antigenic, ct i pasiv, prin transferul de anticorpi exogeni.

Imunitatea dobndit natural activ se instaleaz dup trecerea organismului printr-o stare de infecie aparent (decelabil clinic) sau inaparent. Durata strii de imunitate este variabil. Trecerea prin unele infecii asigur o protecie specific pentru tot restul vieii (rujeola, variola, varicela, oreionul). Alte infecii (difteria, scarlatina, tusea convulsiv etc.) confer o protecie mai puin solid, astfel nct la o nou expunere(dup civa ani), organismul poate face din nou boala ntr-o form mai uoar dect prima mbolnvire.

Imunitatea dobndit natural pasiv este rezultatul transferului transplacentar i prin secreia lactat, al anticorpilor de la mam la ft. Aceast form de imunitate este variabil din punct de vedere cantitativ i calitativ, n funcie de complexitatea structural a barierei placentare i diversitatea antigenelor la care a fost expus organismul matern. Trecerea imunoglobulinelor prin filtrul placentar depinde de structura placentei, adic de numrul de straturi celulare ce se interpun ntre circulaia matern i cea fetal. Tranzitul anticorpilor este restrictiv la speciile de bovine, cabaline, porcine, canine, care au placent de tip epiteliocorial, cu 4 straturi tisulare: endoteliul capilar matern, epiteliul corionic, esutul conjunctiv fetal, endoteliul capilar fetal. Nou-nscutul este protejat de imunoglobulinele din colostru. In primele 24 de ore, aparatul gastrointestinal este imatur din punct de vedere funcional i digestia proteic nu are loc. Imunoglobulinele din colostru rmn intacte i sunt transportate n mediul intern prin celulele epiteliului intestinal. Transferul placentar al imunoglobulinelor este foarte intens la speciile cu

placent hemocorial (om, maimue, roztoare), la care stratul endoteliului capilar matern lipsete i sngele matern scald esutul placentar fetal. Nou-nscutul uman primete anticorpi materni i dup natere, prin colostrul bogat n imunoglobuline, provenite din circulaia matern.

Imunitatea dobndit natural i pasiv asigur noului nscut o stare de nereceptivitate fa de agenii infecioi pentru care organismul matern este imun. Aceast imunitate scade treptat dup natere, pe msura catabolismului anticorpilor de origine matern, astfel nct, dup o perioad de 3-6 luni copilul devine sensibil fa de agenii infecioi. Imunitatea transplacentar explic raritatea maladiilor infecioase la copii, n primele luni de via.

Imunitatea dobndit artificial activ

Imunitatea dobndit artificial activ este consecutiv administrrii vaccinurilor. Denumirea de vaccin vine vine de la cuvntul latin vaca i semnific originea primului preparat pe care E. Jenner (1798) l-a utilizat pentru controlul variolei.

VACCINURI

Vaccinurile sunt produse biologice care conin bacterii vii cu virulen atenuat, bacterii omorte, toxine modificate (anatoxine), virusuri infecioase dar cu virulen atenuat, respectiv virusuri inactivate i care, introduse pe o cale adecvat n organismul uman sau animal, stimuleaz reactivitatea imunitar, genernd o stare de protecie temporar fa de agentul infecios din care au fost preparate.

Preparatul vaccinal trebuie s fie eficient, adic s induc un rspuns imun protector, a crui memorie s se pstreze n timp i, pe de alt parte, s prezinte un grad nalt de siguran, adic s nu determine efecte secundare defavorabile.

Administrarea unui vaccin se face pe baza unei strategii bine definit. Scopul vaccinrii poate fi eradicarea, eliminarea sau limitarea unui proces infecios.

Eradicarea semnific dispariia agentului patogen, consecutiv aciunii de vaccinare.

Eliminarea corespunde dispariiei manifestrilor patologice, dei agentul patogen se pstreaz n populaia uman sau animal.

Limitarea semnific posibilitatea controlului unei maladii infecioase pn la un nivel la care nu mai reprezint o problem de sntate public.

n general, vaccinurile se administreaz nainte de a se produce infecia cu tulpina slbatic a agentului patogen. Face excepie vaccinul rabic, care se administreaz dup ce s-a produs o presupus infecie. Faptul este posibil, deoarece infecia rabic are o perioad lung de incubaie i permite ca preparatul vaccinal s induc un rspuns imun eficient, care modific evoluia infeciei cu o tulpin de virus "de strad".

Dup coninutul lor, vaccinurile pot fi monovalente, adic includ antigenele unei singure tulpini bacteriene sau virale (de exemplu, vaccinul stafilococic), bi-, tri- sau polivalente, care conin antigene provenind de la dou, trei sau mai multe specii de microorganisme sau tulpini virale (de exemplu, vaccinul diftero-tetano-pertusis).

Dup proveniena agenilor patogeni utilizai la prepararea unui vaccin, se disting autovaccinuri i stocvaccinuri. Autovaccinul este vaccinul preparat cu o tulpin a unui microorganism sau a unui virus, izolat de la un bolnav i destinat a fi folosit numai pentru vaccinarea pacientului de la care s-a fcut izolarea. Stocvaccinurile se obin din amestecul mai multor tulpini de ageni infecioi i sunt destinate imunizrii ntregii populaii susceptibile.

Vaccinuri de origine bacterian

Vaccinurile vii constau din suspensii de bacterii vii, dar cu virulen atenuat, astfel nct s nu determine o infecie aparent, dar s rmn capabile s iniieze un proces infecios inaparent, cu efect imunizant. Vaccinurile vii conin celule viabile, slab virulente i care, dup administrare,

induc o imunitate solid, comparabil celei consecutive trecerii prin boal, dar produc cel mult semne minime de mbolnvire. Indiferent de locul inoculrii, agentul infecios din vaccinul viu nu rmne localizat, ci se rspndete n organism, ptrunznd i multiplicndu-se n aceleai esuturi n care se localizeaz i n cazul infeciei naturale, dar infectnd un numr mic de celule sensibile i multiplicndu-se lent, agentul infecios din vaccin nu declaneaz o boal clinic, ci numai o infecie de form atenuat, care este nsoit de modificri umorale i de reactivitate imunitar.

Pentru prepararea vaccinurilor vii se utilizeaz mutante bacteriene cu virulen atenuat, selecionate prin cultivarea unor tulpini slbatice n condiii speciale: de exemplu, cultivarea la o temperatur superioar celei optime n cazul bacilului crbunos Bacillus anthracis, sau prin aciunea unor substane chimice i utilizarea unor medii de cultivare care ofer condiii nefavorabile (vaccinul BCG).

Vaccinurile omorte constau din suspensii bacteriene omorte prin nclzire la temperaturi ridicate (60o), ori sub aciunea formolului sau a fenolului i care conin una din aceste substane ca prezervant. Din aceast categorie fac parte vaccinul tifo-paratific A i B (TAB), vaccinul pertusis (din Bordetella pertusis), vaccinul stafilococic. Proprietile imunogene ale vaccinurilor bacteriene omorte se menin intacte.

Anatoxinele (toxoizii) sunt preparate biologice cu proprieti imnogene, derivate din toxine. Uneori, toxinele se transform spontan n derivai lipsii de toxicitate, dar pstreaz proprietile de imunogenitate i specificitate ale toxinei native. Mecanismul molecular al inactivrii toxinelor nu este cunoscut. Inactivarea este un proces lent i progresiv, dependent de pH, temperatur, prezena ionilor sau a proteinelor contaminante, de procesul nvechirii preparatului. Un factor major al inactivrii pare a fi proteoliza parial a moleculelor de toxin sub aciunea proteazelor contaminante, dar i schimbarea conformaiei moleculei, polimerizarea sau clivarea unui fragment molecular pot aciona n acelai sens.

Inactivarea toxinelor i transformarea lor n produse atoxice are loc n condiii dirijate, sub aciunea formolului 4%o, la 37o i rezult anatoxine. Fenomenul a fost descoperit de Ramon (1925). Beta-propiolactona, 2-4-dinitrofluorbenzenul i glutaraldehida au aceleai efecte asupra toxinelor.

Pentru a fi utilizat ca vaccin, o anatoxin trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: a) s fie imunogen i s induc sinteza anticorpilor la un titru suficient pentru a neutraliza in vivo, toxina nativ; b) s fie complet lipsit de toxicitate; c) s nu aib proprieti alergizante. Anatoxina ideal ar putea fi produs de microorganisme manipulate genetic sau prin mutaii ale genei

codificatoare a toxinei. Ea ar fi o protein netoxic, dar cu aceleai proprieti de imunogenitate cu ale toxinei native, capabil s induc sinteza anticorpilor neutralizani.

Condiiile optime pentru obinerea anatoxinelor sunt proprii fiecrei toxine i au fost optimizate empiric, dar mecanismele moleculare ale inactivrii nu se cunosc. n general, condiiile optime pentru obinerea anatoxinelor sunt urmtoarele:

- concentraia proteic trebuie s fie de 1 mg/ml, iar cea de formol, de 1,3 mg/ml;

- temperatura de detoxifiere este de 37-40o;

- pH-ul optim este de 7,8-8,2 pentru toxinele difteric i tetanic i 5,5 pentru cea botulinic;

- durata contactului cu formolul este de 3-5 sptmni.

Detoxifierea ncepe simultan cu adugarea formolului. Procesul de detoxifiere este evident dup un minut i crete exponenial timp de 24 de ore, cnd toxicitatea are valoare foarte sczut i tinde spre 0, la 5 zile. Forma netoxic poate reveni total sau parial la forma toxic. De aceea este necesar prelungirea contactului cu formolul, o perioad mai lung de timp. Molecula de anatoxin are o structur stabilizat, prin formarea legturilor noi ntre formol i resturile de aminoacil, dar n acelai timp, prin aciune prelungit, formolul are rolul unui agent de reticulare pentru c favorizeaz formarea legturilor ntre moleculele proteice identice, ceea ce explic polimerizarea unor anatoxine.

Anatoxinele bacteriene, ca i exotoxinele sunt foarte imunogene pentru om, cal, capr, iepure, cobai, n special dup asocierea cu adjuvani (fosfat de Ca). Ele se pot administra ca vaccinuri pentru imunizarea activ sau se folosesc pentru imunizarea animalelor n vederea obinerii serurilor imune utilizabile n seroterapie.

Vaccinuri virale

Vaccinurile virale sunt de trei categorii:

1) Vaccinuri cu virus activ (infecios) atenuat;

2) Vaccinuri cu virus inactivat (neinfecios).

Ambele categorii sunt vaccinuri unitare.

3) Vaccinuri subunitare.

Vaccinuri unitare

Vaccinurile cu virus atenuat se obin din tulpinile virale atenuate, lipsite complet sau aproape complet de patogenitate, dar i pstreaz capacitatea de a induce un rspuns imun protector. Fiind infecioase, ele se multiplic n organismul vaccinat i produc o stimulare antigenic continu, ntr-un interval de timp.

Vaccinarea cu virusuri atenuate confer o imunitate de durat, dup administrarea unei singure doze.

Atenuarea virusurilor se obine pe mai multe ci.

1) Utilizarea pentru vaccinare, a unui virus nrudit, de la o alt gazd. Cel mai vechi vaccin viral (Jenner, l798), utilizat n controlul variolei, este virusul vaccinal, recoltat din leziunile pustulare de pe ugerul vacii. Virusul vaccinal imunizeaz ncruciat cu virusul variolei (smallpox) i este protector fa de infecia variolic.

Virusul rujeolei imunizeaz cinele fa de virusul bolii Carr. Anticorpii fa de virusul rujeolei neutralizeaz virusul bolii Carr, dar nu i invers.

Calea de abordare a lui Jenner pentru obinerea preparatelor virale utilizabile ca vaccinuri umane este folosit i astzi. Ea implic izolarea unor virusuri de la mamifere sau de la psri, nrudite

antigenic cu diferite virusuri umane. Pasajul lor n celulele diploide umane (CDU) in vitro, echivaleaz cu procesul atenurii. Celulele diploide umane reprezint un substrat semipermisiv pentru virusurile umane i mamaliene i adeseori, multiplicarea lor este lipsit de eficien.

Genele virusurilor mamaliene i aviare, care determin spectrul de gazd au o mare diversitate a secvenelor de nucleotide, fa de genele corespunztoare ale virusurilor umane. Efortul de a realiza noi vaccinuri, pe calea clasic a lui Jenner, trebuie s se sprijine pe tehnicile de genetic viral, biologie molecular i imunologie.

2) Inocularea virusului patogen sau parial atenuat, pe o cale nenatural, adic alta dect cea prin care virusul ptrunde n mod obinuit n organism. Metoda este folosit pentru vaccinarea animalelor (de exemplu, virusul laringotraheitei psrilor, se administreaz prin instilare n ochi). Pentru om, metoda nu se folosete, deoarece riscul infeciei este mare.

3) Pasajul virusului de origine uman ntr-un substrat nenatural, in vivo sau in vitro. Cele mai importante vaccinuri pentru om i animale s-au obinut pe aceast cale. Virusul se cultiv n mod repetat, prin inoculare la organisme sntoase sau n culturi primare de celule: virusul febrei galbene s-a inoculat la oarece i apoi n embrionul de gin; poliovirusul s-a inoculat n celulele de rinichi de maimu; virusul rujeolei n fibroblaste de embrion de gin. Pasajul ntr-un substrat celular nenatural, selecioneaz mutante printr-un cumul de evenimente mutaionale ntmpltoare. In practica vaccinrii, se utilizeaz cele cu proprieti adecvate de atenuare i imunogenitate. Mutantele care dup administrare rmn localizate la poarta de intrare, sunt cele mai utile. Unul din marile succese ale acestei metode de atenuare este vaccinul polio. Prin pasaje succesive n culturile celulare de rinichi de maimu, s-a selectat o linie lipsit de neurovirulen, dup inocularea intracerebral sau intraspinal la maimu. Vaccinul rubeolic s-a obinut prin cultivarea virusului pe acelai substrat, iar liniile folosite ca vaccin rujeolic i al febrei galbene sau cultivat pe fibroblaste de embrion de gin.

Vaccinarea cu un preparat viral atenuat echivaleaz cu o infecie uoar, asimptomatic.

Vaccinurile virale atenuate au avantajul important al stimulrii ambelor compartimente ale rspunsului imun: celular i humoral, att sistemic ct i local. Acest fapt este deosebit de important pentru infeciile virale n care imunitatea mediat celular are un rol esenial n eliminarea virusului, ct i pentru infeciile mucoaselor, n care att imunitatea local ct i cea sistemic, sunt necesare pentru rezistena optim.

Vaccinurile virale atenuate stimuleaz rspunsul imun fa de fiecare din antigenele protectoare ale unui virus. Imunitatea indus de aceste vaccinuri este mai durabil, mai eficient i are un

spectru mai larg de reactivitate ncruciat, dect cea indus de virusurile inactivate. Reactivitatea ncruciat este foarte important pentru virusurile care sufer variaie antigenic progresiv.

Virusurile atenuate din vaccinuri, pstrndu-i capacitatea de multiplicare n organismul vaccinat, se rspndesc n populaie i imunizeaz chiar indivizi nevaccinai.

Vaccinurile atenuate se produc cu un pre de cost mai sczut i se administreaz mai uor. In cazul vaccinului polio, o singur doz administrat oral este suficient pentru a crea o bun stare de protecie.

Dezavantajele vaccinurilor virale atenuate sunt legate de riscul ridicat al contaminrii cu ageni infecioi supraadugai. De exemplu, loturile iniiale de vaccin polio, au fost contaminate cu SV4o, din celulele de rinichi de maimu, dar nu s-a constatat creterea incidenei tumorilor la copiii vaccinai. Vaccinul atenuat al virusului febrei galbene, multiplicat n fibroblastele de embrion de gin, a fost contaminat iniial cu virusul leucozei aviare.

Unele virusuri atenuate (rujeolic, rubeolic, al febrei galbene) pstreaz un nivel sczut de virulen rezidual, care determin infecii la copiii cu imunodeficiene.

O problem important, legat de infeciozitatea vaccinurilor atenuate, este aceea a restaurrii unui grad variabil de virulen dup vaccinare, care determin infecii cu manifestri clinice la copiii imunodeficieni. Procesul infecios nu este consecina alterrii genetice a virusului din vaccin. Din aceast cauz, vaccinul nu se administreaz gravidelor.

Vaccinurile atenuate ridic problema instabilitii genetice. Virusul rujeolic atenuat este labil, n special la variaiile termice i de aceea necesit un regim termic constant (+4o), pe toat durata depozitrii.

Un alt dezavantaj const n faptul c virusul atenuat poate s produc o infecie persistent. De asemenea, administrarea vaccinului atenuat poate s interfere cu virusul de tip slbatic care infecteaz natural i s domine pn la anulare eficiena vaccinrii. De exemplu, virusul polio atenuat, se administreaz pe cale oral, dar poate s interfere cu o larg varietate de enterovirusuri.

Vaccinurile inactivate conin virioni care, dup tratamentul cu agentul chimic inactivant nu pot s iniieze ciclul de multiplicare n substratul permisiv.

Preparatul viral brut se obine prin cultivarea virusului ntr-un substrat permisiv: n oul embrionat de gin (virusul influenza), n culturi celulare de rinichi de maimu (virusul polio), sau n fibroblastele umane de embrion de gin (polio, rujeolic, rabic). Preparatul brut se inactiveaz cu formol, acetil-etilenimina sau cu beta-propiolactona.

Preparatele virale inactivate, utilizabile ca vaccin au avantajul riscului minim al infeciei. Rareori, preparatele inactivate conin virus infecios rezidual, care a rezistat tratamentului de inactivare, sau care provine din contaminarea cu un alt virus.

Vaccinurile virale inactivate au cteva dezavantaje. Uneori, tratamentul cu un agent chimic anuleaz imunogenitatea unor proteine virale, astfel nct rspunsul imun fa de virusul inactivat nu este protector. De exemplu, inactivarea cu formol a virusului rujeolic anuleaz imunogenitatea proteinei de fuziune (F), iar vaccinul i pierde proprietatea protectoare.

Vaccinurile inactivate nu stimuleaz imunitatea mediat celular (mediat de limfocitele Tc), care au rol decisiv n eliminarea celulelor infectate cu virus i n rezistena la infeciile cu o gam larg de virusuri.

Preul de cost al vaccinurilor inactivate este mai mare.

Preparatele virale inactivate, folosite ca vaccinuri, se obin din virusul rabic cultivat n CDU i n embrionul de ra, din virusul oreionului i din virusul influenza, cultivate n embrionul de gin, din virusul polio, cultivat n celulele de rinichi de maimu. Toate sunt inactivate cu betapropiolacton sau cu formol.

Preparatul inactivat al virusului hepatitei B este o realizare recent, dar este foarte costisitor pentru c virusul nu se cultiv n sisteme celulare in vitro, iar tehnicile de purificare a virusului din serul pacienilor infectai cronic sunt foarte laborioase.

Vaccinuri subunitare

Iniial, vaccinurile s-au obinut din preparatele brute de virus, dup multiplicarea lor ntr-un esut (in vivo) sau n culturi celulare. Pe msur ce a fost posibil obinerea unor titruri nalte de virus, n scopul diminurii toxicitii vaccinului, s-a trecut la purificarea virusului i a unor componente virale.

Vaccinurile subunitare conin proteine virale n care se gsesc localizate situsuri antigenice majore i care se pot substitui virionilor n practica vaccinrii. De exemplu, pentru virusul influenza, vaccinul subunitar conine antigenele de suprafa HA i NA. Preparatul este mai puin toxic dect virusul integral inactivat, dar este mai puin eficient n stimularea rspunsului imun.

Celulele mamaliene reprezint un sistem optim pentru producerea proteinelor virale, utilizabile ca vaccinuri subunitare. Celulele n cultur se infecteaz cu virus i din lizatele celulare se purific antigene proteice. n lizate se gsete o cantitate mare de proteine virale n exces, nencorporate n virioni.

Obinerea vaccinurilor subunitare proteice, n culturile de celule animale ridic probleme dificile de purificare a proteinelor virale, din amestecul cu proteinele celulare. Dac se folosesc linii celulare continue, trebuie ndeprtat ADN celular, potenial oncogen.

Tehnici moderne de obinere a vaccinurilor subunitare

Dezvoltarea biologiei moleculare i cunoaterea mecanismelor rspunsului imun, a stimulat preocuprile privind obinerea unor vaccinuri noi. Utilizarea anticorpilor monoclonali a fcut posibil identificarea epitopior cu rol esenial n stimularea rspunsului imun, iar genele codificatoare ale antigenelor, au fost clonate prin tehnicile de inginerie genic.

Genele codificatoare ale antigenelor protectoare, se pot izola dup fragmentarea genomului sub aciunea catalitic a enzimelor de restricie. Prin tehnologia ADN recombinant, genele se inser n celula procariot (E. coli, B. subtilis), sau n celulele eucariote (levuri, celule mamaliene).

Fragmentarea genomului cu endonucleaze de restricie este posibil numai pentru dezoxiribovirusuri. Genomul ARN trebuie mai nti transcris n ADNc i ulterior poate fi utilizat

n tehnicile de ADN recombinant. Genomul ARN de polaritate pozitiv este adecvat scopului clonrii, dar nu a fost clonat ADNc al unei catene de ARN de polaritate negativ.

Celulele de mamifere reprezint substratul optim pentru clonarea genelor i pentru producerea proteinelor virale, deoarece plierea, transportul celular i prelucrarea proteinelor sunt asemntoare celor ce au loc n celula infectat de virusul natural. Celulele produc cantiti mari de antigen viral, codificate de gena clonat.

Tehnicile de clonare genic se folosesc pentru sinteza proteinelor unor virusuri, care nu se multiplic in vitro, n sistemele celulare uzuale. De exemplu, gena pentru sinteza antigenului HBs a fost inserat ntr-o plasmid i clonat de levuri. Proteina viral este neglicozilat, dar este imunogen pentru om i induce sinteza anticorpilor protectori fa infecia natural. S-au clonat genele codificatoare ale glicoproteinelor de HSV, VEB, HIV, VRS (virusul respirator sinciial).

Pentru purificarea glicoproteinelor virale din celulele infectate n care a fost clonat gena, s-a folosit tehnica cromatografiei de afinitate cu anticorpi monoclonali sau alte tehnici de separare (cromatografia cu lectine, tehnici de separare fizic).

ADN viral este funcional chiar n celula procariot, dup transferul prin intermediul unui vector (plasmid sau fag). Astfel s-au sintetizat antigene de poliovirus, antigenul HBs, antigenul virusului hepatitei A, HA i NA ale virusului gripal.

O variant a tehnicilor de ADN recombinant este aceea de obinere a vaccinurilor cu virusul vaccinal hibrid. Genomul poxvirusurilor codific circa 200 de proteine. Unele sunt eseniale pentru multiplicarea viral, dar un interes deosebit prezint genele neeseniale pentru ciclul de multiplicare. Ele reprezint circa 30% din genom i sunt grupate la extremitile genomului ADN dublu catenar linear. In plus, genomul este mpachetat lax n virion. Aceste particulariti au permis obinerea, prin tehnicile de inginerie genic, a poxvirusurilor recombinate, infecioase, capabile s exprime genele strine inserate n genomul lor.

ADN viral este inserat n genomul virusului vaccinal prin recombinare la situsuri omologe. Virusul vccinal hibrid se multiplic n celulele permisive i genele inserate n genomul su codific antigenul HBs, antigenul rabic, antigenul HSV etc.

Vaccinurile virale hibride sunt stabile i stimuleaz ambele compartimente ale rspunsului imun.

O alt cale de producere a vaccinurilor virale atenuate, genetic stabile, implic obinerea mutantelor de deleie. Acestea au o capacitate diminuat de multiplicare, ceea ce echivaleaz cu atenuarea. Mutantele prin deleie trebuie s-i pstreze infeciozitatea i imunogenitatea i s fie stabile genetic.

Antigene peptidice sintetice. Producerea i utilizarea antigenelor sintetice s-au impus dup demonstrarea bazelor moleculare ale imunogenitii i dup studiile privind proprietile imunogene ale antigenelor artificiale. Pe de alt parte, s-a demonstrat ca macromoleculele proteice sau glicoproteice din structura virusurilor i a microorganismelor infecioase, au un numr mare de determinani antigenici, dar numai un numr limitat dintre acetia au semnificaie imunogen i un numr foarte mic sunt inductori ai rspunsului imun protector.

Sinteza artificial a peptidelor a devenit posibil dup introducerea metodelor de secveniere a ADN. Cunoaterea secvenei bazelor a permis dirijarea secvenei de aminoacizi a proteinelor cu activitate biologic.

Vaccinurile sintetice conin secvene polipeptidice sintetizate pe cale chimic. Ele includ determinani antigenici eseniali pentru inducerea unui rspuns imun protector fa de agenii patogeni corespunztori.

Condiia esenial pentru obinerea vaccinurilor sintetice este cunoaterea structurii chimice a determinanilor antigenici nativi ai virusului (sau ai microorganismelor patogene) i identificarea regiunilor imuno-dominante ale moleculei.

Tehnicile de cristalografie cu raze X, cromatografia n faza lichid, au permis identificarea situsurilor antigenice majore ale unor virusuri foarte importante pentru clinic. De exemplu, s-a determinat structura tridimensional a hemaglutininei virusului gripal i s-au identificat regiunile calde ale moleculei, care, cu mare probabilitate, corespund determinanilor antigenici. S-a stabilit secvena aminoacizilor, care a fost reprodus n proteinele sintetizate artificial.

Marea majoritate a peptidelor sintetice sunt secvene scurte, lineare de aminoacizi, care reproduc un fragment din structura primar a moleculei proteice. Dezavantajul major este c secvenele sintetice nu reproduc configuraia spaial a determinanilor antigenici naturali, n special a celor discontinui. Acetia sunt alctuii din resturi de aminoacizi neadiaceni n structura primar a moleculei, dar pot fi juxtapui n structura tridimensional a proteinei pliate. Astfel se explic slaba imunogenitate a peptidelor sintetice. Ameliorarea calitilor de imunogenitate ale peptidelor sintetice, utilizabile ca vaccinuri, depinde de gradul de asemnare a conformaiei lor, cu determinantul antigenic nativ.

Dimensiunile mici ale peptidelor sintetice impun cuplarea lor cu o molecul purttor, pentru creterea gradului de imunogenitate. S-a folosit hemocianina de Megathura (KHL), cuplat prin intermediul glutaraldehidei sau a unei grupri tiol a unui rest de cistein, adugat la o extremitate a secvenei sintetice.

S-au sintetizat peptide care reproduc secvene de aminoacizi ale unor polipeptide ale virusului hepatitei B, cu diferite eficiene imunoprotectoare, precum i peptide care reproduc unele secvene ale hemaglutininei virusului gripal.

Polipeptidele sintetice utilizate ca vaccinuri, au avantajul c nu conin alte componente care ar putea produce efecte secundare i stimuleaz rspunsul imun strict specific fa de epitopii antigenici critici ai agentului infecios. Sunt stabile indefinit i se produc la un pre de cost sczut. Au ns dezavantajul major de a nu stimula rspunsul imun mediat celular.

Vaccinurile care conin virioni inactivai i anatoxinele se administreaz, n general, pe cale parenteral (subcutan, intradermic, intramuscular), n mod obinuit n trei injecii separate la intervale de 5, 7 i respectiv 21 de zile.

Vaccinurile bacteriene vii i cele virale atenuate se administreaz ntr-o singur doz, n general, pe cale parenteral. Vaccinul BCG, ca i vaccinul polio infecios atenuat, la nou nscui se administreaz pe cale oral.

Imunitatea consecutiv vaccinrii se instaleaz relativ lent, la circa 15-20 de zile de la ultima injecie i are o durat variabil de la un vaccin la altul (n general, ntre 1 i 7 ani), scznd treptat pn la dispariia complet. Vaccinarea primar, ca i infecia, confer organismului o stare special de reactivitate imunitar - memoria imunitar - graie creia, orice contact ulterior cu agentul patogen respectiv, realizat pe cale natural(infecie i boal) sau pe cale artificial(prin vaccinare) declaneaz o redeteptare rapid a imunitii, care se manifest cu o intensitate mai mare dect aceea a rspunsului imun postvaccinal. Cea de a II-a administrare a vaccinului declaneaz o reacie anamnestic (de memorie), cu o cretere brusc i masiv a titrului anticorpilor.

Dei n general este solid, imunitatea postvaccinal este relativ, n sensul c unele persoane vaccinate pot totui s fac boala ntr-o form mai uoar, mai ales consecutiv unei infecii masive cu un agent patogen deosebit de virulent.

Datorit faptului c se instaleaz lent, imunizarea prin vaccinare se folosete n scop profilactic pentru a evita riscul infeciei cu un agent patogen.

Imunitatea dobndit artificial pasiv

Serurile imune sau terapeutice sunt produse biologice obinute din serul sanguin al unui animal imunizat prin vaccinare sau din serul unui convalescent imunizat prin infecie natural sau prin vaccinare. Serul imun conine anticorpi specifici, capabili s neutralizeze aciunea antigenului corespunztor. Primele ncercri de folosire a serurilor n terapeutic dateaz din 1888, cnd Richet i Hericourt au demonstrat c inocularea organismelor animale cu ageni patogeni, determin apariia n ser a anticorpilor, cu efect protector nu numai pentru organismul care i-a sintetizat, dar i pentru organismele crora li se injecteaz serul imun.

n general, serurile imune se prepar pe animale mari (cal), care sunt hiperimunizate, dup principiile imunizrii active, cu doze repetate crescnde de celule, virioni, anatoxine sau toxine. Serul sanguin obinut prin sngerarea animalelor imunizate este inactivat i tratat cu fenol (ca prezervant), controlat pentru sterilitate, inocuitate (lipsa de nocivitate) i pentru eficacitate (titrul de anticorpi). Serul imun se administreaz sub form de injecii intravenoase, intramusculare sau subcutane, n special n scop terapeutic.

Dup cum specia organismului donor este sau nu aceiai cu a organismului receptor, serurile imune pot fi omologe (serurile recoltate de la convalesceni sau de la voluntarii imunizai prin vaccinare) sau heterologe (serurile obinute prin imunizarea animalelor).

Dup natura antigenelor folosite, se disting trei categorii de seruri imune: a) seruri imune antimicrobiene, obinute prin administrarea antigenelor celulare (de exemplu, serurile antistreptococice i antimeningococice); b) seruri antitoxice, obinute prin imunizarea organismelor cu toxine i anatoxine (de exemplu, serurile antidifteric i antitetanic); c) seruri imune mixte (antimicrobiene i antitoxice), obinute prin imunizarea cu antigene celulare i cu toxine (de exemplu, serul antigangrenos).

Imunitatea pasiv, consecutiv administrrii serurilor imune se instaleaz imediat dup injectarea intravenoas sau dup cteva ore, pe msura resorbiei anticorpilor, n cazul administrrii pe alte

ci. Imunitatea pasiv asigur o protecie de scurt durat (circa 30 de zile), datorit faptului c anticorpii primii n mod pasiv au un timp de njumtire de 14 zile. Persistena lor este mai ndelungat dac serul este homolog. Dup catabolizarea anticorpilor exogeni, organismul redevine receptiv la infecie. Datorit acestei particulariti, serurile imune sunt folosite n special pentru tratamentul unei maladii infecioase n evoluie (seroterapie).

Serurile imune (antitoxice, antivirale, antibacteriene) acioneaz prin opsonizarea moleculelor de toxin, a virionilor i a celulelor bacteriene. Efectul este de neutralizare a toxinei i a infeciozitii virale, iar celulele bacteriene tapetate cu anticorpi devin sensibile la aciunea fagocitelor i a complementului.

Serurile imune pot fi folosite i n scop profilactic (seroprofilaxie), la persoane care au fost sigur n pericol de a se infecta i la care se urmrete prevenirea declanrii maladiei n forma clinic. Pentru a evita riscurile de infecie, care pot surveni dup epuizarea imunitii pasive, se recomand ca seroterapiei i seroprofilaxiei s li se asocieze vaccinarea, pentru pstrarea strii de imunitate dup catabolizarea anticorpilor exogeni.

Datorit riscului crescut al producerii reaciilor imune secundare (alergie, oc anafilactic), OMS recomand nlocuirea serurilor hiperimune obinute pe animale (heterologe), cu cele umane obinute de la donori hiperimunizai voluntar sau de la convalesceni (homologe).

n prezent se folosesc seruri imune concentrate i purificate, din care s-au eliminat circa 3/4 din proteinele serului sanguin, pstrndu-se numai fracia globulinic specific. Prin acest procedeu s-a redus foarte mult volumul serului injectat i se evit accidentele care ar putea rezulta din sensibilizarea organismului uman fa de proteinele nespecifice din serul heterolog.

REZISTENA ANTIINFECIOAS NNNASCUT NESPECIFIC

Prin imunitate sau rezisten natural, nscut sau congenital se nelege capacitatea unui organism de a fi rezistent fa de un agent infecios, n absena unui rspuns imun detectabil. Aceast proprietate este nscut pentru organismele unei specii i n mod obinuit este absolut, adic toi indivizii speciei respective sunt rezisteni fa de un anumit patogen, chiar n cazul inoculrii cu doze mari ale agentului infecios. De exemplu, omul este rezistent la agenii patogeni care produc zoonoze (agentul pestei bovine, al pestei porcine, al holerei ginilor etc.), iar animalele sunt rezistente la gonoree, rujeol, oreion, dizenterie, grip etc.

Starea de rezisten natural nu este condiionat de contactul anterior cu agentul patogen respectiv, ci este consecina unei modaliti prompte de reacie a organismului. Starea diametral opus este aceea de receptivitate sau de sensibilitate (susceptibilitate), caracteristic organismelor care, ca rezultat al agresiunii unui agent patogen, reacioneaz prin apariia unui proces infecios. Starea de nereceptivitate este, uneori, relativ, n sensul c exist deosebiri individuale de reactivitate n cadrul speciei, unii indivizi fiind total rezisteni, iar alii prezint diferite grade de receptivitate. Rspunsul diferit al organismelor unei specii, la contactul cu un agent patogen, este rezultatul eficienei variabile a forelor de aprare a organismului, care, izolate sau n asociaie, opun agentului patogen o barier de neptruns, determin inhibarea multiplicrii sau distrugerea lui n esuturi sau umori, precum i neutralizarea i eliminarea substanelor toxice eliberate. Diferenele sunt, probabil, rezultatul aciunii unor factori genetici. De exemplu, oile din Alger sunt mult mai rezistente la infecia crbunoas (produs de B. anthracis), dect cele din Europa. La primele, macrofagele conin un numr mai mare de lizosomi i enzimele componente au activitate hidrolitic mult mai intens. S-au evideniat diferene de sensibilitate a raselor umane la tuberculoz: populaiile africane sunt mai sensibile. Influenele de ordin genetic asupra rezistenei naturale au condus la concluzii de ordin practic. Pe acest criteriu se face selecia populaiilor (liniilor) genetic pure ale animalelor de laborator, care au o rezisten foarte mare fa de un agent patogen sau o sensibilitate deosebit.

Ori de cte ori un agent patogen vine n contact cu un organism neimunizat, iniierea procesului infecios este stopat, n primul rnd prin intrarea n aciune a mecanismelor rezistenei constitutive, nespecifice, reprezentate de barierele mecanice (tegumentul i mucoasele), de componentele moleculare antiinfecioase a cror sintez este amplificat n reacia inflamatorie, de componentele celulare care au capacitatea de fagocitoz. Ulterior, dac barierele rezistenei nespecifice au fost depite, intr n aciune sistemul imunitar. Mecanismele de aprare antiinfecioas, specifice i nespecifice, sunt strns integrate funcional, astfel nct, aciunea lor este totdeauna combinat. De exemplu, epiteliul tubului digestiv secret lizozim, ca factor al rezistenei nscute, iar n stratul de mucus care l tapeteaz se gsete IgA, ca factor al imunitii dobndite.

Barierele mecanice de aprare a organismului sunt reprezentate de tegument i de mucoase. Epiteliul tegumentar i mucoasele sunt structurile care limiteaz accesul agenilor infecioi, constituind n primul rnd bariere fizice, dar la acest nivel funcioneaz mecanisme moleculare i celulare cu rol neutralizant sau litic fa de microorganisme i virusuri. Dei contactul lor cu

microbiota normal sau potenial patogen este permanent, aceste structuri sunt deosebit de eficiente ca bariere mecanice protectoare fa de infecii. Particularitile lor funcionale sunt conferite de integritatea anatomic, de secreiile proprii, de renoirea prin descuamare, de impermeabilitatea sau de permeabilitatea lor selectiv. Astfel, tegumentul intact este impermeabil pentru virusuri i microorganisme, dar alterarea structurii sale, n special dup arsuri, este urmat de infecii. Fig. 96. Mecanismele aprrii nespecifice a organismului.

Suprafaa tegumentului este acoperit cu o pelicul fin, format din produsele de secreie ale glandelor sudoripare i sebacee, cu pH acid (pH = 3,0-5,0), care au efect bacteriostatic. Dup ndeprtarea (prin splare) peliculei de secreie, funcia protectoare antiinfecioas a tegumentului diminu.

Conjunctiva este protejat prin aciunea mecanic i chimic a secreiei lacrimale, n care se gsete lizozim. Lizozimul este o protein cationic mic, prezent n toate fluidele organismului, cu efect enzimatic, hidroliznd legturile glicozidice ale peptidoglicanului parietal bacterian.

Mucoasele sunt acoperite de secreii. Lactoferina este o glicoprotein care leag Fe2+. La nivelul tractului respirator, rolul protector fa de agenii infecioi este ndeplinit de mucinele cu efect neutralizant, iar expulzarea lor este asigurat prin micarea cililor celulelor epiteliale i prin reflexele de strnut i de tuse. Mucinele formeaz un strat mucos vscos, ce tapeteaz mucoasele digestive i respirator. Ele capteaz microorganismele i antigenele, limitnd penetrarea lor n esuturi.

Histatinele(peptide bogate n histidin) formeaz o familie mic de peptide bazice de 3-5 kD, produse de celulele acinare salivare i pancreatice. Ele inhib dezvoltarea celulelor de C. albicans, n forma infecioas sau neinfecioas.

Cistatinele sunt fosfoproteine ce conin cistein, secretate de celulele acinare. Au efect inhibitor asupra creterii microorganismelor.

Mucoasa gastric este protejat de gelul mucos care o tapeteaz, ce formeaz un adevrat glicocalix i de aciditatea conferit de HCl, component al sucului gastric. Bacteriile Gram negative sunt foarte sensibile la aciunea mediului acid gastric. Dup neutralizarea aciditii gastrice cu substane alcaline, capacitatea sa protectoare diminu pn la dispariie i infeciile se instaleaz rapid. Totui, pe cale digestiv ptrund agenii patogeni a numeroase maladii

infecioase, evitnd bariera aciditii gastrice. Bolul alimentar este protector fa de aciditate i n interiorul su exist condiii favorabile supravieuirii agenilor patogeni ingerai odat cu alimentele.

Secreiile mucoase, n compoziia crora intr mucinele (glicoproteine), au rol important n aprarea antiinfecioas. Mucinele ader la suprafaa agenilor patogeni i a paraziilor, formnd un strat molecular care mpiedic interaciunea lor cu celulele epiteliale. Lor li se atribuie de asemenea, un rol neutralizant asupra toxinelor. n acelai timp, secreiile formeaz o pelicul (film) protectoare, continu pe suprafaa mucoasei, constituind o barier greu de trecut pentru microorganisme n calea lor spre situsurile epiteliale de aderen. Pelicula elimin bacteriile care nu se pot adapta condiiilor de sub pelicul, la grania mucus-epiteliu.

Un alt mecanism nespecific care controleaz creterea microorganismelor la zona de contact cu mucoasa digestiv, este peristaltismul intestinal. Microorganismele ader la mucoasa epitelial, prin intermediul unor molecule din categoria lectinelor, care realizeaz adevrate puni de legtur ntre suprafaa bacteriei i a celulei epiteliale. Peristaltismul intestinal mpiedic realizarea acestor interaciuni stabile, creind un flux care deplaseaz microorganismele patogene, nainte ca ele s colonizeze suprafaa epiteliului. Numeroase infecii intestinale accelereaz peristaltismul. Anomaliile micrilor peristaltice sunt factori favorizani ai creterii excesive a populaiilor bacteriene ale microbiotei normale a tractului intestinal. In absena unui clearance mecanic normal al tractului digestiv, microbiota normal poate dobndi un rol patologic.

Rolul factorilor humorali n aprarea antiinfecioas nespecific. Hormonii au un rol esenial n reglarea unor mecanisme homeostatice. Ei nu modific specificitatea de reacie a celulelor limfoide. Concentraiiile optime de hormoni determin o funcionalitate optim a sistemului imunitar, iar modificrile lor cantitative induc perturbri ale metabolismului limfocitelor. Pubertatea i sarcina se caracterizeaz prin creterea steroizilor plasmatici. Cunoaterea multiplelor interaciuni dintre funcia imunitar i sistemul endocrin, precum i perfecionarea tehnicii de radioimunodozare (RIA) a hormonilor, au condus la delimitarea unei noi discipline intermediare imunoendocrinologia.

Afeciunile de natur endocrin au un rsunet major n raport cu rezistena nespecific fa de agenii patogeni. Un exemplu n acest sens este patologia infecioas asociat cu diabetul. Bolnavii de diabet fac n mod frecvent infecii de tip tuberculos, infecii urinare i tegumentare de tipul furunculozelor. Ele se datoreaz fie unor dezechilibre locale provocate de lipsa insulinei, fie glicemiei crescute.

Hormonii tiroidieni influeneaz rezistena fa de infecii. Hipotiroidismul mrete incidena infeciilor.

Cortizolul are influen direct asupra limfocitelor. Hipofuncia cortexului glandelor suprarenale mrete rezistena fa de agenii infecioi.

Capacitatea autosterilizant a umorilor este un factor decisiv al rezistenei nespecifice. In esuturi i n umori se gsesc substane cu rol antibacterian: lizozimul, lactoferina etc. Astfel se explic rezistena organismului fa de numeroasele agresiuni ale microorganismelor, care ptrund permanent n esuturi, pe diferite ci. Microorganismele (n special bacterii) trec din lumenul intestinal n snge, la toate animalele, inclusiv la om, datorit condiiilor speciale de permeabilitate a epiteliului, create n timpul absorbiei intestinale. Permeabilitatea mucoasei este mai accentuat la rumegtoare. La om s-a evideniat c, postprandial, se produce o bacteriemie temporar, originar n cavitatea bucal, ca rezultat al masticaiei sau al periajului dentar. Dup extracia dentar, exist chiar o perioad septicemic (cu multiplicare bacterian). Datorit strii de bacteriemie temporar, animalele nu trebuie hrnite o perioad de 10-20 de ore nainte de sacrificare.

n mod obinuit, strile de bacteriemie fiziologic nu sunt urmate de infecii clinice, datorit capacitii autosterilizante (clearance) a esuturilor i umorilor, care se manifest prin mecanisme variate:

- condiiile tisulare improprii multiplicrii microorganismelor i n primul rnd concentraia O2: microorganismele strict anaerobe nu se multiplic n esuturile bine oxigenate, ci numai n cele traumatizate sau devitalizate. De exemplu, C. perfringens, agentul gangrenei gazoase crete n plgile musculare provocate de explozii, iar M. tuberculosis (strict aerob) se localizeaz preferenial la nivelul esutului pulmonar. Dup distrugerea litic a granulomului, se formeaz un esut cazeos n care O2 nu difuzeaz. Se creeaz condiii de anaerobie, improprii multiplicrii celulelor de M. tuberculosis i astfel evoluia infeciei este limtat;

- substane din categoria lizinelor

- properdina

- sistemul complement

- interferonii

- proteina C reactiv

Rolul acestor componente humorale n aprarea antiinfecioas i mecanismele aciunii lor vor fi prezentate n acest capitol.

SISTEME CELULARE CU ROL N REZISTENA ANTIINFECIOAS NESPECIFIC

Rezistena antiinfecioas a organismului uman i animal este rezultatul aciunii unor sisteme celulare cu aciune nespecific, independent de caracterul nonself al unei substane sau al unui agent infecios. Funcia principal a sistemelor celulare cu aciune nespecific este fagocitoza. Ele intr n aciune dup ce agentul infecios a depit barierele mecanice protectoare ale organismului.

Sistemul fagocitar include celule de origine mezodermic, cu distribuie difuz n organism, care au capacitatea de a ngloba molecule nonself, virusurile i celulele strine i de a le distruge prin procese enzimatice de digestie intracelular.

Fenomenul fagocitozei (phagein = a mnca) a fost descoperit de Ilia Metchnikoff (1882). El a dat denumirea generic de fagocite, celulelor libere sau fixe din esuturi care au capacitatea de a ingera particule strine.

Fagocitoza este cel mai prompt mecanism de aprare i, n filogenie, deriv din funcia de nutriie a protozoarelor i metazoarelor inferioare. La organismele superioare, fagocitele ndeplinesc activiti fiziologice importante:

- elimin moleculele organice proprii care au devenit nefuncionale i reintroduc n economia organismului, constituienii lor chimici;

- la vertebratele superioare, fagocitele ndeprteaz celulele mbtrnite, au rol n remodelarea tisular n embriogenez, n remanierea osoas etc.

I. Metchnikoff a clasificat fagocitele n dou categorii:

- microfage (PMN) celule care fagociteaz particule mici

- macrofage celule care nglobeaz particule mari, chiar celule ntregi.

n 1924, Aschoff a creat conceptul de sistem reticulo-endotelial (SRE), n care a inclus:

- fagocitele propriu-zise

- celulele reticulare ale sinusurilor venoase din splin i ganglioni

- celulele endoteliale ale vaselor sanguine i limfatice

- fibroblastele din esutul conjunctiv.

n 1927, Voltera a propus denumirea de sistem reticulohistiocitar (SRH).

n 1970, fagocitele au fost mprite n dou categorii funcionale:

- fagocite profesioniste, capabile s ingere particule strine tapetate cu Ig sau cu componente ale complementului (C3). Ele au receptori pentru regiunea Fc a Ig i pentru C3. Grupul include fagocitele mononucleare i polimorfonucleare;

- fagocite neprofesioniste, cele care nu au astfel de receptori, funcia fagocitar fiind facultativ. Aceast categorie include fibroblastele, celulele reticulare i celulele epiteliale.

Celulele nglobeaz materialele nonself particulate i solubile prin urmtoarele mecanisme: pinocitoz, endocitoz mediat de receptori (EMR) i fagocitoz.

Pinocitoza este procesul prin care o celul nglobeaz fluidele i soluiile i este foarte asemntoare cu EMR, proces prin care celulele nglobeaz macromoleculele, virusurile i particulele mici. Pinocitoza i EMR au n comun mecanismul bazat pe clatrin i se produc independent de polimerizarea actinei.

Fagocitoza semnific nglobarea particulelor mari(mai mari de 0,5 m) i se produce printr-un mecanism activ, dependent de actin, dar independent de clatrin. Protozoarele fagociteaz pentru obinerea nutrienilor, iar la Metazoa, fagocitoza este funcia, n primul rnd, a unor celule specializate (macrofagele, neutrofilele) i a evoluat ca un proces care susine o varietate de procese biologice: nglobarea i distrugerea agenilor infecioi i a celulelor senescente, remodelarea tisular n cursul dezvoltrii embrionare, rspunsul imun, procesul inflamator.

Sistemul fagocitar mononuclear (S F M)

Fagocitele mononucleare se gsesc n toate esuturile, dar n condiii obinuite, proliferarea lor are loc numai n mduva osoas.

S F M reunete toate tipurile de celule cu capacitate fagocitar bine exprimat, precum i precursorii lor. Conceptul S F M a fost elaborat de van Furth (1972), sub egida OMS.

Celulele S F M i au originea n celula stem din mduva osoas. Celula stem nu s-a identificat, dar este nedifereniat, cu activitate mitotic nalt, este pluripotent. Ea genereaz nu numai precursorul macrofagului, ci i precursorul eritrocitului, al polimorfonuclearelor i megacariocitului. Pe msur ce se difereniaz, descendenii celulei stem i pierd potenialitatea i devin precursori separai ai liniilor monocitar, polimorfonuclear, eritrocitar i plachetar .

Monoblastul este prima celul identificat, pe linia de difereniere a fagocitelor mononucleare. Are receptori pentru regiunea Fc a Ig, fagociteaz i, in vitro, ader de suport. Monoblastul se divide o singur dat n dou promonocite.

Promonocitul, localizat ca i monoblastul n mduva osoas, este o celul mai mare (15 m), citoplasma este acidofil, bogat n poliribosomi. Granulaiile azurofile conin mieloperoxidaz. Cele dou celule rezultate din diviziunea unic a promonocitului sunt monocite.

Monocitul rmne n mduva osoas timp de 24 de ore de la difereniere, trece n snge i devine celul circulant pentru alte 24-72 de ore. In condiii normale, celulele care circul la contactul cu endoteliul capilar, migreaz spre diferite esuturi i caviti, unde devin macrofage rezidente sau migreaz spre un focar de inflamaie:

- n plmn, monocitul se difereniaz direct n macrofagul alveolar, fr maturare n esutul interstiial;

- n sinusoidele ficatului, monocitul devine celul Kupffer;

- n cavitatea peritoneal, monocitul vine direct din capilare i devine macrofag al seroasei.

n condiii normale, puine macrofage rezidente se divid i rmn viabile 1-3 luni. Nu exist dovada c ele recircul prin limf spre vasele sanguine. Probabil c mor n esuturi sau migreaz spre ganglionii limfatici. In cazul unei infecii locale sau unui proces inflamator, factorii chimiotactici i ali mediatori ai inflamaiei citochine i molecule icozanoidice stimuleaz monocitele s migreze spre situsul lezat, unde se difereniaz n macrofagele exudatului.

Dup migrarea n esuturile i cavitile organismului, macrofagele variaz n privina caracteristicilor morfologice i funcionale i au denumiri diferite: celule Kupffer n ficat, macrofage pulmonare i alveolare n plmn, celule microgliale n SNC.

Distribuia celulelor S F M n cele trei compartimente este urmtoarea: Tipul de celul

Localizare

- Celula stem

- Monoblastul n mduva osoas

- Promonocitul

- Monocitul - Monocitul circulant n snge Macrofagul tisular (rezident) - Histiocit n esutul conjunctiv din tegument

n esutul limfoid secundar(ganglioni, MALT)

n mduva osoas

n plmn (macrofage alveolare i tisulare)

n membrana sinovial a cavitilor articulare

n membranele seroase ale cavitilor peritoneal, pleural, cardiac n glande

-Osteoclastul (rezultat prin fuziunea monocitelor) n esutul osos

-Microglia (pare a fi de origine monocitar deoarece nu se evideniaz nainte de formarea vaselor sanguine) n S N C

- Macrofagul intravascular

Celulele Kupffer

-Macrofagul juxtavascular sinusurile ganglionare.

Histiocitul din pulpa roie a splinei, din mduva osoas, din

- Macrofagul din exudat

- Celulele epitelioide n focarul inflamator

- Celulele gigante multinucleate (se

formeaz prin fuziunea macrofagelor

exudatului).

n SFM nu sunt cuprinse:

- celulele reticulare, de origine a limfocitelor, din mduva osoas

- celulele reticulare ale sinusurilor venoase din splin i ganglioni

- celulele endoteliale ale vaselor sanguine i limfatice

- fibroblastele

- celulele Langerhans

- celulele interdigitate

-celulele dendritice din ganglionii limfatici.

