Tratat de Biotehnologie

Cap.3 Cromozomul la organisme pro- i eucariote

CROMOZOMUL LA ORGANISME
PRO- SI EUCARIOTE

3.1 CROMOZOMUL BACTERIAN

3.1.1 Dimensiune
Imensa majoritate a bacteriilor dein ca material genetic esenial o molecul ADN dublu
catenar circular covalent nchis, suprarsucit negativ i mpachetat. Dei complexarea cu proteine i
mpachetarea nu este identic cu cea din cromozomii de tip eucariot, totui aceast molecul este
denumit tot cromozom sau nucleoid. Cromozomul bacterian este ataat la membrana plasmatic a
celulei bacteriene n aproximativ 20 de puncte, dar o funcie deosebit o are punctul de ataare de
lng regiunea de origine a replicrii acestei molecule de ADN (ori C).
Cei mai mici cromozomi de tip procariot msoar mai puin de 1 Mpb i se ntlnesc mai ales
la bacteriile fr perete celular (bacteriile din genurile Mycoplasma, Ureaplasma au cromosomi cu
dimensiuni cuprinse ntre 600 i 800 kpb). La cealalt extrem se afl bacteriile din genurile
Myxococcus i Calothrix, care au cromozomi foarte mari (aproximativ 12-13000 kpb). Escherichia
coli are un cromozom de dimensiune intermediar: 4700 kpb.

Figura 3.1 Modelul Pettijohn de structur a nucleoidului din bacteria Escherichia coli.
ntre 40 i 50 de bucle suprarsucite radiaz dintr-un miez proteic (dup Brown, 2002).

3.1.2 Modelul Pettijohn

n general, molecula ADN ce formeaz cromozomul bacterian este de aproximativ 1000 de ori
mai lung dect celula bacterian. Aceast molecul este complexat cu proteine, suprarasucit i
mpachetat formnd o structur conform cu modelul elaborat de Pettijohn n 1974 (Figura 3.1).
Conform acestui model, prin asocierea ADN cu proteine i cu ARN (de regul, ARN nascent) se
formeaz aproximativ 50 de domenii topologice, semi-independente (denumite i bucle), per genom de
E.coli. Fiecare domeniu (bucl) este suprarsucit separat de celelalte domenii i poate fi relaxat
independent de celelalte prin introducerea unei rupturi monocatenare. Gradul de suprarsucire
negativ este dat de balana dintre activitatea a doua enzime - ADN giraza i ADN topoizomeraza I
amndou reglnd densitatea helical a moleculelor de ADN. ADN giraza crete numrul de spire per
kilopereche de baze azotate (suprarsucete molecula de ADN), iar ADN topoizomeraza I scade
numrul de spire.

45

Tratat de Biotehnologie

Cap.3 Cromozomul la organisme pro- i eucariote

3.1.3 Configuraii ADN n cromozomul bacterian

Principalul tip de structur secundar a ADN ce formeaz cromozomul bacterian este forma B
de dreapta, dar aceast configuraie nu se gsete uniform de-a lungul ntregului cromosom bacterian.
Alte configuraii, prezente pe distane scurte, sunt ADN-Z (n dublu helix de stnga), structuri
cruciforme (n regiunile cu secvene invers repetate) i regiuni triplu-catenare (n zone extrem de
bogate n purine sau pirimidine).
Este de reamintit faptul c, n general, expresia genic este afectat nu numai de secvena
primar a ADN (succesiunea de nucleotide), ci i de structura secundar i teriar a acestuia.

3.1.4 Compoziia n nucleotide

n majoritatea cazurilor, compoziia global n nucleotide a unei molecule de ADN se exprim
prin procentul molar de guanin + citozin (%mol GC), restul pn la 100% fiind, evident, reprezentat
de adenin + timin (datorit criteriului de complementaritate ntre cele dou catene ADN, respectiv
ntre bazele purinice i cele pirimidinice). Compoziia n nucleotide a cromozomului bacterian variaz
n limite foarte largi: 25 %mol GC la Mycoplasma capricolum i 75 %mol GC la Micrococcus luteus.
Procentul molar de guanin citozin n cromozomul bacterian
Procentul molar de guanin + citozin este corelat i cu compoziia n codoni a genomului.
Aceasta variaz n sensul preferinei pentru 1-2 codoni dintr-un grup de codoni sinonimi. Se
constat astfel c la Mycoplasma capricolum este favorizat prezenta A/T n poziia 3-a a codonilor
sinonimi.
S-a mai constatat c n cromosomul bacterian exist i o serie de gene a cror activitate poate
afecta compoziia total n nucleotide a unei molecule de ADN. Astfel, la E.coli au fost descrise
dou gene (mut T i mut Y) care afecteaz frecvena transversiilor A-T / C-G i, respectiv, C-G / AT. Echilibrul ntre exprimarea acestor dou gene afecteaz compoziia global n nucleotide a
moleculei de ADN ce reprezint cromosomul de E.coli.
O alt problem o reprezint contextul de citire a unui anumit codon, n spe, configuraia
codonilor adiaceni. Numrul teoretic posibil de codoni (sens) adiaceni este foarte mare (612 =
3721), dar, examinnd 237 de gene de la E.coli s-a constatat c perechile de codoni adiaceni nu
sunt distribuite randomizat, ci anumite perechi de codoni sunt mai abundente dect altele. S-a dedus
astfel c, compoziia n nucleotide a unui codon este corelat i cu compoziia codonilor adiaceni,
corelat probabil cu procesele de ataare la situsurile A (Aminoacil) i P (Peptidil) ale ribozomilor.
Se pare deci, c aparatul de traducere a informaiei genetice ar fi putut s determine evoluia unor
anumite trsturi ale matriei genetice.

