Reactivi folositi in testarea pretransfuzionala – notiuni de baza

Principiul de baza al testelor pretransfuzionale se bazeaza pe reactia antigen-anticorp.

Aceasta consta in punerea in contact a unei surse de antigen (eritrocitul) cu o sursa de
anticorpi (plasma), intr-un mediu de reactie.
Clasic, testele pretransfuzionale se efectueaza mediu salin, pe lama, in eprubeta sau pe
placa de opalina (macrometoda). Reactia antigen-anticorp este evidentiata prin
prezenta aglutinatelor sau a hemolizei in mediul in care este efectuata reactia.
In ultimii 20 de ani au aparut pe piata tehnologii noi pentru evidentierea reactiei
antigen-anticorp, in gel (Scangel, Diamed) sau pe microbile de sticla (Orthobiovue)
sau in mediu solid. Aceste tehnologii cunoscute sub denumirea de micrometoda au ca
numitor comun faptul ca sursa de antigen sau sursa de anticorp este adaugata in
mediul de reactie de catre producator.

Sursele de antigen pentru testare

-sunt reprezentate fie de suspensiile eritrocitare, preparate comerciale sau preparate in
laborator, fie de eritrocitele pacientului.
Suspensiile eritrocitare furnizate de laboaratoarele producatoare sunt caracterizate din
punct de vedere al antigenelor prezente pe suprafata eritrocitelor, fenotipul fiind
detaliat in antigrama. Folosind acesta sursa cunoscuta de antigen, putem sa depistam
sau sa identificam un anticorp anti-eritrocitar.
Pe de alta parte, daca nu cunoastem antigenele prezente pe eritrocitele unui pacient
sau ale unui donator atunci, pentru aflarea identitatii acestora le testam cu o sursa
cunoscuta de anticorpi.

Surse de anticorpi pentru testare

- sunt reprezentate de serurile hemotest comerciale sau de plasma/serul pacientului.
Serurile hemotest comerciale contin anticorpi anti-eritrocitari cu specificitate
cunoscuta si sunt folosite pentru a a identifica antigene eritrocitare necunoscute.
Specificitatea anticorpilor prezenti in serul/plasma pacientului este precizata prin
testarea acestora cu o suspensie eritrocitara caracterizata fenotipic.

Testele pretransfuzionale
Inaintea oricarei transfuzii se fac urmatoarele teste:
1) determinarea grupei sanguine ABO Rh(D);
2) determinarea fenotipului eritrocitar in sistemul Rh-Kell sau a fenotipului
extins in alte sisteme Duffy (Fya,Fyb), Kidd (Jka, Jkb), MNSs, P.
3) Depistarea anticorpilor iregulari anti-eritrocitari care pot sa apara ca urmare a
aunor transfuzii anterioare sau a sarcinilor
4) Identificarea anticorpilor iregulari anti-eritrocitari daca depistarea a fost
pozitiva
5) Testul de crossmatch sau de compatibilitate prin 3 tehnici: salin, enzimatic,
antiglobulina umana.

I. Notiuni de baza despre serurile hemotest

Serurile hemotest folosite pentru determinarea grupei sanguine produse de diferite
laboratoare trebuie verificate in cadrul Laboratorului de Referinta Imunohematologie.
Au fost stabilite urmatoarele standardele minime pe care trebuie sa le indeplineasca
un reactiv pentru a putea fi calificat in transfuzie:

1
 - specificitatea - reprezinta capacitatea reactivului de a recunoaste un anumit
determinant antigenic, de ex. un reactiv anti-D trebuie sa reactioneze numai cu
hematiile D pozitiv dar nu trebuie sa reactioneze cu hematii D negativ
- intensitatea reactiei de aglutinare – de ex. reactivul anti-A trebuie sa de o
reactie de aglutinare puternica (3+ sau 4+) cu eritrocitele care au antigenul A.
Reactivii nu trebuie folositi dupa expirarea datei de folosire. Exceptie de la acesta
regula fac numai serurile foarte rare cu conditia ca rezultatele controlului de calitate
sa fie corespunzatoare.
Fiecare producator de seruri hemotest prezinta in prospectul de folosire descrierea
reactivului, tehnica de utilizare, performantele caracteristice, interpretarea rezultatelor
si limitele. In procedurile de operare standard si instructiunile de lucru scrise de la
nivelul laboratorului trebuie sa existe informatiile din prospectele reactivilor. Pastrati
toate prospectele reactivilor pentru a putea dovedi oricand corectitudinea tehnicii
folosite. De fiecare data cand se schimba producatorul reactivilor sau lotul,
instructiunea de lucru trebuie revizuita prin introducerea modificarilor specifice
noului producator. Inainte de introducerea noilor reactivi in lucru, pe langa revizuirea
instructiunii trebuie facuta si validarea acestora prin efectuarea controlului de calitate.

