CLASIFICAREA ENZIMELOR

CONFORM COMISIEI DE ENZIMOLOGIE (EC)

EC : 1 Oxidoreductaze
EC : 2 Transferaze
EC : 3 Hidrolaze
EC : 4 Liaze
EC : 5 Izomeraze
EC : 6 Ligaze

1
 Clasa 1
OXIDOREDUCTAZE EC: 1

2
Transportori de hidrogen

COENZIME NICOTINICE
(COENZIME PIRIDINICE)

3
 COENZIME TRANSPORTOARE DE HIDROGEN

COENZIME NICOTINICE (COENZIME PIRIDINICE)

Structură chimică: cele două forme biologic active ale amidei nicotinice (vitamina B3):

Nicotinamid adenindinucleotid - NAD+ (în forma oxidată) Compuse din două

Nicotinamid adenindinucleotid fosfat -NADP+ (forma oxidată). nucleotide legate între ele
prin intermediul grupărilor
fosfat, printr-o legătură
NH2
O fosfoanhidridică
C N
Nicotinamidã N
NH2
+
N N N NADP+ posedă o
O O Adeninã
5' 5' grupare fosforil
2' 3' CH2 în plus, legată
CH2 O P O P O
de C2 al restului
1' OH OH 4' OH O
OH de riboză legat
4' 1'
O 3' 2' de adenină
NAD+
esterificat cu
OH OH
H3PO4
NADP+
OPO3H2 4
 O NH2
C Nicotinamidã Adeninã
NH2 N
+ N
N
O O N N
5'
5'
2' 3' O CH2
CH2 O P O P
1' OH OH 4' O
OH OH
4' 1'
O 3' 2' esterificat cu
H3PO4
NAD+
OH OH

NADP+
OPO3H2

5
 Mecanism de acţiune
Nucleotidele NAD+ şi NADP+ funcţionează ca acceptori reversibili ai
echivalenţilor reducători: protoni şi electroni, şi deci ca transportori de
hidrogen.

Reacţia generală : NAD+ + 2H (2e- + 2H+) NADH + H+

NADP+ + 2H (2e- + 2H+) NADPH + H+

H O
H H O
C NH2 2[H]
C NH2
+ + H+
N N
2[H]
R R

NAD+ sau NADP+ NADH + H+ sau NADPH + H+

(forma oxidatã) (forma redusã)

6
 H O H O
4 H
C NH2 C NH2
5 H H 4
3
6 + 2 + D
+ 1 + H+
H H N
N1
R
Substrat oxidat (D)
R

Formula generalã a Substrat redus Formula generalã a

coenzimelor nicotinice (DH2) coenzimelor nicotinice
oxidate (NAD+ sau NADP+) reduse (NADH+ sau NADPH+)

Unul din electroni este utilizat pentru neutralizarea sarcinii atomului de azot
cuaternar în poziţia 1 iar un electron şi un proton dau naştere atomului de hidrogen
care se fixează în poziţia 4, formâdu-se NADH şi NADPH.

Cel de-al doilea proton (H+) eliberat de substrat rămâne liber în mediul de reacţie.

7
 Caracteristici funcționale

• NAD+ și NADP+ au funcție de coenzime, adică sunt slab legate de suportul

proteic apoenzimatic;
• au potențial de oxidoreducere foarte scăzut:
E’o= - 0,32 V
• reacțiile catalizate de enzimele NAD+ și NADP+ dependente sunt, în general
reversibile;
• formele reduse NADH + H+ intervin în prima etapă în transportul de hidrogen
din cadrul lanțului respirator mitocondrial (reacționează direct cu substratul);
• formele reduse NADH + H+ și NADPH + H+ reprezintă o rezervă de echivalenți
reducători necesari pentru diverse reacții de biosinteză;
• formele reduse NADPH + H+ nu intervin în lanțul respirator mitocondrial;
• formele reduse NADPH + H+ intervin în reacțiile de hidroxilare microzomală.

8
 Exemple de enzime NAD+ dependente

Lactat : NAD+ oxidoreductaza

(enzimă Zn2+ dependentă)

CH3
CH3 NADH +H+ NAD+

C O HO CH

COOH lactat-dehidrogenaza COOH

(EC:1.1.1.27)
Acid piruvic Acid L-lactic

În condiții anaerobe, piruvatul este convertit în lactat.

Lactatul este transportat prin sânge la ficat, unde are loc reacția inversă
de transformare a lactatului în piruvat (ciclul Cori).

9
 IZOENZIMELE LACTAT-DEHIDROGENAZEI (LDH)
Izoenzimele = forme enzimatice diferite ale aceleiaşi enzime (izoforme).
- Acționează asupra aceluiași substrat
- Structură primară diferită,
- Proprietăţi fizico-chimice diferite:
 gradul de afinitate pentru variate substrate;
 sensibilitatea la activatori şi la inhibitori;
 mobilitatea în câmpul electroforetic;
 stabilitatea la căldură;
 sunt elaborate de organe diferite;
 permit o modulare a activității lor în țesuturi diferită și intevin astfel în
reglarea activității tisulare.
Există 5 izoenzime LDH ce pot fi evidenţiate în serul uman prin electroforeză
Enzima activă LDH - tetramer
- două tipuri de protomeri (2 lanţuri): tipul H (de la heart- inimă)
tipul M (de la muscle- muşchi).
-Subunitățile M și H sunt codificate de gene diferite: LDH-A (cromozomul 11 ) și
LDH-B (cromozomul 21)
Asocierea celor două tipuri de protomeri în structura tetrameră a condus la
formarea a 5 izoenzime:
- două omogene: H4 şi M4
- 3 hibrizi: M1H3, M2H2, M3H1. 10
 Structura tridimensională a LDH mușchi scheletic
NAD+ CH3
CH3 NADH +H +

