Sunteți pe pagina 1din 47

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN

VETERINAR CLUJ NAPOCA


COALA DOCTORAL DE TIINE AGRICOLE INGINERETI
DOMENIUL BIOTEHNOLOGII

COSMIN POP

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

UTILIZAREA UNOR TEHNOLOGII MODERNE DE


USCARE A EXTRACTELOR DE PLANTE CU ACIUNE
ANTIMICROBIAN

Coordonator tiinific
Prof. Dr. Carmen Socaciu

Cluj Napoca
2014

Cuprins
INTRODUCERE ............................................................................................................................ I
PARTEA I ....................................................................................................................................VI
Capitolul 1 ....................................................................................................................................VI
PLANTE MEDICINALE CU POTENIAL ANTIMICROBIAN .................................................VI
Capitolul 2 ....................................................................................................................................VI
TEHNOLOGII MODERNE DE USCARE A EXTRACTELOR DE PLANTE..............................VI
Capitolul 3 ................................................................................................................................ VIII
MICROORGANISME PATOGENE DIN ALIMENTE,............................................................. VIII
PARTEA A DOUA.................................................................................................................... VIII
CERCETRI PROPRII.............................................................................................................. VIII
Capitolul 4 ................................................................................................................................. VIII
OBINEREA I CONCENTRAREA EXTRACTELOR............................................................ VIII
4.1. STUDIU EXPERIMENTAL 1. OBINEREA I CARACTERIZAREA EXTRACTELOR
APOASE I HIDROACLCOOLICE DIN 7 PLANTE MEDICINALE INDIGENE CU
POTENIAL ANTIMICROBIAN ............................................................................................. VIII
4.1.1 Materiale i metode ..............................................................................................................IX
4.1.1.1. Obinerea extractelor brute din cele 7 plante investigate.................................................... X
4.1.1.2. Metode de analiz a extractelor ........................................................................................XI
Analiza spectrometric UV-Vis, determinarea fenolilor totali........................................................XI
4.1.1.3. Analiza microbiologic semicantitativ, pe mediu solid .................................................. XII
4.1.2. Rezultate i discuii............................................................................................................ XII
4.1.2.1. Descrierea extractelor apoase i hidroalcoolice ............................................................. XII
4.1.2.2. Analiza spectrometric UV-Vis, i concentraia de compui fenolici .............................. XIII
4.1.2.3.Evaluarea comparativ a activitii antimicrobiene a extractelor, pe mediu solid cu agar
...................................................................................................................................................XIV
4.1.3 Concluzii ...........................................................................................................................XVI
4.2. STUDIUL EXPERIMENTAL 2. OBINEREA I CARACTERIZAREA EXTRACTELOR
DE SALCIE VSC I FRUNZE DE NUC ...............................................................................XVII
4.2.1.2. Spectru UV-Vis i determinarea concentraiilor de compui fenolici totali ....................XVII
4.2.1.3. Analiza cromatografic HPLC i detecie cu fotodiod (HPLC_DAD)........................ XVIII
4.2.1.4. Analiza microbiologic pe mediu solid (semi-cantitativ) i lichid (cantitativ) .......... XVIII
4.2.1.5. Analiza metalelor din extractele apoase de salcie, vsc i nuc..................................... XVIII
4.2.3. Rezultate i discuii...........................................................................................................XIX
4.2.3.1. Caracterizarea spectrelor UV-Vis i a cromatogramelor HPLC-DAD a celor trei extract
...................................................................................................................................................XIX
4.2.3.2. Evaluarea semicantitativ a activitii antimicrobiene pe mediu solid ............................ XX
4.2.3.3. Evaluarea cantitativ a activitii antimicrobiene pe mediu lichid ................................XXII
Dezvoltarea microorganismelor pe mediu lichid ........................................................................XXII
4.2.3.4. Analiza metalelor din extractele brute de salcie, nuc i vsc ....................................... XXIV
4.2.5. Concluzii ........................................................................................................................ XXV

Capitolul 5 .............................................................................................................................. XXVI


OBINEREA I CARACTERIZAREA FIZICO CHIMIC A PUDRELOR OBINUTE,
COMPARATIV PRIN CELE TREI TEHNICI DE USCARE.................................................. XXVI
5.1. MATERIALE I METODE ............................................................................................. XXVI
5.1.1. Obinerea extractelor i analiza spectrometric a compuilor fenolici............................. XXVI
5.1.2. Determinarea activitii antioxidante (DPPH) ................................................................ XXVI
5.1.3. Analiza spectrometric FT-IR........................................................................................ XXVI
5.1.4. Echipamente i tehnici utilizate pentru uscarea extractelor i obinerea pudrelor ...........XXVII
5.2. REZULTATE I DISCUII .......................................................................................... XXVIII
5.2.1. Caracterizarea pudrelor obinute ................................................................................. XXVIII
5.2.2. Coninutul total de polifenoli al pudrelor, comparativ cu extractele crude ...................... XXIX
5.2.3. Caracterizarea amprentei spectroscopice FT-IR a extractelor brute i a pudrelor obinute
................................................................................................................................................ XXXI
5.2.4. Activitatea antioxidant a pudrelor obinute, comparativ cu continuul n polifenoli....... XXXI
5.3. CONCLUZII ...............................................................................................................XXXII
Capitolul 6 ........................................................................................................................... XXXIV
EFICIENA ANTIMICROBIAN A PUDREI DE SALCIE FIXAT PE MALTODEXTRIN
(MD) SAU SARE (S) TESTAT PE CINCI TIPURI DE MICROORGANISME ................ XXXIV
6.1 MATERIALE I METODE ........................................................................................... XXXIV
6.2. REZULTATE I DISCUII ............................................................................................XXXV
6.2.1. Efectul extractului de pudr de salcie fixat pe MD sau S, asupra dezvoltrii
microorganismelor: studiu pe mediu solid evaluare calitativ .............................................XXXV
6.2.2 Evaluarea semicantitativ a efectului, extractului de pudr de salcie fixat pe MD sau S,
asupra dezvoltrii microorganismelor pe plci de agar......................................................... XXXVII
6.4. CONCLUZII ................................................................................................................. XXXIX
CONCLUZII GENERALE................................................................................................... XXXIX
BIBLIOGRAFIE ....................................................................................................................... XLII

INTRODUCERE
Industria alimentar precum i industria farmaceutic sunt ntr-o continu evoluie,
aprnd pe pia noi porduse, folosind tehnologii tot mai avansate i mai rapide. Odata cu
creterea produciei i complexitarea proceselor tehnologice o problem foarte important o
are imerea sub control a microorganismelor care pot cu uurin contamina prosusele i
liniile tehnologice. n prezent produsele folosite pentru indeprtarea microorganismelor sunt
artificial produse n industrie, ele necesit a fi stocate n locuri speciale, folosirea lor se face
cu mult grij i atenie deoarece pot pune n pericol sntatea uman, iar dup utilizare
apele provenite n urma procesului de dezinfectare conin cantiti mari de acizi, produi
alcalini i sod, necesit tratate nainte de a fi deversate n laucuri, ruri sau iazuri.
Produsele realizate din extracte de plante cu ajutorul tehnologiilor inovatoare, care
sunt mai prietenoase cu mediul nconjurtor dect cele chimice, i doresc substituirea
produselor chimice clasice.
Prin aceast lucrare se vrea realizarea unei alternative la dezinfectanii clasici i
nlocuirea lor cu biodezinfectante care nbin tehnologile avansate de procesare (uscare,
imobilizare, stocare) cu extracia clasic din plante, realiznd n final un produs pentru
industria alimentar ct i pentru utilizatorii caznici. Noul produs va fi mult mai uor de
manipulat i stocat, nu va necesita condiii speciale pentru transport, avnd un volum redus
fiind sub form de pudr.
Literatura de specialitate a demonstrat faptul c foarte muli compui care se pot
extrage din diferite plante au efecte duntoare mpotriva culturilor de microorganisme,
unele microorganisme sunt rezistente la antibiotice, dar sunt foarte repede eliminate de
subtanele active gsite n plante.
Aadar referitor la climatul local i la diversitatea mare de plante care se pot gsi pe
teritoriul Romniei am ales un numr de plate care se ntalnesc i se utilizeaz n diferite
domenii i aplicaii. Plantele selectate sunt plante ornamentale Tagetes erecta (Aztec
marigold), Tagetes patula (French marigold), plante care se folosesc n domeniul culinar
(Coriandrum sativum (coriandru), Rosmarinus officinalis (rosmarin), Ocimum basilicum
(busuiocul) i Satureja Montana (cimbru), dar i plante slbatice Urtica dioica (urzic),
Chelidonium majus (rostopasc).

Procedeul de extracie al compuilor activi a fost realizat cu ajutorul unui proces


apos, folosindu-se un amestec de ap distilat i acid clorhidric (1%). Amestecul de ap
acidulat (85%) i plante (15%) a fost lsat la macerat timp de 24 ore, procedeu n urma
cruia au fost extrase o mare parte a compuilor activi printre care se numar produii
acizilor fenolici i flavonoidele.
Plantele investigate sunt cunoscute a fi bogate n derivai polifenolici cu activitate
anti-microbian (Niamh et al., 2009; elik and Wendel, 2005; Pop, 2013). Flavonoidele
formeaz o grup mare de compui chimici din familia derivailor polifenolici, cu potenial
antimicrobian (incluznd acizii fenolici, flavone i izoflavone, dihidroflavone) (Day and
Harborne, 1993; Harborne and Williams, 2000; Cardonaa et al., 2013; Neveu et al., 2010).
Polifenolii sunt prezeni n diferite plante medicinale, inclusiv n fructe, cereale, ceai, cafea,
vin (Sarica et al., 2005), dar i n plante ornamentale (Areej et al., 2013; Couto et al.,2012),
fiind dovedit faptul ca au activiti anti-microbiene (Nichenametla, 2006).
Polifenolii existeni n diferite plante au un efect anti-inflamator, protector mpotriva
stresului oxidativ, efect care este corelat cu efectul de prevenie al arterosclerozei i al altor
maladii cardiovasculare (Qadan et al., 2005; Chizzola et al, 2008; Kale et al., 2012;
Amarowicz et al, 2009; Papageorgiou et al., 2008; Werner and Ros, 2010; Deepinderjeet
and Sachin, 2013).
n prezent sunt folosite tehnologii avansate pentru evaporarea coninutului de ap din
extracte de plante n mediu controlat (la temperaturi sczute sau ridicate), cu scopul de a
pstra intacte componentele fitochimice bioactive i proteinele (Desobry et al. 1997; Hottot
et al., 2004; Zhao et al., 2013; Zhang, et al. 2010).
Atomizarea este tehnologia cea mai folosit n industria alimentar i farmaceutic.
Tehnologia funcioneaz n proces continuu, temperatura de uscare i prelucrarea produsului
trebuie s ramn constant, fiind posibile ajustri de parametri pe perioada uscrii.
(Masters, 1991; De Souza et al. 2009)
Uscarea n pat fluidizat este o metod protectoare, utiliznd aerul cald care intra n
contact cu produsul de jos n sus, uscnd, aglomernd sau concentrnd diferite produse
(Grace et al., 2008), la o temperatur scazut (max. 800C), putndu-se folosi i la extracte
alcoolice. Acest preoces este uor de controlat i este foarte uor s trecem de la studiu de
laborator la producie. Produsul obinut este sub forma unei pudre fine, care trebuie
II

