4.

Acţiunea factorilor fizici, chimici şi biologici asupra

bacteriilor (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

4. 1. Definiţii de bază

Septic înseamnă contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecţia unei
plăgi).
Aseptic înseamnă lipsit de microbi, indiferent dacă microbii sunt patogeni sau nepatogeni.
Asepsia reprezintă ansamblul de metode prin care evităm contaminarea mediului ambiant cu
germeni microbieni sau prin care putem menţine „sterilitatea” ţesuturilor, mediilor de cultură,
medicamentelor injectabile etc.
Antisepsia reprezintă înlăturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe
tegumente, mucoase sau din plăgi. Se realizează cu ajutorul substanţelor antiseptice.
Contaminare, este un termen utilizat în instituţiile sanitare (deosebit de contaminarea
radioactivă) care se referă, în general, la contactul actual sau potenţial cu microorganisme
condiţionat patogene sau patogene (capabile să producă boli sau infecţii). Decontaminarea
reprezintă utilizarea agenţilor fizici / chimici pentru a îndepărta, a inactiva sau a distruge
unele sau toate microorganismele condiţionat patogene sau patogene de pe suprafeţe sau
obiecte, astfel încât acestea să nu mai poată reprezenta o sursă de infecţie sau de transmitere,
iar obiectele sau suprafeţele să poată fi manipulate şi / sau utilizate în siguranţă.
Curăţarea reprezintă utilizarea agenţilor fizici şi / sau chimici pentru a îndepărta murdăria
(materie organică şi anorganică) de pe suprafeţe (inclusiv tegument) sau obiecte, prin procedee
mecanice sau manuale, pregătind astfel suprafeţele sau obiectele pentru utilizare în siguranţă
sau, pentru trecerea la o altă etapă de decontaminare.
Detergentul este un produs sintetic pentru curăţare. Detergenţii pot fi anionici, cationici,
amfoterici şi neionici. Nu prezintă acţiune antimicrobiană.
Detergentul enzimatic este un produs sintetic pentru curăţare care conţine o enzimă.
Echipamentul de protecţie este un echipament special (îmbrăcăminte, mănuşi, ochelari etc)
purtat de personalul care manipulează produse dezinfectante şi realizează dezinfecţia. Enzima
este o proteină care descompune murdăria într-o formă care poate fi uşor îndepărtată de
produsul de curăţare. Are rol de catalizator pentru reacţie, mărind puterea de curăţare a
produsului. De exemplu: amilaza acţionează asupra urmelor de amidon; lipaza acţionează
asupra urmelor de grăsimi şi uleiuri; proteaza acţionează asupra materiei proteice.
Produsul de curăţare este un agent chimic care îndepărtează murdăria (materie organică
şi/sau anorganică) de pe suprafeţe sau obiecte, care nu prezintă activitate antimicrobiană
(bactericidă, virucidă, fungicidă sau sporicidă) şi care nu reduce nivelul de contaminare
microbiană.
Spălarea mâinilor este procedura prin care se elimină murdăria şi se reduce flora
tranzitorie prin acţiune mecanică, utilizând apă şi săpun.
Dezinfecţia reprezintă distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori şi a sporilor) din
anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafeţe. Se realizează cu ajutorul unor agenţi fizici
sau cu ajutorul substanţelor dezinfectante.
Dezinfecţia igienică a mâinilor, prin spălare, reprezintă utilizarea unui produs cu acţiune
directă asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia, fără a acţiona asupra
florei rezidente.
Dezinfecţia chirurgicală a mâinilor, prin spălare, reprezintă utilizarea unui produs cu
acţiune directă asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia şi cu acţiune
asupra florei rezidente.
Produsul pentru dezinfecţie de nivel scăzut este un agent chimic care distruge bacteriile
vegetative, unii fungi (ex. Candida albicans), virusurile capsulate şi virusurile mari
necapsulate.
Produsul pentru dezinfecţie de nivel intermediar este un agent chimic care distruge
bacteriile vegetative, fungii, virusurile capsulate, virusurile necapsulate şi mycobacteriile.
Produsul pentru dezinfecţie de nivel înalt este un agent chimic care, în condiţii bine definite
de timp şi temperatură, distruge microorganismele, are acţiune sporicidă şi potenţial de
sterilizant chimic.
Sterilizantul chimic este un agent chimic (nu în formă gazoasă), utilizat pentru sterilizarea
dispozitivelor medicale „critice”, care nu se pot steriliza prin metode fizice. Un sterilizant
chimic distruge toate categoriile şi formele viabile de microorganisme, nivelul de supravieţuire
al acestora fiind mai mic sau egal cu 10 -6(probabilitatea prezenţei unui singur microorganism
viu pe un dispozitiv medical sterilizat este egală sau mai mică cu 1/1.000.000).
Termenul de valabilitate reprezintă perioada de timp în care un produs dezinfectant este
eficient, din punct de vedere al concentraţiei substanţei active şi eficacităţii antimicrobiene.
Timpul de contact (timp de acţiune) reprezintă perioada de timp în care produsul dezinfectant
este în contact direct cu suprafaţa sau obiectul care trebuie dezinfectat. Perioada de timp în
care produsul antiseptic este în contact direct cu ţesuturile vii.
Sterilizarea reprezintă distrugerea sau îndepărtarea tuturor microorganismelor patogene
sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafaţă sau dintr-un mediu (lichid sau
solid). Toate materialele utilizate în laboratorul de microbiologie trebuie să fie sterile înainte
de utilizare. Există o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel încât şi
metodele de sterilizare sunt destul de variate, după cum urmează:
- Metode de sterilizare prin căldură (căldura uscată sau căldura
umedă); - Metode de sterilizare prin filtrare;
- Metode de sterilizare utilizând radiaţiile, dar şi
- Metode chimice de sterilizare.
Metodele de sterilizare care utilizează radiaţiile (cu excepţia radiaţiilor ultraviolete) şi
metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilenă) sunt utilizate rareori în laboratorul de
microbiologie.
Sterilizarea va fi întotdeauna precedată de pregătirea materialului care urmează să fie
sterilizat, respectiv: spălare, uscare, ambalare (în cazul materialelor curate, necontaminate)
urmat de autoclavare, spălare, uscare, ambalare (în cazul materialelor contaminate refolosibile).
Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc. trebuie curăţate perfect,
de ex. prin spălare cu ajutorul unor detergenţi. Dacă aceste materiale au fost contaminate cu
sânge, înainte de spălare se vor dezinfecta. Sticlăria de laborator este colectată în recipiente
speciale şi se sterilizează prin autoclavare; pipetele vor fi menţinute în amestec dezinfectant
până a doua zi. Instrumentarul metalic, seringile şi acele (deşi este necesară utilizarea pe scară
largă a seringilor şi acelor de unică întrebuinţare) contaminate se vor introduce în baie de
amoniac 1% timp de 15-30 minute, se vor peria în soluţie de 1-2% detergent cationic şi se vor
spăla cu jet de apă pentru îndepărtarea substanţelor chimice.
Există o serie de metode pentru a controla eficienţa sterilizării, prin indicatorii fizici (ex.
termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus
stearotermophilus din genul Geobacillus). Pentru verificarea eficacităţii sterilizării cu ajutorul
radiaţiilor, pot fi utilizaţi spori de Bacillus pumilus, din genul Bacillus).

