TRANSFERUL DE

EMBRIONI

Transferul embrionar reprezint o metod de intensivizare a

reproduciei constnd n prelevarea unuia sau mai multor
embrioni din uterul femelelor donatoare, supuse n prealabil
superovulaiei i fecundaiei, pentru a-i transplanta n uterul
femelelor receptoare a cror cicluri sexuale sunt sincronizate
cu ale donatoarelor.
Transferul de embrioni la animalele de ferm, parte
integrant a marii familii a biotehnologiilor moderne la
animale a cunoscut n ultimul deceniu o dezvoltare
deosebit. Biotehnologiile aplicate pe embrionii de vac s-au
impus ca fiind o combinaie a reproduciei asistate la animale
cu biotehnologiile celulare, moleculare i genomice.

Avantajele transferului de embrioni

Asigurarea progresului genetic al raselor prin
creterea numrului genotipurilor valoroase.
Posibilitatea crerii unor bnci de embrioni care s
asigure conservarea genofondului.
Ofer posibilitatea descifrrii mecanismelor ce
guverneaz procesele biologice de baz.
Tehnicile embrio-transferului sunt implicate n
biotehnologiile avangardiste, reprezentate de
clonare, obinerea de animale transgenice, sexarea
embrionilor.

Selecia donatoarelor de embrioni

Pentru a intra n programul de recoltare a embrionilor,
selecia donatoarelor se realizeaz pe baza anchetei
ginecologice globale, a examenului clinic i a examenului
transrectal individual.
Rezultatele trebuie menionate n Fia de Observaie
Ginecologic
Fia ginecologic se ntocmete individual i st la
baza seleciei donatoarelor

Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar

ANEXA 1

Facultatea de Medicin Veterinar

Clinica de Reproducie, Obstetric i Ginecologie Veterinar

Nume examinator
.

FI GINECOLOGIC DE SELECIE A DONATOARELOR

Numele vaciinr. matricol.rasa...
vrstaproprietatea.producia.
starea de ntreinere...
DATE ANAMNETICE ASUPRA PRODUCIEI
Nr.ftri

anterioare..cnd

avut

loc

ultima

ftare

sau

avortul..cum a decurs (eutocic,

distocic, complicaii)...
..
eliminarea placenteicomportarea n puerperium...
..
De ce boli a suferit animalul.
Apariia primului ciclu de clduri..
dac se repet..caracteristicile cldurilor (neregulate, linitite, inaparente,
intense)
La al ctelea ciclu de clduri a fost poliovulat....
Ce tratament de poliovulaie s-a aplicat.
EXAMENUL CLINIC EXTERN
Temperamentultemperaturapulsul

caracterele

luirespiraia..poziia femelei..
Bazinul (dezvoltare i conformaie).
Organul genital extern (vulva) poziiapigmentaia.
culoarea.infiltraieleziuni i cicatrici.
Dac se observ scurgeri vaginale: cantitatea.caracterul lor.
pH-ul lor..examenul bacteriologic
Antibiograma...
Leucograma

INDUCEREA I SINCRONIZAREA
ESTRUSULUI LA

1. SINCRONIZAREA ESTRULUI CU GESTAGENI

Aceast tehnic const n administrarea de steroizi cu
efect gestagen care inhib estrul i ovulaia, realiznd o
blocad a secreiei de hormoni hipofizari (feed-back
negativ efect Rebound).
Tratamentul are o durat de 11-13 zile, iar rezultatele
cele mai bune se obin atunci cnd se administreaz un
estrogen la nceputul tratamentului, avnd ca rezultat
regresia timpurie a corpului galben.
Durata tratamentului poate fi scurtat (7-9 zile) prin
administrarea unei doze de prostaglandin la sfritul
acestuia.

Preparate utilizate:
Progesteron;
Gestageni sintetici:
CAP chlormadinonacetat;
MAP Medroxiprogesteronacetat;
Melengestrolacetat;
Norgestomet.
Ci de administrare:
Parenteral sub form injectabil;
Intravaginal spirale, burei, etc.;
Subcutanat implante.

