METODE EXPERIMENTALE

PENTRU EVALUAREA DURERII

Curs rezidenţi laborator farmaceutic an I iulie
2017
 Fondata 1973;

 Reunește oameni de știință, medici, furnizorii de

servicii de sănătate, și factorii de decizie politica
pentru studierea durerii în vederea ameliorării
sau îmbunătățit tratamentului durerii

 Respectarea regulilor de bioetică în studiul

experimental
LEGISTALȚIA
 Texte europene
- Directiva 2010/63/UE din 22 nov 2010 privind protecţia
animalelor folosite în scopuri ştiinţifice

Aplicare din 01.01.2013 –

Legea 43 din 11 aprilie 2014 privind protecţia
animalelor utilizate în scopuri ştiinţifice
M.O. nr. 326 din 6 mai 2014; Data intrarii in vigoare : 9 mai
2014
www.arsal.ro
(Asociația Româna pentru Știința
Animalelor de Laborator)
 DUREREA

The Fault in Our Stars, John Green, 2012

Durerea = “o senzaţie şi o experienţă senzitivă şi

emoţională neplăcută,asociată cu o leziune tisulară
existentă sau potenţială sau descrisă ca o astfel de leziune”
IASP (International Association for the Study of Pain)
(Merskey,1979)
DUREREA
 Experiență senzorială și emoțională neplăcută,
asociată cu leziune tisulară actuală sau potențială
(IASP, 1979).
 Experiență subiectivă – metode pentru măsurarea și
analizarea percepției durerii
 Pragul perceperii durerii/ comportamentul, reacția la
durere
• Comunicarea
om experienței dureroase

• Retragerea de la

animal
stimulul dureros
• Manevre de
autoprotecție
COMPONENTE
- fiziologică: mod de transmitere, receptori
implicați, procese biochimice, etc.

- comportamentală: comportamentele ce
exprimă durerea și o însoțesc,

- subiectivă: gânduri, sentimente, reprezentări

legate de durere.
 Tipuri de durere (1)
I. Durerea neurologică
 Durerea nociceptivă:
- somatică (la nivelul pielii,muşchilor
scheletici,oaselor)
- viscerală (la nivel intestinal, ficat,stomac)
 Durerea neuropată (non-nociceptivă)
- centrală (leziuni la nivel cerebral sau spinal)
- periferică (leziuni ale nervilor periferici)
 Tipuri de durere (2)
II. Durerea neurogenă
 Nevralgia (durere pe traiectul unui nerv periferic)
 Constantă :
- independentă de sistemul nervos simpatic
- dependentă de sistemul nervos simpatic
III. Durerea temporală
 Acută : - somatică
- viscerală
 Cronică
CLASIFICARE
Durerea acută
durată 6 săpt. - 6 luni
anxietatea - semnificație de pericol iminent pentru individ.
Poate să fie: durere superficială: tegumente, mucoase, este de scurtă
durată, bine localizată, are caracter ascuțit;
durere profundă: mușchi, este mai greu localizabilă, mai
persistentă și are caracter de arsură.

Durerea cronică
durată peste 6 luni,
 este localizată la nivelul organelor interne, produce un discomfort
important, cu afectare subiectivă, familială, profesională.
Tipuri de durere cronică:
- cronică recurentă, benignă de intensitate crescută, repetată, cu
interval liber, ca în migrenă
- cronică intractabilă, constantă, de intensitate variabilă, ca în durerea
de spate
- cronică progresivă, în artrită reumatismală, cancer
 Fiziopatologia durerii
-cale de conducere ascendentă
 Fiziopatologia durerii
-cale de conducere descendentă
TIPURI DE FIBRE AXONALE

Fein A (2012) Nociceptors and the Perception of Pain./ http://cell.uchc.edu/pdf/fein/nociceptors_fein_2012.pdf

 FIBRE NEMIELINIZATE (FIBRE C), FIBRE
MELINIZATE (FIBRE AΔ/AΒ)

