I.

METODE I TEHNICI DE LABORATOR N FITOPATOLOGIE

1. Aparatur, sticlrie i instrumentar de laborator

Aparatur de laborator

n laboratorul de fitopatologie, precum n orice laborator de
microbiologie, trebuie s existe aparatur de strict necesitate, precum:
microscop, stereomicroscop, lup, termostat, etuv, frigider, autoclav etc.
Microscopul. Aparatul de baz ntr-un laborator de fitopatologie
este microscopul. Bacteriile i marea majoritate a ciupercilor, exceptnd
macromicetele, sunt de dimensiuni mici i pot fi examinate numai cu
microscopul.
Examinarea preparatelor la microscopul optic se realizeaz prin
diferite metode (examinare direct, examinare n cmp ntunecat, examinare
n lumin fluorescent etc.).
n cercetarea tiinific, microscopul electronic a ctigat tot mai
mult teren. Astfel, n numeroase laboratoare de micologie, bacteriologie i
virologie, studiul structurii agenilor fitopatogeni se realizeaz i cu ajutorul
microscopului electronic.
Stereomicroscopul. Acest aparat servete la cercetarea obiectelor
netransparente, folosind lumina reflectat, natural sau electric.
Stereomicroscopul este folosit n fitopatologie pentru studierea simptomelor
de boal, cauzate de agenii patogeni, ale caracterelor morfologice ale
sporulaiei, n special n cazul ciupercilor, pentru identificarea speciei
parazite pe plante.
Termostatul. Este un aparat de strict necesitate, n laboratoarele
care lucreaz cu microorganisme. Este cunoscut faptul c agenii patogeni
se dezvolt i se nmulesc ntre anumite limite de temperatur, specifice
fiecrui gen sau chiar specie (Hulea, 1969).
Etuva de sterilizare. Este folosit pentru sterilizarea sticlriei de
laborator i a tuturor obiectelor (din porelan, de metal, fr suduri cu
cositor etc.), care suport temperatura uscat i ridicat. La etuv nu se pot
steriliza obiectele de cauciuc, vat, seringile de plastic i altele. Sterilizarea
prin cldur uscat se efectueaz, de obicei, la 160
o
C timp de dou ore, de la
atingerea acestei valori sau la 180C, timp de o or.
Lupele. Pentru cercetri mai rapide i grosiere ale plantelor, care
prezint simptome de mbolnvire, se pot folosi lupe (de buzunar, de mn),
att n laborator, ct i n ser i cmpul de cultur.

9
Frigiderul. Este indispensabil pentru pstrarea mediilor necesare
cultivrii agenilor fitopatogeni, a serurilor, a unor culturi de microoganisme
i a oricrui material vegetal infectat care nu poate fi analizat imediat.
Autoclavul. Este folosit pentru sterilizarea, prin vapori sub
presiune, a mediilor de cultur, a pmntului, a soluiilor nutritive i a
oricrui alt material care nu suport temperatur ridicat i uscat. De
asemenea, autoclavul se folosete la sterilizarea vaselor cu culturi de
microorganisme, nainte de a fi golite i splate. Aceast sterilizare este
obligatorie, pentru a evita vicierea atmosferei din laborator, dar i pentru a
proteja sntatea lucrtorilor care spal sticlria. La introducerea obiectelor
n autoclav, se va asigura spaiul necesar, pentru o bun circulaie a
vaporilor i realizarea unei bune sterilizri.
ntre presiunea vaporilor i temperatura din autoclav exist o
corelaie pozitiv (Tab. 1). Sterilizarea materialelor contaminate se face cel
puin 20 minute la 121C (Constantinescu, 1974).

Tabelul 1
Corelaia dintre temperatur (C) i presiune (atm.)
(dup Constantinescu, 1974)
C
108 116 120 121 122 127
atm. 0,34 0,67 0,96 1,01 1,28 1,35

Controlul sterilizrii n autoclav se face cu un indicator bacterian
sau cu un indicator chimic.
Lampa cu radiaii ultraviolete. Dezinfecia prin radiaii
ultraviolete (UV) este indicat pentru boxe de nsmnare (la
microbiologie), sli de aplicare a unor tratamente etc. (Mgureanu i colab.,
1988). Din cauza puterii reduse de ptrundere, radiaiile UV sunt folosite
pentru dezinfecia aerului n spaii relativ mici i a unor suprafee netede.
Pentru sterilizarea ncperii, se aprinde lampa i se las s funcioneze 2 ore,
nainte de nceperea lucrului n boxa de nsmnare.

Sticlrie de laborator

Pentru realizarea experienelor, n laboratorul de fitopatologie se
folosesc diferite vase de sticl: eprubete, tuburi Roux, flacoane Erlenmeyer,
vase (plci, cutii) Petri. De asemenea, n laborator se mai folosesc pipete
gradate, lame de sticl, lamele etc.
Pentru desfurarea activitii n condiii optime, trebuie s existe
i s fie folosit sticlrie de laborator adecvat i steril. Orice resturi de

10
substane sau impuriti pe pereii sticlriei pot denatura rezultatele experi-
mentale.
Splarea vaselor de laborator, atunci cnd nu apar situaii speciale,
se realizeaz cu parcurgerea etapelor: splare cu amestec cromic; splare cu
ap i detergent; cltire cu ap; cltire cu ap distilat sau alcool etilic;
uscare n etuv sau cu curent de aer.
Pentru splare, se folosesc ap cldu, cu adaos de carbonat de sodiu 1-2%
sau detergent i perii adecvate pentru instrumente i sticlrie. Tubulatura de
cauciuc se spal prin brasaj (Mgureanu i colab., 1988).
Vasele de laborator (eprubete, cutii Petri etc.) care conin micro-
organisme se sterilizeaz la autoclav, nainte de splare.

Instrumentar de laborator

Pentru desfurarea activitii ntr-un laborator de fitopatologie,
trebuie s existe un instrumentar de strict necesitate. Astfel, acesta include:
ace i anse de nsmnat, bisturiu, spatule, pensete etc.
Cercetarea microorganismelor fitopatogene necesit aproape
ntotdeauna cultivarea lor n condiii de laborator, pe medii de cultur sau pe
alte materiale. Pentru realizarea unei activiti eficiente n laboratorul de
fitopatologie, este necesar o dotare corespunztoare a acestora, dar i
personal de specialitate bine instruit.

2. Metode de apreciere a atacului i a pagubelor produse de agenii
fitopatogeni

n procesele de infecie i de manifestare a simptomelor bolii la
plante, se disting dou momente principale: atacul i dauna (paguba).
Atacul este reprezentat valoric prin frecven, intensitate i grad
de atac (Oroian, 2004).
Frecvena (F) atacului este valoarea relativ a numrului (n) de
plante sau organe ale plantei atacate de un agent fitopatogen (virus, bacterie,
ciuperc) raportate la numrul (N) de plante sau organe observate. Valoarea
frecvenei se obine prin observaii directe asupra unui numr de plante sau
organe. Datele obinute se calculeaz dup relaia:

F = nx100/N

Intensitatea (I) atacului reprezint valoarea prin care este dat
gradul de acoperire sau de extindere a atacului, raportnd suprafaa atacat
fa de suprafaa total observat. Pentru redarea intensitii atacului se

11
folosesc scri ce pot avea un numr diferit de clase de notare. n majoritatea
cazurilor, n ara noastr se folosete scara cu 4, 5 sau 6 clase de intensiti
ale atacului. Aceste clase corespund unor anumite intervale de procente ale
intensitii atacului (Tab. 2). Expresia relativ a intensitii atacului este
dat de relaia:
I = (ixf)/n, n care:
i =nota sau suprafaa atacat (%);
f= numrul de cazuri cu atac la fiecare not;
n= numrul total de cazuri cu atac.

Tabelul 2
Scara de notare a intensitii atacului la bolile plantelor

Suprafaa atacat (%) Nota intensitii atacului
1-3 1
4-10 2
11-25 3
26-50 4
51-75 5
76-100 6

Spre exemplu, dac ntr-o observaie avem urmtoarele cazuri:
74 cazuri cu 3% = nota 1
23 cazuri cu 10% = nota 2
18 cazuri cu 25% = nota 3
14 cazuri cu 50% = nota 4
13 cazuri cu 75% = nota 5
11 cazuri cu 100% = nota 6

I=(ixf)/n=(3x74)+(10x23)+(25x18)+(50x14)+(75x13)+(100x11)/153=
3675/153=24,04%

Gradul de atac (GA) este expresia extinderii gravitii atacului
culturii sau numrul total de plante la care efectum observaiile.
Expresia valoric a acestuia este dat de relaia:
GA=FxI/100

Dauna sau paguba este exprimat prin noiunea grad de dunare
(GD). Aceasta reprezint valoric pierderea relativ a cantitii de recolt la o
plant sau cultur atacat n raport cu recolta obinut de la o plant sau
cultur neatacat (sntoas). Dauna este redat prin relaia:

12
GD= (s-b/s)x100=(1-b/s)x100 , n care
s=producia plantei sau culturii sntoase;
b=producia plantei sau culturii bolnave.
Presupunnd c la o parcel cu vi de vie, producia a fost de 8000
kg la hectar, pe o suprafa fr atac, iar la alt suprafa atacat numai de
3000 kg, gradul de dunare este:
GD=(1-3000/8000)x100=62,5%
Pragul economic de dunare (PED). Prin prag economic de
dunare se nelege nivelul de atac al agenilor patogeni, respectiv valoarea
pagubelor din recolt, la care trebuie aplicat tratamentul (Tab. 3).
Tabelul 3
Pragul economic de dunare (PED) al unor ageni fitopatogeni la care
se aplic tratamente de avertizare

Planta
cultivat
Fenofaza plantei Agentul patogen PED
(paguba, %
din recolt)
Triticum
spp.
nflorire

Coacere n lapte

Maturitatea
cariopselor
Puccinia
striiformis
Puccinia
recondita
Puccinia graminis
2,5

3,0

1,0
Zea mays Formarea fructului
(atac pe tiulei)
Apariia mtsii
Ustilago maydis

Helminthospo-
rium turcicum
5,0


2,5
Oryza
sativa
Maturitate Piricularia oryzae 1,0
Helianthus
annuus
nflorire Sclerotinia
sclerotiorum
5,0
Beta
vulgaris
Creterea n
greutate a
rdcinilor
Cercospora
beticola
Peronospora
schachtii
1,0

2,0

Conform cu PED, agentul fitopatogen a produs deja pagube (de 1-
5%) recoltelor, egale cu costul tratamentelor i se prognozeaz condiii
favorabile ce pot imprima bolii un caracter epidemic (Oroian, 2004).
Valoarea pagubei din recolt, la care trebuie avertizate tratamentele
chimice, este cuprins ntre 1-5%. Aceasta este diferit, ntre limitele men-

13
ionate, n funcie de planta cultivat, fenofaza dezvoltrii ei i agentul pato-
gen (Tab. 3).
Eficacitatea tratamentelor. n aprecierea msurilor de combatere
a bolilor la plante, o importan practic deosebit prezint cunoaterea
eficacitii tratamentelor. Eficacitatea (E) tratamentelor se calculeaz dup
relaia:
E = 1- Gav/GAMtx100
E = eficacitatea;
Gav = grad de atac la varianta tratat;
GAMt = grad de atac la martor netratat.

Determinarea frecvenei, intensitii i a gradului de atac are o
importan deosebit n evaluarea pagubelor produse, n estimri de pro-
ducie pe parcursul vegetaiei, n stabilirea ritmului de aplicare a trata-
mentelor, precum i n stabilirea eficacitii diferitelor metode i mijloace
de protecie a culturilor mpotriva agenilor fitopatogeni (Rdulescu i
Rafail, 1967).