Originea celulelor dendritice nu se cunoate cu certitudine, dar pare a fi comun cu a monocitului. Glucocorticoizii induc o scdere rapid a monuclearelor circulante, inclusiv a monocitelor, dar i o dispariie rapid a celulelor dendritice din esuturi. Acesta este un argument care sprijin ipoteza c celulele dendritice deriv din precursori din mduva osoas. Dei ele endociteaz, prelucreaz antigenul i l prezint, nu pot fi considerate ca fagocite mononucleare, deoarece nu s-a stabilit cu fermitate originea lor monocitar.

Celulele Langerhans deriv din celule mononucleare circulante care migreaz n tegument. In tegument, celulele Langerhans rmn un interval scurt, nainte de a migra pe cale limfatic, sub forma celulelor cu voal, spre ganglionii limfatici unde devin celule dendritice i interdigitate.

Fagocitele mononucleare intravasculare i juxtavasculare sunt celule care vin n contact direct cu sngele (celule Kupffer, histiocitele din cordoanele pulpei roii splenice) sau cu limfa (macrofagele intra- sau extrasinusoidale din ganglionii limfatici). Ele supravegheaz aceste fluide pentru a capta materialele nonself, pe care le prelucreaz i le prezint limfocitelor. Celulele Kupffer sunt aezate n ntregime n lumenul sinusoidelor hepatice i nu au nici o conexiune evident cu endoteliul sinusoidal. Datorit poziiei, macrofagele splenice juxtavasculare, ca i cele din mduva osoas, trebuie s strbat endoteliul, nainte de a fagocita materialul nonself.

Macrofagele intra i juxtavasculare sunt fixe. Fig. 97. Celulele sistemului fagocitar mononuclear.

Macrofagele tisulare i cele asociate vaselor formeaz o populaie de 17-20 miliarde, ntr-un organism de 70 de kg. Ele i au originea n monocitul sanguin sau rezult prin proliferarea tisular a monocitelor imigrate. Se pare c predomin cele de origine monocitar.

Datorit localizrii lor diverse i a condiiilor fiziologice locale foarte diferite (condiii cvasianaerobe pentru cele peritoneale i o bun aerare pentru cele pulmonare), macrofagele sunt heterogene din punct de vedere morfologic, dar au caracteristici structurale i funcionale comune:

- sunt bogate n lizosomi (pentru digestia enzimatic a substanelor nonself);

- membrana citoplasmatic formeaz prelungiri fine denumite voaluri hialoplasmatice, cu dimensiuni de pn la jumtate din diametrul macrofagului. In microscopia scanning, suprafaa macrofagului se aseamn cu petalele unui trandafir.

Datorit mobilitii membranei, macrofagul are dou proprieti importante:

- ader de suportul solid

- endociteaz (pinociteaz i fagociteaz).

Fagocitele sanguine au proprietatea de a migra din patul vascular, n esuturi, unde devin macrofage rezidente, dar mobile n interiorul esutului.

Deplasarea tisular a macrofagului este ntmpltoare (neorientat de stimuli chimiotactici), i se numete chimiochinez sau este orientat i se numete chimiotaxie. Deplasarea orientat este uurat de enzimele pe care macrofagul le secret, active la pH-ul tisular.

Receptorii membranari ai macrofagului

Sistemul fagocitar mononuclear are capacitatea de a discrimina un numr mare de ageni patogeni, n raport cu selful, utiliznd un numr relativ restrns de receptori, dei agenii infecioi au tendina de a suferi mutaii. Aceast tendin este contracarat de existena unor receptori care recunosc componente antigenice bine conservate, care nu se gsesc la eucariotele superioare, dar ndeplinesc roluri eseniale n biologia agenilor patogeni i sunt supuse proceselor mutaionale cu o rat sczut (mananii din peretele levurilor, peptidele formilate ale bacteriilor, LPS, acizii lipoteichoici).

Macrofagul este o celul multifuncional, care primete o multitudine de semnale din mediul extracelular, prin intermediul receptorilor membranari, capabili s recunoasc liganzi ai altor celule sau liganzi moleculari solubili.

Receptori pentru regiunea Fc a tuturor izotipurilor de lan greu al Ig. Cei mai numeroi sunt receptorii pentru regiunea Fc a IgG monomer (IgG citofil), IgG agregat i IgG din complexele imune (Fc R I, Fc R II, Fc R III). Aceti receptori constituie legtura crucial dintre celulele fagocitare efectoare i limfocitele care secret imunoglobuline.

Fc R I (CD64) este receptorul de mare afinitate, leag IgG monomer, iar exprimarea sa este stimulat de IFN. Aceti receptori mediaz ADCC.

Fc R II (CD32) este receptorul de mic afinitate, leag slab IgG monomer i are afinitate de 10 ori mai mic dect Fc RI, dar leag uor complexele imune.

Fc R III (CD16) au afinitate sczut pentru IgG monomer i se gsete pe macrofagele tisulare, neutrofile i celulele NK.

Anticorpii citofili se cupleaz la suprafaa celulei, prin intermediul receptorilor pentru Fc, iar ulterior leag antigenul specific. Receptorii pentru Fc al IgE au o densitate semnificativ.

Legarea ncruciat a receptorilor de Fc , de ctre complexele imune care conin mai mult de o molecul de IgG, stimuleaz activitatea macrofagului. Macrofagele alveolare au un numr mare de receptori pentru Fc al IgE.

Receptorii pentru complement (CR1, CR3, CR4) leag fragmentele C3b, C4b, primul fiind foarte eficient ca opsonin, dar mai puin eficient ca mediator al ingestiei.

Receptorii pentru limfochine leag mediatorii moleculari secretai de limfocitele activate: MIF, MAF, IFN. Sub influena acestor mediatori, macrofagele devin foarte active n prezena celulelor nonself.

Receptorii pentru glicoproteinele (lectine) care au glucide terminale resturi de fucozil, manozil, glucozil, acetil-glucozamin, sunt foarte importani pentru recunoaterea celulelor strine, a hematiilor mbtrnite, a fungilor, a bacteriilor.

Receptorul de manoz (MR) este o lectin a membranei macrofagelor tisulare, dar lipsete pe monocitul circulant. Acest receptor pare a fi important pentru ingestia agenilor patogeni de ctre macrofagele tisulare. Receptorul de manoz recunoate i leag cu mare afinitate microorganismele care au pe suprafaa lor molecule cu resturi de manoz i fucoz, avnd rol important n fagocitoza levurilor i protozoarelor parazite.

Monocitele sanguine nu exprim MR, ceea ce sugereaz c aceti receptori sunt eseniali pentru evenimentele inflamatorii.

Receptorii pentru fibronectin sunt implicai n aderena monocitelor la zonele de discontinuitate ale endoteliului vascular i n ingestia particulelor opsonizate cu fibronectin.

Receptori pentru proteinele care conin Fe, ceea ce explic rolul macrofagului n metabolismul Fe.

Receptori pentru hormoni(de exemplu, receptorul pentru insulin).

Receptorii pentru LPS. Celulele SFM sunt eseniale pentru mecanismul imunitii antibacteriene nscute.

Macrofagul posed un mecanism fin de recunoatere a LPS. De multe ori, 1 pg/ml (circa 100 fM) stimuleaz un rspuns detectabil. In soluie apoas, LPS formeaz complexe macromoleculare, analoge miceliilor fosfolipidice. Aceste complexe se pot insera direct n

membrana plasmatic i altereaz fluiditatea ei, iar la concentraii mari, produc dezagregarea membranei celulare. De aceea, s-a considerat c miceliile LPS se pot insera direct n membrana plasmatic. Dar n condiii fiziologice, LPS difer de varianta purificat, n soluii apoase.

LPS n plasm, n fluidul interstiial sau LPS asociat suprafaei bacteriilor Gram negative, este legat de diferite proteine plasmatice, care uureaz clearance-ul lor. LPS este opsonizat de o protein (LBP) care leag LPS (LPS binding protein), iar complexul este recunoscut de receptorul opsonic al suprafeei macrofagului CD14. CD14 se asociaz cu suprafaa celulei printr-o legtur glicolipidic. Complexul ternar format din LPS-LBP-CD14 nu transmite semnalul activator, dar activeaz o caten proteic transmembranar.

Caracterizarea complexelor LPS-proteine plasmatice a fost esenial pentru nelegerea interaciunii LPS-macrofag. Concluzia este c macrofagul leag LPS nativ cu o eficien foarte sczut, dar leag foarte eficient complexele LPS-proteine plasmatice, pe calea receptorilor specifici.Fig. 98. LPS sunt recunoscute de un receptor (CD14), dup cuplarea lor cu o protein plasmatic (LBP = LPS binding protein) i formarea complexului LBP-LPS.

Proteinele plasmatice care leag LPS sunt anticorpii spe-cifici fa de antigenul somatic (O), complementul, lipoprotei-nele cu densitate nalt (HDL), albumina, proteina care leag LPS (LBP) i septina. LBP este produs de hepatocite i are valori normale medii de 7 g/ml, iar n faza acut, la om, de 220 g/ml. Chiar dac este un reactant de faz acut, LBP se gsete n concentraii suficiente n plasma normal, pentru a avea rol de aprare n timpul infeciei.

Diferiii receptori fagocitari trimit semnale spre citoscheletul de actin i iniiaz mecanismele de internalizare.

Activarea macrofagului

Activarea macrofagului are loc n condiiile stimulrii antigenice i este un proces care decurge stadial:

- recrutarea monocitului imatur din snge i diferenierea n celul capabil s reacioneze n prezena limfochinelor;

- dobndirea proprietii de citotoxicitate sub aciunea unor semnale secundare (cantiti mari de limfochine, LPS etc.).

Limfocitele Th1 sunt principalele celulele activatoare ale macrofagului, prin intermediul interferonului . Interaciunea dintre limfocitul T i macrofag st la baza imunitii mediate celular i a hipersensibilitii ntrziate. Un alt factor, foarte potent, activator al macrofagului este lipopolizaharidul bacteriilor Gram negative (LPS).

Macrofagul activat prezint urmtoarele particulariti:

- are dimensiuni mai mari, este mai mobil, voalurile membranare sunt mai evidente;

- metabolismul oxidativ al glucozei este mult mai activ;

- coninutul enzimatic lizosomal este crescut i crete secreia de proteaze;

- crete rata procesului de endocitoz;

- crete activitatea antibacterian i antitumoral

- crete sinteza de monochine: IL-1 i TNF.

Activarea este nespecific, ceea ce explic faptul c macrofagul activat de componente antigenice ale celulelor de M. tuberculosis, este mult mai eficient n activitatea de clearance a oricror celule nonself, bacteriene, fungice sau tumorale.

Principala monochin mediatoare a aciunii locale sau sistemice a macrofagului activat este TNF , iar intermediarii reactivi ai O2 i N2 au rol major n liza bacteriilor parazite intracelular.

TNF poate avea rol determinant al efectului letal al LPS. Animalele care au primt o doz letal de E. coli, supravieuiesc dac li se administreaz AMC ce neutralizeaz TNF. Aceasta denot c efectul letal al LPS se datoreaz hiperreactivitii gazdei fa de agentul infecios i infeciei sau efectului toxic direct al LPS.

Dac macrofagul este activat prin stimulare antigenic de durat sau nu reuete s elimine agenii patogeni intracelulari, poate deveni refractar la stimularea ulterioar. Fig. 99. Macrofagele sunt celule eseniale pentru funcia de aprare. Ele constituie o linie de aprare, nainte de activarea specific a limfocitelor T i B. Particip la elaborarea rspunsului, n calitatea lor de celule care prelucreaz i prezint antigenul. Macrofagele sunt activate de limfochinele eliberate de celulele T i elibereaz limfochine cu funcii stimulatoare ale funciei imunitare (dup Roitt, 1993).

Endocitoza

Endocitoza este activitatea biologic a macrofagului, cea mai bine exprimat. Ingestia macromoleculelor dispersate n faz lichid se numete pinocitoz (pinos, grec = a bea). Pinocitoza are loc prin invaginarea membranei, rezultatul fiind formarea unor vezicule mici (0,2 m) i se numete micropinocitoz sau a veziculelor mai mari (pn la 1-2 m) i poart denumirea de macropinocitoz.

Micropinocitoza este constitutiv (adic are loc n absena unui stimul declanator din mediu) i are o rat foarte intens. In 30 de minute se internalizeaz echivalentul ntregii suprafee celulare.

Macropinocitoza are o rat minim n condiii de repaus, in vitro, dar este stimulat de serul adugat n mediu, de complexele imune, de mucopolizaharide etc.

Endocitoza mediat de receptori este un proces specific prin care macromoleculele i antigenele particulate sunt nglobate dup asocierea lor cu un receptor membranar.

Capacitatea de ingestie a macrofagului se materializeaz n urmtoarele funcii:

- funcia citocateretic, adic de epurare sau de sechestrare a celulelor senescente(de exemplu, hematii). Prin mbtrnire, hematiile i pierd acidul sialic din glicopropteinele membranare i expun componente care sunt recunoscute de macrofag. In focarul inflamator, macrofagele cur terenul de celulele moarte i asigur vindecarea leziunilor inflamatorii;

- funcia antixenic (clearance), adic de ndeprtare a materialelor strine, prin fagocitoz;

- funcia imun, const n participarea macrofagului la elaborarea rspunsului imun, prin prelucrarea Ag i cooperarea cu limfocitele.

Fagocitoza

Fagocitoza este procesul de ingestie a materialelor particulate, mai mari de 0,5 m, printr-un mecanism dependent de actin i de obicei, independent de clatrin. Fagocitoza presupune aderena particulei la suprafaa macrofagului i ingestia ei. La protozoare, funcia fagocitar are semnificaia ingestiei nutrienilor, dar la metazoare este un proces complex realizat de celule specializate: macrofage i polimorfonucleare. Funcia fagocitar a macrofagului este esenial pentru nglobarea i degradarea moleculelor nonself, a agenilor infecioi i a celulelor senescente. Macrofagul este o celul esenial pentru elaborarea rspunsului imun i pentru rspunsul inflamator. Fagocitoza este foarte important n embriogenez, pentru remodelarea tisular.

Aderena semnific realizarea contactului fizic dintre particula strin i membrana fagocitului i este mediat de moleculele de suprafa ale particulei, de sarcinile sale electrice sau de opsoninele din umori. In funcie de mecanismul aderenei particulei strine la suprafaa celulei fagocitare se disting dou tipuri de fagocitoz:

- fagocitoza nemediat de receptori, condiionat n principal de fore ionice. Astfel sunt ingerate particulele inerte (de latex, de crbune, siliciu, azbest etc.), moleculele agregate de albumin;

- fagocitoza mediat de receptori este un proces prin care antigenele particulate sunt nglobate prin intermediul unui receptor membranar i este activ n ingestia bacteriilor.

Receptorii membranari pentru lectine, leag nespecific componentele glucidice ale celulei nonself. Unele lectine ale suprafeei bacteriene pot s medieze legarea specific a bacteriilor de PMN i macrofage, n absena opsoninelor, rezultatul fiind activarea fagocitului, ingestia i digestia bacteriei. Procesul a fost denumit lectino-fagocitoz. Lectino-fagocitoza este definit ca o fagocitoz non-opsonic, bazat pe recunoaterea dintre receptorii suprafeei fagocitului i glucidele suprafeei celulei fagocitate. La nevertebrate, se crede c lectinele suprafeei fagocitelor au rol de recunoatere a moleculelor nonself.

Pe suprafaa macrofagului se gsesc nu numai receptori de lectine, ci i lectine cu funcie endocitar, cu rol n clearance-ul glicoproteinelor plasmatice i chiar al eritrocitelor mbtrnite sau al bacteriilor ajunse n mediul intern. De exemplu, lectina cu specificitate de manoz de pe suprafaa macrofagului, are rol n aprarea antimicrobian nespecific. Aceast lectin leag celulele infecioase ce expun pe suprafaa lor grupri cu manoz, uurnd fagocitoza i digestia lor intracelular.

De cele mai multe ori, interaciunea dintre fagocit i celula strin este mediat de receptori specifici pentru diferite opsonine: Ig, C, fibronectin etc. Cei mai importani sunt receptorii pentru Fc. Receptorii pentru regiunea Fc a imunoglobulinelor aparin la dou clase: cei implicai n funciile efectoare i sunt activatori ai funciilor macrofagului i cei care transport imunoglobulinele prin barierele epiteliale.

Fagocitele recunosc i leag celulele opsonizate. Toate opsoninele mediaz legarea celulei strine de suprafaa fagocitului i stimuleaz ingestia sa. Fig. 100. Stadiile nglobrii unui patogen ipotetic de ctre macrofage. Receptorii cu rol n recunoaterea fagocitar sunt FcR, CR, MFR (manoz), CHO (glucidic). FA-11 (macrosialina) este o glicoprotein pan-macrofagic, exprimat abundent n fagosomi (dup Gordon, 1998).

Opsoninele. Denumirea (opsein, grec = a aduce de mncare) semnific o categorie divers de molecule care au rolul de a uura ingestia particulelor strine, funcionnd ca puni de legtur ntre fagocit i particula nonself. Opsonina major termostabil este IgG, iar cea termolabil este reprezentat de proteinele complementului. Cele mai importante opsonine sunt anticorpii specifici ai sublaselor IgG1 i IgG3, deoarece se leag cu cea mai mare afinitate de receptorii pentru Fc . Legarea anticorpului pe particula nonself este mediat de fragmentul Fab al moleculei IgG, iar regiunea Fc interacioneaz cu receptorii Fc ai membranei fagocitului. Fagocitele umane pot exprima 3 clase de receptori Fc : FcRI, FcRII i FcRIII. Pentru interaciunea dintre IgG i receptorul su este esenial ca IgG s fie localizat pe suprafaa extern a particulei, pentru ca Fc s fie accesibil receptorului pentru Fc.

IgM ca atare nu are rol opsonizant, deoarece fagocitele umane nu au receptori pentru Fc al IgM. IgM fixeaz complementul pe calea clasic, cu mare afinitate i particulele tapetate cu IgM pot fi opsonizate cu peptidele derivate din fixarea C. Moleculele de C3b tapeteaz celula bacterian, formnd n jurul ei o ptur molecular. Pentru iniierea ingestiei este necesar al II-lea semnal, transmis prin receptorii membranari ai macrofagului.

IgA favorizeaz fagocitoza microorganismelor i eritrocitelor. IgA activeaz calea altern a complementului i astfel capacitatea sa opsonizant crete prin legarea proteinelor complementului la suprafaa particulei.

IgE nu are proprieti opsonizante.

Componentele opsonizante ale complementului sunt C1q, C4b, C3b, iC3b (produsul de degradare al lui C3b). Fragmentele derivate din C3 sunt cele mai importante opsonine, generate prin activarea complementului pe calea clasic sau altern. Produsul major al clivrii lui C3 (C3b) se leag covalent pe suprafaa particulelor. M. tuberculosis leag fragmentele de C3b i C3bi, care uureaz nglobarea lor n celula fagocitar. Inglobarea pe aceast cale reduce expunerea celulei bacteriene la compuii toxici ai O2.

C3b este opsonizant pentru bacteriile Gram negative ce cresc n forme coloniale R, deoarece lipsesc catenele polizaharidice terminale ale LPS. LPS este activator al cii alterne. Formele coloniale S sintetizeaz LPS complete i dup opsonizare nu sunt fagocitate. C3b este opsonizant pentru celulele eucariote i mediaz interaciunea citotoxic a macrofagului cu celula int.

n focarul de inflamaie se sintetizeaz o diversitate de proteine, multe dintre ele avnd rol opsonizant.

Colectinele formeaz o familie de lectine plasmatice, cu activitate opsonizant. Activeaz complementul i au rol n aprarea antiinfecioas. Domeniul lor lectinic mediaz legarea de structurile glucidice ale suprafeei microorganismelor, iar secvenele de tip colagenic sunt implicate n legarea de receptorul de colectin al suprafeei fagocitelor.

Medicamentele induc modificri ale suprafeei bacteriilor i schimb specificitile opsonice ale microorganismelor. Antibioticele inhibitoare ale sintezei proteinelor sunt foarte eficiente n acest sens. Proteina M pe suprafaa celulelor de Streptococcus pyogenes inhib activarea

complementului. Diminuarea cantitativ a proteinei M (dup tratamentul cu clindamicin i lincomicin) determin o opsonizare crescut cu C3 i o cretere a activitii fagocitelor. Acelai efect, atribuit sintezei sczute de protein A, s-a constatat fa de celulele de S. aureus.

M. leprae posed capacitatea de a lega fibronectina, care apoi are rolul unei puni ntre bacterie i receptorul de fibronectin al celulei gazd.

Faza de ingestie este condiionat de mobilitatea receptorilor membranari ai fagocitului. Vacuola format prin invaginarea membranei, se nchide asemenea unui fermoar. Dac receptorii membranari nu sunt suficient de mobili, sau dac particula strin nu are un numr suficient de grupri care s interacioneze cu receptorii fagocitului, ingestia nu are loc.

Ingestia este un proces activ, dependent de energie. Capacitatea unui fagocit de a ingera complexe imune (ingestie mediat de receptorii pentru Fc i C3b) se numete imunofagocitoz.

Dup ce s-a format, vacuola de fagocitoz este orientat spre aria perinuclear, unde fuzioneaz cu lizosomii i devine fagolizosom.

Dup ingestia unei bacterii sau a unei particule inerte exist urmtoarele posibiliti de evoluie:

- digestia

- persistena bacteriei n fagocit

- multiplicarea n celula fagocitar

- liza fagocitului i pstrarea viabilitii celulei bacteriene.

Digestia corespunde situaiei n care celulele bacteriene, inclusiv cele patogene, sunt degradate de enzimele lizosomale, active la pH acid. Simultan sunt digerate i unele proteine membranare ale vacuolei de fagocitoz, iar receptorii membranari sunt recirculai spre suprafaa celulei pentru a-i relua ciclul.

Persistena particulei ingerate are loc n dou situaii:

- unele fiind inerte, nu pot fi digerate (de exemplu, pulberile)

- unele bacterii patogene (Mycobacterium) posed strategii de succes, care le permit s se multiplice n interiorul celulei fagocitare.

Particulele inerte (azbest, siliciu, crbune) nu sunt atacate de echipamentul enzimatic al macrofagului i sunt pstrate mult timp. Dac acumularea lor depete o limit critic (n special n plmni) se produc procese inflamatorii locale cu consecine patologice. La mineri se cunosc afeciuni pulmonare profesionale: antracoza, silicoza, azbestoza (stocarea pulberilor n macrofagele pulmonare). Nefiind degradabile, acumularea excesiv a pulberilor n macrofage produce moartea celulei i eliberarea materialelor depozitate. Ciclul nglobrii este reluat de alte macrofage. Macrofagul activat elibereaz enzime hidrolitice. Rezultatul este reducerea progresiv a suprafeei respiratorii, ca o consecin a nlocuirii epiteliului alveolar, cu esut conjunctiv (stare patologic denumit emfizem).

Rolul macrofagului n aprarea fa de bacteriile cu localizare celular

Practic, orice celul poate fi infectat, dar fagocitele mononucleare sunt infectate mult mai adesea, deoarece ele fagociteaz bacteriile, au via lung i capacitate sterilizant antibacterian limitat. Din aceast cauz, fagocitele mononucleare sunt colonizate de bacterii ca M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, L. monocytogenes.

Pe de alt parte, monocitele fagocitare sunt efectori ai aprrii antibacteriene. Pentru a contracara aciunea fagocitelor, bacteriile cu localizare intracelular au elaborat modaliti strategice care le permit supravieuirea n mediul citoplasmatic ostil. Multiplicarea agentului infecios este esenial pentru producerea infeciei i a manifestrilor patologice. Multe bacterii patogene, cu localizare intracelular, nu numai c se multiplic, dar unele au mecanisme specifice de a scpa din celula gazd i de a se disemina spre celulele vecine, chiar fr s prseasc nia intracelular.

Bacteriile cu localizare intracelular au elaborat diferite strategii pentru supravieuire:

- invazia fagocitelor neprofesioniste

- localizarea n compartimente citoplasmatice bine delimitate

- interferena cu reactivii intermediari ai reducerii O2

- inhibiia fuziunii fagosom-lizosom

- rezistena la enzimele lizosomale

- interferena cu maturarea fagosomilor prin inhibiia acidificrii.

Fagocitele mononucleare reprezint habitatul major pentru M. tuberculosis i M. bovis.

La interaciunea dintre fagosom i lizosomi se descriu trei rspunsuri poteniale:

- fuziunea fagosom-lizosom, proces n care microorganismele nepatogene i patogene sunt omorte, iar patogenii cu localizare intracelular, supravieuiesc i se multiplic n interiorul fagosomului (L. monocytogenes, Leishmania, S. typhimurium);

- absena fuziunii i agenii patogeni se multiplic n fagosomii nefuzionai(T. gondii, M. tuberculosis);

- ieirea agentului patogen din fagosom, n citoplasm (T. cruzzi i posibil M. leprae).

Majoritatea patogenilor internalizai sau fagocitai n vezicule de origine membranar, rmn localizai n aceste structuri, dar au elaborat diferite strategii pentru a preveni aciunea mecanismelor celulare litice i le favorizeaz supravieuirea;

- unii ageni patogeni au nveliuri protectoare (capsula polizaharidic i LPS);

- enzimele bacteriene neutralizeaz radicalii O2, iar enzimele proteolitice secretate, degradeaz proteinele lizosomale ale gazdei;

- unele bacterii patogene sunt dependente de factori ai fagolizosomului, ca semnale declanatoare ale multiplicrii intracelulare. De exemplu, C. burnetii, S. typhimurium necesit pH acid pentru a persista n mediul intracelular i pentru a iniia replicarea;

- micobacteriile patogene i L. pneumophila modific fagosomul primar ori mpiedic acidifierea. Ele pot fi incluse de la nceput n vacuola celular, la pH neutru; M. tuberculosis rmne localizat ntr-o vacuol delimitat de membran, care rezist fuziunii cu lizosomii i de aceea se acidific foarte puin. Dac fuziunea are loc, membrana vacuolar nu are ATP-az care s pompeze protonii n vacuol (deoarece proteinele membranei sunt nlocuite cu proteine bacteriene) i vezicula ce nconjur celulele de Mycobacterium nu se acidific. Chlamidiile sunt bacterii parazite, obligat-intracelulare, care rmn ntr-o vacuol neacid, pentru c evit fuziunea cu lizosomii, n tot ciclul intracelular. Chlamidiile se difereniaz n dou forme: una ce crete activ n interiorul celulei gazd(corpul reticulat) i forma infecioas - corpul elementar extracelular - ce nu se divide;

- S. typhimurium intr n macrofag prin ondularea membranei i formarea fagosomilor spaioi, n care se dilueaz enzimele lizosomale ale gazdei, ceea ce favorizeaz supravieuirea sa n macrofage. Alteori este posibil inhibiia fuziunii dintre fagosom i lizosomi;

- L. pneumophila este nglobat printr-un mecanism special, al fagocitozei spiralate. Bacteria rmne n fagocitul pulmonar, n interiorul veziculei membranare multistratificate i pH-ul nu scade. Acelai mecanism protejeaz celula bacterian i n gazda sa natural, amoeba.

Sursa nutrienilor utilizai de bacterii n interiorul vacuolei nu este cunoscut. Este posibil ca bacteriile internalizate s altereze vacuola gazdei ntr-o msur suficient, pentru ca nutrienii s difuzeze din citoplasm, spre lumenul vacuolei. Alt posibilitate (probabil la Chlamydia) este ca proteine de origine bacterian s se insere n membrana vacuolei i s aib rol de pori, prin care difuzeaz nutrienii.

Civa patogeni intracelulari au capacitatea de a sparge vezicula de fagocitoz i rmn n citoplasm, unde se multiplic (L. monocytogenes, Shigella). Unele specii de Rickettsia degradeaz enzimatic vezicula nconjurtoare i deplasarea lor intracelular este orientat de componentele citoscheletului. Ieirea n citoplasm evit atacul mecanismelor antibacteriene i furnizeaz nutrienii necesari, dar este folosit de puini patogeni. Supravieuirea i multiplicarea lor este rezultatul unei interaciuni echilibrate ntre celula gazd i bacterie (Brett, 1997).

L. monocytogenes invadeaz celule fagocitare i nefagocitare. Dup internalizare, vacuolele sunt acidificate i circa 14% dintre celulele de Listeria scap din vacuola fagocitar, prin mecanismul lizei, mediat de listeriolizina O (o hemolizin), activat la pH-ul acid al vacuolei. Bacteriile care rmn n vacuola acid, sunt omorte.

Adeseori, patogeneza acestor infecii nu este consecina virulenei bacteriilor, ci se datoreaz rspunsului imunitar al gazdei. Rolul limfocitelor T este esenial pentru reactivitatea imunitar fa de aceti ageni patogeni i pentru generarea manifestrilor patologice. Reacia tisular de rspuns la infecia cu aceste bacterii este formarea granulomului. Bacteriile nu sunt eliminate complet din granuloame i din acest motiv infecia devine cronic.

Toate aceste condiii sunt ndeplinite de M. tuberculosis, M. bovis, iar L. monocytogenes se deosebete numai prin aceea c produce infecii acute.

Salmonella, Shigella au doar o faz intracelular, la tranzitul din lumenul intestinal prin celulele epiteliale (M) ale plcii Peyer, dar rspunsul imun este predominant humoral.

Funciile efectoare ale macrofagului se realizeaz prin urmtoarele mecanisme:

- producerea intermediarilor reactivi ai oxigenului i ai azotului

- limitarea disponibilitii Fe

- acidifierea fagosomului prin fuziunea fagosom-lizosom

- producerea defensinelor.

Dup ingestia particulei strine are loc o cretere brusc a intensitii respiraiei macrofagului. Crete consumul de glucoz i O2, se activeaz oxidaza membranar dependent de NADP. NADP-oxidaza reduce O2 la O2 (radicalul superoxid), care este dismutat de SOD, dup reacia:

O parte din H2O2 este descompus sub aciunea glutation-peroxidazei, reacie n care glutationul este oxidat, iar glutation-reductaza regenereaz glutationul redus.

Fierul este un element esenial pentru supravieuirea bacteriilor. Transferina saturat cu Fe este preluat de macrofag pe calea receptorilor specifici. Diminuarea receptorilor macrofagului pentru transferin determin scderea intracelular a Fe. Fe este necesar macrofagului pentru activarea mecanismelor care genereaz intermediarii reducerii O2 i ai azotului, dar este i un nutrient esenial al celulei bacteriene. Competiia pentru Fe pare a fi decisiv, n raport cu care fagocitul este un efector al aprrii antibacteriene sau este un mediu protector pentru celula bacterian.

Aceste bacterii nu produc invazine. Ele sunt fagocitate de macrofage cu mare uurin, deoarece secret i expun la suprafa cantiti mari de molecule care leag fibronectina, ceea ce favorizeaz fagocitoza prin intermediul receptorilor de fibronectin. M. tuberculosis activeaz C i se tapeteaz cu C3, produce enzime care detoxific intermediarii reducerii O2, iar NH4+ neutralizeaz pH-ul acid al vacuolei de endocitoz.

n concluzie, prin funcia fagocitar, macrofagul reprezint ultima barier protectoare fa de infecie. Dac aceast barier este depit, infecia se extinde i evolueaz spre septicemie i generalizare.

Alte funcii ale macrofagului

Macrofagul este o celul care exercit efecte citotoxice asupra celulelor care poart pe suprafaa lor molecule nonself (celule tumorale). Citotoxicitatea fa de celulele maligne se produce prin cteva mecanisme distincte:

- citotoxicitatea mediat de limfochinele (MAF) secretate de limfocitele stimulate. MAF se leag att pe celulele int (tumorale) ct i pe macrofag;

- citotoxicitatea natural, nespecific, se exprim la un nivel mai sczut. Efectul s-a demonstrat in vitro, prin contactul macrofagelor cu celule alogenice i se intensific dup stimularea nespecific a macrofagelor cu diferii factori chimici sau biologici;

- citotoxicitatea dependent de anticorpi (ADCC), mediat de moleculele de imunoglobulin fixate pe celula int. Regiunea Fc a moleculei de Ig este recunoscut de macrofag prin intermediul receptorilor specifici. Punile moleculare ntre macrofag i celula int favorizeaz un contact spaial strns i transferul factorilor litici.

Funcia secretorie a macrofagului este la fel de important ca i cea fagocitar. S-au identificat circa 75 de produi de secreie, in vitro, n mediul de cretere al macrofagelor sanguine i peritoneale, cu o mare diversitate structural i cu efecte biologice foarte diverse.

Unii produi de secreie sunt constitutivi: lizozimul, componente ale complementului. Alte produse de secreie sunt inductibile, adic se sintetizeaz sub aciunea semnalelor primite de la receptorii suprafeei, activai n procesul de endocitoz, sub aciunea endotoxinelor, a limfochinelor, a modificrilor de pH, a hidrolazelor acide, a metaboliilor acidului arachidonic.

Dup natura i funciile produselor de secreie ale macrofagului, se disting urmtoarele categorii:

- produi enzimatici. Sunt enzime lizosomale active la pH acid, din categoria hidrolazelor: colagenaza i elastaza hidrolizeaz colagenul i elastina, dar i imunoglobulinele, fibronectina, fibrinogenul. Aceste enzime au rol important n patogeneza bolilor pulmonare distructive (emfizem), deoarece secreia lor crete dup activarea macrofagelor. Macrofagele secret proteina activatoare a plaminogenului la plasmin. Plasmina lizeaz fibrina din cheagul sanguin

care se formeaz la periferia focarului de inflamaie. In focarul inflamator, macrofagul activat secret arginaza. Epuizarea argininei produce inhibiia creterii tumorale;

- produi de secreie cu rol n reaciile de aprare. Macrofagul sintetizeaz i secret lizozim (spre deosebire de granulocite care conin lizozim dar nu-l sintetizeaz, iar limfocitele nici nu conin i nici nu-l sintetizeaz). Nivelul seric al lizozimului este o reflectare a activitii fagocitelor mononucleare. Concentraia seric i urinar a lizozimului crete n strile infecioase. Lizozimul are efect antineoplazic prin aciunea sa direct asupra membranei celulelor tumorale. Macrofagul sintetizeaz i secret aproape toate componentele cii clasice i alterne a activrii C;

- n procesul infecios viral, macrofagul sintetizeaz interferon;

- proteine plasmatice. 2-macroglobulina inhib activitatea enzimelor proteolitice i astfel moduleaz efectele litice ale enzimelor lizosomale;

- proteine ale cascadei de coagulare sanguin (tromboplastina);

- proteine structurale (fibronectina, intr n alctuirea membranei bazale);

- compui cu efect reglator asupra altor celule: lipide bioactive (prostaglandine), factori reglatori ai rspunsului imun (IL-1);

- factorul stimulator al angiogenezei, n focarul inflamator;

Funcii metabolice ale macrofagului. Macrofagul intervine n metabolismul urmtoarelor categorii de substane:

- metabolismul Fe. Hematiile sunt distruse de macrofagele splenice, n momentul n care rezerva lor de ATP s-a epuizat. Macrofagul preia Fe din hemoglobin i l cedeaz transferinei, care l transport la mduva osoas. Transferina este sintetizat de macrofag:

- metabolismul lipidelor. Macrofagul capteaz lipidele plasmatice i le degradeaz sub aciunea lipazelor proprii;

- sintetizeaz colesterolul, unele substane carotenoide;

- sintetizeaz un factor stimulator al diviziunii fibroblastelor i al biosintezei de colagen de ctre fibroblaste. Activitile mitotic i de biosintez ale fibroblastelor sunt foarte importante n procesul reparator tisular (vindecarea leziunii), ntr-un proces inflamator. Macrofagul particip n mod direct la vindecarea leziunii, prin nglobarea i distrugerea resturilor tisulare moarte, a bacteriilor, a leucocitelor nefuncionale.

Sistemul fagocitar polimorfonuclear

Polimorfonuclearele (PMN) sau granulocitele sunt celule fagocitare profesioniste de tip microfag, din sngele circulant. Ele se gsesc la toate organismele cu sistem circulator i au rol n eliminarea microorganismelor patogene cu localizare extracelular. Funcia lor se suprapune parial cu a sistemului fagocitar mononuclear. Acesta controleaz microorganismele parazite cu localizare intracelular, fa de care PMN sunt ineficiente.

Dup caracterele tinctorilae ale granulaiilor se disting: PMN neutrofile (PMNN), eozinofile (PMNE) i bazofile (PMNB).

PMN sunt adevrate sisteme celulare de asalt n procesele de aprare antiinfecioas. Durata vieii este scurt (cteva zeci de ore), dar numrul lor n sngele circulant este relativ constant, ceea ce denot c producerea este reglat de necesitile organismului. La om se distrug 5 miliarde de leucocite i 1o miliarde hematii ntr-o or.

Numrul PMN n snge este un indicator al strii de sntate. Creterea numrului de PMN semnific existena unui proces infecios n organism, dar este indiciul unei evoluii favorabile, deoarece organismul se apr prin mobilizarea rezervei de PMN medulare, care trec n circulaie.

Scderea numrului de PMN n cursul unui proces infecios semnific, de cele mai multe ori, incapacitatea organismului de a se apra.

Numrul absolut al diferitelor categorii de celule n sngele circulant:Tip de celul absolut/mm3 Raportul procentual Nou nscut Hematii 5 milioane la brbat 5-8 milioane

Numr

4,5 milioane la femeie

Leucocite

PMNN nesegmentate

PMNN segmentate

PMNE

PMNB

Limfocite

Monocite

Trombocite 5000 8000 150 400 3000 6000 50 200 15 50 1500 3000 285 300 200 000 400 000

100%

3 5%

54 62%

1 3%

0 0,75%

25 33%

37% 15000 50000

7000 30000

2000 8000

Numrul total al leucocitelor este de circa 5 x lo3/mm3 snge.

La adult, se remarc o tendin de scdere a numrului de leucocite circulante: o scdere mai accentuat a numrului de PMNN i o diminuare uoar a numrului de limfocite.

Creterea numrului de leucocite se numete leucocitoz. Ea se realizeaz prin descrcarea n sngele circulant, a leucocitelor din mduva osoas. Cel mai adesea, leucocitoza este nsoit de polinucleoz (creterea numrului de PMNN), care pot ajunge la 50 000/mm3 n cursul infeciei cu ageni piogeni. Numrul leucocitelor crete n cazurile de septicemie, pneumonie, flegmoane, abcese, apendicite (10-15 000 n formele uoare, pn la 50 000 n formele grave), n reumatism, n cazul tuturor distrugerilor tisulare (n infarctul miocardic). Creterea este moderat n infeciile dentare, amigdaliene, urinare. Numrul leucocitelor crete n neoplazii. Necroza esutului tumoral reprezint un stimul pentru afluxul de leucocite.

Creterea numrului de PMNN este frecvent n infeciile cu localizare periferic. Creterea este rezultatul, att al unei descrcri din depozite, ct i al hiperfunciei medulare. Hiperfuncia medular se manifest prin creterea numrului de celule tinere (nesegmentate) n snge. Pentru fiecare neutrofil circulant, n mduva osoas se gsesc 50 100 neutrofile mature.

Arneth a stabilit proporia procentual a neutrofilelor n funcie de numrul segmentelor nucleare. Dup numrul segmentelor nucleare, PMNN se mpart n 5 categorii:

1(nesegm)

2 (2 segm) 3(3 segm) 4(4 segm)

5(5 segm)

5%

35%

41%

17%

2% (distribuie normal)

21%

65%

14%

0%

0% (apendicit)

Formula deviaz spre stnga, cu predominana celulelor tinere, ca semn al unei descrcri mai rapide i al hiperfunciei medulare.

n bolile parazitare (cu protozoare i viermi intestinali), n boli de piele, afeciuni alergice, leucocitoza este nsoit de acidofilie. Leucocitoza poate fi rezultatul unor maligniti hematologice (leucemii), cazuri n care predomin elementele tinere ale seriei afectate de transformarea malign.

Scderea numrului de leucocite (leucopenie) caracterizeaz infecia gripal, febra tifoid, infeciile grave, n care forele de aprare ale organismului au fost paralizate. In cazurile extreme de leucopenie (agranulocitoz), numrul PMNN scade pn la 200/ml, datorit epuizrii potenialului productor al mduvei osoase. Sensibilitatea la infecii este foarte mare.

Diferenierea neutrofilelor

Circa 3/4 din celulele nucleate ale mduvei osoase sunt destinate producerii de leucocite, iar dintre acestea, 2/3 sunt PMNN.

Mieloblastul este primul precursor recunoscut al seriei neutrofilului. Este de dou ori mai mare dect neutrofilul matur.

Promielocitul este de 2,5 ori mai mare dect neutrofilul matur. Este cea mai mare celul din seria de maturare a neutrofilului. Din suprafaa concav a cisternelor Golgi se matureaz granulaiile primare azurofile. Se numesc azurofile deoarece se coloreaz albastru cu colorantul Wright i primare, deoarece sunt primele care apar n timpul maturrii neutrofilelor. Odat cu diviziunea promielocitului, producerea granulelor nceteaz i granulele se distribuie n citoplasma celulelor fiice.

Mielocitul rezult din diviziunea promielocitului. Are aceleai dimensiuni ca i mieloblastul. In mielocit apar granulaiile specifice sau secundare. Cisternele aparatului Golgi i schimb polaritatea i pe faa convex se matureaz aceste granulaii. Se numesc granulaii specifice, deoarece se gsesc numai n neutrofile i sunt secundare deoarece apar dup cele primare.

Granulaiile primare (azurofile, descrise de Bainton) conin mieloperoxidaz, hidrolaze acide degradative (proteaze, fosfataze, nucleotidaze) i substane cu aciune bactericid (lizozim, lactoferin).

Granulaiile secundare (specifice ale lui Bainton) sunt mai mici, mai puin electrono-dense i conin fosfataz alcalin i lizozim. Nu conin peroxidaz.

Mielocitul se matureaz i rezult neutrofilul, fr diviziune celular. n neutrofilul matur, adiacente membranei plasmatice se gsesc microfilamente (actina i miozina), ce genereaz forele contractile necesare locomoiei. Neutrofilul segmentat nu se divide. Cromatina este condensat, iar nucleolul lipsete. Lobulaiile caracteristice ale nucleului nu se coreleaz cu vrsta celulei.

La sfritul perioadei de maturare a neutrofilului, scade sarcina negativ de suprafa i crete gradul de deformabilitate a membranei. Dup maturarea celular, un mare numr de neutrofile se depoziteaz n mduva osoas. Aici se gsesc circa 90% din neutrofile. De aici neutrofilul migreaz n lumenul capilar, printre celulele endoteliale.

Granulaiile specifice fuzioneaz foarte repede cu vacuola de fagocitoz, n timp ce aceasta este nc deschis n spaiul extracelular. Din aceast cauz, peste 90% din coninutul lor se vars n mediul extracelular. Granulaiile primare fuzioneaz mai trziu cu fagolizosomul. De aceea, circa 1/2 din coninutul lor se pierde, iar restul rmne n fagolizosom.

Sisteme bactericide active n PMNN

Dup ingestia unui microorganism, n neutrofil se activeaz sistemele moleculare care omoar celula ingerat. In PMNN funcioneaz dou sisteme bactericide: unul independent de O2 i altul dependent de O2 .Fig. 101. Activarea neutrofilului. Contactul microorganismelor opsonizate cu receptorii de suprafa ai neutrofilului (receptori pentru Fc i C) declaneaz fagocitoza, activarea NADPH-oxidazei i degranularea. In interiorul fagosomului, produsele oxidative pot interaciona cu proteinele din granule, pentru a omor microorganismele ingerate. MPO = mieloperoxidaza (dup Roos, 1998).

Sistemul bactericid independent de O2 cuprinde o gam larg de activiti enzimatice: hidrolaze acide, proteaze neutre, lizozim. Lor li se adaug condiii fiziologice incompatibile cu supravieuirea bacteriilor ingerate: mediul acid al vacuolei de fagocitoz, lipsa substanelor nutritive.

Granulaiile neutrofilelor conin proteine bazice (cationice), bogate n lizin, cu activitate bactericid, denumite generic fagocitine.

Proteazele neutre se gsesc n granulaiile azurofile i au pH optim al activitii lor, n jurul valorii 7. Cea mai cunoscut este elastaza i are proprietatea de a cliva proteine foarte diverse: fibrinogen, colagen, elastin. Catepsina G face parte din aceiai categorie. Ambele au activitate bactericid.

Hidrolazele acide, localizate n primul rnd n granulaiile azurofile sunt reprezentate de catepsinele B, D, E i realizeaz digestia final a proteinelor. Efectul lor se produce, n primul rnd n mediul extracelular, deoarece n PMNN, digestia celulei bacteriene nu atinge etapele finale.

Lizozimul este o enzim bactericid din granulaiile primare i secundare ale neutrofilelor. Este o muramidaz cationic mic (14,5 kD): atac mureina din peretele bacterian, prin scindarea legturilor glicozidice 1-4 din catenele polizaharidice ale mureinei, dintre resturile de Nacetilglucozamin i acidul N-acetilmuramic i rezult dizaharide alctuite din N-acetilglucozamin i acid N-acetilmuramic, la care se pstreaz ataate catenele peptidice. Dup distrugerea structurii de rezisten a peretelui celular, celula bacterian aflat ntr-un mediu neprotejat osmotic, se lizeaz. Macrofagele secret cantiti mari de lizozim i l depoziteaz n granulaiile citoplasmatice, spre deosebire de celelalte tipuri care l secret pe msur ce l sintetizeaz.

Lizozimul se gsete n granulaiile neutrofilelor, macrofagelor, n celulele epiteliale ale glandelor exocrine (celulele Paneth). Macrofagele secret constitutiv lizozimul, dar rata sintezei crete n macrofagele activate. Neutrofilele i celulele Paneth depoziteaz lizozimul n granulaiile citoplasmatice.

Efectul litic al lizozimului s-a evideniat asupra peretelui celular de Micrococcus lysodeikticus, la care mureina reprezint circa 80% din coninutul structurii parietale. Aciunea lizozimului este mai puin eficient asupra peretelui bacteriilor Gram negative i devine posibil dup tratamentul celulelor cu un amestec generator de radicali activi (acid ascorbic, H2O2).

Lizozimul are efect bacteriostatic. Perturb fenomenele de oxido-reducere bacterian i blocheaz procesele de cretere i diviziune.

Mediul acid din vacuola de fagocitoz are efect bactericid. Valoarea pH scade n cteva ninute, datorit producerii acidului lactic prin metabolizarea anaerob a glucozei. La pH acid se activeaz hidrolazele acide din granulaii.

Lactoferina este o protein uor bazic (pI = 8,7) din granulele secundare ale PMNN, sechestreaz Fe3+ i astfel inhib activitile vitale bacteriene dependente de Fe, avnd efect bacteriostatic. Lactoferina se gsete n serul uman, n lacrimi, este abundent n lapte i n alte secreii. S-au descris trei variante de lactoferin: , primele dou avnd activitate RN-azic. Celulele intestinale i fagocitele mononucleare au receptori pentru lactoferin, dar n-o sintetizeaz. Lactoferina leag Fe, fcndu-l indisponibil metabolismului bacterian. Bacteriile Gram negative, n prezena lactoferinei, elibereaz LPS i devin sensibile la lizozim, ceea ce denot c aciunea ei se exercit asupra membranei externe a peretelui celular. Lactoferina are proprieti microbiostatice asupra microorganismelor cu necesiti mari de Fe (coliformi, levuri).

n focarul infecios, lactoferina nesaturat este eliberat din granulaiile specifice, n mediul extracelular. Ea leag Fe n condiiile unui pH acid, iar transferina l leag la un pH mai mare. Complexul lactoferin-Fe este endocitat de macrofage, pe calea receptorilor pentru lactoferin. Astfel, lactoferina produce hipoferemie localizat la focarul infecios.

Defensinele sunt peptide mici de 3,5 kD (29-34 aminoacizi), bogate n cistein, moderat cationice(cu 3-10 sarcini pozitive nete), cu aciune antimicrobian. Sunt asemntoare unele cu altele, pn la identitate, cu excepia aminoacizilor N-terminali. In PMN umane, ele formeaz 30-50% din totalul proteic al granulaiilor primare (azurofile). In vitro, au spectru larg de activitate fa de bacteriile Gram pozitive i Gram negative, fungi (Candida, Cryptococcus neoformans), celulele maligne i fa de virusurile nvelite. Ele acioneaz formnd canale n membranele artificiale i probabil n cele naturale.

Oxidul nitric (NO) rezult prin aciunea nitric-oxid sintazei, dependent de dezaminarea Largininei. NO are efecte citotoxice semnificative asupra unui spectru larg de ageni patogeni facultativi i obligat intracelulari:

M. tuberculosis, Plasmodium, Leishmania, C. neoformans, T. gondii, M. leprae, Chlamydia trachomatis etc.

Sistemul bactericid dependent de O2 este complex i esenial pentru funcia neutrofilelor i a macrofagelor.

Imediat dup ingestia unei bacterii, n neutrofil se produce o intensificare brusc a respiraiei, o adevrat explozie a metabolismului oxidativ. O mare parte a O2 este convertit la intermediarii reactivi ai reducerii sale, care sunt toxici pentru organismul ingerat, dar i pentru intele extracelulare. Stimularea poate fi fizic (aderena la substrat) sau chimic, cu ageni solubili (esterii de forbol, formil-metionil-leucil-fenilalanina produs de bacterii, C5a, Con A, LPS, LTB4, TNF-) sau particulai.

Sursa reductoare pentru producerea intermediarilor reducerii O2, pare a fi o oxidaz complex cu FAD, legat de membrana PMNN. Oxidaza se reduce prelund electronii de la o piridinnucleotid redus (NADPH sau NADH) i se oxideaz prin transferul electronilor la molecula de O2: NADPH + 2O2 2O2- + + NADP+ + 2 H+

Prin reducerea parial a O2, rezult intermediarii reactivi. Dup ce molecula de O2 accept un singur electron se formeaz anionul superoxid (O2-) (forma ionizat) sau radicalul perhidroxi (HO2.).

O2- acioneaz fie ca reductor, fie ca oxidant. Cnd acioneaz ca reductor al unui substrat, pierde electronul suplimentar i este convertit la O2. Cnd acioneaz ca oxidant al unui substrat, formeaz H2O2.

Cei doi radicali ai O2, HO2. i O2- interacioneaz ntr-o reacie de dismutaie, n care unul se reduce iar cellalt se oxideaz i rezult O2 i H2O2, dup reacia: Fig. 102. n fagocite, intermediarii reactivi ai reducerii oxigenului sunt eliminai de superoxid dismutaz, de glu-tation oxidaz, de catalaz, de taurin. HMS = untul hexozo-monofosfatului.

2 HO2. + O2- 2 O2 + H2O2 .

La pH alcalin predomin O2-. Dismutaia este catalizat de SOD.

H2O2 este redus de anionul superoxid (O2-), dup reacia:

O2- i H2O2 sunt bactericide. H2O2 este i substrat al mieloperoxidazei (MPO), eliberat din fagolizosom. Efectul bactericid oxidativ este atribuit O2-, oxigenului singlet(1O2), H2O2, OH. i acidului hipocloros generat de mieloperoxidaz.