4. 2. Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici, chimici sau biologici

Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici, chimici sau biologici se pot traduce în principiu
prin: distrugerea microorganismelor (efect bactericid) şi respectiv inhibarea reversibilă a
multiplicării microorganismelor (efect bacteriostatic).
4. 2. 1. Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici
4. 2. 1. 1. Influenţa temperaturii ridicate asupra microorganismelor
În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi mezofile (temperatură optimă 30-
37ºC), psichrofile (temperatură optimă în jur de 20ºC) şi termofile (temperatură optimă 50-
60ºC). Prin acţiunea căldurii procesele chimice şi fizice sunt mult accelerate; distrugerea se
produce prin ruperea legăturilor intramoleculare, mai ales a punţilor de hidrogen care menţin
proteinele şi alte macromolecule în stare nativă; ca urmare se denaturează protoplasma.
Sterilizarea prin căldură:
a). Sterilizarea prin căldură uscată are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor
bacteriene. Amintim câteva dintre variantele tehnice:
a1. Sterilizarea prin încălzire la incandescenţă („la roşu”) reprezintă introducerea şi
menţinerea în flacăra becului Bunsen până la înroşire, pe toată lungimea, a obiectului care
urmează a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologică (cu buclă sau fir) sau pentru
spatulă.
Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de câteva ori) a unui obiect, fără a se atinge
temperatura de incandescenţă. Flambarea se aplică pentru portansă, gâtul unui recipient de
sticlă (tub, eprubetă, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur şi nu reprezintă
sterilizare.
a2. Sterilizarea cu aer cald se realizează în etuvă (pupinel, cuptor Pasteur). Etuva este o
cutie metalică cu pereţi dubli. Cu ajutorul unor rezistenţe electrice şi a unui termostat se obţine
şi menţine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii în interiorul aparatului
este realizată cu ajutorul unui sistem de ventilaţie.
Pentru majoritatea materialelor care urmează a fi sterilizate, temperatura din etuvă trebuie
să atingă 180ºC, pentru o durată de 1 oră. În unele situaţii timpul de sterilizare poate depăşi 60
de minute (ex. pentru ambalaje de dimensiuni mari).
Sterilizarea cu aer cald este indicată pentru obiecte de sticlă, obiecte de porţelan, pulberi
inerte şi termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic
este de menţionat faptul că repetarea sterilizării, în timp, conduce la decălirea oţelului) etc. Nu
se vor steriliza în etuvă soluţiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vată,
bumbac, fibră sintetică, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator.
a3. Incinerarea reprezintă arderea până la obţinerea de cenuşă. Există anumite reguli stricte
privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. În cazul spitalelor, în România
au existat astfel de incineratoare în structura unităţii sanitare respective. Odată cu procesul de
aderare la Uniunea Europeană şi respectiv necesitatea aplicării unor reguli impuse pentru toate
ţările membre, majoritatea incineratoarelor de spital au fost închise. Modul în care s-a realizat
în perioada 2003-2004 negocierea privind stoparea activităţii
acestor incineratoare nu a ţinut cont de situaţia reală din ţara noastră. În lipsa unui incinerator
propriu, unitatea sanitară trebuie să încheie un contract de prestări servicii cu o firmă de profil.
Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse incinerării materiale
de unică folosinţă din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de
experienţă etc.
b). Sterilizarea prin căldură umedă este cea mai eficientă metodă de sterilizare şi are ca
mecanism coagularea proteinelor şi degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite
substanţe în soluţie, sticlărie (cu excepţia pipetelor şi lamelor), instrumentar chirurgical
(metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultură, aparate de filtrat etc.
b1. Autoclavarea este esenţială atât pentru laboratoarele de microbiologie cât şi pentru
unităţile sanitare în general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de apă realizează
la 0,5 atmosfere o temperatură de 115ºC, la 1 atmosferă o temperatură de 121ºC şi respectiv
134ºC la 2 atmosfere.
Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereţi metalici, care se închide etanş cu un
capac prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul căruia, vaporii de apă sunt
comprimaţi la presiunea necesară în vederea sterilizării. Există mai multe tipuri de autoclave:
- autoclave cu perete simplu
verticale
orizontale
- autoclave cu manta de aburi
verticale
orizontale.
În continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu,
vertical, la care vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune şi ajung în camera de
sterilizare de jos în sus. Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de un manometru.
Pentru punerea în funcţiune a autoclavului, în dotare există 2 robinete: unul superior (robinetul
de aer şi vapori, care permite legătura între cazan şi mediul exterior) şi unul inferior (robinetul
care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele există o supapă de siguranţă
care se deschide şi permite evacuarea vaporilor atunci când, accidental, presiunea vaporilor
depăşeşte limita de siguranţă. În momentul de faţă pentru evitarea riscului de a veni în contact
cu vapori de apă fierbinţi aflaţi sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu
permite deschiderea capacului până când presiunea din interior nu o egalizează pe cea din
exterior. Cazanul de presiune este inclus într-un perete exterior solid care la partea inferioară
are un spaţiu în care se află sursa de căldură.
În partea inferioară a cazanului de presiune se află un suport pe care se aşează o placă de
metal perforată. Pe suport se aşează materialele care trebuie sterilizate iar faptul că placa este
perforată permite trecerea vaporilor de apă produşi după încălzirea apei. În vederea sterilizării
se procedează astfel:
- verificăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului, care trebuie să fie până la o
distanţă de 2-3 centimetri de suport; dacă nivelul a scăzut, se completează (recomandabil
se va utiliza apă distilată);
 - aşezăm pe suport obiectele şi materialele de sterilizat, ambalate corespunzător; -
închidem etanş capacul, folosind sistemul special de etanşeizare cu care este dotat
autoclavul pe care îl avem la dispoziţie;
- conectăm sursa de căldură;
- deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne aer în cazanul
cu presiune eficienţa sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă fiind mai uşori, vor
încălzi în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul, care va atinge temperaturi
inferioare, fiind mai greu, va rămâne în partea inferioară a cazanului) ;
- închidem robinetul după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu de vapori; -
presiunea din cazan începe să crească şi este urmărită cu ajutorul manometrului; atunci
când presiunea atinge valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm sursa de căldură în aşa
fel încât această presiune să fie menţinută pentru toată durata sterilizării (de ex. 30
minute) ;
- după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm autoclavul să se
răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice; -
deschidem lent robinetul de vapori;
- deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului;
- lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis;
- atunci când temperatura ajunge la circa 80ºC putem scoate materialele sterilizate. b2.
Tindalizarea (sterilizarea fracţionată) este o metodă de sterilizare prin căldură umedă care
evită depăşirea unei temperaturi de 100ºC. Substanţele de sterilizat se menţin la 56- 100ºC
timp de 30-60 minute, 3 până la 8 zile succesiv. Astfel, utilizând medii care permit
germinarea, după prima încălzire timp de 30-60 minute sunt distruse formele vegetative iar
după răcire are loc germinarea sporilor. În ziua următoare sunt distruse prin încălzire formele
vegetative rezultate din germinarea sporilor iar după răcire are loc germinarea sporilor care
nu au germinat în prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la care se
va menţine permanent deschis robinetul de vapori (şi astfel nu se va depăşi în interior
temperatura de 100ºC), băi de apă sau băi de nisip. Prin tindalizare se pot steriliza alimente,
unele medii de cultură etc.
b3-4. Pasteurizarea şi fierberea nu reprezintă metode de sterilizare, dar sunt utilizate în
anumite situaţii. Pasteurizarea foloseşte căldura umedă şi are aplicaţii în conservarea pentru
scurtă durată a unor alimente (lapte, bere etc). Există o pasteurizare joasă (30 minute la 56-
65ºC), o pasteurizare medie (15 minute la 65-75ºC) şi o pasteurizare înaltă (2-5 minute la 85-
90ºC). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile în formă vegetativă dar nu şi sporii.
Fierberea poate fi utilizată atunci când nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare.
Fierberea timp de 30 minute distruge bacteriile în formă vegetativă, fungii şi virusurile, dar
nu şi sporii bacterieni. Timpul se înregistrează după ce apa a început să fiarbă. Eficienţa
acestei metode poate fi crescută prin adăugarea de carbonat de sodiu 1-2%. 4. 2. 1. 2.
Influenţa temperaturii scăzute asupra microorganismelor
Temperaturile joase (în jur de 0-4ºC) au în general un efect bacteriostatic. La
temperaturi scăzute, reacţiile biochimice încetinesc, multiplicarea este stopată. Majoritatea
produselor patologice pot fi transportate (menţinând viabilitatea germenilor şi încetinind în
acelaşi timp multiplicarea acestora) la o temperatură de circa 4ºC. O serie de culturi pot fi de
asemenea menţinute la temperatura frigiderului pentru o durată limitată de timp în vederea
prezervării şi posibilităţii de a repeta anumite teste de identificare etc.
În funcţie de viteza cu care are loc răcirea, întâlnim situaţii diferite, cu următoarele
posibile efecte asupra structurilor celulare bacteriene.
a). Congelarea lentă, la temperaturi mai mici -21,3ºC are efecte bactericide prin formarea
de cristale de gheaţă şi prin hiperconcentrarea salină cu denaturarea proteinelor; b).
Congelarea bruscă la -70ºC are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea în masă a
apei fără apariţia cristalelor de gheaţă;
c). Liofilizarea (criodesicarea) reprezintă congelarea bruscă concomitent cu desicaţia
(deshidratarea în vid). O suspensie microbiană în mediu protector, liofilizată, poate fi păstrată
în fiole închise timp îndelungat (de exemplu vaccinul BCG).