3. Msuri i metode de combatere a bolilor la plante

n combaterea bolilor (viroze, bacterioze, micoze, antofitoze) la
plante, se folosesc diferite msuri: agrofitotehnice, fizico-mecanice, chimi-
ce, biologice, legislative (de carantin fitosanitar), de prognoz i averti-
zare (Oroian i Oltean, 2003).
Msurile de combatere a agenilor fitopatogeni pot fi preventive
(profilactice) i curative (terapeutice). Aplicarea msurilor de protecie a
plantelor se realizeaz pe mai multe ci numite metode. Pentru aplicarea
unei msuri de combatere pot exista una sau mai multe metode.

3.1. Msuri agrofitotehnice

Aceste msuri sunt cele mai vechi i n acelai timp cele mai
eficace, n ceea ce privete prevenirea bolilor la plante. Ele mai sunt
cunoscute sub denumirea de msuri culturale sau msuri de igiena plantelor.
Prin aceste msuri (alegerea terenului de cultur, pregtirea terenului,
distrugerea samulastrei, rotaia culturilor, cultivarea de soiuri rezistente,
folosirea de smn sntoas etc.) se creeaz condiii nefavorabile
dezvoltrii agenilor fitopatogeni i se mrete rezistena plantelor fa de
boli (Prvu, 1996).



14
3.2. Msuri fizico-mecanice

n general, msurile fizico-mecanice sunt simple i eficace. Aceste
msuri au aplicare restrns, dar sunt de perspectiv, fiind nepoluante. n
vederea combaterii paraziilor vegetali, se folosesc ca ageni fizici:
temperatura, lumina solar i radiaiile.

Temperatura

Temperatura ridicat cldura este folosit la dezinfectarea
solului i a seminelor. Prin aceast metod se distrug prin ardere plantele
bolnave i resturile de plante rmase pe cmp dup recoltare, se devirozeaz
butaii i materialul sditor.
Dezinfectarea termic a solului. Prin aceasta se obin rezultate
bune n combaterea ciupercilor i bacteriilor fitopatogene termosensibile.
Durata tratamentului termic i valoarea temperaturii difer n funcie de
punctul termic de inactivare a agentului patogen.
n dezinfectarea termic a solului sunt folosite mai multe metode.
Sterilizarea prin cldur uscat a terenului de cultur a
plantelor n cmp. Aceast metod nu are posibiliti mari de aplicare. n
aceast categorie, poate intra vechea practic de ardere a resturilor vegetale,
dup recoltare.
Sterilizarea prin cldur uscat a solului din sere. Este o
metod simpl i se aplic uor n practic. Se folosete pentru dezinfectarea
cantitilor mici de pmnt necesare n rsadnie i sere. Sterilizarea se face
prin nclzirea pmntului (la peste 80C) pe foi de tabl.
Sterilizarea prin cldur umed. Aceast metod se folosete la
dezinfectarea ghivecelor, a utilajelor mici, care se introduc timp de 5-10
minute n ap clocotit. Pentru suprafee mici de rsadnie i sere se poate
aplica oprirea solului prin turnare de ap clocotit (10 l/m
2
). nainte de a se
realiza dezinfecia termic, se sap solul pe o adncime de 30-40 cm, se scot
rdcinile sau alte resturi de plant i se mrunesc bulgrii de pmnt, pn
la dimensiuni de 5-6 cm. Totodat, se dezinfecteaz chimic scheletul intern
al serei.
Sterilizarea prin aburi. Aceast metod se aplic pentru
dezinfectarea unor cantiti mici de pmnt sau pentru solul de la locul
definitiv (rsadnie, sere). n timpul sterilizrii, aburii circul n pmnt
pn la cel puin 30-40 cm adncime, timp de 60 minute. Temperatura
solului, n timpul tratamentului, este de 75-80C.
La tratarea pe cale termic, n special cnd se folosete metoda
sterilizrii prin aburi, trebuie s se in seama de faptul c, n afar de

15
agenii fitopatogeni, sunt distruse i o serie de microorganisme folositoare
din sol. De aceea, plantarea pmntului se face dup 15 zile de la sterilizare,
perioad de timp n care se reface microflora util.
Dezinfectarea termic a seminelor. Prin intermediul
tratamentului termic se pot combate agenii patogeni care se transmit prin
smn. Pentru tratarea termic a seminelor se folosesc diferite metode:
metoda tratrii cu ap cald, metoda tratrii cu cldur (aer) uscat etc.
Durata tratamentului termic difer n funcie de specia patogen i
metoda de dezinfecie folosit.
Este necesar ca tratamentul termic s fie realizat n ntreprinderi
specializate, deoarece exist diferene mici de valoare, ntre temperatura de
inactivare a agenilor patogeni i cea care distruge embrionul seminei.

Lumina solar

n combaterea unor ageni patogeni se folosete lumina solar
(helioterapia). Tuberculii de cartof expui la soare timp de 3-4 zile se
clorofilizeaz i sunt mai rezisteni fa de agenii patogeni (Erwinia
carotovora, Fusarium oxysporum etc.), care produc putregaiuri n depozite.

Radiaiile

Diferite radiaii (gamma, beta, infraroii, ultraviolete) au fost
experimentate cu succes n combaterea agenilor patogeni. Aceste radiaii
inactiveaz i distrug o serie de ageni patogeni (virusuri, bacterii i
ciuperci).

Mijloacele mecanice

Pentru nlturarea unor parazii de pe suprafaa plantelor i
ndeprtarea organelor vegetative bolnave se folosesc mijloace mecanice.
Aceast msur de combatere se poate realiza prin metode diferite:
extirparea, curirea trunchiurilor, decuscutarea, sortarea plantelor sntoase
de exemplarele bolnave etc.

Electricitatea

Ca i alte surse de nclzire, electricitatea poate fi folosit la
sterilizarea solului prin nclzire direct sau prin nclzire indirect.

16
Metoda sterilizrii prin nclzire indirect a solului sau prin
imersiune se aplic n instalaii speciale de forma unor cutii, n care se
introduce pmntul de sterilizat.
Metoda sterilizrii prin nclzirea direct a solului, cu ajutorul
electricitii, se bazeaz pe principiul trecerii curentului direct prin sol. n
timpul sterilizrii, temperatura pmntului care se pune n instalaii speciale
ajunge la 70C i dureaz 30 minute (Popescu, 1993).

Mijloacele electronice

Aparatele electronice se folosesc pentru elaborarea avertizrilor,
sortarea seminelor i n efectuarea tratamentelor chimice etc. Unele aparate
electronice servesc la separarea seminelor necorespunztoare de cele
sntoase, pe baza diferenei de culoare.
Tot cu ajutorul aparatelor electronice, poate fi dirijat soluia
fitofarmaceutic numai asupra plantelor pe care vrem s le tratm (Popescu,
1993).

3.3. Msuri chimice

Combaterea chimic constituie i n prezent un mijloc important pe
care practica agricol l are la dispoziie pentru reducerea pagubelor produse
de agenii fitopatogeni. Astfel, n combaterea speciilor Plasmopara viticola,
Phytophthora infestans, Tilletia spp. i altele, trebuie s se aplice tratamente
chimice, fr de care nu se poate garanta producia plantelor cultivate.

3.3.1. Noiuni generale despre produsele farmaceutice folosite n
protecia plantelor

Msurile chimice se bazeaz pe folosirea unor substane toxice
pentru paraziii vegetali. Produsele chimice preparate pe baza acestor
substane active se numesc produse antiparazitare i fac parte din categoria
produselor fitofarmaceutice.
Clasificarea produselor fitofarmaceutice se face dup mai multe
criterii. Dup agentul patogen de combtut (virusuri, bacterii, ciuperci), se
clasific n virusocide (produse antivirale), bactericide i fungicide. n
funcie de locul unde acioneaz, aceste produse sunt exoterapeutice (de
suprafa, de contact) i endoterapeutice (sistemice).
Dup natura lor chimic, substanele i produsele fitofarmaceutice
sunt anorganice i organice. Dintre produsele fitofarmaceutice anorganice
utilizate n protecia plantelor menionm: produse pe baz de cupru

17
(Zeam bordelez, Champion 50 WP, Kocide 101, Oxicig 50 PU etc.),
produse pe baz de sulf (Polisulfur de calciu, Kumulus S, Sulfomat PU,
Microthiol, Thiovit etc.).
Dintre numeroasele produse organice fitofarmaceutice menionm:
Dithane M45 (mancozeb 80%), Polyram combi (metiram 80%), Benlate
50 WP (benomil 50%), Topsin 70 PU (metil tiofanat 70%), Sumilex 50 PU
(procimidon 50%), Anvil 5 SC (hexaconazol 50g/l), Systhane 12,5 CE
(miclobutanil 125g/l), Tilt 250 CE (propiconazol 250 g/l), Curzate super
C (cimoxanil 4,5%+ mancozeb 68%) etc.
De la aplicarea ultimului tratament pn la darea n consum a
produselor vegetale tratate, este necesar s treac o perioad de timp n care
produsul fitofarmaceutic folosit se degradeaz i devine netoxic pentru
consumator. Aceast perioad de timp se numete timp de pauz.
Pentru fiecare produs fitofarmaceutic folosit n protecia plantelor
este stabilit o toleran limita maxim admisibil (LMA). Aceasta
(LMA) se stabilete pentru ca produsele agricole tratate s poat fi
consumate, fr a fi afectat sntatea consumatorilor.
LMA se exprim n pri per milion (ppm) i este de 100 ori mai
mic dect concentraiile sau dozele care, administrate n hrana animalelor
de experien, le produc primele tulburri (Baicu i esan, 1996).
Respectarea timpilor de pauz, n mod normal asigur i
respectarea limitelor maxime admisibile pentru produsele fitosanitare
(Baicu i esan, 1996).
La aplicarea tratamentelor chimice se ine cont de remanena
reziduurilor de pesticide, de timpul de pauz i de limita maxim admisibil
(LMA).

3.3.2. Metode de aplicare in vivo a produselor fitofarmaceutice

Produsele fitofarmaceutice se folosesc n practic pentru tratarea
seminelor, a tuberculilor, bulbilor i rizomilor la plante. De asemenea,
aceste produse se aplic pe plante n timpul perioadei de vegetaie. Unele
produse fitofarmaceutice se folosesc pentru dezinfectarea solului pe cale
chimic.

3.3.2.1. Metode de tratare a seminelor

Tratarea pe cale chimic d rezultate bune, n practic, n comba-
terea agenilor patogeni localizai pe smn sau n aceasta. n funcie de
substana activ a produsului folosit, de seminele de tratat, de biologia

18
agenilor fitopatogeni i altele, tratarea sau dezinfectarea chimic a semin-
elor se face prin mai multe metode.
Metoda tratrii uscate (prin prfuire). Aceast metod const n
acoperirea seminelor cu produse fitofarmaceutice, sub form de pulberi,
care ader pe suprafaa tegumentului seminal. n practic, o importan
deosebit pentru dezinfectarea seminelor prezint produsele sistemice.
Acestea protejeaz embrionul i plantulele tinere de aciunea agenilor
fitopatogeni localizai n smn.
Metoda tratrii umede. Metoda se bazeaz pe folosirea de
produse fitofarmaceutice, sub form de soluii sau suspensii, n care se
introduc seminele de tratat. Aceast metod prezint avantajul unei econo-
mii de substan activ i al unei dezinfectri complete. Tratarea pe cale
umed se recomand n zonele aride, cu solul uscat n momentul semna-
tului.
Metoda tratrii prin mocirlire. Aceast metod este folosit
pentru a realiza pe suprafaa seminelor un strat mai consistent de produs.
Produsul fitofarmaceutic se prezint sub form de suspensie dens ntr-o
cantitate mic de ap i se amestec cu smna (andru, 1996).

