PROBLEME DE DIAGNOSTIC

11

IMUNOFLUORESCENA DIRECT O ABORDARE

ACTUALIZAT A APLICAIILOR I TEHNICII N
PEMFIGUSURI
Direct immunofluorescence an updated view on the technique and
applications in pemphigus
Dr. Adina Alexandru, Dr. Carmen Maria Slvstru, Dr. Rzvan Andrei,
Dr. Tiberiu Tebeica, Dr. Sabina Zurac, Dr. Florica Stniceanu,
Prof. Dr. George-Sorin iplica
Spitalul Colentina, Bucureti

REZUMAT
Imunofluorescena reprezint un instrument util n diagnosticul i monitorizarea evoluiei pemfigusurilor. Prin
efectuarea imunofluorescenei directe a fost evideniat prezena depozitelor imune cu dispunere specific
att la nivel cutanat, ct i la nivelul folicului pilos anagen n cazul pacienilor cu pemfigus vulgar. Utilizarea
folicului pilos ca substrat pentru efectuarea imunofluorescenei directe are potenialul de a nlocui fragmentele
cutanate sau mucoase prelevate prin biopsie, dar este necesar investigarea unui numr mai mare de
pacieni pentru validarea metodei.
Cuvinte cheie: imunofluorescen, pemfigus, folicul pilos

ABSTRACT
Immunofluorescence is an useful tool for diagnosing and monitoring disease remission in pemphigus group of
disorders. We demonstrated the presence of characteristic immune deposits by performing direct immunofluorescence both on skin fragments and anagen hair follicles in pemphigus vulgaris patients. Using the hair
follicles as an alternate substrate for direct immunofluorescence has the potential of substituting skin or mucosal
fragments taken by biopsies but a larger number of cases is needed in order to validate the method.
Key words: immunofluorescence, pemphigus, hair follicle

INTRODUCERE
Imunofluorescena reprezint o tehnic de imunohistochimie prin marcare cu compui fluoresceni,
utilizat pentru demonstrarea prezenei anticorpilor
fixai la nivelul esuturilor sau circulani n fluidele
organismului.
Aceast metod este utilizat n dermatologie
att pentru investigarea fiziopatologiei afeciunilor
cutanate, ct i n scop diagnostic n multiple patologii, cu o valoare semnificativ mai ales n cazul
afeciunilor buloase autoimune i a bolilor autoimune de esut conjunctiv.
Imunofluorescena direct (IFD) este o procedur
ce determin identificarea anticorpilor legai de

antigene tisulare utiliznd un fragment de esut obinut de la pacient. n mod clasic se descriu dou
tipuri de probe ce pot fi examinate prin IFD, respectiv fragmente de tegument sau mucoase prelevate prin biopsie. IFD este o metod extrem de valoroas pentru confirmarea unui diagnostic de
suspiciune i pentru efectuarea diagnosticului diferenial ntre maladiile imunobuloase. Imunofluorescena indirect (IFID) este util n situaiile n care
metoda direct este negativ sau nespecific (1).
Diagnosticul pemfigusurilor
Pemfigusurile sunt afeciuni buloase autoimune
caracterizate de apariia autoanticorpilor ndreptai

Adresa de coresponden:
Dr. Adina Alexandru, Spitalul Clinic Colentina, os. Stefan cel Mare Nr. 19-21, Bucureti
e-mail: dr_adinaalexandru_ro@yahoo.com

230

REVISTA MEDICAL ROMN VOLUMUL LIX, NR. 3, An 2012

231

REVISTA MEDICAL ROMN VOLUMUL LIX, NR. 3, An 2012

mpotriva unor proteine desmozomale keratino-citare, n principal desmogleina 3 i 1.

Diagnosticul de pemfigus se stabilete pe baza
examinrii clinice, a examenului histopatologic i
este confirmat prin imunofluorescen.
Depunerea de IgG la nivel intercelular reprezint
marca pemfigusurilor (cu excepia pemfigusului cu
IgA) i testarea prin IFD este pozitiv n 90-100%
dintre cazurile de boal activ dac fragmentul de
esut este prelevat corespunztor (1). Pattern-ul de
fluorescen apare sub forma unor depozite liniare
tipice pe suprafaa keratinocitar, descris clasic sub
form de reea.
Valoarea predictiv pozitiv a IFD pentru diagnosticul pemfigusurilor este de aproximativ 100%,
n sensul c n cazul pozitivrii acestui test probabilitatea confirmrii diagnosticului de pemfigus
este de circa 100% (1). Valoarea predictiv negativ
se refer la situaia n care un pacient cu un rezultat
negativ al testrii nu prezint boala. n cazul pemfigusurilor aceast valoare se situeaz la circa 8590%, deoarece exist posibilitatea apariiei unor
rezultate fals negative (1).
IFD efectuat pe folicul pilos n pemfigusuri
Desmogleinele 3 i 1, proteine transmembranare
din familia caderinelor, au fost identificate att la
nivelul epidermului interfolicular, ct i la nivelul
foliculului pilos (FP), cu o dispunere specific diferenierii (2,3): desmogleina 1 se exprim la nivelul
tecii epiteliale interne (TEI) i straturilor interne ale
tecii epiteliale externe (TEE), desmogleina 3 se exprim la nivelul tuturor straturilor TEE.
Prezena depozitelor imune specifice pemfigusului la nivelul FP a fost demonstrat anterior (4-7)
prin efectuarea IFD.
Cercetare personal
Au fost analizate 9 cazuri de pemfigus vulgar
(PV): 3 cazuri la debut nainte de iniierea terapiei,
5 pacieni cu boal activ n curs de tratament i un
caz n remisiune clinic. Pentru fiecare pacient s-au
prelevat biopsii cutanate pentru efectuarea examenului histopatologic i a IFD convenionale cutanate.
S-au prelevat, de asemenea, fire de pr anagene de
la nivelul scalpului pentru efectuarea IFD pe FP.
Prin IFD s-a evaluat exprimarea IgA, IgM, IgG, C3
i fibrinogen, att la nivel cutanat, ct i la nivelul
FP. n cazul unui pacient s-au prelevat i fire de pr
axilare i inghinale ce au fost testate prin IFD.

