Cuprins

I. Introducere 2
I.1. Tehnici de separare directă a produselor de biosinteză 8
II. Separarea directă a produselor de biosinteză prin extracţie 10
II.1. Separarea prin extracţie directă a acizilor carboxilici 18
II.2. Separarea prin extracţie directă a antibioticelor β-lactamice 23
II.3. Separarea prin extracţie directa a aminoacizilor 27
II.4. Separarea prin extracţie directă a alcoolilor 30
III. Separarea directă a produselor de biosinteză prin pertracţie 38
III.1. Separarea directă prin pertracţie a acizilor organici 40
III. 2. Separarea directă prin pertracţie a alcoolilor 46
III.3. Separarea directă prin pertracţie a aminoacizilor 49
III.4. Separarea directă prin pertracţie utilizând microcapsule 53
IV. Separarea directă a produselor de biosinteză prin pervaporizare 57
IV.1. Separarea directă prin pervaporizare a etanolului 60
V. Separarea directă a produselor de biosinteză prin stripare 67
V.1. Separarea directă prin stripare a alcoolilor 69
VI. Separarea directă a produselor de biosinteză prin adsorbţie 76
VII. Separarea directă a produşilor de biosinteză prin sisteme 81
bifazice apoase
VIII. Separarea directă a produselor de biosinteză prin cristalizare 89
IX. Separarea directă a produselor de biosinteză prin distilare 92
X. Separarea directă a produselor de biosinteză prin electrodializă 96
Concluzii 100
Bibliografie 102

I. Introducere
 Separarea şi concentrarea eficientă a unui produs de fermentaţie joacă un rol cheie
în succesul comercial al unui proces biochimic. Chiar atunci când procesul de
fermentaţie oferă rezultate optime recuperarea produsului poate constitui o limitare a
acestuia. Proiectarea proceselor de fermentaţie, privită din punct de vedere istoric, a
avut tendinţa de a urma paradigma ingineriei chimice şi anume de a aranja operaţiile
individuale într-un mod serial pentru a obţine transformarea dorită a substratului dar şi
recuperarea şi purificarea produselor. Din această perspectivă, este necesară doar
selectarea adecvată a acestor operaţii şi dispunerea lor în cea mai avantajoasă poziţie în
fluxul tehnologic. În aceste circumstanţe, operaţiile de recuperare a unui produs util,
ulterioare procesului de biosinteză nu au un impact esenţial asupra operaţiei precedente,
de exemplu: fermentaţia nu este afectată dacă pentru operaţia de îndepărtare a celulelor
se alege centrifugarea sau filtrarea.
Însă, ultimii 20 de ani au oferit exemple de aplicaţii reuşite privind proiectarea
unui proces de fermentaţie în care operaţiile de recuperare ale produsului sunt integrate
direct în etapa de biosinteză. Motivaţia principală a acestei alegeri în cuplarea separării
cu biosinteza nu a fost numai eliminarea unei etape din fluxul tehnologic, ci mai ales
creşterea productivităţii fermentaţiei. Aceste îmbunătăţiri se pot obţine cel mai des prin
îndepărtarea selectivă a produsului din lichidele de fermentaţie simultan cu producerea
lui. Procesele de biosinteză care pot fi îmbunătăţite prin această abordare includ
procesele care generează:
- Produse toxice sau inhibitorii
- Produse labile chimic
- Procese în care substratul trebuie alimentat într-o manieră controlată în
mediul de cultură.[1]
Separarea directă a compuşilor elaboraţi în timpul proceselor de biosinteză sau
rezultaţi în urma unor transformări enzimatice constituie un domeniu pentru care
interesul acordat a crescut foarte mult. Deoarece numeroase procese de biosinteză sunt
inhibate de acumularea produsului, efect caracteristic în special procedeelor
discontinue, la care concentraţia finala a produsului atinge valori ridicate,
productivitatea biosintezei scade. Separarea directă, prin îndepărtarea compusului în
timp ce se formează poate reprezenta o alternativă eficientă pentru creşterea
productivităţii acestor procese.[2]
Costul etapei de recuperare a produsului, în procente faţă de costul total al
procesului poate varia între 5-10%, pentru obţinerea proteinelor monocelulare şi a
enzimelor extracelulare, ca: protează, amilază, până la chiar şi 90% pentru biosinteza cu

2
ajutorul microorganismelor a poli(3-hidroxialcani) utilizaţi pentru obţinerea de
materiale termoplastice biodegradabile (tabel 1).

Tabelul 1. Variaţia costului etapei de separare şi purificare faţa de costul total al

procesului de biosinteză
Produs de biosinteză Costul, %
Proteine monocelulare, extracte de drojdii 5
Acid lactic, malic, citric 10-50
Amilaze, proteaze 10
Penicilina 20-50
Insulina umană, interferon 90

Costurile ridicate ale tehnologiei de separare se datorează, în general unor

concentraţii relativ reduse în lichidele de fermentaţie, a complexităţii compoziţiei
acestora şi a etapelor distincte şi multiple utilizate pentru purificare produsului util. În
consecinţă, dezvoltarea proceselor de biosinteză sunt condiţionate de strategia globală
utilizată pentru separare. Aceasta depinde la rândul ei de puritatea impusă pentru
produs, care poate atinge valori de 99,99% pentru proteine şi medicamente utilizate în
terapeutică. Mai mult, consideraţiile economice trebuie să ofere o fezabilitate maximă,
minimizând complexitatea operaţiilor, producerea de deşeuri şi maximizând
productivitatea. Din acest punct de vedere, avantajele evidente ale unui proces de
separare directă constau în: minimizarea reziduurilor, a produselor secundare, a
substratului neutilizat, a capitalului şi al energiei [3].
Ultimii 10 ani au adus progrese considerabile în separarea directă a etanolului,
acetonei şi butanolului, dar şi în producerea unor produse cu o valoarea substanţial mai
mare. Mai mult, metodele convenţionale de recuperarea a produselor de biosinteză au
fost completate de: extracţie reactivă, cromatografie de afinitate, electrodializă,
pertracţie, etc. Un proces de fermentaţie integrat urmează a fi aplicat la nivel industrial
de Xethanol Corp, din New York, S.U.A.
Pentru separarea directa a produsului biosintetizat există două variante principale:
 separare ex-situ, procedeu caracterizat prin utilizarea unui utilaj distinct
de separare, lichidul de fermentaţie fiind apoi reintrodus în fermentator
 separare in-situ, procedeu caracterizat prin separarea produsului util chiar
în interiorul bioreactorului.

3
 a b c
Figura 1. Procedee de separare directă a produselor de biosinteză comparativ
cu fermentaţia convenţională
a – fermentaţie convenţională, b - separare ex-situ; c – separare in-situ

Recuperarea in-situ a produselor de biosinteză prin integrarea unei tehnici de

separare în etapa de fermentaţie a prezentat o importanţă deosebită pentru îmbunătăţirea
productivităţii fermentaţiilor caracterizate prin inhibiţie de produs şi de asemenea
pentru reducerea numărului de operaţii din fluxul tehnologic. În anumite cazuri,
separarea directă a produsului din lichidele de fermentaţie împiedică degradarea
acestuia, sau a substratului. Condiţiile esenţiale pentru ca o tehnică de separare să fie
aplicabilă pentru fermentaţia extractivă sunt:
- compatibilitatea cu microorganismul producător,
- posibilitatea de prelucrare a unor lichide de fermentaţie cu caracteristici
speciale,
- posibilitatea de recirculare a acestuia.[4]
Separarea directa faţă de procedeele clasice de separare, după terminarea
proceselor de biosinteza prezintă următoarele avantaje:
- evită apariţia inhibiţiei de produs
- elimină etapa de filtrare a biomasei, scăzând pierderile de produs util
- reduce consumurile de materiale şi energie
- simplifică fluxul tehnologic de separare.

4
 Pentru separarea directă se pot utiliza următoarele tehnici: adsorbţia, distilarea,
precipitarea, extracţia, striparea cu gaze, dializa, osmoza inversa, pervaporizare,
elecroforeza.
Alegerea unei metode de separare ca fiind cea mai buna este deosebit de dificilă,
în special datorită diferenţelor care apar între variabilele considerate de fiecare grup de
cercetători: tipul, tulpina şi faza de creştere a microorganismelor, sursa, tratamentele
preliminare şi concentraţia nutrienţilor şi a substratului, temperatura, pH-ul,
concentraţia oxigenului, tipul fermentatorului, nivelul amestecării. Totuşi se pot face o
serie de observaţii cu caracter general [5]:
1. Productivitatea într-un proces de fermentaţie poate fi mărită prin cuplarea
acestuia cu o tehnologie de separare in-situ dacă produsul separat exercită inhibiţie de
produs. Microorganismele, inclusiv tulpinile standard de drojdii, sunt supuse unei
puternice inhibiţii de produs peste anumite concentraţii ale produsului biosintetizat:
etanol 5-8%, butanol  1%. Deci, productivitatea în procesul de biosinteză a alcoolului
butiric, va fi mai puternic influenţată pozitiv decât în cazul etanolului, prin cuplarea cu
o metodă de separare directă. Inhibiţia realizată de un produs în lichidul de fermentaţie
variază foarte mult între diferitele tulpini de microorganisme. De exemplu, Pichia
stipitis CBS 5773, este afectată de inhibiţie de produs la concentraţii ale etanolului de
2%, o valoare mult mai mică decât în cazul tulpinii de Saccharomyces cerevisiae. Ca
rezultat, microorganismele care sunt mai sensibile la acţiunea produsului, dar care
posedă caracteristici de performanţă superioare, ca: termotoleranţă, ar putea fi utilizate
cu randamente şi productivităţi mari dacă se menţine concentraţia produsului sub
valoarea inhibitorie [6]
2. Creşterea concentraţiei de celule viabile în fermentator vor creşte
productivitatea în ceea ce priveşte, de exemplu etanolul, atât timp cât celelalte variabile
ale procesului se menţin constante. Creşterea concentraţiei de celule viabile în
fermentator poate fi realizată fie prin utilizarea unor tehnologii de separare şi
recircularea celulelor, sau prin imobilizarea acestora. Nakao s.a. au observat o creştere
a productivităţii cu 200-300% în fermentaţia etanolului la cuplarea directă
pervaporizării cu fermentaţia. Creşterea productivităţii s-a datorat în principal unei
creşteri în concentraţia celulelor viabile prin imobilizare şi prin îndepărtarea apei prin
pervaporizare, cu un efect mai mic asupra reducerii inhibiţiei de etanol, aceasta
deoarece productivitatea per celule viabile creşte doar cu 20-50% prin eliminarea
inhibiţiei de produs [7]. Creşterea concentraţiei biomasei prezintă importanţă în special
când consumul de substrat este lent. De exemplu, consumul de xiloză de către
Saccharomyces cerevisiae este mai lent decât cel de glucoză, deci consumul de xiloză

5
pe unitatea de reactor poate fi îmbunătăţită prin creşterea concentraţiei celulelor de
drojdie. Cum pervaporizarea îndepărtează apa şi etanolul produs, densitatea celulelor
creşte după aplicarea separării directe, deşi creşterea este mai mică în comparaţie cu
utilizarea filtrării, de exemplu [8].
3. Integrarea unei unităţi de separare a produsului util în procesul de
fermentaţie permite utilizarea unor soluţii de substrat mult mai concentrate care măresc
productivitatea în bioreactor şi reduce cantitatea de apă procesată în sistem. Taylor ş.a.
prin utilizarea stripării cu gaze cuplate cu biosinteza, au reuşit utilizarea unei soluţii de
glucoză de 550 g/cm3, menţinând o concentraţie a etanolului sub valoarea de 5%,
concentraţie care ar determina inhibiţie de produs. Însă, acest procedeu a condus la
obţinerea la nivele ridicate a altor inhibitori: acizi organici (formic, acetic, citric, lactic),
acetaldehida, acetat de etil, metanol, izobutanol [9] Indiferent dacă inhibitorii sunt
produşi de microorganism sau sunt prezenţi în mediul de cultură, probabil datorită
pretratamentelor la care este supus, concentraţia acestora este ridicată când creşterea
productivităţii în bioreactor prin utilizarea unor concentraţii ridicate ale substratului,
prin recircularea celulelor sau a lichidului de fermentaţie. Prin utilizarea tehnologiilor
de separare care îndepărtează numai compuşii volatili, cei nevolatili, sau cu o
volatilitate scăzută se acumulează în fermentator [10].

Tabel 2. Selectarea unei potenţiale tehnici de separare in-situ pentru diferite clase
de produşi de biosinteză [11].
Produşi de Caracteristici utilizate Tehnici potenţiale
biosinteză pentru separare
Acizi organici Solubilitate, Extracţie, schimb ionic
Terpene Hidrofobicitate Extracţie, separare prin membrane
Acizi graşi Solubilitate Extracţie, adsorbţie
Alcooli Solubilitate, presiune de vapori Extracţie, pervaporizare
Aminoacizi Solubilitate Adsorbţie, schimb ionic
Esteri Hidrofobicitate, presiune de vapori Extracţie, separare prin membrane
Proteine Solubilitate, formă şi dimensiune Separare prin membrane, schimb ionic
moleculară

Există, deci, o varietate de tehnologii de separare aplicabile pentru recuperarea

directă a produselor de biosinteză, fiecare dintre ele având posibile avantaje şi
dezavantaje, aplicabile pe o arie relativ largă de microorganisme. În tabelul 2 sunt
prezentate câteva potenţiale tehnici de separare in-situ a unor compuşi, grupaţi pe baza
unor caracteristici similare. Procesele de biosinteză se realizează, în general în fază
apoasă. Tehnicile de separare directă ar trebui să scadă concentraţia produsului dizolvat

6
în fermentator, de exemplu prin modificarea stării de agregare a produsului. Din faza
apoasă acesta poate fi transformat în vapori, prin distilare, pervaporizare sau în fază
solidă prin cristalizare, precipitare. Însă, nu se pot aplica decât temperaturi medii în
toate aceste procese datorită sensibilităţii termice fie a enzimelor, fie a
microorganismelor. De aceea separarea prin transformarea compuşilor în fază de vapori
este posibilă doar pentru produse foarte volatile. Separarea in-situ prin cristalizare oferă
avantajul obţinerii produsului direct în formă solidă finală, însă s-a constat de multe ori
necesitatea redizolvării cristalelor pentru purificare pentru a întruni cerinţele tehnice
[12].

I.1. Tehnici de separare directă a produselor de biosinteză

Procesele de biosinteză sunt, în general caracterizate de o productivitate mai mică

în comparaţie cu reacţiile de sinteză chimică. Cel mai important dezavantaj al
biocatalizatorilor aplicaţi pentru sinteza sau transformarea unor substanţe organice este
relaţionat cu necesitatea utilizării unor substrate sau medii de cultură diluate.

7
Solubilitatea mică a multor substanţe organice în soluţii apoase sau efectele inhibitorii
ale acestora asupra biocatalizatorilor sau microorganismelor producătoare reprezintă
numai câţiva factori restrictivi. Productivitatea unor procese de biosinteză poate fi
crescută dacă transformarea are loc la valori ale concentraţiei substratului sau
produsului la care microorganismele sau enzimele să prezinte activitate maximă. Acest
fapt poate fi realizat prin adăugarea continuă a substratului sau prin îndepărtarea „in-
situ” a produsului [13].
Produsele de biosinteză: acetona, butanolul, şi etanolul sunt poate cele mai
cunoscute exemple de produse de biosinteză care determină inhibiţia fermentaţiei pe
măsură ce se formează (acumulează). În consecinţă, integrarea unei operaţii de separare
în aceste procese de biosinteză are beneficii evidente.[1]
Pentru separarea directă a produselor de biosinteză din lichidele de fermentaţie au
fost propuse şi utilizate următoarele tehnici:
 extracţia: presupune dispersia unui solvent organic în lichidul de
fermentaţie, picăturile de solvent se separă datorită diferenţei de
densitate, extrăgând selectiv produsul, formând apoi un strat distinct
lichidului de fermentaţie prin coalescenţă. Solventul este apoi
regenerat şi recirculat în fermentator. În consecinţă, concentraţia
produsului inhibitor este păstrată sub valoarea inhibitorie, fiind
posibilă biosinteza continuă a acestuia
 extracţia prin membrane lichide: membranele lichide cu aplicaţii în
acest domeniu pot fi obţinute prin emulsionare (LME) sau prin
includere într-un polimer solid (SLME). În cazul LME, solventul este
interpus între lichidul de fermentaţie, din care se face extracţia şi
soluţia de reextracţie. Stabilizarea membranei se realizează cu ajutorul
unor compuşi tensioactivi. Suporturile solide care pot îngloba
solventul sunt membrane microporoase, hidrofobe
 pervaporizarea: aplicabilă amestecurilor de lichide care conţin
componenţi cu volatilităţi diferite. Vaporii difuzează, cu viteze diferite,
prin porii unei membranei semipermeabile. Membranele sunt
confecţionate din: polidimetilsiloxan, cauciuc siliconic, silicaţi, poli(1-
trimetilsilil)-1-propină)
 striparea cu gaze: foloseşte un gaz inert, în general CO 2 sau azot, care
nu este toxic pentru microorganisme. Gazul barbotat în lichidul de
fermentaţie antrenează vaporii produsului util volatil

8
  adsorbţia: utilizează următorii adsorbanţi: filtru textil cu cărbune activ,
ester polimetacrilic, adsorbanţi hidrofili. O condiţie impusă de această
tehnică este folosirea numai a acelor adsorbanţi selectivi pentru
produsul util. Metoda poate fi combinată cu striparea cu gaze, pentru a
se evita adsorbţia compuşilor necesari desfăşurării procesului de
fermentaţie (glucoza)
 prin reacţii chimice: reactanţii folosiţi formează cu produsul util
compuşi uşor de separat
 dializa: este tehnica care utilizează membrane semipermeabile
confecţionate din: acetat de celuloză, polisulfone, cauciuc siliconic
 osmoza inversă: reprezintă separarea prin membrane semipermeabile
sub acţiunea presiunii. Se aplică numai ex-situ.
 distilarea prin membrane: constă în evaporarea şi trecerea vaporilor
printr-o membrană hidrofobă de tipul politetrafluoretilenă. Eficienţa
procedeului poate fi crescută prin înglobarea în porii membranei a
unui solvent

II. Separarea directă a produselor de biosinteză prin extracţie

Extracţia lichid-lichid este utilizată pentru a separa constituenţii din soluţii lichide
omogene. Implică adăugarea unui solvent lichid care este nemiscibil sau parţial miscibil
cu lichidele de fermentaţie şi distribuţia componenţilor prin amestecarea celor două

9
faze. Extracţia lichid-lichid are, în particular câteva avantaje în comparaţie cu alte
procedee in-situ şi este unul dintre cele mai studiate procese de separare pentru
creşterea productivităţii într-un proces de fermentaţie. Schema unei fermentaţii cuplate
cu extracţia directă este prezentată în figura [14]:

Figura 2. Schema simplificată a unei fermentaţii realizată cu separare directă în

regim continuu

Fermentatorul este continuu alimentat cu substrat care este consumat de

microorganisme. În timpul fermentaţiei, un solvent organic este dispersat în lichidul de
fermentaţie. Picăturile de solvent se ridică la suprafaţă, formând prin coalescenţă un
strat separat la partea superioară a lichidului de fermentaţie. Solventul, îmbogăţit cu
produs, este regenerat şi apoi recirculat în fermentator. Astfel, este posibilă menţinerea
unei concentraţii a produsului sub valoarea inhibitorie, permiţând astfel dezvoltarea în
continuare a microorganismelor.
Metoda separării directe a produselor de biosinteză prin extracţie ridică două
probleme majore referitoare la: solventul utilizat şi echipamentul de extracţie. Solvenţii
joacă un rol important în mediul de reacţie: pot afecta viteza sau mecanismul de reacţie.
Procedeul este utilizat frecvent pentru obţinerea:
- etanolului,
- acetonei,
- butanolului,
- acidului propionic

10
 - acidului butiric
Selectarea unui solvent compatibil cu sistemul de biosinteză respectiv este
condiţionată puternic de contactul direct între solvent şi celulele din lichidul de
fermentaţie. Solventul trebuie să îndeplinească următoarele condiţii [2,14,15]
 absenta toxicităţii pentru microorganismele cultivate, biocompatibilitatea
 valori ridicate ale coeficientului de distribuţie al solutului între lichidul de
fermentaţie şi solvent
 formarea unor emulsii puţin stabile cu mediul de cultură
 regenerare uşoara
 solubilitate minimă în lichidul de fermentaţie,
 densitate cât mai diferită de cea a lichidului pentru a asigura separarea
fazelor,
 vâscozitate redusă,
 tensiune interfacială ridicată,
 stabilitate chimică ridicată în special la temperaturi ridicate şi în timpul
proceselor de sterilizare,
 lipsa unor efecte negative asupra mediului înconjurător,
 cost scăzut.
Totuşi, este puţin probabil să existe un solvent care să îndeplinească toate aceste
cerinţe. În consecinţă, este necesară stabilirea unor priorităţi în cadrul acestor atribute.
Wang s.a. (2002) au ales următoarele caracteristici ale unui solvent ca fiind
determinante în alegerea acestuia pentru un proces de fermentaţie extractivă:
1. Biocompatibilitatea
Biocompatibilitatea solventului în raport cu microorganismul producător este o
proprietate deosebit de importantă în alegerea acestuia. Dacă solventul are un impact
pozitiv sau nu are nici un efect asupra productivităţii sistemului de reacţie atunci el este
biocompatibil. În comparaţie cu alte atribute necesare ale solventului, cerinţele de
biocompatibilitate sunt importante criterii restrictive în alegerea acestora. Estimarea
biocompatibilităţii din punct de vedere cantitativ este destul de dificilă, datorită lipsei
unor date experimentale suficiente [15].

Tabel 3. Valorile log P pentru solvenţi utilizaţi uzual[16]

Solvent Log P Extractant Toxicitate
Benzen 2,0 Alamine 304 +(a)
Heptanol 2,4 Alamine 308 +(a)
Toluen 2,8 Alamine 336 +(a)

11
Stiren 2,9 Adogen 283-D +(a)
p-xilen 3,1 Amberlite LA2 +(a)
Etilbenzen 3,3 20% TOPO/kerosen -(a)
Ciclohexan 3,4 20% Hostarex A -(b)
327/alcool oleic
Diclorbenzen 3,6 THP -(b)
Propilbenzen 3,8
Hexan 3,9
Difenileter 4,2
Izooctan 4,8
Octan 4,9
Hexileter 5,1
Nonan 5,5
Decan 6,0
Dodecan 7,0

Biocompatibilitatea poate fi cuantificată prin mărimea log P, definit ca raportul

între coeficientul de distribuţie produsului într-un amestec standard de octanol-apă: cu
cât log P este mai mare cu atât este mai mică toxicitatea solventului. Însă
biocompatibilitatea trebuie analizată pentru fiecare microorganism (sistem bacterian).
În tabelul 3 sunt prezentate câteva valori pentru log P a unor solvenţi uzuali faţă de
microorganismele Propionibacterium acidipropionici(a) şi Clostridium butyricum(b).
Deşi unele studii au observat că Alamine 336 nu prezintă toxicitate pentru unele
bacterii, pentru tulpini de Clostridium tyrobutyricum acest compus este toxic la
concentraţii de 10% Alamine 336 în alcool oleic, neputându-se realiza fermentaţia
extractivă datorită faptului că chiar şi urme ale acestui extractant prezintă toxicitate
pentru microorganismele neimobilizate [17].
Gao s.a. (1992) au dezvoltat, pentru cuantificarea biocompatibilităţii un model
bazat pe variabila: LC 50, definit ca şi concentraţia letală a solventului, care determină
un grad de mortalitate de 50%:
L
 log LC 50   N j j
j 1

în care Nj – numărul de grupări j din compus

j – contribuţia grupei j
L – numărul grupelor j din moleculă.
Pentru a asigura biocompatibilitatea solventului cu sistemul de biosinteză se
impune constrângerea:
 log LC 50  

12
 în care  - o constantă obţinută euristic [18].
Toxicitatea solventului poate apare la nivel molecular, prin: inhibiţia enzimelor
şi/sau modificarea permeabilităţii membranelor, prin îndepărtarea nutrienţilor sau a
unor fragmente celulare datorită extracţiei, prin blocarea difuziei nutrienţilor din mediu
în celulă prin solvatare. Toxicitatea exercitată la nivel molecular poate fi diminuată prin
utilizarea unor solvenţi complet insolubili în apă. Toxicitatea poate fi eliminată prin
utilizarea unor membrane hidrofobe care să prevină contactul direct al celulelor cu
solventul.
2. Separarea fazelor
Solventul selectat pentru fermentaţia extractivă trebuie sa aibă un factor de
separare ridicat şi selectivitate înaltă pentru produs. În esenţa acest fapt se poate rezuma
astfel: solventul trebuie să inducă separarea fazelor, conducând la un echilibru lichid-
lichid. În general, pentru alegerea unui solvent se utilizează un model corespunzător
unui sistem binar cu miscibilitate parţială, în alte cuvinte: odată cu introducerea
solventului în lichidul de fermentaţie se formează două faze. Pentru predicţia separării
fazelor lichide s-au utilizat mai multe metode, bazate pe: o valoare a energiei libere
Gibbs minimă, metoda iteraţiei directe a lui Henlez şi Rosen, cu ajutorul căreia se poate
calcula direct compoziţia la echilibru [15].
3. Inerţie în condiţiile de reacţie
Inerţia solventului pentru reacţia chimică poate fi verificată prin valorile contantei
de echilibru, calculată din energiile Gibbs. O condiţie esenţială, în acest caz este: pentru
ca reacţia să nu aibă loc valoarea energiei libere Gibbs să fie mai mare decât zero. Însă,
în realitate este destul de dificil să se stabilească dacă o reacţie va avea sau nu va avea
loc.
4. Proprietăţile termo-fizice şi fezabilitatea structurală
Proprietăţile termo-fizice, ca: punct de topire şi de fierbere, densitatea sunt
caracteristici importante. Pentru a se asigura fezabilitatea structurală, se poate utiliza
regula octet:
 ( 2   j ) N j  2m
j

în care Nj, j reprezintă numărul de valenţe, şi respectiv de grupări j, m  1,0,-1

pentru molecule aciclice, monociclice şi biciclice [15].

