CAPITOLUL I

STADIUL ACTUAL AL CERCETRILOR PRIVIND CIRCUITUL AZOTULUI N NATUR

Chimitii au gsit mijlocul de a izgoni din agriculur spectrul foametei de azot i au rezolvat problema fixrii azotului atmosferic. Aceasta ns nu nseamn ca problema este definitiv eliminat. Savanii din ntreaga lume caut procedee noi, mai ieftine i mai eficiente pentru fixarea azotului. Cercetrile se efectueaz n dou direcii: biologic i tehnic. Cercetrile lui Delwiche (1970) referitoare la substanele organice azotate din mare, sunt raportate la cei 10 cm de strat activ de la fundul oceanului, n timp ce Sderlund i Svensson (1976) iau n consideraie azotul organic dizolvat n coloana de ap. Mulder, Lie i Woldendorp (1969) consider c bacteriile fi xatoare de azot liber au o contribuie minor la economia global a acestui element n natur i la fertilitatea solului, pe baza urmtoarelor argumente: - numrul celulelor de Azotobacter i Beijerinckia, n foarte multe soluri, este relativ mic; s-a demonstrat, n plus, c prezena n rizosfer a unui numr mare de bacterii fixatoare de azot, ca Azotobacter, Beijerinckia, Derxia i Azospirillum, nu atest rolul lor n economia azotului din sistemul respectiv; - stimularea fixrii azotului necesit consumul unor cantiti mari de carbon organic; - n prezena compuilor cu azot n mediu, i utilizeaz preferenial pe acetia, diminundu-i, semnificativ, capacitatea fixatoare;

- n solurile fertile, activitatea lor este uor depresat de microorganismele nefixatoare care consum substraturile organice cu carbon. Day i colab. (1984), utiliznd tehnici mai riguroase, apreciaz contribuia bacteriilor chemotrofe libere la 2-3 kg N/ha/an i cu un rol mai important n regiunile tropicale dect n cele temperate. n ansamblu, n special pe baza studiilor de laborator efectuate cu tehnici moderne ,se consider c rolul acestei categorii de microorganisme n fixarea azotului i fertilitatea solului este incert. Ele explic lipsa de interes pentru bacteriile Azotobacter. Beijerinckia, Clostridium etc., atat de mult studiate pn n anii 1950. Dup Evans i Barber (1977), leguminoasele cultivate i cele din flora spontan introduc n sol 90 x 106 tone N/an, respectiv aproximativ jumatate din cantitatea total de azot fixat pe cale biologic. Capacitatea fixatoare a sistemului Rhizobium/ lucern sau Rhizobium/ lupin, poate reprezenta ntre 350 i 600 kg N/ha/an. Eficiena este determinat de caracterul integrat al simbiozei, n cursul creia bacteriile beneficiaz de glucidele sintetizate de plante, n cursul fotosintezei, la rndul lor ,cednd produii rezultai din fixarea azotului, pe care i exporta direct din nodul n organismul plantei pe calea unui sistem specializat. Delwiche (1970 1976) semnaleaz un fapt deosebit, care, dei este raportat la perioada anilor 1970, i pstreaz ntreaga semnificaie. Ctigul total de azot fixat anual este de 92 milioane de tone, n timp ce pierderile prin denitrificare sunt limitate la 83 tone N/an. Diferena de 9 milioane de tone/an reprezint, probabil, cantitatea de azot fixat care este introdus anual

n biosfer, n structura diferitelor molecule din sol, lacuri, ruri, oceane, precum i n rezervoarele subterane. Dup Audus, Ghinea i Ghiorghiade (l970) putem ntlni o ac iune direct mpotriva organismelor, alternd un proces fundamental comun. Poate exista i o aciune selectiv, fiind inhibate doar procesele vitale ale unui grup de microorganisme. Unele erbicide pot favoriza, direct sau indirect, o serie de microorganisme care, astfel, pot substitui ali compui ai microbiotei, modificnd echilibrul microbian al solului. J. Audus (1970) arat c microbiota solului alctuiete un microsol dinamic i complex ale crei populaii se afl ntr-un echilibru foarte delicat, echilibru meninut printr-o complexitate de interaciuni a cror natur, de multe ori, ne este cunoscut. Autorul vorbete tocmai de posibilitatea de tulburare a acestei interaciuni prin aplicarea erbicidelor a pesticidelor, n general. Prin aceasta se poate tulbura fertilitatea optim a solului. Obiectivul principal al agriculturii este asigurarea condiiilor favorabile pentru speciile importante din punct de vedere comercial, utilizndu-se erbicide n detrimentul multor altor specii. Practica agricol influeneaz n mod direct sau indirect asupra diversitii biologice. Aceast aciune se reliefeaz la diferite niveluri, cauzele generale ale deteriorrii biodiversitii fiind urmtoarele: - la nivelul ecosistemelor i habitatelor: a influenat direct micorarea habitatelor multor specii de insecte, psri, amfibii, mamifere, plante superioare i inferioare; - la nivelul speciilor: utilizarea erbicidelor duneaz speciilor comensale, iar a insecticidelor microfaunei. Se tulbur ciclurile de dezvoltare ale multor organisme. Mecanizarea i fertilizarea provoac modificarea echilibrului dintre specii;