Dubin AE. , Patapoutian A. Nociceptors: the sensors of the pain pathway J Clin Invest. 2010 November 1; 120(11):
3760–3772.
 HIPERSENSIBILIZARE
ALODINIA/ HIPERALGEZIA

Cohen SP, Mao J. Neuropathic pain: mechanisms and their clinical implications. BMJ. 2014 Feb
5;348:f7656.
DUREREA LA ANIMALE DE EXPERIENȚĂ
 Comportament specific
 Răspuns motor (retragere, săritură, contractură)

 Modificări neurovegetative ( alarmă – stimulare

simpatică: tahicardie, HTA, midriază, hiperpnee)
 Vocalizare

 Comportament motor de invățare (mecanism complex)

STIMULI UTILIZAȚI (1)
- Electric ( stimulează toate tipurile de fibre,
scurtcircuitează transmisia prin receptorii periferici,
variația impedanței – afecteare țesut)

- Termic (receptori cutanați, fibre termosensibile și

nociceptive; caldură radiantă (Vis –IR/ pielea slab
absorbant, bun reflector; termocuplu - principiu Peltier;
laser CO2)
 TRANSFERU
L CĂLDURII
PRIN PIELE
– STIMULI
DIFERIȚI

Le Bars D, Gozariu M, Cadden SW. Animal models of nociception. Pharmacol Rev. 2001 Dec;53(4):597-
652.
EXPUNEREA LA O SURSĂ CONSTANTĂ DE CĂLDURĂ –
TEMPERATURA DE LA SUPRAFAȚA PIELII CREȘTE PROPORȚIONAL
CU RADĂCINĂ PĂTRATĂ DIN TIMP

Le Bars D, Gozariu M, Cadden SW. Animal models of nociception. Pharmacol Rev. 2001 Dec;53(4):597-
652.
STIMULI UTILIZAȚI (2)
- Mecanic (progresiv sau grosier, stimulează
mecanoreceptorii dar și nociceptorii – filamente von Frey
(Handwerker and Brune, 1987), stimul nespecific, tehnic
dificil, separarea stimului de reacție)

- Chimic (agenți algogeni, mișcări stereotipe, apropiate

de durerea clinică, evaluate prin scor, progesul evolutiv)
- acid acetic 0,6 %, ip. – contorsiune Writhing Test;
formalină
DURERII
ARTICOLE PUBLICATE 1970-1999

Le Bars D, Gozariu M, Cadden SW. Animal models of nociception. Pharmacol

Rev. 2001 Dec;53(4):597-652.
CLASIFICAREA METODELOR DE EVALUAREA
A COMPORTAMENTULUI LA DURERE
Tip de durere Natura stimulului
 metode – durere acută  Termic (teste termoanalgezice):
(tail-flick, hot plate, tail-flick, hot plate, testul imersiei
Randall – Sellito, testul cozii
imersiei)
 metode – durere cronică
(inducerea artritei cu
 Chimic (teste chimicoanalgezice):
adjuvant Freund sau bacil stimulul chimic, testul formalinei
Koch inactivat)
 metode – durearea  Mecanic (teste
neuropată (citostatice, mecanoanalgezice):
injurie de nerv, diabet)
Randall-Sellito, von Frey

 Electric (teste electroanalgezice)

flinch-jump
TESTE DE EVALUAREA IN VIVO - MECANISM
 Algezie și analgezie  Algezie și analgezie
prin mecanism prin mecanism
predominant periferic predominant central

 Testul stimului  Testul pensării cozii (M.

chimic Haffner);
 Randall-Sellito 1957
(pe țesut inflamat)  Tail –flick;
 Durere neuropată
Chimioterapice  Testul imersiei cozii;
- Leziune de nerv
- Patologii (diabet, HIV,  Hot plate;
Herpes virus)
 Testul formalinei
SCOPUL TESTELOR EXPERIMENTALE -
DURERE

 Prezența sau absența analgeziei în urma

manipulărilor experimentale
- chirurgicale,
- administrării de medicamente
- expunerea la stres

- Determinarea DE50 efectului analgezic

METODA LUI HAFFNER (HAFFNER 1929)
 Scop: observarea scăderii sensibilității cozii în urma
administrării de morfină

 Mod de lucru: se aplică o clemă la rădăcina cozii

(aproximativ la 1 cm distanță de corp), pentru a induce
durerea. Animalul răspunde rapid la stimul prin mușcarea
agrafei sau a cozii .