4. 2. 1. 3. Filtrarea
Microorganismele pot fi reţinute mecanic şi electrostatic în porii unui filtru. Trecerea unui
lichid printr-o substanţă prevăzută cu pori care va reţine microorganismele din lichidul
respectiv poartă numele de sterilizare prin filtrare.
De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porţelan, sticlă poroasă, azbest
impregnat cu caolin, pământ de infuzori). Actualmente se folosesc din ce în ce mai frecvent
membrane filtrante din acetat de celuloză cu porozităţi între 8 şi 0,025 μm. În vederea filtrării
sunt necesare o serie de piese precum: un recipient în care se introduce
lichidul care urmează a fi filtrat, un recipient în care se va colecta lichidul sterilizat, o pâlnie
care se montează etanş între cele 2 recipiente, o pompă de vid care va aspira lichidul din primul
în al doilea recipient, prin membrana filtrantă. Toate aceste piese sunt sterilizate prin
autoclavare înainte de începerea filtrării.
Există şi alte variante tehnice. Cu o importanţă practică particulară ar fi de menţionat filtrele
pentru sterilizarea aerului din cabinetele de siguranţă biologică (clasa II şi clasa III), filtrele
HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters).
Sterilizarea prin filtrare este utilizată pentru decontaminarea aerului, a unor medii de cultură
(care nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile
atinse în cazul sterilizării prin căldură etc.
4. 2. 1. 4. Radiaţiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) au efecte bactericide prin
ruperea legăturilor de hidrogen, oxidarea legăturilor duble etc. Radiaţiile UV sunt utile în
sterilizarea suprafeţelor de lucru (pentru repartizarea mediilor de cultură, alte manevre aseptice
etc) în cazul în care nu există cabinete de siguranţă biologică cu flux laminar dar şi atunci când
avem la dispoziţie astfel de cabinete de siguranţă biologică şi dorim să sterilizăm incinta în
care am prelucrat spre ex. produse în care există Mycobacterium tuberculosis. Lămpile cu UV
sunt numite lămpi germicide. Astfel de lămpi sunt plasate de ex. şi în instituţiile sanitare în care
sunt internaţi pacienţi cu tuberculoză. Radiaţiile ionizante se pot utiliza în sterilizări industriale
(pentru alimente, medicamente, seringi de unică întrebuinţare etc).
4. 2. 1. 5. Ultrasunetele au efecte bactericide prin acţiune mecanică, mişcare activă a
conţinutului celular, formare în mediul extern de bule mici de gaze dizolvate care se mişcă
energic şi se izbesc de membrană (fenomenul de cavitaţie) şi creşterea temperaturii la 50-
80ºC. Sporii rezistă acestor efecte.
 4. 2. 1. 6. Presiunea osmotică
Plasmoliza (pierderea apei, deshidratarea) în medii hipertone are efecte letale asupra unor
bacterii. În medii hipotone are loc acumularea de apă în celula bacteriană; aceasta devine
turgescentă şi peretele bacterian cedează.
4. 2. 2. Efectele antimicrobiene ale factorilor chimici
Există o serie de substanţe chimice necesare creşterii şi multiplicării bacteriene. Alte
substanţe chimice (antibioticele şi chimioterapicele) au efect bactericid sau bacteriostatic
selectiv.
Antisepticele şi dezinfectantele sunt substanţe cu acţiune antimicrobiană neselectivă,
alterând structuri şi funcţii comune microorganismelor şi organismelor superioare.
Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente şi mucoase, dezinfectantele pot fi utilizate numai
pe suprafeţe şi structuri care nu sunt vii.
O parte dintre dezinfectante au efect sterilizant. Aşa cum am menţionat anterior, trebuie să
existe o etapă de pregătire a materialelor în vederea sterilizării. Materialele de laborator,
instrumentarul, materialele chirurgicale etc, trebuie curăţate perfect, de ex. prin spălare cu
ajutorul unor detergenţi. Dacă aceste materiale au fost contaminate cu sânge, înainte de spălare
se vor dezinfecta.
Substanţele antiseptice şi dezinfectante se pot clasifica în funcţie de mecanismul de
acţiune, după cum urmează:
a). Substanţe care denaturează proteinele (au în general efect bactericid): acizii, bazele,
alcoolii (de exemplu alcoolul etilic de 70º, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor). b).
Substanţe care oxidează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH):
hipermanganatul de potasiu 1‰, util în antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen,
soluţie 3% în apă, utilizat în antiseptizarea plăgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) şi derivaţii lor
(hipocloriţi, cloramine, soluţii iodurate etc) în concentraţii corespunzătoare etc. c). Substanţe
care blochează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale grele
[sărurile de mercur, preparatele organomercuriale (exemplu merthiolat de sodiu), sărurile de
argint, compuşi de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide],
grupările alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei, oxidului de etilen etc. d). Substanţe care
lezează membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizări limitate datorită proprietăţilor
caustice şi toxicităţii sale; este etalonul faţă de care se măsoară activitatea antimicrobiană a
antisepticelor şi dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu
efecte toxice mai reduse) etc], detergenţii [anionici (săpunuri, perlan etc), cationici (săruri
cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul
dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul)]. e). Substanţe care alterează
acizii nucleici: coloranţii bazici (violet de genţiană, albastru de metilen, fucsină bazică etc),
derivaţii de acridină, de exemplu rivanolul. Dintre exemplele prezentate mai sus, alcoolul
etilic de 70º, diferiţi derivaţi halogenaţi, hipermanganatul de potasiu 1‰, peroxidul de
hidrogen, rivanolul, sunt exemple de substanţe antiseptice. Dorim să menţionăm şi să
subliniem că atât în cazul antisepticelor cât şi în cazul dezinfectantelor este important ca
substanţa utilizată să aibă concentraţia corespunzătoare,
să fie aplicată pentru o durată de timp corespunzătoare, să se afle în termenul de garanţie.