- la nivel genetic: se produce micorarea numrului de specii, varieti, rase utilizate. Monocultura favorizeaz mult acest proces. Are loc eroziunea genetic ireversibil a speciilor animale i vegetale. S-a studiat efectul toxic la mai multe grupe de erbicide. Astfel, s-a observat c exist o sensibilitate diferit la aminotriazine, chiar la tulpina aparinnd aceleiai specii microbiene. Dintre diazine a fost studiat, sub aspect microbiologic, mai ales hidrazida maleic. Se pare c aceasta, n doze normale, provoac o uoar stimulare a microbiotei solului (Levi, Krafts, Evans, 1968) - cit. Zarnea (1994), dozele excesive fiind inhibitoare. Substituenii sunt apreciai n general ca fiind toxici pentru microbiot Bartha i colab. (1967) apreciaz faptul c derivaii ureei sunt cele mai toxice erbicide pentru microbiota solului. Carbonaii au un efect depresiv temporar. n timp ce pe plan local (n mod particular, la nivelul suprafeelor supuse unei agriculturi intensive) se pun probleme importante pentru evitarea unui deficit de azot, pe plan global, bilanul circuitului azotului este pozitiv. Acest caracter este determinat de faptul c, la nivelul biosferei, cantitatea de azot fixat este mai mare dect cea pierdut prin recoltri, denitrificri, depuneri de sedimente. Datorit aportului crescut de azot, mai ales n apele de suprafa i subterane, exist riscul ca aceast concentraie crescut de azot s depeasc nivelul acceptabil pentru consumul uman. Exist riscul ca, n perspectiv, chiar pe plan global, s fie necesar utilizarea denitrificrii pentru a controla cantitatea de azot fixat n biosfer. n felul acesta, efortul pentru a gsi ci de mbogire a solului n azot i de a ameliora, pe aceast cale, alimentaia populaiei globului, va trebui sa fie nlocuit cu efortul de a menine, n limite normale, ntr-un echilibru rezonabil, ciclul azotului.

CAPITOLUL II
ROLUL MICROORGANISMELOR N CIRCUITUL GLOBAL AL MATERIEl N NATUR
n natur, organismele vii preiau n mod permanent din sol, din ap i din atmosfer, cantiti mari de elemente pe care le folosesc pentru sinteza constituenilor lor celulari i pentru obinerea energiei necesare activit ilor lor biologice. Parial, n cursul vieii lor i n cea mai mare parte dup moarte, substanele organice formate sunt supuse unui proces de mineralizare, iar elementele componente sunt redate rezervoarelor din care au provenit. Circulaia biochimic este dirijat, direct sau indirect, de energia radiant solar, care este absorbit de organismele fototrofe (plante verzi, alge, bacterii fotosintetizante). Datorit capacitii de a converti energia luminoas n energie chimic, ele pot sintetiza substane organice pornind numai de la CO2 atmosferic, ap i substane minerale. De la plante, substanele organice astfel sintetizate, sunt preluate sub form de hran de ctre animale i om, iar dup moartea acestora se rentorc n sol i n ape, sub form organic, neutilizabil ca atare de ctre plante. La aceast srcire a solului n substane anorganice se adaug pierderile determinate de eroziune, fenomenele produse de vnt i ploi, de depunerea unor compui minerali n sedimente i roci sediment are, sau stocate sub forme ce evolueaz spre stadiul de combustibili fosili (crbune, iei etc.). Dac acest proces ar fi continuu, cu toate c rezervele de elemente biogene existente n natur sunt foarte mari, s-ar ajunge, la un moment dat,

la epuizarea formelor utilizabile, situaie incompatibil cu existena organismelor vii. Acest fenomen este mpiedicat de faptul c microorganismele din sol i din ape, exercitnd o puternic i permanent aciune de mineralizare a substanelor organice de provenin vegetal sau animal, menin constituenii anorganici i organici din biosfer ntr -un raport relativ constant. Chiar i n mediile acvatice, n care dup date mai noi, n procesul de remineralizare particip cu un rol important zooplanctonul, rolul bact eriilor i al fungilor rmne esenial datorit unor particulariti unice: 1. caracter ubicuitar; 2. activitate metabolic intens; 3. capacitate de multiplicare rapid; 4. activitate degradativ marcant chiar asupra unor substane chimice complexe (celuloz, lignin, chitin) neobinuit (hidrocarburi, fenoli etc.) sau recalcitrante (de sintez).

2.1. CICLURILE BIOGEOCHIMICE

Ciclurile biogeochimice nsumeaz cile de circulaie ale elementelor biogene n natur, prin care trec de la forma anorganic la forma organic, respectiv la diferite combinaii, mai mult sau mai puin complexe, pentru ca s revin la forma anorganic din compartimentul abiotic al habitatelor respective. Evoluia acestor ci n care sunt implicate atmosfera, hidrosfera i litosfera, implic intrarea n aciune a numeroase etape intermediare de transformare a unor reacii fizice (solubilizri, precipitaii, volatilizri) i chimice (oxidri, reduceri, hidrolize), ca i activiti biologice (degradri i

mineralizri, conversie organic prin biosintez), precum i prin translocri spaiale repetate: atmosfer <=> ap, atmosfer <=> sol, sol <=> ap, ap <=> sedimente n unele cazuri, transformrile ciclice sunt relativ simple din punct de vedere chimic, fiind limitate la simpla alternan anorganic <=> organic. n acest sens este caracteristic ciclul fosforului, care este preluat de organismele vii (microorganisme i plante) ca fosfat anorganic solubil i ncorporat n compui organici prin esterificarea ionului fosfat.Dup moartea organismelor, fosfatul organic eliberat este reconvertit la formele anorganice. n cursul acestui ciclu, atomul de fosfor rmne component al gruprii fosfat. Circulaia lui sub aciunea microorganismelor nu -i modific starea de oxidare (Stewart, 1976).Transformrile se reduc la trecerea de la fosfat anorganic la organic i invers, respectiv de la insolubil (imobilizat) la solubil i mobil (Atlas, 1984) Situaia este diferit n cazul altor elemente (C, N, 0, S etc.), la care conversia anorganic <=> organic este nsoit de modificri n starea lor de oxidare, cu consecine importante pentru utilizarea lor de ctre microorganisme. n unele medii, indisponibilitatea elementelor citate nu este determinat de absena lor, ci de lipsa unor forme chimice accesibile. Ca urmare, un hectar de sol poate s conin 75000 tone N i s fie, totui, limitant pentru plante. Fraciunea din azotul total, prezent n biosfer disponibil pentru a fi utilizat de plante, variaza intre 0,00001 i 0,001% . n strit, unele cicluri (de exemplu, n ciclul carbonului) prezint ceea ce Hutchinson a denumit imperfeciuni accidentale, n sensul c, permanent, anumite cantiti sunt depuse n forme relativ stabile, fiind scoase din circuit,

fie pe termen mediu (ca n cazul humusului), fie pentru zeci i sute de milioane de ani, ca n cazul combustibililor fosili (Fig.1).
Rezervoare naturale (atmosfer, hidrosfer, litosfer)