Martak s.a. (1997) au studiat toxicitatea solvenţilor organici utilizaţi la separarea

directă a acidului lactic utilizând ca microorganism producător: Rhizopus arrizus.
Aceştia clasifică solvenţii utilizaţi în extracţiile directe în trei categorii:

13
  solvenţi netoxici, caracterizaţi prin faptul ca nu au nici un efect toxic asupra
microorganismelor, productivitatea acestora fiind maxim cu 25 % mai mică
decât cea în condiţii de cultivare controlată (in lipsa solventului). În aceasta
categorie au inclus: TOA 0.4 mol/l în n-alcani, HOE (di-izo-tridecilamina)
0.3 mol/l în alcool oleic.
 solvenţi mediu toxici, când productivitatea a fost cu 25 % mai mică decât
cea din condiţii de cultivare controlată, ca în cazul: izotridecanol, THP
(trihexilfosfat), şi Hostarex A327 dizolvati în n-alcani si alcool oleic.
 solvenţi toxici, în prezenţa cărora microorganismele nu prezintă activitate
biologica sau productivitatea a fost cu mai mult de 25 % mai mica decât cea
obţinută în condiţii de cultivare controlată, iar faza lag a durat de doua ori
mai mult. în aceasta categorie a inclus: toţi solvenţii care conţin octanol,
HOE 2652 în izodecanol.
Modificatorii de fază au fost studiaţi separat pentru a li se verifica toxicitatea.
Rezultatele au fost:
- octanolul inhibă total activitatea biologică
- izo-tridecanolul scade productivitatea de doua ori
- izodecanolul permite doar o slabă conversie a glucozei la acid lactic
Alcoolul oleic nu influenţează parametri de dezvoltare ai biomasei. Mai mult
acesta este consumat de microorganism, faza organică dispărând în timpul fermentaţiei.
În general, cu creşterea catenei alcoolilor toxicitatea acestora scade. S-a observat
deasemenea faptul că în cazul tuturor solvenţilor care conţin izodecanol şi izotridecanol
biomasa a crescut doar sub forma filamentoasă.
În ceea ce priveşte extractanţii utilizaţi în cazul extracţiei reactive directe, efectul
acestora este diferit în funcţie de clasă şi de solubilitatea în apă. În figura 3 este
prezentată influenţa agenţilor de extracţie asupra microorganismului R. arrhizus.

14
 Figura 3. Influenţa agenţilor de extracţie asupra microorganismului R. arrhizus, în
producţia acidului lactic

După cum se observă, Alamine 336, chiar şi în proporţii mici, de 20 şi 30% inhibă
puternic creşterea biomasei. Se observă o diferenţă importantă între efectul a doi
extractanţi aparţinând aceleaşi clase: derivaţi organofosforici: tributilfosfat şi
trihexilfosfat, probabil relaţionată cu diferenţa între valorile solubilităţii acestora în apă:
0,4 şi, respectiv 2 mg/l. Toxicitatea extractantului Cyanex, nu a fost importantă pentru
microorganismul studiat .[19].
Au fost realizate multiple studii privind toxicitatea solvenţilor organici puri: esteri,
cetone, hidrocarburi aromate, alcooli, aldehide pentru biosinteza acidului butiric cu
diferite microorganisme. S-a observat faptul că toţi solvenţii cu excepţia hidrocarburilor
cu 6-12 atomi de carbon, a alcoolilor cu catenă lungă şi a ftalaţilor sunt toxici pentru
Lactobacillus deldrueckii, Clostridium acetobutylicum.
Barton şi Daugulis(1992) au determinat că alcoolul oleic nu are nici o influenţă
asupra fermentaţiei butanolului utilizând Clostridium acetobutylicum. Pentru a creşte
eficienţa extracţiei s-au adăugat în solvent agenţi purtători în faza organică: alchilamine,
alchilfosfaţi. Extractanţii se dizolvă în solvenţi datorită unor valori ridicate ale
toxicităţii acestora în stare pură. Există însă şi extractanţi cu o toxicitate acceptabilă
după diluţie: TOPO şi tri-noctil-ndecilamina, cei mai adecvaţi agenţi de extracţie fiind
pentru separarea directă a butanolului: TOPO sau aminele terţiare, iar ca solvenţi:
alcanii şi alcoolii. Un studiu care a testat nouă agenţi de extracţie a concluzionat că
alcoolul oleic şi Hostareax în alcool oleic par a nu avea efecte negative asupra
microorganismelor.

15
 Daugulis s.a. (1995) a clasificat mai mult de 1000 de solvenţi în concordanţă cu
proprietăţile lor fizice. Dintre aceştia, a testat 70 cercetând toxicitatea lor faţă de
microorganismul: Saccharomyces cerevisiae, autorul publicând o serie de reguli privind
biocompatibilitatea solventului. Aceste reguli permit o selecţie preliminară a solventului
pentru extracţia in-situ, totuşi biocompatibilitatea faţă de microorganismele utilizate
trebuie verificate experimental în fiecare caz [20].
Pentru selectarea unui solvent organic, a fost cercetată influenţa diferiţilor solvenţi
asupra creşterii celulare şi a metabolismului microorganismului Clostridium
thermohydrosulfuricum. Aceste investigaţii au arătat că alcoolul oleic este cel mai bun
solvent pentru extracţia in-situ a etanolului. Coeficientul de distribuţie pentru sistemul:
alcool oleic – apă – etanol este de 0,196 la 20C şi 0,34 la temperatura de fermentaţie:
65C [14].
Există câţiva factori importanţi care trebuie consideraţi în proiectarea şi
dezvoltarea unui sistem de separare directă. Performanţa acestui sistem depinde atât
de eficienţa fermentaţiei cât şi de eficienţa extracţiei.
Alegerea şi proiectarea echipamentului de extracţie adecvat trebuie să ţină cont de
particularităţile lichidului de fermentaţie: prezenţa biomasei, vâscozitate ridicată,
comportarea reologica nenewtoniană, prezenţa unor compuşi tensioactivi. Biomasa are
o influenţă negativă asupra gradului de extracţie, determinând micşorarea acestuia în
comparaţie cu sistemele pure apa-solvent. Există posibilităţi prin care se poate evita
contactul între solvent şi biomasă, concretizate în: extracţia prin membrane lichide
incluse în suporturi solide poroase, extracţia din medii de cultură care conţin celule
imobilizate, ultrafiltrarea prealabilă a biomasei.
Extracţia in-situ presupune următoarele etape: dispersarea solventului şi transferul
de masă al solutului, analiza mecanismului făcându-se în corelaţie cu caracteristicile
reologice ale lichidului de fermentaţie. În sistemele de extracţie directă în care solventul
este dispersat sub forma de picături etapele procesului global de separare sunt:
1. Formarea picăturilor de solvent.
2. Deplasarea picăturilor de solvent.
3. Coalescenta picăturilor de solvent.
4. Transferul de masa al solutului pentru fiecare din etapele de mai sus.
Datorită labilităţii mecanice a microorganismelor cultivate, a vâscozităţii ridicate a
mediilor de cultură, a comportării reologice a acestora şi a prezenţei unor compuşi
tensioactivi în lichidele de fermentaţie apar o serie de particularităţi în sistemele de
separare directă. Dispersarea solventului se realizează prin intermediul capilarelor, dar
este necesar un aport suplimentar de energie prin utilizarea simultană şi a amestecării

16
pulsatorie. În timpul deplasării picăturilor de solvent pot apare canale de curgere şi
asociaţii ale picăturilor de solvent în lichidele de fermentaţie, fenomene ce reduc
eficienţa extracţiei prin micşorarea timpului de contact şi a ariei interfaciale dintre faze.
Prezenţa proteinelor solubile, compuşi cu caracter tensioactiv cumulată cu o viscozitate
a mediului ridicată duce uneori la apariţia dispersiei inverse, care măreşte considerabil
timpul necesar separării fazelor. Valori maxime ale coeficientului de transfer de masă se
obţin pentru valori maxime ale vitezei de deplasare a picăturilor de solvent,
corespunzătoare unei valori maxime ale criteriului Reynolds.

II.1. Separarea prin extracţie directă a acizilor carboxilici

Pentru extracţia in-situ a acizilor carboxilici au fost analizate diferite variante care
sa evite efectele negative ale adsorbţiei celulelor la suprafaţa picăturilor de solvent şi să
mărească gradul de extracţie:

17
  Imobilizarea celulelor,
 Separarea mediului de cultura de solvent prin intermediul unei membrane
solide semipermeabile,
 Extracţia reactiva care implica transformarea acidului carboxilic intr-un
complex puternic hidrofob cu ajutorul unui agent de extracţie,
 Transformarea enzimatica a acidului carboxilic intr-un derivat hidrofob.

Recent, fermentaţiei acidului lactic i s-a acordat un interes crescut datorită unei
cereri crescute de materiale care includ acest compus: polimeri lactici biodegradabili, de
polilactide, dar şi datorită creşterii preţului petrolului, una din materialele prime
utilizate pentru sinteza chimică a acestui compus. Fermentaţia este procedeul care oferă
avantaje majore în obţinerea acidului lactic pur faţă de sinteza chimică urmată de
separarea prin cristalizare fracţionată a amestecurilor racemice.
Ca în cazul mai multor procese de biosinteză, inhibiţia de produs este un obstacol
important şi în cazul fermentaţiei pentru obţinerea acidului lactic, îndepărtarea in-situ a
acestuia putând conduce la creşterea productivităţii. Fermentaţia extractivă pare a fi cea
mai promiţătoare soluţie, fiind o soluţie simplă şi relativ uşor de implementat sistemelor
de fermentaţie la scară industrială. Toxicitatea solvenţilor organici este însă una dintre
problemele acestei tehnici de separare. Deşi s-au găsit soluţii prin imobilizarea celulelor
sau adăugarea unor substanţe de protecţie (ulei de soia), expunerea directă a celulelor la
acţiunea solventului rămâne un important dezavantaj.
Shimizu s.a. (1995) au studiat separarea acidului lactic utilizând un proces de
separare integrat constituit din două unităţi: un separator membranar cu fibre goale
pentru separarea şi recirculare celulelor de Lactobacillus delbrueckii IAM1928, şi o
unitate de extracţie utilizând un amestec de Alamine 336 (40%) dizolvat în solventul
alcool oleic. Schema bloc a procesului este prezentată în figura 4.

Figura 4. Schema bloc a procesului de separare ex-situ a acidului lactic.

18
 Fermentaţia s-a realizat în regim discontinuu fără modificarea pH-ului până la
valoarea de pH de 4,2, după care sistemul a fost conectat la utilajele pentru separarea
ex-situ. Pentru fermentaţia extractivă, lichidul de fermentaţie a fost alimentat continuu
în unitatea de separare prevăzută cu membrane cu fibre goale, în care celulele au fost
separate şi recirculate în fermentator. Filtratul a fost apoi trecut în unitatea de extracţie,
în care acidul lactic a fost extras în sistemul Alamine 336/alcool oleic, iar faza apoasă
care conţine doar cantităţi mici de acid lactic de la extracţie va fi recirculată în
fermentator. Faza solventului a fost supusă, apoi reextracţiei într-un reactor cu NaOH
1N. Instalaţia experimentală este prezentată în figura:

Figura 5. Instalaţia pentru separarea directă prin extracţie a acidului lactic

Fără separare directă productivitatea procesului a scăzut de la 1,46 la 0,93 g/l h, în

patru ore, datorită acumulării acidului lactic în bioreactor. Odată cu cuplarea modului
de separare directă productivitatea a crescut de la 0,93 la 2,91 g/l h, datorită îndepărtării
continue a acidului lactic şi a creşterii densităţii celulare.
Avantajul utilizării acestui sistem constă în posibilitatea utilizării unui conţinut
ridicat (40%) de Alamine 336 in alcool oleic. Studii anterioare au evidenţiat faptul că
pentru acest microorganism concentraţii de Alamine de 30% au stopat creşterea
celulelor. Autorii au utilizat un sistem de extracţie în două stadii, observând: cu cât este
mai ridicată viteza de recirculare a fazei apoase cu atât este mai mare productivitatea,

19
cu cât este mai mică viteza de curgere a solventului, cu atât este mai mare concentraţia
acidului lactic în rezervorul cu produs, după cum se poate observa din figura 6 [21]:

Figura 6. Efectul vitezei de circulaţie a solventului asupra eficienţei extracţiei

acidului lactic utilizând Alamine 336 şi alcool oleic

Acidul lactic a fost separat direct din lichidele de fermentaţie prin extracţie
reactiva cu tri-n-octilfosfinoxid în dodecan sau Alamine 336 în alcool oleic. Prin
îndepărtarea sa productivitatea sistemului de biosinteza a crescut de la 7 la 12 g/l.[2]
Frieling (1991) a utilizat Cyanex 923, un amestec de trioctil- si trihexilfosfinoxid,
caz în care nu a fost necesară adăugarea unui modificator de fază. Productivitatea în
acid lactic a tulpinii L. casei este mărită prin adăugarea acizilor acetic şi citric. Ca
solvent a utilizat: kerosen, observându-se biocompatibilitate faţă de tulpina
microorganismului. [22]
Siebold a obţinut acid lactic utilizând ca microorganism producător Lactobacillus
salivarius, separarea acidului lactic realizându-se prin extracţie directă. S-au utilizat
următoarele sisteme de extracţie: kerosen şi acetat de butil, ca solvenţi şi Amberlite
LA2 Hostarex A327, Alamine 336, ca agenţi de extracţie utilizând şi modificatori de
fază: isodecanol, tributilfosfat, 4-nonilfenol, pentru a îmbunătăţi solubilitatea
complexului amină-acid. Cel mai ridicat grad de extracţie a fost obţinut pentru Hostarex
A327.[23]
Hironaka (2001) a realizat extracţia directă a acidului lactic utilizând TOMAC
dizolvat în alcool oleic. Reacţia chimică prin care se realizează extracţia este:

20
 L+ + Q+Cl- ↔ Cl- + L-
Etapa determinantă de viteză a procesului a fost difuzia prin filmul organic,
datorita vâscozităţii ridicate a fazei organice. Pentru calculul cinetic s-a utilizat modelul
celor doua filme. Coeficienţii de transfer de masa în acest caz au fost:
Ko = 2.03 10-6 m/s
Ka = 1.88 10-6 m/s [24]
Productivitatea acidului lactic a crescut de la 7 g/lh la 12 g/lh, prin utilizarea unor
celule imobilizate şi a unei bucle externe pentru separare prin extracţie utilizând 15%
Alamine 336 dizolvat în alcool oleic.

Acidul butiric are câteva aplicaţii importante în industrie, utilizarea acestuia ca şi

combustibil a fost menţionată prima oară în anul 1923. Astăzi aplicaţiile acestui compus
sunt importante în industria alimentară, a băuturilor alcoolice, în industria de prelucrare
a laptelui, sau sub formă esterică, ca aditiv alimentar pentru îmbunătăţirea aromei
fructelor, de asemenea în industria materialelor plastice şi a fibrelor textile. Se obţine
prin fermentaţie utilizând microorganismul: Clostridium butyricum. Datorita efectului
inhibitor puternic în cele mai multe cazuri se obţin concentraţii ale produsului scăzute
[25].În cazul tulpinilor de Clostridium, acidul butiric nedisociat traversează membrana
celulelor şi disociază în interiorul celulelor, modificând gradientul de pH scade
cantitatea de energie necesară pentru creşterea biomasei. Fermentaţia butirică este
influenţată atât de innhibiţia de produs cât şi de cea de substrat şi de pH. Pentru
separarea directă a acidului butiric cei mai potriviţi agenţi de extracţie au fost
consideraţi: trioctilfosfinoxid, TOPO, şi aminele terţiare: tri-n-octilamina, tri-n-
decilamina, iar ca solvenţi se recomandă alcani sau alcooli [26].
Vandak (1997) a studiat extracţia directa a acidului butiric, urmărind efectele
solventului şi a valorii pH-ului. A luat în considerare următorii solvenţi: n-octanol,
izodecanol, izotridecanol, alcool oleic, trihexilfosfat, Hostarex A327 (amestec de n-octil
si n-decilamina) în izodecanol, Hostarex A327 în n-alcani şi izodecanol, Hostarex A
327 în izotridecanol, Hostarex A 327 în alcool oleic. Rezultatele au demonstrat
următoarele:
- izodecanolul împiedica creşterea microorganismelor şi sinteza acidului butiric.
- Izotridecanolul şi amestecurile în care acesta participă la extracţie împiedica
creşterea microorganismelor, însă doar parţial şi sinteza acidului butiric.
Adăugarea de Hostarex în izotridecanol are o influenţă negativă asupra creşterii
biomasei, dar nu influenţează rata productivităţii şi nici a consumului de substrat.

21
 - In cazul adăugării trihexilfosfatului s-a obţinut cea mai mare concentraţie a
acidului acetic.
- Alcoolul oleic nu a avut nici o influenta negativa asupra creşterii biomasei si nici
asupra producţiei de acid butiric.
În ceea ce priveşte pH-ul producţia maximă de acid butiric s-a obţinut la un pH =
6.5, însă valori acceptabile pentru producţia de acid se obţin pana la un pH de 5.2, care
poate fi aplicat relativ eficient şi în procesele de extracţie directă.
Cea mai buna soluţie pentru separarea directă a fost utilizarea alcoolului oleic sau
a amestecului alcool oleic/Hostarex A327, 20 % vol. Coeficientul de distribuţie al
acidului butiric în amestecul extractant/solvent este de 3.03, de trei ori mai mare decât
cel în alcool pur [27].
Zigova (1999) a studiat fermentaţia extractivă a acidului butiric utilizând tulpini de
Clostridium butyricum şi ca solvent pentru extracţia in-situ Hostarex A327 dizolvat în
alcool oleic. A obţinut o concentraţie finală a acidului de 11 g/l, o productivitate de 0,35
g/l h şi o selectivitate pentru acidul butiric de 0,94.Avantajele acestui procedeu includ
un control mai simplu al pH-ului în bioreactor, fără a fi necesară utilizarea unei baze,
posibilitatea utilizării substratului în concentraţii mai mari, astfel reducând reziduurile
şi costurile de producţie [28].
Evans s.a. (1990) au studiat separarea directă a acidului butiric prin cuplarea
extracţiei in-situ cu fermentaţia, utilizând o fază organică egală ca volum cu lichidul de
fermentaţie, solvenţii utilizaţi fiind: alcool oleic şi un amestec de 30% decanol şi 70%
alcool oleic. Adăugarea alcoolului oleic în lichidul de fermentaţie a determinat extracţia
acidului, concentraţia acestuia scăzând în faza apoasă. Această modificare a prelungit
perioada de biosinteză a acidului butiric, acţionând şi în creşterea diferenţei de pH.
Adăugarea decanolului în faza organică a inhibat producţia de acid datorită, probabil
faptului că şi decanolul, ca toţi alcoolii scade pH-ul soluţiei [29].

Acizii citric este unul dintre produsele de biosinteză cu importante utilizări în

industria alimentară, farmaceutică, piaţa mondială de desfacere a acidului creşte în
fiecare an, nivelul producţiei la ora actuală fiind de mai multe sute de mii de tone pe an.
Acidul citric fost extras din medii care conţineau celule imobilizate utilizând
hidrocarburi cu catenă lungă, hidrocarburi perflorurate, oleat de metil. Aceşti solvenţi
prezintă toxicitate fata de microorganisme şi necesită valori de pH mici pentru atingerea
unor randamente ridicate ale extracţiei.
Pentru creşterea solubilităţii acidului respectiv în solvent, acesta poate fi
transformat enzimatic, de către lipaza, într-un ester hidrofob. Prin esterificare cu

22
alcoolul oleic, coeficienţii de distribuţie ai acizilor carboxilici au crescut de 4-15 ori. În
acest caz, însă procedeul de reextracţie din solvent devine mai dificil.
Unul dintre sistemele de extracţie utilizate pentru separarea directă a acidului citric
din lichidele de fermentaţie conţine un amestec de 30-40 % acetat de butil, 60-70 % o
alchilamida N,N disubstituită, cu nume trivial 2351. Echilibrul a fost atins după
aproximativ 5 minute, iar după cinci etape de extracţie în contracurent, la 20ºC 96.6 %
din acidul citric s-a regăsit în faza organică. Reextracţia s-a realizat în apa la 80ºC.
Formarea unei emulsii stabile a fost împiedicata prin adăugarea de clorura de sodiu şi
cărbune activ.[30]
Sergienski a dezvoltat un model pentru extracţia acidului citric din mediul de
fermentaţie utilizând hexanol şi octanol ca solvenţi. Faza organică conţine monomerii
acidului citric din mediul de fermentaţie, hidratarea acestora scade prin micşorarea
coeficientului de activitate al apei la echilibru. Modelul permite determinarea
constantelor termodinamice ale acidului citric si a gradului de hidratare în soluţii
alcaline saturate. [31]

II.2. Separarea prin extracţie directă a antibioticelor β-lactamice

Separarea antibioticelor β-lactamice la nivel industrial se realizează prin extracţie

fizica. Însă acest procedeu necesită o valoare a pH-ului sub 2.5, domeniu în care
penicilina G nu prezintă stabilitate ridicata (timpul de inactivare la pH = 2 fiind de 4
minute). Acest neajuns poate fi evitat prin utilizarea extracţiei reactive cu amine cu
masa moleculară mare. Însă în timpul fermentaţiei, în special în cazul fermentaţiilor
discontinue apare inhibiţia de produs. Acest fenomen poate fi evitat prin utilizarea
extracţiei reactive directe, a produsului de biosinteză care poate fi in-situ sau ex-situ.

23
Performantele extracţiei sunt influenţate de o serie de parametri reologici, dar si de
prezenta anumitor compuşi secundari care pot precipita sau pot fi coextraşi: acidul
fenilacetic, aminoacizi, etc.
La scara pilot s-a realizat cu succes un program integrat de fermentaţie a
penicilinei G şi conversie la acid 6-aminopenicilanic, utilizând penicilinG-amidaza,
penicilina G fiind extrasa in-situ.[22,32]
Oniscu şi Cascaval (1997, 1999) au studiat extracţia directă a penicilinei G din
lichidele de fermentaţie simulate. În acest caz vâscozitatea prezintă o influenţă
semnificativă asupra difuziei antibioticului dinspre faza apoasă spre interfaţă.

Figura 7. Variaţia fluxului masic unitar al penicilinei G cu turaţia.

După cum se constata din figura 7, pentru o turaţie de 600 rpm, fluxul masic se
reduce cu circa 40 % în intervalul de vâscozitate 1-14.84 cP. Odată cu creşterea
vâscozităţii se modifică şi alura curbelor obţinute. Pentru 1 cP la turaţii mai mari de 900
rpm, fluxul masic specific rămâne constant ceea ce indică faptul că reacţia chimica
interfacială dintre antibiotic şi extractant este etapa limitativă. Odată cu creşterea valorii
vâscozităţii aparente a soluţiei apoase iniţiale, se obţine o creştere continuă a fluxului
masic chiar după 900 rpm. Acest fenomen este explicat prin accentuarea rezistenţei la
transferul de masă al penicilinei G în faza apoasă, ca rezultat al creşterii vâscozităţii.
[33,34]

24
 În cazul în care extracţia directă se realizează din suspensii de Penicillium
chrysogenum, prezenţa miceliului afectează negativ difuzia antibioticului din faza
apoasa spre interfaţă. În comparaţie cu extracţia din soluţii apoase pure transferul de
masa al solutului descreşte puternic în prezenţa biomasei, datorită apariţiei unei
rezistenţe suplimentare de tip difuzional. Aceasta creştere a rezistenţei la transferul de
masă datorită difuziei antibioticului înspre interfaţă, este rezultatul efectului cumulat al
vâscozităţii aparente şi a prezenţei biomasei.[35,36]
Descrierea matematica a procesului se poate realiza prin intermediul corelaţiilor
pentru coeficienţii aparenţi de transfer de masa şi turaţie, în funcţie de vâscozitatea
aparenta a soluţiilor apoase:
- pentru extracţia reactiva din lichide de fermentaţie simulate:
pentru ηa =2.35 - 7.30 cP
K a  e   6.650,39   N 0.868 0.072
a a

K o  e   9.610,197   N 1.1280.11
a a

pentru a = 7.30 - 14.84 cP

  9.540.207a 
Ka  e  N 1.5280.020 a

K o  e   11.40.471   N 10.4520.128
a a

- pentru extracţia reactivă din suspensii de Penicillium chrysogenum:

Cx = 13.5g/l
K a  e   7.200.170C   NX

K o  e   9.870.170C   NX

Modelarea procesului de extracţie directa a penicilinei G din lichidele de

fermentaţie s-a realizat luând în considerare următorii parametri care influenţează
procesul, codificaţi: x1, x2, x3 viteza volumetrica, concentraţia biomasei, viteza de
rotaţie. S-a utilizat o ecuaţie de regresie de forma:

N = 2.80+0.063x1-0.957x2+0.263x3-0.00125x1x2-0.00875x1x3-0.08375x2x3-
0.975x12+0.408x22-0.429x32

Condiţiile optime au fost determinate: viteza volumetrica 1.41 h-1, concentraţia

biomasei 4 g/l, viteza de rotaţie 600 rot/min [37].

Wu (2003) a studiat separarea taxolului, un medicament anticanceros, administrat

în special în cazul cancerului pulmonar, prin extracţie directă din lichidele de

25
fermentaţie a culturilor de Taxus chinesis, utilizând dibutilftalat, ca solvent. Rezultatele
experimentale sunt prezentate în figura 8.