Aceeaşi substanţă chimică (de ex. cloramina) poate intra în categoria antisepticelor sau în
categoria dezinfectantelor, în funcţie de concentraţie (concentraţia este mai mare în al doilea
caz).
În continuare vom prezenta pe scurt câteva exemple de substanţe dezinfectante. Dorim să
menţionăm faptul că, până în prezent, nu există nici un dezinfectant ideal. Există numeroase
substanţe şi numeroşi producători de antiseptice şi dezinfectante.
Hipocloriţii:
- soluţiile de hipoclorit se prepară periodic (se inactivează după mai mult de 24 ore), -
concentraţia în clor activ este diferită în funcţie de scopul urmărit (ex. 2.500 ppm clor activ
pentru dezinfectarea pipetelor contaminate);
- au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, sporilor bacterieni, fungilor
(100 ppm în o oră), virusurilor (200 ppm în 10 minute);
- efectul este diminuat considerabil în prezenţa substanţelor organice (în special proteine),
maselor plastice, detergenţilor.
Derivaţii fenolici:
- datorită toxicităţii, potenţialului carcinogenetic şi corozivităţii, fenolii nu se folosesc ca
atare, ci sub forma derivaţilor fenolici;
- soluţiile fenolice se prepară periodic (după cel mult 24 ore);
- concentraţia poate fi diferită în funcţie de scopul urmărit (de obicei este de 2-5%); - au efect
dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, fungilor, unor virusuri (ex. HIV este
inactivat de soluţia 0,5%);
- efectul este diminuat pe suprafeţele de cauciuc, lemn sau material plastic.
Glutaraldehida:
- cel mai frecvent este utilizată concentraţia de 2%, la un pH alcalin;
- are efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă (în cazul mycobacteriilor este
necesar un timp mai lung de expunere), fungilor, virusurilor;
- datorită faptului că nu corodează metalele (aşa cum se întâmplă în cazul substanţelor
prezentate mai sus) se poate folosi şi la dezinfectarea suprafeţelor metalice; - nu poate fi
folosită pentru suprafeţe, datorită vaporilor iritanţi şi timpului mare de expunere; ideală
pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o perioada mai mare de
timp în containere menţinute închise.
Iodoforii:
- sunt substanţe care complexează iodul pe care îl eliberează în soluţii apoase;
- au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, unor spori bacterieni, fungilor,
unor virusuri (ex. virusuri cu înveliş lipidic);
- sunt inactivaţi de substanţe organice (în special proteice), mase plastice, detergenţi; -
pot fi utilizaţi pentru dezinfecţia suprafeţelor, dezinfecţia pipetelor contaminate.
Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH2O):
- exercită activităţi bactericide prin alkilarea acizilor nucleici şi prin înlocuirea hidrogenului
labil printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH2OH);
- sporii de Bacillus subtilis nu sunt distruşi;
- acest tip de sterilizare se utilizează pentru materiale care nu rezistă atunci când sunt supuse
 acţiunii temperaturii sau radiaţiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament
electronic etc.);
- etilenoxidul poate exploda; variantele pentru evitarea exploziei includ: 1. utilizarea
etilenoxidului în camere speciale care permit menţinerea unei presiuni negative 2.
combinarea cu CO2 în camere de oţel speciale 3. combinarea cu hidrocarburi fluorinate;
- indiferent de varianta folosită trebuie respectate toate recomandările producătorului; - există
o serie de inconveniente în ceea ce priveşte acest tip de sterilizare (efecte carcinogenetice,
efecte la nivelul sistemului nervos etc.);
- sterilizarea este în principiu influenţată de: concentraţia etilenoxidului, temperatură,
umiditatea relativă şi timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraţiei va reduce la
jumătate timpul necesar pentru sterilizare).
4. 2. 3. Produsele biocide
Directiva 98/8/CE defineşte produsele biocide după cum urmează: „Substanţe active şi
preparatele conţinând una sau mai multe substanţe active, condiţionate într-o formă în care sunt
furnizate utilizatorului, având scopul să distrugă, să împiedice, să facă inofensivă şi să prevină
acţiunea, sau să exercite un alt efect de control asupra oricărui organism dăunător, prin mijloace
chimice sau biologice”.
Din categoria produselor biocide sunt excluse produsele de curăţenie, detergenţii sub
formă de pulbere sau lichidă şi alte produse similare, ce nu sunt destinate a avea efect biocid.
Produsele biocide includ:
- produsele utilizate pentru dezinfecţia suprafeţelor mari inerte, a aerului, a
echipamentului medical, a mobilierului, sau pentru dezinfecţia şi curăţarea acestora; -
produsele pentru dezinfecţia / sterilizarea instrumentarului, endoscoapelor, ş.a., prin imersie;
- produsele dezinfectante / antiseptice pentru tegumente, săpunurile dezinfectante,
săpunurile antiseptice, săpunurile antibacteriene / antimicrobiene, gelurile de curăţare
antibacteriene / antimicrobiene, soluţiile de curăţare antibacteriene / antimicrobiene (după cum
sunt denumite de producător);
- produsele dezinfectante/antiseptice pentru mucoase, ex. pentru igiena orală,
ş.a.; - şerveţele umede dezinfectante,
- detergenţii şi produsele de curăţare care au activitate biocidă dovedită (distrug sau inhibă
multiplicarea bacteriilor, fungilor sau a altor microorganisme).
În această categorie ar putea intra şi substanţele sintetizate de Bacillus thuringiensis din
genul Bacillus, cu efect biopesticid.
4. 2. 4. Efectele antimicrobiene ale factorilor biologici
4. 2. 4. 1. Interrelaţiile microbiene în cadrul nişelor ecologice proprii
În natură microorganismele nu se dezvoltă izolat. Relaţiile pot fi de comensualism,
simbioză sau antagonism, noţiuni care vor fi prezentate ulterior.
În cadrul relaţiilor de antagonism, acesta se poate datora vitalităţii mai mari a speciilor
antagoniste sau elaborării de către specia antagonistă a unor substanţe nocive pentru speciile
concurente. Aceste substanţe pot avea (ex. antibioticele şi bacteriocinele) sau nu (ex. acidifierea
mediului) acţiune selectivă.