Mineralizare Substane organice (organisme vii) Asimilare Substane anorganice

Stocare pe termen mediu (humus) sau lung (combustibili fosili, sedimente)

Fig.1. Schem privind circuitul biogeochimc n natur (dup Hutchinson, 1970)

Diferitele forme chimice (organic, anorganic, solubil, insolubil) ale unui element, formeaz rezervoare ale caror mrime poate fi aproximat, att la scar local (la nivel de habitat) sau chiar extrapolat la nivel de biosfer. ntre diferitele rezervoare, prezente n atmosfer, litosfer sau hidrosfer, exist un flux continuu care evolueaz n funcie de viteza de reciclare a materialelor respective. Mrimea rezervoarelor poate diferi mult de la un habitat la altul. Ele pot conine compui uor accesibili, expui unor transformri rapide, sau relativ inaccesibili, transformai lent. n funcie de condiiile locale, unele forme chimice pot fi pierdute, iar altele se pot acumula. Mrimea diferitelor rezervoare determin viteza de turnover. n general, rezervoarele mici (de exemplu, cel de CO2) au un turnover rapid i, n mod deosebit, sensibil la

perturbri. Viteza cu care evolueaz ntregul ciclu depinde de mrimea rezervorului i de cea mai lent vitez de turnover. n unele cazuri, viteza mic de degradare a unor substraturi (celuloz, hemiceluloz, lignin) determin o "strangulare" a fluxului i ncetinirea lui global (Alexander, 1971). n unele cazuri, mrimea rezervorului este constant n timp, datorit unei stri de echilibru, rezultat, n primul rnd, din faptul c pierderea este echilibrat de un flux aproximativ egal. Ca urmare, cantitatea de carbon organic, ntr-un teren virgin este, relativ constant, deoarece pierderea de CO2 este echilibrat de rentoarcerea sub form de carbon organic, ca litier i esut radicular mort.

2. 2. INTERCONECTAREA CICLURILOR BIOGEOCHIMICE n mod convenional, exist o tendin de prezentare separat a ciclului diferitelor elemente biogene, dei, ele sunt strns interconectate i interdependente, realiznd, n ansamblu, circuitul global al materiei n natura. n acest sens, exist probe numeroase de la cele mai simple la cele mai sofisticate. Bacteriile proteolitice, care descompun proteinele la CO2 , NH3 , H2S, sunt implicate n trei cicluri; respectiv, ciclul carbonului, azotului i sulfului. n mod asemntor, Thiobacillus denitrificans particip n desfurarea celor trei cicluri prin reducerea nitratului, oxidarea H2S i utilizarea energiei pentru reducerea CO2 i sinteza de compui organici ai carbonului. n Fig.2 sunt prezentate interaciunile dintre ciclurile carbonului, oxigenului i apei. Interaciuni similare au loc constant ntre ciclul carbonului i cel al azotului.

H2O i CO2 din mediu

H2 H2

O2

CO2

CO2

O2

Constituenii materiei vii O2 din mediu

Fig.2. Interrelaiile dintre ciclurile oxigenului, carbonului i apei (dup Weisz, 1982)
Inf1uena omului este foarte evident pe scar local, unde poate perturba capacitatea proprie de echilibrare a unui ciclu, inducnd, uneori, modificri severe i greu reversibile ale mediului. Ea se poate manifesta negativ i la scar global, aa cum se ntmpl cu creterea concentraie i CO2 n atmosfer, ca o consecin a industrializarii i a arderii combustibililor fosili. Poluarea, sub diferitele ei forme, cu un aport excesiv de materie i energie, poate modifica viteza de transfer a elementelor ntre diferitele rezervoare; mrimea rezervoarelor producnd schimbri majore n particularitile biochimice ale habitatelor i asupra comunitilor de organisme care le populeaz. n circulaia materiei n natur, rolul microorganismelor este esenial. Fr microorganisme nu ar putea exista plante, iar n lipsa lor viaa animalelor ar nceta. Prin urmare, microorganismele sunt tot att de indispensabile vieii, ca i sursa de energie pe care o reprezint soarele,

deoarece, fr unul dintre aceti factori, nu ar mai exista plante verzi, dec i viaa nsi ar nceta.

CAPITOLUL III
CIRCUITUL BIOGEOCHIMIC AL AZOTULUI
Azotul este un element esenial pentru existena vieii in biosfer, deoarece este inclus n structura tuturor proteinelor i acizilor nucleici. Dei este prezent n natur n cantiti foarte mari, se gsete, aproape invariabil, n forme inaccesibile plantelor i animalelor. Azotul reprezint 79% din coninutul atmosferei sub form de azot diatomic, gaz, practic inert, inaccesibil sistemelor biologice. Se adaug cantiti impo rtante prezente n structura plantelor i a animalelor terestre, n humus, n substanele organice din organismele vii din sedimentele din mri i oceane, n roci etc. n cadrul circuitului azotului n natur, azotul mineral este folosit de plante i nglobat n structura lor sub form de constitueni celulari. Animalele sunt dependente de plante ca surs major de azot. esuturile vegetale i animalele moarte sunt mineralizate prin procesul de proteoliz i amonificare i convertite, prin nitrificare, n forme din nou accesibile plantelor. Cu toate acestea, pierderile de azot din sol, legate de recoltarea plantelor de cultur, precum i cele adiionale, determinate de denitrificare i levigaie, sunt att de mari nct, cel puin n cazul solurilor agricole , depesc cantitatea de azot disponibil existent. Se apreciaz c o producie de gru de 5 000 kg/ha echivaleaz cu o pierdere de 120 kg. n mod