Figura 8. Efectul adăugării solventului asupra dezvoltării celulelor şi a producţiei

de taxol

Adăugarea acestuia în lichidele de fermentaţie după 7 zile, a cauzat o creştere

redusă în producţia de taxol, fără însă a anihila inhibiţia de produs. În ceea ce priveşte
producţia de taxol, g taxol/g celule, solventul DBP a îmbunătăţit sinteza taxolului,
obţinându-se 0,8 g taxol/g celule faţă de 0,14 g taxol/g celule pentru fermentaţia
convenţională. Adăugarea DBP în ziua a 15-a, când culturile se găsesc în faza staţionară
de creştere, a condus la o creştere semnificativă a producţiei de taxol, de aproximativ
nouă ori, producţia totală fiind de 19,2 mg/l faţă de 1,9 mg/l în cazul fermentaţiei
convenţionale, fără efecte negative asupra biomasei [38].

II.3. Separarea prin extracţie directa a aminoacizilor

Ruffer s.a.(2003) a dezvoltat un procedeu de separare ex-situ a fenilalaninei direct

din lichidele de fermentaţie a microorganismului E. coli, într-un proces discontinuu de
fermentaţie. Caracteristic acestui proces este faptul ca extracţia şi reextracţia se
realizează în centrifuge, între care este realizat un by-pass. Prin acesta cele două soluţii
de extracţie şi reextracţie sunt în contact, agentul de extracţie fiind regenerat şi
recirculat. După cum se observa din figura 9, în timpul procesului de biosinteză

26
suspensia rezultată a fost supusă ultrafiltrării pentru îndepărtarea biomasei şi a
proteinelor, este trecută în prima centrifugă unde are loc extracţia, în a doua centrifugă
pentru reextracţie şi apoi în rezervor. Soluţia epuizată din prima centrifugă este
recirculată în bioreactor.

Figura 9. Instalaţia de obţinere a fenilalaninei cuplata cu extracţie directa.

Separarea s-a realizat cu D2EHPA dizolvat în kerosen, iar reextracţia cu o soluţie

de acid sulfuric. Lichidul de fermentaţie, supus ultrafiltrării pentru îndepărtarea
biomasei, va conţine cationii de fenilalanina, anioni, amfioni. Datorita solubilităţii
reduse a extractantului în apă, se presupune că transferul de masă al aminoacidului are
loc foarte aproape de interfaţa faza apoasă/faza organică. Faza apoasa din prima
centrifugă este recirculată, evitându-se astfel inhibiţia de produs. Faza organică este
supusă reextracţiei cu o soluţie de acid sulfuric, care pentru a lega fenilalanina va
elibera un proton necesar regenerării agentului de extracţie. Acest schimb ionic are ca
rezultat difuzia fenilalaninei sub forma de cationit în faza acceptoare, care va fi supusa
concentrării. Mecanismul este prezentat în figura 10:

27
 Figura 10. Principiul extracţiei reactive directe.

Deşi în camera de amestecare a centrifugelor regimul este turbulent, se presupune

ca extracţia reactiva are loc intr-un strat limita apos din jurul picăturii de solvent şi
extractant. Cationii aminoacidului trec în stratul limita, reacţia cu D2EHPA având loc în
apropierea interfeţei faza apoasa/faza organica. Protonul eliberat la reextracţie va
regenera extractantul, care va fi supus unui nou ciclu de extracţie.
Studiind influenta vitezei de rotaţie asupra performantelor extracţiei s-a ajuns la
următoarele concluzii:
 în domeniul 2400-3600 rpm viteza de rotaţie nu influenţează performanţa
procesului,
 transferul de masa al extracţiei şi reextracţiei a fost îmbunătăţit prin mărirea
vitezei de curgere a fazei apoase şi organică. Limita superioară a acestui
parametru a fost: 8 l/h.
 din punct de vedere al stabilităţii procesului viteza optima de curgere a fost
4 l/h. Sistemul a fost mai stabil când fenilalanina a fost separata din
supernatantul de la fermentaţie.
In timp ce în bioreactor concentraţia fenilalaninei a rămas aproximativ constanta în
primele 20 de ore ale fermentaţiei, conţinutul de aminoacid din refluxul de la centrifuga
a fost jumătate din concentraţia din bioreactor. În tot acest timp nu s-au observat
modificări în metabolismul microorganismelor.
In figura 11 se pot observa diferenţe clare între rata productivităţii fără procesul de
separare directă şi cel în care s-a realizat separarea ex-situ după 18 h. În acest procedeu
rata productivităţii microorganismului producător a fost menţinută la un nivel constant
0.25 mmoli/gh. Procentul de fenilalanina obţinută în procesul cu separarea directă
integrată a fost de 18.6 fata de 14.5 în cazul referinţei. Îmbunătăţirea productivităţii s-a
realizat cu un procent de 28 %.[39]

28
 Figura 11. Comparaţie între productivităţile procesului cu şi fără separare directă.

II.4. Separarea prin extracţie directă a alcoolilor

Recuperarea alcoolilor din lichidele de fermentaţie este un procedeu destul de

scump, motiv pentru care există cercetări continue în scopul găsirii altor modalităţi mai
econome. Una dintre aceste modalităţi pare a fi extracţia directă în fază lichidă. Dintre
alcooli, etanolul şi butanolul prezintă importanţă din punct de vedere practic. La nivel

29
industrial se obţin în cantităţi ridicate, iar procedeele de separare presupun purificare
prin distilare fracţionată. Aceasta metodă prezintă şi dezavantaje, deoarece etanolul
formează în soluţii diluate cu apa amestecuri azeotrope. Datorita inhibiţiei de produs
asupra creşterii celulelor bacteriene sau a drojdiilor, concentraţia alcoolului etilic în
procesele de fermentaţie este menţinută între 5-10 %, deci foarte scăzută. Industrial este
necesara concentrarea prin distilare fracţionată, pentru obţinerea etanolului absolut
utilizându-se distilarea azeotropă. Însa acest procedeu presupune consumuri energetice
mari şi prin urmare costuri ridicate. [22,40]
Moritz si Duff (1996) au realizat zaharificarea şi fermentaţia celulozei la alcool
etilic simultan cu extracţia alcoolului. Pentru solubilizarea alcoolului s-a utilizat alcool
oleic, într-un raport volumic fază organică:fază apoasă de maxim 5. Prezenţa alcoolului
oleic nu a afectat activitatea enzimelor implicate în procesul biochimic, iar
productivitatea în alcool etilic a crescut cu peste 65 %, în paralel cu creşterea vitezei de
hidroliza a celulozei. [41]
S-au studiat diferiţi solvenţi netoxici, biocompatibili cu sistemul de fermentaţie:
dodecanol, dodecan, dibutilftalat, tributilfosfat, acid oleic, heptanal, laureat de etil,
alcool oleic. Pentru îmbunătăţirea eficientei extracţiei in-situ solvenţii pot conţine şi un
agent de extracţie, sau pot reacţiona ei înşişi cu solventul.[2] Un astfel de amestec este
constituit din: tri-n-butilfosfat si ISOPAR M. Pentru o concentraţie iniţială a etanolului
de 10 % compoziţia extractului s-a situat în domeniul: 93-97 %, cu 70-75 % vol etanol
[22]. Essien si Pyle au investigat diferiţi solvenţi, pentru recuperarea etanolului. Cel
mai eficient a fost găsit a fi heptanalul, însă separarea nu a fost eficientă din punct de
vedere economic, costurile fiind chiar mai ridicate decât cele ale distilării fracţionate.
[42]
Weilnhammer (1994) a studiat separarea etanolului prin extracţie in-situ în cazul
procesului de fermentaţie continuă utilizând Clostridium thermohydrosulfuricum, ca
microorganism producător şi alcool oleic ca solvent, pentru concentraţii ale glucozei
mai mari de 50 g/l, deoarece în domeniul inferior nu apare inhibiţia de produs. În
tabelul 4 sunt prezentate rezultatele experimentale.

Tabelul 4. Valorile în regim staţionar în cazul fermentaţiei cu şi fără extracţie in-

situ
Regim Lichide de fermentaţie Apă/etanol,
staţionar Biomasă, Glucoză, Acid Acid Etanol, mg/l
g/l g/l lactic, g/l acetic, g/l g/l
110 0,415 0,002 3,043 0,925 2,99 0

30
 120 0,430 0,021 4,958 0,531 2,400 0
130 0,687 0,028 6,617 0,347 2,124 0
210 0,857 0,006 4,377 1,114 4,330 0
330 0,429 13,572 8,245 0,743 1,401 0
410 0,609 8,283 21,126 1,095 4,156 0
420 1,021 15,500 18,830 0,79 2,25 0
421 0,961 14,862 15,668 0,428 3,038 3
422 0,861 8,277 20,681 0,361 2,185 5
430 0,662 16,230 26,016 0,676 2,169 0
431 0,983 19,966 12,929 0,435 3,003 6
432 0,997 19,817 13,936 0,386 2,322 6
620 1,375 48,422 24,307 0,748 3,859 0
621 1,45 40,479 24,718 0,686 4,470 9
622 1,392 39,772 24,208 0,638 4,022 12
630 1,989 51,803 24,266 0,631 3,128 0
631 2,028 48,349 23,471 0,594 4,283 9
632 1,9 46,641 24,398 0,724 3,985 14

S-a considerat atingerea regimului staţionar dacă nu au existat variaţii apreciabile

în concentraţiile componenţilor lichidului de fermentaţie. Se observă că o creştere a
concentraţiei glucozei determină o concentrare a lichidului de fermentaţie. Până la
concentraţii ale fazei de alimentare de 16,3 g/l aproape toată cantitatea de glucoză este
consumată, la valori ale concentraţiei fazei de alimentare de 100 g/l doar jumătate din
cantitatea de glucoză este utilizată de microorganisme. Concentraţii ridicate ale
glucozei determină creşterea producţiei de acid lactic, scăzând, în acelaşi timp
selectivitatea pentru etanol. Pentru o concentraţie constantă a glucozei în faza de
alimentare o cantitate mai mare de glucoză va fi disponibilă pentru metabolismul
celular dacă se creşte şi viteza de curgere a lichidelor de fermentaţie. În consecinţă,
concentraţia de celule şi de acid lactic creşte deoarece viteza lor de producţie este mai
mare decât pierderile din eflux. Pe de altă parte, pierderile în etanol şi acid acetic nu
sunt compensate, concentraţiile acestora descresc în lichidele de fermentaţie, la fel şi
selectivitatea pentru etanol. Fără separarea in-situ se obţine o productivitate pentru
etanol de 10%, însă utilizarea separării in-situ îmbunătăţeşte acest randament până la
20%. Creşterea vitezei de curgere a solventului de la 9,2 la 18,01 l/h nu are un efect
important asupra eficienţei separării. Motivul ar putea fi o antrenare a celulelor prin
ridicarea picăturilor de solvent, datorită valorilor diferite ale densităţii, unele celule
fiind absorbite în stratul limită. Fără separarea in-situ selectivitatea faţă de etanol este
de doar 15-20%, însă utilizând separarea directă selectivitatea creşte până la 40%.

31
 O analiză a costului acestei metode s-au evidenţiat următoarele:
- pentru a se obţine un cost al produsului avantajos pentru extracţia in-
situ, glucoza trebuie să se găsească într-o concentraţie mai mare de 25 g/l. La
concentraţii mai mici tot substratul este consumat fără a exista inhibiţie de
produs, caz în care extracţia nu va modifica productivitatea procesului
- este necesar un debit minim de solvent pentru a obţine un cost redus
prin extracţie in-situ.
- există un debit de alimentare a substratului la 0,2 l/h pentru care costul
procesului este minim.
Costul minim se obţine pentru fermentaţia continuă, cu recircularea celulelor şi
extracţia in-situ [14].
Gyamerah s.a. (1996) a studiat separarea directă a etanolului dintr-un proces de
fermentaţie continuu, realizând extracţia cu n-dodecaol, recircularea lichidelor de
fermentaţie şi operarea la diverse viteze de recirculare. Pentru a evita problemele
privind formarea unor emulsii drojdiile au fost utilizate în forma imobilizată, faza de
alimentare pentru bioreactor a fost un amestec de mediu de cultură proaspăt, cu o
concentraţie a glucozei de la 10 până la 45,8% şi rafinat recirculat. Diagrama
schematică a procesului este prezentată în figura 12. Fermentaţia a avut loc în
bioreactorul cu drojdii imobilizate, R1, alimentat cu mediu de cultură proapspăt din
rezervorul V1 şi cu rafinat din rezervorul V2. Lichidul de fermentaţie din fermentator a
fost colectat într-un rezervor, V3 apoi transportat prin pompa peristaltică P3 în coloana
de extracţie după o prealabilă filtrare prin membranele F2, pentru îndepărtarea resturilor
de drojdii. Alimentarea cu solvent a coloanei de extracţie s-a realizat pe la partea
inferioară, iar a lichidului de fermentaţie pe la partea superioară, evacuarea rafinatului
realizându-se în rezervorul V2. Extractul a fost colectat în rezervorul V5, de unde a fost
supus regenerării în coloana C2, amestecul separat de apă şi etanol fiind colectat în V7.

32
 Figura 12. Reprezentarea instalaţiei pilot de separare directă a etanolului prin
extracţie

In timpul experimentelor s-a observat o creştere a conversiei glucozei de la 88% la

97,6%, deoarece concentraţia glucozei a fost modificată de la 10 la 45,8%. Cea mai
mare producţie pentru etanol a fost de 91,9%, pentru o concentraţie a glucozei în faza
de alimentare de 27,2%, în timp ce producţia cea mai mică a fost de 67%, pentru o
concentraţie a glucozei de 19,6% în faza de alimentare.
O evaluare economică a producţiei de etanol prin fermentaţie cuplată cu extracţie
cu solvent a demonstrat că cele mai mari costuri sunt cele ale materiilor prime şi ale
energiei pentru recuperarea etanolului. În consecinţă, pentru aplicarea la nivel industrial
este deosebit de importantă maximizarea conversiei glucozei, sau utilizarea unor materii
prime ca zaharoza, şi a concentraţiei etanolului în lichidul de fermentaţie [43].

Un interes deosebit a fost acordat extracţiei in-situ a butanolului din lichidele de

fermentaţie ale microorganismului Clostridium acetobutylicum. Fermentaţia

33
acetobutanolică este un procedeu industriale de obţinere a acetonei si a butanolului.
Comparativ cu acetona, butanolul manifestă un puternic efect inhibant, motiv pentru
care a fost studiata îndepărtarea sa din lichid în timpul fermentaţiei. Solvenţii utilizaţi
au fost: dibutilftalatul, alcoolul oleic, amestec de alcool oleic si i-propilmiristat
(membrana lichida obtinuta prin emulsionare, LME), 2-etil-hexanolul (membrana
lichida obţinută pe suport solid. SLME), dodecanol, 1,2-dicloretan.
Prin extracţie butanolului după filtrarea prealabila a lichidelor de fermentaţie cu n-
decanol productivitatea a fost mărită de patru ori în fermentaţiile continue. Prin
extracţie directa a butanolului din lichide de fermentaţie nefiltrate cu dibutilftalat, ca
agent de extracţie concentraţia produsului a fost mărită de la 18 la 20 g-l si de la 28 la
30 g/l. [22] Utilizând alcool oleic, productivitatea a crescut cu 20 % în sistemele de
funcţionare discontinue, ceea ce a scăzut costurile cu 20 %. [44] în culturile continue
productivitatea a fost cu aproximativ 70 % mai mare decât în cazul sistemelor
discontinue.[22]
Caşcaval şi Oniscu (1996, 1998) au studiat extracţia directa a butanolului utilizând
1.2-diclormetan, solventul fiind dispersat cu ajutorul unei duze. S-a determinat influenţa
decisivă a caracteristicilor reologice, de exemplu vâscozitatea fazei apoase, asupra
transferului de masă. Dispersia solventului cu ajutorul unei duze este o metoda
compatibilă cu extracţia in-situ aplicabilă la procedeele de fermentaţie la nivel
industrial, deşi apare un efect scăzut de forfecare asupra microorganismelor. Prin
creşterea vâscozităţii lichidelor de fermentaţie este necesara creşterea dimensiunilor
picăturilor de solvent. [45]
S-a propus un model matematic care descrie cantitativ influenta vâscozităţii şi a
comportării reologice a lichidelor de fermentaţie simulate asupra transferului de masă a
butanolului. Ecuaţia corelează criteriul Sh cu caracteristicile fizice ale lichidelor de
fermentaţie şi ale butanolului.
Sh  3  10 7  Re   Sc1.667

Aceasta ecuaţie este valabila pentru Re < 650 si pentru vâscozităţi sub 45cP.
Influenţa semnificativă a vâscozităţii şi a comportării nenewtoniene a soluţiilor apoase
a fost descrisa prin coeficientul α.[46]
Kert ş.a. au utilizat o unitate de microfiltrare, pentru a separa bacteriile
producătoare de butanol de solventul utilizat pentru extracţie, decanolul. Experimentele
au fost realizate în regim continuu, cu recircularea celulelor. Lichidul de fermentaţie a
fost trecut prin membrană, celulele fiind readuse în fermentator, în timp ce permeatul a
fost supus extracţiei pentru îndepărtarea butanolului. Sistemul a tins o productivitate de

34
doar 3,08 g/l h, faţă de 6,5 g/l h în sistemul fără extracţie, însă o comparaţie între
acestea este dificil de realizat necunoscându-se parametri specifici şi concentraţia
biomasei [47].
Shi (2005) a stabilit un model matematic general pentru evaluarea performanţei
unei fermentaţii extractive a butanolului într-un proces de fermentaţie aceton-butanol-
etanolică, formulată în termeni de productivitate, necesar energetic şi puritatea
produsului.
Reprezentarea schematică a procesului este prezentată în figura 13.

Figura 13. Instalaţia experimentală pentru separarea directă a butanolului prin

extracţie

Extracţia s-a realizat in-situ utilizând alcool oleic, ca solvent. Extractul este
prelucrat prin trecerea printr-un schimbător de căldură, apoi într-o coloană de distilare
pentru recuperarea acetonei, iar butanolul este recuperat în a doua unitate de separare.
Solventul rămâne la partea inferioară a coloanelor, fiind recirculat.
Modelul matematic a pornit de la următoarele ipoteze:
1. se consideră numai acetona şi butanolul ca produşi, atât în faza apoasă cât
şi în cea organică, solvent, etanolul găsindu-se într-o proporţie mică, 1,4-
6,6%, concentraţie la care efectul inhibitor este redus
2. densitatea solventului este aproximativ egală cu cea a alcoolului oleic pur,
deoarece concentraţia solutului nu este mai mare, în extract, de 5%
3. coeficientul de distribuţie a butanolului, între solvent şi faza apoasă este
constant

35
 Modelul matematic pentru fermentaţia extractivă se bazează pe următoarele
bilanţuri masice:
- al celulelor:
F
 (S, P1, ……., Pn) = D 
V
- al substratului
1
D0SF – DS = Y  ( S , P1 ,...Pn ) X
S

- al produsului în solvent
Fi  i
DS y i 
0
 DS y i  0
'

V
- al produsului în fază apoasă
F 1
DPi  i i   ( S , P1 ,..., Pn ) X
V Yi
- al vitezei de curgere în faza apoasă şi solvent
1 n 1 n
D0  D   Fi DS'  DS   Fi
V i 1 V i 1

Pentru n = 2, rezolvând ecuaţiile bilanţurilor se obţine următoarea ecuaţie:

Ds`    mi Pi 
2
Y m P
 1 1 1

 Y 2
m P
2 2
 Y1
X ( 2)
w1
 Y2
X ( 2)
w1
 Y2
 (1   )(1   ) 
i 1


m S
 (Y1 P1  Y2 P2 )( P1m  P1 )( P2 m  P2 )  0
( K s  S ) P1m P2 m

în care 1 şi 2 reprezintă acetona şi, respectiv butanolul.

Productivitatea totală a acestor compuşi poate fi exprimată ca:
2 2
I  Ds` (X D(11)  X D( 22) ) mi Pi  D  Pi
i 1 i 1

în care β este un factor de corecţie, care ţine cont de pierderile din faza apoasă.
Este dificilă evaluarea unui cost pentru întregul proces. În figura 14 este prezentată
dependenţa între productivitatea totală şi necesarul de energie la diferite concentraţii ale
substratului. Se observă că o creştere a concentraţiei substratului în faza de alimentare
poate creşte performanţa globală a procesului în termeni de eficienţă energetică, în timp
ce o creştere a vitezei de diluţie a substratului poate îmbunătăţi productivitatea globală
însă cu un necesar sporit de energie. Deci, cele mai importante îmbunătăţiri trebuie
direcţionate pentru utilizarea unor concentraţii ridicate ale substratului.

36
 Figura 14. Dependenţa productivităţii totale de necesarul de energie pentru diferite
concentraţii ale substratului

Sistemul alcătuit din două coloane de distilare, pentru recuperarea butanolului din
extract, nu a reuşit să satisfacă cerinţele privind puritatea produsului şi eficienţa
energetică. Pentru prima coloană, în care se recuperează acetona este necesară aplicarea
distilării la vid şi un sistem de două, trei talere sau o rată de reflux de 1 – 2 [48].

III. Separarea directă a produselor de biosinteză prin pertracţie

37
 Pertracţia este o combinaţie în timp şi spaţiu a două operaţii de separare
binecunoscute: extracţie şi reextracţie cu solvent, oferind avantaje semnificative faţă de
extracţia clasică lichid-lichid. Procesele de separare bazate pe membrane lichide
folosesc mai puţin solvent organic, integrând extracţia şi reextracţia într-un proces
continuu. Dacă două fluide miscibile sunt separate de un lichid nemiscibil cu acestea,
dar care permite transportul masic al unuia sau a mai multor componenţi, între fluide se
formează o membrană lichidă. Totuşi, numai descoperirea a noi metode de contactare a
celor trei faze şi a unor tipuri noi de membrane au condus la progrese semnificative în
ultimii patruzeci de ani a acestui procedeu.
Metodele de obţinere şi menţinere a unor astfel de membrane sunt destul de
dificile, existând trei tipuri principale de procedee: prin emulsionare, respectiv
formarea unei emulsii, la intensităţi ridicate ale amestecării fazelor: 5000-10.000 rpm,
între solvent şi faza apoasa în care se produce reextracţia, şi, apoi, dispersarea acestei
emulsii, în condiţii blânde de agitare: 200-400 rpm, în faza apoasa din care se extrage
solutul; prin înglobarea solventului în porii unui material polimer hidrofob, sau în
interiorul unui material fibros; prin utilizarea unor echipamente de extracţie de
construcţie specială, numite pertractoare: cu cilindri concentrici, în forma de U, cu
discuri cu film de solvent, etc. obţinându-se aşa-numitele membrane lichide libere.
Procesele de separare bazate pe membrane lichide, comparativ cu tehnicile clasice
de separare, prezintă o serie de avantaje: folosesc mai puţin solvent organic, acesta fiind
regenerat continuu; presupun un consum de energie redus; deasemenea integrând
extracţia şi reextracţia permit reducerea timpului total necesar separării unui anumit
produs; permit posibilitatea transportului unui solut împotriva gradientului său de
concentraţie, dacă se menţine gradientul parametrului care controlează procesul, valori
mai mari pentru coeficienţii de difuzie ai permeatului în comparaţie cu membranele
polimerice; disponibilitatea unor agenţi purtători selectivi şi specifici.
Acesta fost propus ca fiind convenabil, econom şi o metoda eficace de separare
selectivă şi concentrare a diferitelor specii: acizi organici, fenoli, aminoacizi, alcaloizi,
antibiotice, aldoze, peptide [2].