Tratamentul cu produse injectabile poate fi

eficient, ns este destul de incomod de realizat,
datorit faptului c necesit deplasarea zilnic a
medicului veterinar, pe toat durata tratamentului,
n vederea administrrii dozei necesare de hormon
gestagen.
Tratamentul intravaginal, cu ajutorul spiralelor
este deosebit de rspndit, fiind cunoscut pe plan
mondial sub forma metodei PRID (progesteron
releasing intravaginal device);
Spirala este din cauciuc siliconat i conine 1,5 g
progesteron (se elibereaz aprox. 60 mg/zi), iar la
captul cranial prezint o capsul ce conine 10
mg benzoat de estradiol.
Introducerea spiralei se face cu ajutorul unui
speculum tubular, iar cldurile apar la 30-40 de ore
de la suprimarea tratamentului. nsmnarea Spiral intravaginal
artificial se efectueaz la 56 h de la scoaterea
spiralei.
n urma meninerii intravaginale timp de mai multe
zile a spiralei, poate apare o uoar leucoree
local care ns nu influeneaz fertilitatea.

Metoda cu Norgestomet implant

Aceast metod presupune efectuarea unui implant subcutanat, la baza
urechii, cu un gestagen sintetic norgestomet . n urma implantului are
loc eliberarea zilnic a dozei necesare meninerii progesteronemiei la un
nivel adecvat obinerii efectului Rebound. Protocolul administrrii
presupune urmtoarele etape:
Se injecteaz 5 mg valerianat de estradiol i 3 mg Norgestomet i.m. (efect
luteolitic);
Se face implantul de Norgestomet s.c., la baza urechii;
Implantul se menine timp de 9 zile dup care se extrage;
Se efectueaz IA la 56 i 72 ore;
Se poate administra PMSG 400-700 UI.

SINCRONIZAREA CLDURILOR CU
PROSTAGLANDINE
Prostaglandinele reprezint o grup de substane cu
efect luteolitic apariia cldurilor realizndu-se la un
interval de 48-72 ore de la administrare. Cel mai
adesea, n urma administrrii prostaglandinelor
cldurile se manifest cu intensitate destul de sczut
(clduri silenioase), ceea ce necesit o supraveghere
atent a femelelor pentru determinarea momentului
optim pentru efectuarea nsmnrii artificiale. De
obicei se aplic dou administrri la interval de 11-12
Prosolvin
zile.
Produse utilizate:
PGF2alfa natural Dinoprost, Lutalyse.
Analogi sintetici: Cloprostenol (Estrumate);Luprostiol
(Prosolvin); Fluprostenol (Equimate); Prostianol.
nsmnarea artificial se efectueaz la 72 i 96 de
ore de la ultima administrare. La 48 de ore de la a doua
doz de PG se poate administra GnRH sau estradiol.

2. SINCRONIZAREA ESTRULUI CU AJUTORUL

UNEI ASOCIERI DE GESTAGENI I
PROSTAGLANDINE
Aceast metod permite reducerea administrrii sau
meninerii sursei de gestageni pn la 7 zile.
Administrarea gestagenilor are ca scop:
Inhibiia apariiei estrului i ovulaiei la vacile aflate n
faza folicular a ciclului;
Dezvoltarea CL mai receni de 5 zile pn la stadiul n
care reacioneaz la PG;
Administrarea PG va provoca luteoliza la vacile cu CL
funcional. La 2-4 zile dup terminarea tratamentului,
vacile vor intra n clduri.

Inducerea poliovulaiei la vacile

donatoare
Poliovulaia este procesul prin care se stimuleaz
eliberarea n cadrul aceluiai ciclu a unui numr mai
mare de ovule comparativ cu numrul caracteristic
speciei.
Principiul:
Tratamentele de inducere a poliovulaiei constau n
administrarea uneia sau mai multor doze de hormoni
foliculo-stimulatori (FSH sau PMSG) pe fondul unui corp
galben pe ovar (productor de progesteron), care este
luteolizat de o PGF2alfa i suplimentarea hormonului de
luteinizare (LH sau HCG) pentru a stimula fenomenul
ovulator natural.

