Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Teza Doctorat
Teza Doctorat
UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR CLUJ-NAPOCA COALA DOCTORAL FACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII
TEZ DE DOCTORAT
CERCETRI PRIVIND DEZVOLTAREA I VALIDAREA UNEI METODE DE GENOTIPIZARE A PARAZITULUI VARROA SP. PREZENT N STUPINELE DIN ZONA TRANSILVANIEI
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
Teza de doctorat intitulat CERCETRI PRIVIND DEZVOLTAREA I VALIDAREA UNEI METODE DE GENOTIPIZARE A PARAZITULUI VARROA SP. PREZENT N STUPINELE DIN ZONA TRANSILVANIEI i propune dezvoltarea unei metode de identificare a genotipului cruia i aparine parazitul Varroa sp. prezent n stupinele din Transilvania, precum i caracterizarea parametrilor de performan a metodei n condiiile Laboratorului Zonal de Genotipizare a Animalelor al Universitii de tiine Agricole i Medicin Veterinar Cluj Napoca, n vederea validrii procedurii.
INTODUCERE
Datorit importanei mierii ct i a produselor apicole secundare (polen, lptior de matc, propolis, cear) tributar factorilor nutritivi pe care i conin precum i aciunii terapeutice a acestora, prevenirea i combaterea bolilor albinelor constituie una dintre preocuprile majore ale apicultorilor pe plan mondial (Bura M., 1996; Dezmirean D. i colab., 2008; Mrghita L. Al., 2002). Un alt factor ce contribuie la importana pstrrii strii de sntate a albinelor, l constituie calitatea lor de vector n procesul de polenizare al plantelor, dar i de perspectivele deschise de progresul biotehnologiilor care le transform n virtuali ageni de vehiculare al transgenelor provenite de la plantele modificate genetic (Dezmirean D. i colab., 2007; Rakosy-Tican Elena, 2005). n acest context, o tot mai mare importan se acord factorilor genetici care sunt implicai n rezistena natural a unor specii sau populaii de albine la ageni patogeni specifici, sau parazii, dar i a paraziilor la aciunea produselor destinate combaterii lor.
230
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
aparin superfamiliei de proteine care conin cofactorul Hem (hemoproteine). Denumirea atribuit acestui grup enzimatic se datoreaz localizrii celulare a acestora (cito), dar i caracteristicilor spectrofotometrice (crom) cnd fierul din Hem este redus, P450 absoarbe radiaiile luminoase cu lungimea de und carcteristic de 450 nm. Reacia de baz prin care Citocromul P450 i manifest rolul catalitic, este tipic monooxigenazelor (oxidare prin introducerea unui atom de oxigen ntr-un substrat organic RH i reducere prin formarea apei cu participarea celuilalt atom de oxigen): RH + O2 + 2H+ + 2e ROH + H2O La echinoderme a fost evideniat dependena de P450 a metabolismului compuilor piretroidici (Besten P. J. i colab., 1990; Besten P. J., 1998). n cazul insectelor, a fost confirmat prezena oxidazelor din complexul enzimatic microzomal P450, care utilizeaz sistemul NADPH/NADH pentru a cliva reductor oxigenul atmosferic, conducnd la o funciune organic i o molecul de ap (Schuler Mary A., 1996; Dong K., 2007; Soderlund D. M., 2008). Descrierea acestor mecanisme a facilitat explicarea fenomenului de rezisten a parazitului Varroa sp. la piretroizi. Pe baza lor tulpinile rezistente la produii de combatere i-au dezvoltat capacitatea de a detoxifica insecticidele prin oxidare. Cellalt mecanism al rezistenei poate fi explicat prin mutaiile punctiforme produse la nivelul genei, care controleaz canalele sodiului. Canalele sodiului caracterizate de un potenial electric sunt constituite integral din proteine transmembranare i sunt responsabile de faza de cretere rapid a potenialului de aciune al celulei care face parte din categoria celor cu excitabilitate ridicat. Insecticidele piretroide au efect de reducere a cineticii activrii i dezactivrii canalului sodiului. Consecina direct este deschiderea prelungit a canalelor individuale, ceea ce conduce la paralizia i n final moartea insectelor ce vin n contact cu aceti compui (Wang R. i colab., 2002; Wang R. i colab., 2003; Wang, R. i colab., 2003). Multe dintre insectele ce prezint rezisten la piretroizi au suferit mutaii punctiforme la nivelul genei canalului sodiului. Teste efectuate asupra oocitelor de Xenopus ce au exprimate canalele sodiului, au demonstrat c aceste mutaii reduc sensibilitatea acestor canale la piretroizi, ceea ce confirm faptul c acesta reprezint mecanismul major de rezisten la piretroizi la diverse specii de insecte (Soderlund D.M. i colab., 2003).