asemntor, o producie de 50 000 kg sfecl necesit 200 kg N, iar producerea de 5 000 kg biomas uscat/ ha/an, pe o pajite din regiunile temperate, implic o pierdere de 150 kg N. Din aceasta decurge necesitatea mbogirii solului n azot combinat, fie pe cale natural, prin fixarea biologic a azotului atmosferic,fie artificial, prin adugare de ngraminte azotate. Altfel, exist riscul ca deficitul de azot s devin un factor limitant al produciei primare n ecosistemele respective. Fcnd abstracie de cantitile mici de azot molecular care devin accesibile plantelor pe cale fizico-chimic, prin fixarea lor n sol n cursul descrcrilor electrice i cu apele din precipitaii, cea mai mare parte a azotului atmosferic ar rmne nefolosit de vieuitoarele de pe pmnt dac nu ar exista microorganismele fixatoare de azot. Cantitatea de azot fixat, pe cale biologic, este apreciat la 175 milioane tone N/an, din care 90 x 106 , tone n solurile agricole. Se adaug azotul fixat pe cale abiotic, prin iradieri, descrcri electrice din atmosfer (fulgere), apreciat la 10 tone N/an i cel din procese de combusti e, de la ehipamente electrice, motoare cu combustie intern etc. ce produc oxizi de azot care, eliberai n atmosfer, sunt readui de ploi n sol sub form de nitrai. Circulaia biologic a azotului este un proces lent i continuu, prin care, sub aciunea a peste 100 de genuri de bacterii diferite, azotul gazos atmosferic este convertit la forme fixe, care sunt folosite de plante i introduse n forme organice, n constitueni structurali, utiliznd energia obinut prin fotosintez. Dup moartea plantelor i animalelor care i-au consumat, compuii organici ai azotului sunt mineralizai i restituii marelui rezervor atmosferic.

Etapele eseniale ale acestui proces, implicnd intrarea n aciune a mai multor activiti biochimice, unele desfaurate n aerobioz, iar altele n anaerobioz sunt: 1) Fixarea azotului molecular; 2) Amonificarea; 3) Nitrificarea; 4) Denitrificarea.

CIRCUITUL AZOTULUI N NATUR

Rezervorul natural de azot atmosferic

Fixarea azotului (NO2-)

Resturi animale

Resturi vegetale

Fertilizatori (NH4+), (NO3=)

Bacterii denitrificatoare

Bacterii descompuntoare

Fixarea biologic a azotului prin aciunea bacteriilor nitrificatoare

Amoniac (NH3) Ion amoniu (NH4+)

Nitrii (NO2=)

Nitrai (NO3=)

n timp ce n ecosistemele naturale circuitul azotului este un proces echilibrat, n sensul c pierderile de azot din sol sunt compensate de procesele de fixare, n sistemele supuse procesului de agricultura intensiv, pierderile depesc ritmul de nlocuire. Se apreciaz c 35% din populaia globului este absolut dependent de ngrmintele azotate. Bilanul global al circuitului biogeochimic al azotului este un bilan pozitiv pentru biosfer, dei exist scurgeri din circuit, att prin denitrificare, ct i prin depozitarea unei pri de substane organice n sedimente. Caracterul pozitiv al bilanului, adic a faptului c se fixeaz mai mult azot dect se pierde, este foarte important deoarece face posibil creterea biomasei ntregii biosfere. Ponderea activitii umane n acest proces este substanial i n continu cretere, iar eforturile fcute pe a cest drum, sunt pe deplin justificate, deoarece duc la creterea cantitii de proteine n alimentaia omului. 3.1.FIXAREA AZOTULUI MOLECULAR Reprezint orice proces care convertete azotul liber n compui cu azot. Molecula de azot poate fi scindat n atomi de azot de energia care rezult din arderi, din aciunea vulcanilor, descrcri electrice i procese

industiale. Lumina din descrcrile electrice atmosferice furnizeaz energia care favorizeaz unirea azotului atomic cu oxigenul atomic, formndu -se oxid de azot. Dup o serie de schimbri compuii cu azot ajung pe pamnt prin ploaie.

3.1.1.Fixarea biologic a azotului

Este realizat n exclusivitate de bacterii i const n ncorporarea azotului n combinaii chimice pe care plantele le pot absorbi i utiliza. Aceste substane sunt amoniacul i ionul de nitrat. Pentru ca azotul atmosferic, molecular s reacioneze cu hidrogenul i oxigenul, el trebuie s fie scindat n atomi de azot. Scindarea azotului molecular n azot atomic i combinarea acestuia cu hidrogenul, avnd ca rezultat amoniacul sau cu hidrogenul i oxigenul din care rezult ionul de nitrat (NO3-), n mediul terestru i n mediul acvatic, este realizat de ctre bacterii fixatoare de azot, cu ajutorul enzimelor. Enzima se numete nitrogenaz. Nitrogenaza funcioneaz numai n absena oxigenului. Nu exist nici un exemplu de organisme eucariote fixatoare de azot molecular. Se apreciaz c aceast proprietate a aprut n cursul evoluiei ntr-o perioad cnd speciile eucariote erau deja existente i bacteriile erau singurele organisme dotate cu capacitatea de a metaboliza anaerob i cu reductazele adecvate unei conversii n direcia nitrogenazelor, sistemul enzimatic esenial pentru fixarea azotului.