1O2 se formeaz dup ce molecula de O2 absoarbe energie. In molecule, n general, electronii apar n perechi stabilizate cu spini de direcie opus. O2 este o molecul neobinuit prin aceea c spinii electronilor au aceiai direcie. Absorbia enegiei schimb unul din electroni pe un orbital cu energie mai nalt i concomitent se produce inversia spinului.

H2O2 este principalul produs al reducerii O2 (dependent de electronii rezultai din oxidarea glucozei), sau prin dismutarea HO2. i a O2-

O2- + O2- + 2H+ H2O2 + O2

Activitatea antibacterian a H2O2 crete cu multe ordine de mrime n combinaie cu mieloperoxidaza i cu un halogen. Peroxidazele se disting prin structura primar, prin grupul prostetic hem i prin halogenul necesar pentru activitatea microbicid. Peroxidaza neutrofilelor i a monocitelor (mieloperoxidaza) se gsete n granulaiile azurofile (primare) i este descrcat n fagosom printr-un proces de degranulare, consecutiv fagocitozei.

Mieloperoxidaza (neutrofil-peroxidaza = verdoperoxidaza, datorit culorii sale verzi) este o protein bazic de 150 kD i catalizeaz oxidarea substraturilor donoare de H+ sau de electroni , de ctre H2O2.

Mieloperoxidaza, alturi de H2O2 (agent oxidant) i de un halogen (Cl sau I) formeaz un sistem toxic pentru bacterii, fungi protozoare, viermi, dar i pentru eritrocite, leucocite, plachete, celule tumorale.

MPO i H2O2 formeaz un complex cu substratul, cu efect oxidant asupra halogenului i rezult un compus oxidant (acidul hipocloros):

HOCl este oxidantul puternic, foarte toxic pentru microorganisme. HOCl poate reaciona cu diferii compui azotai pentru a forma monocloramine i dicloramine.

Fagocitele produc OH. prin reacia O2- cu HOCl sau cu NO:

HOCl + O2- OH. + OH- + Cl-

NO + O2- ONOO- (anion peroxinitrit)

ONOO- + H+ ONOOH (acid peroxinitros)

ONOOH OH. + NO2

Sistemul MPO poate fi eliberat la exteriorul celulei i s devin toxic pentru microorganismele adiacente (bacterii, fungi, protozoare), pentru virusuri, pentru helmini, pentru celulele normale i maligne.

Peroxidaza eozinofilelor poate utiliza Cl, dar este mai puin eficient dect MPO.

Complexul MPO H2O2 Iod formeaz un sistem de iodurare a bacteriei ingerate.

Ionul (OH-) i radicalul hidroxil (OH.) au efecte citotoxice puternice. Ei se formeaz prin interacia H2O2, cu srurile de Fe:

Fe2+ +

H2O2 Fe3+ + OH- + OH.

Cnd concentraia Fe este limitant, este necesar reducerea Fe3+ pentru formarea OH.

Fe3+ se reduce prin reacia Fe3+ + O2- Fe2+ + O2.

Oxigenul singlet revine la starea obinuit cu emisiune de lumin (chemiluminiscen).

1O2 pare s se formeze n sistemul MPO-H2O2-halogen. Acest sistem emite lumin, ceea ce sugereaz formarea 1O2 n fagocite.

Leucocitul PMN este supradotat cu o gam larg de mijloace bactericide. PMN combin mai muli factori antibacterieni, n sisteme complexe cu o putere bactericid superioar fiecruia izolat. Cel mai eficace sistem bactericid este MPO H2O2 halogen. Diferitele sisteme bactericide nu au o distribuie egal la toate speciile de mamifere. La om, MPO are activitate maxim. Aciunea predominant a unuia sau altuia dintre sistemele bactericide depinde i de natura celulei fagocitate.

Deficiene funcionale ale sistemului PMNN

Sistemul PMNN este esenial pentru aprarea organismului fa de microorganismele infecioase. Deficienele sale numerice sau funcionale se rsfrng asupra rezistenei antiinfecioase a organismului.

Cele mai cunoscute anomalii ale sistemului PMNN sunt neutropeniile, de diferite grade. Cnd numrul PMNN scade sub 1000 celule/mm3, riscul infeciilor crete mult, iar n cazul unei scderi accentuate (200 PMNN/mm3) nu mai exist posibilitatea unui rspuns protector eficient. Neutropenia se datoreaz fie unei producii medulare sub nivelul normal, fie unei distrugeri periferice extensive a neutrofilelor.

Deficienele funcionale ale neutrofilelor sunt foarte numeroase i diverse: deficiene de aderen, de chimiotaxie, de fagocitoz, de activitate bactericid.

Deficienele de aderen se datoreaz absenei unor glicoproteine membranare (de 110 i 180 kD), ceea ce mpiedic migrarea lor extravascular. Pacienii sufer infecii bacteriene i fungice recurente.

Maladia cronic granulomatoas este datorat mutaiei unei gene lincat pe cromosomul X, fiind cea mai cunoscut deficien a activitii bactericide a neutrofilelor. Capacitatea de ingestie este normal, dar omorrea bacteriilor care nu elibereaz H2O2 (S. aureus, Seratia marcescens) este foarte mult diminuat, datorit unei defect al oxidazei respiratorii, care nu determin explozia oxidativ a fagocitului dup fagocitoz.

Efectul bactericid se menine fa de bacteriile care produc H2O2 (streptococi, lactobacili). Fagocitele acestor pacieni au un metabolism oxidativ deficitar. Ingestia nu este urmat de intensificarea metabolismului oxidativ i din aceast cauz nu se genereaz intermediarii reactivi ai reducerii O2. Crete incidena infeciilor cu bacterii aerobe catalazo-pozitive, care inactiveaz H2O2 rezultat din propria lor activitate metabolic. Infeciile cu bacterii, levuri (Candida), fungi filamentoi (Aspergillus) sunt trenante i nsoite de reacii inflamatorii ample, care evolueaz n granuloame, ca o reflectare a incapacitii de a inactiva chemoatractanii i de a degrada antigenul. Deficiena enzimatic esenial este oxidaza care transfer electronii de la NADPH la O2, pentru a forma anionul O2-.

Maladia congenital Chediak-Higashi se caracterizeaz printr-o activitate fagocitar mult diminuat a macrofagelor i a PMN, deoarece lizosomii lor nu fuzioneaz cu fagosomii. Din aceast cauz, bolnavii sufer infecii repetate cu microorganisme oportuniste.

Aceste maladii pun n eviden importana mecanismelor de fagocitoz pentru aprarea organismului, fa de infeciile cu microorganisme oportuniste.

n concluzie, fagocitoza contribuie decisiv la rezistena organismului uman i animal fa de agenii infecioi. Aproape 80% din materialele nonself (bacterii, molecule) sunt epurate la primul pasaj al sngelui prin ficat, plmni i splin. Dup ce trece de cteva ori prin aceste organe, sngele se sterilizeaz.

Aciunea opsoninelor este foarte important pentru stimularea fagocitozei. IgM este cea mai eficient opsonin fa de bacteriile Gram negative, iar IgG are o eficien opsonizant de 500 1000 de ori mai mic. Creterea ratei fagocitozei complexelor imune i a particulelor tapetate cu componente ale C (C3b) este consecina prezenei receptorilor pentru Fc i pentru C3b, pe membrana fagocitelor profesioniste, ceea ce le permite intensificarea specific a activitii de endocitoz. Ele se deosebesc de fagocitele amatoare(celulele reticulare), lipsite de astfel de receptori.

REACII IMUNITARE IN VIVO

De cele mai multe ori, n special n procesele infecioase, reaciile imunitare au o finalitate benefic, avnd un rol determinant n eliminarea agenilor patogeni. Uneori, dup contactul cu antigenele (n special moleculare), activarea funciei imunitare are rol prejudiciant, defavorabil asupra organismului, deoarece rspunsul imun se instituie drept cauz i mecanism pentru producerea diferitelor maladii (alergii, boli autoimune).

Reaciile Ag-Ac in vivo, cu consecine defavorabile pentru organism, fac obiectul de studiu al unui domeniu bine conturat, denumit Imunopatologie.

Activarea neadecvat a funciei imunitare determin dou categorii de manifestri clinice:

a) strile de hipersensibilitate

b) maladiile autoimune

Diminuarea activitii sistemului imunitar, genereaz o categorie special de manifestri clinice, cunoscute sub denumirea generic de imunodeficiene. Ele pot fi nscute (primare) sau dobndite (secundare).

Imunopatologia studiaz reactivitatea funciei imunitare n strile neoplazice, reactivitatea consecutiv transplantului de esuturi i organe, n maladiile infecioase virale, bacteriene, fungice i n maladiile parazitare.

1. STRILE (REACIILE) DE HIPERSENSIBILITATE

Strile de hipersensibilitate sunt reacii teriare, consecutive reaciilor Ag-Ac in vivo. Ele sunt o consecin a faptului c procesul de imunizare dup contactul primar cu antigenul i generarea

efectorilor imunitari (anticorpi i limfocite efectoare) nu confer totdeauna o stare favorabil, de rezisten a organismului. Contactul primar cu antigenul creeaz, uneori, o stare de sensibilizare fa de antigenul respectiv. Sensibilizarea este o stare fiziologic duntoare organismului i se manifest, n special dup contactul organismului cu antigene proteice (din ou, din ser), cu antigenele din polen i mai rar dup contactul cu antigenele corpusculare (hematii de berbec). La contactul secundar cu antigenul sensibilizant, organismul rspunde prin strile patologice de hipersensibilitate.

Strile de hipersensibilitate sunt consecina unui rspuns de intensitate prea mare sau a unui rspuns imun neadecvat, care st la originea leziunilor tisulare. Echivalentul termenului de hipersensibilitate, folosit n mod curent, este cel de alergie (allos, ergon = alt energie).

Termenul de alergie a fost introdus de von Pirquet (1906) i semnific o reacie imunitar care se exprim cu energie diferit de cea normal, dup expunerea secundar la un antigen. Ambele denumiri se refer la o reactivitate imunitar de intensitate anormal crescut, fa de un antigen. In sens tiinific, noiunea de alergie include toate manifestrile care decurg din reactivitatea imunitar, cu o alt energie dect cea fiziologic: reaciile hiperergice, hipoergice i anergice.

n mod curent, alergia se definete ca o stare de hipersensibilitate, ce rezult din expunerea la un alergen i se distinge prin supraproducia componentelor imunitare.

Clasificarea strilor de hipersensibilitate

Strile de hipersensibilitate au fost clasificate n raport cu promptitudinea cu care se manifest:

- reaciile de hipersensibilitate imediat au o dinamic rapid. Se declaneaz n cteva secunde sau minute de la contactul secundar cu alergenul i diminu rapid, n cteva ore, fr semne vizibile, cu excepia celor foarte grave. esutul suport al reaciei este diferit de la o specie la alta. Aproape totdeauna va rezulta distrugerea celulei int. Reaciile imediate se desfoar n esuturi vascularizate i, de obicei, se manifest local, dar pot produce i efecte sistemice. Hipersensibilitatea imediat este cea mai rspndit dezordine imunitar la om. Este cea mai frecvent maladie cronic, ce afecteaz circa 25% din populaie n rile dezvoltate, cu severitate variabil, de la o simpl iritare, pn la periclitarea vieii;

- reaciile de hipersensibilitate subacut sunt acelea care ncep s se manifeste dup 1-3 ore de la contactul secundar cu antigenul i nceteaz dup 10-15 ore. Sunt mediate de IgG sau IgM;

- reaciile de hipersensibilitate ntrziat se evideniaz la 1-2 zile dup contactul secundar cu alergenul. Persist un interval de cteva zile, pn la cteva sptmni. Aceste reacii sunt mediate de limfocitele T i de macrofage. Nu sunt dependente de factori humorali circulani i de aceea se pot produce i ntr-un esut nevascularizat. Singura condiie este ca esutul s fie situat n apropiere de sistemul vascular, pentru ca limfocitele i macrofagele s poat migra spre locul unde a fost injectat antigenul.

Reaciile de hipersensibilitate imediat i ntrziat se deosebesc prin urmtoarele trsturi:

- mecanismul inducerii (humoral sau celular)

- dinamica desfurrii n timp

- particularitile manifestrilor patologice

- posibilitatea combaterii.

Gell i Coombs au definit 4 tipuri de reacii de hipersensibilitate:

- reacii de tip I: reaciile de anafilaxie (anafilaxia generalizat, reaciile de anafilaxie local, denumite i stri atopice1 : astmul bronic alergic, febra de fn, urticaria, reacia Arthus, maladia serului).

- reacii de tip II: reacii de citotoxicitate mediate de anticorpi

- reacii de tip III: reaciile de hipersensibilitate induse de complexele imune

- reacii de tip IV: reaciile de hipersensibilitate ntrziat, mediate de limfocitele T(reacia la tuberculin, brucelin, lepromin etc; dermatitele de contact, reacia de respingere a grefei).

Reaciile de tip I, II i III sunt mediate de anticorpi, iar cele de tip IV sunt mediate de celule.

Dovezi pentru natura imunitar a reaciilor de hipersensibiltate:

- reaciile de hipersensibilitate necesit stimularea prealabil (sensibilizarea) organismului uman sau animal cu antigenul inductor (alergenul);

- ntre momentul contactului cu doza sensibilizant i momentul administrrii dozei declanatoare este necesar o perioad de timp (5-10 zile), pentru sinteza efectorilor reaciei (anticorpi) sau pentru expansiunea clonelor de limfocite. Dup acest interval, organismul devine sensibil la declanarea strii de hipersensibilitate, numai la contactul cu acelai alergen care a creat starea de sensibilizare sau cu un antigen nrudit, care d reacie serologic ncruciat cu alergenul inductor. Intre antigenul sensibilizant, cel declanator i starea de hipersensibilitate este o relaie specific;

- organismele sensibilizate prezint un rspuns imun de tip humoral sau celular. Starea de hipersensibilitate este mediat de efectorii rspunsului imun;

- reaciile de hipersensibilitate imediat se transfer prin ser de la un organism hipersensibil la unul sntos. Pentru ca reacia de hipersensibilitate s se manifeste, serul trebuie s se injecteze ntr-un esut vascularizat. Reaciile de hipersensibilitate ntrziat se transfer prin intermediul limfocitelor viabile.

Reaciile de hipersensibilitate imediat de tip I

Reaciile de hipersensibilitate de tip I, denumite i reacii anafilactice au cea mai mare frecven i se manifest foarte diferit, att n ceea ce privete intensitatea, ct i a organului int al reactivitii.Fig. 115. Reprezentare schematic a particularitilor de evoluie a celor patru tipuri de reacii de hipersensibilitate.

Declanatorii

Antigenele care induc manifestrile reaciilor anafilactice se numesc alergene. Ele se gsesc n polenul unor plante, n praful de cas, n veninul insectelor sau n produse alimentare. Alergenele sunt un set de antigene, stimulatoare ale sintezei de IgE. Natura lor chimic este foarte heterogen. Un studiu german recent, relev c organismul uman vine n contact cu circa 14000 de substane chimice: unele sunt substane alimentare, altele sunt ingerate odat cu alimentele, fiind adugate n procesul industrial al prelucrrii. O categorie larg o formeaz substanele poluante. Din punct de vedere chimic, alergenele sunt glicoproteine i polizaharide de origine vegetal sau animal sau molecule mici, cu rol de haptene.

Haptenele sunt molecule organice sau anorganice, cu greutate mic, insuficient pentru a fi antigene, dar devin alergene dup cuplarea lor cu macromoleculele tisulare. De cele mai multe ori, haptenele alergice sunt substane de uz farmaceutic, de 500-1000 D. Dup legarea covalent ireversibil cu proteinele serice, rezult un conjugat hapten-protein, cu specificitate antigenic modificat i adeseori alergic. Toate medicamentele n stare nativ, dar i derivaii lor de degradare parial pot s se comporte ca haptene i s devin alergene.

Intensitatea reaciilor de hipersensibilitate este dependent de calea de ptrundere n organism, de doz, de frecvena expunerii i de caracteristicile moleculare ale alergenului. Cel mai adesea, alergenele se clasific n funcie de calea de ptrundere n organism. In raport cu calea de ptrundere a alergenelor, se disting:

- alergene inhalate

- alergene ingerate

- alergene inoculate

Alergenele inhalate sunt glicoproteine din polen, din fungi, din praful animalelor de cas. Greutatea molecular nu depete 50 kD, deoarece moleculele mai mari nu strbat membranele mucoase ale tractului respirator. Un alergen inhalat poate determina simptome respiratorii: rinit, astm. Crizele se produc numai n prezena alergenului. Unele alergene sunt sezoniere (polen), altele sunt perene (praful de cas).

Polenul este, din punct de vedere cantitativ, cea mai important surs de alergene. Plantele din familiile Gramineae, Compozitae, Betulaceae, Fagaceae produc polen alergic. Toate polenurile alergice provin de la plante polenizate de vnt (anemofile). Ele produc cantiti mult mai mari de polen dect plantele entomofile i n perioada nfloririi l elibereaz n atmosfer. Alergenele din polen sunt glicoproteine nrudite chimic i dau reacii ncruciate. Serul imun de iepure, fa de un alergen din polen precipit o diversitate de alergene polenice.

Sporii fungilor se gsesc n aer, n cantitate de circa 5 ori mai mare dect granulele de polen, dar produc mai puine stri alergice. In regiunile temperate, numrul sporilor fungici este maxim n timpul verii i scade n sezonul rece. Alergiile sunt produse de sporii a peste 80 de genuri de fungi: Alternaria, Penicillium, Aspergillus. Singura substan alergic de origine fungic, izolat n stare pur, este penicilina.

Cantitile de alergene care ptrund pe cale respiratorie, sunt foarte mici: sub 1 g/an.

Reaciile alergice la alergenele fungice apar la 30 de minute de la expunere, iar cele toxice, la 6-8 ore dup ingestie. Reaciile toxice nu au substrat imunologic. Micotoxinele au greutate molecular mic (sub 1 kD) i pot fi eliminate din extractele de alergene fungice, prin dializ.

Cele mai multe particule inhalate (mai mari de 10 m), ca de exemplu, polenul i sporii mari sunt depozitate n nazofaringe i sunt asociate cu manifestri locale, nazale i/sau oculare, denumite generic febr de fn. Particulele mai mici de 10 m (dar n special cele mai mici de 5 m) sunt antrenate cu curentul de aer inspirat, n cile inferioare, unde reaciile alergice tind s se manifeste sub form de astm. Sporii fungici difer ca dimensiuni i determin reacii alergice ale tractului respirator superior i inferior.

Alergenele ingerate se gsesc n compoziia unor alimente: n ou, ciocolat, cpuni, ciree, uleiul de ficat de pete, n seminele de Glycine max (soia), n fina unor cereale (gru, orz), n seminele de Arachys hypogea (alun de pmnt) etc. La copii, laptele de vac i soia sunt cauzele majore ale reaciilor alergice, urmate de cereale, ou i pete. Vrsta manifestrilor este variabil: dup primele zile de via(fa de laptele de vac), pn la doi ani. La 90% din cazuri, intolerana dispare dup trei ani. Cele mai comune manifestri sunt voma, diareea, colicile abdominale, ce apar ntr-un interval variabil, de la cteva minute, pn la 1-2 ore dup ingestie. Alergia la laptele de vac i la pete este mai frecvent la populaiile care consum cantiti mari ale acestor produse.

Alergenele alimentare traverseaz lumenul intestinal, la nivelul mucoaselor digestive. Bariera mucoasei gastrointestinale este expus la un grup heterogen de antigene. Experienele cu

molecule marcate cu peroxidaz de hrean sau cu feritin, au evideniat c unele antigene intacte i fragmente de antigene particulate din tubul digestiv, dobndesc accesul la esuturile limfoide ale gazdei, n special la persoanele cu deficit al sintezei de IgA. Antigenele ce ajung n contact cu structurile limfoide ale mucoaselor, stimuleaz rspunsul imun al gazdei.

Penetrarea antigenelor la nivelul tractului digestiv se face pe dou ci:

- prin endocitoz de ctre celulele intestinale absorbante, la polul luminal. Se formeaz fagosomi, n interiorul crora se produce digestia materialului endocitat, dar cantiti mici rmn nedigerate i sunt exocitate n spaiul extracelular, la polul bazal. Strile de hipo- sau aclorhidrie favorizeaz tranzitul proteinelor prin mucoasa intestinal.

- ptrunderea antigenelor alimentare la nivelul celulelor epiteliale M, ce acoper plcile Peyer, foarte numeroase n regiunea distal a intestinului subire. Aceste celule funcioneaz ca adevrate sonde de antigen, adic au capacitatea de a ngloba antigenele derivate n special din microorganisme i ntr-o msur mai mic, antigene de origine alimentar.

Celulele M reprezint un sistem de avertizare timpurie pentru sistemul imunitar al organismului. Ele sunt acoperite de un strat subire de mucus, au microvili scuri, dar au capacitatea de a endocita antigene luminale, prin mecanismul pinocitozei. Celulele M sunt difereniate, conin lizosomi i nu degradeaz antigenele pe care le pinociteaz, dar le transfer macrofagelor din foliculii subiaceni.

Dei au evoluat ca o modalitate strategic protectoare fa de antigenele luminale, totui celulele M reprezint poarta de intrare pentru microorganismele patogene, care la acest nivel i dobndesc accesul la esuturile subiacente mucoasei.

Studiile electrono-optice cu molecule marcate cu peroxidaz de hrean, au artat c acestea sunt transportate din lumenul intestinal i ajung n spaiul subiacent celulelor M, unde se gsesc limfocite i macrofage. Se stimuleaz astfel rspunsul imun local. Structurile limfoide asociate mucoaselor constituie prima barier de protecie fa de antigenele tractului digestiv. Uneori, cantitile relativ mari de antigene de origine bacterian i alimentar, nu sunt anihilate local, de structurile limfoide ale mucoaselor i trec n mediul intern, ajungnd la cea de a II-a barier major de protecie fa de antigene, care este ficatul. Circa 30% din numrul total de celule ale ficatului au capacitatea de a fagocita i epureaz sngele adus de vena port din teritoriul digestiv.

Antigenele inoculate sunt proteine din veninul de insecte, n special Hymenoptere (albin, viespe), care conine 7-10 antigene. Alergenele din venin sunt diferite forme ale fosfolipazei A. Veninul de albin conine fosfataz acid, hialuronidaz, dopamin i norepinefrin i un peptid care produce degranularea mastocitelor.

Serurile imune obinute pe diferite specii de animale (heteroantiseruri), dup injectare la om, adeseori activeaz rspunsul imun al organismului receptor. Muli diabetici tratai cu insulin de origine animal sau cu insulin sintetizat n celule reprogramate prin metodele ingineriei genice, sintetizeaz anticorpi anti-insulin.

Agenii farmacologici, administrai n scop terapeutic sau diagnostic, pot cauza o varietate de dezordini imunitare, deoarece acioneaz ca haptene care se cupleaz cu diferite proteine tisulare, conferindu-le imunogenitate. Legarea covalent a unui medicament ori a unui metabolit reactiv derivat prin metabolizarea lui, de o macromolecul, creeaz un conjugat hapten-macromolecul, inductoare a rspunsului imun specific. Legarea covalent a celor dou molecule se numete haptenare.

Se descriu dou tipuri de haptenare:

- haptenarea direct a celulelor (a moleculelor membranare) i a moleculelor extracelulare, sub aciunea compuilor chimici cu reactivitate nativ (intrinsec). De exemplu, penicilinele de semisintez (benzil-penicilina, cefalosporinele), dar i alte medicamente se cupleaz cu diferite proteine serice, formnd conjugate cu funcie de alergene. Circa 10% din moleculele de penicilin injectat, se leag covalent prin gruparea NH2, de proteine plasmatice sau membranare. Celula poate lega mii de haptene -lactamice, n cteva minute dup tratament.

- haptenarea indirect a moleculelor membranare sau libere, cu derivaii rezultai din catabolizarea parial a unor molecule, care n stare nativ sunt puin reactive sau areactive.

Metabolizarea are loc n hepatocite, cheratinocite (i n alte celule) i poate crea intermediari reactivi ce formeaz legturi covalente cu molecule carrier.

Uneori, catabolismul medicamentelor este concomitent cu sinteza proteic. Se produce haptenarea moleculelor n cursul sintezei (haptenare intern) i pot fi expuse ca antigene pe suprafaa celulei.

a = inel -lactamic

b = inel tiazolidinic

Dup fisiunea inelului -lactamic rezult gruparea peniciloil, principalul inductor al reaciilor anafilactice la om.

Metaboliii reactivi pot fi secretai n spaiul extracelular i se leag cu proteine extracelulare.

Unii indivizi sunt predispui la reaciile alergice fa de diverse medicamente, n special antiinfecioase. Dac un individ manifest fenomene alergice fa de un compus antimicrobian, riscul alergiei fa de o alt clas de compui farmacologici crete de 9 ori. Circa 10% dintre aduli sunt alergici fa de o clas de compui i intr n categoria celor cu risc crescut fa de ali compui farmacologici.

Reaciile de hipersensibilitate imediat de tip 1, induse de medicamente, se manifest variat: anafilaxie, urticarie, angioedem.

Unele substane pot produce mai mult de un tip de reacie, la un organism sensibil. De exemplu, penicilina poate cauza o reacie anafilactic de tip I, o anemie hemolitic datorat reaciei citotoxice de tip II, dezordini funcionale de tip III cu complexe imune sau o reacie de hipersensibilitate ntrziat.

Reaciile de hipersensibilitate apar, de cele mai multe ori, n esuturile bogate n mastocite: tegument, mucoase, mucoasa lingual, plmn, tractul gastrointestinal.

Dac reacia de hipersensibilitate imediat este localizat n mucoasa nazal i n conjunctiva ocular, simptomele includ rinoree, lcrimare, strnut, congestie nazal, creterea numrului eozinofilelor n snge. Titrul IgE seric poate s creasc sau s rmn sczut.

Dac reacia de hipersensibilitate imediat este localizat n bronhii, manifestarea clinic este astmul alergic, caracterizat prin scurtarea i ngreunarea respiraiei.

Mediatorii reaciei de hipersensibilitate imediat de tip I

Reaciile de hipersensibilitate imediat de tip 1 se datoreaz sintezei unor izotipuri de anticorpi cu proprieti particulare.

Din punct de vedere funcional, anticorpii sunt convenionali i citofili.

Anticorpii convenionali (Ig A, IgG, IgM) din ser se detecteaz in vitro, prin reacia de aglutinare, precipitare sau de fixare a complementului. In vivo, anticorpii convenionali se combin cu antigenul i l neutralizeaz. Reaciile de hipersensibilitate de tip 1 se datoreaz sintezei anticorpilor citofili, cu proprieti funcionale particulare.

Anticorpii citofili au proprietatea de a se fixa pe suprafaa unor celule care au receptori pentru regiunea Fc i n primul rnd pe mastocite, dar i pe bazofile, eozinofile, macrofage. Nu produc reacii secundare de aglutinare, precipitare sau de fixare a complementului.

Anticorpii citofili declanatori ai reaciilor de hipersensibilitate imediat se numesc reagine, deoarece produc modificri ale reactivitii tisulare: mresc permeabilitatea vascular prin intermediul histaminei, eliberat din mastocite. La om, reaginele majore sunt IgE i IgG4. IgE este termolabil (se inactiveaz la 56o, timp de 30 de minute), iar IgG4 este termostabil. Ambele izotipuri se sintetizeaz dup imunizri naturale. IgE nu traverseaz bariera placentar. Timpul de njumtire este de dou zile.

Sinteza lor se face dup mecanismul clasic: dup ce alergenul vine n contact cu mucoasele (respiratorie sau digestiv), penetreaz pelicula de mucus i celulele epiteliale, este fagocitat de macrofage, prelucrat i prezentat n asociaie cu moleculele CMH II, limfocitelor Th. Limfocitele

Th sintetizeaz IL-2 care produce expansiunea clonal a limfocitelor B. Sub aciunea stimulatoare a IL-2, limfocitele B se transform n plasmocite ce sintetizeaz IgE.

La persoanele normale, sinteza IgE este supresat de limfocitele Ts, iar concentraia de IgE seric variaz ntre 17-450 ng/ml, adic 0,002% din totalul cantitii de imunoglobuline serice. La indivizii atopici (cu predispoziie genetic pentru manifestarea reaciilor alergice), dup contactul cu o doz mic de alergen, aproape totdeauna se sintetizeaz IgE, iar titrul seric crete de 1000 de ori. Nivelul seric crescut al IgE este o modalitate de diagnostic al strilor alergice, dar nivelul normal al IgE nu exclude starea alergic.

IgE se sintetizeaz local, n structurile limfoide, la poarta de intrare a antigenului, n plasmocitele din corionul mucoasei. Excesul de IgE trece n circulaie i se leag pe receptorii pentru Fc de mare afinitate ai bazofilelor, neutrofilelor, ai celulelor endoteliului vascular, ai celulelor epiteliale alveolare pulmonare. Sngele transport IgE la masocitele tisulare din tot organismul. IgE fixat pe celule reprezint o proporie important din IgE total.

Dei IgE liber (din ser) are timpul de njumtire de dou zile, IgE fixat pe suprafaa celulelor este foarte stabil. Mastocitele rmn sensibilizate luni de zile, datorit afinitii foarte nalte a receptorilor lor pentru Fc al IgE. n stare legat, IgE este protejat de atacul proteazelor.

Celulele mediatoare ale reaciilor de hipersensibilitate imediat sunt n primul rnd mastocitele i bazofilele.

Bazofilele sunt celule circulante, dar pot ptrunde n focarul inflamator. Mastocitele sunt celule mononucleate i au dou localizri principale:

- n esutul conjunctiv, n special n jurul vaselor sanguine din ficat, rinichi, splin;

- n mucoasele digestive i cea respiratorie.

n creierul uman sunt dou surse de histamin: mastocitele i neuronii histamiergici. Mastocitele se gsesc n zonele cele mai vascularizate (eminena median, glanda pineal, meninge) i controleaz circulaia sngelui i permeabilitatea vaselor SNC. Neuronii histaminergici sunt limitai exclusiv la nivelul nucleului tuberomamilar din hipotalamusul posterior. Colateralele

axonale se proiecteaz n toate zonele cortexului. Astfel, sistemul histaminergic central controleaz activitatea ntregului creier.

Localizarea strategic a mastocitelor se coreleaz cu alterrile patologice care se produc la nivel vascular gastrointestinal, bronic, cutanat, cerebral, ocular.

n citoplasma bazofilelor i mastocitelor, la microscopul electronic se observ granule electronodense, ce reprezint pn la 40% din volumul celular. Ele conin mediatori preformai, cei mai importani fiind aminele biogene (histamina i serotonina).

Mastocitele conin histamin (amina tisular), detectat iniial n tegument. In vivo, histamina se sintetizeaz prin decarboxilarea histidinei, reacie catalizat de histidin-decarboxilaz (o enzim citoplasmatic) i este depozitat n granule. O celul uman conine 2-3 pg de histamin.

Histamina este larg distribuit n esuturile organismului uman. La om, neuronii histaminergici ai SNC reprezint o surs nemastocitar de histamin. Histamina acioneaz asupra unei varieti largi de tipuri celulare: celule musculare netede, neuroni, celule endocrine, exocrine, celule sanguine, celulele sistemului imunitar. Efectele variate se produc prin receptori distinci: H1, H2, H3.

Serotonina (5-hidroxi-triptamina) se formeaz prin decarboxilarea moleculei de triptofan hidroxilat. Mastocitele umane nu conin serotonin. Serotonina s-a izolat iniial din ser (tonina din ser), deoarece are efect vasoconstrictor. Produce edem i are rol important n reaciile anafilactice.

Histidina Histamina Serotonina (5-hidroxi-triptamina)

Mecanismul celular i molecular al reaciilor de hipersensibilitate imediat de tip I

Reaciile de hipersensibilitate imediat de tip 1 se desfoar n mai multe stadii.

Faza I a este legarea anticorpilor citofili (IgE, care s-a sintetizat dup contactul primar cu antigenul), de receptorii pentru Fc ai mastocitelor locale. Ali factori activatori ai mastocitelor sunt:

- alergenul specific sau unul nrudit cu cel inductor al sintezei IgE;

- diferite lectine

- anticorpi anti-IgE, anticorpi anti-idiotipici, anticorpi anti-receptor Fc ; Fig. 116. Activarea masto-citelor este mediat de legarea ncruciat a recep-torului Fc . Aceasta poate fi realizat de legarea antigenului de IgE fixat pe receptorii pentru Fc , de anticorpii bivaleni care recunosc determinanii izo-tipici ai regiunii Fc a IgE, de anticorpii anti-idiotipici ai regiunii Fab ai IgE, de anticorpii anti-receptor care se fixeaz direct pe recep-torul pentru Fc , de dimerii bivaleni de IgE obinui cu ageni chimici de polime-rizare sau de lectinele care se leag de resturile glu-cidice ale IgE. Antigenele i anticorpii monovaleni nu activeaz mastocitele, deoa-rece nu realizeaz legarea ncruciat a receptorilor (dup Roitt, 1993).

- neuropeptide endogene, fapt care explic alergia determinat de stimularea sistemului nervos

- anafilatoxinele C3a i C5a

- peptidele bacteriene ce conin formil-metionin

- ageni fizici (de exemplu, temperatura sczut)

- diferite medicamente.

n faza a II-a se produce activarea mastocitelor i degranularea lor.

Alergenul declanator trebuie s fie multivalent pentru a lega ncruciat dou molecule de IgE fixate pe celula efectoare. Dup legarea ncruciat a receptorilor pentru Fc , membrana granulelor fuzioneaz cu membrana citoplasmatic i elibereaz coninutul. Fig. 117. Ali stimuli activatori ai mastocitelor. Anafilatoxinele C3a, C5a sau substanele medica-mentoase (ionoforii de Ca2+, codeina, morfina, ACTH sintetic) activeaz mastocitele pe o cale direct. Toate aceste substane induc ptrun-derea Ca2+ n mastocit, declanatoare a fenome-nelor biochimice care duc la degranularea i eliberarea mediatorilor.

Eliberarea mediatorilor preformai

- histamina

- triptaza - activeaz C3

- heparina

Moleculele de IgE pot fi legate ncruciat de lectine (PHA, Con A), prin asocierea lor cu resturile glucidice ale regiunii Fc. Astfel se explic urticaria produs de cpuni i ciree, care conin cantiti mari de lectine.

Stimulul activator al mastocitelor este transmis prin receptorii pentru IgE. Activarea se datoreaz legrii ncruciate a dou situsuri Fab, printr-o molecul de alergen. Mastocitele au i receptori pentru Fc , care leag IgG cu afinitate mult mai mic. Degranularea mastocitelor

este precedat de influxul masiv de Ca2+. Granulele pline cu mediatori preformai, migreaz la periferia celulei, fuzioneaz cu membrana extern i elibereaz coninutul: histamina, proteaze neutre(triptaz, chimaz, carboxipeptidaz), proteoglicani (heparina, condroitin-sulfatul). Fig. 118. Inducerea i mecanismele efectoare ale hipersensibilitii de tip I. Prelucrarea antigenului se face la nivelul mucoaselor. Reexpunerea la alergen declaneaz degranularea mastocitelor i producerea mediatorilor ce determin simptome alergice (dup Mirakian, 1998).

Triptaza (prezent n mastocite, dar absent n bazofile) produce constricia muchilor netezi ai bronhiilor, iar chimaza stimuleaz secreia mucoasei bronice.

Proteoglicanii din granulele mastocitelor au rol n mpachetarea mediatorilor preformai n granule.

Heparina este proteoglicanul predominant n mastocitele pulmonare umane. Mastocitul este singura surs endogen de heparin la om i la roztoare. Heparina are efect anticoagulant.

Mastocitele conin SOD i peroxidaz.

Degranularea activeaz o lipaz care mobilizeaz acidul arachidonic din membrana mastocitului. Prin metabolizarea acestuia se sintetizeaz mediatori noi ai reaciei de hipersensibilitate imediat. Astfel, din acidul arachidonic, pe calea lipooxigenazei se sintetizeaz leucotriene, iar pe calea ciclooxigenazei se formeaz prostaglandine i tromboxan.

Efectele mediatorilor mastocitari

Manifestrile reaciilor alergice, inclusiv alergia respiratorie, pot s se produc n dou faze:

faza timpurie, care se desfoar n cteva minute, datorit eliberrii mediatorilor preformai;

faza tardiv se produce la 3-4 ore dup expunerea la alergen, datorit infiltratului celular, ca rspuns la mediatorii fazei timpurii.

n prima etap, aciunea histaminei const n contracia muchilor netezi ai tractului respirator i digestiv. Histamina produce constricia celulelor endoteliale i crete permeabilitatea vaselor mici. Acelai efect l are serotonina. Prin constricia celulelor endoteliale i creterea permeabilitii capilare, se produce edemul tisular.

n etapa a II-a, histamina produce dilatarea vaselor periferice i rezultatul este scderea brutal a tensiunii arteriale. ocul hipotensiv este una din manifestrile dramatice ale anafilaxiei generalizate.

Ali mediatori ai fazei a II-a sunt chininele. Ele se formeaz din chininogenul plasmatic i sunt polipeptide mici:

metionilchinina (Met-Lys-Arg-(Pro)2-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg)

bradichinina(Arg-(Pro)2-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg)

calidina (lisil-bradichinina): Lys-Arg-(Pro)2-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg.

Chininogenul este alctuit din 11 aminoacizi i (acid sialic)n, la una sau la ambele extremiti. Este o -globulin (2 mg/ml ser).

Chininele au efect vasodilatator i mresc permeabilitatea capilar, producnd edem.

n faza a III-a se sintetizeaz ali mediatori, care ntrein n timp diferitele efecte iniiate de mediatorii eliberai din mastocite, prin efectul chimiotactic fa de celulele sanguine:

ECF (eozinofil-chemotactic factor) determin afluxul de eozinofile

NCF (neutrofil-chemotactic factor)

PAF (factorul activator al plachetelor).

Leucotrienele (LC4, LD4, LB4, LE4) determin contracia de durat a muchilor netezi, edem al mucoaselor i stimularea secreiei lor.

Exemple de reacii de hipersensibilitate de tip I

Prima reacie de hipersensibilitate imediat a fost descris de Prausnitz i Kustner.

Reaciile de hipersensibilitate imediat pot s se produc la orice organism al unei specii i se numesc reacii anafilactice sau se manifest numai la anumii indivizi predispui genetic i se numesc atopii (stri atopice).

Reaciile anafilactice (ana = opus; phylaxis = protecie) se caracterizeaz printr-o dinamic exploziv a manifestrilor, n decurs de 3-4 minute. Clinic, termenul de anafilaxie semnific sindromul care rezult din eliberarea unor mediatori preformai i generai de novo n mastocite, care determin o stare opus celei de protecie. Manifestrile clinice ale reaciilor de hipersensibilitate sunt dependente de calea de ptrundere a alergenului i de cantitatea de histamin eliberat. Reaciile cutanate medii, cu eritem, urticarie, prurit, dureri de cap, sunt asociate cu un nivel sczut al histaminei plasmatice (sub 1 ng/ml).

Dac alergenul este injectat intravenos, rspunsul este sistemic, adic are loc o anafilaxie generalizat, care poate duce la oc vascular hipotensiv i asfixie secundar prin constricie bronic i laringian. Dac sfritul nu este letal, recuperarea funcional se poate face ntr-o or. ocul vascular se datoreaz ieirii plasmei n spaiul extravascular, rezultnd scderea volumului sanguin. Scderea debitului cardiac duce la hipoxie i acidifierea mediului intern, antrennd i insuficiena respiratorie.

Dac alergenul este injectat n piele, reacia este limitat la locul injeciei i se numete anafilaxie cutanat, nsoit de eritem (urticarie), angioedem, edem laringian, bronhoconstricie, hipotensiune, aritmie cardiac.

Anafilaxia generalizat (sistemic) este forma cea mai grav a hipersensibilitii imediate. Mult timp s-a considerat c anafilaxia generalizat este o manifestare patologic, indus numai n

condiii experimentale la animalele de laborator. In realitate, att la om ct i la animale se produc ambele tipuri de reacii anafilactice, att generalizate, ct i locale.

Prima reacie de anafilaxie generalizat a fost descris la cine. n 1902, Richt i Portier studiau biologia meduzelor i toxicitatea extractelor apoase i glicerinate din celenterate, asupra mamiferelor. Administrate n doze mari, extractele produc moartea imediat a cinelui, datorit ocului toxic, dar dozele mici sunt suportate. O injecie secundar la cteva sptmni mai trziu, produce o reacie anafilactic generalizat, cu paralizia muchilor respiratori i ocul fatal. Instalarea strii de oc este accelerat de injectarea intravenoas a dozei secundare. La autopsie se observ edemul mucoasei intestinale, a esutului pulmonar, congestia ficatului.

La cobai, anafilaxia se induce prin injectarea intravenoas a unei doze mici (1mg) de albumin seric bovin. La 8 zile dup injectarea dozei sensibilizante, animalul devine sensibil la ocul anafilactic i are sensibilitate maxim la 21 de zile. Doza declanatoare a ocului este mai mare. Rspunsul anafilactic este prompt i manifestrile ncep n primele zeci de secunde: piloerecie dorsal, agitaie motorie, strnut, tuse zgomotoas, cianozarea mucoaselor, pierderea reflexelor de miciune i defecaie, blocaj respirator, convulsie, moarte. Tabloul acestor modificri patologice se succede n cteva minute. Muchii netezi bronici ai cobaiului sunt foarte sensibili la histamin i bronhoconstricia fatal este caracteristica anafilaxiei la aceast specie.

Reaciile anafilactice generalizate la om se manifest n primul rnd fa de alimente i se exteriorizeaz prin urticarie generalizat. Urticaria afecteaz 15-23% din populaie Suportul manifestrilor patologice care nsoesc aceste reacii, este tegumentul.

Anafilaxia generalizat la om, este declanat i de ali factori: penicilin, aloseruri, heteroseruri, veninul insectelor (albin, viespe) i se manifest prin urticarie generalizat, spasmul muchilor bronici, edem laringian, dispnee sever, cianoz, oc hipotensiv. Intensitatea manifestrilor este dependent de gradul de sensibilitate. Sensibilitatea alergic a pacienilor variaz n limita a circa 1/1000.

Rspunsul sistemic cu reacii tegumentare generalizate, tulburri gastrointestinale, tahicardie, aritmie cardiac, hipotensiune medie, este asociat cu creterea concentraiei plasmatice a histaminei peste nivelul de baz. Reacia ampl care pericliteaz viaa, cu hipotensiune sever, fibrilaie ventricular, spasmul muchilor bronici, stop cardiac i respirator, este asociat cu nivelul crescut al histaminei, de 12 ng/ml. La om, histamina are efect vasodilatator asupra vaselor periferice, cu scderea presiunii vasculare.

Hipersensibilitatea imediat la penicilin produce circa 500 decese/an/glob. Reacia este declanat de penicilina nativ sau de derivaii rezultai din degradarea ei (acidul peniciloic, acidul penicilenic).

Anticorpii anti-penicilin aparin izotipurilor IgE i IgG4 i se gsesc chiar n serul persoanelor netratate cu penicilin. Probabil c sinteza lor a fost indus de penicilina din carne. Originea penicilinei este n masa micelian de la fabricile de antibiotice, care se adaug n hrana animalelor, ca stimulator al creterii.

Alergenele inhalate produc manifestri locale, la poarta de intrare.

Reacii atopice. Termenul de atopie definete strile de hipersensibilitate imediat cu substrat ereditar, limitate la om. Strile atopice se manifest la 10-20% din populaie, sub forme variate.

Reaciile atopice au un tablou clinic mai simplu i se produc atunci cnd reacia alergenului cu anticorpii specifici are loc pe suprafaa unei mucoase sau n epiteliul tegumentar.

Rinita alergic sau febra de fn este forma cea mai simpl a atopiei i se manifest prin secreie abundent a glandelor epiteliului nazal, iar astmul bronic, prin contracia muchilor cilor respiratorii. Cele dou forme extreme de manifestri alergice sunt determinate de alergenele inhalate, care se gsesc n polen, n praful de cas(ce conine alergene de acarieni), n prul animalelor. Foarte rspndite sunt alergiile la polenul de Ambrozia, o plant care rspndete o cantitate mare de polen (100 kg/plant/an). Gruncioarele de polen vin n contact cu mucoasa nazal i respiratorie, cu conjunctiva ocular i determin o stare de sensibilizare a aparatului respirator. Reexpunerea la polen n sezonul urmtor, declaneaz reacia alergic, cu urmtoarele manifestri: eritemul conjunctivei oculare, edemul mucoasei nazale i secreia apoas abundent, strnut.

Intensitatea simptomelor depinde de nivelul cantitativ al expunerii la polen, dar i de reactivitatea organismului. Exist situaii grave, inexplicabile, cu crize ample, dup o expunere minimal.

Dac rinita are caracter sezonier sau este dependent de condiiile de mediu, aproape sigur are caracter alergic. Rinita alergic peren se datoreaz contactului cu praful de cas i de animale.

Mecanismul rinitei alergice este diferit de al altor manifestri alergice. In primul rnd, exist diferene funcionale ntre mastocitele mucoaselor i ale esutului conjunctiv. Mastocitele mucoasei nazale(denumite MCT) conin histamin i triptaz, iar dup stimularea alergenic, se degranuleaz, dar concentraia plasmatic a histaminei nu se modific. Mediatorii mastocitari produc o hiperemie a mucoasei nazale, edem i transudarea lichid. Inflamaia nazal se datoreaz transudrii, n care albumina este un marker mult mai stabil dect mediatorii din categoria citochinelor.Fig. 119. Mecanismul rinitei alergice (dup Frankland, 1998).

n al II-lea rnd, manifestrile rinitei sunt dependente de particularitile unice ale vascularizaiei nazale, conferite de esutul venos erectil. Variaiile volumului sanguin din esutul venos erectil regleaz rezistena tractului nazal la coloana de aer. Umplerea cu snge a acestui esut produce congestia mucoasei. Curgerea sngelui este controlat de fibrele nervoase vegetative. Inervaia simpatic este vasoconstrictoare i diminu fluxul sanguin, iar tonusul simpatic are activitate ciclic. De aceea, mucoasa nazal are o perioad de repaus la fiecare 2-4 ore, iar cile nazale se pot obtura alternativ.

Faza primar a rinitei (strnut, rinoree, obstrucie nazal) este dependent de histamina din mastocite, de leucotriene i prostaglandine, iar faza tardiv (obstrucie nazal ampl prin hiperreactivitate i anosmie) este dependent de bazofile.

Astmul alergic, o variant complex a reaciilor atopice, este o maladie cronic inflamatorie a plmnului, cu o prevalen crescnd a morbiditii i mortalitii n ultimele dou decenii. Dei s-a considerat c este o boal a muchilor netezi ai cilor respiratorii, n ultima decad s-a acceptat c astmul este, n primul rnd, o boal inflamatorie. Structural, cile aeriene ale astmaticilor se caracterizeaz prin inflamaie cronic, cu infiltrarea intens a mucoasei bronice, cu limfocite, eozinofile i mastocite, cu descuamarea epiteliului, hiperplazia celulelor mucoase, ngroarea submucoasei. Aceste modificri se asociaz cu manifestrile clinice, care includ obstrucia cilor aeriene i hiperreactivitatea cilor aeriene.

Astmul bronic alergic are determinism multifactorial, atopia (predispoziia genetic de a sintetiza IgE ca rspuns la aeroalergenele comune) fiind cel mai comun factor predispozant. Dup expuneri repetate la doze mici de alergene, indivizii atopici sintetizeaz IgE. Expunerea secundar la alergene iniiaz rspunsul imun humoral. Evenimentele reaciei alergice, consecutive expunerii la alergen, se desfoar n dou faze: faza timpurie, de ordinul minutelor, const n rspunsul bronhospastic i faza tardiv, de ordinul orelor, ce const n rspunsul inflamator.

Rspunsul rapid se caracterizeaz prin edemul mucoasei, creterea tonusului muchilor netezi i ngustarea cilor respiratorii, asociat cu degranularea mastocitelor. Manifestrile astmatice imediate sunt dependente de eliberarea histaminei din mastocite. Pacienii cu astm alergic au o concentraie de IgE de 6 ori mai mare dect astmaticii nealergici, ceea ce confirm relaia dintre concentraia IgE i starea patologic.

Unii astmatici alergici dezvolt rspunsul de faz tardiv, la 3-6 ore dup stimularea cu alergenul, care, n absena terapiei, poate s persiste cteva zile. Rspunsul tardiv, este asociat cu migrarea eozinofilelor, dar i a neutrofilelor i limfocitelor din snge, n parenchimul pulmonar. Limfocitele TCD4 au rol esenial n patogeneza astmului. In plmnul astmatic, alergenul este nglobat, prelucrat i prezentat de macrofagul alveolar, de celulele epiteliale ale mucoasei i de celulele dendritice. Limfocitele Th-2 secret IL-4, 5, 6, 9, 10, 13, stimulatoare ale sintezei de IgE.

Alergiile la alimente formeaz o categorie de stri atopice foarte comune la copii i se manifest fa de alergene din lapte, ou, ulei de pete, ciocolat, cpuni, ciree, portocale. Manifestrile reaciilor alergice la alimente pot fi locale sau generalizate.

Reaciile alergice locale se caracterizeaz prin erupii urticariene (pustule eritematoase) la nivelul mucoasei bucale, nsoite uneori de tulburri digestive (colici abdominale, diaree). La vrsta adult, subiecii vor manifesta reacii alergice respiratorii.

Nu toate urticariile tegumentare sunt determinate de reacii alergice. Urticaria neimun de contact poate fi declanat de ageni chimici (salicilai, sulfii, acidul benzoic, acidul sorbic, acidul nicotinic i esterii si din alimente, din guma de mestecat, din ampoane, din parfum, din unguente) sau de ageni fizici (traumatisme, frigul). Acetia stimuleaz eliberarea factorilor chimici inductori ai urticariei. Mecanismele ei nu se cunosc, dar efectele se manifest asupra endoteliului vascular. Simptomele sunt arsura, usturimea, pruritul, edemul i eritemul.

Urticaria este acut sau cronic. Cea cronic se manifest prin apariia zilnic sau aproape zilnic a leziunilor tegumentare, pentru un interval de cel puin 6 sptmni, cauzat de stimuli fizici.

n toate cazurile de urticarie, imun sau neimun, pe tegument apar leziuni eritematoase (macule) i edematoase, nsoite de prurit. Urticaria implic dermul superficial.

Leziunea cutanat eruptiv este datorat creterii permeabilitii capilarelor i dilatrii venulelor. Plasma prsete patul vascular i determin formarea pustulei tegumentare pruriginoase,

nconjurat de o zon de culoare roie intens. Lichidul veziculelor eruptive este infiltrat cu limfocite i PMNN. Erupia tegumentar dispare la 24-48 ore, fr urme n cazul reaciilor acute sau persist mai multe zile la cele cronice.

n manifestrile cu angioedem, edemul se extinde subcutan sau submucos i leziunile pustulare sunt mai mari i pot s dureze 72 de ore. Se manifest la nivelul buzelor, limbii, pleoapelor, dar poate fi afectat orice zon corporal.