 Avantaje/Dezavantaje
- testul nu necesită echipament sofisticat , ci un observator
priceput;
-acțiunea analgezică periferică a salicilaților nu se
detectează cu acest test.
HOT- COLD PLATE

 (Woolfe and Mac Donald, 1944;

Eddy and Leimbach, 1953;
O’Callaghan and Holzman, 1975)

 timp de reacţie (lins sau salt)

 comportament complex, în
funcţie de specie şi temp.

 Limite maxim 30 s, temp. max.

66 0C, temp. min 2 0C

 1 determinare sau media a 3

determinări
 Scop TESTUL HOT PLATE
- labele șoarecilor și sobolanilor sunt (WOOLFE & MACDONALD 1944)
foarte sensibile la căldură ,dar la
temperaturi ce nu afectează pielea.
- răspunsurile la test includ săritura,
retragerea lăbuțelor și lingerea
acestora.
 Mod de lucru
-plita încinsă constă într-o suprafață
încălzită electric, cu o temperatură
controlată de 55-56 grade.
- animalele se plasează pe suprafața
încinsă și se înregistrează timpul scurs
până la lins sau sărit.
 Avantaje/Dezavantaje
- sedativele , relaxantele musculare sau
psihomimeticele determină raspunsuri
fals-pozitive;
- agoniștii-antagoniști de tip opioid
determină răspunsuri fără încredere.
HOT PLATE  50-55 0C

 Latenţa de la contactul cu
placa încălzită şi până la
apariţia comportamentului
specific de durere – labele
posterioare : lins, salt,
scuturat (evadare, ridicarea
labelor în aer…)

 Contactul cu placa – stă,

merge, aleargă;
comportament de învăţare,
variabilitatea răspunsului
mare
Testul Hot plate
(Woolfe & MacDonald 1944)
 determină pragul perceperii durerii

 placa încălzită > 500 C

Comportament specific: lingerea,
saltul, scuturarea labelor posterioare;
Contactul cu placa – stă, merge,
aleargă; comportament de învăţare,
variabilitatea răspunsului mare
Timp maxim 30 s;
↑ Latenței = analgezie
Stimul rece 2-8 0C
↓ Latenței = hiperalgezie, alodinie
METODA CĂLDURII RADIANTE
 Scop
- evaluarea activității analgezice în
experimente prin măsurarea
schimbărilor induse de administrarea
substanței,observată prin expunerea
cozii la o sursă de căldură
 Mod de lucru
Șoarecii sunt plasați în cuști, coada
rămânând expusă. O sursă de căldură
este concentrată în treimea proximală
a cozii. În câteva secunde animalul își
retrage coada sau încearcă să scape. Se
măsoară timpul scurs până când se
întamplă acest lucru.
• Avantage/Dezavantaje
Testul căldurii radiante este foarte eficace în estimarea potenței substanței testa
 ↑ latenţa = analgezie
TAIL - FLICK
↓ latenţei = hiperalgezie
 D’Amour and Smith, 1941

 Contact direct cu căldură

radiantă sau imersia cozii în
apă
 Răspuns reflex, mediat spinal –
retracţia cozii
 !!!! Valoarea bazală – se
stabileşte prin ajustarea
intensităţii sursei de căldură
(latanţa constantă pentru 4 det.
cnsec.) – fiecare experiment

 Opioide – efect farmacologic,

eficacitate dar poate sa fie şi
efect tot sau nimic
 TESTUL IMERSIUNII COZII
• Scop
- medicamentele tip morfină sunt capabile
de a prelungi selectiv timpul de reacție al
reflexului tipic de retragere al cozii, indus
prin imersiunea cozii în apă la 55 grade.