Pentru inducerea poliovulaiei la vacile donatoare selecionate conform

fiei ginecologice prezentate, se utilizeaz gonadotropina seric
(PMSG) Folligon n doz unic de 2500 UI, administrat n ziua 9 10
a ciclului estral pe cale intramuscular. La 48 de ore de la administrarea
gonadotropinei serice, vacilor donatoare li se administreaz o doz de
prostaglandin F2 - 15 mg (Prosolvin). Att Folligonul ct i
Prosolvinul sunt produse ale firmei Intervet Olanda.
La dou trei zile de la administrarea prostaglandinei, donatoarele care
manifest clduri, sunt inseminate artificial de dou ori la interval de 12
ore.
nainte cu dou ore de prima inseminare, donatoarelor li se administrat
o doz de Neutra-PMSG pe cale intravenoas, urmat de o doz (1500
UI) de gonadotropin corionic (Chorulon) ambele fiind produse ale
firmei Intervet Olanda.

Produsele utilizate pentru inducerea poliovulaiei sunt

prezentate n imaginile de mai jos:

RECOLTAREA EMBRIONILOR
Tipuri de catetere i mediul utilizat pentru
recoltarea nechirurgical a embrionilor
Recoltarea embrionilor se efectueaz la 6,5 zile dup
inseminarea artificial pe cale nechirurgical, prin utilizarea a
trei tipuri de catetere.
Cele trei tipuri de catetere fac parte din grupul sondelor cu
dou ci de acces, avnd urmtoarele particulariti :
Cateterul Rusch
Cateterul MT tip CH 18
Cateterul Lampeter

Cateterul Rusch cu dou ci, confecionat din cauciuc

flexibil avnd 70 cm lungime i 7 mm diametru. Este prevzut
cu dou ci de acces:
o cale care permite att introducerea ct i recuperarea prin
alternan a mediul de recoltare;
o cale care asigur gonflarea balonaului obturator.
Rigidizarea acestui tip de cateter n vederea tunelizrii
cervixului donatoarei n momentul recoltrii, se realizeaz cu
ajutorul unui mandren confecionat din oel inoxidabil.
Cateterul prezint patru orificii de evacuare n zona apical,
prin intermediul crora se introduce i se recolteaz mediul de
splare din uter.

Cateterul MT tip CH 18 cu dou ci, produs de firma Minitub.

Sonda este confecionat din cauciuc fin i flexibil, avnd 70 cm

lungime i 7 mm diametru.
Cateterul dispune de dou ci :
o cale pentru introducerea i recuperarea n alternan a mediului
de recoltare ;
a doua cale asigur gonflarea balonaului fiind prevzut cu valv
i cu supap.
Captul sondei dispune imediat dup balona de dou deschideri, care
permit introducerea i recoltarea mediul de splare. Rigidizarea acestui
tip de sond, n vederea tunelizrii cervixului se realizeaz cu ajutorul
unui mandren confecionat din oel inoxidabil.

Cateterul Lampeter cu dou ci, este confecionat

dintr-un amestec de materiale plastice ce-i ofer
elasticitate i flexibilitate, fiind prevzut cu dou ci de
acces, care permit introducerea, recuperarea alternant a
mediului i fixarea la nivelul uterului donatoarei.
Comparativ cu celelalte dou sonde, acest tip de
cateter prezint imediat dup balona un vrf metalic,
prevzut cu 8 deschideri.
Pasajul cervixului donatoarei n momentul recoltrii
nechirurgicale a embrionilor se realizeaz prin rigidizarea
sondei cu ajutorul mandrenului confecionat din oel
inoxidabil.

Cateterul Lampeter

Pentru recoltarea nechirurgical a embrionilor se utilizeaz

mediul PBS (Phosphate Buffered Salin) produs al firmei Minitub
(Vigro Complete Flush).
Pungile cu mediu se pstreaz la temperatura laboratorului, iar
n momentul recoltrii se nclzesc ntr-o baie marin,
asigurndu-se 30oC vara i 35oC iarna. Recuperarea mediului de
splare s-a realizat n flacoane sterile transparente cu perei
dubli gradai, ceea ce permite controlul aspectului i cantitii
mediului introdus i recuperat.

Protocolul de recoltare
nainte de a fi utilizate, cateterele de recoltare sunt splate
n interior i la exterior cu ser fiziologic steril pentru a
ndeprta eventualele urme de dezinfectani ce pot avea
efect toxic asupra embrionilor.
De asemenea, cateterele se siliconeaz cu silicon spray
pentru a evita aderarea embrionilor n timpul recoltrii.
Donatoarele se contenioneaz, anesteziei epidurale cu 4
ml Lidocain 2% i administrarea i.m. a 10 ml uterorelaxant (Degraspamin produs de firma Graner-Elveia),
se leag coada animalului, se face toaleta i dezinfecia
regiunii perivulvare.