3.3.2.2. Metode de tratare a tuberculilor, bulbilor i rizomilor

Aceste metode de tratare se aplic frecvent la plantele horticole,
pentru dezinfectarea chimic a tuberculilor, bulbilor i rizomilor. n funcie
de produsul utilizat, tratamentele chimice se aplic pe cale umed sau prin
prfuire.
3.3.2.3. Metode de dezinfectare chimic a solului

Dezinfectarea solului pe cale chimic are drept scop distrugerea
agenilor fitopatogeni (bacterii, ciuperci), insectelor, nematozilor etc. care
atac plantele. Tratamentele chimice se aplic cu precdere solului din sere
i rsadnie, dar i n cmpul de cultur al plantelor horticole. Dezinfectarea
chimic a solului se realizeaz prin metoda tratrii umede i metoda tratrii
uscate (prin prfuire).
Tratarea solului pe cale umed. Aceast metod se bazeaz pe
stropirea solului cu o soluie sau o suspensie a produsului fitofarmaceutic,
pn la o adncime de 20 cm.
n tratarea solului din sere i rsadnie se folosete frecvent
Formalin 1,0 %. Pentru dezinfectarea solului se folosesc 10 l soluie (de
Formalin 1,0 %)/m
2
, apoi se acoper pmntul tratat timp de 2-3 zile
pentru sudaie. nsmnarea solului se face dup cel puin 12-15 zile, de la
aplicarea tratamentului (andru, 1996).

19
nainte sau dup semnat, pmntul din rsadni poate fi dezin-
fectat cu Previcur N. Pentru dezinfectarea solului, se folosesc 2-3 l soluie
de Previcur N 0,25%/m
2
(andru, 1996).
Tratarea solului pe cale uscat. Prin aceast metod, se reali-
zeaz dezinfectarea chimic a solului, folosindu-se produs fitofarmaceutic
sub form de pulbere. Produsul fitofarmaceutic este ncorporat n sol prin
spare, pn la o adncime de 20 cm sau prin amestecarea pmntului prin
loptare. De exemplu, pentru dezinfectarea solului prin prfuire, se folosete
Basamid 200 g/m
3
de pmnt sau 20-50 g/m
2
. Acest produs este eficient
mpotriva ciupercilor fitopatogene tericole i nematozilor la plante. Dup
aplicarea tratamentului chimic, timpul de ateptare, pn la folosirea
amestecului de pmnt, este de 10-30 zile, n funcie de temperatura solului.
Timpul de ateptare crete, la temperaturi mai sczute de 15-20C (andru,
1996).

3.3.2.4. Metode de tratare a plantelor n timpul perioadei de vegetaie

Aplicarea produselor fitofarmaceutice pe plante se realizeaz prin
diferite metode.
Metoda tratrii umede. Aceast metod const n aplicarea
produselor fitofarmaceutice sub form lichid (soluie, suspensie, emulsie)
i poate fi realizat, n practic, sub diferite forme: stropit, pulverizare, cea
toxic.
Metoda tratrii prin prfuire. Aplicarea produselor fitofarma-
ceutice pe plante, prin prfuiri, asigur o mai bun ptrundere a pulberii n
interiorul vegetaiei stufoase. De asemenea, aceast metod asigur o distri-
buire mai uniform a particulelor pe suprafaa tratat.

3.3.3. Testarea aciunii in vitro a produselor fitofarmaceutice

Pentru testarea aciunii in vitro, a produselor farmaceutice asupra
agenilor fitopatogeni, se folosesc diferite metode.

Metoda includerii produsului n mediul de cultur

Prin aceast metod se testeaz aciunea in vitro a produselor
fitofarmaceutice asupra agentului fitopatogen (bacterie, ciuperc) cultivat pe
mediu de cultur. Pentru fiecare produs testat se realizeaz mai multe
concentraii. La fiecare concentraie a produsului fitofarmaceutic, se fac mai
multe repetiii. Pentru cultivarea speciilor studiate se folosesc medii

20
nutritive solidificate (mal-agar, cartof-dextroz-agar, Czapek-agar etc.) sau
lichide.
n cazul folosirii unui mediu ce se solidific, acesta se distribuie,
dup includerea produsului fitofarmaceutic, cel mai frecvent n vase Petri.
Inoculul speciei pe care o cercetm se plaseaz cu acul de nsmnare n
mijlocul vasului Petri (metoda nsmnrii n punct central). Periodic, la
intervale egale de timp, se fac observaii asupra mrimii, aspectului coloniei
pe suprafaa mediului, sporulaiei, dac este cazul, comparativ cu martorul,
fr produs fitofarmaceutic. Rezultatele obinute se interpreteaz statistic
(testul student, ANOVA etc.).
Pe baza rezultatelor obinute se stabilete concentraia limit de
toxicitate i concentraia letal a produsului fitofarmaceutic asupra speciei
studiate.
Metoda includerii n mediul de cultur se poate folosi i pentru
testarea aciunii in vitro a altor produse (antibiotice, extracte vegetale etc.)
asupra agenilor fitopatogeni.

3.4. Msuri biologice

Combaterea biologic a agenilor fitopatogeni se realizeaz prin
hiperparazitism, antagonism microbian, imunizarea plantelor i altele.
Hiperparazitismul. Combaterea agenilor fitopatogeni cu ajutorul
paraziilor naturali (bacteriofagi, ciuperci), denumii hiperparazii, a dat
rezultate bune i prezint perspective de extindere n practic. Cele mai
cunoscute cazuri de hiperparazitism sunt micoparazitismul i bacteriofagia.
Micoparazitismul este un fenomen biologic ntlnit frecvent n
natur. Ciupercile hiperparazite au o virulen pronunat i inhib
dezvoltarea, reproducerea i rspndirea speciilor fungice pe seama crora
se dezvolt. De exemplu, Trichoderma viride reprezint principala specie
micoparazit i antagonist, folosit ca mijloc de prevenire i combatere
biologic a diferitelor specii de ciuperci fitopatogene. Coniothyrium
minitans este un hiperparazit al fungilor (Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis
spp.) formatori de scleroi.
Bacteriofagia este un fenomen biologic care se bazeaz pe distru-
gerea unor bacterii fitopatogene de ctre virusuri denumite bacteriofagi.
Antagonismul microbian. ntre diferite microorganisme (bacterii,
ciuperci) din natur exist relaii antagoniste. Aceste relaii au la baz
concurena sau anabioza. S-a constatat c pentru fiecare agent patogen
exist microorganisme antagoniste. Antagonismul microbian este utilizat n
practic, pentru combaterea unor ageni patogeni.

21
Studierea relaiilor (micoparazitismul, antagonismul microbian
etc.) ntre diferite specii de microorganisme, care se pot cultiva pe medii
nutritive, se realizeaz prin metoda culturilor duble. Aceast metod const
n nsmnarea n acelai vas Petri cu mediu nutritiv agarizat a cte dou
specii ale cror interrelaii sunt observate in vitro.
Antibioticele. Acestea sunt produi ai metabolismului unor micro-
organisme care distrug selectiv sau mpiedic multiplicarea altor organisme
patogene. n combaterea agenilor fitopatogeni, s-au experimentat i s-au
folosit n practic, pe scar mic, numai cteva antibiotice, datorit costului
foarte ridicat al acestor tratamente (Prvu, 1996).

3.5. Msuri de carantin fitosanitar

Carantina fitosanitar reprezint un ansamblu de msuri care se iau
pentru a preveni rspndirea paraziilor vegetali, duntorilor i buruienilor
(obiectelor de carantin), deosebit de periculoi, dintr-o ar n alta sau
dintr-o regiune n alta. Carantina fitosanitar este de dou tipuri: extern i
intern.

3.6. Msuri de prognoz i avertizare

Un rol important n prevenirea i combaterea bolilor la plante au
msurile de prognoz i avertizare.
Prin prognoz se nelege stabilirea anticipat a datei apariiei n
mas a agenilor fitopatogeni, n anumite perioade de timp i pe anumite
teritorii, precum i estimarea gravitii atacurilor pe care le pot produce.
Avertizarea const n determinarea momentului optim de aplicare
a tratamentelor, a metodelor i mijloacelor eficace pentru combatere, n
funcie de biologia agentului patogen, fenofaza plantei gazd i condiiile
climatice locale.

4. Metode i tehnici de lucru n studiul virusurilor fitopatogene

Pentru studierea virusurilor fitopatogene, se folosesc diferite meto-
de. Dintre acestea, n continuare vor fi prezentate cteva metode uzuale
folosite n virologia vegetal.

4.1. Metode de determinare a caracteristicilor biologice

Virusurile fitopatogene prezint o serie de caracteristici biologice
care pot fi determinate n laborator.

22

Determinarea rezistenei in vitro

Pentru determinarea rezistenei in vitro se folosete suc vegetal
brut care conine virus sau preparat viral purificat. Rezistena virusului n
sucul vegetal se testeaz, de obicei, la temperatura camerei. Pentru aceasta,
se determin imediat infectivitatea inoculului proaspt preparat, precum i
la diferite intervale de timp de la preparare. Determinarea infectivitii se
realizeaz prin infecii mecanice pe plante test sensibile. n timpul testrii,
inoculul este inut la temperatura camerei. Cu timpul, infectivitatea scade,
pn ce dispare. Se noteaz limita de timp la care inoculul nc mai
pstreaz infectivitatea.

Determinarea punctului de inactivare termic

Pentru determinarea punctului de inactivare termic, se nclzete
inoculul viral la diferite temperaturi, o perioad de timp (1 minut, 5 minute
sau cel mai frecvent 10 minute). Se noteaz prima valoare de temperatur la
care, nclzind inoculul, acesta i pierde infectivitatea dup 10 minute.
Determinarea infectivitii se face prin metoda infeciilor mecanice pe
plante test sensibile.

Determinarea rezistenei la pH


Se modific pH-ul suspensiei de inocul viral, pn ce se constat
pierderea infectivitii. Se noteaz valoarea acelui pH.


4.2. Metode de identificare a infeciilor virotice la plante

Identificarea infeciilor cu virusuri la plante prezint importan
teoretic, dar mai ales practic. Pentru identificarea infeciilor virotice se
folosesc diferite metode, dintre care vom prezenta cteva (observaia
vizual, tehnici serologice, microscopia imunoelectronic).

4.2.1. Observaia vizual

Aceast metod de identificare a infeciilor virotice la plante este
cea mai expeditiv, dar i cea mai puin sigur. Metoda se bazeaz pe
observarea simptomelor (reducerea taliei, tumori, scurtarea internodiilor,

23
ptri foliare etc.) evideniate de plantele infectate. Observaia vizual a
virozelor prezint anumite limite. Astfel, prin aceasta nu se stabilete cu
certitudine virusul sau virusurile care au produs infecia. De asemenea, se
tie c simptomele produse de virusuri difer n funcie de planta gazd i
de condiiile de cretere a acestora. De exemplu, Plum pox virus determin
de multe ori infecii latente la prun.

4.2.2. Tehnici serologice

Tehnicile serologice sunt foarte precise, dau rezultate rapide, sunt
laborioase i permit efectuarea unui numr foarte mare de teste. Cele mai
multe dintre ele au fost preluate din medicina uman i au fost adaptate
pentru studiul virusurilor fitopatogene. Reacia serologic are la baz con-
tactul dintre suspensia viral i antiserul specific. Evidenierea reaciei spe-
cifice dintre antigen i antiser se realizeaz prin diferite teste, precum testul
de floculare, testul de difuzie n gel, testul ELISA etc.

Testul de floculare

Cnd particulele virale interacioneaz cu anticorpii specifici, n
mediu lichid, formeaz combinaii care precipit. Aceste precipitate pot fi
observate n tuburi (testul tub) sau n picturi plasate pe suprafee netede
(testul de microprecipitare). Testul de microprecipitare se utilizeaz, n
principal, pentru diagnoza virusurilor alungite. De obicei, se folosete sucul
plantei purificat prin centrifugare i aezat n vase Petri, sub form de
picturi.