3.1.5 Proteine asociate cu cromozomul bacterian

n afar de ARN polimeraza, care datorit ratei nalte de transcriere la procariote, ramne
asociat cvasi-permanent cu moleculele de ADN, cromosomul bacterian este asociat cu o serie de
proteine bazice, similare cu histonele de la organismele eucariote, denumite proteine histone-like.
La E.coli au fost descrise 9 specii moleculare de proteine bazice, cu greutate moleculare ntre
9 i 28 kd, care se ataeaz la ADN ntr-o manier situs-nespecific i care au funcii similare cu
histonele de la organismele eucariote. Dintre cele 9 specii moleculare proteice, cea mai important este
o protein denumit HU ( HelixUnwinding = desfacerea dubului helix). Din complexarea
moleculelor HU cu ADN cromozomal bacterian se formeaz structuri similare cu nucleosomii de la

46

Tratat de Biotehnologie

Cap.3 Cromozomul la organisme pro- i eucariote

eucariote, denumite structuri nucleosom-like (chiar i n condiii n vitro), n care sunt cuprinse circa
200 pb/nucleosom. Structurile nucleosom-like nu sunt statice, ci se afl ntr-un echilibru dinamic.
Studii mai ample au demonstrat faptul c proteina HU nu este o simpl protein structural a
arhitecturii cromozmului bacterian, ci are rol foarte important n diverse procese din celula bacterian
n mod special n procese ce implic interaciuni ADN-proteine, situaie n care moleculele HU
favorizeaz ataarea altor proteine la ADN.
Dei proteinele histone-like au fost studiate extensiv la E.coli, totui au fost identificate
proteine cu funcii omoloage i la alte genuri i specii bacteriene. Pe de alt parte, s-a constatat c o
serie de microorganisme din grupul Archaea prezint proteine histone-like cu structur intermediar
ntre cele de la Bacteria i histonele de la Eukarya.

Figura 3.2 Organizarea genomului la cteva specii de procariote.

Denumirea speciei
Escherichia coli K-12
Vibrio cholerae El

Deinococcus radiodurans R1

Borrelia burgdorferi B31

Molecule ADN
1 molecul circular
2 molecule circulare
1 cromozom
1 megaplasmid
4 molecule circulare
Cromozom 1
Cromozom 2
Megaplasmid
Plasmid
7 8 molecule circulare
11 molecule lineare
Cromozom linear
Plasmid circular cp9
Plasmid circular cp26
Plasmid circular cp32
Plasmid linear lp17
Plasmid linear lp25
Plasmid linear lp28-1
Plasmid linear lp28-2
Plasmid linear lp28-3
Plasmid linear lp28-4
Plasmid linear lp36
Plasmid linear lp38
Plasmid linear lp54
Plasmid linear lp56

Dimensiune (Mb)
4.639

Numrul de
gene
4397

2.961
1.073

2770
1115

2.649
0.412
0.177
0.046

2633
369
145
40

0.911
0.009
0.026
0.032
0.017
0.024
0.027
0.030
0.029
0.027
0.037
0.039
0.054
0.056

853
12
29
necunoscut
25
32
32
34
41
43
54
52
76
necunoscut

47

Tratat de Biotehnologie

Cap.3 Cromozomul la organisme pro- i eucariote

Proteina HU
este cea mai important protein histone-like de la E.coli
au fost descrise proteine tip HU la toate bacteriile studiate
ca i histonele de la organismele eucariote, proteina HU se ataeaz la molecule de ADN d.c.
indiferent de secvena de nucleotide, deci situs - nespecific
are un caracter bazic i o greutate molecular de 9,7 kd
funcioneaz ca dimer
un monomer este format din 2 polipeptide, denumite HU- i HU- i codificate de gene diferite:
hup A i, respectiv, hup B.
are proprieti fizice i compoziie total n aminoacizi similar cu histonele de la eucariote, dar
secvena de aminoacizi este diferit de acestea.
ca i histonele de la eucariote, proteina HU are un grad nalt de conservare n lumea bacterian
exist aproximativ 25000 de molecule HU per genom de E.coli, dar aceste molecule nu sunt
dispuse uniform de-a lungul cromozomului bacterian, ci sunt mai dense la periferia
nucleoidului (n zonele extrem de active transcripional)

Proteina IHF
Alte proteine histone-like de la E.coli sunt proteina H (similar cu histona H2A de la eucariote),
proteina H1, proteina H-NS, proteina IHF.
Proteina IHF (Integration Host Factor, g.m.=20 kd)
9 a fost descoperit n studiile privind integrarea genomului fagului n cromozomul de E. coli ;
ulterior, s-a constatat c aceast protein intervine i ntr-o serie de alte procese din celula
bacterian
9 este format din 2 subuniti codificate de genele him A i him B.
9 spre deosebire de alte proteine histone-like, moleculele de IHF se ataeaz la ADN ntr-o
manier situs-specific (adic doar la anumite secvene de nucleotide)
9 moleculele de IHF nu sunt necesare pentru recombinarea bacterian omoloag, dar par s
intervin n fenomene de recombinare neomoloag, specializat, cum sunt de altfel, procesele
de transpoziie i de conjugare bacterian

3.1.6 Secvene ADN repetate

n cromosomul bacterian au fost identificate secvene ADN repetate, dintre care unele nu
codific proteine/ARN (secvene repetate necodificatoare), iar altele codific o serie de proteine sau
specii moleculare de ARN (ARNr, ARNt) secvene repetate codificatoare.

3.1.6.1 Secvene repetate necodificatoare = ADN repetitiv

Acestea sunt reprezentate de secvene scurte ce apar de regul n afara ORF-urilor (Open
Reading Frames). Marea majoritate a acestor secvene servesc ca situsuri de interaciune ADNproteine (inclusiv n procese de recombinare, inversie, excizie, transpoziie) i ca situsuri modificate ce
identific catena matri n timpul replicrii semiconservative a cromozomului bacterian. Dintre cele
mai cunoscute asemenea secvene sunt secvenele REP, Chi, Dam.
Secvene REP (Repeated Extragenic Palindromes)
Sunt formate din palindroame repetate, majoritatea aflate n regiuni extragenice. O secven
REP conine o secven consensus de 38 bp. Grupuri (denumite clusteri) de 2-4 secvene REP
separate ntre ele prin 20 pb formeaz un element REP (REPE = REP Element). La E.coli i
Salmonella typhimurium exist 100-200 structuri REPE (reprezentnd deci, aproximativ 0.5% din
cromozomul bacterian), localizate nsa diferit. La secvenele REP se leag molecule de protein HU i