Protocolul de recoltare

Protocolul de recoltare

Sonda se introduce n vagin acoperit cu o cma de

protecie plasticat de unic folosin.
Cnd sonda ajunge la nivelul intrrii vaginale a cervixului,
sonda strpunge protecia i este orientat transrectal n
vederea trecerii barierelor inelare cervicale.

naintarea se realizeaz sub control transrectal,

centimetru cu centimetru, plasarea sondei fcndu-se
n treimea mijlocie a coarnelor uterine, la 4 5 cm de
bifurcaia coarnelor uterine, avnd astfel posibilitatea
recoltrii embrionilor aflai n treimea anterioar a
acestuia.
Dup poziionarea sondei n lumenul cornului uterin, se
umple balonul acesteia cu 8 10 12 cm 3 de aer, n
funcie de diametrul cornului.
Introducerea mediului de splare se realizeaz cu
ajutorul unor seringi cu o capacitate de 60 ml, iar
recoltarea intrauterin a acestuia se realizeaz n vase
de recoltare gradate, cu perei dubli

Mediul recoltat separat din cele dou

coarne uterine se menine 30 minute la
30oC pentru decantarea embrionilor,
dup care se ndeprteaz prin sifonare
supernatantul.
Ultimii 50 100 ml din mediul recoltat
se rein pentru examinarea la
stereomicroscop n vederea identificrii
i izolrii embrionilor
Imediat
dup
recoltare,
pentru
prevenirea
inflamaiilor,
au
fost
introduse
intrauterin
suspensii
constituite din 1 milion UI penicilin i
1gr streptomicin. Luteoliza corpilor
galbeni
de
la
nivelul
ovarelor
donatoarelor se realizeaz cu ajutorul
PGF2
(Prosolvin)
injectat
intramuscular imediat dup recoltare, n
doz de 15 mg per animal.

EVALUAREA
EMBRIONILOR
DE VAC

Dup recoltare i pn cnd este transferat,

embrionul face obiectul unui examen morfologic
minuios destinat aprecierii calitii sale n momentul
recoltrii i stabilirii anselor de dezvoltare.
Aceast apreciere necesit cunoaterea n prealabil
a stadiilor de dezvoltare a embrionilor, evoluia lor i
implicaiile manipulrilor excesive asupra morfologiei
acestora.

Identificarea embrionilor
Identificarea embrionilor din lichidul de splare utilizat
dup recoltarea intrauterin se bazeaz pe observarea
trsturilor morfologice ale acestora.
Embrionul este o structur sferic, compus din celule
(blastomere) nconjurate de o membran cu aspect
gelatinos constituind matricea acelular i reprezentnd
zona pelucid.
Zona pelucida prezint o varietate de funcii att timp ct
embrionul se afl n stadiile de dezvoltare intrapelucide,
fiind totodat un reper pentru identificarea embrionilor
datorit sfericitii i aspectului translucid uor de distins
printre detritusurile celulare.

Diametrul embrionului bovin se estimeaz a fi de 150-180 ,

incluznd grosimea membranei pelucida de 12-15 acesta
rmnnd constant pn n momentul nceperii expansiunii
blastocelice.
n timpul dezvoltrii embrionare, numrul de blastomere
crete n progresie geometric (1-2-4-8-16, etc.), aceste
diviziuni celulare fiind sincrone i n general meninute pn
n stadiul de 16 celule.
Dup acest stadiu, diviziunile devin asincrone, astfel nct
dup stadiul de 32 celule (morul) embrionul sufer
compactarea, fenomen ce ngreuneaz observarea i
identificarea individual a blastomerelor.

Cele mai importante criterii pentru identificarea

embrionilor sunt:
forma embrionilor ;
prezena zonei pelucide ;
mrimea ;
culoarea ;
cunoaterea vrstei embrionului.

Embrionul normal este considerat a fi cel care

prezint n structur blastomere integre, compacte cu o
coloraie, form i dimensiuni conforme stadiului de
dezvoltare.
Astfel un embrion este socotit normal dac la
recoltare n zilele:
2-3 posed 4 blastomere ;
3-4 posed 8 blastomere ;
4-5 posed 16 blastomere ;
5-6 posed morul timpurie ;
6-7 posed morul compact ;
7-8 posed blastocist tnr ;
8-10 posed blastocist expandat ;
9-11 blastocist eclozionat.