O reprezentare schematică a unui proces de separare directă utilizând o membrană

lichidă este prezentată în figura:[11]

38
 Figura 15. Schema unui dispozitiv de realizare a separării directe prin pertracţie
in-situ

Principalul avantaj al utilizării extracţiei şi transportului prin membrane lichide

obţinute prin înglobare pentru separarea directă constă în faptul că lichidele de
fermentaţie, şi inclusiv celulele nu sunt în contact direct cu solventul utilizat pentru
separare. Suporturile solide utilizate, care separă cele două faze: soluţia de reextracţie şi
lichidele de fermentaţie permit utilizarea unor solvenţi care prezintă coeficienţi de
distribuţie maximi, chiar dacă aceştia prezintă toxicitate faţă de microorganismele
utilizate pentru biosinteză. În acelaşi timp utilizarea acestor tipuri de membrane evită
problemele legate de separarea celor două faze specifice extracţiei directe in-situ. Dintre
compuşii separaţi direct prin extracţia şi transport prin membrane lichide se numără:
- acizi organici: acidul propionic, acidul lactic, acid fumaric
- alcooli: etanolul,
- aminoacizi: fenilalanina, leucina

III.1. Separarea directă prin pertracţie a acizilor organici

39
 În ultimii ani problemele legate de epuizarea resurselor de petrol au condus la
investigaţii privind metode alternative de a produce produse petrochimice. Un astfel de
produs este acidul propionic. Procesele de fermentaţie pentru obţinerea acidului
propionic nu au fost aplicate la scară largă datorită duratei mari a procesului şi a
concentraţiei mici a acidului în lichidul de fermentaţie. Una dintre problemele acestei
fermentaţii este şi inhibiţia de produs. Extracţia continuă cuplată cu fermentaţia are
rolul diminuării inhibiţiei de produs şi permite un control exact al pH-ului, permiţând
menţinerea unei viteze de reacţie ridicate.
Producerea acidului propionic prin fermentaţie este îngreunată de apariţia
inhibiţiei de produs. O fermentaţie cuplată cu extracţia cu solvent bazată pe sisteme
membranare, MSBE utilizând ca extractant o amină secundară şi un utilaj cu membrane
lichide înglobate pe suport fibros a fost aplicată pentru fermentaţia pe substrat de
lactoză a acidului propionic utilizând ca microorganism producător Propionibacterium
acidipropionici. În comparaţie cu fermentaţia discontinuă acest procedeu a oferit o
productivitate de 5 ori mai mare, o concentraţie a acidului de 75 g/l, şi o puritate
avansată. De asemenea s-a observat reducerea producţiei de acetat şi succinat. Aceste
rezultate pot fi atribuite reducerii inhibiţiei de produs sau al unei posibile căi metabolice
care favorizează obţinerea cu precădere a acidului propionic. Procesul de separare a fost
stabil şi a oferit performanţă constantă pentru mai mult de 1,5 luni, perioada cât a fost
studiat.[49]
Separarea directă a acizilor acetic şi propionic a fost studiată utilizând o unitate
membranară dispusă în exteriorul fermentatorului, constituită dintr-o membrană lichidă
înglobată pe un suport stratificat plan, cu o arie totală de 130 cm 2 şi dintr-o membrană
cu fibre goale, cu o arie de 184 cm 2. Pentru prima solventul a fost constituit din 10%
TOPO, tri-octilfosfinoxid, dizolvat în n-decan, iar pentru a doua din 20% TOPO
dizolvat în kerosen, soluţia de reextracţie fiind în ambele cazuri: o soluţie de 0,1 M
NaOH. Experimentele au avut scopul de a determina dacă sistemul membranar poate să
îndepărteze continuu acizii organici: acetic şi propionic, din mediul de cultură al
microorganismului Propionibacterium acidipropionici, atât timp cât cultura este
păstrată activă. Fermentaţia a fost realizată pentru 165 ore, observându-se pierderi
semnificative în productivitatea acizilor la modificarea pH-ului de la 6,9 la 5,5, valoare
optimă pentru extracţia acizilor acetic şi propionic cu TOPO. Rezultatele experimentale
pentru cele două membrane sunt prezentate în tabelul 5:

40
 Tabel 5. Rezultate experimentale pentru pertracţia directă a acizilor propinic şi
acetic.
Fermentaţie Acid Acid Biomasă, Productivitate Acid Acid
acetic, propionic, g/l volumetrică, acetic propionic
g/l g/l g/l h extras extras
Convenţională, 12,81,4 34,53,1 19,14,5 0,240,02 - -
pH 6,9
Convenţională, 10 32 21,4 0,21 - -
pH 5,5
Membrană 13 37 38 0,25 22 44,5
plană, pH 5,5
Membrana cu 13 30 20 0,2 25 36,5
fibre goale,
pH 5,5

Compararea între procentele acizilor extraşi de cele două sisteme membranare nu

este posibilă datorită diferenţelor care apar între ariile acestora. Conform datelor din
literatură extracţia eficientă a acizilor volatili este posibilă numai pentru valori de pH
mai mici decât pKa, de exemplu pentru acidul propionic pH-ul ar trebui să fie mai mic
decât 4,87, însă la această valoare dezvoltarea microorganismelor este scăzută,
eforturile autorilor de a obţine în laborator tulpini rezistente în mediul acid eşuând. O
soluţie ar putea fi o extracţie în două stadii care să permită modificarea pH-ului din
lichidele de fermentaţie înainte de extracţie fără recircularea lichidelor de fermentaţie
epuizat sau utilizarea unor extractanţi care ar facilita extracţia acizilor în domeniu
neutru de pH, ca de exemplu sărurile cuaternare de amoniu, dacă va fi posibilă
soluţionarea problemelor legate de toxicitatea acestora faţă de microorganisme şi
reextracţia acizilor din aceşti compuşi [50].
Separarea acidului butiric s-a realizat prin pertracţie, rezultatele experimentale
fiind prezentate în tabelul 6. Se observă o îmbunătăţire semnificativă în valoarea
concentraţiei finale a acidului obţinută în cazul utilizării sistemelor de pertracţie
integrate.

Tabel 6. Rezultate experimentale la separarea directă prin pertracţie a acidului

butiric faţă de fermentaţia convenţională [28,51].

41
 Condiţii de fermentaţie Concentraţia Producţie Productivitate Selectivitate
finală g/g g/lh
C. butyricum, fermentaţie 7,3 0,24 0,24 0,73
discontinuă
C. butyricum, fermentaţie pertractivă 20 0,3 0,21 0,72
cu Hostarex A 327/alcool oleic
C. butyricum, fermentaţie pertractivă 301 0,45 7,37 0,8
cu Alamine336/alcool oleic

Z. Wu ş.a. (2002) au realizat separarea directă a acidului butiric prin pertracţie

utilizând instalaţia experimentală din figura 16, constituită dintr-un fermentator de 5 l,
un bioreactor pentru imobilizarea celulelor şi două module membranare cu fibre goale:
pentru extracţie, respectiv reextracţie. Bioreactorul este conectat cu fermentatorul din
care celulele libere sunt trimise în acesta în vederea imobilizării lor, cu viteze de
curgere mici de 10 l/min. După 36 h de recirculare continuă, densitatea de celule în
lichidele de fermentaţie a rămas constantă, marea majoritate a acestora fiind
imobilizate. Modulele membranare cu fibre goale au oferit o arie interfacială ridicată şi
un bun contact între faze, pierderile de solvent fiind minime.

Figura 16. Instalaţia experimentală utilizată pentru separarea directă prin pertracţie
a acidului butiric
În cazul unei fermentaţii extractive, datorită îndepărtării continue a acidului s-au
putut utiliza concentraţii ridicate ale glucozei, obţinând o productivitate de 260 g/l
pentru o concentraţie a glucozei de 125 g/l. Producţia în bioreactor a fost cu

42
aproximativ 10% mai mare la pH 6 şi cu aproximativ 44% mai mare la 5,5 decât cea
din fermentaţia convenţională. De asemenea s-a observat şi o puritate ridicată a
produsului de 91%. Valori constante ale performanţelor procesului sugerează că celulele
imobilizate nu sunt susceptibile la toxicitatea solventului. Rezultatele: o concentraţie
finală a acidului butiric de 301 g/l şi o productivitate de 7,37 g/l demonstrează
fezabilitatea şi avantajele acestui procedeu [51].

Separarea ex-situ utilizând MBSE a acidului lactic a fost studiată de Kubisova şi

Schlosser (1996), utilizând unităţi membranare cu fibre goale şi o soluţie de 0,4
mol/dm3 Hostarex A327 şi 1,2 mol/dm 3 izodecanol în n-alcani. Au observat o scădere
puternică în fluxul de acid lactic cu creşterea pH-ului fazei de alimentare, fluxul atins la
pH 5 a fost aproximativ 11% din cel de la pH 2. Acest fapt a condus la concluzia că
pentru a obţine rezultate optime în timpul separării directe pH-ul lichidelor de
fermentaţie trebuie menţinut sub valoarea 4, valoare care este însă prea mică pentru
biosinteza eficientă a acidului. O soluţie propusă de autori ar putea fi acidificarea
lichidelor de fermentaţie cu un acid mineral înaintea extracţiei on-line, după extracţie
lichidul fiind reintrodus în fermentator numai după o adăugare de glucoză pentru ai
restabili pH-ul. Un dezavantaj constă în transportul competitiv al acidului mineral. O
altă soluţie ar putea fi o scădere rapidă pentru un timp scurt a pH-ului sub valoarea 5
prin întreruperea neutralizării produsului la sfârşitul ciclurilor de alimentare şi evacuare,
descreştere care nu a afectat producţia de acid lactic [52].

O aplicaţie deosebită a extracţiei directe a produselor de biosinteză o constituie

cuplarea fermentaţiei cu un proces enzimatic de transformare a produsului separat. In
acest sens, Schueberl s.a. (1989, 1993) au conceput şi realizat un proces integrat de
biosinteză şi de transformare enzimatică a penicilinelor G şi V în acid 6-
aminopenicilanic şi acid fenilacetic la pH = 8. Acidul fenilacetic a fost recirculat în
mediul de cultura în timp ce acidul 6-aminopenicilanic concentrat, în membrana lichidă,
este acilat enzimatic la ampicilină, de către aceeaşi enzimă la pH = 6. Extracţia
penicilinelor s-a realizat in-situ prin intermediul unei membrane lichide obţinute prin
emulsionare.
Faza apoasă exterioară a conţinut lichidul de fermentaţie, în timp ce faza apoasă
interioară a inclus enzima care produce scindarea antibioticelor la acidul 6-
aminopenicilanic. Membrana lichidă a fost constituită dintr-un solvent organic, kerosen
şi un agent de extracţie, Amberlite LA-2 şi a fost obţinută prin amestecarea iniţială a

43
solventului cu faza apoasă interioară cu o intensitate ridicată, urmată de dispersarea
emulsiei formate în faza apoasă exterioară cu o intensitate mică.
Avantajele acestui sistem au fos:t menţinerea concentraţiei penicilinei la un nivel
scăzut 7 g/l, pierderile de penicilină sunt reduse de trei ori. Pe de altă parte prin
recircularea acidului fenilacetic costurile privind precursorul pot fi considerate reduse.
Procesul necesita un număr de şapte etape pentru obţinerea ampicilinei ceea ce reduce
puternic consumul de energie si materiale, precum si durata procesului. în figura 17 este
redată schema instalaţiei pilot în care se realizează acest proces integrat, proces care
simplifică mult tehnologia de obţinere a penicilinelor de semisinteză.

Figura 17. Schema instalaţiei pilot de fermentaţie, separare si scindare enzimatica

a penicilinei G pentru obţinerea ampicilinei.
1- Fermentator
2- Vas de micro-(ultra-)filtrare
3- Coloana pentru LME
4- Vas de preparare a emulsiilor
5- Vas de separare a emulsiilor
6- Vas de acilare enzimatica a acidului 6-aminipenicilanic
7- Filtru steril

Un alt exemplu este transformarea acidului fumaric în acid malic, care s-a
realizat într-un bioreactor divizat de două membrane obţinute prin înglobare în trei
compartimente: de alimentare, de reacţie şi al produsului final. Membrana lichidă
obţinută prin înglobare dintre compartimentele de alimentare şi de reacţie a fost

44
realizată din TOPO, 10%vol, dizolvat în acetat de etil, fiind selectivă faţă de substrat:
acidul fumaric. Compartimentele de reacţie şi cel al produsului au fost separate de o
membrană lichidă constituită din D2EHPA, 10% vol, dizolvat în diclormetan, aceasta
prezentând selectivitate faţă de produs: acidul malic. Microorganisme mutante,
Saccharomyces cerevisiae cu capacitatea de a produce cantităţi ridicate de fumarază au
fost imobilizate în granule mari transparente pe o matrice de alginat-silicat-gel şi
plasate în compartimentul de reacţie, funcţionând ca şi catalizator.
Conversia obţinută a atins 100%, în timp ce procesele industriale ating doar 75%,
o altă diferenţă constă în aceea că în urma acestui procedeu se obţine acidul liber în
timp ce în procedeele industriale se obţin săruri ale acidului malic.[53]

III. 2. Separarea directă prin pertracţie a alcoolilor

45
 Există procese de separare integrate în care separarea se realizează în paralel cu
biosinteza. De exemplu separarea etanolului a fost studiată într-un echipament în care
extracţia şi reextracţia se realizează în două utilaje separate conectat la reactor, într-un
circuit închis. În figura 18 este prezentat schematic un circuit utilizat pentru
îndepărtarea etanolului în timpul fermentaţiei alcoolice printr-un procedeu de separare
prin membrane, MBSE şi reextracţie, MBSS.
Această instalaţie poate fi operată în regim continuu sau semicontinuu, recuperarea
produsului evitând inhibiţia de produs determină creşterea productivităţii procesului.
Această instalaţie este aplicată la scară pilot. În comparaţie cu fermentaţia continuă pe
un mediu de glucoză de concentraţie 195 g/l, productivitatea a crescut cu mai mult de
două ori în sistemul cuplat cu cel de pertracţie integrat fără efecte asupra viabilităţii
celulelor şi a consumului de glucoză. Însă, în ciuda eforturilor nu s-a reuşit aplicarea
acestui procedeu la scară largă, datorită costurilor pertractoarelor cu membrane
fibroase.[54]

Figura 18. Schema tehnologică a fermentaţiei alcoolice cuplată cu pertracţia.

Molinari (1997) a studiat separarea izovaleraldehidei pornind de la alcool

izoamilic, utilizând ca microorganism producător Gluconobacter oxydans şi instalaţia
experimentală din figura 19. Aceasta transformă alcoolul cu o conversie de 90%, după
90 minute şi viteze de 3 g/l h. Aceste rezultate au fost obţinute în sistem discontinuu cu
o concentraţie a substratului mult mai mică decât 5g/l, deoarece concentraţii mai mari
au condus la scăderea productivităţii microorganismului. Un proces continuu prelungit
poate fi proiectat pentru a îmbunătăţi randamentul bioconversiei, dar este obligatorie
îndepărtarea aldehidei pentru a evita transformarea acesteia în acid. De asemenea
datorită volatilităţii înalte o mare parte din aldehidă se poate pierde prin evaporare sau
antrenarea cu aerul necesar oxidării alcoolului.

46
 Figura 19. Aparatura experimentală pentru bioconversia extractivă a alcoolului
izoamilic
A – Bioreactor, B – Rezervor cu extractant, C – modul cu fibre goale, D, E –
pompe, F – rezervor substrat, G – solvent proaspăt, H – solvent epiuzat

Recuperarea ex-situ a izovaleraldehidei din mediul de bioconversie a fost obţinută

prin contactarea lichidelor de fermentaţie cu un solvent capabil să extragă selectiv
aldehida şi nu alcoolul: izo-octan, caracterizat printr-o diferenţă favorabilă între
coeficientul de distribuţie pentru aldehidă 9 faţă de alcool 0,6. Dacă faza apoasă se
menţine la o presiune mai mare sau egală cu a fazei organice interfaţa este imobilizată
în membrană şi se evită amestecarea fazelor. Experimentele au evidenţiat un coeficient
de distribuţie pentru aldehidă egal cu 15, faţă de 9 în absenţa membranei. Această
diferenţă se datorează probabil caracterului hidrofob al membranei care prezintă o
permeabilitate mai mare pentru aldehida hidrofobă, determinând o creştere a
selectivităţii extracţiei. Extracţia poate fin îmbunătăţită prin utilizarea unor cantităţi de
solvent proaspăt şi prin modificarea raportului dintre cele două faze. Extracţia realizată
în modelul continuu utilizând solvent proaspăt este mai eficientă decât recircularea
solventului în regim discontinuu. Rezultatele experimentale obţinute în regim continuu
la diferite viteze de adăugare a substratului au evidenţiat faptul că se pot obţine grade de
conversie ridicate în acest sistem. Mai mult, ţinând cont de faptul că alcoolul izo-amilic
nu este extras din mediu, se poate realiza o conversie completă a substratului. Deci prin
conversia unui proces de bioconversie microbial cu un proces de separare ex-situ bazat
pe utilizarea extracţiei şi transportului prin membrane lichide obţinute prin înglobare,

47
s-a împiedicat: acumularea substratului peste valori ale concentraţiei inhibitorii, contact
prelungit între microorganism şi aldehidă, formarea acidului, ca produs secundar.
Sistemul a fost utilizat pentru recuperarea şi concentrarea aldehidei izo-valerice,
obţinându-se conversii de până la 90%, însă performanţa bioreactorului s-a menţinut
constantă numai pentru 12 ore de operare, ceea ce indică faptul că biocatalizatorul nu
poate fi utilizat pentru operarea pe termen lung [13].

III.3. Separarea directă prin pertracţie a aminoacizilor

48
 Mass s.a.(2002) au realizat separarea directa ex-situ a fenilalaninei utilizând
D2EHPA dizolvat în kerosen, iar ca soluţie pentru reextracţie a utilizat o soluţie de acid
sulfuric. S-au studiat diferite sisteme de extracţie: D2EHPA, DNNSA, (acid dinonil-
naftalin sulfonic), Aliquat 336, Alamine 308. Pentru primii doi agenţi de extracţie s-a
lucrat la un pH acid pH < 3, iar pentru ultimii doi s-a lucrat la un pH bazic, pH > 9.
Variaţia gradului de extracţie pentru aceştia este prezentată în figura 20:

Figura 20. Variaţia eficientei extracţiei pentru diferiţi agenţi de extracţie în cazul
fenilalaninei.

Deşi trei agenţi de extracţie: Aliquat 336, D2EHPA şi DNNSA prezintă valori
ridicate ale eficienţei extracţiei, s-a ales D2EHPA ţinând cont de toxicitatea acestora
asupra microorganismului producător: E. coli.
Extracţia s-a realizat cu ajutorul a doua module membranare, unul utilizat pentru
extracţie, iar celalalt pentru reextracţie. Utilizarea acestui sistem a permis dublarea
productivităţii prin adăugarea solventului.

Figura 21. Module membranare.

49
 La nivel de laborator aria membranei utilizata a fost de 0.23 m 2. Separarea
utilizând aceste membrane cu fibre goale ex-situ a permis reextracţia a 98 % din
cantitatea de fenilalanina, în forma cationica, puritatea produsului fiind de 99%.
Coeficienţii de transfer de masă în acest caz au fost:
 dinspre faza apoasa spre faza organica
K = 288 10-7 cm/s
 dinspre faza organica spre faza apoasa
K = 77 10-7 cm/s [55]

Utilizând sistemul de membrane prezentat mai sus Gerigk s.a. (2002) a separat
fenilalanina din lichidele de fermentaţie a microorganismului E. coli, utilizând o
instalaţie la nivel pilot, prezentată în figura:

Figura 22. Reprezentarea schematică a instalaţiei de separare directă a

fenilalaninei

Fermentatorul utilizat are volumul de 300 l, iar cele două contactoare cu fibre
goale au avut o arie interfacială de 18,6 m 2. Prin utilizarea unui proces de separare
integrat s-a obţinut un maxim al vitezei de formare a fenilalaninei de aproximativ 250
g/h după cum se observă din figura 23. În acelaşi timp aminoacidul a fost extras cu o
viteză de extracţie maximă de 110 g/h, rezultând deci o acumulare a fenilalaninei în
fermentator de 22 g/l. În total aproximativ 2 kg de fenilalanină au fost separate, indicată
de aria gri de pe figură, 5 kg rămânând în fermentator pentru separarea convenţională.

50
Etapa limitativă a procesului a fost considerată difuzia prin membrană. Cantitatea de
fenilalanină separată on-line poate fi crescută prin creşterea numărului de membrane.
Separarea ulterioară prin precipitare a condus la o producţie de 99% produs pur,
contaminat cu mai puţin de 40 mg/kg alţi compuşi organici.

Figura 23. Comparaţia vitezei formării produsului cu viteza de extracţie

Makryaleas s.a. (1995) pentru un proces de biosinteză a L-leucinei au utilizat un

sistem complex care implică:
- difuzie fizică
- transport mediat de un purtător în două direcţii
- reacţie enzimatică.
În figura 24 este prezentată o reprezentare schematică a procesului.
Principalele substraturi sunt incluşi în faza externă: α.keto.izocaproatul, formiat de
amoniu, amoniac. Membrana lichidă a fost alcătuită din n-parafine şi 5% agent de
emulsionare: Span 80, agent purtător Adogen 464 în formă Cl.
Formiatul şi α.keto-izocaproatul, în formă ionică la pH = 8, sunt transportaţi spre
faza internă. Amoniacul neutru, fiind solubil în membrană, traversează membrana prin
difuzie simplă, este protonat în interiorul picăturii apoase care conţine enzima:
leucindehidrigenaza, LDH şi formiatdehidrogenaza, FDH. LDH catalizează aminarea
reductivă a α.keto-izocaproatului în L-leucină, iar FDH este responsabilă pentru
regenerarea NADH, care se oxidează în timpul aminării. L-leucina, în formă anionică
este transportată către faza externă, de către agentul purtător, care îndeplineşte astfel
două funcţii: transportă α.keto-izocaproatul şi leucina.

51
 Figura 24 Reprezentarea schematică a procesului de obţinere a leucinei.

În regim continuu s-a atins un regim staţionar după patru perioade de transport.
După aproximativ 200 de minute s-au atins conversii de 70%. [56]

52
 III.4. Separarea directă prin pertracţie utilizând microcapsule

Producţia biotehnologică de arome a devenit din ce în ce mai atractivă, 2-fenil-

etanolul (PEA), deoarece a fost clasificată ca fiind naturală de agenţia US şi Europeană
alimentară, reprezintă una dintre cele mai importante arome, având un puternic avantaj
de marketing. Posedă o aromă asemănătoare trandafirului, fiind adăugată pentru a
modifica compoziţia unor arome specifice, în special în formulele de fructe la care
contribuie organoleptic.
O abordare promiţătoare pentru a produce PEA prin biotehnologie reprezintă
utilizarea drojdiilor pentru bioconversia L-fenilaninei la PEA. Însă, producţia acesteia,
de către drojdii este limitată de efectele inhibitorii ale PEA asupra celulelor. Utilizând
tulpinii de Kluyveromyces marxianus, Fabre ş.a. a observat obţinerea unei concentraţii
maxime de PEA de 1,4 g/l la finalul unei fermentaţii discontinue. Albertazzi ş.a. au
obţinut o concentraţie de 1,73 g/l utilizând o tulpină de Hansenula anomala, iar
utilizând tulpini de Saccharomyces cerevisiae în fermentaţii discontinue s-a obţinut 2,6
g/L. Cea mai înaltă concentraţie finală de PEA a fost de 3,8 g/L realizată prin
fermentaţie utilizând Saccharomyces cerevisiae într-un procedeu discontinuu pe
substrat de glucoză pentru a preveni formarea etanolului, care reduce în general
concentraţia finală a PEA prin efectele inhibitorii sinergetice (PEA+Et).
Pentru a mări concentraţia finală a PEA şi implicit productivitatea, impactul
inhibitor al PEA trebuie îndepărtat. Acest obiectiv poate fi atins prin tehnici de
recuperare in situ a produsului care să îndepărteze PEA din suspensiile de fermentaţie în
timp ce aceasta este produsă. Astfel concentraţia rămâne sub o valoare inhibitorie,
drojdiile fiind capabile să producă în continuare PEA. Pe baza caracterului hidrofob al
PEA caracterizat printr-o valoare a log P = 1,37, fermentaţia extractivă într-un sistem
bifazic în interiorul fermentatorului este o tehnică ISPR promiţătoare.
Concentraţia globală a PEA a fost crescută până la 12,6 g/l când alcoolul oleic a
fost ales pentru culturi bifazice discontinue. Totuşi contactul direct al unei faze organice
cu celulele determină destul de des formarea unei emulsii stabile în timpul fermentaţiei
extractive care ridică dificultăţi în următorul pas al fermentaţiei. Mai mult alegerea
fazei de extracţie este limitată la solvenţi care nu prezintă toxicitate.
O metodă pentru depăşirea acestui dezavantaj a fost utilizarea unei membrane care
separă fizic biocatalizatorul de fază organică. Astfel, pertracţia se realizează fie printr-o
membrană polimerică densă ca de exemplu din cauciuc siliconic sau prin membrane
microporoase hidrofile şi hidrofobe ca de exemplu din polipropilenă sau polisulfone. În
ambele cazuri faza apoasă poate fi saturată cu solvent, însă transferul de masă este

53
redus în prezenţa unei membrane dense sau poroase, fiind necesară utilizarea unei
interfeţe de contact mai mare. Un nou sistem de pertracţie utilizează microcapsule cu
diametrul de aproximativ 2 mm pentru fermentaţia extractivă. Solventul, dibutil
sebacate care prezintă toxicitate faţă de S. cerevisiae, este încapsulat într-o membrană
polimerică, construită din hidrogel pe bază de alginat, nefiind în contact direct cu
celulele. Dimensiunile mici ale microsferelor oferă o suprafaţă interfacială mare pentru
un proces de extracţie rapid. Capsulele au fost obţinute prin coextrudere.

Figura 25. Reprezentarea schematică a instalaţiei utilizată pentru pertracţie 2-fenil-

etanolului

Instalaţia experimentală este prezentată în figura 25, utilizând un fermentator “pat

fluidizat” conţinând capsule de DBS (dibutil sebacate) de 3,6 l pentru conversia L-
fenilalaninei la PEA într-o cultură discontinuă pe substrat de glucoză. Reextracţia PEA
a fost realizată prin circulaţia unei faze apoase “mediator” într-un vas prevăzut cu
amestecare, în care au staţionat: faza apoasă intermediară şi solventul organic, DBS,
ambele agitate la 150 rpm cu agitatoare individuale cu scopul de a nu se amesteca
fazele, transferul de masă având loc numai prin interfaţă. Pentru fermentaţia in situ,
capsulele au fost plasate într-o sită sub formă de cilindru. Microcapsulele conţinute în
această plasă cu dispunere cilindrică introdusă direct în fermentator a rezistat la agitare
în regim turbulent pentru mai mult de 5 zile, fără distrugerea capsulelor.

54
 Concentraţia finală totală a PEA = 5,6 g/l a fost mai mare ca 3,8 g/l în condiţiile
unei fermentaţii discontinue dar mai mică de 12,6, valoare corespunzătoare unei
extracţii directe utilizând alcool oleic. Însă, pe baza bilanţului masic autorii au observat
că dacă în sistem s-ar fi utilizat mai multe capsule cu o fracţie organică totală de 0,25 s-
ar fi atins o concentraţie de 14,3 g/l. Această cantitate de capsule ar ocupa aproximativ
4,5% din volumul total de reacţie însă ar putea fi poziţionată fără probleme de spaţiu în
reactor. Un alt avantaj al acestei metode a fost concentraţia finală mare de PEA în
solvent egală cu 47,2 g/l în capsule, obţinută datorită unui coeficient de distribuţie de
14,9.
Pentru extracţia ex-situ capsulele au fost expuse într-o buclă exterioară
fermentatorului, reextracţia compusului fiind realizată într-un alt reactor cu scopul de a
regenera capsulele, prin transferul 2-fenil-etanolului prin intermediul unei faze
intermediare apoase în solvent. Suspensia de drojdii cu o concentraţie mare de biomasă
de 22 g/L a fost circulată fără probleme prin bucla externă în reactorul cu pat fluidizat.
Concentraţia PEA a fost reglată prin îndepărtarea compusului printr-o serie de cicluri de
extracţie – reextracţie.