3.1.2. Bacteriile libere fixatoare de azot

Sunt reprezentate de 2 grupuri majore: 1. bacteriile chemotrofe;

2. bacteriile fototrofe (eubacterii i cianobacterii). 1. Bacterii chemotrofe fixatoare de azot: Clostridium pasteurianum i Azotobacter sp. au fost descrise, iniial, ca singurele bacterii fixatoare de azot i considerate, mult timp, ca avnd o importan esenial pentru acest proces pe plan global. Ulterior, s-a demonstrat c din numrul total de 260 de genuri de bacterii chemotrofe, aproximativ 10% conin nitrogenaza i, ca urmare, au proprietatea de fixare a azotului atmosferic. Ele includ specii din genurile: Alcaligenes, Aquaspirillum, Arthrobacter, Azospirillum, Azotobacter, Derxia, Bacillus, Bejerinckia, Campylobacter, Citrobacter, Clostridium,

Enterobacter, Erwinia, Frankia, Klebsiella. Methylobacter Methylococcus, Methylosinus. Mycobacterium, Propionibacterium, Rhizobium, Thiobacillus, Xanthobacter. Dintre acestea, unele (Rhizobium, Frankia, Azospirillum) au capacitatea de a forma simbioze cu diferite grade de specificitate i activitate n natur. Celelalte sunt fixatoare libere de azot. Unele sunt aerobe (Azotobacter Beijerinckia etc.), altele anaerobe (Clostridium pasteurianum , Desulfovibrio), iar celelalte, n majoritate , aerobe facultativ anaerobe (Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter). Rspndirea lor n natur este adesea caracteristic: Azotobacter chroococcum n soluri neutre i alcaline; A. agilis n ape uzate alcaline i neutre, srace n azot, bogate n carbon; Beijerinckia n soluri acide, n special tropicale i subtropicale; Derxia gummosa n special n solurile din India.

Din mediile acvatice au fost izolate: Azotobacter agile, A. chroococcum, Azomonas agili, A. insignis, Aeromonas sp., Achromobacter sp., Pseudomonas sp., Flavobacterium sp., Corynebacterium, iar n Marea Neagr, o specie de Spirillum, fixatoare de azot atmosferic. Fixarea azotului atmosferic n mediile bine aerate este considerat unanim ca sporadic, dificil sau imposibil de reprodus i are loc cu o rat insuficient pentru a satisface nevoile recoltelor intensive. Importana bacteriilor chemotrofe fixatoare de azot decurge, probabil din capacitatea lor de a fixa cantiti mici pe suprafee mari i pe perioade ndelungate, n tot cursul anului i nu n perioade scurte (39 50 de zile) ca n cazul leguminoaselor.

2. Bacteriile fototrofe fixatoare de azot Dintre cele 12 genuri de bacterii fototrofe identificate pn n prezent, 92% au capaciti fixatoare de azot. Capacitatea de a sintetiza nitrogenaze este mai degrab regul dect excepie la fototrofe. Ele includ specii din genurile: Amoebobacter, Chlorobium, Chromatium, Ectothiorhodospira, Pelodictyon, Prosthecochloris, Rhodomicrobium, Rhodopseudomona, Rhodospirillum, Thiocapsa, Thiocystis. Datorit capacitii de a realiza fotosintez anoxigenic, importana lor este limitat la mediile anoxice i anume, n principal, la sedimentele din lacurile puin adnci. 3.1.3. Fixarea biologic a azotului n asociaie cu plantele

Deoarece cantitatea de azot disponibil pentru plante este decisiv pentru creterea produciei primare, este firesc ca oamenii s depun eforturi susinute pentru a putea spori intrrile de azot n circuitul biologic. Principala cale de cretere a cantitii de azot n circuitul biogeochimic o reprezint n prezent fixarea industrial a azotului liber, prin fabricarea de ngrminte azotoase. Cantitatea de N fixat pe aceast c ale se ridic la circa 50 milioane tone pe an (1978), reprezentnd cam 1/3 din cantitatea total de azot fixat pe cale biologic. Cifrele arat c activitatea uman afecteaz profund circuitul azotului pe scar planetar. Aceast orientare este justificat i de faptul c fixarea industrial (procedeu energofag ce consum 3% din producia mondial anual de gaze naturale), ridic numeroase probleme tehnice, economice i ecoloice, precum i dificulti ridicate de transport, aplicare, poluarea apelor freatice, a malurilor i a lacurilor etc. n urma cercetrilor, s-a observat c numai 50% din ngrmintele administrate n sol sunt preluate eficient de ctre plante i c necesarul n anul 2000 a fost de 1 miliard tone. Se apreciaz c, pentru fiecare cretere de populaie cu 6 x 106 locuitori, o ar trebuie s construiasc o fabric de ngrminte azotate, cu o capacitate de 106 kg NH4/zi. Efortul este realizabil din punct de vedere tehnologic i financiar, dar consecinele negative pentru mediu sunt intolerabile: poluare, eutrofizare, contaminarea apelor freatice cu nitrai, acumulare de nitrozamine cancerigene, efect distructiv al stratului atmosferic cu ozon, prin aciunea N2O produs n cursul denitrificrii microbiene etc. Suprautilizarea ngrmintelor agricole pe baz de azot pentru creterea produciilor la hectar influeneaz circuitul azotului. Nitraii folosii n exces polueaz ecosistemele acvatice i apa freatic.