C O LDH5 HO CH

COOH LDH1 COOH

+ NAD+
Acid piruvic NADH +H Acid L-lactic
mușchi cardiac

LDH1 (H4) Mușchi cardiac și Eritrocite

LDH2 (M1H3) Leucocite
LDH3 (M2H2) Plămâni
LDH4 (M3H1) Rinichi
LDH5 (M4) Mușchi scheletic și Ficat

Izoenzimele LDH pot fi separate prin electroforeză, obţinându-se zimograme

Markeri de lezare tisulară: semnificație clinică diferită!
Ex: LDH1 și LDH2 – infarct miocardic acut 11
LDH2 și LDH5 – hepatită acută
 Great!
My main LDH is M3H1 !

Izoformele LDH sunt exprimate

diferit la nivel tisular și în
diferite stadii ale dezvoltării
ontogenetice.

• În stadiul prenatal țesutul cardiac

este predominant anaerob și
principala izoformă LDH la nivel
cardiac este M4;

• după naștere – M3H1;

• la vârsta de 1 an – M2H2 și M3H1;
• după vârsta de 2 ani – M1H3 și H4

12
 Exemple de enzime NAD+ dependente
Alcool dehidrogenaza – denumire convențională
Alcool : NAD + oxidoreductaza, EC: 1.1.1.1
alcool dehidrogenaza O
CH3-CH2-OH + NAD+ H3C C + NADH + H+
H
Alcool etilic Acetaldehidã

NAD+ + H 2O
aldehid dehidrogenaza
NADH + H+ EC: 1.2.1.3

- Enzime implicate în calea oxidativă majoră

a metabolismului etanolului Acid acetic
- Ficat și rinichi
- Acetaldehida este instabilă => radicali liberi
foarte toxici
- În ficat există 2 izoforme de aldehid-DH:
mitocondrială și citosolică
13
Marketed as Antabuse®, it
was the most commonly
used pharmaceutical
treatment for alcohol abuse
and dependence.

Disulfiram is used to create

an aversion to alcohol
consumption by
hypersensitizing the patient
to the adverse effects of
alcohol consumption.

14
 Disulfiram

Alcool-DH Aldehid-DH

Etanol Acetaldehida Acetate

•Hipertermie
•Cefalee
•Palpitații
•Amețeală
•Tulburări digestive

15
Fuller RK et al. JAMA 1986;256:1449
“Alfonse, Biochemistry makes my head hurt!!”

16
 Enzime NAD+ dependente

Malat: NAD+ oxidoreductaza

NADH + H+
COOH NAD+ COOH

HO CH C O
malat-dehidrogenaza
(EC:1.1.1.37) CH2
CH3
COOH
COOH
Acid L-malic Acid oxalilacetic

17
 Enzime NAD+ dependente

α-Glicerofosfat : NAD+ oxidoreductaza, EC 1.1.1.95

CH2 OH CH2 OH
-glicerofosfat-DH
HC OH O C O O

CH2 O P OH CH2 O P OH
NAD +
OH OH
Acid  -glicerofosforic NADH + H + Dihidroxiacetonfosfat

18
 Enzime NAD+ dependente

Glutamat: NAD(P)+ oxidoreductaza

COOH H2O NAD(P)H+H+ COOH

NAD(P)+
H2 N CH C O
glutamat-DH (EC: 1.4.1.3)
CH2 CH2 + NH3
CH2 CH2
COOH COOH
Acid L-glutamic Acid -cetoglutaric

19
 Enzime NADP+ dependente
H2 C O PO3 H2 H2 C O PO3 H2
Glucozo-6-fosfat-dehidrogenaza
(EC: 1.1.1.49)
O O D-glucozo-6-fosfat-
OH OH O
NADP+ oxidoreductaza
OH OH NADP+ OH
OH OH
NADPH + H+
-D-Glucozo-6-fosfat Acid 6-fosfo-gluconic

NADPH+ H+ : glutation
Gly Cys Glu NADP+ oxidoreductaza
NADPH+H+
S
2 Gly Cys Glu
S glutation reductaza
(EC:1.6.4.2)
SH
Gly Cys Glu Gly- glicinã (glicocol)
Glutation redus
Glutation oxidat Cys-SH- cisteinã
(G-SH)
(G-S-S-G) Glu- acid glutamic

20
 Enzime NADP+ dependente

CH3
O
HOOC CH2 C CH2 C ~ SCoA
OH -Hidroxi--metilglutaril~SCoA
(HMG~SCoA)
2NADPH + 2H+

HMG~SCoA reductaza (EC: 1.1.1.34)

HS-CoA
2NADP+

CH3
HOOC CH2 C CH2 CH2 OH
OH Acid mevalonic

Enzima care intervine în biosinteza colesterolului

21
 Enzime NADP+ dependente

H2N H2N
C NH2 C O
HN HN

CH2 NADP+ CH2

NADPH+H+
CH2 2 O2 CH2
+ NO + 2H2O
CH2 nitric oxid sintaza CH2
(EC: 1.14.13.39) Monoxid
H2N CH H2N CH de azot
COOH COOH FACTOR DE
L-Argininã L-Citrulinã RELAXARE
ENDOTELIALĂ

terahidrobiopterinã (BH4)
Reacția este complexă și flavin mononucleotid (FMN)
are mai mulți cofactori: flavin adenindinucleotid (FAD)
calmodulinã (CaM) 22
 Flavin-enzime.
Cofactori transportori de hidrogen
cu structură flavinică
FAD
FMN

23
Cofactori cu structură flavinică- transportori de hidrogen.
Flavin-enzime

Flavin mononucleotid – FMN

Flavin adenindinucleotid – FAD

• Sunt grupări prostetice pentru un număr relativ mare de

flavoproteine şi flavin-enzime (strâns legate de partea proteică a
enzimei)
• Alte denumiri: fermentul galben al lui Warburg, ovoflavină, lactoflavină
• sunt forme biologic active ale vitaminei B2 (riboflavina).
• FMN are structură mononucleotidică,
• FAD are o structură dinucleotidică.