232
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
Wang R i colab. (2003) au reuit s evidenieze gena pentru canalul sodiului de la arahnide gena VmNa i la Varroa destructor O. Izolarea integral a genei VmNa a reprezentat un moment important pentru caracterizarea complet a modului de funcionare a acestui mecanism de rezisten la produse pe baz de piretroizi. Cel mai cunoscut mecanism de rezisten a albinelor la boli i duntori, pe baza cruia se poate realiza selecia, este datorat comportamentului igienic al acestora, descris iniial de Park O.W. (1937), citat de Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997. Acest comportament complex const n dou activiti distincte desfurate n dou etape successive (Lapidge K.L. i colab., 2002). Primul implic descpcirea celulelor n care se afl larvele infestate, iar cel de al doilea const n eliminarea efectiv a corpului larvei din celulele descpcite. Pornind de la constatrile lui Park (1937), Rothenbuhler (1964a,b) presupune existena a dou mecanisme diferite care stau la baza controlului acestor activiti. Conform acestei aseriuni, fiecare dintre aceste dou activiti este controlat de o gen cu dou alele, iar comportamentul este transmis la descendeni conform mecanismului mendeleean. Spre exemplu, dac mperecherea se produce ntre un trntor a crui comportament igienic este controlat de ambele alele recesive i o matc ce posed doar cte o alel recesiv pentru fiecare tip de comportament, vor rezulta doar doi descendeni (un trntor i o albin) ce posed ambele alele recesive (fig. 3).
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
Importana cercetrii La noi n ar, nu au fost efectuate studii moleculare asupra caracteristicilor parazitului Varroa sp. i de asemenea, nu a fost ntreprins un studiu integrat ce vizeaz implicarea comportamentul igienic al varietii autohtone de albine n rezistena la boli n greneral i la Varroa sp. n particular. Procedeul de validare a unei metode analitice nou elaborate sau existente urmrete demonstrarea faptului c acea metod corespunde scopului utilizrii pentru care a fost elaborat sau selectat i c performanele sale caracteristice, stabilite prin studii de laborator, satisfac cerinele pentru ca metoda s poat fi aplicat (Kennedy S., 1997). n validarea metodelor analitice principalii parametri care fac obiectul validrii sunt: selectivitate/specificitate, precizie, exactitate, domeniul de lucru, liniaritate, limit de detecie, limit de cuantificare, robustee, sensibilitate i incertitudine. Aceste criterii sunt prevzute i n normele ISO i IUPAC . Enunate fiind principiile generale care stau la baza procedeelor de validare, trebuie subliniat faptul c acestea prezint caracteristici specifice pentru fiecare tip de analiz i, de asemenea, sunt specifice i pentru laboratoarele n care sunt aplicate. n consecin, implementarea acestora n laboratoarele de genetic molecular prezint o serie de particulariti, trebuind s rspund unor exigene specifice (OECD, 2007; Jennings L. i colab., 2009). n acest context, prezentul studiu i aduce aportul la caracterizarea metodei analitice de de izolare, cuantificare i amplificare a ADN din parazitul Varroa destructor O. Din punct de vedere al performanelor analitice i totodat rezultatele obinute permnit ncadrarea aacestora n categoria celor care pot parcurge cu succes exigenele procedeelor de validare n condiiile asigurrii calitii n laboratoarele de biologie molecular (IUPAC, ISO: 2005, 17025). Genotipizarea are un potenial ridicat n depistarea tulpinilor aparinnd Varroa sp. care au dezvoltat rezisten la tratamentul chimic i a cror existen a fost demonstrat nc din anii 90 (ben Hamida T., 1997). n urma aplicrii genotipizrii i confruntrii cu datele din literatur se pot evita cheltuieli inutile cu achiziionarea i
236
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
aplicarea tratamentelor cu Amitraz, Apistan, Cumafos .a. care se dovedesc ineficiente i aplicarea direct a unor soluii diferite de combatere.