i al FP n toate cazurile de pemfigus investigate

(Fig. 1, 2). Depozitele de C3 au fost identificate n
FP ntr-un procent mai mic dect la nivel cutanat i
cu o intensitate mai sczut a fluorescenei. Cu
toate acestea, aspectul n reea pentru IgG evideniat la nivelul FP a prezentat caractere specifice
pentru diagnosticul de pemfigus, similar aspectului
IFD efectuat pe fragmente cutanate. Testarea pentru
IgA, IgM, fibrinogen a fost negativ (Fig. 3).

FIGURA 1. IFD cutanat depozite IgG cu

aspect de reea

FIGURA 2. IFD folicul pilos depozite IgG cu

aspect de reea

REZULTATE
Depozitele imune de IgG cu dispunere caracteristic n reea au fost identificate la nivel cutanat

FIGURA 3. IFD pe folicul pilos rezultat

negativ

232

REVISTA MEDICAL ROMN VOLUMUL LIX, NR. 3, An 2012

DISCUII
Sensibilitatea diagnostic a IFD pe FP la cazurile
investigate, comparativ cu testarea cutanat, este
similar, dar n mod evident este necesar investigarea unui lot lrgit de pacieni n scopul validrii
metodei.
Este remarcabil concordana rezultatelor obinute n contextul includerii n lotul de pacieni investigat a forme diferite de PV din punct de vedere
al duratei de evoluie: att cazurile la debut, ct i
cele cu evoluie mai ndelungat sau chiar n remisiune clinic i sub tratament la momentul examinrii au prezentat rezultate pozitive.
Prelevarea firelor de pr a fost efectuat de la
nivelul scalpului, indiferent dac pacienii prezentau
sau nu leziuni vizibile la acest nivel. Apariia acantolizei i clivajului suprabazal, caracteristice PV,
este evideniabil la nivelul epiteliului folicular i
poate constitui un indiciu preliminar pentru diagnosticul precoce al acestei afeciuni la examinarea
histopatologic, ntruct poate fi limitat strict la
acest nivel, fr a fi regsit la nivelul epidermului
(8). Pozitivarea IFD efectuat pe FP prelevat de la
nivelul scalpului ar putea fi evideniat att la pacienii care prezint leziuni ale scalpului, ct i n
cazul n care nu se constat prezena acestor leziuni,
n condiiile n care boala este imunologic activ.
n cazul unui pacient cu PV la debut a fost efectuat IFD pe FP recoltnd fire de pr att de la nivelul
scalpului, ct i de la nivel axilar i inghinal. Rezultatele au fost pozitive pentru toate tipurile de fire
recoltate, dar cu o intensitate mai sczut a fluorescenei la nivelul firelor axilare i inghinale comparativ cu cele de la nivelul scalpului, constatare
explicabil prin prisma cantitii mari de antigene
specifice PV de la nivelul scalpului comparativ cu
alte zone anatomice (9).
Nu au fost testate prin aceast metod alte forme
clinice de pemfigus. Raportri anterioare (7) relev
faptul c aspecte similare pentru IFD au fost identificate i n cazuri de pemfigus vegetant, foliaceu
sau eritematos.
IFD pe FP n PV aflat n remisiune clinic
A fost testat prin IFD efectuat pe FP recoltat de
la nivelul scalpului un pacient aflat n remisiune
clinic la momentul investigrii, diagnosticat anterior cu PV i aflat la momentul testrii n curs de
tratament cu o doz sczut de corticosteroizi sistemici. Testarea a fost pozitiv pentru IgG. Acest
rezultat demonstreaz faptul c afeciunea se afla n
remisiune clinic, dar nu imunologic.
Aceast constatare poate pune n discuie valoarea efecturii IFD pe folicul pilos n cazul