Controlul de calitate al reactivilor

Reprezinta procedura tehnica prin care se determina daca reactivul respectiv identifica
in mod corect ceea ce trebuie sa identifice si daca indeplinesc criteriile acceptabile de
performanta.
Fiecare laborator stabileste protocoale de control de calitate si de validare atat ale
echipamnetelor cat si ale reactivilor pe care ii foloseste.
Este obligatorie documentarea efectuarii controlului de calitate a reactivilor adica
trebuie consemnate in formularele elaborate in sistemul de management al calitatii
urmatoarele:
- data testarii
- rezultatele obtinute
- identitatea persoanei care a efectuat testarea
In procedura trebuie consemnate de asemenea masurile corective care trebuie luate
daca reactivii testati nu corespund criteriilor de performanta.
Se efectueaza de asemenea inspectia macroscopica, prezenta turbiditatii sau aspectul
neclar putand fi semne ale contaminarii bacteriene.

Seruri monoclonale vs seruri policlonale

Reactivul hemotest ideal contine o suspensie concentrata de molecule de
imunoglobulina inalt specifice, uniform reactive si bine caracterizate.
Produsele comerciale sunt seruri monoclonale sau seruri policlonale.
Reactivii policlonali au in compozitie imunoglobuline secretate de un numar mare de
clone de limfocite ca urmare a unui raspuns imun la un antigen eritrocitar. Se obtin
din plasma umana provenita de la persoanele imunizate.
Reactivul monoclonal are in compozitie imunoglobuline secretate de o singura clona
de limfocite, fiind obtinute inustrial cu ajutorul hibridoamelor (hibridom = celula
hibrid formata din fuziunea unei celule mielomatoase, capabila de multiplicare si un
limfocit capabil sa secrete un anumit tip de imunoglobulina).
Reactivul monoclonal, fiind produsul unei clone care se multiplica la nesfarsit,
contine un singur tip de anticorp cu o specificitate definita. Acesti reactivi au inlocuit
reactivii policlonali in bancile de sange datorita inaltei specificitati si a timpului

2
scazut de reactie. In tabelul 1 sunt prezentate avantajele si dezavantajele reactivilor
monoclonali.

Tabel 1 Reactivi monoclonali vantaje, dezavantaje

Avantaje
- productie nelimitata
- sunt standardizati
- variatii mici intre loturi
- fara contaminare cu alti anticorpi
- timpul de aglutinare mult mai
scazut fiind de tip IgM
- pot fi folositi pentru fenotiparea
hematiilor cu TCD +
Dezavantaje
- specificitatea poate fi relativa
deoarece un determinant antigenic
poate fi comun pentru mai multe
antigene eritrocitare
- specificitatea unica poate sa nu
determine intotdeauna o reactie
deorece eritrocitele pot sa nu
exprime in totalitate acel
determinant