24
Structura flavin mononucleotidului (FMN) = izoaloxazină-ribitil-fosfat

O
H3C 5 N Nucleul
10 4
6 3 NH izoaloxazinã
7 2
9
8
H3C N N O
1

6,7 dimetil, 9 ribitil izoaloxazină =

1'CH2
RIBOFLAVINĂ (vitamina B2)
2'CH OH Ribitil

3'CH OH

4'CH OH
OH
5'CH2 O P OH
O

Riboflavină - fosfat

25
 Structura flavin adenindinucleotidului (FAD)
O
N Nucleul
H3C 5 4
6
10
3 NH
izoaloxazinã
7 2
8 9
H3C N N O
1

CH2 Adeninã

CH OH NH 2

N
CH OH N

CH OH OH
N N
OH
CH2 O P O P O CH2
O
O O

OH OH

Izoaloxazină-ribitil- fosfat - fosfat - riboză - Adenină

26
 Structura flavin adenindinucleotidului (FAD)
O
H3C 5 N Nucleul
4
6
10
3 NH izoaloxazinã
7 2
9
8
H3C N N O
1
Adeninã
1'CH2
NH2
2'CH OH Ribitil
N
N
3'CH OH
N N
4'CH OH OH
OH
5'CH2 O P O P O CH2
O O
O

OH OH

Izoaloxazină-ribitil- fosfat - fosfat - riboză - Adenină 27

 Mecanism de acţiune
H
O O
10
N 2[H] N
H3C 4 NH H3C NH
10
9 1
H3C N N O H3C N N O
1 2[H]

H
R R
H+ + e- H+ + e-
FAD sau FMN FADH2 sau FMNH2
(forma oxidatã) (forma redusã)

H
O
+N .
FMN şi FAD pot funcţionaH3C drept transportori
10 4 NHde hidrogen datorită
capacităţii lor de a lega reversibil hidrogenul la atomii N1 şi N10 din nucleul
H3Cizoaloxazinic.
N N O
În forma oxidată nucleul izoaloxazinic este plan iar în forma redusă are loc
R
o pliere a sa în jurul unei axe imaginare N1-N10.
.
FADH sau FMN
.
(semichinonã)

28
 Caracteristici structurale
• Legătura cu partea proteică a enzimelor este puternică (grupare prostetică)
• O grupare funcţională de alcool primar din ribitil este esterificată cu H3PO4,
(FMN reprezintă de fapt esterul fosforic al vitaminei B2)
• sunt metal-flavoproteine, cu ioni metalici în structură:
Exemple: - succinat-dehidrogenaza are fier neheminic,
- xantinoxidaza conţine fier şi molibden,
- butiril ~ SCoA dehidrogenaza are cupru
• Potenţialul de oxidoreducere a enzimelor flavinice are valoare negativă:
– FAD - Eo’= - 0,05V
– FMN - Eo’= - 0,10V
• FAD şi FMN participă la lanţul respirator mitocondrial, preluând hidrogenii
de la coenzimele nicotinice pe care îi cedează coenzimelor Q (ubichinonelor)

29
 H3C CH3
6 7
5 8
H H H H O
9
10 N N CH2 C C C C O P O
- OH OH OH H O
4
O N1
+
3N 2
+ H +
Partea proteicã
O
H + (apoenzima)
CH 2 NH3
tirozină O H3N CH2

CH2
CH2

CH2
CH2
lizină
CH2
CH2 CH2

O O O
H H
H N N C
N C C
CH N N CH C C CH N
H H H
O O

Legătura cu partea proteică a enzimelor este puternică

(grupare prostetică) 30
 Exemple de enzime dependende de FAD

Succinat:FAD oxidoreductaza
(4 atomi de Fe neheminic, 4
atomi de S legați de proteină)

Succinat
dehidrogenaza
COOH (SDH) HOOC H
EC:1.3.99.1 C
CH2 + + Enz FADH2
Enz FAD
CH2 C
H COOH
COOH
Acid fumaric
Acid succinic

31
 Enzime dependende de FAD

Enzimă implicată în β-oxidarea acizilor grași

O
CH3 CH2 CH2 C ~SCoA Acid gras activat

butiril~SCoA
FAD
butiril~SCoA - DH
(EC: 1.3.99.2) FADH2
O
H Acil gras nesaturat
CH3 C C C ~SCoA (trans)
H
crotonil ~SCoA

32
 Glutation redus
H2O 2
NADP +
(2GSH)

Glutation reductaza Glutation peroxidaza

Seleniu dependentă
Riboflavină (FAD)

H2O
NADPH + H+ Glutation oxidat
(GSSG)