monitorizrii remisiunii clinice i imunologice la

pacienii cu pemfigus. Monitorizarea remisiunii n
pemfigusuri i decizia de ntrerupere a terapiei se
bazeaz pe criterii clinice sau/i imunologice, opiunea clinicianului fiind la baza acestei decizii. Din
punctul de vedere al monitorizrii remisiunii imunologice, clasic efectuat prin IFID, aceasta se
poate realiza, conform studiilor publicate, prin IFD,
ntr-un mod chiar mai eficient dect prin IFID (10).
Managementul acestor pacieni presupune inducerea remisiunii clinice i imunologice a bolii prin terapia instituit, pentru ca ulterior aceasta s poat fi
ntrerupt i reiniiat n cazul recderii.
Un studiu recent (11) investigheaz posibilitatea
efecturii IFD pe FP (fire de pr anagen recoltate de
la nivelul scalpului) n scopul monitorizrii remisiunii imunologice a pemfigusurilor, analiznd 55
de pacieni diagnosticai cu PV, aflai n remisiune
clinic i n curs de tratament de ntreinere, prin
efectuare att a IFD pe FP, ct i IFD convenional
(piele sau mucoase). IFD efectuat pe FP a fost pozitiv n 65,5% din totalul pacienilor pe cnd IFD
convenional a fost pozitiv n 50,9% dintre cazuri.
Prin urmare, au existat cazuri n care, dei IFD convenional era negativ, activitatea imunologic era
nc prezent i relevat de pozitivarea IFD pe FP.
n aceste situaii ntreruperea tratamentului doar pe
baza rezultatului IFD convenional ar fi fost prematur.
Manevra de prelevare a firelor de pr este facil,
nedisconfortant pentru pacient i mai ieftin dect
efectuarea biopsiilor cutanate sau mucoase, aplicabil i n cazul pacienilor la care biopsiile sunt dificile (copii, localizri mucoase, aduli necooperani).
Astfel, acest tip de testare ar putea fi utilizat ca metod diagnostic sau de monitorizare prin IFD a remisiunii imunologice n pemfigusuri fr a exista
dificultatea efecturii biopsiilor seriate.

CONCLUZII
Aceste constatri preliminare necesit investigare suplimentar prin constituirea unor loturi lrgite
de pacieni astfel nct metoda sa poat fi verificat
din punct de vedere al sensibilitii n diagnosticul
i monitorizarea remisiunii imunologice n pemfigusuri. Avantajele utilizrii unei astfel de metode
sunt prelevarea facil a probelor comparativ cu IFD
convenional sau chiar o posibil sensibilitate mai
mare a acestui tip de testare comparativ cu testarea
cutanat sau mucoas n cazurile de pemfigus n re
misiune clinic.

REVISTA MEDICAL ROMN VOLUMUL LIX, NR. 3, An 2012

233

BIBLIOGRAFIE
1. Mutasim D.F., Adams B.B. Immunofluorescence in dermatology. J Am
Acad Dermatol 2001; 45:803-822
2. Wu H., Stanley J.R., Cotsarelis G. Desmoglein isotype expression in
the hair follicle and its cysts correlates with type of keratinization and
degree of differentiation. J Invest Dermatol 2003; 120:1052-7.
3. Wilson C.L., Dean D., Wojnarowska F. Pemphigus and the terminal
hair follicle. J Cutan Pathol 1991; 18:428-31
4. Schaerer L., Trueb R.M. Direct immunofluorescence of plucked hair in
pemphigus. Rao R., Shenoi S.D., Balachandran C. Arch Dermatol 2003;
139:228-9
5. Demonstration of pemphigus specific immunofluorescence pattern
by direct immunofluorescence of plucked hair. J Am Acad Dermatol
2008; 58:AB85.
6. Daneshpazhooh M., Asgari M., Naraghi Z.S. et al. A study on plucked
hair as a substrate for direct immunofluorescence in pemphigus vulgaris.
J Eur Acad Dermatol Venereol 2009; 23:129-31

7. Kumaresan M., Rai R., Sandhya V. Immunofluorescence of the outer

root sheath: an aid to diagnosis in pemphigus. Clin Exp Dermatol 2011;
36(3):298-301
8. Mahalingam M. Follicular acantholysis: a subtle clue to the early
diagnosis of pemphigus vulgaris. Am J Dermatopathol 2005; 27:237-239
9. Ioannides D., Hytiroglou P., Phelps R.G., Bystryn J.C. Regional
variation in the expression of pemphigus foliaceus, pemphigus
erythematosus and pemphigus vulgaris antigens in human skin. J Invest
Dermatol 1991; 96; 159-161
10. David M., Weissman-Katzenelson V., Ben-Chetrit A. et al. The
usefulness of immunofluorescent tests in pemphigus patients in clinical
remission. Br J Dermatol 1989; 120:391-5.
11. Daneshpazhooh M., Zahra S., Naraghi Z.S. et al. Direct
immunofluorescence of plucked hair for evaluation of immunologic
remission in pemphigus vulgaris. J Am Acad Dermatol 2011 June 21,
ahead of print, doi:10.1016/j.jaad.2010.09.721