Pseudoalergii. Simptomele clinice ale alergiilor (urticarie, rinit, astm, ocul anafilactic) apar adeseori din cauze nealergice. Numrul lor depete pe acela al alergiilor. Iat principalele cauze:

- histamina se gsete n cantiti mari n unele alimente i activeaz mediatorii specifici ai reaciilor alergice;

- histidina din alimente este precursorul histaminei;

- tiramina de origine alimentar determin dureri de cap pulsatile i hipertensiune;

- feniletilamina produce migren;

- benzoatul de origine alimentar i din acidul benzoic produce astm i rinit;

- bisulfitul de sodiu, bioxidul de sulf i metabisulfiii (conservani) produc simptome ale tractului gastrointestinal, distrug vitaminele B, produc dureri de cap, astm;

- glutamatul monosodic (agent de aromatizare) produce astm;

- coloranii alimentari (n special culoarea galben) produc astm i alte reacii alergice;

- aspirina induce astm, urticarie, angioedem (Girard, 1998).

Testarea strilor atopice

Pentru prevenirea accidentelor provocate de reaciile de hipersensibilitate imediat, n clinic, nainte de administrarea unor medicamente, se testeaz eventualele manifestri de hipersensibilitate.

O problem esenial pentru diagnosticul i tratamentul alergiilor, este gradul nalt de variabilitate biochimic a alergenelor, de la un lot la altul. Preparatele de alergene sunt foarte heterogene, iar cantitatea de alergen specific, din cele mai multe extracte comerciale, variaz de la cteva procente pn la 50% din proteina total. Extractele sunt amestecuri complexe, cu cantiti variabile de alergene majore, alergene minore i proteine irelevante. Extractele fungice conin proteine, glucide, enzime proteolitice, enzime glicolitice, n cantiti variabile. De aceea, efortul major s-a orientat n direcia clonrii alergenelor de importan clinic major. Majoritatea alergenelor s-a clonat i unele sunt disponibile la un nivel moderat sau chiar nalt de puritate. Disponibilitatea preparatelor antigenice omogene, cu puritate i activitate biologic definite, va avea un impact major asupra diagnosticului i probabil, asupra terapiei dezordinilor alergice.

Multe alergene, n special cele de natur proteic, se prezint ntr-o multitudine de izoforme naturale. Ele sunt rezultatul variaiei alelice a numeroaselor proteine vegetale i fungice, foarte asemntoare ca secven a aminoacizilor, dar au proprieti distincte de combinare cu anticorpii sau de activare a clonelor de limfocite T specifice.

Existena numeroaselor izoforme ale aceleiai molecule de alergen, este probabil, asociat cu grade diferite de recunoatere a epitopilor si, de ctre limfocitelor T i B i, ca o consecin, cu grade diferite de sensibilitate. Ca dovad, anticorpii de la diferii pacieni alergici, leag numai unele izoforme ale alergenului.

Preparatele de alergene pentru diagnostic sunt heterogene i deriv din surse naturale care conin majoritatea sau toate izoformele de alergen. Inlocuirea acestor alergene cu cele clonate, pentru diagnostic, va rezolva unele probleme, dar va crea altele. Unii cercettori apreciaz c majoritatea indivizilor rspund la un numr limitat de epitopi ai oricrui alergen. De aceea se consider c un numr mic de alergene (circa 40) ar putea s fie suficiente pentru a identifica majoritatea indivizilor alergici.

Testele cutanate constau n injectarea subcutan a alergenelor la diferite diluii. La organismul alergic, reacia de hipersensibilitate se manifest n cteva minute, prin apariia la locul injectrii, a unei reacii inflamatorii pruriginoase, nconjurat de o zon mai extins de eritem. Reacia de hipersensibilitate la proteinele salivei de nar are acelai aspect. Alergenul injectat (sau inoculat) se leag specific de IgE fixat pe mastocitele din piele. Mastocitele elibereaz histamina n cteva minute, cauznd edemul localizat, eritem (vasodilataie) i prurit. Leziunile locale ale reaciei de hipersensibilitate imediat se reproduc prin injectarea unei cantiti mici de histamin.

Determinarea cantitativ a IgE seric al pacientului, rmne cel mai bun criteriu de diagnostic. IgE se dozeaz prin metoda RIA:

- alergenul (de exemplu, penicilina) se fixeaz pe suportul inert (dextran);

- proba de ser de cercetat se pune n contact cu alergenul fixat pe suport. IgE din ser se fixeaz pe alergenul imobilizat;

- se adaug ser imun de iepure, care conine IgG marcat radioactiv, anti-IgE uman;

- se msoar indirect cantitatea de IgE fixat pe suport, prin msurarea cantitii de IgG radioactiv legat specific.

Combaterea strilor de hipersensibilitate imediat de tip I se face prin evitarea alergenelor, prin terapie medicamentoas i prin imunoterapie.

Msurile de evitare a alergenelor sunt ideale pentru prevenirea reaciilor: evitarea alimentelor, medicamentelor, controlul prafului de cas, evitarea contactului cu animalele al cror praf este alergic, combaterea mucegaiului din ncperile locuite.

Medicamentele antihistaminice au efect antagonic fa de histamin, deoarece intr n competiie cu receptorii pentru histamin ai celulelor int. Astfel, se poate bloca creterea permeabilitii vasculare, vasodilataia, contracia muchilor bronhiilor i ai mucoasei gastrointestinale. Rinita alergic necesit terapie antihistaminic local. Cromoglicatul de sodiu protejeaz pacienii astmatici. Teofilina(o metilxantin) relaxeaz muchii netezi bronici.

Imunoterapia sau hiposensibilizarea const n administrarea planificat a alergenului la un pacient pentru a diminua sinteza IgE. Rinita alergic, astmul bronic i anafilaxia la veninul de insecte pot rspunde la aceast terapie. Alergenul este injectat sptmnal, n doze gradat crescnde. Dup o cretere iniial a IgE circulant, se produce declinul. Locul IgE este luat de IgG care fixeaz alergenul i-l mpiedic s stimuleze mastocitele, blocnd reacia alergic.

1 Atopia definete o stare de hipersensibilitate imediat local, ce se manifest la persoane cu predispoziie ereditar.

Reaciile de hipersensibilitate de tip II

Reaciile de hipersensibilitate de tip II sunt de tip citotoxic, dependente de anticorpi i sunt consecina aciunii fagocitelor asupra celulelor nucleate, dup opsonizarea lor prealabil cu anticorpi sau cu componente ale complementului.

Diferitele izotipuri de anticorpi variaz n ceea ce privete posibilitatea lor de a iniia aceste reacii, n funcie de capacitatea de a lega C1q sau de a interaciona cu receptorii pentru regiunea Fc, ai celulelor efectoare. Mediatorii reaciilor de hipersensibilitate de tip II sunt IgG, IgM, i componentele complementului (C3), care se leag specific de antigenele celulare sau tisulare.

Consecina legrii anticorpilor, este apariia leziunilor, limitate la celulele sau esuturile care expun antigenele. In general, anticorpii specifici fa de antigenele suprafeei celulelor proprii, produc efecte defavorabile iar cei specifici fa de antigenele intracelulare sunt inofensivi.

n reaciile de hipersensibilitate imediat de tip citotoxic, anticorpii specifici fa de antigenele suprafeei celulare coopereaz cu componentele complementului i cu celulele efectoare.

Celulele efectoare sunt macrofagele, neutrofilele, eozinofilele, celulele NK. Toate au receptori pentru regiunea Fc a Ig i receptori pentru C3. Legarea anticorpilor prin intermediul receptorului pentru Fc, stimuleaz fagocitele s produc leucotriene i prostaglandine, implicate n rspunsul inflamator.

Mecanismul prin care celulele efectoare atac celulele int este acelai prin care ele sunt active fa de agenii infecioi. Agenii patogeni sunt nglobai n fagolizosom, unde, de cele mai multe

ori, virusurile sunt inactivate iar celulele sunt omorte sub aciunea intermediarilor reducerii O2, a enzimelor lizosomale, a pH acid.

n reacia de hpersensibilitate imediat de tip citotoxic, inta celular este prea mare pentru a fi fagocitat i de aceea, coninutul granulaiilor i al lizosomilor citoplasmatici este eliberat la contactul cu celula sensibilizat, prin exocitoz.Fig. 120. Fagocitoza frust are rol n producerea leziunilor tisu-lare, n reacia de hiper-sensibilitate imediat de tip II (jos) i este prezentat comparativ cu funcia fagocitar nor-mal a neutrofilelor (sus).

Exocitoza coninutului enzimatic al fagocitelor are efect benefic, dac inta este un parazit, dar este defavorabil dac inta este esutul propriu, care a fost sensibilizat n prealabil de anticorpi.

Ali efectori ai hipersensibilitii citotoxice mediat de anticorpi, sunt celulele K. Ele au receptori de mare afinitate pentru regiunea Fc i produc efecte citotoxice.

Declanatorii reaciilor de hipersenbilitate imediat de tip citotoxic sunt aloantigenele.

Reaciile citotoxice dependente de anticorpi sunt consecutive aloimunizrii, adic au loc dup contactul cu antigenele unui organism al aceleiai specii, dar cu o alt variant alelic a moleculelor CMH.

Aloimunizarea survine n urmtoarele situaii:

- transfuzii de snge izogrup

- aloimunizarea feto-matern n cazurile de incompatibilitate Rh

- n transplantul de esuturi i organe.

Aloimunizarea post-transfuzional

ntr-o transfuzie heterogrup, incompatibil n sistemul ABO, reacia de aglutinare este imediat, deoarece receptorul posed aglutinine preformate fa de hematiile transfuzate. Aglutininele i aparin clasei IgM. Ele produc aglutinarea rapid, activarea cascadei complementului i hemoliza intravascular.

Transfuzia izogrup produce aloimunizarea, deoarece n interiorul aceluiai grup eritrocitar din sistemul ABO, exist diferene antigenice mai fine ale glicoproteinelor suprafeei eritrocitare, care induc sinteza IgG n organismul receptor. Circa 8% dintre receptorii politransfuzai se imunizeaz fa de antigenele eritrocitare de izogrup sanguin i circa 25% se imunizeaz fa de antigenul HLA al leucocitelor. Se sintetizeaz anticorpi ai izotipului IgG. IgG declaneaz mecanismele hipersensibilitii de tip citotoxic i eritrocitele transfuzate sunt lizate.

Reaciile post-transfuzionale izogrup se manifest, uneori, chiar imediat dup prima transfuzie, deoarece sunt mediate de anticorpi preexisteni, care s-au sintetizat fa de antigenele bacteriene ce dau reacie ncruciat cu antigenele eritrocitare. Alteori, reaciile de hipersensibilitate se manifest la cteva zile sau chiar sptmni dup transfuzie, interval necesar sintezei anticorpilor. Reaciile de hemoliz produc icter2 i anemie. Icterul se datoreaz hemolizei masive, care poate produce necroza acut a tubilor renali, sub aciunea hemoglobinei.

Reaciile post-transfuzionale orientate fa de antigenele plachetare i leucocitare, au consecine mai puin grave.

Aloimunizarea fetomatern n incompatibilitatea Rh[3]

n timpul sarcinii, dar n special n timpul expulziei ftului, hematiile fetale pot traversa placenta i intr n circulaia matern. In cazul incompatibilitii Rh(mama Rh- i ftul Rh+, de origine patern), organismul matern se imunizeaz cu antigenul Rh al hematiilor ftului i se sintetizeaz anticorpi. S-au detectat dou clase de anticorpi: IgM, care determin aglutinarea eritrocitelor Rh+; IgG, fr efect aglutinant. Din punct de vedere clinic, IgG anti D are o importan mai mare, deoarece traverseaz placenta.

Antigenul Rh este o glicoprotein, ancorat n stratul lipidic membranar. Imunizarea matern cu antigenul Rh se produce att n timpul sarcinii, dar mai ales la natere, cnd eritrocitele fetale, prin ruperea vaselor trec n circulaia matern. IgG traverseaz placenta i se fixeaz pe eritrocitele fetale, cauznd distrugerea lor prin mecanismul hipersensibilitii de tip citotoxic, adic anticorpii fa de componentele celulare stimuleaz fagocitoza hematiilor prin aderena

opsonic sau distrugerea are loc prin activarea complementului i hemoliz. Consecina este anemia, icterul, edemul. Situaia patologic se poate preveni prin administrarea organismului matern, imediat dup natere, a gama-globulinei anti-Rh (anti-D), care elimin celulele fetale Rh+ intrate n circulaia matern i protejeaz urmtoarea sarcin Rh+.

Imunizarea Rh este mult mai puin frecvent dect incompatibilitatea materno-fetal Rh, din urmtoarele cauze: transferul placentar al hematiilor fetale poate s nu aib loc; 30% dintre femeile Rh nu rspund la stimularea cu o cantitate mic de hematii Rh+, iar un procent mic nu rspunde nici dup stimulare cu 50 ml de hematii Rh+; ftul poate fi incompatibil cu organismul matern n sistemul ABO. De exemplu, pentru mama cu grup O i ftul cu grup A sau B, hemaglutininele materne i (IgM) elimin celulele fetale nainte ca ele s stimuleze sinteza anticorpilor anti Rh.

Anticorpii anti D se pot detecta folosind Ig de iepure anti-Ig uman, care leag ncruciat IgG anti-D, n prezena unui amestec de ser, cu albumin seric bovin, care reduce sarcina suprafeei eritrocitelor, uurnd aglutinarea.

Un primitor de snge Rh- poate sintetiza anticorpi anti-D, dac este transfuzat cu snge RhDu. O gravid RhDu se poate imuniza anti-D, dac eritrocitele fetale sunt Rh+ cu antigen complet. De aceea, orice gravid, Rh+Du este considerat Rh- i este testat pentru prezena anticorpilor antiRh.

n transfuzie, persoanele Rh+Du se consider ca fiind Rh-, n cazul n care sunt receptoare i Rh+, dac sunt donoare de snge.

Anemia hemolitic indus de medicamente (imunoalergic)

Unele reacii imunitare fa de celulele sanguine (eritrocite, plachete) se pot manifesta ca o consecin a uzului de medicamente. Reacia este orientat fa de molecula nativ sau fa de un derivat rezultat din degradarea sa. Astfel de reacii imunoalergice sunt produse de penicilin, quinin, sulfamide etc.

Anemiile hemolitice imunoalergice se datoreaz modificrii specificitii antigenice a unor molecule ale suprafeei eritrocitare, sub aciunea unor medicamente care acioneaz ca haptene. Pentru ca un medicament s fie imunogenic, este necesar ca molecula nativ sau un metabolit al su, s se cupleze cu o molecul proteic in vivo. Antibioticele -lactamice sunt un exemplu de molecule cu proprieti de haptene. Ele formeaz legturi covalente cu proteinele, datorit ruperii spontane a inelului -lactamic i datorit producerii spontane a gruprii peniciloil cu reactivitate chimic crescut. La doze mari de antibiotic, moleculele proteice ale organismului sunt modificate, dup legarea moleculelor -lactamice. Conjugatul antibiotic-protein este inductor al sintezei IgM i IgG i rezultatul este hemoliza.

Alte medicamente care genereaz reacii imunitare, n absena sintezei anticorpilor sunt sulfonamidele. Ele produc metabolii care se leag preferenial cu anumite proteine. Grupul enzimelor cu citocrom P450 este inta legrii metaboliilor sulfonamidei. Proteina alterat genereaz un peptid care se asociaz cu complexul CMH al celulei, devenind inta atacului limfocitelor T.

Mecanismele moleculare ale inducerii reaciilor hemolitice imonoalergice sunt ipotetice. Reacia autoimun se datoreaz modificrii specificitii antigenice a unor molecule ale suprafeei eritrocitare, sub aciunea unor medicamente care dup ce se adsorb pe suprafaa hematiei, acioneaz ca haptene, fie n stare nativ, fie dup generarea unui intermediar reactiv. Se formeaz conjugate hapten-proteine eritrocitare, n care haptena are rol de epitop stimulator al rspunsului imun. Alteori, molecula legat necovalent, acioneaz prin modificarea conformaiei native a proteinei. Noul epitop stimuleaz limfocitele TCD4, care activeaz limfocitele B. Se sintetizeaz anticorpi cu specificitate foarte larg: anticorpi anti-hapten care se leag cu conjugatul, anticorpi care reacioneaz cu proteinele membranare n absena haptenei. Dup fixarea complementului se produce hemoliza.Fig. 121. Reacia de hipersensibilitate de tip II, indus de medicamente. Molecula nativ sau un produs al metabolismului su, se poate lega de membrana eritrocitar sau de o protein plasmatic pentru a forma un complex care se leag de membrana eritrocitar sau altereaz proteina membranar. Se sintetizeaz auto-anticorpi IgG sau IgM care se fixeaz pe complex i activeaz complementul, producnd liza eritrocitului.

Medicamentele se pot complexa cu proteine plasmatice i formeaz conjugate hapten-proteine, inductoare ale sintetzei anticorpilor specifici. Se formeaz complexe imune, care se adsorb pe hematii i ulterior se produce liza.

Un anumit medicament poate produce o varietate de fenomene patologice, la diferii pacieni: hemoliza, trombocitopenia, neutropenia sau combinaii ale acestor fenomene.

Anemia hemolitic indus de medicamente este divizat n 4 grupe patofiziologice majore:

- hemoliza de tip haptenic apare la pacienii expui la doze mari de penicilin (10-20 milioane de uniti/zi). Moleculele de penicilin sau derivaii si activi se cupleaz cu glicoproteinele suprafaei eritrocitului i au rolul de hapten. Conjugatele stimuleaz rspunsul imun cu sintez de IgG. Diagnosticul se poate stabili prin incubarea serului pacientului cu eritrocitele de la un donor normal, preincubate cu penicilin. IgG se fixeaz pe suprafaa eritrocitelor tapetate cu penicilin i se detecteaz prin testul antiglobulinic (testul Coombs direct). Acelai tip de hemoliz este indus de cefalosporine;

- hemoliza de tip quinidinic. Quinidina sau derivaii si se fixeaz pe proteine plasmatice sau de membrana eritocitar i au rolul de haptene. Se sintetizeaz IgM antiquinidin, se activeaz calea clasic a complementului i C3 se depune pe suprafaa eritrocitului;

- hemoliza indus de -metildopa. O proporie mare (25%) dintre pacienii tratai cu -metildopa devin pozitivi pentru testul Coombs. Se sintetizeaz IgG specific fa de antigenul Rh. Hemoliza survine la mai puin de 1% dintre pacienii tratai cu -metildopa;

- hemoliza indus de cefalotin este rar. Antibioticul se fixeaz pe membrana eritrocitului i astfel celula se tapeteaz cu diferite proteine plasmatice. Se sintetizeaz IgG i testul antiglobulinic este pozitiv.

Majoritatea pacienilor cu anemie imunolaergic au un titru sczut al IgG i hemoliza are un nivel sczut. Tratamentul cu glucocorticoizi are efecte benefice, deoarece diminu sinteza de IgG, determin eluia IgG de pe suprafaa eritrocitelor i interfer cu receptorii macrofagelor pentru Fc , ceea ce prelungete perioada de supravieuire a eritrocitelor.

Respingerea acut a grefelor de esuturi i organe, ca o consecin a citotoxicitii, va fi discutat ulterior.

Reaciile citotoxice mediate de anticorpi specifici fa de antigenele tisulare sunt consecutive maladiilor autoimune.

Unele maladii autoimune sunt nsoite de sinteza anticorpilor anti-membran bazal. Regiunea Fc a anticorpilor fixai, este recunoscut de PMNN, care i revars coninutul enzimatic i

produc leziuni tisulare. Aciunea PMNN este frust, deoarece ele nu pot fagocita o int tisular de dimensiuni mari.

Reaciile de hipersensibilitate imediat de tip III

Hipersensibilitatea imediat de tip III este dependent de complexele imune i este consecina formrii i persistenei complexelor imune n organism.

In vivo, complexele imune se formeaz de fiecare dat cnd anticorpii ntlnesc antigenul specific. De obicei, complexele imune sunt epurate (eliminate din circulaie) de celulele SFM, iar persistena lor produce manifestri patologice (reacii de hipersensibilitate).

Complexele imune in vivo se formeaz n urmtoarele trei situaii:

- n infeciile cronice cu streptococ -hemolitic, cu stafilococ, cu Plasmodium, cu virusurile hepatitice B i C, cu HIV. In toate aceste cazuri, antigenele persist timp ndelungat. Se sintetizeaz anticorpi specifici i se formeaz complexe imune, care eventual se depun n esuturi;

- complexele imune pot fi rezultatul proceselor patologice autoimune. Sinteza continu a anticorpilor fa de componentele self modificate, determin formarea complexelor imune, care nu pot fi eliminate n ritmul formrii i se depun;

- complexele imune se pot forma cu antigenele exogene, care nu se multiplic n organism, dar ptrund n mod repetat, n cantitate mare. Astfel, antigenele vegetale, bacteriene (din actinomicete), fungice sau antigene de origine animal, dup inhalarea repetat n plmn, induc sinteza local a anticorpilor i formarea complexelor imune.

Complexele imune interacioneaz cu celulele sistemului imunitar (macrofage, limfocite), producnd activarea sau inactivarea lor. Un alt efect major este stimularea reelei citochinelor.

Proteinele plasmatice C1q, C4b, C3b, factorul H sau anticorpii anti-IgG(factorul reumatoid), anticorpii anti-idiotipici i anti-fibronectin mresc dimensiunile complexelor imune.

Complexele imune sunt structuri tridimensionale ce formeaz o reea molecular alctuit din antigen i anticorpii specifici, ale crei dimensiuni variaz n funcie de dimensiunile antigenului, de densitatea epitopilor imunogenici, de izotipul anticorpilor, de multi- sau monospecificitatea anticorpilor, de afinitatea lor.

Pentru demonstrarea complexelor imune in vivo, n ser sau n alte lichide ale organismului, n care antigenul nu este cunoscut, pot fi urmate dou ci: 1) estimarea cantitativ a complexelor imune, cu caracterizarea izotipului de imunoglobulin din complex i componentul complementului, utiliznd teste screening convenionale; 2) analiza specificitii anticorpilor i a antigenului complexat.

Testele screening rapide pentru detectarea complexelor imune se bazeaz pe capacitatea complexelor imune de a interaciona cu receptorii naturali, humorali i celulari. O tehnic clasic este testul legrii C1q, bazat pe capacitatea complexelor imune de a interaciona cu domeniul globular al lui C1q. C1q purificat, radiomarcat, se leag cu complexele imune i ansamblul rezultat se detecteaz prin metoda excluderii dimensionale cu PEG. O variant tehnic mai simpl const n amestecul unei concentraii mici de PEG, cu efect precipitant asupra complexelor macromoleculare i analiza ulterioar a precipitatului. AMC specifici fa de C1q imobilizai pe suport, pot fi utilizai pentru a capta C1q, fixat pe complexele imune in vivo, cu evidenierea ulterioar a imunoglobulinei din complex.

Alt metod pentru detectarea complexelor imune pe o faz solid, const n utilizarea conglutininei sau a factorilor reumatoizi, pentru captarea complementului legat cu complexele imune. Conglutinina este o protein din serul normal de bovine, cu proprietatea de a lega componentele complementului.

Complexele imune se pot detecta pe calea utilizrii interaciunii lor cu receptorul Fc de pe suprafaa macrofagelor sau plachetelor. Testul cel mai folosit se bazeaz pe folosirea receptorilor pentru C3bi de pe suprafaa celulelor limfoblastoide transformate in vitro. Testul inhibiiei rozetelor EAC (eritrocite-anticorpi-complement) msoar gradul inhibiiei formrii rozetelor, de ctre complexele imune, dintre o subpopulaie de limfocite B circulante i eritrocitele tapetate cu C3.

Epurarea complexelor imune i cauzele persistenei lor n organism

Complexele imune persist n organism, datorit incapacitii organismului de a le elimina. Rata eliminrii este dependent de mai muli factori:

- dimensiunile complexelor imune

- disponibilitatea proteinelor complementului

- izotipul anticorpilor.

Complexele Ag-Ac de dimensiuni mari sunt eliminate n cteva minute dup ce s-au format, iar cele de dimensiuni mici circul timp ndelungat. Orice factor care influeneaz dimensiunile complexelor imune, influeneaz rata clearance-ului. Anticorpii fa de antigenele self au adeseori, afinitate mic, ceea ce nseamn formarea complexelor imune mici, cu persisten ndelungat. In excesul antigenic, caracteristic infeciilor cronice sau maladiilor autoimune, situsurile de legare ale anticorpilor se satureaz i se formeaz, de asemenea, complexe imune de dimensiuni mici. Fig. 122. Formarea complexelor imune. Dimensiunile complexelor imune sunt de-pendente de valena anti-genului i anticorpilor. a. n excesul de anticorpi, epitopii sunt saturai i se formeaz complexe mici. b. La con-centraii echivalente se for-meaz o reea care aglutineaz sau precipit antigenul. c. n excesul de antigen, paratopii anticorpilor se satureaz i complexele imune sunt mici. d. Cu un antigen monovalent nu se produc legturi ncruciate i reacia secundar nu este vizibil.

Complexele imune ce se formeaz n mediul intern sau ptrund n circulaie, trebuie s ajung n organele care conin celule fixe ale sistemului fagocitar mononuclear. Cea mai mare parte a complexelor imune se leag pe receptorii de suprafa ai celulelor circulante, prin intermediul crora sunt transportate n compartimentul n care vor fi reinute de macrofagele fixe.

Complexele imune sunt legate pe receptorii celulelor din compartimentul de transport. Celulele transportoare ale complexelor imune sunt eritrocitele. Complexele imune opsonizate cu C3b sunt rapid epurate din circulaie, dup ce se fixeaz pe receptorul pentru C3b de pe suprafaa eritrocitelor (receptorul CR 1). Complexele imune mari sunt mai eficiente n legarea C3b i astfel sunt mai uor recunoscute de receptorul eritrocitar. Receptorul eritrocitar pentru C3b se gsete numai la primate. Neprimatele au receptor pentru C3b, numai pe plachete. Pe suprafaa unui eritrocit sunt 50-1000 de receptori. Sunt mobili i gruparea lor n zone membranare distincte (patch), permite legarea complexelor imune, cu mare aviditate. Rolul complementului n medierea legrii complexelor imune a fost sugerat de observaia c serul inactivat la 55o nu mediaz legarea, iar tratamentul prealabil al serului cu factorul veninului de cobr a avut acelai efect, ceea ce denot rolul lui C3.

Receptorii pentru C3 ai neutrofilului sunt mult mai numeroi (pn la 50000), dar rolul esenial n transportul complexelor imune revine eritrocitelor, datorit preponderenei lor numerice.

n capilare, eritrocitele circul n curentul axial al coloanei de snge i nu vin n contact cu celulele endoteliale. Contactul eritrocitelor cu endoteliul se produce n sinusoidele ficatului i splinei, dar i la situsurile la care curgerea sngelui devine turbionar (punctele de ramificaie arterial). n sinusoidele ficatului i splinei, eritrocitele se descarc de complexele imune. Tot aici sunt reinute eritrocitele mbtrnite. Complementul este foarte important, deoarece mediaz legarea complexelor imune, de macrofagele din sinusoidele splenice i hepatice. Insuficiena cantitativ a complementului diminu clearance-ul splenic, iar consecina este iniierea reaciilor mediate de complexele imune.

Complexele imune neopsonizate cu C3b pot fi rapid captate de ficat prin receptorii pentru Fc, dar ulterior se elibereaz i se depun n tegument, rinichi, articulaii, unde produc reacii inflamatorii.

Persistena complexelor imune este influenat de izotipul anticorpilor. Complexele cu IgG sunt eliminate mai eficient, iar cele cu IgA persist i se depun.

Deficienele funciei fagocitelor sistemului mononuclear, datorate suprancrcrii, sunt asociate cu creterea nivelului complexelor imune circulante.

Depozitarea. Incapacitatea sistemului de transport eritrocitar sau disfuncia diferitelor etape de prelucrare a complexelor imune n sistemul fagocitar mononuclear, poate duce la persistena complexelor imune n circulaie i depunerea lor n esuturi: tegument, articulaii, rinichi,

plmn, retin. Depunerea este favorizat de creterea permeabilitii vasculare. Rinichiul este organul de elecie al depunerii complexelor imune, factorul favorizant fiind presiunea sanguin de 4 ori mai mare n glomerulii vasculari, comparativ cu celelalte capilare. Dar cele mai severe leziuni se produc la situsurile unde circulaia sngelui produce curgere turbionar: la bifurcaia arterelor i n filtrele vasculare (plexurile coroide, corpul ciliar).

Depunerea preferenial a complexelor imune (n rinichi, articulaii, tegument) este determinat de natura antigenului din complexele imune. Complexele imune cu ADN se asociaz cu membrana bazal a capilarelor (renale, tegumentare)

Persistena ndelungat a complexelor imune la locul depunerii favorizeaz denaturarea IgG.

IgG denaturat induce sinteza auto-anticorpilor IgM anti-IgG, care poart denumirea de factor reumatoid (FR). Factorul reumatoid se sintetizeaz in situ (n articulaii), n plasmocitele din membrana sinovial.

Maladii determinate de complexele imune

Maladia pulmonar a fermierilor este indus de complexele imune cu anticorpi specifici fa de antigenele actinomicetelor. Actinomicetele se dezvolt abundent pe suprafaa materialelor vegetale. Sporii actinomicetelor termofile, inhalai odat cu praful, sunt principalii ageni inductori ai maladiei. Serul pacienilor, in vitro, precipit antigenele de actinomicete.

Maladia pulmonar a cresctorilor de psri este datorat complexelor imune formate in vivo cu antigene aviare. Prin expunerea repetat la antigenele aviare, se sintetizeaz IgG i se formeaz complexe imune. Pneumopatiile sunt produse de antigenele de la porumbei, papagali etc. Antigenele de la puii de gin induc sinteza anticorpilor precipitani, dar nu produc pneumopatii, deoarece complexele imune nu persist n organism.

Modelul experimental al maladiei cu complexe imune

Fenomenul Arthus este procesul de necroz tisular, ca o consecin a formrii complexelor imune in vivo, ntr-un teritoriu delimitat. Este o reacie de inflamaie acut, indus n tegumentul de iepure, prin injectarea repetat, n acelai loc, a serului de cal, consecutiv modificrilor vasculare i de aceea, reacia se produce numai n teritorii vascularizate. Este o reacie anafilactic local, n interiorul vaselor i n jurul pereilor vasculari. Fenomenul Arthus se evideniaz uor, la nivelul tegumentului.

Fenomenul se induce prin injectarea repetat la iepure, subcutan sau intradermic, a serului de cal, la interval de o sptmn, pn cnd n snge se realizeaz un titru ridicat al IgG anti-proteine heterologe de cal.

Dup primele 2-3 injecii sptmnale de antigen, nu se observ modificri tisulare. Dup a 3-a sau a 4-a injecie, la circa 30 de minute, local, apare un edem eritematos moderat care persist cteva ore. Dup injeciile urmtoare de antigen, edemul este tot mai extins i mai persistent. Dup 6-7 injectri, se produce necroza local a esutului.

Fenomenul Arthus este o reacie de hipersensibilitate local, caracterizat prin necroz dermic, la locul unde se injecteaz repetat, acelai antigen. Se sintetizeaz un titru crescut de anticorpi circulani, iar antigenul este n exces n spaiul extravascular. Se formeaz complexe imune solubile, datorit excesului de antigen.

Din punct de vedere histopatologic, fenomenul Arthus este o reacie inflamatorie clasic. La locul injectrii, iniial se produce un edem eritematos, curgerea sngelui fiind ngreunat. In lumenul vascular se formeaz trombi plachetari i leucocitari, datorit aderenei plachetelor i leucocitelor de celulele endoteliale: circulaia sngelui se ntrerupe i zona se necrozeaz.

Mecanismul celular i molecular al fenomenului Arthus. La locul injectrii repetate a antigenului se formeaz complexe Ag-Ac, cu IgG i IgM. Complexele imune se formeaz extravascular, cu anticorpii adui pe cale circulatorie, care trec n spaiul extravascular, datorit creterii permeabilitii vasculare. Complexele imune se depun pe membrana bazal a capilarului. Se activeaz cascada complementar i se elibereaz C3a i C5a. Anafilatoxinele mresc permeabilitatea vascular, dar sunt i factori atractani pentru leucocite (PMNN).

C3a i C5a activeaz mastocitele, din care se elibereaz histamina. Se sintetizeaz leucotriene i, alturi de histamin, mresc permeabilitatea vascular i determin aflux de PMNN n spaiul extravascular. Fig. 123. Fenomenul Arthus. Antigenul injectat pe cale intradermic se leag cu anticorpii circulani specifici i formeaz complexe imune. Complexele activeaz complementul i activeaz plachetele, care elibereaz aminele vasoactive. Fragmentele C3a i C5a ale complementului provoac o retracie a celulelor endoteliale, degranularea mastocitelor i atragerea polinuclearelor spre situsul de reacie. Produsele eliberate de mastocite, n special histamina i leucotrienele, induc creterea debitului sanguin i a permeabilitii capilare. Reacia inflamatorie este amplificat de enzimele lizosomale eliberate de polinucleare. C3b opsonizeaz complexele imune i uureaz fagocitarea lor (dup Roitt, 1984).

Din mastocite se elibereaz factorul de agregare plachetar (PAF), iar din plachete se elibereaz amine vasoactive. PMNN extravasculare descarc coninutul enzimatic i lezeaz peretele capilar.

Injectarea intradermic a antigenelor fungice sau de actinomicete, la indivizii cu aspergiloz pulmonar i respectiv la cei cu plmn de fermier, produce reacii de hipersensibilitate de tip Arthus.

Ca mecanism intim, fenomenul Arthus este o reacie de hipersensibilitate imediat, deoarece complexele Ag-Ac se formeaz foarte repede, dar manifestarea fenomenului (eritem i edem) este tardiv.

Fenomenul Arthus poate fi transferat pasiv la animale neimunizate, astfel:

- prin injectarea intravenoas a serului de la un organism la care s-a indus fenomenul Arthus, urmat imediat de injectarea intradermic a antigenului declanator;

- prin injectarea intradermic a antigenului, urmat de injectarea intravenoas a serului, obinut de la un organism imunizat fa de antigenul specific.

Modelul clinic al maladiei cu complexe imune

Maladia serului este un fenomen Arthus generalizat, provocat artificial, ca o consecin a utilizrii terapeutice a unui ser imun heterolog.

Serurile imune sunt preparate pe diferite animale (cal, berbec, capr, iepure), n institutele de profil. In perioada 1920-40, naintea introducerii antibioticelor n terapia anti-infecioas, serurile imune s-au folosit pe scar larg, pentru a conferi imunitate pasiv fa de un agent patogen sau o toxin a acestuia.

Dup un interval variabil, primitorii de ser prezint un sindrom caracteristic, denumit boala serului: febr, adenopatie (creterea volumului ganglionar), splenomegalie, eritem i urticarie tegumentar, proteinurie, uremie.

n primele 6 zile dup administrarea serului heterolog, nivelul proteinelor serice heterologe din ser scade foarte lent. Incepnd din ziua a 8-a, nivelul lor scade mai rapid, deoarece proteinele strine ncep s fie eliminate prin formarea complexelor imune. Dup 10 zile de la administrarea serului heterolog (de cal), antigenul liber dispare din circulaie. Proteinele serice heterologe sunt imunogene i induc sinteza anticorpilor, cu care formeaz complexe imune, n excesul de antigen. Odat cu formarea complexelor imune, apar i semnele maladiei serice.

La om, maladia serului se prezint modificat, ori de cte ori se repet injeciile de ser. Manifestrile clinice iau aspectul unei reacii anamnestice generalizate (reacie de hipersensibilitate imediat).

Se descriu trei tipuri de reacii:

- reacia de tip imediat se desfoar n 24 de ore, chiar cu necroz tisular la locul injectrii serului. Se manifest la persoanele la care reinjecia de ser se face la 12-18 zile de la prima injecie de ser heterolog;

- reacia de tip accelerat, cu incubare de 2-6 zile, la persoanele la care reinjecia de ser heterolog survine la 2-6 luni de la prima injecie. Reacia local (la locul injectrii serului) este foarte puternic. Moartea poate s survin prin colaps vasomotor;

- o reacie dup dinamica rspunsului imun primar, la 20-25 de zile, se manifest dup administrarea unei singure injecii de ser heterolog i se produce la 50% dintre indivizi.

Mecanismul manifestrilor patologice ale maladiei serului, rezid n aciunea complexelor imune asupra vaselor sanguine. n snge se formeaz complexe Ag-Ac, care se depoziteaz lent n vasele mici (capilare), ntre endoteliul vascular i membrana bazal, mai ales n ansele glomerulare renale.

Tipul de leziuni renale este dependent de dimensiunile complexelor imune. In condiiile excesului de antigen, complexele imune sunt mici i se depoziteaz n spaiul subepitelial, complexele mari se depun subendotelial.

Complexele depozitate activeaz complementul i determin eliberarea anafilatoxinelor C3a i C5a, care produc degranularea mastocitelor i bazofilelor. Crete permeabilitatea vascular i sunt atrase neutrofilele. Ele inger complexele imune i elibereaz enzimele lizosomale, care lizeaz celulele endoteliului vascular i intensific reacia inflamatorie. Proteinuria nsoete leziunea glomerular.

Pentru depistarea predispoziiei la accidentele serice de hipersensibilitate fa de serul de cal se utilizeaz diferite teste:

- proba oftalmic const n depunerea unei picturi de ser heterolog diluat 1/10, pe conjunctiva primitorului de ser. La persoanele hipersensibile, n 30 de minute apare un eritem intens i edem;

- proba cutanat const n injectarea intradermic a cantitii de 0,1 ml ser heterolog diluat 1/10. La hipersensibili, la locul injectrii, apare o reacie imediat, n 20-30 de minute, cu erupie urticarian, nconjurat de o zon de eritem. Reacia dispare n 30-60 de minute. Dac este intens, reacia dureaz 6-12 ore.

Din cauza reaciilor de hipersensibilitate de tipul maladiei serului, seroterapia trebuie s utilizeze seruri omologe.

Maladia serului se induce experimental, la iepure, prin injectarea intravenoas a albuminei serice bovine. Se sintetizeaz anticorpi specifici, care leag antigenul n exces. Complexele imune, neputnd fi eliminate cu o rat egal cu cea a formrii, se depoziteaz pe membrana bazal a glomerulilor renali i n peretele vaselor mici. Complexele imune fixeaz complementul i se elibereaz lent histamina din bazofile.

Reaciile de hipersensibilitate de tip IV (Hipersensibilitatea ntrziat)

Hipersensibilitatea ntrziat cuprinde toate reaciile care, dup clasificarea lui Coombs i Gell (1963), necesit mai mult de 12 ore pentru a deveni evidente.

Reaciile de hipersensibilitate ntrziat au urmtoarele particulariti:

- apariia lor este lent i atinge amplitudinea maxim la 24-72 de ore de la contactul secundar cu antigenul;

- reacia de hipersensibilitate ntrziat nu afecteaz un anume organ int, ci este o stare cu rsunet sistemic, cu simptome generalizate, ceea ce o deosebete de reaciile de hipersensibilitate imediat;

- n reaciile de hipersensibilitate ntrziat nu se produce liz celular, cu excepia cazurilor grave;

- reaciile de hipersensibilitate ntrziat nu sunt dependente de factorii humorali (anticorpi) i de aceea nu se transfer prin intermediul serului. Sunt dependente de limfocitele T sensibilizate i se transfer prin suspensia celular din exudatul inflamator (exudat peritoneal), bogat n limfocite i macrofage;

- nefiind dependent de molecule proteice circulante, reaciile de hiper-sensibilitate ntrziat se manifest n esuturile vascularizate i nevascularizate.

Declanatorii reaciilor de hipersensibilitate ntrziat

Declanatorii acestor reacii sunt foarte diferii, dar au o caracteristic funcional comun, ce const n aceea c devin stimuli cronici:

- substane anorganice: HgCl2, sulfat de nichel, compui ai cromului, coloranii de anilin;

- glucidele, cu rol de haptene, dup ce in vivo se complexeaz cu o protein purttor;

- substane proteice produse de M. tuberculosis (tuberculina), de Brucella (brucelina), dar i celulele ntregi, al cror perete este rezistent la aciunea anticorpilor i a complementului: celule de M. tuberculosis, vaccinul BCG, M. leprae, Streptococcus, Staphylococcus, Treponema, Bordetella, Brucella, Listeria, Salmonella.

- fungii Candida, Histoplasma;

- paraziii Schistosoma, Plasmodium, Toxoplasma, Leishmania;

- virusuri: rujeolic, herpetice, adenovirusuri etc;

- antigenele celulare din grefele de esuturi i organe.

Modul de administrare a antigenului influeneaz reactivitatea imunitar. Asocierea antigenului cu adjuvantul Freund complet, favorizeaz reacia de hipersensibilitate ntrziat, iar injectarea intravenoas este defavorabil

acestui proces.

Reaciile de hipersensibilitate imediat i ntrziat coexist pentru orice antigen, cu predominana uneia sau alteia, fr s se exclud complet.

Se cunosc trei tipuri de reacie de hipersensibilitate de tip ntrziat:

- reacia ntrziat de tip tuberculinic

- hipersensibilitatea ntrziat de contact. Ambele tipuri de reacie apar la 48-72 de la reexpunerea la antigen;

- hipersensibilitatea ntrziat granulomatoas se manifest n 21-28 de zile. Granuloamele se formeaz prin agregarea i proliferarea macrofagelor i pot s persiste un interval de mai multe sptmni.

1. Reaciile de hipersensibilitate ntrziat de tip tuberculinic

Hipersensibilitatea ntrziat este o reacie caracterizat printr-un proces inflamator, care devine vizibil macroscopic la 6-12 ore dup contactul secundar cu antigenul i atinge intensitatea maxim la 24-72 de ore. Histologic se caracterizeaz prin infiltrare limfocitar i mononuclear.

Cea mai cunoscut reacie de hipersensibilitate ntrziat este cea indus de tuberculin, dar antigene ca lepromina, brucelina, histoplasmina, diferite componente ale celulelor de Candida etc., produc reacii asemntoare

Tuberculina este o substan proteic, netoxic, pe care celulele de M. tuberculosis o elimin extracelular. Este inofensiv pentru organismele umane care nu au experiena antigenic a contactului cu M. tuberculosis sau cu componente antigenice ale celulelor sale.

R. Koch a descoperit tuberculina, dar i reaciile de hipersensibilitate ntrziat la tuberculin, n experiene de genul urmtor:

- a inoculat subcutan n regiunea coapsei cobailor normali, o suspensie de celule vii de M. tuberculosis. Celulele bacteriene se multiplic local i determin o reacie inflamatorie n ganglionii regionali. Se produce adenopatia tuberculoas (creterea volumului ganglionar). Infecia progreseaz lent, se generalizeaz i dup cteva luni, animalul moare;

- la 2-3 sptmni de la prima inoculare, R. Koch a reinoculat cobaii cu o nou doz de celule de M. tuberculosis, vii sau omorte.

La locul celui de al II-lea inocul se produce o reacie ampl, caracterizat prin inflamaie masiv n cteva ore, ce progreseaz rapid i n 2-3 zile determin necroza zonei nvecinate, urmat de eliminarea brutal a esutului.

Reacia de necroz i eliminare tisular, cu o delimitare foarte net fa de esutul nconjurtor, a fost denumit fenomenul Koch.

Fenomenul Koch este o reacie de hipersensibilitate ntrziat i poate fi reprodus prin injectarea corpilor celulari de M. tuberculosis, fie numai a tuberculinei.

La organismele infectate sau care au experiena anterioar a contactului cu antigene de M. tuberculosis (dobndit prin vaccinare), reinjectarea celulelor de M. tuberculosis, vii sau moarte ori a tuberculinei, determin o reacie de hipersensibilitate ntrziat sever, cu producerea leziunilor tisulare ce se succed astfel: induraie local, eritem cu reacie inflamatorie intens, puroi i necroz, n cazul n care reacia este intens pozitiv. Fenomenul Koch este detrimental pentru gazd, pentru c M. tuberculosis se multiplic repede n esutul necrotic.

Reacia este local, dar injectarea unei cantiti mari de tuberculin la un organism sensibilizat, poate produce o reacie sistemic (generalizat), urmat de oc grav i moarte.

Dup contactul secundar cu antigenele de M. tuberculosis se produc dou tipuri de rspuns:

- o reacie local, cu apariia unei congestii i a unui edem la locul injeciei, nsoit de o adenopatie local;

- o reacie focal, ce const n activarea focarelor de tuberculoz latent, eventual existente n organism. Focarele latente se activeaz, printr-o reacie inflamatorie local.

Reacia de hipersensibilitate la tuberculin nu a fost interpretat corect de descoperitorul ei. Koch a injectat tuberculina, ca vaccin, n scop imunoterapeutic, la bolnavii de tuberculoz. Consecina a fost reactivarea focarelor de latente de infecie tuberculoas la cei vindecai clinic (asimptomatici) i agravarea tuberculozei la pacienii cu proces infecios evolutiv.

Bacilul M. tuberculosis nu are efecte toxice directe asupra celulelor infectate, dar reaciile de hipersensibilitate celular pot s determine leziuni tisulare i chiar necroz. De aceea, dup contactul primar, efectele antigenelor de M. tuberculosis sunt minime sau absente.

Efectorii celulari ai reaciilor de hipersensibilitate ntrziat

Celulele efectoare ale reaciei de hipersensibilitate ntrziat sunt de dou categorii:

- celule de origine sanguin: limfocite T sensibilizate, care recunosc specific antigenul, monocite, bazofile, neutrofile;

- celule rezidente tisulare: celule endoteliale vasculare, macrofage tisulare (care nglobeaz antigenul, l prelucreaz i l prezint limfocitelor T), mastocite (i elibereaz coninutul i modific permeabilitatea capilarelor).

Recrutarea bazofilelor i neutrofilelor este mediat de chemoatractanii produi n focar, iar limfocitele T activate produc factori de inhibare a migrrii. Infiltratul celular format din monocite i limfocite ptrunde n derm i dezorganizeaz fasciculele de colagen, sub aciunea

enzimelor eliberate de macrofage. Monocitele i limfocitele infiltratului se gsesc n proporii egale. In teritoriul focarului inflamator, monocitele se difereniaz n macrofage.Fig. 124. Bazele celulare ale hipersensibilitii de tip IV.

Macrofagele, celulele dendritice i posibil chiar limfocitele B preiau moleculele de tuberculin, le prelucreaz i le expun n asociaie cu moleculele CMH II. Antigenul este recunoscut de limfocitele TCD4 i elibereaz limfochine (IL-2, ifn ), cu efect activator asupra macrofagelor, pe care le rein n focarul inflamator.

Reacia inflamatorie, caracterizat anatomic prin edem i eritem, atinge intensitatea maxim la 48-72 de ore. Dac antigenul este degradat, ulterior, intensitatea reaciei de hipersensibilitate ntrziat diminu treptat. Dac antigenul nu poate fi eliminat, persistena lui determin reacia granulomatoas, cea mai important form de manifestare a hipersensibilitii ntrziate.

2. Reacia de hipersensibilitate ntrziat de tip granulomatos

Reacia granulomatoas este produs de antigene persistente, fiind cea care determin efectele patologice ale infeciei cu M. tuberculosis sau cu M. leprae. Granuloamele tuberculos i lepros sunt cele mai cunoscute.

Persistena celulelor de M. tuberculosis i M. leprae este atribuit unor factori care mpiedic fuziunea lizosomilor cu vacuola de fagocitoz. Uneori este posibil chiar multiplicarea celulelor de Mycobacterium.

Granulomul este indus nu numai de persistena celulelor de Mycobacterium, ci i de ncrcarea macrofagelor din focar, cu pulberi nedegradabile (talc, siliciu, azbest, crbune).

Granulomul pulmonar este tipic pentru natura sa imunitar i este consecina reaciei inflamatorii cronice a esutului care nconjur celulele infectate cu M. tuberculosis. Granulomul este o

structur care izoleaz celulele infectate cu M. tuberculosis i previne diseminarea lor, fiind alctuit din dou categorii de celule: macrofage i limfocite T.

Macrofagele infectate cu M. tuberculosis se hipertrofiaz i dobndesc caractere morfologice epitelioide sau fuzioneaz i formeaz celule gigante. Ele ocup o poziie central n granulom, iar limfocitele sunt situate la periferie. In jurul celulelor din focar, fibroblastele prolifereaz i sintetizeaz colagen, formnd un esut fibros de acoperire.

Granuloamele care conin bacili de M. tuberculosis rmn latente pentru zeci de ani, la circa 90% dintre cei aproximativ 2 miliarde de indivizi umani infectai, cu focare de tuberculoz latent, dar fr manifestri clinice. La restul de 10%, celulele centrale ale granulomului se lizeaz din mai multe cauze: lipsa O2, proliferarea bacililor tuberculoi, aciunea TNF i a limfocitelor Tc. Consecutiv lizei celulelor din centrul granulomului, se formeaz granuloame cazeoase (de consistena cheagului de cazein), n interiorul crora celulele de M. tuberculosis se dezvolt foarte bine. Dup ruperea peretelui fibros, bacilii se disemineaz prin contiguitate n esutul adiacent, pe cale sanguin, n alte organe sau pe cale aerian, la ali indivizi.

Raporturile numerice i funcionale dintre limfocite i macrofage, determin intensitatea reaciilor de hipersensibilitate ntrziat i condiioneaz chiar formarea granulomului. Argumentul este infecia cu M. leprae, care determin dou tipuri extreme de manifestri:

- lepra leproid, asociat cu leziuni multiple i un numr enorm de bacili n leziuni. Testul la lepromin este pozitiv. Proliferarea bacilililor produce leziuni tegumentare distribuite difuz sau localizate n noduli. Un numr enorm de bacili de M. leprae se gsete n granuloamele lepromatoase (peste 1010/gram de esut). Granuloamele sunt formate din macrofage inactive, gigante, provenite prin fuziune, ncrcate cu bacili. Lipsete infiltratul limfocitar, ceea ce dovedete absena imunitii mediate celular. S-a demonstrat anergia celulelor T, cu specificitate fa de antigenele bacilului leprozei. Anergia IMC este explicat prin predispoziia genetic, prin deleia clonal a celulelor T specifice fa de antigenele de M. leprae i prin funcia inhibitorie a celulelor Ts specifice. Macrofagele sunt pline cu bacili i chiar dup chimioterapie prelungit, bacilii sunt eliminai lent.

- lepra tuberculoid este o boal localizat, cu granuloame bine organizate, n care macrofagele sunt difereniate n celule epitelioide, celule gigante Langhans active, care omoar i diger bacilii de M. leprae. Infiltratul limfocitar al granulomului este intens, cu predominana limfocitelor TCD4, care secret interferon gama. Interferonul activeaz macrofagele din focar, devenind capabile s inhibe creterea i diviziunea celulelor de M leprae. La periferia granulomului se gsesc limfocite TCD8. Leziunile nervilor se datoreaz proliferrii bacililor i rspunsului IMC, n situsuri adiacente filetelor nervoase.

Dei intensitatea reaciei de hipersensibilitate ntrziat este reflectarea direct a gradului de activare a limfocitelor TCD4, ea nu confer totdeauna imunitate. Strile de hipersensibilitate ntrziat i de imunitate nu se induc reciproc.