Riboflavina în ciclul redox al

glutationului

33
 Enzime dependende de FAD

Are FAD, molibden și Fe-S

FAD FADH2 proteine în structură
O O
N Xantin oxidaza N
HN HN
Molibden
N N O N N
H O2 H H
Hipoxantina H2O2 Xantina
FAD O2
Xantin oxidaza
(EC: 1.1.3.22)
FADH2
H2O2
O
H
HN N
O
O N N
H H
Acid uric

34
Localizarea flavoproteinelor cu FMN şi FAD în complexele enzimatice din lanţul
respirator mitocondrial cuplat cu fosforilarea oxidativă (sinteza ATP).
ATP ATP ATP

Complexul I Complexul V
NADH+H+
FMN
Fe-Sulf
proteine CoQ
1/ O2
NAD+ 2
Citocromi b c1 a-a3
Succinat CoQH2 Complexul III H2O
FAD
Fe-Sulf Complexul IV
proteine
Fumarat
Complexul II 35
 Enzime dependende de FAD
Monoamin-oxidaza (MAO) – enzimă implicată în metabolismul neurotransmițătorilor
cu structură aminică
monoamin oxidazã (MAO, EC: 1.4.3.4)
R CH2 NH2 + H2O + O2 R CHO + NH3 + H2O2
Aminã biologic activã FAD Aldehidã
(dopaminã, triptaminã, FADH2
serotoninã, adrenalinã, MAO catalizează inactivarea
noradrenalinã) neurotransmițătorilor cu structură aminică

dopamina noradrenalina adrenalina

serotonina 2- feniletilamina 36
 Monoamin-oxidazele (MAO, EC: 1.4.3.4 ; amină : oxigen oxidoreductază)

- enzime mitocondriale ce catalizează dezaminarea oxidativă a multor substrate :

amine primare, secundare şi terţiare, neurotransmiţători sau hormoni precum
dopamina, noradrenalina, adrenalina şi serotonina;
- produşii de reacţie: aldehide, H2O2 şi NH3 (neurotoxici)

MAO există în două izoforme, denumite MAO-A şi MAO-B pe baza sensibilităţii la diferiţi
inhibitori enzimatici: clorgilină (forma A) şi deprenil (forma B), şi a specificităţii pentru
substratele menţionate;

- serotonina MAO-A
- noradrenalina
Aldehidă + NH3 + H2O2
- adrenalina
- dopamina clorgilină

- 2-feniletilamina
- benzilamina MAO-B
- tiramina Aldehidă + NH3 + H2O2
- dopamina deprenil 37
UBICHINONELE (COENZIMELE Q)

COFACTORI ENZIMATICI
TRANSPORTORI DE HIDROGEN

38
 • Ubichinonele sau coenzimele Q = grup de compuşi liposolubili omologi,
cu structură benzochinonică, specifici mitocondriei
Denumire:
• ubi = răspândire ubicuitară: la plante, la microorganisme, la animale
• chinone - au structură chinonică
• prezentă în toate celulele şi ţesuturile

Structură: nucleu de benzochinonă substituit cu: 2 gr. metoxi,

1 gr. metil și
1 lanț poliizoprenoidic

O CH3
H3 C O 6 2 CH2 CH C CH2 H
1
n

H3 C O 5
4 3 CH n = 6 pentru ubichinonele de la levuri
3
n = 8 sau 9 pentru ubichinonele de la microorganisme
O
n = 10 pentru ubichinonele de la animale si om
2-decaprenil--5,6-dimetoxi-3-metil-1,4-bezochinona 39
 Particularități structurale ale moleculelor de
ubichinone

• denumirea de “coenzimă” este improprie deoarece ea nu intră în

componenţa unei enzime;
• lanţul poliizoprenic din structura coenzimei Q10 îi permite
integrarea în zonele bogate în lipide din celulă, în special în
structurile de membrană;
• sunt solubilizate în complexe fosfolipidice => rol de transportor de
hidrogen mobil, făcând naveta între transportorii fixaţi la nivel
mitocondrial.

40
 Mecanism de acțiune global
• acceptă şi cedează reversibil 2 atomi de hidrogen:

O OH
CH3O R CH3O
+ 2H R

- 2H
CH3O CH3 CH3
CH3O
O OH

Ubichinona (Q) Ubichinol (QH2)

(forma oxidatã) (forma redusã)

• Potenţial de oxidoreducere Eo’= -0,01V

• => deci în celulă ele oxidează enzimele cu potențial redox mai scăzut, cum
sunt enzimele flavinice
• în lanţul respirator mitocondrial se plasează între sistemele enzimatice cu
potenţial redox negativ –flavinele, şi cele cu potenţial pozitiv -citocromii
41
 Ubichinona- componentă a lanţului respirator mitocondrial

Complexul I
SH 2
NAD+ FMNH 2
1/ O
CoQ 2 2
Complexul III Complexul IV
S NADH FMN
Fe2+ Fe3+ Fe2+
+H +
Cyto b Cyto c Cyto a+a3

Fumarat FADH2 Fe3+ Fe2+ Fe3+

CoQH 2
Succinat FAD H2 O
42
Complexul II
 Schema generală de biosinteză a coenzimei Q10
2 Acetil-CoA
Fenilalanina
Acetoacetil-CoA
Tirozina
HMG-CoA
HMG-CoA reductaza
4-OH-Fenilpiruvat Mevalonat
Mevalonat - P
4-OH-Fenillactat
Mevalonat - PP
Izopentenil - PP
4-OH-Cinamat
trans- Geranil - PP Geranil-geranil -PP
Preniltransferaza
4-OH-Benzoat + Decaprenoil - PP Farnesil - PP
cis-Preniltransferaza
Scualen Poliprenil - PP
Decaprenil- (IZOPRENE)
4-OH-benzoat transferaza Colesterol