In concluzie reactivii monoclonali pot fi folositi in transfuzie cu conditia respectarii

stricte a urmatoarelor indicatii:
- citirea cu atentie a inscrisurilor de pe ambalaj
- respectarea tehnicii de lucru din instructiunile de folosire
- luarea in consideratie a formulei prezentate de producator
Concentratia proteinelor din formula reactivului variaza in functie de producator fiind
cuprinsa intre 3% si 8%.
Reactivii monoclonali pentru determinarea ABO
Reactivii sunt resuspendati intr-un diluent cu o concentratie scazuta de proteine care
contine maximum 6% albumina bovina. Reactia de aglutinare apare imediat, timpul
de reactie este scurt, variaza intre 30 - 90 sec. in functie de producator. Pentru a evita
orice confuzie legata ordinea distribuirii serurilor hemotest ABO exista un cod de
culoare al reactivilor. Reactivul anti-A este intotdeauna albastru, reactivul anti-B este
intotdeauna galben iar reactivul anti-AB este intotdeauna alb.
Reactivii monoclonali pentru determinarea antigenelor Rh
Dintre antigenele sistemului Rh antigenul D este cel mai imunogen si de aceea este
obligatorie determinarea lui inaitea oricarei transfuzii.
Pe piata exista mai multe categorii de reactivi pentru determinarea antigenului D:
- reactivi cu continut crescut de proteine
- reactivi IgM salin
- reactivi IgG modificati chimic
- reactivi monoclonali.
In prezent, reactivii monoclonali sunt folositi aproape in exclusivitate pentru tiparea
antigenului D la pacienti.
In instructiunea de folosire este precizat si materialul pe/in care trebuie sa se efectueze
reactia, de ex. «reactivul poate fi folosit pentru determinarea pe lama, in eprubeta sau
pe microplaca ».
Cand se foloseste reactivul Rh control?
Reactivul Rh control este indicat in testarea de rutina numai daca reactivul anti-D
folosit in laborator are o concentratie crescuta de proteine si daca producatorul
recomanda folosirea controlului. Reactivul Rh control are rolul de a face diferenta
intre situatiile de reactii fals pozitive care apar in deterrminarea antigenului D.
Concentratia crescuta de proteine si solutiile macromoleculare care intra in formula

3
reactivului anti-D au rolul de a favoriza aglutinarea. Reactivul Rh control contine
numai proteine in concentratie mare si solutii macromoleculare nu si anticorpii anti-D.
Reactii fals pozitive in determinarea ag. D apar in urmatoarele situatii:
- eritrocitele de testat sunt sensibilizate de prezenta unui auto-anticorp asa cum
se intampla in anemiile hemolitice autoimune
- eritrocitele de testat provin de la un pacient care are o concentratie anormal de
mare a proteinelor serice in plasma asa cum se intampla in mielomul multiplu
sau boala Waldenstrom. In acest caz, daca eritrocitele nu sunt spalate in
prealabil poate sa apara fenomenul de rulou sau de pseudoaglutinare.
In aceste situatii exista posibilitatea de a determina in mod eronat antigenul Rh(D)
pozitiv. De aceea prezenta unei reactii pozitive cu reactivul Rh control invalideaza
rezultatul obtinut cu reactivul anti-D.
Reactivii monoclonali anti-D au un continut scazut de proteine in formula lor,
asemanator cu reactivii monoclonali hemotest ABO. In consecinta nu apar reactii fals
pozitive legate de eventuala prezenta pe suprafata eritrocitelor a auto-Ac. Totusi,
reactii fals pozitive pot sa apara daca exista o concentratie mare de aglutinine la rece
sau de proteine plasmatice in proba de testat.
In concluzie, folosirea Rh control in cazul in care Rh (D) se determina cu reactivi
monoclonali se face conform recomandarilor producatorului.
II. Reactivii antiglobulina
Testul antiglobulina umana, cunoscut si sub denumirea de testul Coombs, este folosit
pentru detectarea anticorpilor de tip IgG si a complementului exsitente fie pe
suprafata eritrocitului fie in ser. Exista 2 categorii de reactivi amtiglobulina umana:
- reactivi antiglobulina polispecifici care contin atat anti-IgG cat si anti-c3d
- reactivi antiglobulina monospecifici care contin numai anti-IgG sau numai
anti-c3d
Reactivul monospecific anti-c3d nu reactioneaza cu moleculele de imunoglobuline
(Ig). Acesta detecteaza in mod specific numai proteinele complementului care au fost
atasate pe suprafata eritrocitului ca rezultat al activarii cascadei complementului pe
calea clasica. In general moleculele de IgM sunt cele care favorizeaza atasarea
particulei c3d a complementului pe eritrocit. In vivo, eritrocitele sensibilizate cu c3d
apar in situatii patologice si sunt distruse fie printr-un proces de hemoliza
intravasculara fie eliminate din circulatia de catre splina.
Reactivii antiglobulina sunt folositi pentru urmatoarele determinari de laborator:
- efectuarea testului Coombs direct si indirect
- depistarea si identificarea anticorpilor iregulari anti-eritrocitari
- testul de compatibilitatea intre primitor si donator
Controlul de calitate pentru reactivii antiglobulina
Standardele de laborator cer sa existe un sistem de control pentru reactivii
antiglobulina in scopul eliminarii reactiilor fals negative si al validarii rezultatelor
negative.