Macrofagele activate de limfocite pot nu numai s inhibe creterea i diviziunea celulelor de Mycobacterium, dar pot s produc leziuni tisulare, consecutiv eliberrii coninutului lor enzimatic i prin producerea intermediarilor reactivi ai reducerii O2.

Teste in vivo pentru detectarea hipersensibilitii ntrziate

Pentru testarea reaciei de hipersensibilitate ntrziat la tuberculin, se folosesc dou tipuri de preparate:

- tuberculina Koch (alt = old tuberculin) este filtratul brut al culturii de M. tuberculosis n mediul lichid, vechi de cteva sptmni, concentrat n baie de vapori la 1/10 din volumul iniial;

- substana activ denumit PPD (purified protein derivative), de natur proteic. Produsul este parial purificat din culturile de M. tuberculosis autoclavate, prin precipitare cu sulfat de amoniu, fiind un amestec al mai multor fragmente proteice cu greutatea moecular de 5000 D. Nu se cunosc epitopii declanatori ai activrii limfocitelor TCD4. Se pstreaz n stare liofilizat.

Cel mai folosit este testul intradermic (intradermoreacia = IDR), denumit i testul Mantoux, ce const n injectarea unui volum de 0,1 ml din preparatul de PPD. Reacia se citete la 24-48 de ore. Se apreciaz aria eritemului, gradul infiltraiei dermice (edemul) sau chiar necroza tisular indus de antigenul test.

La persoanele pozitive pentru reacia de hipersensibilitate ntrziat, apare o induraie local (ntrire a esutului) eritematoas. Zonele de induraie de 0,5 cm sau mai mari sunt nregistrate ca pozitive. Reacia de intensitate medie dispare n 2-3 zile i denot c organismul a fost vaccinat. La cei cu reacie intens pozitiv, manifestrile sunt mai severe, cu febr uoar, alterarea strii

generale, dureri ale membrelor, ce se instaleaz dup 24 de ore. La locul injectrii tuberculinei, esutul se necrozeaz. Reacia ampl se datoreaz focarelor multiple latente de tuberculoz, existente n organism.

n absena reaciei tisulare (absena edemului i a eritemului), reacia de hipersensibilitate ntrziat este negativ. Semnificaia este c persoana nu are experiena contactului anterior cu antigenele de M. tuberculosis, nici prin vaccinare i nici prin infecie natural.

Testul alergiei de contact se folosete pentru evaluarea alergiei tegumentare i const n impregnarea unei fibre textile cu tuberculin (sau cu oricare substan test), fixat pe leucoplast i aplicare tegumentar pentru o perioad mai lung de timp. Alergenul ptrunde n tegument. La 48-72 de ore apar reacii eritematoase.

Aceleai teste se folosesc pentru evaluarea gradului de sensibilizare a organismului fa de Brucella, L. monocytogenes, T. pallidum, fa de boli parazitare (toxoplasmoz, malarie etc.), fa de infeciile virale, fungice.

In vitro, cel mai folosit este testul proliferrii limfocitelor. Suspensia de limfocite se obine din snge i se cultiv n mediu cu ser de viel i antibiotice. Celulele sunt stimulate cu PHA, Con A, PWM sau cu preparate antigenice din Candida, anatoxin tetanic, PPD sau orice antigen relevant pentru maladia pacientului. In studiile cu lectine mitogene, celulele se marcheaz cu timidin H3 i culturile se sacrific la 2-3 zile. Culturile stimulate cu antigene se sacrific la 6-7 zile.

Sinteza ADN n culturile stimulate cu mitogen sau cu antigene, se compar cu sinteza ADN n cultura martor.

PHA i Con A sunt mitogeni ai limfocitelor T. PWM induce proliferarea i maturarea limfocitelor B, dar rspunsul lor necesit funcia accesorie a limfocitelor T.

n culturile stimulate cu antigene, prolifereaz limfocitele TCD4. Rspunsul limfocitelor reflect gradul de sensibilizare printr-o expunere anterioar a subiectului, la antigenul test.

Rspunsul limfocitelor T la aloantigene se msoar n reacia limfocitar mixt (RLM), n care celulele de la doi indivizi se cultiv mpreun. In reacia unidirecional, una din cele dou

populaii de limfocite se inactiveaz prin iradiere sau tratament cu mitomicin C. Ele nu sintetizeaz ADN propriu, dar stimuleaz limfocitele celeilalte populaii. Sinteza ADN se determin prin msurarea H3, dup cel mult 7 zile. In RLM prolifereaz limfocitele TCD4 i TCD8.

3. Hipersensibilitatea de contact (dermatita de contact)

Hipersensibilitatea de contact, la om, se prezint ca o inflamaie a tegumentului, adic o leziune tegumentar cu eritem, edem moderat i distrugerea epiteliului la locul de contact cu alergenul. Reacia este maxim la 48-72 de ore dup contactul secundar.

Dermatita alergic de contact este o form de hipersensibilitate ntrziat i este rezultatul sensibilizrii limfocitelor. Unele haptene (de exemplu, dinitroclorbenzenul), sensibilizeaz aproape toi indivizii umani.

Moleculele inductoare ale hipersensibilitii de contact sunt mici (sub 1 kD), dar se comport ca haptene: compui ai Ni, Co, Cr (bicromatul de K), ai Hg, cauciucul, compui acrilici, esenele de lemn care conin substane toxice (oetar veninos, stejar veninos), formolul, unele substane cosmetice, diferite rini, unii colorani(de anilin), pesticide, antiseptice, antibiotice, anestezice.

Reacia de hipersensibilitate de contact se desfoar n dou faze:

1) Faza de sensibilizare (faza contactului primar). Moleculele mici (mai mici de 500 D) de orice provenien, traverseaz tegumentul i se leag covalent sau necovalent cu proteine tisulare constitutive, n special cu colagenul, prin gruparea NH2 a lizinei. Astfel se formeaz, in vivo, un conjugat hapten-protein, recunoscut de sistemul imunitar al tegumentului. Celulele Langerhans, localizate n straturile suprabazale ale epidermei sunt principalele celule prezentatoare ale antigenului. Ele exprim la nivel membranar, molecule CMH II, precum i receptori pentru regiunea Fc i pentru componentele complementului. In faza de sensibilizare, celulele Langerhans transport conjugatul antigenic, fie internalizat, fie asociat membranei, de la nivelul tegumentului, n ganglionii limfatici regionali. Fig. 125. Migrarea celulelor Langerhans din epiderm, n ganglionul limfatic. Antigenele sunt prelucrate n epiderm de ctre celulele Langerhans i stimulii produi de cheratinocite, stimuleaz migrarea celulelor n ganglionii limfatici, unde se difereniaz n celule dendritice prezentatoare de antigen. Celulele Langerhans sunt nlocuite de precursori derivai din monocitul circulant (dup Sminia, 1998).

Antigenul sensibilizant este recunoscut de limfocite T neangajate (naive). Ele se activeaz la distan de locul ptrunderii antigenului, n ganglionii limfatici regionali. In ganglioni, antigenul este prezentat limfocitelor TCD4. Celulele T sunt prezente n tegument (i n alte esuturi), n numr nesemnificativ, dar n ganglioni, contactul celulelor T cu celulele prezentatoare de antigen este foarte mult uurat de densitatea mare a ambelor tipuri celulare. In rspunsul imun primar, stimularea celulelor T poate s nu fie evident, deoarece se produce n ganglioni i nu la locul contactului cu antigenul. Celulele T neangajate, de dimensiuni mici, se activeaz, se produce expansiunea clonal i diferenierea n celule efectoare i celule de memorie cu specificitate fa de hapten. Numrul lor crete cu cteva ordine de mrime. Din ganglion, celulele T sunt diseminate n sngele periferic, iar de aici, probabil prin homing specific, n tegument la situsul de contact cu antigenul, unde elibereaz citochine.

ntre contactul sensibilizant i cel de al II-lea contact este necesar un interval de 10-14 zile.

2) Reacia propriu-zis se produce dup cel de al II-lea contact cu alergenul i se exprim ca o dermatit. Dup stimularea secundar cu antigenul, se produce inflamaia deschis a pielii (leziunea tegumentar).Fig. 126. Reprezentare schematic a etapelor succesive ce duc la manifestarea dermatitei alergice de contact.

Celulele Langerhans care au legat conjugatul hapten-protein, se deplaseaz din epiderm spre derm i secret mediatori atractani pentru limfocitele TCD4 de memorie. Acestea secret IFN , care determin exprimarea moleculelor CMH II pe suprafaa cheratinocitelor i a celulelor endoteliale ale capilarelor dermice. n condiii patologice, cheratinocitele exprim molecule CMH II i pot s prezinte antigenul. Ele se activeaz i secret IL-1 i alte interleuchine. IL-1 stimuleaz celulele Langerhans i limfocitele infiltrate n aria de contact cu antigenul. Interleuchinele sunt factori atractani pentru macrofage i limfocite, fr specificitate de antigen. Aceste celule infiltreaz dermul i epidermul n 48 de ore. Majoritatea celulelor infiltrate sunt limfocite TCD4, iar circa 99% dintre ele nu au specificitate fa de antigen. In infiltrat lipsesc PMNN. Mecanismul principal pentru recrutarea celulelor T, este activarea independent de specificitatea antigenic.

Celulele infiltrate limfocite i macrofage secret factori cu aciune litic asupra celulelor epidermice.

Un mecanism alternativ al producerii leziunii, const n aciunea limfocitelor T de memorie. Reacia inflamatorie local este iniiat de un numr minim de limfocite T de memorie, teoretic una singur. Dup contactul primar cu alergenul, n aria tegumentar migreaz un numr mic de limfocite T de memorie. Celulele T de memorie sunt stimulate secundar pe calea receptorului specific. Dup stimulare, secret citochine atractante pentru celulele efectoare nespecifice (limfocite i macrofage).

La om, dermatitele de contact sunt profesionale: dermatita la ciment, la uleiuri minerale, la medicamente, la colorani etc.

Testarea hipersensibilitii de contact se face prin aplicarea substanei direct pe tegument. Reacia se citete dup 48 de ore. Reacia pozitiv este nsoit de eritem i de erupie vezicular.

2 Icterul semnific apariia n snge a pigmenilor rezultai din degradarea hemoglobinei (bilirubina, biliverdina) i colorarea tegumentului i conjunctivei.

3 Factorul antigenic Rh nu este unic, ci constituie un sistem complex, format din mai multe subuniti antigenice. Dintre toate componentele antigenice ale sistemului Rh, antigenul Rho (sau D) este cel mai puternic i cel mai important pentru clinic. Subunitile antigenice ale factorului Rh se noteaz cu A, B, C, D, F. Persoanele Rh-, transfuzate cu snge Rh+, prezint riscul de a sintetiza anticorpi anti-Rh, n proporie de 50-80%. Din acest motiv, persoanele Rh-, trebuie transfuzate numai cu snge Rh-. Uneori, complexul antigenic Rh este incomplet, adic lipsesc anumite subuniti din structura sa. Absena lor fenotipic se noteaz cu a, b, c, f. De exemplu, absena primelor dou subuniti, genereaz un factor care se noteaz RhabCDF. Persoanele care posed antigenul Rh incomplet, dup transfuzia cu snge RhABCDF se imunizeaz i produc anticorpi fa de subunitile antigenice care le lipsesc. Factorul Rh incomplet are o imunogenitate mai slab i se noteaz cu Du.

2. CONFLICTUL IMUNITAR IN VIVO.

MALADIILE AUTOIMUNE

n 1900, Ehrlich i Morgenroth au formulat conceptul horror autotoxicus, care semnific faptul c, n mod normal, organismul i tolereaz propriile componente, pe care le protejeaz fa de autodistrugerea pe calea efectorilor rspunsului imun. Sistemul imunitar este tolerant fa de componentele proprii. Starea de toleran fa de self se instaleaz n cursul dezvoltrii embrionare. Una din axiomele Imunologiei este c, la organismele cu reactivitate imunitar normal, nu se produc anticorpi fa de constituienii proprii organismului. Totui, autoanticorpii apar mai ales la persoanele n vrst: sunt autoanticorpi anti-hematii sau anti-membran bazal glomerular.

Starea de toleran perfect a sistemului imunitar fa de componentele self, este perturbat n unele situaii n care se sintetizeaz autoanticorpi sau se difereniaz limfocite autoreactive, care nu mai recunosc selful. Prin extinderea efectelor sale, starea de autoreactivitate imunitar genereaz maladiile autoimune. Maladiile autoimune, n esen, se caracterizeaz prin expansiunea proliferativ a limfocitelor reactive fa de componentele self.

Reactivitatea imunitar fa de self nu s-a evideniat niciodat ca fiind factorul iniiator primar al maladiilor autoimune, chiar dac self-reactivitatea a amplificat manifestrile patologice cu componente autoimune. Exist maladii cu fenomene autoimune bine exprimate, dar etiologia lor primar nu se cunoate.

Mecanisme ipotetice ale iniierii conflictului autoimun

Mecanismele celulare i moleculare prin care este perturbat starea de toleran a sistemului imunitar fa de self, nu se cunosc, dar faptele de observaie au condus la urmtoarele ipoteze:

a) Eliberarea antigenului sechestrat. Starea de toleran fa de self se induce n timpul dezvoltrii embrionare. Antigenele sechestrate sunt acelea care, prin localizarea sau prin

particularitile de vascularizaie ale unui esut, sunt inaccesibile recunoaterii de ctre celulele limfoide, n perioada dezvoltrii embrionare. Ele au localizare intracelular sau sunt delimitate prin bariere anatomice. In situaii normale, antigenele sechestrate nu stimuleaz nici starea de toleran i nici nu induc rspunsul imun, datorit absenei contactului lor cu limfocitele. Din diferite cauze (traumatisme, intervenii chirurgicale, procese infecioase), antigenele sechestrate se elibereaz i devin accesibile limfocitelor, declannd rspunsul imun. Un astfel de mecanism patogen s-a presupus c este activ n generarea oftalmiei imune i n aspermia autoimun a tubilor seminiferi. Proteinele cristalinului, n cursul interveniilor chirurgicale, dup traumatismele ce sparg capsula sau dup afeciunile care permeabilizeaz cristaloida, se comport ca antigene care declaneaz un rspuns imun anti-cristalin. Astfel, pot fi afectate irisul, procesele ciliare, coroida. Proteinele spermatice, n cazurile de spermostaz, induc sinteza local a anticorpilor n structurile epididimului. Anticorpii reacioneaz cu antigene acrosomale sau flagelare ale spermatozoizilor i produc imobilizarea sau chiar aglutinarea lor, consecina fiind sterilitatea autoimun. Prin acelai mecanism, al eliberrii antigenului sechestrat, se pot declana alte maladii autoimune: afeciuni demielinizante ale SNC, tiroidita Hashimoto. Sistemul nervos central i tiroida sunt delimitate de bariere anatomice etane, care nu permit accesul efectorilor sistemului imunitar. Dup traumatisme, intervenii chirurgicale sau consecutiv unor infecii distructive, antigenele specifice acestor esuturi, se pot elibera i ptrund n circulaie. Fa de ele se poate declana rspunsul imun, generator al maladiilor demielinizante cu component autoimun i al tiroiditei autoimune.

b) Pierderea strii de toleran, ca mecanism posibil al generrii strilor de autoimunitate, este tot mai mult acceptat. Datorit unor mutaii, ar fi posibil apariia clonelor de celule limfoide imunocompetente, care pierd proprietatea de toleran fa de self. Limfocitele T i B autoreactive, genereaz efectorii rspunsului imun care interacioneaz specific cu componentele self. Apariia clonelor autoreactive ar fi asociat cu un deficit al celulelor Ts, precum i cu activarea celulelor Th.

c) Modificarea structurii chimice a antigenelor proprii (teoria selfului alterat). Sub aciunea unor factori fizici (arsuri, radiaii), biologici de natur infecioas (bacterii, virusuri, fungi) sau a unor substane chimice (medicamente), proteinele proprii se modific i expun determinani antigenici interni sau se altereaz configuraia lor molecular. Moleculele modificate devin autoantigene.

Virusurile nvelite au un rol important n generarea autoanticorpilor, deoarece, pe suprafaa celulelor infectate sunt expuse antigene virale, care pot s modifice specificitatea antigenic a moleculelor proprii membranei celulare. Virusurile nvelite nmuguresc prin membranele celulei gazd i pot ncorpora proteine ale membranei celulare. Virusul este neutralizat de anticorpi, iar complexul imun este ingerat de macrofag prin intermediul receptorilor pentru Fc. Odat cu glicoproteinele virale, pe suprafaa macrofagului vor fi expuse i glicoproteine originare n celula gazd. Astfel sunt stimulate limfocitele T fa de proteinele self.

d) Asemnarea antigenic ntre antigenele exogene i componentele self. Uneori, microorganismele infecioase conin molecule asemntoare, nrudite antigenic cu componentele self. Se sintetizeaz anticorpi care recunosc nu numai antigenul invadant, ci i propriile componente. De exemplu, peretele de Str. haemolyticus conine proteina M. Anticorpii antiprotein M reacioneaz ncruciat cu proteine membranare ale celulelor muchiului cardiac. Unele antigene exogene, de origine bacterian, stimuleaz sinteza anticorpilor ce dau reacii ncruciate cu molecule ale suprafeei hematiei. De aceea, infecia cu Str. haemolyticus produce, uneori, leziuni ale miocardului.

Maladiile infecioase (sifilis, lepr) stimuleaz sinteza autoanticorpilor (factorul reumatoid, anticorpi anti-tiroidieni) i acetia ar putea fi cauza dezechilibrului mecanismelor imunologice centrale. Rspunsul autoimun este declanat de novo sau cel preexistent este amplificat dup infecia cu o larg varietate de virusuri ADN i ARN,

La animalele de experien, infeciile virale acute i persistente pot induce sau pot accelera evoluia maladiei autoimune.

e) Activarea rspunsului imun poate fi rezultatul ntreruperii strii de echilibru a reelei idiotipice. Limfocitele sunt legate ntr-o reea funcional complex, prin interaciuni ce implic regiunile variabile ale receptorilor de antigen. Limfocitele T au receptor de antigen cu regiuni variabile i stimuleaz rspunsul anti-idiotipic. In mod normal, n absena stimulului antigenic, interaciunile celulare menin sistemul imunitar n echilibru, dar la contactul cu antigenul, reeaua se orienteaz n sensul elaborrii rspunsului imun specific. Ulterior, datorit semnalelor supresoare, reeaua se ntoarce la starea de echilibru. Interaciunile idiotipice pot avea rol stimulator sau inhibitor al rspunsului imun. Anticorpii anti-idiotipici, care n mod obinuit au rol reglator, pot fi autoanticorpi.

f) Supravieuirea limfocitelor autoreactive. In timus, clonele de limfocite self-reactive sunt eliminate. In organism, rmn totui clone cu o autoreactivitate medie. Ele nu sunt agresive fa de propriile antigene, dar pot deveni foarte reactive, dup ce s-au activat sub aciunea unui antigen exogen. Dup activare, prolifereaz i atac esutul self. Dac limfocitele supravieuiesc mai mult dect este necesar, efectul aciunii lor se extinde. Mecanismul supravieuirii limfocitelor activate pare a fi implicat n generarea lupusului sistemic eritematos i a artritei reumatoide. Supravieuirea limfocitelor se datoreaz producerii unor molecule ce blocheaz ligandul Fas. Astfel, ligandul Fas nu se mai leag specific cu receptorul Fas i transmiterea mesajului morii n limfocit este blocat.

g) Stimularea policlonal a limfocitelor B. Unii ageni infecioi, ca de exemplu virusul EpsteinBarr, infecteaz limfocitele B i produc activarea policlonal. Ele strbat cteva cicluri de

diviziune i sintetizeaz anticorpi cu specificiti multiple de combinare, unii fiind autoanticorpi. Micoplasmele sunt activatoare policlonale ale limfocitelor i pot contamina preparatele virale. Frecvent, virusurile infecteaz limfocitele i macrofagele, stimulnd astfel eliberarea citochinelor. Aceste molecule influeneaz nivelul de exprimare a moleculelor CMH I i II, modulnd rspunsul imun.

h) Influenele hormonale. Numeroase observaii clinice sugereaz o corelare direct ntre dezechilibrele hormonale i momentul declanrii maladiilor autoimune. Maladiile autoimune sunt mai frecvente la femei, iar brbaii cu fenomene autoimune au un nivel mai crescut de hormoni estrogeni. Sarcina se asociaz cu ameliorarea severitii maladiilor autoimune, n special a artritei reumatoide.

j) Factorii genetici. Maladiile autoimune tind s aib o inciden familial, ceea ce sugereaz substratul genetic predispozant la maladiile autoimune.

Inducerea experimental a maladiilor autoimune

Prima manifestare autoimun s-a indus experimental la iepurii injectai cu mojarat corneean bovin. S-au sintetizat anticorpi care au reacionat cu antigenele corneii bovine, dar i cu antigenele esutului corneean de iepure, att in vivo, ct i in vitro. In anii 30, Rivers i colab. au indus encefalomielita la maimu, prin injectarea mojaratului de creier. Fig. 127. Natura multifactorial a fenomenelor autoimune. Bid = celul B care secret autoanticorpi; BalfaId = celul B care secret anticorpi anti-idiotipici; Te = celul T efectoare.

Ulterior, s-a demonstrat c cea mai sigur modalitate experimental de a induce o manifestare autoimun, este injectarea mojaratului tisular singenic, alogenic sau xenogenic, n asociaie cu adjuvantul Freund. Se sintetizeaz anticorpi care reacioneaz cu antigenul inductor, dar i cu componentele tisulare self asemntoare. Anticorpii fa de constituienii tiroidieni i tiroidita pot fi induse prin imunizarea iepurilor cu mojarat tiroidian, asociat cu adjuvantul Freund complet. Sa dedus astfel c unul din mecanismele producerii maladiilor autoimune este similar mecanismului sintezei autoanticorpilor, adic prin stimularea cu antigene nrudite. In sprijinul afirmaiei, exist cazuri de analogie direct.

Encefalomielita autoimun, consecutiv administrrii vaccinului rabic, este declanat de antigenele esutului nervos de iepure (mielin). Preparatul vaccinal atenuat, utilizat chiar de Pasteur, era mduva spinrii de la iepurele infectat cu virus rabic, uscat i macerat.

Capacitatea antigenelor nrudite chimic, de a induce sinteza anticorpilor care reacioneaz ncruciat cu componente proprii, are ca rezultat ntreruperea strii de toleran. De exemplu, utilizarea preparatelor de insulin din pancreasul de bovine sau de porc, a creat dificulti majore n tratamentul pacienilor cu diabet insulino-dependent, deoarece insulina bovin difer de cea uman prin 3 aminoacizi, iar insulina de porc, printr-un singur aminoacid. Aceste diferene sunt suficiente pentru stimularea reactivitii imunitare a receptorului de insulin. O complicaie suplimentar a fost generat de faptul c preparatele de insulin sunt contaminate cu proinsulin. Insulina se sintetizeaz n celulele B insulare, ca preproinsulin, care, fa de proinsulin are o caten de 20 de aminoacizi la captul N-terminal. Dup clivarea acestei catene, rmne proinsulina, n care aminoacidul 1 din catena A este reunit cu aminoacidul 30 din catena B, prin catena C. Proinsulina este convertit la insulin i este depozitat n granule, de unde este eliberat n circulaie. Proinsulina nu se gsete n mod normal n circulaie i nu induce starea de toleran. De aceea, administrarea proinsulinei induce sinteza autoanticorpilor anti-insulin.Fig. 128. Structura primar a proinsulinei, molecula precursoare a insulinei dup clivarea enzimatic a peptidului C. Proinsulina este n mod obinuit, sechestrat de contactul cu sistemul imunitar, dar dac se elibereaz n circulaie, activeaz sinteza anticorpilor care se combin cu molecula de insulin. Catenele A i B ale insulinei sunt legate prin puni S-S.

nelegerea naturii chimice a multor autoantigene este insuficient, iar auto-anticorpii se detecteaz observnd legarea lor de seciunile tisulare, prin tehnica imunofluorescenei. Seciunea tisular este foarte complex din punct de vedere antigenic i interpretarea rezultatelor necesit experien i pruden.

MECANISME CELULARE I MOLECULARE ALE PROGRESIEI MALADIILOR AUTOIMUNE

Indiferent de mecanismul declanator, maladiile autoimune se caracterizeaz prin sinteza autoanticorpilor sau prin generarea limfocitelor T autoreactive. Leziunile tisulare consecutive aciunii efectorilor imunitari, se produc pe una din urmtoarele ci:

- autoanticorpii au, uneori, o aciune direct fa de antigenele tisulare cu care formeaz complexe imune. Se activeaz complementul i rezultatul este liza celulelor;

- alteori, autoanticorpii au aciune indirect. Complexele imune (Ag - Ac - C) se depun la nivelul vaselor mici (arteriole, capilare) din diferite organe i produc reacii inflamatorii, consecina fiind distrugerea esutului;

- n alte cazuri, esutul int este lezat sub aciunea limfocitelor Tc infiltrate.

La pacienii la care se sintetizeaz autoanticorpi, maladiile autoimune au o particularitate comun: inflamaia cronic fr o cauz infecioas cunoscut. Autoanticorpii pot iniia procesul patologic, pot contribui la patogenez i sunt utili pentru diagnostic. In evaluarea semnificaiei autoanticorpilor trebuie avute n vedere urmtoarele situaii: 1) autoanticorpii pot fi agenii efectori ai maladiei, ca de exemplu, n anemia hemolitic autoimun; 2) alteori, dup lezarea unor esuturi (nervos, cardiac) se sintetizeaz autoanticorpi care reacioneaz cu esuturile respective; 3) autoanticorpii semnific prezena unui agent etiologic, fr s aib rol n patogenitate i indic originea infecioas a maladiei; 4) autoanticorpii se gsesc uneori, mai ales la vrstnici, n absena manifestrilor patologice.

Unele maladii autoimune se caracterizeaz prin procese patologice strict localizate, adic efectorii (n special anticorpii) au aciune specific fa de antigenele proprii organului sau esutului int. Astfel, n maladia autoimun diabetus melitus insulino-dependent, auto-anticorpii au specificitate numai fa de celulele B din insulele Langerhans, iar n tiroidita Hashimoto, autoanticorpii sunt specifici fa de celula epitelial tiroidian.

La centrul spectrului se situeaz leziunile care tind s fie localizate ntr-un singur organ, dar autoanticorpii nu au specificitate de organ. Exemplul tipic este ciroza biliar primar, n care, canaliculele biliare sunt inta infiltrrii cu celule inflamatorii, dar anticorpii serici, n special antimitocondriali nu au specificitate de organ (nu sunt specifici fa de mitocondriile hepatice). De asemenea, n sindromul Goodpasture, autoanticorpii se fixeaz pe membrana bazal a glomerulului renal i a epiteliului alveolar, producnd glome-rulonefrita cronic i hemoragii pulmonare.

La cealalt extremitate a spectrului sunt maladiile autoimune diseminate, caracterizate prin sinteza autoanticorpilor fa de antigene cu distribuie tisular larg (de exemplu, anticorpi antinucleari n lupusul eritematos diseminat).

Autoanticorpii se sintetizeaz preponderent, fa de antigenele esuturilor endocrine: tiroid, corticosuprarenale, celulele insulare pancreatice, paratiroide, hipofiz, ovar. Titrul cel mai crescut se nregistreaz n cazul maladiei tiroidiene.

Autoanticorpii pot fi specifici fa de diferite componente antigenice:

- fa de molecule ale suprafeei celulare i au rol patologic(ca de exemplu, anticorpii antireceptori de hormoni);

- fa de inte extracelulare (molecule circulante sau ale matricei extracelulare) i pot fi agravani ai maladiei autoimune;

fa de componente intracelulare.Spectrul maladiilor autoimune Organ sau esut afectat Antigenul

Tiroidita Hashimoto

Mixedemul primar

Maladia Basedow (tireotoxicoza)

Anemia pernicioas Biermer

(deficitul vitaminei B12)

Diabetul juvenil

Unele alergii atopice

Myasthenia gravis

Sterilitatea masculin

Maladia lui Addison

Menopauza precoce

Anemia hemolitic autoimun

Purpura trombocitopenic idiopatic

Hepatita cronic activ fr HBs

Ciroza biliar primar

Poliartrita reumatoid Sindromul Goodpasture

LED

Colita ulcerativ

Sindromul Sjogren

Pemphigus vulgaris

Cardiomiopatia autoimun

Miozita Tiroida Tiroida Tiroida Mucoasa gastric Celulele B insulare Sistemul nervos periferic Muchi striat i cardiac Spermatozoid Celulele corticosuprarenalei Ovar Hematii Plachete Ficatul i muchiul neted Mitocondrii Membrana sinovial Rinichi i plmni Distribuie difuz Mucoasa colonului Glande lacrimale i salivare Tegumentul Muchiul cardiac Muchiul striat Tiroglobulina

Citoplasma, suprafaa celulei

Receptorul pentru TSH al suprafeei celulare

Factorul intrinsec (FI)

Citoplasma celulelor insulare

Receptorul beta-adrenergic

Receptor de acetilcolin

----------

Citoplasma

Citoplasma celulelor pro-ductoare de steroizi Suprafaa hematiei

Suprafaa plachetelor

Celula hepatic, actina

Piruvat dehidrogenaza mitocondrial

Regiunea Fc a moleculei de IgG

Membrana bazal

ADN, ADN-proteine, IgG

Lipopolizaharidul celulelor epiteliale

Mitocondrii, nuclei

Membrana bazal a epidermei

Miofibrilele i sarcolema celulei musculare cardiace

ARN, miozina

Autoanticorpii au specificitate fa de molecule self. Prezena autoanticorpilor este, uneori, un indiciu al riscului pentru viitoare maladii autoimune, iar alteori, titrul lor seric este o reflectare direct a amplitudinii dezordinii autoimune. Evidenierea autoanticorpilor nu este niciodat revelatoare pentru diagnosticul unei maladii, deoarece se pot gsi i n serul organismului normal. Prezena lor n serul normal are o frecven variabil n funcie de vrst i sex: cea mai mic frecven, autoanticorpii o au n serul brbailor tineri, iar n serul femeilor vrstnice, frecvena este cea mai mare.

Autoanticorpii se identific prin tehnicile de aglutinare pasiv i precipitare. Tehnicile de aglutinare utilizeaz particule de latex sau eritrocite, tapetate cu antigenul molecular.

Autoanticorpii antitiroidieni se detecteaz prin hemaglutinarea pasiv (HAI), adic antigenul tiroidian este legat pe suprafaa eritrocitelor, iar aglutinarea particulelor de latex tapetate cu imunoglobulin este cea mai folosit pentru detectarea factorului reumatoid. Imunofluorescena indirect este folosit pentru evidenierea anticorpilor antinucleari.

Nu toi pacienii cu o anumit dezordine endocrin sintetizeaz autoanticorpi. Testul negativ al detectrii autoanticorpilor nu exclude maladia autoimun, iar testul pozitiv nu are semnificaia obligatorie a unui diagnostic pozitiv. Autoanticorpii fa de celulele insulare pancreatice au o particularitate ce const n faptul c procentajul serurilor pozitive scade dup declanarea bolii.

Maladii autoimune ale esutului conjunctiv (colagenoze)

Cele mai frecvente colagenoze sunt lupusul eritematos diseminat (LED), artrita reumatoid (AR) i febra reumatismal. Din punct de vedere imunologic, toate se caracterizeaz prin prezena autoanticorpilor n ser, care formeaz complexe imune cu diferite antigene tisulare. In febra reumatismal, autoanticorpii lezeaz esutul miocardic i articulaiile. In artrita reumatoid sunt lezate articulaiile, iar n LED sunt afectate mai multe organe.

Lupusul eritematos diseminat

Denumirea de lupus semnific efectul distructiv asupra esuturilor, iar calificativul sistemic reflect implicarea unui numr mare de esuturi, ceea ce confer caracterul generalizat al maladiei; termenul eritematos desemneaz eritemul tegumentar care nsoete fazele acute ale maladiei. Lupusul eritematos diseminat este prototipul maladiilor autoimune sistemice. Maladia poate s apar la orice vrst, dar femeile n perioada sarcinii sunt cele mai afectate.

Lupusul este asociat cu multiple fenomene autoimune i se exteriorizeaz prin manifestri clinice plurifocale extrem de diverse, care implic sisteme de organe: tegument, articulaii, rinichi.

Din punct de vedere citologic, LED se caracterizeaz prin prezena celulelor LE (lupice), evideniate de Hargreaves n mduva osoas a pacienilor. Celula LE este un PMN care a ingerat nucleul altei celule i poate s apar n sngele periferic.

Semnul distinctiv al maladiei este nivelul seric ridicat al IgG cu specificitate anti-nuclear. Manifestrile clinice heterogene par a fi asociate cu producerea autoanticorpilor. In serul pacienilor s-au identificat peste 28 de specificiti diferite de autoanticorpi. Cei mai semnificativi sunt anticorpii antinucleari (FAN), anti-leucocitari, anti-muchi neted de stomac, anti-eritrocitari, anti-plachetari, anti-ribosomali. Titrul crescut de anticorpi anti-ADN dublu catenar, asociat cu nivelul sczut al complementului poate fi considerat ca un test de diagnosticare a LED.

n sngele pacienilor cu LED, exist ADN liber, anticorpi anti-ADN, dar i complexe imune anticorpi-ADN. ADN pur nu este imunogen, dar proteinele cu care este asociat i confer imunogenitate. In complexul ADN-proteine, ADN are rol de hapten, iar anticorpii au specificitate fa de ADN. Anticorpii anti-ADN aparin clasei IgG i dau reacii ncruciate multiple: cu polizaharidele bacteriene, cu proteinele fibrilare ale citoscheletului, cu cardiolipina. Anticorpii anti-ADN formeaz complexe imune cu ADN circulant i se depoziteaz n esuturi, avnd astfel efecte patologice directe. Anticorpii lupici se leag de componente renale (membrana bazal a glomerulilor), fixeaz complementul i iniiaz un rspuns inflamator, care modific funcia renal, producnd glomerulonefrita cu complexe imune, a crei consecin este

proteinuria. Complexele imune pot produce i alte manifestri patologice: artrit, vasculit, erupie rash. O fracie a autoanticorpilor este orientat fa de determinanii suprafeei eritrocitare i pot produce anemia hemolitic, trombocitopenia(liza plachetelor) sau chiar leziuni ale SNC.

Complexele imune se depun, n special la nivelul pereilor vasculari sau sunt filtrate la nivelul glomerulilor renali, unde produc leziuni inflamatorii caracteristice. ADN liber, precum i complexele ADN-anticorpi au afinitate pentru colagenul din membrana bazal a glomerulilor, ceea ce explic depozitarea preferenial a complexelor imune n rinichiul pacienilor cu LED. Depunerea preferenial a complexelor ADN-anti-ADN are o explicaie molecular: histonele din complexele nucleoproteice au afinitate fa de heparan-sulfat, component al membranei bazale a glomerulului.

Complexele imune activeaz cascada complementar i cantitatea seric de C3 i C4 diminu la majoritatea pacienilor cu LED activ. Din cauza creterii ratei sintezei, nivelul seric al acestor proteine poate fi normal, n ciuda consumului accelerat. Anafilatoxinele eliberate din activarea complementului, iniiaz reacia inflamatorie local.

Datorit sintezei autoanticorpilor cu specificiti multiple, maladia este nsoit de hipergamaglobulinemie.

Dintre toate specificitile de autoanticorpi care se sintetizeaz n LED, FAN este cel mai caracteristic i este dominant cantitativ. Anticorpii antinucleari sunt specifici pentru aceast maladie i detectarea lor este util pentru diagnostic. Anticorpii anti-nucleari reacioneaz cu toate tipurile de nuclei, indiferent de origine, dar reacioneaz i cu antigenele nucleare ale gazdei i de aceea sunt considerai autoanticorpi. In LED, titrul anticorpilor antinucleari este crescut, dar anticorpi anti-ADN se sintetizeaz i n artrita reumatoid, n sindromul Sjogren, myasthenia gravis, hepatita cronic activ. Anticorpii antinucleari sunt antinucleosomali (structuri ce constau din ADN i histone). ADN poate fi de origine eucariot sau procariot, dublu catenar sau monocatenar, polidispers sau omogen. Anticorpii se fixeaz pe nucleul unei largi varieti de esuturi animale, ceea ce permite evidenierea lor n serul pacienilor prin metoda imunofluorescenei indirecte. Metoda utilizeaz timus de viel, dar n special seciuni de ficat de obolan, obinute prin criotomie. Seciunile se acoper cu serul de cercetat. Lama cu seciuni se spal pentru ndeprtarea anticorpilor care nu au reacionat specific cu nucleul hepatocitului. Lamele se incub cu ser de iepure anti-IgG uman, conjugat cu fluorescein. Seciunile se examineaz la microscop, cu lumin ultraviolet. Dac n serul de cercetat se gsete FAN, se observ fluorescena celulelor hepatice de obolan.

Muli pacieni cu LED au anticorpi serici, nu numai fa de antigenele nucleare, ci i fa de antigenele citoplasmatice.

Cel mai comun fenomen patologic la pacienii cu LED este vasculita inflamatorie, datorat depunerii locale a complexelor imune, ndeosebi a acelora care conin ADN, n pereii vasculari.

Maladia se reproduce experimental la oarece prin injectarea unei endotoxine care determin liza celular, cu eliberare de ADN. ADN liber sau complexele ADN-anticorpi se fixeaz pe membrana bazal.

Agentul declanator al LED nu se cunoate. Retravirusurile sunt posibili ageni etiologici, deoarece la pacienii cu LED este indus sinteza unui interferon atipic (IFN-lentivirus), iar n culturile de limfocite de la pacienii cu LED s-a evideniat revers-transcriptaza.

Predominana net a pacientelor (9:1) fa de brbai sugereaz rolul hormonilor sexuali n aceast maladie. Numeroase date sugereaz un dezechilibru al raportului cantitativ al hormonilor androgeni i estrogeni n plasm. Brbaii cu LED manifest o prevalen superioar a hipoandrogenismului. Boala pare s implice emergena i activarea limfocitelor TCD4 i B cu potenial autoreactiv.

Declanarea i progresia LED are o baz genetic complex, cu contribuia genelor CMH i a multor gene din afara complexului. Complexitatea genetic n bolile poligenice se datoreaz penetranei sczute a fiecrei gene n parte, adic este o mic probabilitate ca o anumit alel s determine expresia maladiei. Datorit penetranei incomplete, chiar n prezena unui set complet de alele susceptibile, maladia nu se manifest totdeauna.

Artrita reumatoid

Artrita reumatoid este o maladie inflamatorie cronic ce afecteaz predominant membrele superioare i inferioare, dar poate s implice orice articulaie. Este o maladie autoimun cronic, sistemic, cu etiopatogenez necunoscut. Debutul ei este, de regul, dup 40 de ani, dar poate s apar la orice vrst. Maladia este mult mai frecvent dect LED i este consecutiv persistenei complexelor imune n circulaie, pentru perioade lungi de timp. Este una din cele mai comune maladii autoimune, de 2-3 ori mai frecvent la femei dect la brbai. Artrita reumatoid este caracterizat prin inflamaia i distrugerea cartilajului articular, producnd deformarea degetelor.

Waaler i Rose au evideniat c serul pacienilor de AR aglutineaz eritrocitele de berbec, tapetate cu o doz subaglutinant de anticorpi specifici. Concluzia lor a fost c serul conine un

factor specific, care recunoate regiunea Fc a moleculelor de anticorpi ce tapeteaz hematiile i lau denumit factor reumatoid (FR).

Factorul reumatoid aglutineaz hematiile oricrei specii, dac sunt tapetate cu anticorpi specifici. Factorul reumatoid este autoanticorp, un IgM anti-regiunea Fc a IgG denaturat. In vitro, FR precipit cu IgG denaturat chimic sau termic.

In vivo, modificarea structurii IgG se produce dup ce IgG reacioneaz cu antigenul corespunztor, sau in vitro, dup ce se fixeaz nespecific pe un suport inert sau dup denaturare termic.

Factorul reumatoid se sintetizeaz fa de molecula IgG a crei conformaie molecular a fost modificat in vivo i se gsete la circa 70% dintre pacienii cu artrit reumatoid. Dup modificarea conformaiei moleculare, IgG expune determinani antigenici inaccesibili pe molecula intact. Sinteza FR se face n plasmocitele din ganglionii limfatici, dar i n cele din esutul de granulaie al membranei sinoviale. esutul de granulaie este un esut conjunctiv reparator care se formeaz n focarul reaciei inflamatorii.

Determinanii antigenici ai IgG uman, care reacioneaz cu FR, nu se gsesc la toi indivizii. Factorul reumatoid care reacioneaz cu IgG de iepure, este diferit de cel care reacioneaz cu IgG uman. Factorul reumatoid este considerat ca autoanticorp, dar nici un FR din aceast categorie nu se poate numi autoanticorp, din urmtoarele motive:

- nu precipit cu IgG nativ a propriului organism. O variant a FR se combin cu IgG numai de origine uman i numai dac este legat n complexe imune, dar nu reacioneaz cu IgG liber;

- factorul reumatoid care se combin cu IgG uman, frecvent recunoate numai IgG denaturat i agregat prin tratament termic;

- factorul reumatoid precipit IgG cu specificitate alotipic, diferit de aceea a pacientului

- factorul reumatoid precipit cu IgG de alte specii.

Pe baza reaciei cu FR, indivizii umani se mpart n dou grupe:

- cei al cror IgG precipit cu FR

- cei al cror IgG nu reacioneaz cu FR.

Determinanii antigenici ai moleculelor de IgG sunt omologi antigenelor de grup sanguin i se numesc Gm(gama marker). Ei reprezint variante antigenice alotipice ale IgG umane. Indivizii al cror IgG reacioneaz cu FR aparin grupului Gm(a+), iar ceilali sunt Gm(a-).

Biologia molecular a artritei reumatoide

Mecanismul declanator al maladiei este incert. Nu se cunoate natura stimulului antigenic. Reacia autoimun ar fi declanat de o infecie cu micoplasme sau cu un virus (EBV, CMV sau un retravirus) care ar avea epitopi asemntori cu autoantigenele. Antigenele de Salmonella, Shigella sau Yersinia pot s activeze diferite artrite. Rspunsul fa de aceste antigene este detectat la situsul sinovial al inflamaiei, fr ca microorganismul s fie prezent. Antigenele bacteriene cu potenial autoimun pot fi transportate n articulaii i iniiaz sau amplific un rspuns imun anormal. Printre posibilii factori etiologici ai AR, o atenie special s-a acordat proteinelor de rspuns la ocul termic. Ali autori consider c un autoantigen (gp 39, component a esutului articular) este recunoscut ca nonself de sistemul imunitar. S-a sugerat posibilitatea ca AR s se datoreze unei insuficiene corticosteroidiene, odat cu descoperirea efectelor antiinflamatorii ample ale cortizonului, n aceast maladie. Ipoteza n-a fost confirmat, dar nici infirmat.

Dup alii, maladia este declanat de complexele imune circulante care se fixeaz n articulaii. Complexele imune sunt recunoscute specific de limfocitele B, care leag antigenul din complex, prin receptorul imunglobulinic.

Artrita reumatoid este o colecie de maladii autoimune, pentru care antigenul declanator difer, la diferite forme ale maladiei. Dei AR este considerat o maladie autoimun, tabloul patologic distinctiv este dominat net de o reacie inflamatorie intens, sever i cronic, stimulat de antigene infecioase sau de superantigene.

Etiologic, AR pare a fi rezultatul unei combinaii de factori care include predispoziia genetic i stimularea antigenic, posibil ca rezultat al infeciei cu microorganisme. Procesul imunologic are un rol central n patogeneza AR, argumentat de urmtoarele observaii:

- prezena autoanticorpilor serici (FR)

- n situsul inflamator se gsesc factorii rezultai din activarea C

- n situsul articular inflamat se gsesc neutrofile, limfocite T, B, macrofage i citochinele lor

- sensibilitatea la AR este asociat cu expresia unor alele specifice CMH II.

Limfocitele T sunt implicate direct n mecanismul patogeniei AR. In esutul sinovial reumatoid, celulele care delimiteaz cavitatea sinovial sunt hiperplazice i sunt infiltrate cu limfocite B, T i macrofage. Utilizarea AMC marcai cu fluorescein, arat c n esuturile sinoviale sunt celule T care exprim molecule CMH II.

Oricare ar fi stimulul, la nivelul articulaiei se declaneaz reacia inflamatorie, proces patologic care determin progresia AR. Se presupune c celulele Th1 recunosc un antigen self n esutul sinovial, se activeaz i produc limfochine (IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IFN ) i activeaz limfocitele B, care se difereniaz n plasmocite i secret IgG, ce formeaz complexe imune (CI). CI activeaz cascada C i se elibereaz C3a i C5a, cu aciune chimiotactic pozitiv i activatoare fa de leucocite, inclusiv pentru limfocite, care amplific reacia inflamatorie. Celulele Th1 secret citochine care activeaz celulele fagocitare ce elibereaz produse de oxidare a acidului arachidonic, radicalii oxigenului i metaloproteaze lizosomale, care degradeaz matricea extracelular a esutului articular.

Macrofagele elibereaz IL-1, cu efecte multiple: stimuleaz proliferarea i eliberarea moleculelor proteolitice i chimiotactice din macrofage, stimuleaz osteoclastele i condroclastele. Osteoclastele i condroclastele atac i lizeaz cartilajul, amplificnd inflamaia articular. Factorii de cretere i citochinele stimuleaz hiperplazia fibroblastelor i angiogeneza n jurul articulaiei, iar n membrana sinovial a articulaiei se organizeaz foliculi limfoizi, cu centri germinativi n care se gsesc numeroase plasmocite. Rspunsul imun i rspunsul inflamator iniiaz i ntrein o sinovit, care poate progresa la forma eroziv a artritei, la pacienii pozitivi pentru epitopul antigenic declanator sau datorit contactului repetat cu un epitop de origine infecioas, stimulator al reactivitii imunitare i al reaciei inflamatorii.

Trstura esenial a patologiei AR este degradarea cartilajului articular, sub aciunea metaloproteazelor derivate din celulele inflamatorii infiltrate i din condrocitele rezidente:

colagenaze, gelatinaze, stromelizine etc. Sinteza lor este stimulat de citochinele inflamatorii. Cartilajul articular este un esut unic pentru c celulele sale componente se gsesc n lacune izolate, fr contact direct cu alte celule. Cartilajul este nevascularizat i este foarte rezistent la invazia cu vasele sanguine i de ctre celulele tumorale.

Molecule din categoria FR se sintetizeaz i la persoane cu dezordini limfoproliferative. Factorii reumatoizi de la persoanele normale sunt componente ale familiei anticorpilor naturali, cu afinitate mic fa de self. Adeseori, anticorpii naturali sunt polispecifici, reacionnd cu antigene self i cu antigene exogene. In contrast, factorii reumatoizi de la pacienii cu artrit reumatoid au adeseori afinitate nalt.

Artrita reumatoid se reproduce experimental prin injectarea fibrinei heterologe. Se produce o hiperplazie a celulelor membranei sinoviale, eroziunea cartilajului articular i a osului subiacent i inflamaia cronic a membranei sinoviale.

Alt model experimental al artritei este artrita de adjuvant. Prin injectarea intradermic a antigenului, asociat cu adjuvantul Freund complet, la obolan se dezvolt o afeciune similar artritei reumatoide.

Febra reumatismal sau reumatismul articular acut (RAA)

Febra reumatic este o complicaie relativ rar a faringitei streptococice, ce apare la 2-4 sptmni dup infecia bacterian. Febra reumatismal este o afeciune provocat de complexele imune circulante, care se localizeaz n regiunile articulare. Se manifest ca o poliartrit febril, cu evoluie favorabil, singurul risc fiind complicaiile valvulare cardiace, miocardice sau pericardice. Febra reumatismal este consecutiv infeciei tractului respirator cu Str. haemolyticus. Dup 2-3 sptmni, se dezvolt o maladie asemntoare maladiei serului, cu febr, artrit, uneori chorea i cardit. Anticorpii cu reacie ncruciat atac valvele cardiace, pentru c antigenele self ale esutului cardiac se aseamn cu proteina M din Str. haemolyticus. Riscul complicaiilor cardiace este mai mare pentru indivizii cu grup sanguin A. Toate grupele sanguine au un precursor antigenic comun antigenul H (codificat de gena H) pe suprafaa eritrocitelor, bine exprimat cantitativ la persoanele de grup 0. Specificitatea antigenic a hematiilor de grup 0 este conferit de L-fucoz. Grupul A are are o alt gen ce codific sinteza glicozil-transferazei, enzim ce adaug N-acetil-D-galactozamina, la galactoza preterminal a substanei H. De aceea, specificitatea antigenic a eritrocitelor grupului A este dat de N-acetilD-galactozamin i L-fucoz.

Indivizii grupului B au o gen ce adaug D-galactoza la galactoza preterminal a moleculei H i specificitatea antigenic a eritrocitelor este dat de D-galactoz i L-fucoz.

Glucidul terminal al polizaharidului streptococic este N-acetil-D glucozamina, legat de un polimer de ramnoz. Diferena dintre N-acetil-D glucozamin i N-acetil-D galactozamin este grupul OH. De aceea, antigenele de grup sanguin A se aseamn cu antigenul streptococic, mai mult dect ale grupului 0. La fel pentru antigenele de grup B, la care D-glucoza este mai asemntoare structural cu N-acetil-D glucozamina de Str. pyogenes, dect cu L-fucoza grupului 0. Ca urmare, anticorpii produi de indivizii de grup A, dup infecia cu Str. pyogenes, se cupleaz cu antigenele tisulare care conin antigene ale grupului A i produc reacii inflamatorii. esutul cardiac conine grupe moleculare, similare cu substana de grup A.

Anticorpii anti-streptococici se leag cu antigenele nrudite (o reacie ncruciat), ceea ce explic frecvena superioar a febrei reumatice la indivizii cu grup sanguin A i B, fa de indivizii cu grup sanguin 0.

Chorea care nsoete febra reumatic, se poate explica prin asemnarea unor molecule ale ganglionilor bazali, cu antigene streptococice.

Febra reumatismal debuteaz n momentul n care ncep s se sintetizeze anticorpi antistreptococici. Absorbia antigenelor streptococice n circulaia sanguin, determin, n special, sinteza anticorpilor anti-streptolizin O (ASLO). Se formeaz complexe imune circulante. Rmne neexplicat faptul c numai 2-3% dintre indivizii atini de infecia cu S. pyogenes fac reumatism articular acut.

esutul cardiac este adeseori implicat, deoarece anticorpii dau reacie ncruciat cu antigenele streptococice i cu antigenele de organ ale fibrei musculare striate din muchiul cardiac i chiar cu muchiul neted din pereii vasculari. Anticorpii anti-streptolizin O reacioneaz cu sarcolema fibrelor musculare cardiace. O fracie a anticorpilor anti-streptococici, reacioneaz ncruciat att cu antigenele glucidice bacteriene, ct i cu o protein structural de pe valvele cardiace. Complicaiile pericardice, uneori consecutive infeciei cu S. pyogenes, nu sunt explicate, pentru c n pericard nu se gsesc antigene care s reacioneze ncruciat cu cele bacteriene.