• Mod de lucru
- se marchează porțiunea inferioară a cozii,
de 5 cm;
- se imersează într-un pahar cu apă încalzită
la 550 C;
- în câteva secunde șobolanul reacționează
prin retragerea cozii.
TESTUL FORMALINEI
formalină soluție 5% intraplantar (0,5 – 15 %)
(Dubuisson and Dennis, 1977).

Evaluează
Analgezic durerea
e clasice neuropată

Lins – mușcat Retras labuța Scor total

DYNAMIC PLANTAR AESTHESIOMETER
 Filament inflexibil (0 Plantar Test (Aparatul
– 50 g) aplicată pe Hargreaves) Hargreaves et
suprafaţa plantară a al., 1988
lăbuţei posterioare  - stimul căldură radiantă
(timp max 90 s) o forţă
crescătoare
 Răspuns nocifensiv
opreşte automat –
prametrii (timp- forţă)
FILAMENTE VON FREY
ANALGESY-METER - RANDALL-SELITTO
 Randall and Selitto
(1957)

 Ţesut inflamat
(caolin, drojdie, )
 MODELE ANIMALE DE DURERE
NEUROPATĂ
 Modele de durere neuropată periferică prin lezare
de nerv
Leziune constrictivă cronică (CCI sau modelul Bennett)
Ligarea partială a nervului sciatic (PNL sau modelul Seltzer
Ligaturarea nervilor spinali L5/L6 (SNL modelul Kim şi Chung)
Leziunea nervului adiţional (spared nerve injury model SNI)

 Durere neuropată periferică indusă de boli

Nevralgie postherpetică (PHN)

Durerea dată de neuropatia diabetică (DNP)

o Durere neuropată periferică indusă de

chimioterapice: vincristină, paclitaxel, cisplatin
 LOCUL UNDE SE REALIZEAZĂ LEZIUNILE ÎN MODELELE
EXPERIMENTALE DE DURERE NEUROPATĂ.

Dubin AE. , Patapoutian A. Nociceptors: the sensors of the pain pathway J Clin Invest. 2010 November 1; 120(11):
3760–3772.
MODELE ANIMALE DE DURERE
NEUROPATĂ

 Model animal de neuropatie diabetică

- inducerea diapetului cu streptozotocin o singura

adm i.p.
- hiperalgezie termică, mecanică şi chimică
- alodinie termală şi tactilă
- reducere sensibilităţii la opioizi
- raspuns la antidepresive
- hiperalgezie mecanică apare după 2 săptămâni de la administrarea
streptozotocinului şi a persistat 6 săptămâni [Malcangia, 1994]
DURERE NEUROPATA INDUSĂ DE
CHIMIOTERAPIE
 vincristină 0,2 mg/kg corp, i.p. în zilele 5 zile
consecutiv,la şobolani albi, masculi suşa Wistar
(Weng şi colab., 2003,modificată)

 paclitaxel 2 mg/kg corp, i.p. 4 zile consecutiv, la

şobolani albi, masculi suşa Wistar [Zbârcea CE,
Negreş S et al., 2011].
 TESTAREA COMPORTAMENTULUI
ÎN DUREREA NEUROPATĂ
a) Durerea spontană c) Hiperalgezia
- evitarea lăsării greutăţii pe - termică (ordinea creşterii
piciorul afectat
sensibilităţii) [Baliki M.şi
- mers şchiopătat colab.,2005]
- lingerea labei
Testul plantar – stimulul
- grooming excesiv nociceptiv este căldură
- explorare excesivă radiantă (Hargreaves’s test)
- protejarea membrului afectat Hot-plate
autotomia - automutilare şi
AlgoTrack
atacul zonelor denervate

b) Alodinia - mecanică
- tactilă (filament von Frey) - testul de presiune al labei
- rece - picătura de acetonă (testul Randall-Selitto)
- von Frey filament
 Testarea sensibilității tactile
Teste utilizate in evaluarea sensibilitatii dureroase tactile - măsurarea
pragurilor de retragere a lăbuței posterioare cu ajutorul

Filamentele von Frey Dynamic Plantar

(von Frey 1896) – metoda up and
down a lui Dixon 1980 și aplicată
Aesthesiometer (Ugo
la rozătoare de Chaplan et Basile, Anderson KD et al., 2005)
al. 1994)