manipulat cu grij, pentru c poate s produc explozii urmate de distrugeri sau rniri
(Araruna et al., 2013). Usctorul n pat fluidizat se folosete n industria alimentar pentru a
usca i acoperii diferite produse alimentare, dar se regsete i n industria farmaceutic
(Desobry et al., 1997; Jaros and Pabis, 2006).
Uscarea prin crioevaporare, cunoscut i sub denumirea de liofilizare, ndeprteaz
apa prin nghearea produsului la presiuni sczute, proces care are patru etape: pre-tratearea,
nghearea, uscarea primar i uscarea secundar (Patapoff et al., 2002; Builders et al.,
2010). Pre-tratarea se folosete pentru a proteja diferitele componente ale produsului
mpotriva formrii cristalelor de ghea care pot distruge produsul. Procesul de ngheare
este lent, temperturile sunt cuprinse ntre 500C i 800C, la o presiune de civa miliBarr
(Hottot et al, 2004). Uscarea primar ndeparteaz pn la 95% din cantitatea de ap
existent n produs. Sub aceste condiii apa trece din form solit n form gazoas i poate
s dureze pn la 2 3 zile. Procesul de uscare secundar este folosit pentru a elimina apa
care este legat chimic de produs (Pathomwichaiwat et al., 2012). Liofilizarea se folosete
pentru materialele sensibile la temperaturi ridicate, cum ar fi proteinele, enzimele,
microorganismele i plasma sanguin, este un procedeu costisitor, dar protejeaz diferitele
componente active.
Pentru a confirma faptul c produsul rezultat are efect antrimicrobian s-au folosit
cinci tipuri de microorganisme (E. coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,
Bacillus cereus i Salmonella).
Scopul prezentei lucrri a fost utilizarea unor tehnologii moderne de uscare
(atomizare, uscare n pat fludizat i liofilizare) a unor extracte de plante din flora indigen,
avnd potenial antibacterian cunoscut.
Obiectivele principale ale studiilor experimentale au fost:
1. Obinerea de extracte apoase i hidroalcoolice din 7 tipuri de plante indigene.
2. Caracterizarea compoziiei n compui fenolici a extractelor, amprenta
spectroscopic, cromatografic i activitatea antioxidant.
3. Evidenierea aciunii antimicrobiene a extractelor prin teste calitatitive i
cantitative pe medii de cultur nsmnate cu diferite tipuri de bacterii.
III

4. Utilizarea extractelor apoase de salcie, nuc i vsc pentru a obine pudre pe


diferite matrici ( maltodextrin, sare sau lactoz) prin tehnologii de uscare
diferite: atomizare, uscare n pat fludizat i crioliofilizare.
5. Caracterizarea fizico-chimic a pudrelor obinute din extractele de salcie, nuc i
vsc.
6. Testarea efectului antibacterian al pudrei de salcie fixate pe maltodextrin sau
sare, cu potenial de a fi utilizate ca biodezinfectante.
Structura tezei. Lucrarea de fa este structurat n dou pri, prima reprezentat de
studiul literaturii de specialitate i a doua, axat pe contribuii originale.
Prima parte (Studiu de literatura) cuprinde 3 capitole (1-3):
Capitolul 1 prezint informaii de baz despre tipurile de plante investigate Aztec
marigold (Tagetes erecta), French marigold (Tagetes patula ), Urzic (Urtica
dioica), Rostopasc (Chelidonium majus), Coriandru (Coriandrum sativum),
Rozmarin (Rosmarinus officinalis), Busuioc (Ocimum basilicum), Cimbru (Satureja
Montana), Vsc (Viscum album), Nuc (Juglans regia) i Salcie (Salix alba). Toate
aceste plante au fost alese deoarece literatura de specialite a demonstrat c o mare
parte din componentele active ale aestora au numeroase activiti, printre care se
numr i activitatea antimicrobian.
Capitolul 2 prezint date despre tehnologiile moderne de evaporare a apei utiliznd
trei metode diferite de evaporare, dou care utilizeaz aerul cald (atomizarea i
uscarea n pat fluidizat) i una care folosete temperatura i presiunea sczut
(liofilizarea). Fiind prezentat i aplicabilitatea acestor tehnologii n industrie n acest
moment.
Capitolul 3 include date de literatura privind diferitele microorganisme care au o
frecven mare de apariie n industria alimentar (E. coli, Staphylococcus aureus,
Listeria monocytogenes, Bacillus cereus i Salmonella), caracterizarea lor morfo
funcional i potenialul lor de patogenitate.
Partea a doua ( Cercetri proprii) cuprinde 3 capitole (4-6):
Capitolul 4 conine date experimentale cu privire la obinerea extractelor din plantele
investigate utiliznd diferite metode de extracie, n mediu apos precum i n mediu
IV

alcoolic. Fiind investigat cea mai ecologic i rapid metod de extracie, dar i care
plante au avut cea mai mare cantitate de componeni activi cu efect antibacterian.
Capitolul 5 cuprinde date despre modul de obinere al pudrelor folosind cele trei
metode de evaporare a apei, precum i comportamentul maltodextrine (MD), srii (S)
i al alactozei (L), matrici supuse la condiii de evaporare diferite.
Capitolul 6 include datele obinute privind eficiena antimicrobian a pudrei de
salcie fixat pe maltodextrin (MD) sau sare (S)
O parte a acestei teze de doctorat a fost realizat la VLB Berlin un institut de
cercetare pentu produse alcoolice i non alcoolice din Germania, n colaborare cu
Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar, Cluj - Napoca, Romnia, ca
urmare a obinerii unui grant pus la dispoziie de Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU
Fundaia German de Mediu) n perioada septembrie 2011 - august 2012.

PARTEA I
Capitolul 1
PLANTE MEDICINALE CU POTENIAL ANTIMICROBIAN
n capitolul 1 sunt prezentate plantele medicinale utilizate pentru studiul experimental
fcndu-se referire la caracteristicile morfo-fiziologice ale plantelor Tagetes sp (Tagetes erecta
(Aztec marigold) i Tagetes patula (French marigold)), Urtica dioica (Urzica), Chelidonium majus
(Rostopasc), Coriandrum sativum (Coriandru), Rosmarinus officinalis (Rozmarin), Ocimum
basilicum (Busuiocul), Satureja Montana (Cimbru), Viscum album (Vsc), Juglans regia (Nuc) i
Salix alba (Salcie) i la compuii bioactivi din acestea.

Capitolul 2
TEHNOLOGII MODERNE DE USCARE A EXTRACTELOR DE PLANTE
n capitolul II sun prezentate tehnologiile de uscare a extractelor de plante ntr-un mediu
controlat (la temperaturi sczute sau ridicate), cu scopul de a pstra intacte componentele
fizicochimice bioactive i proteinele (Desobry et al. 1997; Hottot et al., 2004; Zhao et al., 2013;
Zhang, et al. 2010).
Atomizarea este tehnologia cea mai folosit n industria alimentar i farmaceutic.
Tehnologia funcioneaz n proces continuu, temperatura de uscare i prelucrarea produsului
ramne constant, fiind posibile ajustri de parametri pe perioada uscrii. (Masters, 1991; De Souza
et al. 2009)
Uscarea n pat fluidizat este o metod protectoare, utiliznd aerul cald care intr n contact
cu produsul de jos n sus, uscnd, aglomerand sau concentrnd diferite produse (Grace et al., 2008),
la o temperatur scazut (max. 800C), putndu-se folosi i la extracte alcoolice. Acest preoces este
uor de controlat i este foarte uor s trecem de la studiu de laborator la producie. Produsul obinut
este sub forma unei pudre fine, care trebuie manipulat cu grij, ea putnd produce explozii urmate
de distrugeri sau rniri (Araruna et al., 2013). Uscarea n pat fluidizat se folosete n industria
alimentar pentru a usca i acoperii diferite produse alimentare, dar ea se regsete i n industria
farmaceutic (Desobry et al., 1997; Jaros and Pabis, 2006).

VI

Uscarea prin crioevaporare, cunoscut i sub denumirea de liofilizare, ndeprteaz apa prin
nghearea produsului la presiuni sczute, proces care are patru etape: pre-tratearea, nghetarea,
uscarea primar i uscarea secundar (Patapoff et al., 2002; Builders et al., 2010). Pre-tratarea se
folosete pentru a proteja diferitele componente ale produsului mpotriva formrii cristalelor de
ghea care pot distruge produsul. Procesul de ngheare este lent, temperturile sunt cuprinse ntre
500C i 800C, la o presiune de civa miliBarr (Hottot et al, 2004). Uscarea primar ndeparteaz
pn la 95% din cantitatea de ap existent n produs. n aceste condiii apa trece din form solit n
form gazoas i poate s dureze pn la 2 3 zile. Procesul de uscare secundar este folosit pentru
a elimina apa care este legat chimic de produs (Pathomwichaiwat et al., 2012). Liofilizarea se
folosete pentru materialele sensibile la temperaturi ridicate, cum ar fi proteinele, enzimele,
microorganismele i plasma sanguin, este un procedeu costisitor, dar protejeaz diferitele
componente active.
Plantele cum ar fi nucul, vscul i salcia sunt cunoscute a fi bogate n derivai polifenolici cu
activitate anti-microbian (Niamh et al., 2009; elik and Wendel, 2005; Pop, 2013). Flavonoidele
fromeaz o grup mare de compui chimici din familia derivaiilor polifenolici, cu potenial
antimicrobian (incluznd acizii fenolici, flavone i izoflavone, dihidroflavone) (Day and Harborne,
1993; Harborne and Williams, 2000; Cardonaa et al., 2013; Neveu et al., 2010). Polifenolii sunt
prezeni n diferite plante medicinale, inclusiv n fructe, cereale, ceai, cafea, vin (Sarica et al.,
2005), dar i n plante ornamentale (Areej et al., 2013; Couto et al.,2012), fiind dovedit faptul c au
activiti anti-microbiene (Nichenametla, 2006).
Polifenolii existeni n diferite plante au un efect anti-inflamator,

protector mpotriva

stresului oxidativ, efect care este corelat cu efectul de prevenie al arterosclerozei i al altor maladii
cardiovasculare (Deepinderjeet and Sachin, 2013).
Atomizarea este un proces de evaporarea al apei folosind un flux de aer cald. Aparatul
pulverizeaz o perdea fin de vapori, vapori care intr n contact cu fluxul de aer sunt transformai
ntr-o pudr fin, care se separ gravimetric ntr-un ciclon.
Procesul de liofilizare folosete pentru evaporarea apei temperaturi joase (-600C) i presiuni
care ajung aporape la valoare vidului (milibari). Combinaia de temperatur i presiune sczut face
ca apa aflat n soluia procesat s se evapore, rezultnd un produs lipsit de ap.

VII

Capitolul 3
MICROORGANISME PATOGENE DIN ALIMENTE,

n capitolul 3 sunt descrise cteva tipuri de mincroorganisme cu inciden mare n industira


alimentar, E. coli, Bacilus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella i Listeria monocytogenes,
care au fost selectate pentru investigaiile antimicrobiene. Sunt descrise particularitile morfologice
i factorii care determin proliferarea acestora.