4. 2. 4. 2. Bacteriofagul
 Bacteriofagii sunt virusuri care parazitează bacteriile (de exemplu, bacteriofagii T1-T7 cu
specificitate pentru E. coli). Bacteriofagii (fagii) au fost descoperiţi în 1915. Prof. Mihai Ciucă
obţine în anul 1921 primele tulpini lizogene. În 1949 se înfiinţează în România un Centru
naţional pentru bacteriofagi. Fagii au o structură mai complexă decât cea a virusurilor obişnuite.
Se descriu:
1. capul fagului are formă de prismă hexagonală bipiramidală. Conţine ADN dublu catenar
helicoidal sau ARN înconjurat de capsida formată din capsomere (înveliş proteic); fagii ARN
pot avea un număr mic de gene (ex. 3) în timp ce fagii ADN pot avea până la 150 gene;
2. coada fagului are structură proteică, simetrie helicoidală; are rol de adsorbţie, ajutând
fagul să penetreze bacteria. Se descriu următoarele formaţiuni:
- cilindrul axial;
- teaca cozii;
- placa bazală (cu croşetele de fixare);
- fibrele cozii (formând un strat în jurul tecii cozii).
Toate proteinele fagice pot conduce la apariţia de anticorpi, descoperire utilizată în
studierea înrudirii dintre diferiţi bacteriofagi.
Relaţii bacteriofag-bacterie
Între bacteriofag şi bacteria gazdă se pot stabili două tipuri de relaţii:
- de tip litic sau productiv;
- de lizogenizare sau de tip reductiv.
Relaţiile sunt strict specifice şi sunt mediate de receptori.

