LP 16. Identificarea stafilococilor. Hemocultura în diagnosticul infecţiei.

Obiective:
1. Cunoașterea etapelor de identificare a stafilococilor.
2. Cunoașterea definitiei si indicatiilor hemoculturii; definirea noțiunilor de bacteriemie versus sepsis.
3. Cunoașterea speciilor bacteriene izolate frecvent din hemocultură.
4. Cunoașterea particularităţilor hemoculturii, momentul, numărul şi volumul prelevărilor, incubarea şi
urmărirea hemoculturilor, interpretarea rezultatelor.

1. Etapele de identificare a stafilococilor

Caractere microscopice: coci gram pozitivi, dispuşi izolat, în perechi, scurte lanţuri, grămezi, imobili,
nesporulaţi.

Caractere de cultivare: colonii S, rotunde, bombate, pigmenate diferit (portocaliu, galben, alb).
- pe geloză sânge pot forma colonii hemolitice,
- cresc pe medii cu sare, ceea ce permite izolarea din produse patologice contaminate .

Testul catalazei
Principiu: Catalaza este o hemoproteină care descompune peroxidul de hidrogen în apă şi oxigen.
Bacteriile care o produc se protejează astfel de efectele letale ale peroxidului de hidrogen apărut ca
metabolit final în metabolismul aerob al carbohidraţilor.
Interpretare: pozitiv :apariţia bulelor de gaz până la efervescenţă
negativ: absenţa bulelor

Testul coagulazei
Principiu peste 96% din tulpinile de S aureus coagulează plasma prin:
-activarea unui factor plasmatic similar trombinei: coagulaza liberă
-acţiunea directă asupra fibrinogenului: coagulaza legată de peretele celular.
Interpretare:
 pentru testul pe lamă pentru coagulaza legată :
pozitiv- aglutinare în 15-20 sec
negativ : absenţa aglutinării în 2-3 minute ( necesită confirmare)
 pentru testul în tub pentru coagulaza liberă:
pozitiv : coagulare , indiferent de gradul ei ( în masă, văl de fibrină)
negativ :absenţa cheagului

Latex aglutinare pentru identificarea S. aureus prin depistarea: clumping factor (coagulaza legată),
proteina A, polizaharide capsulare.
Control pozitiv: Staphylococcus aureus ATCC®25923.
Control negativ: Staphylococcus epidermidis ATCC®12228.

1
 Fig. 1: Identificarea stafilococilor prin latex aglutinare
(https://www.fishersci.co.uk/shop/products/staphytect-plus-latex-agglutination-test/p-6758539)

Legendă: 1 - aglutinare prezentă (S. aureus); 2 - aglutinare absentă (stafilococ coagulază-negativ)

Lizotiparea S. aureus:
Principiu: are la bază fenomenele de lizogenie şi de specificitate a receptorilor faţă de anumiţi
bacteriofagi.
Utilitate- în studiile epidemiologice

Genotiparea S.aureus – prin tehnici de biologie moleculara

2. Hemocultura

Hemocultura = însămânţarea şi incubarea într-un mediu de cultură adecvat a unei probe de sânge,
în scopul izolării şi identificării bacteriilor pe care le conţine.

Indicaţiile hemoculturii:
- bacteriemii cu mai multe posibile etiologii
- sepsis = infecţie (în orice parte a corpului) + modificări ale homeostaziei cunoscute sub numele de
sindrom inflamator sistemic (febră, tahicardie, tahipnee, leucocitoză).
- endocardită infecţioasă
- sindrom sugestiv pentru o infecţie sistemică cu bacterii strict patogene: salmonele tifoidice,
Leptospira, Brucella
- sindrom febril de origine neprecizată
- stări febrile după cateterism venos prelungit, dializă peritoneală, etc.

Specii bacteriene izolate frecvent şi cu semnificaţie clinică din hemocultură:

Staphylococcus aureus Enterococi
Bacili gram-negativi fermentativi Haemophilus influenzae tip b
(Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp.) Pseudomonas aeruginosa
Streptococi α şi β-hemolitici Bacterii anaerobe
Pneumococi

Particularităţile hemoculturii:
- numărul mic de bacterii prezente în sânge (efectul bactericid al sângelui)→ ce volum de sânge trebuie
să recoltăm?

2
- descărcările bacteriene în sânge sunt intermitente → câte probe trebuie să recoltăm? când şi cum ?