Anderson KD, Gunawan A, Steward O. Quantitative assessment of forelimb motor function after cervical spinal cord
injury in rats: relationship to the corticospinal tract. Exp Neuro. 2005 Jul;194(1):161-74.
 VARIABILITATEA HIPERSENSIBILITĂŢII DUREROASE
TACTILE (ALODINIE ŞI HIPERALGEZIE) INDUSE DE
PACLITAXEL (2 MG/KG I.P,
4 ZILE CONSECUTIV) LA ŞOBOLAN

Loturi experimentale
Martor: 0,1 mL/100 g i.p, 4 zile
Paclitaxel: 2 mg/kg i,p, 4 zile

Iniţial După 4 doze de La 6 zile după La 14 zile după

paclitaxel 2 mg/kg i.p oprirea adm. oprirea adm.
paclitaxel paclitaxel

Determinare: Sensibilitate dureroasă tactilă - Dynamic Plantar Aesthesiometer

Alodinie – timp de retracţie al labei posterioare la o forţă de 2 g/s
Hiperalgezie - timp de retracţie al labei posterioare la o forţă de 4 g/s
 REZULTATE EXPERIMENTALE PRIVIND ALODINIA (2
G/S) ŞI HIPERALGEZIA MECANICĂ (4 G/S): CURBE
FRECVENŢĂ - DISTRIBUŢIE
Paclitaxel induce alodinie care se menţine 30 A 25
B

Frecvenţa de răspuns (%)

Frecvenţa de răspuns (%)
Lot Martor 20 Lot Martor

25 şi după întreruperea administrării 20

Lot Paclitaxel Lot Paclitaxel
Frecvenţa de răspuns (%)

15

20
A
Lot Martor Frecvenţa de răspuns (%) 40 B 10
Lot Paclitaxel 10
Lot Martor 5
15 30
Lot Paclitaxel
0 0
0 5 10 15 0 10 20 30 40
20
10 30
C
25 D Forţă (g)

Frecvenţa de răspuns (%)

Timp (s)

Frecvenţa de răspuns (%)

10 20 Lot Martor
5 Lot Martor
20 Lot Paclitaxel
Lot Paclitaxel 15
0
0 10 12 14 16 18 20 22
40
0 10 20 30 40 50 50 10
Frecvenţa de răspuns (%)

Forţă (g)
Frecvenţa de răspuns (%)

10
30 C Timp (s)
Lot Martor
40 D 5
Lot Paclitaxel
Lot Martor
30 0
20 Lot Paclitaxel 0
0 2 4 6 8 10 0 10 20 30 40
20 Forţă (g)
25
E
Timp (s) 30
F

Frecvenţa de răspuns (%)

Frecvenţa de răspuns (%)

10
10
20 Lot Martor
Lot Martor Lot Paclitaxel
0 0 20
0 10 20 30 40 0 5 10 15 20 25 15 Lot Paclitaxel

30 Timp (s) Forţă (g)

40
E
10
Frecvenţa de răspuns (%)

F
Frecvenţa de răspuns (%)

10
Lot Martor
30 5
Lot Paclitaxel
20
Lot Martor 0 0
20 0 2 4 6 8 10 0 10 20 30 40
Timp (s) Forţă (g)
10 25 Lot Martor 25
H
Frecvenţa de răspuns (%)

Frecvenţa de răspuns (%)

10 Lot Paclitaxel
20 20 Lot Martor

0 0 15
G 15
Lot Paclitaxel

0 5 10 15 20 25
40 0 10 20 30
80 Forţă (g)
Frecvenţa de răspuns (%)

Lot Martor 10
Timp (s) 10
Frecvenţa de răspuns (%)

30
Lot Paclitaxel
60
H 5 5

20
G Lot Paclitaxel
0 0
40 0 5 10 15 0 10 20 30 40
Timp (s) Forţă (g)
10 20
Paclitaxel induce hiperalgezie care se menţine
şi după întreruperea administrării
0 0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
Timp (s) Forţă (g)