CAPITOLUL V EVIDENIEREA COMPORTAMENTULUI IGIENIC LA APIS MELLIFERA CARPATICA L. DIN ZONA TRANSILVANIEI
Rezultatele obinute demonstreaz c n nici una dintre stupinele studiate, familiile de albine analizate nu au manifestat comportament igienic, procentul mediu de descpcire a nregistrat valoarea maxim n judeul Cluj, maximumul nregistrat fiind de 78,72%, situat mult sub limita de 91% de la care familiile de albine se consider c manifest rezisten natural la boli i parazii ca urmare a comportamentului igienic. Cea mai mic medie pentru procentul de descpcire a fost nregistrat n judeul Harghita, 67,54%.
CAPITOLUL VI REZULTATE PRIVIND DEZVOLTAREA METODEI DE GENOTIPIZARE A PARAZITULUI VARROA SP. PREZENT N STUPINELE DIN ZONA TRANSILVANIEI
Acest demers constituie un proces laborios care implic o succesiune de etape (fig. 30).
237
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
Purificarea ADN
Amplificarea ADN Restricia produsului de amplificare cu enzimele SacI i XhoI Migrarea n gel de agaroz 2% i vizualizarea gelului Secvenierea
Identificarea genotipului Fig. 30. Etapele procesului de genotipizare a parazitului Varroa sp. n urma migrrii produsului de amplificare supus restriciei cu enzimele Xho I i Sac I a rezultat profilul electroforetic al celor 10 migrri, fiecare corespunztoare unei zone de colectare a paraziilor (fig. 36).
238
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
10
S S
700 pb
n
X X
n
X
n
X
n
X
n
X
n
X
n
X
n
X
n
X
n
400 pb 200 pb 150 pb
1- Alba, 2 Bistria Nsud, 3 Braov, 4 - Cluj, 5 - Covasna, 6 - Harghita, 7 - Hunedoara, 8 - Mure, 9 - Slaj, 10 Sibiu, X Xho I, S Sac I, n fragment nedigerat
Fig. 36. Profilul electroforetic al probelor de ADN provenit de la parazitul Varroa sp. obinut n urma restriciei cu enzimele Sac I i Xho I (original) Secvenierea a fost realizat de ctre compania Mycrosinth n Elveia. Rezultatele secvenierii au evideniat structura de interes prezent n subunitatea I a genei mitocondriale citocromoxidazei (CO I) a paraziilor aparinnd genotipului Varroa sp. recoltai din stupine localizate n Transilvania. A rezultat urmtoarea secven (n format FASTA):
ATTTATTTTGATTTTTTGGACACCCAGAAGTTTATATTTTAATTTTGCCTGGTTTTGGTATTATTTCTCAGTA ATTTGTATACAGAGAGGGAAGAAGCAGCCTTTTGGAAATTTAGGGATAATTTACGCTATAATAACTATTG GTATTTTAGGTTTTATTGTATGAGCTCATCATATATTTACAGTAGGAATAGATATTGATACTCGAGCATAT TTTACTGCAGCTACAATAATTATTGCGGTTCCTACTGGTATTAAAATTTTTTCTTGATTAGCAACAATTCAT GGTTCTATAGTTAAATTAGATGTCCCAATAATTTGATCTTTAGGTTTTATTTTTTTATTTACTTTAGGGGGT ATTACTGGTGTAATTTTAGCTAATTCTTCTATTGATATTGTTTTACATGATACTTATTATGTAGTAGCACAT TTTCACTATGTATTAAGAATAGGGGCT
Compararea structurii secvenei izolate de noi din ADN provenit de la indivizi Varroa sp. prezeni n stupinele din Transilvania, cu genotipurile existente n baza de date NCBI, a crei rezultat a constat n suprapunerea de 100% cu secvenele cu numerele de acces AF106900.1, AJ84872.1.i AY372063.1 (fig. 40), a condus la constatatrea c genotipul Varroa existent n Transilvania coincide cu genotipul China 2, ce paraziteaz Apis cerana n Asia.