Testul ELISA

Testul ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) este un test
imunologic foarte sensibil al crui principiu se bazeaz pe interaciunea
antigen-anticorp. Aceast tehnic a fost introdus n virologia vegetal n
anul 1976 (Clark i Adams, 1977).
Spre deosebire de testele de difuzie n gel i de floculare, ELISA
permite detectarea virusurilor care se gsesc n concentraie foarte mic n
plante i chiar direct din vectorii lor. Datorit sensibilitii ridicate a
testului, virusurile se pot evidenia naintea manifestrii simptomelor.
Testul ELISA utilizeaz o metod de dozare imunoenzimatic de
tip double antibody sandwich(DAS), n care anticorpi specifici sunt
cuplai direct cu o enzim (fosfataz alcalin). Antigenul (A) este capturat
pe faza solid, de ctre anticorpii (IgG) fixai anterior. n urmtoarea etap,

24
anticorpii cuplai cu fosfataza alcalin vin i se leag pe antigen. n final,
hidroliza substratului (p-nitrofenilfosfat) de ctre enzim duce la obinerea
unei coloraii galbene a crei intensitate poate fi msurat fotometric prin
citirea densitii optice la 405 nm (valoarea absorbiei).
Testul ELISA este folosit pentru detectarea a numeroase virusuri la
plante (Clark i Adams, 1977; Flegg i Clark, 1979 etc.).

Microscopia imunoelectronic

Microscopia imunoelectronic (IEM) este o tehnic recent
(Derrick, 1973) care permite vizualizarea reaciei serologice (antigen-
anticorp) la microscopul electronic. Are mare precizie i prezint dou mari
avantaje: consumul de antiser este extrem de redus, iar antigenul poate fi
folosit direct din extract vegetal brut.

4.3. Metode de obinere a unor plante libere de virus

n combaterea virusurilor fitopatogene, s-au experimentat mai
multe metode (termoterapia, chimioterapia, culturile meristematice, radio-
terapia etc.). Prin acestea, s-a urmrit obinerea de plante libere de virus.
Termoterapia

Inactivarea termic (termoterapia) este metoda cea mai folosit
pentru combaterea in vivo a virusurilor fitopatogene din plante. Pentru
combatere, se folosesc ap i aer cald. n cazul utilizrii apei, temperaturile
oscileaz n jurul a 40C, iar timpul de expunere este scurt (cteva minute
sau ore.). Cnd se folosete aerul cald, temperaturile pot fi de 35-40C, cu
timp lung de expunere.
n ara noastr, termoterapia cu aer cald a fost folosit cu succes n
combaterea unor virusuri fitopatogene la via de vie, cpun, pomi fructiferi.
Aceast metod se aplic numai n institute dotate cu camere termostat
pentru termoterapie.
Chimioterapia

n literatura de specialitate sunt menionate numeroase substane
(antibiotice, vitamine i altele) care inhib activitatea virusurilor
fitopatogene i determin dispariia simptomelor de boal. n practic ns,
combaterea virusurilor fitopatogene prin chimioterapie nu se aplic,
deoarece aceste tratamente sunt costisitoare, iar rezultatele obinute sunt
limitate.


25
5. Metode i tehnici de lucru n studiul bacteriilor fitopatogene
5.1. Metode de cercetare a bacteriozelor

Diagnosticul unei boli bacteriene prezint mai multe etape:
examinarea direct a simptomelor, izolarea bacteriei n stare pur, examenul
microscopic al celulelor, determinarea caracterelor morfologice, fiziologice
i biochimice etc.

5.1.1. Examinarea direct a materialului vegetal

Materialul vegetal atacat de bacteriile patogene este colectat de
specialiti i este expediat la laboratorul de bacteriologie. Numai pe
materiale vegetale proaspete se pot face investigaii.
Persoanele care execut examinarea direct a materialului vegetal
trebuie s ia n considerare toate detaliile tabloului simptomatologic. n
acest sens, este indicat ca examinarea direct s se realizeze cu ajutorul unui
stereomicroscop.
n cazul examinrii fructelor, tulpinilor, rdcinilor etc., atacate de
bacterioze, se impune cu necesitate efectuarea de seciuni, prin aceste
organe, pentru a forma o imagine clar a tabloului simptomatologic. La
plantele care prezint ofiliri, se examineaz n mod obligatoriu, vasele
conductoare din organe (rdcin, tulpin etc.), secionate la diferite nivele
(Severin i colab. , 1985).

5.1.2. Izolarea bacteriilor fitopatogene

Izolarea bacteriilor din plantele atacate este obligatorie, deoarece,
de cele mai multe ori, aceleai simptome (ptri, putregaiuri, ofiliri etc.) pot
fi provocate de mai multe specii patogene.

5.1.2.1. Izolarea bacteriilor din organe vegetative

Izolarea bacteriilor fitopatogene se face mai uor din probe
proaspt recoltate i din esuturi n primele stadii de infectare. Dezinfectarea
suprafeei organelor respective trebuie fcut cu mare atenie, pentru a nu
distruge nsui agentul patogen.
esuturile vegetale verzi se dezinfecteaz 1 minut cu hipoclorit de
sodiu 5,0 % sau cloramin 1,0 %, dup care se spal bine cu ap distilat.
n unele cazuri, este suficient doar splarea suprafeei organului
vegetal cu ap de robinet i apoi cu ap steril.

26
Izolarea bacteriei patogene din organele vegetale care sunt ntr-un
stadiu avansat de degradare este destul de anevoioas, datorit numeroilor
infectani care au invadat esuturile (Severin i colab. , 1985).
Astfel de situaii se ntlnesc n cazul izolrii i purificrii bacteriei
patogene Erwinia carotovora pv. atroseptica care produce putregaiul moale
al tuberculilor de cartof. n acest caz, pentru izolarea bacteriei patogene, se
folosete un tubercul de cartof sntos. Acesta se spal cu ap, se
dezinfecteaz suprafaa cu alcool etilic 70% i se flambeaz cteva secunde.
Astfel pregtit, tuberculul sntos se secioneaz cu un cuit steril.
Pe suprafaa seciunii proaspete, se aaz o poriune mic de esut infectat al
unui tubercul cu putregai moale, din care dorim s izolm bacteria
patogen. Tuberculul sntos inoculat se introduce ntr-o plac Petri,
cptuit cu hrtie de filtru umed. Se incubeaz la 26-28C, timp de 2-3
zile. Dup incubare, esutul sntos al tuberculului prezint o leziune,
datorit infectrii cu bacteria fitopatogen din esutul bolnav. Din leziunea
proaspt, se izoleaz bacteria patogen i se studiaz la microscop. De
asemenea, se poate nsmna pe medii de cultur.
Din plantele lemnoase, bacteriile patogene care produc infecii
sistemice (Agrobacterium tumefaciens la via de vie, Xanthomonas
campestris pv. juglandis la nuc etc.) pot fi izolate din lichidul de lcrimare.
Pentru aceasta, n perioada cnd lcrimarea este mai intens (primvara la
via de vie, primvara i toamna la nuc etc.), se dezinfecteaz suprafaa unei
coarde sau a unei ramuri, se taie cu un instrument steril i se introduce ntr-o
eprubet steril. Locul rmas gol, ntre gura eprubetei i ramur, se umple
cu vat steril. Eprubeta se fixeaz pe ramur cu ajutorul unui dispozitiv.
Dup colectarea a cca. 20 ml lichid de lcrimare, se centrifugheaz la 10
000 turaii/minut, iar sedimentul se nsmneaz pe mediu de cultur.

5.1.2.2. Izolarea bacteriilor din semine

Multe semine cu aspect sntos pot fi purttoare de bacterii
patogene. Analiza seminei cu privire la infecia cu bacterii se realizeaz
prin diferite metode: examinare macroscopic, metoda indirect sau
cultural, metoda sugativei etc.

Examinarea macroscopic

Pentru examinarea macroscopic a seminelor se poate folosi
stereomicroscopul. Cu ajutorul acestuia, se evideniaz pete mai mult sau
mai puin caracteristice, determinate de bacterii patogene (Raicu i Baciu,
1978).

27
Metoda indirect sau cultural

Seminele cu simptome evidente se nsmneaz n nisip steril,
care se gsete n vase sau ldie, acoperite cu geam. Dup semnat, acestea
se pstreaz la temperatura optim bacteriei respective (18-25C). Dup 5-8
zile, cnd s-au deschis complet cotiledoanele, pe acestea apar simptome de
boal. Unele simptome sunt tipice bacteriozei urmrite, iar altele sunt
atipice. De cele mai multe ori, observarea simptomelor de boal de pe
cotiledoane nu este suficient. De aceea, trebuie efectuate analize
suplimentare: executarea unui preparat microscopic, izolarea i cultivarea
bacteriei patogene etc.
Metoda cultural de analiz poate fi folosit n cazul bacteriozelor
care produc arsuri la leguminoase, ptarea unghiular la castravei etc.

Metoda sugativei

Seminele se dezinfecteaz (Tab. 4) n prealabil, dup care se spal
bine cu ap steril. Incubarea se realizeaz n vase Petri, pe sugativ
umezit, timp de 1-2 zile, la temperatura de 25-30C. Dup incubare,
seminele se analizeaz i se observ dac prezint exsudat bacterian pe
suprafaa lor (Raicu i Baciu, 1978).
n cazul formrii exsudatului, se ia cu ansa din acesta i se dilueaz
ntr-o eprubet cu ap steril. Din aceast diluie se efectueaz preparate
microscopice i/sau se nsmneaz prin epuizare de ans, pe mediu cu
agar. Dup incubare (1-2 zile, la 25-30C), se face purificarea coloniilor
bacteriene.

5.2. Cercetarea i identificarea bacteriilor pe medii de cultur

Identificarea unei bacterii nu se poate face dect dup ce este
izolat n cultur pur i este cultivat pe diferite medii nutritive.

5.2.1. Morfologia bacteriilor

Bacteriile au diferite forme: de bastona (bacil), sferic (coc), de
virgul (vibrion), form filamentoas ondulat (spiril), de filament ramificat
etc. (Fig. 1). Forma coloniilor bacteriene este foarte diferit n funcie de
specie i de tulpin (Florian, 2001; Muntean, 2009). Pentru stabilirea ct
mai exact i complet a caracterelor de cultur, bacteriile se nsmneaz,
pe medii solide i lichide. Pentru nregistrarea caracterelor creterii,
examinarea culturilor bacteriene se face zilnic.

28



Fig.1. Morfologia bacteriilor:
A. coci: a. coci (cu i fr flagel); b. stafilococi; c. i peritrih); B.
cocobacili;C.bacili; D. vibrion; E. spiril*; F. filamente ramificate (cu i
fr endospori); G. filamente**; (*tip Treponema; ** tip Beggiatoa).

Morfologia coloniilor bacteriene pe medii solidificate

Tehnica nsmnrii bacteriilor (Fig. 2) pe medii de cultur din
eprubete i vase Petri este prezentat n diferite lucrri de specialitate.
Dup nsmnarea bacteriei pure, prin tehnic adecvat, pe mediu
nutritiv solidificat n vase Petri, se asigur incubarea la termostat. Dup
incubare, pe baza observaiilor zilnice, se noteaz: momentul apariiei
coloniilor, gradul de uniformitate, forma coloniilor, aspectul suprafeei,
aspectul marginii, profilul, culoarea, mrimea etc.
Informaiile despre caracterele coloniilor bacteriene obinute pe
medii nutritive permit identificarea speciei cercetate (Gerhardt, 1981).


29


Fig. 2. Tehnica nsmnrii bacteriilor i ciupercilor pe medii solidificate:
a. n vas Petri; b. n eprubet.