Ciclul litic are mai multe etape şi anume:

1. Adsorbţia: Ataşarea este specifică. Există receptori strict specifici la nivelul
bacteriofagului, ce recunosc receptori de la nivelul bacteriei. Fixarea pe receptori este iniţial
reversibilă (prin fibrele cozii), apoi ireversibilă (prin croşetele plăcii bazale). Adsorbţia fagică
modifică permeabilitatea membranei citoplasmatice bacteriene.
2. Penetrarea: Fagul eliberează muramidaza care lizează mureina din peretele bacterian.
Teaca cozii se contractă şi antrenează cilindrul axial prin peretele bacterian, ducând apoi la
injectarea ADN-ului fagic în citoplasma bacteriană;
3. Multiplicarea: După aproximativ 4-5 minute, funcţia ADN-ului bacterian este blocată şi
preluată de ADN-ul fagic ce coordonează sinteza componentelor proprii. Se sintetizează un
număr însemnat de proteine virale.
4. Maturarea (ansamblarea) fagului
5. Liza bacteriei (ex. datorită sintezei unor enzime asemănătoare lizozimului) şi eliberarea
bacteriofagului matur, virulent.

Bacteriile lizosensibile permit adsorbţia, penetrarea şi multiplicarea fagilor virulenţi până

la realizarea lizei celulei bacteriene.

Evidenţierea ciclului litic la nivelul culturilor bacteriene

 - în mediu lichid (tulbure), inocularea fagului litic corespunzător duce după câteva zeci de
minute (uneori chiar şi câteva zile) la limpezirea mediului;
- pe mediu solid, însămânţat uniform, inocularea fagului litic duce la apariţia unei zone de
liză, clară, bine circumscrisă (spotul de bacteriofagie), metodă utilizată în lizotipie; - dacă se
amestecă o suspensie de fagi cu o picătură de cultură (pură) bacteriană, iar tulpina respectivă
are receptori potriviţi bacteriofagilor, iar această suspensie se amestecă cu geloză încălzită
putem transfera suspensia într-o placă Petri; bacteriofagii infectează
bacteriile; după circa 30 minute bacteriile sunt lizate şi eliberează fagii; aceştia difuzează prin
geloză şi infectează bacteriile situate în apropiere şi ciclul se reia; o parte dintre bacterii (cele
care nu au receptori potriviţi) nu sunt infectate şi în timp se multiplică iar cultura bacteriană
opacizează mediul; după circa 18-24 de ore putem observa arii cu celule lizate (transparente)
pe un fond produs de cultura bacteriană (bacterii nelizate), aceste arii numindu-se plaje de
bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii virulenţi sunt clare, în comparaţie cu plajele mai
puţin clare produse de bacteriofagii temperaţi (fagii virulenţi sunt acei bacteriofagi care nu pot
evolua decât în ciclul litic)
Ciclul reductiv (de lizogenizare) are aceleaşi etape, iniţial.
După adsorbţie şi penetrare, ADN-ul fagic:
- fie se integrează liniar în cromozomul bacteriei gazdă şi se replică sincron cu aceasta, -
fie se circularizează şi ataşat de membrana citoplasmatică se replică sincron cu diviziunea
bacteriei.
Bacteria a devenit lizogenă, se reproduce şi transmite descendenţilor fagul latent (profag,
fag temperat). În anumite condiţii profagul poate deveni fag virulent. Fagul temperat cel mai
bine studiat este bacteriofagul Lambda specific pentru E. coli capsulat (K12).