239
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct
1 1 61 61 121 121 181 181 241 241 301 301 361 361 421 421
atttattttgattttttggacacccagaagtttatattttaattttgcctggttttggta |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTTATTTTGATTTTTTGGACACCCAGAAGTTTATATTTTAATTTTGCCTGGTTTTGGTA ttatttCTCATGTAATTTGTATACAGAGAGGGAAGAAGCAGCCTTTTGGAAATTTAGGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTATTTCTCATGTAATTTGTATACAGAGAGGGAAGAAGCAGCCTTTTGGAAATTTAGGGA TAATTTACGCTATAATAACTATTGGTATTTTAGGTTTTATTGTATGAGCTCATCATATAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAATTTACGCTATAATAACTATTGGTATTTTAGGTTTTATTGTATGAGCTCATCATATAT TTACAGTAGGAATAGATATTGATACTCGAGCATATTTTACTGCAGCTACAATAATTATTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTACAGTAGGAATAGATATTGATACTCGAGCATATTTTACTGCAGCTACAATAATTATTG CGGTTCCTACTGGTATTAAAATTTTTTCTTGATTAGCAACAATTCATGGTTCTATAGTTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGTTCCTACTGGTATTAAAATTTTTTCTTGATTAGCAACAATTCATGGTTCTATAGTTA AATTAGATGTCCCAATAATTTGATCTTTAGGTTTTAtttttttATTTACTTTAGGGGGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AATTAGATGTCCCAATAATTTGATCTTTAGGTTTTATTTTTTTATTTACTTTAGGGGGTA TTACTGGTGTAATTTTAGCTAATTCTTCTATTGATATTGTTTTACATGATACTTATTATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTACTGGTGTAATTTTAGCTAATTCTTCTATTGATATTGTTTTACATGATACTTATTATG TAGTAGCACATTTTCACTATGTATTAAGAATAGGGGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAGTAGCACATTTTCACTATGTATTAAGAATAGGGGCT 458 458
60 60 120 120 180 180 240 240 300 300 360 360 420 420
Fig. 40. Secvenele genotipurilor originale China 2 (Anderson i Trueman, 2000; Ting Y. i colab., 2004; Solignac M. i colab., 2005) obinute pentru Varroa destructor i a celor obinute n stupinele din Transilvania
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
de lucru, test de liniaritate, limit de detecie, limit de cuantificare robustee, i incertitudinea de msurare) a rezultat c procedeul are o capabilitate (proficiency) corespunztoare i este n conformitate cu scopul pentru care a fost selectat (tabelul 25). Tabelul 25 Gradul de ndeplinire a criteriilor de validare selectate pentru metoda spectrofotometric de absorbie molecular UV-VIS dezvoltat n vederea cuantificrii ADN izolat din parazitul Varroa destructor O.
Parametrul 1 Selectivitatea Obinerea Rezultat impus 2 spectrului de Rezultat realizat
absorbie molecular UV-VIS la = 230 nm, = 260 nm i respectiv = 280 nm, pentru diferite cantiti de ADN (ng/l) izolate de la parazitul Varroa destructor O. Tehnic specific Precizia Exactitatea Parametrii analizei de Curba regresie liniar RSD% < 3,50 85% R 105% de etalonare y = a + bx are o
y = 0,0675 + 0,0009x
Absorbana (Absorbance)
Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructor O., ng/l Quantity of DNA extracted from Varroa destructor O. mite, ng/l
241
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
Tabelul 25 continuare
1 Liniaritate 2
Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructor O., ng/l Quantity of DNA extracted from Varroa destructor O. mite, ng/l
3
800
750
700
650
600
550
500
450
Absorbana (Absorbance)
Domeniu de lucru
Testul
de
omogenitate
(0,8139) indic o dispersie redus a valorilor individuale n jurul liniei de regresie calculate. Limita de detecie i Limita de cuantificare trebuie s limita de cuantificare fie superioar cu cel puin un ordin de mrime Limitei de detecie Robusteea Influena minim a variaiilor Metoda are un caracter robust, din parametrilor metodei ADN izolat din parazitul Varroa
Absorbana (Absorbance)
r = 0,9833
Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructor O., ng/l Quantity of DNA extracted from Varroa destructor O. mite, ng/l
242
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
Tabelul 25 continuare
1 2
Absorbana (Absorbance)
r = 0,9827
Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructor O., ng/l Quantity of DNA extracted from Varroa destructor O. mite, ng/l
r = 0,9759
Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructor O., ng/l Quantity of DNA extracted from Varroa destructor O. mite, ng/l
-Influena temperaturii
Metoda are un caracter robust dac se lucreaz la temperatura ambiental normal 15 - 200C i se evit variaiile de temperatur (tabelul 21).