Decaprenoil-4-OH-benzoat
Lanţ lateral pentru Izoprenilarea
vitamina E, proteinelor
Coenzima Q10 vitamina A,
vitamina K. Dolicol- 43
pirofosfat
 Schema generală de biosinteză a coenzimei Q10
• K. Folkers susţine ideea că sursa principală de CoQ10 la om este cea rezultată din
biosinteză. Acest proces complex desfăşurat pe parcursul a 17 etape necesită
participarea a cel puţin şapte vitamine: riboflavină, niacinamidă, piridoxină, acid
folic, vitamină B12, vitamină C şi acid pantotenic, şi a numeroase microelemente.
•Coenzima Q10 este sintetizată în majoritatea ţesuturilor organismului uman, şi
implică trei etape principale:
•1) sinteza nucleului benzochinonic din aminoacizii tirozina sau fenilalanina;
•2) sinteza lanţului izoprenic de la acetil~SCoA (CH3~SCoA) pe calea
mevalonatului- etapă comună cu sinteza de colesterol;
•3) reacţia de condensare dintre aceste două structuri, catalizată de enzima
transprenil transferaza.
•La fel ca şi în sinteza colesterolului, enzima hidroximetilglutaril (HMG)~SCoA
reductaza joacă un rol cheie în reglarea sintezei de coenzimă Q10. Totuşi secvenţa
finală de formare a CoQ10 ce are loc după reacţia de condensare nu este bine
definită la mamifere.

44
ALȚI COFACTORI TRANSPORTORI DE
HIDROGEN

ACIDUL LIPOIC

45
• Acidul lipoic (acid tioctic) – STRUCTURĂ CHIMICĂ

Acidul 6,8 – ditio-octanoic

H2
8
C 6
1
7
H2C CH (CH2)4 COOH

5

S S
Acid -lipoic

H2 O
5 3

8
C 6
CH2 CH2 C
1

H2C CH OH
CH2 CH2
4 2
S S
Acid lipoic
46
 Acidul lipoic - Particularități structurale

H2
• compus biologic activ, C 1
8
vitamin-like, sintetizat în H2C
7 6
CH (CH2)4 COOH

5
organismele vegetale şi
animale, inclusiv în S S
organismul uman Acid -lipoic - forma oxidată

-2H +2H
• potenţialul de H2
oxidoreducere Eo’ = -0,29 V 8
C 6
1
7
H2C CH (CH2)4 COOH

5

• funcționează, reversibil, SH SH
ca acceptor-donor de
Acid -lipoic - forma redusă
hidrogen (acid dihidro-lipoic)

47
Acidul lipoic - Particularități structurale și funcționale

• Îndeplineşte rolul de cofactor, după legarea sa de proteina

apoenzimatică; această legătură se stabileşte între gruparea
- COOH a acidului lipoic şi gruparea ε-amino a lizinei din
catena polipeptidică
Rest de lizină din proteina
enzimatică
O HN

C N CH2 CH2 CH2 CH2 CH
H
C
O
S S

Acid lipoic oxidat legat de partea proteica a enzimei (lipoil--aminolizina)

48
 Rest de lizinã din proteina
enzimaticã
ACIDUL LIPOIC - H2 H2 H2
O

HN

C C C C N CH2 CH2 CH2 CH2 CH
particularități
8 6
H2C CH C C 1 H
H2 H2 C
O
funcționale S S
Acid lipoic legat de proteina enzimaticã
(forma oxidatã)

O
R C
OH
Acid gras
• Prin ruperea punţii
O  HN
disulfurice, acidul lipoic are H2
8 C 6 C N CH2 CH2 CH2 CH2 CH
capacitatea de a transporta H2C CH H
C
şi o grupare acil. SH S
O
HSCoA
Acil
Acil~SCoA

H2 O  HN
C C N CH2 CH2 CH2 CH2 CH
transportul concomitent H2C
8 6
CH H
C
de hidrogen şi de SH SH
O

grupări acil Acid lipoic legat de proteina enzimaticã 49

(forma redusã)
 Acidul lipoic - cofactor pentru complexe enzimatice
dehidrogenazice
• Acidul α-lipoic, legat în forma de lipoamidă, funcţionează drept cofactor
(grupare prostetică) în structura unor complexe enzimatice mitocondriale,
care catalizează reacții de decarboxilare oxidativă a cetoacizilor
potenţial de oxidoreducere Eo’ = -0,29 V, ceea ce îi dă posibilitatea de
a funcţiona împreună cu molecula de FAD
CH3
O
piruvat-dehidrogenaza + CO2 + NADH + H+
C O H3C C ~SCoA
TPP, acid lipoic, HS-CoA,
COOH FAD, NAD+
Acid piruvic Acetil coenzima A

COOH COOH
C O a-cetoglutarat-dehidrogenaza CH2
+ CO2 + NADH + H+
CH2 TPP, acid lipoic, HS-CoA, CH2
FAD, NAD+ O
CH2
C ~SCoA
COOH
Succinil-coenzima A
Acid -cetoglutaric
50
 ACIDUL LIPOIC
Utilizare terapeutică
Produse farmaceutice

 Este un antioxidant natural, cu reactivitate înaltă față de

radicalii liberi
 Este bine absorbit la nivel gastro-intestinal
 Este neuroprotector
 Interacționează sinergic cu alți antioxidanți și regenerează
vitaminele E și C
 Crește nivelul tisular al glutationului, unul dintre principalii
antioxidanți endogeni, al cărui nivel scade odată cu vârsta
 Util în: neuropatiile diabetice, ateroscleroză, boli
neurodegenerative, (Parkinson, Alzheimer), protector hepatic

51
Oxidoreductaze transportoare de
electroni

TRANSELECTRONAZE

52
 Oxidoreductaze cu fier heminic. Hem-enzime

Citocromii
• Keilin – 1925
• Fier-proteine cu localizare mitocondrială
• Participanți activi la lanțul respirator
• Unii sunt localizați în microzomi
• Se cunosc aproximativ 100 citocromi
• Gruparea prostetică: fier-porfirinică
• Au structură heminică
• Realizează transferul reversibil al unui singur electron- prin intermediul
atomului de fier situat în centrul hemului Fe(II)  Fe(III).

