12/11/2009

Analiza genelor
ADN

Tehnologii ADN
Tehnologii
recombinant

Utilizarea tehnicilor de
analiz a acizilor nucleici
Analiza ADN:

ARN

Proteine

Secveniere

Northern-blot

Western-blot

PCR

RTPCR

Secveniere

Southern-blot

Hibridare in situ

Analiza funciei

Hibridare in situ

Analiza
histochimic

Izolarea acizilor nucleici

Izolarea ADN
Colectarea materialului biologic (celule nucleate din
orice esut)

depistarea mutaiilor genice diagnostic precis al

bolilor genetice (prenatal, postnatal precoce);

Izolarea nucleilor (opional) prin lezarea celulelor n

soluii hipotonice

identificarea polimorfismului individual

dactiloscopie genomic (analiza filiaiei);

Lezarea celulelor (nucleilor) prin aciunea detergenilor

depistarea ADN strin (bacterian, viral) diagnosticul

bolilor infecioase i gradului de infectare.

Deproteinizarea: prin aciunea proteazelor, urmat de

prelucrarea cu solveni organici (fenol, cloroform)

Precipitarea acizilor nucleici n prezena alcoolilor i a

srurilor (70% etanol)

Analiza ARNm:
analiza expresiei genice esut-specific;
evaluarea gradului de expresie a genei normale /
patologice.

Izolarea ARNm
Colectarea materialului din esutul de interes la stadia de
interes
Lezarea celulelor n prezena detergenilor i a inhibitorilor
de ARN-aze
Deproteinizarea cu utilizarea solvenilor organici
Precipitarea selectiv a ARN n prezena srurilor (LiCl,
CH3COONa)

ADN recombinant
molecul de ADN obinut
din segmente de origine
diferit, capabil s
funcioneze

ADN
recombinant

Precipitarea ARN n prezena alcoolului.

12/11/2009

Scopul tehnologiei ADN rec

Clonarea genei/secvenei de interes cu scop de:
multiplicare;
izolare i formare a bibliotecilor de ADNrec;
analiz molecular.
Expresia genic cu scop de:
analiz a funciei genei clonate;
obinerea produsului proteic.

Etapele obinerii ADN recombinant

1. Izolarea ADN de cercetat i a vectorilor de clonare
2. Clivare enzimatic a ADN de cercetat i vectorului
de clonare
3. Ligarea fragmentului de ADN de interes cu vectorul
de clonare obinerea ADN recombinant
4. Introducerea ADN recombinant ntr-o gazd de
clonare - transformare
5. Clonarea genei de intres prin replicarea vectorului
6. Expresia genei de intres prin sinteza proteinei
7. Selecia celulelor transformate prin tratare cu
antibiotice i utiliznd marcherei radioactivi sau
fluoresceni

Etape necesare pentru manipularea

ACIZILOR NUCLEICI
-

Cum se izoleaz ADN sau ARN dintr-o celul?

Cum se obin fragmente de ADN de cercetat?
- FR (ER, SR, RFLPs, hri de restricie)
- ADNc (ADN complimentar unei mol. ARNm);
Cum se separ fragmentele de AN i cum se apreciaz
lungimea comparare a ADN la diferite persoane
(electroforeza AN)?;
Cum se vizualizeaz ADN, avnd dimensiuni
submicroscopice?
Principiile clonrii ADN in vivo (vectori de clonare,
gazde de clonare) i clonrii ADN in vitro;
Denaturarea ADN in vitro
Hibridizarea mol. ADN (ADN/ADN; ADN/ARN)

Componentele necesare pentru

tehnologia AND rec = clonarea ADN in vivo
vivo::
-ADN de clonat (de cercetat): FR, ADNc
-Vector de clonare:
- mol ADN capabil s insereze ADN strin
- s transfere ADN de clonat ntr-o cel
- s se replice independent de replicarea

ADN cel gazd

- Enzime de restricie = restrictaze

- Gazd de clonare compatibil cu vectorul
- Sistem de selecie a clonelor analizate
- Set de enzime pentru manipularea ADN

Dimensiunile inseriilor clonate n diferii

vectori
Vectorul

Dimensiunile fragmentului
inserat

Gazda de
clonare

Plasmide

Pn la 10 kb (ADN
genomic, ADNc)

Bacterii,
Drojdii

Bacteriofagi

Pn la 25 kb (ADN
genomic, ADNc)

Bacterii

Cosmide

30-45 kb (ADN genomic)

Bacterii

BAC (Cromozom artificial

al bacteriilor)

Pn la 300 kb (ADN
genomic)

Bacterii

YAC (Cromozom artificial

al drojdiilor)

0,2-2.0 Mb (ADN genomic)

Drojdii

Celula bacterian

Vectorul:
-se replic autonom n celula gazd (conine punct ori)
-are capacitate s insereze i s transfere ADN strin (conine situsuri de
restricie)
-conine gene de rezisten la antibiotice (capacitate de a fi selectate)

12/11/2009

Ligarea inseriilor n vector

Vector plasmidic

Cromozom artificial
al drojdiilor (YAC)