48

Tratat de Biotehnologie

Cap.3 Cromozomul la organisme pro- i eucariote

de ADN giraz, aceste secvene avnd deci rol n mpachetarea nucleoidului. Tot la aceste secvene se
leag i ADN polimeraza intervenind n procese de replicare i reparare ADN.
Situsuri Chi Un situs Chi are o lungime de 8 pb:
5 GCTGGTGG 3
Datorit faptului c reprezint situsul de recunoatere i tiere a moleculelor ADN de ctre
endonucleaza RecBCD, secvenele Chi stimuleaz recombinarea omoloag mediat de RecA i
RecBCD. S-a mai constatat c efectul recombinativ al situsului Chi este polar: stimuleaz
recombinarea la capatul 5 al lui Chi, i nu la 3. Situsuri Chi au fost identificate att pe cromosom, ct
i pe unele plasmide de la E.coli. Mai mult chiar, s-a constatat c secvenele Chi reprezint situsuri de
stimulare a recombinrii genetice la toi membrii familiei Enterobacteriaceae. n contrast, la
Pseudomonadaceae, complexul enzimatic RecBCD nu acioneaz la situsuri Chi.
In cromosomul de E.coli au fost identificate aproximativ 950 de situsuri Chi, ce par s fie
distribuite relativ uniform (1 situs Chi la 5 kbp), cu excepia zonei adiacente regiunii oriC, unde exist
un cluster de 22 de situsuri Chi.
Situsuri Dam sunt formate din 4 bp (5 GATC 3) i reprezint situsurile de metilare a
adeninei (adenina este metilat la poziia N6). Cromosomul de E.coli conine foarte multe situsuri
Dam (peste 18.000) care, dac ar fi dispuse randomizat ar exist 1 situs Dam/250 bp. i n acest caz sa constatat un numar foarte mare de situsuri Dam n, i n jurul, regiunii oriC: n cele 245 bp ce
definesc oriC la E.coli exist 8 situsuri Dam, iar n cele 350 bp ce flancheaza oriC exist nc 12
situsuri Dam.

3.1.6.2 Secvene repetate codificatoare

Asemena secvene au dimensiuni mult mai mari dect cele necodificatoare.
operoni rrn exist la toate bacteriile i cuprind secvene ce codific pentru molecule de ARN
ribozomal (ARNr). La cele mai multe dintre speciile bacteriene, linkage-ul (ordinea) n cadrul unui
operon rrn este 16S 23S 5S. E.coli i S.typhimurium au cte 7 loci (operoni) rrn, localizai n
poziii echivalente. Cei 7 operoni sunt notai rrnA.rrnG, fiecare cuprinznd secvene 16S-23S-5S
cotranscrise ntr-o molecul ARN de 30S. Numarul operonilor rrn variaz de la un gen/specie
bacterian la alta: Bacillus subtilis are 10 operoni rrn, Mycobacterium sp. are 1-2 operoni rrn. Chiar n
cadrul aceleiai tulpini bacteriene, locii rrn pot diferi ntre ei n ceea ce privete prezena/absena
genelor pentru ARNt n regiunile spacer dintre genele ARNr. Astfel, toi cei 7 operoni rrn de la
E.coli au 1-2 gene pentru ARNt ntre secvenele pentru 16 i 23S, i 0-2 gene ARNt dupa 5S.
Distribuia locilor rrn pe cromosom variaz la diverse specii bacteriene: la E.coli, majoritateta
locilor rrn sunt localizai n jumtatea cromosomal ce are n centru regiunea oriC; la B.subtilis, locii
rrn sunt grupai ntr-o zon ce reprezint 30% din cromosom.
genele pentru ARNt
Cromosomul de E.coli conine 41 de gene/operoni pentru ARNt distribuii n tot
cromosomul. Unii din aceti operoni codific pentru o molecul de ARNt, alii pentru mai
multe molecule de ARNt, iar alii au i secvene ce codific diverse proteine.
secvene rhs (rearrangement hot-spots) sunt capabile s genereze duplicaii genice prin
procese de crossing-over inegal ntre secvene repetate. La E.coli K-12 au fost identificate 4
secvene rhs, notate rhs A, B, C i D. Fiecare din aceste 4 secvene au dimensiuni ntre 8 i
9 kbp i sunt compuse dintr-o regiune core (miez) (cu secven conservat de aproximativ
3700 bp) i din segmente flancatoare. Prin exprimarea regiunilor core ale secventelor rhs
A, B i C sunt sintetizate 2 proteine cu funcie deocamdat necunoscut. n contrast cu E.coli
K-12, la E.coli B i E.coli C, precum i la S.typhimurium, nu au fost descrise secvene rhs.

3.1.7 Numrul de copii genice

La bacterii, n afar de genele sau operonii aflai n copii multiple, numrul de copii ale unei
gene cromosomale poate varia n funcie de urmtorii factori:

49

Tratat de Biotehnologie

Cap.3 Cromozomul la organisme pro- i eucariote

1. poziia genei pe cromosom, de-a lungul unui gradient pornind de la oriC spre regiunea ter.
n timpul replicrii cromosomului bacterian, n funcie de poziia lor pe cromosom, unele gene sunt
deja replicate, n timp ce altele nc nu. Astfel, unele gene se gasesc ntr-un numr mai mare de copii
dect altele.
2. copii ale unei gene cromosomale pot exist i pe plasmide.
n aceast situaie se folosete termenul de meroploidie parial, care se refer la o ploidie
parial ce afecteaz anumite gene, fr s existe multiplii de cromosomi ntregi (este cazul genelor
prezente i pe cromosom i pe un plasmid).
3. ntr-o celula bacterian pot exist mai multe copii ale ntregului cromosom.
La anumite specii bacteriene exist mai multe copii cromosomale n aceeai celul:
Desulfovibrio vulgaris (4 copii), D.gigas (17 copii), Azotobacter chroococcum (20-25 de copii),
A.vinelandii (40-80 de copii cromosomale). Este de subliniat faptul c la majoritatea speciilor
bacteriene cu copii cromosomale multiple exist procese de inactivare cromosomal ce asigur
funcionarea unui singur cromosom i inactivarea celorlali.