PARTEA A DOUA
CERCETARI PROPRII
Capitolul 4
OBINEREA I CONCENTRAREA EXTRACTELOR
4.1. STUDIUL EXPERIMENTAL 1. OBINEREA I CARACTERIZAREA
EXTRACTELOR APOASE I HIDROACLCOLICE DIN 7 PLANTE MEDICINALE
INDIGENE CU POTENIAL ANTIMICROBIAN
Considernd date de literatur care indic aciunea antimicrobian a unor plante medicinale
indigene, obiectivele acestui studiu experimental au fost:
1. Obinerea unor extracte apoase i hidroalcoolice din 7 plante medicinale indigene
2. Analiza spectofotometric UV-Vis a extractelor i determinarea coninutului n compui
fenolici
3. Evaluarea semicantitativ a efectului antimicrobian.

VIII

4.1.1 Materiale i metode


Tabel 4.1
Numele plantelor investigate, tipul de extract i codificarea lor
Plante

Tipul

Codificare

extractului

Apos

011

Hidroalcoolic

021

Apos

012

Hidroalcoolic

022

Apos

013

Hidroalcoolic

023

Apos

014

Hidroalcoolic

024

Apos

015

Rostopasc (Chelidonium
majus)

Urzic (Urtica dioica)

Crie (Tagetes erecta)

Crie mici (Tagetes patula)

Coriandru (Coriandrum
sativum)

IX

Imagine reprezentativ a plantei

Rozmarin (Rosmarinus

Hidroalcoolic

025

Apos

016

Hidroalcoolic

026

Apos

017

Hidroalcoolic

027

Apos

018

Hidroalcoolic

028

officinalis)

Busuioc
(Ocimum basilicum)

Cimbrior (Satureja Montana)

4.1.1.1. Obinerea extractelor brute din cele 7 plante investigate


1. Extract apos: s-au cntarit 100 g din fiecare plant uscat i mcinat fin (Tab. 4.1.) care s-a
amestecat cu 700 ml de ap distilat nclzit la 80 C. Timp de 7 zile amestecul de plante
cu ap a fost pstrat la 40C i a fost agitat zilnic.
2. Extract hidroalcoolic 15%: s-au cntarit 100 g din fiecare plant uscat i macinat fin (Tab.
4.1) care s-a amestecat cu 700 ml amestec de ap cu etanol (v/v 2:5). Timp de 7 zile
amestecul de plante cu solveni a fost pstrat la 40C i a fost agitat zilnic.
Ambele tipuri de extracte au fost filtrate pentru a ndeprta materialul vegetal, iar filtratul
obinut n amestec hidroalcoolic a fost concentrat sub vid n rotavapor la 700C pregtit pentru
concentare.

Tabel 4.2
Cantitatea de extract total, nainte i dup recuperarea etanolului i procentul de concentrare a
extractului (%)
Extract final

Procent de

Extract iniial

( dup eliminarea

concentrare a

ml

etanolului) ml

extractului (%)

021 Chelidonium majus

452

215

47,57

022 Urtica dioica

330

127

38,48

023 Tagetes erecta

355

132

37,18

024 Tagetes patula

638

293

45,92

025 Coriandrum sativum

660

347

52,58

026 Rosmarinus officinalis

570

307

027 Ocimum basilicum

632

352

028 Satureja Montana

360

160

53,86
55,70
44,44

4.1.1.2. Metode de analiz a extractelor


Analiza spectrometric UV-Vis, determinarea fenolilor totali
Ambele tipuri de extracte (011 018; 021 - 028) au fost analizate prin spectometrie UV-Vis,
nregistrndu-se spectrele pe domeniul 200 400 nm (Spectrofotometrul Perkin Elmer Lamda 25).
S-a determinat coninutului de polifenoli totali prin metoda Folin-Ciocalteu conform procedurii de
mai jos, n paralel cu determinarea unei curbe de etalonare efectuat cu acid galic (GAE).
Determinarea curbei de etalonare. S-au cntarit la balana analitic, 25 mg acid galic i
s-au introdus ntr-un balon cotat de 25 ml, se adaug 15 ml etanol 40 %, se sonicheaz i se aduce la
semn cu etanol, rezultnd o soluie de concentraie 1 mg/ml GAE. Aceasta reprezint soluia
standard mam din care s-au prepar 5 dilutii: 1mg/100 ml; 0,5 mg/100 ml; 0,25 mg/100 ml; 0,125
mg/ml i 0,0625 mg/ml.
La 1 ml soluie standard GAE se adaug 60-70 ml ap distilat, se agit, apoi se adaug 5
ml reactiv Folin-Ciocalteu i se omogenizeaz. Dup 1 minut i nainte de 8 minute s-au adugat 15
ml soluie carbonat de sodiu 7,5 %. Se noteaz acest moment ca fiind momentul 0 i se
omogenizeaz din nou. Se aduce la volum de 100 ml cu ap distilat i dupa 30 min se citete
absorbanta la = 750 nm fat de martor (blank). Martorul se prepar n acelai mod, utiliznd 1 ml
etanol 40 %. Pentru celelalte 3 diluii s-au utilizat soluii standard de 0,5 ml, 0,25 ml,0,125 ml i
respectiv 0,0625 ml.
XI

S-a trasat curba de etalonare prin reprezentarea grafic a absorbanelor citite n funcie de
concentraia de acid galic (mg/ml).
Pentru determinarea concentraiei de compui fenolici din extractele (011 018 i 021 028) concentrate s-a procedat similar, la determinare utilizndu-se 1 ml extract.
4.1.1.3. Analiza microbiologic semicantitativ, pe mediu solid
Reactivii utilizai au fost: mediul de cultur Murashige-Skoog (mediu MS) i ap distilat steril.
Culturile de microorganisme E. coli i Bacillus subtilis au provenit din Laboratorul de
microbiologie al Centrului de cercetare Biochimie i biotehnologie agroalimentar.
Materiale utilizate: hot cu flux laminar, plci Petri, incubare termostat, autoclav,
spectometru Nanodrop.
Metoda utilizat e bazat pe proprietatea substanelor antimicrobiene de a difuza ntr-un
mediu de cultur solid nsmnat cu o cultur bacterian.
Mediul de cultur utilizat a fost Mueller-Hinton (30% extract carne, 1,75% casein, 0,15%
amidon, 1,7% agar), fr glucoz i nesuplimentat. S-au folosit microorganisme provenite din
cultrua pur avnd o concentraie de aproximativ 0,5 pe scala MacFarland.
Tehnic de lucru: mediul topit i rcit la 50 C se toarn n plci Petri ntr-o grosime de 4
mm; dup solidificare se nsmneaz cu suspensie bacterian pe toat suprafaa

plcii. Cu

o pens sau depus microcomprimatele cu extractele (011 018 i 021 - 028) concentrate. Se
incubeaz la 3537 C pentru 1824 ore i se msurat diametrul zonei de inhibiie cu ajutorul unei
rigle.
Valorile citite s-au comparat cu tabelele de interpretare (n mm), tulpina bacterian
apreciindu-se ca fiind sensibil sau rezistent la extractul testat. (Zarnea G., 1984)
4.1.2. Rezultate i discuii
4.1.2.1. Descrierea extractelor apoase i hidroalcoolice

Fig. 4.1. Aspectul extractelor apoase (011 018) numerotate de la stnga la dreapta
XII

Fig. 4.2. Aspectul extractelor hidroalcoolice (021 028) concentrate, numerotate de la stnga
la dreapta
4.1.2.2. Analiza spectrometric UV-Vis, i concentraia de compui fenolici
Tabel 4.3
Absobiile UV-Vis ale principalilor acizi fenolici din plantele studiate
Compus bioactiv

Lungimea de und caracteristica (nm)

gallic

217, 272

protocatechuic

218, 260, 295

gentisic

213, 239 , 332 , 370

caffeic

220, 240, 294, 326

vanillic

219, 261, 294, 320

syringic

218, 276, 328

p-coumaric

226, 312, 361

sinapic

238, 326

feruilic

218, 236 , 295

*** Rebecca J. Robbins, 2003


Spectrele UV Vis ale plantelor (fig 4.1 4.2) sunt caracterizate de prezena acizilor fenolici,
manifestnd absorbii intense la 200 400 nm, absorbii ce corespund acizilor fenolici. Rezultate
similare sunt regsite n literatura de specialitate (Tabelul 4.3)( Rebecca J. Robbins, 2003).
De asemenea se poate observa c extractele hidroacloolice au avut intensiti de absorbie
mai ridicate dect cele apoase.

XIII

Tabel 4.4
Cantitate de polifenoli totali din extractele apoase i hidroalcoolice
mg Polifenoli/

Cod extract

1ml extract

011 Chelidonium majus

0.078

012 Urtica dioica

0.106

013 Tagetes erecta

0.065

014 Tagetes patula

0.085

015 Coriandrum sativum

0.042

016 Rosmarinus officinalis

1,543

017 Ocimum basilicum

2,236

018 Satureja Montana

2,484

021 Chelidonium majus

0,591

022 Urtica dioica

0.032

023 Tagetes erecta

0,873

024 Tagetes patula

1,039

025 Coriandrum sativum

0.044

026 Rosmarinus officinalis

8,216

027 Ocimum basilicum

7,522

028 Satureja Montana

13,939

4.1.2.3.Evaluarea comparativ a activitii antimicrobiene a extractelor, pe mediu solid cu agar


Efectul comparativ al extractelor apoase i hidroalcoolice asupra creterii bacteriene, testate
pe E.coli i Bacillus subtilis
Au fost evaluate efectele antimicrobiene ale extractelor apoase (011-018) i hidroalcoolice
(021-028) pe plci cu agar nsmnate cu E.coli i Bacillus subtilis. Extractele au fost adugate ca
atare, dar s-au realizat i diferite diluii de 1:5, 1:10, 1:50 i 1:100 din fiecare extract. Din nefericire
diluiile de 1:10, 1:50 i 1:100 nu au dat rezultate. n fiecare godeu a fost introdus o cantitate de
3l din fiecare prob.