Figura 26. Rezultatele experimentale la separarea ex-situ a PEA

55
 Însă, în timpul experimentelor s-a observat după 48 h transferul a 10 mL de DBS
în fermentator din reactor, care a afectat negativ fermentaţia. Rezultatele sunt prezentate
în tabelul 7.

Tabelul 7. Distribuţia 2-fenil-etanolului la separarea directă ex-situ utilizând

microcapsule
Faza Volum, Fracţia Concentraţia Distribuţia
ml volumică 2-fenil-etanolului, g/l 2-fenil-etanolului, %
Faza apoasă din 2,05 0,52 1,5 28
fermentator
Faza apoasă 820 0,21 0,5 4
mediatoare
Faza organică 970 0,25 6,6 57
de reextracţie
Faza capsulelor 70 0,02 18,4 11
organice
Volum total 3,910 100

Concentraţia globală de 2-fenil-etanol pentru volumul utilizat a fost doar 2,9 g/l
datorită realizării bioconversiei numai timp de 10 h. O fracţie de 28% 2-fenil-etanol a
rămas în fermentator deoarece faza apoasă caq = 1,5 g/l nu era în echilibru cu faza
apoasă din reactor caq = 6,6 g/l. Transferul de masă lent s-a datorat ariei interfaciale mici
de 70 cm2. Coeficientul global de transfer de masa K= 1,1·10 -5 m/s a fost de
aproximativ 3 ori mai mare decât transferul de masă pentru sistemul de capsule în
reextractor.
Astfel, re-extracţia are nevoie pentru a fi performantă de o arie mult mai mare.
Deşi s-a încercat utilizarea etanolului ca reextractant, metoda nu este aplicabilă acesta
dizolvând şi solventul. DBS a fost testat şi el pentru reextracţie direct din capsule însă
la sfârşitul ciclurilor de reextracţie DBS a rămas în reactorul cu pat fluidizat fiind apoi
transferat în fermentator unde datorită efectului toxic a inhibat bioconversia [57].

IV. Separarea directă a produselor de biosinteză prin pervaporizare

56
 Pervaporizarea este o combinaţie eficientă din punct de vedere energetic al unui
proces de evaporare cu un proces membranar. Un amestec de două sau mai multe
componente miscibile, în fază lichidă este pus în contact cu o faţă a unei membrane
polimerică neporoasă în timp ce pe cealaltă faţă a membranei fie se purjează un gaz fie
se aplică vid. Componenţii amestecului lichid sunt absorbite în membrană, traversează
membrana, evaporându-se de cealaltă faţă a membranei. Faza de vapori rezultată este
apoi condensată. Deoarece speciile chimice din amestecul iniţial au afinităţi diferite
pentru membrană şi viteze diferite de difuziune prin membrană este posibilă
concentrarea prin acest procedeu chiar şi a unui component aflat într-o diluţie ridicată în
amestecul iniţial. O prezentare schematică a procesului este realizată în figura 25 [58]:

Figura 27. Reprezentarea schematică a procesului de pervaporizare.

Forţa motrice pentru transportul prin membrană este diferenţa între activităţile
chimice între amestecul iniţial şi permeat. Sistemul de pervaporizare cel mai eficient
din punct de vedere al eficienţei economice este cel care operează la temperatura cea
mai mare posibilă a fluxului de alimentare. În consecinţă, dacă în faza de alimentare
există materiale sensibile la temperatură, ca de exemplu celulele microorganismului
producător sau chiar produsul util atunci sistemul de pervaporizare va trebui să opereze
la o temperatură mai mică decât cea optimă sau materialele sensibile vor fi îndepărtate
înaintea pervaporizării, pentru primul caz. Se poate utiliza un dispozitiv de filtrare sau
de centrifugare, schema unui astfel de sistem este prezentată în figura 28:

57
 Figura 28. Diagrama schematică a unui sistem generic de pervaporizare

O alternativă la introducerea unui dispozitiv de separare solid – lichid pentru

protejarea microorganismelor termosensibile ar putea fi utilizarea unor microorganisme
termotolerante şi termofile. Dacă se utilizează microorganisme termotolerante atunci
acestea pot fi expuse unor temperaturi ridicate, într-un sistem de pervaporizare putând fi
recirculate în fermentator [59]. Moniruzzaman s.a.(1998) au demonstrat că o creştere a
temperaturii la 50C pentru două ore nu a alterat tulpinile de E. coli, într-o fermentaţie
discontinuă deşi valoarea optimă a productivităţii a fost atinsă într-un timp mai mare
decât cea în cazul unei temperaturi de 35C [60]. Chiar şi drojdiile standard pot
supravieţui şi la temperaturi mai ridicate pentru perioade mai scurte de timp, în special
în timpul etapei staţionare din ciclul de dezvoltare şi termotoleranţa poate fi indusă
acestor microorganisme [61]. Un aspect important în acest caz este faptul că acestea
trebuie să tolereze temperaturile ridicate doar pentru o perioadă de timp egală cu timpul
de staţionare în sistemul de pervaporizare. Din păcate chiar şi microorganismele
termotolerante nu pot supravieţui la expuneri la temperaturi peste domeniul de
toleranţă. Cea mai mare temperatură la care ar putea fi supusă tulpina de
Saccharomyces cerevisiae este de 50C. Pentru organisme termofile temperatura în
fermentator ar putea fi mai mare şi chiar aceeaşi cu cea din sistemul de pervaporizare.
De exemplu, Mori s.a. au investigat producţia de etanol biosintetizat pe substrat de
amidon, cu ajutorul unei tulpini termofile anaerobe de Clostridium
termohydrosulfuricum YM3, şi cuplarea fermentatorului cu un modul de pervaporizare

58
în care ambele au fost operate la 66C [62]. Similar, Agrol Limited a obţinut o bacterie
termofilă pentru obţinerea de etanol. Cum activitatea de zaharificare pentru cele mai
multe enzime utilizate în producerea de biocombustibili este optimă la temperaturi
ridicate, temperaturile mai mari permise de microorganismele termotolerante şi
termofile vor reduce necesarul de enzime din proces. De exemplu, domeniul optim de
temperatură pentru activitatea celulazei este de 45-50C. Operarea în procesul de
fermentaţie în temperaturi mai mari are avantajul de a limita contaminarea cu
microorganisme nedorite [63].

59
 IV.1. Separarea directă prin pervaporizare a etanolului

Separarea directă prin pervaporizare a etanolului este una dintre cele mai indicate
metode pentru separarea acestui compus.

Materiale membranare pentru recuperarea etanolului prin pervaporizare

Au fost studiate mai multe materiale membranare cu scopul de a recupera etanolul

din faze apoase prin pervaporizare. Cel mai utilizat material membranar hidrofob este
PDMS – polidimetilsiloxanul (cauciuc siliconic), un material elastomer din care pot fi
fabricate fibrele goale – holow fibre, membranele plane subţiri. Utilizând acest material
pentru constituirea membranei de pervaporizare, factorul de separare pentru alcoolul
etilic din soluţii apoase este cuprins între 4,4 şi 10,8, iar pentru butanol între 40 şi 60,
aproximativ de 10 ori mai mare decât cel pentru etanol. Un alt material membranar
utilizat este PTMSP – poli(1-trimetilsilil-1-propină) [58]. În tabelul 8 sunt prezentaţi
factori de separare în cazul utilizării acestui material.

Tabelul 8. Valorile factorilor de separare pentru amestecul etanol/apă.

Polimer Temperatură, Factor de Observaţii (conc., fază de
C separare,  alimentare, grosime membrană)
PTMSP 30 15,1-19,9 6% Et-OH, 14-43 m
PTMSP 30 15,1-19,3 6% Et-OH, 10-20 m
PTMSP 30 19,9 6% EtOH,   în timp
PTMSP 50 10,3 6-7% EtOH
PTMSP 30 9 5% EtOH,   la 17 pentru 1%
EtOH
PTMSP 75 10,7 10% EtOH
PTMSP 30 11,2 7% EtOH
PTMSP 25 22,9 6% EtOH,  mai mic pentru
lichide de fermentaţie
PTMSP 66 18,7 1,5% EtOH
PTMSP 60 10-26 6% EtOH, 30 m

Se poate observa obţinerea unor valori mai mari în cazul utilizării PTMSP-ului
faţă de PDMS, însă, acest polimer este instabil în timp, atât fluxul cât şi selectivitate
scăzând în timp. Există şi membrane constituite din silicalit, polimer hidrofob.

60
 Efectul componenţilor lichidelor de fermentaţie asupra membranelor de
pervaporizare
Literatura oferă informaţii privind impactul atât pozitiv cât şi negativ al
componentelor lichidelor de fermentaţie asupra performanţei unei varietăţi de module şi
membrane de pervaporizare [58]. În tabelul 9 sunt prezentate efectele acestui parametru
asupra performanţei pervaporizării. Impactul fiecărui component asupra performanţei
membranei pare să depindă de temperatură, deoarece sorbţia, difuzia şi evaporarea sunt
fenomene dependente de temperatură.

Tabelul 9. Componenţi ai unei fermentaţii cu impact asupra performanţei unui

sistem de pervaporizare
Componente ale lichidului Concentraţia Efectul asupra membranei de
de fermentaţie maximă, g/l pervaporizare
Celule viabile sau celule Blocarea suprafeţei membranei prin
întregi moarte acumulare
Componente celulare - II -
Glucoza 100 Scade fluxul şi factorul de selectivitate
datorită  fluxului de apă
Xiloza 50 - II -
Acid acetic, malic, 1, 1, 0,5, 4 Membrane constituite din silicalit:
succinic, butiric scad fluxul şi slectivitatea
Solide dizolvate (NaCl) 10 Pot precipita la temperaturi mari
Glicerol 10 - II -
Etanol 100 Scade factorul de selectivitate
Acetonă 10 - II -
n-butanol 20  selectivitatea
2-propanol 5 Poate conduce la umflarea membranei
2,3-butandiol 0,5  fluxul datorită unui transport
competitiv cu alcoolii
Acizi graşi: acid stearic, 0,15 Reducerea de 10 ori a fluxului de
palmitic butanol
După cum se observă acizii organici ca: acetic, butiric, succinic şi malic au un
impact negativ asupra performanţei membranelor, în special a celor de silicalit, însă
cauza nu a fost încă stabilită. Ar putea fi o sorbţie competitivă, în care acizii sunt
adsorbiţi preferenţial în comparaţie cu etanolul, transformând polimerul într-o formă
hidrofilă. Există şi posibilitatea unor interacţiuni ireversibile între acizi şi situsurile
active sau cu aluminiul din structura zeolitului. pH-ul lichidelor de fermentaţie şi şi
constantele de disociere a acizilor sunt determinante în magnitudinea oricărui impact al

61
acizilor asupra membranelor de silicalit. Componenţii lichidelor de fermentaţie pot de
asemenea să altereze comportarea termodinamică a alcoolilor. De exemplu, adăugarea
unui surplus de sare în lichidele de fermentaţie vor determina creşterea coeficientului de
activitate al alcoolului astfel încât acesta va trece preferenţial din faza apoasă în
membrană.
Energia necesară pentru recuperarea etanolului utilizând un sistem de
pervaporizare a fost calculată în funcţie de concentraţiile diferite ale etanolului. Pentru
factori de separare de 8, 10, 20 şi 50 rezultatele privind necesarul de energie pentru
pervaporizare sunt prezentate în figura 29 [64] .

Figura 29. Energia necesară pentru recuperarea etanolului din apă funcţie de
concentraţia etanolului în fluxul de alimentare la diferiţi factori de separare

Studiile economice realizate privind costurile pentru recuperarea directă a

alcoolilor din lichidele de fermentaţie utilizând sisteme de pervaporizare integrate au
dus la următoarele observaţii:
- cea mai bună membrană pentru separarea etanolului este cauciucul
siliconic: PDMS
- costul pervaporizării este competitiv cu cel corespunzător distilării,
- operarea modulului de pervaporizare la temperaturile cele mai mari
posibile conduce la creşterea fluxului cu 5 sau chiar 10%, iar a
factorului de separare chiar de 2 ori [58]

62
 Shabtai (1991) a studiat separarea etanolului prin cuplarea unui modul de
pervaporizare cu un reactor cu celule imobilizate. Sistemul combinat a utilizat o soluţie
de melasă sau zahăr concentrată: 40%, obţinând o producţie în etanol de aproximativ
15%, la o productivitate de aproximativ 25 g/lh, la o operare timp de 40 de zile [65].
Acelaşi autor a studiat separarea directă a etanolului prin pervaporizare utilizând
sistemul a cărui schemă este prezentată în figura 30.

Figura 30. Schema instalaţii de separare directă a etanolului prin pervaporizare

Sistemul implică un fermentator, 1, controlat cu ajutorul unui microprocesor, 2,

conectat la un calculator, 3. Fermentatorul este cuplat cu un modul de pervaporizare, 4,
constituit din patru membrane cu lungimea de 60 cm. Lichidul de fermentaţie este
transportat cu o pompă centrifugă, 5, în modulul de pervaporizare, iar lichidul din care a
fost îndepărtat etanolul este readus în fermentator. Sistemul de pervaporizare este
conectat cu o pompă de vid, 6, şi cu un condensator, 10, din care condensatul trece într-
un vas de acumulare, 11. Controlul producţiei de etanol şi monitorizarea performanţei
membranei s-a realizat utilizând o analiză spectrometrică de masă, 14, lactoza
concentrată a fost alimentată din rezervorul 15 prin intermediul pompei 16,
monitorizată prin intermediul conexiunii 17 cu calculatorul.
S-a utilizat ca microorganism tulpini de Candida pseudotropicalis IP-513, care
deşi nu este caracterizată de o productivitate ridicată în etanol a permis realizarea
fermentaţiei la o temperatură adecvată pervaporizării: 38C, datorită caracteristicilor
termotolerante, în special în cazul culturilor dense. Datorită îndepărtării continue a
etanolului din bioreactor prin pervaporizare s-a reuşit utilizarea unei concentraţii
ridicată a substratului, menţinerea unei concentraţii staţionare în lichidul de fermentaţie,
controlul concentraţiei lactozei permiţând compensarea pierderilor datorate
pervaporizării, condiţii importante pentru un sistem de operare în regim continuu.

63
 Procesul de separare directă a etanolului utilizând modulul de pervaporizare a
condus la obţinerea unei soluţii concentrate de etanol de 8 până la 12%, în funcţie de
concentraţia iniţială a lactozei şi de stadiul fermentaţiei. După 5 ore de operare a
sistemului în vasul colector s-a acumulat 0,75 l de soluţie limpede cu o concentraţie a
etanolului de 8%, pentru o concentraţie a lactozei de 4%, care corespunde unei
recuperări în procent de 90% a etanolului. Productivitate procesului a fost de
aproximativ patru ori mai mare decât în cazul fermentaţiei convenţionale [66].
O`Brien (1996) a studiat îmbunătăţirea producţiei de etanol într-un sistem
continuu de fermentaţie cuplat cu pervaporizare. Instalaţia experimentală, constituită
dintr-un fermentator conectat la un modul de pervaporizare, cu o membrană din
polidimetilsiloxan dispus pe un suport de polisulfonă, este prezentată în figura:

Figura 31. Instalaţia pentru separarea directă a etanolului prin pervaporizare

Experimentele vizând studiul performanţei modulului de pervaporizare pentru
îndepărtarea continuă a etanolului din lichidele de fermentaţie s-au realizat la început în
regim discontinuu, cu o concentraţie iniţială a glucozei de 150 g/l, iar când etanolul a
atins concentraţia de 5% în lichidele de fermentaţie bioreactorul a fost cuplat cu
modulul de pervaporizare. Rezultatele experimentale sunt prezentate în tabelul:

Tabel 10. Rezultatele experimentale la separarea directă a etanolului utilizând

pervaporizare
Exp Cinetica fermentaţiei Performanţa pervaporizării

64
 Durata Viteza CSF, rS, rP YX/S YP/S cPP Flux, Selectivitate
pervap de g/l g/lh g/lh g/g g/g g/l l/m2h
aeraţie
1 26,1 0,1 259 17,3 6,7 0,043 0,39 123 0,74 2,6
2 33,5 0,1 269 18,4 6,4 0,046 0,34 111 0,73 2,2
3 46,5 0,1 269 19,4 7,8 0,049 0,40 101 0,79 1,8
400 14,4 6,5 0,45 158 0,56 2,3
600 19,4 6,9 0,36 162 0,65 2,4
4 44,0 0,033 269 17,0 7,7 0,047 0,45 104 0,72 2,0
400 15,5 6,5 0,42 148 0,65 2,4
5 26,0 0,033 380 15,8 6,54 0,027 0,41 171 0,51 3,7
6 52,5 0,033 404 14,7 6,63 0,033 0,45 192 0,42 3,3
608 13,4 5,41 0,40 335 0,31 6,5
7 59,0 0,033 385 11,5 5,80 0,042 0,50 223 0,37 4,1
550 15,0 4,89 0,33 216 0,37 3,7
8 55,5 0,033 385 14,3 5,52 0,042 0,39 196 0,40 3,7
584 14,1 5,24 0,37 209 0,40 3,7
9 53,5 0,033 386 14,7 5,44 0,032 0,37 200 0,37 3,6
619 12,6 6,43 0,51 201 0,38 3,2

în care: CSF – concentraţia glucozei în fermentator, g/l

CPP – concentraţia etanolului în permeatul de la nodulul de pervaporizare, g/l
rS – viteza de utilizare a substratului, g/lh
rp – viteza de formare a produsului, g/lh
La începutul experimentului 5 membrana a fost înlocuită, iar în timpul
experimentelor 6-9 a fost spălată.
Domeniul în care s-a dorit menţinerea concentraţiei etanolului în fermentator a fost
de 45-65 g/l. Operarea continuă în acest domeniu ar maximiza concentraţia etanolului
în permeat, minimizând inhibiţia de produs asupra celulelor de drojdie. Fermentaţia
cuplată cu separarea prin pervaporizare a fost realizată continuu timp de 50 de ore,
obţinându-se un permeat cu o concentraţie de etanol de aproximativ 15%, reuşindu-se
menţinerea concentraţiei acestuia în fermentator în domeniul dorit. Prin spălarea
membranelor la 12 ore a fost îmbunătăţită selectivitatea acestora de la 1,8-2,6 până la
3,2-4,1. Agitarea suplimentară cauzată de recircularea lichidului de fermentaţie prin
modulul de pervaporizare produce o cantitate destul de mică de spumă. Concentraţia
maximă a celulelor a atins 18-23 g/l.
Aplicarea industrială a pervaporizării pentru recuperarea etanolului din lichide de
fermentaţie este condiţionată de o serie de factori:

65
 o necesită dezvoltarea unor membrane cu caracteristici de performanţă
acceptabile şi susceptibilitate mică la contaminare
o condensarea permeatului (la vid) deşi este relativ eficientă, ţinând
cont de transferul de căldură, necesită un sistem de refrigerare pentru
condensarea aperi de răcire, care presupune un cost suplimentar
o datorită unei productivităţi crescute în etanol, un sistem de
fermentaţie în regim continuu cuplat cu un modul de pervaporizare
ar necesita un bioreactor cu un volum mai mic, determinând un cost
redus
o datorită utilizării unor medii de cultură mult mai concentrate scad
costurile de capital şi energie.
Astfel balanţa avantajelor şi costul membranelor şi al sistemului de refrigerare va
determină economicitatea pervaporizării pentru recuperarea etanolului. În timp ce
membranele de polidimetilsiloxan prezintă cea mai bună selectivitate la pervaporizare
pentru etanol, aceasta nu este intrinsec selectivă pentru etanol mai mult decât pentru
apă, permeabilitatea etanolului prin această membrană fiind mai mică decât cea pentru
apă. Acest fapt determină obţinerea unui grad total de separare scăzut datorită
evaporării, fapt care limitează selectivitatea membranei între valorile 5 – 10. Astfel,
pentru a fi mai avantajoasă decât distilarea recuperarea directă a etanolului prin
pervaporizare trebuie să posede avantaje privind costul de capital şi consumul de
energie. Un studiu recent privind economicitatea unui astfel de proces a indicat că
membranele utilizate curent nu ar fi avantajoase nici pentru un factor de selectivitate
egal cu 20. Pentru uz comercial se studiază membrane pe bază de zeolit-
polidimetilsiloxan [67].
V. Separarea directă a produselor de biosinteză prin stripare

Striparea cu gaze este o tehnică simplă pentru recuperarea unor compuşi organici
din lichidele de fermentaţie. Gaze, ca: azot, hidrogen sau dioxid de carbon, sunt
barbotate în lichidele de fermentaţie, urmată de trecerea gazului sau gazelor printr-un
condensator. Gazul dispersat în fermentator antrenează compuşi ca: butanol, acetonă,
etanol, produşii fiind recuperaţi prin condensare. Odată condensaţi solvenţii, gazul este
recirculat în fermentator pentru a prelua mai mulţi solvenţi. Acest proces continuă până
la utilizarea completă a substratului din fermentator de către celule. În anumite caturi,
poate fi utilizată şi o soluţie de reextracţie pentru a concentra soluţia, prin recirculare de
mai multe ori. În figura 32 este prezentată o diagramă schematică a unui proces tipic de
stripare cu gaze.

66
 Figura 32. Reprezentarea schematică a unui proces de separare directă prin stripare
cu gaze

Striparea cu gaze este aplicabilă produşilor de fermentaţie cu

proprietăţi volatile, ca de exemplu alcoolii: etilic şi butiric. Striparea
componenţilor volatili din lichidele de fermentaţie se realizează prin realizarea unei
suprafeţe mari de contact între acestea şi faza gazoasă sau de vapori, fiind avantajoasă
circulaţia în contracurent a celor două faze. Contactul lor se poate asigura prin
barbotarea gazului în fermentatoare sau coloane cu talere, ori prin prelingerea lichidului
peste o umplutură prin care circulă în contracurent faza gazoasă, în acest din urmă caz
putându-se folosi instalaţii asemănătoare cu turnurile de răcire.
Recuperarea compuşilor volatili prin stripare este însoţită şi de îndepărtarea unei
cantităţi de apă, biomasa fiind concentrată ceea ce va determina creşterea
productivităţii. S-a studiat separarea prin stripare atât in-situ, caz în care gazul trebuie
îndepărtat crescând costul procesului, cât şi ex-situ, prin utilizarea unui utilaj de stripare
extern, cu o flexibilitate mărită de operare [47].

67
 V.1. Separarea prin stripare a alcoolilor

Ezeji s.a. (2003) au aplicat striparea cu gaze într-un reactor discontinuu pentru
recuperarea solvenţi: butanol, etanol şi acetonă din lichidul de fermentaţie al
microorganismului: C. beijerinckii BA101. În timpul experimentelor nu s-a observat
efecte adverse ale stripării cu gaze asupra acestora, însă prezenţa celulelor a influenţat
negativ selectivitatea îndepărtării ABE (acetonă-butanol-etanol), probabil datorită
toxicitatea unor substanţe minerale, o difuziune înceată a oxigenului, acumularea unor
macromolecule în mediu de cultură.
În acest proces s-a reuşit, prin îndepărtarea prin stripare a compuşilor utilizarea
până la epuizare a unei soluţii concentrate de zahăr. Valorile obţinute pentru
concentraţia solvenţilor în cele două situaţii: cu şi fără separare directă sunt foarte

68
diferite: în cazul utilizării stripării s-a obţinut 75,9 g/l ABE faţă de 17,7 g/l în cazul
unui proces de fermentaţie convenţional. În procesul de biosinteză convenţional de
biosinteză a ABE în care produşii nu au fost îndepărtaţi s-a utilizat o soluţie de zahăr cu
concentraţia egală cu 45 g/l, în timp ce în cazul procesului integrat concentraţia a fost
de 161,7 g/l, depăşirea acestei valori determinând inhibiţia de substrat. O îmbunătăţire
considerabilă privind atât productivitatea cât şi producţia s-a înregistrat în cazul
utilizării procesului de fermentaţie ABE integrat cu striparea cu gaze, productivitatea
ajungând până la 200%, iar producţia la 118%, în comparaţie cu procesul de fermentaţie
discontinuu[68].
Pentru a reduce inhibiţia de substrat aceeaşi autori (2004) au lucrat în regim
discontinuu, realizate în instalaţia experimentală prezentată în figura 33, cuplând
fermentatorul cu un utilaj de stripare cu gaze, utilizând azot ca gaz pentru stripare,
recirculat cu un debit de 6 ml/min, concentraţia iniţială a glucozei fiind de 100 g/l. În
timp ce substratul este consumat în procesul de biosinteză, glucoza utilizată este
înlocuită cu o soluţie de zahăr concentrată: 500 g/l. Nivelul de zahăr în interiorul
bioreactorului a fost menţinut sub valoarea inhibitorie, la 80 g/l. Inhibiţia
microorganismelor datorată acumulării solvenţilor ABE, a fost redusă prin îndepărtarea
acestora compuşilor, concentraţia celulelor crescând până la o valoare maximă de 15 g/l
la sfârşitul fermentaţiei.
Utilizând acest sistem, în 1 l volum de cultură s-a utilizat 500 g glucoză,
producându-se 233 g solvenţi. În timpul procesului producţia în solvent a crescut de la
0,39 la 0,47 g/g [69].