Obinerea
Ob
inerea FR fragmentelor de restricie prin
aciunea specific a ER (enzimelor de restricie)

Situsuri recunoscute de enzime de restricie

RFLPs polimorfismul FR la dou persoane X i Z

12/11/2009

ER edonucleaz situs specific de origine bacterian

care recunoate un SR i cliveaz ADN bicatenar

12 kb
10 kb

SR secven palindromic de nucleotide, recunoscut

i clivat de enzimele de restricie
FR fragment ADN bicatenar obinut prin clivare cu
ajutorul restrictazelor

10 kb
8 kb

6 kb

2,5 kb

6 kb

5 kb

10 kb
6 kb

RFLPs Polimorfismul Lungimii Fragmentelor de

Restricie, ce identific diferenele individuale ale
moleculelor de ADN

4 kb

5 kb

2,5 kb
2 kb

Hri de restricie dispunerea relativ a situsurilor de

restricie ntr-o molecul de ADN

Vizualizarea ADN
Colorarea specific
Fuxn bazic
(in situ)

Vizualizare cu sonde marcate

Fluorescente
(reci)

Radioactive
(calde)

Bromur de
etidiu
(n geluri)
Este necesar de tiut

Clonarea in vivo, ntr-o cel

bactrerian, a unei gene
umane
Probleme:
Genele umane sunt mari;
Conin secvene
reglatoare diferite de cele
a bacteriilor;
Conin introni ce nu pot fi
nlturai ce celula
bacterian.

Sunt necesare

structura secvenei

cantiti mari de ADN

ADN de cercetat

Etapele obinerii ADNc (ADN

complementar)
Izolarea ARN+ poli(A)
Hibridarea poli(A) cu oligo(dT)
Sinteza ADNc cu ajutorul
revertazei
Hidroliza ARN
Sinteza ADN bicatenar cu
ajutorul ADN-polimerazei

Soluie:
Obinerea unui ADNc pe baza
ARNm caracteristic genei
int

12/11/2009

Rolul practic al tehnicilor de analiz a

acizilor nucleici:
1. Cercetare secvenierea ADN, formarea bibliotecilor de
gene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de
reglare, studiul consecinelor mutaiilor.
2. Depistarea persoanelor purttoare de mutaii - prenatal
sau postnatal, cu scop de prevenire a naterii copiilor cu
anomalii genetice sau manifestrii unor patologii severe.

Molecule de ADN
Amplificare ADN (clonare)
Clonare in vivo

Clonare in vitro (PCR)

Analiz molecular
Hibridizare molecular

3. Terapie genic (alegerea genei int, construirea

vectorilor de gene etc.).
4. Depistarea ADN strin (viral sau bacterian) n
diagnosticul bolilor infecioase.
5. Identificarea polimorfismelor individuale n analiza
filiaiei, n criminalistic.

Clonarea ADN
= multiplicarea unei mol ADN prin replicare
repetat
In vivo
Tehnologia ADN rec
Utilizarea celulei
gazd de clonare
Replicarea ntr-un
vector de clonare cu
utilizarea aparatului
de replicare a celulei
gazd
Cu posibilitatea
obinerii produsului
proteic

In vitro
Tehnica PCR
Este relizat n
eprubet
Replicarea unei
secvene de interes
cu ajutorul unui
aparat de replicare
artificial

Componentele necesare pentru

clonarea in vitro (PCR):
- ADN de cercetat
- Primeri specifici secvenei de clonat
complimentari secvenelor flancante
- Taq-polimeraza ADN-polimeraz termostabil
- Dezoxinucleozidtrifosfai (dNTP)
- Instalaie de modificare ciclic a temperaturii:
- t de denaturare ADN
- t de renaturare (ADN+primer)
- t de polimerizare (elongarea catenelor
noi de ADN)

Clonarea in vitro PCR

(reacia ciclic de polimerizare a
noilor copii de ADN)

Etapele tehnicii PCR

A. Pregtirea amestecului cu toate componentele reactante
B. Repetarea automat a procedurelor de denaturarerenaturare-elongare de 30-35 ori
Denaturarea ADN la 96oC
Rcirea pn la temperatura de renaturare a primerilor
Elongarea catenelor ADN la 72oC
C. Analiza produilor PCR
- electroforeza
- colorarea
- interpretarea rezultatelor

12/11/2009

Biblioteci de gene
Biblioteci genomice conin secvene de ADN
genomic, obinut prin digestie enzimatic
Biblioteci ADNc conin secvene de ADNc,
obinute n baza setului de ARNm
Biblioteci cromozomiale conin secvene
caracteristice unui cromozom

Etapele obinerii
bibliotecii genomice
Izolarea ADN genomic
Restricia ADN genomic
i vectorial
Ligarea ADN vectorial cu
fragmente ADN genomic

Etapele obinerii bibliotecii ADNc

Izolarea ARNm
Sinteza ADNc
Ligarea linkerilor
la capetele ADNc
Restricia ADNc i
a vectorului

Introducerea moleculelor
recombinate n gazd

Ligarea ADNc vector

Selecia clonelor

Transformarea
gazdei potrivite
Selecia clonelor