XIV

Tabel 4.5
Zona de inhibiie bacterian a extractelor apoase
E. coli

Bacillus subtilis

nefiltrat

nefiltrat

1:1

1:1

0,7

0,7

013 Tagetes erecta


017 Ocimum basilicum

Din tabelul 4.5 reiese c extractele apoase (011, 012, 014, 015, 016, 018) nu au inhibat
creterea microorganismelor. Extractele (013 si 017) au manifestat inhibiie antibacterian selectiv,
astfel 013 a avut aciune asupra Bacillus subtilis (0,7 cm), dar nu a avut aciune asupra E. coli, n
timp ce 017 a inhibat creterea E. coli (0,7 cm), dar nu a inhibat creterea Bacillus subtilis.
Tabel 4.6
Zona de inhibiie a extractelor hidoalcoolice
E. coli

Planta

Bacillus subtilis

nefiltrat

filtrat

nefiltrat

filtrat

1:1

1:1

1:1

1:1

1:5

022 Urtica dioica

0,7

026 Rosmarinus officinalis

0,6

0,7

1,2

1,4

0,7

027 Ocimum basilicum

1,3

0,7

028 Satureja Montana

0,8

0,9

Conform tabelului 4.6 au manifestat inhibiie bacterian asupra Bacillus subtilis, extractele
022 (0,7 cm), 026 (1,4 cm) i 027 (1,3 cm) sub form filtrat n raport 1:1, extractele nefiltrate au
avut inhibiie bacterian semnificativ mai slab 026 (1,2 cm) i 028 (0,9 cm).
n cazul E. coli inhibiia bacterian a fost observat n cazul extractelor 026 (0,6 cm) raport
1:1 nefiltrat, 028 (0,8 cm) nefiltrat raport 1:1. Extractul filtrat 026 (0,7 cm) raport 1:1 a manifestat
aciune antimicrobian n cazul E. coli.
Analind rezultatele obinute, putem aprecia c extractul hidroalcoolic de rozmarina a avut
cel mai bun efect antimicrobian mpotriva bacilus subtilis, iar busuiocul a manifestat aciune
antibacterian similat cu acesta.
De asemenea se poate remarca faptul c extractele filtrate au avut eficien antibacterian
mai ridicat n cazul bacilus subtilis.
XV

Gradele diferite de inhibiie bacterian a biocomponeilor asupra celor dou bacterii sunt
influenate de structura bacterian. Astefel E. coli avnd mebrana bacterian de natura
lipopolizaharidic a impiedicat trecerea compuilor spre interiorul celulei, fiind puin afectat de
biocomponei.

Fig. 4.1. Inhibiia manifestat de extractul 026 asupra bacillus subtilis

4.1.3 Concluzii
1. Analiza UV-Vis a extractelor din plantele studiate confirm absorbii mai puternice n
cazul extractelor hidroalcoolice dact n cazul extractelor apoase, acestea fiind caracterizate de
prezena acizilor fenolici.
2. Diferena de extracie a compuilor bioactivi (spectrele UV-Vis) este datorat polaritii
diferite a solvenilor utilizai la extracie.
3. Coninutul de polifenoli totali a fost mai ridicat n cazul extractelor hidroalcoolice de
rozmarin, busuioc i crie.
4. La finalizarea investigaiilor se poate afirma c extractele hidroalcoolice au avut efecte
antibacteriene mai intense dect extractele apoase.
5. Extractele hidroalcoolice din Rosmarinus officinalis, Ocimum basilicum i Satureja
Montana au dat rezultate bune, inhibnd dezvoltarea bacteriana a E coli sau Bacillus subtilis. n
general efectul a fost mai intens asupra bacteriei Bacillus subtilis.
6. Variantele de extracte filtrate au fost mai active, cel mai intens efect antibacterian fa de
Bacillus subtilis fiind observat la extractele filtrate 026 i 027, Rosmarinus officinalis i Ocimum
basilicum.
7. Rezultatele cele mai bune, cu efect antibacterian pe ambele tulpini de E coli i Bacillus
subtilis au fost observate cu extractele hidroalcoolice de cimbru Satureja Montana (028) i
Rosmarinus officinalis (026).

XVI

4.2. STUDIUL EXPERIMENTAL 2. OBINEREA I CARACTERIZAREA EXTRACTELOR


DE SALCIE, VSC I FRUNZE DE NUC
Tabel 4.7
Plante investigate, aspectul morfologic i codificarea extractelor obinute n ap acidulat
Plante investigate

Codificare

Vsc

Imagine reprezentativ a plantei

031

(Viscum album)

Frunze nuc (Juglans


regia)

Salcie (Salix alba)

032

033

4.2.1.2. Spectru UV-Vis i determinarea concentraiilor de compui fenolici totali


Tabel 4.8
Cantiatea de polifenoli existeni n extractul crud
Proba

Mg Polifenoli/ 1 ml extract

Salcie

2,6

Vsc

Nuc

1,21

XVII

4.2.1.3. Analiza cromatografic HPLC i detecie cu fotodiod (HPLC_DAD)


Analizele cromatografice au fost realizate pe un cromatograf HPLC Agilent 1200 cuplat cu
o diod de detecie (DAD) i doi elueni A i B: metanol/acid acetic/ap (10:2:88) (solventul A)
respectiv metanol/acid acetic/ap (90:3:7) (solventul B). Debitul de lucru a fost 1 ml/min la 280 nm.
Gradientul folosit a fost urmatorul: de la 100% la 85% (min 0-10), de la 85% - 50% (min 10 - 30),
de la 50% la 15% (min 30 - 45) i de la 15% - 100% (min 45 - 55).
4.2.1.4. Analiza microbiologic pe mediu solid (semi-cantitativ) i lichid (cantitativ)
Pentru realizarea testelor microbiologice s-au utilizat un numar de 5 tipuri de
microorganisme ( E. coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus i
Salmonella enteritis ) la fiecare investigate au fost utilizate microorganisme revitalizate (cultivate
pe mediu proaspt de cultu la temp de 370C, cu 24 ore nainte de investigare). Investigaiile au fost
fcute pe mediu solid i lichid, pH a fost adus la valoare de 7 naintea de a aduga mediul cu
bacterii.
Au fost utilizate microorganisme de Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,
Bacillus cereus, E. coli and Salmonella enteritis furnizate de departamentul de microbiologie al
USAMV Cluj. Extractele au fost testate pentru a vedea inhibiia lor asupra microorganismelor
selectate dup o perioad de 24 de ore.
4.2.1.5. Analiza metalelor din extractele apoase de salcie, vsc i nuc
Proba uscat i mrunit de material vegetal (frunze de nuc, salcie i planta de vsc) este extras cu
o soluie de HCl 1% prin meninerea timp de 16 ore la temperatura camerei i agitat periodic.
Extractul este apoi filtrat i supus determinrilor de metale prin absorbie atomic. Soluia rezultat
este potrivit pentru determinarea metalelor folosind tehnici adecvate de spectrometrie atomic.
Condiiile analitice instrumentale generale sunt prezentate n tabelul 4.9.
Alegerea acestei metode pentru oricare din aceste elemente depinde de cantitatea
elementului respectiv care ar putea fi n eantion ct i de necesitatea de a cuprinde toate elementele
ntr-o singur prob.

XVIII

Tabel 4.9
Condiii analitice generale pentru spectroscopia de absorbie atomic n flacr
Lungime
Element

de und

Tipul de flacr

(nm)

Clorur

Interferene

Corecie

de lantan

principale

de fond

Fe

Deuteriu

Cadmiu

228,8

Aer/acetilen oxidant

Nu

Cobalt

240,7

Aer/acetilen oxidant

Nu

Deuteriu

Cupru

324,8

Aer/acetilen oxidant

Nu

Deuteriu

Plumb

217,0

Aer/acetilen oxidant

Nu

Deuteriu

Mangan

279,5

Fier

248.3

Nichel
Zinc

Aer/acetilen sau

Da

Fe, Si

Deuteriu

Aer/acetilen oxidant

Nu

Al, Mn

Deuteriu

232,0

Aer/acetilen oxidant

Nu

Fe

Deuteriu

213,9

Aer/acetilen oxidant

Nu

acetilen/N2O reductoare

Deuteriu

Prepararea soluiilor etalon pentru fiecare element


Soluia stoc pentru fiecare metal are concentraia de 1000 mg/l. Din ea se prepar o soluie
etalon de lucru de 40 mg/l prin diluarea a 20 ml din soluia stoc la 500 ml. Aceste soluii sunt stabile
6 luni de la data preparrii.
Determinare pe prob pentru analiz
Se aspir separat n flacr soluia pentru proba martor i proba pentru analiz, dup care se
msoar absorbana pentru elementul respectiv. Se citesc soluiile de cel puin dou ori i dac
valorile cad ntr-un interval acceptat, se face media acestora. Dup fiecare msurare se aspir ap i
se reajusteaz zero-ul dac este necesar. Dac n prob de analizat concentraia depete intervalul
de calibrare, se dilueaz soluia de analizat cu soluia martor pentru calibrare.
4.2.3. Rezultate i discuii
4.2.3.1. Caracterizarea spectrelor UV-Vis i a cromatogramelor HPLC-DAD ale celor trei
extracte
Concentraia polifenolilor este cuprins ntre 1 si 2,6 mg/ml (Pop et al, 2013), concentraia
mare fiind la extractul de salcie. Acest extract are cea mai mare cantitate de eridiocite, quercitine,
catechine, salicil i isohamentine, demonstrate n urma investigaiei HPLC-DAD, toate aceste
molecule bioactive sunt responsabile pentru activitile antimicrobiene.

XIX

Extractul de nuc a fost urmatorul extract n ceea ce priveste cantitatea de polifenoli,


reprezentai de derivai ai hydrojuglonelor (P3 si 4), derivai ai quercetinelor (P

8 si 9)

i theaflavine

(P10). Datele obinute sunt n concordan cu cele din baza internaionala Duke.
Extractul de vsc a fost caracterizat ca fiind bogat n quercetine i theaflavine.

800

400
300

8
1

100

5 7
6

10
9

10

15

20

Timp de retentie (min)

25

300

45

200

400

400

9
8 10

6
7

13

300

200

11
12

100

0
0

5
500

Absorbanta(mAU)

500

200

500

Absorbanta(mAU)

Absorbanta (mAU)

600

600

600

700

100
0

10

15

20

25

30

Timpderetentie(min)

10

15

20

25

Timpderetentie(min)

Peak de identificare: 1- acid Peak de identificare: 1- acid Peak de identificare: 1- acid


cafeo quinic; 2- acid cumaroil dihidroascorbic;
3-Hydrojuglone coumaroil

quinic;
glucozidic;

4-quercetin

rhamnozid;

5-kaemferol
6-kaemferol

glucozid;

3- eriodictiol

2-

glucozid;
7-glucozid;

p- cafeo quinic; 2- acid Betulinic;


3- 3-resveratrol
4,5- apigenin

4-

7-glucuronid;

5-

3- naringenin 7- si 5-glucozid; 6- quercetin 3-acetil-rhamnozid;


7- catechin; 7-catechingalate; 8- 6-quercetin 3-rhamnozid; 7-

glucozid; 7-juglone; 8-quercetin naringin;

9-quercetin

3- theaflavin 3-galate

3-glucozid;

9-quercetin

3- glucozid; 10-naringenin dimer;

arabinozid;

10-theaflavin

3- 11-salicilate; 12-taxifolin; 13-

galate

glucozid;

isorhamnetin

Fig. 4.2. Spectre comparative HPLC DAD/MS la 280 nm ale extractului de nuc, salcie i vsc
4.2.3.2. Evaluarea semicantitativ a activitii antimicrobiene pe mediu solid

Fig. 4.4. Zona de inhibiie al extractului de

Fig. 4.5. Zona de inhibiie al extractului de


XX

Salix alba fa de Listeria monocytogenes, la

Salix alba fa de Bacillus cereus la dilu ia

dilu ia de 1:1 i 1:5

de 1:1 i 1:5

Zona de inhibiie a bacteriilor n agar, a depins de concentraia extractului i tipul acestuia.