53
 CITOCROMII – Structură chimică
Citocromii a
• Fier-proteine având o structura de tip
protoporfirinic (nucleu tetrapirolic) ce
are la bază pirolul

• Denumirea de porfirine (din

limba greacă) se datorează culorii
purpurii a acestor compuşi

• Porfirină + FIER = HEM

• HEMUL reprezintă subunitatea

prostetică a numeroase hemoproteine,
printre care şi citocromii

• Atomul de fier (Fe2+ sau Fe3) se leagă

pirol prin legături coordinative de cei patru
atomi de azot tetrapirolici.

54
Structuri tridimensionale ale citocromului c
• Citocromul c = heteroproteină
globulară prezentă în mitocondria de la
toate organismele eucariote.
• un singur lanţ polipeptidic format din
104 de aminoacizi.

• Este implicat direct în respirația

celulară (mitocondrii) și în
metabolizarea medicamentelor (REN -
microzomi)

55
 Mecanism de acţiune

• Citocromiii a, b, şi c sunt prezenţi la nivelul membranei mitocondriale şi fac

parte din complexele lanţului respirator.
• Structurile heminice din citocromii a şi b nu sunt leagate covalent de partea
proteică.
• Potenţialele de oxidoreducere ale citocromilor sunt pozitive, ei fiind plasaţi în
lanţul respirator mitocondrial în ordinea crescătoare a potenţialelor lor redox.
• Transportul electronilor se face pe baza transformărilor redox reversibile ale
atomului de fier heminic:
Citocrom - Fe3+ + e- Citocrom - Fe2+

56
 Citocromii P450 şi b5
• Componente active ale lanţului transportor de electroni situat la
nivelul reticulului endoplasmic neted (microzomi).
• Citocromii P450 (EC: 1.14.14.1) = o familie multigenică de hemoproteine cu
proprietăţi diferite de cataliză, de specificitate pentru substrat, şi de sensibilitate
la tratamentul cu diferiţi inductori.
• Complexul citocromului cu monoxidul de carbon (CO) este un pigment (P) cu
un maxim de absorbţie la 450 nm.
• Anul 2014 a marcat a 60-a aniversare a descoperirii citocromilor P450, fiind
identificate la om un număr de 57 gene care codifică pentru diferite izoenzime
ce prezintă un interes farmacologic şi toxicologic.
• Familia CYP metabolizează mii de compuşi endogeni şi exogeni şi sunt prezente
în aproape toate ţesuturile.
• Sunt implicate în biosinteza colesterolului, a acizilor biliari, hormonilor steroizi,
şi în metabolismul vitaminei D.
• La om, cele mai implicate enzime în metabolismul medicamentelor sunt
izoformele: CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, CYP1A2, CYP2C19.
57
 Nomenclatura CYP
• Multiplicitatea şi eterogenitatea
citocromilor P450 a necesitat
elaborarea unei nomenclaturi Familie Sub-familie Enzima
bazată pe procentul de omologie CYP 1 A 1
al secvenţelor proteice, această B…. 2
nomenclatură fiind adusă la zi o 3….
dată la doi ani. Omologie > Omologie >
• Monooxigenazele citocrom P450 40% 60%
sunt desemnate cu prescurtarea 2 A
CYP urmată de o cifră arabă care B….
indică familia genică din care face
parte. Urmează apoi o literă 3 …..
pentru subfamilie şi o cifră arabă
ca număr de identificare a genei.

58
 Citocromii P450 şi b5
• Citocromul P450 este o oxidază terminală într-un lanţ multienzimatic
cu funcţie mixtă în care mai intervin NADPH-citocrom P450 reductaza
şi NADH-citocrom b5 reductaza.
• Aceşti citocromi participă la
1) reacţiile de hidroxilare din biosinteza unor molecule endogene:
colesterol, hormoni steroizi, calciferoli, acizi graşi hidroxilaţi, acizi
biliari, aminoacizi aromatici
2) reacțiile de metabolizare a compuşilor xenobiotici: medicamente,
pesticide, aditivi alimentari
• Citocromul P450 are rol de monooxigenază cu funcţie mixtă:
Cit. P450
R-H + NADPH + H+ + O2 R-OH + NADP+ + H2O

Capacitatea P450 de a biotransforma numeroase molecule exogene diferite

permite organismelor vii de a se adapta la mediul înconjurător !!
59
Clasificarea CYP 450 în funcție de substrat

60
Izoforma
CYP Substrate Inhibitori Inductori

Principalele clase de CYP implicate în metabolismul

medicamentelor. Activarea şi inhibiţia cu impact asupra
eficacităţii-toxicităţii acestora

B. P. Sweeney and J. Bromilow,

Anaesthesia, 2006, 61, pages 159–177 61
Izoforma Substrate Inhibitori Inductori
CYP

Principalele clase de CYP implicate în metabolismul

medicamentelor. Activarea şi inhibiţia cu impact asupra
eficacităţii-toxicităţii acestora

B. P. Sweeney and J. Bromilow,

Anaesthesia, 2006, 61, pages 159–177 62
 Transelectronaze
Subclasa 1.11 (acceptor de H2O2)

CATALAZA
EC: 1.11.1.6
HEM-ENZIME
Catalaza este prezentă în toate celulele aerobe, fiind localizată la
nivel subcelular în mitocondrii şi peroxizomi.
În organismul animal, catalaza se găseşte în special în ficat şi
eritrocit, unde protejează hemoglobina de acţiunea lezantă a
speciilor reactive de oxigen.