3.1.8 Densitatea informaiei n cromosomul bacterian

Densitatea informaiei biochimice, adic numarul de reacii biochimice catalizate per kb de
material genetic, este un parametru extrem de variabil n genomul bacterian, n primul rnd datorit
faptului c nu ntotdeauna genele au o relaie 1-la-1 cu reaciile biochimice. n mod uzual, este valabil
relaia 1 gen => 1 polipeptid => 1 reacie biochimic. Exist ns i foarte multe excepii, de
exemplu:
- enzime formate din mai multe lanuri polipeptidice: de exemplu, enzima succinat
dehidrogenaza este format din 4 polipeptide codificate de 4 gene diferite sdh A, B, C i D. n acest
caz, relaia este 4 gene =>1 reacie biochimic;
- enzime polifuncionale, ce catalizeaz mai multe reatii biochimice: de exemplu, complexul
enzimatic FAD ce oxideaz acizii grai este format din 2 polipeptide codificate de 2 gene diferite
fadA i fadB. Acest complex enzimatic catalizeaz 5 reacii biochimice (din care 4 sunt catalizate de
FadA). In acest caz, relaia este 1 gen => 4 reacii biochimice.
Gene suprapuse
n cadrul genomului bacterian variaz i densitatea de citire a informaiei genetice prin transcriere. Astfel,
dei marea majoritate a genelor bacteriene sunt contigue, totui cromosomul bacterian cuprinde i gene cu diverse
grade de suprapunere:
- gene cu promotor plasat n regiunea terminal a genei upstream: trpA-trpB, ilvA-ilvD
- gene cu promotor plasat n interiorul genei upstream: mioA-mioD
- gene cu grad ridicat de suprapunere:
1. gene suprapuse total, codificate pe cele 2 catene ale ADN; de exemplu, locusul CysE (codific serinacetil-transferaza), ce este implicat n biosinteza cisteinei, are 2 ORF (cys X i cys E) codificate pe cele 2 catene ale
locusului CysE.
2. secvene codificatoare ce sunt folosite de mai multe ori, pornind transcrierea din poziii diferite; de
exemplu, locusul McrB (codific proteine implicate n restricia ADN la 5-metil-citozin) conine 3 ORF-uri pe
aceeai caten ADN, pornind din 3 situsuri diferite de iniiere a transcrierii. Traducerea celor 3 transcripte duce la
formarea a 3 proteine (de 51, 53 i, respectiv, 54 kdal) cu secven carboxi-terminal identic, dar diferit n
regiunea amino-terminal.
3. gene suprapuse total, cu molecule transcript identice, dar traduse diferit prin procese de frameshift
translaional: de exemplu, gena trpR care codific 2 proteine i gena dnaX, care codific 2 subuniti ale ADN
polimerazei III.
Asemenea gene cu grad ridicat de suprapunere sunt foarte bogate n informaie genetic (unele
au chiar informaie dubl). Multe din ele (de exemplu, genele mcrB i dnaX) nu sunt tipice pentru
cromosomul de E.coli, n ceea ce privete procentul molar de guanin + citozin. Astfel, gena mcrB are
48% mol GC, iar gena dnaX are 58 % mol GC, n timp ce cromosomul de E.coli are, in toto, 51-51.5 %
mol GC. S-a emis ipoteza c asemenea gene care prezint un procent molar de guanin + citozin
extrem de diferit fa de media cromosomal, ar fi fost achiziionate de E.coli din alte genomuri, prin
procese de transfer de material genetic pe orizontal (transformare, conjugare, transducie).

50

Tratat de Biotehnologie

Cap.3 Cromozomul la organisme pro- i eucariote

3.1.9 Redundana genelor i a produselor genetice

Pentru foarte multe funcii celulare, exist cte 2 gene, ca i cum programul genetic al acestor
bacterii ar avea sisteme de backup (copii de siguran). Aceast redundan ar putea fi considerat
ca fiind o densitate redus a informaiei genetice. Cu toate acestea, cel puin n unele cazuri, aceast
informaie este reglat diferit i folosit n scopuri metabolice diferite.
n cromosomul de E.coli exist 58 de perechi (de cte 2 gene) sau clusteri (mai mult de 2
gene), ce codific 125 de produse genice. Din acestea, n 56 de perechi/clusteri reaciile catalizate sunt
identice. n cazul anumitor grupuri genice, reglajul exprimrii lor este diferit, de exemplu:
- genele aroF, aroG i aroH codific, toate trei, o aceeai enzim: 3-deoxi-D-arabinoheptulosonat7 fosfat-sintetaza (DAHPaza). Enzima codificat de aroF este sensibil la concentraia
de tirozin, cea codificat de aroG este sensibil la concentraia de fenil-alanin, iar cea codificat de
aroH este sensibil la concentraia de triptofan ;
- genele glpA i glpD codific amandou glicerol-3-fosfat-dehidrogenaza. Enzima codificat
de glpA este sintetizat i folosit n condiii de anaerobioz, iar cea codificat de glpD n condiii de
aerobioz.
Unele din aceste gene pereche au secven similar una cu cealalt (i proteinele
corespunztoare au secven similar n aminoacizi) i este probabil c au aparut prin procese de
duplicaie genic, urmat de o oarecare divergen funcional.
Altele ns, dei enzimele desfaoar aceeai funcie, totui au secven diferit (att ca
proteine, ct i genele corespunztoare). Este posibil ca asemenea gene s fi aparut fie prin evoluie
convergent, fie prin transfer lateral de la ali repliconi bacterieni (aceast ultim situaie poate fi
identificat prin determinarea procentului molar de guanin + citozin).