Criteriile morfologice de apreciere

a viabilitii embrionare

Stadiul
embrionar

Timp
scurs de
la IVF

Ovocit
fecundat

Ziua
fertilizrii

Stadiul de
2celule

Ziua a 2a

Stadiul de
4celule

36-48h

Stadiul de
8celule

Ziua a 4a

Morul

Ziua a 5a
a 6a

Morfologia
stadiului
embrionar

Stadiul
embrionar

Timp
scurs de
la IVF

Blastocist
tnr

Ziua a 7a

Blastocist

Ziua a 7a
a 8a

Blastocist
expandat

Ziua a 8a
a 9a

Blastocist
n ecloziune

Ziua a 9a

Morfologia
stadiului
embrionar

Identificarea embrionilor pe baza aspectelor morfologice

(dup Groza I. i col., 2005; Ciupe Simona, 2004)

Clasificarea embrionilor
embrioni exceleni (nota 5);

perfect sferici, simetrici;

cu blastomere poligonale uniforme;

vezicule citoplasmatice uniforme;

citoplasma agranular;

spaiul perivitelin liber, cu diametru regulat.

embrioni buni (nota 4);

sunt asemntori cu cei din clasa 5, dar sunt asimetrici, cu unele

celule separate de masa compact.
embrioni mijlocii (mediu) (nota 3);

cuprinde embrioni retardai cu o zi, cu blastomere sferice, de

mrime variabil, uneori putndu-se evidenia vezicule
intracelulare n numr redus.
embrioni slabi (nota 2);

cuprinde clasa embrionilor cu dezvoltare retardat cu 2 zile, cu

limitele celulare nedistincte.
embrioni necorespunztori (nota 1);

embrioni degenerai, cu vacuole intercelulare, zona pelucid

rupt, uor deformat.

Pe parcursul segmentrii sunt deosebite urmtoarele

stadii embrionare:
Stadiul timpuriu al clivajului embrionar care cuprinde
procesele de segmentare de la 0 la 16 blastomere, examenul
microscopic putnd s precizeze: numrul de celule prezente,
forma, simetria, mrimea acestora.

Stadiul de morul tnr: ncadrarea se face pe baza aspectului

blastomerelor i a numrului lor. n acest stadiu de dezvoltare,
blastomerele se prezint sub forma unor aglomeraii sferice ce
pstreaz conturul individual al fiecrei celule, spaiul perivitelin fiind
bine evideniat

Stadiul de morul compact: ncadrarea se face pe baza

aspectului compact al blastomerelor, fapt ce determin
imposibilitatea delimitrii celulelor unele de celelalte. n
acest stadiu, embrionul ocup 60 70% din spaiul
delimitat de membrana pelucida.

Stadiul de blastocistul tnr (timpuriu) se bazeaz pe

evidenierea apariiei cavitii lecitocelice care ocup 50
60% din spaiul intern al zonei pelucida. Se poate observa o
uoar difereniere ntre trofoblast i masa de celule
embrionare care apar mai compacte.

Stadiul de blastocist matur: se face pe baza observrii

trofoblastului care devine mult mai vizibil. n interior, masa
de celule embrionare devine mai compact, de culoare
nchis, masat uniform n interiorul zonei pelucida.

Stadiul de blastocist expandat: se stabilete pe seama

observrii
extensiei
blastocistului,
cu
modificarea
diametrului de la 150 190 microni la 1,2 mm. Zona
pelucida se subiaz foarte mult ajungnd la o treime din
grosimea anterioar de 1 15 microni, fapt datorat sporirii
numrului de celule (de la 70 la 180).

Embrionilor degenerai: n care sunt ncadrai embrionii cu

modificri morfologice clare, reprezentate de apariia n
numr mare a blastomerelor izolate ct i a vacuolizrilor
citoplasmatice nsoite uneori de apariia unor procese de
degenerescen celular i modificri la nivelul membranei
pelucida (fisuri, fragmentri, deformaii). n plus embrionii
prezint retard de peste o zi n dezvoltare vizavi de ziua
recoltrii.