Cantitatea de nitrai, n majoritatea ecosistemelor acvatice, este limitant i prin aceasta, influeneaz dezvoltarea algelor, a fitoplanctonului. Excesul de ngrminte este adus de ploaie n bli, lacuri, ruri. Fiind n exces, stimuleaz dezvoltarea algelor. Algele mor, iar descompunerea lor, de ctre bacteriie aerobe, consum oxigenul dizolvat n ap. Scderea cantitii de oxigen provoac moartea altor organisme prin asfixie, ca de exemplu, petii. Nitriii dizolvai mai pot ptrunde n apa freatic. Consumarea apei din fntni cu nitrii i nitrai este periculoas mai ales p entru copiii mici. Azotatul de amoniu, ca ngrmnt se fabric dup metoda Haber i Bosch, n care azotul atmosferic este combinat cu hidrogenul la temperatur i presiune ridicat. Sursa de hidrogen este gazul metan sau hidrocarburile din petrol. n actuala criz de energie, cnd pericolul epuizrii surselor de petrol i gaze naturale este iminent, iar preul petrolului este n cretere continu, i costurile ngrmintelor fabricate pe cale industrial devine tot mai ridicat. n aceste condiii, apare fireasc nevoia de a gsi alte ci, mai ales biologice, de fixare a azotului atmosferic sau de utilizare a asociaiilor simbionte, fixatoare de azot. Cercetrile se desfoar pe mai multe ci, una din aceste ci const n ncercarea de fixare a azotului liber, n simbioz cu bacteriile. n aceast privin, asociaia Azolla Anabaena reprezint o important surs de azot n culturile de orez. Cercetrile efectuate la Institutul Internaional pentru Cercetarea Orezului din Filipine, au stabilit c, datorit acestei asociaii, se obin recolte constante de 3 4 tone orez/ha,

fr aplicarea ngrmintelor. n mod empiric, n mai multe zone de cultur a orezului, Azolla este utilizat ca ngrmnt. Asociiile de angiosperme cu actinomicete fixatoare de azot, sunt recomandate i folosite n silvicultur, suplinind ngrmintele (Torrey, 1978). Astfel, n Taiwan, meiul (Setaria sp.) este cultivat n alternan cu aninul (Alnus sp.) n Noua Guinee, Casuarina este cultivat pentru ameliorarea solului, n Japonia, de mai mult vreme, sunt plantate Alnus, Myrica, Eleagnus, n amestec cu alte esene, mai ales de conifere, n acelai scop ameliorarea fertilitii solului. Bacterii fixatoare de azot din genul Spirillium au fost gsite simbionte cu unele graminee spontane, de exemplu Digitaria i chiar cu porumb n America de Sud. Unul din cei mai importani productori primari din mlatinile srate de pe coasta atlantic a Americii de Nord gramineul Spartina alterniflora fixeaz azotul atmosferic prin rdcini, n simbioz cu bacterii fixatoare de azot (Charlene Van Raalte, 1977). Cunoaterea precis a condiiilor n care se instaleaz o asemenea simbioz ar deschide perspectiva producerii ei i la gramineele cultivate.

Tabelul I. Principalele grupe de microorganisme fixatoare de azot

Grupul sau familia
Azotobacteriaceae

Genurile sau speciile principale

Azotobacter, Azomonas, Bejerinckia, Derxia, Xanthobacter

Caracteristici fiziologice
Libere, heterotrofe, aerobe

Spirillaceae

Azospirillium, Aquaspirillum, Campylobacter

Libere, heterotrofe, microaerobe

Methylomonadaceae

Methylomonas, Methylomonas, Methilococcus, Methylobacter

Libere, heterotrofe, microaerobe

Enterobacteriaceae

Clebsiella, Citrobacter, Enterobacter

Libere, heterotrofe, facultativ anaerobe

Bacilliaceae

Clostridium Thilobacillus

Libere, heterotrofe, strict anaerobe Libere, autotrofe

Chromtatiaceae

Chromatium, Thiocistis, Thiocapsa, Ectothiospira

Chlorabiaceae

Chclorobium

Libere, fototrofe, anaerobe

Rhodospirilliaceae

Rhodosirillium, Rhodopseudomonas, Rhodomicrobium

Cynobacteria

Anabaena, Nostoc, Calothrix, Scytonema

Fototrofe, aerobe cu heterocisti

Spirulina, Oscillatoria, Lyndbya, Plectonema, Phormidium Synechococcus, Dermocarpa, Pleurocapsa, Xenococcus, Gloeothece Rhizobacteriaceae Rhizobium leguminosarium,R.trifolii, R.phaseoli, R.meliloti, R.rupini, Bradyrhizobium japonicum Streptomycetaceae Frankia discariae, F.coriariae, F.dyadis, F.pushiae, F.casuarinae

Fototrofe, aerobe, fr heterocisti Fototrofe, aerobe, unicelulae Simbionte

Simbionte

Foarte multe specii de bacterii fixatoare de azot sunt asociate, n diferite grade, cu plantele, n aa fel nct fixarea azotului este rezultatul unei cooperari, mai mult sau mai puin intime, cu planta gazd. n aceast categorie sunt incluse: 1) simbioza Rhizobium / plante leguminoase; 2) simbioza Rhizobium / plante neleguminoase; 3) simbiozele asociative; 4) simbiozele foliare; 5) actinorizele; 6) cianobacteriile simbiotice fixatoare de azot, care i exercit activitatea n asociaii, mai mult sau mai puin eficiente, cu diferite alte organisme, ca de exemplu: cu fungii din categoria Ascomycetes sau Basidiomycetes, n licheni; cu muchii din grupul Hepaticae (Anthochos, Blasia, Clavicularia); cu pteridofitele n asociaia Azolla /Anabaena azollae; cu gimnospermele ( Cycas, Ceratozamia, Encephalartos etc); cu anigiospermele (Gunera sp.).