3.1.10 Situsuri de inserie fagic n cromosomul bacterian

Muli bacteriofagi i inser genomul n cromosomul bacterian, fie prin transpoziie n pozitii
randomizate n cromosom (bacteriofagul Mu), fie prin recombinare situs-specific numai n anumite
poziii (fagii lambdoizi ce constituie fagii nrudii cu fagul ). Situsurile cromosomale n care fagul
lambda (i fagii lambdoizi) i inser genomul, sunt denumite situsuri attB (attachment on bacteria)
i corespund unor situsuri attP (attachment on phage) pe genomul fagic. Fagul lambda necesit un
situs attB de minimum 21 bp, din care 15 sunt identice cu 15 bp din attP (234 bp). Lambda are un
situs preferat attB n cromosomul de E.coli K-12 (dar i situsuri secundare) ce e situat intergenic. Ali
fagi lambdoizi (21, e14, P22) se insereaz n situsuri attB cu localizare intragenic. Pe cromosomul de
E.coli K-12 au fost cartate situsurile pentru 15 fagi lambdoizi i s-a constatat c ele sunt grupate ntre
poziiile 6 min i 44 min.
Aceast organizare a situsurilor n care se inserer genomul fagilor lambdoizi reprezin nc
un argument n favoarea ipotezei conform creia cromosomul de E.coli (i nu numai) ar avea o origine
himeric, unul din segmente derivnd dintr-o gazd ancestral a fagilor lambdoizi.
Pe de alt parte, s-a constatat c foarte multe elemente genetice cu caracter mobil se inser
n genele pentru ARNt, fapt pentru care s-a sugerat c acestea ar fi reprezentat situsurile folosite de
fagii ancestrali.

3.1.11 Localizarea cromosomal a genelor nrudite fiziologic

n cromosomul de E.coli, majoritatea genelor (operonilor) par s fie distribuii randomizat
(indiferent de nrudirea lor fiziologic), cu excepia celor implicai n catabolismul glucozei ce par s
fie dispui n 4 zone echidistante pe harta circular a cromosomului. Aceast randomizare a dispunerii
operonilor a fost verificat i prin rearanjamente cromosomale induse experimental caz n care
operonii au continuat s funcioneze normal.
Totui, n treimea cromosomal ce are n centru regiunea ter (ca, de altfel, i n regiunea oriC),
poziia operonilor pare s fie destul de fix, orice rearanjament deranjnd total funcionarea acestora.

51

Tratat de Biotehnologie

Cap.3 Cromozomul la organisme pro- i eucariote

Orice aranjament nerandomizat al genelor duce la ipoteza c poziia genelor ar putea afecta
funcionarea lor, deducndu-se astfel o organizare mai nalt dect operonul sau reglonul.
La cele mai bine studiate specii de Pseudomonas (P.aeruginosa, P.putida) s-a constatat c
genele cu funcii housekeeping (gene implicate n metabolismul central al oricrei celule, precum i
n metabolismul anabolic) sunt grupate n jumtate din harta circular a cromosomului. n acelasi timp,
genele implicate n metabolismul catabolic par s fie dispuse randomizat n cealalt jumatate a
cromosomului bacterian.
Acest mod de dispunere a genelor ar putea reflecta istoria construciei cromosomului din pri
separate: genele pentru metabolismul esenial ar fi existat probabil n acel genom ancestral mai mic,
care a fost ulterior mrit la actuala dimensiune prin fuziune cu un alt element genetic sau prin transfer
de material genetic (transformare, conjugare, transducie).
n general, s-a constatat c la foarte multe bacterii clusterii genici din jurul regiunilor oriC i
ter sunt foarte similari ntre taxoni bacterienei foarte indeprtai filogenetic, fapt ce susine ipoteza c
iniierea i terminarea replicrii cromosomului bacterian sunt procese extrem de vechi i sunt
coordonate prin mecanisme similare la marea majoritate a bacteriilor.

3.2 PLASMIDE BACTERIENE

n prezent, plasmidele sunt definite ca fiind repliconi neeseniali, capabili s se replice fizic
independent de cromozom i transmii n form extracromosomal, pe vertical (de la o generaie de
indivizi la alta) sau pe orizontal (de la un individ la altul n cadrul aceleiai generaii). n general,
plasmidele reprezint un fenomen al lumii procariote. Cu toate acestea, au fost descrise structuri
genetice plasmidiale i la unele grupuri de eucariote inferioare (drojdii, fungi, mucegaiuri) i chiar i la
eucariote superioare (plasmidele din mitocondrii i cloroplaste la unele celule vegetale).
Exista cercettori care ncadreaza plasmidele n categoria organismelor acelulare. n contrast
cu aceast teorie, ali cercettori consider plasmidele ca nefiind organisme, ci alturi de virusuri,
transposoni i secvene de inserie, ar aparine unor specii moleculare speciale, de elemente genetice
mobile (ADN accesoriu) (P. Sykora 1992).

Figure 3.3. Reprezentare schematizat a nucleoidului i a plasmidelor bacteriene.

3.2.1 Principalele categorii de gene codificate de plasmide

Fiind repliconi fizic independeni, toate plasmidele poart gene implicate n propria replicare,
stabilitate i partiie. n afar de acestea, majoritatea genelor codificate de plasmide confer caractere
adaptative, avantajoase gazdelor bacteriene. Cele mai frecvente categorii de gene purtate de plasmide
sunt :
- gene de rezisten la antibiotice
Plasmidele de rezisten au fost descoperite n Japonia n anii 50 la izolate clinice de
Shigella dysenteriae i s-a constatat c aceste gene nu erau plasate pe cromosomul bacterian.
Au fost denumite factori R. Folosirea abuziv i/sau incorect a antibioticelor au determinat,