Proprietăţile bacteriei lizogene

1. este imună faţă de un fag omolog profagului;
2. pot apărea fenomene importante din punct de vedere genetic:
- transducţia;
- conversia genetică (cu producerea de exotoxine de către unele bacterii lizogenizate, cum
ar fi toxina difterică, toxina scarlatinoasă, toxina botulinică de tip C etc); - recombinarea
genetică (atunci când o bacterie parazitată de doi fagi diferiţi, dar înrudiţi, eliberează la
sfârşitul ciclului litic pe lângă tipurile parentale şi tipuri de fagi care însumează unele din
proprietăţile celor doi fagi parentali) etc.;
- inducţia fagică (sub influenţa unor agenţi inductori, de ex. raze UV, sau spontan,
profagul îşi recâştigă virulenţa, devine fag virulent, şi produce liza bacteriei respective).
Bacteriile lizorezistente nu permit infecţia cu un fag fie datorită lipsei receptorilor specifici,
fie datorită unei stări de imunitate. Bacteriile lizogene sunt imune la fagii virulenţi omologi
profagului găzduit.
Fagul defectiv reprezintă profagul care persistă indefinit în stare latentă (nu se
reactivează).

Aplicaţii practice ale fenomenului de bacteriofagie:

- fagii virulenţi sunt un element de echilibru ecologic în mediul natural de viaţă al
bacteriilor (în nişa ecologică respectivă);
- fagii temperaţi pot avea un rol deosebit în reasortarea materialului genetic al bacteriilor,
întrucât atunci când se detaşează (inducţie) de cromozomul bacterian pot antrena porţiuni din
ADN-ul bacterian;
- fagii se pot folosi pentru a descoperi gradul de poluare a apelor (datorită specificităţii
relaţiei fag-bacterie);
- anumite mutante ale fagilor se folosesc în ingineria genetică drept vectori ai ADN
recombinant (ex. fagii Charon Lambda);
- fagii reprezintă un model pentru studii teoretice şi practice privind virusurile şi
oncogeneza, precum şi alte aspecte ale biologiei moleculare;
- s-au evidenţiat tipuri fagice (lizotipuri) pentru tulpini bacteriene care biochimic şi
antigenic par identice. Lizotipia (stabilirea sensibilităţii la un anumit tip fagic) este una dintre
cele mai fine metode de diagnostic bacteriologic şi epidemiologic, pentru identificarea
lanţurilor de transmisie a germenilor şi pentru determinarea originii unei epidemii.