5.2.2. Medii uzuale pentru bacterii fitopatogene

Bulionul de carne

Acesta reprezint mediul de baz n bacteriologie. Este un mediu
aproape universal pentru cultivarea multor grupe de bacterii. Prepararea lui
se realizeaz n dou etape: prepararea maceratului de carne i prepararea
bulionului propriu-zis.
Prepararea maceratului de carne (zemii de carne). Se iau 500 g
carne de vac sau cal, se cur de oase, tendoane, aponevroze, grsime i se
taie n fragmente mici. Apoi, carnea se introduce ntr-o oal emailat i se
adaug 1000 ml ap de robinet. Se ine 24 ore la rece pentru macerare, dup
care se fierbe 30 minute. Dup fierbere i rcire, se filtreaz prin tifon, apoi
prin hrtie de filtru sau vat. Filtratul obinut constituie zeama de carne.
Acesta se completeaz cu ap la volumul iniial i se repartizeaz n baloane
mari, splate i sterilizate, care se nchid cu dopuri de vat, nvelite n tifon.
Sterilizarea se realizeaz la 120C, timp de 30 minute. Astfel
pregtit, zeama de carne se poate pstra timp ndelungat la rece i
ntuneric, servind la prepararea mediilor lichide i solide.
Prepararea bulionului propriu-zis. La 1000 ml zeam de carne
se adaug 10 g pepton i 5 g NaCl. Se amestec i se nclzete pn la
dizolvarea complet a peptonei. Se las s se rceasc, apoi se determin

30
pH-ul i se ajusteaz la 7,5-7,8, cu ajutorul unei soluii de NaOH 10%.
Apoi, mediul se autoclaveaz timp de 15 minute, la 120C, pentru preci-
pitarea srurilor alcalino-pmntoase. Pentru ndeprtarea precipitatului i a
resturilor de grsime, mediul se filtreaz prin hrtie de filtru, dup care se
repartizeaz n baloane sau eprubete. Acestea se nchid cu dopuri de vat i
se sterilizeaz n autoclav la 120C, timp de 30 minute.

Mediul cu extract de porumb

Acest mediu nlocuiete bulionul de carne, n cultivarea multor
bacterii, mai ales a celor fitopatogene. Se prepar din :
Ap distilat1000 ml
Pepton. 5 g
Extract de porumb 10 g
Clorur de calciu.. 0,5 g
Clorur de sodiu.. 5 g
Agar 15-18 g

Agarul se topete n ap i apoi se adaug peptona, extract de
porumb i srurile indicate. Se amestec bine pentru uniformizarea soluiei,
se filtreaz la cald i se ajusteaz pH-ul la 7,4 -7,5. Apoi, se distribuie n
vase i se sterilizeaz 30 de minute la 1,2 atm.
Mediile cu extract de carne i extract de porumb permit dezvol-
tarea a numeroase grupe de bacterii, ceea ce ngreuneaz purificarea culturii
cercetate. Prezena n acest mediu a anumitor substane inhib dezvoltarea
unor grupe de bacterii. Verdele malachit i cristalul violet inhib n mare
parte dezvoltarea bacteriilor Gram-pozitive. Bicromatul de potasiu inhib
dezvoltarea bacteriilor Gram-negative.

Mediul Lieske

Mediul este folosit pentru izolarea bacteriei Agrobacterium tume-
faciens. Pentru prepararea mediului se folosesc: 1 litru ap, 20 g glicin, 5 g
KNO
3
, 1g KH
2
PO
4
, 0,1 g MgSO
4
i 18 g agar. La acest mediu se adaug
10 ml soluie 1:400 rou de Congo. Se ajusteaz pH-ul la 7,2-7,4 i se
sterilizeaz la 1 atm., timp de 20 minute.

Mediul Hugh i Graham

Este un mediu selectiv pentru Erwinia carotovora. Mediul se
prepar din 1 litru ap, 10 g salicin, 5 g taurocolat de sodiu, 1 g NH
4
K
2
PO
4
,

31
0,2 MgSO
4
, 0,2 g KCl, 0,05 g albastru de bromtimol (se dizolv separat n
ap) i 18-20 g agar. Se sterilizeaz 20 minute la 1 atm. (120C).

Mediul cartof - dextroz - agar

Acest mediu este foarte bun, pentru cultivarea bacteriilor. Se
prepar precum mediul folosit pentru cultivarea ciupercilor. Trebuie ajustat
ns la un pH=7,4 7,6.

5.3. Tehnici de colorare a bacteriilor

Dintre tehnicile de colorare, pentru studiul bacteriilor fitopatogene
se folosesc frecvent coloraia vital, coloraia simpl i coloraia Gram.

5.3.1. Coloraia vital

Aceast metod folosete colorani netoxici sau foarte diluai, care
nu omoar microorganismele, ci doar le coloreaz, fcndu-le mai uor
vizibile.
Pentru realizarea coloraiei vitale sunt necesare: cultur bacterian,
colorant, lame i lamele, pipet Pasteur. Pentru colorarea celulelor
bacteriene se pot folosi diferii colorani: rou neutru (0,5g/100 ml ap
distilat), albastru de metilen (0,1g/100 ml ap distilat), albastru de Nil
(0,1g/100 ml ap distilat) sau verde de metil (0,1g/100 ml ap distilat).
Tehnica de lucru. Pe o lam de microscop se amestec o pictur
din soluia de colorant, cu o pictur de suspensie bacterian. Se
examineaz la microscop, ntre lam i lamel, cu obiectivul 40x.
Interpretare. Celulele bacteriene apar mai colorate, n raport cu
fondul preparatului. n cazul n care au flageli, celulele sunt mobile.

Examinarea bacteriilor pe preparate fixate

Pentru efectuarea unui preparat fixat cu bacterii care urmeaz a fi
examinate, trebuie parcurse urmtoarele etape: etalonarea celulelor pe
suprafaa unei lame de microscop, fixarea frotiului i apoi colorarea.
Preparatul astfel obinut este cunoscut sub denumirea de frotiu.
Pentru realizarea unui frotiu sunt necesare urmtoarele: cultur
bacterian (dezvoltat pe mediu solidificat sau lichid), soluie salin fizio-
logic (NaCl 0,85%), ans sau pipet Pasteur, lame de sticl curate i
degresate, cristalizoare, stative i bec Bunsen.

32
Tehnica de lucru. Pentru realizarea frotiului se parcurg mai multe
etape.
Pe o lam de microscop se pune, cu bucla ansei sau cu pipeta
Pasteur, o pictur de ap fiziologic. n bucla ansei se recolteaz o cantitate
mic din suspensie sau dintr-o colonie bacterian i apoi se disperseaz
omogen n pictura de ap fiziologic. Pentru etalonare, se descriu cu bucla
ansei trasee concentrice ovale. n cazul culturilor foarte srace n celule, se
recomand punerea pe lam, cu ajutorul ansei sau al pipetei Pasteur, a uneia
sau mai multor picturi. Apoi, acestea sunt lsate s se usuce.
n toate cazurile, uscarea se face la temperatura camerei, acoperind
frotiurile cu capacul unei plci Petri. De asemenea, uscarea se poate realiza
la termostat, la 37C (Drgan-Bularda i Kiss, 1986).
Fixarea frotiurilor. Prin fixarea frotiurilor, se omoar celulele, se
asigur aderena bacteriilor pe lam, o mai bun colorare i posibilitatea de
studiere a detaliilor. De asemenea, prin aceasta crete permeabilitatea
peretelui celular pentru colorani etc.
Fixarea frotiurilor se realizeaz cu ajutorul unor ageni fizici
(cldura) sau chimici (alcool absolut, alcool metilic, acid osmic etc.).
Fixarea cu ajutorul cldurii. Prin flacra unui bec Bunsen se
trece lama de microscop care este inut de margini, la una din extremiti,
avnd frotiul n sus. n timpul trecerii, se efectueaz o micare lent de
clcare a flcrii. Operaia se repet de trei ori, iar fiecare trecere dureaz
aproximativ o secund. Pentru a evita supranclzirea lamei, care poate
determina carbonizarea celulelor, dup fiecare trecere prin flacr, se
controleaz gradul de nclzire a preparatului. n acest sens, se atinge cu
lama dosul palmei, aproape de baza degetului mare. Fixarea se efectueaz
corect, cnd temperatura poate fi suportat cu uurin (Drgan-Bularda i
Kiss, 1986).

Colorarea frotiurilor

La colorarea frotiurilor, trebuie cunoscute i respectate cteva
reguli generale.
Frotiurile se aaz, dup fixare, pe suporturi metalice sau suporturi
formate din dou baghete de sticl, reunite la capete printr-un tub de
cauciuc i aezate deasupra unui cristalizator folosit numai pentru coloraii.
La colorare, colorantul se aplic direct pe frotiu, cu sticla picur-
toare sau cu ajutorul unei pipete tetin de cauciuc.
n cazul n care coloraia necesit o expunere prelungit sau
acoperirea complet a frotiului, lama cu frotiul se cufund n vase speciale
(pahare Borrel, plci Laveron).

33
Dup aciunea colorantului, splarea lamei cu frotiul se face sub
curent de ap direct de la robinet sau cu ajutorul unei pipete.
Pentru colorare la cald, flambarea se face prin trecerea lamei prin
flacra unui bec Bunsen. Pentru uscarea frotiului, se aaz lamele pe mas
n poziie vertical, n stelaje de lemn speciale, n termostat sau ntre dou
foi de hrtie de filtru. Nu se recomand uscarea frotiului la flacr.
n cazul utilizrii uleiului de imersie, pentru studiul microscopic al
preparatelor, acesta trebuie ndeprtat de pe lam cu xilol sau benzol. Pentru
aceasta, se acoper frotiul cu o bucat de hrtie de filtru sau vat bine
umezit cu una din aceste substane i se terge suprafaa lamei printr-o
micare de translaie (Drgan-Bularda i Kiss, 1986).

5.3.2. Coloraia simpl

Tehnica utilizeaz aciunea unui singur colorant care transfer
culoarea sa celulelor din preparat.
Pentru colorarea celulelor bacteriene sunt necesare: colorant
Loeffler, cultur bacterian (de 24-48 ore), lame de microscop degresate,
ap fiziologic (soluie fiziologic de NaCl 0,85%) i ans de platin.
Colorantul Loeffler (soluie alcoolic de albastru de metilen) se prepar din
albastru de metilen (0,3g), alcool etilic (30 ml), soluie apoas de KOH 1%
(1,0 ml) i ap distilat (100 ml). Albastrul de metilen se dizolv n alcool
etilic, dup care se adaug soluia de KOH 1% i apa distilat.
Tehnica de lucru. Pe lame de microscop, se realizeaz frotiuri.
Acestea se fixeaz termic (la flacr) i apoi se coloreaz cu soluie
Loeffler, 1-2minute. Dup colorare, se spal cu ap de robinet. Frotiul se
usuc la temperatura camerei i se examineaz la obiectivul cu imersie
(Drgan-Bularda i Kiss, 1986).

5.4. Testul ELISA

n cercetrile moderne, pentru determinarea corect a bacteriilor
fitopatogene se folosete tot mai frecvent testul ELISA. Unele bacterii
fitopatogene (Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae etc.)
prezint numeroase tulpini (patovaruri). De aceea, identificarea acestora
necesit folosirea unor metode i tehnici de mare sensibilitate i precizie.
Prin testul ELISA se determin diferite bacterii fitopatogene, precum
Pseudomonas syringae pv. phaseolica, Clavibacter michiganense pv.
michiganense etc.



34
6. Metode i tehnici de lucru n studiul ciupercilor fitopatogene

6.1. Metode de izolare a ciupercilor fitopatogene

Izolarea ciupercilor fitopatogene din substratul pe care se dezvolt
se realizeaz prin metode generale i metode speciale.

6.1.1. Metode generale

Dintre metodele generale de izolare, la studierea ciupercilor fito-
patogene se folosesc izolarea direct, metoda diluiilor etc.