52

Tratat de Biotehnologie

Cap.3 Cromozomul la organisme pro- i eucariote

pe de o parte, rspndirea n populaiile de bacterii patogene a determinanilor de

antibiorezisten, iar pe de alt parte, dezvoltarea unor mecanisme de antibiorezisten
extrem de eficiente.
n ceea ce privete originea genelor de antibiorezisten, au fost emise 2 ipoteze
majore:
a-genele de antibiorezisten existente n prezent n foarte multe bacterii patogene ar avea
originea n gene similare prezente n bacteriile ce produc antibiotice (i care, de
regul, sunt bacterii din sol); n aceast situaie se presupune c ar fi avut loc
evenimente de transfer de gene pe orizontal ntre bacterii din sol i bacterii patogene;
b-genele de antibiorezisten ar fi evoluat din gene house-keeping (de exemplu:
proteinele ce efluxeaz tetraciclina ar putea s fi evoluat din proteinele de transport al
nutrienilor).
- gene de toleran la metale grele (ioni mercurici, derivati organomercurici, nichel,
cobalt, plumb, cadmiu, bismut, antimoniu, zinc, argint)
- gene de rezisten la ageni intercalani, radiaii UV, radiaii X, bacteriofagi,
bacteriocine
- gene ce codific factori de patogenitate i de virulen
- gene ce codific bacteriocine
- gene ce codific antibiotice
- gene implicate n metabolismul opinelor (plasmidele Ti de la Agrobacterium)
- gene ce codific capaciti metabolice deosebite, de exemplu folosirea unor substane
xenobiotice ca surs unic de carbon i energie la specii de Pseudomonas
- gene fixatoare de azot (genele nif de la Rhizobium i Bradirhizobium)
- gene ce codific enzime proteolitice, amilolitice etc
- gene ce codific transferul plasmidelor pe orizontal prin proces de conjugare
bacteriana (regiunea tra)
Deci, n afar de genele implicate n propria replicare, stabilitate i partiie, plasmidele mai pot
purta i gene ce codific caractere - unele eseniale, altele neeseniale pentru bacteria gazd.
Caracterele eseniale reprezint ci metabolice centrale ale celulei bacteriene, plasmidele purttoare
fiind prezente la marea majoritate a izolatelor naturale ale unor tulpini bacteriene (de exemplu, unele
plasmide mari de la Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium leguminosarum).
Unele caractere neeseniale confer avantaje selective gazdelor purttoare, permind
supravieuirea acestora n anumite condiii de mediu. n aceast categorie intr genele plasmidiale ce
codific rezistena la antibiotice i tolerana la metale grele (asemenea gene sunt prezente la multe
tulpini de bacterii patogene). n absena antibioticelor sau a metalelor grele ca factori de presiune
selectiv, procesele de replicare, meninere i partiie a plasmidelor reprezint un efort metabolic
suplimentar pentru celulele bacteriene. Ca urmare, n doar cteva pasaje, aceste plasmide sunt
eliminate din populaia bacterian prin subreplicare. Ele se menin doar ntr-o proporie sczuta a
populaiei bacteriene, fapt ce ar putea fi considerat o economie metabolic la nivelul ntregii
populaii bacteriene.
Exist ns i aa-numite plasmide criptice, care nu par s ofere gazdei nici un caracter
avantajos. Interesant este faptul c, dei pot fi ncadrate n categoria selfish DNA (ADN egoist),
totui i aceste plasmide sunt meninute ntr-o anumit proporie din populaiile bacteriene.
n ansamblu, genomul bacterian se caracterizeaz printr-o intens circulatie pe orizontal a
genelor, ntre diveri indivizi bacterieni (H.Tschape 1994). Aceast circulaie se desfaoar prin trei
procese centrale - conjugare, transformare i transducie - dintre care, plasmidele sunt implicate n
primele dou.
Acest flux continuu de gene pare s fie o caracteristic definitorie a lumii bacteriene i s fi
contribuit esenial la extrema versatilitate metabolic a bacteriilor n aproape toate mediile naturale.

3.2.2 Clasificarea plasmidelor

Plasmidele pot fi clasificate funcie de diverse criterii :
a) criteriul autotransferabilitii. Autotransferabilitatea reprezint capacitatea unui element
genetic (n spe, un plasmid) de a se autotransfera de la un individ bacterian la altul. De

53

Tratat de Biotehnologie

Cap.3 Cromozomul la organisme pro- i eucariote

regul, genele implicate n autotransferabilitate sunt grupate ntr-un operon (denumit

operon tra), iar elementul genetic purttor este denumit conjugon. Conform acestui criteriu
exist 3 clase de plasmide :
1) plasmide conjugative sunt plasmidele care prezint ntreg operonul tra i sunt
autotransferabile, putnd genera proces de conjugare bacterian;
2) plasmide non-conjugative sunt plasmidele ce nu prezinta operonul tra, nu sunt
autotransferabile (nu pot genera conjugare bacterian) i nici mobilizabile;
3) plasmide mobilizabile sunt plasmidele ce nu prezinta operonul tra (i, ca atare, nu
sunt autotransferabile), dar au gene mob care le permit mobilizarea n evenimente
de conjugare iniiate de alte plasmide ce sunt conjugative.
b)

criteriul structurii moleculare. Marea majoritate a plasmidelor sunt formate din ADN dublu
catenar. Mai mult dect att, din punct de vedere al structurii moleculare, exista dou clase
de plasmide :
1) plasmide circulare. Plasmidele circulare sunt alctuite din ADN d.c. circular, iar forma
in vivo pare sa fie CCC (circular covalently closed); foarte rar i temporar se
ntlnete forma CO (circular open), n care una din cele dou catene nu este
continu avnd o legtur fosfodierica lips. Tot in vivo se mai ntlnesc i
concatemeri (oligo/multimeri).
2) plasmide lineare. Asemenea plasmide sunt alctuite din ADN d.c. linear (L). Au fost
descrise dou tipuri de plasmide lineare :
1. Plasmide lineare cu telomere hairpin (telomere n ac-de-pr). Acestea sunt
ntlnite cu precdere la plasmidele lineare de la Borrelia (Figura 3.3). Spirochetele
din genul Borrelia au structur genomic linear: toate speciile de Borrelia
examinate au un cromosom linear de 950-1000 kb i mai multe plasmide lineare cu
dimensiuni cuprinse ntre 5 i 200 kb (unele au i plasmide CCC). Toate plasmidele
lineare de la Borrelia descrise pn n prezent au telomere de tip hairpin.
Telomerele hairpin se caracterizeaz prin palindroame terminale bogate n A/T, la
capete existnd o continuitate n legatura de tip covalent ntre cele 2 catene.
Asemenea structuri (ADN d.c. L cu telomere de tip hairpin) mai exist i la
ADNmt de la reprezentanii genului Pichia, la poxvirusuri i la plasmidele lineare
din mitocondriile de fungi.
2. Plasmide cu telomere invertroni Asemenea telomere sunt ntlnite la plasmidele
lineare de la genul Streptomyces plasmide cu dimensiune cuprins ntre 9 i 600
kbp. Ca i cele hairpin, telomerele invertroni prezint i ele palindroame terminale
bogate n A/T. Diferena const ns n faptul c nu exist legatura covalent ntre
capetele celor 2 catene, i, ca urmare, capetele 5 i 3 sunt libere. La capul 5 al
fiecrei catene este ataat covalent o molecul proteic denumit proteina TP
(Telomeric Protein) (Figura 3.3). Asemenea structuri ADN, cu palindroame
terminale bogate n A/T i cu proteina TP ataat covalent la capul 5 au fost
definite de K.Sakaguchi (1990) ca fiind elemente genetice mobile cu replicare
autonoma i denumite INVERTRONI, similare funcional cu transposonii.
Telomerele invertroni sunt caracteristice repliconilor lineari de la eucariote, n mod
special la plasmidele lineare din mitocondriile de fungi i plante i din citoplasma
de fungi.