3.1.4. Perspective ale mbuntirii procesului de fixare biologic a azotului

Printre procedeele preconizate pentru remanierea acestei situaii cele mai semnificative, ca perspectiv de abordare, sunt urmatoarele: mrirea activitii fixatoare a tulpinilor de Rhizobium n urma

transferului genelor hup (hidrogen uptake), care asigur reciclarea eficient a hidrogenului produs n nodoziti; transferul genelor nif la bacterii nefixatoare de N2O n vederea obinerii de noi bacterii cu aceast proprietate. Realizarea este condiionat de numeroase dificulti tehnice, decurgnd din necesitatea de a transfera 20 40 de gene, de a asigura stabilitatea i activitatea lor n noile celule, protecia nitrogenazei de aciunea inhibitoare a oxigenului, aprovizionarea cu ATP, reglarea sintezei diferiilor produi codificai n cantiti adecvate; obinerea de plante capabile s fixeze autonom azotul prin transferul genelor nif; mrirea spectrului de gazde n simbiozele asociative pentru a include toate plantele de cultur importante. n general, toate aceste abordri au ca inconvenient major, incompleta cunoatere a bazelor genetice i biochimice ale fixarii azotului i a asociaiilor simbiotice. Este nc puin cunoscut biologia bacteriilor fixatoare de azot n natur i contribuia lor la structura i funcia habitatului pe care l ocup, ecologia lor ca membrii liberi ai rizosferei i ai micr obiotei acesteia. Exist riscul ca bacteriile nou create sau plantele modificate, s creeze dezechilibre n circulaia altor elemente (P, K, Mg etc.), mai greu de normalizat, sau, chiar de activare a unor microorganisme slbatice, capabile s competiioneze cu cele modificate genetic. S-au realizat numeroase cercetri i experiene n ceea ce privete posibilitatea de transfer a complexului de gene ce controleaz fixarea de azot, de la bacterii n celulele plantelor superioare, care n acest fel ar deveni capabile s fixeze azotul liber.

Astfel, s-a reuit transferul acestui complex de la Klebsiella pneumoniae la Escherichia coli. De asemenea, s-a reuit introducerea de bacterii fixatoare de azot la pin, utiliznd fungi ca purttori ai bacteriilor. Plantele de pin au nceput s fixeze mici cantiti de azot. n una din variantele experienei, ciuperca purttoare, modificat de bacterie, s-a dovedit a fi duntoare pentru plantele de pin. Varianta a fost distrus din precauie. Acest fapt arat i pericol ele care pot rezulta din asemenea intervenii (Search, 1979). Problema transferului genelor respective este complex, deoarece implic nu numai transferul genelor ce determin producerea nitrogenazei, dar i a celor ce controleaz mecanismele prin care nitrogenaza este ferit de contactul cu oxigenul. Din aceast cauz, dei s-a reuit transferul genelor ce induc producerea de nitrogenaz la Agrobacterium, enzima produs a fost inactiv, deoarece aceste bacterii sunt strict aerobe. Interesul este stimulat de unele calcule care demonstreaz c mbuntirile pe cale biologic ar fi echivalente cu aplicarea optim de ngrminte azotate. 3.2. AMONIFICAREA Amonificarea este procesul de conversie a compuilor organici cu azot, la stadiul de amoniac. Procesul de amonificare este rezultatul activitii a numeroase organisme heterotrofe ca bacterii, actinomicete. Cea mai mare parte a azotului din orizonturile superficiale ale solului este prezent sub forma de azot n combinaii organice. El provine din proteinele vegetale sau animale, din masa microbian, din excrementele animale etc.

n climatul temperat, o rezerv major de azot organic este asociat cu humusul, rezerva accesibil organismelor vii numai dup ce a fost mineralizat printr-un proces foarte lent (Alexander, 1971 ). Mineralizarea azotului organic din sol este un proces esenial n ciclul acestui element n natur, deoarece asigur conversia la forme anorganice, mai mobile, utilizabile de ctre plante, ca i de ctre microorganisme. ntregul proces de mineralizare, deci de transformare a compuilor organici compleci n compui minerali simpli, este nsoit de eliberarea de energie, care astfel devine utilizabil pentru alte procese de nutriie. n sens larg, procesul de amonificare evolueaz n dou a etape succesive: 3.2.1.Etapa nespecific Etapa de proteoliz, este efectuat de microorganisme heterotrofe ca: Pseudomonas sp., Arthobacter sp., Bacillus thermoproteolyticus, Proteus sp., Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Clostridium sp., Flavobacterium sp. sau de fungi ca : Aspergillus, Mucor, Penicillium. Rhizopus, Alternaria etc., crora li se adaug efectul proteinazelor de origine vegetal sau animal. n cursul acestei faze, compuii organici cu structur complex sunt hidrolizai la molecule care pot ptrunde n celule, fiind utilizate de alte microorganisme sau, sunt degradate n continuare n etapa specific de amonificare propriu-zis. 3.2.2.Etapa specific Aceast etap, determinat de microorganismele din sol, asigur degradarea n continuare a compuilor rezultai din etapa premergtoare de

proteoliz i a celor rezultai din hidroliza acizilor nucleici, precum i a ureei, acidului uric, glucidelor animale i conversia lor n NH4. n sens strict, amonificarea este reprezentat de procesul de eliberare a NH3, prin aciunea microorganismelor asupra moleculelor rezultate din descompunerea proteinelor, a acizilor nucleici. n acest sens, producerea i eliberarea de NH3 prin aciunea microorganismelor de putrefacie, nu este un proces de amonificare. Amonificarea se realizeaz prin mecanisme diferite, incomplet elucidate, n funcie de natura microorganismelor implicate i de condiiile de mediu. Ele au ns ntotdeauna, NH3 ca produs final. Procesul de amonificare evolueaz lent. Ritmul i randamentul su sunt evideniate de cantitatea de azot amoniacal care rmne n sol la sfritul procesului. Amonificarea evolueaz n condiii optime n straturile superficiale ale solurilor bine structurate, aerate, cu umiditate potriv it, la un pH apropiat de neutralitate. Randamentul este optim la temperatura de 30C, dar limitele la care se realizeaz sunt mult mai largi (2 40C).