4. 3. Povestiri adevărate

4. 3. 1. Epidemia de holeră din Peru - Legendă urbană

În 1991, în Peru, a izbucnit o epidemie de holeră. Boala nu este foarte frecventă pe
continentul american, motiv pentru care iniţial a fost dificilă stabilirea cauzelor. Situaţia a
apărut oarecum în paralel cu o dezbatere publică ce avea loc în SUA cu privire la raportul risc
/ beneficii adus de clorinarea apei. Dintre „istoriile adevărate” aceasta ca şi istoria epidemiei
de difterie în fostele state sovietice arată cât de mult poate fi influenţată sănătatea publică de
către dezbateri, de către mass-media etc (de multe ori în mod negativ). Este cunoscut faptul că
prin clorinarea apei, pe lângă efectul de distrugere a unor microorganisme ar putea să apară şi
fenomene nedorite, datorită apariţiei unor produşi de tipul trihalometanului. În USA se
discută foarte mult despre efectul cancerigen al acestei substanţe.
Diverşi oficiali americani, având se pare relaţii în industria chimică, şi care doreau ca
metoda clorinării să rămână cea mai importantă metodă de antiseptizare a apei, au folosit multă
vreme exemplul acestei epidemii pentru a demonstra ce se poate petrece dacă clorinarea apei
va fi stopată. Pornind de la date reale (epidemia de holeră) dezbaterile au ajuns să prezinte o
situaţie foarte diferită (numeric) ajungându-se să se discute de 1,3 milioane de cazuri de holeră
soldate cu peste 11.000 de decese. În aceste dezbateri s-a afirmat
că pentru a preveni apariţia unui număr foarte mic de cancere (ipotetice) s-a precipitat apariţia
unui număr extrem de mare de cazuri de holeră şi respectiv a unui enorm număr de decese
datorate infecţiei cu Vibrio cholerae.
A fost criticată şi aşa-zisa „Teorie a precauţiei”, principial corectă, bazată pe următoarele
idei generice: a. stabileşte un ţel în cadrul unui proces decizional deschis, care să se adreseze
tuturor celor implicaţi; b. analizează toate modalităţile de a realiza ceea ce îţi propui şi alege
varianta care va conduce la cele mai puţine efecte nedorite; c. dacă nu eşti sigur de calea pe
care vrei să o urmezi, asigură-te că o alegi pe aceea care creează cele mai mici probleme
mediului, sănătăţii publice, comunităţii în general; d. monitorizează rezultatele şi asigură-te că
iei măsuri rapide de remediere, în cazul în care ar apărea o problemă şi e. consultă-te în
permanenţă cu cei asupra cărora vor avea un efect măsurile pe care le-ai stabilit.
 Totuşi, nu aplicarea greşită a teoriei a fost cea care a provocat epidemia de holeră. În final,
reprezentanţi oficiali din Peru au afirmat că au decis să aplice clorinarea intermitent şi nu
continuu din motive economice (preţ prea mare pentru clorinarea continuă) şi nu au fost
influenţaţi de „teoria precauţiei”; nu au luat în calcul riscul apariţiei cancerului. Investigaţia
epidemiologică realizată împreună cu colegii de la CDC a demonstrat că epidemia de holeră a
avut o cauzalitate multiplă, factorii cei mai importanţi fiind reprezentaţi de: a. clorinarea
intermitentă a apei; b. diferite branşamente ilegale sau amatoristic făcute la linia de
aprovizionare cu apă a oraşului; c. conectarea instalaţiilor ilegale de irigaţie la liniile de
aprovizionare cu apă potabilă; d. perioade lungi în care apa a avut o presiune scăzută sau nu a
existat presiune deloc, situaţii în care colonizarea şi multiplicarea bacteriană este favorizată;
e. depozitarea apei potabile în butoaie, în condiţii neigienice sau „la limită” şi f. lipsa unor
canalizări construite corespunzător, care au permis refularea apei din zonele poluate în
reţeaua de apă potabilă etc.
Cu toate că la baza acestei epidemii au stat mai mulţi factori, cel mai important dintre
aceştia a fost lipsa clorinării (antiseptizării) corespunzătoare a apei potabile. Datele reale cu
privire la această epidemie sunt prezentate succint la punctul 44. 8. 2. 4. 3. 2. Epidemia de
holeră din Dhaka - bacteriofagii
Holera se transmite cel mai frecvent prin consumul de apă contaminată cu tulpini de Vibrio
cholerae, în special în zonele cu educaţie sanitară precară. Datele epidemiologice şi de mediu
obţinute în urma unei izbucnirii epidemice („outbreak”) de holeră în Bangladesh, au sugerat
rolul bacteriofagului litic specific pentru V. cholerae, care ar putea limita gradul de severitate
al epidemiei prin efectul de distrugere a bacteriilor prezente în sursele de apă contaminată, sau
chiar şi în cazul unor persoane infectate.
Au fost emise două ipoteze privind rolul potenţial al bacteriofagilor specifici: a. în cadrul
relaţiei bacterie-bacteriofag, bacteriofagii lizează un număr mare de bacterii, ulterior densitatea
bacteriofagilor scade şi la un moment dat bacteriile se pot multiplica exponenţial şi densitatea
bacteriană atinge nivelul la care pot determina o izbucnire epidemică (severitatea izbucnirii
epidemice va fi cu atât mai mare cu cât densitatea bacteriofagilor rămaşi în sursele de apă
contaminate este mai mică); b. dacă izbucnirea epidemică este datorată multiplicării bacteriene,
necorelat cu diminuarea densităţii fagice, introducerea bacteriofagilor în sursele de apă ar putea
reduce amploarea izbucnirii epidemice şi ar putea duce chiar şi la declinul acesteia.
În ambele situaţii amploarea efectului bacteriofagilor depinde de balanţa care se stabileşte
între rata de multiplicare a vibrionilor şi de rata de distrugere a fagilor.
În timpul izbucnirii epidemice din Dhaka, Bangladesh, au fost cuantificate: a. incidenţa
infecţiilor, b. densităţile tulpinilor de V. cholerae implicate (serotipul O1, rezistent la
streptomicină) şi c. concentraţiile bacteriofagilor litici specifici pentru această tulpină (JSF4),
atât în scaunul pacienţilor spitalizaţi cât şi în rezervoarele de apă potabilă.
Studiul a fost posibil pentru că implica o singură tulpină, a cărei densitate a putut fi uşor
monitorizată prin susceptibilitatea/rezistenţa la streptomicină.
Pe baza observaţiilor în dinamică, studiul a sugerat că infecţiile sunt cauzate de consumul
de apă dintr-un rezervor comun, în care bacteria şi fagul se reproduc şi interacţionează
independent de populaţia umană. Iniţial, schimbările temporare climaterice au creat condiţiile
unei descreşteri a concentraţiei fagice, cu o multiplicare exponenţială a vibrionilor în sursele de
apă. Populaţia a început să se infecteze consumând apa respectivă, s-a creat un cerc vicios de
multiplicare bacteriană în rezervor prin recontaminarea rezervorului datorită igienei precare şi
astfel epidemia s-a amplificat. După un timp producţia de fagi a început să crească, datorită
concentraţiei mari de vibrioni din rezervor şi în persoanele infectate. Amplificarea densităţii
fagice a dus la un declin al densităţii bacteriene şi respectiv la scăderea numărului de persoane
infectate, până la dispariţia cazurilor.
Studiul (a fost realizat şi un model matematic foarte interesant) a sugerat şi posibilitatea ca
fagul să se dezvolte iniţial în gazdele infectate cu V. cholerae, şi abia apoi să ajungă în rezervor
(datorită lipsei de igienă). Această amplificare (numerică şi funcţională) a bacteriofagilor ar
putea reprezenta o importantă componentă în prevenirea / controlul epidemiilor de holeră.