Biologia molecular a maladiilor autoimune organo-specifice

O serie de maladii cu substrat imunitar se caracterizeaz prin spectrul foarte limitat al specificitii autoanticorpilor serici i implicit prin limitarea leziunilor tisulare la esutul int:

tiroidita autoimun Hashimoto, boala Basedow-Graves, diabetul zaharat insulino-dependent, myasthenia gravis, anemia pernicioas, boala Addison, insuficiena ovarian primar, pemphigus.

Cel mai adesea, autoanticorpii sunt specifici fa de componente ale sistemului endocrin. Adeseori, n cazuri patologice, n organism se sintetizeaz anticorpi cu specificitate fa de un anumit receptor hormonal. Mecanismul induciei sintezei acestor anticorpi nu se cunoate, dar se consider c receptorii de hormoni sunt secretai de celule n mediul intern. Moleculele sunt preluate i prelucrate de celulele specializate i sunt prezentate limfocitelor. Anticorpii antireceptor hormonal pot s blocheze funcia hormonului respectiv.

Autoanticorpii fa de receptorii pentru hormonii hipofizari i fa de receptorii organului int au rol determinant n progresia unor maladii. Cei mai studiai sunt anticorpii anti-receptor pentru TSH i anti-receptor de insulin. Efectele fizio-patologice ale anticorpilor anti-receptori hormonali sunt variate. Anticorpii pot stimula activitatea receptorului i efectul este intensificarea activitii secretorii a glandei (efect mimetic hormonal) sau invers, blocheaz receptorul i efectul se reflect n inhibiia activitii secretorii. La acelai pacient pot coexista ambele variante de anticorpi. De exemplu, anticorpii fa de receptorul periferic de insulin, se gsesc la un numr mic de pacieni cu diabetus melitus insulino-rezistent, dar i la cei hipoglicemici. Pacienii cu aceste manifestri au o maladie autoimun de fond, cel mai adesea lupus eritematos diseminat.

Uneori, pacienii hiperglicemici insulino-rezisteni, evolueaz spre hipoglicemie. S-a presupus c autoanticorpii cu titru crescut, distrug receptorul de insulin i de aici ar rezulta rezistena maladiei la hormonul circulant, iar autoanticorpii anti-receptor de insulin, cu titru sczut, produc o stimulare a receptorului (mimeaz aciunea hormonului)i efectul este hipoglicemia. Se pare ns c autoanticorpii au specificitate fa de epitopi diferii ai receptorului, ceea ce explic diferenele aciunii lor.

Diabetus mellitus insulino-dependent

Diabetul zaharat este cea mai frecvent maladie endocrin. Diabetus mellitus insulino-dependent (IDDM) rezult din distrugerea celulelor pancreatice B, productoare de insulin. Rezultatul este hipoinsulinemia i hiperglicemia. IDDM pare a fi o maladie autoimun. Predispoziia genetic este o condiie necesar pentru declanarea maladiei, dar factorii de mediu infeciile virale, regimul alimentar, diferite toxine, au un rol important n expresia clinic a acestei maladii. Maladia s-a reprodus experimental la oarece. Insulele sunt infiltrate cu limfocite. Sunt lizate celulele B ale insulelor, procesul distructiv excluznd alte tipuri celulare, care rmn intacte.

Dup instalarea hiperglicemiei, gradul infiltrrii mononucleare scade. Infiltratul const din macrofage, celule dendritice, TCD4, TCD8, NK i mai puin limfocite B.

n ser se detecteaz anticorpi anti-celule insulare pancreatice, cu specificitate citoplasmatic i anticorpi anti-componente membranare (decarboxilaza acidului glutamic). Aceast enzim se gsete n citoplasma celulelor B pancreatice, dar funcia ei este necunoscut. Aceiai enzim se gsete n neuronii care produc inhibitorul transmiterii impulsului nervos acidul aminobutiric. La epileptici, ca i la pacienii IDDM, titrul anticorpilor anti-glutamic aciddecarboxilaz este crescut. Enzima citoplasmatic se gsete i la nivelul membranei plasmatice, unde devine inta sistemului imunitar i induce sinteza autoanticorpilor. Agentul etiologic al IDDM nu este cunoscut, dar poate fi un picornavirus (Coxsackie B4) litic pentru celulele B insulare, ale crui antigene dau reacie ncruciat cu antigene self. Diferite substane toxice cu efect litic ar elibera antigenele celulare. Celulele B insulare pot fi lizate direct, sub aciunea infeciei virale sau de ctre macrofage, care detecteaz antigenele virale. Agenii chimici diabetogeni (aloxan, streptozocin etc.) distrug celulele B prin diferite mecanisme i reproduc maladia, cu sinteza auto-anticorpilor anti-celule insulare.

Maladii autoimune tiroidiene

Tiroida secret tiroxina (T4) i triiodotironina (T3), hormoni reglatori ai ratei metabolismului bazal i ai funciilor cardiace i neurologice. Afeciunile tiroidei pot determina modificri ale secreiei hormonale, hipertrofia glandei sau ambele consecine.Fig. 129. Reprezentare schematic a dezvoltrii diabetului zaharat insulino-dependent (IDDM). Autoantigenele eliberate din celulele n timpul turnover-ului natural sau lizei celulelor datorit infeciei virale, sunt prelucrate de macrofage i prezentate celulelor Th n asociaie cu moleculele CMH II. Macrofagele elibereaz IL-12, activatoare a limfocitelor Th1. n acelai timp, IL-2 i alte citochine eliberate de celulele CD4+, activeaz limfocitele T cu potenial toxic fa de celulele insulare . IFN eliberat de celulele Th stimuleaz funcia citotoxic a macrofagelor. Ele elibereaz citochine cu efect toxic pentru celulele ( IL-1 , TNF , IFN ) i radicali liberi. Celulele Th secret interleuchine care activeaz alte celule Th, limfocite B i celule Tc. Celulele Tc (CD8+) pot s recunoasc autoantigenele exprimate pe celulele normale. Ele elibereaz granzima i citolizina (perforina), cu efect toxic asupra celulelor insulare. Distrugerea celulelor ar putea fi datorat apoptozei mediat de interaciunea receptorului Fas cu ligandul Fas. Astfel, macrofagele, celulele T i citochinele coopereaz sinergic pentru distrugerea celulelor , rezultatul fiind diabetul zaharat insulino-dependent (dup Ji-Woon Yoon, 1998).

n ariile geografice n care ingestia iodului alimentar este adecvat necesitilor, maladiile tiroidiene au, n primul rnd, mecanisme imunitare. Ele apar cu o fecven de circa 4% n

populaia uman i se manifest prin hipertiroidism cu sau fr oftalmopatie sau prin hipotiroidism. n ambele cazuri, tiroida poate s creasc n volum (gu).

S-au descris trei specificiti de autoanticorpi anti-tiroidieni: anti-tiroid peroxidaz (antigenul microsomal); anti-tiroglobulin; anti-receptor pentru TSH al celulelor acinare tiroidiene.

Hipertiroidismul cu creterea volumului glandei este cunoscut sub denumirea de boala Graves sau von Basedow sau boala Parry, iar insuficiena tiroidian poart numele de tiroidita autoimun, caracterizat prin infiltrare limfocitar. n funcie de aspectul clinic, se disting dou stri patologice: tiroidita Hashimoto (guogen) i tiroidita atrofic (mixedem primar). n ambele cazuri, esutul tiroidian se distruge.

Boala tiroidian autoimun apare n special la organisme feminine i din punct de vedere imunologic se caracterizeaz prin autoanticorpi circulani, celule T activate fa de antigenele tiroidiene i prin infiltrarea limfocitar a organului.

Maladia Basedow-Graves (tirotoxicoza) este de natur autoimun i se caracterizeaz prin sinteza anticorpilor (IgG) anti-tiroidieni, detectabili la 85% dintre pacieni, iar histologic se observ leziuni structurale. Anticorpii anti-tiroidieni sunt autoanticorpi specifici fa de receptorul pentru TSH. Anticorpii se fixeaz pe receptorul celular pentru TSH i efectul este o stimulare de durat a funciei tiroidei. Autoanticorpii s-au denumit LATS (Long-Acting-ThyroidStimulating). Mecanismul lor de aciune este acelai ca i al TSH, prin intermediul adenilciclazei.

Interaciunea autoanticorpilor cu antigenul celular (receptorul pentru TSH) nu produce distrugerea celulei, ci efectul este proliferarea i stimularea activitii ei. Un efect stimulator asemntor l are IgG anti-imunoglobulina de suprafa a limfocitului B. Rezultatul este transformarea blastic a limfocitului.

Aciunea anticorpilor anti-TSH nu se supune controlului feed-back prin hormonul tiroidian, a crui sintez este stimulat. Tiroida se activeaz, secret hormon tiroidian i crete mult n volum. Celulele foliculare se divid i hiperplazia tiroidei este asociat cu hiperfuncia.

Autoanticorpii anti-receptor pentru TSH traverseaz placenta i determin hiperplazia tiroidian a ftului, cu manifestrile clinice ale hipertiroidismului, ce persist pn cnd anticorpii de origine matern sunt catabolizai.

Maladia este influenat de diferii factori: vrst, sex, ras, starea hormonal. Maladia se remite n timpul sarcinii, dar se activeaz la modificri hormonale: pubertate, perioada post-partum, menopauz. Boala este mai grav la brbai (dei ei sunt numai 25% dintre pacieni), cu titru mare de anticorpi.

Oftalmopatia se datoreaz hipertrofiei musculare extraoculare, creterii volumului esutului adipos i a esutului conjunctiv nconjurtor, cu infiltrat celular inflamator i al celulelor imunitare. Se pare c anticorpii i limfocitele T recunosc determinani antigenici pe muchii extraoculari sau pe fibroblastele orbitale, cu fenomene de citotoxicitate mediat celular, dependent sau independent de anticorpi.

Tiroidita Hashimoto. La pacienii cu maladia autoimun a tiroiditei Hashimoto, se gsesc autoanticorpi cu diferite specificiti, dar definitorie pentru aceast maladie este nlocuirea esutului tiroidian, cu esut limfoid. Volumul glandei crete foarte mult, dar nu, sintetizeaz hormoni (gu uscat). In serul pacienilor se gsesc autoanticorpi care reacioneaz cu tiroglobulina, anticorpi anti-celule tiroidiene, anticorpi anti-TSH i anticorpi fa de antigenele microsomale asociate cu lipoproteinele. Microsomii sunt constituieni intracelulari ai veziculei de exocitoz a celulei tiroidiene, n care se matureaz hormonul tiroidian. Veziculele de exocitoz transport tiroglobulina spre suprafaa apical a celulei i o elibereaz prin fuziunea cu membrana polului apical. Microsomii tiroidieni se exprim i pe membrana laterobazal a celulei, cnd vezicula de exocitoz fuzioneaz greit cu aceast zon. Astfel, hormonul devine accesibil sistemului imunitar. Microsomii constituie autoantigenul, potenial stimulator al rspunsului imun.

Anticorpii anti-microsomi tiroidieni au fcut posibil detectarea unei proteine de 993 aminoacizi tiroid-peroxidaza (TPO), enzima tiroidian asociat microsomilor, cu rol esenial n generarea hormonilor tiroidieni din tiroglobulin.

Anticorpii anti-tiroglobulin au titru de pn la 1/2500 i se detecteaz n reacia de precipitare dintre serul pacienilor i mojaratul de esut tiroidian.

In vivo, autoanticorpii se fixeaz pe esutul tiroidian. Se produce inflamaia cronic a tiroidei i creterea volumului ei (gua). Se disting dou situaii patologice: tiroidita guogen i tiroidita atrofic (mixedem primar).

n ambele cazuri, celulele foliculare tiroidiene se lizeaz. Consecina este deficitul tiroidian (hipotiroidia), proporional cu volumul tisular pierdut. Hipotiroidismul este asociat cu mixedemul primar. In serul pacienilor se gsesc anticorpi anti-receptor pentru TSH, care blocheaz legarea TSH, fiind astfel inhibat regenerarea foliculilor, o trstur a guii Hashimoto, dar i anticorpi anti-muchi neted de stomac, anticorpi anti-factor intrinsec. Rolul autoanticorpilor n distrugerea celulelor tiroidiene nu este determinat, iar maladia este, n primul rnd, rezultatul aciunii limfocitelor T care infiltreaz esutul glandular.

Maladia se induce experimental prin injectarea mojaratului de esut tiroidian omolog sau heterolog, la iepure, asociat cu adjuvantul Freund. Tiroida se infiltreaz cu limfocite mici. Liza esutului tiroidian este rezultatul imunitii mediate celular, fa de antigenele tiroidiene.

Autoanticorpii fa de antigene ale membranei se sintetizeaz n diferite neuropatii. Sunt cunoscui anticorpii specifici fa de gangliozidele celulei nervoase. Aceste molecule alctuite dintr-un lipid, ceramid (sfingozina legat de un acid gras), combinate cu o varietate de oligozaharide, se gsesc n membrana neuronilor periferici. In serul pacienilor cu diferite neuropatii se gsete IgM specific fa de o anumit gangliozid. Anticorpii nu iniiaz procesul patologic i nu au specificitate de maladie, ci se sintetizeaz dup leziuni ale esutului nervos (dup atacul cerebral, dup traumatisme ale cutiei craniene sau chiar la pacienii cu spondiloz cervical).

Anemia pernicioas

Anemia pernicioas apare n stadiile terminale ale gastritei autoimune distructive i este consecina distrugerii celulelor parietale ale glandelor gastrice, datorit conflictului imunitar. In absena celulelor parietale, vitamina B12 nu se absoarbe.

Denumirea pernicioas, dat de Biermer (1972), subliniaz progresia inevitabil spre fatalitate i s-a pstrat, dei ea este caracteristic numai pentru faza terminal a bolii.

De fapt, maladia debuteaz i se manifest ca o gastrit autoimun, pentru care exist dovezi histologice din 1970, dar condiionarea dintre anemie i gastrit a fost precizat de Biermer.

Procesul patologic autoimun este iniiat la nivelul mucoasei gastrice i este de lung durat (circa 20 de ani), cu mult naintea epuizrii funcionale a celulelor parietale. n serul pacienilor se gsesc autoanticorpi cu mai multe specificiti, dar cei anti-stomac au titrul cel mai nalt. Sediul

sintezei lor este n plasmocitele din mucoasa gastric i se leag specific fa de dou categorii de auto-antigene:

- ATP-aza H+K+ (o enzim) din celula parietal, cu specificitate celular, dar nu de specie, ceea ce denot importana rolului fiziologic al moleculei n celula parietal gastric;

- un produs de secreie a celulelor gastrice parietale, denumit factor gastric intrinsec sau transcobalamina, o glicoprotein a crei funcie este de a lega vitamina B12 i de a permite absorbia ei intestinal.

Enzima ATP-az H+K+ funcioneaz ca pomp protonic i realizeaz acidifierea sucului gastric. Ea aparine familiei ATP-azelor de tip P, cu rol n fluxul ionic (Na+K+-ATP-aza, Ca2+-ATP-aza). Anticorpii anti-factor intrinsec au o frecven de 80-90%, n cazurile clinice de anemie pernicioas i se evideniaz prin inhibiia fixrii vitaminei B12 radiomarcate, n sucul gastric. Enzima gastric ATP-aza H+K+ este localizat pe membranele intracelulare i pe membrana apical a celulei gastrice parietale.

Factorul gastric intrinsec este o glicoprotein de 44 kD. Vitamina B12, n mediul acid al sucului gastric, se elibereaz din legturile sale cu proteinele i se leag cu transcobalamina. Dac secreia acid este inhibat de inactivitatea H+K+-ATP-azei, cantitatea de vitamin B12 disponibil pentru a se lega cu factorul intrinsec diminu mult, iar situsul de legare cu transcobalamina este blocat de autoanticorpi. Rezultatul este malabsorbia vitaminei B12. Gastrita autoimun progreseaz pn cnd vitamina B12 scade la nivele ce nu mai pot s susin metabolismul neuronal. Pacientul devine anemic, cu complicaii neurologice.

Anticorpii sunt IgG i alturi de limfocitele T, particip la distrugerea celulelor gastrice. Pe msur ce inflamaia progreseaz, se reduce numrul celulelor principale i al celor parietale. Reacia autoimun este limitat la corpul stomacului. Rezultatul este atrofia gastric, dar rata progresiei este variabil. La unii indivizi, capacitatea de a absorbi vitamina B12 se menine timp de circa 20 de ani, iar la alii atrofia este rapid i se instaleaz anemia pernicioas.

Myasthenia gravis

Myasthenia gravis se caracterizeaz clinic prin diminuarea progresiv a forei muchilor scheletici, cu atingerea musculaturii oculare, a membrelor, a trunchiului i, n cazuri severe, a muchilor respiratori.

Maladia este asociat cu sinteza anticorpilor anti-receptor de acetilcolin (Ach), prezent pe membrana celulei musculare la nivelul plcii motorii, prin intermediul creia neuronul intr n contact cu fibra muscular. Receptorii sunt localizai la vrfurile pliurilor membranei postsinaptice ale fibrelor muchilor striai i sunt proteine alctuite din trei catene (, , ). Ei leag acetilcolina eliberat din terminaia nervoas, n fanta sinaptic. Acetilcolina este eliberat de potenialul presinaptic i ca rspuns, se deschid canalele cationice specifice pentru Na, producndu-se depolarizarea local a membranei postsinaptice i declanarea potenialului de aciune al muchiului. Imunizarea iepurelui cu receptori purificai de Ach din organul electric de pete Electrophorus, produce autoanticorpi anti-receptor de Ach i simptome asemntoare cu myasthenia gravis. Legarea anticorpilor de receptorul de Ach, blocheaz legarea Ach i funcia canalelor ionice.

Maladia afecteaz indivizi de la vrsta copilriei, pn la cei vrstnici.

Leziunile plcii motorii pot fi amplificate prin mecanisme dependente de complement. La nivelul plcii motorii, numrul receptorilor de acetilcolin diminu semnificativ. Odat cu pierderea receptorilor se instaleaz oboseala muscular, trstura clinic esenial a maladiei, pentru c impulsul nervos, chiar dac elibereaz o cantitate normal de acetilcolin, nu este urmat de contracia muscular. Muchiul nu este afectat, iar receptorii de acetilcolin se renoiesc cu o rat optim. Oboseala muscular se datoreaz scderii numrului i funciei receptorilor de acetilcolin. Pierderea receptorilor de acetilcolin, diminu sensibilitatea membranei postsinaptice la acetilcolin. Astfel, potenialele electrice produse de eliberarea acetilcolinei din terminaia nervoas motoare au o frecven redus, scade amplitudinea lor i diminu amplitudinea contraciei.

Autoanticorpii fa de receptorii de acetilcolin se detecteaz la 85-90% din pacienii cu myasthenia gravis generalizat i la 50-60% dintre cei cu maladia limitat la musculatura ocular. Practic, sunt abseni la persoanele sntoase.

Eliminarea anticorpilor din snge este condiia recuperrii. Sinteza anticorpilor poate fi inhibat prin supresia limfocitelor B productoare de anticorpi. Anticorpii plasmatici pot fi eliminai prin procedeul plasmaferezei. Fig. 130. Myasthenia gravis presupune pierderea recepto-rilor de acetilcolin (Ach) de la jonciunea neuromuscu-lar. a. O sinaps neuro-muscular normal are un numr mare de receptori ce leag Ach. b. Pacienii mias-tenici au un numr semni-ficativ mai mic de receptori de Ach.

Serul de la miastenicii negativi pentru anticorpii anti- receptor de acetilcolin poate s transfere maladia la animale de experien, sugernd c maladia poate fi produs de anticorpi fa de o alt protein.

Titrul anticorpilor nu se coreleaz cu severitatea bolii, ceea ce sugereaz rolul preponderent al altor factori (neimunitari) n evoluia maladiei.

La jonciunea neuro-muscular, n stadiile de acutizare a simptomatologiei, se gsesc macrofage.

n special la persoanele tinere afectate de myasthenia gravis, timusul se mrete, rezultnd un timom de natur epitelial, limfoid sau mixt, iar alteori timusul rmne nemodificat. In 7080% din cazurile de timom, n timus se formeaz centrii germinativi, ceea ce denot o sintez local a anticorpilor. Rareori, timomul este un epiteliom. Efectul favorabil se obine prin timectomie, ceea ce a stimulat identificarea unui factor timic circulant, susceptibil de a deprima conducerea neuromuscular. Goldstein a izolat, din timusul de viel, un factor polipeptidic, cu greutatea mucular de 6000 D, pe care l-a denumit timopoetin, cu un posibil rol n diferenierea limfocitelor T.

La persoanele vrstnice, timusul este atrofic. La jonciunea cortico-medular se gsesc celule mioide, cu receptori de acetilcolin de tip extrasinaptic (embrionar). Maladia poate fi iniiat n timus, fa de receptorii de acetilcolin ai acestor celule, iar ulterior se extinde fa de receptorul sinaptic de acetilcolin.

Maladia se reproduce experimental la iepure, prin imunizarea organismului cu receptori de acetilcolin, purificai din organul electric de Electrophorus. Fora muscular se reduce, ca i n situaia clinic uman. n serul pacienilor se gsesc autoanticorpi cu alte specificiti: antimuchi striat, anti-nucleari, anti-muchi neted, anti-celul parietal de stomac.

Ciroza biliar primar

Ciroza biliar primitiv (CBP) fr antigenul HBs este o maladie cronic enigmatic a ficatului, caracterizat prin obliterarea inflamatorie progresiv a ductelor biliare intrahepatice. Limfocitele T se infiltreaz i distrug cele mai mici ducturi biliare intrahepatice, rezultatul fiind obstrucia biliar progresiv lent, icter i n final, ciroza. Maladia se detecteaz cu precdere la femei, cu o varietate de autoanticorpi, cu complexe imune circulante i activarea complementului, cu

disfuncia celulelor T reglatoare, cu defecte de comutare izotipic a sintezei imunoglobulinelor, cu predominana celulelor T n infiltratele hepatice periductale.

Autoanticorpii sunt specifici fa de autoantigenele tiroidiene, anti-muchi neted, anticorpi fa de antigenele nucleare. Autoanticorpii anti-tiroidieni sunt citotoxici, dar semnul distinctiv al maladiei este conferit de anticorpii anti-mitocondriali, cu titru nalt, la 90% dintre pacienii cu ciroz. Anticorpii anti-mitocondriali nu au specificitate de organ i nici de specie.

Titrul seric al imunoglobulinelor crete, iar proteinele complementului diminu cantitativ, datorit activrii cascadei. Scade numrul limfocitelor TCD4 i TCD8.

La examenul histologic, ductele biliare sunt nconjurate i penetrate de limfocitele T infiltrate, n special CD8, care formeaz adevrate granuloame, ceea ce este neobinuit pentru patologia autoimun. In mod normal, epiteliul ductelor biliare exprim numai molecule CMH I, dar la pacienii CBP, celulele epiteliale biliare exprim i molecule CMH II. Apariia acestor molecule poate fi relevant i definitorie pentru ciroza biliar primitiv autoimun, pentru c celulele epiteliale ale ductelor biliare pot avea rolul de celule prezentatoare de antigen pentru limfocitele TCD4.

Autoanticorpii specifici antimitocondriali constituie semnul distinctiv al CBP. Anticorpii recunosc proteine majore ale membranei mitocondriale interne. Proteinele mitocondriale sunt enzime intracelulare, componente ale unor complexe enzimatice mari. Autoanticorpii par a fi orientai fa de situsurile funcionale ale enzimelor, deoarece interfer cu funciile lor metabolice. Diagnosticul se bazeaz pe capacitatea serului de la pacientul cu CBP de a inhiba activitatea catalitic a complexului enzimatic al piruvat-dehidrogenazei.

Mecanismul molecular al etiologiei acestei maladii autoimune nu este neles. Este posibil ca antigenele unui agent infecios s dea reacie ncruciat cu autoantigenele mitocondriale. Pe de alt parte, autoantigenele sunt sintetizate n citoplasm i transportate n mitocondrii. Mutaiile n secvena leader sau defecte ale degradrii lor, pot duce la generarea unor molecule noi i la exprimarea lor pe membrana celulei, unde devin inta reactivitii imunitare. Autoanticorpii antimitocondriali nu au efect patologic. Transplantul ficatului normal la un pacient cu CBP nu este urmat de manifestrile patologice, dei anticorpii antimitocondriali persist.

Sindromul Wiskott-Aldrich este x-lincat i se caracterizeaz prin trombo-citopenie i sngerri. Nivelul IgG este sczut, iar IgA i IgE sunt crescute.

Sterilitatea imun a brbailor este caracterizat prin sinteza anticorpilor n lichidul seminal, specifici fa de antigenele spermatozoizilor, care imobilizeaz spermatozoizii, iar la titru nalt, produc chiar aglutinarea lor. Anticorpii se sintetizeaz local, n structurile epididimului, deoarece concentraia lor este mult mai nalt dect n snge.

Maladia Addison

Maladia Addison survine ca o consecin a distrugerii esutului suprarenalian, n proporie de 90%. esutul poate fi distrus pe cale chirurgical, datorit tuberculozei renale, histoplasmozei, criptococozei, prin mecanism autoimun sau datorit altor cauze necunoscute (maladia Addison idiopatic).

n maladia Addison autoimun, esutul glandular este infiltrat cu limfocite, iar n ser se gsesc autoanticorpi specifici fa de antigene din citoplasma celulelor corticosuprarenalelor, cu specificitate de organ. Autoanticorpii sunt detectabili la circa 80% dintre pacienii cu boala Addison de natur autoimun.

Tehnica imunofluorescenei evideniaz c autoanticorpii reacioneaz cu toate cele trei straturi celulare ale corticosuprarenalei. Serul unor pacieni reacioneaz cu antigene ale celor trei zone corticale, alte seruri reacioneaz cu zona fasciculat i cu zona reticulat i o mic proporie reacioneaz numai cu zona glomerular, ceea ce sugereaz heterogenitatea bolii Addison, cu implicarea preferenial a diferitelor antigene ale corticosuprarenalei.

Anticorpii serici dau reacie ncruciat i cu antigenele altor celule care secret hormoni steroidici: cu celulele trofoblastice ale placentei ce secret HCG; cu celulele interstiiale testiculare Leydig; cu celulele corpului galben ovarian.

Celulele zonei corticale se distrug, iar acolo unde mai rmn, nu mai pstreaz arhitectura normal a distribuiei n cele trei zone corticale. Celulele sunt hipertrofiate i au aspect vacuolar. esutul corticosuprarenalian este infiltrat cu macrofage i plasmocite. Zona medular este intact sau infiltrat cu un numr mic de celule limfoide.

Boala Crohn i colita ulcerativ

Boala Crohn i colita ulcerativ sunt maladii ulcerative ale intestinului gros. Ambele constau dintr-un infiltrat intens al macrofagelor i limfocitelor, cu un numr mare de celule plasmatice. In colita ulcerativ, modificarea patologic const n inflamaia difuz, cu ulcere ale mucoasei. Este implicat numai mucoasa, fr straturile profunde.

n boala Crohn, infiltratul inflamator formeaz adeseori granuloame i se poate extinde n stratul muscular. Se sintetizeaz predominant IgG. Mrimea zonei mucoase infiltrate este diferit. Simptomele principale sunt diareea i hemoragia colic.

Leziunile colice sunt induse de anticorpii sintetizai fa de antigenele bacteriene, care dau reacie ncruciat cu antigenele tisulare. In celulele epiteliale ale colonului uman se gsete un antigen lipoproteic, care reacioneaz ncruciat cu anticorpii specifici fa de LPS de E. coli.

Sindromul Sjogren este o maladie autoimun, caracterizat prin infiltrarea cu celule imunitare a glandelor salivare i lacrimale, cu inflamaia cronic i disfuncia acestor esuturi.

Anemiile hemolitice autoimune

Anemiile hemolitice autoimune (AHA) reprezint un grup de dezordini cu substrat imunitar, n care se sintetizeaz anticorpi specifici fa de una sau mai multe componente ale membranei eritrocitare, rezultatul fiind liza eritrocitelor. AHA sunt mediate de IgG i IgM.

Anemia hemolitic autoimun se distinge de anemia de aloimunizare feto-matern, la care IgG matern trece prin bariera placentar. Maladia se deosebete i de anemiile hemolitice imunoalergice, produse de medicamente care se cupleaz cu o protein membranar i formeaz conjugate inductoare ale sintezei anticorpilor specifici.

Anemia hemolitic autoimun este mediat de anticorpii anti-hematie, care se sintetizeaz fa de antigenele suprafeei eritrocitare i au specificitate, n primul rnd fa de antigenele sistemului Rh. Anticorpii sunt IgG, de reacie la cald (adic se fixeaz pe eritrocite la 37o) sau IgM, de reacie la rece sau crioglobuline 4 (se fixeaz pe hematii la temperaturi mai mici de 30o, n capilarele periferice, n sezonul rece). Cea mai comun este maladia cu hemaglutinine la rece, primar sau idiopatic, asociat cu infecia produs de M. pneumoniae, cu virusul Epstein-Barr

sau cu virusul citomegalic. Hemoliza este dependent de activarea cascadei complementului. Eritrocitele tapetate cu IgM se opsonizeaz cu C3b i acestea sunt captate de macrofagele din ficat, cu receptori pentru C3b.

In vivo, liza hematiilor survine la 37o, condiii n care se fixeaz i complementul i de aceea s-a denumit hemoliz la cald. Simptomele apar la cteva ore dup reexpunerea la rece: febr intens, hemoglobinurie (datorat hemolizei), splenomegalie, deoarece se produce o sechestrare splenic masiv a hematiilor tapetate cu anticorpi. Intensitatea hemolizei este dependent de titrul autoanticorpilor.

Macrofagele detecteaz eritrocitele tapetate cu IgG i le fagociteaz n absena C3b, dar n prezena C3b, captarea lor este mai rapid. Hemoliza este aproape totdeauna extravascular i celulele tapetate cu IgG sunt epurate n special n splin. De aceea, splenectomia este o msur strategic, cu remisiune parial a maladiei.

Anticorpii adsorbii pe suprafaa hematiilor pot fi IgG sau IgM, dar pentru c nu produc aglutinarea, s-au numit n mod eronat, anticorpi incomplei. Evidenierea anticorpilor adsorbii pe hematii se face prin testul Coombs direct, denumit i testul antiglobulinic5 .

Testul detectez orice anticorp fixat pe suprafaa hematiilor(anticorpi anti- Rh sau specifici fa de alte antigene eritrocitare) i utilizeaz antiseruri monospecifice marcate cu fluorocromi, obinute pe iepure, fa de antigenele purificate: seruri anti-IgG, anti-IgM, anti-C3, anti-C4. Serurile imune monospecifice se pun n contact cu eritrocitele bolnavului. Dac pe suprafaa lor sunt adsorbii anticorpii, se evideniaz fluorescena sau, dac titrul autoanticorpilor este prea mare, se produce chiar aglutinarea hematiilor.

Purpura trombocitopenic este o maladie autoimun, caracterizat prin diminuarea numrului plachetelor sanguine, pn la 1/10 din valoarea normal. In serul pacienilor se detecteaz anticorpi antiplachetari. Serul pacienilor determin aglutinarea plachetelor indivizilor normali i liza n prezena complementului.

Pemphigus este o maladie a pielii i a membranelor mucoase, caracterizat prin acantoliz, adic pierderea aderenei intercelulare i prin sinteza autoanticorpilor ce se fixeaz pe suprafaa celulelor epidermice. Anticorpii au specificitate fa de dezmosom, o component structural cu rol n coeziunea celulelor epidermice. Autoanticorpii nu sunt declanatori ai maladiei, dar au rol important n progresia ei. Imunofluorescena direct a epidermei lezate, evideniaz imunoglobulinele legate pe suprafaa celulelor epidermice. Nivelul anticorpilor anti-celule epidermice se coreleaz cu gravitatea leziunilor, iar ndeprtarea anticorpilor prin plasmaferez

este urmat de ameliorarea clinic. Maladia poate fi transferat pasiv, prin ser sau imunoglobuline de la pacieni. Anticorpii anti-epidermici aparin subclasei IgG4.

Miozita este o maladie idiopatic(cauz necunoscut) inflamatorie a muchilor, cu o component autoimun. Adeseori, pacienii prezint autoanticorpi specifici pentru una sau alta dintre maladiile autoimune. Cel mai adesea, autoanticorpii sunt specifici fa de proteinele sau ribonucleoproteinele cu rol n sinteza proteic i se cupleaz cu ARN.

Cei mai studiai sunt autoanticorpii fa de histidil-ARNt sintetaz i respectiv glicil-, alanil-, treonil-, izoleucil-ARN sintetaz. Anticorpii se cupleaz cu ARN i inhib aciunea enzimei. Titrul lor este variabil, n raport cu stadiul maladiei. Enzimele nu se gsesc pe suprafaa celulelor musculare, dar se elibereaz prin liza celulelor musculare consecutiv infeciei cu un picornavirus miotropic, ca de exemplu virusul encefalomiocarditei. Aceste virusuri pot produce miozita i ARN viral poate fi substratul aminoacil-ARNt-sintetazei. Rolul autoanticorpilor n progresia acestei maladii este ndoielnic.

Alt component citoplasmatic, inductoare a sintezei anticorpilor este miozina. Miocardita, infarctul miocardic, chirurgia valvular, grefarea arterelor coronare bypass induc sinteza anticorpilor antimiozin, dar nu se cunoate rolul lor patologic.

n concluzie, reaciile autoimune, caracterizate prin sinteza autoanticorpilor i generarea limfocitelor Tc autoreactive, nsoesc multe maladii. Uneori, ele progreseaz spre maladii autoimune. Autoanticorpii specifici fa de componente ale suprafeei celulare (de exemplu, receptori de hormoni) sunt inductori ai proceselor patologice, iar cei specifici fa de inte extracelulare (molecule circulante, matricea extracelular) pot sau nu s produc leziuni. Anticorpii specifici fa de inte intracelulare produc efecte patogene, dac antigenul este eliberat din celul i devine accesibil sistemului imunitar, dac antigenul este orientat greit i expus pe suprafaa celulei sau dac o molecul ce d reacie ncruciat are o localizare accesibil fixrii anticorpilor.

Anticorpii i exercit efectele prin agregare, blocaj, stimulare, opsonizare, fixarea C, sensibilizare la aciunea altor celule efectoare.

4 n serul uman normal apar cantiti mici de crioglobuline (30 mg/l), dar simptomele pot fi asociate cu concentraii de peste 100 mg/l. Uneori, chiar concentraii mari, de cteva grame/l pot s nu produc manifestri clinice.

Pe baza analizei imunochimice, crioglobulinele sunt distribuite n trei grupe:

- crioglobulinele de tip I (5-10% din crioglobulinemii) sunt imunoglobuline monoclonale i se gsesc, n proporie de 90% din cazuri, la pacienii cu maligniti ale limfocitelor B. Cel mai adesea sunt IgM, mai rar IgG, ocazional IgA i foarte rar sunt proteine Bence-Jones;

- crioglobulinele de tip II (50-65% din crioglobulinemii) sunt mixte, cu o component monoclonal, care are activitate de anticorp fa de IgG policlonal. Componenta monoclonal este IgM (factorul reumatoid), dar poate fi IgG sau IgA;

- crioglobulinele de tip III (30-40% din crioglobulinemii) sunt compuse din una sau mai multe clase de imunoglobuline policlonale, n special IgM, sub forma complexelor Ig-anti Ig. Complexele conin, uneori, molecule neimunoglobulinice: complement, lipoproteine, fibronectina.

Simptomele clasice ale crioglobulinemiilor apar n formele de tip II i III (ulceraii cronice ale membrelor inferioare, artralgie, insuficien renal cu proteinurie). Complementul este activat i consumat n proporie de 90%.

Crioglobulinele sunt imunoglobuline care, in vitro la temperaturi mai mici de 37o precipit sau formeaz un gel, reversibil la renclzire. La titruri mici, ele precipit numai n jurul a 4o, dar n general, cu ct concentraia seric este mai mare, cu att crete temperatura de precipitare.

5 Testul antiglobulinic a fost utilizat iniial (1941), pentru detectarea IgG anti-antigene eritrocitare ale sistemului Rh. Se sintetizeaz dou categorii funcionale de anticorpi: cei care determin aglutinarea hematiilor ntr-o suspensie salin (IgM) i anticorpi neaglutinani (incomplei sau blocani) ai izotipului IgG, care nu au aciune aglutinant direct. Eritrocitele au sarcin negativ care le menine la o distan de 20 nm. De aceea, IgG nu leag ncruciat hematiile, chiar dac braele sale au extensia maxim. In schimb, regiunea Fc a moleculei ofer situsul de legare pentru anticorpii anti-IgG. Moleculele de IgG de pe dou eritrocite diferite sunt legate ncruciat, producnd aglutinarea. Testul este utilizat n imunohematologia clinic:

n diagnosticul anemiei hemolitice prin evidenierea anticorpilor fixai pe suprafaa eritrocitelor (testul Coombs direct). Reactivii antiglobulinici specifici anti IgM, anti-IgA i anti-IgG (toate subclasele) se obin pe iepure sau pe capr.

n transfuzia sanguin pentru determinarea compatibilitii dintre donor i receptor. Celulele donorului se pun n contact cu serul receptorului (testul Coombs indirect). Eventualii anticorpi neaglutinani se pot evidenia prin adugarea anticorpilor antiglobulinici marcai cu fluorocromi.

Imunodeficienele

Organismele imunodeficitare reprezint, din punct de vedere clinic, adevrate experiene ale naturii, care, alturi de studiile experimentale, au contribuit decisiv la fundamentarea concepiei actuale cu privire la organizarea i funcionarea sistemului imunitar. Analiza cazurilor clinice ale indivizilor imunodeficieni, a evideniat faptul c cele dou compartimente celulare ale sistemului limfoid sunt semiautonome, deoarece ntre ele exist multiple interdependene funcionale.

Maladiile cu substrat imunitar (imunodeficienele) sunt heterogene, att n expresia lor imunologic-clinic, ct i n privina mecanismelor celulare i moleculare implicate.

Imunodeficienele pot fi nscute (primare) sau dobndite (secundare) i se datoreaz mai multor cauze:

- pot fi rezultatul unor defecte genetice intrinsece ale celulelor limfoide, care se manifest prin erori ale diferitelor trepte de maturare, care se succed de la celula stem pluripotent, pn la celula T matur i respectiv, pn la plasmocit. Deficiena poate fi datorat lipsei unor enzime eseniale pentru metabolismul celulei (de exemplu, metabolismul purinelor). Consecina este absena limfocitelor din organele limfoide i din circulaie;

- alteori se produc deleii ale genelor care codific unele izotipuri de lan greu (H). Astfel, apar deficienele selective ale claselor de imunoglobuline;

- imunodeficienele se pot datora slabei dezvoltrii a mediului necesar diferenierii i maturrii celulelor limfoide (timus, GALT);

- imunodeficienele pot fi rezultatul perturbrii mecanismelor reglatoare ale celulelor Th i Ts, care controleaz rspunsul imun mediat celular i humoral;

- imunodeficienele pot surveni ca rezultat al catabolizrii imunoglobulinelor cu o rat excesiv, sau chiar datorit pierderii imunoglobulinelor din snge i din secreii, dei celulele limfoide i imunoglobulinele sunt normale sub aspect numeric i respectiv, cantitativ;

Circa 50% din imunodeficiene se datoreaz sintezei deficitare a anticorpilor, 10% sunt imunodeficiene celulare, 20% sunt imunodeficiene combinate, 18% sunt deficiene ale fagocitelor i 2% sunt deficiene ale proteinelor complementului.

Imunodeficienele nnscute

Imunodeficienele nnscute (primare) au fost descoperite de O. Bruton (1952), odat cu descrierea agamaglobulinemiei i hipogamaglobulinemiei infantile sex-lincat. Maladia afecteaz bieii i se transmite prin cromosomul X. Pacienii rmn asimptomatici n primele luni de via, deoarece n aceast perioad imunoglobulinele materne asigur protecia antiinfecioas. Dup vrsta de 5-6 luni, pacienii devin foarte sensibili la infeciile tegumentare cu bacterii piogene i la infecii ale tractului respirator cu streptococi, meningococi, H. influenzae. Pacienii sunt lipsii de reactivitatea imunitar mediat humoral. In esuturile limfoide lipsesc plasmocitele, iar foliculii limfoizi nu se formeaz nici dup stimularea antigenic repetat. La electroforez, serul pacienilor nu relev fracia gamaglobulinic. IgG are concentraia de 1/10 (1 mg/ml fa de 10 mg/ml), iar IgM are concentraia de 1/100 din valorile normale. Lipsete IgA, dar lipsesc i hemaglutininele i . n mod normal limfocitele B reprezint 5-18% din totalul limfocitelor circulante, dar la aceti pacieni, proporia lor este foarte mic (mai puin de 0,1%). Absena limfocitelor B mature se datoreaz defectelor de maturare, determinate de tirozin-kinaza nefuncional, codificat de gena mutant.

Pacienii au reactivitate normal a imunitii mediate celular: testul hipersensibilitii ntrziate la tuberculin este pozitiv, resping alogregele, limiteaz infeciile virale, cu excepia hepatitei B (care evolueaz rapid spre ciroz) i a celor cu enterovirusuri. Limfocitele T au valori numerice normale. Vaccinurile virale atenuate sunt bine suportate i nu produc infecii clinice.

Disgamaglobulinemiile selective se caracterizeaz prin incapacitatea sintezei unui anumit izotip imunoglobulinic. Se cunosc deficiene selective ale IgM, IgA sau ale IgM i IgA, IgA i IgG, IgM i IgG.

Deficienele IgA se asociaz cu o frecven crescut a infeciilor tractului digestiv i respirator, iar deficienele sintezei IgG i IgM se nsoesc cu creterea sensibilitii fa de infeciile tegumentare cu bacterii piogene: Streptococcus, Staphylococcus.

Agama-, hipogama- i disgamaglobulinemiile selective se amelioreaz net, prin administrarea intravenoas a gamaglobulinelor.

Sindromul Di George este consecina hipoplaziei sau ageneziei timice. In cursul vieii embrionare se produce o perturbare a dezvoltrii structurilor derivate din perechile a 3-a i a 4-a de pungi faringiene. Agenezia timic este nsoit de absena paratiroidelor i de aceea, pacienii, iniial, prezint alte simptome: hipocalcemie, malformaii cardiace. Timusul este foarte redus ca dimensiuni sau chiar lipsete la 1/3 dintre pacieni. Adeseori, timusul exist sub forma glandelor ectopice. Imunitatea mediat humoral este normal, reflectat n valorile normale ale concentaiei imunoglobulinelor.

Dac supravieuiesc, la civa ani, pacienii manifest sensibilitate nalt fa de infeciile virale, fa de bacteriile intracelulare sau fa de infecia fungic cu Pneumocystis carinii.

Imunodeficiena sever combinat (scid) se caracterizeaz prin deficitul ambelor compartimente ale imunitii, att celular, ct i cel humoral. Deficiena se datoreaz absenei celulelor stem de origine a limfocitelor. Lipsesc limfocitele T, B i granulocitele, datorit hipoplaziei generalizate a esutului reticular hematopoetic. Organele limfoide secundare sunt hipoplazice, iar timusul este absent. Lipsesc imunoglobulinele serice.

Pentru restabilirea funciei imunitare se impune transplantul mduvei osoase.

Imunodeficienele dobndite

Imunodeficienele dobndite (secundare) cuprind diverse maladii, datorate unor cauze patologice care interfer direct sau indirect cu funcia imunitar.

Imunodeficienele dobndite pot fi cauzate de hipercatabolismul imunoglobulinelor. Concentraiile serice ale imunoglobulinelor reflect raportul dintre rata sintezei i rata catabolismului acestor molecule. Creterea ratei catabolismului poate s conduc la o deficien selectiv a unei clase de imunoglobuline, ce se manifest prin hipoproteinemie.

Imunodeficienele dobndite se pot datora pierderii excesive a imunoglobulinelor, la nivelul tractului urinar sau gastrointestnal. Pierderea urinar este consecina defectelor renale glomerulare, a unor disfuncii tubulare sau unor defecte combinate.

Deficienele glomerulare sunt asociate cu pierderea proprietilor de sit ale endoteliului capilarelor glomerulare. Moleculele imunoglobulinice mici (IgG) trec n urin cu o rat superioar fa de moleculele mari (IgM). Totui, IgG3 i IgG4 rmn normale, ceea ce sugereaz c, n afara greutii moleculare, sunt importani i ali factori care condiioneaz funcia filtrului renal. Nivelul seric al IgG scade, proporional cu gradul perturbrii funciei de sit a endoteliului glomerular, iar IgM rmne normal.

A II-a cale major a pierderii majore a imunoglobulinelor este tractul gastrointestinal, la nivelul vaselor limfatice. Cele mai multe situaii patologice la acest nivel nu induc hipogamaglobulinemie, cu excepia limfangiectaziei intestinale. Aceasta se caracterizeaz prin dilatarea excesiv a canalelor limfatice i este nsoit de pierderea masiv de proteine i chiar a limfocitelor. Dilatarea vaselor limfatice este cauzat de obstrucia limfatic, datorit unei infecii (de exemplu, tuberculoza), unei maligniti (limfom) sau datorit creterii presiunii hidrostatice n insuficiena cardiac sever congestiv. Rata sintezei imunoglobulinelor este normal sau crescut, dar turnover-ul este rapid, datorit pierderii excesive a proteinelor la nivel intestinal.

Imunodeficiene datorate micronutrienilor. Deficiena fierului creeaz condiii predispozante pentru candidoza mucocutanat cronic. Deficiena zincului supreseaz funcia celulelor T i predispune la infecii oportuniste. Seleniul este important pentru funcia celulelor T. Deficiena parial la copii, predispune la infecii.

Imunodeficiene induse de medicamente. Cele mai multe medicamente citotoxice i imunosupresoare, utilizate n tratamentul malignitilor, al inflamaiilor i n imunosupresia pacienilor cu transplant de organe, deprim funcia imunitar celular i humoral, iar neutropenia predispune la infecii cu bacterii Gram negative i la infecii fungice. Compuii steroidici utilizai n tratamentul maladiei reumatismale, ciclofosfamida i azatioprina, folosite n tratamentul neoplaziilor, dup administrare prelungit, deprim imunitatea mediat celular, dar i nivelul seric al imunoglobulinelor.

Unele imunodeficiene sunt consecutive altor procese patologice, care interfer cu efectorii sistemului imunitar: deficiena renal sau hepatic are ca efect acumularea substanelor toxice n organism, cu efect supresor asupra reactivitii imunitare.

Dezechilibrul endocrin, cu producerea n exces a cortizonului suprarenalian (n maladia Cushing) este asociat cu imunodeficiena. Cortizonul lizeaz limfocitele T i B circulante i diminu monocitele periferice.

Strile neoplazice, n special cele care afecteaz sistemul imunocitar, monocitar sau granulocitar induc un deficit al funciei imunitare. In maladia Hodgkin neoplazia liniei monocitare a ganglionilor limfatici se instaleaz deficiena imunitii mediate celular, dar imunitatea humoral este normal. In alte maligniti, efectele neoplaziei asupra sistemului imunitar, nu s-au putut disocia de efectele provocate de caexie.

Mielomul multiplu (tumor plasmocitar localizat n mduva osoas) este nsoit de scderea cantitativ sever a tuturor claselor de imunoglobuline normale i de aici, deficiene ample ale imunitii humorale, dar imunitatea celular rmne normal.

Imunodeficiena consecutiv infeciei cu HIV

Imunodeficiena consecutiv infeciei cu virusul HIV este, n esen, expresia incapacitii organismului uman de a neutraliza virionii, n timpul fazei acute a infeciei. Dup contactul primar cu antigenele HIV, organismul se apr prin mecanisme imunitare specifice. Se

sintetizeaz anticorpi specifici, la un titru crescut. Testul ELISA pentru diagnosticul infeciei cu HIV se bazeaz pe detectarea anticorpilor anti-HIV. Titrul maxim al anticorpilor se coreleaz n timp, cu nivelul viremiei.

Imunitatea mediat celular anti-HIV se detecteaz foarte timpuriu dup infecie i este dominat de numrul mare de limfocite TCD8, al cror numr crete de 10-20 de ori fa de valorile normale (200-600/l). Ele manifest activitate citotoxic specific anti-HIV i lizeaz limfocitele infectate, care expun pe suprafaa lor, proteinele env (SU i TM).

Limfocitele TCD8 diminu viremia primar, att prin efect citotoxic direct asupra celulelor n care virusul se replic, ct i prin efect represor asupra replicrii virale, mediat de citochine. Celulele NK lizeaz celulele infectate prin mecanismul ADCC.

Rspunsul imun primar, humoral i celular represeaz replicarea viral dup infecie. Dei foarte energic, rspunsul imun primar nu elimin complet virusul i nici celulele infectate. Organismul nu se sterilizeaz deoarece anticorpii specifici anti-HIV, produi n timpul infeciei primare, nu au activitate neutralizant optim. Anticorpii rspunsului imun primar, n esen, nu au efect protector, deoarece rspunsul imun este neadecvat, fie cantitativ, fie calitativ. O proporie important a virionilor nu este neutralizat, pstrndu-i infeciozitatea. Rmn de asemenea, multe celule infectate cu virus, n special n ganglionii limfatici, att limfocite ct i celule foliculare dendritice.

Anticorpii neutralizani se detecteaz mai trziu, dup trecerea de la faza acut a infeciei, la faza cronic. Probabil c anticorpii neutralizani sunt specifici fa de epitopii care nu sunt expui pe virionii asamblai n cursul infeciei primare sau anticorpii rspunsului imun secundar sufer fenomenul maturrii de afinitate i se leag mai eficient de epitopi.

Pe msur ce infecia progreseaz, anticorpii neutralizani sunt nlocuii cu anticorpi stimulatori (enhancing) ai infeciei. Anticorpii stimulatori favorizeaz infecia celulelor, prin intermediul receptorului pentu C3 sau pentru Fc. Ineficiena anticorpilor este explicat prin aceea c una din glicoproteinele de nveli al virionilor este foarte glicozilat (circa 24 de situsuri de glicozilare), pe o secven de 481 aminoacizi. Gruprile glucidice mascheaz epitopii antigenici i mpiedic neutralizarea virusului.

Imunodeficiena grav este consecina direct a scderii dramatice a numrului de limfocite TCD4 circulante, de la circa 1000 la 100/l. Dac n stadiul preclinic, proporia limfocitelor productoare de virus este de 1/40, n stadiile avansate, proporia este 1/10.

Cauza principal a scderii numrului de limfocite TCD4 este liza consecutiv infeciei cu HIV. Proteinele virale sintetizate n celul au efect toxic. Legarea HIV de membran i penetrarea n celul, este asociat cu creterea volumului celular. Celula pierde controlul influxului ionilor i al apei. Aceste modificri s-au reprodus in vitro cu glicoproteina 120 de HIV. Efectul toxic al glicoproteinelor virale este reversat de antagonitii canalelor de Ca2+, utilizai n clinic pentru a atenua anomaliile neurologice consecutive infeciei cu HIV.

La pacienii infectai cu HIV, o proporie semnificativ de limfocite, dup stimularea cu antigenele virale, n loc s se activeze i s se divid, se sinucid prin apoptoz, adic prin activarea programului genetic al morii.