CRIOCONSERVAREA
EMBRIONILOR
CURS 2

Crioconservarea embrionilor
Tehnicile de congelare/decongelare au evoluat n direcia
simplificrii etapelor de lucru, reuindu-se s se dezvolte
metode rapide, uor utilizabile n producie.
Avantajele crioconservrii embrionilor sunt considerabile
i vor asigura desigur un impact asupra creterii
animalelor, similar celui obinut cu crioconservarea
spermei.

Conservarea prin congelare presupune un complex de

procese fizico-chimice de transport al apei i temperaturii
ntre embrion i mediul de conservare, supravieuirea fiind
condiionat de prezena substanelor crioprotectoare, n
concentraii de 1-2 M, adugate n mediul de conservare.
Viteza de conservare trebuie s fie foarte rapid pentru a
se putea evita formarea de noi cristale (recristalizarea),
care prin aciunea mecanic produc i ntrein leziuni
ireversibile pentru celul.
Supravieuirea celular depinde n esen de condiiile n
care se produc modificrile apei celulare, agentul
crioprotector, concentraiile acestuia n mediu, viteza de
rcire, viteza de decongelare i modul de eliminare a
crioprotectorului

Agenii crioprotectori
Intracelulari reprezentai de substane cu greutate
molecular mic (alcooli), care asociate cu moleculele de
ap ptrund n interiorul celulei: dimetilsulfoxidul (DMSO),
glicerolul, metanolul i etilenglicolul. Prin dislocarea unei
cantiti determinate de ap i asocierea cu aceasta,
crioprotectorul scade punctul de cristalizare, diminu
cantitatea i natura cristalelor de ghea formate n timpul
congelrii /decongelrii i previne creterea excesiv a
concentraiei srurilor n celule;
Extracelulari reprezentai de substane cu greutate
molecular mic sau mare care nu ptrund n celul i care
i exercit efectul crioprotector prin: deschiderea celulei
reprezentantul de baz fiind sucroza, colmatarea zonelor
penetrabile ale membranei n timpul congelrii, asigurnd
revenirea funciei membranei dup decongelare prin lipidele
pe care le conin.

Temperatura de stocare
La majoritatea speciilor domestice,
dup temperatura de - 330C, - 350C,
deshidratarea celulelor este optim,
embrionii putnd fi plonjai direct n
azot lichid la 1960C, stocarea
realizndu-se n containere cu azot
lichid, prevzute cu suporturi pentru
stocare (canistre) .

Personalizarea paietelor i containerelor de

stocare a embrionilor
Etichetarea containerelor i paietelor utilizate n scopul
conservrii pe timp ndelungat a embrionilor se realizeaz
dup sistemul IETS (International Embryo Transfer Society),
astfel nct oricine s poate identifica embrionii din fiecare
recipient de stocaj.
Identificarea paietelor se realizeaz prin inscripionarea
direct cu ajutorul markerelor permanente a urmtoarelor
date:
codul companiei care a congelat embrionul;
rasa i numrul de nregistrare a donatoarei notat sub forma
unor abrevieri bine stabilite de IETS i cunoscute de toat
lumea;
rasa i numrul de nregistrare al taurului notat n pedigri;
numrul paietei;
ziua recoltrii notat ncepnd cu anul, luna i ziua;
numrul embrionilor din paiet.

Tehnica de congelare a embrionilor

Aparatul de congelare care
se preteaz cel mai bine
condiiilor existente la nivel de
ferm este produs n S.U.A.
de ctre firma Cryogenetic i
are ca principiu de funcionare
plasarea gradat a paietelor
care conin embrioni i mediul
crioprotector n vapori de azot
lichid, efectuarea seedingului
la 6oC, apoi rcirea treptat
pn la atingerea temperaturii
ce permite plonjarea n azot
lichid

Aparatul de msurare a temperaturii

Pipeta de aspiraie automat

Agenii crioprotectori recomandai a fi

utilizai sunt :
glicerolul n concentraie de 0,47 M ;
0,94 M ; 1,4 M n PBS Vigro ;
glicerol 1,5 M n PBS Vigro ;
etilen glicol 1,5 M i sucroz 0,1 M
(Mediul Vigro produs al firmei Minitub din
Germania)