3.3. NITRIFICAREA Nitrificarea este un proces biologic prin care NH3, sau alte forme reduse ale azotului anorganic rezultate n cursul procesului de amonificare, sunt oxidate pn la nitrai, care reprezint forma de compui azotai cel mai uor asimilabil de ctre majoritatea plantelor. Nitrificarea cuprinde dou etape successive, strns cuplate i este realizat de bacterii specifice, diferite: Nitritbacteriile care convertesc amoniacul prin oxidare, n nitrit. Sunt Gram-negative i heterogene ca form (bastonae, spiralate, sferice etc). Unele dintre ele au sisteme membranare complexe intracelulare, vizibile pe seciuni ultrafine la microscopul electronic. Cele mai cunoscute

sunt: Nitrosomonas europea , Nitrosococcus nitrosus. N. occanus , N. mobilis , Nitrospira briensis, Nitrosolobus multiformis, Nitrosovibrio tenuis (Backhoops i Harms, 1987) - cit. Zarnea (I994). Nitratbacteriile convertesc nitritul prin oxidare n nitrat i sunt reprezentate de: Nitrobacter winogradskyi. N. hamburgensis. Nitrosococcus mobilis, Nitrospira gracilis, Nitrospira marina. Bacteriile nitrificatoare sunt prezente pretutindeni n sol, n bazinele acvatice dulci i marine, n sistemele de epurare a apelor uzate, n depozitele de compost. Prezena oxigenului este obligatorie pentru toate speciile de bacterii nitrificatoare. Reaciile nceteaz imediat n absena lui, sau se desfaoar ntr-un ritm ncetinit pe masur ce tensiunea oxigenului scade. Bacteriile nitrificatoare se dezvolt cel mai bine la pH ntre 7,5 8, dar cresc n natur i n condiii suboptimale (pH =6). Temperatura optim de dezvoltare este cuprins ntre 25 35C, limita inferioar fiind de 5C, iar cea superioar de 40C. n sol, umiditatea acioneaz indirect asupra nitrificrii, datorit faptului c afecteaz gradul de aerare. Nitrificarea reprezint o etap cu importan excepional n circulaia azotului n natur, deoarece aduce substanele azotate din mediu (sol, ap etc.) n forma lor cea mai uor asimilabil de ctre plante. De altfel, s-a observat c, n general, numrul bacteriilor nitrificatoare este corelat cu gradul de fertilitate a solului, el putnd ajunge n solurile foarte fertile pn la un million de bacterii/gram de sol. Este sigur c acest numr mare este determinat i de faptul c aceste soluri sunt lucrate i aerate.

Etapa urmtoare este cea de asimilare, n cadrul creia rdcinile plantelor absorb nitraii i ncorporeaz azotul n proteine, acizi nucleici i clorofil. Ierbivorele transform azotul n azot al proteinelor animale. 3.4. DENITRIFICAREA Denitrificarea este procesul de descompunere a nitrailor pn la azotul molecular, gazos, N2. Procesul se realizeaz de ctre bacterii denitrificatoare, anaerobe. Ele triesc i se dezvolt n sol, acolo unde exist puin oxigen sau deloc. Bacteriile din genul Pseudomonas folosesc azotaii ca surs de oxigen, necesar pentru degradarea glucozei i formrii ATP-ului. Aceste bacterii au capacitatea de a degrada ionul NO3 i NO2 pn la azot atomic, care se ntoarce n atmosfer. Denitrificarea este mai intens n solurile din pdure pentru c exist condiii mai favorabile dect n solurile agricole. Descris iniial de Schonbein (1868) cit. Zarnea (1994), denitrificarea este un proces biologic efectuat n exclusivitate, de bacterii i const n reducerea dezasimilatorie a unuia sau a ambilor oxizi ionici ai azotului, nitratul (NO3) i nitritul ( N02) pn la oxizi gazoi, ca oxidul nitric (NO) sau oxidul nitros (N2O), acetia pot fi ei nii redui n continuare la azot gazos i eliminai ca atare n atmosfer. Simultan, are loc oxidarea materiei organice din mediu cu producerea de energie. Bacteriile denitrificatoare formeaz un grup biochimic i taxonomic heterogen, care reunete peste 75 de genuri diferite. Contrar concepiilor mai vechi, nici o bacterie denitrificatoare nu este strict anaerob. Acestea pot chiar utiliza oxigenul ca acceptor final de electroni i prefer chiar respiraia

aerob, dac aceasta este posibil. Cresc n anaerobioz, pe medii care conin NO3 , NO2 i N2O. Principalele bacterii denitrificatoare sunt: Alcaligenes faecalis, A. eutrophus, A. denitrificans, Azospirilum sp., Bacillus azotoformans, Hyphomicrobium vulgare, Moraxela sp., Neisseria sicca. N. flavescens, Micrococus denitrificans, Pseudomonas aerogenes, P. pentosaceum Rhizobium sp. . Rhodopseudomonas sp., Thiobacillus denitrificans etc. Sunt ubicvitare, fiind prezente n toate tipurile de sol, inclusiv n zona arctic, n nmolul activat, n sedimentele lacurilor, n sedimentele marine i n numr mare n rizosfera plantelor, datorit prezenei substanelor organice uor accesibile

3.4.1.Rolul denitrificrii n ciclul global biogeochimic

Denitrificarea reprezint calea major de formare a unei bune pri din azotul atmosferic i de echilibrare a schimburilor dintre acesta i mediile terestre sau acvatice. Acest lucru i confer o mare importan ecologic i biogeochimic. Ea este rspunzatoare, n acelai timp, de pierderi majore (5 80%) din fertilizatorii azotai aplicai de ctre om. De asemenea, reprezint un mecanism ce favorizeaz reducerea coninutului n azot al afluenilor staiilor de epurare a apelor reziduale, reducnd pericolele de eutrofizare a bazinelor receptoare. Denitrificarea cuplat cu nitrificarea poate fi folosit pentru tratarea apelor uzate oraeneti cu coninut bogat n substane organice, cu scopul de a reduce cantitatea de azot n exces, contaminarea i riscul de eutrofizare a apelor receptoare.