Incertitudinea msurare
de Stabilirea incertitudini.
bugetului
de Cea mai mare contribuie le bugetul de incertitudini este adus de volumul total de soluie supus cuantificri (soluie tampon + ADN izolat).
u_absorban (ADN) u_volum (Tips) Tipul incertitudinii (Type of incertitude) 0,025 0,1318 u_volum (Total) u_volum (Ap pur) u_volum (Nonidet) u_volum (tampon) u_volum (Eppendorf) 0,74767 0,407738 3,2363877 3,21066 4,391795 u_puritate (Tris)
0,0086592
5
Valoarea (Value)
243
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
Tabelul 32 Gradul de ndeplinire a criteriilor de validare selectate pentru metoda de amplificare a fragmentului de ADN mitocondrial localizat la nivelul genei CO-I a parazitului Varroa destructor O.
Parametrul 1 Limita de detecie Amplificarea Rezultat impus 2 devine vizibil Ct =16,83 dup un numr redus de cicluri de amplificare (< 21) Reproductibilitatea Nu exist diferene care n ntre
500 pb 400 pb
Rezultat realizat 3
700 pb
400 pb 150 pb
Precizia
Valoare deviaiei
ct
mai
redus
a s = 0,638
standard
pentru
amplificarea aceleiai probe n 20 de repetiii Sensibilitatea Cantitate ct mai redus de ADN ce poate fi amplificat (< 1 g)
500 ng
244
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
Liniaritatea
Robusteea
Influena minim a variaiilor -n parametrilor metodei ADN izolat din parazitul Varroa destructor O. (amplificare ADN: izolat proaspt - a, dup 48h - b i dup 96h - c)
condiile
prezervrii
probelor
500 pb 150 pb
700 pb
500 pb
700 pb
500 pb
c -Influena temperaturii de Metoda are un caracter robust dac se lucreaz la temperatura de ataare a primerilor de 500C. ataare a primerilor
245
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
Tabelul 32 continuare
1 Incertitudinea msurare de Stabilirea incertitudini. 2 bugetului 3 de Cea mai mare contribuie le bugetul de incertitudini este adus de volumul total de soluie supus amplificrii (soluie tampon + ADN izolat).
T ip u l in ce rtitu d in ii (T yp eo f in ce rtitu d e )
0,2000003
2,1606608
0,2700263 0,3184415
1,1859058 0,0086592
0,5
1,5
2,5 Valoa
Aceste constatri permit ncadrarea metodei de izolare i cuantificare i amplificare a ADN din parazitul Varroa destructor O. n categoria celor care pot parcurge cu succes exigenele procedeelor de validare n condiiile asigurrii calitii n laboratoarele de biologie molecular (IUPAC, ISO: 2005, 17025).
CONCLUZII
Datorit faptului c finalitatea tezei de doctorat a vizat o abordare complex a problematicii dezvoltrii i validrii unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. n stupinele din zona Transilvaniei, n conexiune cu particularitile albinei melifere (Apis mellifera L.) din punctul de vederea al aspectelor etologice i al mecanismelor de rezisten la boli i parazii, concluziile formulate debuteaz cu aceste aspecte. Privitor la studiul comportamentului igienic al Apis mellifera L., n stupinele din Transilvania, rezultatele studiului concretizate n nregistrarea valorilor medii ale procentului de descpcire cuprinse n intervalul 67 78% (cu valoarea medie minim de 67,54% nregistrat n judeul Harghita i maxim de 78,72% n judeul
246
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
Cluj) au demonstrat c n nici una dintre stupinele studiate, familiile de albine analizate nu au manifestat comportament igienic, limita de la care familiile de albine se consider c manifest rezisten natural la boli i parazii ca urmare a comportamentului igienic fiind de 91%. Genotipul identificat n urma studiului nostru n stupinele din Transilvania, corespunde numrului de acces n Banca de Gene AF 106900 este genotipul China 2 (Anderson i colab., 2000), unul dintre cele dou genotipuri Varroa din cadrul varietii extreme de largi prezente n Asia capabile s paraziteze i Apis mellifera L. Acesta se suprapune 100% cu genotipurile evideniate de Ting Z. si col. (2004) n China, avnd numarul de acces n baza de date NCBI - AY372063.1 i n Europa, de Solignac M. i colab. (2005) avnd cu numrul de acces n baza de date NCBI AJ84872.1 Cuantificarea parametrilor de performan ai metodei de amplificare a ADN din parazitul Varroa destructor O. enumerai mai sus i analiza rezultatelor obinute, confirm faptul c aceasta corespunde scopului pentru care a fost selectat i n consecin poate fi validat.