63
• Catalaza (EC: 1.11.1.6) = hem-enzimă, Catalaza are drept grupare
prostetică patru molecule de hem, deci patru atomi de fier

Catalaza produce reacţia de dismutare a peroxidului de hidrogen;

1 mol de catalază descompune 5 x 106 moli H2O2.

H2O2 + H2O2 2H2O + O2

64
Oxidoreductaze cupru-dependente

Transelectronaze cu cupru
(cupru-enzime)

65
• Transelectronazele cu cupru sunt oxidaze care transferă electroni de pe
un metabolit pe oxigenul molecular (deci reacţionează direct cu O2)

• Transportul electronilor se face pe baza transformărilor redox reversibile

ale atomului de cupru, mecanismul de acţiune fiind:

Cu2+ + e- Cu+

Exemple de transelectronaze cu cupru:

• uricaza
• fenol oxidazele
• ascorbat oxidaza
• ceruloplasmina
• superoxid-dismutaza

66
 Uricaza (sau urat-oxidaza, EC: 1.7.3.3; urat:oxigen-oxidoreductaza)

• Enzima care transformă acidul uric în alantoină la toate mamiferele, cu excepţia

primatelor şi a omului.

• Uricaza recombinată (preparată prin inginerie genetică, ADN recombinat) a fost

studiată şi propusă de curând ca posibil medicament în hiperuricemie (gută).

O 1/2 O2 H2O
H O
N N
HN NH2
O O
URICAZA
O N N O N N
H H H
Acid uric Alantoina
CO2

NH2 COOH NH2 NH2

COOH
C
N
C
H N
C
O
2O C
+ 67
O NH CHO
 Fenilalanină-4-hidroxilaza (EC: 1.14.16.1) este o monooxigenază care
catalizează hidroxilarea fenilalaninei la tirozină.
COOH
COOH
H2 N CH
H2 N CH
CH2
CH2
fenil-alanin-4-hidroxilaza
+ NADP+ + H2 O
+ NADPH+H+ + O2
citocrom P450

L-Fenilalaninã acid ascorbic OH

L-Tirozinã
Cu+

• Fenol-oxidazele = Enzime care catalizează hidroxilarea monofenolilor la

difenoli, şi apoi a difenolilor la chinone.
• Polimerizarea rapidă a acestor chinone conduce mai departe la formarea
pigmenţilor coloraţi (polifenoli), proces întâlnit sub numele uzual de
“brunificare” a fructelor şi legumelor (mere, pere, gutui, cartofi), în
prezenţa oxigenului.
• În funcţie de substratul catalizat fenol-oxidazele sunt clasificate în
tirozinaze (sau monofenol oxidaze) şi catecol-oxidaze (sau difenol oxidaze).
68
 Ceruloplasmina
Feroxidază (Fe2+: oxigen oxidoreductază, EC:1.16.3.1)
• este o metal-proteină multifuncţională
• transportor de cupru, agent anti-inflamator, antioxidant plasmatic
captator de radicali liberi
• 2-glicoproteină ce conţine 8 atomi de cupru în moleculă.
• sintetizată la nivel hepatic
• acţionează ca oxidază
• rol în metabolismul fierului, împreună cu transferina (care îl transportă
numai sub formă ferică)
• catalizează oxidarea Fe2+ în Fe3+, favorizând captarea fierului de către
transferină şi utilizarea sa mai departe în biosinteza hemoglobinei.

Ceruloplasmina
4Fe2+ + 4H+ + O2 4Fe3+ + 2H2O

69
 Superoxid-dismutaza
(SOD, superoxid:superoxid oxidoreductază; EC: 1.15.1.1)

• metal-enzimă ce conţine Cu2+ şi Zn2+, Mn2+ sau Fe2+ (în cazul bacteriilor)
• descoperită în 1969 de către J. McCord şi I. Fridovich
• SOD catalizează reacţia de dismutare a radicalului superoxid:

.- .- + SOD
O2 + O2 + 2H H2O2 + O2

Aproximativ 98% din activitatea SOD la nivel sangvin se găseşte în hematii.

Activitatea enzimatică SOD este scăzută în inflamaţii, tumori, cataractă, precum şi în
70
cursul episoadelor de ischemie a unor organe mari (inimă, creier).
 OXIDOREDUCTAZELE ȘI SPECIILE REACTIVE ALE OXIGENULUI

Unul din paradoxurile vieţii pe planeta noastra este faptul că molecula care
întreţine viaţa aerobă - oxigenul- nu este doar în mod fundamental esenţial
pentru metabolismul energetic şi respiraţie, fiind implicat şi în
etiopatogenia a numeroase boli şi stări degenerative.