1. Congelarea n diluii succesive de glicerol

2. Congelarea n glicerol ntr-un singur pas

3. Metoda de congelare n etilen glicol 1,5 M

i sucroz 0,1 M

Decongelarea embrionilor
Decongelarea unui embrion comport dou fenomene:
renclzirea de la -1960C, temperatura azotului lichid, la o
temperatur de 200C i apoi 370C.
extragerea crioprotectorului prezent n celulele embrionilor.
Renclzirea este instantanee i n funcie de starea de
deshidratare a embrionului. Acestea avantajeaz tehnicile
recente de congelare unde embrionul este plonjat n azot
lichid. Embrionul nu este renclzit lent pentru a nu se
deshidrata. Renclzirea este obinut simplu prin
plonjarea paietei n ap cald.
Procesul de extracie a crioprotectorului poate influena
supravieuirea celulelor datorit ocului osmotic. Fiind
sensibile la mediile hipotonice, unele pot s sufere
fenomenul de gonflare i s se sparg. Apa traverseaz
mai rapid membranele celulare fa de etilenglicol.

Indiferent de metoda utilizat, trebuie corelate cele dou

viteze, de congelare i decongelare.
O congelare lent permite deshidratarea important a
embrionilor, deci a celulei, impune o nclzire lent
pentru evitarea diferenei importante de presiune
osmotic care ar putea sparge celula.
O rcire rapid antreneaz formarea unor mici cristale
intracelulare. O renclzire lent permite o recristalizare
n cristale mari ce pot sparge celula.

1. Decongelarea embrionilor de vac n

soluii succesive de glicerol

2. Decongelarea embrionilor de vac ntr-un

singur pas cu glicerol 1,5M

3. Decongelarea embrionilor de vac n

etilen glicol 1,5M i sucroz 0,1M

TRANSFERUL EMBRIONAR
Cu toate rezultatele bune obinute n urma transferului
chirurgical al embrionilor, obligativitatea interveniei
chirurgicale att la femela donatoare ct i la femela
receptoare de embrioni, cu urmri negative asupra
repetabilitii operaiunilor de embrio-transfer a constituit
un obstacol important n extinderea pe scar larg a
embrio-transferului. De aceea a fost necesar o metod
mai simpl i mai expeditiv de transfer a embrionilor la
vac.
Reuita transferului de embrioni este supus influenei
unui numr mare de factori printre care se numr i
modalitatea de transfer al embrionilor (tipul de inovulare).
Dup recoltarea i selectarea morfologic, embrionii sunt
transferai n stare proaspt sau dup congelare, la
femelele receptoare a cror ciclu estral a fost sincronizat
cu a donatoarelor

Este preferabil ca transferul embrionilor s fie realizat la

tineretul femel i primipare ntruct prezint mai puine
probleme privind infeciile genitale, iar rspunsul la
tratamentele de stimulare este mai bun.
Transferul nechirurgical de embrioni la vacile receptoare
se poate face cu embrioni proaspt recoltai, embrioni
decongelai i embrioni provenii din fecundarea in vitro.
Efectuarea
transferului
nechirurgical
const
n
depunerea embrionului n corpul uterin ipsilateral
corpului galben cu ajutorul unor instrumente introduse n
lumenul uterin prin traiectul cervical.
n vederea utilizrii practice a transferului nechirurgical n
fermele de producie, au fost construite pn n prezent
o serie de instrumente care permit depunerea
embrionilor la diferite nivele ale corpului uterin.

Factorii care pot afecta transferul nechirurgical

al embrionilor pot fi reprezentai de :
calitatea embrionului;
mediul uterin al receptoarei;
sincronizarea estrului dintre donatoare i receptoare;
prevenirea infeciilor;
situsul de transfer;
tehnica de transfer i priceperea operatorului;
calitatea receptoarelor;
statusul nutritiv al receptoarelor.