RECOMANDRI
Pentru combaterea eficient a parazitului Varroa destructor O. este necesar aplicarea unui management specific rezistenei la duntori, inndu-se cont de faptul c orice organism, n condiii de constrngere, caut s gseasc soluii de supravieuire. Acest tip de management trebuie s includ tehnici legate de: bune practici n managementul stupului, meninerea unui grad redus de infestare, dar i aplicarea produselor de combatere n cantitile omologate i de calitate ecologic. Identificarea rezistenei parazitului Varroa destructor O. la Apistan i cuantificarea acesteia, constituie premisa pentru elaborarea unor strategii eficiente pentru combaterea parazitului. Cunoscndu-se genotipul Varroa sp., precum i faptul c rezistena se datoreaz apariiei unei mutaii punctiforme la nivelul genei canalului sodiului, prin
247
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
aplicarea secvenierii se poate dezvolta un sistem de diagnoz eficient, bazat pe diferenele genetice ntre formele rezistene i cele sensibile. Este necesar implementarea, la nivel naional, a unui sistem de monitorizare a formrii i dezvoltrii rezistenei parazitului Varroa destructor O. la tratamentul cu ageni de combatere piretroidici, dar i a celor pe baz de compui organofosforici sau antibiotice, dei, alturi de o metodologie competent pentru diagnoza acesteia, utilizarea lor este din ce n ce mai rar datorit efectelor de remanen. Cuantificarea parametrilor de performan ai metodei de genotipizare a parazitului Varroa destructor O. (prin aplicarea direct la etapele de de izolare, cuantificare i amplificare a ADN) i analiza rezultatelor obinute, n condiiile Laboratorului Zonal de enotipizare a Animalelor Domestice, confirm faptul c aceasta poate fi propus spre validare, contribuind de aceast manier la sporirea competenei laboratorului.
248
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1.
Andersen C.L., J.L. Jensen and T. F. rntoft, 2004, Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Data: A Model-Based Variance Estimation Approach to Identify Genes Suited for Normalization, Applied to Bladder and Colon Cancer Data Sets, Cancer research, No. 64, 5245 5250
2.
den Besten P.J. 1998, Cytochrome P450 monooxygenase system in echinoderms, Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology, Vol. 121, No. 1 - 3, 139 146 Brown, T.A., 2002, Genomes, 2nd Edition, BIOS Scientific Publishers Ltd., 101, 121, 122 Bruneau E., Jacobs F., and Trouiller J., 1997, Rsultats de la campagne dedtection de la rsistance de Varroa aux pyrthrinodes en Belgique - 1997. Abeilles et Compagnie, No. 60, 5 6 Bura M., Creterea intensiv a albinelor, 1996, Editura Helicon, Timioara Bura M., Silvia Ptruic, V.A. Bura, 2005, Tehnologie Apicol, Ed. Solnes, Timioara Burkardt H. J., Standardization and quality control of PCR analyses, Clin. Chem. Lab. Med, 2000, Vol. 38, No. 2, 87 91 Cuia Eliza, 2006 - 2008, Determinarea rezistenei naturale la boli a populaiilor de albine (A. M. Carpatica) din Romania pe baza unor teste specifice i realizarea unei metodologii optime de ameliorare pentru acest character, Proiect CEEX, Modulul II, EP Colton T., 1974, Statistics in Medicine, Little Brown Publishers, 372 pag. Coier Viorica, A. Vlaic, 2007, Abordarea practic a problemelor de genetic animal, Editura Todesco, Cluj - Napoca
249
3.
4.
5. 6.
7.
8.
9. 10.
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
11.