69
 Figura 33. Reprezentarea instalaţiei de separare prin stripare a produselor din
fermentaţia aceto-butirico-etanolică

A fost investigat şi un sistem de fermentaţie continuă în care solvenţii au fost

îndepărtaţi prin stripare cu gaze. În acest sistem 1163 g de glucoză au fost utilizate,
cantitatea totală de solvenţi rezultaţi fiind de 460 g [47].
Caracteristicile acestor procese sunt prezentate în tabelul 11:

Tabel 11. Caracteristicile procesului de fermentaţie ABE

Proces de Tehnică de ABE, g Glucoză, Producţie, Productivitate,
fermentaţie separare g g/g g/l h
Discontinuu Nici una 24,2 59,8 0,39 0,34
Discontinuu Stripare cu 75,9 161,7 0,47 0,60
gaz
Semi-continuu idem 233 500 0,47 1,16
Continuu idem 460 1163 0,40 0,91

Ezeji (2005) a studiat îmbunătăţirea performanţei procesului se recuperare a

butanolului din lichide de fermentaţie utilizând striparea cu gaze. Efectul factorilor ca:
viteza de recirculare a gazului (azot), mărimea bulelor, prezenţa acetonei şi a etanolului
în lichidele de fermentaţie au fost investigate cu scopul de a îndepărta selectiv butanolul

70
din fermentaţia aceto-butanolo-etanolică. În figura 34 este prezentată o diagramă
schematică prezentând recuperarea in-situ a butanolului utilizând striparea cu gaze:

Figura 34. Bioreactor pentru fermentaţie şi stripare in-situ

Striparea cu gaze a butanolului, sau a oricărui alt compus organic dintr-o soluţie
apoasă poate fi modelată ca un proces de ordinul 1 cu utilizarea următoarei ecuaţii:
dC s
Rs   K s aC s
dt
Conform acestei ecuaţii viteza gazului de stripare creşte proporţional cu
concentraţia compusului în faza apoasă, Cs, cât şi cu constanta vitezei de stripare a
gazului, ksa. Pentru cazul în care butanolul este produsul îndepărtat prin stripare, dar şi
compusul cu acţiune inhibitorie asupra microorganismului producător, această
dependenţă are efecte pozitive. În sistemul în care îndepărtarea butanolului din lichidul
de fermentaţie se realizează simultan cu producerea lui modificarea concentraţiei
acestui produs este dată de următoarea ecuaţie:
dC s
  Rs  R p  K s aC s  R p
dt
În regim staţionar (dCs/dt =0) se obţine următoarea ecuaţie:
Rs = Rp = KsaCs,
în care Rs – viteza de îndepărtare a butanolului din faza apoasă în faza gazoasă, g/l h
Rp – viteza de producere a butanolului, g/l h
Această ecuaţie indică faptul că odată cu creşterea constantei vitezei de stripare,
microorganismele C. beijerinckii BA101 vor fi supuse unei concentraţii inhibitorie a
solventului mai mică pentru orice viteză de producere a acestuia.
Pentru corelarea vitezei de circulaţie a gazului, Q cu constanta vitezei de stripare
s-a utilizat următoarea ecuaţie:

71
 V
Ksa  b( Hc ) m
Q
în care: b, m – constante
Hc – constanta Henry
V – volumul de lichid din bioreactor, cm3
Acţionând asupra vitezei de circulaţie a gazului se poate modifica valoarea K sa.
Datele experimentale au evidenţiat următoarele:
- utilizarea unei viteze de circulaţie a gazului egală cu 80 cm 3/s şi o
constantă a vitezei de stripare egală cu 0,058 h-1 sunt suficiente pentru
menţinerea concentraţiei butanolului sub valoarea inhibitorie pentru
un bireactor de 2 l, cu volumul util de 1 l;
- o mărime a bulelor mai mică decât 0,5 şi 0,5-5,0 mm nu prezintă nici
un efect asupra vitezei de stripare a butanolului;
- utilizarea unui barbotor duce la formarea unei cantităţi ridicate de bule
de dimensiuni mici, care determină acumularea de spumă în
bioreactor, necesitând adăugarea unui agent antispumant;
- productivităţile procesului au fost 0,47, corespunzătoare utilizării
agitatorului pentru obţinerea bulelor cu dimensiuni mari şi 0,25 g/l h
pentru utilizarea barbotorului, şi obţinerea unor bule de dimensiuni
reduse;
- prezenţa acetonei şi a etanolului nu are nici un efect asupra vitezei de
îndepărtare a butanolului;
- se recomandă utilizarea unor bule de azot cu un diametru cuprins între
0,5 şi 5 mm (produse de agitator), pentru a oferi un bun transfer masic
şi de asemenea de a evita problemele asociate acumulării unei cantităţi
mari de spumă [70].
Separarea butanolului prin striparea cu gaze poate fi realizată şi ex-situ, într-un
utilaj exterior bioreactorului, ca în figura 35. Fermentatorul are un volum de 2 litri,
lichidele de fermentaţie au fost trecute peste o coloană de stripare, alimentarea
realizându-se pe la partea superioară a coloanei, gazul utilizat pentru stripare, azotul,
fiind introdus pe la baza coloanei utilizând un compresor. Vaporii de apă şi etanol au
fost condensaţi într-un condensator, la -5C. Viteza de circulaţie a gazului a fost de 10
l/min iar a lichidului de fermentaţie de 0,3 l/h.

72
 Figura 35. Instalaţia pentru separarea butanolului ex-situ

Rezultatele experimentale au evidenţiat faptul că reducerea inhibiţiei de produs

prin separarea directă a butanolului a condus la o creştere a conversiei substratului.
Concentraţia biomasei a crescut până la 5-6 kg/m 3 în timp ce cantitatea de butanol
separată a fost de 1 kg/m 3 h, faţă de 0,36 kg/ m 3 h în cazul unei fermentaţii
convenţionale [71].
Mollah ş.a. (1993) au separat butanolul prin stripare cu gaze, în cazul fermentaţiei
acetono-butanol-etanolică utilizând ca microorganism: Clostridium acetobutylicum. Un
amestec de gaze: azot, hidrogen şi dioxid de carbon a fost utilizat cu succes pentru
menţinerea concentraţiei butanolului sub nivelul toxic: 5 g/l [1].

Şi în cazul fermentaţiei etanolice una dintre propunerile pentru îmbunătăţirea

productivităţii constă în recircularea conţinutului fermentatorului printr-o coloană de
stripare care să îndepărteze etanolul. Prin îndepărtarea alcoolului în timp ce acesta se
formează concentraţia lui este păstrată la nivel sub valoarea inhibitorie, făcând posibilă
conversii mai mari şi utilizarea unor soluţii de substrat mai concentrate, care determină
creşterea concentraţiei celulelor şi implicit a productivităţii în fermentator. Taylor s.a.
(1996) a studiat separarea etanolului prin stripare într-o instalaţie la nivel pilot, care
implică următoarele elemente principale: un bioreactor, cu o capacitate de 14 l, coloana
de stripare, condensator, prezentată în figura:

73
 Figura 36. Instalaţia pentru separarea directă a etanolului

Mediul de cultură a conţinut o soluţie de glucoză de concentraţie 600 g/l, săruri de

calciu şi magneziu. Experimentele s-au realizat pe o durată de 215 zile, în 5 serii
succesive de experimente. Gazul utilizat pentru stripare a fost CO 2, productivitatea în
fermentator a fost de 15,8 g/l h, iar producţia de condensat (amestecul de apă şi etanol
este trecut din fermentator în coloana de stripare, iar apoi într-un schimbător de căldură
pentru condensare), a ajuns la 10 l/zi. Însă performanţa sistemului a fost afectată de
formarea unor floculi din celulele de drojdie, care au blocat coloana de stripare,
micşorând fluxul de gaz prin coloană. Performanţa sistemului a putut fi restabilită prin
îndepărtarea acestor acumulări de celule şi curăţarea acesteia [72].
Taylor (1997) a studiat efectul concentraţiei etanolului şi a temperaturii gazului de
stripare asupra vitezei fermentaţiei continue. Rezultatele experimentale au demonstrat
că stabilitatea procesului poate fi menţinută pentru cel puţin 100 de zile. Productivitatea
acestui proces este de aproximativ zece ori mai mare decât cea din cazul unei
fermentaţii discontinue convenţionale. Şi producţia de etanol, 0,51 g alcool/g glucoză
consumată este mai mare decât valoarea corespunzătoare unui sistem convenţional.
Efectul concentraţiei etanolului, al concentraţiei glucozei şi a temperaturii asupra
vitezei de creştere a celulelor de Saccharomyces cerevisiae este descris de următoarea
ecuaţie matematică:

 S  P  T  35 
  0.233 1  1  
 0.28  S  76.0  8.04 

pentru 0 < P < 76.0 şi 35 < T < 43.04

în care:  - viteza de creştere a biomasei

74
P – concentraţia produsului - etanolului, g/l
S – concentraţia substratului – glucozei, g/l
T – temperatura gazului care părăseşte vârful coloanei de stripare, C [73]

75
 VI. Separarea directă a produselor de biosinteză prin adsorbţie

Selectarea unei tehnici pentru îndepărtarea anumitor produse dintr-un mediu

complex depinde, în principal de proprietăţile fizico-chimice care îl deosebesc de alte
componente ale lichidului de fermentaţie. În cazul în care aceste diferenţe sunt
distinctive se pot aplica tehnici de recuperare in-situ ca: extracţie, pertracţie,
pervaporizare. Însă, pentru îndepărtarea unor compuşi, din lichidele de fermentaţie cu
caracteristici foarte apropiate de ale altor compuşi din mediu, necesită o mai mare
specificitate, ca de exemplu, prin formarea unor legături chimice, a unor baze Schiff,
sau prin recunoaştere biologică. Această abordare poate fi în mod particular atractivă
când produsul îndepărtat este imobilizat prin adsorbţie specifică, prin legarea chimică
cu polimeri insolubili în apă.
Adsorbţia este o tehnică adecvată capturării atât a unor molecule cu greutate
moleculară mare cât şi cu greutate moleculară mică. Însă, o problemă majoră constă în
impurificarea adsorbentului prin legături nespecifice cu celule sau fragmente celulare,
rezultatul fiind o scădere a capacităţii de adsorbţie a răşinii şi, de asemenea agregarea
particulelor de suport.
Există mai mulţi factori care trebuie luaţi în considerare în alegerea unui adsorbant
utilizat pentru separarea directă:
- cantitatea de compus cu acţiune inhibitorie care trebuie adsorbit,
- existenţa unor compuşi, în mediul de bioconversie, cu acţiune
competitivă
- posibilitatea adsorbţiei unor precursori utilizaţi în proces,
- posibilitatea adsorbţiei unor nutrienţi,
- posibilitatea adsorbţiei celulelor
- capacitatea de a prelucra lichide de fermentaţie,
- compatibilitatea cu celulele producătoare
- posibilitatea recirculării.
Adsorbţia a fost utilizată ca metodă de separare directă, ex-situ pentru următorii
produşi:
 acid lactic
 aromei: γ-decalactonă
 antibiotice: tienamicină
 butanol, acetonă

76
 Senthuran (2004) a studiat separarea acidului lactic într-un proces de bioconversie
extractivă cuplată cu adsorbţia pe schimbători de ioni. Datorită unor dificultăţi specifice
utilizării adsorbanţilor de acest tip, în ceea ce priveşte denaturarea datorită legării
adsorbantului prin legături nespecifice de resturi celulare sau chiar de celule, s-a
încercat acoperirea schimbătorilor de ioni cu un strat subţire de polimer pentru
reducerea adsorbţiei celulelor la separarea directă.
Experimentele s-au realizat în regim discontinuu, bioreactorul fiind cuplat cu o
coloană cu schimbători de ioni, lichidele de fermentaţie fiind recirculate după separarea
acidului lactic prin adsorbţie, pentru utilizarea completă a substratului. Instalaţia
experimentală este prezentată în figura 37:

Figura 37. Instalaţia experimentală pentru bioconversia extractivă a acidului lactic

Coloana cu adsorbanţi este conectată şi cu un reactor de condiţionare, pentru

omogenizarea lichidelor de fermentaţie epuizate cu cele proaspete aduse din bioreactor.
Prin acoperirea adsorbantului cu un strat subţire al unui polimer neutru, celulele
microbiene ar trebui să fie împiedicate steric să ajungă la suprafaţa acestuia, în timp ce
moleculele mici pot trece prin acest strat fiind apoi adsorbite de matrice. Când lichidele

77
de fermentaţie conţinând 84 g/l acid lactic au fost trecute peste o coloană cu Amberlite
IRA 400 neprelucrată prin acoperirea granulelor de răşină, capacitatea de adsorbţie a
acesteia a fost de 76 g/l. La utilizarea răşinii acoperită cu agaroză s-a observat o scădere
a capacităţii la 72 g/l, însă această valoare a rămas neschimbată după mult mai multe
utilizări comparativ cu răşinile neacoperite, după cum se observă din figura:

Figura 38. Reprezentarea capacităţii de adsorbţie funcţie de cicluri de utilizare

pentru Amberlite LA-400, acoperite cu agaroză (o) şi neacoperite (●) la separarea
acidului lactic

Fermentaţia s-a realizat utilizând tulpini de Lactobacillus casei, imobilizate pe un

suport poros. Lichidele de fermentaţie sunt trecute prin coloana cu adsorbant, acidul
lactic se leagă de aceştia, având loc simultan şi eliberarea unei grupări hidroxil care
menţine pH-ul la valoarea optima, proces diferit faţă de fermentaţia convenţională, în
care modificarea pH-ului este necesar să se realizeze cu o soluţie de hidroxid de
amoniu. S-a obţinut o utilizare completă a substratului şi într-un timp mai scurt decât în
cazul fermentaţiei convenţionale. Cantitatea de acid lactic eluat de pe coloană a fost
echivalent cu 45,8 g/l, iar productivitatea a fost 4,1 g/l h, faţă de 3,0 g/l h, în cazul
fermentaţiei discontinue cu recirculare [74].
A fost studiată şi separarea directă a butanolului, utilizând patru adsorbanţi pentru
care valorile adsorbţiei sunt prezentate în tabelul 12. După cum se observă capacitatea
de adsorbţie a acestora a fost cuprinsă între 55 şi 83 mg butanol/g adsorbant. Amberlite
XAD-4, o răşină polistirenică hidrofobă, şi Bonopore, un copolimer divinil-
benzenstiren, au prezentat cele mai mari capacităţi de legare a butanolului. Pentru
testarea capacităţii de adsorbţie în cazul apariţiei unor fenomene competitive s-au
efectuat măsurători şi în prezenţa unor compuşi din lichidul de fermentaţie. Rezultatele
au fost mai mici în al doilea caz, probabil datorită unei concentraţii mai mari a

78
butanolului în lichidele de fermentaţie, a prezenţei unor acizi: acizii acetic şi butiric în
lichide capabili să reacţioneze cu adsorbanţii.

Tabel 12. Cantitatea de butanol adsorbită din soluţii apoase (2%), şi lichide de
fermentaţie (4%)
Adsorbant mg butanol/g adsorbant mg butanol/g adsorbant
Amberlite XAD-7 69 22
Amberlite XAD-4 83 27
Bonopore 74 23
Bonopore nitrat 55 13

În figura 39 este reprezentată modificarea concentraţiei butanolului în timp. Se

observă o creştere puternică a concentraţiei după 125 de ore, în cazul fermentaţiei
discontinue fără separare directă la valori mult mai mari decât concentraţia inhibitorie
(2%). În cazul utilizării adsorbţiei s-a reuşit menţinerea pe tot parcursul fermentaţiei,
200 h, sub valori inhibitorii şi un consum complet al substratului [75].

Figura 39. Concentraţiile butanolului în funcţie de timp.

Separarea directă prin adsorbţie a antibioticului tinamicina, un antibiotic β-

lactamic cu spectru larg de acţiune, obţinut în procesul de fermentaţie utilizând celule
de Streptomyces cattleya. Adsorbanţii utilizaţi au fost: β-lactamaza imobilizată pe un
suport Sepharose (cyanogen bromide), celule întregi de Bacillus stearothermophilus, o
bacterie termofilă în ultima etapă de creştere şi o răşină XAD-2. În tabelul 13 este
prezentată capacitatea de adsorbţie a acestora. Se observă că adsorbentul cu cea mai
mare capacitate de adsorbţie sunt celulele de Bacillus stearothermophilus.

79
 Tabelul 13. Capacitatea de adsorbţie a adsorbanţilor utilizaţi pentru separarea
tienamicinei
Tipul adsorbantului Concentraţia la echilibru, Capacitatea de adsorbţie,
g/ml mg antibiotic/ g adsorbent
XAD-2 40-100 0,1-0,8
β – lactamază 10-50 2-8
imobilizată
Celule de Bacillus 40-90 40-95
stearothermophilus

În timpul biosintezei, după aproximativ 84 ore în lichidul de fermentaţie s-au

adăugat celulele de bioadsorbant, în cantitate de 3,6 g/l. Rezultatele experimentale sunt
prezentate în figura 40. Se observă o scădere imediată după adăugarea celulelor de
Bacillus stearothermophilus, iar biosinteza antibioticului a continuat până la atingerea
unui maxim cu o valoare mai mare decât în cazul unei fermentaţii convenţionale,
considerat de referinţă. Este posibilă astfel, prin îndepărtarea specifică a tinamicinei din
lichidele de fermentaţie, mărirea duratei de biosinteză. Din figură se notează faptul că la
sfârşitul celor 144 de ore de fermentaţie, s-a biosintetizat aproximativ de două ori mai
mult antibiotic faţă de sistemul de referinţă [76].

Figura 40. Influenţa duratei procesului asupra concentraţiei antibioticului la

separarea directă a tinamicinei

80
 VII. Separarea directă a produşilor de biosinteză prin sisteme bifazice
apoase

Obţinerea sistemelor eterogene apoase, ATPS are la bază incompatibilitatea

mutuală a doi polimeri sau a unui polimer şi a unei sări într-o soluţie apoasă. În
domeniul concentraţiilor reduse ale polimerilor în soluţia apoasă, sistemul este omogen.
Raportul concentraţiilor celor doi polimeri la care se produce separarea fazelor este
strict determinat, fiind măsurabil prin metode turbidimetrice. Compoziţia unui astfel de
sistem depinde de:
- greutatea moleculară a polimerilor,
- concentraţia polimerilor,
- pH
- temperatură
- concentraţia şi tipul sărurilor dizolvate în mediu.
Valorile concentraţiilor la care sistemul devine eterogen depinde de masa
moleculară a polimerilor, scăzând cu creşterea acesteia.
Sistemele bifazice apoase pot fi obţinute, după cum s-a menţionat mai sus şi prin
amestecarea, în anumite proporţii, a polimerilor cu electroliţi, acestea fiind uneori mai
performante comparativ cu sistemele care conţin numai polimeri. Cei mai utilizaţi
polimeri pentru aceste sisteme au fost: dextran cu greutate moleculară mare şi PEG
(polietilenglicol), datorită structurii lor chimice şi a proprietăţilor fizice. Dextranul nu
este toxic şi are un efect de stabilizare asupra celulelor microbiene, acestea putând
creşte şi rămâne viabile un timp mai lung, ceea ce conduce la o producţie mai mare.
Utilizarea unor sisteme bifazice apoase constituite din doi polimeri, ca sisteme de
extracţie într-un proces de fermentaţie oferă o biocompatibilitate superioară faţă de
sistemele bifazice: fază apoasă – fază organică. Distribuţia inegală a celulelor într-un
sistem bifazic apos permite îndepărtarea produsului din faza superioară fără operaţia de
îndepărtare a biomasei.
A fost studiată separarea directă utilizând un sistem bifazic apos a următorilor
compuşi:
 antibiotice: subtilin.
 acizi organici: acid lactic
 alcooli: 2,3-butandiol
 enzime : celulaza, -glucozidazei, -amilază, protează
În tabelul 14 sunt prezentate rezultatele obţinute pentru cele mai importante
biomolecule separate prin fermentaţie extractivă cu sistem bifazic apos:

81
 Tabel 14. Fermentaţia extractivă a unor compuşi organici utilizând ATPS [76]
Produs Microorganism Compoziţia Coeficient de Distribuţia Producţia Mod de
sistemului, % distribuţie a celulelor funcţionare
produsului
Butanol Clostridium 10 PEG8000 1,3 Faza 37% Discontinuu
acetobutylicum 5 dextran T500 inferioară
Etanol Saccharomyces 6 PEG6000 - Faza 90% Semi-
cerevisiae 2 dextranT500 inferioară continuu
Proteine E. coli 9 PEG4000 0,84 Faza 0,18 Semi-
9 dextran inferioară mg/ml continuu
Acid Lactobacillus 5 PEI 1,1 Faza 0,81 g/g Continuu
lactic lactis 1,3 HEC infperioară 0,95 g/g Discontinuu
Lactobacillus 7,8 PEG20,000 - - 77 g/l Discontinuu
Casei 2,6 dextran
Lactobacillus 5,5 EO-PO - Ambele 46,5 g/l Continuu
lactis 12 HPS100
Subtilin Bacillus subtilis 20 PEG 35000 10 Faza 13,1 U/ml Discontinuu
5,5 KOH inferioară
Surfactin Bacillus subtilis 5,6 PEG6000 1,8 Faza - Discontinuu
10,2 dextran inferioară
Toxin Clostridium 12 PEG 4000 - Ambele - Continuu
tetani 5 dextran D48

Producţia de subtilin utilizând ca microorganism producător tulpini de Bacillus

subtilis a fost studiată într-un sistem bifazic apos constituit din: 20% PEG şi 5,5% fosfat
de potasiu. Deşi cantitatea de antibiotic obţinută în sistemul bifazic este de 60% faţă de
cea din fermentaţia convenţională realizată într-o singură fază, s-a recuperat un maxim
de 13,1 U/ml, din faza superioară faţă de 8,2 U/ml dintr-un mediu cu o compoziţie
scăzută în săruri. Aceasta deoarece antibioticul are un coeficient de distribuţie mai mare
în faza superioară în contrast cu celulele care se distribuie cu precădere în faza
inferioară [77].
Pentru a creşte productivitatea în acid lactic şi a reduce inhibiţia de produs în
cazul fermentaţiei, s-au studiat vitezele de creştere şi coeficienţii de distribuţie pentru
tulpini de Lactobacillus lactis şi Lactobacillus delbrueckii utilizând următorul sistem
bifazic apos: etilenoxid-propilenoxid (EO-PO) şi hidroxipropilamidon (HPS).
Utilizând acest sistem concentraţia de acid lactic a crescut la realizarea succesivă a
cinci experimente, de fiecare dată fiind înlocuită faza polimerului. După al treilea
experiment s-a adăugat o cantitate mai mare de substrat, glucoză. În tabelul 15 sunt

82
 prezentate valorile comparative ale producţiei de acid lactic într-un mediu de cultură
într-un proces de fermentaţie discontinuu, considerat de referinţă, în sistemul ATPS
discontinuu şi în cazul celor cinci experimente de fermentaţie extractivă.

Tabel 15. Valori experimentale la separarea acidului lactic prin ATPS

Parametri P discontinuu Fermentaţie extractivă
referinţa ATPS 1 2 3 4 5 total Primele 3
cumulat
Acid lactic 38 35,9 27,8 40,6 45,0 46,0 48,1 48,1 45,00
YP/S 0,74 0,68 0,52 0,64 1,01 0,38 0,56 0,86 1,00
PS/P 2,5 2,4 4,5 3,1 3,0 2,8 0,8 1,8 3,0
PP/S 8,4 6,6 6,6 4,9
pHI 6,8 6,8 6,7 5,9 5,5 5,5 5,4
Acid lactic 5,5 3,5 1,1 21,8 27,3 29,3 28,6
iniţial
YP/S - producţia
PP/S – productivitatea sistemului după primele patru ore
PS/P – productivitatea globală a sistemului

După cum se observă, la utilizarea sistemului bifazic apos pentru extracţia in-situ,
concentraţia acidului lactic a crescut după fiecare şarjă, iar celulele şi-au păstrat
viabilitatea pentru întreaga perioadă de fermentaţie. Producţia a crescut de la 0,74 moli
de acid lactic/mol de glucoză adăugată la 1 mol de acid lactic/mol de glucoză în cazul
fermentaţiei extractive, productivitatea variind de la 2,5 mM/h la 3,0 mM/h. Viteza de
producere a acidului a fost de 8,4 mM/h faţă de 6,6 mM/h în fermentaţia convenţională
discontinuă. Pe de altă parte la valori ale creşterii de de 10 8 cfu/ml acidul lactic a fost
biosintetizat şi la concentraţii foarte mici ale glucozei. Acest fapt a evidenţiat
posibilitatea operării la concentraţii scăzute ale substratului, modificând volumele celor
două faze pentru a se obţine o productivitate volumetrică ridicată fără a afecta producţia
[78].
Acidul lactic a fost separat din lichidele de fermentaţie a microorganismelor:
Lactococcus lactis, utilizând următorul amestec de polimeri: 3% PEI (polietilenimină)
şi 0,75% HEC (hidroxietilceluloză). Creşterea celulară şi producţia de acid lactic au fost
maxime pentru o concentraţie iniţială a glucozei de 20 g/l, fiind de aproximativ 2,4 ori
mai mare decât cea obţinută în sistem monofazic, deşi s-a observat o prelungire a fazei
lag din ciclul de dezvoltare a microorganismelor. Distribuţia celulelor s-a realizat cu
precădere în faza superioară: HEC, în timp ce acidul lactic s-a deplasat în faza

83
inferioară bogată în PEI. O creştere de 15% în producţia de acid lactic a fost obţinută
prin creşterea concentraţiei iniţiale a glucozei la 50 g/l şi prin triplarea cantităţii de
fosfat. După realizarea a cinci experimente consecutive s-a observat o modificare cu
1,27 ori mai mare în concentraţia acidului faţă de cazul unei fermentaţii convenţionale
[77].
Katzbauer (1995) a utilizat ATPS constituit din dextran şi PEG pentru separarea
acidului lactic în sistem continuu şi discontinuu din lichidele de fermentaţie ale
microorganismelor Lactobacillus casei. În fermentaţia discontinuă s-a obţinut o
producţie a acidului lactic de 0,9 (g glucoză iniţială/g acid lactic produs) valoare
similară cu cea dintr-un proces de fermentaţie convenţional. În sistemul continuu viteza
de diluţie a fost 0,09 l/h pentru un raport de recirculare de egal cu 1. Cantitatea maximă
de celule a fost egală cu 9 g/l s.u., concentraţia acidului lactic de 46,2 g/l şi
productivitatea de 4,2 g/l h. În acelaşi sistem, însă la o valoarea a vitezei de diluţie de
0,3 s-au obţinut: o cantitate de celule de 2,4 g/l s.u., o concentraţie de 17 g/l acid lactic
şi o productivitate de 5,1 g/l h [79].