Extractul din Salix alba, a avut cele mai mari zone de inhibiie a creterii pentru Bacillus cereus
(2.72 cm), Staphylococcus aureus (1.10 cm), Listeria monocytogenes (3.08 mm) and E. coli (0.85
cm). Fig 4.4 i 4.5 prezint zona de inhibiie al extractului de Salix alba mpotriva Listeria
monocytogenes and B.cereus.
Tabel 4.10
Vaorile inhibitorii (msurate n cm) al extractelor de nuc i salcie.
Microorganism

Extract de nuc

Extract de salcie

testat

1:1

1:5

1:10

1:1

1:5

1:10

E. coli

0.1

0.8

Staphylococcus

1.1

Bacillus cereus

2.72

2.1

0.9

Salmonella

0.3

0.8

3.08

2.6

0.5

aureus

enteritis
Listeria
monocytogenes
Datele prezentate n tabelul 4.10 sugereaz faptul c n cazul extractului de nuc (1:1) zona de
inhibiie bacterian a fost de 0,8 cm, n cazul listeriei; diluia 1:1 a manifestat slab inhibiie
bacterian mpotriva E.colisi Salmonella enteritis (0,1 respectiv 0,3 cm), n timp ce inhibiia nu a
fost observat la Bacillus cereus i Staphylococcus aureus. Diferenele aprute la zonele de inhibiie
sunt datorate diferenelor de structur membranar a celor dou bacterii.
Extractul de salcie a avut influen negativ asupra creterii bacterinene, n cazul Listeria
monocytogenes (dil 1:1- 3,08 cm) i Bacillus cereus (dil 1:1- 2,72 cm). Se poate observa c
extractul de salcie a avut o inhibiie slab asupra salmonela, stafilococ i E. coli. (0, 1,1 i 0,8 cm).
n cazul diluiei 1:5 i 1:10 s-au observat zone de inhibiie doar n cazul Bacillus cereus i Listeria
monocytogenes. Slabul efect antibacterian, manifestat de extractul de nuc poate fi atribuit
concentraiei slabe de polifenoli totali, comparativ cu extractul de salcie (de trei ori).

XXI

4.2.3.3. Evaluarea cantitativ a activitii antimicrobiene pe mediu lichid


Dezvoltarea microorganismelor pe mediu lichid
Fig. 4.6 4.7 reprezint dinamica creterii bacteriene pentru cele cinci tipuri de bacterii
studiate.
n urma evalurilor n mediu lichid extractul de nuc a artat un efect inhibitor asupra tuturor
plantelor investigate. Efectul extractului de nuc mpotriva Staphylococcus aureus arat un puternic
efect inhibitor pe o perioada de 24 de ore pentru toate cele 3 concentraii n parte stng a figurii se
poate observa extractul de vsc care nu are un efect inhibitor pentru Staphylococcus aureus, toate

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

S. aureus
1:1
1:5
0

8 24

1:10

Absorbance 600 nm

Absorbance 600 nm

cele trei concentraii avnd valori comparative cu martorul. (Fig.4.6)


0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

S. aureus
1:1
1:5
0 2 4 6 8 24

Time hours

1:10

Time hours

Fig. 4.6. Dinamica creterii la Staphylococcus aureus n vitro utiliznd trei concentraii ale
extractelor de Juglans regia i Viscum album
Braga i Col., (2005) au folosit Punica granatum pentru a inhiba dezvoltare S. aureus, la fel
cum i Zuo i col. (2008) au demonstrat o diminuare a creterii lui Staphylococcus utiliznd extracte
din plante medicinale.
Vscul care are un coninut destul de sczut n acizi fenolici; nu are nici un efect mpotriva
lui Staphylococcus aureus.
Figura 4.7 prezint curba de cretere pentru Listeria monocytogenes crescut n vitro i
adaugnd extracte de Juglans regia and Viscum album n diferite concentraii( 1:1, 1:5 i 1:10),
arat o mic inhibare a acesteia. Doar extractul de nuc (1:1) arat o inhibare mai pronunat a
Listeria monocytogenes, rezultate similare au fost raportate de (Alvarez et al. 2006; Zuo et al.,
2008). Vscul a avut un efect inhibitor scazut asupra listeriei.

XXII

Absorbance 600 nm

Absorbance 600 nm

0.3
0.25
0.2

Listeria

0.15

1:1

0.1

1:5

0.05

1:10

0.25
0.2
Listeria

0.15
0.1

1:1

0.05

1:5
1:10

0 2 4 6 8 24

0 2 4 6 8 24

Time hours

Time Hours

Fig. 4.7. Dinamica creterii la Listeria monocytogenes n vitro utiliznd trei concentra ii ale
extractelor de Juglans regia i Viscum album
Extractul de nuc a reusit s inhibe dezvoltarea Bacillus cereus pe toata perioada
investigaiei, rezultatele cele mai bune sunt date de dil. 1:1 (Fig 4.7), rezultate similare fiind
raportate i de Hyejung et al, n 2013.
Extractul de vasc a avut un efect mai slab al inhibitiei, dar un rezultat pozitiv a fost observat
la dil. 1:1 care a reuit la final s stopeze cretera microorganismului, rezultate similare au fost
raporate i de Gutirrez-Larranzar et al., 2013.

Ansorbance 600 nm

Ansorbance 600 nm

0.300
0.250
0.200

B. Cereus

0.150

1:1

0.100

1:5

0.050
0.000

1:10

0.300
0.250
0.200

B. Cereus

0.150

1:1

0.100

1:5

0.050

1:10

0.000

0 2 4 6 8 24

0 2 4 6 8 24

Time hours

Time hours

Fig. 4.8. Dinamica creterii la Bacillus cereus n vitro utiliznd trei concentra ii ale
extractelor de Juglans regia i Viscum album
Extractul de nuc inhib creterea lui E. coli (Fig 4.9) ntr-o manier controlat, rezultate
similare fiind observate i de (Wong i Kitts 2006), comparativ cu extractul de vsc care are un
efect mai slab al inhibiiei (Fig 4.9)

XXIII

0.3

Absorbance 600 nm

Absorbance 600 nm

0.3
0.25
0.2

E. Coli

0.15

1:1

0.1

1:5

0.05

1:10

0
0

0.25
0.2

E. Coli

0.15

1:1

0.1

1:5

0.05

1:10

8 24

0 2 4 6 8 24

Time hours

Time hours

Fig. 4.9. Dinamica creterii la E coli n vitro utiliznd trei concentra ii ale extractelor de
Juglans regia i Viscum album
Dup 24 de ore de investigare n Fig 4.10 se poate observa cum extractul de nuc a inhibat
dezvoltarea Salmonella enteritidis. n studii recente s-a demonstrat o inhibiie a Salmonella cu
ajutorul unui extract din Vaccinium corymbosum (Shen et al., 2014).
Vscul are un elect slab de inhibare al salmonelei. Studii similare realizate cu extrat de Aloe

0.25

Absorbance 600 nm

Absorbance 600 nm

secundiflora au aratat un efect inhibitor asupra salmonelie (Waihenya et al. 2002) .


0.20
0.15

Salmonela

0.10

1:1

0.05

1:5
1:10

0.00

0.30
0.25
0.20

Salmonela

0.15

1:1

0.10

1:5

0.05

1:10

0.00

0 2 4 6 8 24

0 2 4 6 8 24

Time hours

Time hours

Fig. 4.10. Dinamica creterii la Salmonella n vitro utiliznd trei concentra ii ale extractelor
de Juglans regia i Viscum album
4.2.3.4. Analiza metalelor din extractele brute de salcie, nuc i vsc
Valorile concentraiilor de metale, exprimate n mg/L (ppm) i g/L (ppb) sunt redate n
Tabelul 4.11.

XXIV

Tabel 4. 11
Valorile concentraiilor metalelor detectate n extracte exprimate n ppm ( mg/l)
Element/Plant

Ppm (mg/l)
Salcie

Nuc

Vsc

Li

0.006

0.027

0.032

Na

5.511

8.850

17.501

Mg

119.091

403.671

242.748

Ca

640.561

19.045

316.688

Mn

23.841

7.983

61.869

Fe

4.456

1.502

2.689

Co

0.039

0.005

0.052

Ni

0.064

0.125

0.777

Cu

0.215

0.267

0.832

Zn

23.085

2.780

5.057

Pb
Cd

<0.001
0.216

<0.001
0.002

<0.001
0.035

4.2.5. Concluzii
Studiul cofirm c extractele apoase din nuc (Juglans regia), vsc (Viscum album) i salcie
(Salix alba) au un bun efect antimicrobian. Toate cele trei extracte au un coninut ridicat de derivai
polifenolici, prezentai n urma analizelor HPLC. Dupa investigarea efectelor pe agar, extractul de
salcie a aratat cel mai mare efect antimicrobian n special mpotriva Listeria monocytogenes i
Bacillus cereus.
Evaluarea cantitativ antimicrobian, n mediu lichid i msurnd absorbana amestecului de
microorganisme din extract, a dovedit c n funcie de concentraia de polifenoli i derivai fenolici,
activitatea difer ntre extractul de nuc, vsc i salcie, acestea reuind s inhibe creterea
microorganismelor.
n concluzie, extractul apos din salcie, nuc i vsc, se pot utiliza ca un conservat natural sau
un bio-dezinfectant, mpotriva unui numr mare de microorganisme, care se pot ntalni n produsele
alimentare. Aceste extracte pot fi utilizate ca ingrediente pentru producerea unor produse folosite
pentru obtinerea unor biodezinfectante.

XXV

Capitolul 5
OBINEREA I CARACTERIZAREA FIZICO CHIMIC A PUDRELOR
OBINUTE, COMPARATIV PRIN CELE TREI TEHNICI DE USCARE
Scopul cercetrilor experimentale a fost obinerea i caracterizarea unor pudre obinute,
din extracte de nuc (Juglans regia), vsc (Viscum album) i salcie (Salix alba), utiliznd diferite
metode de uscare (atomizare, ucare n pat fluidizat i liofilizare).
Obiectivele studiului:
1. Utilizarea a trei metode diferite de uscare (atomizare, ucare n pat fluidizat i liofilizare)
pentru a obine pudre, selectnd cea mai eficient metod de uscare, imobilizare i
conservare a activitii antioxidante i antimicrobiene a polifenolilor prezeni n pudre,
provenii din cele trei extracte de plante
2. Determinarea aciunii antioxidante a pudrelor obinute, comparativ cu extractele crude de
nuc (Juglans regia), vsc (Viscum album) i salcie (Salix alba)
3. Analiza screening prin spectrometrie n Infrarosu ( FTIR) a pudrelor, comparativ cu
extractele crude de nuc (Juglans regia), vsc (Viscum album) i salcie (Salix alba)
5.1. MATERIALE I METODE
5.1.1. Obinerea extractelor i analiza spectrometric a compuilor fenolici
Descris la subcapitolul 4.1.1.2.
5.1.2. Determinarea activitii antioxidante (DPPH)
5.1.3. Analiza spectrometric FT-IR
Toate extractele crude i pudrele rezultate au fost caracterizate cu ajutorul spectofotometriei
IR, n domeniul MIR (600-4000cm -1). nregistrarea spectrelor de absorbie FTIR s-a fcut direct
prin utilizarea spectofotometrului Shimadzu IR Prestige -21 cu accesoriu de diamant de tip ATR
orizontal (Horizontal Attenuated Total Reflectance) cu o singur reflexie. S-au utilizat volume de
10

rob evaporat n sistemul HATR. Spectrele au fost nregistrate pe domeniul de lungimi de

und 600-4000 cm

-1

iar benzile de absorbie caracteristice tipului de legturi i a gruprilor

funcionale (exprimate n cm-1) au fost identificate. Zona de fingerprint a fost identificat pe


domeniul 600-1800 cm-1.