Metoda izolrii directe

Aceast metod se folosete pentru izolarea ciupercilor care
formeaz fructificaii abundente la suprafaa substratului pe care se
dezvolt. n unele cazuri, sporulaia ciupercii poate fi observat cu ochiul
liber.
Examinarea mai detaliat a sporulaiei se realizeaz cu ajutorul
stereomicroscopului. Din materialul infectat se detaeaz spori sau miceliu
de ciuperc, cu ajutorul unui ac de nsmnat, umectat n prealabil n
mediul nutritiv. Materialul izolat este folosit pentru efectuarea de preparate
microscopice sau se nsmneaz pe un mediu de cultur. Pentru evitarea
contaminrii cu bacterii, la mediul de cultur se adaug substane
bactericide.
Stimularea dezvoltrii i sporulrii ciupercii fitopatogene, n
vederea identificrii, se realizeaz n camer umed, care asigur speciei
cercetate condiii optime de temperatur (20-22C) i umiditate. Materialul
vegetal infectat se pregtete corespunztor, nainte de a fi introdus n
camera umed. Astfel, acesta se spal bine la suprafa cu ap steril, apoi
se introduce ntr-un dezinfectant (Tab. 4). Dup aceasta, se spal bine cu
ap steril i se introduce n camera umed. Pentru pregtirea camerei
umede, se folosesc cteva rondele de hrtie de filtru, umectate cu ap
steril, care sunt puse ntr-un vas Petri sterilizat.
Camera umed cu materialul vegetal infectat se acoper i se
introduce ntr-un termostat la temperatura de 20-22C, timp de cteva zile,
n funcie de specia cercetat.
n aceast perioad de timp, ciuperca se dezvolt, formnd miceliu
i sporulaie caracteristic, necesare pentru determinarea speciei.



35
Metoda diluiilor

Este folosit, atunci cnd ciupercile sunt slab dezvoltate pe substrat
sau cresc n amestec cu alte specii de microorganisme.
Pentru realizarea metodei, se cntrete un gram din materialul de
analizat (esut vegetal infectat, suc vegetal infectat etc.) i se pune n 9 ml
ap steril. Astfel se obine diluia de 1:10, din care se ia 1 ml i se pune
ntr-o eprubet cu 9 ml ap steril, dup ce n prealabil s-a agitat coninutul.
n acest mod, s-a obinut diluia 1:100. Prin acest procedeu i n acelai mod
se obin diluii de 1:1000; 1:10 000; 1:100 000 etc.
O cantitate foarte mic din suspensia iniial (1:10) se transfer cu
ajutorul unei anse pe suprafaa mediului agarizat, turnat n vase Petri. Pentru
a inhiba dezvoltarea bacteriilor, n mediul de cultur se adaug substane
bactericide. Folosind i celelalte soluii cu diluii mai mari, se nsmneaz
i alte vase Petri cu mediu agarizat, n acelai mod.
Suspensia optim pentru inoculare este aceea care prin inocularea
unui mililitru de soluie, pe suprafaa mediului, se vor dezvolta numai 3-6
colonii. Frecvent se folosesc diluii de 1:10 000 (Constantinescu, 1974).
Aceast metod se aplic i pentru izolarea ciupercilor
fitopatogene din sol.

6.1.2. Metode speciale

Pentru izolarea ciupercilor de pe unele organe ale plantelor sau
pentru izolarea anumitor grupe de ciuperci s-au adoptat metode speciale.
Aproape ntotdeauna, pe organele plantelor, n afara ciupercilor
parazite, se afl i bacterii sau ciuperci saprofite. Pentru ndeprtarea
contaminanilor de pe suprafaa materialelor colectate, se folosesc diferite
metode. Una dintre acestea se bazeaz pe utilizarea de sterilizani sub form
de soluii (Tab. 4).
Cnd se folosesc sterilizani sub form de soluii, dezinfectarea la
suprafa se realizeaz astfel: se spal materialul vegetal i se taie n
fragmente mici, de cca. 1 cm lungime, apoi se imerseaz n alcool etilic
75% i imediat n soluie de sterilizare. Dup scoaterea din soluie, se spal
de mai multe ori n ap steril, se zvnt ntre foi de hrtie steril, se
secioneaz i se transfer pe mediul de cultur.
Dup sterilizarea la suprafa a materialului vegetal, urmeaz etapa
de izolare a ciupercilor fitopatogene. Metoda de izolare folosit, difer n
funcie de grupul de ciuperci, de locul unde este localizat agentul patogen
(la suprafaa plantei sau n esuturi profunde), de organul vegetal afectat
(tulpin, smn etc.) etc.

36
Tabelul 4
Sterilizarea la suprafa a materialului vegetal
(dup Booth , 1971, citat de Constantinescu, 1974)

Sterilizantul Concentraia
(%)
Timp
(min.)
Soluia de splare
Formaldehid
(40%)
51 1-5 Alcool etilic 70%,
apoi ap steril
H
2
O
2
3 1-5 Ap steril
KMnO
4
2 1-5 Ap steril
Hipoclorit de
calciu sau sodiu
0,35 1-5 Ap steril
Alcool etilic 75 1-5 Ap steril
AgNO
3
1 1-5 NaCl steril, apoi ap
steril


Izolarea ciupercilor care sporuleaz la suprafaa plantelor

Izolarea ciupercilor care produc ptri ale frunzelor se realizeaz n
mai multe etape: sterilizarea la suprafa a materialului vegetal (Tab. 4);
introducerea n camera umed; incubarea (la 20-22C, timp de cteva
zile); izolarea direct a miceliului i sporulaiei; identificarea speciei prin
studiul preparatelor microscopice.

Izolarea ciupercilor din esuturile profunde ale organelor vegetative

Izolarea ciupercilor, care paraziteaz esuturile profunde i care, de
obicei, nu sporuleaz la suprafaa organelor atacate (bulbi, tuberculi, tulpini
etc.), se realizeaz prin parcurgerea urmtoarelor etape: sterilizarea, sp-
larea, secionarea esuturilor i depunerea fragmentelor pe mediu de cultur
sau n camere umede. Dup cteva zile de incubare la temperatura camerei
(20-22C), din miceliul care se dezvolt n jurul fragmentului de esut, se
poate izola agentul patogen.

6.1.3. Metode de analiz a seminei cu privire la infecia cu ciuperci

Seminele plantelor sunt infectate uneori de diferite specii de
ciuperci. Datorit infeciei, seminele prezint diferite simptome de boal
(pete de decolorare, culori diferite etc.), care se deosebesc de seminele
sntoase.

37
Ciupercile se pot localiza pe suprafaa seminelor sau pot ptrunde
prin tegumentul seminal n interiorul acestora.
Pentru determinarea precis a agenilor patogeni purtai de smn-
, trebuie s se foloseasc diferite metode, pe lng metoda examinrii
macroscopice. Dintre aceste metode menionm: metoda suspensiei de
spori, metoda sugativei, metoda plcilor cu agar, metoda Hiltner etc.

Metoda suspensiei de spori

Aceast metod de analiz const n examinarea microscopic a
suspensiilor de spori obinute prin splarea seminei. Este o metod
calitativ, deoarece servete numai la depistarea sporilor, dar nu stabilete
viabilitatea acestora sau gradul de contaminare a seminelor.
Mod de lucru. Din proba de analizat, se iau cte 200 semine, care
se mpart, n mod egal, n dou loturi. Fiecare lot se pune ntr-un balon de
sticl i se adaug cte 100 ml ap steril. Apoi, se agit puternic balonul de
sticl (cu mna sau la agitator mecanic), timp de 10 minute. Suspensia din
baloane se transfer n dou tuburi de centrifug. Dup centrifugare (la
2000-2500 turaii/min., timp de 10-15 min.), se decanteaz supernatantul,
iar sedimentul fiecrui tub se examineaz. Din fiecare tub se iau cte 4
picturi i se pun n cte 4 picturi de lactofenol pe lame microscopice. Se
identific la microscop prezena sporilor de la diferite specii de ciuperci.

Metoda sugativei

Seminele cercetate sunt puse n condiii optime de temperatur i
umiditate, astfel nct ciupercile care le-au infectat s se poat dezvolta pe
ele.
Mod de lucru. Seminele se aaz n vase Petri, pe hrtie sugativ
umectat i se incubeaz cca. 7 zile, la temperatura camerei (20-22C).
Observaiile cu privire la prezena sau lipsa infeciei pe smn se
fac la stereomicroscop. n cazul unor semine care sunt puternic
contaminate cu ciuperci saprofite (Rhizopus spp., Mucor spp. Aspergillus
spp. etc.) este necesar s se fac o dezinfecie superficial (Tab. 4), n
prealabil.
Metoda sugativei este mult folosit n acele laboratoare care
efectueaz, n mod curent, analize de stare sanitar a seminelor. Aceast
metod ofer condiii optime pentru creterea miceliului la multe ciuperci
patogene, ct i pentru dezvoltarea simptomelor produse de aceste specii pe
germenii care se dezvolt n timpul incubrii.


38
Metoda plcilor de agar

Este folosit pentru izolarea i identificarea pe mediu agarizat a
agenilor patogeni localizai n smn.
Cel mai frecvent sunt folosite mediile extract mal-agar (MA) i
extract cartof-agar (CA), cartof-dextroz-agar etc..
Mod de lucru. Seminele testate se dezinfecteaz, n prealabil cu
un sterilizant slab (Tab. 4), iar apoi sunt plasate pe mediu de cultur n vase
Petri, fiind distanate n funcie de mrimea lor. Incubarea se realizeaz la
temperatura camerei (20-22
o
C), pe o perioad de 5-8 zile. Estimarea
infeciei se face prin examinarea coloniei de ciuperci la stereomicroscop. De
asemenea, se efectueaz preparate microscopice, pentru identificarea speciei
patogene (Raicu i Baciu, 1978).

6.2. Noiuni de tehnic micologic

Examinarea ciupercilor se poate face direct pe substratul pe care se
dezvolt n natur, cu ajutorul aparatelor optice (lup, microscop), fie n
culturi pure pe diferite medii de cultur. Culturile pure sunt indispensabile,
pentru cercetrile din micologie. Ele permit izolarea i determinarea
diferitelor specii de ciuperci, cunoaterea morfologiei, fiziologiei i altor
caractere ale lor. Nu toate ciupercile pot fi cultivate pe medii de cultur. Pe
aceste medii pot fi cultivate ciupercile saprofite (obligate i facultative) i
parazite facultative. Ciupercile parazite obligate nu pot fi cultivate pe medii
de cultur acelulare. Studierea lor se face direct pe planta gazd pe care se
dezvolt.

6.2.1. Medii de cultur pentru ciuperci

Necesitile nutritive ale ciupercilor sunt att de diverse nct nu
exist un mediu standard pentru toate speciile. Unele medii de cultur
(Czapek-agar, cartof-dextroz-agar, mal-agar etc.) permit dezvoltarea unui
numr mare de ciuperci, iar altele sunt specifice unui numr restrns sau
chiar unei singure specii. Mediile de cultur se folosesc n stare lichid sau
n stare solid. Solidificarea mediilor de cultur se realizeaz prin adugare
de agar sau silicagel (Constantinescu, 1974).
Pentru cultivarea ciupercilor, n literatur s-au descris cteva sute
de medii nutrtive, dintre care, n continuare, sunt prezentate cteva.




39
Ap-agar

Mediul de cultur ap-agar se prepar din:
Agar .......................... 20 g
Ap distilat ............. 1000 ml

Agarul se dizolv n ap timp de 30 minute i apoi se sterilizeaz
20 minute, la 121
0
C. Acest mediu specific este folosit pentru cultivarea i
iden-tificarea drojdiilor (Constantinescu, 1974).