Oxigenul atmosferic în starea fundamentală este diferit de alte elemente

gazoase deoarece este un diradical sau, în alţi termeni, el posedă
2 electroni nepereche.
Acest fapt îi conferă oxigenului proprietatea de gaz paramagnetic şi
determină participarea sa la reacţiile cu molecule organice numai sub formă
“activată”. Necesitatea activării sale se datorează faptului că cei 2 electroni
nepereche au spini paraleli (restricţie de spin).

.. . .. .
O2 .O .
.. O ..
71
 OXIDOREDUCTAZELE ȘI SPECIILE REACTIVE ALE OXIGENULUI

Oxigenul este de obicei nereactiv faţă de majoritatea moleculelor organice

care au electroni cu spini opuşi. Astfel este favorizată calea univalentă de
reducere a O2 cu formarea intermediară a radicalului superoxid (O2• -).
Schema reducerii univalente a moleculei de oxigen (O2), cu formarea
radicalilor liberi: anion superoxid (O2• -), radical hidroxil (HO•) şi peroxid de
hidrogen (H2O2). Sistemele enzimatice protectoare superoxid-dismutaza
(SOD), catalaza şi peroxidaza constituie în celulă prima linie de apărare
antioxidantă.

e- .- e- + 2H+ e- + H+ . e- + H+
O2 O2 H2O2 HO H2O

O2.- + O2.- + 2H+ H2O2 + O2 SOD

H2O2 + H2O2 2H2O + O2 Catalaza

H2O2 + RH2 2H2O + R Peroxidaza

72
 Surse de radicali liberi în organism
ENDOGENE EXOGENE
Lanţul respirator mitocondrial Radiaţii diferite (ultrasunete,
Ozonul microunde...)
Activitatea enzimelor
din reticulul endoplasmic Substanţe poluante din apă, aer, sol
(metabolismul xenobioticelor)
Căldura exagerată

Activitatea enzimelor din fagocite Fumul de ţigară (NO2)

Hiperoxie
Activitatea enzimelor lizozomale
Metabolism Hipoxie
Activitatea enzimelor din peroxizomi O2
Creşterea presiunii O2
Activitatea oxihemoglobinei
Efortul fizic intens
Biosinteza eicosanoizilor
în membrane celulare Pesticide
Infecţii microbiene şi virale
Autooxidarea catecolaminelor
Inflamaţia
Activitatea oxidoreductazelor Ischemia-Reperfuzia
Medicamente
Îmbătrânire Specii reactive de oxigen Droguri

O2 .- . OH H2O2

Lezare celulară 73
 Surse endogene de specii reactive de oxigen

Mieloperoxidaza
Oxidari microzomiale (fagocite)
Flavoproteine, CYP

Xantin oxidaza Reticul endoplasmic

izoformele NOS Lizozomi Metale
Citoplasma tranzitionale
Fe
Cu

Oxidaze
Flavoproteine Peroxizomi Mitocondrie Transport de electroni
(respiratia celulara)

Membrana plasmatica
Lipooxigenaze
Ciclooxigenaza
Prostaglandin sintaza
NADPH oxidaza

74
Principalele „ţinte” ale speciilor reactive de oxigen

Căi respiratorii
intestin

OH HOCl
O2-
H2O2

Inimă şi
vase de
Creier şi sange
nervi
75
 Hipo-, hiper-
oxigenare;
Reperfuzie
după
Reacţii ischemie Cataractogeneză
imune
Cancerogeneză
Iradiere chimică
demenţa RADICALI Cancer
senilă
LIBERI Diabet
Ateroscleroza
Parkinson
medicamente
reacţii
inflamaţii induse prin
poluare

intracelular Intracelular şi extracelular

extracelular

Stări patologice caracterizate printr-o componentă prooxidantă,

manifestată la nivel intra- și extracelular. 76
 Teoria radicalilor liberi în îmbătrânire…

D. Harman (1956)

‘’Îmbătrânirea este rezultatul acumulării

progresive a leziunilor celulare determinate
de reacțiile radicalilor liberi ce au loc în mod
continuu în decursul vieții organismului.”

W.A. Pryor (1972)

“Radicalii liberi sunt implicați în primul rând în

dezvoltarea proceselor patologice, care la rândul
lor pot accelera procesul de îmbătrânire”.

G. Barja (1998)

„Viteza de generare a radicalilor liberi la nivel

mitocondrial determină rata îmbătrânirii precum
și durata maximă de viață a difeitelor specii”.

77
 Cum se apără celula în mod natural de efectele ROS?
„Viața este un proces de oxido-reducere”

În cursul evoluţiei celula şi-a construit mecanisme endogene de apărare

antioxidantă
• Compartimentarea proceselor metabolice în diversele organite subcelulare
(“înţelepciunea celulei”)

se evită întâlnirea dintre biomoleculele care reacţionează şi care ar determina

dezordini celulare.
• Sistemele endogene de protecţie antioxidantă acţionează în trepte, cu
mecanisme biochimice foarte specifice

78
 Enzime: SOD, Echilibrul factorilor
GPx, Catalază Specii Reactive ale prooxidanţi / antioxidanţi =
Antioxidanti neenzimatici:
vitamine (E,A,C), tioli, Oxigenului: O2  HOMEOSTAZIE REDOX
fenoli, ceruloplasmină, H2O2 1O2 OH,
transferină, acid uric, HOCl
albumină, etc.

Enzime: SOD,GPX,CAT
Antiox. neenzimatici: Specii Reactive ale
vitamine (E,A,C), thioli,
acid uric, ceruloplasmina, Oxigenului:
transferina,albumina, etc.
O2   , H 2 O2 , 1 O2
OH, HOCl

Stres redox = Stres oxidativ

79