XXVI

5.1.4. Echipamente i tehnici utilizate pentru uscarea extractelor i obtinerea pudrelor

Fig. 5.1. Atomizorul Mobil Minor de la GEA, utilizat n experimente. 1 camer de uscare,
2 ciclonul folosit pentru colectarea pulberilor, 3 ventilatorul care absoarbe particulele din
camera de uscare.

Fig. 5.2. Usctorul n pat fluidizat utilizat n experimente: 1 - camera unde are loc uscarea,

XXVII

granularea i aglomerarea. 2 - panoul de comand

Fig. 5.3. Liofilizatorul utilizat n experimente: 1 camera pentru vacum i duzele de


adaptare, 2 - unitatea central pentru control, 3 pomp de vacum

5.2. REZULTATE I DISCUII


5.2.1. Caracterizarea pudrelor obinute
In fig. 5.4. sunt prezentate imaginile pudrelor obinute n urma deshidratrii extractelor (nuc,
salcie, vsc) imobilizate pe maltodextrina (MD), lactoz (LA) i sare (S) prin procesele specifice de
atomizare (SD), uscare n pat fluidizat (FB) i liofilizare (FD).
Sarea s-a comportat bine n toate cele trei procese de deshidratare SD, FB i FD. Lactoza a
dat rezultate bune pentru FB i FD, spre deosebire de maltodextrin care a dat rezultate bune doar n
cazul SD. Procentul cel mai mare de polifenoli recuperai dup procesare 94 96% a fost n urma
atomizarii (Fang and Bhandari, 2011).

XXVIII

Atomizare (SD)

Liofilizare (FD)

Uscare n pat fluidizat


(FB)
0

Proces

Temperatura de intrare: Uscarea principala 55 C, Temperatura de intrare:

de

1800C

uscare

Temperatura de uscare: Uscare

presiune vacum: 0.12 mbar

450C
Debit

finala

50C, Temperatura

presiune vacum: 0.12 mbar


pompa:

380

800C
de

uscare:

400C
Debit pompa: 28 ml/min

ml/min
Matric
e

MD

LA

LA

Salcie
(Salix
alba)
Vsc
(Viscu
m
album)
Nuc
(Juglan
s regia)
Fig. 5.4. Aspectul pudrelor obinute din trei extracte de nuc, salcie i vsc, imobilizate pe
maltodextrin (MD), lactoz (LA) i sare (S) utilizand atomizarea (SD), uscarea n pat fluidizat
(FB) i liofilizarea (FD)

5.2.2. Coninutul total de polifenoli al pudrelor, comparativ cu extractele crude


Tabel 5.1
Valorile polifenolilor totali (mg GAE/ml) din extractul iniial (cI), comparativ cu valorile teoretice
cD i valorile reale obinute n pudre (cR) un ajutorul tehnicii SD, FB i FD.
XXIX

Extract

cI

SD

FB

(mg

(mg GAE /

FD

ml SD (mg GAE / ml FB (mg GAE /

ml FD

GAE / extract pudra 10%)

extract pudra 10%) extract pudra 10%)

ml

MD

LA

extrac

LA

MD

LA

2,44

2,44

2,44

2,44

1,32

1,61

1,51

1,88

1,00

1,00

1,00

1,00

0,51

0,55

0,51

0,66

1,19

1,19

1,19

1,19

0,70

0,82

0,70

0,71

t)
Salcie

2,60

cD

= 2,44 -

(Salix

2,44

alba)

cR =1,53

Vsc

1,00

cD

1,50
= 1,00 -

(Viscum

1,00

album)

cR =0,82

Nuc

1,21

cD

0,52
= 1,19 -

(Juglans

1,19

regia)

cR =0,60

0,70

Astfel, n cazul utilizrii metodei de atomizare (SD):


Pentru salcie randamentul de recuperare a polifenolilor a fost de 62,7% pe MD, respectiv
61,47% pe S.
Pentru vsc randamentul de recuperare a polifenolilor a fost de 82 % pe MD, respectiv 52 %
pe S.
Pentru nuc randamentul de recuperare a polifenolilor a fost de 50,4 % pe MD, respectiv 58,8
% pe S.
In cazul utilizrii metodei de uscare n pat fluidizat:
Pentru salcie, randamentul de recuperare a polifenolilor a fost de 54 % pe S, respectiv 66 %
pe LA.
Pentru vsc, randamentul de recuperare a polifenolilor a fost de 51 % pe S, respectiv 55 %
pe LA.
Pentru nuc randamentul de recuperare a polifenolilor a fost de 58,8 % pe S, respectiv 68,9 %
pe LA.

XXX

5.2.3. Caracterizarea amprentei spectroscopice FT-IR a extractelor brute i a pudrelor


obinute
Tabel 5.2
Valorile absorbanelor FTIR identificate la pudre i extracte de nuc (Juglans regia), vsc (Viscum
album) i salcie (Salix alba).
Extract

Zona 1

Zona 2

Zona 3-4

Zona 5

600-970 cm-1

1000-1250 cm-1

1300-1700 cm-1

2900-3300 cm-1

Salcie

634, 763, 819, 865

1041, 1232

1446, 1608, 1718

2937, 3238

Nuc

632, 667, 775, 812, 1045, 1224, 1319

1647, 1732

2935, 3278

1508, 1543, 1645, 1716

2933, 3238

871
590, 605, 632, 786, 1047, 1215

Vsc

866

5.2.4. Activitatea antioxidant a pudrelor obinute, comparativ cu continuul n polifenoli


Tabel 5.3
Valorile medii ale concentraiilor de compui fenolici, comparativ cu activitatea antioxidant a
pudrelor obinute din cele trei extracte de plante prin cele trei tehnologii SD, FB, FD.
Pudr

mg GAE/1 ml pudra

M Trolox/1ml

Raport

dizolvata

pudra dizolvata

Polifenoli/
activitate
antioxidant

Salcie(SD)

pe

matrice

1,501

13,55

9,02

Nuc (SD) pe matrice MD

0,698

6,02

8,62

Vsc(SD) pe matrice MD

0,520

5,24

10,07

Salcie(FD) pe matrice S

1,317

11,90

9,03

Nuc(FD) pe matrice S

0,701

5,87

8,37

Vsc(FD) pe matrice S

0,509

5,41

10,62

Salcie(FB) pe matrice S

1,512

13,26

8,75

Nuc(FB) pe matrice S

0,700

5,98

8,54

MD

XXXI

Vsc(FB) pe matrice S

0,512

5,60

10,93

Se constat c pudrele de salcie au cea mai intens activitate antioxidant ( 11,9- 13,55 M
Trolox/1ml pudr dizolvat) i aceasta este corelat cu un coninut maxim de polifenoli (1,3171,512 mg GAE/1 ml pudr dizolvat). La tehnicile SD i FB s-au obinut rezultate mai bune,
utilizndu-se matrici de MD, respectiv S.
Activitatea antioxidant minim ( redus cu aprox. 50 %) a fost constatat la pudrele de
vsc, indiferent de tehnica de uscare sau matrice.
Rapoartele obinute ntre concentraia de polifenoli i activitatea antioxidant au fost relativ
constante pentru o anumit tehnic de uscare, dar a fost diferit n funcie de tipul plantei din care
s-a obinut pudra. Astfel, raportul cel mai mare s-a obinut la vsc (10,07-10,93), cu toate c
valoarea absolut a compuilor fenolici a fost cea mai mic, n timp ce salcia i extractul de nuc au
avut valori similare , n intrevalul 8,5-9. Aceste diferene sugereaz ca activitatea antioxidant a
vscului este mai mare per unitate de compus fenolic, adic potenialul antioxidant al unitilor
polifenolice din vsc ( flavonoide) e mai intens. In schimb, potenialul antioxidant al unitilor
polifenolice din salcie ( acizi fenolici) e mai mic dei concentraia acestora e mai mare.
5.3.

CONCLUZII

1. Au fost obinute pudre din extracte apoase 15% de nuc (Juglans regia), vsc (Viscum
album) i salcie (Salix alba), utiliznd trei tehnologii de uscare: atomizare (SD), uscare n pat
fluidizat (FB) i crioliofilizare (FD). Un total de 21 de pudre, s-au obinut utiliznd aceste tehnici
pe trei matrici diferite: maltodextrin, sare sau lactoz.
Matricele utilizate s-au comportat diferit n procesul de uscare, pentru atomizare cele mai
potrivite au fost sarea i maltodextrina, sarea i lactoza s-au comportat bine pentru uscarea n pat
fluidizat. Rezultate bune au fost obinute de sare i lactoz i n procesul de liofilizare, dar
tehnologia este destul de costisitoare. Consideram ca atomizarea este cea mai adecvat metoda de a
imobiliza extracte bogate n polifenoli pe un suport de sare sau maltodextrina, datorit faptului c
este un proces rapid i continuu de uscare, fiin n final cel mai economic.
Cea mai rapid metod de evaporare a fost SD n sistem continuu. Prin acest procedeu s-au
obinut pudre cu matricile de maltodextrina (MD) i sare.
Uscarea n pat fluidizat a dat rezultate bune la utilizarea matricilor de lactoza i sare, dar nu
a avut un rezultat satisfctor pentru MD. Dezavantajul FB este faptul c se lucreaz doar n sarje
mici 300 450 g/sarja.
XXXII

Crioliofilizarea este un proces lent i un mare consumator de energie. Matricile care s-au
pretat bine pentru acest procedeu au fost sarea i lactoza.
2. Coninutul de compui fenolici a fost diferit n funie de extractul de plante i stabilitatea
pudrei i a matrici utilizate.
Astfel, pudra de salcie a avut coninut maxim de polifenoli de 1.53 mg GAE/ ml pudra
obinut pe maltodextrina, dizolvat i 1.88 mg GAE/ ml pudr obinut pe lactoz, dizolvat. O
mai bun stabilitate a polifenolilor a fost observat pentru procesul de SD, cu cea mai bun
recuperare de polifenoli, de pn la 82% pe un substrat de MD.
3. Spectrometria FTIR a fost utilizat pentru a obine amprenta specific a extractelor de
plante nainte i dup uscare. Conform datelor spectroscopice, cea mai bun tehnologie de uscare
s-a dovedit a fi atomizarea, datorit vitezei mare de procesare, precum i un proces continuu de
aciune, comparativ cu liofilizarea care este un proces lent, datorit evaporatii la temperatur
scazut.
4. Pudrele de salcie au avut cea mai intens activitate antioxidant ( 11,9- 13,55 M
Trolox/1ml pudr dizolvat) i aceasta este corelat cu un coninut maxim de polifenoli (1,3171,512 mg GAE/1 ml pudr dizolvat). Tehnicile SD i FB au fost cu rezultate mai bune, utiliznduse matrici de MD, respectiv S.
Activitatea antioxidant minim ( redus cu aprox. 50 %) a fost constatat la pudrele de
vsc, indiferent de tehnica de uscare sau matrice.
Rapoartele obinute ntre concentraia de polifenoli i activitatea antioxidant au fost relativ
constante pentru o anumit tehnic de uscare, dar a fost diferit n funcie de tipul plantei din care
s-a obinut pudra. Astfel, raportul cel mai mare s-a obinut la vsc (10,07-10,93), cu toate c
valoarea absolut a compuilor fenolici a fost cea mai mic, n timp ce salcia i extractul de nuc au
avut valori similare , n intrevalul 8,5-9. Aceste diferene sugereaz c activitatea antioxidant a
vscului este mai mare per unitate de compus fenolic, adic potenialul antioxidant al unitilor
polifenolice din vsc ( flavonoide) e mai intens. n schimb, potenialul antioxidant al unitilor
polifenolice din salcie ( acizi fenolici) e mai mic dei concentraia acestora e mai mare.
Produsul obinut din extractul de salcie este cel mai bogat n polifenoli i se recomand a fi
folosit ca bio- dezinfectant.