O alt cauz a imunodeficienei o constituie anergia limfocitelor. Cele dou glicoproteine (120 i 41)rezult prin clivajul enzimatic al proteinei precursoare 160. Clivajul proteinei 160 este esenial pentru infeciozitatea viral. Glicoproteina 120 asociat necovalent cu gp 41pe suprafaa nveliului viral, este uor eliberat de pe suprafaa celulei i a nveliului. Glicoproteina 120 sintetizat n exces, se gsete liber(solubil) n snge i se leag de receptorul CD4, producnd perturbri ale reactivitii imunitare, prin blocarea reactivitii limfocitelor. Afinitatea interaciunii gp 120 cu CD4 este conferit de resturile sale glucidice. Starea de anergie poate fi reversat sub aciunea stimulatoare a IL-2. Complexele imune gp 120-anti gp 120 s-au identificat pe suprafaa limfocitelor, la pacienii infectai cu HIV.

HIV-1 infecteaz limfocitele TCD4, dar i monocitele, macrofagele, celulele dendritice, celulele Langerhans, celulele trofoblastice placentare, neuronii.

Scderea ampl a numrului de limfocite TCD4, detectabil n testul transformrii blastice cu mitogene, anuleaz funcia lor reglatoare asupra funciei imunitare. Limfocitele viabile asigur persistena infeciei. Diminuarea sintezei IL-2 ncetinete proliferarea i diferenierea limfocitelor Tc. In absena celulelor Tc activate, multiplicarea viral este necontrolat. Consecutiv scderii sintezei IL-2, diminu activitatea macrofagelor i a celulelor NK.

La organismele infectate cu HIV, numrul limfocitelor B este normal, iar concentraia imunoglobulinelor este de circa 10 ori mai mare dect la persoanele sntoase. Explicaia creterii titrului anticorpilor este c, n absena limfocitelor TCD4, celulele Ts nu-i ndeplinesc rolul fiziologic de a supresa activarea limfocitelor B, diferenierea lor i sinteza Ig. Limfocitele B se activeaz nespecific, policlonal. Se sintetizeaz anticorpi la un titru crescut, dar nu au specificitate anti-HIV i nu sunt protectori nici fa de ali ageni patogeni sau potenial patogeni.

Dat fiind specificitatea interaciunii gp 120 cu receptorul limfocitar CD4, s-a ncercat utilizarea CD4 solubil ca agent imunoterapeutic. Tulpinile virale de laborator au fost neutralizate eficient de preparatele CD4, dar izolatele primare de HIV-1 sunt relativ rezistente. Absena neutralizrii infeciozitii s-a atribuit mecanismelor complexe de intrare a virusului n celul. CD4 solubil stimuleaz eliberarea gp 120 din nveliul viral, ceea ce determin creterea infeciozitii.

Grupurile cu risc major de mbolnvire sunt cele ale homosexualilor i ale consumatorilor de droguri. Virusul se transmite i pe cale heterosexual, mai ales la femei, care transmit infecia ftului.

IMUNOLOGIE TUMORAL

Dup malignizare, membrana citoplasmatic este cea mai modificat structur celular. Semnalele reglatoare de control al creterii i multiplicrii, care acioneaz n primul rnd prin intermediul receptorilor membranari, nu-i mai gsesc inta structural. Incapacitatea celulelor de a recepiona semnalele reglatoare ale creterii i diviziunii sau de a rspunde adecvat acestor semnale, este cauza principal a comportamentului invaziv al celulelor maligne. Pierderea inhibiiei de contact este reflectarea modificrilor suprafeei celulare.

Adeseori, malignizarea este nsoit de sinteza unor molecule noi, localizate n oricare din compartimentele celulei i care se comport ca antigene tumorale.

Orice structur chimic a celulei maligne, absent n sau pe celulele normale ale esutului de origine a tumorii, susceptibil de a induce o reacie imunitar la gazda primar sau dup injectare la o nou gazd, poate fi considerat ca antigen tumoral.

ANTIGENE TUMORALE

Se disting urmtoarele categorii de antigene tumorale:

1. Antigenele tumorale de difereniere, denumite i antigene oncofetale, deoarece se gsesc att pe suprafaa celulelor unor tumori, dar sunt prezente i n timpul unei faze de difereniere embrionar. Ele lipsesc pe suprafaa celulelor organismului adult sau se gsesc n cantiti foarte mici, nedectabile.

a) Antigenul carcinoembrionar (CEA) s-a izolat din sngele unui pacient cu cancer de colon (1965). Este o glicoprotein de 180-200 kD, localizat pe membrana celulelor normale ale tractului digestiv la ft, dar se gsete n cantiti foarte mici la subiecii normali aduli.

La ft, CEA este sintetizat n celulele mucoasei gastro-intestinale i este concentrat n glicocalix, pe suprafaa luminal a acestor celule. In celulele embrionare normale, CEA pare a avea rol n aderena celular, dar probabil favorizeaz metastazarea celor maligne.

CEA este un grup foarte heterogen de molecule, cu o cantitate foarte variabil de glucide. Raportul proteine/glucide variaz ntre 1/1 i 1/5. Componenta glucidic este reprezentat, n primul rnd, de acidul sialic. Imunogenitatea moleculei este conferit de componenta proteic.

La adult, CEA se gsete n cantiti mici pe mucoasa colonului, n plmn, n esutul mamar, dar reapare n cantiti mari pe celulele maligne ale tractului digestiv uman (intestin subire, pancreas, ficat, stomac, colon, rect). CEA se gsete nu numai asociat suprafeei celulelor maligne, dar trece i n sngele a 60-80% dintre pacienii cu cancer de colon. Nu se cunoate mecanismul prin care CEA ajunge n snge.

Din sngele pacienilor neoplazici, CEA sintetizat de celulele maligne, este epurat la nivelul ficatului. De aceea, cele mai mari concentraii de CEA apar la neoplazicii cu insuficien hepatic (metastaze hepatice, ciroze).

CEA este un antigen nespecific, deoarece poate s apar, n concentraii mici (10 ng/ml), n sngele unor pacieni cu maladii nemaligne: la cei cu ciroz alcoolic a ficatului sau cu insuficien renal, astfel c sperana detectrii cancerului prin depistarea CEA n snge, s-a nruit.

Leziunile de orice natur ale mucoasei tractului gastrointestinal sunt nsoite de creterea sintezei i secreiei CEA, care trece i n snge: n maladia inflamatorie a intestinului, n colita ulcerativ, polipi ai tractului digestiv, tumori ale tractului gastrointestinal.

Unele tumori secret CEA, mai ales dup o metastazare hepatic (adenocarcinomul colonului, tumorile de pancreas, ficat, plmn).

Nivelul CEA foarte crescut, reflect o evoluie rapid a tumorii.

b) Alfafetoproteina (AFP) este o glicoprotein major a ftului timpuriu, o globulin normal (69 kD)a sngelui fetal uman i a celorlalte mamifere, descoperit n 1956. Coninutul glucidic este de 3,5%. Din punct de vedere structural, AFP este asemntoare albuminei. Genele codificatoare ale celor dou proteine au organizare similar. AFP se detecteaz n plasm la embrionul de 4 sptmni i crete rapid n primul trimestru de sarcin. Nivelul maxim (2-3 mg/ml) se gsete la ftul de 14 sptmni i scade la valorile caracteristice adultului, la vrsta de 6-10 luni. AFP se gsete nu numai n plasm, ci i n fluidele fetale: lichidul amniotic, lichidul cerebrospinal, urin. Cantiti mici de AFP (500 ng/ml) strbat placenta i se gsesc n serul femeilor gravide.

n timpul vieii fetale, AFP se sintetizeaz n ficat, n celulele gastrointestinale. La adultul normal, concentraia sa este nedetectabil prin metodele imunochimice obinuite, dar crete n neoplaziile de carcinom hepatic. Circa 70% din cancerele hepatice primare sunt nsoite de creterea nivelului seric al AFP. AFP crete i n alte neoplazii: testiculare, ovariene. Nu toate hepatoamele i tumorile testiculare produc AFP, dar cele care sintetizeaz aceast glicoprotein, o produc n cantiti foarte mari.

Creterea concentraiei AFP n snge nu este totdeauna asociat cu malignitatea: AFP crete n strile patologice de hepatit viral, hepatit cronic, ciroz, fapt ce reflect regenerarea celular.

AFP crete n maladiile inflamatorii ale intestinului: boala Crohn, colita ulcerativ.

AFP este un marker util pentru depistarea cancerului hepatic la populaiile cu risc nalt (chinezi, japonezi, eschimoi din Alaska), dar este inutil pentru celelalte populaii, datorit creterii nivelului su n afeciuni nemaligne.

n lichidul amniotic, nivelul crescut al AFP este asociat cu defecte ale tubului neural (spina bifida).

2. Antigenele de transplantare a tumorilor (TATA = tumor associated transplantation antigen).

a) Antigenele specifice de organ se exprim la un nivel nalt pe celulele tumorale, n timp ce exprimarea lor pe celulele normale este foarte sczut sau este limitat la un anumit stadiu al dezvoltrii esutului.

Antigenul specific prostatei (PSA) este fosfataza acid prostatic, o glicoprotein cu activitate proteolitic asupra gelului seminal, pe care-l hidrolizeaz. PSA se gsete n esutul prostatic normal, n adenomul benign i n carcinomul malign. Este produs de celulele acinare ale prostatei. n ser, PSA este legat cu 1-antichimiotripsina, ceea ce influeneaz valorile furnizate de determinarea sa cantitativ.

PSA crete mult n cancerul prostatic, cel mai comun cancer la vrsta de peste 75 se ani, dar crete i n hipertrofia prostatic benign. Concentraia sa se coreleaz cu volumul prostatei, cu stadiul cancerului prostatic, cu rspunsul la terapie.

Glicoproteinele mucinoase sunt antigene de suprafa celular, cu greutate molecular mare.

Sunt formate dintr-o ax polipeptidic, de care se ataeaz numeroase catene oligozaharidice. Glucidele reprezint 60-80% din greutatea lor molecular. Sinteza glicoproteinelor mucinoase este consecina pierderii controlului metabolismului celulei neoplazice. Uneori, celula malign pierde capacitatea de sintez a unor glicoproteine de suprafa, ca de exemplu antigenul de grup sanguin A i sintetizeaz molecule absente n celulele normale.

Glicoproteinele mucinoase se exprim pe suprafaa celulelor epiteliale i se detecteaz n ser, saliv, ori sunt adsorbite pe eritrocite. Ele s-au identificat odat cu disponibilitatea anticorpilor monoclonali: CA 15-3, CA 125, asociate cu cancerele ovariene, CA 19-9, identificat ntr-o tumor colorectal (CA = cancer associated). Modificarea cantitativ a glucidelor membranare poate modifica dramatic malignitatea, influennd potenialul de metastazare.

Markerii tumorali imunoglobulinici se identific prin electroforeza serului sau a urinii. Aparin izotipurilor IgG, A, M, E sau sunt catene k sau libere. Aproximativ, 1% din aduli au proteine

serice M (monoclonale), iar din acestea 25% au semnificaie nedeterminat. 50% din totalul proteinelor serice M sunt datorate mielomului multiplu. Determinarea proteinelor M n snge sau urin este util pentru monitorizarea rspunsului la terapie.

b) Antigenele specifice fiecrei tumori sunt antigene individuale (TSTA = tumor specific transplantation antigen), proprii fiecrei tumori. Sunt exprimate numai n celulele tumorale i nu sunt niciodat detectabile n esuturile normale. Sunt caracteristice tumorilor induse chimic (L. Gross, 1953). Chiar tumorile multiple induse de acelai agent chimic (metilcolantren), n acelai esut (tegument) al unui organism, sunt diferite n ceea ce privete specificitatea antigenelor de transplantare. Aceasta semnific faptul c informaia genetic declanatoare a malignizrii, rezid n gene diferite, care sufer mutaie sub aciunea agentului chimic. Fig. 131. Tumorile tegumentare induse de un agent chimic (de exemplu, metilcolantrenul) posed antigene tumorale strict individuale.

Toate celulele unei tumori induse de metilcolantren sunt identice din punct de vedere antigenic, fapt demonstrat experimental: oarecele imunizat cu mojarat de celule tumorale, respinge ulterior o gref de celule vii ale aceleiai tumori.

Datorit unicitii lor antigenice, fiecare tumor indus chimic, stimuleaz imunitatea fa de antigenele proprii, iar reaciile ncruciate sunt absente totdeauna.

Antigenele tumorale specifice de transplantare sunt complexe glicoproteice sintetizate n celul i inserate n membrana citoplasmatic.

Celulele maligne pot s prezinte simultan, att antigene tumorale comune, ct i antigene specifice.

Tumorile care apar n mod natural sunt slab sau deloc antigenice.

Nu se tie dac antigenele tumorale sunt prezente de la nceput pe toate celulele tumorale sau dac celula devine malign, fr s dobndeasc markerii distinctivi de malignitate. Antigenele tumorilor induse de ageni chimici pot fi stabile i se transmit de la o generaie celular la alta, dar majoritatea tumorilor induse de ageni chimici, trebuie considerate heterogene din punct de vedere antigenic, datorit instabilitii genetice.

Antigenele suprafeei celulelor maligne sunt supuse modificrilor cantitative i calitative.

La om, 90% din tumori sunt induse de ageni chimici.

3. Antigenele de origine viral sunt comune i se gsesc la toate tumorile induse de acelai virus, chiar la specii diferite.

Antigenele tumorilor induse de oncodnavirusuri sunt codificate de programul timpuriu al informaiei genetice virale. De exemplu, virusurile polioma i SV40 induc tumori la animalele de experien, iar virusul papiloma este implicat n geneza tumorilor de cervix uterin uman.

Virusurile oncogene ADN induc sinteza antigenelor tumorale cu localizare nuclear i membranar. Sunt proteine nestructurale, care se disting de antigenele capsidei virale. In celulele transformate cu oncodnavirusuri, nu se detecteaz antigene capsidale, deoarece programul tardiv al genomului viral nu este transcris i virusul progen nu este asamblat.

SV40 codific sinteza a dou proteine virale (antigene tumorale), de 94 i respectiv 17 kD, iar virusul polioma codific sinteza a trei antigene, de 100, 55 i respectiv de 22 kD. Antigenul T de 100 kD are o localizare aproape exclusiv nuclear i se sintetizeaz att n celulele infectate productiv, ct i n cele transformate. Antigenul de 55 kD este o protein fosforilat ce se asociaz cu oncoproteina Src, o chinaz tirozin-specific, codificat de protooncogena c-src. Interaciunea cu antigenul viral produce o stimulare de circa 50 de ori a activitii chinazice a oncoproteinei celulare Src.

Antigenele T sunt comune i pentru alte virusuri ale grupului. Toate tumorile induse de un virus, au antigene comune, chiar la specii diferite. Imunizarea organismului receptor de gref de esut tumoral cu celule tumorale iradiate sau cu mojarat de celule tumorale de acelai tip este protectoare fa de dezvoltarea tumorii transplantate.

Antigenele T, codificate de oncodnavirusuri nu se gsesc n structura virionului (proteine nestructurale). De aceea, virionii inactivai nu imunizeaz i nu protejeaz organismul fa de suspensia de celule tumorale omologe (transformate de acelai virus).

Antigenele tumorale codificate de oncornavirusuri sunt comune pentru toate tumorile induse de un virus, indiferent de specificitatea antigenic a celulei. Majoritatea sunt antigene proteice virale structurale, adic se regsesc n structura virionului, ceea ce le deosebete net de antigenele codificate de oncodnavirusuri.

Antigenele tumorilor induse de oncornavirusuri sunt codificate de gena env i au specificitate de grup. Multiplicarea oncornavirusurilor nu interfer cu capacitatea celulelor de a crete i de a se divide. Deoarece antigenele tumorale sunt proteine structurale ale virionilor, imunizarea organismului cu o suspensie viral inactivat, confer protecie fa de celulele transformate de virusul omolog.

Spre deosebire de antigenele induse chimic, care pot fi tari sau slabe, antigenele codificate de virusurile oncogene sunt foarte imunogene.

La om, circa 10% din totalul tumorilor sunt cauzate de virusuri:

- carcinomul hepatocelular (indus de virusul hepatitei B)

- cancerul de col uterin (indus de papilomavirusuri HPV16, HPV18)

- limfomul Burkitt i carcinomul nazofaringian (induse de virusul Epstein-Barr)

- leucemia celulelor T mature (indus de HTLV-1).

4. Antigenele tumorale codificate de protooncogene. Mutaiile punctiforme ale oncogenelor genele ce regleaz creterea normal i diferenierea - i mutaiile genelor supresoare ale oncogenelor, ca de exemplu, p53 i Rb, produc substituii ale unui singur aminoacid n catena polipeptidic codificat, care le transform n antigene tumorale, codificate de genom. Ele au localizare nuclear, citoplasmatic sau membranar. S-au descris peste 10 antioncogene (supresoare ale oncogenelor) i circa 100 de oncogene (de exemplu, genele ras), ale cror mutaii punctiforme determin sinteza unor molecule cu substituii punctiforme de aminoacizi, unice sau multiple i care se deosebesc de moleculele normale. Antioncogena p53 codific o protein nuclear, reglatoare a diviziunii celulare. In celulele maligne, p53 se sintetizeaz n exces.

Dup localizare, antigenele tumorale sunt:

- antigene expuse la suprafaa celulei. Sunt cele mai importante, deoarece sunt accesibile efectorilor rspunsului imun (TSTA, TATA);

- antigene intracelulare, localizate n nucleu sau n citoplasm.

Ambele categorii de antigene, se pot elibera fie din celulele vii, fie dup necroz i se gsesc n circulaie, la distan de tumor. Eliberarea lor poate stimula rspunsul imun sau are un efect de blocare a reactivitii imunitare, prin fenomenul de inundare antigenic.

Anticorpii antitumorali se obin prin injectarea celulelor tumorale viabile, ori a mojaratului tumoral, la organismele altei linii genetice sau altei specii, care poart alte molecule CMH. Celulele vor fi respinse ca o gref alogenic. Antiserul conine anticorpi anti-antigene tumorale, dar i anticorpi anti-antigene CMH. De aceea, serul imun trebuie absorbit cu antigene tisulare normale. Astfel s-a evideniat CEA la pacienii cu tumori de colon i AFP la cei cu hepatoame. Antigenul evideniat de anticorpi n serul absorbit poate fi un antigen tumoral sau un antigen normal, exprimat abundent pe celulele tumorale.Fig. 132. Modificri ale suprafeei celulei, asociate cu transformarea malign (dup Roitt, 1997).

Procesul dezvoltrii tumorii are loc n cteva trepte:

- transformarea celulei normale n celul malign

- creterea exponenial a celulei maligne i constituirea tumorii primare

- angiogeneza

- invazia esutului nconjurtor

- intravazarea i eliberarea celulelor tumorale individuale, n vasele sanguine i limfatice, unde trebuie s supravieuiasc

- oprirea celulelor tumorale n diferite localizri (ficat, plmn etc.)

- extravazarea celulelor tumorale i invazia acestor esuturi

- creterea tumorii la noile situsuri de metastazare i angiogeneza.

Fiecare etap a dezvoltrii tumorii este influenat de factori imunologici i neimunologici. De exemplu, integrinele condiioneaz interaciunile dintre celule. Cu ct aderena celulelor maligne este mai bine exprimat, cu att tendina ei de metastazare este mai limitat. Celulele maligne elibereaz unele componente membranare, ca de exemplu, fibronectina. Pierderea fibronectinei pare s determine scderea aderenei majoritii tipurilor de celule maligne i precede metastazarea. Componentele glicocalixului sunt eliberate sub aciunea proteazelor, pe care le secret celulele tumorale. Proteazele (din categoria metaloproteazelor) modific consistena substanei fundamentale a esutului conjunctiv, degradeaz colagenul i proteoglicanii, uurnd metastazarea i invazia.

RSPUNSUL IMUN ANTITUMORAL

Creterea anormal este prevenit prin diferite mecanisme de control: mecanisme de reparare a ADN, aciunea genelor supresoare ale oncogenelor (antioncogene) sau prin apoptoza celulelor care au suferit leziuni ireversibile. Dac aceste mecanisme nu mai sunt operative, celula continu s prolifereze. Celula malign se afl ntr-o interaciune dinamic cu micromediul, ce determin supravieuirea sau moartea ei.

Imunogenitatea tumorilor pentru gazd i stimularea timpurie a rspunsului imun antitumoral a condus la formularea conceptului imunosupravegherii, n acord cu care, organismele elimin celulele potenial canceroase care apar n cursul vieii individuale. Conform acestui concept, cancerul clinic este consecina scprii celulelor maligne, de aciunea mecanismelor protectoare. De aceea, factorii care interfer cu reactivitatea imunitar, predispun la malignitate. In concepia

actual, malignizarea este rezultatul activrii oncogenelor sau pierderii funciei genelor supresoare ale oncogenelor (antioncogene).

Teoria supravegherii imune afirm c sistemul imunitar, monitorizeaz constant organismul, pentru apariia celulelor tumorale i c majoritatea acestor celule aberante suntdetectate i lizate de sistemul imunitar, nainte de a produce tumori clinice. Aa se ntmpl cu celulele tumorale intens imunogene. Majoritatea (sau toate) celulele tumorale care apar spontan, sunt imunogene i rspunsul imun inhib creterea tumorii.

Argumentele n favoarea sau contra acestei teorii sunt greu de obinut. Ele sunt extrapolate din observaii asupra tumorilor clinice.

Dispariia spontan a tumorilor i recuperarea complet a pacienilor cu cancer diseminat, este rar, dar exist i este explicat prin insuficiena vascularizaiei, prin procese de difereniere a celulelor tumorale, prin mecanisme psihosomatice. O explicaie imunologic, este c raportul dintre creterea tumorii i rspunsul imun antitumoral este n favoarea rspunsului imun. Exist dovezi care sugereaz c organismul uman rspunde la prezena tumorilor, prin mecanisme imunitare:

- regresia spontan, n special a meloanoamelor maligne, a carcinoamelor renale, a neuroblastomului i retinoblastomului, semnalat n peste 100 de cazuri publicate;

- unele tumori evolueaz latent, o lung perioad, adic cresc foarte ncet sau sunt complet inactive i apoi brusc metastazeaz. Latena se poate explica prin echilibrul dintre tumor i sistemul imunitar;

- frecvent tumorile sunt infiltrate cu celule mononucleare: limfocite, monocite, puine plasmocite. Celulele T i macrofagele sunt prezente abundent n tumorile umane, sugernd un rspuns imun antitumoral. Celulele T activate fa de tumora autolog, s-au izolat din cteva tipuri de tumori(melanom malign, carcinom renal, cervical). Ele recunosc peptide asociate cu moleculele CMH I, care sunt represate n celulele normale sau peptide derivate din proteinele mutante;

- carcinoamele asociate cu reacie inflamatorie evolueaz mai lent dect cele care nu manifest un rspuns inflamator;

- tumorile sunt mai frecvente la organismele foarte tinere (datorit imaturitii sistemului imunitar) i la cele vrstnice (datorit senescenei sistemului imunitar);

- anumite categorii de tumori (cancerele de piele cu papiloma virus, limfoamele pozitive pentru antigenele EBV) au o inciden crescut la pacienii cu transplant, supui imunosupresiei. Imunosupresia prelungit (20 de ani), este asociat cu creterea incidenei tumorilor de origine viral, n timp ce incidena celorlalte categorii de tumori, crete foarte puin. Dovezile clinice sugereaz c rspunsul imun este orientat predominant fa de infecia cu virusuri oncogene i neoncogene, iar rata apariiei altor tumori este relativ nemodificat. Aceasta arat, indirect, c supravegherea antitumoral este relativ ineficient. Datele experimentale sprijin ideia c supravegherea imun este orientat, n primul rnd, fa de virusuri oncogene ADN i nu fa de oncorna- sau fa de tumorile induse de agenii chimici carcinogeni.;

- celulele metastatice sunt comune la pacienii cu cancer, dar frecvena implantrii lor i creterea tumorilor secundare este mic. Efectorii rspunsului imun antitumoral

Dac sunt prezente, multe antigene tumorale stimuleaz rspunsul imun la animalele de experien i pot induce o stare de rezisten antitumoral fa de celulele transplantate. Rspunsul imun antitumoral are o eficien foarte variabil, n funcie de natura antigenelor. Astfel, antigenele induse de virusurile oncogene sau ale tumorilor induse de radiaiile UV, sunt foarte imunogene i stimuleaz rspunsul imun protector, iar antigenele de transplantare ale tumorilor induse chimic sunt slabe. Tumorile care apar spontan la animale i la om sunt puin antigenice i induc un rspuns imun de mic intensitate.

Antigenele asociate celulelor tumorale sunt recunoscute ca nonself, de sistemul imunitar al gazdei, dar tumorile secret antigene solubile, care tind s produc fenomenul de inundare antigenic i paralizie imunitar.

Rspunsul imun antitumoral este humoral i celular. Anticorpii specifici, de cele mai multe ori, nu au eficien antitumoral. Cel mai adesea, celulele tumorale supravieuiesc aciunii factorilor humorali i se multiplic. Ineficiena aciunii lor s-a demonstrat n experiene cu celule maligne nchise n camere poroase, permeabile numai pentru molecule, amplasate n cavitatea abdominal a unor organisme imunizate cu mojarat de esut tumoral. Anticorpii sunt efectori eficieni fa de celulele maligne de origine limfoid (leucemii, limfoame). Dup activarea complementului, se produce liza celulei int.

Efectorii imunitii antitumorale sunt celulele. Rolul lor s-a demonstrat cu acelai gen de experimente, cu celule maligne plasate n camere poroase, care permit trecerea celulelor efectoare ale rspunsului imun. Rezultatul aciunii celulelor imunitare este liza celulei int.Fig. 133. Antigenul tumoral poate fi prezentat celulelor T, pe diferite ci: direct, n absena costimulilor necesari, rezultatul fiind anergia; direct de celula tumoral care exprim molecule costimulatoare, rezultnd activarea celulelor Tc; direct de celulele tumorale i indirect via CPA, producnd activarea limfocitelor Tc i Th (dup Roitt, 1997).

Imunitatea celular antitumoral este mediat de celule capabile s lizeze celulele int, prin interaciune specific sau de celule care nu necesit procese de recunoatere specific.

Rolul celulelor NK

Celulele NK sunt cei mai importani efectori ai imunitii antitumorale. Aciunea lor nu este limitat de identitatea moleculelor CMH i i exercit efectul prin contact direct. Celulele NK nu necesit prezentarea antigenului de ctre celulele accesorii. Mecanismul molecular al interaciunii lor cu celula int nu este cunoscut.

Activitatea celulelor NK se modific cu vrsta: are nivel sczut la natere, atinge maximum la pubertate i scade gradat cu vrsta. Activitatea lor fa de celulele maligne, in vitro, este invers proporional cu nivelul moleculelor CMH I, exprimate pe suprafaa celulelor maligne. Exprimarea moleculelor CMH I poate duce chiar la scparea celulelor tumorale de a fi recunoscute de celulele NK, in vivo. Se presupune c celulele NK controleaz celulele pentru nivelul expresiei CMH I. Celulele care au pierdut total sau parial moleculele CMH I, par a fi recunoscute ca inte i lizate. Deoarece aciunea celulelor NK nu este restrictiv n raport cu moleculele CMH, ele sunt active fa de celulele tumorale singenice, alogenice i chiar xenogenice.

Importana funcional a celulelor NK pentru protecia antitumoral este argumentat de faptul c liniile de oareci congenital atimici sau cei timectomizai neonatal au un numr mare de celule NK

Celulele K interacioneaz cu celula int prin intermediul receptorilor pentru Fc . Celula tumoral tapetat cu IgG este astfel uor recunoscut de celulele K. Ele se activeaz i lizeaz celula int prin fenomenul ADCC.

Activitatea celulelor NK i K din snge, testat in vitro, scade odat cu progresia tumorii. La contactul cu celula malign, direct sau mediat de anticorpi, celula efectoare elibereaz factori citotoxici solubili: perforina, proteaze, TNF-, limfotoxina (TNF-). Mecanismul eliberrii factorilor litici este acelai, descris pentru limfocitulTc.

Celulele NK, activate in vitro de IFN- i de IL-2, se numesc LAK (celule killer activate de limfochine).

Activarea celulelor NK i K nu produce memorie imun. Nu exist diferene ntre rspunsul imun primar i secundar.

Citotoxicitatea mediat de macrofage

Macrofagul neactivat (de la indivizi normali) exprim un nivel minim de citotoxicitate antitumoral.

Macrofagul activat distinge celulele tumorale de celulele normale i poate s omoare selectiv, celulele tumorale. Activitatea sa citotoxic este independent de moleculele CMH, dar este dependent de factori genetici.Macrofagul se activeaz n urmtoarele situaii:

- dup ce leag prin receptorul pentru Fc, moleculele de imunoglobulin fixate pe determinanii antigenici ai celulei maligne sau complexele IgAg tumoral solubil;

- sub aciunea factorilor eliberai de celulele T sensibilizate (IFN )

- sub aciunea endotoxinelor bacteriene

- sub aciunea antigenelor de Mycobacterium, Listeria, Toxoplasma sau dup infecia cu aceste microorganisme intracelulare.

Activarea const n amplificarea ratei metabolice i macrofagul devine killer potenial al celulelor tumorale. Macrofagul activat nu interacioneaz cu antigenele tumorale specifice, dar

ca i celulele NK, pare s disting ntre celulele maligne i cele normale, prin mecanisme moleculare necunoscute.

Macrofagele activate secret diferite molecule antitumorale:

- enzime hidrolitice care degradeaz esutul conjunctiv

- IFN-, activator al celulelor NK

- TNF- (caectina) cu efect stimulator asupra altor celule care elibereaz IL

- H2O2 i produi de oxidare a glucozei, cu efect toxic direct asupra celulei int, prin perturbri membranare

- oxidul nitric (NO), toxic pentru celulele maligne. NO se formeaz prin combinarea oxigenului cu azotul derivat din dezaminarea enzimatic oxidativ a L-argininei. Reacia este catalizat de nitric-oxid-sintaz. NO mediaz citotoxicitatea macrofagului, dependent de L-arginin.

Una din cauzele primare ale patologiei maligne este metastazarea, adic eliberarea celulelor din situsul tumorii primare, pentru a iniia la distan, creterea unei noi tumori. Celulele metastazate au aceleai antigene de suprafa, ca i tumora primar. Principalele situsuri de metastazare sunt ganglionii limfatici, plmnul, ficatul.

n studiile experimentale, macrofagele activate s-au dovedit a fi foarte eficiente n reducerea incidenei metastazelor unor tumori.

Imunitatea mediat de celulele T

Imunitatea antitumoral mediat de celulele T, ca mecanism, este analog rspunsului imun fa de alte antigene T-dependente (de exemplu, antigenele CMH). Experienele in vitro au evideniat c antigenele tumorale stimuleaz proliferarea tuturor subpopulaiilor de limfocite T (Th, Ts, Tc). Funciile efectoare ale limfocitelor T sunt stimulate de limfochine i monochine (IL-1 i TNF-), sintetizate i secretate de macrofagele care prezint antigenele tumorale solubile.

IL-1 stimuleaz proliferarea celulelor B, T i NK. IL-1 produce i rspunsul febril n reacia inflamatorie, iar TNF- determin necroza celulelor tumorale.

Limfocitele TCD4 (i NK) secret IL-2, cu efect stimulator asupra celulelor care o secret.

IFN este secretat de celulele TCD4 (i NK) i activeaz macrofagele i celulele NK. Interferonul are efect antitumoral direct, dar este i imunomodulator.

Limfocitele Tc au rol important n liza celulelor tumorale, dac acestea exprim molecule CMH I. Interaciunea limfocitului Tc cu celula malign este specific. Limfotoxina produs de limfocitul Tc are efect litic direct asupra celulelor tumorale.

Celula tumoral expune pe suprafaa ei, antigene asociate cu moleculele CMH I, dar elimin i molecule solubile, care sunt preluate de CPA i prezentate limfocitelor Th. Acestea secret IL-2, activatoare pentru toate tipurile de celule cu funcie imunitar, specific sau nespecific.

n concluzie, reacia imun fa de celulele tumorale are dou trepte. In prima etap sunt activate celulele efectoare nespecifice (macrofage, eozinofile, neutrofile, celule NK) i se produce o reacie inflamatorie local. Reacia nespecific uureaz reacia imun specific, prin diminuarea ratei de cretere a tumorii i creterea nivelului de prezentare a antigenelor tumorale de ctre celulele maligne, prin modularea exprimrii moleculelor CMH. In faza a II-a, celulele Tc asigur protecia imun fa de creterea tumorii.

Celulele efectoare ale imunitii mediate celular, specific i nespecific, sunt eficiente n detectarea i liza celulelor tumorale izolate i transplantate. Deoarece detecteaz celulele tumorale izolate, ele sunt eficiente n prevenirea metastazelor, dar sunt ineficiente fa de celulele care constituie o microtumor.

Mecanisme de scpare a celulelor tumorale

Antigenele tumorale se gsesc pe suprafaa celulelor tumorale. Ele sunt antigene TSTA, mai concentrate sau mai diluate. Antigenele CMH normale nu dispar, dar diminu cantitativ.

Creterea tumorilor, n condiiile activrii rspunsului imun, nu este explicat satisfctor. S-au propus mai multe mecanisme prin care celulele tumorale evit recunoaterea de ctre efectorii rspunsului imun. Cnd sistemul imunitar este alertat, esutul tumoral este prea dezvoltat i nu mai poate fi nlturat.

De cele mai multe ori, tumora nu este imunogen. Lipsa imunogenitii nu se datoreaz absenei antigenelor tumorale, ci faptului c celulele tumorale nu sunt eficiente n prezentarea antigenului.

Cel mai surprinztor i cel mai studiat mecanism de evitare a rspunsului imun este modularea antigenic. Fenomenul modulrii antigenice definete capacitatea tumorii de a masca sau de pierde antigenele, n prezena efectorilor imunitari. De exemplu, celulele leucemice transplantate la oarecele imunizat cu mojaratul celulelor leucemice care conin antigenul TL, au pierdut antigenul TL, dar antigenul reapare dup transplantul celulelor leucemice la oarecii care nu au anticorpi serici anti-TL.

Imunoselecia. Antigenele exprimate pe suprafaa celulelor tumorale activeaz rspunsul imun mediat celular, iar antigenele solubile stimuleaz sinteza anticorpilor. Unele celule tumorale, ca rezultat al instabilitii genetice, pierd antigenele iniiale i astfel evit efectorii rspunsului imun specific. Ele devin dominante n masa tumorii. Noile variante antigenice induc rspunsul imun specific, dar fenomenul schimbrii specificitii antigenice se repet. Rspunsul imun nu induce schimbarea specificitii antigenice a suprafeei celulei maligne, ci selecteaz celulele care au suferit modificarea antigenic i astfel au devenit rezistente la aciunea efectorilor imunitari.

Diminuarea reactivitii imunitare pe cale natural sau artificial este nsoit de creterea incidenei neoplaziilor. Imunosupresia natural este mediat de limfocitele Ts. Antigenele tumorale par s activeze mai uor celulele Ts dect limfocitele Th. Limfocitele Ts sunt mai numeroase la pacienii neoplazici i pot s represeze rspunsul imun pn la ineficien total.

Celulele tumorale secret citochine cu aciune imunosupresoare, prin efectul lor inhibitor asupra interleuchinelor. Celulele maligne produc IL-10, detectat n lichidul peritoneal i n serul pacientelor cu cancer ovarian sau cu alte neoplasme intraperitoneale. IL-10 inhib exprimarea moleculelor CMH II pe suprafaa monocitelor i macrofagelor i diminu reactivitatea imunitar prin efectele sale multiple asupra limfocitelor, monocitelor, celulelor NK i celulelor dendritice.

Reactivitatea imunitar poate s diminue datorit mascrii antigenelor tumorale. De exemplu, sialomucina, abundent pe suprafaa celulelor unor tumori, mascheaz antigenele tumorale i le face inaccesibile recunoaterii imunitare i efectorilor imunitari. Sialomucina poate fi

ndeprtat, in vitro, prin tratamentul celulelor cu neuraminidaz de Vibrio cholerae i celulele i dobdesc sensibilitatea la aciunea litic a efectorilor imunitari.

Diminuarea reactivitii imunitare se poate datora inundrii organismului cu antigenele tumorii. Fiind o celul foarte activ din punct de vedere metabolic, componentele membranei sale au un turn-over ridicat. Antigenele eliberate se complexeaz cu anticorpii specifici sau cu receptorii specifici ai limfocitelor, fcndu-i ineficieni n recunoaterea celulelor maligne. Efectul imunosupresor al antigenelor tumorale este proporional cu dimensiunile tumorii i dependent de existena metastazelor.

Efectul de inundare cu antigenele tumorii este argumentat de experienele de transplant tumoral. Numrul celulelor transplantate este determinant pentru dezvoltarea tumorii. Grefarea unui numr mic de celule (prin injectarea suspensiei) este urmat de respingere, iar grefarea unui numr mare de celule este urmat totdeauna de creterea tumorii. Dup ce organismul a respins un numr mic de celule maligne transplantate, se va apra fa de un numr progresiv crescnd de celule de acelai tip. Imunitatea de transplantare fa de antigenele tumorale poate fi depit de un numr de 100-10 000 mai mare de celule tumorale, dect numrul de celule necesar grefei tumorii la animalele neimunizate.

Efectul imunosupresor al tumorii. Pacienii purttori de tumori mari nu rspund la antigenele tumorale, iar limfocitele lor in vitro, au o slab activitate citotoxic fa de celulele tumorale autologe.

Antigenele tumorale exercit un efect imunosupresor n gradient. La un situs ndeprtat de tumor, efectul imunosupresor diminu i inoculul mic de celule tumorale este respins. Dup ce tumora a dobndit dimensiuni importante, efectul imunosupresor este sistemic. Antigenele tumorale circulante se asociaz cu celulele efectoare ale sistemului imunitar, chiar n sngele circulant, producnd paralizia rspunsului imun.

Creterea tumorii poate fi stimulat prin fenomenul de enhancement imunitar. Fenomenul de enhancement, descoperit experimental, se definete ca un proces de intensificare a creterii tumorii, n prezena anticorpilor specifici. Tumorile au fost transplantate la organisme imunizate cu mojarat celular al aceleiai tumori, pentru sinteza anticorpilor specifici. Anticorpii nu numai c nu resping celulele grefate, ci determin un efect invers, de stimulare a creterii tumorii, comparativ cu creterea sa la animalele neimunizate. Anticorpii cu efect de enhancement sunt IgG, la titru mic.

Fenomenul de enhancement se explic astfel:

- anticorpii ar putea induce un efect imunosupresor, deoarece prin feed-back inhib sinteza anticorpilor potenial citolitici;

- anticorpii de enhancement sunt citofili, adic se leag specific pe suprafaa celulelor tumorale, formndu-se complexe Ag-Ac, care blocheaz fizic ataarea efectorilor humorali sau celulari.

Evoluia tumorii este condiionat, ntr-o oarecare msur, de tipul anticorpilor care se sintetizeaz.

Tolerana imunitar este un mecanism eficient de scpare a celulelor tumorale de aciunea efectorilor sistemului imunitar. Tolerana se datoreaz lipsei de reactivitate a limfocitelor Tc i B, care la contactul cu antigenele tumorale nu se sensibilizeaz i nu genereaz rspunsul imun, dei fa de alte antigene, reactivitatea imunitar este normal. Tolerana survine datorit stimulrii repetate cu cantiti mici de antigene, dar un rol esenial n inducerea toleranei imunitare pare s revin raportului dintre limfocitele Th i Ts.

Diferite produse tumorale, altele dect antigenele, pot s interfere cu funcia imunitar i s favorizeze instalarea toleranei imunitare. De exemplu, prostaglandinele diminu nivelul exprimrii moleculelor CMH II pe suprafaa celulelor prezentatoare de antigen i pot de asemenea s suprime activitatea celulelor NK.

Factorii genetici, neidentificai, influeneaz evoluia tumorii. Unele neoplazii sunt asociate cu incapacitatea limfocitelor T de a activa rspunsul imun, probabil datorit incapacitii lor de a recunoate antigenul.

n concluzie, micile acumulri de celule tumorale, stimuleaz rspunsul imun. Dar, chiar tumorile imunogene continu s creasc la gazdele imunocompetente, datorit eficienei sczute a rspunsului imun antitumoral in vivo. Tumorile evit aciunea distructiv a efectorilor imunitari sau blocheaz chiar rspunsul imun.

Abordri terapeutice ale neoplaziilor

Terapia neoplaziilor este abordat pe urmtoarele ci: chirurgical, radioterapia, chimioterapia i imunoterapia. Oricare ar fi modalitatea de tratament, este necesar reducerea prealabil a masei tumorale prin rejecie chirurgical.

Terapia chirurgical are ca scop reducerea dimensiunilor tumorilor solide, n stadiile timpurii ale neoplasmelor de sn, colon, plmn, prostat - cele 4 maligniti majore la om, ce reprezint peste 50% din totalul tumorilor solide.

Radioterapia poate fi primar sau secundar. Cea primar se practic n cancerele capului, gtului i n maladia Hodgkin (neoplazie a ganglionilor limfatici, din diferite regiuni ale corpului). Radioterapia este mai eficient pentru esuturile moi, n arii adiacente maxilarelor i cilor nazale. Iradierea total se practic nainte de transplantul mduvei osoase i este foarte eficient pentru anumite leucemii acute, refractare la chimioterapie i pentru tratamentul unor tumori solide (cancer de sn), care au revenit dup civa ani de remisiune.

Chimioterapia const n tratamentul cu medicamente citotoxice, majoritatea fiind produse de sintez chimic. Scopul chimioterapiei este de a omor selectiv celulele maligne, deoarece au o rat superioar de cretere i diviziune. Cele mai sensibile la chimioterapie sunt leucemiile. Efectul medicamentelor citotoxice este dependent de doz. Dozele prea mici nu produc efect, iar cele mari au efecte toxice asupra organismului, n special asupra mduvei osoase i asupra celulelor cu o rat mare de diviziune. Doza se calculeaz la aria de suprafa corporal, preferabil raportrii la greutate. Majoritatea agenilor citotoxici se administreaz intravenos, calea oral fiind adecvat pentru ciclofosfamid (i pentru tamoxifen).

Agenii chimioterapeutici, n funcie de mecanismul aciunii lor, aparin mai multor clase.

Agenii alchilani induc formarea legturilor transversale stabile ntre cele dou catene ale AND (prin legarea de N7 a guaninei) i inhib replicarea moleculei de ADN. Interaciunea poate s se produc cu una sau cu ambele catene ADN. Alchilarea guaninei induce mperecherea anormal cu timina sau depurinarea prin excizia resturilor de guanin. Consecina este ruperea catenei de ADN. Dac legtura transversal se face ntre resturile de guanin ale celor dou catene, excizia reparatorie poate s rup molecula de ADN i s rezulte o mutaie letal pentru celul. Agenii alchilani reacioneaz chimic cu gruprile sulfhidril, amino, hidroxil i fosfat. Aciunea lor nu are specificitate de faz a ciclului celular, dar celulele sunt mai sensibile n faza G1 i S. Efectul se manifest prin blocarea ciclului celular dup faza G2.

Mecanismul rezistenei dobndite la agenii alchilani poate s conste ntr-o retenie sczut a agentului n celul, n creterea sintezei compuilor sulfhidril cu greutate mic i n creterea

capacitii de reparare a leziunilor ADN. Dei au mecanisme asemntoare de aciune, diferenele structurii moleculare reduc gradul rezistenei ncruciate ntre compuii subclaselor majore. Efectele secundare sunt gastrointestinale (grea, vom) i hematologice (mielosupresie).

Ciclofosfamida este cel mai folosit agent alchilant, n tratamentul malignitilor hematologice i a tumorilor solide. Este convertit la forma activ n ficat

Compuii platinei (cisplatin, carboplatin) nu sunt ageni alchilani, dar acioneaz printr-un mecanism similar, adic se leag de N7 al guaninei i realizeaz legarea ncruciat a catenelor de ADN. Se leag i cu alte molecule: adenina, citozina, ARN, proteine.

Antimetaboliii (citarabina, fluorouracil, metotrexat, mercaptopurina, hidroxiureea) sunt analogi ai bazelor azotate i inhib sinteza ADN, ARN sau sinteza proteinelor. Sunt ageni cu specificitate de faz a ciclului celular.

Antagonitii pirimidinelor. Citarabina (Ara-C) este un compus cu specificitate de faz S. Este metabolizat n celul la forma activ, ara-CTP, inhibitor al ADN-polimerazei i al sintezei ADN. Ara-C este ncorporat n ADN i blocheaz alungirea catenei, ca i legarea fragmentelor n molecula de ADN nou sintetizat.

Antagonitii purinelor. 6-mercaptopurina i 6-tioguanina sunt convertite la forma nucleotidic de hipoxantin-guanin fosforibozil transferaz (HGPRT). Metaboliii lor inhib unele enzime ale cii purinice. Unii metabolii ai 6-tioguaninei sunt ncorporai n ADN i n ARN.

Fludarabina este analog al adeninei. Derivatul su, fludarabin-trifosfat, acioneaz prin inhibiia ADN-polimerazei i ribonucleotid-reductazei i prin ncorporarea n ADN

Antagonitii acidului folic (metotrexat, aminopterina) sunt analogi structurali ai acidului folic.

Alcaloizii din plante (vincristina i vinblastina, izolai din Vinca rosea), produc agregarea tubulinei i dezorganizarea microtubulilor celulari. Vinblastina este toxic pentru mduva hematopoetic, iar vincristina are efecte toxice majore asupra terminaiilor nervoase periferice, producnd neuropatii senzoriale (parestezie, adic lipsa senzaiei de durere) i motorii, n degete.

Pentru un numr mare de categorii de tumori, chimioterapia determin o citoreducere important. Dar, la cteva luni sau la civa ani, creterea tumoral este reluat i continu chiar n condiiile reinstituirii tratamentului. Creterea reflect dobndirea rezistenei specifice la medicamentele administrate.

n general, dezvoltarea rezistenei la un medicament este considerat ca rezultat al unei rate nalte a mutaiilor celulelor maligne, consecina fiind apariia unor subpopulaii heterogene, din care unele sunt rezistente la diferite medicamente. Cea mai important mutant este cea cu rezisten medicamentoas multipl, mediat de glicoproteina P, o glicoprotein membranar, care funcioneaz ca o pomp de eflux, dependent de energie. Pompa elimin activ din celul, o varietate de ageni citotoxici: alcaloizii din plante, antibioticele (dactinomicina, doxorubicina, daunorubicina) i unii ageni sintetici (melphalan). Celulele maligne mutante, care exprim gena codificatoare a glicoproteinei P, sunt rezistente la o larg varietate de medicamente anticanceroase.

Imunoterapia ncearc s distrug celulele maligne, prin manipulri de stimulare a reactivitii a sistemului imunitar.

Injectarea citochinelor sau stimularea in vitro, cu IL-2, a limfocitelor autologe, obinute din sngele pacientului, are efecte stimulatoare asupra rspunsului imun. Rareori s-a produs remisiunea complet a neuroblastomului, a carcinomului renal sau a melanomului malign, ceea ce evideniaz c rspunsul imun fa de aceste neoplazii poate fi stimulat. Fig. 134. Modelul unei celule maligne care exprim glico-proteina P, o protein transmembranar care funcioneaz ca o pomp de efluaturale sau artifi-ciale), dup care sunt pompate la exteriorul celulei. Funcia glico-proteinei P poate fi inhibat cx. Ea are situsuri acceptoare la care se leag diferite medicamente anti-canceroase (nompetitiv de ageni chimio-sensibilizatori ca verapamil.

Cea mai obinuit form de terapie imun a neoplaziilor este utilizarea anticorpilor monoclonali (AMC) cu specificitate tumoral, cuplai cu toxine (toxina difteric, toxina de ricin) sau cuplai cu ageni chimici (I131, medicamente citotoxice), ce suprim proliferarea celular. In ansamblu, terapia cu AMC nu a reuit. Cele mai frecvente tumori (de colon, de sn, de plmn, de prostat) poart antigene proteice intracelulare, inaccesibile AMC. Strategiile chimioterapeutice au progresat mult i ofer mai multe anse de reuit, la un pre de cost inferior.

n tratamentul limfoamelor celulelor B se folosesc AMC anti-idiotipici fa de imunoglobulina membranar a limfomului.

Stimularea nespecific a esutului limfoid este o metod terapeutic introdus de G. Math. El a administrat BCG pentru terapia leucemiilor limfoblastice la copii. Remisiunile se prelungesc ca durat. Celulele de Corynebacterium parvum au efecte antitumorale, n asociere cu chimioterapia, iar celule de C. parvum i BCG injectate direct n masa tumorii, inhib creterea tumorii. Antigenele bacteriene stimuleaz imunitatea mediat celular. Celulele limfoide sunt atrase n numr mare la locul injectrii i aciunea lor este orientat asupra celulelor tumorale. Macrofagele se activeaz la contactul cu antigenele bacteriene i dobndesc proprieti citotoxice fa de celulele tumorale, evideniate in vitro.

Interferonul (produs de leucocite) se utilizeaz n tratamentul unor leucemii i n tratamentul limfoamelor, dar este toxic, ceea ce impune limitarea dozei. Majoritatea pacienilor, dup administrarea interferonului, fac un sindrom al strii gripale: febr, senzaie de frig, dureri de cap, dureri musculare. Aceste simptome diminu pe parcursul terapiei i sunt controlate, parial, cu diferii ageni farmacologici.

Imunoprofilaxia cu vaccinuri, pentru anumite virusuri, a avut succes la animale. Boala lui Marek, produs de un herpesvirus, este o maladie limfoproliferativ la puii de gin. Incidena leucemiei felinelor a sczut, ca rezultat al unui program de vaccinare. Nu exist vaccinuri protectoare fa de neoplaziile umane.

IMUNITATEA N TRANSPLANTUL DE ESUTURI I ORGANE

Chirurgia transplantului a depit dificultile de ordin tehnic. Reuita transplantului depinde exclusiv de reactivitatea imunitar, care declaneaz un rspuns de respingere.

Ideia nlocuirii unui organ lezat, cu unul sntos, a preocupat medicina din timpuri foarte ndeprtate. n mitologia greac se vorbea de organisme himere, pstrate i astzi n reprezentrile sculpturale sub forma montrilor fabuloi, a cror origine sugereaz o tripl heterogref: leu-capr-coad de dragon sau leu-capr-arpe. Combinaia este interpretat ca o materializare pe plan abstract, a ideii de a asocia organisme foarte diferite. Sirenele (jumtate femeie-jumtate pete) i minotaurii (jumtate om, jumtate taur) exprimau ideia de asociere a acestor organisme foarte diferite.

Perioada tiinific a transplantului ncepe cu Alexis Carrel (medic american, care a lucrat n Frana, autorul lucrrii Omul fiin necunoscut), cel care a pus bazele cultivrii celulelor i esuturilor. In 1902, Carrel a fcut grefe de rinichi la animale. In 1906, a grefat plmni la pisic i a fcut primul transplant de inim la cine, legnd inima de vasele regiunii cervicale. Animalul a trit 21 de ore.