Defilando Baker M. D., 1988, Variability and biotypes of Varroa jacobsoni Oudemans, American Bee Journal, Vol. 128, No. 8, 567 568 Dezmirean S. Daniel, L. Al. Mrghita, Graia I. Dezmirean, G. Dini, O.Bobi, L. Laslo, A. Moise, Antonia Odagiu, A. Fiiu, I. Paca, C. Bojan, Simona Brsan, O. Maghear, C. Coroian, M. Man; 2007, Reccomandations regarding prophylaxis of honey contamination during primary processing, Apicultura de la tiin la agribusiness i apiterapie, 82-84 Dezmirean D., L. Al. Mrghita, Oltica Giorgiana Stanciu, Otilia Bobi, Laura Laslo, Adela Moise, O.Maghear, Cristina Bojan, 2008, Mineral composition of honeydew honey produced in Transylvania determined by Atomic Absorbtion Spectrometry, Bulletin USAMV-CN, Vol. 65, No.1 - 2, 233-237
12.
13.
14.
Gonccalves M.C., M. M. Klerks, M. Verbeek, J. Vega, J. F. van den Heuvel, 2002, The use of molecular beacons combined with NASBA for the sensitive detection of Sugarcane Yellow Leaf Virus, European Journal of Plant Pathology No. 108, 401407 de Graaf D.C., W. Ritter, F. J. Jacobs, Marleen Brunian, H. Inberechts, K. Mintiens, Y. Van der Stede, B. Verheyden, A.K. Fauske, P. Boujon, Gabriela Chioveanu, D. Dezmirean, G. Formato, F. Mutinelli, H.-J. Roest, D. Titera, S.F. Pernal, Katia Knapen, 2009, Lessons from the first international proficiency test for the detection of spores from the honey bee pathogen Paenibacillus larvae, Accreditation Quality Assurance, No. 14, 273-276 Martin S. J., 2004, Acaricide (pyrethroid) resistance in Varroa destructor, Bee World, No. 85, 67 - 69 Mrghita L. Al., 2003, Albinele i produsele lor, Editura Ceres, Bucureti Mrghita L. Al., D. Dezmirean - Coordonatori, 2007, Apicultura de la tiin la agribusiness i apiterapie, Editura AcademicPres, Cluj - Napoca Milani N., G. Della Vedova, 2002, Decline in the proportion of mites resistant to fluvalinate in a population of Varroa destructor not treated with pyrethroids, Apidologie, No. 33, 417 - 422
15.
16.
17. 18.
19.
250
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
20.
Odagiu Antonia, A. Vlaic, L. Al. Mrghita, D. Dezmirean, I. Cornoiu, Laura Laslo, 2007, Research into the hygienic behaviour of honeybees in Transylvania, Proceedings of the 42nd Croatian&2nd International Symposium on Agriculture, 13-16 February, 302 306 Odagiu Antonia, A. Vlaic, L. Al. Mrghita, D. Dezmirean, 2007, The hygienic behavior testing honeybee colonies from Transylvanian area, n Apicultura de la tiin la agribusiness i apiterapie, Mrghita L. Al., D. Dezmirean Coordonatori, Editura AcademicPres, Cluj Napoca, 17 - 19 Odagiu Antonia., A.Vlaic, L. Al. Mrghita, I. Oroian, D. Dezmirean, Dana Pusta, 2008, The Validation of the DNA Extraction Method from Apis mellifera L., Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Animal Science and Biotechnologies, Vol. 65, No.1 - 2, 387 390 Odagiu Antonia, I. Oroian, A. Vlaic, Al. Mrghita, P. Mazzone, E. Caprio, D. Dezmirean, 2009, Assessing Linearity of the Parasite Varroa destructor DNA Amplification, ProEnvironment/ProMediu, Vol. 2, No. 4, 226 229 (319 322) Patti Elzen and D. Westervelt, 2004, A scientific note on reversion of fluvalinate resistance to a degree of susceptibility in Varroa destructor, Apidologie, No. 35, 519 520 Peirson S. N., J. N. Butler, and R. G. Foster, 2003, Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis, NucleicAcid Res., Vol. 31, No. 14, 118 125 Peters I. R., C. R. Helps, E. J. Hall, and M. J. Day, 2004, Real-time RT-PCR: considerations for efficient and sensitive assay design, J. Immunol. Methods, Vol. 286, Nos. 1- 2, 203217 Ponchel F., C. Toomes, K. Bransfield, F. T. Leong, Susan Douglas, Sarah Field, Sandra Bell, Valerie Combaret, A. Puisieux, A.J. Mighell, P. A. Robinson, C. F. Inglehearn, J. D. Isaacs and A. F. Markham, 2003, Real-time PCR based on SYBRGreen I fluorescence: An alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene deletions, BMC Biotechnology, Vol. 3, No. 18, 1 13
251
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
28.