XXXIII

Capitolul 6
EFICIENA ANTIMICROBIAN A PUDREI DE SALCIE FIXT PE
MALTODEXTRIN (MD) SAU SARE (S) TESTAT PE CINCI TIPURI DE
MICROORGANISME

6.1 MATERIALE I METODE


Pentru a corela datele anterior obinute (coninutul de compui fenolici totali n cele trei
tipuri de pudre, dependente de tehnica de uscare (SD, FB sau FD), de matricea utilizat (MD, S sau
LA) i capacitatea antixidat, cu potenialul lor antimicrobian, s-a ales pudra de salcie pentru c
are cea mai mare concentraie de compui fenolici, ea a fost obinut prin tehnica SD, pe matrici de
maltodextrina (MD) i sare (S).
Dup 5 i 10 min au fost colectate probe cu ajutorul tampoanelor sterile, suspendate apoi n
ser fiziologic, din care s-au facut 5 diluii i din fiecare diluie a fost incubat 1 ml suspensie pe
mediu de cultur solid (agar) timp de 24 ore. n paralel, s-a considerat corelaia ntre numrul de
uniti formatoare de colonii (CFU/ml), i absorbana la 600 nm, conform literaturii de specialitate,
1 unitate de absorban corespunde la 108 CFU/ml per OD600 (Chia-Liang Cheng, et al., 2009).
Astfel, pe baza citirilor de absorban a acestor soluii la 600 nm, s-a evaluat numrul de CFU/ml,
denumit i Colonii .
Testarea efectului antimicrobian s-a fcut astfel:
Pe suprafaa unei buci de faian (10x10cm) curat i dezinfect s-a aplicat o cantitate de 1
ml mediu de cultur cu microorganisme. Mediu care a fost omogenizat pe toat suprafaa plcuei.
Dup omogenizare, mediul i microorganismul au fost laste 5 respectiv 10 minute, dup care s-a
pulverizat pe suprafa faianei soluia de ap+pudr dizolvat (10% pudr dizolvat). Dup scurgera
soluiei au fost colectate probe cu beisoare de sanitaie, s-au fcut 6 diluii, soluia a fost trecut pe
mediu de cultur cu agar i s-a efectuat incubarea acestora.

XXXIV

6.2. REZULTATE I DISCUII

6.2.1. Efectul extractului de pudr de salcie fixat pe MD sau S, asupra dezvoltarii


microorganismelor: studiu pe mediu solid evaluare calitativ

Fig. 6. 1 .a-b. Aspectul culturii de E.coli pe mediu solid, dup incubare cu soluia care a fost
recoltat dup 5 min (a), respectiv 10 min (b) de la aplicarea pudrei rehidratate de salcie
fixate pe MD

Fig. 6.2. a-b Aspectul culturii de S.aureus pe mediu solid, dup incubare cu soluia care a
fost recoltat dup 5 min (a), respectiv 10 min (b) de la aplicarea pudrei rehidratate de salcie
fixate pe MD

XXXV

Fig. 6.3. a-b. Aspectul culturii de B.cereus pe mediu solid, dup incubare cu soluia care a
fost recoltat dup 5 min ( a), respectiv 10 min (b) de la aplicarea pudrei rehidratate de salcie
fixate pe MD

Fig. 6.4. Aspectul culturii de Salmonella (stnga) i Listeria ( dreapta) pe mediu solid, dup
incubare cu soluia care a fost recoltat dup 5 min de la aplicarea pudrei rehidratate de salcie
fixate pe MD
Dup 5 min de la aplicarea pudrei de salcie/ MD rehidratat pe placua de faian, pe mediu
solid s-au dezvoltat 62 colonii de Salmonella, i respectiv 321 colonii de Listeria. Dupa 10 minute,
12 colonii de Salmonella, i respectiv 9 colonii de Listeria. n cazul pudrei de salcie/ S rehidratat,
pe mediu solid s-au dezvoltat 8 colonii de Salmonella, i respectiv 9 colonii dup 5 min i dup 10
min, s-au dezvoltat 2 colonii de Salmonella, i respectiv Listeria.

XXXVI

6.2.2 Evaluarea semicantitativ a efectului extractului de pudr de salcie fixat pe MD sau S,


asupra dezvoltarii microorganismelor pe plci de agar

E.coli
600

Nr. coloni

500
400
300
200
100
0
5 (MD)

m
512

1
321

2
69

3
7

4
3

10 (MD)

266

57

5 (sare)

324

245

51

10 (sare)

184

41

Fig. 6.5. Numrul de colonii formate pe plcutele de cultur (m proba initial, 1 4 diluii fcute
din proba martor) dup aplicarea soluie (pudra rehidratat din extract de salcie pe matrice de
maltodextrin (MD) i sare) la 5 i 10 minute de la aplicare

Nr. coloni

S. aureus

5 (MD)

m
35

1
4

2
0

3
0

4
0

10 (MD)

5 (sare)

10 (sare)

Fig. 6.6. Numrul de colonii formate pe plcutele de cultur (m proba iniial, 1 4 dilutii fcute
din proba martor) dup aplicarea soluie (pudra rehidratat din extract de salcie pe matrice de
maltodextrin (MD) i sare) la 5 i 10 minute de la aplicare

XXXVII

Nr. coloni

B. cereus
140
120
100
80
60
40
20
0
5 (MD)

m
135

1
52

2
7

3
1

4
0

10 (MD)

105

24

5 (sare)

10 (sare)

Fig. 6.7. Numrul de colonii formate pe plcutele de cultur (m proba iniial, 1 4 diluii fcute
din proba martor) dup aplicarea soluie (pudra rehidratat din extract de salcie pe matrice de
maltodextrin (MD) i sare) la 5 i 10 minute de la aplicare

Nr. coloni

Salmonella
70
60
50
40
30
20
10
0
5 (MD)

m
62

1
21

2
2

3
0

4
0

10 (MD)

12

5 (sare)

10 (sare)

Fig. 6. 8. Numrul de colonii formate pe plcutele de cultur (m proba iniial, 1 4 diluii fcute
din proba martor) dup aplicarea soluie (pudra rehidratat din extract de salcie pe matrice de
maltodextrin (MD) i sare) dup 5 i 10 minute de la aplicare

XXXVIII

Nr. coloni

Listeria
350
300
250
200
150
100
50
0
5 (MD)

m
321

1
215

2
62

3
8

4
5

10 (MD)

5 (sare)

10 (sare)

Fig. 6.9. Numrul de colonii formate pe plcutele de cultur (m proba iniial, 1 4 diluii fcute
din proba martor) dup aplicarea soluie (pudra rehidratat din extract de salcie pe matrice de
maltodextrin (MD) i sare) dup 5 i 10 minute de la aplicare
6.4. CONCLUZII
Efectul antibacterian a fost testat cu pudrele de salcie pe matrici de maltodextrin i sare, pe
cinci tipuri de culturi bacteriene care au fost dispersate iniial pe plci de faian. Evaluarea
efectului s-a fcut prin preluarea de tampoane dup pulverizarea cu pudr de salcie dizolvat, la
intervale de 5 i 10 min, tampoane care au fost dizolvate n ap distilat i incubate pe plci de agar.
Din datele obinute, corelate cu absorbiile la 600 nm, s-a constatat eficiea diferit a pudrelor, i
anume pudrele cu matrice sare au fost mai eficiente, timpul de aciune de 10 minute este mai bun.
Microorganiosmele cele mai sensibile au fost S.aureus i Salmonella.
n concluzie se recomand

utilizarea pudrei de salcie pe matrice de sare ca potenial

biodezinfectant, cu alicaii n industria alimentar i n domeniul biomedical.

CONCLUZII GENERALE
n raport cu scopul i obiectivele lucrrii se pot meniona urmatoarele concluzii

XXXIX

1. Au fost obinute extracte apoase i hidroalcoolice din plante indigene, i anume salcie,
vsc i nuc. Plantele au fost amestecate cu ap acidulat, avnd o concentraie de 15%
plant uscat i lsate la macerat timp de 24 ore.
2. Au fost caracterizate extractele, prin calculul eficienei de extracie, compoziia n
compui fenolici a extractelor, amprenta spectroscopic, cromatografic i activitatea
antioxidant.
Analizele fizico chimice, urmate de testele microbiologice au artat c extractele
hidroalcoolice sunt mai eficiente dect cele apoase. Cele mai bune rezultate au fost obinute la
extractele de Rosmarinus officinalis, Urtica dioica, Ocimum basilicum i Satureja Montana.
3. Au fost evideniate efecte antimicrobiene a extractelor prin teste calitative i cantitative
pe medii de cultur nsmnate cu diferite tipuri de bacterii.
Extractul hidroalcoolic de rozmarin (026) a fost singurul extract care a dat rezultate bune
mpotriva microorganismelor utilizate pentru test E.coli i Bacillus subtilis. Aa cum s-a vzut n
literatura de specialitate uleiurile eseiale obinute de la Rosmarinus officinalis au o bun activitate
mpotriva altor micoorganisme ca Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Enterococcus feacalis, Escherichia coli, Staphylococcus
epidermidis, Bacillus subtilis i Candida albicans. Un rezultat bun s-a obinut i n cazul
extractului hidroaclcoolic de Satureja Montana (028) fiind singurul extract care a dat rezultate bune
mpotriva microorganismelor utilizate pentru test E.coli i Bacillus subtilis.
n concluzie extractele hidroalcoolice de Rosmarinus officinalis, Ocimum basilicum i
Satureja Montana au dat rezultate bune mpotriva microorganismelor inhibnd dezvoltarea
acestora.
Studiul efectuat pe extractul apos al nucului, vscului i salciei, a artat c toate cele trei
extracte au avut un efect antibacterian. Extractele invetigate au avut un coninut ridicat de
polifenoli, n special flavonoide i triterpenoide, rezultat obinut n urma analizelor HPLC.
Investigaiile fcute pe mediu de agar au demonstrat c extractul de salcie a aratat un efect bun
mpotriva Listeria monocytogenes i Bacillus cereus.
Evaluarea cantitativ a efectului antimicrobian n mediu lichid, utiliznd metoda de
spectometrice UV-Vis, a demonstrat c extractul de salcie este cel mai bogat n derivai polifenolici
(acid salicilic) i a avut cel mai bun efect antimicrobian. Nucul i vscul au activiti microbiene
specifice, n funcie de concentraie, respectiv tipul de microorganism folosit.
4. Obinerea de pudre din extractele apoase de salcie, nuc i vsc utiliznd diferite matrici
(maltodextrine, sare sau lactoz) prin tehnologii de uscare, de atomizare, uscare n pat
fludizat i crioliofilizare .
XL