Alegerea femelelor receptoare de embrioni

Alegerea cu atenie a femelelor receptoare de embrioni
este o condiie esenial a reuitei embrio-transferului.
Cele mai importante criterii care stau la baza alegerii
femelelor receptoare de embrioni sunt:
starea general de sntate,
integritatea funcional a organelor genitale,
activitatea ciclica a ovarelor i a cilor genitale.
Astfel, este preferabil ca transferul de embrioni s se fac
la viel i vaci primipare, ntruct prezint mai puine
probleme de reproducie legate de infeciile genitale,
traumatismele peri parturiale, iar rspunsul la
tratamentul de sincronizare este mult mai bun.
Cu toate c receptoarele sunt aparent mai uor de
selecionat, devin o problem complex care preocup
cercettorii din domeniul transferului de embrioni

naintea efecturii transferului, precum i dup efectuarea

lui, se evit factorii stresani ca:
schimbarea brusc a regimului furajer,
intervenia personalului pentru separarea sau
mutarea animalelor alese,
variaiile climatice,
aciuni sanitar veterinare etc.
n acest context se are n vedere realizarea unui echilibru
hormonal sincron, metabolic, de histocompatibilitate,
pentru a pstra calitatea mediului uterin care
condiioneaz implantarea, nidarea sau din contr
respingerea embrionului

1. Tehnica de inovulare cu ajutorul pistoletului Cassou

Pistoletul telescopic tip Cassou permite extensia n lumenul
uterin a unei piese flexibile din plastic, denumit aspibrion,
care conine minipaieta cu embrionul aflat n mediul de
cultur. n acest fel, embrionul poate fi depus profund n
lumenul cornului uterin, aproape de vrf.

Tehnica inovulrii

Menionm c aceast tehnic necesit pe lng operatorul calificat,

special pregtit pentru efectuarea acestei tehnici, i prezena unui ajutor
care s acioneze tija pistoletului.

2. Tehnica cu inovulatorul tip MT

Acest inovulator are o construcie mult mai simpl, fiind foarte
asemntor cu un pistolet de nsmnare artificial, alctuit
dintr-o tija, in interiorul creia se gsete un mandren.
Prezint de asemenea un vrf demontabil i prezint un
orificiu lateral pentru depunerea embrionului. Paieta se
introduce fie prin demontarea vrfului, fie prin adaptarea la tij

Protocolul inovulrii

Aceast tehnic este superioar celei cu

inovulatorul tip Cassou, deoarece :
nu este nevoie de prezena ajutorului, i chiar mai mult,
manopera poate fi executat cu uurin de ctre
medicul veterinar cu minime cunotine de nsmnare
artificial;
nu necesit fonduri suplimentare pentru achiziionarea
ghenelor;
nu exist riscul ca ghena s rmn n lumenul uterin;
dispare riscul refulrii materialului n interiorul ghenei.

METODE CLINICE DE DIAGNOSTIC AL

GESTAIEI LA ANIMALE

Diagnosticul de gestaie prin metode clinice

Anamneza
Examenul clinic extern
Inspecia: Modificarea conturului
abdominal, Edemele declive, Dezvoltarea
glandei mamare, Edemaierea organelor
genitale externe, Relaxarea i infiltraia
ligamentelor i articulaiilor bazinului
semne sigure: Micrile fetuilor

Palpaia:
la vac ncepnd din luna a VI-a de
gestaie,

Ascultaia:
din lunile VII - VIII la vac

Examenul clinic intern

Examenul vaginal cu speculum
culoarea mat a mucoasei vaginale n primele dou treimi de
gestaie i o congestie vaginal cu evidenierea reelei venoase n ultima
treime i mai ales n preajma ftrii;
prezena unei glazuri de mucus vscos, mat, aderent de mucoasa
vaginal;
perfecta nchidere a cervixului i prezena unui dop de mucus
cervical;
poziia cervixului care variaz n funcie de cornul gestant i de
vrsta fetusului.

Examenul vaginal manual se face pentru a constata gradul

de permeabilitate a cervixului.

Examenul transrectal

topografia cervixului i starea lui de nchidere;

topografia uterului;
mrimea cornului gestant;
perceperea fluctuaiei;
palparea placentoamelor;
palparea embrionului, iar apoi a prilor din ft;
palparea arterei uterine medii i posterioare;
persistena corpului galben de gestaie dac ovarul poate fi
palpat.

Aplicarea radiografiei

ECOGRAFIA

Gestaie de 17-19 zile

Gestaie 24 zile

Gestaie 26 zile (gemeni)

Gestaie 25 zile

Gestaie 27 zile

Gestaie 30 zile

Gestaie 42 zile

Gestaie 35 zile

Gestaie 55 zile

Gestaie 58 zile

Gestaie 61 zile

Gestaie 63 zile

Gestaie 65 zile