Rakosy - Tican Elena, 2005, Inginerie genetica vegetala: note de curs, Casa Crii de tiin, Cluj-Napoca Rakosy Tican Elena, L. Al. Mrghita, 2007, The bees as vehicles for transgene transfer from genetically moddified plants to other organisms theoretical issues, n Apicultura de la tiin la agribusiness i apiterapie, Mrghita L. Al., D. Dezmirean - Coordonatori, Editura AcademicPres, Cluj Napoca, 184 188 Rieu I. and S. J. Powers, 2009, Real - Time Quantitative RT-PCR: Design, Calculations, and Statistics, Plant Cell, No. 21, 1031 1033 Soderlund D. M., 2008, Pyrethroids, knockdown resistance and sodium channels, Pest Management Science, Vol. 64, No. 6, 610 - 616 Solignac M., D. Vautrin, E. Baudry, F. Mouguel, A. Loiseau and J-M Cornuet, 2004, A Microsatelitte-Based Linkage Map of the Honeybee, Apis mellifera L., Genetics, No. 167, 253 - 262 Spivak M., and G. S. Reuter, 2001, Varroa destructor infestation in untreated honey bee (Hymenoptera: Apidae) colonies selected for hygienic behavior, Journal of Economic Entomology, Vol. 94, No. 2, 326 331 Tnase I. Gh., G. L. Radu, Al. Pan, Mihaela Buleandr, 2007, Validarea metodelor analitice. Principii teoretice i studii de caz, Editura PRINTECH, Bucureti Vlaic A., 1997, Inginerie genetic, realizri, sperane, neliniti, Editura Promedia Plus Vlaic A., T. Oroian, Simona Pacalu, 2001, Genotypization of bulls used for artificial insemination at k-casein and -lactoglobulin locus, Bulletin USAMVCN, Vol. 55 56, 112 117 Vlaic A., T. Oroian, 2004, Elemente de genetic pentru zootehniti, Editura AcademicPres, Cluj Napoca Vlaic A., Viorica Coier, Antonia Odagiu, T. Oroian, V. Blteanu, 2005, Analysis of genetic diversity in five cattle breeds from Romania, Bulletin USAMV-CN, Seria ZB, Vol. 61, 332
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
252
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. prezent n stupinele din zona Transilvaniei
39.
Vlaic A., V. A. Blteanu, F. D. Pop, Anda Raluca Rusu, 2008, Molecular methods used for detection of cattle milk in buffalo, ewe and dairy products, Lucrri tiinifice, seria Zootehnie, Iai, Vol. 51, 1016 - 1021 Ting Z., L. Anderson, Z. Y. Huang, S. Huang, J. Yao, T. Ken, Q. Zhang, 2004, Identification of Varroa mites (Acari: Varroidae) infesting Apis cerana and Apis mellifera in China, Apidologie, No. 35, 645 - 654 ***, 1993, ISO 3534 - 1/VIM, International Vocabulary of Basic and General Terms in Metrology, International Standards Organization, Geneva, Switzerland, IInd Edition ***, 1995, SR 13 434, ISO/GUM, Guide to the expression of uncertainty in measurement, International Standards Organization, Geneva, Switzerland ***, 2001, IUPAC Recommendations, Selectivity in analytical chemistry, Pure Applied Chemistry, Vol. 73, No. 8, 1381 - 1386 ***, 2003, Validation of analytical procedures: Methodology, International Conference on Harmonization Federal Register, Vol. 60, 27463 ***, 2003, Ghidul ILAC-G17 privind incertitudinea de msurare, SR ENV 13005, International Standards Organization, Geneva, Switzerland ***, 2005, Standardul SR EN ISO/CEI 17025 : 2005, International Standards Organization, Geneva, Switzerland
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
253