Bere (must)-agar

Mediul de cultur se prepar din:
Agar 30 g
Must de bere .. 1000 ml

Agarul se topete n must de bere, prin fierbere pe baie de ap,
timp de 15 minute. Dup ajustarea pH-lui la 5,0-5,5, se sterilizeaz 10
minute la 116
0
C (Constantinescu, 1974).

Cartof-dextroz-agar

Mediul cartof-dextroz-agar este cel mai utilizat n micologie i
este foarte favorabil pentru creterea majoritii ciupercilor.

Se prepar din:
Cartof 200 g
Dextroz 20 g
Agar .. 20 g
Ap distilat .. 1000 ml

Pentru prepararea mediului, se spal i se cur cartofii, iar apoi se
taie n cuburi de circa 12 mm. Se cntresc 200 g cartofi, se cltesc repede
n ap i se fierb ntr-un vas de sticl sau smluit, timp de o or, pn se
nmoaie. Se sfrm cartofii i se strecoar ct mai mult pulp printr-o sit
fin sau printr-un tifon. Se adaug agarul i se fierbe pn se dizolv. Se ia
de pe foc, se adaug dextroza i se amestec pn se dizolv. Se
completeaz la un litru cu ap distilat. n timpul turnrii n eprubete, se va
agita soluia, pen-tru a repartiza n fiecare eprubet o parte din substana
solid. Se sterilizeaz la 121
0
C, timp de 15 minute. n funcie de calitatea
agarului, se poate folosi 15 g la un litru de mediu (Constantinescu, 1974).

40
Fa de formula standard, exist mai multe variante ale acestui
mediu. Pentru producerea de conidii la Venturia inaequalis, se recomand
acest mediu preparat din 40 g cartofi, 5 g dextroz, 17 g agar i 1000 ml ap
distilat (Boone i Keitt, 1956, citat de Constantinescu, 1974).

Czapek-agar

Soluie A .50 ml Soluia A Soluia B
Soluie B .50 ml NaNO
3
.. 40 g K
2
HPO
4
............. 20 g
Sucroz 30 g KCl ............... 10 g Ap distilat....1000 ml
Agar.. 20 g MgSO
4
..10 g
Ap distilat ...900 ml FeSO
4
..............0,2 g
Ap distilat...1000 ml

Preparare. Se dizolv sucroza n 50 ml soluie A, diluat cu
aproxi-mativ 500 ml ap distilat. Se adaug 50 ml soluie B, se
completeaz la un litru cu ap distilat, se adaug agarul i se topete. Se
sterilizeaz 20 minute, la 121
0
C (dup Booth, 1971, citat de Constantinescu,
1974).
Czapek soluie-agar
Compoziie/l:
Sucroz 30 g KCl ... 0,5 g
Agar .. 15 g MgSO
4
. 7H
2
O ... 0,5 g
NaNO
3
.. 2 g FeSO
4
. 7H
2
O ..0,01 g
K
2
HPO
4
. 1 g
pH: 7,3 0,2 la 25
0
C

Componentele se amestec n ap distilat i se aduce la volum de
1,0 l. Se distribuie n vase i se autoclaveaz 15 minute la 121
0
C. Se
folosete pentru cultivarea speciilor de Aspergillus, Penicillium i altor
ciuperci (Atlas, 2004).
Fasole-agar

Reeta de preparare cuprinde:
Fasole 100 g
Agar ... 15 g
Ap distilat .. 1 000 ml

Fasole lima (Phaseolus lunatus) proaspt sau ngheat se umec-
teaz ntr-un litru de ap cldu timp de 30 minute. Se nltur lichidul i se
completeaz cu ap, se filtreaz prin sit, se adaug agarul i se fierbe pn

41
la topirea agarului. Se filtreaz prin vat. Se sterilizeaz 20 minute, la
121
0
C. Acest mediu este recomandat pentru cultivarea speciei Phytophthora
infestans.
Mal (extract)-agar

Reeta standard cuprinde:
Extract mal .. 30 g
Agar . 15 g
Ap distilat 1000 ml

Se nclzete extractul de mal n ap pn se dizolv, se adaug
agarul i se fierbe pn se topete. Se ajusteaz pH-ul final la 5,5 0,2, la
25
0
C. Se sterilizeaz prin autoclavare la 121
0
C, timp de 15 min. (Samson i
Van Reenen-Hoekstra, 1988).

Sabouraud-glucoz-agar

Reeta standard cuprinde:
Glucoz . 40 g
Pepton granulat . 10 g
Ap distilat .. 1000 ml

Se amestec ingredientele, se fierb pn la dizolvare i se ajusteaz
pH-ul la 5,6. Se sterilizeaz la 120
0
C, timp de 10 minute. Acest mediu este
foarte sensibil i nu trebuie supranclzit, la sterilizare. Se folosete n
derma-tologie pentru cultivarea ciupercilor care produc micoze ale pielii i
prului, la om (Constantinescu, 1974).

Extract de orez-agar

Compoziie/l:
Agar ... 20 g pH: 6,60,2 la 25
0
C
Orez alb (extract) 5,0 g
Polisorbat 80 .. 10,0 ml

Se amestec componentele, cu excepia polisorbatului 80, n ap
dis-tilat/deionizat i se aduce la un volum de 990 ml. Se fierbe pn la
dizol-vare i apoi se adaug polisorbatul 80. Se sterilizeaz 15 minute, la
121
0
C. Mediul este folosit pentru cultivarea i diferenierea speciilor de
Candida albicans i Candida stellatoidea, de alte specii de Candida, pe
baza formrii clamidosporilor (Atlas, 2004).

42
Sterilizarea mediilor de cultur

Dup preparare, mediul de cultur se toarn n vase de cultur
(eprubete, plci Petri, flacoane Erlenmeyer etc.). Toat sticlria care se
folosete pentru cultivarea microorganismelor trebuie splat, uscat i
sterilizat.
Toate aceste etape sunt descrise amnunit n diferite manuale de
laborator Sterilizarea sticlriei se realizeaz n etuv la 180
o
C cel puin 60
minute sau la 160
o
C, cel puin dou ore(Constantinescu, 1974).
Mediul de cultur se toarn n vase cu ajutorul unei plnii de sticl.
Sterilizarea lor se face prin cldur umed n autoclav. Durata
sterilizrii i valoarea temperaturii sunt indicate n reeta de preparare. Dup
sterilizare, vasele cu medii se scot din autoclav i pot fi folosite pentru
cultivarea ciupercilor. Mediile de cultur i soluiile care conin substane
(zaharuri, vitamine etc.) termolabile i ai cror constitueni ar putea fi
denaturai sub aciunea temperaturilor ridicate se sterilizeaz complet prin
tindalizare. Sterilizarea prin tindalizare const n trei pasteurizri repetate
(30 minute la 56-90C), efectuate la intervale de 24 ore, prin imersia
recipientelor respective n bi de ap electrice, cu temperatur constant
(Prvu, 2007).
Culturile n vase Petri se practic n special pentru izolarea
ciupercilor prin nsmnri repetate. Aceste culturi nu se pstreaz mult
vreme, deoarece se usuc mai repede i se pot infecta mai uor prin
deschiderea vaselor. De asemenea, ciupercile pot fi cultivate pe medii de
cultur n eprubete i n flacoane Erlenmeyer. Pe aceste medii de cultur,
culturile de ciuperci pot fi pstrate la temperaturi sczute (2-4
o
C) 2-3 luni,
dup care trebuie rensmnate.

6.2.2. nsmnarea ciupercilor pe mediul de cultur

Dei par simple, inocularea i transferul sunt efectuate de multe ori
greit. Aceasta duce la contaminri nedorite ale culturilor, la infestarea
laboratorului i chiar a operatorului (Constantinescu, 1974). Prin ns-
mnare se nelege trecerea pe medii de cultur a microorganismelor din
diferite surse (ap, sol, produse patologice etc.), n vederea cultivrii i
izolrii lor n culturi pure.
Ciupercile se cultiv pe medii de cultur n diferite scopuri: pentru
examinarea caracterelor culturale, morfologice, biochimice i serologice, n
vederea identificrii lor; pentru a le conserva, prin rensmnare din culturi
vechi pe medii proaspete etc. nsmnarea ciupercilor se poate executa cu
ansa sau cu pipeta Pasteur.

43
nsmnarea cu ansa

Pentru inoculare, trebuie folosit un ac de nsmnat confecionat
din platin sau un aliaj care nu vibreaz. n timpul inoculrii, acul de
nsmnat nu se introduce fierbinte n cultur. Dup inoculare, se
recomand ca acul de nsmnat s fie imersat n alcool etilic 70% i dup
aceea trebuie trecut n flacra becului de gaz. Aceast ordine a operaiilor
trebuie respectat deoarece, prin nclzire brusc, fragmente de inocul sunt
dispersate n aer. n timpul inoculrii mediilor de cultur, trebuie s se
lucreze sub hot, n condiii sterile.
Tehnica transferului inoculului fungic n eprubet, vas Petri sau alt
vas de cultur este prezentat detaliat n diferite manuale de laborator
(Botton i colab., 1985; Kreisel i Schauer, 1987).
Materialul de nsmnat se introduce n mediul de cultur din
diferite vase (eprubete, vase Petri etc.), cu ajutorul ansei de nsmnat.
Dac nu dispunem de o cultur pur a unei anumite ciuperci, este necesar s
o izolm i s o purificm.
Din zonele n care ciuperca apare mai puin amestecat i cu alte
microorganisme, se ia o mic poriune care se nsmneaz din nou.
Repetnd aceast operaie de mai multe ori, se purific cultura, de micro-
organisme strine, izolnd astfel ciuperca pe care dorim s o studiem. Dup
ce s-a obinut cultura pur n vase Petri, ciuperca se nsmneaz din nou n
eprubete, spre a putea pstra izolatul mai mult vreme (2-3 luni), la tempe-
ratur sczut (2-4
o
C). Dup aceast perioad, culturile trebuie nsmnate
din nou, spre a le mprospta.
Pentru purificarea culturilor de ciuperci, se folosesc o serie de
factori chimici care inhib creterea bacteriilor. Dintre aceti factori
chimici, se folosesc frecvent penicilina, streptomicina, cloramfenicolul etc.
Penicilina (20-40 uniti/ml mediu de cultur) i streptomicina (40-100
uniti/ml mediu de cultur) se adaug dup sterilizare, cnd mediul s-a rcit
la 45
o
C. Cloramfenicolul (0,05 mg/ml mediu de cultur) poate fi inclus
nainte de sterilizare (Constantinescu, 1974).
Dup efectuarea nsmnrii, pe vasele cu mediul de cultur se
noteaz specia cultivat, data efecturii operaiei, mediul de cultur folosit
etc. Mediile de cultur nsmnate cu ciuperci se pun n termostat, la tem-
peratura optim (20-22
o
C) de cretere i dezvoltare, timp de 10-15 zile.
Periodic, la intervale egale de timp, se fac observaii i se noteaz caracte-
rele morfologice ale coloniilor obinute.




44
6.3. Tehnica examenului microscopic al ciupercilor

Caracterele morfologice i/sau ultrastructurale ale ciupercilor pot fi
studiate n preparate la microscopul optic i/sau la microscopul electronic.

Microscopie optic la ciuperci

Pentru examinare la microscopul optic, ciupercile trebuie fixate pe
un suport transparent, ntr-un mediu al crui indice de refracie este ct mai
apropiat de cel al sticlei. n general, n preparate se monteaz sporii ciuper-
cilor, mpreun cu structurile pe care se formeaz sau fragmente ori seciuni
din esuturile vegetale n care acestea se gsesc.
Preparatele microscopice pot fi provizorii sau permanente. Prepa-
ratele provizorii se pstreaz numai att ct este necesar pentru examinare
rapid, iar cele permanente pot fi conservate timp ndelungat n colecii.
Efec-tuarea preparatelor presupune parcurgerea mai multor etape:
prelevarea, montarea, colorarea, fixarea i lutarea (Constantinescu, 1974).