K. Landsteiner, unul din promotorii perioadei tiinifice, a descris grupele sanguine i condiiile de compatibilitate major ntre donor i receptor. In 1944, Medawar a conchis c respingerea grefelor de esuturi i organe are cauze imunitare, iar curnd dup aceea, Billingham, Brent i Medawar au descris fenomenul de toleran imunitar.

G. Math (hematolog francez) a creat himerele biologice. El a pornit de la ideia c fenomenele de respingere a grefelor de esuturi i organe sunt datorate stimulrii activitii sistemului imunitar. In lucrrile sale experimentale, a recurs la metoda paralizrii reactivitii imunitare. In acest scop, puii nou-nscui de obolan au fost supui iradierii totale, cu doza de 800 de razi. Rezultatul iradierii este desfiinarea barierelor imunitare, adic anihilarea reactivitii imunitare fa de gref. La animalele iradiate a inoculat cteva milioane de celule din mduva osoas de oarece. Autorul a creat astfel, himera biologic oarece-obolan (obolan cu elemente figurate sanguine de oarece). Himera este sensibil la infecia cu virusul leucemiei oarecelui i face leucemia, n timp ce obolanii convenionali sunt rezisteni la infecia cu acest virus.

Himera biologic este orice organism dotat n mod artificial cu componente celulare, cu esuturi sau organe, care provin de la alte organisme. Ulterior, tehnicile de inginerie genetic au creat molecule de ADN himere i chiar microorganisme himere, ce poart informaie genetic provenit de la dou specii diferite.

n 1967, Christian Barnard a realizat primul transplant de cord la om.

Denumirea de gref, folosit curent pentru esutul implantat n organismul strin, vine de cuvntul grecesc grafion, care desemneaz un instrument de scriere prin gravur. Denumirea a fost ulterior folosit cu nelesul de altoi la plante. Denumirea de transplant a fost folosit de Paracelsus i nseamn a transfera, a muta.

Noiunea de transplant are un sens mai larg. Ea include fecundarea ovulului de ctre spermatozoid, ca transplant natural. Ftul este o alogref natural, ce poart informaia genetic

de origine patern, dar este protejat prin mecanisme cu aciune placentar, de fenomenele de respingere.

Terminologie.Terminologia modern referitoare la gref are trei origini: chirurgical, imunologic i genetic. Uniformizarea ei a fost cerut de OMS.Relaia genetic

i antigenic

ntre organismul

donor i receptor (Denumire nou) Identitate

Tipul de gref Denumire veche Tipul de esut Observaii

Autogref

Gref autolog esut autogenic

(autohton, autogen)

Individul este att donor ct i receptor Identitate Singref

(Homogref singenic) Izogref (Gref izogen Gref izolog) esut singenic (congenic) Organisme identice ale unei linii inbred.

Pentru om, gemeni univitelini. Diferite Alogref Gref homolog esut alogenic Allos = altul

(Homogref alogenic)

Organisme ale aceleiai specii dar cu variante alelice diferite. Foarte diferite (Gref heterolog) Xenogref Heterogref Xenos = strin

esut xenogenic

Indivzii aparin unor specii diferite (cine - iepure).

Autogrefele se practic cu o frecven mare: n cazuri de arsuri, intervenii chirurgicale estetice. Pielea dintr-o regiune a corpului este implantat ntr-o zon compromis.

Alte denumiri se refer la particularitile esutului transplantat:

-> grefele homovitale se fac pentru asigurarea viabilitii esutului transplantat

-> grefele homostatice sunt acelea n care esutul grefat are rolul numai de suport structural, pe care se poate dezvolta esutul gazdei, pentru restabilirea arhitecturii iniiale. Astfel de grefe sunt lipsite de orice urm de esut antigenic, se practic pentru a nlocui un fragment de vas sau de os.

n raport cu locul de unde esutul a fost luat i locul unde se reimplanteaz, se disting grefe ortotopice (esutul grefat este aezat la receptor n aceiai poziie) i grefe heterotopice (esutul grefat este implantat n alt situs anatomic al organismului receptor).

Dup 1956, primul succes al grefei de rinichi ntre gemeni univitelini, transplantul de organe a devenit o practic curent. Interesul pentru transplant s-a deplasat de la actul chirurgical, la aspectele imunologice.

Argumente ale rolului reactivitii imunitare n respingerea grefei

Respingerea grefei este rezultatul activrii mecanismelor imunitare, datorit diferenelor antigenice ntre moleculele CMH I i II ale donorului i receptorului. In favoarea acestei afirmaii argumenteaz mai multe fapte de observaie:

-> autogrefele i singrefele sunt acceptate totdeauna, dac sunt respectate condiiile de asepsie;

-> grefa ntre indivizi diferii este respins cu att mai brutal, cu ct diferenele antigenice(biochimice) dintre moleculele CMH ale donorului i receptorului sunt mai mari;

D R

A ---------------- A ----- O Grefa prinde.

B ---------------- A ---- 0 Grefa este respins, pentru c organismele difer prin moleculele CMH.

B --------------- AxB ---- O Grefa este acceptat. Capacitatea de a accepta o gref depinde de existena la organismul receptor, a tuturor genelor de histocompatibilitate ale donorului. Dac receptorul are un antigen suplimentar, grefa este acceptat.

AxB ----------- B ------ 0 Dac donorul posed un antigen suplimentar fa de receptor, grefa este respins.

-> din punct de vedere histologic, esutul grefat respins este infiltrat cu celule efectoare ale rspunsului imun: limfocite, macrofage, plasmocite;

-> animalele timetomizate au o capacitate sczut de respingere a grefelor de esuturi i organe, care se restabilete dup grefarea timusului;

-> debutul fenomenelor de respingere este foarte mult ntrziat, dac organismului receptor de gref i se administreaz ser antilimfocitar (SAL);

-> fenomenele de respingere sunt mai intense la copii, datorit abundenei esutului limfoid, dar sunt mult atenuate la btrni.

Argumente indirecte n favoarea respingerii imunitare:

-> organele grefate rapid dup recoltare sunt suportate mult mai bine dect cele care au fost pstrate o perioad mai lung de timp n afara organismului. esutul transplantat dup o perioad de pstrare, conine mai multe celule lezate i lizate, din care se elibereaz molecule nonself, care amplific rspunsul imun;

-> conservarea n condiii optime mrete gradul de toleran fa de esutul grefat, iar pstrarea neadecvat are efecte defavorabile;

-> organele i esuturile sntoase sunt tolerate mai bine dect cele care prezint o stare de uzur biologic.

EVOLUIA RESPINGERII GREFEI DE PIELE

n raport cu dinamica desfurrii, se disting trei modaliti de respingere a grefei de piele.

Respingerea acut sau hiperacut este foarte rar ntlnit i se datoreaz incompatibilitii totale ntre donor i receptor, care nu aparin aceluiai grup sanguin n sistemul ABO. In organismul receptor de gref, exist anticorpi circulani preformai (aglutininele i ) fa de antigenele esutului transplantat. Lor li se adaug efectele imediate produse de macrofagele i neutrofilele activate, de anafilatoxinele eliberate din fixarea complementului. Vasele din organul grefat se obtureaz prin formarea trombilor de coagulare. Grefa nu se vascularizeaz, rmne alb i n cteva ore este respins.

Respingerea dup dinamica rspunsului imun primar survine n cazul n care, ntre donor i receptor este o incompatibilitate relativ. Grefa se vascularizeaz, dobndete o culoare normal (roz), dar dup 10-12 zile, culoarea se nchide, devine purpurie, apar fenomene de respingere i grefa este eliminat.

Respingerea dup dinamica rspunsului imun secundar este de tip accelerat i are loc la organismele la care grefa s-a repetat dup o alt gref cu esut de la acelai organism donor sau

de la un organism al aceleiai linii inbred. Rspunsul este accelerat, n sensul c fenomenele de infiltraie cu macrofage, neutrofile i limfocite T sensibilizate, se produc foarte repede i n 3-4 zile, grefa este respins.

Respingerea grefei de rinichi

Respingerea hiperacut se produce foarte repede dup ce s-au stabilit conexiunile vasculare cu organul grefat i se datoreaz incompatibilitii totale ntre donor i receptor, care nu aparin aceluiai grup sanguin n sistemul ABO. In primele ore dup stabilirea conexiunilor vasculare se produce ncetinirea fluxului sanguin, urmat de o staz circulatorie n organul grefat. Rinichiul se ncarc cu o cantitate mare de snge i dobndete culoarea roie, fenomen denumit hepatizare. Oprirea circulaiei sanguine iniiaz procesul de coagulare la nivelul capilarelor sanguine.

Cauzele respingerii hiperacute. In sngele organismului receptor se gsesc anticorpi preformai (aglutinine), specifici fa de antigenele din organul grefat. Antigenele de grup sanguin n sistemul ABO se gsesc nu numai pe eritrocite, ci i pe celulele endoteliale ale capilarelor sanguine. Aglutininele i ale receptorului de gref ajung n rinichiul grefat imediat dup realizarea anastomozelor vasculare. Se formeaz complexe antigen-anticorp care iniiaz fixarea complementului. Endoteliul capilar sufer mici leziuni, suficiente pentru a determina apariia suprafeelor rugoase, de care ader PMNN. La acest nivel, celulele endoteliale exprim selectinele, prin intermediul crora leucocitele ader de endoteliu i prsesc circulaia. La nivelul suprafeei rugoase se acumuleaz trombocitele, care se agreg treptat i mpreun cu factorii plasmatici, formeaz trombi care obtureaz lumenul capilar. n 48 de ore, arteriolele i capilarele se trombozeaz.

Respingerea hiperacut este o reacie de activare endotelial i grefa este respins ca o xenogref. Pentru a elimina anticorpii naturali, se practic plasmafereza sngelui receptorului i absorbia anticorpilor pe coloan. Complementul este eliminat prin administrarea veninului de cobr.

Respingerea acut se produce n dou variante dinamice:

-> respingerea acut precoce, n 10-14 zile de la transplantare

-> respingerea acut tardiv, n circa 4 luni.

Dup grefarea esutului, o parte a antigenelor tisulare se elibereaz din rinichi i trec n circulaie, ajungnd n ganglionii limfatici regionali.

Antigenele declanatoare ale respingerii grefei

Moleculele CMH ale esutului grefat stimuleaz un rspuns imun intens al organismului receptor, a crui finalitate este respingerea grefei. Moleculele CMH I se gsesc pe toate celulele nucleate, dar au un nivel variabil de exprimare. Moleculele CMH II au o distribuie limitat: pe macrofage, pe limfocitele B, pe unele celule epiteliale i endoteliale, pe celulele dendritice. Nivelul de exprimare a moleculelor CMH I i II este modulat de citochine (IFN i TNF ). Polimorfismul extensiv al moleculelor CMH limiteaz posibilitatea transplantului numai ntre parteneri compatibili CMH. Chiar n aceste condiii, grefa poate fi respins, datorit diferenelor ntre antigenele minore ale donorului i receptorului.

Antigenele din gref au urmtoarele origini:

-> antigenele libere (antigene solubile) provin din liza eritrocitelor i din membrana bazal;

-> antigenele CMH exprimate pe celulele dendritice existente n esutul grefat;

-> antigene CMH asociate membranelor rezultate din liza celulelor organului, n perioada de conservare.

Antigenele CMH ale donorului pot fi recunoscute pe suprafaa celulelor prezentatoare (prezentare direct) sau ca fragmente prelucrate i asociate cu moleculele CMH ale receptorului (prezentare indirect).

Antigenele eliberate din gref, ajung n ganglionii regionali ai gazdei i activeaz limfocitele T i B. Cele mai importante antigene aduse de organul grefat, cu rol esenial n declanarea conflictului imun, sunt moleculele CMH I i II. Un rol deosebit se atribuie celulelor dendritice din esutul grefat. Ele exprim molecule CMH II la densitate foarte nalt, care determin stimularea iniial a limfocitelor gazdei.

Moleculele CMH I i II libere se comport ca antigene tari, intens imunogene i nu necesit prezentarea n asociaie cu moleculele CMH proprii organismului, pentru a stimula limfocitele T, dar sunt mult mai imunogene dac sunt prezentate de alte celule, n special de celulele dendritice i de celulele endoteliale.

Rspunsul imun fa de esutul grefat este mediat n primul rnd de limfocitele T. Ca dovad, oarecii atimici (nuzi) nu resping grefele alogenice de piele i tolereaz chiar grefe xenogenice.

La examenul histologic al unei grefe de piele, n cursul respingerii, se observ infiltratul cu mononucleare, multe fiind limfocite. Acumularea lor n esutul grefat precede respingerea, care survine n cteva zile. In organul grefat, raportul dintre limfocitele TCD4 i TCD8 este 1/3, adic predomin net limfocitele Tc, iar n mod normal, acest raport este 2/1.

Limfocitele T stimulate de antigenele CMH sintetizeaz interferon , activator al macofagelor din focarul conflictului. Macrofagele devin citotoxice fa de esutul grefat, ca i limfocitele Tc.

Macrofagele secret IL-1, care produce febra ce nsoete reacia de respingere a grefei. Limfocitele ptrunse n esutul grefat sunt pasagere. Ele prsesc grefa, trec n limf i ajung n ganglioni, unde ncepe proliferarea, elibereaz citochine, care activeaz limfocitele ganglionare. Acestea devin limfocite efectoare.

Celulele NK nu necesit activarea prealabil pentru a liza diferite celule tumorale. Ele sunt implicate n respingerea alogrefelor de organe.

Capacitatea de a respinge grefa poate fi uor transferat prin intermediul limfocitelor de la organismul imunizat prin contactul anterior cu antigenele grefei. Surprinztor, n esutul grefat nu migreaz limfocitele transferate, ci migreaz limfocitele organismului gazd, activate de IL secretate de limfocitele transferate.

Rolul anticorpilor. Ca rspuns fa de antigenele esutului grefat, se sintetizeaz anticorpi specifici fa de antigenele de transplantare. Anticorpii au rol secundar n reacia de respingere a grefelor de esuturi i organe. Anticorpii au rol foarte important n respingerea grefei, n situaiile n care, anticorpii anti-CMH preexist la un titru crescut n momentul transplantrii. Sinteza lor este indus de sarcinile multiple, de transfuzii repetate sau de o gref anterioar. Grefa este respins imediat.

Anticorpii au rol important n respingerea grefelor cu incompatibilitate grav ntre donor i receptor, deoarece fixeaz complementul i produc fenomenul de citoliz. Dac nu fixeaz complementul, anticorpii au rol de opsonine, adic sensibilizeaz celulele grefate fa de aciunea macrofagelor i neutrofilelor. Anticorpii sintetizai n esutul grefat, determin eliberarea mediatorilor reaciei de hipersensibilitate imediat (de exemplu, histamina), care produc modificri circulatorii n vasele grefei.

Anticorpii fa de antigenele eritrocitare sunt singurii efectori imunitari eficieni n transfuzia incompatibil. Efectul lor const n aglutinarea i liza eritrocitelor.

Dup grefarea unui organ sntos ntr-un organism uzat, din punct de vedere funcional, organul grefat se aliniaz repede la starea general de uzur a gazdei.

Transplantarea mduvei osoase se realizeaz pentru tratamentul pacienilor cu maladii imunodeficitare, anemie aplazic sever, leucemie, limfom, iar mai recent, pentru dezordinile hematopoetice cu substrat genetic.

La pacienii imunodeficitari, transplantul mduvei osoase este destinat s furnizeze celule stem pentru a restabili sistemul imunitar al receptorului, fr s nlocuiasc n mod necesar compartimentul mieloid. Datorit strii nefuncionale a sistemului imunitar, transplantul mduvei osoase poate fi fcut fr tratamentul imunosupresor al gazdei.

Mduva este recoltat prin aspiraie din crestele iliace anterioare i posterioare, de la donorul anesteziat. Amestecul de mduv osoas i snge este plasat n mediu de cultivare cu heparin, ntr-o pung hematologic i se administreaz fr ntrziere organismului receptor, prin infuzie intravenoas, n cantitatea de 2 x 108 - 6 x 108 celule medulare/kg. Infuzia se face la 1-24 ore dup ultima iradiere total a corpului sau la 36 de ore dup ultima doz de ciclofosfamid. Celulele stem circul n snge, nsmneaz cavitatea medular i ncep s se divid. n 2-4 sptmni, crete populaia celular a mduvei i n acelai timp crete numrul celulelor sanguine periferice. La donor, mduva se reface repede.

Prevenirea respingerii grefelor de organe este posibil printr-o mperechere ct mai adecvat a donorului i receptorului din punctul de vedere al asemnrii moleculelor CMH i, ulterior, prin instituirea tratamentului imunosupresor. Dar, spre deosebire de alte celule, cele din mduva osoas sunt foarte antigenice (au o mare densitate a moleculelor CMH I) i din aceast cauz, receptorul trebuie s fie supus unui tratament radio-chimioterapeutic intens, pn la limita suportabilitii, pentru ca transplantul de mduv s aib succes. Chiar astfel, la pacienii

leucemici, respingerea mduvei osoase poate s aib loc, n cazul unei mperecheri antigenice neadecvate.

Transplantul de mduv osoas ridic o problem special: celulele transplantate fiind imunocompetente, pot s iniieze reacia gref contra gazd, fa de antigenele receptorului. Reacia este iniiat fa de antigenele tegumentare, ale ficatului i intestinului i este letal la 1015% dintre receptorii de mduv osoas cu molecule HLA identice i la 40% dintre receptorii cu molecule HLA neidentice.

Teste de histocompatibilitate

n transplantul de esuturi i organe, esenial este asemnarea ct mai accentuat a moleculelor CMH ale donorului i receptorului. Pentru testul gradului de asemnare, se analizeaz comportamentul limfocitelor celor doi parteneri, n amestec (reacia de amestec limfocitar, RAL). Testul evideniaz diferenele antigenice dintre donor i receptor, n ceea ce privete moleculele CMH II. Pentru reuita grefei, este obligatorie identitatea acestor molecule. Perechea donor-receptor care produce cel mai uor rspuns n RAL, ofer cea mai bun ans de acceptare a grefei.

Cel mai adesea se folosesc limfocitele din snge. Celulele trebuie s fie viabile i n mediu se adaug ser de viel (1-10%) i 2-mercaptoetanol. Limfocitele donorului se cultiv n amestec cu limfocitele receptorului, n prezena timidinei H3. Se msoar nivelul radioactivitii limfocitelor, consecutiv ncorporrii timidinei H3 pentru sinteza ADN. RAL reflect rspunsul proliferativ al celulelor T, cu puine sau fr celule B. Transformarea blastic nu se produce n RAL a gemenilor monozigoi. Intr-un amestec celular a x b + a x c, rspunsul este bidirecional. Cea mai ampl reacie are loc ntre limfocitele care se deosebesc prin moleculele CMH. Cel mai puternic stimul n RAL l reprezint aloantigenele CMH II, cu un polimorfism foarte nalt, iar aloantigenele clasa I au un rol stimulator limitat. Moleculele CMH II se gsesc pe limfocitele B, pe macrofage, pe celulele dendritice, iar pe limfocitele T, numai dup activare. Se pare c rspunsul n RAL nu este orientat fa de epitopii CMH propriu-zii, ci fa de o larg varietate de peptide self legate de moleculele CMH, rezultate probabil prin degradarea diferitelor proteine celulare. Dat fiind polimorfismul deosebit al moleculelor CMH, probabil c marea majoritate a limfocitelor T din amestec manifest aloreactivitate fa de cel puin unul din aloantigenele CMH ale speciei.

Pentru rspunsul unidirecional, una din cele dou populaii celulare (de obicei a donorului) se inactiveaz prin tratament cu mitomicin C (pentru inhibiia sintezei ADN) sau se supun iradierii.

Tratamentul inactiveaz celulele T, dar nu interfer cu imunogenitatea lor. In RAL se activeaz numai limfocitele receptorului de gref, ca rspuns la aloantigenele donorului.

n cazul grefei unui organ imunocompetent la o gazd imunodeficitar, n RAL se inactiveaz limfocitele receptorului, pentru a evalua reactivitatea limfocitelor donorului, care ar putea iniia o reacie gref contra gazd.

Compatibilitatea donor-receptor pentru antigenele CMH I se testeaz cu seruri imune anti- CMH I. Se analizeaz reacia limfocitelor celor doi parteneri, fa de un numr ct mai mare de seruri anti CMH I. In laboratorul de profil exist seturi de seruri anti-CMH I, recoltate de la persoane care au o bogat experien antigenic HLA:

-> persoane care suferit transfuzii sanguine multiple i astfel s-au imunizat fa de antigenele HLA;

-> femei multipare, care au avut sarcini multiple cu parteneri diferii.

Serurile anti-CMH se pun n contact cu limfocitele donorului i cu ale receptorului de gref. Anticorpii anti-CMH se fixeaz pe suprafaa limfocitelor i astfel este iniiat transformarea blastic. Se determin un coeficient de reactivitate (coeficient de transformare blastic), pe baza numrului de limfocite transformate.

Dac limfocitele donorului i receptorului se comport asemntor fa de un numr mare de seruri, concluzia este c cele dou populaii de limfocite sunt asemntoare.

Dac titrul anticorpilor anti-CMH n ser este crescut, se poate produce nu numai activarea limfocitelor, ci chiar aglutinarea imun sau, dup fixarea complementului, citoliza.

Xenotransplantarea

Termenul semnific transplantul de esuturi i organe ntre organismele unor specii diferite. Interesul clinic pentru xenotransplantare a fost determinat de lipsa organelor umane. Succesul alotransplantului a creat un necesar care depete disponibilul. In 1963, transplantul de rinichi de cimpanzeu la om, a prelungit supravieuirea cu 9 luni i moartea a survenit dup complicaiile

provocate de imunosupresie. In 1984, inima de babuin a fost transplantat la om. A urmat transplantul de ficat de maimu, transplantul de celule neurale de embrion de porc, la un pacient cu boal Parkinson, transplantul de mduv osoas de la babuin, la un pacient cu SIDA.

Barierele xenotransplantrii sunt multiple: unele organe de la alte specii nu funcioneaz adecvat n noul mediu. Rinichiul de cimpanzeu este funcional n organismul uman. Persoanele transplantate cu rinichi de porc devin anemice, probabil pentru c eritropoetina nu este activ, iar cele cu ficat de babuin au nivele mai mici de colesterol (echivalente cu cele de babuin) i nivele foarte sczute de acid uric (pentru c ficatul de babuin nu produce acid uric). Grefarea celulelor sanguine stem xenogenice este limitat de absena factorului de cretere specific celulelor stem transplantate.

Xenogrefele pot fi neconcordante (de la porc) sau concordante (de la cimpanzeu, babuin). La perechile neconcordante, titrul anticorpilor preformai este detectabil i xenogrefele sunt respinse hiperacut (n cteva minute), prin reacia de activare a endoteliului. Pentru respingerea hiperacut a grefelor neconcordante, un alt factor critic (alturi de anticorpii preformai) al producerii leziunilor endoteliale este complementul i proteinele sale reglatoare. In combinaia porc-om, anticorpii preformai se leag la nivelul determinanilor antigenici de galactoz (1,3)galactoz ai endoteliului grefei, deoarece omul a pierdut gena pentru enzima alfa-galactoziltransferaz i nu posed acest epitop. Activarea complementului se face pe calea clasic, iar n absena anticorpilor preformai, pe calea altern. In esen, respingerea hiperacut se datoreaz reaciei endoteliale la activarea complementului, mediat de anticorpii preformai (IgG anti-gal).

Incompatibilitatea combinaiei porc-om se datoreaz faptului c porcul exprim un nou antigen de grup sanguin, -gal(gal- 1,3-gal) (la om, specificitatea antigenic a grupului 0 este conferit de L-fucoz, a grupuluiA, de N-acetil-galactozamin, galactoz i L-fucoz, iar a grupului B, de D-galactoz i L-fucoz). -gal nu este singurul determinant recunoscut de anticorpii naturali umani. Alte heteroantigene pot deveni importante, dup transplantul organului. Anticorpii xenoreactivi, specifici fa de epitopii 1,3-gal i complementul sunt factorii majori ai respingerii hiperacute.

inta respingerii hiperacute este endoteliul vascular. Activarea endoteliului produce cele mai evidente manifestri ale respingerii hiperacute: tromboza intravascular, hemoragia extravascular i edemul.

n asocierile concordante, titrul anticorpilor preformai nu este detectabil i respinerea este acut, datorit aceluiai fenomen de activare a endoteliului vascular.

Respingerea ntrziat (acut) a xenogrefelor concordante se face n 2-3 zile (mult mai repede dect a alogrefelor). Din punct de vedere histologic, respingerea acut relev mai puin hemoragie, dar cu tromboz intravascular semnificativ, ca i n reacia hiperacut, deoarece inta este endoteliul vascular. Respingerea acut a xenogrefei se datoreaz anticorpilor a cror sintez este indus de antigenele xenogrefei. Se sintetizeaz preponderent IgG anti--gal, al cror titru crete rapid.

Progresul n xenotransplantare s-a fcut n sensul prevenirii respingerii hiperacute: imunosupresia receptorului de gref i ingineria genic a donorului pentru a elimina marile diferene antigenice dintre xenogrefe i alogrefe. La oarece s-a reuit eliminarea genei galactozil-transferazei prin recombinare homolog, dar tehnologia nu este adecvat pentru alte specii. Eliminarea antigenului -gal, expune un nou determinant glucidic, fa de care omul are un nivel sczut de anticorpi preformai.

Imunosupresia

Variantele alelice multiple codificatoare ale moleculelor CMH fac cu totul improbabil posibilitatea ca dou organisme s fie identice pentru moleculele CMH, cu excepia gemenilor monozigoi. Natura determinismului genetic al moleculelor CMH nu este favorabil transplantului de esuturi i organe. Amplitudinea procesului de respingere a grefei este parial dependent de gradul de incompatibilitate al antigenelor CMH, dintre donor i receptor.

Scopul imunosupresiei selective este de a menine funcionalitatea mecanismelor de aprare a organismului, fa de infeciile virale, bacteriene, fungice i fa de parazii, de a pstra capacitatea SFM de a fagocita celulele mbtrnite i de a proteja mecanismele de imunosupraveghere care elimin celulele maligne. Pe de alt parte, se urmrete inducerea strii de toleran fa de antigenele organului grefat (rinichi, ficat, inim). n cazul maladiilor autoimune, dezideratul imunosupesiei este inhibiia selectiv a reactivitii imunitare autoagresive fa de antigenele retinei (n uveit)sau fa de antigenele colonului (n boala Crohn).

Un medicament imunosupresor trebuie s ntruneasc urmtoarele criterii:

-> s inhibe activarea rspunsului imun i s fie eficient fa de procesele imunitare n curs de desfurare;

-> s aib aciune selectiv, adic s produc deleia clonal sau s inactiveze numai anumite subpopulaii de celule imunocompetente;

-> s aib un index terapeutic bun, adic un raport favorabil ntre doza terapeutic i cea toxic.

Pentru supravieuirea grefei, transfuziile de snge cu specificitatea antigenic a donorului sau transfuziile nespecifice, ca i testele de histocompatibilitate sunt importante numai dac se asociaz cu imunosupresia, cu scopul diminurii reactivitii imunitare. Terapia imunosupresoare este foarte complex, pentru c nici un agent chimic nu are aciune strict selectiv asupra esutului limfoid. Imunosupresia se realizeaz prin:

-> iradierea x

-> terapia imunosupresoare

-> metode imunologice.

Terapia imunosupresoare. Medicamentele imunosupresoare inhib nespecific reactivitatea imunitar i se administreaz att dup grefa tisular, ct i pacienilor cu maladii reumatice, caracterizate prin reactivitate imunitar excesiv.

Imunosupresia s-a realizat cu o varietate de ageni terapeutici: hormoni corticosteroizi, medicamente citotoxice. Cele mai multe metode convenionale de imunosupresie i realizeaz efectul n mod neselectiv.

Medicamentele citotoxice au fost iniial folosite n tratamentul neoplaziilor, dar reprezint o modalitate important de imunosupresie pentru tratamentul maladiilor autoimune.

Chimioterapia administrat pacienilor neoplazici produce, uneori, o imunosupresie profund. Medicamentele citotoxice sunt imunosupresoare deoarece distrug celulele imunocompetente sau blocheaz proliferarea lor.

Agenii citotoxici folosii pentru imunosupresie(dar i n tratamentul neoplaziilor) sunt:

-> ageni alchilani

-> antimetabolii: analogi ai purinelor (6-mercaptopurina i azatioprina); analogi pirimidinici (citozin-arabinozida);

-> antagonitii acidului folic (methotrexatul).

Ciclofosfamida este compusul prototip al agenilor alchilani. Aciunea sa este nespecific, asupra tuturor subpopulaiilor de limfocite i a celulelor nelimfoide care intr n faza S.

Agenii din categoriile menionate, au aciune nespecific, adic aciunea lor nu este limitat la celulele imunocompetente. Ei produc leziuni asupra tuturor celulelor aflate n mitoz, inclusiv asupra celulelor hematopoetice. Respingerea grefei poate fi blocat, dar aciunea neselectiv a acestor ageni produce efecte secundare toxice prea severe i rezultatele au fost considerate ca nesatisfctoare.

Ciclosporina este un peptid ciclic lipofil, izolat din culturi de microorganisme i acioneaz specific asupra limfocitelor, inhibnd transcrierea genic pe o cale dependent de Ca, adic blocheaz progresia ciclului celular de la G0 la G1. Este un agent imunosupresor mai selectiv, deoarece acioneaz asupra celulelor Th, fr efecte notabile asupra altor subpopulaii de limfocite T, asupra limfocitelor B, granulocitelor sau macrofagelor. Efectul major pare a fi inhibiia sintezei IL-2. Imunosupresia cu ciclosporin este o modalitate imunofarmacologic, datorit aciunii sale selective fa de celulele imunocompetente.

n ultimii ani s-au identificat civa compui chimici naturali, izolai ca i ciclosporina, din culturi de microorganisme: tacrolimus, sirolimus (rapamycin), mizoribine i spergualin.

Tacrolimus este o lacton macrociclic lipofil, cu mecanism de aciune asemntor cu al ciclosporinei. Sirolimus este un macrolid care inhib proliferarea celulelor T, prin blocarea trecerii de la faza G1 la faza S.

Imunosupresorul ideal va media inducerea toleranei, n special n transplant, adic va permite sistemului imunitar s adopte ca self, moleculele CMH specifice esutului grefat.

Radiaia ionizant x i gama produce ionizarea atomilor i genereaz radicali liberi, n special radicalul OH., foarte reactiv, principalul agent ce mediaz moartea celulelor iradiate. Efectele radiaiilor ionizante sunt dependente de doz. Celulele stem i celulele imature sunt foarte sensibile. Limfocitele T sunt mai rezistente dect limfocitele B, iar monocitele i macrofagele sunt relativ rezistente.

Corticosteroizii sunt cele mai folosite medicamente, cu efect inhibitor asupra rspunsului imun, dar i al proceselor inflamatorii. S-a propus mecanismul limfolizei, dar la om acest efect nu se produce. Timp de 4-6 ore dup administrare, corticosteroizii reduc numrul de leucocite circulante (limfocite, monocite, eozinofile), dar crete semnificativ numrul neutrofilelor. Valorile leucocitelor revin la normal n 24 de ore. Limfocitele T, precum i monocitele prsesc circulaia i migreaz n mduva osoas, iar limfocitele B sunt relativ rezistente la corticosteroizi. Eozinopenia, dup injectarea corticosteroizilor, explic efectele benefice ale acestor hormoni la persoanele alergice.

Serul antilimfocitar (SAL) i globulina antitimocitar se obin prin injectarea limfocitelor, respectiv a timocitelor, la o specie xenogen. Se folosesc celulele ductului toracic sau timocitele pentru imunizarea iepurelui sau calului. Din serul heterolog se separ fracia imunoglobulinic, ce se administreaz intravenos pentru depirea unei stri critice dup grefare.

Anticorpii policlonali din SAL au fost nlocuii cu AMC specifici fa de antigene celulare de suprafa: AMC anti-receptor de IL-2 i anti CD4.

Deoarece citochinele sunt molecule foarte importante n reacia imunitar, s-a ncercat neutralizarea lor cu receptori solubili.

Deleia specific a populaiilor de limfocite este posibil cu preparatele denumite imunotoxine. Acestea sunt complexe ce constau din dou componente: un anticorp monoclonal care asigur recunoaterea specific a intei celulare i o component toxic (ricina, toxina difteric).

Interaciunile sistemului imunitar cu sistemul neuroendocrin

Sistemele imunitar, nervos i endocrin sunt interconectate structural (anatomic) i funcional, ceea ce a condus la conturarea unor noi domenii interdisciplinare, ca neuroimunoendocrinologia, neuroimuno-modularea i psihoneuroimunologia. Sistemele enumerate au n comun capacitatea de rspuns la un numr de stimuli comuni (hormoni steroizi, citochine, neuropeptide), care furnizeaz baza molecular a integrrii bidirecionale. Starea psihic influeneaz reactivitatea imunitar i intensitatea rspunsului inflamator a organismului. Exist dovezi certe c anomaliile neuroendocrine au rol important n inducerea disfunciilor imunitare, materializate, n primul rnd, n manifestrile autoimune. Pe de alt parte, vrsta, genul i ali factori genetici regleaz interaciunile imuno-neuroendocrine.

Cele mai pregnante interaciuni neuroendocrinoimunitare se produc n starea de stress. Stressul este definit ca o condiie dinamic n cursul creia homeostazia normal (starea de echilibru a mediului intern) este perturbat sau periclitat. Starea de dezechilibru este indus de factori de stress, fizici sau psihologici. Factorii de stress, fizici sau mentali, declaneaz un rspuns complex adaptativ, denumit rspunsul de stress sau de alarm, menit s contracareze efectele factorului de stress. Intensitatea rspunsului adaptativ este dependent de vrst, gen, starea hormonal i de ali factori genetici. Fig. 135. Interaciuni neuro-endocrino-imunitare.

Stressul presupune n primul rnd, modificarea unor componente mentale i comportamentale. Crete brusc activitatea sistemului nervos central ce controleaz starea de veghe, alerta, starea psihic, atenia, concentrarea ateniei i este inhibat activitatea vegetativ care controleaz hrnirea i reproducerea. In rspunsul la stress se produc modificri fizice ale sistemului circulator, care redirecioneaz nutrienii spre organele activate. O reactivitate prea mare sau prea mic la stress poate produce sau poate contribui indirect la manifestri patologice.

Rspunsul la factorii de stress este mediat de factorul (hormonul) de eliberare a corticotropinei (CRH), de axa hipotalamo-hipofizo-corticosu-prarenal i de sistemul nervos simpatic. CRH este produs n primul rnd n hipotalamus, dar i n alte arii ale creierului i n sistemul nervos periferic i are urmtoarele funcii:

- controleaz starea de veghe, starea psihic i integreaz sistemele de rspuns la stress;

- activeaz axa hipofizo-corticosuprarenal, stimulnd secreia ACTH i a corticosteroizilor;

- activeaz sistemul nervos simpatic, cu stimularea epinefrinei i norepinefrinei.

CRH este activatorul strii de alarm, manifestat prin creterea glicemiei, a ritmului cardiac, a tensiunii arteriale, dar inhib funcia imunitar i rspunsul inflamator. Efectul activator al CRH asupra sistemului nervos simpatic este mediat de locus ceruleus, care i proiecteaz axonii n trunchiul cerebral i n hipotalamus, ceea ce contribuie direct la eliberarea mediatorilor simpatici (epinefrina i norepinefrina) n arii foarte largi ale SNC. Activarea sistemului nervos simpatic stimuleaz eliberarea CRH din neuronii nucleilor paraventriculari sub aciunea impulsurilor cu originea n locus ceruleus.

Sistemul de rspuns la stress funcioneaz ca o bucl feedback pozitiv, bidirecional. Activarea unui component al sistemului, activeaz pe cellalt. Serotonina i acetilcolina activeaz rspunsul la factorii de stress, iar MSH (hormonul stimulator al melanocitelor) i acidul gama aminobutiric sunt inhibitori.

Corticosteroizii sunt componentele majore ale sistemului de rspuns la stress i inhib cele dou componente majore ale rspunsului (secreia CRH i sistemul nervos vegetativ), dar i reactivitatea imunitar i rspunsul inflamator.

Rspunsul activator la stress influeneaz axa hipotalamo-hipofizar cu componentele ei: hipotalamus-hipofiz-tiroid (HHT) i respectiv, hipotalamo-hipofizo-gonadal (HHG).

Chiar dac stressul acut stimuleaz secreia hipofizar a hormonului de cretere, stressul cronic, prin intermediul CRH, stimuleaz secreia hipofizar a somatostatinei (inhibitor al creterii). Somatostatina, a crei secreie este stimulat de CRH, inhib secreia de TSH, iar glucocorticoizii inhib conversia tiroxinei, relativ inactiv, la triiodotiroxin. Aceste rspunsuri sunt adaptative i se coreleaz cu necesitatea limitrii pierderii energiei.

Activarea rspunsului la stress inhib axa HHG, la mai multe nivele. CRH inhib sinteza factorului eliberator al hormonului luteinizant din nucleul arcuat hipotalamic, fie direct, fie prin intermediul corticosteroizilor. Corticosteroizii inhib secreia hormonului luteinizant (LH) hipofizar i concomitent, producia hormonilor gonadali: estrogeni, progesterona, testosteronul.

Hormonii tiroidieni i sexosteroizi influeneaz activitatea axei hipotalamo-hipofizocorticosuprarenale (HHC). Hipotiroidismul inhib axa HHC. La organismele de sex feminin (oarece, obolan, om), axa HHC este mai activ dect la masculi, adic stressul induce un

rspuns mai amplu, msurabil prin nivelul mai nalt al corticosteroizilor. Ovarectomia diminu eliberarea corticosteroizilor, iar orhiectomia mrete rata sintezei corticosteroizilor la stress.

Rspunsul integrat neuro-imuno-endocrin este mediat nu numai de hormoni, ci i de interleuchine, cele mai cunoscute fiind IL-1 i IL-6.

IL-1 activeaz axa hipotalamo-hipofizo-corticosuprarenal, stimulnd eliberarea ACTH hipofizar, iar sinteza ei este inhibat de glucocorticoizi. Endotoxinele stimuleaz producerea IL-1 n hipofiz i astfel secreia ACTH este reglat local, n hipofiz.

IL-1 este sintetizat local, n arii discrete ale SNC (hipotalamus, hipocamp). Aceste arii regleaz rspunsul la stress.

Rolul corticosteroizilor n reglarea funciei imunitare

Asemnarea dintre hormoni i imunoglobuline rezult din similitudinea structural i funcional a celor dou categorii de molecule: ambele conin o regiune de legare la un receptor celular i o secven cu rolul de a transmite semnale specifice la un sistem efector.

Exist dovezi c moleculele CMH I, implicate n prezentarea antigenelor, au rol de receptor pentru insulin.

Corticosteroizii regleaz toate componentele rspunsului imunitar i inflamator, chiar i creterea i diferenierea timocitelor. Nivelul corticosteroizilor crete ntr-un interval de ordinul minutelor, dup expunerea la factorul de stress. Rolul lor este de a limita extensia rspunsului i a procesului inflamator. Amplitudinea lor prea mare poate s produc leziuni, inclusiv maladii autoimune.

Administrarea corticosteroizilor, la roztoare, produce moartea apoptotic a limfocitelor timice. Limfocitele T mature (periferice) umane sunt rezistente la corticosteroizi, dar cele timice sunt sensibile. Creterea nivelului plasmatic al corticosteroizilor, produs de stress, induce apoptoza timocitelor.

Corticosteroizii par a fi implicai n selecia timocitelor cu specificitate fa de antigenele nonself. Concepia dominant presupune c timocitele sunt selectate pentru apoptoz sau supravieuire, n funcie de capacitatea lor de a se asocia cu moleculele CMH. Timocitele cu receptori (RCT) de mare afinitate pentru moleculele CMH, sunt potenial generatoare ale maladiilor autoimune i sufer moartea apoptotic. Cele cu receptori de mic afinitate pentru moleculele CMH mor de asemenea prin apoptoz, sub aciunea corticosteroizilor. Supravieuiesc numai timocitele cu receptori de aviditate medie pentru moleculele CMH. Selecia limfocitelor n timus este controlat de hormonii sintetizai local. Astfel, timusul exprim activiti neuroendocrine multiple, inclusiv sinteza CRH i ACTH. CRH stimuleaz secreia ACTH, iar ACTH induce producerea corticosteroizilor n celulele corticosuprarenalelor. Sinteza neuropeptidelor (CRH) n timus este deosebit de interesant, avnd n vedere rezultatele care susin c celulele timice epiteliale conin enzime steroidogene i sintetizeaz corticosteroizi, n special n perioada fetal i neonatal. Astfel, timusul poate s sintetizeze toi hormonii produi prin activarea axei HHC.

Corticosteroizii regleaz dezvoltarea subpopulaiilor Th1 i Th2 de limfocite, inhibnd sinteza citochinelor Th1 (IL-2, IFN ).

Rolul sexosteroizilor

Hormonii steroizi sexuali influeneaz maturarea i diferenierea timocitelor. Timusul sufer modificri profunde n timpul sarcinii, dup gonadectomie sau dup administrarea exogen a hormonilor sexuali. Dup gonadectomie, masa timusului crete, iar administrarea hormonilor sexuali (estrogen, testosteron) are efecte inverse.

Factorul hipotalamic de eliberare a hormonului luteinizant (RFLH), regleaz att funcia de reproducere, ct i funcia imunitar. Acest hormon se sintetizeaz nu numai n creier, ci i n gonade, n glandele mamare, n placent, splin i timus, avnd rol integrator al funciei neuroendocrine reproductoare i al funciei imunitare. In timus, limfocitele T sintetizeaz RFLH i au receptori specifici pentru acest hormon.

Îmbtrnirea sistemului imunitar, la om, ncepe dup 30 de ani i se caracterizeaz prin creterea produciei de autoanticorpi i diminuarea capacitii de a produce anticorpi fa de antigenele nonself. Diminu sinteza IL-2, dar crete rata sintezei IL-4, IL-5 i IL-6. Aceste schimbri sugereaz o cretere numeric a subpopulaiei de limfocite Th2, n raport cu subpopulaia Th1. Diminu funcia citotoxic. Crete nivelul plasmatic al IL-6, cu rol reglator al sintezei anticorpilor, dar i cu rol n progresia maladiilor autoimune sau a altor procese patologice, ca osteoporoza.

Un rol important n procesul de mbtrnire se atribuie dehidroepiandrosteronului (DHEA), secretat de corticosuprarenale, sub controlul ACTH. Este un intermediar al biosintezei altor hormoni (testosteronul i estradiolul). DHEA circul n form inactiv, de sulfat. Hormonul se activeaz numai n esuturile care au DHEA-sulfataz, cu distribuie diferenial n organele limfoide. Nivelul plasmatic al sulfatazei scade odat cu mbtrnirea sistemului imunitar i scade brusc n diferite boli cronice, inclusiv maladiile autoimune. Administrarea DHEA la roztoare i om, restabilete funcia imunitar la organismele vrstnice i are efect antagonic corticosteroizilor, care produc atrofia timic. Fig. 136. Organele i celulele influenate de hormonii steroizi sexuali. Aceti hormoni pot aciona n timpul dezvoltrii celulelor imunitare, dar i direct asupra celulelor mature efectoare.

Hormonul de cretere, prolactina i hormonul tiroidian stimuleaz maturarea i diferenierea timocitelor. Hipofizectomia sau hiposecreia acestor hormoni hipofizari duce la imunodeficien i hipoplazia timusului. Hormonul de cretere stimuleaz intens proliferarea celulelor precursoare ale timocitelor n mduva osoas. Prolactina stimuleaz diferenierea celulelor T cu specificitate de antigen n organele limfoide periferice. Hormonul tiroidian stimuleaz creterea timusului i a splinei. oarecii hipotiroidieni au timus i splin hipoplazic, numr redus de celule TCD8.

Interaciunile neuro-imuno-endocrine sunt bidirecionale. esuturile i celulele sistemului imunitar sintetizeaz un spectru larg de hormoni neuro-endocrini. Foarte important este sinteza CRH, un reglator esenial al rspunsului la stress, n timus, splin, hipofiza anterioar, corticosuprarenale, ovar, testicul, intestin, inim, plmn. In timus i splin, CRH este sintetizat de celulele T, unde exercit efecte reglatoare autocrine sau paracrine. CRH este de asemenea sintetizat local n focarele inflamatorii acute sau cronice, inclusiv n lichidul sinovial al pacienilor cu artrit reumatoid.

Factori neuroendocrini favorizani ai maladiilor autoimune umane

Diferenele funcionale cu privire la intensitatea rspunsului axelor hipotalamo-hipofizocorticosuprarenaliene (HHC) i hipotalamo-hipofizo-gonadale (HHG) sunt importante pentru nelegerea manifestrilor autoimune. Maladiile autoimune sunt mult mai frecvente la femei dect la brbai. De exemplu, raportul pe sexe al tiroiditei autoimune este de 19/1, al lupusului de 9/1, iar al artritei reumatoide, de 3-4/1. Mai mult, maladiile autoimune tind s se dezvolte, s aib intensitate maxim ori s diminue, n perioadele de schimbare a activitii axei HHG (pubertate, menstruaie, sarcin, perioada postpartum, menopauz sau n timpul unui stress psihologic de amploare). Toate aceste perioade sunt asociate cu modificri ale secreiei factorului hipotalamic de eliberare a LH, a LH hipofizar, a hormonilor sexuali i a altor hormoni. Frecvena fenomenelor autoimune crete cu vrsta, corelat cu schimbrile neuroendocrine.

Artrita reumatoid este asociat cu o insuficien a sintezei corticosteroizilor. Nivelul corticosteroizilor plasmatici tinde s se coreleze cu severitatea inflamaiei, dar pacienii cu afeciune de intensitate medie au nivele inferioare ale corticosteroizilor comparativ cu indivizii normali. Nivelul testosteronului la pacienii cu artrit reumatoid, n special la brbai, tinde s aib valori sczute, iar nivelul estrogenului este nemodificat. Terapia cu testosteron amelioreaz maladia. Estrogenii nu par s produc o exacerbare a artritei reumatoide, iar contraceptivele orale ncetinesc evoluia maladiei. Odat cu scderea brusc a nivelului estrogenilor (perioada postpartum, intervalul care precede menstruaia, menopauza), artrita reumatoid se intensific. In acelai timp diminu secreia de corticosteroizi, deoarece estrogenii influeneaz axa HHC. Nivelul prolactinei la pacienii cu artrit reumatoid este variabil(crescut, normal sau sczut). Artrita reumatoid se remite frecvent n timpul sarcinii i se reactiveaz sau se declaneaz n perioada postpartum, ndeosebi la femeile care alpteaz. Alptarea este nsoit cu creterea marcat a secreiei de prolactin i cu supresia funciei axei HHC.

Lupusul sistemic eritematos are o dominan net la femei, ceea ce denot rolul hormonilor sexuali n declanarea i evoluia acestei maladii. În plasma pacienilor s-a relevat un dezechilibru ntre nivelul androgenilor i estrogenilor. Dezechilibrul poate fi primar sau secundar, datorat unei enzime care convertete androgenii la estrogeni. Brbaii cu lupus sunt prevalent hipoandrogenici. Nivelul sczut al androgenilor favorizeaz imunitatea mediat humoral, iar estrogenii favorizeaz autoimunitatea, prin stimularea producerii de prolactin, care are efect activator asupra funciei imunitare. Pacienii cu lupus se caracterizeaz prin hiperprolactinemie. In timpul sarcinii, maladia se intensific.

Tiroidita autoimun se declaneaz frecvent n perioada postpartum, caracterizat prin hipocortisolemie.

Perioada sarcinii se caracterizeaz prin supresia imunitii mediate celular i meninerea sau chiar creterea imunitii humorale. Setul de citochine sintetizate de celulele Th1 diminu (IL-2 i IFN ), ceea ce elimin riscul avortului imunitar. Diminuarea sintezei IFN este esenial pentru pstrarea sarcinii, deoarece cantitile mari favorizeaz avortul. Nivelul plasmatic al corticosteroizilor, estrogenilor i progesteronei crete. Starea hormonal complex n timpul sarcinii pare s condiioneze remisia maladiilor autoimune dependente de imunitatea celular, ca de exemplu artrita reumatoid i agravarea maladiilor dependente de procese ale imunitii humorale, ca de exemplu, glomerulonefrita n lupusul eritematos.

Postpartum, starea hormonal se modific brusc. Corticosteroizii, estrogenii i progesterona scad la nivele subnormale, iar imunitatea mediat celular se restabilete, ceea ce permite declanarea sau activarea unor maladii autoimune, aa cum este artrita reumatoid, datorit creterii secreiei de prolactin.

Perioadele de sarcin i postpartum se caracterizeaz prin modificri ample ale strii hormonale i sunt asociate frecvent cu declanarea sau activarea unor maladii autoimune, ceea ce ilustreaz rolul mecanismelor endocrine n reglarea funciei imunitare.

BIBLIOGRAFIE

Coninutul acestei cri a fost redactat pe baza consultrii unui numr mare de articole aprute n diferite periodice i a unor capitole speciale sau volume de Imunologie, publicate n tratate de Microbiologie sau de Virologie. Sintezele aprute n Annual Review of Immunology au constituit o surs informaional de o valoare deosebit.

Periodice

Annual Reviews Biochemistry

Annual Reviews Immunology

Annual Reviews Microbiology

Bulletin dInstitut Pasteur

Cancer Immunology

Cell

Clinical Microbiology Reviews

EMBO Journal

Immunology Today

Journal of Immunology

Mediators of inflamation

Microbiology and Molecular Biology Reviews

Nature

Scientific American

Science

Cri

Delves P.J,RoittI. M. Encyclopedia of Immunology, vol. 1-4, sec. ed., 1998, Acad. Press.

Fields B. N., Knipe D. M., Howley P. M. Fields Virology, 3rd edition, Lippincot Raven Publishers, Philadelphia, 1996

Male D., Champion B., Anne Cook Advanced Immunology, J.B. Lippincot Company, 1987.

Patrick S. adn Larkin M. J. - Immunological and molecular aspects of bacterial virulence, J. Wiley & Sons, 1995.

Roitt I. M. Essential Immunology, ninth edition, 1997, Blackwell Science

Samter M, Talmage D. W., Frank M. M., Austen K. F., Claman H. N. Immunological diseases, vol. I, II, fourth ed., Boston, Toronto.

Serhan C. N., Ward P. A. - Molecular and Celular basis of Inflamation, 1999, Humana Press.

Sheehan Catherine Clinical Immunology, Principles and Laboratory Diagnosis, sec. edition, 1997, Lippincot, Philadelphia, New York

Topley and Wilsons Principles of Bacteriology, Virology and Immunity, 8th Ed. M. Tom Parker, Lesslie H. Collier, 1990

Topley and Wilsons Microbiology and Microbial Infections, vol. IV Immunology, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman, 1998.

Weir D. M., Stewart J. Immunology , seventh edition, Longman Group, UK, 1993.

Zarnea G. Tratat de Microbiologie, vol. IV Imunobiologie, Ed. Academiei Romne, 1990.

Zarnea G., Mihescu Gr. Imunologie, Ed. Universitii Bucureti, 1995.

Zwilling B. S., Eisenstein T. K. Macrophage- Pathogen Interactions, 1994, New York, Basel, Hong Kong.