III. Suspensiile eritrocitare – reactivi pentru testarea anticorpilor

Suspensiile eritrocitare pentru deteminarea anticorpilor ABO (proba Simonin

sau reverse)
Preparatul comercial contine eritrocite test de grup O, A1,A2, B si detecteaza prezenta
anticorpilor anti-A si anti-B.
Procesul de obtinere a reactivilor consta in selectarea eritrocitelor de la anumiti
donatori, spalarea acestora pentru indepartarea oricaror urme de anticorpi si

4
resuspendarea lor in intr-o solutie tampon pentru a minimiza hemoliza si pierderea
antigenicitatii. Concentratia finala a suspensiei eritrocitare trebuie sa fie de 2-5%.
Preparatele contin eritrocite provenite de la mai multi donatori.

Suspensiile eritrocitare pentru depistarea ( screening) anticorpilor anti-

eritrocitari
Reactivii sunt necesari pentru determinarea prezentei anticorpilor anti-eritrocitari in
serul indivizilor. Pacientii sau donatorii pot sa aiba aloanticorpi anti-eritrocitari ca
urmarea a unui proces anterior de imunizare, prin sarcina sau transfuzie.
Pentru siguranta transfuzionala acesti aloanticorpi trebuie determinati atat la pacient
inainte de a primi transfuzia cat si la donator. In caz contrar aloanticorpul prezent la
primitor poate duce la accidente hemolitice severe daca in sangele transfuzat exista
antigenul corespunzator.
Preparatul comercial consta in 3 suspensii eritrocitare distincte al caror fenotip este
cunoscut si prezentat in antigrama care insoteste produsul. Eritrocitele din suspensie
provin de la donatori de grup O deorece acestea nu reactioneaza cu anticorpii din
sistemul ABO. Preparatele contin eritrocite provenite de la un singur donator si sunt
asfel alese de catre producator incat sa depisteze si anticorpii cu reactivitate slaba.
De asemenea eritrocitele selectionate trebuie sa fie tipate pentru acele antigene
capabile sa detecteze anticorpii cu semnificatie transfuzionala: D, C, E, c, e, M, N, S,
s, P1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb.
Suspensiile eritrocitare se pot prezenta in 2 feluri:
- sub forma nativa, resuspendate in ser fiziologic
- sub forma de eritrocite tratate enzimatic (papaina, bromelina, ficina)
Prin tratarea enzimatica a eritrocitelor creste sensibilitatea reactiei antigen anticorp.
In apropierea datei expirarii se poate constata o scadere a reactivitatii suspensiilor
eritrocitare pentru screening, de aceea nu pot fi folosite dupa acesta data.
Inspectia reactivilor este obligatorie inaite de folosire, hemoliza, decolorarea sau
aglutinarea eritrocitelor sunt semne care indica o eventuala contaminare bacteriana.

Panelul de suspensii eritrocitare pentru depistarea/identificare anticorpilor anti-

eritrocitari
Panelul este folosit pentru a identifica specificitatea unui anticorp odata ce acesta a
fost depistat prin screening.
Preparatul comercial consta de data acesta din minimum10 suspensii eritrocitare
distincte al caror fenotip este cunoscut si prezentat in antigrama care insoteste
produsul.

IV. Lectinele
Lectinele reprezita o alternativa la folosirea serurilor hemotest. Sunt extrase din
semintele unor plante (vezi tabel 2) si au ca specificitate anumite antigene de grupe
sanguine. Aceste extracte contin proteine care se comporta identic cu anticorpii dar nu
sunt imunoglobuline. Lectinele se leaga in mod specific de carbohidratii anumitor
antigene eritrocitare cu aparitia aglutinarii.
In tabelul 2 sunt prezentate principalele lectine folosite in laboratorul de
imunohematologie.