Prelevarea materialului

Pentru efectuarea unui preparat microscopic, se detaeaz direct de
pe substrat (frunze, semine etc.) sau din cultur, un fragment de ciuperc,
folosind un ac spatulat sau un ac de nsmnat. Fragmentul detaat se pune
pe o lam de sticl, ntr-un lichid de montare. Ulterior, se acoper cu lamela
de sticl i se examineaz la microscop.

Montarea

Aceast etap const n includerea materialului fungic - miceliu,
spori etc. - ntr-un mediu de montare. Mediul de montare - soluia n care se
include materialul - poate rmne lichid sau se poate solidifica prin evapo-
rarea solventului.
Pentru efectuarea preparatelor micologice se pot folosi diferite
medii de montare, precum apa, lactofenolul, acidul lactic etc.
Apa. Dac exist suficient material, orice ciuperc trebuie
examinat ntr-un preparat provizoriu n ap de robinet sau ap distilat,
deoarece nici un mediu de montare nu are un indice de refracie, att de
sczut, ca apa.
Lactofenolul. Este cel mai folosit lichid de montare n micologie.
ntr-o singur operaie se asigur fixarea, clarificarea esuturilor, colorarea

45
(dac se adaug un colorant), conservarea i red turgescena normal a
miceliilor sau sporulaiei contractate. Lactofenolul este miscibil cu majori-
tatea coloranilor i mai ales cu derivaii de anilin (Constantinescu, 1974).
Se prepar din:
Fenol cristalizat .. 20 g
Glicerin 31 ml
Acid lactic . .. 16 ml
Ap distilat . 20 ml
Primele trei componente se amestec i se nclzesc pn se
dizolv cristalele de fenol. Se filtreaz prin hrtie de filtru, obinndu-se
astfel lactofenolul anhidru. Acesta se poate hidrata prin adugarea apei
distilate (Constantinescu, 1974). La prepararea lactofenolului hidratat, se
nclzete fenolul cu apa pn la dizolvare, apoi se adaug acidul lactic i
glicerina. Pentru a mpiedica oxidarea (nnegrirea) sa, lactofenolul se
pstreaz n sticle brune (erbnescu-Jitariu i colab., 1983).
Cloral-lactofenol. Acest lichid de montare are un indice (1,49) de
refracie ridicat i clarific mai bine dect lactofenolul (Dade, 1960a, citat
de Constantinescu, 1974).
Se prepar din:
Cloral hidrat (cristalizat) 20 g
Fenol (cristalizat) .. 10 g
Acid lactic 10 ml
Acidul lactic. Este un lichid (mediu) foarte bun de montare, dar
mrete volumul materialelor incluse (Constantinescu, 1974). La acidul
lactic se poate aduga bleu coton sau alt colorant.

Colorarea

n micologie, se folosesc diferii colorani. Dintre acetia, civa se
folosesc pentru colorarea citoplasmei i pereilor celulari la ciuperci.
Bleu coton (Albastru de anilin, Coton blue). n funcie de
solventul folosit, se cunosc diferite reete de preparare a acestui colorant, n
vederea utilizrii.
Bleu coton n lactofenol. Se folosete pentru colorarea citoplasmei
celulelor fungice. Se prepar din 1,0 g bleu coton pulbere la 200 ml ap
distilat, se nclzete i se agit pn la dizolvarea complet a colorantului.
Apoi, se filtreaz. Se amestec (per volum) o parte din soluia obinut cu 4
pri lactofenol anhidru. Astfel, se obine o soluie cu o concentraie de
0,10%.
Colorarea se poate face prin introducerea materialului prelevat n
soluia concentrat de 0,10%, nclzire i apoi transferare n lactofenol pur

46
sau prin montarea direct n soluie diluat. Soluia diluat se obine din o
parte bleu coton 1,0% n lactofenol i 2 pri lactofenol hidratat.
Bleu coton n acid lactic. Se obine prin dizolvare, la temperatura
camerei, a 0,05 g bleu coton pulbere n 30,0 ml acid lactic. Dup 24 ore,
soluia se filtreaz. Este un colorant la fel de bun ca bleu coton n lactofenol
(Constantinescu, 1974).
Bleu coton n acid acetic. Colorantul se prepar din ap distilat
(100ml), bleu coton (0,5g) i acid acetic (3ml). Este indicat pentru colorarea
culturilor fungice pe lame sau a seciunilor prin esuturi vegetale care conin
ciuperci.
Cultura se deshidrateaz la 37
o
C, se fixeaz cu o pictur de alcool
etilic 95% care se las s se evapore. Se coloreaz cultura cteva minute cu
o pictur de colorant, se spal n ap, se deshidrateaz cu alcool etilic i se
monteaz n balsam (Constantinescu, 1974).
Albastru de tripan (Trypan blue). Se folosete n concentraie de
0,1-0,5% n acid acetic, pentru colorarea ciupercilor. De asemenea, se poate
folosi n concentraie de 0,2% n lactofenol. nclzirea preparatului grbete
colorarea, care se continu apoi n timp. Coloreaz citoplasma n albastru-
indigo.
Fucsin. Colorantul se poate prepara, dup diferite reete.
Fucsin acid. Este un colorant citoplasmatic. Se prepar din
fucsin acid 0,1 g n 100 ml lactofenol.
Lacto-fucsin. Este un colorant superior bleu cotonului n
lactofenol, deoarece colorarea este mai rapid, iar celulele se vd mai bine
i pot fi fotografiate cu uurin. Se prepar din 0,1 g fucsin acid care se
dizolv n 100 ml acid lactic anhidru. Este un colorant citoplasmatic.

Montarea i lutarea preparatelor microscopice

n laboratorul de micologie, se folosete frecvent lichid de montare
care conine colorant. Aa sunt fucsina acid, lacto-fucsin, bleu coton n
lactofenol etc. De aceea, montarea i colorarea materialului fungic prelevat
se face concomitent pe aceeai lam de sticl, folosind lichide de montare
care conin colorant. Dac lichidul de montare nu conine colorant, atunci,
colorarea se face nainte de montare.
Lamele de sticl i lamelele folosite pentru efectuarea preparatelor
microscopice trebuie splate cu detergent, cltite cu ap de robinet, ap
distilat i apoi uscate.
Dup curire, lamele i lamelele se pstreaz n alcool etilic 70%
sau n vase de sticl acoperite, pentru a fi ferite de praf. n cazul pstrrii n

47
alcool etilic, lamele i lamelele se scot din lichid i se terg cu o pnz
moale, curat, nainte de utilizare.

Montarea materialului

Pe o lam microscopic curat se pune la mijloc sau la 1/3 fa de
unul din capete o pictur din lichidul de montare (fucsin acid, lacto-
fucsin, bleu coton n lactofenol etc.). Materialul fungic miceliu, spori etc.
prelevat se pune apoi n lichidul de montare de pe lam, cu ajutorul unui
ac de nsmnat. Dup aceea, se aaz lamela cu o latur pe suprafaa
lamei, la o distan mic fa de pictura de lichid.
Cu ajutorul unui ac, se coboar lent lamela peste pictura din
lichidul de montare. Astfel pregtit, preparatul microscopic se poate
examina la microscop. Dac dorim s realizm preparat durabil, acesta se
nclzete pn la evaporarea complet a urmelor de lichid.

Etanarea preparatelor

Etanarea preparatelor n medii lichide este necesar, pentru a evita
evaporarea lichidului de montare. Astfel, se obin preparate durabile.
Preparatele microscopice montate n medii (balsam de Canada, gum
arabic, glicerin gelatinat etc.) care se solidific, nu se etaneaz.
Pentru etanarea preparatelor, se folosesc diferite materiale,
precum: lacul pentru unghii, rini naturale, rini sintetice etc. Lacul pentru
unghii a devenit cel mai utilizat lut, datorit faptului c se usuc rapid, se
manipuleaz uor i este eficient (Constantinescu, 1974).

Microscopie electronic la ciuperci

Caracteristicile morfologice ale ciupercilor pot fi evideniate n
pre-parate, la microscopul electronic scanning, iar cele ultrastructurale, la
micros-copul electronic cu transmisie, conform datelor din literatur
(Vanky, 1994; Hayat, 2000).
Pentru evidenierea caracteristicilor ultrastructurale la microscopul
electronic cu transmisie, se parcurg urmtoarele etape, necesare realizrii
unei probe: recoltarea materialului micologic; prefixarea cu soluie de
glutaral-dehid (2,7%) n tampon fosfat; splri succesive cu tampon fosfat
0,15 M (dup a patra splare se las peste noapte, la frigider); postfixarea n
soluie de OsO
4
2 %

n tampon fosfat 0,15 M; deshidratarea n soluii de
aceton de concentraii cresctoare (50%-100%); infiltrarea i includerea n
rin poliesteric; efectuarea seciunilor la ultramicrotom i contrastarea cu

48
acetat de uranil i citrat de plumb; examinarea seciunilor la microscop,
analiza imaginilor i interpretarea rezultatelor.
Pentru evidenierea aspectelor morfologice ale ciupercilor, la mi-
croscopul electronic scanning, trebuie parcurse urmtoarele etape:
recoltarea direct a probelor; centrifugarea materialului, dac este necesar;
acoperirea materialului, prin stropire, cu Au sau Ag, n vid; examinarea
probei la microscop, analiza i interpretarea rezultatelor.

6.4. Noiuni de micrometrie

Pentru studiul bacteriilor i ciupercilor microscopice, trebuie s
cunoatem dimensiunile lor. Aceasta prezint importan pentru determi-
nare. Pentru aceasta, se fac msurtori i este necesar s cunoatem puterea
de mrire a aparatelor optice cu care se lucreaz.
n micrometrie se folosesc micrometrul ocular i micrometrul
obiectiv, pentru determinarea indicelui micrometric.
Micrometrul ocular este un rondel (disc) de sticl care se introduce
n ocularul microscopului cu care se lucreaz. Rondelul de sticl are gravat
la mijloc o scar gradat de 1 cm i mprit n 100 pri egal deprtate una
de alta.
Fiecare diviziune a acestei scri este egal cu 1/10 de milimetru
(0,1 mm). nainte de a efectua msurtori, trebuie stabilite, pentru fiecare
ocular i obiectiv ale diferitelor microscoape, valoarea n microni (m) a
unei diviziuni de pe micrometrul ocular. Pentru a afla aceasta, se determin
indicele micrometric.
Pentru determinarea indicelui micrometric, se folosete microme-
trul obiectiv. Acesta este o lam de sticl n mijlocul creia este gravat o
scar gradat lung de 1 mm i mprit n 100 pri egale. Fiecare divi-
ziune este egal cu 1/100 de milimetru (0,01 mm).
Pentru determinarea indicelui micrometric, aezm micrometrul
ocular n ocularul microscopului i micrometrul obiectiv pe platina
microscopului. Potrivim ca diviziunile scrii micrometrului ocular s se
suprapun exact peste un anumit numr de diviziuni ale micrometrului
obiectiv.
Indicele micrometric (Im) se calculeaz dup formula:

Im = (ob x 10):oc
n care:
ob = reprezint numrul de diviziuni ale micrometrului obiectiv
care se suprapun exact peste un anumit numr de diviziuni din micrometrul
ocular.

49
oc = reprezint numrul de diviziuni ale micrometrului ocular care
se suprapun exact peste un anumit numr de diviziuni din micrometrul
obiectiv.
Im se exprim n microni (m). n acest mod se apreciaz ct este
Im pentru fiecare obiectiv al microscopului cu care se lucreaz. Cunoscnd
valoarea n microni (m) a unei diviziuni din micrometrul ocular i numrul
de diviziuni corespunztoare dimensiunilor celulei fungice sau bacteriene,
pe care o msurm, putem aprecia lungimea i limea acestora.


































50