Procesul de obţinere a 2,3-butandiolului de către Klebsiella oxytoca are

dezavantajul reutilizării produsului de către microorganisme. Producţia alcoolului s-a
observat a fi mai mare în condiţii aerobe, în special la utilizarea unor concentraţii mari
de substrat (zaharuri cu 5 atomi de carbon). Cunoştinţele privind limitarea
combustibililor fosili convenţionali, a gazului natural a determinat cercetări pentru noi
surse de energie. 2,3-butandiolul este o materie primă valoroasă, având o capacitate
calorică de 27.200 kJ/kg, comparabilă cu a etanolului sau a metanolului. Valoarea
ridicată a cifrei octanice permite utilizarea acestuia ca şi combustibil în aviaţie.
Gosh s.a. (2003) au studiat utilizarea unui sistem bifazic apos utilizând 9,2 % PEG
6000 şi 8% dextran 40.000 ca faze formatoare de polimeri. Utilizând o metodă de
optimizare statistică au stabilit condiţiile optime de realizarea a fermentaţiei extractive
în sistem bifazic apos. Cum cei doi polimeri care determină formarea celor două faze
apoase sunt substanţe organice s-a studiat dacă celulele pot utiliza polimerii ca un
substitut al substratului. Rezultatele: absenţa creşterii celulare chiar şi după 72 h în
mediu cu PEG sau dextran au evidenţiat imposibilitatea utilizării celor doi polimeri de
către microorganisme. Deoarece trei variabile influenţează combinat procesul:
temperatura, pH-ul, agitarea este impropriu un studiu individual al efectelor celor trei
parametri consideraţi. Condiţiile optime au fost stabilite utilizând următoarea ecuaţie de
regresie:

84
Y  0.715077  0.039105x1  0.019072x2  0.014448x3  0.131008x12  0.056780x22 
 0.044426x23  0.006250x1 x 2  0.00125x1 x 3  0.018750x2 x 3

în care x1 – valoarea codată pentru temperatură

x2 – valoarea codată pentru pH
x3 – valoarea codată pentru agitare
Y – productivitatea maximă pentru 2,3-butandiol
Temperatura optimă pentru biosinteză este cuprinsă între 30-37C, în sisteme de
fermentaţie convenţionale, cu valoarea pentru producerea diolului pe substrat de
glucoză şi sucroză de 34C, respectiv 35-37C, în timp ce valoarea optimă pentru pH
este de 5,2 pentru microorganismul Klebsiella oxytoca.

Figura 41. Efectul variabilelor considerate asupra productivităţii

Figura 41 demonstrează că fiecare parametru considerat: temperatura, pH, agitare

are o influenţă individuală asupra productivităţii. Productivitatea maximă obţinută a fost
de 0,74 kg/m3 h. În cazul fermentaţiei extractive, producţia de butandiol nu a fost
puternic influenţată în domeniul 4,4 şi 5,8, dar s-a observat un maxim între valorile de
pH de 5,2 şi 5,6. Peste 6 valoarea productivităţii a scăzut mult. Pentru agitare maximul
s-a observat la 176 rpm, o valoare mai mare decât în cazul fermentaţiei convenţionale,

85
de 160 rpm. Această diferenţă a fost explicată prin faptul că celulele, în sistemul ATPS
rămân ataşate de dextran în faza superioară, acesta fiind un polimer cu lanţ lung creşte
vâscozitatea mediului determinând rezistenţe suplimentare la transport, în special cel al
gazelor. Se observă că valoarea medie a acesteia variază într-un domeniu larg pentru
temperaturi cuprinse între 20 şi 40C, fapt ce nu a fost observat şi faţă de ceilalţi
parametri consideraţi. Această observaţie indică faptul că menţinerea pH-ului şi a
agitării la nivelul optim cu modificarea temperaturii afectează procesul într-o manieră
mai severă [80].

Sistemele bifazice apoase au fost utilizate şi pentru producţia şi recuperarea in-situ

a câtorva enzime din lichidele de fermentaţie, prelucrate pentru îndepărtarea celulelor,
enzime care pot fi utilizate direct ca biocatalizatori, fiind recuperate chiar în forma
nativă. În tabelul 16 sunt prezentate principalele enzime separate prin sistem bifazic
apos şi polimerii utilizaţi.
Studii extinse asupra producerii celulazei de către Trichoderma reesei au fost
realizate utilizând ca sistem de polimeri: PEG şi dextran. Concentraţia maximă a
enzimei de 1,2 U/ml s-a obţinut pentru o compoziţie de 5% PEG 8000 şi 7% dextran.
Compoziţia mediului şi celuloza au fost adăugate intermitent în timp ce o parte a
acestui sistem a fost eliminată la intervale de timp prestabilite. S-a obţinut o activitate a
enzimei de 2,2 FPU/ml, în faza superioară, când compoziţia mediului a fost adăugată la
fiecare 24 de ore, iar celuloza la 72 de ore. În condiţii similare enzima care degradează
celuloza a fost obţinută cu o activitate maximă de 4,8 FPT/ml în faza superioară,
producţia fiind de 148 FPU/ g celulază, când extracţia a început după 120 ore, şi s-a
repetat la fiecare 72 ore [81]. S-a obţinut celulază şi în sistem semi-continuu, utilizând
următorul sistem de polimeri: 5% PEG 8000 şi 7% dextran T500, obţinându-se o
producţie maximă de 3,920 U/g celuloză.
Studii privind producerea -glucozidazei de Aspergilius phoenicis au arătat o
creştere în producţia enzimei cu 32,5% într-un sistem ATPS utilizând 9,5% PEG şi
7,5% dextran.
Fermentaţia extractivă a chitinazei utilizând ca microorganism, tulpini de Seratia
marcensis a fost realizată într-un ATPS cu o compoziţie de 2% PEG 20000 şi 5%
dextran T500. Pentru cultivarea discontinuă activitatea enzimelor a fost de 3,1 ori mai
mare decât în cazul unui mediu de cultură convenţional. În cazul unei fermentaţii
discontinuă după repetarea a trei cicluri a câte 48 de ore, productivităţile au fost de
0,96; 1,71 şi 2,67 U/ml, comparativ cu 0,49 U/ml în cazul unei biosinteze fără separare.
[82].

86
 Tabel 16. Enzime separate prin ATPS
Produs Microorganism Compoziţia Coef. de Distribuţia Producţia Mod de
sistemului, % distribuţie a celulelor funcţionare
produsului
Protează Bacillus 13PEG 4000 4,976 Faza 3600- Discontinuu
alcalină thuringiensis 13,75 K2PO3 inferioară 4000
U/ml
Bacillus 5 PEG 6000 0,965 Faza 3000 Şarje
licheniformis 5 dextran T500 inferioară, U/ml repetate
interfaţă
-amilază Bacillus 9 PEG 3350 0,62 Faza 95% Discontinuu
amyloliquefacien 2 dextran T500 inferioară
s
8 PEG 600 0,77 Faza
5 PEG 3350 inferioară
2 dextran T500
Bacillus 10 PEG6000 1,25 Faza 97,4% Şarje
licheniformis 3 dextran D500 inferioară repetate
Bacillus subtilis 10 PEG6000 1,25 Faza 6,6 U/ml Şarje
3 dextran D500 inferioară repetate
8 PEG 600 0,5 Faza 91% Şarje
5 PEG 3350 inferioară repetate
2 dextran T500
Chitinaza Serratia 2 PEG 20.000 0,92 Faza 157,7 Semi-
marcesens 5 dextran T500 superioară U/ml continuu
Endo -D- Trichoderma 5 PEG 8000 1,41 Faza 3,920 Şarje
glucanaza reesei C30 7 dextran T500 inferioară U/g repetate
celuloză
- E. coli ML308 9 PEG 6000 10,3 Faza 4,26 Discontinuu
galactozidaz 9 fosfat inferioară U/mg
a celulă
- Aspergilius 4 PEG 8000 1,8 Faza 3,4 U/ml Discontinuu
glucozidaza phoenicis QM 8 polivinil inferioară
329 alcool 14000

Fermentaţiile cu sisteme bifazice apoase pot fi exploatate pentru a se reuşi

procesarea unui volum mare de substanţe cu pierderi scăzute, într-o instalaţie compactă,
care necesită mai puţine investiţii în termeni de infrastructură şi costuri mai mici în
procesare şi manipulare, decât procesele convenţionale. Deoarece sunt relativ simple de

87
transpus la o scară superioară de operare, rezultatele experimentale de laborator pot fi
utilizate pentru transpunere la scară industrială. Însă, costul dextranului limitează
aplicaţiile procesului la scară largă. Există posibilitatea utilizării unor polimeri netoxici,
ieftini, ca de exemplu: derivaţi de amidon sau celuloză cu bune caracteristici de formare
a fazelor. Recuperarea acestor polimeri: PEG este posibilă prin utilizarea unor
membrane specifice de ultrafiltrare, pentru o ulterioară recirculare [77].

VIII. Separarea directă a produselor de biosinteză prin cristalizare

Cristalizarea ca tehnică de îndepărtare in-situ a produselor de biosinteză a fost

destul de puţin studiată în procesele biotehnologice care utilizează celule întregi, deşi

88
cele mai multe produse biochimice obţinute prin fermentaţie sau biotransformare sunt
solide la temperatura camerei şi a căror separare şi purificare presupune o etapă de
cristalizare sau precipitare, în cele mai multe cazuri. Uneori, are loc cristalizarea în
reactor atunci când concentraţia produsului depăşeşte limita de solubilitate în timpul
unei reacţii. Cele mai importante exemple relevante la nivel industrial care însă nu
realizează o recuperare in-situ propriu-zisă, produsul final necesitând o ulterioară
redizolvare pentru purificare, includ biosinteza:
- riboflavinei
- triptofanului
- tetraciclinei
- oxitetraciclinei
- precursori de diltiazem
Doar în cazul riboflavinei şi a 6-R-dihidro-oxoizoforonei cristalele au putut fi
separate de microorganisme prin filtrare. Aplicarea cristalizării pentru separarea directă
se pretează în special pentru utilizarea unui dispozitiv extern bioreactorului, deci pentru
separarea ex-situ. S-au utilizat astfel de sisteme pentru obţinerea:
- acid malic utilizând -malează imobilizată pe celule de
Brevibacterium flavum,
- -alanină obţinută utilizând L-aspartat-β-decarboxilază imobilizată pe
celule de Pseudomonas dacunhae
- gluconat de calciu utilizând glucoz-oxidaze imobilizate
Tabuada (2004) a utilizat o buclă externă de cristalizare pentru separarea ex-situ
pentru următoarea transformare enzimatică, utilizând ca biocatalizatori tulpini de
Saccharomyces cerevisiae:

4-oxo-izoforona(OIP) 6-R-dihidro-oxoizoforonă(DOIP) actinol

Compusul 6-R-dihidro-oxoizoforona este un intermediar important în sinteza

carotenoizilor, în producţia de arome şi tabac. Această reacţie de transformare
enzimatică este afectată de inhibiţia de substrat, în plus 6-R-dihidro-oxoizoforona se
degradează în mediu la un compus: actinol, sub acţiunea aceloraşi microorganisme.
Solubilitatea 4-oxoizoforonei în apă este până la 98,7 mM  15 g/L la 30oC, în
timp ce 6-R–dihidrooxoizoforona are o solubilitate mai mică, rezultă 64,9 mM  10
g/L în acest fel menţinându-se concentraţia OIP sub această valoare în bioreactor

89
permiţându-se rămânerea in soluţie şi la 5 oC numai şi DOIP va cristaliza. În timpul
experimentelor nu s-au observat nici o variaţie in concentraţia biomasei.
Instalaţia experimentală este prezentată in figura:

Figura 42. Instalaţia experimentală pentru separarea ex-situ prin cristalizare

Fermentatorul a fost cuplat cu un cristalizator, iar celulele au fost reţinute în

bioreactor prin inserarea unei membrane de ultrafiltrare într-o buclă externă între cele
două utilaje. Amestecul fără cristale din cristalizator a fost recirculat printr-un filtru.

Tabel 17. Valori comparative pentru fermentaţia DOIP

Parametri S discontinuu S semi-continuu Sistem integrat
Producţie DOIP/OIP 85 68 85
Selectivitate DOIP/DOIP+ACT 87 92 96
Concentraţia finală produs 57,9 145,1 301,8
Consum de biocatalizator 3,52 0,89 0,67
Productivitate volumetrică 0,2 0,15 0,30

Degradarea produsului a fost indicată de prezenţa actinolului în reactor, dar a atins

doar un maxim de 8 mmoli, aproximativ 1,25 g fiind doar 4% din cantitatea totală de
OIP, fiind produs prin transformarea a doar 4,7% din cantitatea totală de DOIP.
Producţia finală în produs util, 6-R–dihidrooxoizoforona, a fost de 85% comparabilă cu
valoarea din procesele discontinue, însă, selectivitatea a fost de 96% mult mai mare
decât în cazul unor fermentaţii semi-continue şi discontinue, conform tabelului 17.
Productivitatea volumetrică a crescut cu aproximativ 50% faţă de sistemul
discontinuu şi semi-continuu. Consumul de biocatalizator / kg de produs a fost
aproximativ de 6 ori mai mic comparativ cu sistemul discontinuu fiind minimizate şi
apele reziduale [83].

90
 S-a studiat separarea prin cristalizare a triptofanului pentru a îmbunătăţi producţia
de L-triprofan prin utilizarea unei tulpini recombinate de E coli. S-a observat că la
acumularea triptofanului în mediul de fermentaţie în concentraţii mai mari de 30 g/l
apare ca produs secundar indolul. Astfel, s-a observat că aminoacidul are peste această
valoare a concentraţiei efect inhibitor asupra microorganismelor biosintetizante,
limitând concentraţia finală care ara putea fi atinsă. Prin adăugarea unor surfactanţi
neionici, în lichidele de fermentaţie s-a redus solubilitatea triptofanului în lichidele de
fermentaţie, determinând cristalizarea acestuia in-situ. În acest mod s-a redus inhibiţia
de produs a triptofan-sintetazei, permiţându-se obţinerea unor concentraţii ale
aminoacidului de 50 g/l [84].

IX. Separarea directă a produselor de biosinteză prin distilare

Un proces de fermentaţie extractivă dezvoltat prin integrarea biosintezei, a

ultrafiltrării şi a distilării oferă simultan: retenţia biomasei, îndepărtarea selectivă a
inhibitorilor din permeat, separarea şi purificarea compuilor: acetonă, butanol, etanol.

91
Inhibiţia de produs în cazul acestor procese de biosinteză constituie, dup[ cum amai fost
mentionat, un dezavantaj major datorită vitezelor de producţie mici, unor volume mari
care trebuie prelucrate şi a costului etapelor de separare.
Minier ş.a. (1990) au utilizat ultrafiltrarea, ca o metodă de reţinere a
microorganismelor pentru atingerea unei densităţi celulare ridicate a culturilor de
Clostridium acetobutylicum. şi ca o barieră selectivă între reacţiile biologice şi
tratamentele ulterioare de separare. Distilarea ultrafiltratului a permis separarea ABE
(acetonă, butanol, etanol) din mediul de cultură. Mai mult, cum a fost demonstrat faptul
că tratamentul termic al ultrafiltrarii ar putea să scadă activitatea autolitică a enzimelor
în lichidele de fermentaţie care determină fenomenul complex de inhibiţie,
experimentele s-au realizat prin expunerea atat la temperatură de distilare mare cat şi
scăzută.
S-au realizat şase experimente succesive la pH = 4,8 pentru 239 h după o inoculare
simplă. Ultrafiltratul lipsit de celule a fost condus continuu într-un schimbător de
căldură reglat la 98oC cu o perioadă de staţionare între 0,1 – 0,8 h şi recirculat în
fermentator după separarea solvenţilor: butanol şi acetonă, prin distilare. Volumul lichid
de fermentaţie şi volumul ultrafiltratului din membrana de UF şi din schimbătorul de
căldură au fost 7,5; 1,5 şi respectiv 1,6. Adăugarea de mediu de cultură concentrat (550
– 770 g/l glucoză) a fost realizată cu scopul de a menţine concentraţia substratului la
aproximativ 70 g/l când ajunge în lichidele de fermentaţie la valori mai mici de 10 g/l.
Au fost realizate cinci astfel de adăugări, determinând şase cicluri discontinue, pentru
primele patru vitezele de diluţie fiind de 0,002 h-1.
Separarea microorganismelor a permis extracţia solvenţilor din ultrafiltrat
prevenind acumularea butanolului în lichidul de fermentaţie în concentraţii inhibitorii,
acesta fiind menţinut la valori mai mici de 5,8 g/l. Acest fapt a condus la o exploatare
prelungită a culturii, a fost transformată o concentraţie de glucoză de 280 g/l în
experimente, cu modificări foarte mici în mediu de cultură, spre deosebire de
fermentaţiile discontinue clasice în care se consumă maxim 80 g/l, valoare ce
corespunde unei concentraţii a butanolului de 14 g/l - valoare inhibitorie.
Productivitatea şi randamentul producţiei a solvenţilor şi a acizilor organici sunt
prezentate în tabelul:

Tabel 18. Rezultate experimentale la separarea ABE prin fermentaţie discontinuă

cuplată cu distilare la presiune normală
Ciclu Perioada, h Productivitatea, Viteza de Producţia,
g/g h producere a g/g

92
 compuşilor, g/ l h
I 0-26 0,61 0,23 0,24
II 26-65,5 0,48 0,065 0,29
III 65,5-112 0,53 0,077 0,28
IV 112-147 0,78 0,11 0,26
V 147-193 0,033 0,005 0,035
VI 193-243 0,031 0,005 0,08

Prima perioadă: ciclurile I-IV prezintă o solventogeneză cu un maxim de

productivitate de 0,78 g/l în timpul celui de-al patrulea ciclu. Randamentul principal în
solvent a fost de 0,26 g ABE/l. Ultimele două cicluri au fost caracterizate de o scădere
rapidă în activitatea culturii şi un salt către biosinteză acizilor, fenomen observat în
fermentaţiile acetono-butirice. Totuşi, rezultatele principale ţin de posibilitatea de a
menţine şi chiar de a reactiva, producţia specifică de solvenţi în timpul procesului.
Acesta a dus la o creştere a productivităţii globale de 41,5 g/l butanol şi 67,9 g/l ABE,
în comparaţie cu volumul total de lichid din instalaţie, în timpul primelor patru cicluri.
Media vitezei de sinteză a culturii a fost de 0,36 g/lh butanol şi 0,59 g/lh ABE în
timpul aceleaşi perioade.
Aceste rezultate au trebuit comparate cu fermentaţiile industriale discontinue, unde
producţia totală de ABE atinge o valoare de 20 g/l, pentru o medie de 0,61g/lh.
Fermentaţia cuplată cu distilarea şi ultrafiltrarea oferă o creştere de 3,4 ori a
producţiei totală de solvent, pentru o viteză globală de producţie practic neschimbată.
În afara acestor date privind fermentaţia, rezultatele performanţei procesului de
separare sunt prezentate în tabelul 19. Compoziţia distilatului recuperat în timpul
primelor patru cicluri ilustrează puritatea şi concentraţia solvenţilor obţinuţi prin acest
procedeu, mai mult, nivelul scăzut de acizi organici estraşi asigură faptul că aceşti
inductori şi substanţe rămase în lichidele de fermentaţie. Distilatul cumulat, compoziţia
totală a acestora corespunde unui grad de extracţie de 92% butanol şi 92% de solvenţi
ABE total produşi în această perioadă.

Tabelul 19. Compoziţia medie a lichidelor de fermentaţie şi a distilatului recuperat.

Perioada Acetona, g/l Butanol, g/l Etanol, g/l Acid acetic, Acid butiric,
(0-147 h) g/l g/l
Distilat 64 117 8,2 0,8 1,6
Lichid de 1,65 3,25 0,35 1,95 1,10
fermentaţie

93
 Cu scopul de a diminua efectele negative ale termotratamentelor pe o perioada
lungă, distilarea continuă s-a realizat la pH = 4,8. În aceste experimente s-a utilizat o
membrană de UF cu aria de 0,158 m2 s-a operat cu un volum de 8,35 l şi 2 l de
ultrafiltrat recirculat (0,5 l în schimbătorul de căldură). Timpul de staţionare al
ultrafiltratului în schimbătorul de căldură a fost între 0,14 – 0,5 h pentru trei
experimente.
Viteza de diluţie a fost menţinută între 0,025 – 0,075 h -1 pentru concentraţia
glucozei în faza de alimentare variind între 70 – 210g-l depinzând de necesităţile
culturii. Distilarea a limitat nivelul butanolului în lichidul de fermentaţie sub 9 g/l.
În comparaţie cu rezultatele precedente în sistem discontinuu s-a observat un
avantaj: creşterea a continuat şi între experimente conducând la concentraţie maximă de
celule egală cu 30, 32 şi 33 mult mai mari decât 8g/l obţinută în aceeaşi perioadă
aproximativ 230 h în experimente discontinue succesive. Faza de sporulare a scăzut de
asemenea în regim continuu cu un maxim raport de endospori cuprins între 29 – 29,5%.
Deci, viteza de sinteză a solventului a crescut, de exemplu: valoarea medie pentru
primele 140 h a fost de 1,43 pentru o viteză medie de diluţie de 0,045 h -1 şi un  =
0,29 g/l. Trebuie precizat că rolul distilării rămâne primordial pentru scăderea inhibiţiei
de produs, deoarece 76% din totalul de butanol produs şi 76,4% din totalul solvenţilor
au fost simultan recuperate ca un distilat concentrat (135 g ABE/L). Fluxul, debitul
distilatului a reprezentat 12% din viteza medie de diluţie. Însă şi în acest caz apar efecte
negative datorită expunerii la temperatură.
Pentru a clarifica cauzele pentru inhibiţie în acest experiment de fermentaţie
extractivă s-au studiat influenţele: butanolului, a enzimelor extracelulare autolitice şi
efectele secundare ale termotratamentului. Astfel, în prima perioada între 19,6 h şi 332
h temperatura schimbătorului de căldură a fost fixată între 40 şi 43 oC, necesitând o
presiune scăzută 0,73 - 110-4 Pa pentru îndepărtarea butanolului. Prin acest fapt a fost
posibilă îndepărtarea compuşilor volatili fără a denatura mediul sau a enzimelor
autolitice deoarece acestea sunt stabile la această temperatură. În a doua perioadă de la
332 h la 600 h temperatura schimbătorului de căldură a fost ridicată între 56 şi 60 oC,
distilarea având loc la presiuni cuprinse în domeniul 2,05 – 2,15104 Pa. Timpul de
staţionare a ultrafiltratului in schimbătorului de căldură a variat între 0,5 – 1 h funcţie
de viteza permeatului. În aceste condiţii, enzimele autolitice sunt rapid inactivate,
timpul de înjumătăţire fiind de aproximativ 10 minute la 60 oC. Ca şi în experimentele
precedente, viteza de diluţie a fost menţinută scăzută cu o medie de 0,036 h -1 pentru a se
asigura o modificare minimă a mediului. Prin distilare s-au îndepărtat o mare parte din

94
butanol, 75%, şi ABE 79% în timp ce sunt produşi. Concentraţia totală a butanolului în
distilatul recuperat a fost de 70 g/l.
În aceste condiţii fermentaţia se poate realiza într-un timp mai mare decât cea
cuplată cu distilare la temperaturi ridicate. Producţia de solvent a fost îmbunătăţită:
pentru mai mult de 10 zile, productivitatea în solvent a fost menţinută la o valoare
medie mai mare de 1,6 g/lh, iar între 353 – 498 h o viteză medie cuprinsă între 2,2 -2,6
g/lh cu o viteză de diluţie de 0,036 h -1. Separarea realizată prin ultrafiltrare a permis
combinarea reţinerii şi a detoxifierii biocatalizatorilor într-un proces integrat [85].

95
 X. Separarea directă a produselor de biosinteză prin electrodializă

Electrodializa, des aplicată pentru obţinerea sărurilor anorganice, demineralizarea

zahărului, obţinerea aminoacizilor, acizilor organici, stabilizarea vinului şi în unele
tratamente ale sângelui reprezintă unul dintre cele mai importante procese membranare
aplicată în tehnologiile de epurare. De asemenea este privită ca o abordare promiţătoare
pentru separarea acizilor organici din lichidele de fermentaţie.
Acidul piruvic este un acid carboxilic important atât în metabolism, fiind un
precursor important în sinteza aminoacizilor şi ca materie primă în sinteza chimică
pentru diferite medicamente şi agrochimice şi în industria alimentară.
B. Zelic (2003) a studiat separarea în situ a acidului piruvic prin electrodializă din
lichidul de fermentaţie a microorganismelor Escherichia coli ZZ C202 cu scopul de a
menţine concentraţia acidului sub valoarea inhibitorie (peste 500 mmoli/L).
Electrodializa a fost aplicată pentru separarea unor aminoacizi, acizi organici, pentru
stabilizarea vinurilor demineralizarea zahărului, fiind una dintre cele mai importante
procese membranare pentru tehnologia de protecţie în a mediului în industriile
biochimice.
Echipamentele experimentale pentru electrodializă includ o unitate cu trei
compartimente separate de o membrană cu patru perechi de celule, conform figurii:

Figura 43. Principiu de bază al electrodializei

96
 Ionii de piruvat si cei de natriu din componenta de alimentare sunt transferaţi
simultan prin membranele schimbătorului de cationi şi anioni. Acidul piruvic s-a format
prin combinarea ionilor de piruvat cu ioni de H+ generaţi de stratul schimbătorului de
cationi a membranei bipolare. NaOH s-a format prin combinarea Na + cu OH- , soluţia
de electrolit a fost circulată continuu pentru a transfera curent electric şi îndepărta H 2 şi
O2, gaze formate prin reacţia la electrozi.
Instalaţia utilizată este prezentată in figura:

Figura 44. Reprezentarea instalaţiei utilizată la separarea directă a acidului piruvic

prin electrodializă.