Tabel 2 Lectine folosite in serologia grupelor sanguine

5
Lectine Specificitatea antigenica
Dolichos biflorus A1
Ulex europaeus H
Vicia graminea N
Iberis amara M

V. Alte metode folosite pentru detectarea reactiei antigen-anticorp - micrometoda

Reactivii mentionati mai sus sunt fabricati pentru a detecta reactia de aglutinare in
eprubeta sau pe lama. Recent au aparut tehnologii noi care evidentiaza reactia
antigen-anticorp, sub forma unor cartele de plastic sau microplaci, in care reactivul
furnizat este deja incorporat intr-un mediu de reactie, gel sau mediu solid.

Tehnologia de aglutinare in gel

Tehnologia, descoperita de Lapierre in 1985, foloseste particule de gel din dextran-
acrilamida in care este incorporat reactivul dorit. Acesta compozitie este introdusa in
coloanele de reactie ale cartelei de plastic, fiecare cartela avand 6 coloane de reactie.
Reteaua de gel are rol atat de mediu de reactie cat si de filtru. Astfel, aglutinatele care
apar ca urmare a reactiei antigen-anticorp nu pot sa treaca in urma centrifugarii prin
acesta retea si raman in partea de sus a coloanei de reactie. Daca nu se produce reactia
de aglutinare, atunici eritrocitele pot sa treaca prin acesta retea in urma centrifugarii,
formand un buton eritrocitar in partea de jos a coloanei. Pentru a scadea timpul de
incubare se pot adauga in camera de reactie potentiatori care sensibilizeaza reactia,
cum ar fi solutii cu forta ionica scazuta ( solutii LISS – low ionic strenght solution).
In functie de reactivul pre-existent in cartele, cu aceasta tehnologie se pot efectua
toate determinarile de imunohematologie:
- determinarea de grup sanguin ABO Rh(D)
- determinarea fenotipului eritrocitar Rh (C, c, E, e) –Kell (K)
- depistarea anticorpilor iregulari anti-eritrocitari prin 3 metode, salin, enzimatic
si antiglobulina
- identificarea anticorpilor iregulari anti-eritrocitari
- testul Coombs direct (antiglobulina)
- testul Coombs indirect
- testeul de compatibilitate prin metoda enzimatica si prin testul coombs indirect
- testul pentru precizarea antigenului D slab

Ideile importante ale prezentarii

1. Reactivii folositi in laboratorul de imunohematologie pun in evidenta reactia
antigen-anticorp, aglutinarea sau hemoliza fiind un indicator al prezentei
acestei reactii.
2. Reactivii folositi pot fi impartiti in 4 categorii:
- seruri hemotest care contin anticorpi cu o specificitate cunoscuta
- suspensii eritrocitare care sunt caracterizate fenotipic, adica prezinta antigene
cu specificitate cunoscuta
- reactivi antiglobulina care detecteaza prezenta Ig sau a complementului pe
eritrocitele de testat sau in serul de testat
- potentiatori care cresc capacitatea de depistare a anticorpilor
3. Reactivii sunt folositi cu scopul de:
- a determina de grup sanguin ABO Rh(D)
- a determina fenotipului eritrocitar Rh (C, c, E, e) –Kell (K)

6
 - a depista anticorpii iregulari anti-eritrocitari prin 3 metode, salin, enzimatic si
antiglobulina
- a identifica anticorpii iregulari anti-eritrocitari
- a efectua testul Coombs direct (antiglobulina)
- a efectua testul Coombs indirect
- a efectua testul de compatibilitate prin metoda enzimatica si prin testul coombs
indirect
- a efectua testul pentru precizarea antigenului D slab
4. Personalul care efectueaza testele de imunohematologie trebuie sa cunoasca
instructiunile de folosire furnizate de producator, de asemenea limitele de determinare
ale reactivilor precum si importanta efectuarii controlului de calitate.