a)
Figura 3.4 Structura telomerelor hairpin la Borrelia (a) i
invertroni la Streptomyces (b) (dupa H.Hinnebusch, 1992).
palindroame terminale, bogate n A-T

b)

= la capul 5 al fiecrei catene exist o protein ataat

covalent

54

Tratat de Biotehnologie
c)

Cap.3 Cromozomul la organisme pro- i eucariote

criteriul incompatibilitii plasmidiale

De-a lungul anilor, conceptul de incompatibilitate plasmidial a ridicat foarte multe
probleme. Actualmente, acest concept este definit ca fiind incapacitatea a dou sau mai
multe plasmide de a se menine i propaga stabil n aceeai linie celular. Plasmidele din
acelai grup de incompatibilitate ce conin origini de replicare similare (deci, au acelai
replicon-type), nu sunt motenite stabil n descenden i segreg una de cealalt. Cel mai
probabil acest proces se datoreaz unei competiii moleculare ntre plasmide cu acelai
replicon-type pentru aceleai proteine implicate n replicarea respectivelor plasmide
proteine codificate cromozomal. La Enterobacteriaceae au fost descrise peste 30 de grupuri
de incompatibilitate plasmidial. Un tip de incompatibilitate s-ar baza pe competiia ntre
secvenele repetate RS (la care se ataeaz proteina RepA), dintre diferite plasmide existente
n celula bacterian. Bazndu-se pe tipul de replicon a fost imaginat o metod nou de
identificare plasmidial folosind o colectie de sonde rep (Sykora P. 1992).
Procesul de gene-flow n lumea bacterian ar putea avea un rol important n evoluia
bacteriilor. Cu toate acestea, procesele de transfer de material genetic pe orizontal nu par s
afecteze stabilitatea speciilor taxonomice bacteriene. Din acest punct de vedere, plasmidele
se gsesc intr-o situaie total diferit: gene-flow-ul ntre plasmide nenrudite pare s fie
att de ridicat i de rspndit, nct nu se poate alctui o identificare taxonomic a
plasmidelor doar pe baza unei liste a caracterelor pe care le codific. Se pare c biologia
plasmidelor nu implic mecanisme de izolare taxonomic asemntoare cu speciile de plante
i animale. n contrast, n lumea plasmidelor se observ un fenomen total diferit: izolarea
plasmidelor individuale sau foarte asemntoare. Acest fenomen este cunoscut ca fenomenul
de incompatibilitate plasmidial.

3.3 STRUCTURA CROMOZOMULUI

LA EUCARIOTE
Materialul genetic este reprezentat dintr-un genom nuclear i un genom extranuclear
(reprezentat din genomul mitocondrial i, n cazul celulelor vegetale, i din genom cloroplastic).
Genomul nuclear cuprinde un set de molecule lineare de ADN, fiecare reprezentnd un
cromozom. Fr excepie, toate eucariotele au cel puin 2 cromozomi care ntotdeauna sunt lineari.
Singura variaie care se nregistreaz este cea referitoare la numrul de cromozomi, care ns nu este
corelat cu caracteristicile biologice sau cu poziia evolutiv a organismului respectiv. Astfel, la
Saccharomyces cerevisiae (drojdia de bere - un eucariot unicelular, inferior) numrul haploid de
cromozomi este 16, de 4 ori mai mare dect la musc (Musca domestica). De asemenea, numrul de
cromozomi nu este corelat nici cu dimensiunea genomului; de exemplu, la salamandr genomul este
de 30 ori mai mare dect la om, dar are jumtate din numrul haploid de cromozomi de la om.
Cromozomii eucarioi sunt separai de citoplasm prin membrana nuclear i, ca urmare,
transcrierea i traducerea sunt separate n timp i spaiu una de cealalt; n contrast, la procariote, cele
dou procese se de sfoar aproximativ simultan.
Nucleul este format din 4 componente: nucleolem, carioplasm, cromonemata (singular,
cromonema) i nucleol. Cromonemata este o substan cromatic despiralizat n interfaz i
condensat n mitoz. Din aceast substan se difereniaz cromozomii.
Nucleolul este o substructur nuclear cu rol n biogeneza ribozomilor. n aceast zon a
nucleului are loc sinteza de ARN ribozomal prin transcrierea genelor corespunztoare.
La eucariote ADN este complexat cu o clas de proteine specializate, cu caracter bazic,
denumite histone. Acest complexpoart numele de cromatin (denumirea are la baz tinctorialitatea
fa decolorani bazici).