Procesul constă din patru paşi:

1. fermentaţia cu reţinerea celulelor prin ultrafiltrare şi recirculare.
2. separarea proteinelor prin ultrafiltrare
3. recuperarea produsului prin electrodializă
4. sterlizarea prin microfiltrare şi recircularea permeatului din care a fost
îndepărtat o parte a acidului piruvic.
După cum se observă din instalaţie trei fluxuri părăsesc unitatea de electrodializă;
- permeatul cu un conţinut redus de acid
- soluţia de acid concentrată

97
 - soluţia de bază îmbogăţită cu NH4OH
Permeatul din care s-a îndepărtat acidul conţine glucoză nutrienţi, poate fi
reutilizat printr-o continuă recirculare. În consecinţă, se poate obţine o scădere a
preţului de cost a materiei prime. NH4OH produs în compartimentul de electrodializă ar
putea fi utilizat pentru a scoate cantitatea de bază necesară pentru modificarea pH-ului
în bioreactor. Conform experimentelor preliminare există posibilitatea concentrării
acidului piruvuc în fluxul final simplificând purificarea ulterioară.
Deci suspensia din bioreactor a fost ultrafiltrată pentru îndepărtarea celulelor,
filtratul a fost trecut într-o unitate de ultrafiltrare pentru reţinerea proteinelor şi
fragmentele celulare. Soluţia rezultată fiind trecută apoi în unitatea de electrodializă.
După cum se observă în figura 45 concentraţia acidului piruvic în funcţie de timp,
procesul a fost realizat în trei părţi:
- o fază discontinuă
- o fază continuă
- faza cu recuperare in situ

Figura 45. Concentraţia acidului piruvic, ○ – în sistemul integrat, ● – în bioreactor,

şi viteza volumetrică de formare, ▲ în timp

În timpul primei faze s-a observat o creştere în nivelul de acid piruvic, urmată de o
menţinere constantă a piruvatului, indicând un echilibru între acidul piruvic
biosintetizat şi cel îndepărtat. Pentru concentraţii de 600 mM s-a observat la cuplarea
unităţii de electrodializă o creştere a vitezei de biosinteză datorită îndepărtării
produsului inhibitor. În timpul etapei de electrodializă care a durat 14 h concentraţia

98
acidului în bioreactor a scăzut cu mai mult de 20%, observându-se în acelaşi timp
menţinerea activităţii celulelor producătoare. În figură sunt prezentate valorile
concentraţiei acidului piruvic atât în lichidele de fermentaţie cât şi în unitatea de
electrodializă, observându-se o valoare mai mare corespunzătoare cazului separării
directe de 2,5 ori. Totuşi eficienţa extracţiei a fost de doar 56% faţă de valoarea
anterioară de 72% probabil datorită deteriorării membranei prin precipitarea unor
compuşi din mediul de cultură. Acidul piruvic obţinut a avut o concentraţie de 550
mmoli/L după separarea prin electrodializă şi o puritate mai mare de 95% [86].

99
 Concluzii

Recuperarea in-situ a produselor de biosinteză prin integrarea unei tehnici de

separare în etapa de fermentaţie prezintă o importanţă deosebită pentru îmbunătăţirea
productivităţii fermentaţiilor caracterizate prin inhibiţie de produs şi de asemenea
pentru reducerea numărului de operaţii din fluxul tehnologic. În anumite cazuri,
separarea directă a produsului din lichidele de fermentaţie împiedică degradarea fie a
produsului, fie a substratului.
Alegerea unei metode de separare ca fiind cea mai buna este deosebit de dificilă,
în special datorită diferenţelor care apar între variabilele considerate de fiecare grup de
cercetători: tipul, tulpina şi faza de creştere a microorganismelor, sursa, tratamentele
preliminare şi concentraţia nutrienţilor şi a substratului, temperatura, pH-ul,
concentraţia oxigenului, tipul fermentatorului, nivelul amestecării.
Tehnologiile membranare oferă cele mai promiţătoare realizări dacă se reuşeşte
creşterea selectivităţii fără a se reduce şi fluxul prin membrană. Principalul avantaj al
utilizării extracţiei şi transportului prin membrane lichide obţinute prin înglobare pentru
separarea directă constă în faptul că lichidele de fermentaţie, şi inclusiv celulele nu sunt
în contact direct cu solventul utilizat pentru separare. Suporturile solide utilizate, care
separă cele două faze: soluţia de reextracţie şi lichidele de fermentaţie permit utilizarea
unor solvenţi care prezintă coeficienţi de distribuţie maximi, chiar dacă aceştia prezintă
toxicitate faţă de microorganismele utilizate pentru biosinteză. În acelaşi timp utilizarea
acestor tipuri de membrane evită problemele legate de separarea celor două faze
specifice extracţiei directe in-situ.
Pervaporizarea, deşi este o combinaţie al unui proces de evaporare cu un proces
membranar, eficientă din punct de vedere energetic (datorită utilizării unor medii de
cultură mult mai concentrate scad costurile de capital şi energie) necesită dezvoltarea
unor membrane cu caracteristici de performanţă acceptabile şi susceptibilitate mică la
contaminare, iar condensarea permeatului (la vid) deşi este relativ eficientă, ţinând cont
de transferul de căldură, necesită un sistem de refrigerare pentru condensarea aperi de
răcire, care presupune un cost suplimentar. Astfel balanţa avantajelor şi costul
membranelor şi al sistemului de refrigerare va determină economicitatea pervaporizării
pentru recuperarea directă a produselor de biosinteză.
Fermentaţiile cu sisteme bifazice apoase pot fi exploatate pentru a se reuşi
procesarea unui volum mare de substanţe cu pierderi scăzute, într-o instalaţie compactă,

100
care necesită mai puţine investiţii în termeni de infrastructură şi costuri mai mici în
procesare şi manipulare, decât procesele convenţionale.
Separarea in-situ prin cristalizare oferă avantajul obţinerii produsului direct în
formă solidă finală, însă s-a constat de multe ori necesitatea redizolvării cristalelor
pentru purificare pentru a întruni cerinţele tehnice.
Cele mai importante îmbunătăţiri în tehnologiile directe de separare ţin de
dezvoltarea unor noi materiale sau de modificarea unor materiale generice: răşini,
membrane şi chiar solvenţi, cu scopul obţinerii unor adsorbenţi cu afinităţi foarte mari
(ppb), dar şi cu capacităţi de a fi regeneraţi usor (la temperaturi şi presiuni reduse), al
unor solvenţi şi membrane caracterizate de o selectivitate înaltă şi capacitatea de
separare doar a compusului dorit. Deasemenea deosebit de importantă este şi
optimizarea proceselor de biocataliză şi separare, urmărind creşterea simultană a
selectivităţii şi fluxului şi reducerea impurităţilor şi a pierderilor.
Există, deci, o varietate de tehnologii de separare aplicabile pentru recuperarea
directă a produselor de biosinteză, fiecare dintre ele având avantaje şi dezavantaje.
Alegerea unei metode este deosebit de dificilă, depinde de puritatea impusă pentru
produs, şi presupune minimizarea reziduurilor, a produselor secundare, a substratului
neutilizat, a capitalului şi al energiei, a operaţiilor implicate maximizând în acelaşi timp
productivitatea.

101
 Bibliografie

1. Andrew J Daugulis - Integrated fermentation and recovery processes, Current

Opinion in Biotechnology 1994, 5:192-195
2. D. Cascaval, C. Oniscu, A.I. Galaction– Inginerie biochimica si biotehnologie 3.
Procese de separare, Editura Performantica, Iasi, 2004
3. P.V. Hoek. A. Aristidou, J.J.Hahn, A. Patist – Fermentation goes large scale,
Biotechnologz, CEP, 37-42, 2003
4. A.Senthuran. V. Senthuran, R. Hatti-Kaul, Bo Mattiasson- Lactate production in
an integrated process configuration: reducing cell adsorption by shielding of
adsorbent, Appl Microbiol Biotechnol, 65, 658–663, 2004
5. L.M. Vane – A review of pervaporization for product recovery from biomass
fermentation processes, J. Chem. Technol. Biotechnol., 80, 603-629, 2005
6. O’Brien DJ and Craig JC, Jr - Ethanol production in a continuous
fermentation/membrane pervaporation system. Appl Microbiol Biotechnol
44:699–704, 1996
7. Nakao S-I, Saitoh F, Asakura T, Toda K and Kimura S, Continuous ethanol
extraction by pervaporation from a membrane bioreactor. J Membr Sci 30:273–
287, 1987
8. Roca C and Olsson L, Increasing ethanol productivity during xylose
fermentation by cell recycling of recombinant Saccharomyces cerevisiae, Appl
Microbiol Biotechnol 60:560–563, 2003
9. Taylor F, Kurantz MJ, Goldberg N and Craig JC, Jr, Kinetics of continuous
fermentation and stripping of ethanol. Biotechnol Lett 20:67–72, 1998
10. Ezeji TC, Qureshi N and Blaschek HP, Acetone butanol ethanol (ABE)
production from concentrated substrate: reduction in substrate inhibition by fed-
batch technique and product inhibition by gas stripping. Appl Microbiol
Biotechnol 63:653–658, 2004
11. J.A. Vente, J.v. Erkel – In-situ product recovery in bioconversions,
12. E.M.B. Taboada, A.J. Straathof, J.J. Heijnen, L.A.M. Wielen – In situ product
removal using a crzstallization loop in asymetric reduction of 4-exoisophorone
by Saccharomyces cerevisiae, Biotechnol. Bioeng, 86, 795-800, 2004
13. F. Molinari, F. Aragozzini. J.M. S. Cabral, D.M.F. Prazeres – Continous
production of isovaleraldehyde through extractive bioconversion in a hollow-
fiber membrane bioreactor, Enzime Microb. Technol., 20, 604-6111997

102
14. C. Weilnhammer, E. Blass – Continous fermentation with product recovery by
in-situ extraction, Chem. Eng. Technol. 17, 365-373, 1994
15. Y. Wang, L.E.K. Achenie – Computer aided solvent design for extractive
fermentation, Fluid Phase Equilibria 201, 1-18, 2002
16. Inoue A and K Horikoshi - Estimation of solvent-tolerance of bacteria by the
solvent parameter log P. J Ferm Bioeng 71: 194–196, 1991.
17. M.S. Solichien, D. OBrian E.G. Hammond, C.E. Glatz – Membrane based
extractive fermentation to produce propionic and acetic acis: Toxicity and mass
transfer considerations, Eny. Microb. Technol. 17, 23-31, 1995
18. C. Gao, R. Govind, H. Tabak – Environ. Toxicol. Chem. 11, 631, 1992
19. J. Martak, E. Sabolova, S. Schlosser, M. Rosenberg, L. Kristofikova – Toxicity
of organic solvents used in situ in fermentation of lactic acid by Rhizopus
arrizus, Biotechnology techniques, 11(2), 71-75, 1997,
20. A.J. Daugulis, F. Kollerup – Can. J. Chem. Eng 63(6), 919-927, 1985
21. K. Ze, S. Jin, K. Shimizu – Performance improvement of lactic acid fermentation
by multistage extractive fermentation, Journal of Fermentation and
bioengineering, 81 (3), 240-246, 1996
22. K. Schugerl – Solvent extraction in biotechnology, Springer-Verlag, 1994
23. M. Siebold, V.P. Frieling, R. Joppien, D. Rindfleisch, K. Schurgerl, H. Roper –
Process Biochemistry, 1994
24. M. Hironaka, M. Hirata, H. Takanashi, T. Hano, S. Miura – Kinetics of lactic
acid extraction with quaternary ammonium salt, Separation, Science and
Technology, 2001, 36 (13), 2927-2943.
25. Van den Heuvel, J.C. Beeftink, P.G. Verschuren– Inhibition of the acidogenic
disimilation of glucose in anaerobic continuous cultures by free butyric acid,
Applied Microbiology and Biotehnology, 1988, 29, 89-94
26. J Zigova, E. Sturdik – Advances in biotechnical production of butyric acid,
Jornal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 24, 153-160, 2000
27. D. Vandak, J. Zigova, E. Sturdik, S. Schlosser – Evaluation of solvent and pH for
extractive fermentation of butyric acid, Process Biochemistry, 32 (3), 245-251,
1997
28. J. Zigova, E. Sturdik, D. Vandak, S. Schlosser – Butyric acid production by
Clostridium butyricum with integrated extraction and pertraction, Proc.
Biochem, 34, 835-843, 1999

103
29. P.J. Evans, H.Z. Wang – Effects of extractive fermentation on butyric acid
production by Clostridium acetobutylicum, Appl. Microbiol Biotechnol, 32, 393-
397, 1990
30. M. Yi, Q. Pen, D. Chen, L. Pen, M. Zhan, R. Wen, X. Mon, W. Wang –
Extraction of citric acid by N,N disubstitued alkylamides from fermentation
aqueous solutions, Beijing Daxue Xuebao, Ziran, Kexuebn 4, 30-37, 1987
31. V.V. Sergienski– Hydratation in extraction of citric acid with alcohols. Izv.
Vyssh. Vchebn. Zaved., Khim.Khim. Tekhnol., 32, 79-81, 1989
32. H.J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P. Standler, Biotechnology, vol. 3, VCH,
Weinheim, 1993
33. C. Oniscu, C. Cascaval, D. Cascaval – Extractia reactiva a penicilinei G direct
din lichidele de fermentatie, Ib Extractia din lichide de fermentatie simulate,
Revista de chimie, 50(3), 157-167, 1999
34. C. Oniscu, C. Cascaval, D. Cascaval, L. Marin – Reactive extraction of penicilin
G directly from fermentation broth. Ia. Extraction from Simulated Fermentation
Broth, Roum. Biotech. Lett., 2(4), 305-314, 1997
35. D. Cascaval, C. Oniscu, C. Cascaval – Reactive extraction of penicilin G directly
from fermentation broth. IIb Extraction from Penicillium chrysogenum
suspensions, Revue Roumain de Chimie, 44(4), 403-411, 1999
36. C. Oniscu, C. Cascaval, D. Cascaval - Reactive extraction of penicilin G
directly from fermentation broth. II.a. Extraction from Penicillium chrysogenum
Suspensions, Roum. Technol.mLett., 3(1), 31-42, 1998
37. C. Oniscu, C. Cascaval, D. Cascaval, A. Dumitrascu, A. Chichirau - Reactive
extraction of penicilin G directly from fermentation broth.II.b. Modeling of
extraction process from Penicilium chrysogenum Suspensions, Roum. Biotech.
Lett., 3(1), 55-63, 1998
38. J. Wu, L. Lin – Enhancement of taxol production and release in Taxus chinensis
cell culture by ultrasound, methyl jasmonate and is-situ extraction, Appl.
Microbiol. Biotechnol, 62, 151-155, 2003
39. N. Ruffer, U. Heidersdorf, I. Kretzers, G.A. Sprenger, L. Raeven, R. Takors -
Fully integrated L-phenylalanine separation and concentration using reactive-
extraction with liquid-liquid centrifuges in a fed-batch process with E. coli,
Bioprocess Biosyst Eng., 26, 239–248, 2004
40. B. Atkinson, F. Mavituna – Biochemical engineering and biotechnology
handbook, Macmilian Publishers Ltd, 1985
41. J.W. Moritz, S.J.B. Duff– Biotechnol. Bioeng. 49(5), 504, 1996

104
42. D.E. Essien, D.L. Pyle– Fermentation ethanol recovery by solvent extraction.
Separations for Biotechnology, Verrall M.S. Hudson M.J., Chichester,
43. M. Gyamerah, J. Glover – Production of etanol by continous fermentation and
liquid-liquid extraction, J. Chem. Tech. Biotechnol, 66, 145-152, 1996
44. S.R. Roffler, H.W. Blanch, C.R. Wilke– Biotechnol Bioeng, 31,135, 1988
45. D. Cascaval, C. Oniscu, L. Marin, V. Rosca – Liquid-liquid extraction of
biosynthesis products directly from fermentation broth I. Mass transfer to drops,
Buletinul I.P., XLIV (XLVIII), 69-74, 1998
46. D. Cascaval, C. Oniscu - Liquid-liquid extraction of biosynthesis products
directly from fermentation broth II Mathematical correlation for mass transfer
coeficients, Roum. Biotehnol. Lett, 1(2), 139-146, 1996
47. T. Ezeji, N. Qureshi, H.P. Blaschek – Butanol fermentation research: Upstream
and downstream manipulations, The chemical record, 4, 305-341, 2004
48. Z. Shi, C. Zhang, J. Chen, Z. Mao - Performance evaluation of acetone-butanol
continuous flash extractive fermentation process, Bioprocess Byosyst Eng, 27.
175-183, 2005
49. Y.W. Jin, S.T. Zang – Extractive fermentation for enhanced propionic-acid
production from lactose by Propionibacterium acidipropionici, Biotechnol. Prog.
14, 457, 1998
50. F Ozadali, B.A. Glatz, C.E. Glatz – Fed-batch fermentation with and without on-
line extraction for propionic and acetic acid production by Propionibacterium
acidipropionici, Appl. Microbiol Biotechnol 44,710-716, 1996
51. Y. Wu, S.T. Zang – Extractive fermentation for butyric acid production from
glucose by Clostridium tyrobutyricum, Biotechnology and bioengineering, 82
(1), 93-102, 2003
52. J. Martak, S. Schlosser, E. Salolova, L. Kristofiva, M. Rosenberg – Fermentation
of lactic acid with Rhizopus arrizus in a stirred tank reactor with a periodical
bleed and feed operation, Process Biochemistrz 38, 1573-1583, 2003
53. E. Bressler, O. Pines, I. Goldberg, S. Braun – Conversion of fumaric acid to l-
malic by sol-gel immobilized Saccharomyces cerevisiae in a supported liquid
membrane bioreactor, Biotechnol. Prog. 18, 445, 2002
54. S. Schlosser – Integration of membrane processes into bioconversions, Kluwer
Academic, Plenum Publishers, New York, 2000
55. D. Maass, M.R. Gerigk, A. Kreutzer, D. Weuster-Botz, M. Wubbolts, R. Takors -
Integrated L-phenylalanine separation in an E. coli fed-batch process: from
laboratory to pilot scale, Bioprocess Biosyst. Eng., 25, 85–96, 2002

105
56. Makryaleas K., Scheper T., Schugerl K. and Kula, M.R. - Enzymatic production
of L-amino acid with continuous coenzyme regeneration by liquid membrane
technique, Ger. Chem. Eng., 8, 345-350, 1985
57. D. Stark, H. Kornmann, T. Munch, B. Sonnleitner, I.W. Marison, U. von Stockar
– Novel Type of in situ extraction: Use of solvent containing microcapsules for
the bioconversion of 2-phenylethanol from L-phenylalanine by Saccharomyces
cerevisiae, Biotechnology and Bioengineering , 83 (4), 376-385, 2003
58. L. Vane - A review of pervaporation for product recovery from biomass
fermentation processes, J. Chem. Technol. Biotechnol., 80, 603 - 629, 2005
59. Jonquieres A, Clement R, Lochon P, Neel J, Dresch M and Chretien B -
Industrial state-of-the-art of pervaporation and vapour permeation in the western
countries. J Membr Sci 206:87–117, 2002
60. Moniruzzaman M, York SW and Ingram LO - Effects of process errors on the
production of ethanol by Escherichia coli KO11. J Ind Microbiol Biotechnol
20:281–286, 1998
61. Lewis JG, Learmonth RP and Watson K - Induction of heat, freezing and salt
tolerance by heat and salt shock in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology
141:687–694, 1995
62. Mori Y and Inaba T - Ethanol production from starch in a pervaporation
membrane bioreactor using Clostridium thermohydrosulfuricum. Biotech Bioeng
36:849–853, 1990
63. J.L.Lucas, F.E. Martin - Process for production of lignin fuel, ethyl alcohol,
cellulose, silica/silicates, and cellulose derivatives from plant biomass. US Patent
5,735,916, 1998
64. Galbe M and Zacchi G - A review of the production of ethanol from softwood.
Appl Microbiol Biotechnol 59:618–628, 2002
65. Z. Shabtai, C. Mandel – Continuous ethanol production by immobilized yeast
reactor coupled with membrane pervaporation unit, Biotechnol Bioeng 38, 869-
876, 1991
66. Z. Shabtai, C. Mandel – Control of ethanol production and monitoring of
membrane performance by mass-spectrometric gas analysis in the coupled
fermentation – pervaporation of whey permeate, Appl. Microbiol. Biotechnol.
40, 470-476, 1993
67. D.J. O Brien, J.C. Craig – Ethanol production in a continuous
fermentation/membrane pervaporization system, Appl Microbiol Biotechnol, 44,
699-704, 1996

106
68. T.C. Ezeji, N. Qureshi, H.P. Blaschek – Production of acetone, butanol and
ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping,
Worl J. Microbiol & Biotechnol, 19, 595-603, 2003
69. T.C. Ezeji, N. Qureshi, H.P. Blaschek - Acetone butanol ethanol (ABE)
production from concentrated substrate: reduction in substrate inhibition by fed-
batch technique and product inhibition by gas stripping, Appl Microbiol
Biotechnol, 63,653–658, 2004
70. T.C. Ezeji, P.M. Karcher, N. Qureshi, H.P. Blaschek - Improving performance of
a gas stripping-based recovery system to remove butanol from Clostridium
beijerinckii fermentation, Bioprocess Biosyst Eng, 27, 207–214, 2005
71. W. J. Groot, R. G. J. M. van der Lans, and K. Ch. A. M. Luyben - Batch and
continuous butanol fermentations with free cells: integration with product
recovery by gas-stripping, Appl Microbiol Biotechnol, 32, 305-308, 1989
72. F.Taylor á M. J. Kurantz á N. Goldberg á J. C. Craig Jr. - Effects of ethanol
concentration and stripping temperature on continuous fermentation rate, Appl
Microbiol Biotechnol 48, 311-316, 1997
73. F.Taylor á M. J. Kurantz á N. Goldberg á J. C. Craig Jr. – Control of packed
column fouling in the continous fermentation and stripping of ethanol,
Biotechnology and Bioengineering, 51, 33-39, 1996
74. A. Senthuran, V. Senthuran, R. H-Kaul, B. Mattiasson – Lactate production in an
integrated process configuration: reducing cell adsorbtion by shielding of
adsorbent, Appl. Microbiol Biotechnol, 65, 658-663, 2004
75. L. Nelsen, M. Larsson, O. Holst, B. Mattiasson – Adsorbents for extractive
bioconversion applied to the acetone-butanol fermentation, Appl Microbiol
Biotechnol, 28, 335-339, 1988
76. H Wang, S. Palanki, G. Hyatt – Application of affinity adsorption in thienamycin
fermentation, Appl. Microbiol. Biotechnol, 30, 115-119, 1989
77. J Sinha, P.K. Dey. T Panda – Aqueous two-phase: the system of choice for
extractive fermentation, Appl. Microbiol Biotechnol, 54, 476-486, 2000
78. J. Planas, P. Radstrom, F. Tjerneld, B. Hahn-Hagerdal – Enhanced production of
lactic acid through the use of a novel aqueous two-phase system as an extractive
fermentation system, Appl Microbiol Biotechnol, 45, 737-743, 1996
79. B. Katzbauer, V. Cesi, M. Narodoslawsky, A. Moser – Extractive lactic acid
fermentation using aqueous two-phase system, Chem. Biochem Eng Q, 9, 79-87,
1995

107
80. S. Gosh, T. Swaminathan – Optimization of process variables for the extractive
fermentation of 2,3-butanediol by Klebsiella oxytoca in aqueous two-phase
system using response surface methodology, Chem. Biochem. Eng. Q 17, 319-
325, 2003
81. I. Persson, F. Tjerneld, B. Hahn-Hagerdal – Influence of cultivation conditions
on the production of cellulolytic enzymes with Trichoderma reesei Rutgers C30
in aqueous two-systems, Appl. Biochem Biotechnol, 27, 9-25, 1991
82. J. P. Chen, M.S. Lee – Enhanced production of Serratia marcescens chitinase in
PEG/dextran aqueous two-phase systems, Enzyme and Microbial Technology,
17, 1021-1027, 1995
83. E.M. Buque Taboada, Adrie J.J. Straathof, J.J. Heijnen, L.A.M. van der Wielen –
In situ product removal using a crystallization loop in asymmetric reduction of
4-oxoisophorone by Saccharomyces cerevisiae, Biotechnology and
Bioengineering, 86(7), 2004
84. S. Aguma, H. Tsunekawa, M. Okabe, R. Okamoto, S. Aiba – Hyperproduction
of L-triptophan via fermentation with cristallization, Appl Microbiol Biotechnol,
39, 471-476, 1993
85. M. Minier, R. Grateloup, E. Blanc-Ferras, G. Goma – Extractive acetonobutyllic
fermentation by coupling ultrafiltration and distillation, Biotechnology and
Bioengineering, 35, 1990, 861-869
86. B. Zelic, S. Gostovic, K. Vuorilehto, D. Vasic-Racki, R. Takors – Process
strategies to enhance pyruvate production with recombinant Escherichia coli:
from repetitive fed-betch to in situ product recovery with fully integrated
electrodialysis, Biotechnology and Bioengineering, 85 (7), 2003

108