Pudrele au fost obinute n urma extractului cu ap acidulat (1% HCl) cu 15% plant i
amestecat cu matricea (MD, L i S). n urma proceselor de desidratare au fost obiute un numr de
21 pudre. Matricile au avut un comportament diferit pe parcursul procesrii, sarea a reactionat bine
la toate cele trei procese de evaporare (SD, FB i FD), MD la SD i FD, iar L la FD i FB.
n urma investigaiilor fcute asupra pudrelor pentru a stabilii coninutul de polifenoli rmai
dup procesare a rezultat c extractul de salcie a avut cel mai mare procent de compui activi.
Ca i performan cele mai bune rezultate au fost obinute pe SD, cu matricile de S i MD.
Atomizarea prezint cteva avantaje comparativ cu procedurile similare ca, fulux continuu de
procesare (proces pe sarje la celelte dou procese), control permanet al debitului de lichid i
temperaturi de uscare, consum de energie sczut (liofilizarea consum o cantitate mare de energie
pentru a rci produsul la -50 - 600C), pe parcursul procesului se poate modifica uor concentraia
extractului, nlocui produsul sau modifica temperatura.
5. Caracterizarea fizico-chimic a pudrelor obinute din extractele de salcie, nuc i vsc.
Pudrele de salcie au avut cele mai bune rezultate ca activitate antioxidant (11,9- 13,55 M
Trolox/1ml pudr dizolvat) i aceasta este corelat cu un coninut maxim de polifenoli (1,3171,512 mg GAE/1 ml pudr dizolvat).
Rapoartele obinute ntre concentraia de polifenoli i activitatea antioxidant au fost relativ
constante pentru o anumit tehnic de uscare, dar a fost diferit n funcie de tipul plante din care
s-a obinut pudra.
6. Testarea efectului antibacterian al pudrei de salcie fixate pe maltodextrin sau sare, cu
potential de a fi utilizate ca biodezinfectante.
Dup rehidratarea pudrelor a fost efectuat un test controlat pentru a stabilii eficacitatea
extractului de salcie pe matrice de sare respectiv pe maltodextrin.
Pe suprafa ceramic curat de orice impuritate au fost impregnate microorganime cu o
concentraie tiut, s-a omogenizat distribuia acestora, dup care a fost aplicat soluia obinut n
urma rehidratrii. Extractul de salcie pe matice de sare a avut un rezultat net superior celui pe
matrice de maltodextrin, acesta avnd o aciune foarte bun pentru patru din cele cinci
microorganisme utilizate (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus i
Salmonella enteritis). Pudra rehidratat pe matice de sare din extractul de salcie poate fi folosit cu
uurint n eliminarea microorganismelor.
n concluzie putem aprecia c extractul apos i mai ales pudra de salcie, n form
concentrat are potenial antibacterian i poate fi utilizat ca si bioconservant sau biodezinfectant
natural de tip instant cu eficien mpotriva unor microorganisme patogene din spaiile de
producie a alimentelor, din spaii biomedicale, etc.
XLI

BIBLIOGRAFIE
1. Areej, M. et al. (2012). Anti-cancer, anti-inflammatory and anti-microbial activities of plant
extracts used against hematological tumors n traditional medicine of Jordan, J.
Ethnopharmacol. 145(3): 728736
2. Bad Bug Book (2012b) - Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins - Second
Edition
- Bacillus cereus and other Bacillus
species, p 93
- 79
(http://www.fda.gov/Food/FoodSafety/FoodborneIllness/FoodborneIllnessFoodbornePathogens
NaturalToxins/BadBugBook/default.htm)
3. Bad Bug Book (2012c) - Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins - Second
Edition - Appendix 3. Factors that Affect Microbial Growth in Food, p 244 - 245
(http://www.fda.gov/Food/FoodSafety/FoodborneIllness/FoodborneIllnessFoodbornePathogens
NaturalToxins/BadBugBook/default.htm)
4. Braga, L.C., et al. (2005). Pomegranate extract inhibits Staphylococcus aureus growth and
subsequent enterotoxin production, J.Ethnopharmacol. 96: 335339.
5. Builders P.F. et al. (2010). Assessment of the intrinsic and stability properties of the freezedried and formulated extract of Hibiscus sabdariffa Linn. (Malvaceae), Afr. J. Pharmacy (4)6:
304-313
6. Cardonaa, F. et al. (2013). Benefits of polyphenols on gut microbiota and implications n
human health, J. Nutr. Biochem.24: 14151422
7. elik, M and Wendel, S.C., (2005). Spray drying and pharmaceutical applications. In: DM
Parikh. Handbook of pharmaceutical granulation technology. 2 Ed., Boca Raton: Taylor &
Francis GroupL 129-158.
8. Clark MA, and Barret EL (1987). "The phs gene and hydrogen sulfide production
bySalmonella typhimurium.". J Bacteriology 169 (6): 23912397
9. Couto, A. G. et all. (2012). Anti-infl ammatory, antiallodynic effects and quantitative analysis
of gallic acid n spray dried powders from Phyllanthus niruri leaves, stems, roots and whole
plant, Braz J Pharm Sci. 23(1): 124-131,
10. De Souza, T.P. et al. (2009). Development of granules from Phyllanthus niruri spray-dried
extract. Braz J Pharm Sci 45: 669-675.
11. Deepinderjeet, S. and Sachin K., (2013). Investigational study of Juglans regia extract and
quercetin against photoaging, Biomedicine & Aging Pathology Available online 17 September
12. Desobry, S. A. et al. (1997). Comparison of spraydrying, drum-drying and freeze-drying for hcarotene encapsulation and preservation. Journal of Food Science, 62(6): 1158 1162.
13. Desobry, S. A. et al. (1997). Comparison of spraydrying, drum-drying and freeze-drying for hcarotene encapsulation and preservation. Journal of Food Science, 62(6): 1158 1162.
14. Dey, P. M., & Harborne, J. B. (1993). 1. Plant phenolics methods n plant biochemistry (2nd
printing). London: Academic Press Limited. pp. 326341.
15. Dr. J. Jeff Schwegman (2009) "Basic Cycle Development Techniques for Lyophilized
Products".
16. F. Ronsse et all. Powder Technology 190 (2009) 170175
17. Fang, Z. and Bhandari B. (2011). Effect of spray drying and storage on the stability of
bayberry polyphenols, Food Chemistry, 129: 1391147
18. Gutirrez-Larranzar, M. et al. (2013). In vitro assessment of synthetic phenolic antioxidants for
inhibition of foodborne Staphylococcus aureus, Bacillus cereus and Pseudomonas fluorescens,
Food Control, 30(2): 393399
19. Harborne, J. B., & Williams, C. A. (2000). Advances n flavonoid research since 1992.
Phytochemistry, 55(6), 481504.
XLII

20. Hottot, A. et al. (2004). A direct characterization method of the ice morphology. Relationship
between mean crystals sizes and primary drying times of freeze-drying processes. Drying
Technol. 22: 113
21. Iskandar, F., et al., (2003).Control of the Morpology of Nanostructured Particles Prepared by
the Spray Drying of a Nano-particle.Sol, J. Coll. Interface Sci. 265(2), 296-303
22. Jaros, M. and Pabis S. (2006), Theoretical Models for Fluid Bed Drying of Cut Vegetables,
Biosystems Engineering 93(1): 4555
23. K. Dewettinck et all, Fluidized bed coating n food technology, Trends Food Sci. Technol. 10
(1999) 163168
24. Masters, K. (1991). Spray Drying Handbook, Longman, New York, p. 30
25. Neveu, V. et al. (2010). Phenol-Explorer: an online comprehensive database on polyphenol
contents n foods
26. Niamh, H. et al. (2009). Effect of drying methods on the phenolic constituents of meadowsweet
(Filipendula ulmaria) and willow (Salix alba), LWT - Food Science and Technology 42 (9):
14681473
27. Nichenametla, S. N., Taruscio, T. G., Barney, D. L., & Exon, J. H. (2006). A review of the
effects and mechanisms of polyphenolics n cancer. Critical Reviews n Food Science and
Nutrition, 46(2), 161183.
28. O. Yesil Celiktas, E. H. (2007). Antimicrobial activities of methanol extracts and essential oils
of Rosmarinus officinalis, depending on location and seasonal variations,. Food Chemistry 100,
553-559.
29. Patapoff, T.W. et al. (2002). The importance of freezing on lyophilization cycle development.
Biopharm. 3:1621.
30. Pathomwichaiwat, T. et al. (2012). Antiosteoporotic effect of sequential extracts and freezedried juice of Cissus quadrangularis L. n ovariectomized mice, Asian Biomedicine 6 (3), 377384
31. Pop, C. et al. (2013). Application of three alternative technologies (spray drying, fluid bed
drying and freeze drying) to obtain powdered formulas from plants with antimicrobial
potential, Bull. USAMV Cluj-Animal Science and Biotechnology, 70(1-2), in press
32. Pop, C. et al. (2013). Comparative antibacterial activity of different plant extracts in relation to
their bioactive molecules, as determined by LC-MS analysis Bull. USAMV Cluj-Animal Science
and Biotechnology, 70(1-2), in press
33. Rebecca J. Robbins, 2003, Phenolic Acids in Foods: An Overview of Analytical Methodology
J. Agric. Food Chem., , 51 (10), 2866-2887 DOI: 10.1021/jf026182t Downloaded from
http://pubs.acs.org on February 5, 2009
34. Sarica, S. et al. (2005). Use of an antibiotic growth promoter and two herbal natural feed
additives with and without exogenous enzymes n wheatbasedbroilerdiets. South African J. of
Animal Sci. 35(1):61e72.
35. Shen, X. et al. (2014). Antimicrobial effect of blueberry (Vaccinium corymbosum L.) extracts
against the growth of Listeria monocytogenes and Salmonella Enteritidis, Food Control, 35:
159165
36. Waihenya, R.K. et al. (2002). Efficacy of crude extract of Aloe secundiflora against Salmonella
gallinarum in experimentally infected free-range chickens in Tanzania, J. Ethnopharmacol. 79(
3): 317323
37. Wong, P.Y.Y. and Kitts, D.D. (2006). Studies on the dual antioxidant and antibacterial
properties of parsley (Petroselinum crispum) and cilantro (Coriandrum sativum) extracts, Food
Chemistry. 97: 505515
38. Wu H.M., et al., (2005).Spray-drying technology for the synthesis of nanosized LiMn2O4
cathode material. Scr. Mater. 52, 513
39. Zarnea G. (1984). Tratat de microbiologie general. Editura Academiei.
XLIII

40. Zhang, CH, et al. (2010). Experimental and numerical investigation of spray drying parameters
on the dried powder properties of Ginkgo biloba seeds. Dry Technol 3: 380-388.
41. Zhao, Q., et al. (2013). Effects of Spray Drying and Freeze drying on the Properties of Protein
Isolate from Rice Dreg Protein, Food and Bioprocess Technol. 6(7): 1759-1769.
42. Zuo, G.Y. et al. (2008). Screening of Chinese medicinal plants for inhibition against clinical
isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), J. of Ethnopharmacol.,vol:
287290

XLIV