Cromatina se prezint sub 2 stri:

eucromatina cromatin decondensat n interfaz i condesat n timpul
diviziunii celulare se replic la nceputul fazei S a interfazei
heterocromatina condensat permanent i se replic la sfritul fazei S.
55

Tratat de Biotehnologie

Cap.3 Cromozomul la organisme pro- i eucariote

Heterocromatina se clasific n:
- heterocromatin constitutiv este caracteristic zonelor centromerice i telomerice
- heterocromatin facultativ - este caracteristic unuia din cromozomii X la femelele de
mamifer i constituie cromatina sexual; apare datorit necesitii compensaiei de
doz a genelor eseniale prezente pe cromozomul X
- heterocromatin de citodifereniere apare prin inactivarea selectiv a unor gene n
timpul proceselor de citodifereniere
Eucromatina este caracteristic genelor active transcripional, n timp ce heterocromatina are
rol preponderent reglator i structural.

3.3.1 Clase de secvene ADN la eucariote

1. secvene unice, o copie per genom haploid, corespunztoare genelor codificatoare pentru
lanuri polipeptidice, excepie fcnd genele ce codific histone, care se gsesc n
ctevasute de copii per genom haploid (este necesar o sintez rapid ntr-un timp scurt
corespunzzoare perioadei S de replicare a ADN).
2. secvene moderat repetitive: sunt intr-un numr de 102 103 copii per genom haploid i
codific pentru ARN ribozomal, ARN de transfer i pentru histone.
3. secvene nalt repetitive: ajung pn la 106 copii per genom haploid
n general, eucariotele conin mult mai mult ADN dect procariotele. O celul de om conine
de peste 1000 de ori mai mult ADN dect o celul de Escherichia coli. Astfel, ADN-ul dintr-o celul
de om, aflat n stare decondensat atinge o lungime de 4 cm i nu poate ncpea ntr-un nucleu (de
diametru 5 m) dect n form condensat.
Forma cromozomilor dintr-o celul eucariot se modific n timpul ciclului celular.

3.3.2 Proteinele cromozomale

Principalele proteine ce complexeaz ADN-ul au greutate molecular mic, o cantitate mare
de aminoacizi cu caracter bazic i se numesc histone. Au fost descrise 5 clase de histone: H1 H2A,
H2B, H3 i H4.
Histona H1 este alctuit din 3 domenii structurale distincte:
- un capt amino-terminal cu 39 aminoacizi bazici
- o regiune globular central cu un diametru de 2,8 nm, cu aminoacizi cu caracter acid;
interacioneaz cu alte proteinexi-terminal ce conine 40% lizin (cu puternic caracter bazic)
i are afinitate de interaciune cu molecula de ADN.
Histonele H2A i H2B au cantitate mai redus de lizin. H2A are leucin, iar H2B are serin i
prolin. Au doar 2 domenii, dintre care unul interacioneaz cu ADN. Histonele H3 i H4 sunt bogate
n arginin i, n mod similar cu H2A i H2B, au tot doar 2 domenii funcionale.
n general, histonele prezint o structur nalt conservat n lumea vie. Cea mai heterogen
este histona H1, acest parametru scznd de la H1 ctre H4. Genele pentru histone sunt organizate n
uniti repetitive dispuse n tandem. De exemplu, la D.melanogaster unitatea repetitiv este format
din genele pentru: H1 H3 H4 H2A H2B

Figura 3.5 Organizarea genelor pentru histone la D.melanogaster.

regiuni reglatoare ale genelor (situsuri hipersensibile la nucleaz)

56

Tratat de Biotehnologie

Cap.3 Cromozomul la organisme pro- i eucariote

3.3.3 Nivelele de organizare ale cromatinei

Elementul structural de baz al cromatinei este nucleozomul care este format dintr-un octamer
histonic central i o histon de legtur (linker). Nucleozomul are 145 perechi de baze corespunztoare
la aproximativ 2 ture de spir suprarsucite negativ n jurul miezului histonic. Miezul histonic prezint
domeniul hidrofob carboxi-terminal de interaciune cu celelalte proteine spre partea central, iar
domeniul amino-terminal se gsete la suprafaa de interaciune cu ADN.
ntre 2 nucleozomi adiaceni se interpune ADN linker de 60 perechi de baze i este complexat
cu histona H1.
Cromatina extins apare ca un irag de mrgele cu un diametru de 11 nm. Prin intermediul
histonei H1 implicat n superspiralizare interacioneaz 6 10 nucleozomi pentru a forma solenoidul
de 30 nm. Acesta este unitate de baz a condensrii materialului genetic in interfaz.
Forma superioar de condensare este reoprezentat de cromozomii metafazici, perioada n care
materialul genetic atinge un nivel maxim de condensare de 1400 nm. Procesul de condensare a
cromatinei este realizat prin ataarea ei la o clas de proteine denumite proteine scaffold (proteine de
eafodaj). Ataarea se realizear cu formarea unor bucle (domenii) care au fiecare 100 kpb,
comparabile cu cele de la cromozomul bacterian.

Figura 3.6 Reprezentarea schematizat a structurii nucleosomilor (dup Strachan, 1999).

n organizarea materialului genetic nuclear la organisme eucariote intervin i proteine nonhistonice. Acestea se submpart n mai multe clase:
enzime ale metabolismului ADN: ADN polimeraze, ADN ligaze, ADN
topoizomeraze, terminal-ADN-nucleotidil-transferaze
enzime ale metabolismului ARN: ARN polimeraze, poliA polimeraze, enzime
de splicing, RNaze
enzime ce modific histonele: protein-kinaze, metilaze, acetilaze, esteraze,
proteaze
proteine structurale: proteinele fusului de diviziune, proteinele matricei
nucleare,
proteinele
scaffold,
proteinele
particulelor
RNP
(RiboNucleoProtein)
proteinele HMG (High Mobility Group) ce intervin n modificarea structurii
cromatinei n vederea funcionrii genelor n replicare i transcriere:
o HMG 1 i HMG 2 proteine omoloage cu g.m. 29 kd;
o HMG 14 i HMG 17 - proteine omoloage cu g.m. 10-12 kd
Proteinele HMG nlocuiesc histona H1 determinnd, alturi de topoizomeraze, relaxarea
helixului ADN n iniierea transcrierii genelor.

57