Tehnica hemoculturii:
a. prelevarea hemoculturii:
o medii de cultură:
 medii lichide cu valoare nutritivă mare, adecvate pentru creşterea unei game largi de bacterii
 pentru anaerobi: flacoane cu atmosferă anaerobă
 medii difazice: pantă de mediu solid + mediu lichid
 medii pentru sistemele automate de urmărire a hemoculturilor
o volumul prelevărilor
 la adult - 20 ml per probă
 nou-născuţi, sugari şi copii mici – 1-3 ml (concentraţia bacteriilor în sânge este mai mare decât la
adult)
o numărul prelevărilor
 în bacteriemii continue – 2 prelevări
 în bacteriemii intermitente – 3 prelevări în 24 ore, în caz de urgenţă la interval de 30-60 minute
o momentul prelevării
 înaintea instituirii antibioticoterapiei
 cât mai aproape de debutul bolii
 în momentul apariţiei frisoanelor sau în cursul evoluţiei ascendente a curbei febrile
 în bacteriemii continue (endocardita infecţioasă) – oricând în cursul zilei
o tehnica prelevării
 cele 2-3 prelevări trebuie făcute din vene diferite şi de fiecare dată în cel puţin 2 flacoane diferite
 decontaminarea zonei de puncţie → 3 etape: 1) apă şi săpun, 2) alcool iodat, 3) eter – importanţa
uscării tegumentului.
 pregătirea flacoanelor cu medii de cultură – medii preîncălzite la 37ºC ; dezinfecţia membranei de
cauciuc
 recoltăm până la indicatorul de pe flacon / realizăm o diluţie a sângelui în mediul de cultură de aprox.
1/10 pentru a reduce efectul bactericid al sângelui
 agitarea blândă a flaconului
 transportul cât mai rapid la laborator

b. incubarea hemoculturilor şi urmărirea lor

o un flacon va fi incubat aerob, iar celălalt anaerob
o urmărire timp de 7 zile cu examinare macroscopică, microscopică şi prin subcultivare
o endocardite infecţioase, pacienţi trataţi cu antibiotice, suspectarea unor microorganisme pretenţioase
nutritiv – urmărire timp de 14-21 de zile
o examenul macroscopic - de 2 ori pe zi în primele 3 zile, apoi zilnic, cu aprecierea semnelor creşterii:
 prezenţa coloniilor sau a unui depozit pe stratul de hematii
 tulburarea mediului
 hemoliza
 coagularea mediului
 prezenţa bulelor de gaz
 colonii pe stratul de geloză al mediilor difazice
o examenul microscopic - frotiuri Gram efectuate din flacoane.
o subcultivarea
 hemocultură cu creştere evidentă – subcultivare pe medii adecvate bacteriei observate la examenul
microscopic, în atmosferă adecvată în funcţie de flaconul în care a apărut creşterea.
 se pot efectua teste de identificare pe cultură primară şi antibiogramă pe cultură primară, ce va trebui
confirmată prin antibiograma standardizată a subculturii.
o identificarea bacteriei izolate
3
o testarea sensibilităţii la antibiotice

c. interpretarea rezultatelor → argumentarea semnificaţiei clinice a bacteriei izolate:

o argumentele bacteriologului:
 izolarea aceleiaşi bacterii în mai multe flacoane ale unui set de hemocultură sau în hemoculturi
repetate din sedii venoase diferite  semnificaţie clinică
 izolarea unor bacterii diferite din flacoanele hemoculturilor de la acelaşi pacient  contaminare
 izolarea a ≥ 2 specii bacteriene din aceeaşi hemocultură de cel puţin 2 ori în 24 ore  bacteriemie
polimicrobiană
o argumentele clinicianului
 vârsta şi statusul imun al pacientului
 particularităţile focarului septic primar

În sală se găsesc:
1. 2 seturi de hemoculturi: din ambele flacoane ale unui set am izolat S. aureus / al doilea set =
hemocultură negativă
2. set de transfer
3. frotiuri din hemocultura pozitivă (stafilococi)
4. subcultura pe agar-sânge, din hemocultura pozitivă
5. subcultura pe agar-nutritiv
6. frotiuri din cultură (stafilococi)
7. H2O2, lame de microscop pentru testul catalazei (pozitiv), beţişoare, pipetă
8. testul coagulazei-pozitiv (+ martor pozitiv şi martor negativ)
9. testul de sensibilitate la novobiocină – pozitiv: S. epidermidis (şi martor negativ)
10. antibiograma difuzimetrică pentru tulpina de testat şi pentru S. aureus ATCC
11. rigle, tabel cu diametrele zonelor de inhibiţie